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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-30
(54)【発明の名称】ＨＥＲＶ由来エピトープを同定するための新規方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20250123BHJP
C07K 14/15 20060101ALI20250123BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20250123BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250123BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250123BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20250123BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250123BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250123BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250123BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250123BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250123BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20250123BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
C07K14/15
C12N15/113 102Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
A61K39/12
A61K48/00
A61K35/17
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/04
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024565251
(86)(22)【出願日】2023-01-25
(85)【翻訳文提出日】2024-09-24
(86)【国際出願番号】 EP2023051839
(87)【国際公開番号】W WO2023144231
(87)【国際公開日】2023-08-03
(31)【優先権主張番号】22305079.0
(32)【優先日】2022-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524279238
【氏名又は名称】イーアールブイイミューン
(71)【出願人】
【識別番号】521141383
【氏名又は名称】セントレ レオン－ベラード
(71)【出願人】
【識別番号】521141372
【氏名又は名称】ウニベルシテ クラウデ バーナード リオン １
(71)【出願人】
【識別番号】516086358
【氏名又は名称】サントル ナショナル デ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(71)【出願人】
【識別番号】505347628
【氏名又は名称】インスティテュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ ルシェルシェ メディカル （インサーム）
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100227329
【弁理士】
【氏名又は名称】延原 愛
(72)【発明者】
【氏名】デピル，ステファン
(72)【発明者】
【氏名】アルカザー，ヴィンセント
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ79
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS33
4B063QS34
4B063QS40
4B063QX02
4B063QX10
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA45
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA03
4C085AA06
4C085BA65
4C085BB11
4C085CC32
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA15
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045EA34
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、癌に関連するＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープを同定するための方法、および本方法により同定されたエピトープを含むかまたはそのエピトープからなるペプチド、本ペプチドをコードする発現ベクター、本ペプチドまたは本ベクターで治療される対象の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および本ペプチドを認識するＴ細胞受容体を発現する改変されたＴ細胞に関する。本発明はまた、ペプチド、発現ベクター、ＣＴＬ、または改変されたＴ細胞のワクチンもしくは医薬品としての使用、特に、それを必要とする対象における癌の予防または治療における使用のためのペプチド、発現ベクター、ＣＴＬ、または改変されたＴ細胞の使用に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの癌に関連するヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）由来Ｔ細胞エピトープを同定するための方法であって、次のステップ：（ａ）少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップ、および
（ｂ）前のステップで同定された前記ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
次のステップ：
（ｉ）前記ステップ（ａ）で同定された前記癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、前記ステップ（ａ）と前記ステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）腫瘍サンプル中の前記ステップ（ｂ）で同定された前記ＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、前記ステップ（ｂ）の後である、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つをさらに含み、
好ましくは前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｉ）および（ｉｉ）が、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのステップである、または前記ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｉ）が、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのステップでありかつ前記ステップ（ｉｉ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏのステップである、
方法。
【請求項2】
前記ステップ（ａ）が、腫瘍サンプル中のおよび正常サンプル中のＨＥＲＶ発現を比較するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ステップ（ｂ）が、前のステップで同定された前記ＨＥＲＶの配列をＨＥＲＶタンパク質と整列させるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ステップ（ｂ）が、ＭＨＣクラスＩ分子への、ＨＥＲＶタンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のまたはそれを超える同一性を共有する配列の結合を予測するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ステップ（ｉ）における前記癌関連ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性が、各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞シグネチャの関連性、各ＨＥＲＶとインターフェロン（ＩＦＮ）－γシグネチャまたは細胞溶解活性のいずれかである機能シグネチャの関連性、および正常な精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞中の各ＨＥＲＶの発現の不在により評価され、好ましくは前記関連性が、機械学習ベースのアプローチにより評価される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ステップ（ｂ）の後でまたは前記ステップ（ｉｉ）の前に、前記ステップ（ａ）で同定された前記癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ステップ（ｂ）の後でまたは前記ステップ（ｉｉ）の後で、前記ＨＥＲＶ由来のＴ細胞エピトープをヒトプロテオームと整列させるステップをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法により同定されたエピトープを含むまたはそのエピトープからなるペプチド。
【請求項9】
ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）およびＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むまたはこれらからなる群において選択される配列を有するエピトープを含むまたはそのエピトープからなるペプチド。
【請求項10】
請求項８または請求項９に記載の１つ以上のペプチド（複数可）の発現を誘導する発現ベクター。
【請求項11】
請求項８もしくは請求項９に記載の１つ以上のペプチド（複数可）、または請求項１０に記載の１つ以上の発現ベクター（複数可）で治療される対象の細胞傷害性Ｔリンパ球。
【請求項12】
請求項８または請求項９に記載のペプチドを認識するＴ細胞受容体を発現する改変されたＴ細胞。
【請求項13】
ワクチンまたは医薬品としての使用のための請求項８または請求項９に記載の１つ以上のペプチド（複数可）、請求項１０に記載の１つ以上の発現ベクター（複数可）、請求項１１に記載の１つ以上の細胞傷害性Ｔリンパ球（複数可）、または請求項１２に記載の１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）。
【請求項14】
それを必要とする対象において癌を予防するまたは治療することにおける使用のための請求項８または請求項９に記載の１つ以上のペプチド（複数可）、請求項１０に記載の１つ以上の発現ベクター（複数可）、請求項１１に記載の１つ以上の細胞傷害性Ｔリンパ球（複数可）、または請求項１２に記載の１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）。
【請求項15】
前記癌が、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、奇形癌、膀胱癌、非小細胞肺癌および小細胞肺癌を含む肺癌、頭頸部癌、大腸癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、ならびに他の固形腫瘍および血液悪性腫瘍を含むまたはそれらからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための前記１つ以上のペプチド（複数可）、前記１つ以上の発現ベクター（複数可）、前記１つ以上の細胞傷害性Ｔリンパ球（複数可）または前記１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌に関連するＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープを同定するための方法、および本方法により同定されたエピトープを含むかまたはそのエピトープからなるペプチド、本ペプチドをコードする発現ベクター、本ペプチドまたは本ベクターで治療される対象の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および本ペプチドを認識するＴ細胞受容体を発現する改変されたＴ細胞に関する。本発明はまた、ワクチンまたは医薬品としての上記ペプチド、発現ベクター、ＣＴＬ、または改変されたＴ細胞の使用、特に、それを必要とする対象における癌の予防または治療のための上記ペプチド、発現ベクター、ＣＴＬ、または改変されたＴ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
癌における適応型Ｔ細胞免疫応答は、腫瘍細胞により特異的に発現される腫瘍エピトープの認識に依存する。腫瘍ゲノムに特異的な非同義変異により生成されるネオ抗原の役割は、過去１０年間に広範に研究されており、個別化された癌ワクチン中のネオ抗原の組み合わせを試験する多くの臨床試験が開始され、有望な予備的結果が得られている。しかし、各患者にとって最適なネオエピトープの組み合わせを決定することは、依然として困難である。さらに、多くの腫瘍は、腫瘍変異負荷が低いか中程度であることを特徴とする。したがって、スプライスバリアント、融合タンパク質、または内因性レトロエレメントに由来し、おそらく異なる癌サブタイプ間で共有されるものなどの、腫瘍抗原の他のファミリーを明らかにすることは、固形腫瘍の容易に利用できる治療法の開発にとって極めて重要である。
【0003】
ヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）は、ヒトゲノムの８％に相当する。ほとんどのＨＥＲＶ遺伝子は、ＤＮＡ組換え、突然変異、および欠失により非機能的であるが、いくつかは、群特異的抗原（Ｇａｇ）、逆転写酵素によるポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、およびエンベロープ（Ｅｎｖ）表面ユニットを含む機能性タンパク質を生成する。ほとんどのＨＥＲＶは、正常細胞中のエピジェネティック機構によりサイレンシングを受ける。しかし、ＨＥＲＶは、挿入変異誘発、染色体異常、またはＬＴＲ誘発性癌遺伝子活性化におけるそれらの関与により、発癌の病原体である可能性があると報告された。したがって、ＨＥＲＶは、共通の腫瘍抗原の興味深い供給源であり得る。
【0004】
先行技術の中で、国際公開第２０２０／０４９１６９号は、ＨＥＲＶに由来しかつ特定のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発できるエピトープの同定を可能にする方法を記載する。しかし、この特許出願で開発された方法は、１つの癌種、すなわち限られた数のＨＥＲＶを有する、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）に適用された。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するのに効率的でありかつ複数の癌サブタイプ間で共通のＨＥＲＶ由来の抗原を同定できる、新しいアプローチを開発する必要性が残っている。
【0005】
本出願において、発明者らは、このニーズに対応する新しいアプローチを開発した。特に、本発明者らは、多数のＨＥＲＶ候補の中で、効率的であり複数の癌サブタイプにより共有される、限られた数のエピトープを決定できる選択ステップに依存する方法を開発した。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、少なくとも１つの癌に関連するヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）由来Ｔ細胞エピトープを同定するための方法に関し、本方法は、次の：
（ａ）．少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後に行われる、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
（ａ）．少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後に行われる、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
【0007】
一実施形態では、ステップ（ａ）および（ｂ）ならびにステップ（ｉ）および／または（ｉｉ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのステップである。一実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのステップである。
【0008】
本発明は、癌に関連するヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）由来Ｔ細胞エピトープを同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法に関し、本方法は、次の：
（ａ）癌に関連するＨＥＲＶを同定し選択するステップと、
（ｂ）前のステップで同定されたＨＥＲＶ間で共通のＴ細胞エピトープを選択するステップ
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後に行われる、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
（ａ）癌に関連するＨＥＲＶを同定し選択するステップと、
（ｂ）前のステップで同定されたＨＥＲＶ間で共通のＴ細胞エピトープを選択するステップ
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後に行われる、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
【0009】
本発明は、癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）由来Ｔ細胞エピトープを同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法に関し、本方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後に行われる、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後に行われる、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
【0010】
一実施形態では、ステップ（ａ）は、腫瘍および正常サンプル中のＨＥＲＶ発現を比較するステップを含む。
【0011】
一実施形態では、ステップ（ｂ）は、前のステップで同定されたＨＥＲＶの配列をＨＥＲＶタンパク質と整列させるステップを含む。
【0012】
一実施形態では、ステップ（ｂ）は、ＭＨＣクラスＩ分子へのＨＥＲＶタンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれを超える同一性を共有する配列の結合を予測するステップをさらに含む。
【0013】
一実施形態では、ステップ（ｉ）における癌関連ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞シグネチャの関連性、各ＨＥＲＶとインターフェロン（ＩＦＮ）－γシグネチャまたは細胞溶解活性のいずれかである機能シグネチャの関連性、および正常な精製Ｔ細胞またはＮＫ細胞中の各ＨＥＲＶの発現の不在により評価され、好ましくはこの関連性は、機械学習ベースのアプローチにより評価される。
【0014】
一実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）の後でまたはステップ（ｉｉ）の前に、ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップをさらに含む。
【0015】
一実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）の後またはステップ（ｉｉ）の後で、ＨＥＲＶ由来のＴ細胞エピトープをヒトプロテオームと整列させるステップをさらに含む。
【0016】
本発明はまた、前述の方法により同定されたエピトープを含むかまたはそのエピトープからなるペプチドに関する。
【0017】
本発明はまた、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）およびＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはこれらからなる群において選択される配列を有するエピトープを含むかまたはそのエピトープからなるペプチドに関する。本発明はまた、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）およびＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはこれらからなる群において選択される配列を含むかまたはその配列からなるペプチドに関する。
【0018】
本発明はまた、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）およびＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはこれらからなる群において選択される配列を有するエピトープを含むかまたはそのエピトープからなるペプチドに関する。本発明はまた、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）およびＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはこれらからなる群において選択される配列を含むかまたはその配列からなるペプチドに関する。
【0019】
本発明はまた、上記のような１つ以上のペプチド（複数可）の発現を誘導する発現ベクターに関する。
【0020】
本発明はまた、上述の１つ以上のペプチド（複数可）、または１つ以上の発現ベクター（複数可）で治療される対象の細胞傷害性Ｔリンパ球に関する。
【0021】
本発明はまた、上記のようなペプチドを認識するＴ細胞受容体を発現する改変されたＴ細胞に関する。
【0022】
本発明はまた、ワクチンまたは医薬品としての使用のための、上述の１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上の細胞傷害性Ｔリンパ球（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）に関する。
【0023】
本発明はまた、それを必要とする対象において癌を予防するまたは治療することにおける使用のための、上述の１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上の細胞傷害性Ｔリンパ球（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）に関する。
【0024】
一実施形態では、上記の癌は、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、奇形癌、膀胱癌、非小細胞肺癌および小細胞肺癌を含む肺癌、頭頸部癌、大腸癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、ならびに他の固形腫瘍および血液悪性腫瘍を含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【0025】
定義
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する：
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する：
【0026】
「エピトープ」は、免疫応答を刺激できる、抗原の部分を指す。
【0027】
「ヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）」：感染能力を失ったが転座能力を保持した、生殖細胞系列に組み込まれたレトロウイルスを指す。
【0028】
「ペプチド」は、ペプチド結合により互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸のアミノ酸の線状ポリマーを指す。ペプチド中のアミノ酸残基は、次のように略記される：フェニルアラニンは、ＰｈｅまたはＦ、ロイシンは、ＬｅｕまたはＬ、イソロイシンは、ＩｌｅまたはＩ、メチオニンは、ＭｅｔまたはＭ、バリンは、ＶａｌまたはＶ、セリンは、ＳｅｒまたはＳ、プロリンは、ＰｒｏまたはＰ、スレオニンは、ＴｈｒまたはＴ、アラニンは、ＡｌａまたはＡ、チロシンは、ＴｙｒまたはＹ、ヒスチジンは、ＨｉｓまたはＨ、グルタミンは、ＧｌｎまたはＱ、アスパラギンは、ＡｓｎまたはＮ、リジンは、ＬｙｓまたはＫ、アスパラギン酸は、ＡｓｐまたはＤ、グルタミン酸は、ＧＩｕまたはＥ、システインは、ＣｙｓまたはＣ、トリプトファンは、ＴｒｐまたはＷ、アルギニンは、ＡｒｇまたはＲ、グリシンは、ＧｌｙまたはＧである。
【0029】
「予防する」、「予防すること」および「予防」は、予防的手段および防止的手段を指し、その目的は、対象が所与の期間にわたり病的状態または障害を発症する可能性を低下させることである。そのような低下は、例えば、対象における病的状態または障害の少なくとも１つの症状の発症の遅延に反映され得る。
【0030】
「防御免疫応答」は、感染性因子または腫瘍抗原に由来する抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／またはヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）の応答を指し、これは、疾患の症状もしくは進行を予防するか、または少なくとも部分的に阻止する。免疫応答はまた、ヘルパーＴ細胞の刺激により促進された抗体応答も含み得る。
【0031】
「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、温血動物、より好ましくはヒトであり得、対象は、医療を受けるのを待機している、もしくは医療を受けているか、または医療処置の目的物であった、もしくは目的物である、目的物となるであろう、または疾患の発症について監視される。ここでの用語「哺乳動物」は、ヒト、家畜、および動物園の、競技の、またはペットの動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む任意の哺乳動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、霊長類であり、より好ましくはヒトである。
【0032】
「治療的有効量」は、標的への顕著な負のまたは有害な副作用を引き起こすことなく、（１）疾患、障害または状態の発症を遅延させるまたは防止する；（２）疾患、障害、または状態の１つ以上の症状の進行、増悪、または悪化を遅らせる、または停止させる；（３）疾患、障害、または状態の症状の改善をもたらす；（４）疾患、障害、もしくは状態の重症度もしくは発生率を低下させる；または（５）疾患、障害、もしくは状態を治癒する；ことを目的とした、本明細書に記載の１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）のレベルまたは量を指す。治療的有効量は、予防的または防止的作用のために、疾患、障害または状態の発症の前に投与され得る。あるいはまたはさらに、治療的有効量は、治療作用のために、疾患、障害または状態の開始後に投与され得る。
【0033】
「治療すること」または「処置」または「緩和」は、治療的処置を指し、その目的は、標的とされる病状または障害を遅らせる（軽減する）ことである。対象または哺乳動物は、本発明による１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上の細胞傷害性Ｔリンパ球（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）の治療量を受けた後、患者が、次の：癌細胞の数（または腫瘍サイズ）の減少；癌性である全細胞の割合の減少；ならびに／または特定の疾患もしくは状態に関連する症状、の１つ以上のある程度の緩和；罹患率および死亡率の低下、ならびに生活の質の問題の改善、の１つ以上の観察可能なおよび／または測定可能な減少またはこれらの１つ以上の不在を示す場合、癌について良好に「治療される」。良好な治療および疾患における改善を評価するための上記のパラメータは、医師が精通しているルーチン手順により容易に測定可能である。
【0034】
「ワクチン」は、患者に投与されると、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導し得、かつこの免疫応答が防御的である、化合物を指す。
【0035】
「ベクター」または「発現ベクター」は、宿主を形質転換し導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、それによりＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入され得る、ビヒクルを意味する。
【発明を実施するための形態】
【0036】
本発明は、癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連する、ヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）由来のＴ細胞エピトープを同定するための方法に関する。
【0037】
一実施形態では、方法のすべてのステップは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、本発明の方法は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法である。
【0038】
本発明の方法は特に、腫瘍細胞により特異的に過剰発現され、かつ多数のＨＥＲＶ候補の中で免疫原性が最も高いと思われる、限られた数のＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープを選択することを可能にする。
【0039】
一実施形態では、この方法は、共有されるエピトープ、すなわち、同じ癌を有する複数の患者において共有されるエピトープ、および／または異なる癌タイプ間で共有されるエピトープ、および／または癌関連ＨＥＲＶ間で共有されるエピトープを選択することを可能にする。一実施形態では、本発明の方法により同定されたエピトープ（複数可）は、同じ癌を有する複数の患者により共有される。一実施形態では、本発明の方法により同定されたエピトープ（複数可）は、異なる癌種間で共有される。一実施形態では、本発明の方法により同定されたエピトープ（複数可）は、癌関連ＨＥＲＶ間で共有される。
【0040】
一実施形態では、本方法は、以下に記載される少なくとも２、３、４、５個の、またはそれより多いステップを含む。
【0041】
一実施形態では、上述の方法は、腫瘍サンプルおよび正常サンプル中のＨＥＲＶを同定するステップを含む。ＨＥＲＶは、ＨＥＲＶデータベースにより同定され得る。
【0042】
サンプル中のＨＥＲＶを同定するための方法は、当業者には周知であり、これらに限定されないが、リファレンスツール、例えばＨｅｒｖｑｕａｎｔ（Ｃ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１２８，４８０４－４８２０（２０１８））またはＴｅｌｅｓｃｏｐｅ（Ｂｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｌｅｓｃｏｐｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｂｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２０１９ Ｓｅｐ ３０；１５（９）：ｅ１００６４５３）の使用を含む。
【0043】
さらに、ＨＥＲＶデータベースは、文献に記載されており、例えば、Ｌ．Ｖａｒｇｉｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ；ｍｏｓａｉｃ ｆｏｒｍｓ ａｒｅ ｃｏｍｍｏｎ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．１３，７（２０１６）を参照されたい。ＨＥＲＶデータベースは、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから取得され得る。
【0044】
一実施形態では、正常サンプルは、癌に罹患していない対象から得られたサンプル、または癌に罹患している対象からの腫瘍周囲の部位において得られたサンプルを指す。
【0045】
一実施形態では、腫瘍サンプルは、癌に罹患した対象における腫瘍組織からのサンプルを指す。
【0046】
一実施形態では、上述の方法は、癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを選択するステップを含む。このステップは特に、腫瘍中と正常サンプル中で差別的に発現されるＨＥＲＶの選択を可能にする。
【0047】
一実施形態では、癌に関連するＨＥＲＶの選択は、腫瘍中および正常サンプル中のＨＥＲＶ発現を比較するステップを含む。この比較は、ＲＮＡレベルで行われてよく、ＲＮＡ配列の発現が、腫瘍サンプルと正常サンプルの間で各ＨＥＲＶについて比較されることを意味する。
【0048】
ＲＮＡ配列は、ＲＮＡシーケンシングデータベースから、および／または新鮮な組織からの抽出により得られ得る。
【0049】
一実施形態では、ＨＥＲＶは、ＨＥＲＶが正常サンプル中よりも腫瘍サンプル中で２倍超、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、またはそれより多く発現される場合、癌と関連しており、好ましくは少なくとも１つの癌と関連している。一実施形態では、ＨＥＲＶは、ＨＥＲＶが正常サンプル中よりも腫瘍サンプル中で２倍を超えて発現され、かつその一致する腫瘍中と比較してあらゆる正常組織中で２倍を超えず発現される場合、癌と関連しており、好ましくは少なくとも１つの癌と関連している。
【0050】
一実施形態では、上記の方法は、細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップを含む。このステップは特に、免疫応答を誘導できるＨＥＲＶの選択を可能にする。
【0051】
一実施形態では、ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、表現型基準により評価される。一実施形態では、ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞シグネチャの関連により評価される。
【0052】
一実施形態では、ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、各ＨＥＲＶと、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞表現型の少なくとも１つと関連するトランスクリプトームシグネチャの関連を決定することにより評価される。一実施形態では、このステップは、腫瘍サンプル中にＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞表現型を有する細胞が存在することを示唆する転写産物に関連するＨＥＲＶを選択することを可能にする。。
【0053】
ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の表現型を割り当てる方法の例は、当業者に周知であり、例えば、Ｘｃｅｌｌ法（Ｄ．Ａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，ｘＣｅｌｌ：ｄｉｇｉｔａｌｌｙ ｐｏｒｔｒａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１８，２２０（２０１７））、およびＭＣＰカウンターを含む。
【0054】
ここで使用されるように、Ｘｃｅｌｌは、６４種類の免疫細胞型および間質細胞型の遺伝子発現データから細胞型のエンリッチメント分析を行う遺伝子シグネチャベースの方法である。ｘＣｅｌｌシグネチャは、広範なｉｎ－ｓｉｌｉｃｏシミュレーションおよびサイトメトリー免疫表現型解析を使用して検証された。ｘＣｅｌｌの開発用の細胞型スコアおよびＲスクリプトを生成するためのｘＣｅｌｌ Ｒパッケージは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｄｖｉｒａｒａｎ／ｘＣｅｌｌで入手可能であり、Ｚｅｎｏｄｏに寄託される（割り当てられたＤＯＩ ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．１００４６６２）。
【0055】
一実施形態では、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞表現型を割り当てるためのシグネチャは、Ｘｃｅｌｌのシグネチャに基づく。
【0056】
一実施形態では、ＣＤ４ Ｔ細胞表現型、特にＣＤ４メモリーＴ細胞表現型を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＣＤ６、ＣＤ２８、ＧＰＲ１８３、ＥＩＦ３Ｅ、ＩＴＫ、ＰＫＰ４、ＰＲＥＰＬ、ＤＮＡＪＡ２、ＰＴＧＥＳ３、ＣＤ２ＡＰおよびＩＣＯＳ。
【0057】
一実施形態では、ＣＤ４ Ｔ細胞表現型、特にＣＤ４ナイーブＴ細胞表現型を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＣＤ２７、ＣＬＣ、ＣＴＳＷ、ＤＮＡＪＢ１、ＲＢＬ２、ＨＡＵＳ３、ＡＮＫＲＤ５５、ＺＮＦ３９４およびＣＨＭＰ７。
【0058】
一実施形態では、ＣＤ４ Ｔ細胞表現型を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＡＰＢＢ１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＴＫ、ＰＬＣＬ１、ＳＮＰＨ、ＰＰＷＤ１、ＰＨＦ３、ＩＣＯＳ、ＴＲＡＴ１、ＲＡＰＧＥＦ６、ＮＯＬ９およびＣＨＭＰ７。
【0059】
一実施形態では、ＣＤ４ Ｔ細胞表現型、特にＣＤ４セントラルメモリーＴ細胞表現型（ＣＤ４ Ｔｃｍ）を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＴＬＡ４、ＤＡＢ１、ＥＲＮ１、ＧＰＲ１５、ＤＮＡＪＢ１、ＫＲＴ１、ＰＯＵ６Ｆ１、ＴＰＯ、ＴＲＡＤＤ、ＤＬＥＣ１、ＩＣＯＳ、ＴＲＡＴ１、ＦＸＹＤ７、ＦＢＸＬ８、ＳＩＲＰＧ、ＡＮＫＲＤ５５およびＯＢＳＣＮ。
【0060】
一実施形態では、ＣＤ４ Ｔ細胞表現型、特にＣＤ４エフェクターメモリーＴ細胞表現型（ＣＤ４ Ｔｅｍ）を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＲＰＮ２、ＳＬＡＭＦ１、ＳＰＴＡＮ１、ＴＲＡＤＤ、ＭＹＯ１６、ＭＣＦ２Ｌ２、ＥＳＹＴ１、ＴＲＡＰＰＣ２Ｌ、ＡＲＨＧＡＰ１５およびＲＩＣ８Ａ。
【0061】
一実施形態では、ＣＤ８Ｔ細胞表現型、特にＣＤ８ナイーブＴ細胞表現型を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＥＥＦ１Ｄ、ＧＰＲ１５、ＭＹＬ１、ＮＤＵＦＡ４、ＮＤＵＦＳ５、ＰＳＧ１１、ＳＫＩ、ＳＯＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、ＢＵＤ３１、ＧＰＲ５２、ＺＮＨＩＴ３、ＣＧＲＲＦ１、ＲＲＰ８、ＮＧＤＮ、Ｃ１９ｏｒｆ５３、ＳＥＴＤ２、ＭＥＤ３１、ＳＳ１８Ｌ２、ＣＤＫ５ＲＡＰ１、ＤＤＸ２４、ＰＣＩＦ１、ＭＳ４Ａ５、ＨＡＵＳ３、ＬＩＮ２８ＡおよびＴＮＫＳ２。
【0062】
一実施形態では、ＣＤ８ Ｔ細胞表現型を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＣＡＳＰ８、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＧＺＭＫ、ＰＴＧＤＲ、ＳＬＣ１Ａ７、ＴＳＰＡＮ３２、ＫＬＲＧ１、ＮＰＲＬ２、ＧＩＭＡＰ４、ＣＲＴＡＭおよびＺＮＦ６１１。
【0063】
一実施形態では、ＣＤ８Ｔ細胞表現型、特にＣＤ８セントラルメモリーＴ細胞表現型（ＣＤ８ Ｔｃｍ）を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＣＡＳＰ８、ＣＤ２７、ＴＮＦＳＦ８、ＧＺＭＫ、ＮＣＫ１、ＧＰＲ１７１、ＣＲＴＡＭ、ＰＡＲＰ１１およびＴＭＥＭ３０Ｂ。
【0064】
一実施形態では、ＣＤ８ Ｔ細胞表現型、特にＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞表現型（ＣＤ８ Ｔｅｍ）を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＤＨＸ８、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＬＡＧ３、ＺＡＰ７０、ＣＯＬＱ、ＲＧＳ９、ＣＸＣＲ６、ＰＶＲＩＧおよびＰＹＨＩＮ１。
【0065】
一実施形態では、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞表現型を割り当てるためのシグネチャは、ＭＣＰカウンターのシグネチャに基づく。
【0066】
一実施形態では、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞表現型を割り当てるためのシグネチャは、以下の遺伝子を含むかまたは以下の遺伝子からなる：ＣＤ２８、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＨＲＭ３－ＡＳ２、ＣＴＬＡ４、ＦＬＴ３ＬＧ、ＩＣＯＳ、ＭＡＬ、ＭＧＣ４００６９、ＰＢＸ４、ＳＩＲＰＧ、ＴＨＥＭＩＳ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＲＡＴ１、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ８Ａ、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦＢＰ２、ＧＮＬＹ、ＫＬＲＣ３、ＫＬＲＣ４、ＫＬＲＤ１、ＢＡＮＫ１、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＲ２、ＦＣＲＬ２、ＩＧＫＣ、ＭＳ４Ａ１、ＰＡＸ５、ＣＤ１６０、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＣＲ１、ＰＴＧＤＲ、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＡＤＡＰ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＰＲ３、ＫＹＮＵ、ＰＬＡ２Ｇ７、ＲＡＳＳＦ４、ＴＦＥＣ、ＣＤ１Ａ、ＣＤ１Ｂ、ＣＤ１Ｅ、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＣＬＩＣ２、ＷＦＤＣ２１Ｐ、ＣＡ４、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＨＡＬ、ＫＣＮＪ１５、ＭＥＧＦ９、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＳＴＥＡＰ４、ＴＥＣＰＲ２、ＴＬＥ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＶＮＮ３、ＡＣＶＲＬ１、ＡＰＬＮ、ＢＣＬ６Ｂ、ＢＭＰ６、ＢＭＸ、ＣＤＨ５、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＣＸｏｒｆ３６、ＥＤＮ１、ＥＬＴＤ１、ＥＭＣＮ、ＥＳＡＭ、ＥＳＭ１、ＦＡＭ１２４Ｂ、ＨＥＣＷ２、ＨＨＩＰ、ＫＤＲ、ＭＭＲＮ１、ＭＭＲＮ２、ＭＹＣＴ１、ＰＡＬＭＤ、ＰＥＡＲ１、ＰＧＦ、ＰＬＸＮＡ２、ＰＴＰＲＢ、ＲＯＢＯ４、ＳＤＰＲ、ＳＨＡＮＫ３、ＳＨＥ、ＴＥＫ、ＴＩＥ１、ＶＥＰＨ１、ＶＷＦ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＤＣＮ、ＧＲＥＭ１、ＰＡＭＲ１およびＴＡＧＬＮ。
【0067】
一実施形態では、ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、各ＨＥＲＶと機能シグネチャの関連性を決定することにより評価される。一実施形態では、機能シグネチャは、インターフェロン（ＩＦＮ）－γシグネチャまたは細胞溶解活性である。
【0068】
一実施形態では、ＩＦＮ－γシグネチャは、ＩＦＮ－γに応答してアップレギュレートされる遺伝子に基づく。一実施形態では、ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、各ＨＥＲＶとＩＦＮ－γ応答に関連するトランスクリプトームシグネチャの関連を決定することにより評価される。
【0069】
一実施形態では、ＩＦＮ－γシグネチャは、データベースに基づき決定される。例えば、ＩＦＮ－γシグネチャデータベースは、分子シグネチャデータベースを介して利用され得る。
【0070】
一実施形態では、ＩＦＮ－γシグネチャは、以下の遺伝子の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、もしくは２００個、またはすべてを含む：ＡＤＡＲ、ＡＰＯＬ６、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＡＲＬ４Ａ、ＡＵＴＳ２、Ｂ２Ｍ、ＢＡＮＫ１、ＢＡＴＦ２、ＢＰＧＭ、ＢＳＴ２、ＢＴＧ１、Ｃ１Ｒ、Ｃ１Ｓ、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＤ２７４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＣＤ７４、ＣＤ８６、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＦＢ、ＣＦＨ、ＣＩＩＴＡ、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＰＫ２、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ９、ＤＤＸ５８、ＤＤＸ６０、ＤＨＸ５８、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＥＩＦ４Ｅ３、ＥＰＳＴＩ１、ＦＡＳ、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＧＬ２、ＦＰＲ１、ＦＴＳＪＤ２、ＧＢＰ４、ＧＢＰ６、ＧＣＨ１、ＧＰＲ１８、ＧＺＭＡ、ＨＥＲＣ６、ＨＩＦ１Ａ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ２７、ＩＦＩ３０、ＩＦＩ３５、ＩＦＩ４４、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＨ１、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＳＯＣ１、ＩＴＧＢ７、ＪＡＫ２、ＫＬＲＫ１、ＬＡＰ３、ＬＡＴＳ２、ＬＣＰ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＹ６Ｅ、ＬＹＳＭＤ２、１－Ｍａｒ、ＭＥＴＴＬ７Ｂ、ＭＴ２Ａ、ＭＴＨＦＤ２、ＭＶＰ、ＭＸ１、ＭＸ２、ＭＹＤ８８、ＮＡＭＰＴ、ＮＣＯＡ３、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＬＲＣ５、ＮＭＩ、ＮＯＤ１、ＮＵＰ９３、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＯＧＦＲ、Ｐ２ＲＹ１４、ＰＡＲＰ１２、ＰＡＲＰ１４、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＥＬＩ１、ＰＦＫＰ、ＰＩＭ１、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＰＬＳＣＲ１、ＰＭＬ、ＰＮＰ、ＰＮＰＴ１、ＰＲＩＣ２８５、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＢ１０、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＰＳＭＥ１、ＰＳＭＥ２、ＰＴＧＳ２、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ６、ＲＡＰＧＥＦ６、ＲＢＣＫ１、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ２、ＲＮＦ２１３、ＲＮＦ３１、ＲＳＡＤ２、ＲＴＰ４、ＳＡＭＤ９Ｌ、ＳＡＭＨＤ１、ＳＥＣＴＭ１、ＳＥＬＰ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ２５Ａ２８、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＯＤ２、ＳＰ１１０、ＳＰＰＬ２Ａ、ＳＲＩ、ＳＳＰＮ、ＳＴ３ＧＡＬ５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＴＡＰ１、ＴＡＰＢＰ、ＴＤＲＤ７、ＴＮＦＡＩＰ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＡＩＰ６、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＯＲ１Ｂ、ＴＲＡＦＤ１、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２６、ＴＸＮＩＰ、ＵＢＥ２Ｌ６、ＵＰＰ１、ＵＳＰ１８、ＶＡＭＰ５、ＶＡＭＰ８、ＶＣＡＭ１、ＷＡＲＳ、ＸＡＦ１、ＸＣＬ１、ＺＢＰ１およびＺＮＦＸ１。
【0071】
一実施形態では、ＩＦＮ－γシグネチャは、上述のすべての遺伝子を含む。一実施形態では、ＩＦＮ－γシグネチャは、ＨＡＬＬＭＡＲＫ＿ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ＿ＧＡＭＭＡ＿ＲＥＳＰＯＮＳＥ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ｃａｒｄｓ／ＨＡＬＬＭＡＲＫ＿ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ＿ＧＡＭＭＡ＿ＲＥＳＰＯＮＳＥ．ｈｔｍｌ）である。
【0072】
一実施形態では、ＩＦＮ－γシグネチャは、癌種ごとの各サンプルについてＩＦＮ－γシグネチャデータベースに基づきエンリッチメントスコアを計算することにより算出される。
【0073】
一実施形態では、細胞溶解活性は、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）およびパーフォリン（ＰＲＦ１）の発現レベルを評価することにより算出される。一実施形態では、細胞溶解活性は、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）およびパーフォリン（ＰＲＦ１）レベルの発現の幾何平均を計算することにより算出される。
【0074】
一実施形態では、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）およびパーフォリン（ＰＲＦ１）の発現レベルは、トランスクリプトームレベルで算出される。一実施形態では、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）およびパーフォリン（ＰＲＦ１）の発現レベルは、ＲＮＡ－ｓｅｑにより算出される。
【0075】
ここで使用されるように、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（ＲＮＡシーケンシングの略称）は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して特定の時期での生物学的サンプル中の特異的なＲＮＡの存在および量を明らかにするシーケンシング技術である。
【0076】
ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）ポータルのデータベースなどのデータベースにおいて見出され得る。
【0077】
一実施形態では、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）およびパーフォリン（ＰＲＦ１）の発現レベルは、プロテオームレベルで算出される。
【0078】
一実施形態では、ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、正常な精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞中のＨＥＲＶの発現の不在により評価される。このステップはさらに、腫瘍性細胞中で発現され、Ｔ細胞またはＮＫ細胞中で発現されないＨＥＲＶを選択することを可能にする。
【0079】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞中で発現されるＨＥＲＶの例は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１を含む。
【0080】
一実施形態では、ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、上に記載した１つ、２つ、または３つのパラメータ（複数可）の算出により評価される。
【0081】
一実施形態では、ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、（ｉ）各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞シグネチャの関連性、（ｉｉ）各ＨＥＲＶとＩＦＮ－γシグネチャまたは細胞溶解活性のいずれかである機能シグネチャの関連性、および／または（ｉｉｉ）正常な精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞中の各ＨＥＲＶの発現の不在により評価される。
【0082】
一実施形態では、ＨＥＲＶと上に記載の１つ、２つ、または３つのパラメータ（複数可）の関連性は、機械学習ベースのアプローチにより評価される。一実施形態では、機械学習ベースのアプローチを使用して、各癌種に対し独立して関連性を試験する。ここで使用されるように、機械学習は、アルゴリズムがトレーニングデータに基づきモデルを構築する、人工知能を指す。
【0083】
一実施形態では、ＨＥＲＶと上述のパラメータの１つの関連性は、回帰、好ましくはＬ１ペナルティ回帰（ＬＡＳＳＯ）により算出される。特に、あるモデルが、各癌種に対し構築でき、そのモデルにおいて正の係数を有する各ＨＥＲＶは、パラメータとすると見なされる。
【0084】
一実施形態では、上記の方法は、Ｔ細胞エピトープを選択するステップ、特に共有Ｔ細胞エピトープを選択するステップを含む。
【0085】
このステップは特に、ｉ）既知のＨＥＲＶタンパク質と共通の領域を有し、それにより非翻訳配列を選択するリスクを低下させる、かつｉ）ＭＨＣクラスＩ分子に対する強力な結合剤であり、ＭＨＣクラスＩ分子によるそれらの提示を可能にする、エピトープの選択を可能にする。このステップはさらに、ｉｉｉ）癌に関連するＨＥＲＶなどの、ＨＥＲＶにおいて最も共有される、エピトープの選択を可能にし得る。
【0086】
一実施形態では、この方法は、Ｔ細胞エピトープを選択するステップを含む。一実施形態では、Ｔ細胞エピトープを選択するステップは、推定のエピトープを決定するステップを含む。
【0087】
一実施形態では、Ｔ細胞エピトープを選択するステップは、１、２、３、４、５、または６個の可能なフレームへとＨＥＲＶ配列を翻訳し少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５個の、またはそれより多いアミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定して推定のエピトープを得るステップを含む。
【0088】
一実施形態では、Ｔ細胞エピトープを選択するステップは、推定のエピトープとＭＨＣクラスＩ分子の結合を予測するステップを含む。
【0089】
配列とＭＨＣ分子の結合を予測するための分析ツールは、当業者によく知られており、例えば、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ（Ｔ．Ｊ．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ：Ｏｐｅｎ－Ｓｏｕｒｃｅ Ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ．７，１２９－１３２．ｅ４（２０１８））またはＮｅｔＭＣＨ Ｉ＆ＩＩを含む。
【0090】
一実施形態では、上記ＭＣＨクラスＩ分子は、ＨＬＡ分子である。一実施形態では、ＭＣＨクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ分子、ＨＬＡ－Ｂ分子、およびＨＬＡ－Ｃ分子を含むかまたはそれらからなる群から選択される。一実施形態では、ＭＣＨクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ２分子などの、ＨＬＡ－Ａ分子である。
【0091】
一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子と結合できると予測されるＴ細胞エピトープのみが、選択される。一実施形態では、そのエピトープは、その配列が上で定義したようにＭＣＨクラスＩ分子の強力な結合剤として予測される場合、選択される。
【0092】
一実施形態では、Ｔ細胞エピトープを選択するステップは、非翻訳配列を選択するリスクを低下させるために、エピトープを既知のＨＥＲＶタンパク質の配列と整列させることを含む。
【0093】
一実施形態では、ＨＥＲＶタンパク質は、エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質である。一実施形態では、ＨＥＲＶタンパク質は、群特異的抗原（Ｇａｇ）タンパク質である。一実施形態では、ＨＥＲＶタンパク質は、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）である。一実施形態では、ＨＥＲＶタンパク質は、プロテアーゼ（Ｐｒｏ）である。一実施形態では、ＨＥＲＶタンパク質は、Ｒｅｃタンパク質である。一実施形態では、ＨＥＲＶタンパク質は、アクセサリータンパク質である。
【0094】
一実施形態では、ＨＥＲＶタンパク質は、ＨＥＲＶ－Ｋ／ＨＭＬ－２タンパク質である。一実施形態では、ＨＥＲＶタンパク質は、ＨＥＲＶ－Ｋ／ＨＭＬ－２Ｇａｇタンパク質である。一実施形態では、ＨＥＲＶタンパク質は、ＨＥＲＶ－Ｋ／ＨＭＬ－２Ｐｏｌタンパク質である。
【0095】
ＨＥＲＶタンパク質の例としては、これらに限定されないが、ＨＥＲＶ－Ｋ１０Ｇａｇタンパク質（配列番号２０）、ＨＥＲＶ－Ｋ１１３Ｇａｇタンパク質（配列番号２１）、ＨＥＲＶ－Ｋ２１Ｇａｇタンパク質（配列番号２２）、ＨＥＲＶ－Ｋ１１３Ｐｏｌタンパク質（配列番号２３）、ＨＥＲＶ－Ｋ９Ｐｏｌタンパク質（配列番号２４）、ＨＥＲＶ－Ｋ６Ｐｏｌタンパク質（配列番号２５）、ＨＥＲＶ－Ｋ１１３Ｅｎｖタンパク質（配列番号２６）が挙げられる。
配列番号：２０
MGQTKSKIKSKYASYLSFIKILLKRGGVKVSTKNLIKLFQIIEQFCPWFPEQGTSDLKDWKRIGKELKQAGRKGNIIPLTVWNDWAIIKAALEPFQTEEDSISVSDAPGSCLIDCNENTRKKSQKETESLHCEYVAEPVMAQSTQNVDYNQLQEVIYPETLKLEGKGPELMGPSESKPRGTSPLPAGQVLVRLQPQKQVKENKTQPQVAYQYWPLAELQYRPPPESQYGYPGMPPAPQGRAPYHQPPTRRLNPMAPPSRQGSELHEIIDKSRKEGDTEAWQFPVTLEPMPPGEGAQEGEPPTVEARYKSFSIKMLKDMKEGVKQYGPNSPYMRTLLDSIAYGHRLIPYDWEILAKSSLSPSQFLQFKTWWIDGVQEQVRRNRAANPPVNIDADQLLGIGQNWSTISQQALMQNEAIEQVRAICLRAWEKIQDPGSTCPSFNTVRQGSKEPYPDFVARLQDVAQKSIADEKAGKVIVELMAYENANPECQSAIKPLKGKVPAGSDVISEYVKACDGIGGAMHKAMLMAQAITGVVLGGQVRTFGGKCYNCGQIGHLKKNCPVLNKQNITIQATTTGREPPDLCPRCKKGKHWASQCRSKFDKNGQPLSGNEQRGQPQAPQQTGAFPIQPFVPQGFQGQQPPLSQVFQGISQLPQYNNCPSPQAAVQQ
配列番号：２１
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配列番号：２２
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配列番号：２３
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配列番号：２４
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配列番号：２５
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配列番号：２６
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配列番号：２０
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配列番号：２１
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配列番号：２２
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配列番号：２３
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配列番号：２４
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配列番号：２５
NKSRKRRNRESLLGAATVEPPKPIPLTWKTEKPVWVNQWPLPKQKLEALHLLANEQLEKGHIEPSFSPWNSPVFVIQKKSGKWRMLTDLRAVNAVIQPMGPLQPGLPSPAMIPKDWPLIIIDLKDCFFTIPLAEQDCEKFAFTIPAINNKEPATRFQWKVLPQGMLNSPTICQTFVGRALQPVREKFSDCYIIHCIDDILCAAETKDKLIDCYTFLQAEVANAGLAIASDKIQTSTPFHYLGMQIENRKIKPQKIEIRKDTLKTLNDFQKLLGDINWIRPTLGIPTYAMSNLFSILRGDSDLNSKRMLTPEATKEIKLVEEKIQSAQINRIDPLAPLQLLIFATAHSPTGIIIQNTDLVEWSFLPHSTVKTFTLYLDQIATLIGQTRLRIIKLCGNDPDKIVVPLTKEQVRQAFINSGAWKIGLANFVGIIDNHYPKTKIFQFLKLTTWILPKITRREPLENALTVFTDGSSNGKAAYTGPKERVIKTPYQSAQRAELVAVITVLQDFDQPINIISDSAYVVQATRDVETALIKYSMDDQLNQLFNLLQQTVRKRNFPFYITHIRAHTNLPGPLTKANEQADLLVSSALIKAQELHALTHVNAAGLKNKFDVTWKQAKDIVQHCTQCQVLHLPTQEAGVNPRGLCPNALWQMDVTHVPSFGRLSYVHVTVDTYSHFIWATCQTGESTSHVKKHLLSCFAVMGVPEKIKTDNGPGYCSKAFQKFLSQWKISHTTGIPYNSQGQAIVERTNRTLKTQLVKQKEGGDSKECTTPQMQLNLALYTLNFLNIYRNQTTTSAEQHLTGKKNSPHEGKLIWWKDNKNKTWEIGKVITWGRGFACVSPGENQLPVWIPTRHLKFYNEPIRDAKKSTSAETETSQSSTVDSQDEQNGDVRRTDEVAIHQEGRAANLGTTKEADAVSYKISREHKGDTNPREYAACSLDDCINGGKSPYACRSSCS
配列番号：２６
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【0096】
一実施形態では、エピトープは、その配列が上で定義される少なくとも１つのＨＥＲＶタンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれを超える同一性を共有する場合選択される。一実施形態では、配列は、上記配列が上で定義される少なくとも１つのＨＥＲＶタンパク質と少なくとも９０％の同一性を共有する場合選択される。
【0097】
一実施形態では、エピトープは、その配列が上で定義されるＨＥＲＶタンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、または、それを超える同一性を共有する場合、および／または上記エピトープが上で説明されるＭＨＣクラスＩ分子と結合すると予測される場合選択される。
【0098】
一実施形態では、上述の方法は、上述のステップの１つで同定されたＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップを含む。このステップは特に、癌に関連するＨＥＲＶなどの、ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択することを可能にする。
【0099】
このステップは、癌に関連するＨＥＲＶなどの、前述のステップの１つで同定されたＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の、またはそれより多いエピトープの選択をもたらし得る。
【0100】
一実施形態では、上述の方法は、腫瘍サンプル中のタンパク質またはペプチドレベルで上述のステップの１つにより同定されたエピトープの発現を評価するステップを含む。このステップは特に、選択されたエピトープが腫瘍サンプル中で翻訳されるまたは発現されることを確認することを可能にする。
【0101】
一実施形態では、タンパク質またはペプチドレベルでの上記エピトープの発現は、１つ以上のプロテオームデータベース（複数可）を使用することによりｉｎ ｓｉｌｉｃｏで算出される。
【0102】
プロテオームデータベースは、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）データから得られ得る。ここで使用されるように、タンデム質量分析法（ＴＡＮＤＥＭ ＭＳ）は、ＭＳ／ＭＳとも呼ばれ、２つ以上の質量分析装置を使用する質量分析技術を指す。２つをタンデムにして、前駆体イオンは、第１の質量分析装置により質量選択され、衝突領域に収束され、ここでそれらは次いで生成イオンへと断片化され、それらは次いで第２の質量分析装置により特徴付けられる。
【0103】
データベースからのタンパク質またはペプチドの発現を評価するための分析ツールは、当業者には周知であり、例えば、ｐｅｐｑｕｅｒｙ（Ｂ．Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰｅｐＱｕｅｒｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｆａｓｔ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２９，４８５－４９３（２０１９））を含む。
【0104】
一実施形態において、タンパク質またはペプチドレベルでの上記エピトープの発現は、イムノペプチドミクス分析によりｉｎ ｖｉｔｒｏで算出される。イムノペプチドミクス分析は、腫瘍のＨＬＡ分子に関連するエピトープの存在を評価することを可能にする。
【0105】
一実施形態では、エピトープは、上記エピトープが腫瘍サンプルにおける翻訳の証拠、および／または腫瘍サンプルにおけるＨＬＡ分子の翻訳およびＨＬＡ分子との関連の証拠を示す場合が選択される。
【0106】
一実施形態では、上に記載される方法は、次の：
（ａ）．癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後である、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
（ａ）．癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後である、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
【0107】
一実施形態では、ステップ（ａ）および（ｂ）ならびにステップ（ｉ）および／または（ｉｉ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのステップである。一実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのステップである。
【0108】
一実施形態では、ステップ（ａ）は、癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定し選択するステップを含む。
【0109】
一実施形態では、ステップ（ｂ）は、共通のＴ細胞エピトープを選択するステップを含む。
【0110】
一実施形態では、上に記載される方法は、次の：
（ａ）．癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後である、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｉ）および（ｉｉ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施される。
（ａ）．癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後である、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｉ）および（ｉｉ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施される。
【0111】
したがって、一実施形態では、上述のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法は、次の：
（ａ）．癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後である、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
（ａ）．癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後である、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含む。
【0112】
一実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）の後でまたはステップ（ｉｉ）の前に、ステップ（ａ）で同定された癌に関連するＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップをさらに含む。
【0113】
一実施形態では、上に記載されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｃ）腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｃ）腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
【0114】
一実施形態では、上に記載されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
【0115】
一実施形態では、上に記載されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）で同定された癌に関連するＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｄ）腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）で同定された癌に関連するＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｄ）腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
【0116】
一実施形態では、上に記載されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｅ）腫瘍サンプル中のステップ（ｄ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｅ）腫瘍サンプル中のステップ（ｄ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
【0117】
一実施形態では、上に記載されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含む。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含む。
【0118】
一実施形態では、上に記載されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップ、
を含む。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップ、
を含む。
【0119】
一実施形態では、ステップは、上で説明されるとおりである。
【0120】
一実施形態では、上に記載されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、
ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、（ｉ）各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞シグネチャの関連性、（ｉｉ）各ＨＥＲＶとインターフェロン（ＩＦＮ）－γシグネチャまたは細胞溶解活性のいずれかである機能シグネチャの関連性、および／または（ｉｉｉ）正常な精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞中の各ＨＥＲＶの発現の不在により評価される、選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップであって、
Ｔ細胞エピトープを選択することは、
－推定のエピトープを決定することと、
－推定のエピトープとＭＨＣクラスＩ分子の結合を予測することと、
－任意により、エピトープを既知のＨＥＲＶタンパク質の配列と整列させること、
を含む、選択するステップと、
（ｄ）任意により、癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｅ）任意により、腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）または（ｄ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、
ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、（ｉ）各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞シグネチャの関連性、（ｉｉ）各ＨＥＲＶとインターフェロン（ＩＦＮ）－γシグネチャまたは細胞溶解活性のいずれかである機能シグネチャの関連性、および／または（ｉｉｉ）正常な精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞中の各ＨＥＲＶの発現の不在により評価される、選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップであって、
Ｔ細胞エピトープを選択することは、
－推定のエピトープを決定することと、
－推定のエピトープとＭＨＣクラスＩ分子の結合を予測することと、
－任意により、エピトープを既知のＨＥＲＶタンパク質の配列と整列させること、
を含む、選択するステップと、
（ｄ）任意により、癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｅ）任意により、腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）または（ｄ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含む。
【0121】
一実施形態では、上に記載される方法は、次の：
（ａ）．癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後である、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｉ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｉｉ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
（ａ）．癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）．前のステップで同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップ、
を含み、かつ
本方法はさらに、次の：
（ｉ）．ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間である、選択するステップ、および／または
（ｉｉ）．腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップであって、ステップ（ｂ）の後である、評価するステップ
の少なくとも１つ、好ましくは２つを含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｉ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｉｉ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【0122】
一実施形態では、ステップ（ａ）は、癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定しかつ選択するステップを含む。
【0123】
一実施形態では、ステップ（ｂ）は、共通のＴ細胞エピトープを選択するステップを含む。
【0124】
一実施形態では、本方法はさらに、ステップ（ｂ）の後でまたはステップ（ｉｉ）の前に、ステップ（ａ）で同定された癌に関連するＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップを含む。
【0125】
一実施形態では、上に記載される方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｃ）腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｃ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｃ）腫瘍サンプル中のステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｃ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【0126】
一実施形態では、上に記載される方法は、次の：
（ｃ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｄ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
（ｃ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｄ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【0127】
一実施形態では、上に記載される方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）で同定された癌に関連するＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｄ）腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｄ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）で同定された癌に関連するＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｄ）腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｄ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【0128】
一実施形態では、上に記載される方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｅ）腫瘍サンプル中のステップ（ｄ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｅ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｅ）腫瘍サンプル中のステップ（ｄ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｅ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【0129】
一実施形態では、ステップは、上で説明されるとおりである。
【0130】
一実施形態では、上に記載される方法は、次の：
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、
ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、（ｉ）各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞シグネチャの関連性、（ｉｉ）各ＨＥＲＶとインターフェロン（ＩＦＮ）－γシグネチャまたは細胞溶解活性のいずれかである機能シグネチャの関連性、および／または（ｉｉｉ）正常な精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞中の各ＨＥＲＶの発現の不在により評価される、選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップであって、
Ｔ細胞エピトープを選択することは、
－推定のエピトープを決定することと、
－推定のエピトープとＭＨＣクラスＩ分子の結合を予測することと、
－任意により、エピトープを既知のＨＥＲＶタンパク質の配列と整列させること、
を含む、選択するステップと、
（ｄ）任意により、癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｅ）任意により、腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）または（ｄ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｅ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
（ａ）癌に関連する、好ましくは少なくとも１つの癌に関連するＨＥＲＶを同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された癌関連ＨＥＲＶの中で細胞傷害性Ｔ細胞応答に関連するＨＥＲＶを選択するステップであって、
ＨＥＲＶと細胞傷害性Ｔ細胞応答の関連性は、（ｉ）各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞シグネチャの関連性、（ｉｉ）各ＨＥＲＶとインターフェロン（ＩＦＮ）－γシグネチャまたは細胞溶解活性のいずれかである機能シグネチャの関連性、および／または（ｉｉｉ）正常な精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞中の各ＨＥＲＶの発現の不在により評価される、選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたＨＥＲＶの中でＴ細胞エピトープを選択するステップであって、
Ｔ細胞エピトープを選択することは、
－推定のエピトープを決定することと、
－推定のエピトープとＭＨＣクラスＩ分子の結合を予測することと、
－任意により、エピトープを既知のＨＥＲＶタンパク質の配列と整列させること、
を含む、選択するステップと、
（ｄ）任意により、癌関連ＨＥＲＶにおいて最も共有されるエピトープの中でエピトープを選択するステップと、
（ｅ）任意により、腫瘍サンプル中のステップ（ｃ）または（ｄ）で同定されたＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープのタンパク質またはペプチドレベルでの発現を評価するステップ、
を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施され、ステップ（ｅ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【0131】
一実施形態では、ステップ（ｄ）および（ｅ）は、存在する場合、並行して実行される。一実施形態では、エピトープを既知のＨＥＲＶタンパク質の配列と整列させるステップと、ステップ（ｄ）および／または（ｅ）は、存在する場合、並行して実施される。
【0132】
一実施形態では、上述の方法はさらに、選択されたエピトープをヒトプロテオームと整列させるステップを含む。このステップは特に、選択されたエピトープがいずれの自己タンパク質とも一致しないことを確認することを可能にする。
【0133】
一実施形態では、選択されたエピトープをヒトプロテオームと整列させるステップは、エピトープを既知のＨＥＲＶタンパク質の配列と整列させるステップ、存在する場合、ステップ（ｄ）および／またはステップ（ｅ）と並行して実施される。
【0134】
一実施形態では、上述の方法は、選択されたエピトープのｉｎ ｖｉｔｒｏの検証と組み合わされる。特に、上述の方法は、以下に記載する１つ以上のステップ（複数可）と組み合わされてよい。
【0135】
一実施形態では、上記ｉｎ ｖｉｔｒｏの検証は、Ｔ細胞応答の誘導を算出するステップを含む。
【0136】
一実施形態では、Ｔ細胞応答の誘導は、選択されたエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を測定することにより評価される。ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を評価する方法の例としては、例えば、選択されたエピトープを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏプライミングアッセイが挙げられる（例えば実施例の部分を参照されたい）。
【0137】
一実施形態では、Ｔ細胞応答の誘導は、エピトープで刺激された細胞の存在下でＩＦＮ－γまたはグランザイムＢの産生を測定することにより評価される（例えば実施例の部分を参照されたい）。ＩＦＮ－γまたはグランザイムＢの産生を測定するための方法の例としては、例えば、フローサイトメトリーまたはＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイが挙げられる。
【0138】
一実施形態では、Ｔ細胞応答の誘導は、例えばＣＤ１０７ａなどの、脱顆粒マーカーを測定することにより評価される（例えば実施例の部分を参照されたい）。
【0139】
一実施形態では、上記ｉｎ ｖｉｔｒｏの検証は、選択されたエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞とＭＣＨ分子の親和性を算出するステップを含む。このような親和性を評価するための方法の例は、これに限定されないが、３Ｄモデリング（例えば実施例の部分を参照されたい）を含む。
【0140】
一実施形態では、上記ｉｎ ｖｉｔｒｏの検証は、選択されたエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の機能性を算出するステップを含む。ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能性を測定する方法の例としては、これらに限定されないが、免疫細胞殺傷アッセイおよび顕微鏡によるＴ細胞活性化の形態学的兆候の分析が挙げられる（例えば実施例の部分を参照されたい）。
【0141】
一実施形態では、上記ｉｎ ｖｉｔｒｏの検証は、癌に罹患した対象の腫瘍組織における選択されたエピトープに特異的なＴ細胞の存在を評価するステップを含む（例えば実施例の部分を参照されたい）。腫瘍組織は、生検により得られてよい。
【0142】
本発明はまた、上記の方法により同定されたエピトープを含むかまたはエピトープからなるペプチドに関する。
【0143】
本発明は、ＫＬＬＧＤＩＮＷＩ（配列番号１）、ＦＩＦＴＬＩＡＶＩ（配列番号２）、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＦＬＳＬＹＦＶＳＶ（配列番号４）、ＴＬＩＡＶＩＭＧＬ（配列番号５）、ＹＬＤＱＩＡＴＬＩ（配列番号６）、ＦＬＱＡＥＶＡＮＡ（配列番号７）、ＷＭＧＤＲＬＭＳＬ（配列番号８）、ＡＬＨＳＳＶＱＳＶ（配列番号９）、ＩＬＴＥＶＬＫＧＶ（配列番号１０）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＲＬＳＹＶＨＶＴＶ（配列番号１２）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）、ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）、ＹＩＩＨＹＩＤＤＩ（配列番号１７）、ＹＩＷＣＰＴＷＲＬ（配列番号１８）、およびＹＩＷＣＰＴＷＳＬ（配列番号１９）を含むかまたはそれらからなる群において選択される配列を有するエピトープを含むかまたはそのエピトープからなるペプチドに関する。本発明は、配列番号１）、ＦＩＦＴＬＩＡＶＩ（配列番号２）、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＦＬＳＬＹＦＶＳＶ（配列番号４）、ＴＬＩＡＶＩＭＧＬ（配列番号５）、ＹＬＤＱＩＡＴＬＩ（配列番号６）、ＦＬＱＡＥＶＡＮＡ（配列番号７）、ＷＭＧＤＲＬＭＳＬ（配列番号８）、ＡＬＨＳＳＶＱＳＶ（配列番号９）、ＩＬＴＥＶＬＫＧＶ（配列番号１０）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＲＬＳＹＶＨＶＴＶ（配列番号１２）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）、ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）、ＹＩＩＨＹＩＤＤＩ（配列番号１７）、ＹＩＷＣＰＴＷＲＬ（配列番号１８）、およびＹＩＷＣＰＴＷＳＬ（配列番号１９）を含むかまたはそれらからなるペプチドに関する。
【0144】
一実施形態では、ペプチドは、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＡＬＨＳＳＶＱＳＶ（配列番号９）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）、ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはそれらからなる群において選択される配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＡＬＨＳＳＶＱＳＶ（配列番号９）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）、ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはそれらからなる群において選択される配列を有するエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。
【0145】
一実施形態では、ペプチドは、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）、ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはそれらからなる群において選択される配列を有するエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）、ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはそれらからなる群において選択される配列を含むかまたはその配列からなる。
【0146】
一実施形態では、ペプチドは、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはそれらからなる群において選択される配列を有するエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）、ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはそれらからなる群において選択される配列を含むかまたはその配列からなる。
【0147】
一実施形態では、ペプチドは、配列ＫＬＬＧＤＩＮＷＩ（配列番号１）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＦＩＦＴＬＩＡＶＩ（配列番号２）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＦＬＳＬＹＦＶＳＶ（配列番号４）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＴＬＩＡＶＩＭＧＬ（配列番号５）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＹＬＤＱＩＡＴＬＩ（配列番号６）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＦＬＱＡＥＶＡＮＡ（配列番号７）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＷＭＧＤＲＬＭＳＬ（配列番号８）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＡＬＨＳＳＶＱＳＶ（配列番号９）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＩＬＴＥＶＬＫＧＶ（配列番号１０）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＲＬＳＹＶＨＶＴＶ（配列番号１２）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＹＩＩＨＹＩＤＤＩ（配列番号１７）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＹＩＷＣＰＴＷＲＬ（配列番号１８）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。一実施形態では、ペプチドは、配列ＹＩＷＣＰＴＷＳＬ（配列番号１９）のエピトープを含むかまたはそのエピトープからなる。
【0148】
一実施形態では、ペプチドは、ＫＬＬＧＤＩＮＷＩ（配列番号１）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＦＩＦＴＬＩＡＶＩ（配列番号２）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＲＭＬＴＤＬＲＡＶ（配列番号３）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＦＬＳＬＹＦＶＳＶ（配列番号４）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＴＬＩＡＶＩＭＧＬ（配列番号５）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＹＬＤＱＩＡＴＬＩ（配列番号６）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＦＬＱＡＥＶＡＮＡ（配列番号７）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＷＭＧＤＲＬＭＳＬ（配列番号８）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＡＬＨＳＳＶＱＳＶ（配列番号９）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＩＬＴＥＶＬＫＧＶ（配列番号１０）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＬＭＡＱＡＩＴＧＶ（配列番号１１）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＲＬＳＹＶＨＶＴＶ（配列番号１２）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＶＬＱＤＦＤＱＰＩ（配列番号１３）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＡＬＭＩＶＳＭＶＶ（配列番号１４）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＭＬＬＡＡＬＭＩＶ（配列番号１５）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＹＩＤＤＩＬＣＡＡ（配列番号１６）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＹＩＩＨＹＩＤＤＩ（配列番号１７）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＹＩＷＣＰＴＷＲＬ（配列番号１８）を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ペプチドは、ＹＩＷＣＰＴＷＳＬ（配列番号１９）を含むかまたはそれからなる。
【0149】
上記ペプチドは、標準的な分子生物学的手法によるタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知である任意の手法により作成されてよい。合成ペプチドは一般に、最大で約３５残基長であり、これは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から入手できるもののような、自動ペプチド合成機械のおおよその上限長である。より長いペプチドもまた、例えば組換え手段により、調製され得る。
【0150】
本発明はまた、上記のような１つ以上のペプチド（複数可）の発現を誘導する発現ベクターに関する。本発明はまた、上記のような１つ以上のペプチド（複数可）をコードする核酸配列を含む発現ベクターに関する。
【0151】
本ベクターは特に、ＲＮＡベクター、ＤＮＡベクターまたはプラスミド、ウイルスベクター、または細菌ベクターであり得る。ベクターの性質に応じて、宿主細胞ゲノムへの発現カセットの組み込みがあってよく、または組み込みがないこともあり得、これは当業者には周知のことである。発現ベクターまたは発現カセットはさらに、対象における核酸（ポリヌクレオチド）のｉｎ ｖｉｖｏ発現に必要なエレメントを含んでよい。例えば、これは、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン、およびプロモーター、ならびにプラスミドおよびポックスウイルス以外のウイルスベクターなどの特定のベクターのポリアデニル化配列で構成され得る。ＡＴＧは、読み取りフレームの５’に配置され得、終止コドンは、３’に配置され得る。よく知られているように、エンハンサー配列、安定化配列、およびペプチドの分泌を可能にするシグナル配列などの、発現の制御を可能にする他のエレメントが存在する可能性がある。
【0152】
ＲＮＡベクターに関しては、本ベクターは、例えば、非複製ｍＲＮＡまたはウイルス由来の自己増幅するＲＮＡを使用できる。従来のｍＲＮＡベースのベクターは、目的のペプチドをコードし、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る。自己増幅するＲＮＡは、目的のペプチドのみでなく、細胞内ＲＮＡ増幅および豊富なタンパク質発現を可能にするウイルス複製機構もコードし得る。
【0153】
ウイルスベクターの例としては、これらに限定されないが、レンチウイルスおよびレトロウイルスが挙げられる。
【0154】
一実施形態では、上に記載されるようなペプチドを得る方法は、
－コンピテント宿主細胞中に上述のベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで導入することと：
－ペプチドの発現に好適な条件下で、上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養することと；
－任意により、上記ペプチドを発現するおよび／または分泌する細胞を選択することと；
－発現されたペプチドを回収すること、
を含む。
－コンピテント宿主細胞中に上述のベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで導入することと：
－ペプチドの発現に好適な条件下で、上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養することと；
－任意により、上記ペプチドを発現するおよび／または分泌する細胞を選択することと；
－発現されたペプチドを回収すること、
を含む。
【0155】
本発明はまた、上記のような１つ以上のペプチド（複数可）で治療される対象の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に関する。
【0156】
本発明はまた、上述のように１つ以上の発現ベクター（複数可）で治療される対象の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に関する。
【0157】
本発明はまた、上記のようなペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。
【0158】
本発明はまた、上記のようなペプチドを認識するＴＣＲを発現する改変されたＴ細胞に関する。
【0159】
これらのT細胞を調製するプロセスは、当業者には既知であり、以下のとおりであり得る：（ｉ）ＴＣＲα鎖およびβ鎖を、上述のようにペプチドを認識するＴ細胞から単離し、ベクターに挿入する；（ｉｉ）患者またはドナーの末梢血から単離されたＴ細胞を、所望のＴＣＲαβ配列をコードするように、そのようなベクターで改変する；（ｉｉｉ）これらの改変されたＴ細胞を次に、治療のために十分な数を得るためにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖し、患者に投与する。注目すべきことに、ＴＣＲ配列は、ＴＣＲ親和性の最適化のために改変され得る。
【0160】
本発明はまた、ワクチンとしての使用のための、上述の１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）に関する。
【0161】
本発明はまた、医薬品としての使用のための、上述の１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）に関する。
【0162】
本発明はまた、それを必要とする対象において癌を治療することまたは予防することに使用するための、上に記載された１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）に関する。
【0163】
本発明はまた、それを必要とする対象において癌を治療するまたは予防するための医薬品の製造における、上に記載された１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）の使用に関する。
【0164】
本発明はまた、それを必要とする対象における癌を治療するまたは予防するための方法に関し、本方法は、上記対象における、上に記載される１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）の投与を含む。
【0165】
一実施形態では、上記癌は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、奇形癌、膀胱癌、非小細胞肺癌および小細胞肺癌などの肺癌、頭頸部癌、大腸癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、ならびに他の固形腫瘍および血液悪性腫瘍を含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【0166】
一実施形態では、上記癌は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、非小細胞肺癌および小細胞肺癌などの肺癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、ならびに他の固形腫瘍および血液悪性腫瘍を含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【0167】
一実施形態では、上記癌は、乳癌であり、好ましくはＴＮＢＣである。
【0168】
一実施形態では、上述の１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）は、Ｔ細胞応答などの免疫応答、好ましくは腫瘍関連エピトープに対する免疫応答を誘導する。
【0169】
当業者であれば、腫瘍関連エピトープに対する免疫応答が生じた否かを決定するための様々なアッセイを知っているであろう。ＥＬＩＳＡ、クロム放出アッセイなどの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用する増殖アッセイ、テトラマーアッセイ、およびサイトカイン産生アッセイなどの、様々なＢリンパ球およびＴリンパ球アッセイがよく知られている。
【0170】
したがって、本発明はまた、それを必要とする対象において、免疫応答を誘導するための方法にも関し、本方法は、上記対象における、上で説明した１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）の投与を含む。
【0171】
一実施形態では、上述の１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）は、治療的有効量で投与される。
【0172】
しかし、上に記載される１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）の１日あたりの合計使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることが、理解されるであろう。
【0173】
任意の特定の対象に対する特異的な用量は、治療中の症状および症状の重症度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全身状態、性別、および食事；使用される特定の化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療期間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医療分野でよく知られている同様の要因を含む、様々な要因により異なる。
【0174】
対象への投与における使用のために、１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）は、対象への投与のために配合される。上述の１つ以上のペプチド（複数可）、１つ以上の発現ベクター（複数可）、１つ以上のＣＴＬ（複数可）、または１つ以上の改変されたＴ細胞（複数可）は、非経口的に、吸入スプレーにより、直腸で、経鼻で、または埋め込まれたリザーバーを介して投与されてよい。本明細書で使用される投与という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注射技術または注入技術を含む。
【図面の簡単な説明】
【0175】
【図1】ＣＴＬ応答に関連するＨＥＲＶの汎がん同定を示す図と１つのヒストグラムの組み合わせである。図１Ａ：腫瘍とその正常な対応物（腫瘍周囲組織）中で過剰発現されるＨＥＲＶの総数と、腫瘍周囲正常組織とその腫瘍対応物中で過剰発現されるＨＥＲＶの総数を示すベン図である。少なくとも１つの腫瘍で過剰発現され、いずれの腫瘍周囲組織においても決して過剰発現されないＨＥＲＶは、癌関連であると考えられる。図１Ｂ：ＣＴＬ応答に関連付けられるとしてアノテーションが付けられるＨＥＲＶ（ｃｙｔ－ＨＥＲＶ）の選択基準のベン図である。各ＨＥＲＶは、表現型（ＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞シグネチャ）と機能（細胞溶解活性（グランザイムＢおよびパーフォリン１）またはＩＦＮ－γシグネチャ）基準の両方（ＡおよびＢ）と関連付けられる必要があり、かつ正常な精製されたＴ／ＮＫ細胞では過剰発現されない（ＡおよびＢであるがＣでない）。図１Ｃ：Ａで定義されたＣＴＬ応答基準と癌関連ＨＥＲＶの関連性を示すベン図である。合計１９２個のＨＥＲＶが、ｃｙｔ－ＨＥＲＶとしてアノテーションが付けられている。図１Ｄ：癌のサブタイプごとに、ｃｙｔ－ＨＥＲＶとしてアノテーションが付けられた癌関連ＨＥＲＶの割合。Ｃｙｔ－ＨＥＲＶは、薄い灰色で表される。ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔ細胞応答、Ｃｙｔ－ＨＥＲＶ：癌におけるＣＴＬ応答に関連するＨＥＲＶ：ＴＮＢＣ：トリプルネガティブ乳癌。
【図2】ＧａｇおよびＰｏｌＨＥＲＶ－Ｋ／ＨＭＬ－２から誘導された共通のＨＬＡ－Ａ２エピトープの選択を示す１つのヒストグラム、１つのスキーム、および１つの表の組み合わせである。図２Ａ：ｃｙｔ－ＨＥＲＶ配列からのペプチド選択のフローチャートである。図２Ｂ：１９２個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの中で強力なＨＬＡ－Ａ＊０２結合剤として予測された最も多く共有される上位２５個のペプチドの棒グラフである。選択されたペプチド（Ｐ１～Ｐ６）は、星印が付けられる。図２Ｃ：選択された６つのＨＬＡ－Ａ２エピトープの特徴。９ｍｅｒペプチドを、それらの予測されるＨＬＡ－Ａ＊０２親和性（パーセンタイルランク≦０．５の強力な結合剤を考慮）およびそれらの配列を含むＨＥＲＶの数に応じて選択した。
【図3】保存されたＧａｇおよびＰｏｌＨＥＲＶ－Ｋ／ＨＭＬ－２モチーフに由来する共通のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープがＴＮＢＣで発現されることを示す図と２つのヒストグラムの組み合わせである。図３Ａ：ＴＣＧＡデータベース中の乳癌の各サブタイプで過剰発現されるｃｙｔ－ＨＥＲＶの総数のベン図である。図３Ｂ：ＴＣＧＡ基底サブタイプ、Ｖａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌの独立データベースおよび髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）で過剰発現される５４個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの平均発現を示す。図３Ｃ：Ｒｉｂｏｓｅｑにより分析した乳癌の基底細胞株（Ｈｓ５７８ｔおよびＭＤＡ－ＭＢ－２３１）および管腔Ａ細胞株（ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ）における１８個のペプチド含有ＣＡＨの発現を示す。
【図4】ＨＥＲＶ由来のエピトープが多機能ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示すスキームとプロットの組み合わせである。図４Ａ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏプライミングプロトコルの概略図である。図４Ｂ：１１名のＨＬＡ－Ａ２陽性ＨＤ（ＨＤ１〜ＨＤ１１、１系統につき１名のドナー）由来のＰＢＭＣで得られた結果の概要。図４Ｃ：ＣＤ８＋Ｔ細胞でゲートしたＩＦＮ－γ（左パネル）、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α（中央パネル）、またはＩＦＮ－γおよびＣＤ１０７ａ（右パネル）染色のプロット。ＰＢＭＣを、ペプチド（ここではＰ６、上線）、ペプチドなし（中央線）、またはＣＭＶｐｐ６５ペプチド（下線）で刺激した。
【図5】ＣＤＲループおよびＣＤＲループとペプチドの相互作用の可視化を示す表と図の組み合わせである。図５Ａ： 各ペプチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６）ならびに対応する分離されたＶ、Ｄ、およびＪ対立遺伝子に特異的なトップクローンのＴＣＲαおよびＴＣＲβ ＣＤＲ３配列の生産頻度。図５Ｂ：予測される結合親和性（Ｐｒｅｄｉｃｔ．Δｇ）を、ｋｃａｌ／ｍｏｌで表す。平均値を報告する。星印は、５％レベルで有意な統計検定（Ｗｅｌｃｈ２標本ｔ検定）を示す。図５Ｃ：それらの予測される結合親和性に従う、タンパク質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）で入手可能であり結晶学的データから取得されるモデル化されたＨＥＲＶ特異的ＴＣＲ－ｐＭＨＣおよび参照ＴＣＲ－ｐＭＨＣの複合体のランク付けの図である。ＣＤＲ：相補性決定領域、ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ：主要組織適合性複合体、ｐＭＨＣ：ペプチド－ＭＨＣ、ＴＲＡ：ＴＣＲのアルファ鎖、ＴＲＢ：ＴＣＲのベータ鎖。
【図6】ＨＥＲＶ特異的Ｔ細胞クローンが機能的であり、腫瘍細胞を認識し死滅させることを示すグラフの組み合わせである。図６Ａ：正規化されたＩＦＮ－γ産生の非線形適合として計算されたＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの機能的結合力。Ｎ９－Ｖ１およびＮ９－Ｖ２：ＣＭＶ特異的Ｔ細胞クローン（方法を参照）。ＥＣ５０を、破線とＸ軸の補間により各クローンについて表す。図６Ｂ：細胞死の定量化を、時間の関数（時間、Ｘ軸）におけるベースライン（Ｙ軸）からの蛍光強度の増加として表す。図６Ｃ：４８時間での特異的腫瘍細胞溶解。技術的な三重実験の平均パーセンテージを、各条件についてプロットする（データは、少なくとも２つの独立した実験を表す）。
【0176】
実施例
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。
【0177】
材料および方法
データセット
ＲＮＡ－ｓｅｑデータについて、ｒａｗ ｆａｓｔｑファイルを、Ｖａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．の独立した乳がんデータセットに対するアクセッション番号ＧＳＥ５８１３５（Ｋ．Ｅ．Ｖａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｕｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１４６，２８７－２９７（２０１４））、ソートされたＰＢＭＣデータセットに対するアクセッション番号ＧＳＥ７４２４６（Ｍ．Ｒ．Ｃｏｒｃｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｃｈａｒｔｓ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．４８，１１９３－１２０３（２０１６））、６つのｍＴＥＣサンプルに対するアクセッション番号ＧＳＥ１２７８２５およびＧＳＥ１２７８２６（Ｊ．－Ｄ．Ｌａｒｏｕｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．１２，１－１６（２０２０））で、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）ポータルからアクセスした。ＴＣＧＡ ｐａｎｃａｎｃｅｒ ｒａｗ ｆａｓｔｑファイルを、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄａｔａ Ｃｏｍｍｏｎｓ（ＧＤＣ）ポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌ．ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）からアクセスした。細胞株データを、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ （ＣＣＬＥ）ポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ）からアクセスした。
データセット
ＲＮＡ－ｓｅｑデータについて、ｒａｗ ｆａｓｔｑファイルを、Ｖａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．の独立した乳がんデータセットに対するアクセッション番号ＧＳＥ５８１３５（Ｋ．Ｅ．Ｖａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｕｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１４６，２８７－２９７（２０１４））、ソートされたＰＢＭＣデータセットに対するアクセッション番号ＧＳＥ７４２４６（Ｍ．Ｒ．Ｃｏｒｃｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｃｈａｒｔｓ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．４８，１１９３－１２０３（２０１６））、６つのｍＴＥＣサンプルに対するアクセッション番号ＧＳＥ１２７８２５およびＧＳＥ１２７８２６（Ｊ．－Ｄ．Ｌａｒｏｕｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．１２，１－１６（２０２０））で、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）ポータルからアクセスした。ＴＣＧＡ ｐａｎｃａｎｃｅｒ ｒａｗ ｆａｓｔｑファイルを、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄａｔａ Ｃｏｍｍｏｎｓ（ＧＤＣ）ポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌ．ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）からアクセスした。細胞株データを、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ （ＣＣＬＥ）ポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ）からアクセスした。
【0178】
ＨＥＲＶ発現の定量
ＨＥＲＶ発現を、ＨｅｒｖＱｕａｎｔパイプライン（Ｃ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１２８，４８０４－４８２０（２０１８））を使用して評価した。簡単に説明すると、ＲＮＡｓｅｑリードを、ＳＴＡＲ ｖ２．７．３ａ（Ａ．Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＳＴＡＲ：ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｌｉｇｎｅｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２９，１５－２１（２０１３））を使用して、３，１７３個のＨＥＲＶ配列のアノテーションでコンパイルされたｈｇ１９参照トランスクリプトーム（Ｌ．Ｖａｒｇｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ；ｍｏｓａｉｃ ｆｏｒｍｓ ａｒｅ ｃｏｍｍｏｎ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．１３，７（２０１６））にマッピングした。マルチマップ≦１０およびミスマッチ≦７を、元の刊行物と同様に、可能とした。ＢＡＭ出力を、ＳＡＭｔｏｏｌｓ ｖ１．４（Ｈ．Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１０００ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ，Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ ｆｏｒｍａｔ ａｎｄ ＳＡＭｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２５，２０７８－２０７９（２００９））を使用して、ＨＥＲＶ配列をマップしたリードに対しフィルタにかけ、次いでＳａｌｍｏｎ ｖ０．７．２（Ｒ．Ｐａｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｌｍｏｎ：ｆａｓｔ ａｎｄ ｂｉａｓ－ａｗａｒｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｕａｌ－ｐｈａｓｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４，４１７－４１９（２０１７））を使用して定量化した。生のカウントを、１００万個の合計読み取り数あたりのカウントに正規化し、その後ｌｏｇ２＋１に変換した。
ＨＥＲＶ発現を、ＨｅｒｖＱｕａｎｔパイプライン（Ｃ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１２８，４８０４－４８２０（２０１８））を使用して評価した。簡単に説明すると、ＲＮＡｓｅｑリードを、ＳＴＡＲ ｖ２．７．３ａ（Ａ．Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＳＴＡＲ：ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｌｉｇｎｅｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２９，１５－２１（２０１３））を使用して、３，１７３個のＨＥＲＶ配列のアノテーションでコンパイルされたｈｇ１９参照トランスクリプトーム（Ｌ．Ｖａｒｇｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ；ｍｏｓａｉｃ ｆｏｒｍｓ ａｒｅ ｃｏｍｍｏｎ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．１３，７（２０１６））にマッピングした。マルチマップ≦１０およびミスマッチ≦７を、元の刊行物と同様に、可能とした。ＢＡＭ出力を、ＳＡＭｔｏｏｌｓ ｖ１．４（Ｈ．Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１０００ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ，Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ ｆｏｒｍａｔ ａｎｄ ＳＡＭｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２５，２０７８－２０７９（２００９））を使用して、ＨＥＲＶ配列をマップしたリードに対しフィルタにかけ、次いでＳａｌｍｏｎ ｖ０．７．２（Ｒ．Ｐａｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｌｍｏｎ：ｆａｓｔ ａｎｄ ｂｉａｓ－ａｗａｒｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｕａｌ－ｐｈａｓｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４，４１７－４１９（２０１７））を使用して定量化した。生のカウントを、１００万個の合計読み取り数あたりのカウントに正規化し、その後ｌｏｇ２＋１に変換した。
【0179】
品質チェック／サンプルのフィルタリング
原発性固形腫瘍サンプル（ＴＣＧＡコード０１）のみを含め、３２の異なる癌種から９，７１８個のサンプルを再グループ化し、そのうち９，４９２個が、ＨＥＲＶ発現について分析可能であった。品質チェックは、ＨＥＲＶ分布が大きく偏っていたためＥＳＣＡおよびＳＴＡＤサンプルの完全な除去をもたらし、２９の異なる癌種からの８，８９３個のサンプルの最終的な分析につながった。
原発性固形腫瘍サンプル（ＴＣＧＡコード０１）のみを含め、３２の異なる癌種から９，７１８個のサンプルを再グループ化し、そのうち９，４９２個が、ＨＥＲＶ発現について分析可能であった。品質チェックは、ＨＥＲＶ分布が大きく偏っていたためＥＳＣＡおよびＳＴＡＤサンプルの完全な除去をもたらし、２９の異なる癌種からの８，８９３個のサンプルの最終的な分析につながった。
【0180】
免疫シグネチャおよび遺伝子変化
表現型免疫シグネチャを、Ｘｃｅｌｌ法（Ｄ．Ａｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｘＣｅｌｌ：ｄｉｇｉｔａｌｌｙ ｐｏｒｔｒａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１８，２２０（２０１７））を使用して計算した。ＴＣＧＡ Ｐａｎｃａｎｃｅｒサンプルについて、Ｘｃｅｌｌシグネチャを、Ｘｃｅｌｌ Ｗｅｂサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｘｃｅｌｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｘＣｅｌｌ＿ＴＣＧＡ＿ＲＳＥＭ．ｔｘｔ）から直接ダウンロードした。ＧＳＭ１４０１６４８データセットについて、シグネチャを、データセット全体について計算し、免疫シグネチャを、その後フィルタ処理した。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）シグネチャを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）からのＨＡＬＬＭＡＲＫ＿ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ＿ＧＡＭＭＡ＿ＲＥＳＰＯＮＳＥシグネチャに基づき、単一サンプルの遺伝子セット変異解析（ＧＳＶＡ）（Ｓ．Ｈａｎｚｅｌｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，ＧＳＶＡ：ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎｄ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｄａｔａ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１４，７（２０１３））により計算した。エンリッチメントスコアを、癌種ごとに各サンプルについて計算した。細胞溶解活性（ＣＹＴ＿ｓｃｏｒｅ）を、以前に説明したように、グランザイムＢ（ＧＲＺＢ）とパーフォリン（ＰＲＦ１）の発現の幾何平均として計算した（Ｍ．Ｓ．Ｒｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ．１６０，４８－６１（２０１５））。ＴＣＧＡ Ｐａｎｃａｎｃｅｒ遺伝子変化を、Ｔｈｏｒｓｓｏｎ Ｖ． ｅｔ ａｌ．（Ｖ．Ｔｈｏｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４８，８１２－８３０．ｅ１４（２０１８））から得た。
表現型免疫シグネチャを、Ｘｃｅｌｌ法（Ｄ．Ａｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｘＣｅｌｌ：ｄｉｇｉｔａｌｌｙ ｐｏｒｔｒａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１８，２２０（２０１７））を使用して計算した。ＴＣＧＡ Ｐａｎｃａｎｃｅｒサンプルについて、Ｘｃｅｌｌシグネチャを、Ｘｃｅｌｌ Ｗｅｂサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｘｃｅｌｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｘＣｅｌｌ＿ＴＣＧＡ＿ＲＳＥＭ．ｔｘｔ）から直接ダウンロードした。ＧＳＭ１４０１６４８データセットについて、シグネチャを、データセット全体について計算し、免疫シグネチャを、その後フィルタ処理した。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）シグネチャを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）からのＨＡＬＬＭＡＲＫ＿ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ＿ＧＡＭＭＡ＿ＲＥＳＰＯＮＳＥシグネチャに基づき、単一サンプルの遺伝子セット変異解析（ＧＳＶＡ）（Ｓ．Ｈａｎｚｅｌｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，ＧＳＶＡ：ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎｄ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｄａｔａ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１４，７（２０１３））により計算した。エンリッチメントスコアを、癌種ごとに各サンプルについて計算した。細胞溶解活性（ＣＹＴ＿ｓｃｏｒｅ）を、以前に説明したように、グランザイムＢ（ＧＲＺＢ）とパーフォリン（ＰＲＦ１）の発現の幾何平均として計算した（Ｍ．Ｓ．Ｒｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ．１６０，４８－６１（２０１５））。ＴＣＧＡ Ｐａｎｃａｎｃｅｒ遺伝子変化を、Ｔｈｏｒｓｓｏｎ Ｖ． ｅｔ ａｌ．（Ｖ．Ｔｈｏｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４８，８１２－８３０．ｅ１４（２０１８））から得た。
【0181】
癌関連およびｃｙｔ－ＨＥＲＶアノテーション
癌特異性を定義するために、差次的ＨＥＲＶ発現を、腫瘍サンプルとそれらのそれぞれの正常な腫瘍周囲に一致した組織の間で行った。少なくとも１０個の腫瘍周囲サンプルを用いたＴＣＧＡ試験のみを含めた（ｎ＝１４の異なる癌種）。ＨＥＲＶ発現の差次的解析を、ＴＣＧＡ癌種ごとに個別に実施した。その一致する腫瘍と比較して任意の正常組織中で２倍を超えて発現されるあらゆるＨＥＲＶをフィルタ処理で除き、正常な対応物（腫瘍周囲組織）と比較して少なくとも１つの癌で２倍を超えて過剰発現される残りのＨＥＲを、癌関連であると見なした。
癌特異性を定義するために、差次的ＨＥＲＶ発現を、腫瘍サンプルとそれらのそれぞれの正常な腫瘍周囲に一致した組織の間で行った。少なくとも１０個の腫瘍周囲サンプルを用いたＴＣＧＡ試験のみを含めた（ｎ＝１４の異なる癌種）。ＨＥＲＶ発現の差次的解析を、ＴＣＧＡ癌種ごとに個別に実施した。その一致する腫瘍と比較して任意の正常組織中で２倍を超えて発現されるあらゆるＨＥＲＶをフィルタ処理で除き、正常な対応物（腫瘍周囲組織）と比較して少なくとも１つの癌で２倍を超えて過剰発現される残りのＨＥＲを、癌関連であると見なした。
【0182】
潜在的に免疫原性であるとアノテートされるには、各癌関連ＨＥＲＶは、少なくとも１つの表現型（Ａ）基準および１つの機能性（Ｂ）基準と関連付けられ、かつＴ／ＮＫ細胞により過剰発現されない（Ｃ）必要があった。表現型の基準は、Ｘｃｅｌｌ法により定義されるようなＣＤ４＋Ｔ細胞シグネチャまたはＣＤ８＋Ｔ細胞シグネチャのいずれかとの関連を含んだ。機能基準は、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）およびパーフォリン（ＰＲＦ１）の発現の幾何平均により定義される、ＩＦＮ－γまたは細胞溶解活性のいずれかとの関連を含んだ。正常なＰＢＭＣ発現を、健康なドナーからの選別されたＰＢＭＣの独立したデータセットにおいて評価した（Ｍ．Ｒ．Ｃｏｒｃｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｃｈａｒｔｓ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．４８，１１９３－１２０３（２０１６））。ＨＥＲＶ発現を、ＰＢＭＣの残りに対しＴ細胞およびＮＫ細胞中で独立して比較した。
【0183】
Ｌ１ペナルティ回帰（ＬＡＳＳＯ）
関連性を、ｇｌｍｎｅｔパッケージおよびｃ０６０パッケージを使用するＬａｓｓｏ回帰により計算した（Ｊ．Ｈ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌｓ ｖｉａ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ Ｄｅｓｃｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．３３，１－２２（２０１０），Ｍ．Ｓｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，ｃ０６０：Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｌａｓｓｏ ａｎｄ Ｅｌａｓｔｉｃ－Ｎｅｔ Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ Ｃｏｘ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．６２，１－２２（２０１４））。ガウス分布を、ＣＹＴスコアおよびＩＦＮ－γシグネチャについて考慮し、ポアソン分布を、Ｘｃｅｌｌシグネチャについて考慮した。ＨＥＲＶを、ｌｏｇ２（ＣＰＭ＋１）として分析し、さらなる標準化を必要としない。それぞれの癌種ごとに、モデルを、１０倍の交差検証で見つかった最適なパラメータに基づき構築した。最終モデルで正の係数を有する各ＨＥＲＶ（平均二乗誤差を最小化するラムダパラメーターに基づく）を、変数と関連付けられると見なした。
関連性を、ｇｌｍｎｅｔパッケージおよびｃ０６０パッケージを使用するＬａｓｓｏ回帰により計算した（Ｊ．Ｈ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌｓ ｖｉａ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ Ｄｅｓｃｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．３３，１－２２（２０１０），Ｍ．Ｓｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，ｃ０６０：Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｌａｓｓｏ ａｎｄ Ｅｌａｓｔｉｃ－Ｎｅｔ Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ Ｃｏｘ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．６２，１－２２（２０１４））。ガウス分布を、ＣＹＴスコアおよびＩＦＮ－γシグネチャについて考慮し、ポアソン分布を、Ｘｃｅｌｌシグネチャについて考慮した。ＨＥＲＶを、ｌｏｇ２（ＣＰＭ＋１）として分析し、さらなる標準化を必要としない。それぞれの癌種ごとに、モデルを、１０倍の交差検証で見つかった最適なパラメータに基づき構築した。最終モデルで正の係数を有する各ＨＥＲＶ（平均二乗誤差を最小化するラムダパラメーターに基づく）を、変数と関連付けられると見なした。
【0184】
エピトープスクリーニング
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）検出を、ＥＭＢＯＳＳ ｖ６．６．０．０からのｓｉｘｐａｃｋを使用して行った（Ｆ．Ｍａｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＬ－ＥＢＩ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ＡＰＩｓ ｉｎ ２０１９．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４７，Ｗ６３６－Ｗ６４１（２０１９））。検出された１０個を超えるアミノ酸のＯＲＦを次いで、ＵｎｉＰｒｏｔ（ＵｎｉＰｒｏｔ：ａ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｈｕｂ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４７，Ｄ５０６－Ｄ５１５（２０１９））で参照される既知のＨＭＬ－２（ＨＥＲＶ－Ｋ）Ｇａｇ、Ｐｒｏ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、ＲｅｃおよびＮｐ９タンパク質と整列した。レトロウイルスについて最適なパラメータを有するＢｌａｓｔを使用した（ワードサイズ＝３、構成ベースの統計、「低複雑性領域」フィルターなし）。９０％を超える同一性およびｅ－値＜０．０５を有するＧａｇおよびＰｏｌタンパク質と整列された保存配列を次に、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ ｖ１．３（Ｔ．Ｊ．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ：Ｏｐｅｎ－Ｓｏｕｒｃｅ Ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ．７，１２９－１３２．ｅ４（２０１８））を使用して、予測されるＨＬＡ－Ａ＊０２強力結合剤についてスクリーニングした。ランク＜＝０．５パーセンタイルを有するペプチドを、強力な結合剤であると見なした。ヒトプロテオームを、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ＩＤ：ＵＰ０００００５６４０）でダウンロードして、ペプチド合成およびｉｎ ｖｉｔｒｏ検証の前に一致がないことを検証した。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）検出を、ＥＭＢＯＳＳ ｖ６．６．０．０からのｓｉｘｐａｃｋを使用して行った（Ｆ．Ｍａｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＬ－ＥＢＩ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ＡＰＩｓ ｉｎ ２０１９．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４７，Ｗ６３６－Ｗ６４１（２０１９））。検出された１０個を超えるアミノ酸のＯＲＦを次いで、ＵｎｉＰｒｏｔ（ＵｎｉＰｒｏｔ：ａ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｈｕｂ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４７，Ｄ５０６－Ｄ５１５（２０１９））で参照される既知のＨＭＬ－２（ＨＥＲＶ－Ｋ）Ｇａｇ、Ｐｒｏ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、ＲｅｃおよびＮｐ９タンパク質と整列した。レトロウイルスについて最適なパラメータを有するＢｌａｓｔを使用した（ワードサイズ＝３、構成ベースの統計、「低複雑性領域」フィルターなし）。９０％を超える同一性およびｅ－値＜０．０５を有するＧａｇおよびＰｏｌタンパク質と整列された保存配列を次に、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ ｖ１．３（Ｔ．Ｊ．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ：Ｏｐｅｎ－Ｓｏｕｒｃｅ Ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ．７，１２９－１３２．ｅ４（２０１８））を使用して、予測されるＨＬＡ－Ａ＊０２強力結合剤についてスクリーニングした。ランク＜＝０．５パーセンタイルを有するペプチドを、強力な結合剤であると見なした。ヒトプロテオームを、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ＩＤ：ＵＰ０００００５６４０）でダウンロードして、ペプチド合成およびｉｎ ｖｉｔｒｏ検証の前に一致がないことを検証した。
【0185】
累積発現スコア
π値スコアを、Ｘｉａｏらにより提案された方法（Ｙ．Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｓｃｏｒｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｎｋｉｎｇ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３０，８０１－８０７（２０１４））に従い、発現のｌｏｇ２倍率変化と逆ｐ値のｌｏｇ１０の積として各ＨＥＲＶおよび各組織の比較（ＴＮＢＣ対腫瘍周囲組織）について定義した。累積発現スコアを、エピトープ配列を含むすべてのＨＥＲＶ（ＣＡＨおよび他のＨＥＲＶを含む）のπ値を合計することにより計算した。
π値スコアを、Ｘｉａｏらにより提案された方法（Ｙ．Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｓｃｏｒｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｎｋｉｎｇ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３０，８０１－８０７（２０１４））に従い、発現のｌｏｇ２倍率変化と逆ｐ値のｌｏｇ１０の積として各ＨＥＲＶおよび各組織の比較（ＴＮＢＣ対腫瘍周囲組織）について定義した。累積発現スコアを、エピトープ配列を含むすべてのＨＥＲＶ（ＣＡＨおよび他のＨＥＲＶを含む）のπ値を合計することにより計算した。
【0186】
ペプチドームプロテオームのデータセットの分析
生のＭＳ／ＭＳデータセットを、乳癌研究のためのＣＰＴＡＣ（Ｎ．Ｊ．Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＰＴＡＣ Ｄａｔａ Ｐｏｒｔａｌ：Ａ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１４，２７０７－２７１３（２０１５））からダウンロードした（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｒｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４９０，６１－７０（２０１２）；Ｋ．Ｋｒｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ．１８３，１４３６－１４５６．ｅ３１（２０２０））。取得したＭＳ／ＭＳスペクトルを、ｐｒｏｔｅｏｗｉｚａｒｄからのｍｓｃｏｎｖｅｒｔ（Ｒ．Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ，Ｐ．Ｍａｌｌｉｃｋ，Ｄａｔａ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄ ｍｓＣｏｎｖｅｒｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１５５０，３３９－３６８（２０１７））を使用してＭＧＦ形式に変換した。次に、ペプチドのリストを、Ｐｅｐｑｕｅｒｙ（スタンドアロンバージョン）（ｖ．１．６．２．０）（Ｂ．Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰｅｐＱｕｅｒｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｆａｓｔ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２９，４８５－４９３（２０１９））を使用して分析した。使用したコマンドラインは、ｊａｖａ－Ｘｍｘ１０Ｇ－ｊａｒｐｅｐｑｕｅｒｙ．ｊａｒ－ｆｉｘＭｏｄ６，６２，１０８－ｖａｒＭｏｄ１１７－ｍａｘＶａｒ３－ｃ１－ｔｏｌ１０－ｔｏｌｕｐｐｍ－ｍｉｎＳｃｏｒｅ１２－ｅ１－ｕｍ－ｈｃＴＲＵＥ－ｎ１０００－ｉｔｏｌ０．０５－ｍ１ｃｐｕ１２－ｐｅｐ＄｛ｐｅｐｔｉｄｅｓ＿ｌｉｓｔ｝－ｄｂ＄｛Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｄａｔａｂａｓｅ｝－ｍｓ＄｛ＭＳ＿ｄａｔａｂａｓｅ｝－ｏ＄｛ｏｕｔｐｕｔ＿ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ｝であった。第２のデータセットのために、コマンドラインのｆｉｘｍｏｄおよびｖａｒＭｏｄを、次のように調整した：－ｆｉｘｍｏｄ６，１０３，１５７－ｖａｒＭｏｄ１０１，１１７。
生のＭＳ／ＭＳデータセットを、乳癌研究のためのＣＰＴＡＣ（Ｎ．Ｊ．Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＰＴＡＣ Ｄａｔａ Ｐｏｒｔａｌ：Ａ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１４，２７０７－２７１３（２０１５））からダウンロードした（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｒｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４９０，６１－７０（２０１２）；Ｋ．Ｋｒｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ．１８３，１４３６－１４５６．ｅ３１（２０２０））。取得したＭＳ／ＭＳスペクトルを、ｐｒｏｔｅｏｗｉｚａｒｄからのｍｓｃｏｎｖｅｒｔ（Ｒ．Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ，Ｐ．Ｍａｌｌｉｃｋ，Ｄａｔａ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄ ｍｓＣｏｎｖｅｒｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１５５０，３３９－３６８（２０１７））を使用してＭＧＦ形式に変換した。次に、ペプチドのリストを、Ｐｅｐｑｕｅｒｙ（スタンドアロンバージョン）（ｖ．１．６．２．０）（Ｂ．Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰｅｐＱｕｅｒｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｆａｓｔ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２９，４８５－４９３（２０１９））を使用して分析した。使用したコマンドラインは、ｊａｖａ－Ｘｍｘ１０Ｇ－ｊａｒｐｅｐｑｕｅｒｙ．ｊａｒ－ｆｉｘＭｏｄ６，６２，１０８－ｖａｒＭｏｄ１１７－ｍａｘＶａｒ３－ｃ１－ｔｏｌ１０－ｔｏｌｕｐｐｍ－ｍｉｎＳｃｏｒｅ１２－ｅ１－ｕｍ－ｈｃＴＲＵＥ－ｎ１０００－ｉｔｏｌ０．０５－ｍ１ｃｐｕ１２－ｐｅｐ＄｛ｐｅｐｔｉｄｅｓ＿ｌｉｓｔ｝－ｄｂ＄｛Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｄａｔａｂａｓｅ｝－ｍｓ＄｛ＭＳ＿ｄａｔａｂａｓｅ｝－ｏ＄｛ｏｕｔｐｕｔ＿ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ｝であった。第２のデータセットのために、コマンドラインのｆｉｘｍｏｄおよびｖａｒＭｏｄを、次のように調整した：－ｆｉｘｍｏｄ６，１０３，１５７－ｖａｒＭｏｄ１０１，１１７。
【0187】
Ｒｉｂｏｓｅｑ解析
リボソームプロファイリングデータを、以前に発表された研究（Ｆ．Ｌｏａｙｚａ－Ｐｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｌｉｎｅ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｃｏｄｏｎ ｒｅａｄｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ．５３０，４９０－４９４（２０１６））から得た。生のｆａｓｔｑファイルを、最初の刊行物で記載されるように前処理した。簡単に説明すると、アダプター配列を、パラメータ（－－ｑｕａｌｉｔｙ－ｂａｓｅ＝３３－Ｏ１２－ｍ２０－ｑ５）を用いるｃｕｔａｄａｐｔ１．１を使用して、生データからトリミングし、参照ｈｇ１９－ＨＥＲＶトランスクリプトームにマッピングした。
リボソームプロファイリングデータを、以前に発表された研究（Ｆ．Ｌｏａｙｚａ－Ｐｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｌｉｎｅ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｃｏｄｏｎ ｒｅａｄｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ．５３０，４９０－４９４（２０１６））から得た。生のｆａｓｔｑファイルを、最初の刊行物で記載されるように前処理した。簡単に説明すると、アダプター配列を、パラメータ（－－ｑｕａｌｉｔｙ－ｂａｓｅ＝３３－Ｏ１２－ｍ２０－ｑ５）を用いるｃｕｔａｄａｐｔ１．１を使用して、生データからトリミングし、参照ｈｇ１９－ＨＥＲＶトランスクリプトームにマッピングした。
【0188】
統計分析
すべての分析を、Ｒ統計ソフトウェアバージョン３．６．０を使用して行った。差次的ＨＥＲＶ発現解析を、ＤＥＳＥＱ２ ｖ１．２４．０（Ｍ．Ｉ．Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＤＥＳｅｑ２．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５５０（２０１４））を用いて行い、および対数倍率変化を、ａｐｅｇｌｍパッケージ（Ａ．Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｖｙ－ｔａｉｌｅｄ ｐｒｉｏｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｕｎｔ ｄａｔａ：ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｉｓｅ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３５，２０８４－２０９２（２０１９））により縮小した。
すべての分析を、Ｒ統計ソフトウェアバージョン３．６．０を使用して行った。差次的ＨＥＲＶ発現解析を、ＤＥＳＥＱ２ ｖ１．２４．０（Ｍ．Ｉ．Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＤＥＳｅｑ２．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５５０（２０１４））を用いて行い、および対数倍率変化を、ａｐｅｇｌｍパッケージ（Ａ．Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｖｙ－ｔａｉｌｅｄ ｐｒｉｏｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｕｎｔ ｄａｔａ：ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｉｓｅ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３５，２０８４－２０９２（２０１９））により縮小した。
【0189】
生物学的サンプル
健康ドナーからの血液を、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（Ｌｙｏｎ）から入手した。新鮮なＴＮＢＣ（ｎ＝１１）を、ヘルシンキ宣言に従い、治験審査委員会および倫理委員会（Ｌ－０６－３６およびＬ－１１－２６）からの承認後ならびに患者の書面によるインフォームドコンセント後に、ｔｉｓｓｕｅ ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｅｎｔｒｅ Ｌｅｏｎ Ｂｅｒａｒｄ（ＣＬＢ）（ＢＢ－００３３－０００５０，ＣＲＢ－ＣＬＢ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ；Ｆｒｅｎｃｈ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ－２０１３－１８７１）から得た。
健康ドナーからの血液を、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（Ｌｙｏｎ）から入手した。新鮮なＴＮＢＣ（ｎ＝１１）を、ヘルシンキ宣言に従い、治験審査委員会および倫理委員会（Ｌ－０６－３６およびＬ－１１－２６）からの承認後ならびに患者の書面によるインフォームドコンセント後に、ｔｉｓｓｕｅ ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｅｎｔｒｅ Ｌｅｏｎ Ｂｅｒａｒｄ（ＣＬＢ）（ＢＢ－００３３－０００５０，ＣＲＢ－ＣＬＢ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ；Ｆｒｅｎｃｈ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ－２０１３－１８７１）から得た。
【0190】
ペプチド合成
ペプチドを、ＪＰＴ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＧＥ、ＥＵ）で、ある仕様および９０％を超える純度で合成した。凍結乾燥した粉末を、１％ＤＭＳＯ蒸留水に再懸濁した。
ペプチドを、ＪＰＴ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＧＥ、ＥＵ）で、ある仕様および９０％を超える純度で合成した。凍結乾燥した粉末を、１％ＤＭＳＯ蒸留水に再懸濁した。
【0191】
細胞株
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１基底乳癌上皮細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣカタログ名：ＨＴＢ－２６）から得て、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）１％ペニシリン／ストレプトマイシン１％Ｌ－グルタミン中で培養した。ＨＭＥＣ初代細胞を、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（ＧＥ，ＥＵ）から入手し、乳腺上皮増殖培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，ＧＥ，ＥＵ）中で培養した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１基底乳癌上皮細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣカタログ名：ＨＴＢ－２６）から得て、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）１％ペニシリン／ストレプトマイシン１％Ｌ－グルタミン中で培養した。ＨＭＥＣ初代細胞を、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（ＧＥ，ＥＵ）から入手し、乳腺上皮増殖培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，ＧＥ，ＥＵ）中で培養した。
【0192】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏプライミングアッセイ
ＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心分離（Ｅｕｒｏｂｉｏ，ＦＲ，ＥＵ）により得た。それらを、３７℃で急速解凍し、徹底的に洗浄し、室温または３７℃で一晩放置し、その後それらの生存率を評価した。０．１５ｘ１０６個／ウェルのＰＢＭＣを、０日目に５μｇ／ｍＬ Ｒ－８４８（Ｒｅｓｑｕｉｍｏｄ）、１０μｇ／ｍＬ ＨＭＷポリＩＣ（両方ともＩｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＦＲ，ＥＵ）、２０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮアルデスロイキン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ，ＣＨ，ＥＵ）、および１０μｇ／ｍＬの目的ペプチドを富化したＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）の入った９６ウェルプレートで培養した。３、６、１０日後に、１００μＬの培地を、新鮮な富化培地（６日目はＩＬ－２およびペプチドのみ、１０日目はＩＬ－２のみ）に交換し、必要に応じて分割した。１２日目に細胞を、採取し分析のためにカウントした。
ＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心分離（Ｅｕｒｏｂｉｏ，ＦＲ，ＥＵ）により得た。それらを、３７℃で急速解凍し、徹底的に洗浄し、室温または３７℃で一晩放置し、その後それらの生存率を評価した。０．１５ｘ１０６個／ウェルのＰＢＭＣを、０日目に５μｇ／ｍＬ Ｒ－８４８（Ｒｅｓｑｕｉｍｏｄ）、１０μｇ／ｍＬ ＨＭＷポリＩＣ（両方ともＩｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＦＲ，ＥＵ）、２０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮアルデスロイキン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ，ＣＨ，ＥＵ）、および１０μｇ／ｍＬの目的ペプチドを富化したＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）の入った９６ウェルプレートで培養した。３、６、１０日後に、１００μＬの培地を、新鮮な富化培地（６日目はＩＬ－２およびペプチドのみ、１０日目はＩＬ－２のみ）に交換し、必要に応じて分割した。１２日目に細胞を、採取し分析のためにカウントした。
【0193】
フィーディングプロトコル
デキストラマーにより単一細胞選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０：１の比率での３５Ｇｙ照射された同種ＰＢＭＣとＢリンパ芽球細胞株から成るフィーダー上で拡張した。フィーダー細胞を、ＰＨＡ－Ｌ１．５μｇ／ｍＬ（ＭｅｒｃｋＫｇＡａ，ＧＥ，ＥＵ）およびＩＬ－２１５０ＩＵ／ｍＬ（ＮｏｖａｒｔｉｓＰｈａｒｍａ，ＣＨ，ＥＵ）を含むＲＰＭＩ５％ヒト血清中で、０．１０ｘ１０６細胞／ウェルの濃度で、９６ウェル丸底プレートにプレーティングし、最大で５ｘ１０３個の選別された細胞を、ウェルあたり添加した。細胞を、１４日間培養し、培地を、必要に応じて新鮮なＩＬ－２富化ＲＰＭＩ５％ヒト血清と交換した。このプロセスを、必要に応じて繰り返した。
デキストラマーにより単一細胞選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０：１の比率での３５Ｇｙ照射された同種ＰＢＭＣとＢリンパ芽球細胞株から成るフィーダー上で拡張した。フィーダー細胞を、ＰＨＡ－Ｌ１．５μｇ／ｍＬ（ＭｅｒｃｋＫｇＡａ，ＧＥ，ＥＵ）およびＩＬ－２１５０ＩＵ／ｍＬ（ＮｏｖａｒｔｉｓＰｈａｒｍａ，ＣＨ，ＥＵ）を含むＲＰＭＩ５％ヒト血清中で、０．１０ｘ１０６細胞／ウェルの濃度で、９６ウェル丸底プレートにプレーティングし、最大で５ｘ１０３個の選別された細胞を、ウェルあたり添加した。細胞を、１４日間培養し、培地を、必要に応じて新鮮なＩＬ－２富化ＲＰＭＩ５％ヒト血清と交換した。このプロセスを、必要に応じて繰り返した。
【0194】
ＴＣＲ免疫シーケンシング
特定のＣＤ８＋Ｔ細胞および対応するバルクＰＢＭＣからのＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ，ＧＥ，ＥＵ）を使用して抽出し、ＴＣＲ調査および詳細な分析のためにＡｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＷＡ，ＵＳ）に送った。
特定のＣＤ８＋Ｔ細胞および対応するバルクＰＢＭＣからのＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ，ＧＥ，ＥＵ）を使用して抽出し、ＴＣＲ調査および詳細な分析のためにＡｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＷＡ，ＵＳ）に送った。
【0195】
３Ｄモデルの生成および精緻化
各Ｔ細胞クローンのアルファ鎖およびベータ鎖の両方の完全なＴＣＲ配列を、以前に公開されたように（Ａ．Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＰＤ－１＋ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２９，４９９２－５００４（２０１９））免疫シーケンシングの結果から再構築した。可変ドメインについて、ＴＲＡおよびＴＲＢ ＣＤＲ３ヌクレオチド配列を、免疫シーケンシングから取得し（図５Ａ）、ＴＲＡＶ領域およびＴＲＢＶ領域の５’末端および３’末端を、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）オンラインデータベースから得た。可変ドメインの３’にＴＲＡおよびＴＲＢのヒト定常ドメインを、全長ＴＣＲを再構成するために追加した。これらの完全長ＴＣＲ配列を、ＭＨＣおよびペプチド配列とともに、テンプレートベースのモデリングを使用してＴＣＲ－ｐＭＨＣ複合体の自動構造モデリング用に特別に開発された、ＣＢＳ ＴＣＲｐＭＨＣｍｏｄｅｌｓ－１．０ ｗｅｂサーバー（Ｋ．Ｋ．Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＴＣＲｐＭＨＣｍｏｄｅｌｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＴＣＲ－ｐＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．９，１４５３０（２０１９））に提出した。ＴＣＲ残基を、標準化された手順（Ｋ．Ｒ．Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｋａｂａｔ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｃｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５，３８３２－３８３９ （２００８）；Ｍ．Ｓ．Ｋｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＬＹＲＡ， ａ ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３，Ｗ３４９－３５５（２０１５））を用いて、再度ナンバリングする。Ｗｅｂサーバーにより生成された初期モデルをさらに、Ｂｏｂｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ（Ｓ．Ｂｏｂｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ｎｅｏ－ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ－ｎａｉｖｅ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．９，１－１０（２０１８））から適応されたプロトコルを使用して、４ラウンドで精緻化した。簡潔に言えば、ＣＤＲループを、Ｍｏｄｅｌｌｅｒソフトウェアバージョン９．２５（Ａ．Ｆｉｓｅｒ，Ａ．Ｓａｌｉ，Ｍｏｄｅｌｌｅｒ：ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７４，４６１－４９１（２００３）；Ａ．Ｓａｌｉ，Ｔ．Ｌ．Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｂｙ ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３４，７７９－８１５（１９９３））を使用してペアごとに精緻化し：ラウンド１でＣＤＲループα１／α２、ラウンド２でα１／α３、ラウンド３でβ１／β２、ラウンド４でβ１／β３であった。初期モデル中のコイル構造の残基のみを、精緻化した。各ラウンドで、５００個のモデルを生成し、Ｍｏｄｅｌｌｅｒの内部ＤＯＰＥスコアに基づき最も良いモデルを選択し、次のラウンドのインプットとして使用した。
各Ｔ細胞クローンのアルファ鎖およびベータ鎖の両方の完全なＴＣＲ配列を、以前に公開されたように（Ａ．Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＰＤ－１＋ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２９，４９９２－５００４（２０１９））免疫シーケンシングの結果から再構築した。可変ドメインについて、ＴＲＡおよびＴＲＢ ＣＤＲ３ヌクレオチド配列を、免疫シーケンシングから取得し（図５Ａ）、ＴＲＡＶ領域およびＴＲＢＶ領域の５’末端および３’末端を、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）オンラインデータベースから得た。可変ドメインの３’にＴＲＡおよびＴＲＢのヒト定常ドメインを、全長ＴＣＲを再構成するために追加した。これらの完全長ＴＣＲ配列を、ＭＨＣおよびペプチド配列とともに、テンプレートベースのモデリングを使用してＴＣＲ－ｐＭＨＣ複合体の自動構造モデリング用に特別に開発された、ＣＢＳ ＴＣＲｐＭＨＣｍｏｄｅｌｓ－１．０ ｗｅｂサーバー（Ｋ．Ｋ．Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＴＣＲｐＭＨＣｍｏｄｅｌｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＴＣＲ－ｐＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．９，１４５３０（２０１９））に提出した。ＴＣＲ残基を、標準化された手順（Ｋ．Ｒ．Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｋａｂａｔ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｃｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５，３８３２－３８３９ （２００８）；Ｍ．Ｓ．Ｋｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＬＹＲＡ， ａ ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３，Ｗ３４９－３５５（２０１５））を用いて、再度ナンバリングする。Ｗｅｂサーバーにより生成された初期モデルをさらに、Ｂｏｂｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ（Ｓ．Ｂｏｂｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ｎｅｏ－ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ－ｎａｉｖｅ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．９，１－１０（２０１８））から適応されたプロトコルを使用して、４ラウンドで精緻化した。簡潔に言えば、ＣＤＲループを、Ｍｏｄｅｌｌｅｒソフトウェアバージョン９．２５（Ａ．Ｆｉｓｅｒ，Ａ．Ｓａｌｉ，Ｍｏｄｅｌｌｅｒ：ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７４，４６１－４９１（２００３）；Ａ．Ｓａｌｉ，Ｔ．Ｌ．Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｂｙ ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３４，７７９－８１５（１９９３））を使用してペアごとに精緻化し：ラウンド１でＣＤＲループα１／α２、ラウンド２でα１／α３、ラウンド３でβ１／β２、ラウンド４でβ１／β３であった。初期モデル中のコイル構造の残基のみを、精緻化した。各ラウンドで、５００個のモデルを生成し、Ｍｏｄｅｌｌｅｒの内部ＤＯＰＥスコアに基づき最も良いモデルを選択し、次のラウンドのインプットとして使用した。
【0196】
４ラウンドの最後に、代表的なモデルを、次のように重み付けされない接触のコンセンサスに基づき、選択した。ＴＣＲ－ｐＭＨＣ界面での残基間の接触（重原子間の５オングストローム未満の距離により定義される）を、各精緻化ラウンドの最高のＤＯＰＥスコアを有する４＊２５モデルのセットでカウントした。次に、最終ラウンドで最高のＤＯＰＥスコアを有する２５のモデルの中で、非正規化ＣＯＮＳＲＡＮＫスコア（Ｇ．Ｌａｕｎａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＯＮＳＲＡＮＫ－Ｌｉｋｅ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｃｏｒｉｎｇ Ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｏｃｋｉｎｇ Ｐｏｓｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ．７，５５９００５（２０２０）；Ｒ．Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｎｋｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒ－ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｔａｃｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．８１，１５７１－１５８４（２０１３））と呼ばれる、頻発する接触の最も多い数を有するモデルを、代表モデルとして選出する。
【0197】
ＴＣＲとｐＭＨＣの潜在的な安定化相互作用の定量的な見解を、各精緻化ラウンドの最高ＤＯＰＥスコアを有する４＊２５モデルのセットで観察された残基間接触の頻度により得る。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方のＣＤＲ１ループおよびＣＤＲ３ループは、ＭＨＣおよびペプチドの両方と相互作用する一方で、ＣＤＲ２ループは、主にＭＨＣ分子と相互作用する。
【0198】
３Ｄ構造解析
異なる複合体の代表モデル間の構造的類似性を、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｅ．Ｆ．Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ－－ａ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ．２５，１６０５–１６１２（２００４））によりコンピューターで計算されたバックボーンＣＤＲループ間のＲＭＳＤにより評価した。予想どおり、構造のばらつきは、ＣＤＲβ３ループ内で最も高かった。ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａをまた、水素結合および疎水性接触の検出ならびに構造の可視化に使用した。
異なる複合体の代表モデル間の構造的類似性を、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｅ．Ｆ．Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ－－ａ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ．２５，１６０５–１６１２（２００４））によりコンピューターで計算されたバックボーンＣＤＲループ間のＲＭＳＤにより評価した。予想どおり、構造のばらつきは、ＣＤＲβ３ループ内で最も高かった。ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａをまた、水素結合および疎水性接触の検出ならびに構造の可視化に使用した。
【0199】
結合親和性の予測
結合親和性を、界面での接触の数および種類に基づく線形モデルを使用するｐｒｏｄｉｇｙ法（Ａ．Ｖａｎｇｏｎｅ，Ａ．Ｍ．Ｂｏｎｖｉｎ，Ｃｏｎｔａｃｔｓ－ｂａｓｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｅｌｉｆｅ．４，ｅ０７４５４（２０１５））を使用して予測した。各複合体について、代表的なモデルに対し１つの予測を実行する代わりに、精緻化プロトコルの第４ラウンドで得られた最高のＤＯＰＥスコアを有する２５のモデルについて得られた予測を平均した。
結合親和性を、界面での接触の数および種類に基づく線形モデルを使用するｐｒｏｄｉｇｙ法（Ａ．Ｖａｎｇｏｎｅ，Ａ．Ｍ．Ｂｏｎｖｉｎ，Ｃｏｎｔａｃｔｓ－ｂａｓｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｅｌｉｆｅ．４，ｅ０７４５４（２０１５））を使用して予測した。各複合体について、代表的なモデルに対し１つの予測を実行する代わりに、精緻化プロトコルの第４ラウンドで得られた最高のＤＯＰＥスコアを有する２５のモデルについて得られた予測を平均した。
【0200】
Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔ
ＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）中で１０：１の比率にてＰＢＭＣまたはＣＤ８＋Ｔ細胞と、ペプチドをパルスしたまたはパルスしないＴ２細胞を、３７℃、９％ＣＯ２で２４時間共培養した後、ＩＦＮ－γＡＦ４８８およびＧｒｚ－ｂＣＴＬ－ｒｅｄを使用するダブルカラーＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ（ＣＴＬＧｍｂＨ，ＣＡ，ＵＳ）を、製造業者の指示に従い実施した。レベレーションプレート（Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ６ ＵＬＴＩＭＡＴＥ ＵＶイメージアナライザーで読み取り、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）分析ソフトウェアにより分析した。
ＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）中で１０：１の比率にてＰＢＭＣまたはＣＤ８＋Ｔ細胞と、ペプチドをパルスしたまたはパルスしないＴ２細胞を、３７℃、９％ＣＯ２で２４時間共培養した後、ＩＦＮ－γＡＦ４８８およびＧｒｚ－ｂＣＴＬ－ｒｅｄを使用するダブルカラーＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ（ＣＴＬＧｍｂＨ，ＣＡ，ＵＳ）を、製造業者の指示に従い実施した。レベレーションプレート（Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ６ ＵＬＴＩＭＡＴＥ ＵＶイメージアナライザーで読み取り、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）分析ソフトウェアにより分析した。
【0201】
機能的結合力
選択したペプチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ６）に対し、デキストラマーにより単離された特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＲ，ＥＵ）による機能的結合性ＩＦＮ－γ産生試験において使用した。免疫優勢エピトープＮ９Ｖ（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）に特異的な２つのＣＭＶＴ細胞クローンを、使用した。Ｎ９Ｖ－１は、ｐｐ６５デキストラマーにより選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対応し、Ｎ９Ｖ－２は、Ｄｒ Ｈｅｎｒｉ Ｖｉｅから好意で提供されたＣＤ８＋Ｔ細胞クローンである。特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の機能的結合力を、５時間パルスされたＴ２細胞に１０－４～１０－９Ｍ（ｌｏｇ）の限界ペプチド希釈を実施することにより評価した。洗浄後、ペプチドパルスされたＴ２細胞を、５％のヒト血清を補充したＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）中で、１：１の比率で特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。１８時間後に、上清を収集し、ＥＬＩＳＡを実施した。最大サイトカイン応答の半値（ＥＣ５０）を達成するために必要なペプチド濃度を、決定した（Ｗｉｎｄｏｗｓ用のｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍバージョン６．０を、５０％ＥＣ（ＥＣ５０）の決定のために使用した、Ｒ＞０．９８）。
選択したペプチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ６）に対し、デキストラマーにより単離された特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＦＲ，ＥＵ）による機能的結合性ＩＦＮ－γ産生試験において使用した。免疫優勢エピトープＮ９Ｖ（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）に特異的な２つのＣＭＶＴ細胞クローンを、使用した。Ｎ９Ｖ－１は、ｐｐ６５デキストラマーにより選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対応し、Ｎ９Ｖ－２は、Ｄｒ Ｈｅｎｒｉ Ｖｉｅから好意で提供されたＣＤ８＋Ｔ細胞クローンである。特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の機能的結合力を、５時間パルスされたＴ２細胞に１０－４～１０－９Ｍ（ｌｏｇ）の限界ペプチド希釈を実施することにより評価した。洗浄後、ペプチドパルスされたＴ２細胞を、５％のヒト血清を補充したＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）中で、１：１の比率で特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。１８時間後に、上清を収集し、ＥＬＩＳＡを実施した。最大サイトカイン応答の半値（ＥＣ５０）を達成するために必要なペプチド濃度を、決定した（Ｗｉｎｄｏｗｓ用のｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍバージョン６．０を、５０％ＥＣ（ＥＣ５０）の決定のために使用した、Ｒ＞０．９８）。
【0202】
ＭＳによるエピトープの検証および定量化
ＭＳによるエピトープの検証および定量化を、さらに変更を加えて前述の方法（Ｊ．Ｄｏｕｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＲＡＳ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，ｅａｂｄ５５１５ （２０２１））に従いＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）により実施した。簡潔に説明すると、合計３億個の細胞を溶解し、ペプチド－ＨＬＡ複合体を、抗ヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体クローンＷ６／３２（Ｂｉｏ－Ｘ－Ｃｅｌｌ）をあらかじめロードした自己充填Ｖａｌｉｄ－ＮＥＯネオ抗原濃縮カラムを使用して免疫沈降させた。溶出、解離、濾過、および浄化の後で、ペプチドを、さらなる分析の前に凍結乾燥した。各エピトープペプチドについての遷移パラメータを、Ｖａｌｉｄ－ＮＥＯメソッドビルダーバイオインフォマティクスパイプライン（Ｖａｌｉｄ－ＮＥＯｍｅｔｈｏｄ ｂｕｉｌｄｅｒ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅ）により検査し、キュレートして、不純物との共溶出による過剰なノイズを含むイオンを除外し、かつ重要なイオンの再帰最適化による検出可能性を高めた。細胞表面に存在するペプチドの絶対コピー数を、重同位体標識ペプチドを使用する定量化に基づき計算した。ＭＳデータは、ＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅにより保管されており、識別子ＰＡＳＳ０１６９８によりアクセス可能である。
ＭＳによるエピトープの検証および定量化を、さらに変更を加えて前述の方法（Ｊ．Ｄｏｕｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＲＡＳ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，ｅａｂｄ５５１５ （２０２１））に従いＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）により実施した。簡潔に説明すると、合計３億個の細胞を溶解し、ペプチド－ＨＬＡ複合体を、抗ヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体クローンＷ６／３２（Ｂｉｏ－Ｘ－Ｃｅｌｌ）をあらかじめロードした自己充填Ｖａｌｉｄ－ＮＥＯネオ抗原濃縮カラムを使用して免疫沈降させた。溶出、解離、濾過、および浄化の後で、ペプチドを、さらなる分析の前に凍結乾燥した。各エピトープペプチドについての遷移パラメータを、Ｖａｌｉｄ－ＮＥＯメソッドビルダーバイオインフォマティクスパイプライン（Ｖａｌｉｄ－ＮＥＯｍｅｔｈｏｄ ｂｕｉｌｄｅｒ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅ）により検査し、キュレートして、不純物との共溶出による過剰なノイズを含むイオンを除外し、かつ重要なイオンの再帰最適化による検出可能性を高めた。細胞表面に存在するペプチドの絶対コピー数を、重同位体標識ペプチドを使用する定量化に基づき計算した。ＭＳデータは、ＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅにより保管されており、識別子ＰＡＳＳ０１６９８によりアクセス可能である。
【0203】
ライブイメージング
細胞を、１０％ＳＶＦ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＦＲ、ＥＵ）培地にプレーティングした。ＩｎｃｕＣｙｔｅ分析のために、培地を、一晩細胞を接着させた後９６ウェルプレートから除去した。ブロッキングＨＬＡ－Ａ２抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ，クローンＢＢ７．２，ＧＴＸ７５８０６，ＣＡ，ＵＳ）を、条件に従い、１時間ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）に添加した。Ｔ細胞を次に、細胞死の定量化のために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｃｙｔｏｔｏｘ染料（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ，ＥＵ）の存在下でエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比２：１で添加した。４８時間のライブイメージングを、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍにより３７℃、５％ＣＯ２で行った。細胞死を、ベースラインでカウントされた染色細胞の数で補正された、カウントされた染色細胞の総数として計算した。最大の死滅を、ＤＭＳＯを使用して確立した。特異的溶解を、次式に従い計算した：
特異的溶解％＝（（（ＨＥＲＶ特異的Ｔ細胞が誘導した標的細胞死－自発的な標的細胞死）－（非特異的デキストラマー陰性Ｔ細胞が誘導した標的細胞死－自発的な標的細胞死））／（ＤＭＳＯが誘導した標的細胞死－自発的な標的細胞死））×１００
細胞を、１０％ＳＶＦ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＦＲ、ＥＵ）培地にプレーティングした。ＩｎｃｕＣｙｔｅ分析のために、培地を、一晩細胞を接着させた後９６ウェルプレートから除去した。ブロッキングＨＬＡ－Ａ２抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ，クローンＢＢ７．２，ＧＴＸ７５８０６，ＣＡ，ＵＳ）を、条件に従い、１時間ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＦＲ，ＥＵ）に添加した。Ｔ細胞を次に、細胞死の定量化のために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｃｙｔｏｔｏｘ染料（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ，ＥＵ）の存在下でエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比２：１で添加した。４８時間のライブイメージングを、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍにより３７℃、５％ＣＯ２で行った。細胞死を、ベースラインでカウントされた染色細胞の数で補正された、カウントされた染色細胞の総数として計算した。最大の死滅を、ＤＭＳＯを使用して確立した。特異的溶解を、次式に従い計算した：
特異的溶解％＝（（（ＨＥＲＶ特異的Ｔ細胞が誘導した標的細胞死－自発的な標的細胞死）－（非特異的デキストラマー陰性Ｔ細胞が誘導した標的細胞死－自発的な標的細胞死））／（ＤＭＳＯが誘導した標的細胞死－自発的な標的細胞死））×１００
【0204】
Ｎａｎｏｌｉｖｅイメージングのために、Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ１０：１で追加し、位相イメージングを、Ｎａｎｏｌｉｖｅ顕微鏡３Ｄ細胞エクスプローラーを使用して１分ごとに実施した。
【0205】
腫瘍の解裂：オルガノイドおよびＴＩＬの増殖
腫瘍組織を、約１ｍｍ３の断片に切断し、２０％ＳＶＦ富化ＲＰＭＩ中でコラーゲナーゼＩＶおよびＤＮＡｓｅにより４５分間寸裂した。腫瘍溶解物を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５％ヒト血清富化ＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、カウントし、１：４のビーズ対細胞の比率で１００ＩＵ／ｍＬにて抗ＣＤ３抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｇｉｂｃｏ，ＥＵ）およびＩＬ－２と共に、平底９６ウェルプレートに５ｘ１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。
腫瘍組織を、約１ｍｍ３の断片に切断し、２０％ＳＶＦ富化ＲＰＭＩ中でコラーゲナーゼＩＶおよびＤＮＡｓｅにより４５分間寸裂した。腫瘍溶解物を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５％ヒト血清富化ＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、カウントし、１：４のビーズ対細胞の比率で１００ＩＵ／ｍＬにて抗ＣＤ３抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｇｉｂｃｏ，ＥＵ）およびＩＬ－２と共に、平底９６ウェルプレートに５ｘ１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。
【0206】
オルガノイドの場合、腫瘍溶解物の一部（３００万～１，０００万個の細胞）を、１０ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁した。細胞を、５００ｒｃｆで１０秒間遠心分離し、その後全培地に再懸濁した。このプロトコルを、開始時の細胞数に応じて３～５回繰り返して、細胞懸濁液の上皮細胞を濃縮した。これらの細胞を次いで、Ｄｒｅｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．により以前に説明されたプロトコル（Ｅ．Ｄｒｉｅｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ－ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１５，３３８０－３４０９（２０２０））に従い培養した。
【0207】
マルチパラメトリックフローサイトメトリー
Ｔ細胞を、カウントし、５：１の比率で同族ペプチドをロードしたＴ２細胞とまたはロードしないＴ２細胞と共培養した。１時間後に、ＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ、クローンＨ４Ａ３）を、ゴルジプラグ（１／１０００）（１０μｇ／ｍＬ、ＢＤ、ＦＲ、ＥＵ）と共に各ウェルに添加した。５時間後に、生細胞染色、表面染色および細胞内染色を、実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるサイトカイン発現を評価するために、製造業者の指示に従い、ＦｏｘＰ３固定および透過処理用キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳ）による細胞内染色を用いた。
Ｔ細胞を、カウントし、５：１の比率で同族ペプチドをロードしたＴ２細胞とまたはロードしないＴ２細胞と共培養した。１時間後に、ＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ、クローンＨ４Ａ３）を、ゴルジプラグ（１／１０００）（１０μｇ／ｍＬ、ＢＤ、ＦＲ、ＥＵ）と共に各ウェルに添加した。５時間後に、生細胞染色、表面染色および細胞内染色を、実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるサイトカイン発現を評価するために、製造業者の指示に従い、ＦｏｘＰ３固定および透過処理用キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳ）による細胞内染色を用いた。
【0208】
デキストラマー染色を、１２日間の培養（プライミングプロトコル）後のＰＢＭＣに対しまたは腫瘍の寸裂後１４日間増殖させたＴＩＬに対して実施した。細胞を、２ｍＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋２ｍＭＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｅｒｉｃｈ，ＭＩ，ＵＳ））で洗浄し、生細胞および表面マーカー染色の前に、室温でデキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ ＡｐＳ，ＤＫ，ＥＵ）で１０分間染色した。洗浄を、非特異的デキストラマー染色を回避するために２回行った。ＣＭＶ ｐｐ６５ ＮＬＶＰＭＶＡＴＶを、陽性対照として使用した。ＴＩＬ分析のために、非天然の無関係なペプチド（ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ）と複合体化したデキストラマーを、陰性対照として使用した。
【0209】
すべてのサンプルを、試験全体を通じて保存された設定で、ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＦＲ，ＥＵ）で分析した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ ｖ１０．４，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
【0210】
結果
機械学習ベースのアプローチは、ＣＴＬ応答に関連するＨＥＲＶの同定を可能にする
エピトープ検出を最適化するために、ＨＥＲＶにアノテーションを付ける新規パイプラインを開発した。このために、複数のＨＥＲＶデータベースを調査し、ほとんどが完全なプロウイルス配列で構成され、そのため翻訳されたペプチドを含むより高い可能性を有する３，１７３個のＨＥＲＶの最新でかつ完全なリファレンスを選択した。ＨｅｒｖＱｕａｎｔを使用して、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の汎がんＲＮＡｓｅｑデータベースから２９の異なる癌種からの８，８９３個の原発腫瘍サンプル中でのＨＥＲＶ発現を評価した。少なくとも１０個の一致する腫瘍周囲サンプルを有する癌（ｎ＝１４）を選択して、腫瘍中で高度に発現され正常組織中で発現されないＨＥＲＶ（癌関連ＨＥＲＶまたはＣＡＨ）をフィルタにかけた。差次的ＨＥＲＶ発現解析は、１，１３４個のＣＡＨ候補を明らかにした（図１Ａ）。検査する候補の数を減少させるために、次に第２のフィルターを適用して、ＣＡＨの中でＣＴＬ応答に関連するＨＥＲＶ（ｃｙｔ－ＨＥＲＶ）のみを保持した。Ｃｙｔ－ＨＥＲＶのアノテーションは、２つの包含基準、すなわち各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞の表現型（Ａ）および機能（Ｂ）シグネチャとの関連性、ならびに１つの除外基準、すなわち精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞によるその発現（Ｃ）に基づいた（ＡおよびＢでありＣでない）（図１Ｂ）。偽陽性の関連性のリスクを低下させ、ＨＥＲＶ発現との高い共線性を制御するために、これらの関連性を、Ｌ１ペナルティ回帰（Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ Ｌａｓｓｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．５８，２６７－２８８（１９９６））により算出して、癌のサブタイプを制御しながら、ＣＴＬ応答と高い関連性のあるＨＥＲＶのみを保持した。機械学習ベースのアプローチを使用して、それぞれの癌種ごとにその関連性を個別に検査して（詳細については方法を参照）、１９２個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの最終的な同定に至った（図１Ｃ）。サブ癌解析は、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、および肺腺癌（ＬＵＡＤ）が、ｃｙｔ－ＨＥＲＶの総数が最も多い上位５つの癌（図１Ｄ）であることを明らかにした。
機械学習ベースのアプローチは、ＣＴＬ応答に関連するＨＥＲＶの同定を可能にする
エピトープ検出を最適化するために、ＨＥＲＶにアノテーションを付ける新規パイプラインを開発した。このために、複数のＨＥＲＶデータベースを調査し、ほとんどが完全なプロウイルス配列で構成され、そのため翻訳されたペプチドを含むより高い可能性を有する３，１７３個のＨＥＲＶの最新でかつ完全なリファレンスを選択した。ＨｅｒｖＱｕａｎｔを使用して、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の汎がんＲＮＡｓｅｑデータベースから２９の異なる癌種からの８，８９３個の原発腫瘍サンプル中でのＨＥＲＶ発現を評価した。少なくとも１０個の一致する腫瘍周囲サンプルを有する癌（ｎ＝１４）を選択して、腫瘍中で高度に発現され正常組織中で発現されないＨＥＲＶ（癌関連ＨＥＲＶまたはＣＡＨ）をフィルタにかけた。差次的ＨＥＲＶ発現解析は、１，１３４個のＣＡＨ候補を明らかにした（図１Ａ）。検査する候補の数を減少させるために、次に第２のフィルターを適用して、ＣＡＨの中でＣＴＬ応答に関連するＨＥＲＶ（ｃｙｔ－ＨＥＲＶ）のみを保持した。Ｃｙｔ－ＨＥＲＶのアノテーションは、２つの包含基準、すなわち各ＨＥＲＶと少なくとも１つのＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞の表現型（Ａ）および機能（Ｂ）シグネチャとの関連性、ならびに１つの除外基準、すなわち精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞によるその発現（Ｃ）に基づいた（ＡおよびＢでありＣでない）（図１Ｂ）。偽陽性の関連性のリスクを低下させ、ＨＥＲＶ発現との高い共線性を制御するために、これらの関連性を、Ｌ１ペナルティ回帰（Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ Ｌａｓｓｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．５８，２６７－２８８（１９９６））により算出して、癌のサブタイプを制御しながら、ＣＴＬ応答と高い関連性のあるＨＥＲＶのみを保持した。機械学習ベースのアプローチを使用して、それぞれの癌種ごとにその関連性を個別に検査して（詳細については方法を参照）、１９２個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの最終的な同定に至った（図１Ｃ）。サブ癌解析は、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、および肺腺癌（ＬＵＡＤ）が、ｃｙｔ－ＨＥＲＶの総数が最も多い上位５つの癌（図１Ｄ）であることを明らかにした。
【0211】
全体として、ｃｙｔ－ＨＥＲＶは、ＣＡＨ全体の約１５％を占め、潜在的な候補の数が大幅に減少した。最も共有されるｃｙｔ－ＨＥＲＶのうち、１１個は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導すると以前に報告された３つのＨＥＲＶ（ｈｅｒｖ＿２２５６、ｈｅｒｖ＿６０６９、ｈｅｒｖ＿４７００）を含む、１０種以上の癌種で過剰発現された。ＴＣＧＡ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ４５０ｋメチル化データからの１０の最も近い周辺プローブの平均ベータ値の分析は、メチル化（ｎ＝１５）よりも局所的な脱メチル化（ｎ＝３７）と顕著に相関するより多くのｃｙｔ－ＨＥＲＶを明らかにし、これらのＨＥＲＶの部分的なエピジェネティック制御を示唆する。
【0212】
ｃｙｔ－ＨＥＲＶ間で保存されたＧａｇおよびＰｏｌ ＨＥＲＶ－Ｋ／ＨＭＬ－２モチーフの選択は、共通のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの同定につながる
次に、最も一般的なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子であるＨＬＡ－Ａ２に焦点を合わせ、これらのｃｙｔ－ＨＥＲＶ間で共通のＴ細胞エピトープの存在を評価した。１９２個のｃｙｔ－ＨＥＲＶ配列を６つの可能なフレームに翻訳し、少なくとも１０個のアミノ酸の予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を保持した。偽陽性（非翻訳配列）の数を減少させるために、これらのＯＲＦをＵｎｉＰｒｏｔで参照される既知のＨＥＲＶ－Ｋ／ＨＭＬ－２ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質に対して整列させ、既知の既存のＨＭＬ－２タンパク質と９０％の相同性を有するＯＲＦのみを維持した。この保存的アプローチは、２７個の異なるＯＲＦから５７個のＨＭＬ－２ＨＬＡ－Ａ＊０２０１エピトープ候補を同定し（図２Ａ）、保存されたＨＭＬ－２由来ＯＲＦの最も多い数を示すｈｅｒｖ＿２４１０およびｈｅｒｖ＿６０６９を含んだ。これらのエピトープの分布をよりよく理解するために、すべてのＣＡＨ間で各ペプチドを再配置した。最も共有されるエピトープ上位２５個を、図２Ｂに示す。１３個の固有のエピトープが、少なくとも１０種の異なるＨＥＲＶ中に存在していた（図２Ｂ）。さらなる生物学的検証および免疫学的アッセイのために、６つの最も共有されるエピトープ候補；Ｇａｇから３つ（Ｐ１、Ｐ２、およびＰ４）、Ｐｏｌから３つ（Ｐ３、Ｐ５、およびＰ６）（図２Ｃ）を、選択した。ＴＣＧＡおよびＣｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＣＰＴＡＣ）からの質量分析（ＭＳ）データの分析は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、およびＰ６ペプチドの翻訳の証拠を示した。Ｐ４もまた、それが腫瘍からのＨＬＡ－Ｉ溶出ペプチド中に記載されていたため、選択した（国際公開第２０１９／１６２１１０（Ａ１）号）。重要なことに、ヒトプロテオームに対するアラインメントは、これらのエピトープ候補の配列が、いずれの自己タンパク質配列とも一致しないことを明らかにした。注目すべきことに、これらのＨＬＡ－Ａ２エピトープは、他の最も一般的なＨＬＡ－ＡおよびＢ対立遺伝子に対する強力な結合剤として予測されなかった。
次に、最も一般的なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子であるＨＬＡ－Ａ２に焦点を合わせ、これらのｃｙｔ－ＨＥＲＶ間で共通のＴ細胞エピトープの存在を評価した。１９２個のｃｙｔ－ＨＥＲＶ配列を６つの可能なフレームに翻訳し、少なくとも１０個のアミノ酸の予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を保持した。偽陽性（非翻訳配列）の数を減少させるために、これらのＯＲＦをＵｎｉＰｒｏｔで参照される既知のＨＥＲＶ－Ｋ／ＨＭＬ－２ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質に対して整列させ、既知の既存のＨＭＬ－２タンパク質と９０％の相同性を有するＯＲＦのみを維持した。この保存的アプローチは、２７個の異なるＯＲＦから５７個のＨＭＬ－２ＨＬＡ－Ａ＊０２０１エピトープ候補を同定し（図２Ａ）、保存されたＨＭＬ－２由来ＯＲＦの最も多い数を示すｈｅｒｖ＿２４１０およびｈｅｒｖ＿６０６９を含んだ。これらのエピトープの分布をよりよく理解するために、すべてのＣＡＨ間で各ペプチドを再配置した。最も共有されるエピトープ上位２５個を、図２Ｂに示す。１３個の固有のエピトープが、少なくとも１０種の異なるＨＥＲＶ中に存在していた（図２Ｂ）。さらなる生物学的検証および免疫学的アッセイのために、６つの最も共有されるエピトープ候補；Ｇａｇから３つ（Ｐ１、Ｐ２、およびＰ４）、Ｐｏｌから３つ（Ｐ３、Ｐ５、およびＰ６）（図２Ｃ）を、選択した。ＴＣＧＡおよびＣｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＣＰＴＡＣ）からの質量分析（ＭＳ）データの分析は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、およびＰ６ペプチドの翻訳の証拠を示した。Ｐ４もまた、それが腫瘍からのＨＬＡ－Ｉ溶出ペプチド中に記載されていたため、選択した（国際公開第２０１９／１６２１１０（Ａ１）号）。重要なことに、ヒトプロテオームに対するアラインメントは、これらのエピトープ候補の配列が、いずれの自己タンパク質配列とも一致しないことを明らかにした。注目すべきことに、これらのＨＬＡ－Ａ２エピトープは、他の最も一般的なＨＬＡ－ＡおよびＢ対立遺伝子に対する強力な結合剤として予測されなかった。
【0213】
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、共通のＨＥＲＶエピトープを含む多くのｃｙｔ－ＨＥＲＶにより特徴づけられる。
ＴＮＢＣにおけるＨＥＲＶの十分に特徴付けらた発現および正常サンプルを含むＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）データベースの可用性のおかげで、本発明者らは、乳癌に焦点を当てた。差次的ＨＥＲＶ発現分析は、異なる乳癌サブタイプにわたり発現される合計４９７個のＣＡＨを明らかにし、そのうち９１個をｃｙｔ－ＨＥＲＶとしてアノテーションを付けた。これらの９１個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの５４個が、基底サブタイプで発現された（図３Ａ）。これらの５４個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの平均の発現は、独立したデータセットからの腫瘍周囲または正常乳房組織と比較して、ＴＮＢＣおよびＥＲ＋サンプルで顕著に高かった（図３Ｂ）。Ｖａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．の研究で配列決定された乳癌細胞株中およびＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａの細胞株中で、これらの５４個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの高発現を確認した。基底サブタイプ中で発現されるすべてのＣＡＨの中で最も共有される上位２５のエピトープ候補は、以前に同定された６つのペプチドＰ１～Ｐ６を含んだ。
ＴＮＢＣにおけるＨＥＲＶの十分に特徴付けらた発現および正常サンプルを含むＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）データベースの可用性のおかげで、本発明者らは、乳癌に焦点を当てた。差次的ＨＥＲＶ発現分析は、異なる乳癌サブタイプにわたり発現される合計４９７個のＣＡＨを明らかにし、そのうち９１個をｃｙｔ－ＨＥＲＶとしてアノテーションを付けた。これらの９１個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの５４個が、基底サブタイプで発現された（図３Ａ）。これらの５４個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの平均の発現は、独立したデータセットからの腫瘍周囲または正常乳房組織と比較して、ＴＮＢＣおよびＥＲ＋サンプルで顕著に高かった（図３Ｂ）。Ｖａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．の研究で配列決定された乳癌細胞株中およびＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａの細胞株中で、これらの５４個のｃｙｔ－ＨＥＲＶの高発現を確認した。基底サブタイプ中で発現されるすべてのＣＡＨの中で最も共有される上位２５のエピトープ候補は、以前に同定された６つのペプチドＰ１～Ｐ６を含んだ。
【0214】
次に、基底サブタイプ中で発現されるＣＡＨの中で、以前に同定された６つのエピトープ候補Ｐ１～Ｐ６の配列を含むＨＥＲＶを、選択した。１８個の異なるＣＡＨのＯＲＦは、それらのＯＲＦ中に６つのペプチドの少なくとも１つを含んだ（表１）。
【表1】
【0215】
対応する遺伝子座のゲノムマッピングは、染色体上のこれらの１８個のＨＥＲＶの拡散した位置を示した。ＴＮＢＣ対正常組織（ここでは利用可能な各腫瘍周囲サンプルにより示される）におけるエピトープ含有ＨＥＲＶの差次的発現を定量化するために、ｐ値により示される統計的有意性と倍数変化により表される生物学的有意性の両方を考慮するπ値スコアを使用した。累積発現スコアを次に、その配列を含むすべてのＨＥＲＶのπ値を合計することにより、各エピトープについて計算した。このスコアは、ほとんどの場合１０～２００であり、これは、評価された各正常サンプルに対しＴＮＢＣにおけるエピトープ含有ＨＥＲＶの顕著な過剰発現を確認した。最後に、以前に公開された試験からのリボソームプロファイリング（ｒｉｂｏｓｅｑ）データの分析は、２つの基底サブタイプおよび２つの管腔Ａサブタイプを含む４つの異なる乳癌細胞株における１８個のペプチド含有ＣＡＨの翻訳の証拠を明らかにした（図３Ｃ）。
【0216】
全体として、本発明者らのバイオインフォマティクスアプローチは、腫瘍細胞により特異的に過剰発現され、かつ多数のＨＥＲＶ候補の中で最も免疫原性であろう限られた数のＨＥＲＶ由来Ｔ細胞エピトープを選択することを可能にした。
【0217】
ＨＥＲＶ由来エピトープは、強力でかつ多機能のＴ細胞応答を誘導する
次に、効率的なＴ細胞応答を誘導する選択されたエピトープ候補の能力を評価した。選択された６つのペプチドのＨＬＡ－Ａ２親和性を最初に、精製されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを使用して確認した。これらの６つのペプチドの免疫原性を評価するために、ＨＬＡ－Ａ２陽性ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対し、最適化されたｉｎ ｖｉｔｒｏプライミングアッセイを開発した（詳細は、図４Ａおよび方法を参照）。デキストラマーに基づくペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化は、ドナー間でばらつきを有して、すべてのペプチドに対する特異的Ｔ細胞の存在を明らかにした（図４Ｂ）。Ｐ１は、１１人中９人のドナーで有意なＴ細胞応答を有する最も免疫原性のペプチドであると考えられ、Ｐ４（７／１０）、Ｐ６（４／９）、Ｐ２（３／１１）がそれに続いた（図４Ｂ）。これらのペプチドの免疫原性を、５人のＨＬＡ－Ａ２陽性の健康なドナーから調製された単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を使用する従来のアッセイによりさらに確認した。フローサイトメトリー分析は、ペプチド刺激ＰＢＭＣを同族エピトープでパルスしたＴ２細胞と共培養したときに、ＣＤ８＋Ｔ細胞 ＩＦＮ－γの産生を示した。注目すべきことに、Ｐ１はまた、他のペプチドと比較して、最も高いＩＦＮ－γ応答を誘導した。バイオインフォマティクスの予測と一致して、特異的Ｔ細胞誘導は、ＨＬＡ－Ａ２陰性ドナー（ｎ＝５）由来のＰＢＭＣを使用した場合観察されなかった。
次に、効率的なＴ細胞応答を誘導する選択されたエピトープ候補の能力を評価した。選択された６つのペプチドのＨＬＡ－Ａ２親和性を最初に、精製されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを使用して確認した。これらの６つのペプチドの免疫原性を評価するために、ＨＬＡ－Ａ２陽性ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対し、最適化されたｉｎ ｖｉｔｒｏプライミングアッセイを開発した（詳細は、図４Ａおよび方法を参照）。デキストラマーに基づくペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化は、ドナー間でばらつきを有して、すべてのペプチドに対する特異的Ｔ細胞の存在を明らかにした（図４Ｂ）。Ｐ１は、１１人中９人のドナーで有意なＴ細胞応答を有する最も免疫原性のペプチドであると考えられ、Ｐ４（７／１０）、Ｐ６（４／９）、Ｐ２（３／１１）がそれに続いた（図４Ｂ）。これらのペプチドの免疫原性を、５人のＨＬＡ－Ａ２陽性の健康なドナーから調製された単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を使用する従来のアッセイによりさらに確認した。フローサイトメトリー分析は、ペプチド刺激ＰＢＭＣを同族エピトープでパルスしたＴ２細胞と共培養したときに、ＣＤ８＋Ｔ細胞 ＩＦＮ－γの産生を示した。注目すべきことに、Ｐ１はまた、他のペプチドと比較して、最も高いＩＦＮ－γ応答を誘導した。バイオインフォマティクスの予測と一致して、特異的Ｔ細胞誘導は、ＨＬＡ－Ａ２陰性ドナー（ｎ＝５）由来のＰＢＭＣを使用した場合観察されなかった。
【0218】
これらの結果に基づき、さらなる実験のためにＰ１、Ｐ２、Ｐ４、およびＰ６を選択した。多機能性ＩＦＮ－γ＋ＴＮＦ－α＋特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの存在と関連して、刺激されたＰＢＭＣとペプチドパルスＴ２細胞の共培養時に観察された（図４Ｃ）。同じ共培養条件でのＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイは、二重陽性細胞の存在下でのＩＦＮ－γおよびグランザイムＢの分泌を確認した。
【0219】
エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、高い予測される親和性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により特徴づけられる。
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、およびＰ６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、デキストラマー染色を用いるフローサイトメトリーにより選別し、フィーダー細胞上で拡張させた（方法を参照）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の９０％超（９０～９９％）が、選択－拡張の１つのステップ（Ｐ１）または２つのステップ（Ｐ２、Ｐ４およびＰ６）の後でデキストラマー陽性であった。ＴＣＲβ免疫シーケンシングは、それぞれ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、およびＰ６について拡張されたＴ細胞の９０．８％、９０．７％、９９．６％、７６％である固有のＶβ再構成を有するドミナントクローンの存在を確認した（図５Ａ）。注目すべきことに、これらのクローンを特徴付けるＴＣＲβのＶ／Ｄ／Ｊ組換え配列は、ペプチド刺激前のＴ細胞バルク中に存在しなかった（閾値感度：３ｘ１０－６）。ＴＣＲα鎖もまた配列決定し、Ｐ１、Ｐ４、およびＰ６について固有の主要クローンの存在を確認し、ＴＣＲの対形成とモデリングを可能にした。２つの主要なＶα再構成がＰ２について得られたため、６０％の頻度で発生する主な再構成を、ＴＣＲモデリングのために使用した。
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、およびＰ６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、デキストラマー染色を用いるフローサイトメトリーにより選別し、フィーダー細胞上で拡張させた（方法を参照）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の９０％超（９０～９９％）が、選択－拡張の１つのステップ（Ｐ１）または２つのステップ（Ｐ２、Ｐ４およびＰ６）の後でデキストラマー陽性であった。ＴＣＲβ免疫シーケンシングは、それぞれ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、およびＰ６について拡張されたＴ細胞の９０．８％、９０．７％、９９．６％、７６％である固有のＶβ再構成を有するドミナントクローンの存在を確認した（図５Ａ）。注目すべきことに、これらのクローンを特徴付けるＴＣＲβのＶ／Ｄ／Ｊ組換え配列は、ペプチド刺激前のＴ細胞バルク中に存在しなかった（閾値感度：３ｘ１０－６）。ＴＣＲα鎖もまた配列決定し、Ｐ１、Ｐ４、およびＰ６について固有の主要クローンの存在を確認し、ＴＣＲの対形成とモデリングを可能にした。２つの主要なＶα再構成がＰ２について得られたため、６０％の頻度で発生する主な再構成を、ＴＣＲモデリングのために使用した。
【0220】
ペプチドＰ１、Ｐ２、Ｐ４、およびＰ６に対し特異的なＴ細胞クローンの親和性を次に、ＴＣＲ－ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体の３Ｄモデルを考慮することにより特徴付けた（方法を参照）。巨大分子複合体の安定性は、水素結合、塩橋、および疎水性相互作用などの、界面での好ましい相互作用の形成による。これらの相互作用は、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ界面で露出されるペプチドの特定の側鎖を要する。ＴＣＲ Ｐ１複合体では、ペプチドのＰｈｅ１、Ｐｈｅ４、Ｔｒｐ８側鎖が、複数の疎水性相互作用を形成し、Ｐｈｅ４およびＩｌｅ９のバックボーン原子が、水素結合に関与する。ＴＣＲ Ｐ２複合体では、いくつかの疎水性相互作用が、ペプチド残基Ｐｒｏ４、Ｔｙｒ５、およびＴｒｐ７により媒介される。ＴＣＲＰ４では、ペプチド残基Ｉｌｅ５、Ｉｌｅ７、およびＬｅｕ８が、いくつかの疎水性相互作用を形成し、一方でＴｙｒ１およびＬｙｓ６側鎖、ならびにＰｈｅ４およびＬｅｕ８バックボーン原子が、水素結合に関与する。ＴＣＲＰ６では、Ｔｙｒ１、Ｓｅｒ４、Ａｓｎ５、Ｌｅｕ６、およびＰｈｅ７が、複数の疎水性相互作用を形成し、一方でＳｅｒ４／Ｌｅｕ６／Ｓｅｒ８バックボーンおよびＴｙｒ１／Ｓｅｒ４／Ａｓｎ５／Ｓｅｒ８側鎖が、８つの水素結合を形成する。
【0221】
全体として、予測３Ｄモデルのこの分析は、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ複合体がいくつかの好ましい非共有結合相互作用により安定化されることを示唆し、ＨＥＲＶ特異的Ｔ細胞のクローン拡張後に同定されたＴＣＲが、ＨＬＡ－Ａ２分子により提示されるペプチドと安定な複合体を形成することを裏付ける。さらなる洞察を得るために、３Ｄモデルを結合親和性予測に提出した（図５Ｂ）。タンパク質構造データバンクで入手可能でありかつ結晶構造データから得られる参照ＴＣＲ－ｐＭＨＣ複合体と比較すると、同定されたＴＣＲの予測される親和性は、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＨＴＬＶ、またはＣＭＶを標的とするＴＣＲなどの、臨床的に関連するＴＣＲの親和性と一致する（図５Ｃ）。したがって、同定されたＨＥＲＶ特異的ＴＣＲは、高親和性ＴＣＲを暗示する、それらのそれぞれのｐＭＨＣ複合体と安定的に相互作用すると予測される。
【0222】
高い結合性のＨＥＲＶ特異的Ｔ細胞クローンは、腫瘍細胞を認識し死滅させる
選別され拡張されたエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能性を、ペプチドパルスＴ２細胞を用いるＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔにより確認した。機能的結合力をその後、Ｔ２細胞に低下する濃度の同族ペプチド（１０－４～１０－９Ｍの範囲）を添加すること、および細胞の５０％でＩＦＮ－γ応答を引き起こすために必要な最低のペプチド濃度（最大有効濃度の半分として定義、すなわちＥＣ５０）を測定することにより評価した。Ｐ１、Ｐ２、およびＰ６特異的Ｔ細胞について、それぞれ、６．６ｘ１０－７Ｍ、１．９ｘ１０－６Ｍ、６．８ｘ１０－６Ｍと推定される、ＥＣ５０値は、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞クローン（２８）およびＣＭＶ特異的Ｔ細胞（それぞれ、Ｎ９Ｖ－１およびＮ９Ｖ－２について、１．２ｘ１０－６および１．９ｘ１０－６）と同じ階数の大きさであった（図６Ａ）。
選別され拡張されたエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能性を、ペプチドパルスＴ２細胞を用いるＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔにより確認した。機能的結合力をその後、Ｔ２細胞に低下する濃度の同族ペプチド（１０－４～１０－９Ｍの範囲）を添加すること、および細胞の５０％でＩＦＮ－γ応答を引き起こすために必要な最低のペプチド濃度（最大有効濃度の半分として定義、すなわちＥＣ５０）を測定することにより評価した。Ｐ１、Ｐ２、およびＰ６特異的Ｔ細胞について、それぞれ、６．６ｘ１０－７Ｍ、１．９ｘ１０－６Ｍ、６．８ｘ１０－６Ｍと推定される、ＥＣ５０値は、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞クローン（２８）およびＣＭＶ特異的Ｔ細胞（それぞれ、Ｎ９Ｖ－１およびＮ９Ｖ－２について、１．２ｘ１０－６および１．９ｘ１０－６）と同じ階数の大きさであった（図６Ａ）。
【0223】
次に、腫瘍細胞を認識し死滅させるこれらのＨＥＲＶエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を評価した。本発明者らは、エピトープ配列を含むＨＥＲＶを発現すると以前に示された、ＨＬＡ－Ａ２陽性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１基底ＢＲＣＡ腫瘍細胞株を、標的候補として選択した（図３Ｃ）。エピトープが実際に細胞表面上に存在するという証拠を提供するために、ＭＳベースの方法を使用して、ＨＬＡ分子から溶出されたペプチドを分析した。Ｐ１およびＰ６エピトープは、ＭＳにより明確に検出された。重同位体標識対照との比較に基づき、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞表面に１．８コピーのＰ１－ＨＬＡ複合体が存在すると推定した。
【0224】
腫瘍細胞を、エピトープ特異的Ｔ細胞と、または同じ条件で選別され拡張されたデキストラマー陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞画分（陰性対照）と共培養した。フローサイトメトリー分析は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１と接触したエピトープ特異的Ｔ細胞の約２５％によるＩＦＮ－γの産生を強調し、非特異的Ｔ細胞で観察されたバックグラウンドと比較して顕著な増加（＞６倍）を有した。このＩＦＮ－γの産生は、ＨＬＡ－Ａ２ブロックモノクローナル抗体により阻害され、Ｔ細胞クローンが、ＨＬＡ－Ａ２に制限された様式で腫瘍細胞を特異的に認識することを実証した。
【0225】
リアルタイムで腫瘍細胞死を監視するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ技術を使用して免疫細胞死滅アッセイを実施した。Ｔ細胞クローンは、標的細胞のＣｙｔｏｔｏｘ蛍光試薬の量における時間依存的な増加により示されるように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の顕著でＨＬＡ－Ａ２制限された死滅を誘導した。対照的に、Ｔ細胞のデキストラマー陰性画分は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ペプチドでパルスした、またはパルスしない）の顕著な細胞死を誘導しなかった（図６Ｂ）。特異的溶解（エフェクター対標的比Ｅ：Ｔ＝２：１で）を、アロ反応性バックグラウンド（対応するデキストラマー陰性Ｔ細胞分画で誘導された標的細胞死により評価される）を引いた後、４８時間後の標的細胞死の定量化に基づき計算した（方法を参照）。腫瘍細胞の特に高い特異的溶解が、Ｐ１およびＰ２特異的Ｔ細胞で達成され（それぞれ、３５％および４４％）、さらに中程度の溶解（１５％）が、Ｐ６特異的Ｔ細胞で達成された。特異的溶解は、標的腫瘍細胞を同族エピトープでパルスした場合、さらに増加し、それぞれ、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ６特異的Ｔ細胞では５５％、８０％、およびさらに９５％に達した。注目すべきことに、エピトープ特異的Ｔ細胞クローンは、ここで陰性の正常細胞対照として使用したＨＬＡ－Ａ２陽性ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を死滅させなかった（図６Ｃ）。これらの結果を、３Ｄ顕微鏡Ｎａｎｏｌｉｖｅ技術を使用してさらに検証し、４．５時間後の腫瘍細胞の大部分の死滅に関連する特異的Ｔ細胞の活性化の形態学的兆候を示す（Ｅ：Ｔ＝１０：１）。ここでもまた、細胞死は、特異的Ｔ細胞をＨＭＥＣと共培養した場合、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を非特異的Ｔ細胞と共培養した場合観察されなかった。同様の結果が、標的としてＴＮＢＣ ＨＬＡ－Ａ２陽性細胞株ＨＣＣ１５９９を使用して得られた。全体として、これらのデータは、選択されたエピトープが、ＨＥＲＶを発現する腫瘍細胞を選択的に認識し死滅させる、高い結合力のＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを誘発することを示している。
【0226】
ＨＥＲＶ特異的Ｔ細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞中に存在する
ＨＥＲＶに対する適応免疫応答が癌患者において存在し得るという仮説を検証するために、ＴＮＢＣ ＨＬＡ－Ａ２患者（いかなるペプチド特異的刺激もなし）由来のポリクローナル的に拡張した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）中のＨＥＲＶエピトープ特異的Ｔ細胞の存在を、デキストラマー染色により評価した。ＨＥＲＶ特異的ＴＩＬが、分析した１１個の腫瘍サンプルの７個中で、少なくとも１つのエピトープに対し観察され、患者ごとにエピトープ特異性および頻度の点で異なっていた。Ｐ１、Ｐ４、およびＰ６が、最も高頻度で認識されたペプチドであり、それぞれ、４／１１、４／１１、および５／１１件で、デキストラマーベースで同定された。
ＨＥＲＶに対する適応免疫応答が癌患者において存在し得るという仮説を検証するために、ＴＮＢＣ ＨＬＡ－Ａ２患者（いかなるペプチド特異的刺激もなし）由来のポリクローナル的に拡張した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）中のＨＥＲＶエピトープ特異的Ｔ細胞の存在を、デキストラマー染色により評価した。ＨＥＲＶ特異的ＴＩＬが、分析した１１個の腫瘍サンプルの７個中で、少なくとも１つのエピトープに対し観察され、患者ごとにエピトープ特異性および頻度の点で異なっていた。Ｐ１、Ｐ４、およびＰ６が、最も高頻度で認識されたペプチドであり、それぞれ、４／１１、４／１１、および５／１１件で、デキストラマーベースで同定された。
【0227】
これらの結果は、ＴＮＢＣ患者の転帰とこれらのＨＬＡ－Ａ２エピトープを含む１８個のＣＡＨの発現の間の潜在的な関連性を調査させた。本発明者らは、ＴＣＧＡコホートからの基底乳癌のＨＬＡ－Ａ２患者におけるこれら１８のＨＥＲＶの平均発現に基づきスコアを確立した。興味深いことに、高いまたは中程度の１８－ＨＥＲＶスコアを有するＨＬＡ－Ａ２陽性患者は、低いスコアを有する患者より有意に良好な全生存率を有した（Ｐ＝０．００６６）（図７Ａ）。この予後への影響は、集団全体では観察されなかった。
【0228】
最後に、患者８の腫瘍由来のオルガノイドを用いることにより、原発腫瘍細胞に対するＨＥＲＶ特異的Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価した（方法を参照）。ＲＮＡｓｅｑ解析は、継代初期および後期での１８個のエピトープ含有ＣＡＨの発現を確認した。腫瘍オルガノイドを、３Ｄ顕微鏡Ｎａｎｏｌｉｖｅ実験（Ｅ：Ｔ＝１０：１）において、Ｐ１、Ｐ６、またはＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンと共培養した。Ｔ細胞の活性化は、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞では観察されなかったが、Ｐ１およびＰ６特異的Ｔ細胞は、オルガノイドの溶解に関連する活発な増殖の兆候を呈した（図７Ｂ）。
【0229】
全体として、これらの最後の結果は、ＨＥＲＶ特異的Ｔ細胞が、腫瘍の発達中に誘導され、抗腫瘍免疫応答に関与し得ることを示唆する。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【配列表】
【国際調査報告】