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特表2025-503305ＶＣＩ、ＰＳＣＩ又はＣＳＶＤの治療におけるキニン又はその誘導体の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-30
(54)【発明の名称】ＶＣＩ、ＰＳＣＩ又はＣＳＶＤの治療におけるキニン又はその誘導体の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20250123BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20250123BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20250123BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20250123BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20250123BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20250123BHJP
C07K 7/18 20060101ALN20250123BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20250123BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20250123BHJP
C07K 14/765 20060101ALN20250123BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20250123BHJP
C12N 15/16 20060101ALN20250123BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20250123BHJP
C12N 15/14 20060101ALN20250123BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08
A61K38/07
A61K38/10
A61P9/00
A61P25/28
A61K47/60
C07K7/18 ZNA
C07K19/00
C07K16/00
C07K14/765
C12N15/62 Z
C12N15/16
C12N15/13
C12N15/14
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024545275
(86)(22)【出願日】2023-01-17
(85)【翻訳文提出日】2024-09-30
(86)【国際出願番号】 CN2023072640
(87)【国際公開番号】W WO2023143256
(87)【国際公開日】2023-08-03
(31)【優先権主張番号】202210113865.3
(32)【優先日】2022-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524159077
【氏名又は名称】江蘇衆紅生物工程創薬研究院有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＺＯＮＨＯＮ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ，ＩＮＣ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲馬▼ 永
(72)【発明者】
【氏名】江 辰▲陽▼
(72)【発明者】
【氏名】庄 宇
(72)【発明者】
【氏名】▲許▼ 振
(72)【発明者】
【氏名】徐 丹
(72)【発明者】
【氏名】王 俊
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA94
4C076BB13
4C076CC01
4C076CC11
4C076EE23
4C076EE59
4C076FF65
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA16
4C084BA17
4C084BA18
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA59
4C084DB01
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA12
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA361
4C084ZA362
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA55
4H045BA57
4H045CA40
4H045DA30
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA74
(57)【要約】
キニン又はその誘導体、特に長時間作用型のキニン又はその誘導体のＶＣＩ、ＰＳＣＩ又はＣＳＶＤの治療における使用。ＶＣＩ、ＰＳＣＩによく認知機能障害と精神・行動症状が見られ、その認知機能障害にコリンエステラーゼ阻害薬や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬が使用され、精神・行動症状には対症的に抗うつ薬などが使用される。慢性ＣＳＶＤ患者には認知障害、運動障害、感情障害、排便障害などの症状が見られ、その認知障害にコリンエステラーゼ阻害薬や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬が使用され，抑うつには一般的に抗うつ薬が使用される。本発明は研究によりキニン又はその誘導体、特に長時間作用型のキニン又はその誘導体がＶＣＩ、ＰＳＣＩ、ＣＳＶＤなどの治療に使用できることを発見し、これらの疾患の治療に新たな方法を提供した。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血管性認知機能障害を治療または改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用。
【請求項2】
血管性認知機能障害を治療または改善するための薬物組成物であって、キニン又はその誘導体を含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項3】
血管性認知機能障害を治療又は改善する方法であって、キニン又はその誘導体を患者に投与することを特徴とする、方法。
【請求項4】
脳卒中後認知機能障害を治療または改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用。
【請求項5】
脳卒中後認知機能障害を治療または改善するための薬物組成物であって、キニン又はその誘導体を含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項6】
脳卒中後認知機能障害を治療または改善する方法であって、キニン又はその誘導体を患者に投与することを特徴とする、方法。
【請求項7】
血管病変を伴うアルツハイマー病を治療または改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用。
【請求項8】
血管病変を伴うアルツハイマー病を治療または改善するための薬物組成物であって、キニン又はその誘導体を含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項9】
血管病変を伴うアルツハイマー病を治療または改善する方法であって、キニン又はその誘導体を患者に投与することを特徴とする、方法。
【請求項10】
脳小血管病を治療または改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用。
【請求項11】
脳小血管病を治療または改善するための薬物組成物であって、キニン又はその誘導体を含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項12】
脳小血管病を治療または改善する方法であって、キニン又はその誘導体を患者に投与することを特徴とする、方法。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のキニンは、ブラジキニン又はリシルブラジキニンであることを特徴とする、キニン。
【請求項14】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のキニン誘導体は、長時間作用型のキニンであることを特徴とする、キニン誘導体。
【請求項15】
請求項１４に記載のキニン誘導体であって、前記キニン誘導体は、キニンのポリエチレングリコール修飾体であり、
用いたＰＥＧ修飾剤がＳＰＡ、ＳＣＭ、又はＳＳの修飾剤で、直鎖型又は分岐型のＰＥＧ修飾剤であることを特徴とする、
キニン誘導体。
【請求項16】
請求項１４に記載のキニン誘導体であって、前記キニン誘導体は、キニンの突然変異体であり、
リシルブラジキニン又はブラジキニンのアミノ酸配列中の任意の位置にシステインを導入し、
及び／又はリシルブラジキニンのＮ末端の１位と２位のアミノ酸残基との間に任意のアミノ酸を挿入し、
及び／又はブラジキニンのＮ末端の１位のアミノ酸残基の前に任意のアミノ酸を挿入し、
及び／又は２個あるいは２個以上のリシルブラジキニン単体を、又は２個あるいは２個以上のブラジキニン単体を、又はリシルブラジキニン単体とブラジキニン単体を繋ぎ合わせ、
及び／又はリシルブラジキニンの６位のＰｈｅ又はブラジキニンの５位のＰｈｅを他のアミノ酸に突然変異したことを特徴とする、
キニン誘導体。
【請求項17】
請求項１４に記載のキニン誘導体であって、前記キニン誘導体は、融合タンパク質であり、キニンとＦｃ断片と融合するか、又はキニンとヒト血清アルブミンと融合することを特徴とする、
キニン誘導体。
【請求項18】
請求項１４に記載のキニン誘導体であって、前記キニン誘導体は、脂肪酸付加のキニン、又は長時間作用型製剤のキニンであることを特徴とする、キニン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬分野におけるキニン又はその誘導体、特に長時間作用型のキニン又はその誘導体が血管性認知機能障害（ＶＣＩ）、脳卒中後認知機能障害（ＰＳＣＩ）又は脳小血管病（ＣＳＶＤ）の治療における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
社会の発展と高齢化の進展に伴って、脳血管疾患の発症率が年々上昇しており、患者と家族の生活の質に深刻な影響を及ぼす。１９９３年にＨａｃｈｉｎｓｋｉとＢｏｗｌｅｒが血管性認知機能障害（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ，ＶＣＩ）という概念を初めて提唱した。これは脳血管疾患の危険因子（例えば高血圧、糖尿病、高脂血症など)、明らかな脳血管疾患（例えば脳梗塞と脳出血など）又は明らか
でない脳血管疾患（例えば白質粗しょう化、慢性脳虚血）による軽度の認知障害から痴呆までの一連の症候群である（『２０１９年中国血管性認知障害診療ガイドライン』、『中国の脳卒中の予防治療の指導規範（２０２１版）』における『中国血管性認知障害診療指導規範』）。
でない脳血管疾患（例えば白質粗しょう化、慢性脳虚血）による軽度の認知障害から痴呆までの一連の症候群である（『２０１９年中国血管性認知障害診療ガイドライン』、『中国の脳卒中の予防治療の指導規範（２０２１版）』における『中国血管性認知障害診療指導規範』）。
【0003】
血管性認知機能障害の患者には、認知機能障害と精神・行動症状が見られる。一部の患者では、その認知障害は抽象的思惟、概念の形成と変換、思惟の柔軟性、情報処理速度などの機能的障害を主としており、記憶力が保たれている。また、複数の領域に障害がみられ、記憶力も著しく障害されている患者もいる。血管性認知機能障害における認知機能障害に対する治療薬には、コリンエステラーゼ阻害薬や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬がある。血管性認知機能障害の精神・行動症状には、知覚、思惟、心境、行動などの異常が含まれ、無気力、抑うつ、焦燥感、興奮・攻撃性などがよくみられる。その治療は、抗うつ薬である選択的セロトニン再取り込み阻害薬などの対症治療薬が利用可能である（『中国血管性認知障害診療指導規範』）。脳卒中後認知機能障害（ｐｏｓｔ－ｓｔｒｏｋｅ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ、ＰＳＣＩ）、脳小血管病（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｓｍａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＳＶＤ）による認知機能障害、血管病変を伴うアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）などが血管性認知機能障害の主要なサブタイプである。
【0004】
脳卒中後認知機能障害は、脳卒中によって起こる認知機能障害が強調され、同じく認知機能の損傷や精神・行動症状が見られる。脳卒中後認知機能障害と血管性認知機能障害とアルツハイマー病は、神経病理学的と神経生化学的機序においてある程度の共通性があることを考慮して、中国の『卒中後認知障害管理専門家共通認知２０２１』は、脳卒中後認知機能障害を治療するにあたって、血管性認知機能障害やアルツハイマー病などの研究や証拠を参考にして、認知障害に対しては一般的にアセチルコリンエステラーゼ阻害剤や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬（メマンチン）を使用し、卒中後の抑うつに対しては一般的に抗うつ薬を使用することを推奨している。欧州脳卒中組織が最近発表した『２０２１年 ＥＳＯ／ＥＡＮ共同ガイドライン：脳卒中後認知障害』によれば、脳卒中後認知障害に対する治療薬はまだ存在しない。本ガイドラインが注目する試験の中に脳卒中後認知障害に焦点を当てたものは一つあるが、陽性の結果は得られなかった。本ガイドラインはまた、脳卒中後認知機能障害に対するランダム化比較試験の高品質のデータが著しく不足すると指摘している。
【0005】
脳小血管病は、脳内の小動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、小静脈が複数の危険因子による影響を受けて引き起こされる一連の臨床的、画像的、病理学的症候群であり、急性脳
小血管病と慢性脳小血管病に分類される。急性脳小血管病は虚血性脳卒中を引き起こす可能性があり、現在では急性虚血性脳卒中の予防・治療法（例えば、血圧降下、血栓溶解、抗血小板、脂質降下など）を参考にして治療することが推奨されている。慢性脳小血管病の患者には、認知障害、運動障害、感情障害、排便障害などの症状が見られ、明確に診断された後は、一般的に対症的な治療が推奨される。脳小血管病による認知障害に対してはコリンエステラーゼ阻害薬や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬が使用され，抑うつに対しては一般的にセロトニン再取り込み阻害薬などの抗うつ薬が使用される（『中国脳小血管病診療専門家共通認識』）。
小血管病と慢性脳小血管病に分類される。急性脳小血管病は虚血性脳卒中を引き起こす可能性があり、現在では急性虚血性脳卒中の予防・治療法（例えば、血圧降下、血栓溶解、抗血小板、脂質降下など）を参考にして治療することが推奨されている。慢性脳小血管病の患者には、認知障害、運動障害、感情障害、排便障害などの症状が見られ、明確に診断された後は、一般的に対症的な治療が推奨される。脳小血管病による認知障害に対してはコリンエステラーゼ阻害薬や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬が使用され，抑うつに対しては一般的にセロトニン再取り込み阻害薬などの抗うつ薬が使用される（『中国脳小血管病診療専門家共通認識』）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】『２０１９年中国血管性認知障害診療ガイドライン』
【非特許文献2】『中国の脳卒中の予防治療の指導規範（２０２１版）』
【非特許文献3】『卒中後認知障害管理専門家共通認識２０２１』
【非特許文献4】『２０２１年 ＥＳＯ／ＥＡＮ共同ガイドライン：脳卒中後認知障害』
【非特許文献5】『中国脳小血管病診療専門家共通認識』
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明が解決しようとする第一の技術的課題は、血管性認知機能障害を治療するための新薬を提供することである。本発明が解決しようとする第二の技術的課題は、脳小血管病を治療するための新薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明が解決しようとする第一の技術的課題は、血管性認知機能障害を治療するための新薬を提供することであり、具体的には、血管性認知機能障害を治療又は改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用を提供する。
【0009】
本発明はまた、血管性認知機能障害を治療又は改善するための薬物組成物を提供する。前記組成物は、キニン又はその誘導体を含む。
【0010】
本発明はまた、血管性認知機能障害を治療又は改善する方法を提供する。前記方法は、キニン又はその誘導体を患者に投与する方法である。
【0011】
前記血管性認知機能障害には、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病による認知機能障害、血管病変を伴うアルツハイマー病などが含まれるが、これらに限定されない。
【0012】
好ましくは、前記血管性認知機能障害は、脳卒中後認知機能障害である。
好ましくは、前記血管性認知機能障害は、脳小血管病による認知機能障害である。
好ましくは、前記血管性認知機能障害は、血管病変を伴うアルツハイマー病である。
好ましくは、前記血管性認知機能障害は、脳小血管病による認知機能障害である。
好ましくは、前記血管性認知機能障害は、血管病変を伴うアルツハイマー病である。
【0013】
本発明が解決しようとする第二の技術的課題は、脳小血管病を治療するための新薬を提供することであり、具体的には、脳小血管病を治療又は改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用を提供する。
【0014】
本発明はまた、脳小血管病を治療又は改善するための薬物組成物を提供する。前記組成物は、キニン又はその誘導体を含む。
【0015】
本発明はまた、脳小血管病を治療又は改善する方法を提供する。前記方法は、キニン又
はその誘導体を患者に投与する方法である。
前記キニンは、ブラジキニン又はリシルブラジキニンを含む。
前記キニン又はその誘導体は、長時間作用型のキニン又はその誘導体である。
はその誘導体を患者に投与する方法である。
前記キニンは、ブラジキニン又はリシルブラジキニンを含む。
前記キニン又はその誘導体は、長時間作用型のキニン又はその誘導体である。
【0016】
ペプチド薬物は一般に生体内での安定性が悪く、半減期が短いというデメリットがあり、特に慢性疾患の治療薬としては長期にわたる頻回の投与が必要とされることが多い。生体内におけるリシルブラジキニン／ブラジキニンの分解には、主にアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ及びアンジオテンシンＡＣＥＩＩが関与し、キニンの放出酵素系と分解酵素系により、生体内におけるブラジキニンの動的バランスを維持する。リシルブラジキニンとブラジキニンは、普通のペプチドよりさらに不安定であり、半減期がわずか数秒と報告されている。外因的に投与されたキニンは、生体内でキナーゼによる加水分解によってはやく失活してしまう。
【0017】
ペプチド薬物の安定性を改善し、生体内での半減期を延長しようとして、長時間作用させるために、現在、主に以下の２つの方法が用いられている。一つはペプチド分子の改造であり、例えば、アミノ酸置換や環化、ＰＥＧ修飾、長時間作用性断片との融合（Ｆｃ断片との融合、ヒト血清アルブミンとの融合）、脂肪酸の付加などの策略が利用される。もう一つは、製剤化によってペプチド薬物を長時間作用型にする方法である。
【0018】
本発明は、具体的な実施例でキニンの半減期を延長するために２つの方法を用いた。即ち、キニンをポリエチレングリコールで修飾する方法と、キニンのアミノ酸配列を最適化する方法である。
【0019】
ポリエチレングリコール修飾について、本発明の具体的な実施例で用いたＰＥＧ修飾剤はＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳ修飾剤を含み、直鎖型又は分岐型であってよい。
【0020】
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤は直鎖型ＰＥＧ修飾剤である。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は２ＫＤ～２０ＫＤである。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は２ＫＤ～２０ＫＤである。
【0021】
キニンのアミノ酸配列の最適化について、本発明は具体的な実施例で、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのアミノ酸配列中の任意の位置にシステイン（Ｃｙｓ）を導入した。好ましくは、野生型のリシルブラジキニンのアミノ酸配列の一位のＬｙｓをＣｙｓに突然変異する。即ち、アミノ酸配列をＣＲＰＰＧＦＳＰＦＲになるようにする。
【0022】
本発明は具体的な実施例で、野生型のリシルブラジキニンのＮ末端の１位と２位のアミノ酸残基との間に任意の数、任意の種類のアミノ酸を挿入し、即ちアミノ酸配列をＫＸＲＰＰＧＦＳＰＦＲになるようにした（Ｘは任意の数、任意の種類のアミノ酸を表す）。または、野生型のブラジキニンのＮ末端の１位のアミノ酸残基の前に任意の数、任意の種類のアミノ酸を挿入し、即ちアミノ酸配列をＸＲＰＰＧＦＳＰＦＲになるようにした（Ｘは任意の数、任意の種類のアミノ酸を表す）。実験結果は、Ｎ末端が延長された後の活性がよりよいことを示した。好ましくは、１個又は２個又は３個のアミノ酸を挿入する。好ましくは、１個又は２個のアルギニン（Ａｒｇ）を挿入する。
【0023】
本発明は具体的な実施例で、２個あるいは２個以上のリシルブラジキニン単体を、又は２個あるいは２個以上のブラジキニン単体を、又はリシルブラジキニン単体とブラジキニン単体を繋ぎ合わせたリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体（例えばｍ１４、ｍ１２）を作製した。前記リシルブラジキニン又はブラジキニンの単体は、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンであってよいし、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに一部のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異体であってもよい。
【0024】
本発明は具体的な実施例で、野生型リシルブラジキニンの６位のＰｈｅ又は野生型ブラジキニンの５位のＰｈｅを他のアミノ酸、例えば非天然アミノ酸Ｉｇｌ（α－２－インドリルグリシン）、ＴＨＩ（β－２－チエニルアラニン）に突然変異した。前記部位突然変異したＬＢＫ又はＢＫは、生体内の酵素に認識されにくいため、その生体内での半減期が効果的に延長された。
【0025】
好ましくは、本発明のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示される配列である。
【0026】
本発明の具体的な実施例で用いたポリエチレングリコール修飾方法およびアミノ酸配列の最適化方法は、キニンの半減期をこういった方法で延長できることを例示するものであり、キニンの半減期を延長する具体的な実施形態を限定することを意図するものではない。当業者は、本発明で例示した方法とは別に、他のポリエチレングリコール修飾方法、他のアミノ酸配列の最適化方法、又はペプチド薬物を長時間作用させる他の修飾方法（例えば、上記で述べたＦｃ断片との融合、ヒト血清アルブミンとの融合、脂肪酸の付加、製剤化）を用いて、ペプチドを修飾して長時間作用させることができる。
【0027】
前記キニン又はその誘導体は単独で投与してよいし、又は他の薬物（例えば、コリンエステラーゼ阻害薬や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬など）と併用で投与してもよい。
【0028】
投与方法は、注射投与、経口投与などを含むが、これらに限定されない。前記注射投与は、静脈注射、皮下注射などを含むが、これらに限定されない。
【0029】
広く受け入れられている血管性認知機能障害の動物モデルには、４血管閉塞法（４－ｖｅｓｓｅｌ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ、４－ＶＯ）、改良的４－ＶＯ法、３期４－ＶＯ法、２血管閉塞法（２－ＶＯ）、改良的２－ＶＯ法、改良的一側総頚動脈閉塞一側総頚動脈狭窄法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ｍＣＣＡＯ）などによるラットのモデル、及び総頚動脈狭窄法（ｂｉｌａｔｅｒａｌ ＣＣＡ ｓｔｅｎｏｓｉｓ，ＢＣＡＳ）、非対称的頚動脈手術（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＣＣＡ ｓｕｒｇｅｒｙ，ＡＣＡＳ）などによるマウスのモデルがある（『血管性認知障害動物モデルの研究進展』）。
【0030】
広く受け入れられている脳小血管病の動物モデルには、主に両側総頸動脈結紮モデル、両側総頸動脈狭窄モデル（ＢＣＡＳ）、脳卒中易発症高血圧自然発症ラットモデルなどがある（『脳小血管病トランスレーショナル・リサーチに関する中国専門家の共通認識』）。
【0031】
血管性認知障害と脳小血管病の研究においてよく受け入れられている実験動物モデルであるＢＣＡＳモデルは、動物の脳血流が著しく低下し、これによって慢性的な低灌流損傷が引き起こされることで、血液脳関門の透過性が増加し、白質が損傷され、さらに記憶機能障害、運動機能損傷などが引き起こされる。
【0032】
本発明の研究結果は、ＢＣＡＳモデルマウスにキニン又はその誘導体を投与することで、動物の損傷した協調運動機能、前肢の損傷した筋肉の強度、ワーキング・メモリー、空間学習・記憶機能と抑うつ行為が顕著に改善されたことを示している。したがって、キニン又はその誘導体は、血管性認知機能障害、脳小血管病の治療に使用できる。
【0033】
なお、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病による認知機能障害、血管病変を伴うアルツ
ハイマー病は、すべて血管性認知機能障害の重要なサブタイプであり、それぞれの臨床上の治療は同様な対症療法薬を使用する。例えば、認知機能障害に対して、血管性認知機能障害と脳卒中後認知機能障害と脳小血管病の治療ガイドラインや専門家共通認識は一般的に、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬（メマンチン）の使用を推奨しており、抑うつなどの精神・行動症状に対する薬物治療は、一般的に抗うつ薬の使用を推奨する。したがって、キニン又はその誘導体は、血管性認知機能障害のさまざまなサブタイプ、例えば脳卒中後認知機能障害、脳小血管病による認知機能障害、血管病変を伴うアルツハイマー病などの治療に用いることができる。
ハイマー病は、すべて血管性認知機能障害の重要なサブタイプであり、それぞれの臨床上の治療は同様な対症療法薬を使用する。例えば、認知機能障害に対して、血管性認知機能障害と脳卒中後認知機能障害と脳小血管病の治療ガイドラインや専門家共通認識は一般的に、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬（メマンチン）の使用を推奨しており、抑うつなどの精神・行動症状に対する薬物治療は、一般的に抗うつ薬の使用を推奨する。したがって、キニン又はその誘導体は、血管性認知機能障害のさまざまなサブタイプ、例えば脳卒中後認知機能障害、脳小血管病による認知機能障害、血管病変を伴うアルツハイマー病などの治療に用いることができる。
【0034】
カリクレイン－キニン系（略称：ＫＫＳ）は、心血管系、腎臓、神経系の機能調節などさまざまな生理的および病理的な過程に関与している。ＫＫＳ系には、カリクレイン（ＫＬＫ）、キニノゲン、キニン、キニン受容体（Ｂ１、Ｂ２受容体）及びキニナーゼが含まれる。カリクレインは、キニノゲナーゼあるいはカリジノゲナーゼとも称され、セリンプロテアーゼの一種であり、血漿カリクレイン（ＰＫ）と組織カリクレイン（ＴＫ）の２種に分けられ、どちらも非常に重要な生理作用を発揮している。現在、ヒト組織カリクレインは少なくとも１５のメンバー（ＫＬＫ１－ＫＬＫ１５）で構成されると考えられており、そのなかで組織カリクレイン１（ＫＬＫ１）に対する研究が比較的に多く行われている。ＫＬＫ１はキニノゲンをキニンに変換させ、対応する受容体に作用して一連の生物学的作用を発揮する。現在、より明確に研究されているキニンとしては、リシルブラジキニン（デカペプチド）とブラジキニン（ノナペプチド）があり、前者は生体内でアミノペプチダーゼによってブラジキニンに切断され、両者とも血圧調節や炎症反応など幅広い生理機能を持つ。一方、リシルブラジキニンとブラジキニンは体内での半減期が数秒から数分と非常に短いため、そのドラッガビリティが大きく制限されている。今のところ医薬品として市販されるキニンはまだない。中国では２種類の注射用カリクレイン１が販売されており、適応症には微小循環障害や軽度・中等度の急性血栓性脳卒中などが含まれる。
【0035】
血管性認知機能障害や脳小血管病などは、ＫＬＫ１の承認適応とはかなり異なる。病理的メカニズムの面では、急性虚血性脳卒中は様々な原因による血管壁病変によって、脳動脈の主幹動脈や分枝動脈の内腔に狭窄や閉塞が生じ、または血栓が形成されるため、脳局所の血流が減少し、又は血液供給が遮断されて、脳組織に虚血性または低酸素性の壊死が発生して局所神経系症状や徴候が現れるのである。一方、血管性認知障害は、脳血管疾患の危険因子（例えば高血圧、糖尿病、高脂血症など）、明らかな脳血管疾患（例えば脳梗塞、脳出血など）又は明らかでない脳血管疾患（例えば白質粗しょう化、慢性脳虚血）による軽度の認知障害から痴呆までの一連の症候群である。
【0036】
脳小血管病の発病過程において、神経血管ユニット（ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｕｎｉｔ，ＮＶＵ）の機能異常が重要な役割を果たしており、何らかの原因でＮＶＵが構造的または機能的に変化した場合にＣＳＶＤが起こりうる。よく考えられる発病のメカニズムとして慢性脳虚血や低灌流、内皮機能障害や血液脳関門の破壊、組織間液の還流障害、炎症反応、遺伝的要因などが挙げられる。異なるメカニズムの間は相互に影響し合っている（ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｖａｓｅｕｌａｒ ｕｎｉｔ ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ ａｇｅ：ａ
ｊｏｕｒｎｅｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｅｕｒｏｖａｓｅｕｌａｒ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ）。
ｊｏｕｒｎｅｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｅｕｒｏｖａｓｅｕｌａｒ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ）。
【0037】
さらに、急性虚血性脳卒中の診断と治療法は、血管性認知障害や脳小血管病とは大いに異なっている。急性虚血性脳卒中に対する最も効果的な治療はタイム・ウィンドウ内で血管内再開通療法（静脈内血栓溶解、機械的血栓回収、血管形成術など）を行うことであり、治療の成功率は発症時間と密接に関係する。薬物治療には、抗血小板・抗凝・繊維減少・容積拡張・血管拡張薬、スタチン系薬剤、神経保護薬などの使用が含まれる。血管性認
知障害はよく認知機能障害と精神・行動症状が表れる。血管性認知障害と脳卒中後認知障害における認知機能障害の治療薬には、コリンエステラーゼ阻害薬、非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬があり、精神・行動症状に対する対症療法薬には抗うつ薬である選択的セロトニン再取り込み阻害薬などが挙げられる。慢性脳小血管病の患者には、認知障害、運動障害、感情障害と排便障害などの症状が見られ、明確に診断された後は、一般的に対症的な治療が推奨される。例えば、脳小血管病による認知障害に対してはコリンエステラーゼ阻害薬や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬を使用し、抑うつに対してはセロトニン再取り込み阻害薬などの抗うつ薬を一般的に使用する。
知障害はよく認知機能障害と精神・行動症状が表れる。血管性認知障害と脳卒中後認知障害における認知機能障害の治療薬には、コリンエステラーゼ阻害薬、非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬があり、精神・行動症状に対する対症療法薬には抗うつ薬である選択的セロトニン再取り込み阻害薬などが挙げられる。慢性脳小血管病の患者には、認知障害、運動障害、感情障害と排便障害などの症状が見られ、明確に診断された後は、一般的に対症的な治療が推奨される。例えば、脳小血管病による認知障害に対してはコリンエステラーゼ阻害薬や非競合的Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体拮抗薬を使用し、抑うつに対してはセロトニン再取り込み阻害薬などの抗うつ薬を一般的に使用する。
【0038】
本発明は研究を通して、キニン又はその誘導体が血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病などの治療に使用できることを明らかにし、血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、及び脳小血管病の治療に新たな方法を提供している。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1a】図１は、Ｌｙｓ－ＢＫとその変異体が下流のＥＲＫ１／２及びＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することを示す図である。その５つのシグナルの中で、β－ａｃｔｉｎは内部対照であり、ｐ－は対応するタンパク質のリン酸化を表し、ｃｏｎｔｒｏｌは緩衝液空白対照であり、Ｌｙｓ－ＢＫ－Ｍ０６－ＥＨはｍ０６と血清と混合してインキュベートした後のサンプルである。
【図1b】図１は、Ｌｙｓ－ＢＫとその変異体が下流のＥＲＫ１／２及びＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することを示す図である。その５つのシグナルの中で、β－ａｃｔｉｎは内部対照であり、ｐ－は対応するタンパク質のリン酸化を表し、ｃｏｎｔｒｏｌは緩衝液空白対照であり、Ｌｙｓ－ＢＫ－Ｍ０６－ＥＨはｍ０６と血清と混合してインキュベートした後のサンプルである。
【図1c】図１は、Ｌｙｓ－ＢＫとその変異体が下流のＥＲＫ１／２及びＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することを示す図である。その５つのシグナルの中で、β－ａｃｔｉｎは内部対照であり、ｐ－は対応するタンパク質のリン酸化を表し、ｃｏｎｔｒｏｌは緩衝液空白対照であり、Ｌｙｓ－ＢＫ－Ｍ０６－ＥＨはｍ０６と血清と混合してインキュベートした後のサンプルである。
【図1d】図１は、Ｌｙｓ－ＢＫとその変異体が下流のＥＲＫ１／２及びＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することを示す図である。その５つのシグナルの中で、β－ａｃｔｉｎは内部対照であり、ｐ－は対応するタンパク質のリン酸化を表し、ｃｏｎｔｒｏｌは緩衝液空白対照であり、Ｌｙｓ－ＢＫ－Ｍ０６－ＥＨはｍ０６と血清と混合してインキュベートした後のサンプルである。
【発明を実施するための形態】
【0040】
特に明記しない限り、本発明における技術用語または略語は次の意味を持つ。
Ｌｙｓ－ＢＫ：野生型リシルブラジキニンであり、天然ヒトリシルブラジキニンのアミノ酸配列と一致し、そのアミノ酸配列はＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲである。
Ｌｙｓ－ＢＫ：野生型リシルブラジキニンであり、天然ヒトリシルブラジキニンのアミノ酸配列と一致し、そのアミノ酸配列はＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲである。
【0041】
ＢＫ：野生型ブラジキニンであり、天然ヒトブラジキニンのアミノ酸配列と一致し、そのアミノ酸配列はＲＰＰＧＦＳＰＦＲである。
【0042】
突然変異体：野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに一部のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異体である。
【0043】
誘導体：本発明の実施例で例示した各種突然変異体のみならず、本発明のＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ突然変異体をもとにさらに改造して得られたペプチド、融合タンパク質（アルブミン融合、Ｆｃ融合などを含むが、これらに限定されない）、種々の形式の修飾体をも含む。
【0044】
ポリエチレングリコール：略称がＰＥＧであり、通常、エチレンオキシドの重合により形成され、分岐型、直鎖型と多腕型がある。通常のポリエチレングリコールは両末端にヒドロキシ基があり、片末端をメチル基でブロックするとメトキシ・ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が得られる。
【0045】
ポリエチレングリコール修飾剤：略称がＰＥＧ修飾剤であり、官能基を持つポリエチレングリコール誘導体のことを指し、タンパク質とペプチドの薬物の修飾に用いられる活性化されたポリエチレングリコールである。本発明で使用するポリエチレングリコール修飾剤は、江蘇衆紅生物工程創薬研究院有限公司、又は北京鍵凱科技股▲ふん▼有限公司より購入している。特定の分子量であるＰＥＧ修飾剤の実際の分子量は、表示値の９０％～１１０％であってよい。例えばＰＥＧ５Ｋの分子量は４．５ｋＤａ～５．５ｋＤａであってよい。
【0046】
Ｍ－ＳＰＡ－５Ｋ：分子量が約５ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは９８～１２０の整数である。
【0047】
【化1】
【0048】
Ｍ－ＳＰＡ－２Ｋ：分子量が約２ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは３７～４５の整数である。
【0049】
Ｍ－ＳＰＡ－１０Ｋ：分子量が約１０ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは２００～２４５の整数である。
【0050】
Ｍ－ＳＰＡ－２０Ｋ：分子量が約２０ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは４０５～４９５の整数である。
【0051】
Ｍ－ＳＣＭ－５Ｋ：分子量が約５ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルカルボキシメチレートであり、構造式は式（２）に示される通りである。式中、ｎは９９～１２０の整数である。
【0052】
【化2】
【0053】
Ｍ－ＳＳ－５Ｋ：分子量が約５ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルサクシネートであり、構造式は式（３）に示される通りである。式中、ｎは９８～１１９の整数である。
【0054】
【化3】
【0055】
Ｍ－ＹＮＨＳ－１０Ｋ：分子量が約１０ｋＤａの分岐型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルカルボキシメチレートであり、構造式は式（４）に示される通りである。式中、ｎは９８～１２０の整数である。
【0056】
【化4】
【実施例】
【0057】
実施例１ リシルブラジキニン／ブラジキニンの変異体の設計と合成
リシルブラジキニン／ブラジキニンの配列及び生体内における可能な分解経路に基づいて、一連の変異体を設計した（表１－１）。主にリシルブラジキニン／ブラジキニンの配列中のアミノ酸を構造的に類似する天然アミノ酸又は非天然アミノ酸に置き換えた変異体（ｍ０１～ｍ０４、ｍ０７、ｍ０２はＢＫの変異体である）と、リシルブラジキニン／ブラジキニンの生物学的活性／機能を発揮する最小活性単位を同定するために設計した部分的に切断又は延長されたペプチド変異体（ｍ０５、ｍ０６、ｍ０８～ｍ１１）と、変異体の抗酸化力をさらに高めるためにシステインを導入した変異体（ｍ１３、ｍ１５、ｍ１６）と、ペプチドの安定性をさらに向上させるためにリシルブラジキニン／ブラジキニン単体を繋ぎ合わせた変異体（ｍ１２はＬｙｓ－ＢＫとＢＫと繋ぎ合わせたものであり、ｍ１４は二つのＬｙｓ－ＢＫを繋ぎ合わせた変異体である）と、Ｎ末端の延長が薬効に及ぼす影響を比較するためにペプチドｍ１３を基に設計した変異体ｍ１５、ｍ１６である。ペプチドの純度はすべて＞９５％である。
リシルブラジキニン／ブラジキニンの配列及び生体内における可能な分解経路に基づいて、一連の変異体を設計した（表１－１）。主にリシルブラジキニン／ブラジキニンの配列中のアミノ酸を構造的に類似する天然アミノ酸又は非天然アミノ酸に置き換えた変異体（ｍ０１～ｍ０４、ｍ０７、ｍ０２はＢＫの変異体である）と、リシルブラジキニン／ブラジキニンの生物学的活性／機能を発揮する最小活性単位を同定するために設計した部分的に切断又は延長されたペプチド変異体（ｍ０５、ｍ０６、ｍ０８～ｍ１１）と、変異体の抗酸化力をさらに高めるためにシステインを導入した変異体（ｍ１３、ｍ１５、ｍ１６）と、ペプチドの安定性をさらに向上させるためにリシルブラジキニン／ブラジキニン単体を繋ぎ合わせた変異体（ｍ１２はＬｙｓ－ＢＫとＢＫと繋ぎ合わせたものであり、ｍ１４は二つのＬｙｓ－ＢＫを繋ぎ合わせた変異体である）と、Ｎ末端の延長が薬効に及ぼす影響を比較するためにペプチドｍ１３を基に設計した変異体ｍ１５、ｍ１６である。ペプチドの純度はすべて＞９５％である。
【0058】
【表1】
【0059】
実施例２ リシルブラジキニン／ブラジキニンとその変異体の安定性研究
リシルブラジキニン／ブラジキニンの安定性をｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系において評価した。２ｍｇ／ｍｌのペプチドとＳＤラット血清を体積比８５：１５で混合し、３７℃で３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分と異なる期間のインキュベートを行った。３％のトリクロロ酢酸（上記のペプチド－血清混合系の５０％の体積で）を加えて終止させ、血清中の基質による干渉も効果的に除去できた。さらに、ＵＰＬＣ－ＲＰ－ＵＶ２１４ｎｍ法に基づいて血清系におけるペプチドサンプルの分解をモニターすることによりペプチドサンプルの安定性を評価した。ＲＰ分析法：クロマトグラフィーカラムはＰｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ２．１ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍで、カラム温度は３０℃で、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮで、グラジエント：０－５ｍｉｎ，５％Ｂ；５－１０ｍｉｎ，５－４０％Ｂ；１０－３０ｍｉｎ，４０－６０％Ｂ；３０－３２ｍｉｎ，６０－１００％Ｂ；３２－３５ｍｉｎ，５％Ｂであった。
リシルブラジキニン／ブラジキニンの安定性をｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系において評価した。２ｍｇ／ｍｌのペプチドとＳＤラット血清を体積比８５：１５で混合し、３７℃で３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分と異なる期間のインキュベートを行った。３％のトリクロロ酢酸（上記のペプチド－血清混合系の５０％の体積で）を加えて終止させ、血清中の基質による干渉も効果的に除去できた。さらに、ＵＰＬＣ－ＲＰ－ＵＶ２１４ｎｍ法に基づいて血清系におけるペプチドサンプルの分解をモニターすることによりペプチドサンプルの安定性を評価した。ＲＰ分析法：クロマトグラフィーカラムはＰｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ２．１ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍで、カラム温度は３０℃で、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮで、グラジエント：０－５ｍｉｎ，５％Ｂ；５－１０ｍｉｎ，５－４０％Ｂ；１０－３０ｍｉｎ，４０－６０％Ｂ；３０－３２ｍｉｎ，６０－１００％Ｂ；３２－３５ｍｉｎ，５％Ｂであった。
【0060】
【表2】
【0061】
表２－１の結果は、野生型リシルブラジキニンと比較して本発明で設計した複数のペプチドの変異体が血清中でより優れた安定性を有することを示している。このことから、変異体はｉｎ ｖｉｖｏでの安定性と有効性において有利であることが示唆される。
【0062】
実施例３ リシルブラジキニン／ブラジキニンとその変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性評価
一、レポータ遺伝子アッセイによるＢ２受容体への親和性評価
リシルブラジキニン／ブラジキニンは、Ｂ２受容体に結合して下流のシグナル経路を活性化することによりｉｎ ｖｉｖｏでの薬理作用を発揮する。ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞へＢ２受容体レポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションした細胞株Ｂ２－ＮＦＡＴ－ＣＨＯ－Ｋ１を構築し、細胞ライブラリーの構築を完成した。これを用いて、リシルブラジキニン／ブラジキニン又はその変異体、及びそれらのＰＥＧ修飾体のＢ２受容体への結合活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定と評価を行った。
一、レポータ遺伝子アッセイによるＢ２受容体への親和性評価
リシルブラジキニン／ブラジキニンは、Ｂ２受容体に結合して下流のシグナル経路を活性化することによりｉｎ ｖｉｖｏでの薬理作用を発揮する。ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞へＢ２受容体レポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションした細胞株Ｂ２－ＮＦＡＴ－ＣＨＯ－Ｋ１を構築し、細胞ライブラリーの構築を完成した。これを用いて、リシルブラジキニン／ブラジキニン又はその変異体、及びそれらのＰＥＧ修飾体のＢ２受容体への結合活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定と評価を行った。
【0063】
測定方法：細胞を５×１０４個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに敷き詰め、３７℃、５％ ＣＯ２下で１６～２０時間培養した。その後、濃度勾配をつけて希釈した標準品と試験品の溶液を加えた。５時間後に、Ｂｉｏ－Ｌｉｔｅルシフェラーゼ酵素検出試薬を加え、化学発光強度を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄでグラフを作成し、４パラメータ方程式曲線をフィッティングし、ＥＣ５０値に基づいた相対的活性を算出した。Ｂ２受容体に対するペプチド変異体の相対的親和性を表３－１に示しており、変異体Ｌｙｓ－ＢＫｍ１１、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１５とＬｙｓ－ＢＫｍ１６は野生型リシルブ
ラジキニンと比較して活性の増加を示した。
ラジキニンと比較して活性の増加を示した。
【0064】
【表3】
【0065】
二、下流シグナル経路の主要な標的タンパク質に基づく活性分析
Ｂ２受容体を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞Ｂ２－ＮＦＡＴ－ＣＨＯ－Ｋ１をもとに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ又はその異なる変異体の投与によるＢ２Ｒの下流シグナルｐ－ＣＲＥＢ、ｐ－ＥＲＫ１／２の変化をＷＢ法で測定した。これを通して、被験物の活性の差異を比較した。細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ １／２，ＥＲＫ１／２）、環状アデノシン－リン酸エフェクター結合タンパク質（ＣＡＭＰ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＥＢ）はともにＢ２Ｒが活性化した後で、下流で直接作用するシグナル分子である。脳卒中発症後に、ＣＲＥＢとＥＲＫ１／２の活性化は虚血後の炎症反応やニューロン損傷の発生を防ぐことができるので、その発現レベルは被験物のＢ２Ｒ活性化能力をある程度反映するとともに、発揮した神経保護作用の効果も側面から反映する。
Ｂ２受容体を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞Ｂ２－ＮＦＡＴ－ＣＨＯ－Ｋ１をもとに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ又はその異なる変異体の投与によるＢ２Ｒの下流シグナルｐ－ＣＲＥＢ、ｐ－ＥＲＫ１／２の変化をＷＢ法で測定した。これを通して、被験物の活性の差異を比較した。細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ １／２，ＥＲＫ１／２）、環状アデノシン－リン酸エフェクター結合タンパク質（ＣＡＭＰ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＥＢ）はともにＢ２Ｒが活性化した後で、下流で直接作用するシグナル分子である。脳卒中発症後に、ＣＲＥＢとＥＲＫ１／２の活性化は虚血後の炎症反応やニューロン損傷の発生を防ぐことができるので、その発現レベルは被験物のＢ２Ｒ活性化能力をある程度反映するとともに、発揮した神経保護作用の効果も側面から反映する。
【0066】
対数増殖期のＣＨＯ－Ｋ１（Ｂ２Ｒ＋）細胞を収集し、培地で３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、３×１０５個／ウェルで細胞培養プレートに接種した。細胞を３７．０℃、５．０％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで２４～４８時間培養し、細胞密度が９０％以上に増殖した時点で、細胞をＰＢＳで洗浄した。ウェルごとに１ｍＬ １μＭのＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ又はその変異体を加え、Ｆ１２培地を対照群とした。細胞培養プレートを３７．０℃、５．０％ＣＯ２のインキュベーター内で５分間インキュベートし、ＰＢＳで細胞培養プレートを洗浄した。タンパク質溶解液（ＲＩＰＡ、ＰＭＳＦ、ホスファターゼ阻害剤）を８０μＬ／ウェルで加え、細胞溶解を加速するためにウェルの底をスクレーパーで前後に研磨した。細胞破片と溶解液を遠心チューブに移し、１２，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。上清を吸い取って、５×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと４：１の体積比で均一に混合し、１００℃の金属浴で１０分間煮沸した。等量のタンパク質サンプルを１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし、ゲルランニング、メンブレン転写、ブロッキング、抗体インキュベーション、発光同定などの操作を行った。
【0067】
Ｌｙｓ－ＢＫ／ＢＫ及びその変異体が下流シグナルを活性化する活性の測定結果を図１に示しており、リシルブラジキニン（Ｌｙｓ－ＢＫ）は、下流のＥＲＫ１／２とＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することができる。これは当該薬物の作用メカニズムと一
致している。下流のＥＲＫ１／２とＣＲＥＢタンパク質のリン酸化レベルを判定することを通して、サンプルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的活性を定性的に評価した結果、変異体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０５、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０７は既に下流経路を活性化する活性を失っており、変異体ＬＢＫｍ０１、ｍ０２、ｍ０６、ｍ１１、ｍ１２、ｍ１３、ｍ１４、ｍ１５、ｍ１６は全て下流経路を活性化する活性を示した。
致している。下流のＥＲＫ１／２とＣＲＥＢタンパク質のリン酸化レベルを判定することを通して、サンプルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的活性を定性的に評価した結果、変異体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０５、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０７は既に下流経路を活性化する活性を失っており、変異体ＬＢＫｍ０１、ｍ０２、ｍ０６、ｍ１１、ｍ１２、ｍ１３、ｍ１４、ｍ１５、ｍ１６は全て下流経路を活性化する活性を示した。
【0068】
上記２つのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性評価結果から次のことが分かる：リシルブラジキニン／ブラジキニンはＣ末端を切断されると、Ｂ２Ｒに対する親和性と下流経路を活性化する活性を失う；Ｎ末端からリシンを欠失されることは、リシルブラジキニンのＢ２Ｒに対する親和性と下流経路を活性化する活性に影響しない；Ｎ末端から他のアミノ酸を欠失されることで、リシルブラジキニンはＢ２Ｒに対する親和性と下流経路を活性化する活性を失う；最小活性単位はＲＰＰＧＦＳＰＦＲである；Ｎ末端の延長（ｍ１１）又はシステインの導入（ｍ１３）はＢ２Ｒに対する親和性を高めるのに有利である。図１ｄに示すように、ｍ１２群、ｍ１３群、ｍ１４群のＣＲＥＢタンパク質のリン酸化は、ＬＢＫ群に比べて顕著に高く、ｍ１２、１３、１４はＬＢＫに比べて、より優れたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を持ち、より下流経路を活性化できることが明らかになった。
【0069】
実施例４ リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体の作製
リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ修飾は、当該技術分野の公知の方法で行う。特定の変異体を特定のＰＥＧ修飾剤で修飾する場合、工程パラメータの一部に若干の変更があるが、当業者であれば限られた回数の実験によって修飾方法を最適化することができ、技術上問題がない。Ｍ－ＳＰＡ－５Ｋによる野生型ＢＫの修飾を例にして、その作製プロセスは以下の通りである：
リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ修飾は、当該技術分野の公知の方法で行う。特定の変異体を特定のＰＥＧ修飾剤で修飾する場合、工程パラメータの一部に若干の変更があるが、当業者であれば限られた回数の実験によって修飾方法を最適化することができ、技術上問題がない。Ｍ－ＳＰＡ－５Ｋによる野生型ＢＫの修飾を例にして、その作製プロセスは以下の通りである：
【0070】
一、ＰＥＧ複合体サンプルの作製
ペプチドサンプルをリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解し、最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調製した。ペプチドとＭ－ＳＰＡ－５Ｋとの質量比が１：７であるように、ペプチド溶液にＰＥＧを加え、均一になるまでゆっくりと撹拌し、その後２～８℃の条件下で１時間反応させた。
ペプチドサンプルをリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解し、最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調製した。ペプチドとＭ－ＳＰＡ－５Ｋとの質量比が１：７であるように、ペプチド溶液にＰＥＧを加え、均一になるまでゆっくりと撹拌し、その後２～８℃の条件下で１時間反応させた。
【0071】
二、反応混合物の精製
第一段階精製のクロマトグラフィー条件は以下の通りである：
精製用充填剤はＧＥ社のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ミディアムを使用し、精製の移動相はｐＨ７．０～７．５、２０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液であった（０．２Ｍ ＮａＣｌを含む）。
サンプルローディング：反応終了後の上記のペプチド－ＰＥＧ修飾反応混合物を取って、直接にロードした。
溶出：サンプルローディングが終わった後で、クロマトグラフィーカラムを移動相で１．５カラムベッド以上の体積で洗浄し、ＵＶ２１４ｎｍのトレンドに基づいて溶出サンプルを段階的に収集した。
第一段階精製のクロマトグラフィー条件は以下の通りである：
精製用充填剤はＧＥ社のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ミディアムを使用し、精製の移動相はｐＨ７．０～７．５、２０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液であった（０．２Ｍ ＮａＣｌを含む）。
サンプルローディング：反応終了後の上記のペプチド－ＰＥＧ修飾反応混合物を取って、直接にロードした。
溶出：サンプルローディングが終わった後で、クロマトグラフィーカラムを移動相で１．５カラムベッド以上の体積で洗浄し、ＵＶ２１４ｎｍのトレンドに基づいて溶出サンプルを段階的に収集した。
【0072】
第二段階精製のクロマトグラフィー条件は以下の通りである：
Ｃ１８逆相カラム分離精製法により、極性の違いで二つの物質の分離を達成した。この方法で、生成物の精製収率が８０％以上に達するほか、遊離ＰＥＧも完全に除去できる。
Ｃ１８逆相カラム分離精製法により、極性の違いで二つの物質の分離を達成した。この方法で、生成物の精製収率が８０％以上に達するほか、遊離ＰＥＧも完全に除去できる。
【0073】
三、ＰＥＧ複合体サンプルの純度分析
（１）ＨＰＬＣによる純度分析
２０２０年版『中国薬典』の通則０５１２高速液体クロマトグラフィー法を参考に測定を行った。測定クロマトグラフィーのタイプはＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）で、流動相は２０ｍＭ ＰＢ７．０＋１０％ＩＰＡで、クロマトグラフィーカラムはＴＳ
Ｋ Ｇ２０００で、収集条件は２１４ｎｍであった。
ＲＰ純度分析方法：クロマトグラフィーカラムはＰｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ２．１ｘ１５０ｍｍ，１．７μｍであり、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮであった。
純度分析の結果が示すように、作製した一連のリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ修飾体は生成物ピークが均一で、明らかな不純物ピークが見られず、純度が＞９５％であった。
（１）ＨＰＬＣによる純度分析
２０２０年版『中国薬典』の通則０５１２高速液体クロマトグラフィー法を参考に測定を行った。測定クロマトグラフィーのタイプはＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）で、流動相は２０ｍＭ ＰＢ７．０＋１０％ＩＰＡで、クロマトグラフィーカラムはＴＳ
Ｋ Ｇ２０００で、収集条件は２１４ｎｍであった。
ＲＰ純度分析方法：クロマトグラフィーカラムはＰｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ２．１ｘ１５０ｍｍ，１．７μｍであり、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮであった。
純度分析の結果が示すように、作製した一連のリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ修飾体は生成物ピークが均一で、明らかな不純物ピークが見られず、純度が＞９５％であった。
【0074】
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度分析
２０２０年版『中国薬典』の０５４１電気泳動法第五法のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に基づきサンプルの純度測定を行った。１２．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてサンプル測定を行った。
電気泳動の結果が示すように、作製した一連のリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ修飾体はバンドが均一で、不純物バンドが見られず、純度が＞９５％であった。
なお、リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体は、Ｎ末端にしか理論的修飾可能部位がないため、そのＰＥＧ修飾体はすべてＮ末端の単一修飾を有する産物である。
２０２０年版『中国薬典』の０５４１電気泳動法第五法のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に基づきサンプルの純度測定を行った。１２．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてサンプル測定を行った。
電気泳動の結果が示すように、作製した一連のリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ修飾体はバンドが均一で、不純物バンドが見られず、純度が＞９５％であった。
なお、リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体は、Ｎ末端にしか理論的修飾可能部位がないため、そのＰＥＧ修飾体はすべてＮ末端の単一修飾を有する産物である。
【0075】
実施例５ リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価
一、安定性
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体の安定性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系での安定性評価によって、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を間接的に評価した。評価方法は実施例２と同様である。リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体はｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系での残存期間が全て６時間以上であり（表５－１）、その安定性が著しく向上した。同一分子量のＰＥＧの場合、分岐型複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０Ｋの安定性は直鎖型複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０Ｋよりも優れている。
一、安定性
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体の安定性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系での安定性評価によって、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を間接的に評価した。評価方法は実施例２と同様である。リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体はｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系での残存期間が全て６時間以上であり（表５－１）、その安定性が著しく向上した。同一分子量のＰＥＧの場合、分岐型複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０Ｋの安定性は直鎖型複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０Ｋよりも優れている。
【0076】
【表4】
【0077】
二、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体に対して、Ｂ２受容体への親和性及び下流シグナル経路活性化の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。評価方法は実施例３と同様である。リシルブラジキニン及びその変異体は、ＰＥＧで修飾された後もＢ２受容体に対する親和性を有しており（図２ａ、２ｂ）、またＢ２受容体の下流シグナル経路の主要タンパク質のリン酸化を活性化することができる（図３）。異なる構造タイプと異なる分子量のＰＥＧ修飾剤による複合体は、全てＢ２受容体への結合活性をよく保持している。ＰＥＧ修飾剤には、分子量２Ｋから２０Ｋ、直鎖型又は分岐型、及び異なる構造（ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳなど）のＰＥＧ修飾剤が含まれた。評価の結果から分かるように、同じ
分子量では直鎖型ＰＥＧ複合体の方は分岐型ＰＥＧ複合体よりも活性が高い。これは分子量１０Ｋと２０Ｋの２種類のＰＥＧで示されている。図２ａに示すように、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０ＫとＬｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０ＫのＥＣ５０値はそれぞれ９０．８μｇ／ｍｌ、３４６．６μｇ／ｍｌであり、直鎖型ＰＥＧ複合体の活性は分岐型ＰＥＧ複合体の活性より４倍近く高かった。また、同じ構造タイプのＰＥＧでは、分子量２Ｋ、５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋの４種類のＰＥＧの中で、２Ｋと１０ＫのＰＥＧの複合体の方は比較的に活性が高かった。
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体に対して、Ｂ２受容体への親和性及び下流シグナル経路活性化の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。評価方法は実施例３と同様である。リシルブラジキニン及びその変異体は、ＰＥＧで修飾された後もＢ２受容体に対する親和性を有しており（図２ａ、２ｂ）、またＢ２受容体の下流シグナル経路の主要タンパク質のリン酸化を活性化することができる（図３）。異なる構造タイプと異なる分子量のＰＥＧ修飾剤による複合体は、全てＢ２受容体への結合活性をよく保持している。ＰＥＧ修飾剤には、分子量２Ｋから２０Ｋ、直鎖型又は分岐型、及び異なる構造（ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳなど）のＰＥＧ修飾剤が含まれた。評価の結果から分かるように、同じ
分子量では直鎖型ＰＥＧ複合体の方は分岐型ＰＥＧ複合体よりも活性が高い。これは分子量１０Ｋと２０Ｋの２種類のＰＥＧで示されている。図２ａに示すように、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０ＫとＬｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０ＫのＥＣ５０値はそれぞれ９０．８μｇ／ｍｌ、３４６．６μｇ／ｍｌであり、直鎖型ＰＥＧ複合体の活性は分岐型ＰＥＧ複合体の活性より４倍近く高かった。また、同じ構造タイプのＰＥＧでは、分子量２Ｋ、５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋの４種類のＰＥＧの中で、２Ｋと１０ＫのＰＥＧの複合体の方は比較的に活性が高かった。
【0078】
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体による下流シグナル経路の活性化を評価した結果（図５）、ＰＥＧで修飾された後もペプチドはＢ２受容体の下流シグナルであるＥＲＫ１／２和ＣＲＥＢのリン酸化を活性化する活性を保持している。Ｌｙｓ－ＢＫペプチドと比較して、上記の活性（特にＥＲＫ１／２リン酸化を活性化する活性）がある程度下がった。同じＳＰＡ５Ｋ－ＰＥＧ修飾剤で修飾される場合、異なるペプチド変異体の中でＬｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ５Ｋは活性が最も高かった。同じペプチド変異体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１をＰＥＧで修飾するの場合、分子量２Ｋと１０ＫのＰＥＧによる複合体の活性が最も高く、さらに直鎖型ＰＥＧの複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０Ｋの活性は分岐型ＰＥＧの複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０Ｋより高かった。
【0079】
要するに、リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体は安定性が顕著向上したとともに、ＰＥＧと複合された後もＢ２受容体への親和性及び下流シグナル経路活性化の活性をよく保持している。
【0080】
実施例６ ＢＣＡＳマウスモデルにおけるＢＫ－ＰＥＧの薬効作用の比較（ＢＫは野生型ＢＫ、ＰＥＧはＳＰＡ５Ｋ）
マウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ，ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを用いて、静脈注射でＢＫ－ＰＥＧを数回投与し（５ｍｇ／ｋｇ，ＢＫは野生型リシルブラジキニン、ＰＥＧはＳＰＡ５Ｋ）、ＢＫ－ＰＥＧの反復投与による脳小血管虚血損傷に対する保護効果を観察して比較した。
マウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ，ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを用いて、静脈注射でＢＫ－ＰＥＧを数回投与し（５ｍｇ／ｋｇ，ＢＫは野生型リシルブラジキニン、ＰＥＧはＳＰＡ５Ｋ）、ＢＫ－ＰＥＧの反復投与による脳小血管虚血損傷に対する保護効果を観察して比較した。
【0081】
一、群分けと実験設計
両側総頸動脈スプリング狭窄術を行ってマウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ、ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを作製した。
両側総頸動脈スプリング狭窄術を行ってマウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ、ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを作製した。
【0082】
ＢＣＡＳ脳小血管損傷モデルの作製：ＢＣＡＳ脳小血管虚血損傷モデルの作製によって、マウスの前脳を持続的に慢性虚血させた。イソフルランでマウスを麻酔した。まずは、マウスを麻酔器の導入麻酔ボックスに入れ、マウスへ麻酔の導入を行った。その後、マウスを仰向けに固定し呼吸用マスクと接続し、皮膚を剃毛、消毒し、頸部正中部を切開し、両側総頸動脈を分離した。特注のスプリングで（スプリングの材質：輸入品のピアノ線、寸法：線径０．０８ｍｍ、内径０．１８ｍｍ、ピッチ：約０．５ｍｍ、全長：２．５ｍｍ）、両側総頸動脈を狭窄させ血流の大部分を遮断することによって、脳への血液供給を減少させ、脳全体を持続的な慢性虚血の状態にした。頸部の皮膚を縫合し、マウスをケージに戻して飼育した。
【0083】
計３群、即ち偽手術群（ＳＨＡＭ群）、モデル対照群（ＢＣＡＳ群）、薬物候補群（ＢＫ－ＰＥＧ群）を設定した。
【0084】
ＢＣＡＳ術後３日目に群分けと投与を行った。ＢＣＡＳ群とＳＨＡＭ群は週２回で同じ体積の生理食塩水を尾静脈より注射した。ＢＫ－ＰＥＧ群（５ｍｇ／ｋｇ）は週２回で尾
静脈注射より計７週間の投与を行った。
静脈注射より計７週間の投与を行った。
【0085】
術後１３日目、２６日目に、ロータロッド・テスト（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）を行ってマウスの協調運動機能を評価した。マウスをマウス用ロータロッド（直径３０ｍｍ×長さ６０ｍｍ）の上に回転方向と反対の方向に乗せた。ロッドを回転させ、２０ｒｐｍ／ｍｉｎから４０ｒｐｍ／ｍｉｎに一様に加速し、その後は速度を維持した。マウスがロータロッド上に滞在する時間（即ち、マウスがロッドから落下するまでの時間）を指標として記録した。各マウスは、２０～３０分の間隔で３～５回のテストを行った。記録値の平均値をマウスの落下するまでの時間とし、落下するまでの時間が長いほど協調運動機能が高いことを示す。
【0086】
術後２０日目、２８日目に、ワイヤー・ハング・テストを行ってマウスの前肢筋肉強度の損傷状況を評価した。マウスの前肢をワイヤー（直径１．５ｍｍ×長さ６０ｃｍ）に吊り下げ、マウスがワイヤーに吊り下げる時間（即ち、マウスがワイヤーから落下するまでの時間）を指標として記録した。各マウスは、２０～３０分の間隔で３～５回のテストを行った。記録値の平均値をマウスの落下するまでの時間とし、落下するまでの時間が長いほど筋肉の損傷が少ないことを示す。
【0087】
術後２９日目、４４日目に、Ｙ字型迷路テスト（Ｙ Ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を行ってマウスのワーキング・メモリーの損傷状況を評価した。Ｙ字型迷路は、３本の同じのアームが１２０°の角度で接続されたＹ字型のテスト装置であり、各アームの長さが３０ｃｍで、幅が８ｃｍで、高さが１５ｃｍである。これはげっ歯類動物の新しい環境に対する探索本能を利用した学習や記憶などを評価する実験的研究装置である。マウスをＹ字型迷路に置き、自由に行動させ、７分間にわたってマウスが各アームに進入（４本の足がすべてアームに進入すること）した順を記録する。各アームに進入した総回数をアーム進入回数と定義し、連続して異なるアームに進入した回数を交替行動回数と定義し、交替スコアをＹ字型迷路テストの評価指標とした。
交替スコア＝［交替行動回数／（アーム進入回数－２）］＊１００
試験中にアームに進入した回数が８回未満の動物を除外した（そのデータは精確に変化を反映できないため）。交替スコアが高いほどワーキング・メモリの損傷が少ないことを示す。
交替スコア＝［交替行動回数／（アーム進入回数－２）］＊１００
試験中にアームに進入した回数が８回未満の動物を除外した（そのデータは精確に変化を反映できないため）。交替スコアが高いほどワーキング・メモリの損傷が少ないことを示す。
【0088】
術後４８日目に、モリス水迷路テスト（Ｍｏｒｒｉｓ ｍａｚｅ）を行ってマウスの空間学習・記憶の損傷状況を評価した。計５回のテストを行った。モリス水迷路の水温を２３±２℃に維持し、水に入る４つの位置を示すようにプールの壁に「東」「南」「西」「北」と書いてある。プールを４等分して、４つの象限（Ｅ、Ｓ、Ｗ、Ｎ）とする。水迷路の上部にディスプレイシステム付きのビデオカメラを設置し、マウスの行動軌跡を同期して記録する。マウスにプラットフォームの位置を特定させるために、訓練期間中、水迷路の外の参照物を変えないようにする。プラットフォームへの到達潜時（マウスが水に入ってからプラットフォームに到達するまでの時間）を測定指標として、プラットフォームへの到達潜時が短いほど空間学習・記憶の損傷が少ないことを示す。
【0089】
術後５７日目に、糖水嗜好性テスト（ＳＰＴ）を行ってマウスの抑うつ行為を評価した。糖水嗜好性は快感が消失したかどうかを反映する評価指標であり、無快感とは奨励からの刺激に興味がなくなることであり、無快感症状は感情障害（抑うつ病を含む）の現われとされる。１％糖水と飲用水の摂取状況によって、マウスの抑うつ状況を判定し、糖水の摂取量が糖水と飲用水との総量に占める割合をマウスの抑うつの指標とし、糖水嗜好スコアが高いほど抑うつの程度が低いことを示す。
【0090】
二、結果
ＢＣＡＳ群とＳＨＡＭ群との比較では、両群の間にロータロッド・テスト、ワイヤ・ハング・テスト、Ｙ字型迷路テスト、モリス水迷路テスト、糖水嗜好性テストの結果において統計学的に顕著な差が認められた。これはＢＣＡＳモデルの作製によって動物の運動協調性、前肢筋肉強度、ワーキング・メモリー及び空間学習・記憶が損傷され、抑うつ行為が誘発されたことを示した。投与群とＢＣＡＳモデル群との比較では、ＢＫ－ＰＥＧ群は上記の各試験において全て統計学的に顕著な改善が認められた。このことから、この薬物はＢＣＡＳモデル作製による動物の運動協調性、前肢筋肉強度、ワーキング・メモリー及び空間学習・記憶の障害を顕著に改善し、ＢＣＡＳモデル作製による抑うつ行為を軽減することができる。ＢＣＡＳモデルは血管性認知障害および脳小血管病の研究においてよく受け入れられている実験動物モデルである。したがって、試験薬は血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病の治療に使用できる。詳しい結果を図４～１１、表６－１～６－５にまとめた。
ＢＣＡＳ群とＳＨＡＭ群との比較では、両群の間にロータロッド・テスト、ワイヤ・ハング・テスト、Ｙ字型迷路テスト、モリス水迷路テスト、糖水嗜好性テストの結果において統計学的に顕著な差が認められた。これはＢＣＡＳモデルの作製によって動物の運動協調性、前肢筋肉強度、ワーキング・メモリー及び空間学習・記憶が損傷され、抑うつ行為が誘発されたことを示した。投与群とＢＣＡＳモデル群との比較では、ＢＫ－ＰＥＧ群は上記の各試験において全て統計学的に顕著な改善が認められた。このことから、この薬物はＢＣＡＳモデル作製による動物の運動協調性、前肢筋肉強度、ワーキング・メモリー及び空間学習・記憶の障害を顕著に改善し、ＢＣＡＳモデル作製による抑うつ行為を軽減することができる。ＢＣＡＳモデルは血管性認知障害および脳小血管病の研究においてよく受け入れられている実験動物モデルである。したがって、試験薬は血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病の治療に使用できる。詳しい結果を図４～１１、表６－１～６－５にまとめた。
【0091】
【表5】
【0092】
【表6】
【0093】
【表7】
【0094】
【表8】
【0095】
【表9】
【0096】
実施例７ ＢＣＡＳマウスモデルにおけるＢＫ－ＰＥＧの薬効作用の比較（ＢＫはｍ１１、ＰＥＧはＳＰＡ５Ｋ）
マウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ，ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを用いて、静脈注射でＢＫ－ＰＥＧを数回投与し（５ｍｇ／ｋｇ，ＢＫはｍ１１、ＰＥＧはＳＰＡ５Ｋ）、ＢＫ－ＰＥＧの反復投与による脳小血管虚血損傷に対する保護効果を観察して比較した。
マウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ，ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを用いて、静脈注射でＢＫ－ＰＥＧを数回投与し（５ｍｇ／ｋｇ，ＢＫはｍ１１、ＰＥＧはＳＰＡ５Ｋ）、ＢＫ－ＰＥＧの反復投与による脳小血管虚血損傷に対する保護効果を観察して比較した。
【0097】
一、群分けと実験設計
両側総頸動脈スプリング狭窄術を行ってマウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ、ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを作製した。ＢＣＡＳ脳小血管損傷モデルの作製方法は実施例６と同じである。
両側総頸動脈スプリング狭窄術を行ってマウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ、ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを作製した。ＢＣＡＳ脳小血管損傷モデルの作製方法は実施例６と同じである。
【0098】
計２群、即ちモデル群（ＢＣＡＳ群）、ＢＫ－ＰＥＧ（５ｍｇ／ｋｇ）群を設定した。
ＢＣＡＳ術後７日目に群分けと投与を行った。モデル群（ＢＣＡＳ群）は週２回で同じ体積の生理食塩水を尾静脈より注射した。ＢＫ－ＰＥＧ群は週２回で尾静脈注射より計６週間の投与を行った。
投与後６週目に、ロータロッド・テスト（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）を行ってマウスの協調運動機能を評価した。投与終了１週間後に、モリス水迷路テスト（Ｍｏｒｒｉｓ ｍａｚｅ）を行ってマウスの空間学習・記憶の損傷状況を評価した。
ＢＣＡＳ術後７日目に群分けと投与を行った。モデル群（ＢＣＡＳ群）は週２回で同じ体積の生理食塩水を尾静脈より注射した。ＢＫ－ＰＥＧ群は週２回で尾静脈注射より計６週間の投与を行った。
投与後６週目に、ロータロッド・テスト（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）を行ってマウスの協調運動機能を評価した。投与終了１週間後に、モリス水迷路テスト（Ｍｏｒｒｉｓ ｍａｚｅ）を行ってマウスの空間学習・記憶の損傷状況を評価した。
【0099】
二、結果
ＢＫ－ＰＥＧ群はモデル群（ＢＣＡＳ群）と比較して、ロータロッド・テストの結果において改善の傾向を示し、モリス水迷路テストの結果において統計学的に顕著な差が認められた。これは、この薬物がＢＣＡＳモデル作製による動物の運動協調性と、空間学習・記憶の障害を改善できることを示した。ＢＣＡＳモデルは血管性認知障害および脳小血管病の研究においてよく受け入れられている実験動物モデルである。したがって、試験薬は血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病の治療に使用できると考えられる。詳しい結果を表１０－１１にまとめた。
ＢＫ－ＰＥＧ群はモデル群（ＢＣＡＳ群）と比較して、ロータロッド・テストの結果において改善の傾向を示し、モリス水迷路テストの結果において統計学的に顕著な差が認められた。これは、この薬物がＢＣＡＳモデル作製による動物の運動協調性と、空間学習・記憶の障害を改善できることを示した。ＢＣＡＳモデルは血管性認知障害および脳小血管病の研究においてよく受け入れられている実験動物モデルである。したがって、試験薬は血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病の治療に使用できると考えられる。詳しい結果を表１０－１１にまとめた。
【0100】
【表10】
【0101】
【表11】
【0102】
実施例８ ＢＣＡＳマウスモデルにおけるＢＫ－ＰＥＧの薬効作用の比較（ＢＫはｍ１３、ＰＥＧはＳＰＡ２Ｋ）
マウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ，ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを用いて、皮下注射でＢＫ－ＰＥＧを数回投与し（１５ｍｇ／ｋｇ，ＢＫはｍ１３、ＰＥＧはＳＰＡ２Ｋ）、ＢＫ－ＰＥＧの反復投与による脳小血管虚血損傷に対する保護効果を観察して比較した。
マウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ，ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを用いて、皮下注射でＢＫ－ＰＥＧを数回投与し（１５ｍｇ／ｋｇ，ＢＫはｍ１３、ＰＥＧはＳＰＡ２Ｋ）、ＢＫ－ＰＥＧの反復投与による脳小血管虚血損傷に対する保護効果を観察して比較した。
【0103】
一、群分けと実験設計
両側総頸動脈スプリング狭窄術を行ってマウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ、ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを作製した。ＢＣＡＳ脳小血管損傷モデルの作製方法は実施例６と同じである。
両側総頸動脈スプリング狭窄術を行ってマウスの両側総頸動脈狭窄（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ、ＢＣＡＳ）脳小血管虚血損傷モデルを作製した。ＢＣＡＳ脳小血管損傷モデルの作製方法は実施例６と同じである。
【0104】
計２群、即ちモデル群（ＢＣＡＳ群）、ＢＫ－ＰＥＧ（１５ｍｇ／ｋｇ）群を設定した。
ＢＣＡＳ術後７日目に群分けと投与を行った。モデル群（ＢＣＡＳ群）は週２回で同じ体積の生理食塩水を皮下注射より注射した。ＢＫ－ＰＥＧ群は週２回で皮下注射より計８週間の投与を行った。
投与後８週目に、ロータロッド・テスト（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）を行ってマウスの協調運動機能を評価した。投与終了１週間後に、モリス水迷路テスト（Ｍｏｒｒｉｓ ｍａｚｅ）を行ってマウスの空間学習・記憶の損傷状況を評価した。
ＢＣＡＳ術後７日目に群分けと投与を行った。モデル群（ＢＣＡＳ群）は週２回で同じ体積の生理食塩水を皮下注射より注射した。ＢＫ－ＰＥＧ群は週２回で皮下注射より計８週間の投与を行った。
投与後８週目に、ロータロッド・テスト（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）を行ってマウスの協調運動機能を評価した。投与終了１週間後に、モリス水迷路テスト（Ｍｏｒｒｉｓ ｍａｚｅ）を行ってマウスの空間学習・記憶の損傷状況を評価した。
【0105】
二、結果
ＢＫ－ＰＥＧ群はモデル群（ＢＣＡＳ群）と比較して、ロータロッド・テストの結果において改善の傾向を示し、モリス水迷路テストの結果において統計学的に顕著な差が認められた。これは、この薬物がＢＣＡＳモデル作製による動物の運動協調性と、空間学習・記憶の障害を改善できることを示した。ＢＣＡＳモデルは血管性認知障害および脳小血管病の研究においてよく受け入れられている実験動物モデルである。したがって、試験薬は血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病の治療に使用できると考えられる。詳しい結果を表１２－１３にまとめた。
ＢＫ－ＰＥＧ群はモデル群（ＢＣＡＳ群）と比較して、ロータロッド・テストの結果において改善の傾向を示し、モリス水迷路テストの結果において統計学的に顕著な差が認められた。これは、この薬物がＢＣＡＳモデル作製による動物の運動協調性と、空間学習・記憶の障害を改善できることを示した。ＢＣＡＳモデルは血管性認知障害および脳小血管病の研究においてよく受け入れられている実験動物モデルである。したがって、試験薬は血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病の治療に使用できると考えられる。詳しい結果を表１２－１３にまとめた。
【0106】
【表12】
【0107】
【表13】
【0108】
実施例６～８では、血管性認知機能障害、脳小血管病の研究においてよく受け入れられているＢＣＡＳモデルという実験動物モデルを使用した。実施例で用いられた試験薬はブラジキニン受容体への親和性および下流のシグナル経路活性化の活性をよく保持しているブラジキニンであり、ＢＣＡＳモデルマウスに投与された後は、動物の損傷した協調運動機能、前肢の損傷した筋肉強度、ワーキング・メモリー、空間学習・記憶機能および抑うつ行為の改善が認められた。
【0109】
実施例６～８の試験薬以外に、ブラジキニン受容体への親和性および下流シグナル経路活性化の活性をよく保持する他のブラジキニン誘導体（例えば、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１、ｍ０２、ｍ０６、ｍ１２、ｍ１４、他の適切なＰＥＧ複合体）をＢＣＡＳモデルマウスに投与した場合、同様の効果が観察された。すなわち、ＢＣＡＳモデルマウスの損傷した協調運動機能、前肢の損傷した筋肉強度、ワーキング・メモリー、空間学習・記憶機能および抑うつ行為の改善を認められた。それとは逆に、ブラジキニン受容体への親和性および下流シグナル経路活性化の活性を比較的に多く失ったブラジキニン誘導体（例えば、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０５、ｍ０７などのＰＥＧ複合体）を投与した場合は、いずれも同様の効果が観察されなかった。
【0110】
要するに、受容体への親和性および下流シグナル経路活性化の活性をよく保持するブラジキニン誘導体は、すべて血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、脳小血管病の治療に用いることができる。
【0111】
なお、ペプチド薬物は一般に生体内での安定性が悪く、半減期が短いという問題がある。リシルブラジキニンとブラジキニンは通常のペプチドよりさらに不安定で、半減期は数秒程度であり、外因的に投与されたキニンは生体内でキニナーゼにより速くも加水分解されて失活してしまいから、ドラッガビリティがない。したがって、長時間作用型のリシルブラジキニンとブラジキニンのみがドラッガビリティを有する。実施例において例示された長時間作用化方法はすべてＰＥＧによる複合化であるが、リシルブラジキニン及びブラジキニンを長時間作用型にすることは本発明において解決しようとする主要な課題ではなく、具体的な実施例で用いたＰＥＧ複合化技術は例示を目的とするものであり、本発明の長時間作用化方法を限定するものではない。当業者は、受容体への親和性と下流のシグナル経路活性化の活性をよく保持するリシルブラジキニン／ブラジキニンの誘導体が、ほか
の方法で長時間作用されても、ＢＣＡＳモデルマウスの損傷した機能を改善し、血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、および脳小血管病の治療に使用され得ると予想できる。
の方法で長時間作用されても、ＢＣＡＳモデルマウスの損傷した機能を改善し、血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、および脳小血管病の治療に使用され得ると予想できる。
【0112】
さらに、実施例は、リシルブラジキニン又はブラジキニン及び種々の変異体のＰＥＧ修飾体の安定性、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬効を例証しており、全て良好な安定性を示し、またｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を保持するリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体がＰＥＧで修飾された後は全てリシルブラジキニン又はブラジキニンの半減期が延長され、同時にそのｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性を発揮することができる。一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を保持していない他のリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体はＰＥＧで修飾された後、又はこれらのリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体自体（ＰＥＧで修飾されていない）は、全てｉｎ ｖｉｖｏ薬効を示さなかった。従って当業者は、実施例で例示した特定のリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体に限定されることなく、受容体に対する結合活性を保持している他のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であれば、長時間作用化された後は、全てリシルブラジキニン又はブラジキニンの半減期が延長され、同時にｉｎ ｖｉｖｏにおける生物活性の発揮することができ、またＢＣＡＳモデルマウスの損傷した機能を改善し、血管性認知機能障害、脳卒中後認知機能障害、および脳小血管病の治療に使用され得ると合理的に予想することができる。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図2a】
【図2b】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血管性認知機能障害を治療または改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用。
【請求項2】
血管性認知機能障害を治療または改善するための薬物組成物であって、キニン又はその誘導体を含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項3】
脳卒中後認知機能障害を治療または改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用。
【請求項4】
脳卒中後認知機能障害を治療または改善するための薬物組成物であって、キニン又はその誘導体を含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項5】
血管病変を伴うアルツハイマー病を治療または改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用。
【請求項6】
血管病変を伴うアルツハイマー病を治療または改善するための薬物組成物であって、キニン又はその誘導体を含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項7】
脳小血管病を治療または改善する薬物の製造におけるキニン又はその誘導体の使用。
【請求項8】
脳小血管病を治療または改善するための薬物組成物であって、キニン又はその誘導体を含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項9】
前記キニンは、ブラジキニン又はリシルブラジキニンであることを特徴とする、請求項１、３、５、又は７に記載の使用。
【請求項10】
前記キニンは、ブラジキニン又はリシルブラジキニンであることを特徴とする、請求項２、４、６、又は８に記載の薬物組成物。
【請求項11】
前記キニン誘導体は、長時間作用型のキニンであることを特徴とする、請求項１、３、５、又は７に記載の使用。
【請求項12】
前記キニン誘導体は、長時間作用型のキニンであることを特徴とする、請求項２、４、６、又は８に記載の薬物組成物。
【請求項13】
前記キニン誘導体は、キニンのポリエチレングリコール修飾体であり、用いたＰＥＧ修飾剤がＳＰＡ、ＳＣＭ、又はＳＳの修飾剤で、直鎖型又は分岐型のＰＥＧ修飾剤であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項14】
前記キニン誘導体は、キニンのポリエチレングリコール修飾体であり、
用いたＰＥＧ修飾剤がＳＰＡ、ＳＣＭ、又はＳＳの修飾剤で、直鎖型又は分岐型のＰＥＧ修飾剤であることを特徴とする、請求項１２に記載の薬物組成物。
【請求項15】
前記キニン誘導体は、キニンの突然変異体であり、リシルブラジキニン又はブラジキニンのアミノ酸配列中の任意の位置にシステインを導入し、
及び／又はリシルブラジキニンのＮ末端の１位と２位のアミノ酸残基との間に任意のアミノ酸を挿入し、
及び／又はブラジキニンのＮ末端の１位のアミノ酸残基の前に任意のアミノ酸を挿入し、
及び／又は２個あるいは２個以上のリシルブラジキニン単体を、又は２個あるいは２個以上のブラジキニン単体を、又はリシルブラジキニン単体とブラジキニン単体を繋ぎ合わせ、
及び／又はリシルブラジキニンの６位のＰｈｅ又はブラジキニンの５位のＰｈｅを他のアミノ酸に突然変異したことを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項16】
前記キニン誘導体は、キニンの突然変異体であり、
リシルブラジキニン又はブラジキニンのアミノ酸配列中の任意の位置にシステインを導入し、
及び／又はリシルブラジキニンのＮ末端の１位と２位のアミノ酸残基との間に任意のアミノ酸を挿入し、
及び／又はブラジキニンのＮ末端の１位のアミノ酸残基の前に任意のアミノ酸を挿入し、
及び／又は２個あるいは２個以上のリシルブラジキニン単体を、又は２個あるいは２個以上のブラジキニン単体を、又はリシルブラジキニン単体とブラジキニン単体を繋ぎ合わせ、
及び／又はリシルブラジキニンの６位のＰｈｅ又はブラジキニンの５位のＰｈｅを他のアミノ酸に突然変異したことを特徴とする、請求項１２に記載の薬物組成物。
【請求項17】
前記キニン誘導体は、融合タンパク質であり、キニンとＦｃ断片と融合するか、又はキニンとヒト血清アルブミンと融合することを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項18】
前記キニン誘導体は、融合タンパク質であり、キニンとＦｃ断片と融合するか、又はキニンとヒト血清アルブミンと融合することを特徴とする、請求項１２に記載の薬物組成物。
【請求項19】
前記キニン誘導体は、脂肪酸付加のキニン、又は長時間作用型製剤のキニンであることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項20】
前記キニン誘導体は、脂肪酸付加のキニン、又は長時間作用型製剤のキニンであることを特徴とする、請求項１２に記載の薬物組成物。
【国際調査報告】