特表 2025-502831 リポソームの捕捉容量の測定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-28

(54)【発明の名称】リポソームの捕捉容量の測定

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/127 20250101AFI20250121BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20250121BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20250121BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20250121BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20250121BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20250121BHJP

【ＦＩ】

A61K9/127

A61K47/24

A61K47/26

A61K47/18

A61K47/10

G01N33/50 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024539802

(86)(22)【出願日】2023-01-01

(85)【翻訳文提出日】2024-08-21

(86)【国際出願番号】 IL2023050003

(87)【国際公開番号】W WO2023126947

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】63/295,896

(32)【優先日】2022-01-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524245587

【氏名又は名称】モエビウス・メディカル・リミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】517272482

【氏名又は名称】イッスム リサーチ デヴェロップメント カンパニー オブ ザ ヘブライ ユニヴァーシティー オブ エルサレム，リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＹＩＳＳＵＭ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯＭＰＡＮＹ ＯＦ ＴＨＥ ＨＥＢＲＥＷ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＪＥＲＵＳＡＬＥＭ， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｈｉ－Ｔｅｃｈ Ｐａｒｋ， Ｅｄｍｏｎｄ Ｊ．Ｓａｆｒａ Ｃａｍｐｕｓ Ｇｉｖａｔ－Ｒａｍ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ３９１３５，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ９１３９０，Ｉｓｒａｅｌ

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100228980

【弁理士】

【氏名又は名称】副島 由加里

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】バレンホルツ，イェチェズケル

(72)【発明者】

【氏名】トゥルジェマン，ケレン

(72)【発明者】

【氏名】ピンクス，ロン

【テーマコード（参考）】

2G045

4C076

【Ｆターム（参考）】

2G045DA60

2G045DA61

2G045FB08

4C076AA19

4C076DD38

4C076DD60Z

4C076DD63

4C076DD67

4C076DD70

(57)【要約】

本発明は、リポソーム組成物中の複数のリポソームの捕捉容量及び捕捉水容量を決定する方法に関する。その方法は、リポソーム内に捕捉された医薬有効成分の濃度を計算し、予め形成されたリポソーム組成物の品質を保証するために使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リポソーム組成物中の複数のリポソームの捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を決定する方法であって、
（ｉ）流体媒体中に懸濁又は分散された所定の脂質濃度で複数のリポソームを含むリポソーム組成物を得る段階；
（ｉｉ）前記リポソーム組成物にマーカーを添加する段階［前記マーカーはリポソーム不浸透性であり、１ｋＤａ以上の分子量を有する。］；
（ｉｉｉ）前記リポソーム組成物中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで、前記リポソーム組成物の総容量を求める段階；
（ｉｖ）前記複数のリポソームから前記流体媒体を分離することで、流体媒体と、複数のリポソームとリポソーム間の間隙媒体とを含む沈殿とを得る段階；
（ｖ）段階（ｉｖ）の前記分離された流体媒体中の前記マーカーによって誘導されたシグナルを測定することで、前記流体媒体及び前記間隙媒体の容量を求める段階；
（ｖｉ）任意に、段階（ｉｖ）の複数のリポソームと複数のリポソーム間の間隙媒体とを含む前記沈殿中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで、前記沈澱中のリポソーム間の前記間隙容量を求める段階；及び
（ｖｉｉ）段階（ｉｉｉ）及び（ｖ）で測定された容量、又は段階（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）で測定された容量と段階（ｉ）の所定濃度に基づいて、前記複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算する段階
を含む方法。

【請求項2】

リポソーム組成物中の複数のリポソームの捕捉容量（Ｖｔ）を決定することが、特定の捕捉容量を決定することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

リポソーム組成物中の複数のリポソームの捕捉水容量を決定することが、特定の捕捉水容量を決定することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

段階（ｖｉ）を実行し、段階（ｖｉｉ）が、段階（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）で決定した容量、及び段階（ｉ）の所定の濃度に基づいて、前記複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

段階（ｖｉ）は行わず、段階（ｖｉｉ）が、段階（ｉｉｉ）、（ｖ）で決定した容量、及び段階（ｉ）の所定濃度に基づいて、前記複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

段階（ｖｉｉ）が、段階（ｉｖ）後の前記流体媒体中の前記マーカーによって誘導されるシグナルと、段階（ｉｖ）前の前記リポソーム組成物中の前記マーカーによって誘導されるシグナルとの比を計算することを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記マーカーが水溶性である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記マーカーが少なくとも約２ｋＤａの分子量を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記マーカーが放射性マーカーである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記マーカーが^１４Ｃ－カルボキシイヌリンである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記リポソーム組成物が単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）、巨大単ラメラ小胞（ＧＵＶ）、オリゴラメラ小胞（ＯＬＶ）、多ラメラ小胞（ＭＬＶ）、多小胞リポソーム（ＭＶＬ）、及びこれらの混合物若しくは組み合わせからなる群から選択される複数のリポソームを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記リポソーム組成物が約０．３μｍ～約５０μｍの範囲のサイズの複数のリポソームを含む、請求項１～１１のいずれか１項ｍに記載の方法。

【請求項13】

前記リポソーム組成物が約１μｍ～約４０μｍの範囲のサイズの複数のリポソームを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記リポソーム組成物が脂質濃度が約５０ｍＭ～約３００ｍＭである複数のリポソームを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記リポソーム組成物が脂質濃度が約１００ｍＭ～約２００ｍＭである複数のリポソームを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記リポソーム組成物が医薬活性剤を本質的に含まない複数の空リポソームを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記リポソーム組成物が医薬有効成分を封入した複数のリポソームを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記複数のリポソームに封入された前記医薬有効成分の濃度を決定することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

段階（ｉｖ）が、リポソームを実質的に含まない流体媒体を提供する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

段階（ｉｖ）を、遠心、濾過又はデカンテーションによって行う、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

段階（ｉｖ）を遠心によって行う、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

段階（ｉｖ）を約１０，０００～約３０，０００（×ｇ）の相対遠心力で行う、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

段階（ｉｖ）を約２℃～約２５℃の温度で行う、請求項２１又は２２に記載の方法。

【請求項24】

段階（ｉｖ）を約１０分～約１００分間にわたって行う、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

リポソーム組成物の品質を管理する方法であって、
（ｉ）請求項１～２４のいずれか１項に記載のリポソーム組成物中の複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を決定すること；
（ｉｉ）前記決定された捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を基準捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）値と比較すること；及び
（ｉｉｉ）前記決定された捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）が前記基準値から±１０％を超えて異なる場合、前記リポソーム組成物を不合格とすること
を含む方法。

【請求項26】

複数のリポソーム内に封入された医薬有効成分を含むリポソーム組成物の品質を管理する方法であって、
（ｉ）請求項１８に記載のリポソーム組成物中の複数のリポソーム内に封入された前記医薬有効成分の濃度を決定すること；
（ｉｉ）前記決定された医薬有効成分濃度を基準医薬有効成分濃度と比較すること；及び
（ｉｉｉ）前記決定された医薬有効成分濃度が前記基準医薬有効成分濃度から±１０％を超えて異なる場合には、前記リポソーム組成物を不合格とすること
を含む方法。

【請求項27】

流体媒体；ポリオール等張化剤；及び約４５：５５の比率での１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、及び１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から本質的になる複数のリポソームを含む関節内投与用に製剤化されたリポソーム組成物であって、当該組成物が、医薬活性剤を本質的に含まず、前記複数のリポソームが、
（ｉ）前記リポソーム組成物にマーカーを加える段階［前記マーカーはリポソーム不透過性であり、１ｋＤａ以上の分子量を有する。］；
（ｉｉ）前記リポソーム組成物中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで、前記リポソーム組成物の総容量を求める段階；
（ｉｉｉ）前記流体媒体を前記複数のリポソームから分離し、分離後に、前記流体媒体中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで得られる前記流体媒体及びリポソーム間の前記間隙媒体の容量を決定する段階；及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）で測定される容量及び前記リポソームを形成する脂質の濃度に基づいて前記複数のリポソームの捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算する段階
を含む方法によって決定される、約１～約４μＬ／ｍｇ脂質の範囲の特定の捕捉水容量を特徴とするリポソーム組成物。

【請求項28】

段階（ｉｉｉ）がさらに、分離後の沈澱中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで沈澱中のリポソーム間の前記間隙容量を決定することを含む、請求項２７に記載のリポソーム組成物。

【請求項29】

前記マーカーが少なくとも約２ｋＤａの分子量を有する、請求項２７又は２８に記載のリポソーム組成物。

【請求項30】

前記マーカーが水溶性である、請求項２７～２９のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項31】

前記マーカーが放射性マーカーである、請求項２７～３０のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項32】

前記マーカーが^１４Ｃ－カルボキシイヌリンである、請求項３１に記載のリポソーム組成物。

【請求項33】

前記複数のリポソームからの前記流体媒体の分離を遠心によって行う、請求項２７～３２のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項34】

前記複数のリポソームが単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）、巨大単ラメラ小胞（ＧＵＶ）、オリゴラメラ小胞（ＯＬＶ）、多ラメラ小胞（ＭＬＶ）、多小胞リポソーム（ＭＶＬ）、及びこれらの混合物又は組み合わせからなる群から選択される、請求項２７～３３のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項35】

前記複数のリポソームが多ラメラ小胞（ＭＬＶ）である、請求項３４に記載のリポソーム組成物。

【請求項36】

前記複数のリポソームが約０．３μｍ～約５０μｍの範囲のサイズを有する、請求項２７～３５のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項37】

前記複数のリポソームが約１μｍ～約４０μｍの範囲のサイズを有する、請求項３６に記載のリポソーム組成物。

【請求項38】

前記リポソームを形成する前記脂質の濃度が約５０ｍＭ～約３００ｍＭの範囲である、請求項２７～３７のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項39】

前記リポソームを形成する前記脂質の濃度が約１００ｍＭ～約２００ｍＭの範囲である、請求項３８に記載のリポソーム組成物。

【請求項40】

約５～約８のｐＨを有する、請求項２７～３９のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項41】

前記流体媒体がヒスチジン緩衝液である、請求項２７～４０のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項42】

前記ポリオールが直鎖ポリオールである、請求項２７～４１のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項43】

前記ポリオールがマンニトール、デキストロース、ラクトース、トレハロース及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７～４２のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項44】

前記ポリオールがマンニトールである、請求項４３に記載のリポソーム組成物。

【請求項45】

ＤＭＰＣが約１重量％～約１０重量％の範囲の重量パーセントで前記組成物中に存在し、ＤＰＰＣが約２重量％～約１２重量％の範囲の量パーセントで前記組成物中に存在する、請求項２７～４４のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項46】

前記特定の捕捉水容量が約１．５～約３．５μＬ／ｍｇ脂質の範囲である、請求項２７～４５のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項47】

前記特定の捕捉水容量が約２～約３μＬ／ｍｇ脂質の範囲である、請求項４６に記載のリポソーム組成物。

【請求項48】

前記捕捉水容量が約１０％～約３５％の範囲である、請求項２７～４５のいずれか１項に記載のリポソーム組成物。

【請求項49】

前記捕捉水容量が約２０％～約３０％の範囲である、請求項４８に記載のリポソーム組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リポソームの捕捉容量を決定する方法、及びリポソームの特性決定におけるそれの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

リポソームの捕捉容量（Ｖｔ）と捕捉水容量（Ｖｔａｑ）は、特にそれらが有効医薬品成分（ＡＰＩ）のカプセル化に利用できる容量を定義することから、リポソーム特性決定において重要なパラメータである。したがって、ＶｔとＶｔａｑを決定することで、リポソーム組成物におけるリポソーム内に封入されたＡＰＩの濃度を計算することができる。空のリポソームを含む組成物では、捕捉容量と捕捉水容量は、リポソームの構造とそれの特性の重要な特徴である。

【0003】

リポソームの捕捉容量は各種方法で決定でき、そのほとんどの方法で、捕捉されていないマーカーの除去後にリポソーム内に捕捉されたマーカーが測定される。このアプローチは、マーカーがリポソームから漏れず、リポソームとリポソーム外の媒体との間の良好な分離がなされている限り、すべてのタイプのリポソームに適している可能性がある。しかしながら、このアプローチでは、リポソーム調製時にマーカーをカプセル化する必要がある。したがって、臨床使用を指定されたバッチの特性決定には使用できない。

【0004】

Ｏｋｕら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ）－Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ， ６９１（２）， １９８２， ３３２－３４０）は、蛍光色素カルセインを使用してリポソームの水性コンパートメントの容量を測定する方法について報告している。リポソーム内の総容量の割合は、カルセインによってキレート化されると蛍光を消光するコバルト（ＩＩ）イオンを加えた後に残る蛍光の割合として得られる。

【0005】

Ｐｅｒｋｉｎｓら（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ， ６４， １９９３， １９７－２１７）は、リポソーム捕捉容量を定量するいくつかの方法を報告している。第１の方法は、^３Ｈ_２Ｏと^１４Ｃ－グルコースを使用して、総水容量と外部容量をマークした。この方法は、^１４Ｃ－グルコースと比較した^３Ｈ_２Ｏの膜透過性の速度論における差に依存するものであった。この方法は、４℃で実行して、グルコースの結合と透過を防ぎ、^３Ｈ_２Ｏ蒸気吸入のリスクを低下させた。ＶｉＶｏと呼ばれる第２の方法は、ＥＳＲスピンプローブ４－トリメチルアンモニウムＴＥＭＰＯ（ＣＡＴ１）を総容量１ｍＬのサンプルに加え、次に標準曲線を使用して、遠心したペレットの上にある上清中のプローブ濃度と総容量中のプローブ濃度を比較することによって実行された。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ）－Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ， ６９１（２）， １９８２， ３３２－３４０．

【非特許文献2】Ｐｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ， ６４， １９９３， １９７－２１７．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

臨床使用に適したリポソーム組成物の特性決定を行うために使用できる、リポソームの捕捉容量を製造後に正確に測定するニーズがまだ満たされていない。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、リポソームの捕捉容量及び捕捉水容量を決定する製造後方法、並びに臨床使用のためのリポソームの特性決定及びそれのバッチ製造の品質管理におけるそれの使用を開示する。

【0009】

本発明は、簡単で正確かつ再現性のあるリポソームの捕捉容量及び捕捉水容量の決定方法の発見に一部基づいている。この方法は、リポソームを貫通せず、脂質膜に統合又は結合されることもなく、外部水相にのみ存在する、分子量が１ｋＤａ以上のマーカーを使用する。リポソームを懸濁液から分離すると（例えば、遠心を使用）、脂質膜及びリポソーム内水系媒体の両方が分散容量の一部を占有するがマーカーを取り込まないことから、液体中のマーカー濃度の増加を測定する。この濃度増加は捕捉容量を示す。捕捉容量の計算は、リポソームの分離後の懸濁液中のマーカーによって誘導される信号と分離前の全信号との比から推定される外部水系媒体の容量に基づいて行われる。一部の実施形態において、計算はさらに、分離前のマーカーによって誘導される全信号と比較した、分離後の懸濁液中及びリポソームを含む沈殿物中のマーカーによって誘導される信号の測定に基づいてさらに行われてもよい。

【0010】

製造後法として適していないか、脂質二重層を透過し、リポソームのゼータ電位及び表面電荷に依存するプローブを使用するこれまで知られている方法とは逆に、本発明の方法は、感度が高く、再現性があり、マーカー濃度、濁度、クエンチングなどへの依存度が低い製造後法である。それはまた、実行が比較的容易で、よりアクセスしやすい。

【0011】

第１の態様によれば、リポソーム組成物中の複数のリポソームの捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を決定する方法であって、
（ｉ）流体媒体中に懸濁又は分散された所定の脂質濃度で複数のリポソームを含むリポソーム組成物を得る段階；
（ｉｉ）前記リポソーム組成物にマーカーを添加する段階［前記マーカーはリポソーム不浸透性であり、１ｋＤａ以上の分子量を有する。］；
（ｉｉｉ）前記リポソーム組成物中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで、前記リポソーム組成物の総容量を求める段階；
（ｉｖ）前記複数のリポソームから前記流体媒体を分離することで、流体媒体と、複数のリポソームとリポソーム間の間隙媒体とを含む沈殿とを得る段階；
（ｖ）段階（ｉｖ）の前記分離された流体媒体中の前記マーカーによって誘導されたシグナルを測定することで、前記流体媒体及び前記間隙媒体の容量を求める段階；
（ｖｉ）任意に、段階（ｉｖ）の複数のリポソームと複数のリポソーム間の間隙媒体とを含む前記沈殿中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで、前記沈澱中のリポソーム間の前記間隙容量を求める段階；及び
（ｖｉｉ）段階（ｉｉｉ）及び（ｖ）で測定された容量、又は段階（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）で測定された容量と段階（ｉ）の所定濃度に基づいて、前記複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算する段階
を含む方法が提供される。

【0012】

理解すべき点として、段階（ｖｉ）を行う場合、段階（ｖｉｉ）は、段階（ｉｉｉ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）で測定された容量と段階（ｉ）の所定の濃度に基づいて、前記複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算することを含む。

【0013】

別の態様によれば、リポソーム組成物中の複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を求める方法であって、
（ｉ）流体媒体中に懸濁又は分散された所定の脂質濃度で複数のリポソームを含むリポソーム組成物を得る段階；
（ｉｉ）前記リポソーム組成物にマーカーを添加する段階［前記マーカーはリポソーム不浸透性であり、１ｋＤａ以上の分子量を有する。］；
（ｉｉｉ）前記リポソーム組成物中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで、前記リポソーム組成物の総容量を求める段階；
（ｉｖ）前記複数のリポソームから前記流体媒体を分離することで、流体媒体と、複数のリポソームとリポソーム間の間隙媒体とを含む沈殿とを得る段階；
（ｖ）段階（ｉｖ）の前記分離された流体媒体中の前記マーカーによって誘導されたシグナルを測定することで、前記流体媒体及び前記間隙媒体の容量を求める段階；
（ｖｉ）段階（ｉｉｉ）及び（ｖ）で測定された容量と段階（ｉ）の所定濃度に基づいて、前記複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算する段階
を含む方法が提供される。

【0014】

理解すべき点として、段階（ｉｉｉ）及び（ｖ）で測定された容量に基づいて、前記複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算することは、段階（ｉｖ）後の前記分離された流体媒体中の前記マーカーのシグナルと、段階（ｉｖ）前の前記リポソーム組成物中のそれのシグナルとの比を計算することを含む。

【0015】

さらに別の態様によれば、リポソーム組成物中の複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を求める方法であって、
（ｉ）流体媒体中に懸濁又は分散された所定の脂質濃度で複数のリポソームを含むリポソーム組成物を得る段階；
（ｉｉ）前記リポソーム組成物にマーカーを添加する段階［前記マーカーはリポソーム不浸透性であり、１ｋＤａ以上の分子量を有する。］；
（ｉｉｉ）前記リポソーム組成物中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで、前記リポソーム組成物の総容量を求める段階；
（ｉｖ）前記複数のリポソームから前記流体媒体を分離することで、流体媒体と、複数のリポソームとリポソーム間の間隙媒体とを含む沈殿とを得る段階；
（ｖ）段階（ｉｖ）の前記分離された流体媒体中の前記マーカーによって誘導されたシグナルを測定することで、前記流体媒体及び前記間隙媒体の容量を求める段階；
（ｖｉ）段階（ｉｖ）の複数のリポソームと複数のリポソーム間の間隙媒体とを含む前記沈殿中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで、前記沈澱中のリポソーム間の前記間隙容量を求める段階；及び
（ｖｉｉ）段階（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）で測定された容量と段階（ｉ）の所定濃度に基づいて、前記複数のリポソームの前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算する段階
を含む方法が提供される。

【0016】

１実施形態において、前記捕捉容量（Ｖｔ）及び前記捕捉水容量（Ｖｔａｑ）の決定は、それぞれ特定の捕捉容量及び特定の捕捉水容量の決定を含む。

【0017】

一部の実施形態によれば、マーカーは水溶性である。他の実施形態によれば、マーカーは少なくとも約２ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態において、マーカーは放射性マーカーである。特定の実施形態において、マーカーはイヌリンである。他の特定の実施形態において、マーカーは^１４Ｃ－カルボキシイヌリンである。

【0018】

さらなる実施形態において、マーカーによって誘導されるシグナルは、放射線検出、熱量測定、蛍光、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ＧＣ連結質量分析（ＧＣ－ＭＳ）、赤外分光法、ラマン分光法、ＮＭＲ、比色分析、ＵＶ－ＶＩＳ分光法、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも一つの技術を使用して測定される。各可能性は、別個の実施形態を表す。

【0019】

各種実施形態において、リポソーム組成物は、単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）、巨大単ラメラ小胞（ＧＵＶ）、オリゴラメラ小胞（ＯＬＶ）、多ラメラ小胞（ＭＬＶ）、多小胞リポソーム（ＭＶＬ）、及びそれらの混合物又は組み合わせからなる群から選択される複数のリポソームを含む。各可能性は、別個の実施形態を表す。

【0020】

特定の実施形態において、リポソーム組成物は、約０．３μｍ～約５０μｍの範囲のサイズを有する複数のリポソームを含み、指定された範囲内の各値を含む。他の実施形態において、リポソーム組成物は、約１μｍ～約４０μｍの範囲のサイズを有する複数のリポソームを含み、指定された範囲内の各値を含む。

【0021】

各種実施形態において、リポソーム組成物は、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの脂質濃度を有する複数のリポソームを含み、指定範囲内の各値を含む。特定の実施形態において、リポソーム組成物は、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭの脂質濃度を有する複数のリポソームを含み、指定範囲内の各値を含む。

【0022】

一部の実施形態において、リポソーム組成物は、本質的に医薬有効成分を含まない複数の空のリポソームを含む。他の実施形態において、リポソーム組成物は、医薬有効成分を封入した複数のリポソームを含む。後者の実施形態によれば、本発明の方法はさらに、前記複数のリポソームによって封入された医薬有効成分の濃度を求めることを含む。

【0023】

各種実施形態において、流体媒体の前記複数のリポソームからの分離は、遠心分離、濾過、又はデカンテーションによって行われる。各可能性は、別個の実施形態を表す。１実施形態において、前記流体媒体の前記複数のリポソームからの分離により、リポソームが実質的に存在しない流体媒体が提供される。

【0024】

現在好ましい実施形態において、前記流体媒体の前記複数のリポソームからの分離は、遠心分離によって行われる。

【0025】

一部の実施形態において、前記リポソーム組成物の遠心分離は、約１０，０００～約３０，０００（×ｇ）の相対遠心力で実行され、指定範囲内の各値を含む。

【0026】

さらなる実施形態において、前記リポソーム組成物の遠心分離は約２℃～約２５℃の温度で行われ、指定範囲内の各値を含む。

【0027】

追加の実施形態において、リポソーム組成物の遠心は約１０分～約１００分間にわたって実行され、指定範囲内の各値を含む。

【0028】

各種実施形態において、本明細書で開示された方法は、リポソーム組成物の品質を管理するのに有用である。これらの実施形態によれば、当該方法はさらに、測定された捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を基準捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）値と比較し、測定された捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）が基準値から±１０％を超えて異なる場合、前記リポソーム組成物を不合格とすることを含む。

【0029】

他の実施形態において、本明細書で開示の方法は、複数のリポソーム内に封入された医薬有効成分（ＡＰＩ）を含むリポソーム組成物の品質を管理するのに有用であり、その方法は、本明細書に開示された捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）からリポソーム組成物中の複数のリポソーム内に封入されたＡＰＩの濃度を決定すること、その決定されたＡＰＩ濃度を基準ＡＰＩ濃度と比較すること、及び前記決定されたＡＰＩ濃度が前記基準ＡＰＩ濃度と±１０％を超えて異なる場合に、前記リポソーム組成物を不合格とすることを含む。

【0030】

一部の実施形態によれば、ポリオール等張化剤；及び約４５：５５の比率での１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）及び１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から本質的になる複数のリポソームとを含む関節内投与用に製剤されたリポソーム組成物が提供され、その組成物は本質的に医薬活性剤を含まず、前記複数のリポソームは、本明細書に開示された方法のいずれか一つによって決定される、約１～約４μｌ／ｍｇ脂質の範囲の特定の捕捉水容量（指定範囲内の各値を含む）を特徴とする。

【0031】

別の態様によれば、流体媒体；ポリオール等張化剤；及び約４５：５５の比率での１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、及び１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から本質的になる複数のリポソームを含む関節内投与用に製剤されたリポソーム組成物が提供され、その組成物は、医薬活性剤を本質的に含まず、前記複数のリポソームは、
（ｉ）前記リポソーム組成物にマーカーを加える段階［前記マーカーはリポソーム不透過性であり、１ｋＤａ以上の分子量を有する。］；
（ｉｉ）前記リポソーム組成物中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで、前記リポソーム組成物の総容量を求める段階；
（ｉｉｉ）前記流体媒体を前記複数のリポソームから分離し、分離後に、前記流体媒体中の前記マーカーによって誘導されるシグナルを測定することで得られる前記流体媒体及びリポソーム間の前記間隙媒体の容量を決定する段階；及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）で決定される容量及び前記リポソームを形成する脂質の濃度に基づいて前記複数のリポソームの捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を計算する段階
を含む方法によって測定される、約１～約４μＬ／ｍｇ脂質（指定の範囲内の各値を含む）の範囲の特定の捕捉水容量を特徴とする。

【0032】

各種実施形態によれば、流体媒体及びリポソーム間の間隙媒体の容量を決定する段階（ｉｉｉ）はさらに、流体媒体からの分離後に沈澱中のマーカーによって誘導されるシグナルを測定することにより、沈澱中のリポソーム間の間隙容量を求めることを含む。１実施形態において、分離は遠心によって行われる。

【0033】

一部の実施形態によれば、流体媒体はヒスチジン緩衝液を含む。他の実施形態によれば、ポリオールは直鎖ポリオールである。さらに他の実施形態によれば、ポリオールはマンニトール、デキストロース、ラクトース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、別個の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、ポリオールはマンニトールである。各種実施形態によれば、複数のリポソームとポリオール等張化剤との重量比は、約６：１～約２：１の範囲であり、指定された範囲内の比率のすべての値を含む。

【0034】

さらなる実施形態によれば、前記複数のリポソームは、本質的には、ＤＭＰＣとＤＰＰＣの組み合わせからなり、ＤＭＰＣは、約１％（重量）～約１０％（重量）の範囲の重量パーセントで存在し、ＤＰＰＣは、約２％（重量）～約１２％（重量）の範囲の重量パーセントで存在し、指定された範囲内の各値が含まれる。特定の実施形態によれば、リポソーム組成物は、約５～約８の範囲のｐＨを有し、指定された範囲内の各値が含まれる。他の実施形態によれば、前記複数のリポソームは、約１．５～約３．５μＬ／ｍｇ脂質の特定の捕捉水容量を特徴とし、指定された範囲内の各値が含まれる。さらに他の実施形態によれば、前記複数のリポソームは、約２～約３μＬ／ｍｇ脂質の特定の捕捉水容量によって特徴付けられ、指定された範囲内の各値が含まれる。さらなる実施形態によれば、前記複数のリポソームは、約１０％～約３５％の捕捉水容量によって特徴付けられ、指定された範囲内の各値が含まれる。追加の実施形態によれば、前記複数のリポソームは、約２０％～約３０％の捕捉水容量によって特徴付けられ、指定された範囲内の各値が含まれる。

【0035】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で説明されているものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験に使用できるが、例示的な方法及び／又は材料を以下で説明する。これらの例示的な方法及び／又は材料は、必ずしも限定することを意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】本発明の特定の実施形態に従って捕捉容量を計算するために使用される異なる容量を示す、遠心後のエッペンドルフバイアルの概略図である。

【図2】水及びＨＭＢ中の波長４２０ｎｍでのフェリシアン化物の光学密度の検量線である。

【図3】フェリシアン化物色素を使用して測定した、各種サンプルの上相の捕捉容量及びと濁度を示した図である。Ａ－３ｍＭ脂質；Ｂ－５２ｍＭ脂質；Ｃ－１２２ｍＭ脂質；Ｄ－１６０ｍＭ脂質；Ｅ－２０６ｍＭ脂質；Ｆ－３０５ｍＭ脂質；Ｇ－１０ｍＭ ＮａＣｌ；Ｈ－１００ｍＭ ＮａＣｌ；Ｉ－１５０ｍＭ ＮａＣｌ；Ｊ－３０００ｍＭ ＮａＣｌ；Ｋ－ＭＬＶｓ；Ｌ－ＬＭＶＶｓ；及びＭ－ＭＬＶｓ。

【図4】上清と総容量（左）、及び上清とペレット（右）を使用して求められた特定の捕捉水容量（ライトグレー）及び特定の捕捉容量（ダークグレー）を示す図である。

【図5】異なる脂質濃度における％捕捉水容量及び％ＲＳＤを示すグラフである。得られた結果は、上清の放射能に基づいている（ｎ＝３）。

【図6】脂質濃度に対する特定の捕捉水容量（捕捉容量μＬ／脂質ｍｇ）を示すグラフである。特定の捕捉水容量の平均は、２±０．１μＬ／ｍｇ脂質（ｎ＝１５）であった。

【図7】異なる^１４Ｃ－カルボキシイヌリン濃度における特定の捕捉水容量を示すグラフである（ＣＰＭはサンプル総重量に対して正規化されている）。

【図8】ＨＳＰＣ及びコレステロールを含むリポソーム組成物、又はＨＳＰＣ単独を含むリポソーム組成物の特定の捕捉水容量の倍数変化を示す図である（ｎ＝２）。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本発明は、リポソーム組成物の捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を非破壊的に決定する方法に関する。この方法を用いて、リポソーム組成物の製造の品質を、精度及び再現性を向上させて管理することができる。

【0038】

リポソームの捕捉容量を測定するために現在使用されている方法では、リポソーム内にマーカーを封入する必要があるが、本発明は異なるアプローチを定義する。このアプローチでは、放射性マーカー^１４Ｃ－カルボキシイヌリンなどの、分子量が≧１ｋＤａのリポソーム不透性であるマーカーを使用する。脂質膜を通過できないマーカーを使用する場合、マーカーはリポソームの外部水相にのみ分布する。リポソームから流体媒体を分離すると（たとえば、遠心を使用して）、リポソームの沈殿が起こることで、上清にリポソームが実質的に残らない。上清中のマーカーの濃度を測定して、外部水相の容量を計算することができる。リポソーム間の間隙容量を含む外部水相の容量と計算された脂質容量をリポソーム組成物の全容量から引くと、リポソーム捕捉容量に相当する。

【0039】

この方法は、既に形成されたリポソームの少量部分に使用できる製造後法であり、臨床使用に適さなくするリポソーム内へのマーカーの封入が関与しないことから、前述のアプローチの限界を克服するものである。また、捕捉されたマーカーを使用して捕捉容量を測定する場合、すべての水性コンパートメント中にマーカーが均一に分布している必要がある。しかしながら、多ラメラ小胞（ＭＬＶ）では、捕捉された溶質は、溶質と水透過性との間の違いにより、必ずしも均一に分布しているとは限らないことが知られている。本明細書に開示された方法は、ＭＬＶを含む各種リポソームの捕捉容量の正確な測定を提供し、リポソーム構造を変更することなく実行できる。この方法は、脂質二重層を透過しない高分子量極性マーカーを使用するため、捕捉容量及び捕捉水容量の正確で再現性のある測定が可能になる。本発明の方法は、空のリポソーム及びＡＰＩを充填したリポソームのバッチ製造の品質管理及び物理的評価に使用できる。

【0040】

本発明の一部の実施形態は、添付の図面を参照して本明細書で説明される。その説明は、図面とともに、一部の実施形態がどのように実施できるかを当業者に明らかにするものである。その図面は、例示的な説明を目的としており、本発明の基本的な理解に必要な範囲を超えて、より詳細に実施形態の構造を示す試みはなされていない。明瞭性のため、図面に描かれた一部の対象物は、縮尺通りではない。

【0041】

本発明は、いくつかの段階を含む、リポソーム組成物中の複数のリポソームの捕捉容量（Ｖｔ）及び捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を決定する方法を提供し、その段階の一部は、任意の順序で順次又は同時に実行することができ、各可能性は、別々の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「捕捉容量」という用語は、リポソームを構成する脂質膜が占める容量及びリポソーム内水性媒体の容量の合計を指す。一部の態様及び実施形態において、本明細書に開示の方法は、捕捉水容量の測定を含む。本明細書で使用される「捕捉水容量」という用語は、リポソーム内水性媒体の容量を指す。さらなる態様及び実施形態において、本発明の方法は、脂質の重量で正規化された、それぞれ捕捉容量及び捕捉水容量である特定の捕捉容量及び特定の捕捉水容量の測定を提供する。

【0042】

本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、代表的にはリン脂質二重層を含む脂質膜に囲まれた内部水性中心を特徴とする小胞を指す。例示的なリン脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、又はそれらの任意の誘導体若しくは組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。各可能性は、別々の実施形態を表す。本発明の範囲内の好適なホスファチジルコリンには、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、及びこれらの混合物又は組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。各可能性は、別個の実施形態を表す。好適なホスファチジルエタノールアミンには、１，２－ジラウロイル－Ｌ－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤｐｈＰＥ）、１，３－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－２－ホスホエタノールアミン（１，３－ＤＰＰＥ）、１－パルミトイル－３－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－２－ホスホエタノールアミン（１，３－ＰＯＰＥ）、ビオチン－ホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びこれらの混合物又は組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。各可能性は、別個の実施形態を表す。好適なホスファチジルグリセロールには、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－（ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール））（ＤＭＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１，２－ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、及びこれらの混合物又は組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。各可能性は、別個の実施形態を表す。

【0043】

本発明の原理によれば、本明細書で開示の方法は、単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）、巨大単ラメラ小胞（ＧＵＶ）、オリゴラメラ小胞（ＯＬＶ）、多ラメラ小胞（ＭＬＶ）、多小胞リポソームs（ＭＶＬ）、及びこれらの混合物又は組み合わせを含む構造を有するリポソームの捕捉容量を決定するのに使用することができる。各可能性は、別個の実施形態を表す。

【0044】

本発明の方法は、空のリポソームに対して実施することができるか、医薬有効成分（ＡＰＩ）を封入したリポソームに対して実施することができる。各可能性は、別個の実施形態を表す。本発明の原理によるマーカーはリポソームに取り込まれないため、リポソーム内に封入された医薬有効成分の存在は、捕捉容量の決定を妨害しない。捕捉容量とリポソーム内に封入された医薬有効成分の濃度との間の相関関係により、ＡＰＩ濃度の測定を得ることができる。したがって、リポソームの捕捉容量の決定により、その中に封入された医薬有効成分の濃度を評価することができる。したがって、本発明はさらに、本明細書に開示の方法に従って医薬有効成分を封入した複数のリポソームの捕捉容量及び／又は捕捉水容量を決定することを含む、リポソーム組成物中の複数のリポソーム内に封入された医薬有効成分の濃度を決定する方法を提供する。

【0045】

一部の態様及び実施形態において、本発明の方法は、代表的には重量単位で表す所定濃度の脂質で流体媒体及び複数のリポソームを含むリポソーム組成物を使用する。本明細書で使用される「リポソーム組成物」という用語は、好適な液体媒体、例えば緩衝液などの水性媒体に懸濁又は分散させた複数のリポソームを含む組成物を指す。リポソーム組成物を指す場合、理解すべき点として、組成物全体の捕捉容量に関する情報を提供するためにサンプリングされた前記組成物の一部への言及を含む。代表的には、リポソーム組成物中の脂質の濃度は、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの範囲であり、指定範囲内の各値が含まれる。本発明の範囲内に含まれる例示的な濃度範囲は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、及び約１００ｍＭ～約２００ｍＭであり、指定範囲内の各値が含まれる。本発明の原理によれば、リポソーム組成物中の脂質の濃度により、組成物中のリポソーム脂質膜が占める容量を求めることができる。脂質の容量は、脂質の重量をその密度で割ることによって計算することができる。代表的には、リポソーム膜を形成する脂質の密度は、好適な密度計（例えば、アントンパール密度計）を使用して測定することができる。或いは、密度は、基準サンプルから得ることができるか、各種モデルに従って計算することができる。

【0046】

特定の態様及び実施形態において、分子量が１ｋＤａ以上のマーカーを組成物に加える。本発明の原理によれば、マーカーはリポソームによって内部化されず、リポソーム膜と相互作用しないことで、リポソーム不浸透性である化合物である。一部の実施形態によれば、マーカーは好ましくは水溶性である極性分子である。本発明の範囲内のマーカーには、スペクトル測定などの既知の技術によって測定及び定量化できるシグナルを誘導する検出可能な部分を含む化合物などがある。好適なマーカーには、放射性剤、発色団、蛍光化合物、リン光化合物、磁性化合物、及び重金属クラスターなどがあるが、これらに限定されるものではない。各可能性は、別個の実施形態を表す。例示的なマーカーは、測定可能なシグナルとして放射線を放出する放射性同位体を含む放射性マーカーである。追加の例示的なマーカーは、外部光源からの放射線への曝露時に特定の波長の光を発する蛍光化合物であり、前記発せられた光は、測定可能なシグナルとして使用することができる。マーカーによって誘導されるシグナルは、例えば、各種の検出器及びモニターを使用して、当該技術分野で知られている方法に従って測定することができる。シグナルを測定するために使用できる技術には、放射線検出、熱量測定、蛍光、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ＧＣ連結質量分析（ＧＣ－ＭＳ）、赤外分光法、ラマン分光法、ＮＭＲ、比色法、ＵＶ－ＶＩＳ分光法、及びそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。各可能性は、別個の実施形態を表す。

【0047】

本発明の原理によれば、マーカーは、少なくとも１ｋＤａ、好ましくは少なくとも２ｋＤａの分子量を有する化合物を含む。代表的には、マーカーの分子量は１ｋＤａ～１，０００ｋＤａの範囲であり、指定範囲内の各値が含まれる。マーカーの例示的な分子量としては、１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、９５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ、３５０ｋＤａ、４００ｋＤａ、４５０ｋＤａ、５００ｋＤａ、５５０ｋＤａ、６００ｋＤａ、６５０ｋＤａ、７００ｋＤａ、７５０ｋＤａ、８００ｋＤａ、８５０ｋＤａ、９００ｋＤａ、９５０ｋＤａ、又は１，０００ｋＤａなどがあるが、これらに限定されるものではない。各可能性は、別個の実施形態を表す。

【0048】

一部の態様及び実施形態において、マーカーは、イヌリン、ＦＩＴＣ－イヌリン、デキストラン、ＦＩＴＣ－デキストラン、及びそれらの誘導体など（これらに限定されるものではない）などの多糖類を含む。各可能性は、別個の実施形態を表す。他の態様及び実施形態において、マーカーは、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など（これらに限定されるものではない）の炭水化物、ポリペプチド又は合成ポリマーを含む。各可能性は、別個の実施形態を表す。本発明の範囲内のマーカーは代表的には、少なくとも１ｋＤａの分子量を有するが、理解すべき点として、リポソームを貫通せず、脂質膜に統合又は結合しない１ｋＤａ未満の分子量を有するマーカーも、本発明の原理に従って捕捉された容量の正確な測定を提供すると予想される。このようなマーカーには、ショ糖などの二糖類、三糖類、及びオリゴ糖類などがあるが、これらに限定されるわけではない。

【0049】

一部の現在好ましい態様及び実施形態において、本発明の方法では、放射性マーカーが使用される。本発明の範囲内の例示的な放射性マーカーには、^１４Ｃ－カルボキシル－イヌリン、^１２５Ｉ－ポリビニルピロリドン、及び放射性炭水化物などがあるが、これらに限定されるものではない。各可能性は、別個の実施形態を表す。^１４Ｃ－カルボキシル－イヌリンなどの放射性マーカーはリポソームと相互作用しないことから、約０．１マイクロキュリー（μｃｉ）／ｍＬ～約１０μｃｉ／ｍＬの濃度で添加することができ、指定範囲内の各値が含まれる。本発明の範囲内に含まれる例示的な濃度範囲は、約０．１μｃｉ／ｍＬ～約５μｃｉ／ｍＬ、約０．５μｃｉ／ｍＬ～約５μｃｉ／ｍＬ、及び約０．５μｃｉ／ｍＬ～約３μｃｉ／ｍＬであり、指定範囲内の各値が含まれる。

【0050】

本明細書で提供される原理によれば、マーカーは、リポソーム内容量には利用できない。したがって、それをリポソーム組成物と混合すると、リポソーム外媒体中のそれの濃度が増加する。一部の態様及び実施形態において、本発明の方法は、リポソーム組成物中のマーカーによって誘導されるシグナルを測定することを含む。たとえば、放射性マーカーを使用する場合、その方法は、全リポソーム組成物の放射能／重量（１分あたりの崩壊率（ＤＰＭ）／ｇｒ）を測定することを含む。使用されるリン脂質の密度は１に非常に近い（１．０５未満）ため、このようなリポソームの場合、放射能／重量は放射能／容量（ＤＰＭ／ｍＬ）と実質的に互換的である。全リポソーム分散液の（ＤＰＭ／ｍＬ）である（ＤＰＭ／ｍｌ）_{ｔｏｔａｌ}を測定することで、リポソーム組成物の容量が求められる。

【0051】

放射能の測定は、当該技術分野で知られているように、例えば、Ｐａｃｋａｒｄ １９００ ＴＲシンチレーションカウンター、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｒｉ－Ｃａｒｂ液体シンチレーションカウンターなどの好適な液体シンチレーションカウンターを使用して実行できる。

【0052】

リポソーム組成物全体が占める容量を測定した後、流体媒体を前記複数のリポソームから分離する。複数のリポソームからの流体媒体の分離は、当該技術分野で知られているように、例えば遠心、濾過、又はデカンテーションによって行うことができる。各可能性は、別個の実施形態を表す。代表的には、マーカーを補充したリポソーム組成物を遠心して、前記複数のリポソームを沈殿させる。本発明の原理によれば、遠心は、上清溶液にリポソームが実質的に含まれないように行われる。代表的には、約０．３μｍ～約５０μｍの範囲、例えば約１μｍ～約４０μｍの範囲のサイズのリポソームは、十分な遠心で沈殿させることができる。組成物が小さいリポソームを含む一部の実施形態において、超遠心を用いて、完全な沈殿を達成すべきである。一部の態様及び実施形態において、リポソーム組成物の遠心は、約１０，０００～約３０，０００（×ｇ）の相対遠心力で実行され、指定範囲内の各値が含まれる。例示的な相対遠心力には、約１０，０００、約１１，０００、約１２，０００、約１３，０００、約１４，０００、約１５，０００、約１６，０００、約１７，０００、約１８，０００、約１９，０００、約２０，０００、約２１，０００、約２２，０００、約２３，０００、約２４，０００、約２５，０００、約２６，０００、約２７，０００、約２８，０００、約２９，０００、又は約３０，０００（×ｇ）があるが、これらに限定されるものではなく、各可能性は、別個の実施形態を表す。遠心は室温で行ってもよいが、より低温での遠心も本発明の範囲内で想定される。代表的には、約２℃～約２５℃の温度範囲で行われ、指定範囲内の各値が含まれる。例示的な温度には、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、又は約２５℃などがあるが、これらに限定されるものではなく、各可能性は、別個の実施形態を表す。代表的には、上記相対遠心力での約１０分～約１００分間にわたる遠心が、実質的にリポソームがない上清を得るのに十分である。遠心の例示的な期間には、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、又は約１００分などがあるが、これらに限定されるものではなく、各可能性は、別個の実施形態を表す。

【0053】

遠心及びリポソームのほぼ完全な沈殿に続いて、上清を回収し、マーカーによって誘導されたシグナルを測定することにより、リポソーム外媒体（上清又は分離された流体媒体と、沈殿したリポソーム間に存在する間隙容量）の容量を求めることができる。例えば、放射性マーカーを使用する場合、上清の放射能（ＤＰＭ／ｍＬ）_ｓｕｐを測定する。本発明の原理によれば、（ＤＰＭ／ｍＬ）_ｓｕｐは、リポソーム外媒体の放射能／ｍＬ、すなわち、上清の容量及び沈澱の間隙（リポソーム間に捕捉された）リポソーム外媒体の容量を表す。したがって、リポソームが形成された後に放射性トレーサーがリポソーム分散液に添加される場合、（ＤＰＭ／ｍＬ）_{ｔｏｔａｌ}と（ＤＰＭ／ｍＬ）_ｓｕｐの比率を使用して、リポソームの外部の全水分容量（Ｖ_ｆｒｅｅ、式１）を求める。

【0054】

次に、分散液の総容量からリポソームの外部の容量を減算することによってリポソームに捕捉された容量（Ｖｔ）を求める（式２）。捕捉水容量（Ｖｔａｑ）は、リポソーム捕捉容量からリポソーム脂質の容量（Ｖ_{ｌｉｐｉｄｓ}）を減算することによって計算される（式３）。Ｖ_{ｌｉｐｉｄｓ}は、既知のリポソーム脂質重量と既知の脂質密度から求められる。リポソームを調製するために使用される脂質に対するＶｔ又はＶｔａｑの比率は、それぞれ特定のＶｔ及び特定のＶｔａｑを表す。これらは、リポソーム分散液中のリポソームの最も関連のある記述子である。各成分（脂質、遊離（間隙容量も含む非リポソーム容量）、及びリポソーム内水相（Ｖｔａｑ））が占める異なる容量の定義とともにエッペンドルフ試験管の図を図１に示している。

【0055】

【数1】

【0056】

任意に、複数のリポソームとリポソーム間の間隙媒体とを含む沈澱中のマーカーによって誘導されるシグナルをさらに測定し、それを用いて、沈澱中のリポソーム間の間隙容量を求めることができる。

【0057】

リポソームを含む分散液の品質の記述子として、求めたＶｔ及びＶｔａｑ並びに特定のＶｔ及び特定のＶｔａｑを用いることは本発明の範囲内である。これらの実施形態によれば、本発明の方法はさらに、求めた捕捉容量を基準捕捉容量値と比較し、前記求めた捕捉容量が基準捕捉容量値からプラス又はマイナス１０％以上異なる場合に、前記リポソーム組成物を不合格とすることを含む。求めた捕捉容量を基準捕捉容量値と比較する場合、それを臨床使用に許容されることが知られている標準捕捉容量と比較することができる。標準捕捉容量は、正確な数値であってもよく、又は範囲であってもよい。たとえば、それは、絶対量と許容されるパーセンテージ偏差、すなわち±１０％、±５％などであってもよい。計算された捕捉容量を標準捕捉容量範囲と比較し、±１０％を超えてその範囲外である場合には、そのリポソーム組成物は不合格とされる。代表的には、基準捕捉容量値は、リポソーム組成物の仕様に従って許容される値の範囲に相当し、差はその範囲の下限から１０％を超えて低い値、又はその範囲の上限から１０％を超えて高い値に相当する場合に不合格となる。リポソーム組成物の代表的な標準捕捉容量は、例えば、約０．１～約１０μＬ／ｍｇ脂質、約０．３～約５μＬ／ｍｇ脂質、又は約１～約４μＬ／ｍｇ脂質などであることができ、各値は指定範囲内の各値を含む。標準捕捉容量は、品質管理が望まれるリポソーム組成物の捕捉容量の測定前、測定中、又は測定後に測定できる対照サンプルから得ることができる。さらなる代替法として、標準捕捉容量は、以前の分析に基づく絶対値であってもよい。測定された捕捉容量が標準基準値と大幅に異なる場合（±１０％を超えて）、この差は製造不良を示す。

【0058】

さらに又は或いは、捕捉容量を用いて、リポソーム内に封入されたＡＰＩの濃度を計算することができる。次に、ＡＰＩの濃度は、基準濃度とそれを比較し、測定されたＡＰＩ濃度が基準濃度と±１０％を超えて異なる場合に、前記リポソーム組成物を不合格にすることによって、リポソーム組成物の品質を管理するのに使用することができる。基準ＡＰＩ濃度は、前記ＡＰＩで治療される患者に治療効果を発揮するのに許容されることが知られている量であることができる。基準ＡＰＩ濃度は、正確な数値であってもよく、範囲であってもよい。たとえば、許容可能なパーセンテージ偏差を有する絶対量であってもよく、又は標準的なＡＰＩ濃度範囲であってもよい。本発明の方法によって求めたリポソーム組成物のＡＰＩ濃度が基準濃度の範囲から±１０％を超えて外れている場合、そのリポソーム組成物は不合格となる。

【0059】

上述のように、本発明の方法は、有利なことに、捕捉容量の製造後測定を提供する。したがって、サンプルのごく一部だけを本発明の方法で使用するために収集し、残りの組成物を臨床及びその他の用途に使用することができる。代表的には、実験偏差、不均一な収集、及び／又はサンプルの非代表的収集の影響を最小限に抑えるため、捕捉容量の測定のために複数のサンプルを収集する。したがって、平均値と基準値との比較が本発明の範囲内である。

【0060】

流体媒体；ポリオール等張化剤；及び医薬有効成分を本質的に含まない約４５：５５の比で１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、及び１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から本質的になる複数のリポソームを含む関節内投与用に製剤されたリポソーム組成物も本発明の範囲に含まれる。本明細書で使用される場合、「実質的に医薬有効成分を含まない」という用語は、一部の実施形態において、関節の潤滑、関節機能不全の治療、関節痛、刺激及び／又は摩耗の軽減、又はそれらの任意の組み合わせに使用することが知られている、治療上有効量未満の医薬有効成分を含むリポソーム組成物を指す。一部の実施形態において、リポソーム組成物は、潤滑剤、例えば、とりわけグリコサミノグリカン、又は薬学的に許容されるその塩、エステル、又は誘導体、例えばヒアルロン酸、又はヒアルロン酸含有塩若しくはエステルを含まない。前記リポソーム組成物中の複数のリポソームは、本明細書に開示されたいずれかの方法によって測定される約１～約４μＬ／ｍｇ脂質の範囲の特定の捕捉水容量を特徴とし、指定範囲内の各値を含む。

【0061】

一部の態様及び実施形態によれば、流体媒体はヒスチジン緩衝液を含む。他の態様及び実施形態によれば、ポリオールは直鎖ポリオールである。追加の態様及び実施形態によれば、ポリオールは少なくとも五つのヒドロキシル基を有する糖又は糖アルコールである。例示的なポリオールには、マンニトール、デキストロース、ラクトース、トレハロース、及びそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。各可能性は、別個の実施形態を表す。現在、ポリオールとしてマンニトールを使用することが好ましい。各種実施形態によれば、複数のリポソームとポリオールの重量比は、約６：１～約２：１の範囲であり、指定範囲内の比率のすべての反復を含む。

【0062】

本明細書に開示された方法のいずれかによって測定された約１～約４μＬ／ｍｇ脂質の範囲の特定の捕捉水容量を有するリポソーム組成物であって、流体媒体、ポリオール、及びＤＭＰＣ及びＤＰＰＣの組み合わせから本質的になる複数のリポソームを含み、ＤＭＰＣが約１％（重量）～約１０％（重量）の範囲の重量パーセントで存在し、ＤＰＰＣが約２％（重量）～約１２％（重量）の範囲の重量パーセントで存在し、各値は指定範囲内の各値を含むリポソーム組成物が本発明によって包含される。代表的には、前記リポソーム組成物は約５～約８の範囲のｐＨを有し、各値は指定範囲内の各値を含む。

【0063】

特定の態様及び実施形態において、前記リポソーム組成物中の複数のリポソームは、約１．５～約３．５μＬ／ｍｇ脂質、又は約２～約３μＬ／ｍｇ脂質の範囲（指定範囲内の各値を含む）の特定の捕捉水容量を特徴とする。他の態様及び実施形態において、前記リポソーム組成物中の複数のリポソームは、約１０％～約３５％、又は約２０％～約３０％の範囲（指定範囲内の各値を含む）の捕捉水容量を特徴とする。

【0064】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに別段の定めがない限り、複数形も含む。したがって、たとえば「脂質」への言及は、複数のそのような脂質を含む。留意すべき点とて、「及び（ａｎｄ）」という用語又は「又は（ｏｒ）」という用語は、文脈上明らかに別段の定めがない限り、一般に「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味で使用されている。本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、±１０％の変動を包含することを意味する。

【0065】

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に説明するために提供されたものである。ただし、これらの実施例は、本発明の広い範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、本明細書に開示の原理の多くのバリエーションや変更を容易に考案できる。

【実施例】

【0066】

比較例：フェリシアン化カリウム色素を用いたリポソームの捕捉水相の測定
１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５を含む４％マンニトール中溶液でリン脂質含有混合物を水和することで約４５：５５の比率での１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、及び１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から形成された空のリポソームを含むリポソーム組成物の捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を評価した。

【0067】

捕捉されたＶｔとＶｔａｑを決定するのに使用される一般的な方法は、フェリシアン化カリウムなどの、リポソーム膜と相互作用せず、リポソームを透過しない色素の使用に基づくものである。Ｖｔの測定のためのフェリシアン化カリウムの使用を、以下に記載のように行った。

【0068】

フェリシアン化カリウムの標準溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）を調製し、リポソーム組成物（薬物を含まない空のリポソームを含む）の予め計量したサンプルと混合した。小さい（サブミクロン）リポソームを除去するために、サンプルを１４，０００ｒｐｍで１０～３０分間遠心した。次に上清を取り出し、計量した。フェリシアン化カリウムの標準溶液をリポソーム含有沈澱に１：１の重量比で加え、続いて渦攪拌を使用して混合し、１４，０００ｒｐｍで３０～６０分間遠心した。注目すべき点として、混合が困難であったため、長時間の渦攪拌、加熱、及び超音波処理を使用した。次に上清溶液を収集した。フェリシアン化物色素の吸光度を、４２０ｎｍでのＵＶ－ＶＩＳ分光光度計を使用して測定し、フェリシアン化物の濃度を同じ条件下で作成された検量線に基づいて計算した（図２）。

【0069】

代替手順も採用した。フェリシアン化カリウムの標準溶液（１．２５～５０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、空の（薬剤を含まない）リポソームのリポソーム分散液の計量済みサンプル約１グラムに加え、続いて渦攪拌を使用して混合し、１４，０００ｒｐｍで１～３時間遠心した。上清溶液を収集し、フェリシアン化物濃縮物の吸光度を、４２０ｎｍ及び６００ｎｍでＵＶ－ＶＩＳ分光光度計を使用して測定した。フェリシアン化物は６００ｎｍで光を吸収しないため、この波長での吸光度は上清中の小リポソームの濁度の寄与によるものと考えられる（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １， １９９３， ５２７－６１６）。濁度が非常に高かったため、リポソーム分散液全体の吸光度を測定できなかったことから、Ｖｔを計算するために、上清の吸光度を、リポソームを含まない同じ容量の基準分散液に対して４２０ｎｍで読み取った。リポソーム分散液の上清の濁度により、４２０ｎｍでの一貫した吸光度値が得られず、従ってこの方法を用いてはＶｔとＶｔａｑの信頼できる値を全く測定できなかった（上清（フェリシアン化物なし）のＯＤ_{４２０ｎｍ}は０．０６５であったのに対し、ヒスチジンマンニトール緩衝液単独の場合は０．０４９であった）。

【0070】

結果（図３）は、上清の濁度が４２０ｎｍでの吸光度に及ぼす影響を示している。特に、２時間の遠心後でも濁度は比較的高く、すなわち上相のリポソームの６００ｎｍでの光学密度値が０．０５５～０．０６３であった。６００ｎｍでの吸光度は、４２０ｎｍではるかに大きな濁度が存在することを示している。したがって、この方法で得られたＶｔの値は偽値である。したがって、このアプローチでは、ＤＭＰＣ／ＤＰＰＣリン脂質を含むＭＬＶ組成物のＶｔを計算することはできない。

【0071】

実施例１：^１４Ｃ－カルボキシル－イヌリンを用いるリポソームの捕捉容量及び捕捉水容量の決定
従って、吸光度に依存しない代替アプローチを開発した。リポソームと相互作用せず、及び／又はリポソームを透過しない^１４Ｃ－カルボキシルイヌリンをトレーサー／マーカーとして選択した。

【0072】

１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５を含む４％マンニトール中溶液でリン脂質含有混合物を水和することで約４５：５５の比率での１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、及び１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から形成された空のリポソームを含むリポソーム組成物の捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を、放射性マーカーとして^１４Ｃ－カルボキシル－イヌリンを用いて評価した。リポソーム組成物のＶｔとＶｔａｑ及び特定のＶｔ及びＶｔａｑの測定を、上清及びペレットに基づく二つのアプローチを使用して行った（図４）。

【0073】

^１４Ｃ－カルボキシル－イヌリン溶液（水溶液）を、リポソーム組成物を含む予め計量したサンプルに加えた。サンプルの一部（１００～２００ｍｇ）を予め計量した２０ｍＬシンチレーションバイアルに移し、計量した。別の一部（２５０～３５０ｍｇ）をエッペンドルフ管に移し、２０８１７相対遠心力（ｒｃｆ）で３０分間、４℃で遠心した（遠心機５８１０Ｒ、エッペンドルフ、ドイツ）。水性上清を収集し、予め計量したエッペンドルフ管に移し、再度計量した。約１００～２００ｍｇの範囲の上清の部分を、予め計量したシンチレーションバイアルに移し、計量した。可溶化剤（ｓｏｌｖａｂｌｅ）を加え、溶液を５０℃で約１時間混合してリポソームを溶解させた。各バイアルに液体シンチレーションカクテル（Ｏｐｔｉ－Ｆｌｕｏｒ）を加え、バイアルを５～８℃で遮光して一晩保管した。１分あたりの崩壊数（ＤＰＭ）としての放射能カウントを、液体シンチレーションβカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ １９００ ＴＲシンチレーションカウンター）で測定した。

【0074】

捕捉水容量（Ｖｔａｑ）を二つの方法で計算した（図４）。第１の方法では、リポソームが占める総捕捉容量（Ｖｔ）（脂質容量と捕捉水容量Ｖｔａｑを含むＶｔ）を、上清のＤＰＭ／ｍＬと総リポソーム分散液（リポソーム沈殿前）のＤＰＭ／ｍＬの比率から計算した。この比率により、リポソーム分散液の総量からリポソームが占める総容量の％を計算することができる。上記の比率を容量に変換することができる。次に、Ｖｔから脂質容量を減算してＶｔａｑを計算した。Ｖｔａｑを上記の式１～３に従って計算し、式中、Ｖ_ｆｒｅｅは上清と間質液の容量の合計であり；Ｖ_{ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ}は遠心後の沈殿リポソーム間の自由（非リポソーム）水容量であり、Ｖ_{ｌｉｐｉｄｓ}は、脂質の質量を密度で割って計算した脂質の容量である。Ｖ_ｆｒｅｅ（Ｖ_{ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ}も含む））は等式１に従って計算した。

【0075】

相対標準偏差（％ＲＳＤ）を、この測定のために計算した（ｎ＝５）。上相（上清）の放射能に基づいて計算された特定の捕捉水容量（Ｖｔａｑ）は１．９±０．０６μＬ／ｍｇ脂質であった。上相の放射能に基づいて計算された特定の捕捉容量（Ｖｔ）は２．９±０．０６μＬ／ｍｇ脂質で、％ＲＳＤは２．９％であった（図４）。

【0076】

実施例２：異なる脂質濃度での捕捉容量の決定
リポソームサンプルを、４％マンニトール中の１０ｍＭ等浸透圧ヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５で希釈した。上清のＤＰＭ／ｍＬと全リポソーム分散液のＤＰＭ／ｍＬの比率に基づいて、実施例１に記載の方法に従って、特定の捕捉水容量を測定した。総脂質濃度と％捕捉水容量の間には直線的な相関が認められた。相対標準偏差は、脂質濃度が低下するにつれて指数関数的に増加した（図５）。脂質重量で正規化して、特定の捕捉水容量（ｎ＝１５）（捕捉容量μＬ／脂質ｍｇ）の平均を求めることによって、リポソームサンプルの特定のＶｔａｑを計算した。得られた特定のＶｔａｑは、２．０±０．３μＬ／脂質ｍｇであった（図６）。その結果は、同じリポソーム組成物における全脂質濃度に関係なく、特定のＶｔａｑ（μＬ／脂質ｍｇ）が同じままであることを明確に示している。したがって、当該捕捉容量の測定方法は一貫性があり、信頼性がある。特定の捕捉容量が脂質（リポソーム）濃度に依存しないという事実は、^１４Ｃ－カルボキシイヌリンとリポソームの間に相互作用がないことを明確に裏付けている。

【0077】

実施例３：異なる^１４Ｃ－カルボキシル－イヌリン濃度での捕捉用量の決定
捕捉水容量（Ｖｔａｑ）の測定が^１４Ｃ－カルボキシル－イヌリンのリポソームとの相互作用によって影響を受けないことを検証するために、異なる^１４Ｃ－カルボキシル－イヌリン濃度における捕捉水容量を、上清の放射能に基づいて実施例１で説明した方法に従って測定した。図７は、特定の捕捉水容量の平均（ｎ＝６）が２．２％±０．１でＲＳＤが４．３％であったことを示しており、これは、^１４Ｃ－カルボキシル－イヌリンを、予め形成されたリポソーム分散液に添加した場合、リポソーム膜と相互作用せず、リポソームに浸透しないことを示している。これは、Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－Ｌｅｇａｃｙ Ｃｏｎｔｅｎｔ ２０６， １９６４， ９８５－９９１でも確認されている。

【0078】

実施例４：多ラメラ小胞（ＭＬＶｓ）と大型多小胞小胞（ＬＭＶＶ）の捕捉容量の決定
リポソーム分散液の品質の信頼できる記述子としてのＶｔ及びＶｔａｑを決定するための^１４Ｃ－イヌリンアプローチの有用性を実証するために、多ラメラ小胞（ＭＬＶ）及び大型多小胞小胞（ＬＭＶＶ）を含むリポソーム組成物のＶｔとＶｔａｑの間の比較を行った。ＬＭＶＶリポソーム組成物は、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １６０， ２０１２， ３４６－３５２に記載の方法と同様にして、凍結と解凍の繰り返しサイクルによってＭＬＶから調製した。

【0079】

ＭＬＶからなるリポソーム組成物は、次のようにして調製した。モル比２：１での水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）とコレステロール又はＨＳＰＣのみのＭＬＶは、６５～７０℃でホスファチジルコリン（コレステロールあり／なし）をエタノール中で混合し、その後水溶液（水又は生理食塩水）に注入することによって生理食塩水中で調製した。そのリポソーム組成物は、約７５ｍＭのホスファチジルコリン濃度を含んでいた。次に、組成物の一部を１０サイクルの凍結と解凍にかけて、ＭＬＶからＬＭＶＶへの変換を誘導した。リポソームの凍結－解凍を繰り返すと、捕捉水容量が劇的に増加することが知られている（Ｓｒｉｗｏｎｇｓｉｔａｎｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ， ４， ２０１０， １－６； Ｅｌｏｒｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ， １０（２）， １９９３、２３７－２４８； Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ）－Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ， ８１７（１）， １９８５， １９３－１９６）。凍結時に、リポソームの二重層は破壊され不安定化する（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １， １９９３， ２０９－２２８）が、解凍時には、露出した疎水性コアが融合して、ラメラの数が減少した新しい小胞を形成する（Ｐｉｃｋ， Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ， ２１２（１）， １９８１， １８６－１９４）。

【0080】

リポソームを、サイズ分布とホスファチジルコリン濃度によって特性決定した。ＭＬＶ及びＬＭＶＶを含むサンプル（同じ脂質組成）は両方とも同じ脂質濃度と類似の平均直径（サイズ分布は多少異なるが）であったが、遠心後のバイアルの肉眼検査では、ＭＬＶと比較してＬＭＶＶのペレット容量が大幅に増加していることが明らかになった。ＬＭＶＶの捕捉容量（Ｖｔ）と、なおさら捕捉水容量Ｖｔａｑも、ＭＬＶより大幅に大きいことが認められた。

【0081】

結果を表１にまとめ、図８に示している。
表１．

【表1】

【0082】

したがって、本発明の方法は、Ｖｔ、Ｖｔａｑ、特定のＶｔ、及び特定のＶｔａｑの正確な測定を提供し、ＬＭＶＶと比較してＭＬＶの捕捉容量に有意差があることを示している。特に、ＬＭＶＶの捕捉容量はＭＬＶの捕捉容量より有意に高かった。

【0083】

実施例５：本発明の方法及びカルシウムイオンを捕捉マーカーとして利用する方法を用いて測定した捕捉容量の比較
^１４Ｃ－イヌリンに基づくＶｔａｑ決定法のさらなるバリデーションのため、脂質水和時にリポソームの水相内にマーカーを封入することにより捕捉容量を直接決定する方法を適用し、本発明の方法と比較した。特に、４５：５５モル比でのＤＭＰＣ／ＤＰＰＣから構成されるＭＬＶのＶｔａｑを直接決定するために、水溶性膜不透過性マーカーとしてカルシウムイオンを選択した。脂質のエタノール混合物を、４％マンニトール（ヒスチジンマンニトール緩衝液、ＨＭＢ）中の２０ｍＭカルシウムイオン（酢酸カルシウムとして）を含む水性媒体に注入することにより、リポソームを調製した。緩衝液の交換及びエタノール及び封入されていないカルシウムイオンの除去を、沈殿（遠心による）及び酢酸カルシウムを含まない同じＨＭＢを使用したリポソームの繰り返し洗浄の繰り返しサイクルにより行った。沈殿及びＭＬＶの洗浄のこれらの繰り返しサイクルは、カルシウムを含む外部媒体をほぼ完全に除去し、それを等浸透圧ＨＭＢに置き換えるために実行した。洗浄媒体及び酢酸カルシウムを含む水和媒体のｐＨ及び浸透圧は、それぞれ６．５、２７２、及び２７９ｍＯｓｍｏ／ｋｇに調節した。カルシウムイオンを含む外部媒体を、遠心及び洗浄の段階を５回連続で行うことでＨＭＢ媒体に置き換えた。最終的なリポソーム分散液の脂質濃度及び浸透圧は、それぞれ１４８ｍＭ総ＰＣ（１０５ｍｇ／ｍＬ）と２７９ｍＯｓｍｏ／ｋｇであった。リポソーム内に捕捉されたカルシウムイオンの濃度を、誘導結合プラズマ（ＩＰＣ）－発光分光法（ＩＣＰ－ＯＥＳ）を使用して測定した。間隙容量を補正し、その寄与をリポソーム内カルシウム量から減算するために、リポソーム調製後のリポソーム分散液に添加した^１４Ｃ－イヌリンを使用して間隙容量を測定した（上記のように、複数のリポソーム及びリポソーム間の間隙媒体を含む沈澱の放射能を測定することによって）。比較のために、同じリポソーム組成物の捕捉水容量も、実施例１で説明したように^１４Ｃ－イヌリン外部マーカーを使用して、（ＤＰＭ／ｍＬ）_ｓｕｐと（ＤＰＭ／ｍＬ）_{ｔｏｔａｌ}の比から測定した。

【0084】

カルシウム濃度は、緩衝液交換と、遠心及び洗浄の繰り返しサイクルによるリポソーム外媒体からのエタノール及びカルシウムイオンの除去の前後にＩＣＰ－ＯＥＳを使用して測定した。遠心後の外部媒体に残留するカルシウム濃度も、リポソームの上相で測定した。有機負荷が高いため、リポソームサンプルは２００℃で４時間酸分解処理したが、それはカルシウム測定には影響がないと考えられる。総脂質濃度は、改良バートレット法（Ｓｈｍｅｅｄａ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ３６７， ２００３， ２７２）を使用して測定した。

【0085】

捕捉水容量（Ｖｔａｑ）は下記式に従って計算した。

【数2】

式中、カルシウム_１及びカルシウム_２は、それぞれ緩衝液交換の前後の総カルシウム濃度であり；脂質_１及び脂質_２は、それぞれ緩衝液交換の前後の総脂質濃度であり；カルシウム_ｅは、緩衝液交換後の外部容量中の残留カルシウムの濃度であり；Ｖ_{ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ}は、ペレット中の^１４Ｃ－イヌリンによって測定された間隙液の容量であり；Ｖ_{ｌｉｐｉｄｓ}は、密度約１と仮定して既知の脂質濃度から計算される。これら異なるサンプルのカルシウム濃度及び脂質濃度の結果を表２にまとめてある。

【0086】

表２．

【表2】

【0087】

捕捉されたカルシウムマーカーによって測定された捕捉水容量（Ｖｔａｑ）は２４．４２％（％Ｖｔ_ａｑ＝（（６．０３４－０．１０９）／１４８×２０２／１９．２７）×１００％－７．１％－１０．４５％＝２４．４２％）で、特定の捕捉水容量（Ｖｔａｑ）は２．３μＬ／ｍｇ脂質、特定の捕捉容量（Ｖｔ）は４μＬ／ｍｇ脂質であった。外部容量も緩衝液交換前の外部カルシウム濃度を使用して計算し、５８％と測定された。両方の結果を、^１４Ｃ－イヌリンマーカーを用いる本発明の方法と以下のように比較した。リポソームの捕捉水容量を、二つの異なるアプローチを使用して測定した。１－上清の放射能と総放射能の比率に基づくもの、及び２－ペレットの放射能（間質液の放射能）に基づくものである。両方のアプローチを使用して同様の結果が得られた。相対標準偏差（％ＲＳＤ）を、両方のアプローチについて計算した（ｎ＝５）。計算された特定の捕捉水容量（Ｖｔａｑ）及び特定の捕捉容量（Ｖｔ）の結果を、表３にまとめた。

【0088】

表３．

【表3】

【0089】

このように、（リポソーム内部の）捕捉されたカルシウムイオンをマーカーとして用いて得られたリポソームの捕捉水容量（Ｖｔａｑ）の結果は、放射性^１４Ｃ－イヌリン外部マーカーによって得られた結果とほぼ同一である。したがって、本発明の特定の実施形態によるリポソーム分散液のＶｔ及びＶｔａｑを決定するために^１４Ｃ－イヌリン外部リポソーム媒体マーカーを使用すると、容易で、簡単な、高感度で、信頼性のある、正確な、再現性のある方法が得られる。この方法は、予め形成されたリポソーム分散液に適用することができ、リポソーム内部のマーカーを含めることを必要としない。また、この方法は、リポソーム沈殿後の上清の濁度に依存しないことが明らかになっており、したがって、低分子量発色団をマーカーとしてリポソーム外媒体を測定する際に遭遇することが多い問題を克服するものである。この方法はＶｔとＶｔａｑの両方の決定を可能とすることから、リポソーム特性の重要な記述子であり、事前に形成されたリポソームの品質保証に使用することができる。

【0090】

以上、本発明の特定の実施形態について図示及び説明したが、本発明は本明細書に記載の実施形態に限定されるものではないことは明らかである。下記の特許請求の範囲に記載される本発明の精神及び範囲を逸脱しない限りにおいて、多くの修正、変更、変形、置換及び均等物が当業者には明らかであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】