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▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-30
(54)【発明の名称】リステリア属バリアント及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20250123BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20250123BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250123BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250123BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250123BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250123BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20250123BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250123BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250123BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20250123BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250123BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20250123BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20250123BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20250123BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20250123BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20250123BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C07K16/46
C12N15/12
C12N15/63 Z
A61P37/04
A61P35/00
A61K35/74
A61K39/395 N
A61P43/00 121
A61K31/7088
A61K48/00
A61K39/00 H
A61K38/02
A61K35/76
C07K16/28
C07K16/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024542288
(86)(22)【出願日】2023-01-26
(85)【翻訳文提出日】2024-09-05
(86)【国際出願番号】 US2023011628
(87)【国際公開番号】W WO2023146967
(87)【国際公開日】2023-08-03
(31)【優先権主張番号】63/304,235
(32)【優先日】2022-01-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ポートノイ ダニエル エー．
(72)【発明者】
【氏名】リベラ－ルゴ ラファエル ホセ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA15X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065BB13
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA13
4C084AA19
4C084CA04
4C084MA52
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB26
4C084ZC75
4C085AA03
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB11
4C085CC07
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG01
4C085GG08
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC76
4C087BC83
4C087CA12
4C087CA20
4C087MA02
4C087MA52
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZC75
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、機能性ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子を欠くバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、該バリアントリステリア属細菌を、例えば、ベクター、ワクチン、及び治療薬として作製及び使用する方法である。本開示は、インビボで粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞リガンドの産生をもたらすバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、例えば、個体におけるＭＡＩＴ細胞を刺激する及びその数を増大させるための、該バリアントリステリア属細菌を作製及び使用する方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）生合成に必要な遺伝子の変異を含むバリアントリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）細菌であって、哺乳類においては細胞外で増殖しない、前記バリアントリステリア属細菌。
【請求項2】
ＦＭＮ及びＦＡＤ合成に必要な前記遺伝子が、ｒｉｂＣ遺伝子及び／またはｒｉｂＦ遺伝子である、請求項１に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項3】
条件的偏性細胞内細菌である、請求項１または請求項２に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項4】
増殖するためにフラビンモノヌクレオチド及びフラビンアデニンジヌクレオチドの補給を必要とする、請求項１～３のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項5】
前記変異が、前記ｒｉｂＣ遺伝子及び／または前記ｒｉｂＦ遺伝子のすべてまたは一部の欠失を含む、請求項２～４のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項6】
前記バリアントが、少なくとも１つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含むように遺伝子改変されている、請求項５のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項7】
前記異種核酸が、前記細菌のゲノムに組み込まれている、請求項６に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項8】
前記少なくとも１つの異種遺伝子産物が、抗原を含む、請求項６または請求項７に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項9】
前記抗原が、がん関連抗原である、請求項８に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項10】
バリアントリステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）細菌である、請求項１～９のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項11】
前記細菌に弱毒化表現型を付与する１つ以上のさらなる変異、及び／または増殖優位性をもたらす１つ以上のさらなる変異をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項12】
前記弱毒化表現型を付与する１つ以上のさらなる変異が、ａｃｔＡ及びｉｎｌＢから選択される遺伝子の変異を含み、前記増殖優位性をもたらす１つ以上のさらなる変異が、ｅｅｔＢ遺伝子の変異を含む、請求項１１に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項13】
ａ）請求項１～１２のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属細菌、及びｂ）多重特異性抗体
を含む、組成物。
【請求項14】
前記多重特異性抗体が、ｉ）がん関連抗原に特異的な第一の抗原結合部位、及びｉｉ）Ｔ細胞に特異的な第二の抗原結合部位を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記Ｔ細胞が、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、γ／δ Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属を含む、免疫原性組成物。
【請求項17】
個体における免疫応答を誘導する方法であって、請求項１６に記載の免疫原性組成物の有効量を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項18】
前記バリアントリステリア属細菌が、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含むように遺伝子改変されており、前記免疫応答が、前記異種ポリペプチドに対して誘導される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記異種ポリペプチドが、抗原である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記抗原が、がん関連抗原である、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記免疫応答が、ガンマ－デルタＴ細胞応答を含む、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
請求項１６に記載の免疫原性組成物の単位用量を含む、キット。
【請求項23】
前記単位用量が、経口用量である、請求項２２に記載のキット。
【請求項24】
前記単位用量が、注射用である、請求項２２に記載のキット。
【請求項25】
異種抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターをさらに含む、請求項２２～２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項26】
粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞リガンド５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）の産生をもたらす、５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属。
【請求項27】
前記バリアントリステリア属が、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンを含み、前記バリアントリステリア属が、リボフラビンを合成し、ＭＡＩＴ細胞の増殖を刺激する、請求項２６に記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属。
【請求項28】
前記バリアントリステリア属が、異種のｒｉｂＤ及びｒｉｂＡ遺伝子を含む、請求項２６に記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属。
【請求項29】
前記バリアントが、少なくとも１つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含むように遺伝子改変されている、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属。
【請求項30】
前記異種核酸が、前記細菌のゲノムに組み込まれている、請求項２９に記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属細菌。
【請求項31】
前記少なくとも１つの異種遺伝子産物が、抗原を含む、請求項２９または請求項３０に記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属細菌。
【請求項32】
前記抗原が、がん関連抗原である、請求項３１に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項33】
前記少なくとも１つの異種遺伝子産物が、キメラ抗原受容体を含む、請求項２９または請求項３０に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項34】
前記細菌に弱毒化表現型を付与する１つ以上のさらなる変異、及び／または増殖優位性をもたらす１つ以上のさらなる変異をさらに含む、請求項２６～３３のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項35】
前記弱毒化表現型を付与する１つ以上のさらなる変異が、ａｃｔＡ及びｉｎｌＢから選択される遺伝子の変異を含み、前記増殖優位性をもたらす１つ以上のさらなる変異が、ｅｅｔＢ遺伝子の変異を含む、請求項３４に記載のバリアントリステリア属細菌。
【請求項36】
請求項２６～３５のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属を含む、組成物。
【請求項37】
個体における粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）細胞の数及び活性化状態を増大させる方法であって、前記個体に、請求項２６～３５のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項38】
個体におけるがんの治療方法であって、前記個体に、請求項２６～３５のいずれか１項に記載のバリアントリステリア属の有効量を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２２年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／３０４，２３５号の利益を主張するものであり、当該出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２２年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／３０４，２３５号の利益を主張するものであり、当該出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0002】
合衆国政府の支援による研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により付与された認可番号ＡＩ０２７６５５及び認可番号ＡＩ０６３３０２の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により付与された認可番号ＡＩ０２７６５５及び認可番号ＡＩ０６３３０２の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
序論
リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、免疫不全の個体及び妊娠中の女性における重篤な感染症の原因であるグラム陽性の食品媒介性のヒト及び動物病原体である。ヒトにおける重度のＬ．モノサイトジェネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）感染症は、髄膜炎、髄膜脳炎、敗血症、及び胎児死亡を特徴とする。Ｌ．モノサイトジェネスは、自然界に偏在している上、多種多様な温血動物から単離され得る。
リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、免疫不全の個体及び妊娠中の女性における重篤な感染症の原因であるグラム陽性の食品媒介性のヒト及び動物病原体である。ヒトにおける重度のＬ．モノサイトジェネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）感染症は、髄膜炎、髄膜脳炎、敗血症、及び胎児死亡を特徴とする。Ｌ．モノサイトジェネスは、自然界に偏在している上、多種多様な温血動物から単離され得る。
【0004】
Ｌ．モノサイトジェネスは、動物に接種されると主に細胞性免疫応答を誘発する。したがって、Ｌ．モノサイトジェネスは、感染及び免疫の多くの側面を研究するための実験モデルとして広く使用されている。重要なことに、致死未満量のＬ．モノサイトジェネスをマウスに感染させることにより、長期の細胞性免疫（ＣＭＩ）が誘導される。前臨床試験では、Ｌ．モノサイトジェネスの弱毒化株は、組み換えワクチンベクターとしての途方もない可能性を示している。弱毒化組み換え株は、がん免疫療法のための治療用ワクチンとして臨床効果を示している。
【0005】
多くの既知の原核生物は、ｒｉｂＣ（または生物によってはｒｉｂＦ）遺伝子によってコードされ、リボフラビンキナーゼ／ＦＡＤシンテターゼ（ＦＡＤＳ）と呼ばれる単一の二機能性酵素に依存して、リボフラビン（ＲＦ）を最初にフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）に変換し、その後、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）に変換する。リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）は、遺伝子ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦによってコードされる２つの別個の酵素を有する。
【発明の概要】
【0006】
概要
本開示は、機能性ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子を欠くバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、該バリアントリステリア属細菌を、例えば、ベクター、ワクチン、及び治療薬として作製及び使用する方法である。本開示は、インビボで粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞リガンドの産生をもたらすバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、例えば、個体におけるＭＡＩＴ細胞を刺激する及びその数を増大させるための、バリアントリステリア属細菌を作製及び使用する方法である。
本開示は、機能性ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子を欠くバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、該バリアントリステリア属細菌を、例えば、ベクター、ワクチン、及び治療薬として作製及び使用する方法である。本開示は、インビボで粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞リガンドの産生をもたらすバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、例えば、個体におけるＭＡＩＴ細胞を刺激する及びその数を増大させるための、バリアントリステリア属細菌を作製及び使用する方法である。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】図１Ａ～１Ｄ。図１Ａは、リボフラビン、ＦＭＮ、及びＦＡＤの構造を示す。図１Ｂは、富栄養型培地で増殖させたＬ．モノサイトジェネス株のブロス増殖曲線を示す。図１Ｃ～１Ｄは、１ｘ１０５ＣＦＵの各株を静脈内感染させた４８時間後のマウスの脾臓（Ｃ）及び肝臓（Ｄ）におけるＬ．モノサイトジェネス株のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。
【図2】図２Ａ～２Ｂ。図２Ａは、フラビンを欠く既知組成培地で増殖させたＬ．モノサイトジェネス株のブロス増殖曲線を示す。図２Ｂは、３７℃で振とうしながら２４時間増殖させた後の野生型（左）及びΔｒｉｂＵ＋ｒｉｂＤＥＡＨＴ株（右）の培地上清の画像を示す。
【図3】図３Ａ～３Ｄ。図３Ａは、感染した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）においてオートファジー受容体ｐ６２と共局在したＬ．モノサイトジェネス株のパーセンテージを示す。図３Ｂ～Ｃは、ＢＭＭにおけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。（Ｂ）は、野生型ＢＭＭにおける示されたＬ．モノサイトジェネス株の成長曲線を示す。（Ｃ）は、感染の直前に１μＭのリボフラビンを補給した、リボフラビンを（３時間）与えない野生型ＢＭＭにおける示されたフラビン飢餓Ｌ．モノサイトジェネス株の成長曲線を示す。図３Ｄは、リボフラビンが十分なＢＭＭ及びリボフラビンを与えないＢＭＭにおいて細胞内で増殖するＬ．モノサイトジェネス株の２～５時間の間の世代時間を示す。
【図4】図４Ａ～４Ｆ。図４Ａ～Ｃは、ＢＭＭにおけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。（Ａ）は、野生型ＢＭＭにおける示されたＬ．モノサイトジェネス株の成長曲線を示す。（Ｂ）は、感染の過程で過剰の（１０μＭ）のリボフラビンを含む細胞培地でインキュベートした野生型ＢＭＭにおける示されたＬ．モノサイトジェネス株の成長曲線を示す。（Ｃ）は、リボフラビン欠乏野生型ＢＭＭにおける示されたフラビン欠乏Ｌ．モノサイトジェネスの成長曲線を示す。図４Ｄ～Ｅは、特定のＬ．モノサイトジェネス株に感染させた野生型（Ｄ）またはＡＩＭ２ ＫＯ（Ｅ）ＢＭＭの細胞死を示す。図４Ｆは、ＡＩＭ２ ＫＯ ＢＭＭにおける示されたＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。
【図5】図５Ａ～５Ｆ。図５Ａ～Ｃは、異なるフラビン源を含む既知組成の合成培地で増殖させたＬ．モノサイトジェネス株のブロス増殖曲線を示す。（Ａ）は、リボフラビン、ＦＭＮ、またはＦＡＤを唯一のフラビン源として含む培地で増殖させた野生型Ｌ．モノサイトジェネスの増殖曲線を示す。（Ｂ）は、リボフラビン、ＦＭＮ、またはＦＡＤを唯一のフラビン源として含む培地で増殖させたΔｒｉｂＵ変異Ｌ．モノサイトジェネス株の増殖曲線を示す。（Ｃ）は、リボフラビンを含む培地で増殖させた示されたＬ．モノサイトジェネス株の増殖曲線を示す。図５Ｄは、マウスＢＭＭにおけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。図５Ｅ～５Ｆは、１ｘ１０５ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させたＣＤ－１マウスの感染の４８時間後の脾臓（Ｃ）及び肝臓（Ｄ）における細菌量を示す。
【図6】図６Ａ～６Ｃ。図６Ａは、脱繊維素ヒツジ血中でのＬ．モノサイトジェネス株のインビトロ増殖を示す。図６Ｂは、１ｘ１０５ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させたＣＤ－１マウスの感染の４８時間後の胆嚢における細菌量を示す。図６Ｃは、１ｘ１０８ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を経口感染させたＣＤ－１マウスの胃腸管における細菌量を示す。
【図7】示されたｐＨｙｐｅｒ（構成的プロモーター）及びｐＮａｔｉｖｅ（誘導性、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の天然プロモーター）の両方とともに、Ｌ．モノサイトジェネス染色体に導入されたリボフラビンオペロンの図である。
【図8】マウスＢＭＭにおけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。
【図9】１ｘ１０３ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させたＢ６マウスの感染の９６時間後の脾臓及び肝臓における細菌量を示す。
【図12】野生型マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）におけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。
【図13】様々なＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させたＣＤ－１マウスの感染の４７時間後の脾臓及び肝臓における細菌量を示す。
【図14】脱繊維素ヒツジ血中でのＬ．モノサイトジェネスのΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ、ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ、及びΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ＋ｅｅｔＢ：：ｔｎ株の成長を示す。
【図15】Ｌ．モノサイトジェネスのΔａｃｔＡ及びΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異株によるワクチン接種の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
詳細な説明
本開示は、機能性ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子を欠くバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、該バリアントリステリア属細菌を、例えば、ベクター、ワクチン、及び治療薬として作製及び使用する方法である。本開示は、インビボで粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞リガンドの産生をもたらすバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、例えば、個体におけるＭＡＩＴ細胞を刺激する及びその数を増大させるための、バリアントリステリア属細菌を作製及び使用する方法である。
本開示は、機能性ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子を欠くバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、該バリアントリステリア属細菌を、例えば、ベクター、ワクチン、及び治療薬として作製及び使用する方法である。本開示は、インビボで粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞リガンドの産生をもたらすバリアントリステリア属細菌を提供する。さらに提供するのは、例えば、個体におけるＭＡＩＴ細胞を刺激する及びその数を増大させるための、バリアントリステリア属細菌を作製及び使用する方法である。
【0009】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを目的とするものではないことも理解されるべきである。
【0010】
ある範囲の値が提供される場合、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、その範囲の上下限、及び、その述べられた範囲内の任意の他の述べられた値または介在値の間の各介在値は、その下限の単位の１０分の１まで本発明に包含されることが理解されるべきである。これらのより小さい範囲の上下限は、述べられた範囲内の任意の具体的に除外された限定を有することを条件として、独立してより小さな範囲に含まれ得、本発明にも包含される。述べられた範囲が上下限の一方または両方を含む場合、それらの含まれた上下限のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【0011】
別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法及び材料もまた、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれ、方法及び／または材料を当該刊行物が引用されているものに関連して開示及び記載する。
【0012】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。したがって、例えば、「バリアントリステリア属細菌（ａ ｖａｒｉａｎｔ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」への言及は、複数のかかるバリアントリステリア属細菌を含み、「免疫原性組成物（ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及は、１つ以上の免疫原性組成物及び当業者に既知のその均等物への言及を含む、等である。さらに、特許請求の範囲は、いかなる任意の要素も除外するように起草され得ることが留意される。したがって、本記述は、クレーム要素の列挙と関連した「唯一」、「のみ」等の排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用の先行詞としての役割を果たすことが意図される。
【0013】
明確にするために別個の実施形態の文脈で記載される本発明のある特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。反対に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載される本発明の様々な特徴はまた、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションで提供され得る。本発明に関する実施形態のすべての組み合わせは、本発明に具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたものとして、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素のすべてのサブコンビネーションもまた、本発明に具体的に包含され、ありとあらゆるかかるサブコンビネーションが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたものとして、本明細書に開示される。
【0014】
本明細書において論じられている刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみが提供されている。本明細書中のいかなるものも、先行発明のために、本発明がかかる刊行物に先行する権利がないということの承認として解釈されるべきではない。さらに、提示される公開日が、実際の公開日と異なる場合もあり、それは、個別に確認する必要がある場合がある。
【0015】
ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な遺伝子に変異を含むバリアントリステリア属細菌
本開示は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）生合成に必要な遺伝子の変異を含むバリアントリステリア属細菌を提供し、該バリアントリステリア属は、インビボで条件的偏性細胞内細菌である（すなわち、哺乳類においては細胞外で増殖することができない）。該バリアントリステリア属は、ＦＭＮ及びＦＡＤが補給された培地中でインビトロで増殖（培養）することができるが、インビボ（例えば、哺乳動物内）では細胞外で増殖することはできない。本開示のバリアントリステリア属は、増殖するためにフラビンモノヌクレオチド及びフラビンアデニンジヌクレオチドの補給を必要とし、ひいては、インビボの場合（例えば、哺乳類または他の動物宿主内の場合）、条件的偏性細胞内細菌である。
本開示は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）生合成に必要な遺伝子の変異を含むバリアントリステリア属細菌を提供し、該バリアントリステリア属は、インビボで条件的偏性細胞内細菌である（すなわち、哺乳類においては細胞外で増殖することができない）。該バリアントリステリア属は、ＦＭＮ及びＦＡＤが補給された培地中でインビトロで増殖（培養）することができるが、インビボ（例えば、哺乳動物内）では細胞外で増殖することはできない。本開示のバリアントリステリア属は、増殖するためにフラビンモノヌクレオチド及びフラビンアデニンジヌクレオチドの補給を必要とし、ひいては、インビボの場合（例えば、哺乳類または他の動物宿主内の場合）、条件的偏性細胞内細菌である。
【0016】
ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な遺伝子としては、ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦが挙げられる。本開示は、機能性ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子を欠くバリアントリステリア属細菌を提供する。バリアントリステリア属細菌は、ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子が機能しないように親リステリア属細胞を遺伝子改変することによって生成され得る。非機能性遺伝子は、完全に欠失した遺伝子；５％～９５％欠失した（すなわち、対応する野生型遺伝子と比較して、ヌクレオチドの５％～９５％が欠失した）遺伝子；対応する野生型遺伝子と比較して、１つ以上のヌクレオチド（例えば、１～１０、１０～１００、または１００を超えるヌクレオチド）の挿入を有する遺伝子であって、該１つ以上のヌクレオチドの挿入により、該遺伝子が機能しなくなる、遺伝子、等であり得る。場合によっては、本開示のバリアントリステリア属を生成するために、５％～１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～１００％）のｒｉｂＣ遺伝子及び／またはｒｉｂＦ遺伝子が削除される。
【0017】
場合によっては、本開示のバリアントリステリア属細菌は、ΔｒｉｂＣ／ΔｒｉｂＦ細菌であり、例えば、ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子が削除される。ＲｉｂＣは、リボフラビンからＦＭＮへのリン酸化及びＦＡＤを形成するためのＦＭＮのアデニリル化を触媒する二機能性酵素である。ＲｉｂＦもまた、アデニリル化によってＦＭＮをＦＡＤに変換する。
【0018】
本開示のバリアントリステリア属細菌を生成するために使用されるリステリア属細胞（例えば、親リステリア属細胞）は、いくつかの異なるリステリア属種のいずれか１つでよく、通常、リボフラビン要求性株である。目的のリステリア属種としては、Ｌ．フレイシュマンニ（Ｌ．ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎｉｉ）、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）、Ｌ．イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）、Ｌ．マルスイ（Ｌ．ｍａｒｔｈｉｉ）、Ｌ．モノサイトジェネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌ．ルコウルティアエ（Ｌ．ｒｏｃｏｕｒｔｉａｅ）、Ｌ．シーリゲリ（Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、Ｌ．ウェイヘンステファネンシス（Ｌ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）、及びＬ．ウェルシメリ（Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、Ｌ．モノサイトジェネス以外のリステリア属株も宿主細胞であり得る。ある特定の場合には、該リステリア属株は、Ｌ．モノサイトジェネスである。
【0019】
場合によっては、該リステリア属宿主細胞は弱毒化される。「弱毒化」及び「弱毒化された」は、病原性を低下させるように改変されたリステリア属宿主細胞を包含する。該宿主は、ヒトもしくは動物宿主、または器官、組織、もしくは細胞であり得る。非限定的な例を挙げると、該リステリア属宿主細胞は、宿主細胞（例えば、ヒトもしくは非ヒト動物細胞、例えば、ヒトもしくは非ヒト哺乳類細胞）への結合を低減するため、１つの宿主細胞から別の宿主細胞への拡散を低減するため、細胞外増殖を低減するため、または宿主細胞での細胞内増殖を低減するために弱毒化され得る。弱毒化は、例えば、病原性の指標、ＬＤ５０、器官からのクリアランス率、または競争指標を測定することによって評価され得る（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：５９５３－５９５７参照）。一般に、弱毒化により、ＬＤ５０（致死量、５０％、特定の試験期間後に試験された集団のメンバーの半数を死滅させるために必要な用量（細菌数））の増加及び／またはクリアランス率の増加が、少なくとも２５％、より一般的には、少なくとも５０％、最も一般的には、少なくとも１００％（２倍）、標準的には、少なくとも５倍、さらに標準的には、少なくとも１０倍、最も標準的には、少なくとも５０倍、多くの場合、少なくとも１００倍、さらに多くの場合、少なくとも５００倍、最も多くの場合、少なくとも１０００倍、通常は、少なくとも５０００倍、より通常は、少なくとも１０，０００倍、最も通常は、少なくとも５０，０００倍、及び最も多くの場合、少なくとも１００，０００倍もたらされる。弱毒化はまた、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を測定することによっても評価され得る。
【0020】
ある特定の実施形態では、本開示による弱毒化リステリア属は、Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ａｓｓａｙ Ｔｏ Ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ａｃｔＡ Ｍｕｔａｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ，”Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００１，ｐ．５９５３－５９５７，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．９に記載の競合指標アッセイにおいて、対応する野生型株と比較して、病原性の低下を示すものである。本アッセイでは、マウスに試験及び参照、例えば、野生型細菌株を接種する。ある期間後、例えば４８～６０時間後、接種したマウスをサクリファイスし、１つ以上の器官、例えば、肝臓、脾臓の細菌の存在量を評価する。これらの実施形態では、所与の細菌株は、脾臓におけるその存在量が、対応する野生型株で観察されるものの少なくとも約１／５０以上、例えば、１／７０以上少ない場合、及び／または肝臓におけるその存在量が、対応する野生型株で観察されるものの少なくとも約１／１０以上少ない、例えば、１／２０以上少ない場合に、病原性が低いと見なされる。
【0021】
さらに他の実施形態では、細菌は、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ．（１９９４ｂ）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３６：４６３－４６７に記載のアッセイを使用して測定される、約８時間未満、例えば、約４時間未満を含め、約６時間未満の複製の失敗を示す場合、病原性が低いと見なされる。さらに他の実施形態では、細菌は、野生型と比較して、米国特許第７，７９４，７２８号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）で採用されているプラークアッセイにおいてより小さなプラークを形成する場合、弱毒化されたまたは病原性が低いと見なされる。該アッセイでは、細胞、例えば、マウスＬ２細胞を、例えば、６ウェル組織培養ディッシュにて、コンフルエンシーまで増殖させ、その後細菌に感染させる。その後、ゲンタマイシンを含むＤＭＥ寒天を加え、プラークをある期間、例えば３日間増殖させる。その後、例えば、ニュートラルレッド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含む追加のＤＭＥ寒天オーバーレイを添加することによって、生細胞を可視化し、終夜インキュベートする。かかるアッセイでは、野生型と比較して弱毒化変異体で観察されるプラークサイズの減少の程度は、ある特定の実施形態では、１０％であり、１５％が含まれ、例えば、２５％以上である。
【0022】
弱毒化細菌は、弱毒化表現型を付与する１つ以上の異なる変異を含んでよく、目的の変異としては、例えば、米国特許第７，７９４，７２８号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のｈｌｙ変異及び／またはｌｐｌＡ変異、例えば、Ｄｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１２）１８：８５８－８６８に報告されているａｃｔＡ及び／またはインターナリンＢ（ＩｎｌＢ）変異等が挙げられる。したがって、場合によっては、本開示のバリアントリステリア属は、ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子が機能しないようにする変異（例えば、ｒｉｂＣ及びｒｉｂＦ遺伝子のすべてまたは一部の削除によって）に加えて、ａｃｔＡ（ａｃｔｉｎｇ ａｓｓｅｍｂｌｙ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡｃｔＡをコードする）及び／またはｉｎｌＢ（インターナリンＢをコードする）の変異を含む。場合によっては、本開示のバリアントリステリア属は、ａ）ｒｉｂＣのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｒｉｂＣ遺伝子が機能しなくなる）を含み、ｂ）ｒｉｂＦのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｒｉｂＦ遺伝子が機能しなくなる）、ｃ）ａｃｔＡのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりａｃｔＡ遺伝子が機能しなくなる）、及びｄ）ｉｎｌＢのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｉｎｌＢ遺伝子が機能しなくなる）を含む。
【0023】
本開示のバリアントリステリア属細菌は、上記のｒｉｂＣ／ｒｉｂＦの改変に加えて、ｅｅｔＢ遺伝子のすべてまたは一部の欠失を含み得る。ｅｅｔＢ遺伝子のすべてまたは一部を削除することにより、増殖上の利点がもたらされ得る。場合によっては、かかるバリアント株は、ｒｉｂＣ／ｒｉｂＦの改変を含み、ｅｅｔＢ遺伝子の欠失がないリステリア属細菌のインビトロでのブロス中での増殖率と比較して、該ブロス中での増殖率の増加を示す。場合によっては、本開示のバリアントリステリア属は、ａ）ｒｉｂＣのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｒｉｂＣ遺伝子が機能しなくなる）、ｂ）ｒｉｂＦのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｒｉｂＦ遺伝子が機能しなくなる）、及びｃ）ｅｅｔＢのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｅｅｔＢ遺伝子が機能しなくなる）を含む。場合によっては、本開示のバリアントリステリア属は、ａ）ｒｉｂＣのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｒｉｂＣ遺伝子が機能しなくなる）、ｂ）ｒｉｂＦのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｒｉｂＦ遺伝子が機能しなくなる）、ｃ）ａｃｔＡのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりａｃｔＡ遺伝子が機能しなくなる）、ｄ）ｉｎｌＢのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｉｎｌＢ遺伝子が機能しなくなる）、及びｅ）ｅｅｔＢのすべてまたは一部の欠失（この欠失によりｅｅｔＢ遺伝子が機能しなくなる）を含む。
【0024】
本開示のバリアントリステリア属細菌は、上記のｒｉｂＣ／ｒｉｂＦの改変に加えて１つ以上の遺伝子改変を含んでもよく、該１つ以上のさらなる改変は、宿主細胞において望ましい性質、例えば、弱毒化、免疫原性の向上等を提供する。かかるさらなる改変の例としては、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ ２０１４／１０６１２３号、同第ＷＯ ２０１４／０７４６３５号、同第ＷＯ ２００９／１４３０８５号、同第ＷＯ ２００８０２７５６０号、同第ＷＯ ２００８０６６７７４号、同第ＷＯ ２００７１１７３７１号、同第ＷＯ ２００７１０３２２５号、同第ＷＯ ２００５０７１０８８号、同第ＷＯ ２００３１０２１６８号、同第ＷＯ ２００３／０９２６００号、同第ＷＯ／２０００／００９７３３号、及び同第ＷＯ １９９９／０２５３７６号に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない。これらの出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0025】
本開示のバリアントリステリア属細菌は、上記のｒｉｂＣ／ｒｉｂＦの改変に加えて、Ｌｍ－ＲＩＩＤ（Ｌ．モノサイトジェネスリコンビナーゼ誘導細胞内死）変異を含み得る。例えば、ＵＳＰＮ９，５１１，１２９を参照されたい。
【0026】
該細菌は、生きている場合もあれば、死滅しているが代謝的に活性な（「ＫＢＭＡ」）場合もある。ＫＢＭＡワクチン株は、ＤＮＡ修復遺伝子、例えば、ｕｖｒＡ及びｕｖｒＢの削除を介してヌクレオチド除去修復の能力を破棄することによって構築される。該遺伝子の削除により、該細菌は、ソラレンとＵＶＡの併用処理を介した光化学的不活性化に弱くなる。形成されたソラレン誘導性のＤＮＡ架橋を修復することができないため、ＫＢＭＡ細菌株は、複製することができず、したがって、機能的に非感染性である。この特性により、生弱毒化株と比較して安全性プロファイルが改善される。しかしながら、架橋の数は非常に限られており、抗原の発現を含めたそれらの代謝活性、ひいてはそれらの免疫能が維持される。ＫＢＭＡワクチン株については、米国特許第７，８３３，７７５号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0027】
ある特定の例では、本開示のバリアントリステリア属細菌は、異種抗原を発現する。該異種抗原は、ある特定の実施形態では、該異種抗原が由来する感染性因子による抗原投与から動物を保護することができるもの、または宿主生物にとって有益に、腫瘍の増殖及び転移に影響を与えることができるものである。したがって、異種抗原をコードするＤＮＡによって本開示のリステリア属株に導入され得る異種抗原は、リステリア属によって発現された場合に、応答が誘導される宿主にとって有益である細胞性免疫応答を誘発するのに役立つ任意の抗原を含む。したがって、異種抗原としては、感染性因子によって特定されるものが挙げられ、該抗原に対する免疫応答が、該因子によって引き起こされる疾患を予防または治療する役割を果たす。かかる異種抗原としては、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物の表面タンパク質及び任意の他のタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質等が挙げられるがこれらに限定されない。異種抗原には、腫瘍抗原が含まれる。異種抗原としては、該異種抗原を発現する腫瘍をもたらすリスクがある、またはそれを有すると診断される宿主生物に利益をもたらすものも挙げられる。該宿主生物は、哺乳類、例えば、ヒトであり得る。
【0028】
本明細書で使用される、「異種抗原」という用語は、リステリア属で通常発現されないタンパク質もしくはペプチド、糖タンパク質もしくは糖ペプチド、リポタンパク質もしくはリポペプチド、または任意の他の高分子を意味し、実質的には、感染性因子、腫瘍細胞または腫瘍関連タンパク質における同じ抗原に対応する。該異種抗原は、本開示によるリステリア属株によって発現され、該株による哺乳類細胞の感染後に、プロセッシングされ、細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。リステリア属種によって発現される異種抗原は、哺乳類で自然に発現される未改変の抗原またはタンパク質を認識するＴ細胞応答をもたらす限り、腫瘍細胞または感染性因子内の対応する未改変の抗原またはタンパク質と正確に一致する必要はない。他の例では、該腫瘍細胞抗原は、哺乳類において自然に発現されるものの変異型であってもよく、リステリア属種によって発現される抗原は、その腫瘍細胞変異抗原に適合する。本明細書で使用される、「腫瘍関連抗原」という用語は、宿主生物における腫瘍の増殖または転移に影響を与える抗原を意味する。該腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞によって発現される抗原の場合もあれば、非腫瘍細胞によって発現されるが、そのように発現された際に、腫瘍細胞の増殖または転移を促進する抗原の場合もある。腫瘍抗原及び腫瘍関連抗原をコードするＤＮＡを組み込むことによってリステリア属に導入され得る該腫瘍抗原及び腫瘍関連抗原のタイプとしては、あらゆる既知の、またはこれまで知られていなかった腫瘍抗原が挙げられる。他の例では、該「腫瘍関連抗原」は、腫瘍の増殖にも転移にも影響を与えないが、該腫瘍が由来する組織（及び腫瘍）で特異的に発現することから、リステリア属ワクチンの成分として使用される。さらに他の例では、該「腫瘍関連抗原」は、腫瘍の増殖にも転移にも影響を与えないが、該腫瘍細胞で選択的に発現され、任意の他の正常組織では発現されないことから、リステリア属ワクチンの成分として使用される。
【0029】
ワクチン開発において有用な異種抗原は、当業者に入手可能な知識を使用して選択されてもよく、腫瘍細胞によって発現される、または腫瘍の増殖もしくは転移に影響を与える、または感染性因子によって発現される多くの抗原性タンパク質が現在知られている。例えば、異種抗原として有用であると見なされ得るウイルス抗原としては、インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）及びＨＩＶのｇａｇタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。他の異種抗原としては、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質またはその構成部分ｇｐ１２０及びｇｐ４１、ＨＩＶのｎｅｆタンパク質、ならびにＨＩＶのｐｏｌタンパク質、逆転写酵素及びプロテアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。さらに他の異種抗原は、Ｅ１及びＥ２糖タンパク質、ならびに非構造（ＮＳ）タンパク質、例えば、ＮＳ３が挙げられるがこれらに限定されない、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関連するものであり得る。さらに、他のウイルス抗原、例えば、ヘルペスウイルスタンパク質も有用であり得る。該異種抗原は、ウイルス起源のものであることに限定される必要はない。寄生生物抗原、例えば、マラリア抗原等が含まれ、真菌抗原、細菌抗原、及び腫瘍抗原も含まれる。
【0030】
本明細書に記載の通り、腫瘍細胞によって発現されるいくつかのタンパク質も既知であり、本発明のワクチン株に挿入され得る異種抗原として目的のものである。これらとしては、白血病におけるｂｃｒ／ａｂｌ抗原、子宮頸癌に関連する発がん性ウイルスのＨＰＶＥ６及びＥ７抗原、黒色腫におけるまたはそれに関連するＭＡＧＥ１及びＭＺ２－Ｅ抗原、ならびに乳癌におけるまたはそれに関連するＭＶＣ－１及びＨＥＲ－２抗原が挙げられるがこれらに限定されない。適切な異種抗原としては、がん関連抗原、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体、ガングリオシド抗原ＧＤ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、カッパ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ｖＩＩＩポリペプチド等が挙げられる。他の目的のコード配列としては、共刺激分子、免疫調節性分子等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0031】
本明細書に記載の細菌は、様々な異なるプロトコルを使用して生成され得る。したがって、該対象弱毒化細菌の生成は、欠失突然変異誘発、挿入突然変異誘発、点変異、フレームシフト変異の生成をもたらす突然変異誘発、タンパク質の未成熟末端をもたらす変異、及び遺伝子発現に影響を与える調節配列の変異を含めた当業者に周知のいくつかの方法で達成され得る。突然変異誘発は、組み換えＤＮＡ技術を使用して、または変異原性の化学物質もしくは放射線を使用し、その後変異体を選択する従来の突然変異誘発技術を使用して達成され得る。本発明にしたがって細菌を生成する様々な方法の代表的なプロトコルを、以下の実験セクションで提供する。
【0032】
異種抗原をコードするＤＮＡのリステリア属株への導入は、例えば、異種抗原をコードするＤＮＡが、ベクター、例えば、プラスミド等に担持された組み換えリステリア属の創出によって達成されてもよく、該プラスミドは、該リステリア属種において維持及び発現され、その抗原発現は、原核生物のプロモーター／調節配列の制御下にある。代替的に、該異種抗原をコードするＤＮＡは、例えば、トランスポゾン突然変異誘発、相同組み換え、またはインテグラーゼ媒介性部位特異的組み込み（その開示が参照により本明細書に組み込まれる出願第１０／１３６，８６０号に記載の通り）を使用することによってリステリア属染色体に安定に組み込まれ得る。
【0033】
本開示を与えられた後の当業者には理解されるように、リステリア属種において異種抗原を発現させるためにいくつかのアプローチが使用され得る。ある特定の実施形態では、異種抗原をコードする遺伝子は、該細菌からの異種抗原の分泌を促進するように、またはリステリア属細胞表面での該異種抗原の発現を促進するように設計される。
【0034】
ある特定の実施形態では、所望の異種抗原及びリステリア属の分泌されたまたは細胞表面タンパク質を含む融合タンパク質が使用される。かかる融合タンパク質の適切な成分であるリステリア属タンパク質としては、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）及びホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ（ＰＩ－ＰＬＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。融合タンパク質は、両方の遺伝子が互いにインフレームであるように、所望の融合タンパク質の成分の各々をコードする遺伝子をライゲートすることによって生成され得る。したがって、ライゲートされた遺伝子の発現により、異種抗原とリステリア属タンパク質の両方を含むタンパク質が得られる。ライゲートされた遺伝子の発現は、該遺伝子の発現が該生物の増殖及び複製中にもたらされるように、リステリア属プロモーター／調節配列の転写制御下に置かれ得る。該融合タンパク質の細胞表面発現及び／または分泌のためのシグナル配列はまた、該融合タンパク質の細胞表面発現及び／または分泌をもたらすために、異種抗原をコードする遺伝子に付加され得る。該異種抗原が単独で（すなわち、融合されたリステリア属配列の非存在下で）使用される場合、該異種抗原の細胞表面発現及び／または分泌のためにシグナル配列をそれに融合することが有利な場合がある。これを達成するための手順は、細菌学及び分子生物学の技術分野で周知である。
【0035】
発現される異種抗原をコードするＤＮＡには、いくつかの実施形態では、かかる発現を促進するために適切なプロモーターが先行する。使用される適切なプロモーター／調節配列及びシグナル配列は、該融合タンパク質において所望されるリステリア属タンパク質のタイプに依存し、リステリア属分子生物学の当業者には容易に分かるであろう。例えば、融合タンパク質の発現を導くために使用され得るＬ．モノサイトジェネスのプロモーター／調節配列及び／またはシグナル配列としては、ＬＬＯをコードするリステリア属のｈｌｙ遺伝子、リステリア属のｐ６０（ｉａｐ）遺伝子、及びＬ．モノサイトジェネスのアクチン集合に必要な表面タンパク質をコードするリステリア属のａｃｔＡ遺伝子に由来する配列が挙げられるがこれらに限定されない。他の目的のプロモーター配列としては、ＰＩ－ＰＬＣをコードするｐｌｃＡ遺伝子、メタロプロテアーゼをコードするリステリア属のｍｐｌ遺伝子、及びリステリア属の膜タンパク質であるインターナリンをコードするリステリア属のｉｎｌＡ遺伝子が挙げられる。該異種調節エレメント、例えば、ファージに由来するプロモーター及び他の細菌種に由来するプロモーターまたはシグナル配列が、該リステリア属種による異種抗原の発現に使用され得る。別の適切なプロモーターは、構成的ＨｙＰｅｒプロモーターであり、例えば、Ｒｅｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００５７４１を参照されたい。
【0036】
ある特定の実施形態では、該弱毒化リステリア属は、ベクターを含む。該ベクターは、異種抗原をコードするＤＮＡを含み得る。場合によっては、該ベクターは、リステリア属内で複製が可能なプラスミドである。該ベクターは、異種抗原をコードしてもよく、該抗原の発現は、真核生物のプロモーター／調節配列の制御下にあり、例えば、発現カセットに存在する。目的のものである適切なプロモーターを有する典型的なプラスミドとしては、ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーター／エンハンサー領域を含むｐＣＭＶベータ、及びＳＶ４０初期プロモーター領域またはマウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター領域を含むものが挙げられるがこれらに限定されない。
【0037】
したがって、ある特定の実施形態では、該対象細菌は、上記の異種ポリペプチド／タンパク質の少なくとも１つのコード配列を含む。場合によっては、該コード配列は、イントロンを欠くものであり、例えば、染色体配列から産生され得るｃＤＮＡ配列と同じ配列を有する連続オープンリーディングフレームである。いくつかの実施形態では、このコード配列は、発現カセットの一部であり、該発現カセットは、該リステリア属細胞において該コード配列の発現をもたらし、そのために該ベクターが設計される。本明細書で使用される、「発現カセット」という用語は、少なくとも１つの所望のコード配列及び作動可能に連結された該コード配列の特定の宿主生物、すなわち、該ベクターが設計されるリステリア属細胞内での発現に必要な適切な核酸配列、例えば、上で特定したプロモーター／調節／シグナル配列を含む組み換えＤＮＡ分子から構成される発現モジュールまたは発現構築物を指し、該発現カセットは、２つ以上の異なるポリペプチドのコード配列、または同じコード配列の複数のコピーを所望の通りに含み得る。したがって、該コード産物のサイズは、大幅に変動する場合があり、広範囲の異なる産物が、本実施形態のベクターに存在する発現カセットによってコードされ得る。
【0038】
上述のように、該ベクターは、少なくとも１つのコード配列を含んでよく、ある特定の実施形態では、該ベクターは、２つ以上のコード配列を含み、該コード配列は、同時に作用して所望の結果を提供する産物をコードし得る。一般に、該コード配列は、いくつかの異なる産物のいずれをコードしてもよく、様々な異なるサイズのものであってもよく、上記の考察は、代表的な目的のコード配列を提供するにすぎない。
【0039】
バリアントリステリア属を含む組成物
本開示は、本開示のバリアントリステリア属（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えば、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）を含む組成物を提供する。本開示の組成物は、本開示のバリアントリステリア属に加えて、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等）、緩衝剤等のうちの１つ以上を含み得る。場合によっては、本開示の組成物は、本開示のバリアントリステリア属に加えて、生理食塩水を含む。場合によっては、本開示の組成物はさらに、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。多重特異性抗体は、場合によっては、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体である。多重特異性抗体は、がん関連抗原に特異的な第一の抗原結合部位及びＴ細胞（例えば、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、γ／δＴ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）に特異的な第二の抗原結合部位を含み得る。
本開示は、本開示のバリアントリステリア属（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えば、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）を含む組成物を提供する。本開示の組成物は、本開示のバリアントリステリア属に加えて、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等）、緩衝剤等のうちの１つ以上を含み得る。場合によっては、本開示の組成物は、本開示のバリアントリステリア属に加えて、生理食塩水を含む。場合によっては、本開示の組成物はさらに、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。多重特異性抗体は、場合によっては、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体である。多重特異性抗体は、がん関連抗原に特異的な第一の抗原結合部位及びＴ細胞（例えば、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、γ／δＴ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）に特異的な第二の抗原結合部位を含み得る。
【0040】
本開示は、本開示のバリアントリステリア属を含む免疫原性組成物（本明細書では「ワクチン組成物」とも呼ばれる）を提供する。本開示の免疫原性組成物は、ａ）本開示のバリアントリステリア属、及びｂ）抗原を含み得る。適切な抗原としては、がん関連抗原、病原体関連抗原（例えば、ウイルス抗原、病原性動物抗原等）が挙げられるがこれらに限定されない。
【0041】
場合によっては、本開示のバリアントリステリア属（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えば、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）を含む組成物は、該バリアントリステリア属の単位用量を含む。該バリアントリステリア属の単位用量は、用量当たり１０４～１０１０個の細菌の範囲であり得る。例えば、場合によっては、本開示のバリアントリステリア属（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えば、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）の「有効量」は、単位用量当たり、１０４～５ｘ１０４、５ｘ１０４～１０５、１０５～５ｘ１０５、５ｘ１０５～１０６、１０６～５ｘ１０６、５ｘ１０６～１０７、１０７～５ｘ１０７、５ｘ１０７～１０８、１０８～１０９、または１０９～１０１０個の細菌の範囲である。本開示はさらに、バリアントリステリア属の単位用量を含むキットを提供する。
【0042】
有用性
上記の細菌（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えばΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）は、いくつかの異なる用途に使用される。該対象細菌の代表的な使用としては、（ａ）リステリア属種に対する抗体を生成するための免疫原、（ｂ）免疫化プロトコルにおけるアジュバント組成物、（ｃ）高分子、例えば、核酸またはタンパク質を標的細胞の細胞質に導入するためのベクター、及び（ｄ）例えば、宿主における細胞性免疫応答を誘発または増強するためのワクチン組成物が挙げられるがこれらに限定されない。ここで、これらの代表的な用途の各々を、以下に個別にさらに説明する。弱毒化リステリア属種の使用はまた、米国特許第８，６７９，４７６号、同第８，２７７，７９７号、同第８，１９２，９９１号、同第７，８４２，２８９号、同第７，７９４，７２８号、同第７，７４９，５１０号、同第７，４８８，４８７号、同第７，４２５，４４９号、同第６，５９９，５０２号、同第６，５０４，０２０号、同第６，２８７，５５６号、同第６，０９９，８４８号、同第６，００４，８１５号、同第５，８３０，７０２号、及び同第５，６４３，５９９号にも記載されている。これらの出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
上記の細菌（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えばΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）は、いくつかの異なる用途に使用される。該対象細菌の代表的な使用としては、（ａ）リステリア属種に対する抗体を生成するための免疫原、（ｂ）免疫化プロトコルにおけるアジュバント組成物、（ｃ）高分子、例えば、核酸またはタンパク質を標的細胞の細胞質に導入するためのベクター、及び（ｄ）例えば、宿主における細胞性免疫応答を誘発または増強するためのワクチン組成物が挙げられるがこれらに限定されない。ここで、これらの代表的な用途の各々を、以下に個別にさらに説明する。弱毒化リステリア属種の使用はまた、米国特許第８，６７９，４７６号、同第８，２７７，７９７号、同第８，１９２，９９１号、同第７，８４２，２８９号、同第７，７９４，７２８号、同第７，７４９，５１０号、同第７，４８８，４８７号、同第７，４２５，４４９号、同第６，５９９，５０２号、同第６，５０４，０２０号、同第６，２８７，５５６号、同第６，０９９，８４８号、同第６，００４，８１５号、同第５，８３０，７０２号、及び同第５，６４３，５９９号にも記載されている。これらの出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0043】
ワクチン
該対象細菌（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えばΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）は、ワクチン（本明細書では「免疫原性組成物」とも呼ばれる）として使用される。本開示のワクチンは、脊椎動物を、致死未満量の弱毒化リステリア属ワクチンと接触させることによって該脊椎動物に投与され、接触は通常、該ワクチンを該宿主に投与することを含む。いくつかの実施形態では、該細菌は、医薬的に許容される製剤で提供される。投与は、経口、非経口、鼻腔内、筋肉内、皮内、腹腔内、血管内、皮下、リンパ節の直接ワクチン接種、カテーテルによる投与、または様々な周知の投与経路のいずれか１つ以上であり得る。例えば、家畜において、該ワクチンは、飼料または液体（例えば、水）中に該ワクチンを組み込むことによって経口投与され得る。それは、凍結乾燥粉末として、凍結製剤として、もしくはカプセルの成分として、または該ワクチンの抗原性を維持する任意のその他の都合のよい医薬的に許容される製剤として供給され得る。いくつかの周知の医薬的に許容される希釈剤または賦形剤のうちのいずれか１つが、本発明のワクチンに使用され得る。適切な希釈剤としては、例えば、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液等が挙げられる。希釈剤の量は、当業者には認識されるように、大きく異なり得る。適切な賦形剤もまた当業者には周知であり、例えば、Ａ．Ｗａｄｅ ａｎｄ Ｐ．Ｊ．Ｗｅｌｌｅｒ，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎから選択され得る。投与される用量は、患者の年齢、健康状態、及び体重、患者のタイプ、ならびにもしあれば、併用療法の存在に依存し得る。該ワクチンは、経口投与のための剤形、例えば、カプセル、溶液、懸濁液、もしくはエリキシルで、または非経口、鼻腔内、筋肉内、もしくは血管内使用のための製剤、例えば、溶液もしくは懸濁液のための滅菌液体で使用され得る。本発明によれば、該ワクチンは、選択された生物もしくはウイルスの感染に対して、または腫瘍等に関して患者を免疫化する上で有用なワクチン組成物として、医薬的に許容される希釈剤と組み合わせて使用され得る。患者を免疫化するとは、選択された病原体、がん細胞等に対する少なくともある程度の治療的または予防的免疫を患者に提供することを意味する。
該対象細菌（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えばΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）は、ワクチン（本明細書では「免疫原性組成物」とも呼ばれる）として使用される。本開示のワクチンは、脊椎動物を、致死未満量の弱毒化リステリア属ワクチンと接触させることによって該脊椎動物に投与され、接触は通常、該ワクチンを該宿主に投与することを含む。いくつかの実施形態では、該細菌は、医薬的に許容される製剤で提供される。投与は、経口、非経口、鼻腔内、筋肉内、皮内、腹腔内、血管内、皮下、リンパ節の直接ワクチン接種、カテーテルによる投与、または様々な周知の投与経路のいずれか１つ以上であり得る。例えば、家畜において、該ワクチンは、飼料または液体（例えば、水）中に該ワクチンを組み込むことによって経口投与され得る。それは、凍結乾燥粉末として、凍結製剤として、もしくはカプセルの成分として、または該ワクチンの抗原性を維持する任意のその他の都合のよい医薬的に許容される製剤として供給され得る。いくつかの周知の医薬的に許容される希釈剤または賦形剤のうちのいずれか１つが、本発明のワクチンに使用され得る。適切な希釈剤としては、例えば、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液等が挙げられる。希釈剤の量は、当業者には認識されるように、大きく異なり得る。適切な賦形剤もまた当業者には周知であり、例えば、Ａ．Ｗａｄｅ ａｎｄ Ｐ．Ｊ．Ｗｅｌｌｅｒ，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎから選択され得る。投与される用量は、患者の年齢、健康状態、及び体重、患者のタイプ、ならびにもしあれば、併用療法の存在に依存し得る。該ワクチンは、経口投与のための剤形、例えば、カプセル、溶液、懸濁液、もしくはエリキシルで、または非経口、鼻腔内、筋肉内、もしくは血管内使用のための製剤、例えば、溶液もしくは懸濁液のための滅菌液体で使用され得る。本発明によれば、該ワクチンは、選択された生物もしくはウイルスの感染に対して、または腫瘍等に関して患者を免疫化する上で有用なワクチン組成物として、医薬的に許容される希釈剤と組み合わせて使用され得る。患者を免疫化するとは、選択された病原体、がん細胞等に対する少なくともある程度の治療的または予防的免疫を患者に提供することを意味する。
【0044】
該対象ワクチンは、脊椎動物において、選択された因子、例えば、病原生物、腫瘍等に対する細胞性免疫応答、例えば、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発または増強するための方法で使用され、かかる方法は、有効量の該リステリア属ワクチンを投与することを含む。該対象ワクチンは、該抗原特異的免疫応答を増強する自然免疫応答を脊椎動物において誘発するための方法で使用される。さらに、本発明のワクチンは、曝露後または診断後の治療に使用され得る。一般に、曝露後治療のためのワクチンの使用は、例えば、狂犬病及び破傷風の治療において、当業者には認識されよう。本発明の同じワクチンは、例えば、免疫化と曝露後の免疫増強の両方に使用され得る。代替的に、本発明の異なるワクチン、例えば、曝露の後期で発現する抗原に特異的なもの等を曝露後の治療に使用してもよい。したがって、該対象ベクターを用いて調製される該対象ワクチンは、様々な病状に関連する抗原に特異的な免疫応答を誘導するために、予防ワクチン及び治療ワクチンの両方として使用される。
【0045】
該患者は、選択された生物に感染しやすい任意のヒト及び非ヒト動物であり得る。該対象ワクチンは、特に哺乳類（ヒト及び非ヒト哺乳類を含む）等の脊椎動物に、及び家畜に使用される。家畜としては、家禽、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ科（例えば、ウサギ）、または他の非ヒト動物が挙げられる。
【0046】
該対象ワクチンは、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２０１４／１０６１２３号、同第ＷＯ２０１４／０７４６３５号、同第ＷＯ ２００９／１４３０８５号、同第ＷＯ ２００８０２７５６０号、同第ＷＯ ２００８０６６７７４号、同第ＷＯ ２００７１１７３７１号、同第ＷＯ ２００７１０３２２５号、同第ＷＯ ２００５０７１０８８号、同第ＷＯ ２００３１０２１６８号、同第ＷＯ ２００３／０９２６００号、同第ＷＯ／２０００／００９７３３号、及び同第ＷＯ １９９９／０２５３７６号に記載のワクチン接種用途に使用される。これらの出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0047】
アジュバント組成物
該対象細菌株（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えばΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）は、免疫増強剤として、すなわち、アジュバントとしても使用される。かかる用途において、該対象弱毒化細菌は、生きた細菌株がアジュバントとして使用される当技術分野で既知の方法にしたがって、免疫原、例えば、腫瘍抗原、改変腫瘍細胞等と組み合わせて投与され得る。例えば、Ｂｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎ ２００１ Ｍａｒ ２１；１９（１７－１９）：２５６５－７０を参照されたい。
該対象細菌株（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えばΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）は、免疫増強剤として、すなわち、アジュバントとしても使用される。かかる用途において、該対象弱毒化細菌は、生きた細菌株がアジュバントとして使用される当技術分野で既知の方法にしたがって、免疫原、例えば、腫瘍抗原、改変腫瘍細胞等と組み合わせて投与され得る。例えば、Ｂｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎ ２００１ Ｍａｒ ２１；１９（１７－１９）：２５６５－７０を参照されたい。
【0048】
いくつかの実施形態では、該細菌株は、感作抗原に化学的にカップリングすることによってアジュバントとして使用される。該感作抗原は、任意の目的の抗原でよく、代表的な目的の抗原としては、ウイルス性因子、例えば、単純ヘルペスウイルス、マラリア原虫、細菌、例えば、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細菌、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、幼住血吸虫、腫瘍細胞、例えば、ＣＡＤ２乳腺腺癌腫瘍細胞、ならびにホルモン、例えば、チロキシンＴ４、トリヨードチロニンＴ３、及びコルチゾールが挙げられるがこれらに限定されない。該感作抗原の該免疫増強剤へのカップリングは、２つの反応部位を有する様々な化学的因子、例えば、ビスジアゾベンジジン、グルタルアルデヒド、ジヨードアセテート、ならびにジイソシアネート、例えば、ｍ－キシレンジイソシアネート及びトルエン－２，４－ジイソシアネート等によって達成され得る。リステリア属種のアジュバントとしての使用はさらに、米国特許第４，８１６，２５３号に記載されている。その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0049】
送達媒体
該対象細菌（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えば、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）はまた、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０９７３３号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）、及びＤｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６：１８１－１８５に記載の通り、標的細胞への高分子の送達用ベクターまたは送達媒体としても使用される。これらの刊行物に記載されているように、核酸、ポリペプチド／タンパク質等が挙げられるがこれらに限定されない様々な異なるタイプの高分子が送達され得る。
該対象細菌（ＦＭＮ及びＦＡＤ生合成に必要な１つ以上の遺伝子に１つ以上の変異を含むバリアントリステリア属、例えば、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦバリアント）はまた、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０９７３３号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）、及びＤｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６：１８１－１８５に記載の通り、標的細胞への高分子の送達用ベクターまたは送達媒体としても使用される。これらの刊行物に記載されているように、核酸、ポリペプチド／タンパク質等が挙げられるがこれらに限定されない様々な異なるタイプの高分子が送達され得る。
【0050】
ＭＡＩＴ細胞リガンドを産生するバリアントリステリア属
本開示は、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞リガンド５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）の産生をもたらし、ＭＡＩＴ細胞を活性化及び刺激するバリアントリステリア属を提供する。場合によっては、ＭＡＩＴ細胞リガンドを産生する本開示のバリアントリステリア属は、リボフラビンも産生する。本開示は、リボフラビンを産生し（すなわち、リボフラビンをデノボ合成する）、インビボでＭＡＩＴ細胞の増殖を活性化及び刺激するバリアントリステリア属を提供する。本開示のリボフラビンを産生するＭＡＩＴ細胞刺激型バリアントリステリア属は、本明細書では「ｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属」とも呼ばれる。本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属は、リステリア属以外の細菌に由来するリボフラビンオペロン（「ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロン」）を含むように遺伝子改変される。したがって、本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属は、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロン（すなわち、リステリア属以外の細菌に由来するｒｉｂＤＥＡＨＴオペロン）を含むように遺伝子改変される。異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンは、任意のリボフラビン合成型細菌に由来し得る。例えば、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンは、グラム陽性細菌、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えば、Ｂ．スブチリスに由来し得る。図７に示すように、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴは、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｒｉｂＡ、ｒｉｂＨ、及びｒｉｂＴ遺伝子を含むことができ、これらの遺伝子は、転写制御因子（例えば、プロモーター）に作動可能に連結することができ、該プロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよい。
本開示は、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞リガンド５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）の産生をもたらし、ＭＡＩＴ細胞を活性化及び刺激するバリアントリステリア属を提供する。場合によっては、ＭＡＩＴ細胞リガンドを産生する本開示のバリアントリステリア属は、リボフラビンも産生する。本開示は、リボフラビンを産生し（すなわち、リボフラビンをデノボ合成する）、インビボでＭＡＩＴ細胞の増殖を活性化及び刺激するバリアントリステリア属を提供する。本開示のリボフラビンを産生するＭＡＩＴ細胞刺激型バリアントリステリア属は、本明細書では「ｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属」とも呼ばれる。本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属は、リステリア属以外の細菌に由来するリボフラビンオペロン（「ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロン」）を含むように遺伝子改変される。したがって、本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属は、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロン（すなわち、リステリア属以外の細菌に由来するｒｉｂＤＥＡＨＴオペロン）を含むように遺伝子改変される。異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンは、任意のリボフラビン合成型細菌に由来し得る。例えば、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンは、グラム陽性細菌、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えば、Ｂ．スブチリスに由来し得る。図７に示すように、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴは、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｒｉｂＡ、ｒｉｂＨ、及びｒｉｂＴ遺伝子を含むことができ、これらの遺伝子は、転写制御因子（例えば、プロモーター）に作動可能に連結することができ、該プロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよい。
【0051】
場合によっては、該ＭＡＩＴ細胞リガンド５－ＯＰ－ＲＵを産生する（かつＭＡＩＴ細胞の増殖を活性化及び刺激することができる）本開示のバリアントリステリア属は、リボフラビンを産生しない。かかるバリアントリステリア属の例は、異種ｒｉｂＤ遺伝子及び異種ｒｉｂＡ遺伝子で遺伝子改変されているものである。かかるバリアントリステリア属は、本明細書では、「ｒｉｂＤＡバリアントリステリア属」と呼ばれる。
【0052】
本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属及びｒｉｂＤＡバリアントリステリア属は、本明細書では「５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属」と総称される。本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属は、前駆体５－アミノ－６－（Ｄ－リビチルアミノ）ウラシル（５－Ａ－ＲＵ）を産生し、これがメチルグリオキサールまたはグリオキサールと呼ばれる内因性求電子剤と反応して、５－ＯＰ－ＲＵを生じる。
【0053】
場合によっては、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属はまた、ｇｌｏＡ遺伝子に変異を有する（例えば、ｇｌｏＡ－株である）。例えば、Ａｎａｙａ－Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０２１）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １７：ｅ１００９８１９を参照されたい。
【0054】
場合によっては、本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属は、ｒｉｂＵタンパク質を産生しないように、ｒｉｂＵ遺伝子に欠失を有する。したがって、例えば、場合によっては、本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属は、ΔｒｉｂＵバリアントである。
【0055】
本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属または本開示のｒｉｂＤＡバリアントリステリア属（すなわち、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属）を生成するために使用されるリステリア宿主細胞は、いくつかの異なるリステリア属種のいずれか１つでよく、通常、リボフラビン要求性株である。目的のリステリア属種としては、Ｌ．フレイシュマンニ、Ｌ．イノキュア、Ｌ．イバノビイ、Ｌ．マルスイ、Ｌ．モノサイトジェネス、Ｌ．ルコウルティアエ、Ｌ．シーリゲリ、Ｌ．ウェイヘンステファネンシス、及びＬ．ウェルシメリが挙げられるがこれらに限定されない。したがって、Ｌ．モノサイトジェネス以外のリステリア属株も宿主細胞であり得る。ある特定の場合には、該リステリア属株は、Ｌ．モノサイトジェネスである。
【0056】
場合によっては、該リステリア属宿主細胞は弱毒化される。「弱毒化」及び「弱毒化された」は、病原性を低下させるように改変されたリステリア属宿主細胞を包含する。該宿主は、ヒトもしくは動物宿主、または器官、組織、もしくは細胞であり得る。非限定的な例を挙げると、該リステリア属宿主細胞は、宿主細胞への結合を低減するため、１つの宿主細胞から別の宿主細胞への拡散を低減するため、細胞外増殖を低減するため、または宿主細胞での細胞内増殖を低減するために弱毒化され得る。弱毒化は、例えば、病原性の指標、ＬＤ５０、器官からのクリアランス率、または競争指標を測定することによって評価され得る（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：５９５３－５９５７参照）。一般に、弱毒化により、ＬＤ５０（致死量、５０％、特定の試験期間後に試験された集団のメンバーの半数を死滅させるために必要な用量（細菌数））の増加及び／またはクリアランス率の増加が、少なくとも２５％、より一般的には、少なくとも５０％、最も一般的には、少なくとも１００％（２倍）、標準的には、少なくとも５倍、さらに標準的には、少なくとも１０倍、最も標準的には、少なくとも５０倍、多くの場合、少なくとも１００倍、さらに多くの場合、少なくとも５００倍、最も多くの場合、少なくとも１０００倍、通常は、少なくとも５０００倍、より通常は、少なくとも１０，０００倍、最も通常は、少なくとも５０，０００倍、及び最も多くの場合、少なくとも１００，０００倍もたらされる。
【0057】
ある特定の実施形態では、本開示による弱毒化リステリア属は、Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ａｓｓａｙ Ｔｏ Ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ａｃｔＡ Ｍｕｔａｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ，”Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００１，ｐ．５９５３－５９５７，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．９に記載の競合指標アッセイにおいて、対応する野生型株と比較して、病原性の低下を示すものである。本アッセイでは、マウスに試験及び参照、例えば、野生型細菌株を接種する。ある期間後、例えば４８～６０時間後、接種したマウスをサクリファイスし、１つ以上の器官、例えば、肝臓、脾臓の細菌の存在量を評価する。これらの実施形態では、所与の細菌株は、脾臓におけるその存在量が、対応する野生型株で観察されるものの少なくとも約１／５０以上、例えば、１／７０以上少ない場合、及び／または肝臓におけるその存在量が、対応する野生型株で観察されるものの少なくとも約１／１０以上少ない、例えば、１／２０以上少ない場合に、病原性が低いと見なされる。
【0058】
さらに他の実施形態では、細菌は、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ．（１９９４ｂ）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３６：４６３－４６７に記載のアッセイを使用して測定される、約８時間未満、例えば、約４時間未満を含め、約６時間未満の複製の失敗を示す場合、病原性が低いと見なされる。さらに他の実施形態では、細菌は、野生型と比較して、米国特許第７，７９４，７２８号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）で採用されているプラークアッセイにおいてより小さなプラークを形成する場合、弱毒化されたまたは病原性が低いと見なされる。該アッセイでは、細胞、例えば、マウスＬ２細胞を、例えば、６ウェル組織培養ディッシュにて、コンフルエンシーまで増殖させ、その後細菌に感染させる。その後、ゲンタマイシンを含むＤＭＥ寒天を加え、プラークをある期間、例えば３日間増殖させる。その後、例えば、ニュートラルレッド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含む追加のＤＭＥ寒天オーバーレイを添加することによって、生細胞を可視化し、終夜インキュベートする。かかるアッセイでは、野生型と比較して弱毒化変異体で観察されるプラークサイズの減少の程度は、ある特定の実施形態では、１０％であり、１５％が含まれ、例えば、２５％以上である。
【0059】
弱毒化細菌は、弱毒化表現型を付与する１つ以上の異なる変異を含んでよく、目的の変異としては、例えば、米国特許第７，７９４，７２８号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のｈｌｙ変異及び／またはｌｐｌＡ変異、例えば、Ｄｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１２）１８：８５８－８６８に報告されているａｃｔＡ及び／またはインターナリンＢ（ＩｎｌＢ）変異等が挙げられる。したがって、場合によっては、本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属は、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンに加えて、ａｃｔＡ及び／またはｌｎｌＢに変異を含む。
【0060】
本開示のバリアントリステリア属細菌は、上記の通り、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンまたは異種ｒｉｂＤＡ遺伝子に加えて１つ以上の遺伝子改変を含んでもよく、該１つ以上のさらなる改変は、宿主細胞において望ましい性質、例えば、弱毒化、免疫原性の向上等を提供する。かかるさらなる改変の例としては、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ ２０１４／１０６１２３号、同第ＷＯ ２０１４／０７４６３５号、同第ＷＯ ２００９／１４３０８５号、同第ＷＯ ２００８０２７５６０号、同第ＷＯ ２００８０６６７７４号、同第ＷＯ ２００７１１７３７１号、同第ＷＯ ２００７１０３２２５号、同第ＷＯ ２００５０７１０８８号、同第ＷＯ ２００３１０２１６８号、同第ＷＯ ２００３／０９２６００号、同第ＷＯ／２０００／００９７３３号、及び同第ＷＯ １９９９／０２５３７６号に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない。これらの出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0061】
該細菌は、生きている場合もあれば、死滅しているが代謝的に活性な（「ＫＢＭＡ」）場合もある。ＫＢＭＡワクチン株は、ＤＮＡ修復遺伝子、例えば、ｕｖｒＡ及びｕｖｒＢの削除を介してヌクレオチド除去修復の能力を破棄することによって構築される。該遺伝子の削除により、該細菌は、ソラレンとＵＶＡの併用処理を介した光化学的不活性化に弱くなる。形成されたソラレン誘導性のＤＮＡ架橋を修復することができないため、ＫＢＭＡ細菌株は、複製することができず、したがって、機能的に非感染性である。この特性により、生弱毒化株と比較して安全性プロファイルが改善される。しかしながら、架橋の数は非常に限られており、抗原の発現を含めたそれらの代謝活性、ひいてはそれらの免疫能が維持される。ＫＢＭＡワクチン株については、米国特許第７，８３３，７７５号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0062】
ある特定の例では、本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属または本開示のｒｉｂＤＡバリアントリステリア属（本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属）は、異種抗原を発現する。該異種抗原は、ある特定の実施形態では、該異種抗原が由来する感染性因子による抗原投与から動物を保護することができるもの、または宿主生物にとって有益に、腫瘍の増殖及び転移に影響を与えることができるものである。したがって、異種抗原をコードするＤＮＡによって本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属に導入され得る異種抗原は、リステリア属によって発現された場合に、応答が誘導される宿主にとって有益である細胞性免疫応答を誘発するのに役立つ任意の抗原を含む。したがって、異種抗原としては、感染性因子によって特定されるものが挙げられ、該抗原に対する免疫応答が、該因子によって引き起こされる疾患を予防または治療する役割を果たす。かかる異種抗原としては、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物の表面タンパク質及び任意の他のタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質等が挙げられるがこれらに限定されない。異種抗原としては、該異種抗原を発現する腫瘍をもたらすリスクがある、またはそれを有すると診断される宿主生物に利益をもたらすものも挙げられる。該宿主生物は、哺乳類、例えば、ヒトであり得る。
【0063】
本明細書で使用される、「異種抗原」という用語は、リステリア属で通常発現されないタンパク質もしくはペプチド、糖タンパク質もしくは糖ペプチド、リポタンパク質もしくはリポペプチド、または任意の他の高分子を意味し、実質的には、感染性因子、腫瘍細胞または腫瘍関連タンパク質における同じ抗原に対応する。該異種抗原は、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属によって発現され、該株による哺乳類細胞の感染後に、プロセッシングされ、細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属によって発現される異種抗原は、哺乳類で自然に発現される未改変の抗原またはタンパク質を認識するＴ細胞応答をもたらす限り、腫瘍細胞または感染性因子内の対応する未改変の抗原またはタンパク質と正確に一致する必要はない。他の例では、該腫瘍細胞抗原は、哺乳類において自然に発現されるものの変異型であってもよく、リステリア属種によって発現される抗原は、その腫瘍細胞変異抗原に適合する。本明細書で使用される、「腫瘍関連抗原」という用語は、宿主生物における腫瘍の増殖または転移に影響を与える抗原を意味する。該腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞によって発現される抗原の場合もあれば、非腫瘍細胞によって発現されるが、そのように発現された際に、腫瘍細胞の増殖または転移を促進する抗原の場合もある。腫瘍抗原及び腫瘍関連抗原をコードするＤＮＡを組み込むことによってリステリア属に導入され得る該腫瘍抗原及び腫瘍関連抗原のタイプとしては、あらゆる既知の、またはこれまで知られていなかった腫瘍抗原が挙げられる。他の例では、該「腫瘍関連抗原」は、腫瘍の増殖にも転移にも影響を与えないが、該腫瘍が由来する組織（及び腫瘍）で特異的に発現することから、リステリア属ワクチンの成分として使用される。さらに他の例では、該「腫瘍関連抗原」は、腫瘍の増殖にも転移にも影響を与えないが、該腫瘍細胞で選択的に発現され、任意の他の正常組織では発現されないことから、リステリア属ワクチンの成分として使用される。
【0064】
ワクチン開発において有用な異種抗原は、当業者に入手可能な知識を使用して選択されてもよく、腫瘍細胞によって発現される、または腫瘍の増殖もしくは転移に影響を与える、または感染性因子によって発現される多くの抗原性タンパク質が現在知られている。例えば、異種抗原として有用であると見なされ得るウイルス抗原としては、インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）及びＨＩＶのｇａｇタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。他の異種抗原としては、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質またはその構成部分ｇｐ１２０及びｇｐ４１、ＨＩＶのｎｅｆタンパク質、ならびにＨＩＶのｐｏｌタンパク質、逆転写酵素及びプロテアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。さらに他の異種抗原は、Ｅ１及びＥ２糖タンパク質、ならびに非構造（ＮＳ）タンパク質、例えば、ＮＳ３が挙げられるがこれらに限定されない、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関連するものであり得る。さらに、他のウイルス抗原、例えば、ヘルペスウイルスタンパク質も有用であり得る。該異種抗原は、ウイルス起源のものであることに限定される必要はない。寄生生物抗原、例えば、マラリア抗原等が含まれ、真菌抗原、細菌抗原、及び腫瘍抗原も含まれる。
【0065】
本明細書に記載の通り、腫瘍細胞によって発現されるいくつかのタンパク質も既知であり、本発明のワクチン株に挿入され得る異種抗原として目的のものである。これらとしては、白血病におけるｂｃｒ／ａｂｌ抗原、子宮頸癌に関連する発がん性ウイルスのＨＰＶＥ６及びＥ７抗原、黒色腫におけるまたはそれに関連するＭＡＧＥ１及びＭＺ２－Ｅ抗原、ならびに乳癌におけるまたはそれに関連するＭＶＣ－１及びＨＥＲ－２抗原が挙げられるがこれらに限定されない。適切な異種抗原としては、がん関連抗原、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体、ガングリオシド抗原ＧＤ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、カッパ軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ｖＩＩＩポリペプチド等が挙げられる。他の目的のコード配列としては、共刺激分子、免疫調節性分子等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0066】
場合によっては、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を産生するように遺伝子改変される。ＣＡＲは、がん関連抗原に結合する抗原結合部分を含み得る。該抗原結合部分は、例えば、一本鎖Ｆｖ、ナノボディ等であり得る。
【0067】
ｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属またはｒｉｂＤＡバリアントリステリア属を含む組成物
本開示は、本開示のバリアントリステリア属（本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属、本開示のｒｉｂＤＡバリアントリステリア属）を含む組成物を提供する。本開示の組成物は、本開示のバリアントリステリア属に加えて、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等）、緩衝剤等のうちの１つ以上を含み得る。場合によっては、本開示の組成物は、本開示のバリアントリステリア属に加えて、生理食塩水を含む。場合によっては、本開示の組成物はさらに、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。多重特異性抗体は、場合によっては、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体である。多重特異性抗体は、がん関連抗原に特異的な第一の抗原結合部位及びＴ細胞（例えば、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、γ／δＴ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞）に特異的な第二の抗原結合部位を含み得る。
本開示は、本開示のバリアントリステリア属（本開示のｒｉｂＤＥＡＨＴバリアントリステリア属、本開示のｒｉｂＤＡバリアントリステリア属）を含む組成物を提供する。本開示の組成物は、本開示のバリアントリステリア属に加えて、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等）、緩衝剤等のうちの１つ以上を含み得る。場合によっては、本開示の組成物は、本開示のバリアントリステリア属に加えて、生理食塩水を含む。場合によっては、本開示の組成物はさらに、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。多重特異性抗体は、場合によっては、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体である。多重特異性抗体は、がん関連抗原に特異的な第一の抗原結合部位及びＴ細胞（例えば、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、γ／δＴ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞）に特異的な第二の抗原結合部位を含み得る。
【0068】
本開示は、本開示のバリアントリステリア属を含む免疫原性組成物（本明細書では「ワクチン組成物」とも呼ばれる）を提供する。本開示の免疫原性組成物は、ａ）本開示のバリアントリステリア属、及びｂ）抗原を含み得る。適切な抗原としては、がん関連抗原、病原体関連抗原（例えば、ウイルス抗原、病原性原生動物抗原等）が挙げられるがこれらに限定されない。
【0069】
有用性
本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属は、ＭＡＩＴ細胞の増殖を活性化及び／または刺激することに使用される。ＭＡＩＴ細胞は、制限分子主要組織適合複合体（ＭＨＣ）関連タンパク質－１（ＭＲ１）に提示されるリボフラビン合成の低分子生合成誘導体を認識するそれらのセミインバリアントαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって定義される自然様Ｔ細胞である。ＭＡＩＴ細胞リガンドとしては、５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）及び５－（２－オキソエチリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＥ－ＲＵ）が挙げられ、これらは、多種多様な細菌、マイコバクテリア、及び酵母によってリボフラビン（ビタミンＢ２）合成の過程で産生される。ＭＡＩＴ細胞は、固有のエフェクターメモリー表現型、例えば、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ９５ＨｉＣＤ６２ＬＬｏＣＤ４４Ｈｉを有し、様々な炎症性サイトカインを分泌する能力を有する。
本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属は、ＭＡＩＴ細胞の増殖を活性化及び／または刺激することに使用される。ＭＡＩＴ細胞は、制限分子主要組織適合複合体（ＭＨＣ）関連タンパク質－１（ＭＲ１）に提示されるリボフラビン合成の低分子生合成誘導体を認識するそれらのセミインバリアントαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって定義される自然様Ｔ細胞である。ＭＡＩＴ細胞リガンドとしては、５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）及び５－（２－オキソエチリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＥ－ＲＵ）が挙げられ、これらは、多種多様な細菌、マイコバクテリア、及び酵母によってリボフラビン（ビタミンＢ２）合成の過程で産生される。ＭＡＩＴ細胞は、固有のエフェクターメモリー表現型、例えば、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ９５ＨｉＣＤ６２ＬＬｏＣＤ４４Ｈｉを有し、様々な炎症性サイトカインを分泌する能力を有する。
【0070】
場合によっては、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属が個体に投与され、該投与により、該個体におけるＭＡＩＴ細胞の数が増加する。場合によっては、有効量の本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属を個体に投与することにより、該個体のＭＡＩＴ細胞の数が少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または５０％超増加する。場合によっては、有効量の本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属の個体への投与により、該個体においてＭＡＩＴ細胞が活性化する。
【0071】
場合によっては、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属は、個体に経口投与され、該個体の腸内の免疫応答が調節される。
【0072】
本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属の「有効量」は、それを必要とする個体に投与された場合に、該個体に有益な効果（例えば、臨床的に有益な効果）をもたらす量である。場合によっては、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属の有効量は、それを必要とする個体に投与された場合に、該個体においてＭＡＩＴ細胞の数を増加させる量である。場合によっては、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属の有効量は、腫瘍を有する個体に投与された場合に、該個体において腫瘍体積を減少させる量、及び／またはがん細胞の数を減少させる量である。
【0073】
場合によっては、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属の「有効量」は、用量当たり１０４～１０１０個の細菌の範囲である。例えば、場合によっては、本開示の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属の「有効量」は、単位用量当たり、１０４～５ｘ１０４、５ｘ１０４～１０５、１０５～５ｘ１０５、５ｘ１０５～１０６、１０６～５ｘ１０６、５ｘ１０６～１０７、１０７～５ｘ１０７、５ｘ１０７～１０８、１０８～１０９、または１０９～１０１０個の細菌の範囲である。
【0074】
本開示の非限定的態様の例
上記本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様もしくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。先の記載を限定することなく、本開示のある特定の非限定的な態様を以下に示す。本開示の読後に当業者には明らかであるように、個々の番号が付された態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付された態様のうちのいずれかとともに使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、すべてのかかる態様の組み合わせに対する支持を提供することを意図するものであり、以下に明示的に示される態様の組み合わせに限定されるものではない。
上記本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様もしくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。先の記載を限定することなく、本開示のある特定の非限定的な態様を以下に示す。本開示の読後に当業者には明らかであるように、個々の番号が付された態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付された態様のうちのいずれかとともに使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、すべてのかかる態様の組み合わせに対する支持を提供することを意図するものであり、以下に明示的に示される態様の組み合わせに限定されるものではない。
【0075】
態様１．フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）生合成に必要な遺伝子の変異を含むバリアントリステリア属細菌であって、哺乳類においては細胞外で増殖しない、前記バリアントリステリア属細菌。
【0076】
態様２．ＦＭＮ及びＦＡＤ合成に必要な前記遺伝子が、ｒｉｂＣ遺伝子及び／またはｒｉｂＦ遺伝子である、態様１に記載のバリアントリステリア属細菌。
【0077】
態様３．条件的偏性細胞内細菌である、態様１または態様２に記載のバリアントリステリア属細菌。
【0078】
態様４．増殖するためにフラビンモノヌクレオチド及びフラビンアデニンジヌクレオチドの補給を必要とする、態様１～３のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属細菌。
【0079】
態様５．前記変異が、前記ｒｉｂＣ遺伝子及び／または前記ｒｉｂＦ遺伝子のすべてまたは一部の欠失を含む、態様２～４のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属細菌。
【0080】
態様６．前記バリアントが、少なくとも１つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含むように遺伝子改変されている、態様５のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属細菌。
【0081】
態様７．前記異種核酸が、前記細菌のゲノムに組み込まれている、態様６に記載のバリアントリステリア属細菌。
【0082】
態様８．前記少なくとも１つの異種遺伝子産物が、抗原を含む、態様６または態様７に記載のバリアントリステリア属細菌。
【0083】
態様９．前記抗原が、がん関連抗原である、態様８に記載のバリアントリステリア属細菌。
【0084】
態様１０．バリアントリステリア・モノサイトジェネス細菌である、態様１～９のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属細菌。
【0085】
態様１１．前記細菌に弱毒化表現型を付与する１つ以上のさらなる変異、及び／または増殖優位性をもたらす１つ以上のさらなる変異をさらに含む、態様１～１０のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属細菌。
【0086】
態様１２．前記弱毒化表現型を付与する１つ以上のさらなる変異が、ａｃｔＡ及びｉｎｌＢから選択される遺伝子の変異を含み、任意に、前記増殖優位性をもたらす１つ以上のさらなる変異が、ｅｅｔＢ遺伝子の変異を含む、態様１１に記載のバリアントリステリア属細菌。
【0087】
態様１３．
ａ）態様１～１２のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属細菌、及び
ｂ）多重特異性抗体
を含む、組成物。
ａ）態様１～１２のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属細菌、及び
ｂ）多重特異性抗体
を含む、組成物。
【0088】
態様１４．前記多重特異性抗体が、ｉ）がん関連抗原に特異的な第一の抗原結合部位、及びｉｉ）Ｔ細胞に特異的な第二の抗原結合部位を含む、態様１３に記載の組成物。
【0089】
態様１５．前記Ｔ細胞が、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、γ／δ Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、態様１４に記載の組成物。
【0090】
態様１６．態様１～１２のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属を含む、免疫原性組成物。
【0091】
態様１７．個体における免疫応答を誘導する方法であって、態様１６に記載の免疫原性組成物の有効量を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【0092】
態様１８．前記バリアントリステリア属細菌が、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含むように遺伝子改変されており、前記免疫応答が、前記異種ポリペプチドに対して誘導される、態様１７に記載の方法。
【0093】
態様１９．前記異種ポリペプチドが、抗原である、態様１８に記載の方法。
【0094】
態様２０．前記抗原が、がん関連抗原である、態様１８に記載の方法。
【0095】
態様２１．前記免疫応答が、ガンマ－デルタＴ細胞応答を含む、態様１７～２０のいずれか１つに記載の方法。
【0096】
態様２２．態様１６に記載の免疫原性組成物の単位用量を含む、キット。
【0097】
態様２３．前記単位用量が、経口用量である、態様２２に記載のキット。
【0098】
態様２４．前記単位用量が、注射用である、態様２２に記載のキット。
【0099】
態様２５．異種抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターをさらに含む、態様２２～２４のいずれか１つに記載のキット。
【0100】
態様２６．粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞リガンド５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）の産生をもたらす、５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属。
【0101】
態様２７．前記バリアントリステリア属が、異種ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンを含み、前記バリアントリステリア属が、リボフラビンを合成し、ＭＡＩＴ細胞の増殖を刺激する、態様２６に記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属。
【0102】
態様２８．前記バリアントリステリア属が、異種のｒｉｂＤ及びｒｉｂＡ遺伝子を含む、態様２６に記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属。
【0103】
態様２９．前記バリアントが、少なくとも１つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含むように遺伝子改変されている、態様２６～２８のいずれか１つに記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属。
【0104】
態様３０．前記異種核酸が、前記細菌のゲノムに組み込まれている、態様２９に記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属細菌。
【0105】
態様３１．前記少なくとも１つの異種遺伝子産物が、抗原を含む、態様２９または態様３０に記載の５－ＯＰ－ＲＵ前駆体産生型バリアントリステリア属細菌。
【0106】
態様３２．前記抗原が、がん関連抗原である、態様３１に記載のバリアントリステリア属細菌。
【0107】
態様３３．前記少なくとも１つの異種遺伝子産物が、キメラ抗原受容体を含む、態様２９または態様３０に記載のバリアントリステリア属細菌。
【0108】
態様３４．前記細菌に弱毒化表現型を付与する１つ以上のさらなる変異、及び／または増殖優位性をもたらす１つ以上のさらなる変異をさらに含む、態様２６～３３のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属細菌。
【0109】
態様３５．前記弱毒化表現型を付与する１つ以上のさらなる変異が、ａｃｔＡ及びｉｎｌＢから選択される遺伝子の変異を含み、前記増殖優位性をもたらす１つ以上のさらなる変異が、ｅｅｔＢ遺伝子の変異を含む、態様３４に記載のバリアントリステリア属細菌。
【0110】
態様３６．態様２６～３５のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属を含む、組成物。
【0111】
態様３７．個体における粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）細胞の数及び活性化状態を増大させる方法であって、前記個体に、態様２６～３５のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属の有効量を投与することを含む、前記方法。
【0112】
態様３８．個体におけるがんの治療方法であって、前記個体に、態様２６～３５のいずれか１つに記載のバリアントリステリア属の有効量を投与することを含む、前記方法。
【実施例】
【0113】
以下の実施例は、当業者に本発明をいかに作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が実施されたすべてまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用した数値（例えば、量、温度等）に関しては、正確さを確保するための努力がなされているが、多少の実験誤差及び偏差を考慮されたい。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。例えば、ｂｐ、塩基対、ｋｂ、キロベース、ｐｌ、ピコリットル、ｓまたはｓｅｃ、秒、ｍｉｎ、分、ｈまたはｈｒ、時間、ａａ、アミノ酸、ｋｂ、キロベース、ｂｐ、塩基対、ｎｔ、ヌクレオチド、ｉ．ｍ．、筋肉内（筋肉内に）、ｉ．ｐ．、腹腔内（腹腔内に）、ｉ．ｖ．、静脈内（静脈内に）、ｓ．ｃ．、皮下（皮下に）等の標準的な略語が使用され得る。
【0114】
実施例１：Ｌ．モノサイトジェネスの偏性細胞内病原性株
材料及び方法
細菌培養及び株
Ｌ．モノサイトジェネスの株（表１）は、野生型１０４０３Ｓ株に由来し、２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むフィルター滅菌富栄養型ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地（ＢＤ、Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）で培養した。ΔｒｉｂＵ（ｌｍｏ１９４５）、ΔｒｉｂＣ（ｌｍｏ１３２９）、ΔｒｉｂＦ（ｌｍｏ０７２８）、及びΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株の構築を、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７での対立遺伝子交換を使用して行った。ΔｒｉｂＣ、ΔｒｉｂＦ、及び二重ｒｉｂＣ／ｒｉｂＦ変異株の生成プロセスの間、細菌を常に２．５μＭのＦＭＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び２．５μＭのＦＡＤ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むＢＨＩ培地で培養し、合成致死性を回避した。ΔｒｉｂＣ、ΔｒｉｂＦ、及びΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株を使用したすべての手順について、細菌を常に２．５μＭのＦＭＮ及び２．５μＭのＦＡＤを含むＢＨＩ培地で増殖させた。
材料及び方法
細菌培養及び株
Ｌ．モノサイトジェネスの株（表１）は、野生型１０４０３Ｓ株に由来し、２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むフィルター滅菌富栄養型ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地（ＢＤ、Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）で培養した。ΔｒｉｂＵ（ｌｍｏ１９４５）、ΔｒｉｂＣ（ｌｍｏ１３２９）、ΔｒｉｂＦ（ｌｍｏ０７２８）、及びΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株の構築を、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７での対立遺伝子交換を使用して行った。ΔｒｉｂＣ、ΔｒｉｂＦ、及び二重ｒｉｂＣ／ｒｉｂＦ変異株の生成プロセスの間、細菌を常に２．５μＭのＦＭＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び２．５μＭのＦＡＤ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むＢＨＩ培地で培養し、合成致死性を回避した。ΔｒｉｂＣ、ΔｒｉｂＦ、及びΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株を使用したすべての手順について、細菌を常に２．５μＭのＦＭＮ及び２．５μＭのＦＡＤを含むＢＨＩ培地で増殖させた。
【0115】
ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンを発現するΔｒｉｂＵ株またはｒｉｂＵを発現する相補株の生成は、それぞれ、ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンをバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の天然プロモーターで、及びｒｉｂＵ遺伝子を野生型Ｌ．モノサイトジェネス由来の天然プロモーターで増幅し、それらをｐＰＬ２組み込みベクターにクローニングすることによって行った。同様に、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体の補完は、ｒｉｂＣ遺伝子を野生型Ｌ．モノサイトジェネス由来の天然プロモーターで増幅し、それをｐＰＬ２ベクターにクローニングすることによって行った。それらを、コンジュゲーションを介してＬ．モノサイトジェネスのゲノムに組み込んだ。ブロス増殖曲線は、３７℃で振とう（２００ｒｐｍ）にて増殖させた終夜培養物からのＬ．モノサイトジェネス株を用いて行った。富栄養型（ＢＨＩ）及び既知組成の合成培地の増殖曲線を光学濃度（ＯＤ６００）０．０３から開始した。増殖曲線は、波長６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）によって分光光度法で測定した。
【0116】
組織培養及び増殖培地
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を、８週齢の雌の野生型（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＡＩＭ２ ＫＯ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから骨髄を採取することによって調製した。ＢＭＭを、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ａｖａｎｔｏｒ－Ｓｅｒａｄｉｇｍ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）、１０％Ｍ－ＣＳＦ産生型３Ｔ３細胞上清、１％Ｌ－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３１５Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）、１４ｍＭの２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた高グルコースＧｉｂｃｏ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）にて、または実験手順で説明している修正ＤＭＥＭレシピを用いて培養した。
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を、８週齢の雌の野生型（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＡＩＭ２ ＫＯ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから骨髄を採取することによって調製した。ＢＭＭを、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ａｖａｎｔｏｒ－Ｓｅｒａｄｉｇｍ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）、１０％Ｍ－ＣＳＦ産生型３Ｔ３細胞上清、１％Ｌ－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３１５Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）、１４ｍＭの２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた高グルコースＧｉｂｃｏ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）にて、または実験手順で説明している修正ＤＭＥＭレシピを用いて培養した。
【0117】
細胞内増殖曲線
感染の１６～１８時間前に、３ｘ１０６個のＢＭＭを、１４ １２ｍｍのガラスカバースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を各ディッシュに含む６０ｍｍの非ＴＣ処理ディッシュ（ＭＩＤＳＣＩ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）に播種した。Ｌ．モノサイトジェネス株を、１４ｍｌのラウンドポリプロピレンチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）内で、傾斜位にて３０℃で終夜増殖させた。細菌を洗浄し、滅菌１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、ＢＭＭに感染の多重度（ＭＯＩ）０．２５で感染させた。感染後３０分で、細胞を１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄した。感染後１時間で、５０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を細胞培地に加えて、細菌を死滅させ／細菌の細胞外での増殖を防止した。
感染の１６～１８時間前に、３ｘ１０６個のＢＭＭを、１４ １２ｍｍのガラスカバースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を各ディッシュに含む６０ｍｍの非ＴＣ処理ディッシュ（ＭＩＤＳＣＩ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）に播種した。Ｌ．モノサイトジェネス株を、１４ｍｌのラウンドポリプロピレンチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）内で、傾斜位にて３０℃で終夜増殖させた。細菌を洗浄し、滅菌１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、ＢＭＭに感染の多重度（ＭＯＩ）０．２５で感染させた。感染後３０分で、細胞を１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄した。感染後１時間で、５０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を細胞培地に加えて、細菌を死滅させ／細菌の細胞外での増殖を防止した。
【0118】
リボフラビンを欠く培地における細胞内増殖曲線
Ｌ．モノサイトジェネスの細胞内フラビンを枯渇させるために、ＢＭＭ感染の２日前に１μＭのリボフラビンを含む既知組成培地で細菌培養を開始し、３７℃で振とうしながら増殖させた。細菌を、感染の１６～１８時間前に１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、フラビンを欠く既知組成培地で希釈し、３７℃で振とうしながら増殖させた。
Ｌ．モノサイトジェネスの細胞内フラビンを枯渇させるために、ＢＭＭ感染の２日前に１μＭのリボフラビンを含む既知組成培地で細菌培養を開始し、３７℃で振とうしながら増殖させた。細菌を、感染の１６～１８時間前に１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、フラビンを欠く既知組成培地で希釈し、３７℃で振とうしながら増殖させた。
【0119】
マクロファージをＢＭＭ感染の３時間前に１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、細胞培地を、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブを使用した２０％透析ＦＢＳ、３．５Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、及び上記の組織培養及び増殖培地のセクションに記載した他の成分を含む、リボフラビンを欠くＤＭＥＭ高グルコース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）と交換した。これらのリボフラビン飢餓Ｌ．モノサイトジェネスを洗浄し、滅菌１Ｘ ＰＢＳで希釈し、ＢＭＭにＭＯＩ０．２５にて感染させた。これらの増殖曲線は、凡例に別途記載のない限り、リボフラビンを添加せずに行った。
【0120】
細胞死（乳酸脱水素酵素放出）アッセイ
感染の１６～１８時間前に、５ｘ１０５個のＢＭＭ／ウェルを、１００ｎｇ／ｍＬのＰａｍ３ＣＳＫ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地で２４ウェルプレートに播種した。ＢＭＭに感染させる前に、この細胞培地を５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地と交換した。Ｌ．モノサイトジェネス株を３０℃で傾斜して終夜増殖させた。感染に関しては、細菌を１Ｘ ＰＢＳで希釈し、ＢＭＭにＭＯＩ４で感染させた。感染後３０分で、ＢＭＭを１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、５％ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ培地をウェルに添加した。
感染の１６～１８時間前に、５ｘ１０５個のＢＭＭ／ウェルを、１００ｎｇ／ｍＬのＰａｍ３ＣＳＫ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地で２４ウェルプレートに播種した。ＢＭＭに感染させる前に、この細胞培地を５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地と交換した。Ｌ．モノサイトジェネス株を３０℃で傾斜して終夜増殖させた。感染に関しては、細菌を１Ｘ ＰＢＳで希釈し、ＢＭＭにＭＯＩ４で感染させた。感染後３０分で、ＢＭＭを１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、５％ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ培地をウェルに添加した。
【0121】
マウス静脈内感染
８週齢の雌のＣＤ－１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に、尾静脈を介して１ｘ１０５個の対数増殖中の細菌を含む２００μＬのＰＢＳを感染させた。感染後４８時間でマウスを安楽死させ、脾臓、肝臓、及び胆嚢を採取し、ホモジナイズし、プレーティングして、器官ごとのＣＦＵ数を測定した。
８週齢の雌のＣＤ－１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に、尾静脈を介して１ｘ１０５個の対数増殖中の細菌を含む２００μＬのＰＢＳを感染させた。感染後４８時間でマウスを安楽死させ、脾臓、肝臓、及び胆嚢を採取し、ホモジナイズし、プレーティングして、器官ごとのＣＦＵ数を測定した。
【0122】
血液増殖曲線
血中のＬ．モノサイトジェネス株の増殖は、脱繊維素ヒツジ血（ＨｅｍｏＳｔａｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉｘｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。細菌を２．５時間対数増殖させ、洗浄し、３ｍＬの脱繊維素ヒツジ血中に濃度１ｘ１０６／ｍＬにて再懸濁した。血液培養を３７℃で振とうしながらインキュベートした。血中のＬ．モノサイトジェネスの増殖を、血液を１Ｘ ＰＢＳで希釈し、プレーティングすることによって３日間観察し、全血中のＣＦＵ数を特定した。
血中のＬ．モノサイトジェネス株の増殖は、脱繊維素ヒツジ血（ＨｅｍｏＳｔａｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉｘｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。細菌を２．５時間対数増殖させ、洗浄し、３ｍＬの脱繊維素ヒツジ血中に濃度１ｘ１０６／ｍＬにて再懸濁した。血液培養を３７℃で振とうしながらインキュベートした。血中のＬ．モノサイトジェネスの増殖を、血液を１Ｘ ＰＢＳで希釈し、プレーティングすることによって３日間観察し、全血中のＣＦＵ数を特定した。
【0123】
マウス経口感染
マウスに、５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む飲料水を感染の４８時間前に与えた。感染の１８～２４時間前にマウスを清潔なケージに移し、食物源（ｍｏｕｓｅ ｃｏｌｏｎｙ ｃｈｏｗ）を除去して終夜の絶食を開始した。感染当日に、３ｍｍのパン片に１ｘ１０８個の対数増殖中の細菌を含む１Ｘ ＰＢＳを植菌し、３μＬのバターを塗った。次に、各８週齢の雌のＣＤ－１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に、植菌したパンを一片与えた。硫酸ストレプトマイシン水を標準的な飲料水と交換し、食事を元に戻した。フン試料を感染後５日間毎日採集し、重量を測定し、４℃で１０分間ボルテックスし、プレーティングして、フン便１グラム当たりのＣＦＵ数を測定した。
マウスに、５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む飲料水を感染の４８時間前に与えた。感染の１８～２４時間前にマウスを清潔なケージに移し、食物源（ｍｏｕｓｅ ｃｏｌｏｎｙ ｃｈｏｗ）を除去して終夜の絶食を開始した。感染当日に、３ｍｍのパン片に１ｘ１０８個の対数増殖中の細菌を含む１Ｘ ＰＢＳを植菌し、３μＬのバターを塗った。次に、各８週齢の雌のＣＤ－１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に、植菌したパンを一片与えた。硫酸ストレプトマイシン水を標準的な飲料水と交換し、食事を元に戻した。フン試料を感染後５日間毎日採集し、重量を測定し、４℃で１０分間ボルテックスし、プレーティングして、フン便１グラム当たりのＣＦＵ数を測定した。
【0124】
ファゴソーム脱出アッセイ
１２ｍｍのガラスカバースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む２４ウェルプレートにＢＭＭを播種し、終夜培養した。ＢＭＭを２５０ｎｇ／ｍＬのサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で処理し、３０分後に、傾斜位置で３０℃にて終夜増殖させたＬ．モノサイトジェネス株に感染させた（ＭＯＩ１５）。感染後１時間１５分で、ＢＭＭを１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ，ＵＳＡ）で１５分間固定した。次いで、免疫蛍光染色、顕微鏡検査、及び画像解析を進めた。使用した一次抗体は、１：１０００希釈のウサギ抗リステリア属（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ、カタログ番号２２３０２１）、及び１：２００希釈のモルモット抗ｐ６２（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号２０Ｒ－ＰＰ００１）であった。使用した二次抗体は、１：２０００希釈のＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ－Ｘヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号Ｒ６３９４）及び１：２０００希釈のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号Ａ２１４５０）であった。条件ごとに少なくとも１００個の細菌を分析のために定量化した。
１２ｍｍのガラスカバースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む２４ウェルプレートにＢＭＭを播種し、終夜培養した。ＢＭＭを２５０ｎｇ／ｍＬのサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で処理し、３０分後に、傾斜位置で３０℃にて終夜増殖させたＬ．モノサイトジェネス株に感染させた（ＭＯＩ１５）。感染後１時間１５分で、ＢＭＭを１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ，ＵＳＡ）で１５分間固定した。次いで、免疫蛍光染色、顕微鏡検査、及び画像解析を進めた。使用した一次抗体は、１：１０００希釈のウサギ抗リステリア属（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ、カタログ番号２２３０２１）、及び１：２００希釈のモルモット抗ｐ６２（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号２０Ｒ－ＰＰ００１）であった。使用した二次抗体は、１：２０００希釈のＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ－Ｘヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号Ｒ６３９４）及び１：２０００希釈のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号Ａ２１４５０）であった。条件ごとに少なくとも１００個の細菌を分析のために定量化した。
【0125】
結果
ＲｉｂＵはマウスにおける病原性に必要である
Ｌ．モノサイトジェネスにおいて唯一のアノテーションされたリボフラビントランスポーターである、ｒｉｂＵ遺伝子にトランスポゾンが挿入されたＬ．モノサイトジェネスの変異株を単離した。ＲｉｂＵが増殖に必須ではないことを確認し、発病の過程でのフラビンの獲得及び必要性を評価するために、ｒｉｂＵがインフレームで欠失しているＬ．モノサイトジェネス株（ΔｒｉｂＵ）を生成した。トランスポゾン変異体と同様に、ΔｒｉｂＵ株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスと比較して、富栄養型培地において検出可能な増殖欠陥を有さなかった（図１ｂ）。対照的に、ΔｒｉｂＵ株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスと比較して、マウスの脾臓に５ｌｏｇの病原性の欠損を有し（図１ｃ）、感染マウスの肝臓からはコロニー形成単位（ＣＦＵ）を回収することができなかった（図１ｄ）。ΔｒｉｂＵ変異体のｒｉｂＵ遺伝子での、その内在性プロモーターによる補完（ΔｒｉｂＵ＋ｒｉｂＵ）により、インビボでの病原性が完全に回復した（図１ｃ、ｄ）。
ＲｉｂＵはマウスにおける病原性に必要である
Ｌ．モノサイトジェネスにおいて唯一のアノテーションされたリボフラビントランスポーターである、ｒｉｂＵ遺伝子にトランスポゾンが挿入されたＬ．モノサイトジェネスの変異株を単離した。ＲｉｂＵが増殖に必須ではないことを確認し、発病の過程でのフラビンの獲得及び必要性を評価するために、ｒｉｂＵがインフレームで欠失しているＬ．モノサイトジェネス株（ΔｒｉｂＵ）を生成した。トランスポゾン変異体と同様に、ΔｒｉｂＵ株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスと比較して、富栄養型培地において検出可能な増殖欠陥を有さなかった（図１ｂ）。対照的に、ΔｒｉｂＵ株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスと比較して、マウスの脾臓に５ｌｏｇの病原性の欠損を有し（図１ｃ）、感染マウスの肝臓からはコロニー形成単位（ＣＦＵ）を回収することができなかった（図１ｄ）。ΔｒｉｂＵ変異体のｒｉｂＵ遺伝子での、その内在性プロモーターによる補完（ΔｒｉｂＵ＋ｒｉｂＵ）により、インビボでの病原性が完全に回復した（図１ｃ、ｄ）。
【0126】
ΔｒｉｂＵ株の病原性の欠損がインビボでのリボフラビン飢餓によって引き起こされたかどうかを判断するために、近縁グラム陽性細菌であるＢ．スブチリス由来のリボフラビンオペロンｒｉｂＤＥＡＨＴを、Ｌ．モノサイトジェネス染色体に挿入することによって、リボフラビンを合成するようにΔｒｉｂＵ変異体を操作した。この株は、リボフラビンを補給しない無色の既知組成の合成培地で増殖し、培地を、フラビンの天然色である黄色に変化させた（図２）。ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンの発現は、マウスの脾臓及び肝臓において、ΔｒｉｂＵ株の病原性を野生型Ｌ．モノサイトジェネスのレベルまでレスキューした（図１ｃ、ｄ）。これらの観察に基づいて、ＲｉｂＵがＬ．モノサイトジェネスの発病に不可欠であること、及びＲｉｂＵマイナス株におけるリボフラビンのデノボ産生がインビボでＲｉｂＵの不可欠性を完全に回避したため、その機能がフラビンの獲得に関連していることが結論付けられる。
【0127】
Ｌ．モノサイトジェネスはＲｉｂＵを使用してマクロファージ中で増殖する
ＲｉｂＵがマウスにおけるＬ．モノサイトジェネスの増殖に不可欠である理由を調べるために、感染を骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を使用してインビトロで行った。感染後２時間では、ΔｒｉｂＵ変異体は、小さいが野生型Ｌ．モノサイトジェネスよりも顕著な増殖優位性を有し（図４ａ）、これは、ファゴソーム脱出の増加と関連していた（図３ａ）。しかしながら、指数増殖中（感染後２～５時間）、ΔｒｉｂＵ変異体は、複製速度に明らかな欠陥を有し、感染後期（感染後５～８時間）にＣＦＵの損失を示した（図４ａ）。ΔｒｉｂＵ株のｒｉｂＵ遺伝子またはｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンでの補完により、ＢＭＭにおける増殖欠陥が完全に回復した（図３ｂ）。
ＲｉｂＵがマウスにおけるＬ．モノサイトジェネスの増殖に不可欠である理由を調べるために、感染を骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を使用してインビトロで行った。感染後２時間では、ΔｒｉｂＵ変異体は、小さいが野生型Ｌ．モノサイトジェネスよりも顕著な増殖優位性を有し（図４ａ）、これは、ファゴソーム脱出の増加と関連していた（図３ａ）。しかしながら、指数増殖中（感染後２～５時間）、ΔｒｉｂＵ変異体は、複製速度に明らかな欠陥を有し、感染後期（感染後５～８時間）にＣＦＵの損失を示した（図４ａ）。ΔｒｉｂＵ株のｒｉｂＵ遺伝子またはｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンでの補完により、ＢＭＭにおける増殖欠陥が完全に回復した（図３ｂ）。
【0128】
ΔｒｉｂＵ株が、リボフラビンに関連しない固有の細胞内病原性欠損を有するかどうかを調べるために、感染前にＢＭＭを過剰のリボフラビン（１０μＭ）とインキュベートし、細胞内リボフラビンの濃度を増加させた。このリボフラビン過剰の条件において、ΔｒｉｂＵ変異体は、野生型レベルまで複製した（図４ｂ）。ＢＭＭにおける指数増殖期に観察されたΔｒｉｂＵ株の増殖（図４ａ）が、培地に由来する残留フラビンに起因するかどうかを評価するために、リボフラビン欠乏ＢＭＭにリボフラビン飢餓細菌を感染させた。本実験では、ΔｒｉｂＵ変異株及び野生型Ｌ．モノサイトジェネス株を、感染前に、フラビンを欠く既知組成の合成培地で１６～１８時間インキュベートした。ＢＭＭ細胞培地を、リボフラビンを欠く培地と交換し、マクロファージを３時間インキュベートした後、リボフラビン飢餓細菌に感染させた。リボフラビン飢餓野生型Ｌ．モノサイトジェネスは、リボフラビン欠乏ＢＭＭにおいて増殖することができることが観察された。しかしながら、リボフラビン飢餓ΔｒｉｂＵ変異体は、リボフラビン欠乏ＢＭＭでは複製することができなかった（図４ｃ）。リボフラビン飢餓ΔｒｉｂＵ変異体は、感染直前に１μＭのリボフラビンを補給したリボフラビン欠損ＢＭＭにおいて増殖することができた（図３ｃ）。
【0129】
ΔｒｉｂＵ株による感染が宿主細胞死をもたらしたかどうかを調べるために、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイを行った。これらの結果は、ΔｒｉｂＵが宿主細胞死の有意な増加を引き起こすことを示した（図４ｄ）。ΔｒｉｂＵがＡＩＭ２依存性パイロトーシスを誘発しているかどうかを調べるために、ＡＩＭ２ノックアウト（ＫＯ）ＢＭＭを使用してＬＤＨ放出アッセイを行ったところ、ΔｒｉｂＵ変異体がＬＤＨ放出を引き起こさないことが観察された（図４ｅ）。対照として、ＮＬＲＣ４インフラマソームを活性化するフラジェリンを分泌するＬ．モノサイトジェネス（ＷＴ＋Ｌ．ｐ．ｆｌａＡ）は、感染したＡＩＭ２ ＫＯ ＢＭＭにおいて依然として細胞死を媒介した（図４ｅ）。ΔｒｉｂＵ変異体は、ＡＩＭ２ ＫＯ ＢＭＭでは細胞死を引き起こさなかった。実際、感染後８時間では、ΔｒｉｂＵ変異体のＣＦＵの損失はなかった（図４ｆ）。これらのデータは、ＲｉｂＵマイナス株がインビボである程度溶解し、ＡＩＭ２依存性パイロトーシスを活性化し、これが株の病原性にマイナスの影響を与えることを示唆した。
【0130】
Ｌ．モノサイトジェネスはＲｉｂＵを使用して宿主細胞のサイトゾルからＦＭＮ及びＦＡＤを捕捉する
リボフラビン欠乏ＢＭＭにおけるリボフラビン飢餓野生型Ｌ．モノサイトジェネスの倍加時間は、リボフラビンとともにＢＭＭで増殖する野生型Ｌ．モノサイトジェネスの倍加時間と非常に類似しており、それぞれ、４８．６分及び５１．５分であった（図３ｄ）。これらの結果及び哺乳類細胞が取り込み時にリボフラビンをＦＭＮ及びＦＡＤに急速に変換するという事実の両方が、野生型Ｌ．モノサイトジェネスが細胞内でＦＭＮ及び／またはＦＡＤを取り込み、それらの輸送にＲｉｂＵを使用して増殖することを示している。Ｌ．モノサイトジェネスがＦＭＮ及びＦＡＤを取り込んで増殖を支援することができるかどうかを調べるために、唯一のフラビンとしてリボフラビン、ＦＭＮ、またはＦＡＤを補給した既知組成の合成培地を使用したところ、野生型Ｌ．モノサイトジェネスは、３つのフラビンの各々を含む培地で増殖することが分かった（図５ａ）。対照的に、ΔｒｉｂＵ株は、ＦＭＮまたはＦＡＤを含む既知組成培地では複製せず（図５ｂ）、リボフラビンを含む培地では増殖にわずかな欠陥を有するのみであった。これらの結果は、ＲｉｂＵがＦＭＮ及びＦＡＤによる増殖に関与していること、ならびにリボフラビンが、ＲｉｂＵ及び／または別のまだ同定されていないリボフラビントランスポーターを使用して細胞に進入することができることを示唆している。
リボフラビン欠乏ＢＭＭにおけるリボフラビン飢餓野生型Ｌ．モノサイトジェネスの倍加時間は、リボフラビンとともにＢＭＭで増殖する野生型Ｌ．モノサイトジェネスの倍加時間と非常に類似しており、それぞれ、４８．６分及び５１．５分であった（図３ｄ）。これらの結果及び哺乳類細胞が取り込み時にリボフラビンをＦＭＮ及びＦＡＤに急速に変換するという事実の両方が、野生型Ｌ．モノサイトジェネスが細胞内でＦＭＮ及び／またはＦＡＤを取り込み、それらの輸送にＲｉｂＵを使用して増殖することを示している。Ｌ．モノサイトジェネスがＦＭＮ及びＦＡＤを取り込んで増殖を支援することができるかどうかを調べるために、唯一のフラビンとしてリボフラビン、ＦＭＮ、またはＦＡＤを補給した既知組成の合成培地を使用したところ、野生型Ｌ．モノサイトジェネスは、３つのフラビンの各々を含む培地で増殖することが分かった（図５ａ）。対照的に、ΔｒｉｂＵ株は、ＦＭＮまたはＦＡＤを含む既知組成培地では複製せず（図５ｂ）、リボフラビンを含む培地では増殖にわずかな欠陥を有するのみであった。これらの結果は、ＲｉｂＵがＦＭＮ及びＦＡＤによる増殖に関与していること、ならびにリボフラビンが、ＲｉｂＵ及び／または別のまだ同定されていないリボフラビントランスポーターを使用して細胞に進入することができることを示唆している。
【0131】
Ｌ．モノサイトジェネスがＲｉｂＵを利用して宿主細胞のサイトゾルからＦＭＮ及びＦＡＤを捕捉するかどうかを調べるために、Ｌ．モノサイトジェネスのＦＭＮ及びＦＡＤ要求性株を、ｒｉｂＣを欠く、ｒｉｂＦを欠く、またはその両方（ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ）、すなわち、リボフラビンをＦＭＮ及びＦＡＤに変換することに関与する酵素を欠く株を構築することによって生成した。ＦＭＮ及びＦＡＤは必須補因子であるため、この株の構築を、合成致死性を回避するために過剰なＦＭＮ及びＦＡＤを含む富栄養型培地で行った。ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体は、リボフラビンを唯一のフラビン源として有する既知組成培地では複製することができなかった（図５ｃ）。
【0132】
Ｌ．モノサイトジェネスが宿主サイトゾルからＦＭＮ及びＦＡＤを取り込む場合、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体は、細胞内増殖が損なわれないはずである。実際、これらの株は、ＢＭＭの細胞内で野生型Ｌ．モノサイトジェネスのレベルまで複製した（図５ｄ）。ΔｒｉｂＣ、ΔｒｉｂＦ、及びΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異Ｌ．モノサイトジェネス株がインビボで増殖するかどうかを調べるために、マウス病原性アッセイを行った。ΔｒｉｂＣ、ΔｒｉｂＦ、及びΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体は、病原性を維持し、マウスの脾臓及び肝臓の両方で高レベルまで増殖したが、ΔｒｉｂＣ及びΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株は、肝臓で統計学的に有意な２ｌｏｇの欠損を有した（図５ｅ、ｆ）。ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株のｒｉｂＣ遺伝子での、その内在性プロモーターによる補完により、感染マウスの脾臓及び肝臓における増殖のほとんどを回復することが可能であった（図５ｅ、ｆ）。したがって、これらの結果は、Ｌ．モノサイトジェネスがＲｉｂＵを使用して宿主細胞のサイトゾルからＦＭＮ及びＦＡＤを取り込むモデルを裏付ける。
【0133】
ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体は、血液、胆嚢、または胃腸管では増殖できない
野生型Ｌ．モノサイトジェネスは、マウスの胆嚢、血液、及び胃腸（ＧＩ）管において、細胞外増殖することができる。感染時、Ｌ．モノサイトジェネスは、胆管を介して肝臓に接続される胆嚢の内腔にコロニー形成し、胆汁において細胞外で急速に複製して、この器官を細菌の保有宿主として確立する。ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体は、胆嚢にコロニー形成することができなかったが、ΔｒｉｂＣ及びΔｒｉｂＦ株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスのレベルまで増殖した（図６ａ）。ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体のｒｉｂＣ遺伝子での、その内在性プロモーターによる補完により、胆嚢におけるΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株の増殖が完全にレスキューされた。
野生型Ｌ．モノサイトジェネスは、マウスの胆嚢、血液、及び胃腸（ＧＩ）管において、細胞外増殖することができる。感染時、Ｌ．モノサイトジェネスは、胆管を介して肝臓に接続される胆嚢の内腔にコロニー形成し、胆汁において細胞外で急速に複製して、この器官を細菌の保有宿主として確立する。ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体は、胆嚢にコロニー形成することができなかったが、ΔｒｉｂＣ及びΔｒｉｂＦ株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスのレベルまで増殖した（図６ａ）。ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体のｒｉｂＣ遺伝子での、その内在性プロモーターによる補完により、胆嚢におけるΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株の増殖が完全にレスキューされた。
【0134】
ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異株が血中で細胞外増殖できるかどうかを評価するために、脱繊維素ヒツジ血中での増殖曲線を行ったところ、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体は複製しないことが分かり、接種後２４時間までに２～３ｌｏｇのＣＦＵの損失が観察された（図６ｂ）。ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体がＧＩ管の内腔内で細胞外増殖できるかどうかを調べるために、感染の２日前にマウスをストレプトマイシンで前処理し、１ｘ１０８ＣＦＵ／マウスにて感染させた。フン便ペレットを５日間毎日採集し、プレーティングして細菌量を評価した。ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体は、感染後２４時間で、野生型Ｌ．モノサイトジェネスと比較して、フンペレットのＣＦＵに７ｌｏｇの欠損を有した（図６ｃ）。感染後１日目以降、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体感染マウスからＣＦＵは回復しなかった（図６ｃ）。まとめると、これらの観察結果は、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株が胆嚢、血液、またはＧＩ管中で細胞外増殖することができないこと、及びこの変異体がインビボでは細胞内増殖に限定されることを示唆している。
【0135】
図１Ａは、リボフラビン（黒）、ＦＭＮ（赤）、及びＦＡＤ（紫）の構造を示す。図１Ｂは、富栄養型培地で増殖させたＬ．モノサイトジェネス株のブロス増殖曲線を示す。３つの独立した実験の平均及び標準偏差を表示している。図１Ｃ～１Ｄは、１ｘ１０５ＣＦＵの各株を感染させた４８時間後のマウスの脾臓（Ｃ）及び肝臓（Ｄ）におけるＬ．モノサイトジェネス株のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。黒線は、各株のＣＦＵの中央値を表す。破線は、検出限界を表す。
【0136】
図２Ａは、フラビンを欠く既知組成培地で増殖させたＬ．モノサイトジェネス株のブロス増殖曲線を示す。３つの独立した実験の平均及び標準偏差を表示している。フラビンを欠く既知組成培地では、野生型Ｌ．モノサイトジェネスは、そのフラビンプールを枯渇させるまで増殖する。対照的に、ΔｒｉｂＵ＋ｒｉｂＤＥＡＨＴ株は、より高い密度まで増殖する。図２Ｂは、３７℃で振とうしながら２４時間増殖させた後の野生型（左）及びΔｒｉｂＵ＋ｒｉｂＤＥＡＨＴ株（右）の培地上清の画像を示す。
【0137】
図３Ａは、感染した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）においてオートファジー受容体ｐ６２と共局在したＬ．モノサイトジェネス株のパーセンテージを示す。サイトカラシンＤで処理したＢＭＭでは、ファゴソームを脱出する細菌は、ｐ６２でタグ付けされる。ファゴソーム脱出パーセントは、全細菌のｐ６２＋細菌の数を計数することによって計算される。データは、２つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を示す。図３Ｂ～３Ｃは、ＢＭＭにおけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。ＢＭＭをＭＯＩ０．１で感染させ、ＣＦＵを示された時間に数えた。（Ｂ）は、野生型ＢＭＭにおける示されたＬ．モノサイトジェネス株の増殖曲線を示す。データは、２つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を示す。（Ｃ）は、感染直前に１μＭのリボフラビンを補給したリボフラビンを（３時間）与えない野生型ＢＭＭにおける示されたフラビン飢餓Ｌ．モノサイトジェネス株の増殖曲線を示す。データは、３つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を表す。図３Ｄは、リボフラビンが十分なＢＭＭ及びリボフラビンを与えないＢＭＭにおいて細胞内で増殖するＬ．モノサイトジェネス株の２～５時間の間の世代時間を示す。負の値は、回復可能な細菌の数が経時的に減少したことを示す。
【0138】
図４Ａ～４Ｃは、ＢＭＭにおけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。ＢＭＭをＭＯＩ０．１で感染させ、ＣＦＵを示された時間に数えた。（Ａ）は、野生型ＢＭＭにおける示されたＬ．モノサイトジェネス株の増殖曲線を示す。データは、２つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を示す。（Ｂ）は、感染時、過剰（１０μＭ）のリボフラビンを含む細胞培地でインキュベートした野生型ＢＭＭにおける示されたＬ．モノサイトジェネス株の増殖曲線を示す。３つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を示す。（Ｃ）は、リボフラビン欠乏野生型ＢＭＭにおける示されたフラビン飢餓Ｌ．モノサイトジェネス株の増殖曲線を示す。データは、３つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を表す。図４Ｄ～Ｅは、特定のＬ．モノサイトジェネス株に感染させた野生型（Ｄ）またはＡＩＭ２ ＫＯ（Ｅ）ＢＭＭの細胞死を示す。データは、それぞれ、少なくとも２つまたは４つの独立した実験の３回のテクニカルレプリケートの平均及び平均の標準誤差を示す。図４Ｆは、ＡＩＭ２ ＫＯ ＢＭＭにおける示されたＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。５つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を示す。
【0139】
図５Ａ～５Ｃは、異なるフラビン源を含む既知組成の合成培地で増殖させたＬ．モノサイトジェネス株のブロス増殖曲線を示す。（Ａ）は、リボフラビン、ＦＭＮ、またはＦＡＤを唯一のフラビン源として含む培地で増殖させた野生型Ｌ．モノサイトジェネスの増殖曲線を示す。データは、４つの独立した実験の平均及び標準偏差を示す。（Ｂ）は、リボフラビン、ＦＭＮ、またはＦＡＤを唯一のフラビン源として含む培地で増殖させたΔｒｉｂＵ変異Ｌ．モノサイトジェネス株の増殖曲線を示す。リボフラビンを含む培地で増殖させた野生型Ｌ．モノサイトジェネスを参照として使用する。データは、４つの独立した実験の平均及び標準偏差を示す。（Ｃ）は、リボフラビンを含む培地で増殖させた示されたＬ．モノサイトジェネス株の増殖曲線を示す。データは、２つの独立した実験の平均及び標準偏差を示す。図５Ｄは、マウスＢＭＭにおけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。ＢＭＭをＭＯＩ０．１で感染させ、ＣＦＵを示された時間に数えた。２つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を示す。図５Ｅ～５Ｆは、１ｘ１０５ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させたＣＤ－１マウスの感染の４８時間後の脾臓（５Ｅ）及び肝臓（５Ｆ）における細菌量を示す。データは、少なくとも２つの独立した実験の組み合わせを示す。黒線は、各株のＣＦＵの中央値を表す。
【0140】
図６Ａは、脱繊維素ヒツジ血中でのＬ．モノサイトジェネス株のインビトロ増殖を示す。３つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を示す。図６Ｂは、１ｘ１０５ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させたＣＤ－１マウスの感染の４８時間後の胆嚢における細菌量を示す。データは、少なくとも２つの独立した実験の組み合わせを示す。黒線は、各株のＣＦＵの中央値を表す。破線は、検出限界を表す。図６Ｃは、１ｘ１０８ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を経口感染させたＣＤ－１マウスの胃腸管における細菌量を示す。マウスをストレプトマイシンで経口的に前処理した後に感染させた。フン便試料を１～５日目に採集し、プレーティングして、フン便１グラム当たりのＣＦＵを測定した。データは、３つの独立した実験の組み合わせからの平均及び平均の標準偏差を示す。破線は、検出限界を表す。
【0141】
実施例２：操作されたＬ．モノサイトジェネス株を使用したＭＡＩＴ細胞の活性化
Ｌ．モノサイトジェネスがＭＡＩＴ細胞応答を回避している場合に対処するために、リボフラビンをデノボ合成するＬ．モノサイトジェネス株を、近縁細菌であるバチルス・スブチリス由来のリボフラビン生合成オペロン（ｒｉｂＤＥＡＨＴ）を、Ｌ．モノサイトジェネス染色体にクローニングすることによって操作した。２つのバックグラウンド株を２つの異なるプロモーターを用いて創出した。第一のものは、野生型Ｌ．モノサイトジェネスバックグラウンドにおいて構成的活性化プロモーター（ｐＨｙｐｅｒ）からオペロン、すなわち、ｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴ（図７）を発現する。第二の株は、天然のＢ．スブチリスプロモーター（ｐＮａｔｉｖｅ）からリボフラビンオペロン（図７）、ＦＭＮリボスイッチを発現し、これは、この細菌の宿主細胞からのフラビンの取り込みを防ぎ、ひいてはこれにリボフラビンをデノボ産生させる、リボフラビントランスポーター（ｒｉｂＵ）マイナスＬ．モノサイトジェネスバックグラウンドにおいてこの細菌内のフラビン濃度に応じてｒｉｂＤＥＡＨＴの翻訳をオン／オフにする。ｒｉｂＤＥＡＨＴ株がリボフラビンをデノボ合成することができたかどうかを判断するために、フラビンを欠く既知組成培地でブロス増殖曲線を行ったところ、野生型Ｌ．モノサイトジェネスが内部のフラビンプールを枯渇させるまである程度増殖するが、ΔｒｉｂＵ ｐＮａｔｉｖｅ ｒｉｂＤＥＡＨＴ株は、より高い密度まで増殖することが分かった（図２ａ）。さらに、ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンを含む株の培地では、無色から明黄色（フラビンの天然の色）への色の視覚的な変化があり、ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンが機能的であること、及び操作された株においてリボフラビンをデノボ合成することができることを示唆している。Ｌ．モノサイトジェネスに外因性オペロンを発現させ、リボフラビンを合成させると、その病原性または適応度に影響する可能性があるため、骨髄由来マクロファージの細胞内増殖曲線を行った。ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンを発現する株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスと同様に細胞内で増殖したため、リボフラビンの産生は、インビトロでＬ．モノサイトジェネスの細胞内適応度に影響を与えないことが分かった（図３ｂ及び図８）。これらの結果は、ｒｉｂＤＥＡＨＴ株がリボフラビンを産生することができること、及びそれらの細胞内増殖に関しては減弱されていないことを示唆した。
Ｌ．モノサイトジェネスがＭＡＩＴ細胞応答を回避している場合に対処するために、リボフラビンをデノボ合成するＬ．モノサイトジェネス株を、近縁細菌であるバチルス・スブチリス由来のリボフラビン生合成オペロン（ｒｉｂＤＥＡＨＴ）を、Ｌ．モノサイトジェネス染色体にクローニングすることによって操作した。２つのバックグラウンド株を２つの異なるプロモーターを用いて創出した。第一のものは、野生型Ｌ．モノサイトジェネスバックグラウンドにおいて構成的活性化プロモーター（ｐＨｙｐｅｒ）からオペロン、すなわち、ｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴ（図７）を発現する。第二の株は、天然のＢ．スブチリスプロモーター（ｐＮａｔｉｖｅ）からリボフラビンオペロン（図７）、ＦＭＮリボスイッチを発現し、これは、この細菌の宿主細胞からのフラビンの取り込みを防ぎ、ひいてはこれにリボフラビンをデノボ産生させる、リボフラビントランスポーター（ｒｉｂＵ）マイナスＬ．モノサイトジェネスバックグラウンドにおいてこの細菌内のフラビン濃度に応じてｒｉｂＤＥＡＨＴの翻訳をオン／オフにする。ｒｉｂＤＥＡＨＴ株がリボフラビンをデノボ合成することができたかどうかを判断するために、フラビンを欠く既知組成培地でブロス増殖曲線を行ったところ、野生型Ｌ．モノサイトジェネスが内部のフラビンプールを枯渇させるまである程度増殖するが、ΔｒｉｂＵ ｐＮａｔｉｖｅ ｒｉｂＤＥＡＨＴ株は、より高い密度まで増殖することが分かった（図２ａ）。さらに、ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンを含む株の培地では、無色から明黄色（フラビンの天然の色）への色の視覚的な変化があり、ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンが機能的であること、及び操作された株においてリボフラビンをデノボ合成することができることを示唆している。Ｌ．モノサイトジェネスに外因性オペロンを発現させ、リボフラビンを合成させると、その病原性または適応度に影響する可能性があるため、骨髄由来マクロファージの細胞内増殖曲線を行った。ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロンを発現する株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスと同様に細胞内で増殖したため、リボフラビンの産生は、インビトロでＬ．モノサイトジェネスの細胞内適応度に影響を与えないことが分かった（図３ｂ及び図８）。これらの結果は、ｒｉｂＤＥＡＨＴ株がリボフラビンを産生することができること、及びそれらの細胞内増殖に関しては減弱されていないことを示唆した。
【0142】
Ｌ．モノサイトジェネスがインビボでのＭＡＩＴ細胞応答を回避している可能性があるかどうかを判断するために、マウスに野生型Ｌ．モノサイトジェネスまたはリボフラビン産生（ｒｉｂＤＥＡＨＴ）株を感染させた。感染後４日目までに、ｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴ及びΔｒｉｂＵ ｐＮａｔｉｖｅ ｒｉｂＤＥＡＨＴ株は、感染マウスの脾臓及び肝臓において、野生型Ｌ．モノサイトジェネスと比較して高度に弱毒化されることが判明し、ＭＡＩＴ細胞がリボフラビンを産生する株を感知していること、及び細菌量を制御していることが示唆された（図９）。ＭＡＩＴ細胞がリボフラビン産生株に応答し、感染組織で活性化及び／または蓄積しているかどうかを判断するために、マウスにΔａｃｔＡバックグラウンドのリボフラビン産生株を感染させ、脾臓及び肝臓を採取して、ＭＡＩＴ細胞の数を調べた（図１０Ａ）。ＡｃｔＡは、Ｌ．モノサイトジェネスが細胞間で広がることを可能にする病原性因子であり、この因子を欠く株は病原性が低いため、このバックグラウンドの株を使用することにより、マウスにより高用量の細菌を感染させることができ、ＭＡＩＴ細胞が、ｒｉｂＤＥＡＨＴ株に感染した細胞と遭遇する機会を増加させることができる。ΔａｃｔＡ ｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴを感染させたパーフォリンＫＯマウスにおけるＭＡＩＴ細胞の頻度は、脾臓及び肝臓における全ａｂ－Ｔ細胞のそれぞれ約１５％及び２０％であり（図１１Ｂ）、野生型感染マウスで観察された頻度（図１０Ｃ）と同様であった。
【0143】
図７は、示されたｐＨｙｐｅｒ（構成的プロモーター）及びｐＮａｔｉｖｅ（誘導性、Ｂ．スブチリス由来の天然プロモーター）の両方とともに、Ｌ．モノサイトジェネス染色体に導入されたＢ．スブチリス由来のリボフラビンオペロンの図である。
【0144】
図８は、マウスＢＭＭにおけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。ＢＭＭをＭＯＩ０．１で感染させ、ＣＦＵを示された時間に数えた。２つの独立した実験の平均及び平均の標準誤差を示す。
【0145】
図９は、１ｘ１０３ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させたＢ６マウスの感染の９６時間後の脾臓及び肝臓における細菌量を示す。データは、少なくとも３つの独立した実験の組み合わせを示す。黒線は、各株のＣＦＵの中央値を表す。
【0146】
実施例３
リボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネスに感染した組織では、ＭＡＩＴ細胞の５倍の増加が観察されたが、マウスにより多くの細菌を感染させることによってこの応答を増強できるかどうかの疑問が出た。しかしながら、前の実験で使用した株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスのバックグラウンドであり、マウスの５０％致死量（ＬＤ５０）は投与した用量の約５倍であるため、より高用量での感染は、マウスの死をもたらすことになる。したがって、ｐＮａｔｉｖｅ及びｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロン構築物を、ＡｃＡマイナスＬ．モノサイトジェネスのバックグラウンドに導入することを決定した（ΔａｃｔＡΔｒｉｂＵ ｐＮａｔｉｖｅ及びｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴ）。ＡｃｔＡマイナスＬ．モノサイトジェネスは、細胞から細胞へ広がることができないため、マウスでは高度に弱毒化され（ＢＡＬＢ／Ｃでは野生型と比較して約１０００倍）、これにより、マウスを殺傷することなく実質的により多くの細菌に感染させることが可能になった。
リボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネスに感染した組織では、ＭＡＩＴ細胞の５倍の増加が観察されたが、マウスにより多くの細菌を感染させることによってこの応答を増強できるかどうかの疑問が出た。しかしながら、前の実験で使用した株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスのバックグラウンドであり、マウスの５０％致死量（ＬＤ５０）は投与した用量の約５倍であるため、より高用量での感染は、マウスの死をもたらすことになる。したがって、ｐＮａｔｉｖｅ及びｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴオペロン構築物を、ＡｃＡマイナスＬ．モノサイトジェネスのバックグラウンドに導入することを決定した（ΔａｃｔＡΔｒｉｂＵ ｐＮａｔｉｖｅ及びｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴ）。ＡｃｔＡマイナスＬ．モノサイトジェネスは、細胞から細胞へ広がることができないため、マウスでは高度に弱毒化され（ＢＡＬＢ／Ｃでは野生型と比較して約１０００倍）、これにより、マウスを殺傷することなく実質的により多くの細菌に感染させることが可能になった。
【0147】
野生型バックグラウンドのリボフラビン産生株で観察された弱毒化が再現可能であることを確認するため、第一に、ＡｃＡマイナスバックグラウンドの株を、前に投与したものよりも高用量（１ｘ１０７ＣＦＵ／マウス、１ｘ１０３ＣＦＵ／マウスの代わりに）でマウスに感染させることにより、病原性実験を行った。実際、感染後４日目で、ＡｃＡマイナスリボフラビン産生株は、野生型Ｌ．モノサイトジェネスバックグラウンドの株で観察された通り、脾臓及び肝臓で２ｌｏｇ弱毒化された（図１０Ａ）。驚くべきことに、ＡｃＡマイナスｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴ株に感染させたマウスにおけるＭＡＩＴ細胞（ＣＤ３＋ＴＣＲ－β＋ＭＲ１：５－ＯＰ－ＲＵ四量体＋Ｔ細胞）の頻度は、感染マウスの肝臓において、３０％の高さのαβ－Ｔ細胞を示すことが観察された（図１０Ｂ）。ＡｃｔＡマイナスｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴ株を感染させたマウスの脾臓及び肝臓におけるＭＡＩＴ細胞の頻度の中央値は、それぞれ、全αβＴ細胞の１５％及び２０％であった（図１０Ｃ）。対照的に、ΔａｃｔＡ Ｌ．モノサイトジェネス対照を感染させたマウスの脾臓及び肝臓におけるＭＡＩＴ細胞の頻度は、全Ｔ細胞の０．５％～１％であり、これはナイーブマウスと同じであった（図１０Ｃ）。
【0148】
感染の後、ＭＡＩＴ細胞は、感染が治まってからかなり後にも組織内に残存し得る。それが、リボフラビンを産生するＬ．モノサイトジェネスに感染した後の場合に該当するかどうかの疑問が出た。マウスにＡｃＡマイナスｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴを感染させ、感染後２、４、７、１４、及び６０日目に脾臓及び肝臓を採取した。感染後２日での全αβＴ細胞の１％未満から、ＭＡＩＴ細胞の頻度は、感染後４日の脾臓及び感染後１４日の肝臓で最大２０％に達した（図１０Ｄ）。感染後６０日で、ＭＡＩＴ細胞は、脾臓及び肝臓においてそれぞれ、全αβＴ細胞の平均５％及び１０％を構成していた（図１０Ｄ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、両器官で約２０％から始まり、感染後４日で脾臓では最大４０％、肝臓では最大６０％に達した（図１０Ｄ）。対照的に、感染後２日でＣＤ４＋Ｔ細胞は最も高い頻度であり、脾臓でαβＴ細胞の６０％、肝臓で４０％であった（図１０Ｄ）。感染後４日では、それらの頻度は、脾臓及び肝臓でそれぞれ２５％及び１０％の低さであった（図１０Ｄ）。感染後６０日で、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、両器官で、実験開始時の初期頻度よりも低い頻度で終了した（図１０Ｄ）。これらのＭＡＩＴ細胞動態実験により、ＭＡＩＴ細胞の頻度が、脾臓では感染後４日、及び肝臓では１４日でピークに達し、これらの器官では、ナイーブマウス（図１０Ｃ）及び２日の感染マウス（図１０Ｄ）におけるＭＡＩＴ細胞の頻度よりも高い頻度で６０日間維持されることが分かった。これらのデータは、ＭＡＩＴ細胞が、感染した器官に高頻度で蓄積することによって弱毒化リボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネス株に強く応答すること、及びそれらがナイーブマウスで見出されるものよりも高頻度で組織に残留することができることを示唆している。
【0149】
図１０Ａ～１０Ｄ。ＡｃｔＡマイナスバックグラウンドの弱毒化リボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネス株による感染は、感染組織におけるＭＡＩＴ細胞の実質的かつ持続的な蓄積をもたらす。（Ａ）１×１０７ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させたＣ５７ＢＬ／６マウスの細菌量。感染後４日で、脾臓（左）及び肝臓（右）を採取し、ホモジナイズし、プレーティングして、器官ごとのＣＦＵを測定した。これらのデータは、３つの独立した実験：ΔａｃｔＡ、ΔａｃｔＡΔｒｉｂＵ ｐＮａｔ ｒｉｂＤＥＡＨＴ、及びΔａｃｔＡ ｐＨｙｐ ｒｉｂＤＥＡＨＴ（ｎ＝１５マウス）の組み合わせを示す。黒線は、各株のＣＦＵの中央値を表す。破線は、検出限界を表す。対数的に変換されたＣＦＵ値の統計的有意性を、一元配置分散分析及び対照としてＷＴを使用してダネットの事後検査を使用して決定した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（Ｂ及びＣ）（Ｂ）肝臓ＭＡＩＴ細胞からの代表的なフローサイトメトリープロット及び（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの感染後４日のナイーブ、ΔａｃｔＡ、またはΔａｃｔＡ ｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴにおけるＭＡＩＴ細胞の頻度を示す脾臓及び肝臓からの要約データ。感染させる用量は、１ｘ１０７ＣＦＵ／マウスであった。生存、ＣＤ４５陽性、ＴＣＲβ陽性、ＭＲ１：５－ＯＰ－ＲＵ四量体陽性Ｔ細胞のＭＡＩＴ細胞パーセンテージを示す。（Ｃ）では、３つの独立した実験：ナイーブ（ｎ＝１４マウス）、ΔａｃｔＡ（ｎ＝１０マウス）、及びΔａｃｔＡ ｐＨｙｐ ｒｉｂＤＥＡＨＴ（ｎ＝１３マウス）の平均及びＳＥＭを示す。統計的有意性を、一元配置分散分析及び対照として（ＰＢＳ）ナイーブマウスを使用してダネットの事後検査を使用して決定した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ、有意でない、Ｐ＞０．０５。（Ｄ）１ｘ１０７ＣＦＵ／マウスのΔａｃｔＡ ｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴに感染させたマウスにおける感染後２、４、７、１４、及び６０日でのＭＡＩＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示すＭＡＩＴ細胞動態実験。生存、ＣＤ４５陽性、ＴＣＲβ陽性、ならびにその後ＭＲ１：５－ＯＰ－ＲＵ四量体陽性ＣＤ４－／ＣＤ８－陰性細胞（ＭＡＩＴ細胞）、ＣＤ４＋／ＣＤ８－（ＣＤ４＋Ｔ細胞）、及びＣＤ４－／ＣＤ８＋（ＣＤ８＋Ｔ細胞）としてゲートした細胞のパーセンテージを示す。ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水。
【0150】
これらのデータは、ＭＡＩＴ細胞がリボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネスを特異的に制限することを示す。どのメカニズムが関与しているかについての疑問が出た。ＭＡＩＴ細胞は、病原体の制御を媒介する２つの主要なエフェクター機能を有し、バイスタンダー細胞を活性化するサイトカインを産生するか、または細胞溶解性エフェクターであるグランザイムＢ及びパーフォリンを使用して感染細胞を直接殺傷する。Ｌ．モノサイトジェネスは細胞内病原体であるため、感染細胞の直接的な殺傷が、リボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネスを制限するためにＭＡＩＴ細胞が使用する応答であるという仮説を立てた。ＭＡＩＴ細胞を含めたすべての細胞傷害性細胞が感染細胞を直接殺傷することを防ぐはずのパーフォリンを欠く（パーフォリンＫＯ）マウスを感染させた。リボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネスは、野生型Ｌ．モノサイトジェネスと比較して病原性欠損を有しないことが観察された（図１１Ａ）。ＭＡＩＴ細胞が依然として応答し、感染組織に蓄積していること、及び感染後４日目の応答がパーフォリンＫＯマウスで異なっていないことを確認するために、これらのマウスにＡｃｔＡマイナスリボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネス株を感染させ、器官におけるＭＡＩＴ細胞の頻度を特定した。パーフォリンＫＯマウスにおけるＭＡＩＴ細胞の頻度は、脾臓及び肝臓における全αβ－Ｔ細胞のそれぞれ１５％及び２０％であり（図１１Ｂ）、野生型感染マウスで観察された頻度と同様であった。これらの結果は、リボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネスを制限するためにＭＡＩＴ細胞が使用する主な機序が、感染細胞の直接殺傷であることを示唆した。
【0151】
図１１Ａ～１１Ｂ。パーフォリンマイナスＭＡＩＴ細胞は、リボフラビン産生Ｌ．モノサイトジェネスを制限する。１×１０３ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させた細胞溶解性エフェクターパーフォリンを欠くパーフォリンＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウスの細菌量。感染後４日で、脾臓（左）及び肝臓（右）を採取し、ホモジナイズし、プレーティングして、器官ごとのＣＦＵを測定した。これらのデータは、２つの独立した実験：ＷＴ（ｎ＝１０マウス）、ΔｒｉｂＵ ｐＮａｔ ｒｉｂＤＥＡＨＴ（ｎ＝１１マウス）、及びｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴ（ｎ＝１０マウス）の組み合わせを示す。対数的に変換されたＣＦＵ値の統計的有意性を、一元配置分散分析及び対照としてＷＴを使用してダネットの事後検査を使用して決定した。ｎｓ、有意でない、Ｐ＞０．０５。（Ｂ）パーフォリンＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウスの感染後４日のナイーブ、ΔａｃｔＡ、またはΔａｃｔＡ ｐＨｙｐｅｒ ｒｉｂＤＥＡＨＴの脾臓及び肝臓におけるＭＡＩＴ細胞の頻度を示す要約データ。感染させる用量は、１ｘ１０７ＣＦＵ／マウスであった。生存、ＣＤ４５陽性、ＴＣＲβ陽性、ＭＲ１：５－ＯＰ－ＲＵ四量体陽性Ｔ細胞のＭＡＩＴ細胞パーセンテージを示す。２つの独立した実験：ΔａｃｔＡ（ｎ＝８マウス）、ΔａｃｔＡΔｒｉｂＵ ｐＮａｔ ｒｉｂＤＥＡＨＴ （ｎ＝９マウス）、及びΔａｃｔＡ ｐＨｙｐ ｒｉｂＤＥＡＨＴ（ｎ＝９マウス）の平均及びＳＥＭを示す。統計的有意性を、一元配置分散分析及び対照としてΔａｃｔＡマウスを使用してダネットの事後検査を使用して決定した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ、有意でない、Ｐ＞０．０５。
【0152】
実施例４：ＡｃｔＡ及びｉｎｌＢ変異を有するＲｉｂＣ／ＲｉｂＦ株
Ｌ．モノサイトジェネスのΔｒｉｂＣ、ΔｒｉｂＦ、ΔａｃｔＡ、ΔｉｎｌＢ株を構築した。この株を、インビトロのマクロファージにおいて、Ｌ．モノサイトジェネスのΔａｃｔＡ、ΔｉｎｌＢ株及び野生型Ｌ．モノサイトジェネスと比較した。データを図１２に示す。
Ｌ．モノサイトジェネスのΔｒｉｂＣ、ΔｒｉｂＦ、ΔａｃｔＡ、ΔｉｎｌＢ株を構築した。この株を、インビトロのマクロファージにおいて、Ｌ．モノサイトジェネスのΔａｃｔＡ、ΔｉｎｌＢ株及び野生型Ｌ．モノサイトジェネスと比較した。データを図１２に示す。
【0153】
図１２は、野生型マウスＢＭＭにおけるＬ．モノサイトジェネス株の細胞内増殖曲線を示す。ＢＭＭをＭＯＩ０．１で感染させ、ＣＦＵを示された時間に数えた。このデータは、Ｌ．モノサイトジェネスのΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ株が、細胞内で野生型、ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ、及びΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株のレベルまで増殖したことを示す（欠陥は検出されなかった）。ａｃｔＡ及びｉｎｌＢの欠失をＬ．モノサイトジェネスのΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株と組み合わせると、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株を、その細胞内複製に影響を与えることなく、より安全なワクチンベクターまたは治療薬にすることができる。
【0154】
図１３は、１ｘ１０５ＣＦＵの示されたＬ．モノサイトジェネス株を静脈内感染させたＣＤ－１マウスの感染の４８時間後の脾臓及び肝臓における細菌量を示す。このデータは、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ及び ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ｅｅｔＢ：：ｔｎ株がΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのＣＦＵレベルまで増殖することを示す（欠陥は検出されなかった）。このバックグラウンドにおいて、ａｃｔＡ及びｉｎｌＢの欠失をΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株と組み合わせ、ｅｅｔＢ遺伝子を破壊する（当該遺伝子を機能させない）と、マウスのインビボで対照ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ株と同程度に病原性が高い株がもたらされた。
【0155】
ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ及びΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ＋ｅｅｔＢ：：ｔｎ変異株が血中で細胞外増殖できるかどうかを評価するために、脱繊維素ヒツジ血中での増殖曲線を行った。血中のＬ．モノサイトジェネス株のΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ及びΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ＋ｅｅｔＢ：：ｔｎ変異株の増殖を、脱繊維素ヒツジ血（ＨｅｍｏＳｔａｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉｘｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。細菌を対数期まで２．５時間増殖させ、洗浄し、３ｍＬの脱繊維素ヒツジ血中に濃度１ｘ１０６／ｍＬにて再懸濁した。血液培養を３７℃で振とうしながらインキュベートした。血中のＬ．モノサイトジェネスの増殖を、血液を１Ｘ ＰＢＳで希釈し、プレーティングすることによって４日間観察し、全血中のＣＦＵ数を特定した。データを図１４に示す。
【0156】
図１４に示すように、血液の接種後２４時間では、ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ及びΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ＋ｅｅｔＢ：：ｔｎの両方は増殖せず、多数まで複製したΔａｃｔＡΔｉｎｌＢと比較して、２～３ｌｏｇのＣＦＵの損失が両株に関して観察された。ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ及びΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ＋ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ＋ｅｅｔＢ：：ｔｎは、ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異体（図６Ａ）で観察されたように、血中で高度に弱毒化されている。
【0157】
実施例５：ワクチン接種
ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異株が適応免疫応答を堅牢に誘導し、将来のＬ．モノサイトジェネスによる抗原投与に対して保護を生じさせることができるかどうかを調べるために、マウスを１ｘ１０５用量のΔａｃｔＡ及びΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦで免疫した。３０日間マウスの感染を取り除き、休ませた後、マウスに５ｘ１０４個の野生型Ｌ．モノサイトジェネスを感染させ、ΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株によって提供される保護のレベルを調べた。一般に、ワクチン接種に使用される株が、Ｌ．モノサイトジェネスに対して堅牢な免疫応答を生成することができる場合、マウスは、抗原投与に対して強力な二次免疫応答を開始することが可能であり、そのマウスは保護される。適応免疫応答の活性化におけるこの実験株の有効性に応じて、異なるレベルの保護を観察することができる。
ΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ変異株が適応免疫応答を堅牢に誘導し、将来のＬ．モノサイトジェネスによる抗原投与に対して保護を生じさせることができるかどうかを調べるために、マウスを１ｘ１０５用量のΔａｃｔＡ及びΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦで免疫した。３０日間マウスの感染を取り除き、休ませた後、マウスに５ｘ１０４個の野生型Ｌ．モノサイトジェネスを感染させ、ΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株によって提供される保護のレベルを調べた。一般に、ワクチン接種に使用される株が、Ｌ．モノサイトジェネスに対して堅牢な免疫応答を生成することができる場合、マウスは、抗原投与に対して強力な二次免疫応答を開始することが可能であり、そのマウスは保護される。適応免疫応答の活性化におけるこの実験株の有効性に応じて、異なるレベルの保護を観察することができる。
【0158】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１ｘ１０５用量の対数増殖期のΔａｃｔＡ及びΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ細菌に感染させ、マウスの感染を３０日間消散させた。その後、マウスに５ｘ１０４個の対数増殖期の野生型Ｌ．モノサイトジェネスを抗原投与し（感染させ）、ΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ株によって提供される保護のレベルを調べた。抗原投与の３日後、脾臓（左）及び肝臓（右）を採取し、プレーティングして、器官あたりのＣＦＵを計数した。ΔａｃｔＡ及びΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦ、ｎ＝１０、ＰＢＳ対照（０日目に対照として１Ｘ ＰＢＳを注射したマウス）、ｎ＝５。
【0159】
データを図１５に示す。図１５に示すように、ΔａｃｔＡ及びΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦは、同じレベルの保護を提供し、ΔａｃｔＡΔｒｉｂＣΔｒｉｂＦが、インビボでＴ細胞／免疫刺激に対する安全かつ有効なワクチンプラットフォームまたは治療薬であり得ることが示唆される。
【0160】
本発明を、その特定の実施形態を参照して説明してきたが、当業者によれば、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、均等物に置き換え得る点は理解されるはずである。さらに、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスステップ、またはステップを本発明の目的、趣旨及び範囲に適合させるために多くの改変がなされ得る。すべてのかかる改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】