特表 2025-503009 アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-30

(54)【発明の名称】アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20250123BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20250123BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024542950

(86)(22)【出願日】2023-01-13

(85)【翻訳文提出日】2024-09-06

(86)【国際出願番号】 CN2023071987

(87)【国際公開番号】W WO2023138481

(87)【国際公開日】2023-07-27

(31)【優先権主張番号】202210059880.4

(32)【優先日】2022-01-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519255447

【氏名又は名称】アカデミー オブ ミリタリー メディカル サイエンシズ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】マ， ボー

(72)【発明者】

【氏名】ワン， リリ

(72)【発明者】

【氏名】リ， ジー

(72)【発明者】

【氏名】グオ， レイ

(72)【発明者】

【氏名】シュ， フア

(72)【発明者】

【氏名】シエ， ジャンウェイ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QR41

4B063QR48

4B063QR66

4B063QR77

4B063QS28

4B063QS36

4B063QS40

4B063QX02

(57)【要約】

本開示は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法に関し、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするためのキット及びシステムに更に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法であって、
１）被スクリーニング試料を、アセチルコリンエステラーゼと混合するステップ；
２）ステップ１）で得られた混合系を、アセチルコリンと混合するステップ；
３）レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳを、ステップ２）で得られた混合系と接触させるステップ；
４）前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの活性化度を、検出するステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの活性化度を、前記レポーター細胞の細胞質から核へのＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰの移行度として表現し、
前記レポーター細胞内の前記ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰが細胞質から核へと移行する場合、前記被スクリーニング試料がアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含むと判断し、
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤のアセチルコリンエステラーゼに対する阻害活性を、細胞質から核へ移行した細胞内ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰの数に従って定量する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記アセチルコリンがヨウ化アセチルコリンであり、前記アセチルコリンエステラーゼが組換えヒトアセチルコリンエステラーゼである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ステップ１）において、前記被スクリーニング試料を、第１の溶媒の前記アセチルコリンエステラーゼと混合し；
ステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系を、第２の溶媒の前記アセチルコリンと混合し；
前記第１の溶媒及び前記第２の溶媒は、同じであるか、又は異なり、各々独立的に、前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの通常の増殖に適した培地、例えば、ＤＭＥＭ高グルコース培地であり、
好ましくは、ステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、前記得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度が、０．００５～０．０１８Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．００７～０．０１５Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは０．０１Ｕ／ｍＬであり、
好ましくは、ステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、前記得られた混合系のアセチルコリンの初濃度が、１０～１０００ｎＭ、好ましくは３０～８００ｎＭ、更に好ましくは３０～５００ｎＭ、更に好ましくは３０～４００ｎＭ、更に好ましくは３０～３００ｎＭ、更に好ましくは３０～２００ｎＭ、更に好ましくは３０～１００ｎＭである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

好ましくは、ステップ１）において、前記被スクリーニング試料を、２５～４０℃（例えば、３０℃、３２℃、３５℃、３７℃）の温度で、前記アセチルコリンエステラーゼと１０～６０分間、例えば、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、５０分間混合し、
好ましくは、ステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系を、２５～４０℃（例えば、３０℃、３２℃、３５℃、３７℃）の温度で、前記アセチルコリンと１０～６０分間、例えば、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、５０分間混合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ステップ３）において、前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳを、ステップ２）で得られた混合系と１０～６０分間、例えば、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、５０分間接触させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ステップ４）の前に、
前記レポーター細胞を、リン酸緩衝液で希釈したホルムアルデヒド溶液で固定するステップ；
前記レポーター細胞の核及び／又は細胞骨格（アクチン、チューブリン）を染色（例えば、蛍光染色）するステップ
を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ハイコンテント細胞イメージング及び分析システムが、レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの活性化度を検出するのに使用されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳ、アセチルコリン（例えば、ヨウ化アセチルコリン）、アセチルコリンエステラーゼ（例えば、組換えヒトアセチルコリンエステラーゼ）及び蛍光色素（例えば、ヘキスト３３３４２、ファロイジン）を含み、
好ましくは、前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの増殖に適した培地、例えば、ＤＭＥＭ高グルコース培地を更に含み、
好ましくは、リン酸緩衝物質（水溶液の形態又は無水形態の）、及びホルムアルデヒドを更に含み、
任意選択で、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法を説明する説明書を更に含む、キット。

【請求項9】

アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための請求項８に記載のキットの使用。

【請求項10】

請求項８に記載のキットと、ハイコンテント細胞イメージング及び分析システムとを含む、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするためのシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、食品、環境、薬理学及び医学の分野に属し、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法に特に関し、また、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするためのキット及びシステムにも関する。

【背景技術】

【0002】

アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、真性コリンエステラーゼとしても知られ、生物学的神経伝導過程における重要な酵素である。ＡＣｈＥは、コリン作動性シナプスでアセチルコリン（ＡＣｈ）を分解し、シナプス後膜における神経伝達物質の興奮作用を停止し、体内の神経信号の正常な伝達を保証することができる。現在知られている有機リン酸塩（ＯＰ）神経毒性物質、カーバメイト（ＣＭ）農薬、及びアルツハイマー病（ＡＤ）治療薬はすべて、ＡＣｈＥを重要な標的としており、正常又は病的に上昇したＡＣｈＥ活性を阻害することによって神経毒性作用を誘導するか又はＡＤにおいて認知機能を改善する。ＯＰは、最大のクラスのＡＣｈＥ阻害剤（ＡＣｈＥＩ）であり、関連化合物としては農薬、落葉剤、難燃剤、工業用溶媒、滑沢剤、可塑剤、燃料添加剤、及び神経毒性化学戦剤、並びにＡＤ処方薬メトリホネートが挙げられ、現在世界中で使用されている数百種類の製品に見出される。農業の生産性の改善及び致死的なベクター媒介疾患の制御における農薬の大きな利点と、工業化の急速な発展とにより、ＯＰは広範囲に利用されている。統計によると、ＯＰは、毎年世界的規模で環境、食品、及び水の供給源に約十億ポンドのＯＰが放出されることで、環境、動物組織、及びヒト組織において検出される最も一般的な合成化学物質の一つとなっている。このことは、益々深刻になってくる環境及び生態学的問題をもたらし、人間の健康と公共の安全に対する重大な脅威となってきている。さらに、世界人口が高齢化し、ＡＤ治療への必要性が全く充足されていないという益々厳しくなる問題に直面して、ＡＤ治療薬として認められている新規のタイプ（非有機リン）のＡＣｈＥＩは、依然としてＡＤ薬の研究開発の焦点となっている。したがって、既知及び潜在的なＡＣｈＥＩ（有機リン神経剤を含む）のスクリーニング及び正確な特性決定は、環境及び食品の安全性の早期警告、潜在的に有毒な物質の理解、中毒の正確な治療、並びに新規でより効果的なＡＤ薬の研究のために重要である。

【0003】

現在までのところ、３つの主要なタイプの一般に使用されるＡＣｈＥＩスクリーニング方法、すなわち、既知のＯＰ構造に基づく決定、ＡＣｈＥ活性の阻害に基づく分析、及びＯＰ免疫原性に基づく免疫測定が存在する。強力な親和性と高い特異性を有する抗体を調製するのには限界があるため、免疫測定方法は、低レベルのＯＰを成功裏に検出するのに課題があるだけでなく、構造が異なるＯＰを区別することもできない。化学構造に基づく分析は、クロマトグラフィー法、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、及びガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）を主として使用する。これらの方法は、ナノモル濃度範囲内の検出限界の高感度をもたらし、微量成分定量分析に好ましい方法である。しかし、これらの方法は、既知の分子にのみ適しており、スループットが低く、大規模スクリーニングに適していない。さらに、これらの方法は、時間がかかり、高価な装置を使用し、十分な訓練を受けた技術者によって実施されなければならない。酵素活性阻害法はＡＣｈＥの阻害に基づくもので、ＡＣｈＥＩを、被検試料への曝露前後の酵素活性を測定することで検出できる。酵素活性は、Ｅｌｌｍａｎ比色分析、放射能分析、蛍光分析、電気化学分析、又は化学発光分析によって通常測定される。これらの方法は、コストが低く、スループットが高く、分析速度が速く、古典的な方法（ＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ）に代わる最も有望な方法である。しかし、これらの方法は、いくつかのＯＰ化合物に曝露した後の酵素活性変化への感度が低く、このことは、これらの方法の検出感度を著しく制限する。さらに、ＡＣｈＥＩの効率的なスクリーニングという観点からは、上記の方法は、既知の構造又は酵素分子のレベルでの被検化学物質の単一の特性決定をすることができるのみで、潜在的に有毒な分子の生物学的特性決定をすることができず、正確な早期警告及び効果的な治療ガイダンスのための多次元的情報をもたらすこともできない。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法であって、
１）被スクリーニング試料を、アセチルコリンエステラーゼと混合するステップ；
２）ステップ１）で得られた混合系を、アセチルコリンと混合するステップ；
３）レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳを、ステップ２）で得られた混合系と接触させるステップ；
４）レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの活性化度を、検出するステップを含む、方法に関する。

【0005】

いくつかの実施形態では、レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの活性化度は、レポーター細胞の細胞質から核へのＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰの移行度として表現する。レポーター細胞内のＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰが細胞質から核へと移行するとき、被スクリーニング試料がアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含むと判断する。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤のアセチルコリンエステラーゼに対する阻害活性はまた、細胞質から核へ移行した細胞内ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰの数に従って定量できる。

【0006】

いくつかの実施形態では、本開示に従う被スクリーニング試料は、化学物質、食品（例えば、様々な肉、野菜、茶等）、環境中の有機リン農薬、ＡＤ治療薬、神経剤等でもよい。

【0007】

いくつかの実施形態では、アセチルコリンはヨウ化アセチルコリンであり、アセチルコリンエステラーゼは組換えヒトアセチルコリンエステラーゼである。

【0008】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ１）において、被スクリーニング試料は、第１の溶媒のアセチルコリンエステラーゼと混合する。

【0009】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系は、第２の溶媒のアセチルコリンと混合する。

【0010】

いくつかの実施形態では、第１の溶媒及び第２の溶媒は、同じであるか、又は異なり、各々独立的に、レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの通常の増殖に適した培地、例えば、ＤＭＥＭ高グルコース培地である。

【0011】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度（アセチルコリンと反応していないときの濃度）は、０．００５～０．０１８Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．００７～０．０１５Ｕ／ｍＬ、また更に好ましくは０．０１Ｕ／ｍＬである。

【0012】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、得られた混合系のアセチルコリンの初濃度（アセチルコリンエステラーゼと反応していないときの濃度）は、１０～１０００ｎＭ、好ましくは３０～８００ｎＭ、更に好ましくは３０～５００ｎＭ、更に好ましくは３０～４００ｎＭ、更に好ましくは３０～３００ｎＭ、更に好ましくは３０～２００ｎＭ、更に好ましくは３０～１００ｎＭである。

【0013】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ１）において、被スクリーニング試料は、２５～４０℃（例えば、３０℃、３２℃、３５℃、３７℃）で、アセチルコリンエステラーゼと１０～６０分間、例えば、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、５０分間混合する。

【0014】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系は、２５～４０℃（例えば、３０℃、３２℃、３５℃、３７℃）で、アセチルコリンと１０～６０分間、例えば、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、５０分間混合する。

【0015】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度（アセチルコリンと反応していないときの濃度）は、０．００５～０．０１８Ｕ／ｍＬであり、得られた混合系のアセチルコリンの初濃度は、１０～１０００ｎＭ（例えば、３０～８００ｎＭ、３０～５００ｎＭ、３０～４００ｎＭ、３０～３００ｎＭ、３０～２００ｎＭ、又は３０～１００ｎＭ）である。

【0016】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度（アセチルコリンと反応していないときの濃度）は、０．００７～０．０１５Ｕ／ｍＬであり、得られた混合系のアセチルコリンの初濃度は、１０～１０００ｎＭ（例えば、３０～８００ｎＭ、３０～５００ｎＭ、３０～４００ｎＭ、３０～３００ｎＭ、３０～２００ｎＭ、又は３０～１００ｎＭ）である。

【0017】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度（アセチルコリンと反応していないときの濃度）は、０．０１Ｕ／ｍＬであり、得られた混合系のアセチルコリンの初濃度は、１０～１０００ｎＭ（例えば、３０～８００ｎＭ、３０～５００ｎＭ、３０～４００ｎＭ、３０～３００ｎＭ、３０～２００ｎＭ、又は３０～１００ｎＭ）である。

【0018】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度は、０．０１Ｕ／ｍＬであり、得られた混合系のアセチルコリンの初濃度は、３０ｎＭであり、好ましくは、ステップ１）で得られた混合系は、アセチルコリンと１０分間混合する。

【0019】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度は、０．０１Ｕ／ｍＬであり、得られた混合系のアセチルコリンの初濃度は、１００ｎＭであり、好ましくは、ステップ１）で得られた混合系は、アセチルコリンと２０分間混合する。

【0020】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ３）において、レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳを、ステップ２）で得られた混合系と１０～６０分間、例えば、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、５０分間接触させる。

【0021】

いくつかの実施形態では、本方法は、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法のステップ４）の前に、
レポーター細胞を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈したホルムアルデヒド溶液で固定するステップ；
レポーター細胞の核及び／又は細胞骨格（アクチン、チューブリン）を染色（例えば、蛍光染色）するステップを更に含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法は、レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの活性化度を検出するためのハイコンテント細胞イメージング及び分析システムを使用する。

【0023】

本開示はまた、レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳ、アセチルコリン（例えば、ヨウ化アセチルコリン）、アセチルコリンエステラーゼ（例えば、組換えヒトアセチルコリンエステラーゼ）、及び蛍光色素（例えば、ヘキスト３３３４２、ファロイジン）を含む、キットにも関する。

【0024】

いくつかの実施形態では、キットは、レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの増殖に適した培地、例えば、ＤＭＥＭ高グルコース培地を更に含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、キットは、リン酸（ＰＢＳ）緩衝物質（水溶液の形態又は無水形態のいずれか）、及びホルムアルデヒドを更に含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、キットは、本開示に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法を説明する説明書を更に含む。

【0027】

本開示はまた、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするためのキットの使用にも関する。

【0028】

本開示はまた、キットと、ハイコンテント細胞イメージング及び分析システムとを含む、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするためのシステムにも関する。

【0029】

本開示に記載のレポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳは、ヒトムスカリン性Ｍ３受容体（ムスカリン性受容体３、Ｍ３）と、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＣ末端に融合したヒトＮＦＡＴｃ１（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ １）とを安定に発現するＵ２ＯＳ細胞であり、Ｍ３がアゴニストＡＣｈによって活性化されると、細胞内Ｃａ^２＋が放出され、カルシウムレベルの増加により、ＮＦＡＴｃ１は、脱リン酸化され、細胞質から核へと急速に移行する。細胞は、市販されているか、又は既存の技術に従って構築できる。

【0030】

本開示では、特に説明がない限り、本明細書で使用する科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用する細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験室操作ステップは、対応する分野で広く使用されている通常の操作ステップである。

【0031】

本開示の有益な効果
本開示では、ＡＣｈ活性に基づくＡＣｈＥ阻害剤のハイスループットスクリーニング方法が、Ｍ３受容体活性化レポーター細胞を検出装置として使用し、ｒｈＡＣｈＥ反応系を最適化することによって確立される。この方法は、ＯＰ農薬、神経剤、及びＡＤ薬のコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするのに成功裏に使用され、パラオクソンに対する検出限界が１ｎＭであり、ドネペジルに対する検出限界が１ｎＭであり、ＧＤ（ソマン）に対する検出限界が０．１ｎＭであり、ＶＸに対する検出限界が３０ｐＭである。これまでの方法と比較して、この方法は、ハイスループット、高感度、及び時間と試薬の低消費コストを達成できる。特に、この方法は、一回の実験で、被検物質の細胞毒性及び細胞効果に関する表現型スペクトル情報を得ることで、潜在的な薬物又は毒性物質を同定するためのより豊富な特性情報をもたらし、多数の神経毒性化合物をスクリーニングするための新規の効果的なツールをもたらすことができる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】本開示の実施例で確立された、ＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法の検出システムを示す図である。

【図2A】ＡＣｈＩが、レポーター細胞株を濃度依存的に活性化し、Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳヒト骨肉腫細胞においてＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行を誘導することを示す図である。

【図2B】ＡＣｈＩが、レポーター細胞株を濃度依存的に活性化し、Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳヒト骨肉腫細胞においてＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行を誘導することを示す図である。

【図3A】異なる濃度のｒｈＡＣｈＥのＡＣｈＩとの１０分インキュベーションによる、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行への影響を示す図である。

【図3B】異なる時間での０．０１Ｕ／ｍＬ ｒｈＡＣｈＥの異なる濃度のＡＣｈＩとのインキュベーションによる、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行への影響を示す図である。

【図3C】ＶＸによる、２つの反応系におけるＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行への影響を示す図である。

【図4A】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用した有機リン農薬ＡＣｈＥＩの検出結果を示す図であり、Ａはパラオクソンの検出結果を表し；Ｂはジクロルボスの検出結果を表し；Ｃはクロルピリホスの検出結果を表す。

【図4B】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用した有機リン農薬ＡＣｈＥＩの検出結果を示す図であり、Ａはパラオクソンの検出結果を表し；Ｂはジクロルボスの検出結果を表し；Ｃはクロルピリホスの検出結果を表す。

【図4C】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用した有機リン農薬ＡＣｈＥＩの検出結果を示す図であり、Ａはパラオクソンの検出結果を表し；Ｂはジクロルボスの検出結果を表し；Ｃはクロルピリホスの検出結果を表す。

【図5A】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用したＡＤ治療薬ＡＣｈＥＩの検出結果を示す図であり、Ａはドネペジルの検出結果を表し；Ｂはリバスチグミンの検出結果を表す。

【図5B】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用したＡＤ治療薬ＡＣｈＥＩの検出結果を示す図であり、Ａはドネペジルの検出結果を表し；Ｂはリバスチグミンの検出結果を表す。

【図6A】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用した神経剤ＡＣｈＥＩの検出結果を示す図であり、Ａはタブンの検出結果を表し；Ｂはサリンの検出結果を表し；Ｃはソマンの検出結果を表す。

【図6B】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用した神経剤ＡＣｈＥＩの検出結果を示す図であり、Ａはタブンの検出結果を表し；Ｂはサリンの検出結果を表し；Ｃはソマンの検出結果を表す。

【図6C】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用した神経剤ＡＣｈＥＩの検出結果を示す図であり、Ａはタブンの検出結果を表し；Ｂはサリンの検出結果を表し；Ｃはソマンの検出結果を表す。

【図7A】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用したＡＣｈＥＩの細胞表現型スペクトルの特性決定及び分析結果を示す図である。

【図7B】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用したＡＣｈＥＩの細胞表現型スペクトルの特性決定及び分析結果を示す図である。

【図7C】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用したＡＣｈＥＩの細胞表現型スペクトルの特性決定及び分析結果を示す図である。

【図7D】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用したＡＣｈＥＩの細胞表現型スペクトルの特性決定及び分析結果を示す図である。

【図7E】本開示の実施例で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用したＡＣｈＥＩの細胞表現型スペクトルの特性決定及び分析結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

［発明を実施するための特定のモデル］
本開示のいくつかの実施形態での技術的解決法は、本開示の実施例における図面を参照して、以下に明確に且つ完全に記載される。もちろん、記載した実施例は、実施例の全てではなく、本開示の実施例のいくつかに過ぎない。少なくとも１つの例示的な実施例の以下の記載は、本質的に単なる例示であり、本開示、その用途又は使用を制限することを意図するものではない。本開示における実施例に基づき、当業者によって創造的な取組みをすることなく得られる他の全ての実施例は、本開示の保護の範囲に含まれる。

【0034】

本明細書で示され、論考される全ての実施例では、任意の特定の値は、例示的なものとしてのみ理解されるべきであり、限定的なものとして理解されるべきではない。したがって、例示的な実施例の他の実施例は、異なる値を有し得る。

【実施例】

【0035】

本開示は、特定の実施例を通して以下に詳細に説明される。

【0036】

特に示されない限り、本開示で使用される分子生物学的実験方法及び免疫アッセイは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５に記載の方法に実質的に従って実施される。具体的な条件が実施例に示されていない場合、条件は、従来の条件又は製造元が推奨する条件に従って実施されるべきである。使用した試薬又は機器の製造元は、示されていない場合、すべて市販品として購入できる従来品であった。当業者であれば、実施例は、例示として本開示を説明するものであり、本開示の保護の範囲を制限することを意図するものではないことを理解する。

【0037】

本開示の実施例で使用した主な薬物及び試薬としては以下が挙げられる：Ｇｉｂｃｏから購入した、ＤＭＥＭ高グルコース培養培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｇ４１８（ジェネテシン、５０ｍｇ／ｍＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液（１００×）、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液、１×ＰＢＳリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）、及び１０×ＰＢＳリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）；Ａｍｒｅｓｃｏから購入したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；Ｓｅｌｌｅｃｋから購入したヨウ化アセチルコリン（ＡＣｈＩ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した組換えヒトアセチルコリンエステラーゼ（ｒｈＡＣｈＥ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したヘキスト３３３４２蛍光色素；Ｓｏｌａｒｂｉｏから購入した６３３標識ファロイジン；Ｔｈｅｒｍｏから購入したマウス抗ヒトα－チューブリン一次抗体；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５４６標識ロバ抗マウス二次抗体；Ｍｅｒｃｋから購入したパラオクソン、ジクロルボス、及びクロルピリホス；Ｓｅｌｌｅｃｋから購入したドネペジル及びリバスチグミン；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｅｎｓｅから購入したサリン、タブン、及びソマン及びＶＸ；並びに分析グレード試薬のものである他の試薬。

【0038】

本開示のいくつかの実施形態で使用される主な機器は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒのオペラフェニックス（Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ）（商標）ハイコンテント細胞イメージング及び分析システムである。

【0039】

本開示の実施例で使用される細胞株及び培養条件：Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳヒト骨肉腫細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース培地で培養した。さらに、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを、培養培地に添加した。

【0040】

本開示の実施例で使用した溶液の調製：
１．組換えヒトアセチルコリンエステラーゼ（ｒｈＡＣｈＥ）は、０．１％ＢＳＡを含む１０×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）を使用して１Ｕ／ｍＬ保存溶液へと調製し、実験の際に無血清培養培地を用いて保存溶液を目的の使用溶液へと希釈した。

【0041】

２．ヨウ化アセチルコリン（ＡＣｈＩ）は、滅菌脱イオン水を使用して５ｍＭ保存溶液へと調製し、実験の際に無血清培養培地を用いて保存溶液を目的の使用溶液へと希釈した。

【0042】

３．パラオクソン、ジクロルボス、及びクロルピリホスは、メタノールを使用して５００μＭ保存溶液へと調製し、実験の際に無血清培地を用いて保存溶液を目的の使用溶液へと希釈した。

【0043】

４．塩酸ドネペジル（ドネペジル）及び酒石酸リバスチグミン（リバスチグミン）は、滅菌脱イオン水を使用して５ｍＭ保存溶液へと調製し、実験の際に無血清培地を用いて保存溶液を目的の使用溶液へと希釈した。

【0044】

５．タブン（ＧＡ）、サリン（ＧＢ）、ソマン（ＧＤ）、及びＶＸは、アセトニトリルを使用して０．１Ｍ保存溶液へと調製し、実験の際に無血清培地を用いて保存溶液を目的の使用溶液へと希釈した。

【0045】

本開示の実施例で確立された、ＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法の検出システムは、図１に示され、（１）コリン作動性受容体に基づくレポーター細胞株、（２）ＡＣｈＥ反応系、並びに（３）（１）及び（２）から構成されるハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）検出システムを含んでいた；ここで、（１）は、コリン作動性受容体細胞株Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳであり、これは、ヒトムスカリン性コリン受容体３（Ｍ３）と、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＣ末端に融合したヒトＮＦＡＴｃ１とを安定に発現するＵ２ＯＳ細胞であり、Ｍ３がアゴニストＡＣｈによって活性化されると、細胞内Ｃａ^２＋が放出され、カルシウムレベルの増加により、ＮＦＡＴｃ１は、脱リン酸化され、細胞質から核へと急速に移行するが、このことに基づき、アゴニストの活性を定量的に分析できた；（２）は、組換えヒトＡＣｈＥ（ｒｈＡＣｈＥ）、ＡＣｈ及びレポーター細胞株を含む検出システムであり、その含有量は、最適化された後に決められた；また、（３）は、最適化されたＨＣＳ検出システムをＡＣｈＥＩを検出するのに使用した。本開示では、最適化濃度のヨウ化アセチルコリン（ＡＣｈ）をアゴニストとして使用し；ＡＣｈＥをＡＣｈＥＩで予め処理し、次いでＡＣｈを添加し、ある特定の期間インキュベートし、レポーター細胞株を、得られた混合系を使用して処理し、ＨＣＳシステムを、ＡＣｈＥＩをＡＣｈＥ反応系へと添加した後でレポーター細胞の活性を定量的に検出するのに使用することで、ＡＣｈＥＩのＡＣｈＥに対する阻害活性及びその固有の細胞応答特性を決めた。

【0046】

実施例１：ＡｃｈによるＭ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳレポーター細胞株の活性化のハイコンテント分析
この実施例では、ＡＣｈがＭ３：ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１細胞を安定に活性化できるかどうか調べた。ＡＣｈＩをＡｃｈとして選択し、レポーター細胞株のＡＣｈ処理後に、ハイコンテント細胞イメージング分析システムを細胞の画像を収集するのに使用し、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行度を定量的に分析することで、ＡＣｈ活性化Ｍ３受容体の程度及び濃度範囲を決めた。具体的なステップは以下の通りである：
１×１０^５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製し、黒色透明底９６ウェル培養プレートに１００μＬ／ウェルで播種し、次いで２４時間培養し、培養上清を捨て、細胞を無血清培地で２回洗浄し、次いでＡＣｈＩ勾配溶液（無血清培養培地で希釈、最終濃度は、それぞれ０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、１００００、３００００、１０００００ｎｍｏｌ／Ｌであり、各濃度に対して３ウェル）をそれぞれ１００μＬ／ウェルで添加し、次いで細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターに２０分間置いた。次いで１２％ホルムアルデヒドを含む１×ＰＢＳ溶液を５０μＬ／ウェルで添加して（ホルムアルデヒドの最終濃度は４％であった）、室温で暗所にて２０分固定した。細胞は、１×ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、１μＭヘキスト３３３４２を含む１×ＰＢＳ溶液２００μＬ／ウェルを添加し、次いで細胞を３７℃で暗所にて３０分インキュベートした。細胞は、１×ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、次いで１×ＰＢＳ １００μＬ／ウェルを添加した。細胞は、器械にロードし、Ａｌｅｘａ ４８８（吸収波長：４９５ｎｍ、発光波長：５１９ｎｍ）及びＤＡＰＩ（吸収波長：３４０ｎｍ、発光波長：４８８ｎｍ）チャンネルを選択し、２０×対物レンズを使用して細胞の画像を収集し、ウェルあたり９視野を設定して検出した。Ｈａｒｍｏｎｙ ４．９ソフトウェアを、細胞核の数と、細胞質から核への細胞内ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ移行とを定量的に分析するのに使用し、ＡＣｈの活性化効果は、３複製ウェル、ウェルあたり１，０００細胞以上で、各細胞におけるＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰの平均核移行度として表現され、ＥＣ_５０値はＰｒｉｓｍ ８を使用して計算した。

【0047】

Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳを異なる濃度のＡＣｈＩで処理した後、細胞内ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１移行のハイコンテント分析の結果を、図２に示した。レポーター細胞株を０．１～１００ｎＭの範囲でＡＣｈＩ濃度依存的に活性化し、ＡＣｈＩの濃度が０．３ｎＭであったとき、細胞は活性化反応を示し；ＡＣｈＩの濃度が１ｎＭに達したとき、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行度は最大核移行度の約４０％であり；ＡＣｈＩの濃度が１０ｎＭに達したとき、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行度は最大核移行度に近づき；ＡＣｈＩの濃度が３０ｎＭであったとき、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の最大核移行度に達した。Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェアをｌｏｇ（アゴニスト）対応答を非線形にフィッティングするのに使用してＳ字型曲線を得た後、分析により、ＡＣｈＩのＥＣ_５０値が１．７６±０．３４ｎＭであり、Ｚ’因子が０．６８５であることが示され、このことより、ＡＣｈＩをアゴニストとして使用するコリン作動性受容体レポーター細胞の分析モデルが高感度で安定なＨＴＳ法であることが示された。

【0048】

実施例２：ＡＣｈＥ反応系の確立
この実施例では、レポーター細胞株に適したＡＣｈＥ反応系を確立した。基質（ＡＣｈＩ）濃度の違い、酵素（ｒｈＡＣｈＥ）濃度の違い、及び酵素基質反応時間の違いが反応系に及ぼす影響を、レポーター細胞株の活性化の定量分析結果に従って検討した。具体的なステップは以下の通りである：
まず、勾配ｒｈＡＣｈＥ使用溶液及びＡＣｈＩ使用溶液は、相互に組み合わせ、９６ウェルプレートにて１：１（ｖ／ｖ）の比で混合し、３７℃で５、１０、１５、及び２０分間それぞれ反応させた。次いで混合溶液は、レポーター細胞株を予め播種した黒色透明底９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、細胞を２０分間インキュベーションし、次いで、レポーター細胞株の活性化度を実施例１に記載の方法に従って定量的に分析し、Ｚ’因子を計算して最適な実験系を得た。
Ｚ’因子の計算式は以下の通りである：

【0049】

【数1】

（式中、「σ」は標準偏差を表し；「μ」は平均シグナルを表し；「ｃ＋」は陽性対照を表し；「ｃ－」は陰性対照を表す）。

【0050】

Ｚ’因子の値は、０～１となるはずである。Ｚ’因子が０である場合、実験系は確立されていないことが示され；０＜Ｚ’因子＜０．５である場合、実験系は安定性が悪く、信頼性が低いことが示され；０．５≦Ｚ’因子＜１である場合、実験系は安定性が良く、信頼性が高いことが示され；Ｚ’因子が１である場合、陽性対照及び陰性対照の標準偏差は０であり、実験系が理想的な実験系であることが示された（Ｚｈａｎｇ、Ｃｈｕｎｇ、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ．Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、１９９９、４（２）：６７～７３）。

【0051】

レポーター細胞株を活性化するＡＣｈＩの濃度範囲に従って、ＡＣｈＩ濃度の５点を、１０～１×１０^５ｎＭの範囲で選択し、ＡＣｈＥ反応系における最適なＡＣｈＥの含有量及び反応時間をこれらの条件下で検討した。

【0052】

０．００１、０．００３、０．０１及び０．０２Ｕ／ｍＬのｒｈＡＣｈＥ（この濃度は、ＡＣｈＥ反応系におけるｒｈＡＣｈＥの初濃度、すなわち、ＡＣｈＩと反応していないときの系における酵素濃度である）を、異なる濃度のＡＣｈＩと１０分間インキュベーションした場合の各反応系によるレポーター細胞株の活性化の結果を図３Ａに示した。酵素の含有量が低すぎる場合（≦０．００３Ｕ／ｍＬ）、ＡＣｈＩの加水分解は効果的に行われることができず；酵素の含有量が高すぎる場合（０．０２Ｕ／ｍＬ）、ＡＣｈＩの加水分解は過剰に行われ、レポーター細胞分析において２つの条件間の差は限られていた；０．０１Ｕ／ｍＬ ｒｈＡＣｈＥの条件下では、ＡＣｈＩは、１０～１０００ｎＭの範囲で濃度依存的にＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行を誘導した。上記の濃度範囲のＡＣｈＩは、酵素を含まない系においてほぼ１００％の細胞活性化効果を有し、このことより、１０分以内に０．０１Ｕ／ｍＬ ｒｈＡＣｈＥによって加水分解される基質ＡＣｈＩの量をレポーター細胞株で定量できることが示唆された。したがって、反応系におけるｒｈＡＣｈＥの適切な初濃度は、０．００５～０．０１８Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．００７～０．０１５Ｕ／ｍＬ、また更に好ましくは０．０１Ｕ／ｍＬでもよい。

【0053】

アンタゴニストスクリーニング実験の実施可能性を考慮し、ＡＣｈＥ反応系における基質ＡＣｈＩの初濃度は、濃度依存性を示す範囲内の１０、３０、１００、及び３００ｎＭに設定し、０．０１Ｕ／ｍＬ酵素及び基質のインキュベーション時間の違いによる、結果への影響を検討した。結果は図３Ｂに示した。最も低い基質濃度（１０ｎＭ）では、加水分解は５分以内に完了し、その後の実験の実施可能性は低かった。最も高い基質濃度（３００ｎＭ）では、各時点での基質の残存量が高すぎ、差が顕著であったため、その後の実験に十分なウィンドウ及び安定性を欠く一方、以下の２つの場合、すなわち、濃度３０ｎＭの基質を酵素と１０分間インキュベートした場合、及び濃度１００ｎＭの基質を酵素と２０分間インキュベートした場合では、ＡＣｈＩの加水分解は９０％超であり、系は基本的に安定に達していた。この条件は、阻害剤スクリーニングに関する最大ウィンドウ値の要件を満たすのみでなく、系の安定性にも有益であり、高い操作性を有していた。したがって、２つの反応系、すなわち、０．０１Ｕ／ｍＬ ｒｈＡＣｈＥ及び３０ｎＭ ＡＣｈを１０分間インキュベートすることと、０．０１Ｕ／ｍＬ ｒｈＡＣｈＥ及び１００ｎＭ ＡＣｈを２０分間インキュベートすることとが好ましいことが事前に求められた。

【0054】

これに基づいて、上記の２つのスクリーニング系を、既知のアセチルエステラーゼ阻害剤ＶＸを使用して更に評価した。結果は、図３Ｃに示され、両反応系において、ＶＸは、濃度依存的にレポーター細胞のコリン作動性受容体の活性を上昇させる、すなわち、レポーター細胞のＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行を誘導することができ、最も低い検出濃度が０．１ｎＭであった；２つの反応系から構成される２つの方法のＺ’因子はそれぞれ、０．７１６及び０．６１４であり、すなわち、２つの反応系は両方とも、レポーター細胞株と組み合わせたときにＶＸのＡＣｈＥに対する阻害活性を敏感且つ確実に反映でき、ここで、０．０１Ｕ／ｍＬ ｒｈＡＣｈＥを３０ｎＭ ＡＣｈと１０分間インキュベーションした条件下のＺ’因子がより高かったため、この系が最適な反応系として選択された。この系とレポーター細胞株とから構成されるコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥＩ）をスクリーニングするための方法は、ハイスループット検出能を有し、比較的良好な安定性及び感度を有していた。

【0055】

実施例３：本開示で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法を使用する、異なるタイプのＡＣｈＥＩのＡＣｈＥに対する阻害活性の評価
この実施例では、本開示の実施例で確立された方法は、農業生産に一般的に使用される有機リン農薬、例えば、パラオクソン、ジクロルボス（ＤＤＶＰ）及びクロルピリホス、ＡＤ治療薬、例えば、ドネペジル及びリバスチグミン、並びに神経剤、例えば、サリン（ＧＢ）、タブン（ＧＡ）、ソマン（ＧＤ）及びＶＸのＡＣｈＥに対する阻害活性を検出するのに使用した。具体的なステップは以下の通りである：
各ウェルのｒｈＡＣｈＥ使用溶液３０μＬに、対応する勾配濃度を有するＡＣｈＥＩ ３０μＬを添加し、ＡＣｈＥＩとｒｈＡＣｈＥとが十分に相互作用できるように混合溶液を３７℃で３０分インキュベートし、次いでＡＣｈＩ使用溶液６０μＬを添加し、３７℃で１０分反応させた。次いで１００μＬの反応溶液をピペッティングし、レポーター細胞株を予め播種した黒色透明底９６ウェルプレートに添加した。２０分間のインキュベーション後、レポーター細胞株の活性化度を、実施例１に記載の方法に従って定量的に分析して、ＡＣｈＥＩのＡＣｈＥに対する阻害活性を決めた。

【0056】

有機リン農薬のｒｈＡＣｈＥ活性に対する阻害効果の結果は、図４に示され、パラオクソン、ジクロルボス、及びクロルピリホスはすべて、細胞検出システムのｒｈＡＣｈＥを阻害し、システムのＡＣｈＩの加水分解を低下させ、次いで、レポーター細胞のＭ３受容体を活性化して、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行を促進することができた。３つの有機リン農薬の最も低い検出濃度はそれぞれ、１ｎＭ、０．３μＭ、及び３μＭであり、ＩＣ_５０値はそれぞれ、４．７５±０．０５ｎＭ、０．９３±０．０４μＭ、及び１３．２８±０．８７μＭであった。この３つの阻害活性の順序は、パラオクソン＞ジクロルボス＞クロルピリホスであることが示唆され、報告された結果と一致しており、このことは、本開示の実施例で確立された方法が異なるＯＰ農薬のアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を評価するのに使用できることを示している。

【0057】

ドネペジル及びリバスチグミンのｒｈＡＣｈＥに対する阻害効果の結果は図５に示され、ドネペジル及びリバスチグミンの両方は、細胞検出システムのｒｈＡＣｈＥを阻害することによりＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行を促進でき、ＩＣ_５０値がそれぞれ、２６．２１±１．４５ｎＭ、４．０５±１．２６μＭであった。この結果は、文献で報告されている結果と基本的に一致していた。

【0058】

ＯＰ神経剤のｒｈＡＣｈＥに対する阻害効果の結果は、図６及び図３Ｃに示され、タブン、サリン、ソマン及びＶＸはすべて、細胞検出システムのｒｈＡＣｈＥを顕著に阻害し、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行を促進し、ＩＣ_５０値が３．７５±０．０３ｎＭ（ＧＡ）；０．６２±０．０５ｎＭ（ＧＢ）；０．１９±０．０５ｎＭ（ＧＤ）、０．１９±０．０３ｎＭ（ＶＸ）であった。ＶＸの最小検出濃度は３０ｐＭに達した。この結果は、Ｅｌｌｍａｎ法を使用した本発明者らの研究室の結果（タブンが部分的に分解された）と一致した。

【0059】

上記３つの主要なカテゴリーのＡＣｈＥＩの評価結果に基づき、本開示で確立された方法は、異なるタイプのＡＣｈＥＩをハイスループットで定量的にスクリーニングでき、この方法は、高感度、高い安定性、簡便な操作、及び低消費の特性を有していることが示された。

【0060】

実施例４：ＡＣｈＥＩ細胞の表現型特性の特性決定における、本開示で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法の適用
ＡＣｈＥＩのスクリーニング及びＡＣｈＥＩの酵素阻害効果の検出に加えて、本開示で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法はまた、核及び細胞骨格（アクチン、チューブリン）の蛍光染色と組み合わせて、ＡＣｈＥＩを検出するのに使用される細胞の表現型特性（被検物質の固有の細胞活性及び毒性の情報を示す）を特性決定することができた。具体的な方法は以下の通りである：
処理細胞は、実施例１に記載の方法に従ってヘキスト３３３４２で染色し、０．３％トリトンＸ－１００を含む１×ＰＢＳ溶液２００μＬを使用して３７℃で暗所にて３０分間透過処理した；次いで、６３３標識ファロイジンを５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で暗所にて３０分染色した。上清は捨てた。細胞は、１×ＰＢＳ溶液で３回洗浄し、次いで、２００μＬのブロッキング溶液（５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）を各ウェルに添加し、細胞を室温で１ｈブロッキングした。ブロッキング溶液を捨て、５０μＬのマウス抗ヒトα－チューブリンモノクローナル抗体を一次抗体として各ウェルに添加し、次いで、細胞を３７℃で暗所にて１ｈインキュベートした。一次抗体を回収し、細胞をブロッキング溶液で３回洗浄し、５０μＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５４６標識ロバ抗マウスＩｇＧを二次抗体として各ウェルに添加し、細胞を室温で暗所にて３０分インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、１×ＰＢＳ溶液１００μＬをウェルに添加した。ハイコンテント細胞イメージング及び分析システムは、細胞の画像を取得し、核形態、アクチン、及びチューブリンの状態を分析するのに使用した。

【0061】

異なる外因性物質は、異なる標的を有し、異なる細胞変化を誘導し、異なる細胞表現型特性を有する。ＡＣｈＥＩは、構造が多様で生物学的効果が異なる多くのタイプが存在する。研究により、特定の標的ＡＣｈＥに加えて、ＯＰはまた、他の標的、例えば、何百もの酵素、受容体及び他のタンパク質にも影響を及ぼすことが示されており、該他の標的のうちのいくつかは、慢性的なＯＰ曝露による長期ＣＮＳ効果及び発育神経毒性と特に関連している可能性があり、これらの標的とのＡＣｈＥの相互作用は、ＯＰの累積リスクアセスメントの一部となりつつある。本開示で確立されたＡＣｈＥＩをスクリーニングするための方法は、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行度を検出することによってＡＣｈＥＩを同定するだけでなく、同じ実験での適合する蛍光標識を通して、被検分子によって誘導される細胞及び細胞内の形態構造、シグナル伝達経路並びに標的タンパク質の変化をも定量的に検出し、これによって、被検分子の固有の細胞表現型スペクトル特性を得ることができた。これにより、新規ＡＣｈＥＩをスクリーニングし、同定するための情報をより豊富に得られる。

【0062】

この実施例では、異なるタイプのＡＣｈＥＩ（神経剤ＶＸ、ＯＰ農薬パラオクソン、及びＡＤ薬ドネペジル）を代表として使用して、標的特異的活性を決めるためにＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行を検出し、同じ分析過程で、チャンネルの異なる蛍光標識を通して、細胞核、アクチン及びチューブリンの変化を例示的且つ定量的に分析した。これらは、外因性物質の干渉によって引き起こされる細胞及び細胞内の形態並びに細胞骨格の迅速な応答特性を反映するのみならず、毒性及び潜在的な機構の重要な指標にもなることができる。異なるタイプのＡＣｈＥＩで処理した細胞の４つのパラメーターの蛍光イメージング及び定量的結果を、図７に示した。ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴｃ１の核移行像に示されるように、ＶＸ、パラオクソン及びドネペジルはすべて、濃度依存的にＡＣｈＥの活性を阻害できるが、しかし、濃度活性曲線の範囲及び傾きが異なっていた。ＶＸ及びパラオクソンの傾きは基本的に同じであり、ドネペジルの傾きは顕著に小さいことから、ドネペジルがＡＣｈＥに結合する仕方が、ＶＸ及びパラオクソンとは異なることが示唆された（これは、基本的に文献報告と一致していた）。３つすべてが濃度依存的に細胞アクチン（アクチン）の発現レベルの増加を示した（図７のＡ及びＢ）が、曲線の傾きは全く異なっていた；３つすべてが核領域の増加を示した（図７のＡ及びＣ）が、しかし、濃度効果曲線が異なっていた；さらに、これら３つは、処理後、細胞内チューブリン分布が明らかに異なっていた（図７のＡ）、すなわち、ドネペジルは、１ｎＭから開始して、濃度依存的にチューブリン分布の増加を示したが、一方、ＶＸ及びパラオクソンは、細胞チューブリン分布が、濃度が増加するにつれてわずかに減少した。これらの結果は、ＡＣｈＥ活性を阻害するのに加えて、３者がそれぞれの表現型変化特性を示すことを示した；ＶＸ及びパラオクソンは両方ともＯＰであり、ＡＤ薬ドネペジルとは極めて異なる、より類似した細胞表現型特性を有していた。したがって、スクリーニングの目的に従って、表現型特性は、時点の拡張及び細胞表現型の変更によって際立たせることができ、最終的に、各被検物質の固有の表現型スペクトルを得て、スクリーニング及び同定のためのより多くの根拠を得ることができる。

【0063】

本開示の特定の実施形態を詳細に説明したが、当業者であれば、開示されている全ての教示に基づいて様々な修正及び変更を細部に加えることができ、これらの変更は本開示の保護の範囲内であることを理解するであろう。本開示の全体は、添付の特許請求の範囲及びその均等物から得られる。

【0064】

本出願は、２０２２年１月１９日に出願した中国出願第２０２２１００５９８８０．４号に基づき、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【手続補正書】

【提出日】2024-09-19

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法であって、
１）被スクリーニング試料を、アセチルコリンエステラーゼと混合するステップ；
２）ステップ１）で得られた混合系を、アセチルコリンと混合するステップ；
３）レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳを、ステップ２）で得られた混合系と接触させるステップ；
４）前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの活性化度を、検出するステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの活性化度を、前記レポーター細胞の細胞質から核へのＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰの移行度として表現し、
前記レポーター細胞内の前記ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰが細胞質から核へと移行する場合、前記被スクリーニング試料がアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含むと判断し、
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤のアセチルコリンエステラーゼに対する阻害活性を、細胞質から核へ移行した細胞内ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰの数に従って定量する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記アセチルコリンがヨウ化アセチルコリンであり、前記アセチルコリンエステラーゼが組換えヒトアセチルコリンエステラーゼである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ステップ１）において、前記被スクリーニング試料を、第１の溶媒の前記アセチルコリンエステラーゼと混合し；
ステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系を、第２の溶媒の前記アセチルコリンと混合し；
前記第１の溶媒及び前記第２の溶媒は、同じであるか、又は異なり、各々独立的に、前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの通常の増殖に適した培地である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

培地が、ＤＭＥＭ高グルコース培地である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、前記得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度が、０．００５～０．０１８Ｕ／ｍＬであり、
ステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系をアセチルコリンと混合した後、前記得られた混合系のアセチルコリンの初濃度が、１０～１０００ｎＭである、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

以下のｉ）及びｉｉ）の１以上により特徴づけられる、請求項６に記載の方法。
ｉ）前記得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度が、０．００７～０．０１５Ｕ／ｍＬである、
ｉｉ）前記得られた混合系のアセチルコリンの初濃度が、３０～８００ｎＭである。

【請求項8】

以下のｉ）及びｉｉ）の１以上により特徴づけられる、請求項７に記載の方法。
ｉ）前記得られた混合系のアセチルコリンエステラーゼの初濃度が、０．０１Ｕ／ｍＬである、
ｉｉ）前記得られた混合系のアセチルコリンの初濃度が、３０～５００ｎＭである。

【請求項9】

前記得られた混合系のアセチルコリンの初濃度が、３０～４００ｎＭである、請求項６に記載の方法。

【請求項10】

前記得られた混合系のアセチルコリンの初濃度が、３０～３００ｎＭである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記得られた混合系のアセチルコリンの初濃度が、３０～２００ｎＭである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記得られた混合系のアセチルコリンの初濃度が、３０～１００ｎＭである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ステップ１）において、前記被スクリーニング試料を、２５～４０℃の温度で、前記アセチルコリンエステラーゼと１０～６０分間混合し、
ステップ２）において、ステップ１）で得られた混合系を、２５～４０℃の温度で、前記アセチルコリンと１０～６０分間混合する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項14】

ステップ３）において、前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳを、ステップ２）で得られた混合系と１０～６０分間接触させる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項15】

ステップ４）の前に、
前記レポーター細胞を、リン酸緩衝液で希釈したホルムアルデヒド溶液で固定するステップ；
前記レポーター細胞の核及び／又は細胞骨格を染色するステップ
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項16】

ハイコンテント細胞イメージング及び分析システムが、レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの活性化度を検出するのに使用されている、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項17】

レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳ、アセチルコリン、アセチルコリンエステラーゼ及び蛍光色素を含む、キット。

【請求項18】

以下のｉ）～ｖｉ）の１以上により特徴づけられる、請求項１７に記載のキット。
ｉ）アセチルコリンがヨウ化アセチルコリンである、
ｉｉ）アセチルコリンエステラーゼが組換えヒトアセチルコリンエステラーゼである、
ｉｉｉ）蛍光色素がヘキスト３３３４２又はファロイジンである、
ｉｖ）前記レポーター細胞Ｍ３：ＮＦＡＴｃ１－ＥＧＦＰ Ｕ２ＯＳの増殖に適した培地を更に含む、
ｖ）リン酸緩衝物質、及びホルムアルデヒドを更に含む、
ｖｉ）請求項１に記載の方法を説明する説明書を更に含む。

【請求項19】

アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするための請求項１７又は１８に記載のキットの使用。

【請求項20】

請求項１７又は１８に記載のキットと、ハイコンテント細胞イメージング及び分析システムとを含む、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をスクリーニングするためのシステム。

【国際調査報告】