特表 2025-503326 高レベルの７－デヒドロコレステロールを含有するトマトおよびその調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-30

(54)【発明の名称】高レベルの７－デヒドロコレステロールを含有するトマトおよびその調製方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 6/82 20180101AFI20250123BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20250123BHJP

   A01H 5/06 20180101ALI20250123BHJP

   A01H 5/08 20180101ALI20250123BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250123BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20250123BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250123BHJP

   C12N 15/74 20060101ALI20250123BHJP

【ＦＩ】

A01H6/82 ZNA

A01H5/00 A

A01H5/06

A01H5/08

C12N15/09 110

C12N15/113 Z

C12N15/63 Z

C12N15/74 100Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024565892

(86)(22)【出願日】2023-01-25

(85)【翻訳文提出日】2024-09-19

(86)【国際出願番号】 KR2023001125

(87)【国際公開番号】W WO2023140722

(87)【国際公開日】2023-07-27

(31)【優先権主張番号】10-2022-0009633

(32)【優先日】2022-01-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524277739

【氏名又は名称】ジーエフエルエーエス ライフ サイエンシズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チェ ソンファ

(72)【発明者】

【氏名】チェ ソンミ

(72)【発明者】

【氏名】キム ジンファ

(72)【発明者】

【氏名】キム ジョンモ

(72)【発明者】

【氏名】ユ ミン キョン

(72)【発明者】

【氏名】チョン ユ－ナ

(57)【要約】

本発明は、遺伝子編集技術を使用することによって生産される、高レベルのビタミンＤ３前駆体を含有するトマト、およびその調製方法に関する。具体的には、ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたトマトは、高レベルの７－デヒドロコレステロールを蓄積し、種子をそれから産生できることが確認されている。したがって、そのようにして生産されるトマトは、高レベルのビタミンＤ３前駆体を含有し、高い商業的適用性を有し得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

高濃度の下記式１の７－デヒドロコレステロールを含有する形質転換されたトマト。

【化1】

【請求項2】

７－デヒドロコレステロールが、前記トマトの果実および根に高濃度で含まれる、請求項１に記載の形質転換されたトマト。

【請求項3】

７－デヒドロコレステロールの濃度が、重量１００ｇ当たり０．０１ｍｇ～１．５ｍｇである、請求項１に記載の形質転換されたトマト。

【請求項4】

野生型トマトと比較して、ＤＷＦ５－１遺伝子またはＤＷＦ５－１タンパク質の発現または活性を低下させるように遺伝子操作されている、請求項１に記載の形質転換されたトマト。

【請求項5】

前記ＤＷＦ５－１遺伝子が、配列番号６３の核酸配列を含む、請求項４に記載の形質転換されたトマト。

【請求項6】

前記遺伝子操作が、前記ＤＷＦ５－１遺伝子の核酸配列における改変によって誘導される、請求項４に記載の形質転換されたトマト。

【請求項7】

前記核酸配列の前記改変が、置換、欠失または挿入により前記野生型トマトのものとは異なる配列を含む、請求項６に記載の形質転換されたトマト。

【請求項8】

ＣＰＤ遺伝子またはＣＰＤタンパク質の発現または活性を低下させるようにさらに遺伝子操作されている、請求項４に記載の形質転換されたトマト。

【請求項9】

前記ＣＰＤが、配列番号５の核酸配列を含む、請求項８に記載の形質転換されたトマト。

【請求項10】

前記遺伝子操作が、前記ＣＰＤ遺伝子の核酸配列における改変によって誘導される、請求項８に記載の形質転換されたトマト。

【請求項11】

ＳＭＴ１遺伝子またはＳＭＴ１タンパク質の発現または活性を低下させるようにさらに遺伝子操作されている、請求項８に記載の形質転換されたトマト。

【請求項12】

前記ＳＭＴ１が、配列番号７の核酸配列を含む、請求項１１に記載の形質転換されたトマト。

【請求項13】

前記遺伝子操作が、前記ＳＭＴ１遺伝子の核酸配列における改変によって誘導される、請求項１１に記載の形質転換されたトマト。

【請求項14】

ホモ接合体である、請求項４に記載の形質転換されたトマト。

【請求項15】

種子を形成する、請求項４に記載の形質転換されたトマト。

【請求項16】

ＤＷＦ５－１遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいたパリンドローム反復、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的に結合する少なくとも１つのｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）を含むベクター。

【請求項17】

前記ｓｇＲＮＡが、配列番号２０、配列番号２１およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載のベクター。

【請求項18】

前記ＣＰＤ遺伝子のヌクレオチド配列に相補的に結合する１つまたは２つ以上のｓｇＲＮＡをさらに含む、請求項１６に記載のベクター。

【請求項19】

前記ｓｇＲＮＡが、配列番号２８、配列番号２９およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載のベクター。

【請求項20】

前記ＳＭＴ１遺伝子のヌクレオチド配列に相補的に結合する１つまたは２つ以上のｓｇＲＮＡをさらに含む、請求項１６に記載のベクター。

【請求項21】

前記ｓｇＲＮＡが、配列番号３２、配列番号３３およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載のベクター。

【請求項22】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃａｓ１３、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃｓｎ１、Ｃｓｘ１２、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｕｌ９６６からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１６に記載のベクター。

【請求項23】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質がＣａｓ９である、請求項２２に記載のベクター。

【請求項24】

請求項１６から２３のいずれか一項に記載のベクターを、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用してトマトに導入することを含む、高濃度の７－デヒドロコレステロールを含有する形質転換されたトマトを生産するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高濃度の７－デヒドロコレステロール（ビタミンＤ３の前駆体）を含有するトマト、およびそれを生産するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ビタミンＤは、生命を維持するための必須栄養素である。不足したビタミンＤにより、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症だけでなく、乳がん、結腸直腸がん、および前立腺がんなどの悪性腫瘍；高血圧症を含む心血管疾患；糖尿病；多発性硬化症；乾癬；関節リウマチ；結核なども増加することが報告されている。ビタミンＤは、食品を介して摂取することができるが、十分な日光を介してインビボで合成することもできるビタミンである。したがって、日光に十分に曝露しない場合は、ビタミンＤが豊富な食品またはビタミンＤ栄養補助食品を摂取すべきである。

【0003】

特に、現代人は、１日のほとんどを屋内で過ごし、屋外活動を行う場合でも、日光を衣服および帽子で遮るため、ビタミンＤ欠乏症に注意する必要がある。日光への暴露が不十分な場合、食品を介してビタミンＤを十分に摂取しなければならないが、ビタミンＤの含有量が高い食品が多くないという問題がある。ビタミンＤが豊富であると公知の食品であっても、１００ｇ当たりに含まれるビタミンＤの量は、０．２９μｇ／約７枚のスライスチーズ（約１００ｇ）、２．９μｇ／１００ｇのマグロ、１．３６μｇ／２個の卵（約１００ｇ）、４．４μｇ／約１カップのレーズン（約１００ｇ）である。したがって、これらの食品からビタミンＤの１日推奨量を満たすことはできない。

【0004】

さらに、ビタミンＤ栄養補助食品としての、合成ビタミンＤには副作用および有害の可能性があることが報告されており、天然ビタミンＤは非常に高価であり、入手が困難であるという問題を有する。一方、韓国特許出願公開第１０－２０１７－０１３８６５７号は、ＤＷＦ５（デルタ５、７－ステロールデタ７レダクターゼ、ＤＷＡＲＦ５）、ＣＰＤ（構成的光形態形成ＤＷＡＦ、ＤＷＦ３）およびＳＭＴ１（ステロールメチルトランスフェラーゼ１）遺伝子を欠失させた場合、ビタミンＤの前駆体である７－デヒドロカンペステロールを豊富に含むレタスを生産できることを開示している。しかしながら、ビタミンＤ３の前駆体である７－デヒドロコレステロールを豊富に含むトマトの生産に関する研究は行われていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ技術によって、ＤＷＦ５－１、ＣＰＤおよびＳＭＴ１遺伝子を欠失させることによる実験を行った。結果として、ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させた場合、高濃度の７－デヒドロコレステロールを含有するトマトが生産されることが確認された。以上のことに基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は、ビタミンＤ３産生のための前駆体である高濃度の７－デヒドロコレステロールを含有するトマトを開発するために最適化されたＤＷＦ５－１、ＣＰＤおよびＳＭＴ１欠失部位を同定し、それらを含むビタミンＤ３の前駆体を豊富に含むトマトを開発することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するために、本発明の一態様では、高濃度の下記式１の７－デヒドロコレステロールを含有する形質転換されたトマトが提供される。

【0007】

本発明の別の態様では、ＤＷＦ５－１遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいたパリンドローム反復、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的に結合する１つまたは２つ以上のｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）を含むベクターが提供される。

【0008】

本発明の別の態様では、ベクターを、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用してトマトに導入することを含む、高濃度の７－デヒドロコレステロールを含有する形質転換されたトマトを生産するための方法が提供される。

【発明の効果】

【0009】

本発明により生産される形質転換されたトマトが、ＤＷＦ５－１遺伝子の変異を含むホモ接合体であった場合、トマトの果実および根に多量の７－デヒドロコレステロールが蓄積された。さらに、ホモ接合体（Ｔ２）は種子を産生することができ、したがって所望のトマト形質を保存することができた。したがって、本発明の形質転換されたトマトは、高い商業的適用性を有する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ＤＷＦ５－１ ｓｇＲＮＡによって標的とされるＤＷＦ５－１の部位を示す図である。

【図2】ＣＰＤ ｓｇＲＮＡによって標的とされるＣＰＤの部位を示す図である。

【図3】ＳＭＴ１ ｓｇＲＮＡによって標的とされるＳＭＴ１の部位を示す図である。

【図4】ＲＧＥＮを使用して、ＤＷＦ５－１ ｓｇＲＮＡの遺伝子編集効率を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図5】ＲＧＥＮを使用して、ＣＰＤ ｓｇＲＮＡのＣＰＤ遺伝子編集効率を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図6】ＲＧＥＮを使用して、ＳＭＴ１ ｓｇＲＮＡのＳＭＴ１遺伝子編集効率を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図7】ＤＷＦ５－１ ｓｇＲＮＡをロードしたＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターの概略図を示す。

【図8】ＤＷＦ５－１ ｓｇＲＮＡおよびＣＰＤ ｓｇＲＮＡをロードしたＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターの概略図を示す。

【図9】ＤＷＦ５－１ ｓｇＲＮＡ、ＣＰＤ ｓｇＲＮＡおよびＳＭＴ１ ｓｇＲＮＡをロードしたＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターの概略図を示す。

【図10】アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用して、形質転換されたトマトを構築するためのプロセスを示すフローチャートである。

【図11】遺伝子編集により構築されたトマトの発芽プロセスを示す。

【図12】ＤＷＦ５－１遺伝子を編集したトマト植物体を観察することによって得られた結果を示す図である。

【図13】ＤＷＦ５－１およびＣＰＤ遺伝子を編集したトマト植物体を観察することによって得られた結果を示す図である。

【図14】ＤＷＦ５－１、ＣＰＤおよびＳＭＴ１遺伝子を編集したトマト植物体を観察することによって得られた結果を示す図である。

【図15】Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して、ＤＷＦ５－１、ＣＰＤまたはＳＭＴ１遺伝子が編集されたかどうかを確認することによって得られた結果を示す図である。

【図16】サンガー配列決定を使用して、ＤＷＦ５－１遺伝子が欠失したかどうかを確認することによって得られた結果を示す図である。

【図17】ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたＴ１世代の形質転換されたトマト植物体におけるＤＷＦ５－１遺伝子表現型を、次世代配列決定により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図18a】ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたＴ１世代のホモ接合型の形質転換されたトマト植物体の、遺伝子編集効率および採取された種子の量（上）、ならびにヌクレオチド配列（下）を示す図である。

【図18b】ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたＴ１世代のホモ接合型の形質転換されたトマト植物体のヌクレオチド配列を示す図である。

【図19】ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたホモ接合体（Ｔ１）の、Ｔ２世代の形質転換されたトマト植物に含まれる７－デヒドロコレステロールを測定するためのサンプル調製プロセスを示すフローチャートである。

【図20】ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたホモ接合体（Ｔ１）の、Ｔ２世代の形質転換されたトマト植物体に含まれる７－デヒドロコレステロールを測定するための、ＬＣ／ＭＳによる測定条件を示す図である。

【図21】標準試薬としての市販の７－デヒドロコレステロールと、野生型（ＷＴ）トマト植物体に含まれる７－デヒドロコレステロールと、ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたホモ接合体（Ｔ１）の、Ｔ２世代の形質転換されたトマト植物体に含まれる７－デヒドロコレステロールとを、ＬＣ／ＭＳにより測定することによって得られた結果を示す図である。

【図22】ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたホモ接合体（Ｔ１）の、Ｔ２世代の形質転換されたトマト植物体の果実に含まれる７－デヒドロコレステロールを、ＬＣ／ＭＳにより測定することによって得られた結果を示すグラフである。

【図23】ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたホモ接合体（Ｔ１）の、Ｔ２世代の形質転換されたトマト植物体におけるハイグロマイシンおよびホスフィノトリシン（ＰＰＴ）耐性遺伝子の発現を、ＲＴ－ＰＣＲにより確認することによって得られた結果を示す図である。

【図24】抗生物質耐性遺伝子を発現していないＴ２世代の形質転換されたトマト植物体（Ｄ１００＿３－１４－２９およびＤ１００＿７－１－１５）におけるＤＷＦ５－１のエクソン６ドメインのヌクレオチド配列を、野生型（ＷＴ）トマト植物体のものと比較し、分析することによって得られた結果を示す図である。

【図25】抗生物質耐性遺伝子を発現していないＴ２世代の形質転換されたトマト植物体（Ｄ１００＿３－１４－２９およびＤ１００＿７－１－１５）におけるＤＷＦ５－１のエクソン６ドメインのアミノ酸配列を、野生型（ＷＴ）トマト植物体のものと比較し、分析することによって得られた結果を示す図である。

【図26】ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたホモ接合型（Ｔ２）の形質転換されたトマト植物体（Ｔ２）の表現型を示す図である。

【図27】トマト植物体の根、茎、葉および果実におけるＤＷＦ５－１またはＤＷＦ５－２遺伝子の発現レベルを、ｑ－ＰＣＲにより確認することによって得られた結果を示すグラフである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１

【図28】ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させたホモ接合体（Ｔ１）の、Ｔ３世代の形質転換されたトマト植物体の根（培養された根）に含まれる７－デヒドロコレステロールを、ＧＣ／ＭＳにより測定することによって得られた結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

発明を実施するための最良の形態
本発明の一態様では、高濃度の下記式１の７－デヒドロコレステロールを含有する形質転換されたトマトが提供される。

【化1】

【0012】

本明細書で使用される場合、「トマト」という用語は、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの科学名を有し、ナス科、ナス目に属する植物またはその果実を指す。中南米原産で、１～３ｍの高さを有し、黄色の花を有する一年生植物である。この果実はリコペンに起因して赤色であり、食用目的に使用される。本明細書では、トマトは植物体であってもよく、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁（花）、種子、果実など）、植物組織（表皮、篩、柔組織、木部、維管束組織）などであってもよい。具体的には、果実および／または根であってもよい。この場合、トマト植物体は、根の培養物などを含む細胞培養物を含んでもよい。

【0013】

本明細書で使用される場合、「７－デヒドロコレステロール」という用語は、ビタミンＤ３に変換されるプロビタミンＤ３である。本発明では、形質転換されたトマトは、重量１００ｇ当たり０．０１ｍｇ～１．５ｍｇの７－デヒドロコレステロールを含み得る。具体的には、形質転換されたトマトは、重量１００ｇ当たり０．０１ｍｇ、０．１０ｍｇ、０．２０ｍｇ、０．３０ｍｇ、０．４０ｍｇ、０．５０ｍｇ、０．６０ｍｇ、０．７０ｍｇ、０．８０ｍｇ、０．９０ｍｇ、１．００ｍｇ、１．１０ｍｇ、１．２０ｍｇ、１．３０ｍｇ、１．４０ｍｇまたは１．５０ｍｇの７－デヒドロコレステロールを含み得る。

【0014】

本発明では、形質転換されたトマトは、野生型トマトと比較して、リコペルシカムＤＷＦ５－１（ＤＷＦ５－１）遺伝子またはＤＷＦ５－１タンパク質の発現または活性を低下させるように遺伝子操作され得る。この場合、遺伝子操作は、核酸配列の改変によって誘導されてもよい。

【0015】

本明細書で使用される場合、「ＤＷＦ５」という用語は、７－デヒドロコレステロールレダクターゼを指す。この酵素はまた、デルタ５，７－ステロールデルタ７レダクターゼとも称される。この酵素は、フィトステロール代謝経路の中間代謝産物である５－デヒドロエピステロールを還元し、それを２４－メチレンコレステロールに変換する活性を有する。

【0016】

植物においてＤＷＦ５が単一遺伝子として存在するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａでは、ＤＷＦ５遺伝子を欠失させると、フィトステロール代謝が急速に低下し、成体への成長を妨げる矮性をもたらすことが知られている。トマトでは、ＤＷＦ５は、ＤＷＦ５－１およびＤＷＦ５－２の２つの形態で存在する。この場合、ＤＷＦ５－１およびＤＷＦ５－２は、それぞれ配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を含み得る。ＤＷＦ５－１遺伝子はフィトステロール代謝経路で機能し、ＤＷＦ５－２遺伝子は、７－デヒドロコレステロールを還元（７－デヒドロコレステロールレダクターゼ）し、それをコレステロールに変換することにより、コレステロール産生経路で機能することが報告されている。このため、ＤＷＦ５－１遺伝子を欠失させた場合、フィトステロール代謝を低下させる可能性が高いことに起因して、異常な成長が起こり得ることが予想され得る。しかしながら、植物におけるコレステロール経路は、フィトステロール代謝経路から進化したことが報告されているため、ＤＷＦ５－１およびＤＷＦ５－２が互いに機能的相同性を有する可能性を完全に除外することはできない。本発明におけるＤＷＦ５－１およびＤＷＦ５－２の遺伝子発現パターンの比較および分析の結果として、ＤＷＦ５－１は、トマトの葉、茎、根、花、未熟果実および成熟果実のすべてにおいて、ＤＷＦ５－２遺伝子よりも５～１０倍以上高く発現しており、ＤＷＦ５－２遺伝子はまた、すべての組織において低い発現レベルで発現していた。したがって、ＤＷＦ５－１およびＤＷＦ５－２の機能的相同性を仮定すると、ＤＷＦ５－１遺伝子は、トマト果実中の７－デヒドロコレステロール含有量をより効率的に増加させることができると考えられた。

【0017】

本発明では、ＤＷＦ５－１遺伝子のみを欠失させた変異体の植物体は、未熟および成熟トマト果実および根組織のいずれにおいても高含有量のプロビタミンＤ３を産生し、それらの成長および種子産生は、野生型トマトのものと同様であった（図１８、図２６および表１３）。したがって、本発明では、少なくともＤＷＦ５－１遺伝子の欠失により、成熟果実においてプロビタミンＤ３を高濃度に産生するトマトを開発し、ＤＷＦ５－１遺伝子の単一欠失が、野生型のものと同様に、成長および果実産生することができる産業上有用な技法であることを確認した。

【0018】

本発明では、ＤＷＦ５は、ＤＷＦ５－１であり得る。具体的には、本発明では、ＤＷＦ５は、配列番号２のアミノ酸を含むＤＷＦ５－１であり得る。ＤＷＦ５－１遺伝子は、ＤＷＦ５－１をコードするヌクレオチド配列を含むゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。より具体的には、本発明では、ＤＷＦ５－１遺伝子はゲノムＤＮＡであってもよい。本発明では、ＤＷＦ５、ＤＷＦ５－１およびＳｌＤＷＦ５－１は、互換的に使用され得る。

【0019】

本明細書で使用される場合、「ゲノムＤＮＡ」という用語は、染色体ＤＮＡを指し、遺伝的情報が真核細胞においてコードされている形態を指す。真核生物ゲノムＤＮＡ（以下、ＤＮＡと称する）は、エクソンおよびイントロンを含む。エクソンは、タンパク質をコードする核酸配列を含む部分であり、イントロンは、タンパク質合成に関与しない部分である。生物の機能のために必要な様々なタンパク質を産生するために、ＤＮＡはＲＮＡに転写され、この際、イントロンを除くエクソンが一緒に連結される。イントロンは、転写の開始を誘導するプロモーターなどの転写を助ける情報を含み、転写プロセスにおいてプレｍＲＮＡを作製するために使用されるが、成熟ｍＲＮＡを作製するために使用されるのではなく切断される。

【0020】

本発明では、ＤＷＦ５－１遺伝子は、１２個のエクソンおよび１１個のイントロンを含み得る。具体的には、ＤＷＦ５－１は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、またはエクソン１２を含み得る。さらに、ＤＷＦ５－１は、イントロン１、イントロン２、イントロン３、イントロン４、イントロン５、イントロン６、イントロン７、イントロン８、イントロン９、イントロン１０、またはイントロン１１を含み得る。

【0021】

より具体的には、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン１からエクソン１２は、それぞれ配列番号４０から配列番号５１の核酸配列を含み得るか、またはそれらからなり得る。ＤＷＦ５－１遺伝子のイントロン１からイントロン１１は、それぞれ配列番号５２から配列番号６２の核酸配列を含み得るか、またはそれらからなり得る。

【0022】

一実施形態では、本発明において、ＤＷＦ５－１遺伝子は、配列番号６３の核酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る。

【0023】

本発明では、ＤＷＦ５－１遺伝子は、ＤＷＦ５－１の転写を調節するフランキング領域を含み得る。

【0024】

本明細書で使用される場合、「フランキング領域」という用語は、特定の遺伝子の両側に広がるＤＮＡ配列であり、ＲＮＡに転写されない部位である。遺伝子の５’端に隣接するＤＮＡ領域は５’フランキング領域と称され、遺伝子の３’端に隣接するＤＮＡ領域は３’フランキング領域と称される。フランキング領域は調節配列を含み、上記の配列を介して転写に関与するタンパク質に結合することによって遺伝子の転写を調節する。特に、真核生物の場合、５’フランキング領域は、エンハンサー、サイレンサー、プロモーターなどを含み、転写因子およびＲＮＡポリメラーゼなどのタンパク質に結合することによって転写を調節する。

【0025】

本発明の一実施形態では、ＤＷＦ５－１遺伝子の５’フランキング領域は、配列番号６４の核酸配列を含み得る。一実施形態では、ＤＷＦ５－１遺伝子の３’フランキング領域は、配列番号６５の核酸配列を含み得る。

【0026】

より具体的には、本発明では、ＤＷＦ５－１遺伝子はｃＤＮＡであってもよい。一実施形態では、それは配列番号１の核酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る。

【0027】

本明細書で使用される場合、「遺伝子操作」または「遺伝子操作された」という用語は、細胞またはそれによって産生される細胞に１つまたは複数の遺伝的改変を導入する行為を指す。

【0028】

本明細書で使用される場合、「遺伝子またはタンパク質の発現または活性の低下」という用語は、標的遺伝子またはタンパク質の発現または活性が、標的遺伝子またはタンパク質が相当する同じ種の野生型の発現または活性と比較して、低いことを意味する。さらに、「不活性化」とは、野生型の標的遺伝子またはタンパク質と比較して、発現しないかまたは発現しても活性を有しないタンパク質が産生されることを意味する。

【0029】

換言すれば、ＤＷＦ５－１遺伝子またはタンパク質の発現または活性の低下または不活性化とは、野生型トマトのＤＷＦ５－１遺伝子によって通常行われる生物学的機能または役割のすべてまたは一部が失われることを意味する。例えば、ＤＷＦ５－１遺伝子によって発現されるタンパク質は、未成熟で終結され得るか、またはタンパク質としてのその正常な機能を失い得る。具体的には、遺伝子編集は、標的領域に終止コドンを生成させること、または野生型のものとは異なるアミノ酸をコードするコドンを生成させることにより、ＤＷＦ５－１遺伝子をノックアウトすることであってもよい。さらに、タンパク質を産生しない非コードＤＮＡ配列に変異を導入することであってもよいが、これに限定されない。

【0030】

具体的には、遺伝子操作され形質転換されたトマトは、野生型トマトのＤＷＦ５－１遺伝子またはタンパク質と比較して、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上または約１００％低減したＤＷＦ５－１遺伝子またはタンパク質を有し得る。ＤＷＦ５－１遺伝子またはＤＷＦ５－１タンパク質の発現または活性は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して求めることができる。

【0031】

遺伝子操作は、核酸配列の改変によって誘導されてもよい。具体的には、遺伝子操作は、置換（変換）、欠失または挿入による核酸配列の改変によって誘導されてもよい。上記遺伝子操作により、本発明の形質転換されたトマトのＤＷＦ５－１遺伝子は、野生型トマトのＤＷＦ５－１遺伝子とは異なる遺伝子配列を含み得、上記遺伝子の生物学的機能を失い得る。

【0032】

より具体的には、ＤＷＦ５－１遺伝子の操作は、以下からなる群から選択される核酸配列における任意の１つの改変によって誘導され得る：
ｉ）ＤＷＦ５－１遺伝子のすべてまたは１～５０の連続するヌクレオチド配列の欠失；
ｉｉ）ＤＷＦ５－１遺伝子の１～５０のヌクレオチドを、野生型ＤＷＦ５－１遺伝子のものとは異なるヌクレオチドで置換；
ｉｉｉ）Ａ、Ｔ、ＣおよびＧからそれぞれ独立して選択される１～５０のヌクレオチドのＤＷＦ５－１遺伝子への挿入；ならびに
ｉｖ）それらの組合せ。

【0033】

より具体的には、遺伝子操作は、以下からなる群から選択される核酸配列における任意の１つの改変によって誘導され得る：
ｉ）ＤＷＦ５－１遺伝子のすべてまたは一部の欠失、例えば、ＤＷＦ５－１遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、例えば、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～３または１ヌクレオチドの欠失；
ｉｉ）ＤＷＦ５－１遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～３または１ヌクレオチドの、野生型ＤＷＦ５－１遺伝子のものとは異なるヌクレオチドによる置換；
ｉｉｉ）Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択される１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～３または１ヌクレオチドの、ＤＷＦ５－１遺伝子の任意の部位への挿入；ならびに
ｉｖ）ｉ）～ｉｉｉ）の組合せ。

【0034】

ＤＷＦ５－１遺伝子の核酸配列（「標的領域」）が改変される部分は、上記遺伝子における１個以上、３個以上、５個以上、７個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、２０個以上、２５個以上、２７個以上、３０個以上、３３個以上、３７個以上、４０個以上、４３個以上、４７個以上、または５０個以上の連続するヌクレオチド配列の領域であり得る。

【0035】

本発明の一実施形態では、ＤＷＦ５－１遺伝子の核酸配列における改変は、エクソン６（配列番号９）、エクソン７（配列番号１０）、エクソン９（配列番号１１）、エクソン１０（配列番号１２）、エクソン１１（配列番号１３）およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つのドメインの核酸配列に含まれ得る。本発明の一実施形態では、ＤＷＦ５－１遺伝子の核酸配列における改変は、エクソン６ドメインの核酸配列に含まれ得る。具体的には、ＤＷＦ５－１のエクソン６ドメインの核酸配列を含む配列番号９のヌクレオチド配列は、核酸配列における置換、欠失または挿入によって改変され得る。より具体的には、配列の改変は、ＤＷＦ５－１遺伝子もしくはＤＷＦ５－１タンパク質の発現もしくは活性を低下させるために、または終止コドンの存在をもたらすために、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン６ドメインの核酸配列を含む配列番号９のヌクレオチド配列における置換、欠失または挿入によって誘導され得る。

【0036】

本発明の形質転換されたトマトは、ＣＰＤ遺伝子またはＣＰＤタンパク質の発現または活性を低下させるようにさらに遺伝子操作されてもよい。遺伝子操作は、上記と同じである。

【0037】

本明細書で使用される場合、「ＣＰＤ（構成的光形態形成ＤＷＡＦ）」という用語は、ＤＷＦ３としても公知のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼのＣＰ９０Ａファミリーの酵素である。ブラシノリド生合成プロセス中、それはＣ６酸化経路に作用して、カサステロンをテアステロンに変換し、６－デオキシカサステロンを６－デオキシテアステロンに変換する。本発明では、上記酵素は、７－デヒドロカンペステロールを７－デヒドロカンペスタノールに還元する働きをする。

【0038】

この場合、ＣＰＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含み得る。さらに、それをコードする核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る。

【0039】

本発明では、ＣＰＤ遺伝子またはＣＰＤタンパク質の発現または活性の低下または不活性化とは、野生型トマトのＣＰＤ遺伝子によって通常行われる生物学的機能または役割のすべてまたは一部が失われることを意味する。この場合、遺伝子またはタンパク質の発現または活性の低下および不活性化は、上記と同じである。例えば、ＣＰＤ遺伝子によって発現されるタンパク質は、未成熟で終結され得るか、またはタンパク質としてのその正常な機能を失い得る。具体的には、遺伝子編集は、標的領域に終止コドンを生成させること、または野生型のものとは異なるアミノ酸をコードするコドンを生成させることにより、ＣＰＤ遺伝子をノックアウトすることであってもよい。さらに、タンパク質を産生しない非コードＤＮＡ配列に変異を導入することであってもよいが、これに限定されない。

【0040】

具体的には、遺伝子操作され形質転換されたトマトは、野生型トマトのＣＰＤ遺伝子またはタンパク質と比較して、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％低減したＣＰＤ遺伝子またはタンパク質を有し得る。ＣＰＤ遺伝子またはＣＰＤタンパク質の発現または活性は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して求めることができる。

【0041】

遺伝子操作は、核酸配列の改変によって誘導されてもよい。具体的には、遺伝子操作は、置換、欠失または挿入による核酸配列の改変によって誘導されてもよい。上記遺伝子操作により、本発明の形質転換されたトマトのＣＰＤ遺伝子は、野生型トマトのＣＰＤ遺伝子とは異なる遺伝子配列を含み得、上記遺伝子の生物学的機能を失い得る。

【0042】

より具体的には、ＣＰＤ遺伝子の操作は、以下からなる群から選択される核酸配列における任意の１つの改変によって誘導され得る：
ｉ）ＣＰＤ遺伝子のすべてまたは１～５０の連続するヌクレオチド配列の欠失；
ｉｉ）ＣＰＤ遺伝子の１～５０のヌクレオチドを、野生型ＣＰＤ遺伝子のものとは異なるヌクレオチドで置換；
ｉｉｉ）Ａ、Ｔ、ＣおよびＧからそれぞれ独立して選択される１～５０のヌクレオチドのＣＰＤ遺伝子への挿入；ならびに
ｉｖ）それらの組合せ。

【0043】

より具体的には、遺伝子操作は、以下からなる群から選択される核酸配列における任意の１つの改変によって誘導され得る：
ｉ）ＣＰＤ遺伝子のすべてまたは一部の欠失、例えば、ＣＰＤ遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、例えば、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～３または１ヌクレオチドの欠失；
ｉｉ）ＣＰＤ遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～３または１ヌクレオチドの、野生型ＣＰＤ遺伝子のものとは異なるヌクレオチドによる置換；
ｉｉｉ）Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択される１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～３または１ヌクレオチドの、ＣＰＤ遺伝子の任意の部位への挿入；ならびに
ｉｖ）ｉ）～ｉｉｉ）の組合せ。

【0044】

ＣＤＰ遺伝子の核酸配列（「標的領域」）が改変される部分は、上記遺伝子における１個以上、３個以上、５個以上、７個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、２０個以上、２５個以上、２７個以上、３０個以上、３３個以上、３７個以上、４０個以上、４３個以上、４７個以上、または５０個以上の連続するヌクレオチド配列の領域であり得る。

【0045】

本発明の一実施形態では、ＣＰＤ遺伝子の核酸配列における改変は、エクソン７（配列番号１４）、エクソン８（配列番号１５）およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つのドメインの核酸配列に含まれ得る。本発明の一実施形態では、ＣＰＤ遺伝子の核酸配列における改変は、エクソン８ドメインの核酸配列における改変であり得る。具体的には、ＣＰＤ遺伝子のエクソン８ドメインの核酸配列を含む配列番号１５のヌクレオチド配列は、核酸配列における置換、欠失または挿入によって改変され得る。より具体的には、配列の改変は、ＣＤＰの活性を低下させるために、または終止コドンの存在をもたらすために、ＣＤＰ遺伝子のエクソン８ドメインの核酸配列を含む配列番号１５のヌクレオチド配列における置換、欠失または挿入によって誘導され得る。

【0046】

本発明のＤＷＦ５－１およびＣＰＤ遺伝子に変異を含む形質転換されたトマトは、ＳＭＴ１遺伝子またはＳＭＴ１タンパク質の発現または活性を低下させるようにさらに遺伝子操作されてもよい。遺伝子操作は、上記と同じである。

【0047】

本明細書で使用される場合、「ＳＭＴ１（ステロールメチルトランスフェラーゼ１）」という用語は、ステロイドの側枝にメチル基を付加する酵素である。具体的には、ＳＭＴ１は、５－デヒドロエピステロールを７－デヒドロカンペステロールに変換する働きをする。

【0048】

この場合、ＳＭＴ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含み得る。さらに、それをコードする核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列を含み得る。

【0049】

本発明では、ＳＭＴ１遺伝子またはＳＭＴ１タンパク質の発現または活性の低下または不活性化とは、野生型トマトのＳＭＴ１遺伝子によって通常行われる生物学的機能または役割のすべてまたは一部が失われることを意味する。この場合、遺伝子またはタンパク質の発現または活性の低下および不活性化は、上記と同じである。例えば、ＳＭＴ１遺伝子によって発現されるタンパク質は、未成熟で終結され得るか、またはタンパク質としてのその正常な機能を失い得る。具体的には、遺伝子編集は、標的領域に終止コドンを生成させること、または野生型のものとは異なるアミノ酸をコードするコドンを生成させることにより、ＳＭＴ１遺伝子をノックアウトすることであってもよい。さらに、タンパク質を産生しない非コードＤＮＡ配列に変異を導入することであってもよいが、これに限定されない。

【0050】

具体的には、遺伝子操作され形質転換されたトマトは、野生型トマトのＳＭＴ１遺伝子またはＳＭＴ１タンパク質と比較して、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％低減したＳＭＴ１遺伝子またはＳＭＴ１タンパク質を有し得る。ＳＭＴ１遺伝子またはＳＭＴ１タンパク質の発現または活性は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して求めることができる。

【0051】

遺伝子操作は、核酸配列の改変によって誘導されてもよい。具体的には、遺伝子操作は、置換、欠失または挿入による核酸配列の改変によって誘導されてもよい。上記遺伝子操作により、本発明の形質転換されたトマトのＳＭＴ１遺伝子は、野生型トマトのＳＭＴ１遺伝子とは異なる遺伝子配列を含み得、上記遺伝子の生物学的機能を失い得る。

【0052】

より具体的には、ＳＭＴ１遺伝子の操作は、以下からなる群から選択される核酸配列における任意の１つの改変によって誘導され得る：
ｉ）ＳＭＴ１遺伝子のすべてまたは１～５０の連続するヌクレオチド配列領域の欠失；
ｉｉ）ＳＭＴ１遺伝子の１～５０のヌクレオチドを、野生型ＳＭＴ１遺伝子のものとは異なるヌクレオチドで置換；
ｉｉｉ）Ａ、Ｔ、ＣおよびＧからそれぞれ独立して選択される１～５０のヌクレオチドのＳＭＴ１遺伝子への挿入；ならびに
ｉｖ）それらの組合せ。

【0053】

より具体的には、遺伝子操作は、以下からなる群から選択される核酸配列における任意の１つの改変によって誘導され得る：
ｉ）ＳＭＴ１遺伝子のすべてまたは一部の欠失、例えば、ＳＭＴ１遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、例えば、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～３または１ヌクレオチドの欠失；
ｉｉ）ＳＭＴ１遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～３または１ヌクレオチドの、野生型ＳＭＴ１遺伝子のものとは異なるヌクレオチドによる置換；
ｉｉｉ）Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択される１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～３または１ヌクレオチドの、ＳＭＴ１遺伝子の任意の部位への挿入；ならびに
ｉｖ）ｉ）～ｉｉｉ）の組合せ。

【0054】

ＳＭＴ１遺伝子の核酸配列（「標的領域」）が改変される部分は、上記遺伝子における１個以上、３個以上、５個以上、７個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、２０個以上、２５個以上、２７個以上、３０個以上、３３個以上、３７個以上、４０個以上、４３個以上、４７個以上、または５０個以上の連続するヌクレオチド配列の領域であり得る。

【0055】

本発明の一実施形態では、ＳＭＴ１遺伝子の核酸配列における改変は、エクソン７（配列番号１６）、エクソン９（配列番号１７）、エクソン１１（配列番号１８）、エクソン１２（配列番号１９）およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つのドメインの核酸配列に含まれ得る。本発明の一実施形態では、ＳＭＴ１遺伝子における変異は、エクソン７およびエクソン９ドメインの核酸配列における改変を含み得る。具体的には、ＳＭＴ１遺伝子における変異は、エクソン７およびエクソン９ドメインの核酸配列を含む配列番号１６および配列番号１７のヌクレオチド配列における置換、欠失または挿入による改変であり得る。より具体的には、配列の改変は、ＳＭＴ１の活性を低下させるために、または終止コドンの存在をもたらすために、ＳＭＴ１遺伝子のエクソン７およびエクソン９ドメインの核酸配列を含む配列番号１６および配列番号１７のヌクレオチド配列における置換、欠失または挿入によって誘導され得る。

【0056】

形質転換されたトマトはホモ接合体であってもよい。すなわち、核酸配列の改変は、ＤＷＦ５－１をコードする２つの遺伝子に含まれてもよい。一実施形態では、核酸配列の改変は、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン６、エクソン７、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つのドメインをコードする２つの遺伝子に含まれ得る。本発明の一実施形態では、形質転換されたトマトは、野生型ＤＷＦ５－１遺伝子の核酸配列とは異なる、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン６ドメインをコードする２つの遺伝子において改変された配列を有し得る。

【0057】

形質転換されたトマトでは、核酸配列の改変は、ＤＷＦ５－１、ＣＰＤおよびＳＭＴ１をコードする２つの遺伝子に含まれてもよい。この場合、形質転換されたトマトは、野生型ＣＰＤ遺伝子の核酸配列とは異なる、ＣＰＤ遺伝子のエクソン７、エクソン８およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つのドメインをコードする２つの遺伝子において改変された配列を有し得る。さらに、核酸配列の改変は、ＳＭＴ１遺伝子のエクソン７、エクソン９、エクソン１１、エクソン１２およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つのドメインをコードする２つの遺伝子に含まれ得る。この場合、核酸配列の改変は、上記と同じである。

【0058】

本発明の一実施形態では、形質転換されたトマトにおいて、核酸配列の改変は、それぞれがＤＷＦ５－１のエクソン６ドメイン、ＣＤＰのエクソン７ドメイン、ならびにＳＭＴ１のエクソン７およびエクソン９ドメインをコードする２つの遺伝子に含まれ得る。

【0059】

本発明による形質転換されたトマトがホモ接合体であり、かつＤＷＦ５－１遺伝子またはタンパク質の発現または活性が低下または不活性化される場合、トマトは種子を形成することができる。形質転換されたトマトがホモ接合体であり、かつＤＷＦ５－１、ＣＰＤおよびＳＭＴ１遺伝子またはタンパク質の発現または活性が低下または不活性化される場合、トマトは果実を生じない可能性があり、種子を形成しない可能性がある。

【0060】

本発明の別の態様では、ＤＷＦ５－１遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的に結合する１つまたは２つ以上のｓｇＲＮＡを含むベクターが提供される。ここで、ＤＷＦ５－１は、上記と同じである。さらに、ＤＷＦ５－１遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。

【0061】

本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」という用語は、ゲノム編集を通じて細胞内の標的核酸を認識し、標的核酸を切断、挿入、またはライゲーションするポリヌクレオチドを指す。ｇＲＮＡは、標的核酸中の標的配列に相補的な配列を含み得る。ｇＲＮＡは、標的核酸中のＰＡＭの５’または３’方向に２～２４の連続するヌクレオチド（以下、「ｎｔ」と称する）」のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドであり得る。ｇＲＮＡの長さは、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔまたは２４ｎｔであり得る。

【0062】

ｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。ｓｇＲＮＡは、標的核酸配列に特異的なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と複合体を形成するトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、標的遺伝子中の標的核酸配列（標的領域）（スペーサー領域、標的ＤＮＡ認識配列、塩基対合領域などとも称される）に相補的なヌクレオチド配列（標的化配列）と、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に結合するためのヘアピン構造とを有する部分を含み得る。より具体的には、標的遺伝子中の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列（標的化配列）、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に結合するためのヘアピン構造、およびターミネーター配列を含む部分を含み得る。上記の構造は、５’から３’へと順に順次存在してもよいが、これに限定されない。ｓｇＲＮＡが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要領域と、標的遺伝子に相補的なヌクレオチド配列とを含む限り、いずれの種類のｓｇＲＮＡが使用されてもよい。

【0063】

本発明では、ｓｇＲＮＡは、ＤＷＦ５－１のゲノムＤＮＡの核酸配列に相補的に結合し得る。具体的には、ｓｇＲＮＡは、配列番号６３に相補的に結合し得る。より具体的には、ｓｇＲＮＡは、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン１からエクソン１２、イントロン１からイントロン１１、５’フランク領域および３’フランク領域からなる群から選択される１つまたは２つ以上のドメインの核酸配列に相補的に結合し得る。より具体的には、それは配列番号４０から配列番号６２、配列番号６４および配列番号６５からなる群から選択される１つまたは２つ以上のドメインの核酸配列に相補的に結合し得る。

【0064】

本発明では、ｓｇＲＮＡは、ＤＷＦ５－１のｃＤＮＡの核酸配列に相補的に結合し得る。具体的には、ｓｇＲＮＡは、配列番号１の核酸配列に相補的に結合し得る。

【0065】

本発明の一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン６、エクソン７、エクソン９、エクソン１０およびエクソン１１からなる群から選択されるいずれか１つのドメインの核酸配列に相補的に結合し得る。一実施形態では、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン６ドメインの核酸配列に結合するｓｇＲＮＡは、配列番号２０または配列番号２１のヌクレオチド配列を含み得る。一実施形態では、エクソン７ドメインの核酸配列に結合するｓｇＲＮＡは、配列番号２２のヌクレオチド配列を含み得る。一実施形態では、エクソン９ドメインの核酸配列に結合するｓｇＲＮＡは、配列番号２３または配列番号２４のヌクレオチド配列を含み得る。一実施形態では、エクソン１０ドメインに結合するｓｇＲＮＡは、配列番号２５のヌクレオチド配列を含み得る。一実施形態では、エクソン１１ドメインの核酸配列に結合するｓｇＲＮＡは、配列番号２６のヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、本発明の一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、エクソン６ドメインの核酸配列に相補的に結合する配列番号２０および配列番号２１のヌクレオチド配列を含み得るか、またはそれらからなり得る。

【0066】

本発明では、ベクターは、ＣＰＤ遺伝子のヌクレオチド配列に相補的に結合するｓｇＲＮＡをさらに含んでもよい。ＣＰＤ遺伝子に相補的に結合するｓｇＲＮＡは、ＣＰＤ遺伝子のエクソン７またはエクソン８ドメインのヌクレオチド配列に相補的に結合し得る。ＣＰＤ遺伝子のエクソン７ドメインに結合するｓｇＲＮＡは、配列番号２７のヌクレオチド配列を含み得る。ＣＰＤ遺伝子のエクソン８ドメインに結合するｓｇＲＮＡは、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１のヌクレオチド配列を含み得る。本発明の一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、エクソン８ドメインのヌクレオチド配列に相補的に結合する配列番号２８および配列番号２９のヌクレオチド配列を含み得る。

【0067】

本発明では、ＤＷＦ５およびＣＰＤ遺伝子のヌクレオチド配列に相補的に結合するｓｇＲＮＡを含むベクターは、ＳＭＴ１遺伝子のヌクレオチド配列に相補的に結合するｓｇＲＮＡをさらに含んでもよい。この場合、ＳＭＴ１遺伝子のヌクレオチド配列に相補的に結合するｓｇＲＮＡは、ＳＭＴ１遺伝子のエクソン７、エクソン９、エクソン１１およびエクソン１２からなる群から選択される１つまたは２つ以上のドメインのヌクレオチド配列に相補的に結合し得る。ＳＭＴ１遺伝子のエクソン７ドメインに結合するｓｇＲＮＡは、配列番号３２のヌクレオチド配列を含み得る。ＳＭＴ１遺伝子のエクソン９ドメインに結合するｓｇＲＮＡは、配列番号３３のヌクレオチド配列を含み得る。ＳＭＴ１遺伝子のエクソン１１ドメインに結合するｓｇＲＮＡは、配列番号３４のヌクレオチド配列を含み得る。ＳＭＴ１遺伝子のエクソン１２ドメインに結合するｓｇＲＮＡは、配列番号３５のヌクレオチド配列を含み得る。本発明の一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、エクソン７およびエクソン９ドメインのヌクレオチド配列に相補的に結合する配列番号３２および配列番号３３のヌクレオチド配列を含み得る。この場合、ＤＷＦ５およびＣＰＤ遺伝子のヌクレオチド配列に相補的に結合するｓｇＲＮＡは、上記と同じである。

【0068】

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいたパリンドローム反復）関連タンパク質」（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸が二本鎖または一本鎖（ｄｓＤＮＡ／ＲＮＡおよびｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ）を有する場合に、核酸を認識および切断することができる酵素を指す。具体的には、それはｓｇＲＮＡに結合した二本鎖または一本鎖核酸を認識し、それを切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質には、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、およびその機能を有する変異体が含まれる。

【0069】

ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａまたはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａの細菌に由来してもよい。

【0070】

本発明では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃａｓ１３、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃｓｎ１、Ｃｓｘ１２、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｕｌ９６６からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＣａｓ９であり得る。

【0071】

Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドｓｇＲＮＡと複合体を形成して、リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）の形態として作用し得る。ここで、「リボ核タンパク質（ＲＮＰ）」とは、ＲＮＡおよびタンパク質の複合体であり、本発明ではＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体であり得る。

【0072】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞に導入され、次いで宿主細胞のゲノムに組み換えられ、挿入されることができる。あるいは、ベクターは、エピソームとして自律複製することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸ビヒクルであると理解される。そのようなベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、ミニ染色体およびそれらの類似体が挙げられる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0073】

本発明の一実施形態では、ベクターは、配列番号３６から配列番号３８のヌクレオチド配列のいずれか１つを含み得る。さらに、本発明では、ベクターは、配列番号３６から配列番号３８のいずれか１つと約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の配列相同性を有する。さらに、ベクターは、標的生物または細胞における発現のために部分的または完全にコドン最適化されてもよい。

【0074】

ベクターは、ポリヌクレオチドが宿主細胞において発現され得るように、適切なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。本発明のベクターを植物細胞に適用する場合、本発明のプロモーターは、植物体内への遺伝子導入のために使用されるプロモーターを含んでもよい。プロモーターの例としては、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＰＭプロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、サトウキビバシリフォームウイルスプロモーター、コメリナイエローモトルウイルスプロモーター、リブロース－１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）光誘導性プロモーター、イネサイトゾルトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）プロモーター、およびオクトピンシンターゼプロモーターが挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0075】

具体的には、ベクターは、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどであってもよい。さらに、ベクターは、商業的に開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ－ＡＭＰなど）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来プラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９など）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）、酵母由来プラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０など）、ファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰなど）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなど）、昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルスなど）などであってもよい。ベクターのタンパク質の発現レベルおよび改変は宿主細胞に依存して異なるので、目的に最も適した宿主細胞を選択し使用することが好ましい。

【0076】

本発明では、ベクターは、選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーは、従来の化学的方法により選択され得る特徴を有する核酸配列であり、形質転換された細胞と非形質転換細胞とを識別することができるすべての遺伝子を含む。マーカーの例としては、グリホサート、グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンなどの除草剤耐性遺伝子、ならびにカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシンおよびクロラムフェニコールなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられ得るが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、選択マーカーは、ハイグロマイシンおよび／またはホスフィノトリシンであり得る。

【0077】

本発明の別の態様では、ｓｇＲＮＡをコードする遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用してトマトに導入することを含む、高濃度の７－デヒドロコレステロールを含有する形質転換されたトマトを生産するための方法が提供される。

【0078】

形質転換された植物は、当技術分野で公知の植物形質転換方法によって構築されてもよい。当業者は、宿主として選択された植物の特徴を考慮して、特定の植物に適した公知の形質転換方法を選択し実行することができる。具体的には、植物の形質転換方法として、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用する形質転換方法が使用され得る。

【0079】

「アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用する形質転換方法」とは、植物の根および茎に腫瘍を発生させるグラム陰性土壌細菌であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用して、植物細胞に外部遺伝子を形質転換する方法である。これは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓなどのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に見出される腫瘍誘導プラスミド（Ｔｉプラスミド）のＴ－ＤＮＡ（トランスファーＤＮＡ）を植物ゲノムに挿入する現象を使用する方法である。

【0080】

本発明の一実施形態では、核酸配列の改変が、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン６ドメインに含まれる場合、ホモ接合型トマト（Ｔ１）は種子を産生することができる（図１８）。さらに、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン６ドメインの核酸配列に改変を有するホモ接合型Ｔ２世代トマトは正常に成長して種子を産生し（図２６）、果実および根には７－デヒドロコレステロールが高濃度で蓄積する（表１４、図２１および図２２）。しかしながら、形質転換されたトマトが、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン６ドメインおよびＣＰＤ遺伝子のエクソン８ドメインにおける核酸配列に改変を含んだ場合、トマトはインタクトな植物体に成長することができなかった。さらに、形質転換されたトマトが、ＤＷＦ５－１遺伝子のエクソン６ドメイン、ＣＰＤ遺伝子のエクソン８ドメイン、ＳＭＴ１遺伝子のエクソン７およびエクソン９ドメインにおける核酸配列に改変を有するホモ接合体であった場合、果実は産生されなかった。

【実施例】

【0081】

以下、本発明を、以下の実施例により詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は本発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲はこれらの実施例だけに限定されない。

【0082】

実施例１．ＤＷＦ５、ＣＰＤおよびＳＭＴ１の遺伝子編集のためのＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターの構築
ＤＷＦ５－１（以下、「ＤＷＦ５」と称する、図１）、ＣＰＤ（図２）およびＳＭＴ１（図３）の遺伝子編集のためのｓｇＲＮＡの設計および選択は、Ｃａｓ－Ｄｅｓｉｇｎｅｒウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｄｅｓｓｄａｉｇｎｅｒ／）を通じて行った。標的遺伝子の名称または配列、および動物または植物の種を選択し、次いで使用されるＣａｓ９を選択し、ｓｇＲＮＡを、遺伝子中の必要なエクソン部位、ｓｇＲＮＡのＧＣ含有量、およびミスマッチが存在する場合のオフターゲットの結果に基づいて設計した。Ｃａｓ９はＮＧＧ－３’のＰＡＭ配列を有し、トマト（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）を植物として選択した（図１～図３）。さらに、ｓｇＲＮＡをスクリーニングして、遺伝子編集効率を確認した（表２および図１～図３）。

【0083】

具体的には、ＲＧＥＮ（ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ）分析を使用して、ｓｇＲＮＡの標的化の妥当性を行った。ＤＮＡ鋳型を、上記増幅されたＰＣＲ産物（ＰＣＲ産物）からＰＣＲ精製キットを使用して精製し、次いでＤＮＡ鋳型の量を測定し、ＲＧＥＮを表１に示す組合せで行った。３７℃で１時間インキュベーションした後、３μＬの６×ＤＮＡ－Ｐｕｒｐｌｅ色素をそれぞれに入れ、凍結し、次いで２．５％ゲルにロードした。遺伝子編集効率を、ＤＮＡ鋳型中の未切断バンドの程度を分析することによって分析した。

【0084】

【表1】

【0085】

結果として、ＤＷＦ５遺伝子を標的として構築されたｓｇＲＮＡの場合、Ｄ５－４およびＤ５－６を除くすべてのｓｇＲＮＡが、ＤＷＦ５遺伝子を標的化できたことが確認された（図４）。Ｃ１を除くすべてのＣＰＤ ｓｇＲＮＡがＣＰＤ遺伝子を標的とし（図５）、構築されたＳＭＴ１ ｓｇＲＮＡのすべてがＣＰＤ遺伝子を標的とした（図６）。

【0086】

【表2】

【0087】

ｓｇＲＮＡスクリーニングの結果に基づいて、ＤＷＦ５、ＣＰＤまたはＳＭＴ１を標的とするように構築されたｓｇＲＮＡを含むＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターを最終的に構築した。ｐＮＧＰＪ００１４ベクター（配列番号３９）を、カナマイシン耐性およびハイグロマイシン耐性遺伝子を有するｐＣＡＭＢＩＡ１３００プラスミドを基礎にして構築した。

【0088】

ｐＮＧＰＪ００１４ベクターは、カナマイシンおよびハイグロマイシン抗生物質による選択のための抗生物質カセットと、Ｃａｓ９を用いて合成されたポリシストロニックｔＲＮＡ－ｇＲＮＡカセットとを有する。Ｃａｓ９は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ユビキチン１０（Ｕｂｉ１０）プロモーターによって発現されるように構築し、ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡは、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ユビキチン６プロモーターによって発現されるように構築した。

【0089】

Ｃａｓ９タンパク質を核に送達するために、ＳＶ４０（ＰＫＫＫＲＫＶ）核局在化シグナル配列をＣａｓ９オープンリーディングフレームのＮ末端に付加し、バイパータイト（Ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）（ＫＥＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）核局在化シグナル配列をＣ末端に付加した。この際、１～３種類の遺伝子を標的とするＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターを構築した。さらに、１つの標的当たり２種類のｓｇＲＮＡをロードするように構築した。ＤＷＦ５遺伝子を標的とするＤ５－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号２０）およびＤ５－２ ｓｇＲＮＡ（配列番号２１）のヌクレオチド配列を含むＣａｓ－ｓｇＲＮＡベクターを、「Ｄ１００」（配列番号３６）と命名した（図７）。

【0090】

ＣＰＤおよびＤＷＦ５遺伝子を標的とするＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターを、「Ｄ１２０」（配列番号３７）と命名した。この際、ＣＰＤ ｓｇＲＮＡは、Ｃ２（配列番号２８）およびＣ３（配列番号２９）のヌクレオチド配列を含み、ＤＷＦ５ ｓｇＲＮＡは、Ｄ５－１（配列番号２０）およびＤ５－２（配列番号２１）のヌクレオチド配列を含む（図８）。

【0091】

ＳＭＴ１、ＣＰＤおよびＤＷＦ５遺伝子を標的とするＣａｓ９－ｓｇＲＮＡベクターを、「Ｄ１２１」（配列番号３８）と命名した。この際、ＳＭＴ１ ｓｇＲＮＡは、Ｓ１（配列番号３２）およびＳ２（配列番号３３）のヌクレオチド配列を含み、ＣＰＤ ｓｇＲＮＡは、Ｃ２（配列番号２８）およびＣ３（配列番号２９）のヌクレオチド配列を含み、ＤＷＦ５ ｓｇＲＮＡは、Ｄ５－１（配列番号２０）およびＤ５－２（配列番号２１）のヌクレオチド配列を含む（図９）。

【0092】

実施例２．ＤＷＦ５、ＣＰＤおよびＳＭＴ１の遺伝子編集によるトマトの形質転換
図１０の概略図に示すように、トマトの形質転換を行った。各ステップで使用した培地およびホルモンは、表３～表８に記載されたものと同じ様式で調製し、使用した。

【0093】

【表3】

【0094】

【表4】

【0095】

【表5】

【0096】

【表6】

【0097】

【表7】

【0098】

【表8】

【0099】

【表9】

【0100】

具体的には、トマト種子を７０％エタノールで５秒間消毒し、２％漂白剤で２０分間消毒した。消毒した種子を滅菌水で４～５回洗浄し、次いで滅菌濾紙に載せて水分を除去した。消毒したトマト種子を播種培地ＴＭＳ（表３）に移し、２５℃暗培養条件下で３日間培養し、次いで明培養条件下で培養した。播種後、子葉が１ｃｍ～１．５ｃｍに成長したら（９～１２日間）、トマトの胚軸の頂点を０．７ｃｍ～１．０ｃｍにカットし、約１８～２０個（４、５、５および４、または５、５、５および５、それぞれ合計１８～２０個）をＴＰＣ培地プレート（表４）に植えて、明培養条件（１６Ｌ／８Ｄ）下で１日培養した。

【0101】

アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＧＶ３１０１株、ＤＳＭＺ、カタログ番号ＤＳＭ１２３６４）を、１００ｍＭのＡＳ（アセトシリンゴン）および５０ｍｇ／Ｌのリファンピシン、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｋｍ）を含有する５０ｍＬの細菌培養培地（ＹＥＰ）で、暗培養条件下、２８℃、１日～２日間培養し、ＯＤ６００値を０．８～１．２とした。

【0102】

培養された細菌を４℃、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を除去し、ペレットを同量のトマト共培養（ＴＣＣ）培地（表５）に再懸濁し、希釈して、ＯＤ値を０．５とした。

【0103】

上記方法により調製された細菌培養液（０．５のＯＤ６００値）４０ｍＬと、明培養条件下で前処理された植物体とを５０ｍＬチューブ（２００個の種子の播種に基づく）に入れ、２５℃、室温で２０～３０分間培養した。共培養した外植片を滅菌濾紙に移し、乾燥させて、できるだけ水分を除去し、次いで約１８～２０個（４、５、５および４、または５、５、５および５、それぞれ合計１８～２０個）をＴＣＣ培地プレート（表５）に植え、２５℃、明培養条件（１６Ｌ／８Ｄ）下で２日間培養した。２日間の共培養の後、外植片をシュート選択培地（ＴＳＩ、表７）に移し、次いで植物インキュベーターにて２５℃、明培養条件（１６Ｌ／８Ｄ）下で培養した。この際、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）が増殖している場合には、３００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを共培養液体培地に添加し、洗浄し、次いで濾紙上で乾燥させ、次いで再度培地に植えた。

【0104】

カルスは、植付け後３～４週間の間に切断部分から分化した。シュートが分化されたカルスから誘導され、１ｃｍを超えて成長したら、それらを発根培地（表９）に移して根を誘導した。この際、カルスをできるだけ除去し、発根をシュート部分を移植することにより誘導した。根の発根が完了したら、根を水道水で洗浄して根に残っているアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を除去し、土壌に移し、培養室環境を維持しつつ外部環境（湿度変化および非滅菌条件）に適応させながら培養した。

【0105】

カルスにおける植物体分化の段階に応じた対象物の変化を図１１に示す。

【0106】

結果として、図１２から図１４に示すように、Ｄ１００（図１２）またはＤ１２１（図１４）で形質転換されたトマトシュートは、植物体として正常に成長したが、Ｄ１２０で形質転換されたトマト外植片は、正常に成長しなかった（図１３）。

【0107】

実施例３．ＤＷＦ５、ＣＰＤおよびＳＭＴ１の遺伝子編集によって生成されたトマト植物体の配列決定
実施例２で得られたトマト植物体の形質転換を確認するために、Ｔ７Ｅ１アッセイ（図１５）およびサンガー配列決定（図１６および表１２）を、Ｄ１００またはＤ１２１で形質転換されたトマト対象物に対して行った。

【0108】

具体的には、Ｔ７Ｅ１アッセイでは、まず標的領域をＰＣＲによって増幅し、次いで増幅されたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。精製されたＰＣＲ産物をＤＮＡ鋳型として、ヘテロデュプレックス形成を、表１１の条件下および表１０に示す組合せで行った。次いで、１μＬのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）を添加し、３７℃で３０分間反応させた。最後に、１μＬのプロテイナーゼＫで処理し、３７℃で５分間反応させてＴ７Ｅ１酵素の活性を不活性化した。遺伝子編集効率は、ＰＣＲ産物中の断片濃度の程度で評価した。

【0109】

【表10】

【0110】

【表11】

【0111】

サンガー配列決定を以下のように行った。ｓｇＲＮＡ標的領域を、２０μＬの反応ボリュームで、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してゲノムＤＮＡ抽出物から増幅した。その後、ＰＣＲ産物を、Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｆａｃｔ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用して、ＴＡベクターにクローニングし、サンプル毎に１５～２０個のクローン化されたクローンを個別に配列決定した。結果として、Ｄ１００を用いた形質転換により生じたＤＷＦ５遺伝子が欠失された１４個のトマトホモ接合体を同定した（図１５および図１６）。さらに、Ｄ１２１で形質転換されたＤＷＦ５、ＣＰＤおよびＳＭＴ１遺伝子が欠失された１個のトマトホモ接合体を同定した（図１５および表１２）。Ｄ１２１で形質転換された植物体の場合、遺伝子欠失により生じる植物ホルモンの不均衡により、果実が形成されない現象がもたらされた。

【0112】

【表12】

【0113】

実施例４．ＤＷＦ５遺伝子編集によって生じたトマトの種子および遺伝子表現型解析の取得
遺伝的ハサミにより、ＤＷＦ５遺伝子が欠失されたトマト（Ｔ０世代）７つから得られた種子（ＤＷＦ５ホモ接合体）を播種し、次世代配列決定（ＮＧＳ）を行って、次世代（Ｔ１）のＤＷＦ５遺伝子が欠失されたトマトが得られるかどうかを判定した。

【0114】

結果として、７個のＴ０対象物から得られた２３個の種子（Ｔ１）のうち１２個がホモ接合型であったことが確認された（図１７）。さらに、上記１２個の種子のうち、遺伝子編集効率（インデル効率）が１００％である６つの種子を選抜し、種子（Ｔ２）の発生および得られた種子の量を確認した。結果として、６個の対象物のうち５個で、種子が産生された（図１８および表１３）。さらに、野生型トマトと比較して、ＤＷＦ５遺伝子が欠失されたトマトの果実、葉、および茎の表現型に有意差は観察されなかった。この際、野生型トマト（野生型、ＷＴ）が対照群である。

【0115】

【表13】

【0116】

実施例５．Ｔ２世代の表現型解析
実施例５．１．ビタミンＤ３前駆体の分析
実施例４で得られた種子（Ｔ２）を播種し、Ｔ２世代のトマトに含まれるプロビタミンＤ３の含有量をＬＣ／ＭＳにより測定した。この際、野生型トマト（ＷＴ）、＃３－１４系統（Ｄ１００－３－１４）のＴ２世代（４個の対象物）および＃７－１系統（Ｄ１００－７－１）のＴ２世代（１１個の対象物）をサンプルとして使用した。動物プロビタミンＤ３の前駆体である７－デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３、ｓｉｇｍａ、カタログ３０８００、ロットＢＣＢＳ６０２１）を、標準試薬として使用した。さらに、対照群として、野生型（ＷＴ）トマトをサンプルとして使用した。

【0117】

具体的には、ある特定の量の各サンプルを秤量し、３０ｍＬのエタノールおよび１ｍＬの１０％エタノール性ピロガロを添加した。その後、３ｍＬの９０％水酸化カリウム（ＫＯＨ）を添加し、８０℃の水浴中で１０分毎にボルテックスしながら３０分間反応させた。反応が完了した後、混合物を室温に冷却し、次いで３０ｍＬの蒸留水および３０ｍＬのｎ－ヘキサンを添加し、１時間振盪することにより混合した。その後、上清を分液ロートに移し、３０ｍＬのｎ－ヘキサンを水層に添加し、ボルテックスにより混合した。上清を再度分液ロートに移し、１００ｍＬの蒸留水をヘキサン層に添加して水で洗浄した。水を用いた洗浄プロセスを２回繰り返した。その後、ヘキサン層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、次いで濃縮し、５ｍＬのメタノール（ＭｅＯＨ）に溶解し、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルタを通して濾過して、試験溶液を調製した（図１９）。

【0118】

上記プロセスにより調製された試験溶液に含まれる７－デヒドロコレステロールを、図２０の条件下でＬＣ／ＭＳにより測定した。

【0119】

結果として、７－デヒドロコレステロールは、ＷＴトマトの果実部では検出されなかったが、７－デヒドロコレステロールは、Ｔ２世代の＃３－１４系統では４個、＃７－１系統では１１個の対象物（計１５個）において検出された（表１４、図２１および図２２）。

【0120】

【表14】

【0121】

実施例５．２．トマトの根におけるビタミンＤ３前駆体の分析
実施例４で得られた種子（Ｔ２）を７０％エタノールで５秒間消毒し、２％漂白剤で２０分間消毒した。消毒した種子を滅菌水で４～５回洗浄し、次いで滅菌濾紙に載せて水分を除去した。種子をＭＳ培地（表１５）に播種し、２５℃、１６時間の明／８時間の暗サイクル条件下で培養した。２～３週間後、根が形成されたら、根をプレートから取り出し、次いで根（毛状根）を回収し、ＧＣ－ＭＳ法により７－ＤＨＣ含有量について分析した。

【0122】

【表15】

【0123】

ＧＣ－ＭＳ代謝分析を、１０ｍｇの根と３ｍＬの０．１％アスコルビン酸－エタノールおよび０．０５ｍＬの５α－コレスタンとを混合して根抽出物を得ることによって行った。抽出物を８０％水酸化カリウムと混合してケン化を進行させ、次いでヘキサンと混合して親油性物質を分離した。分離された親油性物質を、ピリジンおよびＮ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを使用して誘導体化し、次いでＧＣ－ＭＳ（ガスクロマトグラフィー－四重極質量分析）分析を行った。定量的および定性的分析のために、標準物質から計算された検量線を使用した。

【0124】

結果として、７－デヒドロコレステロールは、ＷＴトマトの根では検出されなかったが、７－デヒドロコレステロールは、Ｔ３世代の＃３系統（３－１４－２９）および＃７系統（７－１－１５）において、それぞれ１．３μｇ／ｇおよび１．０μｇ／ｇの濃度で検出された（図２８）。

【0125】

実施例５．３．Ｔ２世代での抗生物質不含対象物の選択
実施例４で得られたＴ２世代の＃３－１４系統（Ｄ１００－３－１４）および＃７－１系統（Ｄ１００－７－１）の中から、抗生物質耐性のない対象物を選択するために、対象物のｍＲＮＡにおける抗生物質耐性遺伝子の発現を、ＲＴ－ＰＣＲにより確認した。

【0126】

結果として、＃３－１４系統（Ｄ１００－３－１４）の５個の対象物および＃７－１系統（Ｄ１００－７－１）の１１個の対象物が、抗生物質耐性なしの対象物であることが確認された（図２３）。

【0127】

抗生物質耐性のない対象物として選択された対象物のうち、＃３－１４－２９および＃７－１－１５の対象物を、ＤＷＦ５遺伝子編集についてチェックした。

【0128】

結果として、図２４および図２５に示すように、当該対象物のヌクレオチド配列は、野生型（ＷＴ）トマトのものとは異なり（図２４）、エクソン６に相当する配列が欠失していたことから、アミノ酸配列も野生型（ＷＴ）トマトのものとは異なることが確認された（図２５）。

【0129】

実施例５．４．Ｔ２世代の表現型および種子生成の確認
実施例４で得られたＴ２世代の＃３－１４系統（Ｄ１００－３－１４）および＃７－１系統（Ｄ１００－７－１）を、表現型および種子産生についてチェックした。具体的には、主に果実で発現されるＤＷＦ５遺伝子（ＤＷＦ５－１、配列番号６３）のみを欠失させた場合、野生型トマトと比較して、果実、葉および茎の表現型に有意差は観察されなかった（図２７）。したがって、本発明では、ＤＷＦ５－１（配列番号６３）遺伝子のみを欠失させることにより、プロビタミンＤ３の濃縮を誘導しつつ、種子生成の問題を補完することができるトマトを生産することができた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18a】

【図18b】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【配列表】

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【国際調査報告】