特表 2025-503119 化粧品に使用するためのペプチドおよび組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-30

(54)【発明の名称】化粧品に使用するためのペプチドおよび組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20250123BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20250123BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250123BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20250123BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20250123BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20250123BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20250123BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06 ZNA

A61K38/08

A61P43/00 111

A61K8/64

A61Q19/08

A61P17/00

A61P21/00

【審査請求】有

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024543517

(86)(22)【出願日】2023-02-15

(85)【翻訳文提出日】2024-07-23

(86)【国際出願番号】 EP2023053685

(87)【国際公開番号】W WO2023156413

(87)【国際公開日】2023-08-24

(31)【優先権主張番号】22382122.4

(32)【優先日】2022-02-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519271311

【氏名又は名称】リポトゥルー，エセ．エレ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】グラウ－カンピスタニー，アリアドナ

(72)【発明者】

【氏名】パストル，シルヴィア

(72)【発明者】

【氏名】カルラ，パトリシア

(72)【発明者】

【氏名】エスクデロ，フアン カルロス

(72)【発明者】

【氏名】クレイン，マルコ ハン

(72)【発明者】

【氏名】トリム，スティーブン アンソニー

【テーマコード（参考）】

4C083

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C083AD411

4C083AD412

4C083BB51

4C083CC02

4C083EE12

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA16

4C084BA17

4C084BA23

4C084NA14

4C084ZA89

4C084ZA94

4C084ZC41

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA50

4H045EA15

4H045FA20

4H045FA61

(57)【要約】

本発明は、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの活性および／またはシグナルを低下させることができる４個～８個のアミノ酸のペプチドを指す。前記ペプチドはまた、細胞外マトリックスの産生を促進することもできる。また、本明細書には、前記ペプチドを含む組成物、およびシワの治療のための化粧品の分野における本発明のペプチドおよび組成物の使用も開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種類のナトリウムチャネルの活性および／またはシグナルを低下させることができる５個～８個のアミノ酸のペプチド；その許容される異性体、塩、溶媒和物、誘導体および／またはそれらの混合物、ここで、前記ペプチドは式（Ｉ）の配列を含み：
Ｒ_１－ＡＡ１－ＡＡ２－ＡＡ３－ＡＡ４－ＡＡ５－ＡＡ６－Ｒ_２
（Ｒ_１－配列番号７－Ｒ_２）
ここで、ＡＡ１は、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＩｌｅから選択され；
ＡＡ２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＧｌｕから選択され；
ＡＡ３は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＨｉｓから選択され；
ＡＡ４は、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＴｒｐから選択され；
ＡＡ５は、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＴｒｐから選択され；
ＡＡ６は存在しないか、またはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択され；
Ｒ_１は、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルおよびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換もしくは非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換もしくは非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３員～１０員の置換もしくは非置換のヘテロシクリル環、ならびに、２個～２４個の炭素原子および１個～３個の炭素以外の原子および１個～６個の炭素原子のアルキル鎖の置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族基、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルから選択され；
あるいは、Ｒ_１およびＲ_２は存在せず、ＡＡ１は前記ペプチドの最後のアミノ酸に直接結合している、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの活性および／またはシグナルを低下させることができる５個～８個のアミノ酸のペプチド；その許容される異性体、塩、溶媒和物、誘導体および／またはそれらの混合物。

【請求項2】

前記ペプチドは、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの発現をダウンレギュレートすることが可能であり、および／または、少なくとも１個の神経伝達物質のレベルを低下させることが可能であり、および／または、ＥＣＭを維持および／または合成することが可能であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

前記ナトリウムチャネルは電位依存性ナトリウムチャネルである、請求項２に記載のペプチド。

【請求項4】

前記電位依存性ナトリウムチャネルは、Ｎａｖ１．３および／またはＮａｖ１．４である、請求項３に記載のペプチド。

【請求項5】

前記神経伝達物質は、ノルアドレナリンである、請求項２に記載のペプチド。

【請求項6】

前記ＥＣＭは、コラーゲンＩ、エラスチン、ヒアルロン酸またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載のペプチド。

【請求項7】

式（Ｉ）の配列を有し：
Ｒ_１－ＡＡ１－ＡＡ２－ＡＡ３－ＡＡ４－ＡＡ５－ＡＡ６－Ｒ_２
（Ｒ_１－配列番号７－Ｒ_２）
ここで、
ＡＡ１は、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＩｌｅから選択され；
ＡＡ２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＧｌｕから選択され；
ＡＡ３はＡｒｇ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＨｉｓから選択され；
ＡＡ４は、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＴｒｐから選択され；
ＡＡ５は、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＴｒｐから選択され；
ＡＡ６は存在しないか、またはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択され；
Ｒ_１は、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルおよびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換もしくは非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換もしくは非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３員～１０員の置換もしくは非置換のヘテロシクリル環、ならびに、２個～２４個の炭素原子および１個～３個の炭素以外の原子および１個～６個の炭素原子のアルキル鎖の置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族基、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルから選択され；
あるいは、Ｒ_１およびＲ_２は存在せず、ＡＡ１は前記ペプチドの最後のアミノ酸に直接結合していることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項8】

前記ペプチドは以下から選択され：
Ｒ_１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｒ_２；
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ｒ_２；または
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｒ_２
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｒ_２；
Ｒ_１－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｒ_２；または
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｒ_２
ここで、
Ｒ_１は、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルおよびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換もしくは非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換もしくは非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３員～１０員の置換もしくは非置換のヘテロシクリル環、ならびに、２個～２４個の炭素原子および１個～３個の炭素以外の原子および１個～６個の炭素原子のアルキル鎖の置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族基、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルから選択され；
あるいは、Ｒ_１およびＲ_２は存在せず、ＡＡ１は前記ペプチドの最後のアミノ酸に直接結合していることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項9】

Ｒ_１はＨであり、および／または、Ｒ_２はＮＨ_２であることを特徴とする、請求項７または８のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載のペプチドを含む、組成物。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１０に記載の組成物のそれを必要とする対象における、化粧品としての使用。

【請求項12】

前記化粧品としての使用は、皮膚の老化の徴候を軽減し、予防し、および／または除去することであることを特徴とする、請求項１１に記載の化粧品としての使用。

【請求項13】

前記皮膚の老化の徴候は、シワであることを特徴とする、請求項１２に記載の化粧品としての使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔発明の分野〕
本発明は、分子生物学の分野に関し、より正確には、化粧品に適用される分子生物学に関し、さらにより正確には、シグナルおよび／またはその発現の減少を提供するナトリウムチャネルを調節することができ、したがって筋弛緩または筋収縮の減少を提供することができるペプチドおよび前記ペプチドを含む組成物に関する。前記ペプチドおよび前記ペプチドを含む組成物はまた、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を維持および／または合成もしくは増加させることもできる。したがって、前記ペプチドおよび組成物は、上記の態様（例えば、筋弛緩またはＥＣＭの維持もしくは合成）の調節に関連する状態の治療に有効であり、化粧品に有用である（抗シワ活性、皮膚の弛みもしくは緩みに対する活性、皮膚のハリおよび／または弾力性の改善）。

【0002】

〔背景技術〕
近年、健康で若々しい外観の皮膚を維持するために、皮膚の欠点を予防、軽減または除去することに対する人々の関心が高まっている。このため、皮膚の欠点の出現につながる原因、および、これらの欠点を予防または緩和できる化合物および組成物の探索に対する関心が高まっている。

【0003】

シワ（例えば、表情ジワ）の形成の基礎またはメカニズムは、皮膚を内側に引きずり込む筋肉の緊張である。この筋肉の緊張は、対応する筋肉を支配する神経の過活動の結果である。前記神経の過活動は、次いで、筋線維を興奮させる神経伝達物質の制御されない過剰な放出によって特徴付けられる。

【0004】

これに関連して、シワと上記の発生メカニズムとに対するいくつかの化粧品的アプローチが生み出されてきた。例えば：
ボツリヌス毒素：表情ジワを軽減および／または除去する目的で広く使用されている。特に血清型Ａ（ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ、Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｃ．）。前記ボツリヌス毒素は局所的に注射され、その麻痺効果は可逆的であり、平均持続期間は６ヶ月であるため、繰り返し注射する必要がある。ボツリヌス製剤に対する免疫反応を誘発し、治療効果が失われる危険性があることが知られている。この問題を克服するために、Ｂ、Ｆ、およびＥなどの他の血清型のボツリヌス毒素も検討されているが、前記血清型にも免疫反応を誘発する危険性がある。分子レベルでは、ボツリヌス毒素はカルシウムイオン活性化エキソサイトーシスメカニズムに関与する神経細胞タンパク質を分解するプロテアーゼである。例えば、ボツリヌス毒素Ａは神経細胞のＳＮＡＰ－２５タンパク質を切断する。

【0005】

ＳＮＡＲＥ複合体を形成するタンパク質の配列に由来する特定のペプチドは、例えば、ＳＮＡＰ－２５のアミノおよびカルボキシルドメインに由来するペプチド（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／３４６２０、欧州特許ＥＰ１１８０５２４Ｂ１および欧州特許ＥＰ２１２３６７３Ｂ１を参照のこと）；シナプトブレビンまたはシンタキシンに由来するペプチド（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／３４６２０；Blanes-Mira,C., Clemente, J., Jodas, G., Gil, A., Fernandez-Ballester, G., Ponsati, B., Gutierrez, L., Perez-Paya, E., Ferrer-Montiel, A. A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity. International Journal of Cosmetic Science, (2002), 24, 303-310を参照のこと）；およびＭｕｎｃ１８とＳｙｎｔａｘｉｎ－１との相互作用の表面に位置する特異的配列と競合するペプチド（ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５４４７９を参照のこと）などの神経細胞のエキソサイトーシスを阻害し得ることも、当技術分野において知られている。

【0006】

当技術分野において、Ａｃｔｉｖｅｎ ＸＥＰ－０１８（商標）という名のコノトキシンも存在する。これは、インド・西太平洋地域からのイモガイ毒（Ｃｏｎｕｓ ｃｏｎｓｏｒｓ）を模倣した生体模倣ペプチドで、ボトックス様活性を示す。生物学的には、神経筋伝達のモジュレーターとして、ならびに電位依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．４の強力かつ選択的なブロッカーとして作用する。化粧品的には、即効性のほうれい線緩和剤として作用し、滑らかな肌の外観を与える。

【0007】

しかし、抗シワ活性を有し、ＥＣＭの維持および合成に役立ち得る新しい分子（好ましくは、ペプチド）を見つける必要性が依然として存在する。

【0008】

〔発明の説明〕
電位依存性ナトリウムチャネルは、活動電位の伝搬を管理することで神経シグナル伝達を制御している。ナトリウムチャネルを阻害すると、神経に沿った活動電位の流れが減少し、したがってシグナルの効果が低下する。皮膚では、ＮａＶ１．３および近縁のＮａＶ１．４などのナトリウムチャネルが、表皮、皮下脂肪組織、骨格筋、および神経に認められる。これらのシステムは、皮膚の筋肉トーン、ひいては肌におけるシワ（wrinkles）の深さおよびシワ（creases）を改善する。

【0009】

この意味で、Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ（二ホンフグ、トラフグ）は、肝臓および卵巣にテトロドトキシン（ＴＴＸ）が存在するために極めて有毒であるにもかかわらず、日本では珍重される食用魚であることが注目される。ＴＴＸは、電位依存性ナトリウムチャネルに特異的に結合する強力な毒素である。ＴＴＸは、電位依存性ナトリウムチャネルに物理的に結合し、前記チャネルを通るナトリウムイオンの流れを遮断し、それによって活動電位（ＡＰ）の発生および伝播を妨げる。さらに、前記フグは弾力性のある皮膚でよく知られており、捕食者を抑止するために体を膨らませることができ、危険を乗り越えると短時間で元の形態に回復する。したがって、ヒトの皮膚に対する前記ペプチドには、いくつかの重要な相補的活性が潜在的に同定される可能性があり、その結果、筋肉に関連したシワまたは表情ジワ、および年代的なシワの両方を含むシワに対してプラスの影響を与える可能性がある。

【0010】

本発明者らは、広範かつ徹底的な研究の結果、驚くべきことに、Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ（ニホンフグ、トラフグ）に由来するペプチド（それらのタンパク質またはゲノム由来）および／または保存的置換によってそれらに由来するペプチドが、適切な化粧品用抗シワ活性を提供することを見出した。前記ペプチドは、電位依存性ナトリウムチャネルの調節（前記チャネルによって提供されるシグナルまたは活性を減少させる）によって、必要な筋肉弛緩活性を提供することができる。さらに、本発明のペプチドはまた、電位依存性ナトリウムチャネルの発現を調節すること（前記チャネルの発現をダウンレギュレートまたは減少させること）、およびノルアドレナリンの放出を調節すること（前記神経伝達物質のレベルを減少させ、したがって前記神経伝達物質の放出を減少させること）が可能であることも示されている。さらに、本発明のペプチドはまた、コラーゲンＩ、エラスチン、およびヒアルロン酸などの主要な細胞外マトリックス（以下、ＥＣＭ）成分の発現を、遺伝子およびタンパク質の発現レベルでアップレギュレートすることもできる。これらのことは、シワ（好ましくは、年代的なシワ、および、筋肉由来のシワまたは表情ジワの両方）の治療、予防および／または軽減；皮膚の弛みまたは緩みの治療、予防および／または軽減；皮膚の荒れの治療、予防および／または軽減；ならびに皮膚のハリおよび／または弾力性の改善のための化粧品における本発明のペプチドの有用性を実証する。

【0011】

筋弛緩のために電位依存性ナトリウムチャネルを遮断する（シグナル伝達および／またはその活性を低下させる）ことは、まだ広く研究されておらず、現在市場で広く使用されている製品の作用メカニズムとは明らかに異なる興味深い作用メカニズムである。本発明のペプチドは、神経筋接合部に到達する前に神経伝達を減少させる。

【0012】

さらに、本発明のペプチドは、そのサイズにより、例えば、安定性の増加または延長、および好ましくは皮膚からの浸透の増加または改善などの固有の利点を有する。

【0013】

第１の態様において、本発明は、少なくとも１種類のナトリウムチャネルのシグナルおよび／または活性を低下させることができ、したがって抗シワ活性を有する、４個～８個のアミノ酸のペプチドに関する。

【0014】

第２の態様において、本発明は、本発明のペプチドを含む組成物に関する。

【0015】

さらなる態様において、本発明は、治療を必要とする対象における、本発明のペプチドまたは本発明の組成物の化粧品としての使用に関する。

【0016】

第４の態様において、本発明は、治療を必要とする対象における本発明のペプチドまたは本発明の組成物の化粧品的な使用に関する。

【0017】

最終的な態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における皮膚の老化の徴候を軽減、予防および／または除去する方法に関する。

【0018】

本明細書で使用される場合、用語「非環式脂肪族基」およびその複数形は、当技術分野において前記用語に与えられる一般的な意味を有する。したがって、これらの用語は、例えば、これらに限定されないが、直鎖状または分枝状のアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基を指す。

【0019】

本明細書で使用される場合、用語「アルキル基」およびその複数形は、飽和、直鎖状または分枝状の基を指し、１個～２４個、好ましくは１個～１６個、より好ましくは１個～１４個、さらにより好ましくは１個～１２個、さらによりいっそう好ましくは１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りの部分と結合しており、例えば、これらに限定されないが、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、ラウリル、ヘキサデシル、オクタデシル、アミル、２－エチルヘキシル、２－メチルブチル、５－メチルヘキシルおよび類似物を含む。アルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプト、およびアルコキシチオなどの１個以上の置換基によって任意に置換され得る。

【0020】

本明細書で使用される場合、用語「アルケニル基」およびその複数形は、直鎖状または分枝状の基を指し、２個～２４個、好ましくは２個～１６個、より好ましくは２個～１４個、さらにより好ましくは２個～１２個、さらによりいっそう好ましくは２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有し、共役または非共役の、１個以上の炭素－炭素二重結合、好ましくは１個、２個または３個の炭素－炭素二重結合を有し、単結合を介して分子の残りの部分と結合しており、例えば、これらに限定されないが、ビニル基、オレイル基、リノレイル基および類似の基を含む。アルケニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１個以上の置換基によって任意に置換され得る。

【0021】

本明細書で使用される場合、用語「アルキニル基」およびその複数形は、直鎖状または分枝状の基を指し、２個～２４個、好ましくは２個～１６個、より好ましくは２個～１４個、さらにより好ましくは２個～１２個、さらによりいっそう好ましくは２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有し、共役または非共役の、１個以上の炭素－炭素三重結合、好ましくは、１個、２個または３個の炭素－炭素三重結合を有し、単結合を介して分子の残りの部分に結合しており、例えば、これらに限定されないが、エチニル基、１－プロピニル、２－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、３－ブチニル、ペンチニル（１－ペンチニルなど）および類似の基を含む。アルキニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１個以上の置換基によって任意に置換され得る。

【0022】

本明細書で使用される場合、用語「脂環式基」およびその複数形は、当技術分野において前記用語に与えられる一般的な意味を有する。したがって、これらの用語は、例えば、これらに限定されないが、シクロアルキル基またはシクロアルケニル基またはシクロアルキニル基を指すために使用される。

【0023】

本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキル」およびその複数形は、飽和単環脂肪族基または飽和多環脂肪族基を指し、３個～２４個、好ましくは３個～１６個、より好ましくは３個～１４個、さらにより好ましくは３個～１２個、さらによりいっそう好ましくは３個、４個、５個または６個の炭素原子を有し、単結合を介して分子の残りの部分に結合しており、例えば、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、メチルシクロヘキシル、ジメチルシクロヘキシル、オクタヒドロインデン、デカヒドロナフタレン、ドデカヒドロ－フェナレン、アダマンチルおよび類似物を含む。シクロアルキルは、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１個以上の基によって任意に置換され得る。

【0024】

本明細書で使用される場合、用語「シクロアルケニル」およびその複数形は、非芳香族単環脂肪族基または非芳香族多環脂肪族基を指し、５個～２４個、好ましくは５個～１６個、より好ましくは５個～１４個、さらにより好ましくは５個～１２個、さらによりいっそう好ましくは５個または６個の炭素原子を有し、共役または非共役の、１個以上の炭素－炭素二重結合、好ましくは１個、２個または３個の炭素－炭素二重結合を有し、単結合を介して分子の残りの部分と結合しており、例えば、これらに限定されないが、シクロペント－１－エン－１－イル基および類似の基を含む。シクロアルケニルは、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１個以上の基によって任意に置換され得る。

【0025】

本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキニル」およびその複数形は、非芳香族単環式脂肪族基または非芳香族多環式脂肪族基を指し、８個～２４個、好ましくは８個～１６個、より好ましくは８個～１４個、さらにより好ましくは８個～１２個、さらによりいっそう好ましくは８個または９個の炭素原子を有し、共役または非共役の、１個以上の炭素－炭素三重結合、好ましくは１個、２個または３個の炭素－炭素三重結合を有し、単結合を介して分子の残りの部分と結合しており、例えば、これらに限定されないが、シクロオクト－２－イン－１－イル基および類似物を含む。シクロアルキニルは、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１個以上の基によって任意に置換され得る。

【0026】

本明細書で使用される場合、用語「アリール基」およびその複数形は、芳香族基を指し、６個～３０個、好ましくは６個～１８個、より好ましくは６個～１０個、さらにより好ましくは６個または１０個の炭素原子を有し、１個、２個、３個または４個の芳香族環を含み、炭素－炭素結合によって結合しているか、または縮合しており、単結合を介して分子の残りの部分に結合しており、例えば、これらに限定されないが、特に、フェニル、ナフチル、ジフェニル、インデニル、フェナントリルまたはアントラニルを含む。アリール基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１個以上の置換基によって任意に置換され得る。

【0027】

本明細書で使用される場合、用語「アラルキル基」およびその複数形は、芳香族基によって置換されたアルキル基を指し、７個～２４個の炭素原子を有し、例えば、これらに限定されないが、－（ＣＨ_２）１－６－フェニル、－（ＣＨ_２）１－６－（１－ナフチル）、－（ＣＨ_２）１－６－（２－ナフチル）、－（ＣＨ_２）１－６－ＣＨ（フェニル）_２、および類似物を含む。アラルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１個以上の置換基によって任意に置換され得る。

【0028】

本明細書で使用される場合、用語「複素環基」およびその複数形は、３員～１０員のヘテロシクリルまたは炭化水素環を指し、環原子の１個以上、好ましくは環原子の１個、２個または３個が、窒素、酸素または硫黄などの炭素とは異なる元素であり、飽和または不飽和であってもよい。本発明の目的のために、ヘテロシクリルは、縮合環系を含み得る環式系、単環式系、二環式系または三環式系であり得；窒素原子、炭素原子または硫黄原子は、ヘテロシクリルラジカルにおいて任意に酸化され得；窒素原子は、任意に四級化され得；ヘテロシクリルラジカルは、部分的または完全に飽和していてもよく、または芳香族であってもよい。好ましくは、ヘテロシクリルという用語は、５員環または６員環に関する。複素環基は、１個以上の置換基、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどによって任意に置換され得る。

【0029】

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールアルキル基」およびその複数形は、置換もしくは非置換の芳香族ヘテロシクリル基によって置換されたアルキル基を指し、当該アルキル基は１個から６個までの炭素原子を有し、当該芳香族ヘテロシクリル基は２個～２４個の炭素原子および１個から３個の炭素以外の原子を有し、例えば、これらに限定されないが、－（ＣＨ_２）１－６－イミダゾリル、－（ＣＨ_２）１－６－トリアゾリル、－（ＣＨ_２）１－６－チエニル、－（ＣＨ_２）１－６－フリル、－（ＣＨ_２）１－６－ピロリジニルおよび類似物を含む。ヘテロアリールアルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ－カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１個以上の置換基によって任意に置換され得る。

【0030】

本明細書で使用される場合、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指し、その陰イオンはハロゲン化物を指す。

【0031】

本明細書で使用される場合、用語「誘導体」およびその複数形は、化粧品として許容される化合物、すなわち、化粧品の調製に使用され得る目的の化合物から誘導される化合物、および化粧品として許容されない誘導体を指す。これは、これらが化粧品として許容される誘導体の調製に有用であり得るからである。

【0032】

本明細書で使用される場合、用語「塩」およびその複数形は、当技術分野において公知のものの中から任意の種類の塩、例えば、ハロゲン化物塩、ヒドロキシ酸塩（オキシ酸塩、酸塩、塩基性塩および二重塩など）、ヒドロキシ塩、混合塩、オキシ塩または他の水和塩を指す。この用語は、化粧品として許容される塩；および化粧品として許容されない塩を含む。これは、後者が化粧品として許容される塩の調製に有用であり得るからである。

【0033】

本明細書で使用される場合、用語「異性体」およびその複数形は、光学異性体、鏡像異性体、立体異性体またはジアステレオ異性体を指す。個々の鏡像異性体またはジアステレオ異性体、ならびにそれらの混合物は、当技術分野において公知の従来技術によって分離され得る。

【0034】

本明細書で使用される場合、用語「溶媒和物」およびその複数形は、極性溶媒和物、無極性溶媒和物または両親媒性溶媒和物など、当技術分野において公知の任意の溶媒和物を指し、関心対象に（直接的または間接的に）投与または適用されると、関心対象の化合物（本発明のペプチド（peptide）またはペプチド（peptides））をもたらす、任意の化粧品として許容される溶媒和物を含む。好ましくは、溶媒和物は、水和物、アルコール（メタノール、エタノール、プロパノールまたはイソプロパノールなど）との溶媒和物、エステル（酢酸エチルなど）との溶媒和物、エーテル（メチルエーテル、エチルエーテルまたはＴＨＦ（テトラヒドロフラン）など）との溶媒和物またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）との溶媒和物であり、より好ましくは、水和物またはアルコール（エタノールなど）との溶媒和物である。

【0035】

さらに、本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」およびその複数形は、遺伝暗号によってコード化されたアミノ酸だけでなく、天然であるか否か、およびＤ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸であるか否かにかかわらず、未コード化アミノ酸も含む。未コード化アミノ酸の例は、特に限定されないが、特に、シトルリン、オルニチン、サルコシン、デスモシン、ノルバリン、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸、２－アミノイソ酪酸、６－アミノヘキサン酸、１－ナフチルアラニン、２－ナフチルアラニン、２－アミノ安息香酸、４アミノ安息香酸、４－クロロフェニルアラニン、２，３－ジアミノプロピオン酸、２，４ジアミノ酪酸、シクロセリン、カルニチン、システイン、ペニシラミン、ピログルタミン酸、チエニルアラニン、ヒドロキシプロリン、アロ－イソロイシン、アロ－トレオニン、イソニペコチン酸、イソセリン、フェニルグリシン、スタチン、β－アラニン、ノルロイシン、Ｎ－メチルアミノ酸、α－アミノ酸およびβ－アミノ酸、ならびにそれらの誘導体である。それにもかかわらず、さらなる非天然アミノ酸は、当技術分野において知られている（例えば、“Unusual amino acids in peptide synthesis”by D. C. Roberts and F. Vellaccio, The Peptides, Vol. 5 (1983), Chapter VI, Gross E. and Meienhofer J., Eds., Academic Press, New York, USAを参照のこと）。

【0036】

本明細書で使用される場合、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に関する「同一性の割合」は、当技術分野において一般的に帰属される意味を有し、したがって、これらの配列の最適アラインメントの後に比較される２個のアミノ酸配列の間で同一であるアミノ酸の割合に関連し、ここで、前記割合は、単に統計的であり、２個のアミノ酸配列の間の差異は、配列全体にランダムに分布する。「最適アラインメント」は、より大きな同一性の割合をもたらすアミノ酸配列のアラインメントとして理解される。同一性の割合は、２個の比較された配列においてアミノ酸が同一である同一位置の数を決定し、同一位置の数を比較された位置の数で割り、得られた結果に１００を乗じて２個の配列間の同一性の割合を得ることによって計算される。２個のアミノ酸配列間の配列比較は、手作業で行うこともできるし、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）アルゴリズムなどの、当技術分野において公知のコンピュータプログラムによって行うこともできる。

【0037】

上述のように、第１の態様において、本発明は、少なくとも１種類のナトリウムチャネルのシグナルおよび／または活性を低下させることができる４アミノ酸以上８アミノ酸以下のペプチド（すなわち、４個～８個のアミノ酸を含むペプチド、より好ましくは、４個～８個のアミノ酸を有するペプチド、より好ましくは、本質的に４個～８個のアミノ酸からなるペプチド、より好ましくは、４個～８個のアミノ酸からなるペプチド）；その許容される異性体、塩、溶媒和物誘導体および／またはそれらの混合物を指す。

【0038】

上述のように、本発明のペプチドは、好ましくは、フグのタンパク質および／またはフグのゲノムに由来する。フグは、現在知られている、または将来発見される任意のフグであり得る。より好ましくは、フグは、Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ（二ホンフグ、トラフグ）である。本発明のペプチドはまた、好ましくは、保存的置換によって、フグのタンパク質および／またはフグのゲノムに由来するペプチドから得られるか、または誘導されるペプチドであり得る。

【0039】

本発明のペプチドに使用される、または存在するアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはそれらの組み合わせであることが企図される。好ましい実施形態において、本発明のペプチドに使用される、または存在するアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。

【0040】

好ましくは、上記の異性体は立体異性体である。前記立体異性体は、鏡像異性体またはジアステレオ異性体であることが企図される。したがって、本発明の好ましい実施態様において、ペプチドは、ラセミ混合物、ジアステレオマー混合物、純粋な鏡像異性体または純粋なジアステレオ異性体である。

【0041】

さらに、異性体、塩、溶媒和物、誘導体および／またはその混合物は、好ましくは、化粧品として許容される異性体、塩、溶媒和物、誘導体および／またはその混合物である。

【0042】

以下に含まれる実施例から直接導き出され得るように、本発明のペプチドは、ナトリウムチャネルの調節を提供し、少なくとも１種類のナトリウムチャネルのシグナルおよび／または活性の減少として現れる。少なくとも１種類のナトリウムチャネルの活性および／またはシグナルの前記減少は、好ましくは、前記少なくとも１種類のナトリウムチャネルによってもたらされる電流の減少、すなわち活動電位の減少である。

【0043】

上記のナトリウムチャネルは、好ましくは電位依存性ナトリウムチャネルである。

【0044】

少なくとも１種類のナトリウムチャネルは、任意の種類のナトリウムチャネルであり得る。ナトリウムチャネルの例は、ＮａＶ１．１、ＮａＶ１．２、ＮａＶ１．３、ＮａＶ１．４、ＮａＶ１．５、ＮａＶ１．６、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８およびＮａＶ１．９である。本発明のペプチドは、１種類のナトリウムチャネルあるいは数種類（２種類以上）のナトリウムチャネルの活性および／またはシグナルを低下させることが可能であることが企図される。

【0045】

実施形態において、本発明のペプチドは、少なくとも、前記ナトリウムチャネルＮａｖ１．３の活性および／またはシグナルを低下させ、より好ましくは、本発明のペプチドは、前記ナトリウムチャネルＮａＶ１．３の活性および／またはシグナルのみを低下させる。

【0046】

さらなる実施形態において、本発明のペプチドは、少なくとも、前記ナトリウムチャネルＮａＶ１．４の活性および／またはシグナルを低下させ、より好ましくは、本発明のペプチドは、前記ナトリウムチャネルＮａＶ１．４の活性および／またはシグナルのみを低下させる。

【0047】

好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、少なくとも前記ナトリウムチャネルＮａｖ１．３およびＮａＶ１．４のシグナルおよび／または活性を低下させ、より好ましくは、本発明のペプチドは、前記ナトリウムチャネルＮａＶ１．３およびＮａＶ１．４の活性および／またはシグナルのみを低下させる。

【0048】

本発明のペプチドは、ナトリウムチャネルが存在する場所であればどこでも、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの活性および／またはシグナルを低下させることが可能であることに留意されたい。好ましくは、本発明のペプチドは、シナプス前レベルで、好ましくはニューロンにおいて、少なくとも１個のナトリウムチャネルの活性および／またはシグナルを低下させる。

【0049】

本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも１種類のナトリウムチャネルのシグナルおよび／または活性を低下させることは、少なくとも１種類のナトリウムチャネルを遮断することを意味し、部分的な遮断または全体的な遮断であり得、より好ましくは部分的な遮断である。

【0050】

さらに、いくつかの実施形態において、この実施形態は、上述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、本発明のペプチドはまた、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの発現を調節することが可能であり、より好ましくは、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの発現をダウンレギュレートすることが可能である。少なくとも１種類のナトリウムチャネルは、上記で説明した通りである。これらの実施形態において、本発明のペプチドは、前記ナトリウムチャネルが発現している場所であればどこでも、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの発現をダウンレギュレートすることが可能である。好ましくは、本発明のペプチドは、シナプス後レベルで、好ましくは筋肉細胞において、より好ましくは骨格筋細胞において、少なくとも１個のナトリウムチャネルの発現をダウンレギュレートする。

【0051】

さらに、いくつかの実施形態において、この実施形態は、上述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、本発明のペプチドはまた、ＥＣＭの維持および／または合成、より正確にはＥＣＭの維持の促進および／またはＥＣＭ成分の合成の促進および／または増加も可能である。本発明のペプチドは、ＥＣＭの関連遺伝子およびタンパク質の発現をアップレギュレートすることによって前記活性を発揮し；より好ましくは、本発明のペプチドは、ＥＣＭの合成および／または維持を担う少なくとも１つの遺伝子および／またはタンパク質をアップレギュレートすることが可能であり；より好ましくは、本発明のペプチドはまた、コラーゲンＩ、エラスチン、ヒアルロン酸またはそれらの組み合わせから選択される、ＥＣＭの合成および／または維持を担う少なくとも１つの遺伝子および／またはタンパク質をアップレギュレートすることが可能であり；さらにより好ましくは、本発明のペプチドはまた、コラーゲンＩ、エラスチンおよびヒアルロン酸を、全て遺伝子および／またはタンパク質レベルでアップレギュレートすることが可能である。

【0052】

好ましい実施形態において、この実施形態は、上述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、本発明のペプチドは、タンパク質レベルで、エラスチン、プロコラーゲンＩα１およびヒアルロン酸の合成（したがって、そのレベル）を増加することが可能である。

【0053】

さらに好ましい実施態様において、この実施態様は、上述のいずれかの実施態様と組み合わせることができ、本発明のペプチドは、ＥＣＭの分解をもたらす遺伝子の発現をダウンレギュレートすることが可能であり、および／またはＥＣＭの維持または合成をもたらす遺伝子をアップレギュレートすることが可能である。より好ましくは、ダウンレギュレートされる遺伝子は、ＭＭＰ１、ＨＹＡＬ１またはそれらの組み合わせから選択され；アップレギュレートされる遺伝子は、ＴＩＭＰ２、ＨＡＳ１、ＦＢＬＮ５、ＬＯＸＬ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１またはそれらの組み合わせから選択される。さらにより好ましくは、ダウンレギュレートされた遺伝子は、ＭＭＰ１およびＨＹＡＬ１であり、アップレギュレートされた遺伝子は、ＴＩＭＰ２、ＨＡＳ１、ＦＢＬＮ５、ＬＯＸＬ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ７Ａ１である。

【0054】

本発明のペプチドは、少なくとも線維芽細胞において、ＥＣＭを維持および／または合成する（より好ましくは、ＥＣＭの維持を促進する、および／またはＥＣＭの合成を促進および／または増加させる）上述の活性を発揮することが可能である。

【0055】

さらなる実施形態において、この実施形態は、上述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、本発明のペプチドは、少なくとも１個の神経伝達物質、より好ましくはノルアドレナリンのレベルまたは量を減少させる。少なくとも１個の神経伝達物質のレベルの前記減少は、好ましくはシナプス前レベルで、好ましくはニューロンにおいて行われる。容易に誘導可能なように、少なくとも１個の神経伝達物質のレベルまたは量の減少は、前記神経伝達物質の分泌の減少または抑制につながる。

【0056】

上記の活性は、以下に含まれる実施例において実証されており、本発明のペプチドが筋弛緩を誘導または生成する（または筋収縮または過剰な筋収縮を回避する）能力を提供し、これは、順に抗シワ効果（好ましくは、表情ジワに対して）を提供する。さらに、上記の活性はまた、本発明のペプチドの、年代的なシワ（好ましくは、その深さ、長さおよび／または粗さ）の予防および／または軽減；弛みまたは緩んだ皮膚の治療、予防および／または軽減；ならびに皮膚のハリおよび弾力性の改善に対する有用性を検証する。

【0057】

好ましい実施形態において、この実施形態は、上述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、本発明のペプチドは、５個または６個のアミノ酸のペプチド（すなわち、５個または６個のアミノ酸を含むペプチド、より好ましくは、５個または６個のアミノ酸を有するペプチド、より好ましくは、本質的に５個または６個のアミノ酸からなるペプチド、より好ましくは、５個または６個のアミノ酸からなるペプチド）である。

【0058】

さらに、好ましくは、本発明のペプチドは、上述の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１個の荷電アミノ酸（正または負）を含む。さらにより好ましくは、１位のアミノ酸および／または２位のアミノ酸は、荷電アミノ酸（正または負）である。いっそうより好ましくは、本発明のペプチドにおいて、最初の３個のアミノ酸は荷電アミノ酸（正または負）である。

【0059】

好ましい実施形態において、この実施形態は、上述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、本発明のペプチドにおいて、１位および３位のアミノ酸は正に荷電したアミノ酸であり、２位のアミノ酸は正または負に荷電したアミノ酸である。

【0060】

さらに、好ましくは、上記の実施形態のいずれかにおいて、本発明のペプチドにおいて、アミノ酸の残りの部分は、電荷を持たない極性、無極性および／または芳香族である。さらに、好ましくは、存在する場合、５位のアミノ酸は芳香族であり、好ましくはＴｙｒまたはＴｒｐから選択される。また好ましくは、存在する場合、６位のアミノ酸は電荷を持たない極性または無極性である。

【0061】

したがって、好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、少なくとも１個の芳香族アミノ酸、より好ましくは、１個または２個の芳香族アミノ酸を含む。さらにより好ましくは：
本発明のペプチドが５個のアミノ酸を有する場合、１個の芳香族アミノ酸を有し、より好ましくは５位に有する。この場合、芳香族アミノ酸は好ましくはＴｙｒである。

【0062】

本発明のペプチドが６個のアミノ酸を有する場合、２個の芳香族アミノ酸を有し、１個は４位にあり、もう１個は５位にある。この場合、芳香族アミノ酸はＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅまたはそれらの組み合わせから選択される。

【0063】

上記の実施形態のいずれかにおいて、荷電アミノ酸（正または負）は、好ましくは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐから選択される。

【0064】

したがって、好ましい実施形態において、本発明のペプチドにおいて、１位の荷電アミノ酸はＬｙｓである。さらにより好ましくは、本発明のペプチドにおいて、ペプチドの最初の３個のアミノ酸は、Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ、Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ、Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＡｒｇまたはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓである。

【0065】

好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、式（Ｉ）の配列を有する：
Ｒ_１－ＡＡ１－ＡＡ２－ＡＡ３－ＡＡ４－ＡＡ５－ＡＡ６－Ｒ_２
（Ｒ_１－配列番号７－Ｒ_２）
ここで、
ＡＡ１は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＨｉｓから選択され；
ＡＡ２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＡｓｐまたはＧｌｕから選択され；
ＡＡ３は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＨｉｓから選択され；
ＡＡ４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＴｒｐから選択され；
ＡＡ５は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＴｒｐから選択され；
ＡＡ６は存在しないか、またはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、ＡｓｎまたはＧｌｎから選択され；
Ｒ_１は、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルおよびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換もしくは非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換もしくは非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３員～１０員の置換もしくは非置換のヘテロシクリル環、ならびに、２個～２４個の炭素原子および１個～３個の炭素以外の原子および１個～６個の炭素原子のアルキル鎖の置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族基、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルから選択され；
あるいは、Ｒ_１およびＲ_２は存在せず、ＡＡ１は前記ペプチドの最後のアミノ酸、すなわちＡＡ６またはＡＡ６が存在しない場合にはＡＡ５に直接結合している（環式ペプチドを形成する）。

【0066】

Ｒ_１は、ペプチドのＮ末端、すなわちＡＡ１のアミノ基に連結される（ＡＡ１のアミノ基からＨを置換（substitute）または置換（replace）する）。

【0067】

Ｒ_２は、ペプチドのＣ末端、すなわちＡＡ６のカルボキシ基、またはＡＡ６が存在しない場合にはＡＡ５のカルボキシ基に連結される（カルボキシ基のＯＨを置換（substitute）または置換（replace）する）。

【0068】

より好ましい実施形態において、上述のペプチドは、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの発現をダウンレギュレートすることが可能であり、および／または少なくとも１種類の神経伝達物質のレベルを低下させることが可能であり、および／またはＥＣＭを維持および／または合成することが可能である。好ましくは、ナトリウムチャネルは電位依存性ナトリウムチャネルであり、より好ましくは、前記電位依存性ナトリウムチャネルはＮａｖ１．３および／またはＮａｖ１．４である。好ましくは、神経伝達物質はノルアドレナリンである。好ましくは、ＥＣＭは、コラーゲンＩ、エラスチン、ヒアルロン酸またはそれらの組み合わせから選択される。

【0069】

別の好ましい実施形態において、前記ペプチドは式（Ｉ）の配列を有する：
Ｒ_１－ＡＡ１－ＡＡ２－ＡＡ３－ＡＡ４－ＡＡ５－ＡＡ６－Ｒ_２
（Ｒ_１－配列番号７－Ｒ_２）
ここで、
ＡＡ１は、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＩｌｅから選択され；
ＡＡ２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＧｌｕから選択され；
ＡＡ３は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＨｉｓから選択され；
ＡＡ４は、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＴｒｐから選択され；
ＡＡ５は、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＴｒｐから選択され；
ＡＡ６は存在しないか、またはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択され；
Ｒ_１は、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルおよびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換もしくは非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換もしくは非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３員～１０員の置換もしくは非置換のヘテロシクリル環、ならびに、２個～２４個の炭素原子および１個～３個の炭素以外の原子および１個～６個の炭素原子のアルキル鎖の置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族基、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルから選択され；
あるいは、Ｒ_１およびＲ_２は存在せず、ＡＡ１は前記ペプチドの最後のアミノ酸に直接結合している。

【0070】

好ましくは、式（Ｉ）において：
ＡＡ１は、Ｌｙｓであり
ＡＡ２は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐから選択され；
ＡＡ３は、ＡｒｇまたはＨｉｓから選択され；
ＡＡ４は、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＰｈｅから選択され；
ＡＡ５は、ＴｙｒまたはＴｒｐから選択され；
ＡＡ６は存在しないか、ＣｙｓまたはＡｌａから選択される。

【0071】

好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、以下から選択され：
Ｒ_１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｒ_２（Ｒ_１－配列番号１－Ｒ_２）；
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ｒ_２（Ｒ_１－配列番号２－Ｒ_２）；
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｒ_２（Ｒ_１－配列番号３－Ｒ_２）；
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｒ_２（Ｒ_１－配列番号４－Ｒ_２）；
Ｒ_１－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｒ_２（Ｒ_１－配列番号５－Ｒ_２）；または
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｒ_２（Ｒ_１－配列番号６－Ｒ_２）；
ここで、
Ｒ_１は、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルおよびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換もしくは非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換もしくは非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３員～１０員の置換もしくは非置換のヘテロシクリル環、ならびに、２個～２４個の炭素原子および１個～３個の炭素以外の原子および１個～６個の炭素原子のアルキル鎖の置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族基、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルから選択され；
あるいは、Ｒ_１およびＲ_２は存在せず、ＡＡ１は前記ペプチドの最後のアミノ酸に直接結合している（環式ペプチドを形成する）。

【0072】

より好ましくは、本発明のペプチドは、以下から選択され：
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｒ_２（Ｒ_１－配列番号４－Ｒ_２）；または
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｒ_２（Ｒ_１－配列番号６－Ｒ_２）；
Ｒ_１およびＲ_２は上記に開示されている。

【0073】

さらにより好ましくは、本発明のペプチドは、以下の通りであり：
Ｒ_１－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｒ_２（Ｒ_１－配列番号４－Ｒ_２）；
Ｒ_１およびＲ_２は上記に開示されている。

【0074】

上記の実施形態のいずれかにおいて、好ましくは、Ｒ_１はＨまたはアセチルであり、より好ましくは、Ｒ_１はＨである。

【0075】

また、上記の実施形態のいずれかにおいて、Ｒ_２はＮＨ_２またはＯＨであり、より好ましくは、Ｒ_２はＮＨ_２である。

【0076】

したがって、最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、以下から選択される：
Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－ＮＨ_２（配列番号１－ＮＨ_２）；
Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－ＮＨ_２（配列番号２－ＮＨ_２）；
Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－ＮＨ_２（配列番号３－ＮＨ_２）；
Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＮＨ_２（配列番号４－ＮＨ_２）；
Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－ＮＨ_２（配列番号５－ＮＨ_２）；または
Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－ＮＨ_２（配列番号６－ＮＨ）_２。

【0077】

さらにより好ましくは、本発明のペプチドは、以下である：
Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＮＨ_２（配列番号４－ＮＨ_２）；または
Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－ＮＨ_２（配列番号６－ＮＨ）_２
さらにより好ましくは
Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＮＨ_２（配列番号４－ＮＨ_２）。

【0078】

ペプチドの配列番号１～配列番号３は、フグＴａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ（二ホンフグ、トラフグ）のタンパク質および／またはゲノムから直接誘導されることに留意されたい。より正確には、
配列番号１は、フグＴａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓの核小体複合体タンパク質２ホモログ（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照番号：Ｈ２ＴＧＢ２、アミノ酸８８～９３）の配列に由来する。

【0079】

配列番号２は、Ｄｉｓａｂｌｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇ ２－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｋｅ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ２（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｒａｓ－ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００３９７６５２３．１、アミノ酸６４～６８）の配列に由来する。

【0080】

配列番号３は、カルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２－γ様アイソフォームＸ２（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１１６０５８０２．２、アミノ酸７～１１）として予測されるゲノム配列に由来する。

【0081】

配列番号４～６のペプチドは、保存的置換によって配列番号１～３のペプチドに由来する。

【0082】

本発明の範囲内には、上述の活性の少なくとも１個（好ましくは、本発明のペプチドについて上述の活性の全て）を保持するか、示すか、または改善する限り、好ましくは１個以上の保存的置換を組み込んだ、上記に開示したペプチドのいずれかから誘導されるか、または得られるペプチドも含まれる。

【0083】

さらに、本発明の範囲内には、上述の活性の少なくとも１個（好ましくは、本発明のペプチドについて上述の活性の全て）を保持するか、示すか、または改善する限り、上述の特定の配列のいずれかと７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％の割合の同一性を有するペプチドも含まれる。

【0084】

上記から直接導き出されるように、本発明のペプチドは直鎖ペプチドまたは環式ペプチドであることが企図される。

【0085】

実施形態において、この実施形態は、上記の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、ペプチドは環式である。この場合、本発明のペプチドの最初のアミノ酸と最後のアミノ酸とは（上記の説明にしたがって）結合している。したがって、上記の実施形態のいずれかに対する適切な改変を行わなければならない（例えば、Ｒ_１およびＲ_２は、前記部位が結合しているアミノ酸が、現在、互いに結合しているので、存在しなくてもよい）。

【0086】

好ましい実施形態において、この実施形態は、上記の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前記ペプチドは直鎖状である。

【0087】

本発明のペプチドは、当技術分野において公知の任意の手段によって合成および生産され得る。例えば、それらは、化学合成（好ましくは、固相ペプチド合成の手段によって）、細胞培養における前記ペプチドの発現、または植物もしくは動物におけるペプチドの遺伝子導入生産の手段によって合成および生産され得る。さらに、本発明のペプチドは、当技術分野において公知の任意の手段によって精製され得る。

【0088】

好ましい実施形態において、この実施形態は、上記に開示した実施形態のいずれかと組み合わせることができ、本発明のペプチドは、イオン導入法によって、より好ましくは、対象（好ましくは、ヒト）の顔面に塗布するのに適しているか、または適合している。

【0089】

さらなる好ましい実施形態において、この実施形態は、上記に開示した実施形態のいずれかと組み合わせることができ、本発明のペプチドは、皮下、より好ましくは、対象（好ましくは、ヒト）の顔面に塗布するのに適しているか、または適合している。

【0090】

別の好ましい実施形態において、この実施形態は、上記に開示した実施形態のいずれかと組み合わせることができ、本発明のペプチドは、局所的に（好ましくは、クリームの形態で）、より好ましくは、対象（好ましくは、ヒト）の顔面に塗布するのに適しているか、または適合されている。

【0091】

下記に含まれる実施例から直接導き出されるように、本発明のペプチドは、少なくとも筋弛緩の手段ならびにＥＣＭの維持および合成の手段によるシワの予防、治療および／または軽減を提供するために必要な活性を有する。さらに、本発明のペプチドは、皮膚の緩みまたは弛み、および皮膚の荒れ（好ましくは、シワ荒れ）の予防、治療および／または軽減；ならびに皮膚のハリおよび弾力性の改善をもたらすために必要な活性も有する。したがって、本発明のペプチドは、上述の技術的課題を解決し、化粧品に有用である。

【0092】

第２の態様において、本発明は、本発明のペプチドを含む組成物を指す。

【0093】

本発明のペプチドは、本発明の第１の態様において上記で開示した通りである。

【0094】

本発明の組成物は、好ましくは化粧品組成物である。したがって、この実施形態において、本発明の化粧品組成物は、本発明の少なくとも１個のペプチドの化粧品的に有効な量を含み、より好ましくは、本発明の化粧品組成物は、本発明のペプチドの０．０００１％（重量／体積、ｇ／１００ｍＬ、以下、ｗ／ｖ）から０．０５％（ｗ／ｖ）までを含む。最も好ましい実施形態において、本発明の化粧品組成物は、本発明のペプチドの０．０００１％（ｗ／ｖ）から０．００５％（ｗ／ｖ）までを含み、より好ましくは、０．０００５％（ｗ／ｖ）ｙ０．００１５％（ｗ／ｖ）を含む。

【0095】

本発明の化粧品組成物はまた、少なくとも１個の追加の化粧品成分を含むことが企図される。前記追加の化粧品成分は、少なくとも１個の賦形剤および／または少なくとも１個の追加の化粧品活性成分であり得る。前記追加の化粧品成分は、本発明のペプチドの活性に影響を与えないか、または許容できない態様で影響を与えない限り、当技術分野において公知の任意の化粧品成分であり得る。

【0096】

実施形態において、本発明の組成物は、本質的に本発明のペプチドからなる。

【0097】

別の実施形態において、本発明の組成物は、本発明のペプチドからなる。

【0098】

第３の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明の組成物の、治療を必要とする対象における化粧品としての使用を指す。

【0099】

本発明のペプチドは、本発明の第１の態様において上記に開示した通りである。

【0100】

本発明の組成物は、本発明の第２の態様において上記に開示した通りである。

【0101】

本発明のペプチドまたは組成物は、化粧品的に有効な量（amount）または量（quantity）で使用される。

【0102】

好ましい実施形態において、化粧品としての使用は、皮膚の老化の徴候を軽減、予防および／または除去することである。

【0103】

好ましくは、皮膚の老化の徴候は、シワ、皮膚の荒れ（好ましくは、シワの荒れ）、皮膚の緩みまたは皮膚の弛みであり、より好ましくは、シワ、皮膚の荒れ、非炎症性の皮膚の緩みまたは非炎症性の皮膚の弛みであり、より好ましくは、シワ、さらにより好ましくは、顔のシワである。前記シワは、年代的シワまたは表情（筋肉由来）シワであり得る。

【0104】

非炎症性弛緩性皮膚は、化粧品的弛緩性皮膚、すなわち、非病理学的（非医学的状態）な弛緩性皮膚に相当する。

【0105】

非炎症性弛み皮膚は、化粧品的弛み皮膚、すなわち、非病理学的（非医学的状態）な弛み皮膚に相当する。

【0106】

上述したことから直接導き出されるように、本発明において、皮膚の老化の徴候（好ましくは、年代的なシワおよび表情ジワの両方）は、既に上記で説明したように、神経筋収縮の遮断によって、および／またはＥＣＭの維持もしくは合成によって、（本発明のペプチドによって、または本発明の組成物によって）予防され、軽減され、および／または除去される。

【0107】

少なくとも１個のナトリウムチャネルおよび少なくとも１個の神経伝達物質は、本発明の第１の態様において上記で説明した通りである。

【0108】

本発明のこの第３の態様において、治療を必要とする対象は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。

【0109】

本発明のこの第３の態様において、化粧品としての使用は、皮膚のハリおよび／または弾力性の改善のためであることも企図される。

【0110】

第４の態様において、上述のように、本発明は、治療を必要とする対象における本発明のペプチドまたは本発明の組成物の化粧品的使用に関する。

【0111】

好ましくは、本発明のこの第４の態様において、化粧品の使用は、皮膚の老化の徴候を軽減し、予防し、および／または除去することである。

【0112】

本発明のこの第４の態様において、化粧品としての使用は、皮膚のハリおよび／または弾力性の改善のためであることも企図される。

【0113】

本発明のペプチドは、本発明の第１の態様において上記に開示した通りである。

【0114】

本発明の組成物は、本発明の第２の態様において上記に開示した通りである。

【0115】

皮膚の老化の徴候および治療を必要とする対象は、本発明の第３の態様において上記で説明した通りである。

【0116】

さらに、本発明の第３の態様において上記で説明した全ての実施形態は、適切な適合を伴って、本発明のこの第４の態様に直接適用可能である。

【0117】

第５および最後の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における皮膚の老化の徴候を軽減、予防および／または除去する方法に関する。

【0118】

本発明のペプチドは、本発明の第１の態様において上記に開示した通りである。

【0119】

本発明の組成物は、本発明の第２の態様において上記に開示した通りである。

【0120】

皮膚の老化の徴候および対象は、本発明の第３の態様において上記で説明した通りである。

【0121】

さらに、本発明の第３および第４の態様において上記で説明した全ての実施形態は、適切な適合を伴って、本発明のこの第５の態様に直接適用可能である。

【0122】

配列表フリーテキスト
配列番号１：フグＴａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓの核小体複合体タンパク質２ホモログ（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照番号：Ｈ２ＴＧＢ２、アミノ酸８８～９３）の配列に由来するペプチド。

【0123】

配列番号２：Ｄｉｓａｂｌｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇ ２－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｋｅ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ２（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｒａｓ－ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００３９７６５２３．１、アミノ酸６４～６８）の配列に由来するペプチド。

【0124】

配列番号３：カルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２－γ様アイソフォームＸ２と予測されるゲノム配列に由来するペプチド（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１１６０５８０２．２、アミノ酸７～１１）
配列番号４：人工的に合成された配列
配列番号５：人工的に合成された配列
配列番号６：人工的に合成された配列
配列番号７：人工的に合成された配列
Ｘａａは、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓから選択される
Ｘａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕから選択される
Ｘａａは、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓから選択される
Ｘａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐから選択される
Ｘａａは、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐから選択される
Ｘａａは存在しないか、またはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択される。

【0125】

〔図面の簡単な説明〕
より良く理解できるように、本発明は、同封の図面（例として提示されており、例示的かつ非限定的な実施例の参照を有する）を参照して、以下により詳細に説明する。

【0126】

図１は、以下に含まれる実施例２におけるペプチド配列番号４－ＮＨ_２について得られた細胞生存率の結果を示す。より具体的には、図１Ａは、ＨＥＫａ細胞における生存率を示し、図１ＢはＨＤＦａ細胞における生存率を示す。両図において、Ｙ軸は陰性対照（未処理細胞）の生存率を１００％として、細胞の生存率の割合を指す。両図において、ｘ軸の左から右への列は、陰性対照（未処理細胞）；および０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞を指す。

【0127】

図２は、実施例３で得られた結果を示す。すなわち、試験した試料の経時電流（応答曲線下面積）、ひいては電位依存性ナトリウムチャネル（ＮａＶ１．３）の活性である。Ｙ軸は内向き電流（Ａｍｐ）を指す。ｘ軸は試験した異なる実験群を指し、各列の組について、左側が陰性対照を指し、右側が処理した試料を指す。ｘ軸において、左から右への列の組は、以下の実験処理または群を指す：配列番号１－ＮＨ_２、配列番号２－ＮＨ_２、配列番号３－ＮＨ_２およびアミトリプチリン。

【0128】

図３は、実施例４で得られた結果を示す。この図は、電位依存性ナトリウムチャネルの阻害率を示している。Ｙ軸は陰性対照（０％）に対する電位依存性ナトリウムチャネルの阻害率を表し、Ｘ軸は試験した異なるペプチドのＭ単位の濃度の対数を指す。三角の線は配列番号２－ＮＨ_２であり；四角の線は配列番号３－ＮＨ_２であり；十字の線は配列番号４－ＮＨ_２であり；丸の線は配列番号５－ＮＨ_２であり；ひし形の線は配列番号６－ＮＨ_２である。

【0129】

図４は、実施例５において、配列番号６－ＮＨ_２で処理した場合のノルアドレナリンのレベルについて得られた結果を示す。ｙ軸は陽性対照（未処理の脱分極細胞、１００％とする）に対するノルアドレナリンの割合を示す。ｘ軸は異なる処理群を示し、左から右へバーで示す：基底状態；陽性対照（処理なしの脱分極細胞）；０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号６－ＮＨ_２で処理した脱分極細胞；および０．１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号６－ＮＨ_２で処理した脱分極細胞。

【0130】

図５は、配列番号４－ＮＨ_２で処理した実施例５におけるノルアドレナリンのレベルについて得られた結果を示す。ｙ軸は陽性対照（未処理の脱分極細胞、１００％とする）に対するノルアドレナリンの割合を示す。ｘ軸は異なる処理群を示し、左から右へバーで示す：基底状態；陽性対照（処理なしの脱分極細胞）；０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した脱分極細胞；および０．１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した脱分極細胞。

【0131】

図６は、０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド配列番号４－ＮＨ_２で２４時間処理した場合の、実施例６で得られた遺伝子発現結果を示す。各バーは上から順に１個の遺伝子を示す：ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ４Ａ、ＳＣＮ３ＡおよびＣＡＬＭ３。左（すなわち、負の値）に向かって伸びるバーは、遺伝子のダウンレギュレーションを示す。

【0132】

図７は、０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド配列番号４－ＮＨ_２で２４時間処理した場合の、実施例６で得られた遺伝子発現結果を示す。各バーは上から順に１個の遺伝子を示す：ＲＡＰＳＮ、ＳＣＮ３ＡおよびＣＡＬＭ３。左（すなわち、負の値）に向かって伸びるバーは、遺伝子のダウンレギュレーションを示す。

【0133】

図８は、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬまたは０．０１５ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド配列番号４－ＮＨ_２でＨＤＦａ細胞を４８時間処理した場合の、実施例７で得られたエラスチンの産生または合成の結果を示す。エラスチンの産生または合成は、１００％として確立された基底状態（未処理細胞）に対する割合として表される。Ｙ軸は基底状態に対するエラスチンの割合を示す。ｘ軸は異なる処理群を示し、左から右へバーで示す：基底状態（未処理細胞）；０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞；０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞；および、０．０１５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞。

【0134】

図９は、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０１５ｍｇ／ｍＬまたは０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２でＨＤＦａ細胞を４８時間処理した場合の、実施例８におけるプロコラーゲンＩα１の放出について得られた結果を示す。プロコラーゲンＩα１の放出は、１００％として確立された基底状態（未処理細胞）に対する割合として表される。ｙ軸は、基底状態に対するプロコラーゲンＩα１の放出の割合を示す。ｘ軸は異なる処理群を示し、左から右へバーで示す：基底状態（未処理細胞）；０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞；０．０１５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞；および０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞。

【0135】

図１０は、ＨＤＦａ細胞を、ペプチド配列番号４－ＮＨ_２を用いて、０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＭＭＰ１、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ４Ａ１）で２４時間、０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＴＩＭＰ２、ＦＢＬＮ５、ＬＯＸＬ１およびＣＯＬ７Ａ１）で２４時間、０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＨＹＡＬ１）で６時間、および０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＨＡＳ１）で６時間処理した場合の、実施例１０において得られた遺伝子発現結果を示す。各バーは上から順に１個の遺伝子を示す：ＭＭＰ１、ＨＹＡＬ１、ＴＩＭＰ２、ＨＡＳ１、ＦＢＬＮ５、ＬＯＸＬ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ７Ａ１。左（すなわち、負の値）に向かって伸びるバーは、遺伝子のダウンレギュレーションを示す。右（すなわち、正の値）に向かって伸びるバーは、遺伝子のアップレギュレーションを示す。

【0136】

〔実施例〕
略語：
アミノ酸に使用される略語は、Eur. J. Biochemにおいて概説された１９８３年の生化学命名法に関するＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ合同委員会（1983 IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature recommendations outlined in Eur. J. Biochem. (1984) 138:937）に従う。

【0137】

Ａｌａ、アラニン；Ａｒｇ、アルギニン；Ａｓｎ、アスパラギン；Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル；ｃＤＮＡ、相補ＤＮＡ；Ｃ末端、カルボキシ末端；Ｃｙｓ、システイン；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＰＣＤＩ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ｅｑｕｉｖ、当量；ＥＳＩ－ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化質量分析；Ｆｍｏｃ、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｇｌｎ、グルタミン；ＨＢＳＳ、Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＨＥＰＥＳ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸；Ｈｉｓ、ヒスチジン；ＨＯＢｔ、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＨＲＰ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ；Ｉｌｅ、イソロイシン；ＬＳＧＳ、Ｌｏｗ Ｓｅｒｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｌｙｓ、リジン；ＭＢＨＡ、ｐ－メチルベンズヒドリルアミン；Ｍｅ、メチル；ＭｅＣＮ、アセトニトリル；ＭＥＭ、最小必須培地；ＭｅＯＨ、メタノール；Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ末端、アミノ末端；Ｐｂｆ、２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル；Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｐｒｏ、プロリン；ＲＮＡ、リボ核酸；ＲＴ、室温；ＲＴ－ｑＰＣＲ、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；Ｓｅｒ、セリン；ＳＫＭ－Ｄ、骨格筋細胞分化培地；ＳＫＭ－Ｍ、骨格筋細胞増殖培地；ｔＢｕ、ｔｅｒｔ－ブチル；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＩＳ、トリイソプロピルシラン；ＴＰＡ、１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール－１３－アセテート；Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｔｒｔ、トリフェニルメチルまたはトリチル；Ｔｙｒ、チロシン；Ｖａｌ、バリン。

【0138】

実施例に含まれる化学合成手順に関して、全ての合成工程は、多孔性ポリエチレンディスクを取り付けたポリプロピレンシリンジまたは多孔性プレートを取り付けたＰｙｒｅｘ製（登録商標）リアクターで実施したことに留意されたい。試薬および溶媒は全て合成品質であり、追加処理なしで使用した。溶媒および可溶性試薬は吸引によって除去した。Ｆｍｏｃ基はピペリジン－ＤＭＦ（２：８、体積／体積、ｖ／ｖ）（少なくとも１×１分、２×１０分、５ｍＬ／ｇ樹脂）（Lloyd Williams P. et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC, 1997, Boca Raton (Fla., USA)）で除去した。脱保護、カップリング、および再び脱保護の段階間の洗浄は、毎回１０ｍｌ溶媒／ｇ樹脂を用い、ＤＭＦ（３×１分）およびＤＣＭ（３×１分）で行った。カップリング反応は３ｍｌ溶媒／ｇ樹脂で行った。カップリングの制御は、ニンヒドリン試験（Kaiser E. et al., Anal. Biochem., 1970, 34:595598）を実施することによって行った。全ての合成反応および洗浄をＲＴで行った。

【0139】

〔実施例１．ペプチドの合成および調製〕

【0140】

【化1】

【0141】

重量を正規化した。０．５２ｍｍｏｌ／ｇの官能基化を有するＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ樹脂４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）を、Ｆｍｏｃ基を除去するために、当技術分野において公知の記載された一般的プロトコールにしたがってピペリジン－ＤＭＦで処理した。２．３３ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）を、溶媒としてＤＭＦを用い、ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）の存在下、１時間かけて脱保護樹脂に取り込んだ。

【0142】

その後、当技術分野において公知の一般的な方法に記載されているように樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返して次のアミノ酸を結合させた。先に記載したプロトコールにしたがって、３．９４ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）；続いて２．９０ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｐｈｅ－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）；続いて４．６４ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）；続いて３．５１ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）および続いて３．５１ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）を、順次、１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）の存在下で各々カップリングさせた。上記ですでに述べたように、各アミノ酸付加ステップの間に、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を行った。

【0143】

合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（各５回、３分間）、真空下で乾燥させた。

【0144】

【化2】

【0145】

重量を正規化した。０．５２ｍｍｏｌ／ｇの官能基化を有するＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ樹脂４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）を、Ｆｍｏｃ基を除去するために、当技術分野において公知の記載された一般的プロトコールにしたがってピペリジン－ＤＭＦで処理した。３．４４ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）を、溶媒としてＤＭＦを使用して、ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）の存在下、１時間かけて脱保護樹脂に取り込んだ。

【0146】

その後、当技術分野において公知の一般的な方法に記載されているように樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返して次のアミノ酸を結合させた。先に記載したプロトコールにしたがって、２．５５ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）、続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）、続いて３．０８ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）、続いて３．５１ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）を、順次、１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）の存在下で各々カップリングさせた。上記ですでに述べたように、各アミノ酸付加ステップの間に、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を行った。

【0147】

合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（各５回、３分間）、真空下で乾燥させた。

【0148】

上述の合成手順を用いて、必要なアミノ酸を選択し、以下の配列を合成した：
Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－ＮＨ_２（配列番号１－ＮＨ_２）；
Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－ＮＨ_２（配列番号２－ＮＨ_２）；
Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－ＮＨ_２（配列番号３－ＮＨ_２）；
Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＮＨ_２（配列番号４－ＮＨ_２）；
Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－ＮＨ_２（配列番号５－ＮＨ_２）；および
Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－ＮＨ_２（配列番号６－ＮＨ_２）。

【0149】

【化3】

【0150】

上記ａ）またはｂ）で得られたペプチジル樹脂のＮ末端Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％（体積／体積、以下ｖ／ｖ）ピペリジンで脱保護した（１×１分＋２×１０分）((Lloyd Williams P. et al. (1997) Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC, Boca Raton (Fla., USA))。ペプチジル樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）で洗浄し、真空下で乾燥させた。

【0151】

【化4】

【0152】

重量を正規化した。ｃ）で得られた乾燥ペプチジル樹脂２００ｍｇを、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ（体積比９０：５：５）で、撹拌下、室温で２時間処理した。濾液を集め、５０ｍＬ（８倍～１０倍）の冷ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。エーテル溶液を減圧下、室温で蒸発乾固し、沈殿物をＨ_２Ｏ中５０％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮに再溶解し、凍結乾燥した。

【0153】

【化5】

【0154】

ｄ）にしたがって得られたペプチドのＨＰＬＣ分析は、逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、３．５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ、米国）を用い、Ｈ_２Ｏ（＋０．０４５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）中、ＭｅＣＮ（＋０．０３６％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）のグラジエントで流速１．２５ｍＬ／分で行い、検出は２２０ｎｍで行った。全てのペプチドは８０％を超える純度を示した。得られたペプチドの同一性は、移動相としてＭｅＯＨを用い、流速０．２ｍＬ／分で、Ｗａｔｅｒ ＺＱ ４０００検出器を用いたＥＳＩ－ＭＳによって確認した。得られた結果から、ペプチド配列番号１－ＮＨ_２、配列番号２－ＮＨ_２、配列番号３－ＮＨ_２、配列番号４－ＮＨ_２、配列番号５－ＮＨ_２および配列番号６－ＮＨ_２が正しく効果的に合成されたことが示された。

【0155】

〔実施例２．本発明のペプチドの毒性の分析〕
この場合、ＭＴＴ（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを用いて、ＨＥＫａ（成人皮膚由来ヒト表皮角化細胞）およびＨＤＦａ（成人皮膚由来ヒト真皮線維芽細胞）初代細胞に対する本発明のペプチドの細胞毒性能を評価した。

【0156】

この実施例では、ペプチド配列番号４－ＮＨ_２を用いて、実施例１にしたがって調製した。

【0157】

ペプチドのストック溶液を蒸留水で２５ｍｇ／ｍＬ調製した。このストック溶液をさらに希釈して、対応する培養液中の最終作用濃度（０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬ）を得た。

【0158】

未処理細胞を陰性対照試料（Ｂａｓａｌ）として用いた。

【0159】

簡単に説明すると、ＨＥＫａ細胞およびＨＤＦａ細胞を、最終容量２００μＬの培地（２０，０００細胞／ウェル）に１×１０^５細胞／ｍＬの濃度で９６ウェルプレートに播種した。ＨＥＫａ細胞はケラチノサイト増殖キットを添加した真皮細胞基底培地で培養し；ＨＤＦａ細胞は２％のＬＳＧＳを添加した１０６培地で培養した。細胞は３７℃、ＣＯ_２５％、および飽和湿度で培養した。

【0160】

２４時間のインキュベーション後、細胞を異なる濃度のペプチド（０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬ）で３連処理し、ＭＴＴ評価を行った。ペプチドで２４時間処理した後、培地を完全に除去し、補充培地中の５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液１００μＬを各ウェルに加え、細胞を３７℃で３時間インキュベートした。ＭＴＴでインキュベートした後、各ウェルの培地を吸引し、形成されたホルマザン結晶を可溶化するためにＤＭＳＯ１５０μＬを加えた。結晶を完全に可溶化するため、プレートを５分間シェーカーにかけ、次いで、マイクロプレートリーダーＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣを用いて、培地中の生存細胞の数に直接比例する、各ウェルの５４５ｎｍの吸光度を測定した。

【0161】

吸光度の値は、非処理細胞（対照）で得られたデータを用いて正規化し、図１Ａおよび１Ｂに示した生存率％を得た。各条件は、３回の独立した実験（Ｎ＝３）で３回実施した（ｎ＝３）。

【0162】

生存率が８０％超であるペプチドの濃度は、有効性試験のために安全であると考えられる。逆に、生存率が８０％未満の濃度は潜在的に毒性があると考えられ、有効性試験の目的には使用されない。

【0163】

得られた結果は、図１Ａ（ＨＥＫａ細胞における生存率）および図１Ｂ（ＨＤＦａ細胞における生存率）に要約されている。前記図から直接導かれるように、０．００１ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬの試験ペプチドで処理した後のＨＥＫａ細胞における生存率は８０％超であり；０．００１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの試験ペプチドで処理した後のＨＤＦａ細胞における生存率は８０％超であり、これは本発明のペプチドの安全性を実証している。

【0164】

〔実施例３．ナトリウムチャネルの活性またはシグナル伝達の調節の分析〕
この実施例では、ペプチド配列番号１－ＮＨ_２、配列番号２－ＮＨ_２および配列番号３－ＮＨ_２を実施例１にしたがって調製した。

【0165】

チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定的にトランスフェクションしたヒトＮａＶ１．３を用い、ＱＰａｔｃｈ４８ ＨＴ（Ｓｏｐｈｉｏｎ、デンマーク）を使用して電気生理学的にイオンチャネル活性を測定した。実験は３連で行い、１０μＭのペプチド濃度を用いた。陰性対照は、各々のペプチドについて別々に行った。陽性対照にはアミトリプチリンを用いた。

【0166】

この実施例で得られた結果は図２に要約されている。前記図から導かれるように、３個のペプチドは全てＮａＶ１．３内向き電流の阻害を示し、その結果、負の電流（Ａｍｐ）が少なかった。したがって、３個のペプチドは全て、ナトリウムチャネルＮａｖ１．３を遮断または調節する（活性またはシグナルを低下させる）ことができた。さらに、驚くべきことに、配列番号２－ＮＨ_２および配列番号３－ＮＨ_２は、増大した統計的に有意な効果を示すことができた（それぞれ、ｐ＝０．０１８およびｐ＝０．０３９）。

【0167】

〔実施例４．ナトリウムチャネルの活性またはシグナル伝達の調節の分析〕
この実施例では、実施例１にしたがって、ペプチド配列番号２－ＮＨ_２、配列番号３－ＮＨ_２、配列番号４－ＮＨ_２、配列番号５－ＮＨ_２および配列番号６－ＮＨ_２を調製した。

【0168】

ＳＨＳＹ－５Ｙ細胞を用い、ＱＰａｔｃｈ４８ ＨＴ（Ｓｏｐｈｉｏｎ、デンマーク）を用いて電気生理学的にイオンチャネル活性を測定した。試験した試料は以下の通りであった：
陰性対照：０．０５％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン
陽性対照：３ｎＭ、１０ｎＭおよび３０ｎＭの濃度のテトラドトキシン（ＴＴＸ）
配列番号２－ＮＨ_２ ０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度
配列番号３－ＮＨ_２ ０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度
配列番号４－ＮＨ_２ ０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度
配列番号５－ＮＨ_２ ０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度
配列番号６－ＮＨ_２ ０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度。

【0169】

各試験用量適用期間の阻害率は、ビヒクル対照（薬物投与前）の終了時に測定されたカーソル値に対する平均カーソル値（ピーク電流）の減少として計算され、ＴＴＸの上乗せ添加で記録された最大阻害に対して正規化された。

【0170】

得られた結果は、（不活性化状態の）ナトリウムチャネルの阻害（または遮断）の割合を示す図３に要約されている。試験した全てのペプチドが、用量依存的にナトリウムチャネルを効果的に調節（活性またはシグナルの減少）したことがわかる。テストした２個の高濃度で最良の結果を得たペプチドは、配列番号４－ＮＨ_２であった。その一方で、試験した低濃度で最良の結果を得たペプチドは、配列番号５－ＮＨ_２であった。

【0171】

その結果、本発明のペプチドは、低濃度のＴＴＸで達成されたのと同様の調節効果を示した（高濃度のＴＴＸは、完全な遮断効果をもたらした）。

【0172】

〔実施例５．ノルアドレナリンレベルの分析〕
この実施例では、ペプチド配列番号４－ＮＨ_２および配列番号６－ＮＨ_２を、実施例１にしたがって調製した。

【0173】

この場合、分化したＳＨＳＹ５Ｙ細胞（ヒト神経細胞モデル）におけるノルアドレナリン（ＮＡ）レベルを測定した。この試験は、候補物質が神経伝達物質の放出を調節できるかどうかを測定するために用いられた。

【0174】

ヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、細胞密度２５０，０００個／ウェルで２４ウェルプレートに３連で播種した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙは、レチノイン酸で１週間神経細胞表現型に分化させた後、０．０５ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬの上記ペプチドで３０分間処理した。

【0175】

その後、細胞を洗浄し、放出増強のために、まず１００ｎＭの１２－０－テトラデカノイル－ホルボール－１３－アセテート（ＴＰＡ）で８分間処理し、さらに神経伝達物質の誘発放出を達成するために１００ｍＭのＫＣｌで、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液でＨＢＳＳ中、５分間処理した。最後に、細胞を溶解し、０．８ｍｍのゲージ針で１０回、ウェル上で直接ホモジナイズした。ホモジナイズした細胞懸濁液を４℃で１５分間、最高速度で遠心した。上清を回収し、ヒトノルアドレナリンＥＬＩＳＡキットを用いて、製造者の指示に従って酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により総ノルアドレナリンを定量するまで－８０℃で保存した。各試料の総タンパク質含量は、データを正規化するために、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いて定量した。

【0176】

各条件は、３個の独立した実験（Ｎ＝３）で少なくとも３回実施し（ｎ＝３）、陽性対照（ペプチドを含まないが刺激を加えた試料）で得られたノルアドレナリンに関して、試料の総タンパク質に関して正規化し、陽性対照に関する割合を得た。

【0177】

得られた結果は、図４および５に要約されている。前記図から直接導かれるように、試験したペプチド（本発明のペプチドの代表または例として）は、ノルアドレナリンのレベルを低下させ（３０％超の減少）、それゆえ、ボトックス様効果を提供した。したがって、この処理は、刺激され分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における神経伝達物質の放出を調節することを示し、これは、本発明のペプチドが抗シワ活性を提供することを実証している。

【0178】

〔実施例６．発現筋収縮関連遺伝子の分析〕
この実施例では、実施例１にしたがってペプチド配列番号４－ＮＨ_２を調製した。

【0179】

ペプチドのストック溶液を２５ｍｇ／ｍＬでミリＱ水中に調製した。このストックを対応する補充培地でさらに希釈し、最終作用濃度０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．００５ｍｇ／ｍＬを得た。未処理細胞を陰性対照試料として用いた。

【0180】

発現が測定された関連遺伝子は以下の通りであった：ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウム電位依存性チャネルβサブユニット１）、ＳＣＮ４Ａ（ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット４）、ＳＣＮ３Ａ（ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット３）、ＣＡＬＭ３（カルモジュリン３）、およびＲＡＰＳＮ（シナプスの受容体関連タンパク質）。各々の遺伝子に使用したプライマーは、市販のＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙプローブであった。実験は筋細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで行われ、２種類の濃度のペプチド（０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．００５ｍｇ／ｍＬ）を２４時間で試験した。

【0181】

簡単に説明すると、ヒト骨格筋筋芽細胞を１２ウェルプレートに１×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、播種した筋芽細胞が８０％～９０％のコンフルエントに達するまで、４８時間～７２時間、標準培養条件（１％抗生物質／抗真菌剤添加ＳＫＭ－Ｍ培地；３７℃、相対湿度９５％、ＣＯ_２５％）で維持した。その後、筋管分化（筋細胞への分化）を誘導するため、増殖培地をＳＫＭ－Ｄ培地に交換し、２～３日ごとに新しい培地を加えた。分化工程の開始から６～７日後、筋細胞を０．０１ｍｇ／ｍＬまたは０．００５ｍｇ／ｍＬの上記ペプチドでさらに２４時間処理した。未処理細胞は基底対照として用いた。最後に細胞を溶解し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを用いて、製造者の指示にしたがってＲＮＡ抽出を行った。精製したＲＮＡを、増幅のための鋳型となる逆転写によって対応するｃＤＮＡを生成するために使用した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置を用いて、上記に特定したＴａｑＭａｎアッセイプローブのパネルおよび２ｘ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて行った。増幅は以下の４０サイクルを含んでいた：９５℃で１５秒（変性）、および６０℃で１分（アニーリングおよび伸長）。

【0182】

得られたデータは、ΔΔＣｔ法を用いて分析した。これは、未処理の基底試料と比較した処理試料における標的遺伝子の発現値を倍数変化として提供する。両試料とも、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）の相対発現で正規化した。

【0183】

分析のステップは以下を含んでいた：
１．各条件の平均Ｃｔを計算する
２．ΔＣＴ試験試料およびΔＣＴ校正試料を計算する。

【0184】

３．ΔΔＣＴを計算する：ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ試験試料－ΔＣＴ校正試料
４．２^{－ΔΔＣＴ}によって比率を求める。

【0185】

得られた結果は、図６および図７に要約されている。これは、ペプチド配列番号４－ＮＨ_２（本発明のペプチドの一例として）は、試験した関連遺伝子の筋細胞における発現を調節することができ、したがって、このペプチドは、筋細胞におけるナトリウムチャネルおよび筋収縮関連遺伝子の発現を調節（ダウンレギュレート）することができることを示している。

【0186】

〔実施例７．エラスチンの合成の分析〕
この実施例では、実施例１にしたがってペプチド配列番号４－ＮＨ_２を調製した。

【0187】

ペプチドのストック溶液を２５ｍｇ／ｍＬで水中に調製した。このストックをさらに希釈し、完全培地（２％ＬＳＧＳ添加１０６培地）中で０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬまたは０．０１５ｍｇ／ｍＬの最終作用濃度を得た。未処理細胞を基底状態として使用した。

【0188】

この研究のために、ＨＤＦａ細胞を１２ウェルプレートに１２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、標準培養条件（１０６培地＋２％ＬＳＧＳ；３７℃、相対湿度９５％、ＣＯ_２５％）で２４時間維持した。その後、線維芽細胞を０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬまたは０．０１５ｍｇ／ｍＬの上述のペプチドで４８時間処理した。処理後、Ｆａｓｔｉｎ Ｅｌａｓｔｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて、製造者の指示にしたがってエラスチンを定量するために細胞を採取した。各条件は、３個の独立した実験（Ｎ＝３）で少なくとも３回行った（ｎ＝３）。

【0189】

得られた結果は図８に要約されている。０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．０１５ｍｇ／ｍＬの本発明のペプチドで処理したＨＤＦａは、未処理の試料と比較して、エラスチンレベルの増加を示した。これらの結果は、本発明のペプチドが皮膚の弾力性を増加させるだけでなく、皮膚の構造的完全性を改善し、皮膚の緩みおよび／または弛みを改善（予防、治療または軽減）する役割を果たす可能性を示唆している。さらに、エラスチンの合成または産生の増加はまた、本発明のペプチドが皮膚のハリおよび創傷治癒能力を改善できることも実証している。

【0190】

〔実施例８．プロコラーゲンＩα１放出の分析〕
この実施例では、実施例１にしたがってペプチド配列番号４－ＮＨ_２を調製した。

【0191】

ペプチドのストック溶液を水中で２５ｍｇ／ｍＬに調製した。このストックをさらに希釈し、完全培地（２％ＬＳＧＳ添加１０６培地）中で０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０１５ｍｇ／ｍＬまたは０．０５ｍｇ／ｍＬの最終作業濃度を得た。未処理細胞を基底状態として用いた。

【0192】

この研究では、ＨＤＦａ細胞を１００，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、標準培養条件（２％ＬＳＧＳ添加１０６培地；３７℃、相対湿度９５％、ＣＯ_２５％）で２４時間維持した。

【0193】

２４時間後、細胞を上述の本発明のペプチド（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０１５ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬ）で４８時間処理した。処理後、上清を回収し、細胞残屑を除去するために遠心分離し、製造者の指示にしたがってヒトプロコラーゲンＩα１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットを用いてプロコラーゲンＩα１の定量に使用するまで－８０℃で保存した。各条件は、独立した３個の実験（Ｎ＝３）で少なくとも３回実施した（ｎ＝３）。

【0194】

得られた結果は図９に要約されている。前記図から直接導かれるように、プロコラーゲンＩα１タンパク質の放出は、全ての試験濃度で、用量依存的に増加し、最高試験濃度（０．０５ｍｇ／ｍＬ）では５３％まで有意に増加した。これらの結果は、本発明のペプチドがＩ型コラーゲンの放出をもたらすことを実証している。

【0195】

〔実施例９．ヒアルロン酸の合成の分析。〕
この実施例では、実施例１にしたがってペプチド配列番号４－ＮＨ_２を調製した。

【0196】

この場合、この実験の目的は、ヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸（ＨＡ）合成または産生を増加させる本発明のペプチドの能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することであった。この評価は、細胞をペプチド（以下に記す異なる濃度）で４８時間処理した後のＨＡ量を測定することによって行った。

【0197】

簡単に説明する：
実験群は以下の通りであった：
未処理細胞培養（陰性対照）。

【0198】

本発明のペプチドで処理した細胞（０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬまたは０．０５ｍｇ／ｍＬ）。

【0199】

４８時間処理を行った。処理は３連で、２個の異なる実験セッションで行った。

【0200】

この研究で用いた実験モデルは、ウシ胎児血清１０％および抗生物質１％を添加したＭＥＭ中、３７℃、ＣＯ_２５％で培養したヒト線維芽細胞（ＳＦ－ＴＹ ＪＣＲＢ）であった。

【0201】

細胞を９６ウェルプレートに１×１０^４個／ウェルで播種し、標準培養条件（３７℃、相対湿度９５％、ＣＯ_２５％）で２４時間維持した後、処理を行った。

【0202】

実験期間の終わりに、ＥＬＩＳＡ法によってヒアルロン酸合成の測定を行った。この目的には市販のキットを用いた。この検査キットは試料中のＨＡを定量するために２部位サンドイッチＥＬＩＳＡを採用した。簡単に説明すると、ＨＡに特異的な抗体がマイクロプレートにプレコートされた；標準品および試料がウェルにピペッティングされ、存在するＨＡは固定化抗体に結合した；未結合の物質を除去した後、ＨＡに特異的なビオチン結合抗体がウェルに加えられた；洗浄後、ストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をウェルに加えた；未結合のアビジン－酵素試薬を除去するための洗浄後、基質溶液をウェルに加え、最初のステップで結合したＨＡの量に比例して発色させた。発色を止め、色の強さを測定した。既知濃度の標準ヒアルロン酸の検量線を用いて試験試料の定量を行った。

【0203】

得られた結果を表１に要約した。結果は細胞培養培地および細胞培養液中のＨＡ含量の％として表されている。これは、陰性対照中のＨＡ含量を１００％とし、残りの試料と適切な比較を行うことによって計算される。陰性対照と試料と間のＨＡ含量の変化率は、ヒアルロン酸の合成または産生を増加させる本発明の試験ペプチドの有効性を示す。

【0204】

【表1】

【0205】

表１から容易に導かれるように、本発明のペプチド（配列番号４－ＮＨ_２で例示される）はＨＡの合成または産生の増加をもたらす。

【0206】

〔実施例１０．ＥＣＭ関連遺伝子の発現の分析〕
この実施例では、実施例１にしたがってペプチド配列番号４－ＮＨ_２を調製した。

【0207】

ペプチドのストック溶液を２５ｍｇ／ｍＬのミリＱ水で調製した。このストックを対応する補充培地でさらに希釈し、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．００５ｍｇ／ｍＬの最終作用濃度を得た。未処理細胞を陰性対照試料として用いた。

【0208】

発現が測定された関連遺伝子は以下の通りであった：ＭＭＰ１（マトリックスメタロペプチダーゼ１）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロニダーゼ１）、ＴＩＭＰ２（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼインヒビター２）、ＨＡＳ１（ヒアルロン酸合成酵素１）、ＦＢＬＮ５（フィブリン５）、ＬＯＸＬ１（リシルオキシダーゼ様１）、ＣＯＬ４Ａ１（ＩＶ型コラーゲンα１鎖）、ＣＯＬ３Ａ１（ＩＩＩ型コラーゲンα１鎖）、およびＣＯＬ７Ａ１（ＶＩＩ型コラーゲンα１鎖）。各遺伝子のプライマーには、市販のＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙプローブを使用した。

【0209】

簡単に説明すると、ＨＤＦａ細胞を１２ウェルプレートに１．５×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、標準培養条件（１％のＬＳＧＳを補充した１０６培地；３７℃、相対湿度９５％、ＣＯ_２５％）で２４時間維持した。その後、細胞を０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、または０．０５ｍｇ／ｍＬの上述のペプチドでさらに６時間または２４時間処理した。

【0210】

最後に細胞を溶解し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを用いて、製造者の指示にしたがってＲＮＡ抽出を行った。精製されたＲＮＡを、増幅のための鋳型となる逆転写によって対応するｃＤＮＡを生成するために使用した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置を用いて、上記に特定したＴａｑＭａｎアッセイプローブのパネルおよび２ｘ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて行った。増幅は以下の４０サイクルを含んでいた：９５℃で１５秒（変性）および６０℃で１分（アニーリングおよび伸長）。

【0211】

得られたデータは、ΔΔＣｔ法を用いて分析した。これは、未処理の基底試料と比較した処理試料における標的遺伝子の発現値を倍数変化として提供する。両試料とも、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）の相対発現で正規化した。

【0212】

分析のステップは以下を含んでいた：
１．各条件の平均Ｃｔを計算する
２．ΔＣＴ試験試料およびΔＣＴ校正試料を計算する
３．ΔΔＣＴを計算する：ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ試験試料－ΔＣＴ校正試料
４．２^{－ΔΔＣＴ}によって比率を求める。

【0213】

得られた結果は、図１０に要約されている。これは、ペプチド配列番号４－ＮＨ_２（本発明のペプチドの例として）が、試験したＥＣＭの関連遺伝子の線維芽細胞における発現を調節できることを示している：０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチド、ＭＭＰ１のダウンレギュレーション、およびＣＯＬ３Ａ１ならびにＣＯＬ４Ａ１のアップレギュレーションで２４時間；０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド、ＴＩＭＰ２、ＦＢＬＮ５、ＬＯＸＬ１およびＣＯＬ７Ａ１のアップレギュレーションで２４時間；０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチド、ＨＹＡＬ１のダウンレギュレーションで６時間；０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド、ＨＡＳ１のアップレギュレーションで６時間。ＭＭＰ１およびＨＹＡＬ１はそれぞれＥＣＭおよびＨＡの分解に関連する遺伝子である。ＴＩＭＰ２、ＨＡＳ１、ＦＢＬＮ５、ＬＯＸＬ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ７Ａ１はＥＣＭの合成および効果的な維持に関係する遺伝子である。したがって、本発明のペプチド（配列番号４－ＮＨ_２で例示される）を用いて得られた発現プロフィールは、ＥＣＭの維持および合成または増加に有用であることを実証している。

【0214】

したがって、上記に含まれる実施例で実証されたように、本発明のペプチドは効果的に製造され、本明細書を通して言及された活性を示した：
電位依存性ナトリウムチャネルの活性またはシグナル伝達を調節または低下させる
電位依存性ナトリウムチャネルの発現を調節または減少させる
ノルアドレナリンのレベルの低下させる（したがって、ノルアドレナリンの放出の抑制）
エラスチンの産生を増加させる
プロコラーゲンＩα１の放出を増加させる
ヒアルロン酸レベルを増加させる
ＥＣＭ関連遺伝子の好ましい制御。

【0215】

したがって、本発明のペプチドは、シワ（年代シワおよび表情ジワの両方）、荒れ、皮膚の緩みまたは弛みを予防、治療または軽減することができ；ならびに、皮膚のハリおよび／または弾力性を改善することができ、当技術分野に存在する上述の技術的課題を解決する。

【図面の簡単な説明】

【0216】

【図1A】図１は、以下に含まれる実施例２におけるペプチド配列番号４－ＮＨ_２について得られた細胞生存率の結果を示す。より具体的には、図１Ａは、ＨＥＫａ細胞における生存率を示し、図１ＢはＨＤＦａ細胞における生存率を示す。両図において、Ｙ軸は陰性対照（未処理細胞）の生存率を１００％として、細胞の生存率の割合を指す。両図において、ｘ軸の左から右への列は、陰性対照（未処理細胞）；および０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞を指す。

【図1B】図１Ａと同じ。

【図2】図２は、実施例３で得られた結果を示す。すなわち、試験した試料の経時電流（応答曲線下面積）、ひいては電位依存性ナトリウムチャネル（ＮａＶ１．３）の活性である。Ｙ軸は内向き電流（Ａｍｐ）を指す。ｘ軸は試験した異なる実験群を指し、各列の組について、左側が陰性対照を指し、右側が処理した試料を指す。ｘ軸において、左から右への列の組は、以下の実験処理または群を指す：配列番号１－ＮＨ_２、配列番号２－ＮＨ_２、配列番号３－ＮＨ_２およびアミトリプチリン。

【図3】図３は、実施例４で得られた結果を示す。この図は、電位依存性ナトリウムチャネルの阻害率を示している。Ｙ軸は陰性対照（０％）に対する電位依存性ナトリウムチャネルの阻害率を表し、Ｘ軸は試験した異なるペプチドのＭ単位の濃度の対数を指す。三角の線は配列番号２－ＮＨ_２であり；四角の線は配列番号３－ＮＨ_２であり；十字の線は配列番号４－ＮＨ_２であり；丸の線は配列番号５－ＮＨ_２であり；ひし形の線は配列番号６－ＮＨ_２である。

【図4】図４は、実施例５において、配列番号６－ＮＨ_２で処理した場合のノルアドレナリンのレベルについて得られた結果を示す。ｙ軸は陽性対照（未処理の脱分極細胞、１００％とする）に対するノルアドレナリンの割合を示す。ｘ軸は異なる処理群を示し、左から右へバーで示す：基底状態；陽性対照（処理なしの脱分極細胞）；０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号６－ＮＨ_２で処理した脱分極細胞；および０．１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号６－ＮＨ_２で処理した脱分極細胞。

【図5】図５は、配列番号４－ＮＨ_２で処理した実施例５におけるノルアドレナリンのレベルについて得られた結果を示す。ｙ軸は陽性対照（未処理の脱分極細胞、１００％とする）に対するノルアドレナリンの割合を示す。ｘ軸は異なる処理群を示し、左から右へバーで示す：基底状態；陽性対照（処理なしの脱分極細胞）；０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した脱分極細胞；および０．１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した脱分極細胞。

【図6】図６は、０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド配列番号４－ＮＨ_２で２４時間処理した場合の、実施例６で得られた遺伝子発現結果を示す。各バーは上から順に１個の遺伝子を示す：ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ４Ａ、ＳＣＮ３ＡおよびＣＡＬＭ３。左（すなわち、負の値）に向かって伸びるバーは、遺伝子のダウンレギュレーションを示す。

【図7】図７は、０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド配列番号４－ＮＨ_２で２４時間処理した場合の、実施例６で得られた遺伝子発現結果を示す。各バーは上から順に１個の遺伝子を示す：ＲＡＰＳＮ、ＳＣＮ３ＡおよびＣＡＬＭ３。左（すなわち、負の値）に向かって伸びるバーは、遺伝子のダウンレギュレーションを示す。

【図8】図８は、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬまたは０．０１５ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド配列番号４－ＮＨ_２でＨＤＦａ細胞を４８時間処理した場合の、実施例７で得られたエラスチンの産生または合成の結果を示す。エラスチンの産生または合成は、１００％として確立された基底状態（未処理細胞）に対する割合として表される。Ｙ軸は基底状態に対するエラスチンの割合を示す。ｘ軸は異なる処理群を示し、左から右へバーで示す：基底状態（未処理細胞）；０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞；０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞；および、０．０１５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞。

【図9】図９は、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０１５ｍｇ／ｍＬまたは０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２でＨＤＦａ細胞を４８時間処理した場合の、実施例８におけるプロコラーゲンＩα１の放出について得られた結果を示す。プロコラーゲンＩα１の放出は、１００％として確立された基底状態（未処理細胞）に対する割合として表される。ｙ軸は、基底状態に対するプロコラーゲンＩα１の放出の割合を示す。ｘ軸は異なる処理群を示し、左から右へバーで示す：基底状態（未処理細胞）；０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞；０．０１５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞；および０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド配列番号４－ＮＨ_２で処理した細胞。

【図10】図１０は、ＨＤＦａ細胞を、ペプチド配列番号４－ＮＨ_２を用いて、０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＭＭＰ１、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ４Ａ１）で２４時間、０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＴＩＭＰ２、ＦＢＬＮ５、ＬＯＸＬ１およびＣＯＬ７Ａ１）で２４時間、０．００５ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＨＹＡＬ１）で６時間、および０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド（ＨＡＳ１）で６時間処理した場合の、実施例１０において得られた遺伝子発現結果を示す。各バーは上から順に１個の遺伝子を示す：ＭＭＰ１、ＨＹＡＬ１、ＴＩＭＰ２、ＨＡＳ１、ＦＢＬＮ５、ＬＯＸＬ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ７Ａ１。左（すなわち、負の値）に向かって伸びるバーは、遺伝子のダウンレギュレーションを示す。右（すなわち、正の値）に向かって伸びるバーは、遺伝子のアップレギュレーションを示す。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-07-23

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種類のナトリウムチャネルの活性および／またはシグナルを低下させることができる５個～８個のアミノ酸のペプチド；その許容される異性体、塩、溶媒和物および／またはそれらの混合物、ここで、前記ペプチドは式（Ｉ）の配列を含み：
Ｒ_１－ＡＡ１－ＡＡ２－ＡＡ３－ＡＡ４－ＡＡ５－ＡＡ６－Ｒ_２
（Ｒ_１－配列番号７－Ｒ_２）
ここで、前記ペプチドは以下から選択され：
Ｒ _１ －Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｒ _２ ；
Ｒ _１ －Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ｒ _２ ；または
Ｒ _１ －Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｒ _２
Ｒ _１ －Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｒ _２ ；
Ｒ _１ －Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｒ _２ ；または
Ｒ _１ －Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｒ _２
Ｒ_１は、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルおよびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここで、Ｒ_５は、置換もしくは非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換もしくは非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換もしくは非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換もしくは非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３員～１０員の置換もしくは非置換のヘテロシクリル環、ならびに、２個～２４個の炭素原子および１個～３個の炭素以外の原子および１個～６個の炭素原子のアルキル鎖の置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換の非環式脂肪族基、置換もしくは非置換のアリシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルから選択され；
あるいは、Ｒ_１およびＲ_２は存在せず、ＡＡ１は前記ペプチドの最後のアミノ酸に直接結合している、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの活性および／またはシグナルを低下させることができる５個～８個のアミノ酸のペプチド；その許容される異性体、塩、溶媒和物および／またはそれらの混合物。

【請求項2】

前記ペプチドは、少なくとも１種類のナトリウムチャネルの発現をダウンレギュレートすることが可能であり、および／または、少なくとも１個の神経伝達物質のレベルを低下させることが可能であり、および／または、ＥＣＭを維持および／または合成することが可能であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

前記ナトリウムチャネルは電位依存性ナトリウムチャネルである、請求項２に記載のペプチド。

【請求項4】

前記電位依存性ナトリウムチャネルは、Ｎａｖ１．３および／またはＮａｖ１．４である、請求項３に記載のペプチド。

【請求項5】

前記神経伝達物質は、ノルアドレナリンである、請求項２に記載のペプチド。

【請求項6】

前記ＥＣＭは、コラーゲンＩ、エラスチン、ヒアルロン酸またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載のペプチド。

【請求項7】

Ｒ_１はＨであり、および／または、Ｒ_２はＮＨ_２であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか１項に記載のペプチドを含む、組成物。

【請求項9】

請求項１～７のいずれか１項に記載のペプチドのそれを必要とする対象における、化粧品としての使用。

【請求項10】

請求項８に記載の組成物のそれを必要とする対象における、化粧品としての使用。

【請求項11】

前記化粧品としての使用は、皮膚の老化の徴候を軽減し、予防し、および／または除去することであることを特徴とする、請求項９に記載の化粧品としての使用。

【請求項12】

前記化粧品としての使用は、皮膚の老化の徴候を軽減し、予防し、および／または除去することであることを特徴とする、請求項１０に記載の化粧品としての使用。

【請求項13】

前記皮膚の老化の徴候は、シワであることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の化粧品としての使用。

【国際調査報告】