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▶ ザ ユナイテッド ステイツ ガバメント アズ リプレゼンティド バイ ザ デパートメント オブ ヴェテランズ アフェアーズの特許一覧 ▶ ラッシュ ユニヴァーシティ メディカル センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-04
(54)【発明の名称】神経系損傷及び障害の治療のための安息香酸塩
(51)【国際特許分類】
A61K 31/192 20060101AFI20250128BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20250128BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20250128BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20250128BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20250128BHJP
A61K 31/216 20060101ALI20250128BHJP
A61K 31/045 20060101ALI20250128BHJP
【ＦＩ】
A61K31/192
A61P25/02
A61P25/00
A61P25/24
A61P25/28
A61K31/216
A61K31/045
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536317
(86)(22)【出願日】2022-12-15
(85)【翻訳文提出日】2024-08-09
(86)【国際出願番号】 US2022053034
(87)【国際公開番号】W WO2023114414
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/290,633
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519376579
【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ ガバメント アズ リプレゼンティド バイ ザ デパートメント オブ ヴェテランズ アフェアーズ
(71)【出願人】
【識別番号】517318218
【氏名又は名称】ラッシュ ユニヴァーシティ メディカル センター
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100183379
【弁理士】
【氏名又は名称】藤代 昌彦
(72)【発明者】
【氏名】パハン カリパダ
【テーマコード（参考）】
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA03
4C206DA13
4C206DA17
4C206DA22
4C206DB04
4C206DB13
4C206DB16
4C206DB47
4C206DB54
4C206FA08
4C206FA09
4C206FA32
4C206FA33
4C206FA35
4C206KA12
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA41
4C206MA72
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZA12
4C206ZA15
4C206ZA20
4C206ZB22
(57)【要約】
対象における神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか、又はその重症度を低減させるための安息香酸の塩及びそのプロドラッグが開示される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか又はその重症度を低減させることを必要とする対象において、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか又はその重症度を低減させる方法であって、対象に有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグを投与し、それによって神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか又はその重症度を低減させることを含む、方法。
【請求項2】
安息香酸塩が、存在する場合、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、安息香酸カルシウム、２－アミノ安息香酸、３－アミノ安息香酸、４－アミノ安息香酸、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
安息香酸塩のプロドラッグが、存在する場合、桂皮酸ベンジル、三安息香酸グリセリル、桂皮酸、酢酸ベンジル、ベンジルアルコール、安息香酸、キナ酸、フェニルアラニン、チロシン、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
対象が、尿素サイクル障害、グリシン脳症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、又は自閉症スペクトラム障害と診断されていない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
対象が、投与するステップの前に神経系損傷と診断されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
神経系損傷が、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷又は末梢神経損傷である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
神経系損傷が、脊髄損傷（ＳＣＩ）、脊髄挫傷、又は神経挫滅損傷である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグが、ＳＣＩ、脊髄挫傷、又は神経挫滅損傷後２４時間以内に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
神経系損傷が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
神経系損傷が、脱髄障害である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
脱髄障害が、視神経炎、Ｘ副腎白質ジストロフィー、クラッベ病、進行性多巣性白質脳症、副腎脊髄神経障害、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、多発性硬化症、バロー病（同心円硬化症）、シャルコ・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ－Ｉ関連性骨髄症、視神経脊髄炎（デビック病）、シルダー病、横断性脊髄炎、又はそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグが、外傷性脳損傷後２４時間以内に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグを投与することが、グリア炎症の低減、運動機能若しくは協調性の改善、又は学習若しくは記憶機能障害の改善をもたらす、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグを投与することが、気うつに関連する症状を予防するか、又はその重症度を低減させる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
安息香酸塩又はそのプロドラッグが、安息香酸塩又はそのプロドラッグ及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として投与され、前記組成物が、組成物の０．１重量％超の安息香酸塩又はそのプロドラッグを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
安息香酸塩又はそのプロドラッグが、経口投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか又はその重症度を低減させることを必要とする対象において、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか又はその重症度を低減させる方法であって、対象に有効量の安息香酸ナトリウムを投与し、それによって神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか又はその重症度を低減させることを含む、方法。
【請求項18】
対象が、尿素サイクル障害、グリシン脳症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、又は自閉症スペクトラム障害と診断されていない、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
対象が、投与するステップの前に神経系損傷と診断されている、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
神経系損傷が、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷又は末梢神経損傷である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
神経系損傷が、脊髄損傷（ＳＣＩ）、脊髄挫傷、又は神経挫滅損傷である、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
有効量の安息香酸ナトリウムが、ＳＣＩ、脊髄挫傷、又は神経挫滅損傷後２４時間以内に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
神経系損傷が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
神経系損傷が、脱髄障害である、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
脱髄障害が、視神経炎、Ｘ副腎白質ジストロフィー、クラッベ病、進行性多巣性白質脳症、副腎脊髄神経障害、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、多発性硬化症、バロー病（同心円硬化症）、シャルコ・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ－Ｉ関連性骨髄症、視神経脊髄炎（デビック病）、シルダー病、横断性脊髄炎、又はそれらの組み合わせである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
有効量の安息香酸ナトリウムが、外傷性脳損傷後２４時間以内に投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
有効量の安息香酸ナトリウムを投与することが、グリア炎症の低減、運動機能若しくは協調性の改善、又は学習若しくは記憶機能障害の改善をもたらす、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
有効量の安息香酸ナトリウムを投与することが、気うつに関連する症状を予防するか、又はその重症度を低減させる、請求項１７～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
安息香酸ナトリウムが、安息香酸ナトリウム及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として投与され、前記組成物が、組成物の０．１重量％超の安息香酸ナトリウムを含む、請求項１７～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
安息香酸ナトリウムが、経口投与される、請求項１７～２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願された米国特許仮出願第６３／２９０，６３３号の優先権を主張し、これは、その全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願された米国特許仮出願第６３／２９０，６３３号の優先権を主張し、これは、その全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
毎年、米国では約１７０万人、世界では１，０００万の人々が外傷性脳損傷（ＴＢＩ）に苦しんでいる。ＴＢＩは、米国における死亡及び身体障害の主な原因であり、全ての損傷関連死亡の約３０％に寄与している。全ての人々にリスクがあるが、軍人は、職業の性質によりＴＢＩのリスクがより高い。ＴＢＩ中、慢性神経炎症並びに脱髄及び／又は再髄鞘形成不全が、軍人の間での身体障害に重要に寄与する。ＴＢＩに関連するある特定の身体的、感情的、及び認知的問題を低減させるか、又は取り除くための治療があるが、ＴＢＩから回復するためには、人にとって効果的な神経保護療法が必要である。
【0003】
ＴＢＩ及び他の神経系損傷の後に、一連の複雑な病態生理学的事象が生じ、構造的ダメージ及び機能的欠損の両方を引き起こす。神経系におけるグリア細胞の活性化及び関連する炎症促進分子の上方調節は、いくつかの神経変性疾患及び神経炎症性疾患の病因に関与する。したがって、急性及び慢性ＴＢＩの両方の主な特徴のうちの１つはまた、ＴＢＩの数分以内に証明される神経炎症である。局所ＴＢＩ及びびまん性ＴＢＩの実験動物からの研究は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、及び誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）などの様々な炎症促進分子がＴＢＩの病因に関与することを示した。多くの臨床研究は、健常な対照と比較して、ＴＢＩ患者のＣＳＦ及び血清中のＩＬ－１β及びＴＮＦ－αの増加を示した。脳における広域スペクトルの炎症促進分子の上方調節は、浮腫、血液脳関門（ＢＢＢ）の漏出、ニューロンのアポトーシス、及び萎縮を引き起こし、最終的に機能障害につながる。ＴＢＩを含む神経系損傷のためのより効果的な治療の必要性が存在する。
【発明の概要】
【0004】
一態様では、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか、又はその重症度を低減させることを必要とする対象において、それを行う方法は、対象に、有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグを投与し、それによって、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか、又はその重症度を低減させることを含む。
【0005】
別の態様では、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか、又はその重症度を低減させることを必要とする対象において、それを行う方法は、対象に、有効量の安息香酸ナトリウムを投与し、それによって、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか、又はその重症度を低減させることを含む。
【0006】
添付の図面と併せて読むと、前述の要約、及び本開示の以下の説明をよりよく理解できる。本開示を例示する目的で、図面は、全てではないが、いくつかの代替的な実施形態を例示する。この開示は、示される正確な配置及び手段に限定されるものではない。本明細書に組み込まれ、本明細書の一部分を構成する以下の図は、本開示の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】図１Ａは、マウスの脳が露出したＣＣＩ機器の先端の写真である。ＣＣＩ技術を使用して、麻酔したマウスの曝露した脳領域に脳損傷を穏やかに誘導した。 図１Ｂは、脳において誘導されたＣＣＩを示す写真である。穿頭孔（定位座標－ブレグマから１．５ｍｍ後方及び１．５ｍｍ側方）における血栓及び組織ダメージが、ＣＣＩ損傷後のマウスの損傷した脳領域において見られた。 図１Ｃは、それぞれ３つの異なる速度、すなわち、１．０Ｖ、１．２５Ｖ、及び１．５Ｖで、１ｍｍの先端を使用した、軽度、中等度、及び重度のＣＣＩ損傷の誘導を示す画像である。損傷の１週間後、マウス（ｎ＝３）を４％のパラホルムアルデヒドで灌流し、続いて、脳を取り出し、脳切片をクレシルバイオレットで染色した。 図１Ｄは、ＣＣＩ損傷（１ｍｍ先端／１．０Ｖ）後の処置、行動、及び組織学的分析の経過を示す実験設計の概略図である。
【図2】図２Ａは、対照についての脳切片におけるＧＦＡＰ及びｉＮＯＳに対する二重標識免疫蛍光の画像である。マウスを、ＣＣＩ損傷の誘導後、経口投与により５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮａＢ又はＮａＦＯで処置した。７日間のＮａＢ処置後、脳切片をＧＦＡＰ及びｉＮＯＳに対する二重標識免疫蛍光によって分析した。これらの結果は、ＮａＢの経口処置が、ＣＣＩ損傷を有するマウスの皮質及び海馬領域におけるインビボでの星細胞の活性化を減弱させることを示す。 図２Ｂは、ＣＣＩ損傷についての脳切片におけるＧＦＡＰ及びｉＮＯＳに対する二重標識免疫蛍光の画像である。ＣＣＩ損傷の誘導後、経口投与により、マウスを５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮａＢ又はＮａＦＯで処置した。７日間のＮａＢ処置後、脳切片をＧＦＡＰ及びｉＮＯＳに対する二重標識免疫蛍光によって分析した。これらの結果は、ＮａＢの経口処置が、ＣＣＩ損傷を有するマウスの皮質及び海馬領域におけるインビボでの星細胞の活性化を減弱させることを示す。 図２Ｃは、ＣＣＩ＋ＮａＢについての脳切片におけるＧＦＡＰ及びｉＮＯＳに対する二重標識免疫蛍光の画像である。ＣＣＩ損傷の誘導後、経口投与により、マウスを５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮａＢ又はＮａＦＯで処置した。７日間のＮａＢ処置後、脳切片をＧＦＡＰ及びｉＮＯＳに対する二重標識免疫蛍光によって分析した。これらの結果は、ＮａＢの経口処置が、ＣＣＩ損傷を有するマウスの皮質及び海馬領域におけるインビボでの星細胞の活性化を減弱させることを示す。 図２Ｄは、ＣＣＩ＋ＮａＦＯについての脳切片におけるＧＦＡＰ及びｉＮＯＳに対する二重標識免疫蛍光の画像である。ＣＣＩ損傷の誘導後、経口投与により、マウスを５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮａＢ又はＮａＦＯで処置した。７日間のＮａＢ処置後、脳切片をＧＦＡＰ及びｉＮＯＳに対する二重標識免疫蛍光によって分析した。これらの結果は、ＮａＢの経口処置が、ＣＣＩ損傷を有するマウスの皮質及び海馬領域におけるインビボでの星細胞の活性化を減弱させることを示す。 図２Ｅは、皮質領域において計数されたＧＦＡＰに対して陽性の細胞のヒストグラムである。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の６つの切片の分析を表す。aｐ＜０．００１対対照、bｐ＜０．００１対ＣＣＩ損傷。 図２Ｆは、ＣＡ１領域において計数されたＧＦＡＰに対して陽性の細胞のヒストグラムである。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の６つの切片の分析を表す。aｐ＜０．００１対対照、bｐ＜０．００１対ＣＣＩ損傷。 図２Ｇは、皮質領域において計数されたｉＮＯＳに対して陽性の細胞のヒストグラムである。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の６つの切片の分析を表す。aｐ＜０．００１対対照、bｐ＜０．００１対ＣＣＩ損傷。 図２Ｈは、ＣＡ１領域において計数されたｉＮＯＳに対して陽性の細胞のヒストグラムである。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の６つの切片の分析を表す。aｐ＜０．００１対対照、bｐ＜０．００１対ＣＣＩ損傷。 図２Ｉは、ＧＦＡＰについての全てのマウス群（群当たりｎ＝４）由来の海馬領域の組織抽出物の免疫ブロット画像である。アクチンをローディング対照として実行した。 図２Ｊは、免疫ブロットバンドスキャンによって得られた対照に対するＧＦＡＰ／アクチンの値を示すプロットである。aｐ＜０．００１対対照、bｐ＜０．００１対ＣＣＩ損傷。
【図3】図３Ａは、対照についてのＩｂａ１及びｉＮＯＳに対する二重標識蛍光の画像である。マウスを、ＣＣＩ損傷の誘導の２４時間後から５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮａＢ又はＮａＦＯで処置した。７日間の処置後、脳切片をＩｂａ１及びｉＮＯＳに対する二重標識蛍光によって分析した。これらの結果は、ＮａＢ処置が、ＣＣＩ損傷を有するマウスの皮質及び海馬におけるインビボでのミクログリア活性化を阻害することを示す。 図３Ｂは、ＣＣＩ損傷についてのＩｂａ１及びｉＮＯＳに対する二重標識蛍光の画像である。マウスを、ＣＣＩ損傷の誘導の２４時間後から５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮａＢ又はＮａＦＯで処置した。７日間の処置後、脳切片をＩｂａ１及びｉＮＯＳに対する二重標識蛍光によって分析した。これらの結果は、ＮａＢ処置が、ＣＣＩ損傷を有するマウスの皮質及び海馬におけるインビボでのミクログリア活性化を阻害することを示す。 図３Ｃは、ＣＣＩ＋ＮａＢについてのＩｂａ１及びｉＮＯＳに対する二重標識蛍光の画像である。マウスを、ＣＣＩ損傷の誘導の２４時間後から５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮａＢ又はＮａＦＯで処置した。７日間の処置後、脳切片をＩｂａ１及びｉＮＯＳに対する二重標識蛍光によって分析した。これらの結果は、ＮａＢ処置が、ＣＣＩ損傷を有するマウスの皮質及び海馬におけるインビボでのミクログリア活性化を阻害することを示す。 図３Ｄは、ＣＣＩ＋ＮａＦＯについてのＩｂａ１及びｉＮＯＳに対する二重標識蛍光の画像である。マウスを、ＣＣＩ損傷の誘導の２４時間後から５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮａＢ又はＮａＦＯで処置した。７日間の処置後、脳切片をＩｂａ１及びｉＮＯＳに対する二重標識蛍光によって分析した。これらの結果は、ＮａＢ処置が、ＣＣＩ損傷を有するマウスの皮質及び海馬におけるインビボでのミクログリア活性化を阻害することを示す。 図３Ｅは、皮質領域において計数されたＩｂａ１に対して陽性の細胞のヒストグラムである。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の６つの切片の分析を表す。aｐ＜０．００１対対照、bｐ＜０．００１対ＣＣＩ損傷。 図３Ｆは、ＣＡ１領域において計数されたＩｂａ１に対して陽性の細胞のヒストグラムである。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の６つの切片の分析を表す。aｐ＜０．００１対対照、bｐ＜０．００１対ＣＣＩ損傷。 図３Ｇは、Ｉｂａ１についての全てのマウス群（群当たりｎ＝４）由来の海馬領域の組織抽出物の免疫ブロット画像である。アクチンをローディング対照として実行した。 図３Ｈは、免疫ブロットバンドスキャンによって得られた対照に対するＩｂａ１／アクチンの値を示すプロットである。aｐ＜０．００１対対照、bｐ＜０．００１対ＣＣＩ損傷。 図３Ｉは、ｉＮＯＳについての全てのマウス群（群当たりｎ＝４）由来の海馬領域の組織抽出物の免疫ブロット画像である。アクチンをローディング対照として実行した。 図３Ｊは、免疫ブロットバンドスキャンによって得られた対照に対するｉＮＯＳ／アクチンの値を示すプロットである。aｐ＜０．００１対対照、bｐ＜０．００１対ＣＣＩ損傷。
【図4】２１日後の実験条件における、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）及び乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）のマーカーであるＡ２Ｂ５のレベルを示す、マウスの脳梁（ｃｏｒｐｕｓ ｃｏｌｌｏｓｕｍ）の画像である。ギ酸ナトリウム（ＮａＦＯ）ではなく、安息香酸ナトリウム（ＮａＢ）の経口投与が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有するマウスにおける再髄鞘形成を刺激する。マウス（群当たりｎ＝６）は、制御された皮質衝撃（ＣＣＩ）によって中等度のＴＢＩを誘導された。ＴＢＩの２時間後から、マウスへのＮａＢ及びＮａＦＯ（５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、水と混合された）の強制経口投与での処置を開始した。２１日の処置後、脳切片をＰＬＰ及びＡ２Ｂ５に対して二重標識した。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の２つの切片の分析を表す。
【図5】図５Ａは、種々の群における病変空洞の体積を示す一連の海馬領域に配置されたマウス脳の代表的なクレシルバイオレット切片を示す画像である。ＮａＢ処置は、ＣＣＩ損傷を有するマウスにおける病変体積を低減させる。 図５Ｂは、クレシルバイオレット切片の例示的な画像である。脳において誘導されたダメージの程度は、処置のないＣＣＩマウス及びＮａＦｏで処置されたＣＣＩ損傷マウスと比較した場合、ＮａＢで処置されたマウスにおいて低減することが見出されたことに留意されたい。 図５Ｃは、実験条件における病変サイズを示すプロットである。損傷の２１日後に、対照マウス、未処置のＣＣＩ損傷マウス、ＮａＢで処置されたＣＣＩマウス、及びＮａＦＯで処置されたＣＣＩマウスにおいて、病変サイズを定量的に測定した。統計分析は、脳の損傷側でスチューデントのｔ検定を用いて実施された［aｐ＜０．００１（５．６２３×１０-7）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００１）対ＣＣＩ損傷］。
【図6】図６Ａは、７日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）のヒートマップ分析を示す。オープンフィールド活動は、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＸＴ１３．０オープンフィールド活動システム（Ｎｏｌｄｕｓ）によって監視された。ＴＢＩの２時間後から、マウスへのＮａＢ及びＮａＦＯ（５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、水と混合された）の強制経口投与での処置を開始した。ギ酸ナトリウム（ＮａＦＯ）ではなく、安息香酸ナトリウム（ＮａＢ）の経口投与が、ＴＢＩを有するマウスにおけるオープンフィールド活動を改善する。 図６Ｂは、７日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）が移動した距離を示す棒グラフである。移動した距離［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００２９）対ＣＣＩ損傷］、速度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００７８）対ＣＣＩ損傷］、中心頻度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００３６）対ＣＣＩ損傷］及び飼育行動［aｐ＜０．００１（＝９．４９８ｘ１０-6）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００８１）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を行った。 図６Ｃは、７日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の速度を示す棒グラフである。移動した距離［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００２９）対ＣＣＩ損傷］、速度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００７８）対ＣＣＩ損傷］、中心頻度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００３６）対ＣＣＩ損傷］及び飼育行動［aｐ＜０．００１（＝９．４９８ｘ１０-6）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００８１）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を行った。 図６Ｄは、７日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の中心頻度を示す棒グラフである。移動した距離［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００２９）対ＣＣＩ損傷］、速度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００７８）対ＣＣＩ損傷］、中心頻度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００３６）対ＣＣＩ損傷］及び飼育行動［aｐ＜０．００１（＝９．４９８ｘ１０-6）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００８１）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を行った。 図６Ｅは、７日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の飼育行動を示す棒グラフである。移動した距離［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００２９）対ＣＣＩ損傷］、速度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００７８）対ＣＣＩ損傷］、中心頻度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００３６）対ＣＣＩ損傷］及び飼育行動［aｐ＜０．００１（＝９．４９８ｘ１０-6）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００８１）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を行った。 図６Ｆは、２１日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）のヒートマップ分析を示す。オープンフィールド活動は、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＸＴ１３．０オープンフィールド活動システム（Ｎｏｌｄｕｓ）によって監視された。ＴＢＩの２時間後から、マウスへのＮａＢ及びＮａＦＯ（５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、水と混合された）の強制経口投与での処置を開始した。 図６Ｇは、２１日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）が移動した距離を示す棒グラフである。移動した距離［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００２９）対ＣＣＩ損傷］、速度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００７８）対ＣＣＩ損傷］、中心頻度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００３６）対ＣＣＩ損傷］及び飼育行動［aｐ＜０．００１（＝９．４９８ｘ１０-6）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００８１）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を行った。 図６Ｈは、２１日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の速度を示す棒グラフである。移動した距離［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００２９）対ＣＣＩ損傷］、速度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００７８）対ＣＣＩ損傷］、中心頻度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００３６）対ＣＣＩ損傷］及び飼育行動［aｐ＜０．００１（＝９．４９８ｘ１０-6）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００８１）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を行った。 図６Ｉは、２１日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の中心頻度を示す棒グラフである。移動した距離［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００２９）対ＣＣＩ損傷］、速度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００７８）対ＣＣＩ損傷］、中心頻度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００３６）対ＣＣＩ損傷］及び飼育行動［aｐ＜０．００１（＝９．４９８ｘ１０-6）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００８１）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を行った。 図６Ｊは、２１日間の処置後のオープンフィールド活動におけるＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の飼育を示す棒グラフである。移動した距離［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００２９）対ＣＣＩ損傷］、速度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００７８）対ＣＣＩ損傷］、中心頻度［aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００３６）対ＣＣＩ損傷］及び飼育行動［aｐ＜０．００１（＝９．４９８ｘ１０-6）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００８１）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を行った。 図６Ｋは、尾部吊り下げ試験の結果を示す棒グラフである。ＮａＢ処置後、ＣＣＩ損傷を有するマウスは、損傷の７日後［aｐ＜０．００１（＝５．７２５ｘ１０-8）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］及び損傷の２１日後［aｐ＜０．００１（＝３．９９５ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００３）対ＣＣＩ損傷］の尾部吊り下げ試験において有意な改善を示した。 図６Ｌは、ロータロッド試験の結果を示す棒グラフである。ＮａＢ処置を有するマウスの能力は、損傷の７日後［aｐ＜０．００１（＝９．５９９８ｘ１０-9）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００３）対ＣＣＩ損傷］及び損傷の２１日後［aｐ＜０．００１（＝１．２１３３ｘ１０-9）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００１０）対ＣＣＩ損傷］のロータロッド試験で有意に改善した。 図６Ｍは、ビームランウェイ上での歩数を示す棒グラフである。ＮａＢの経口処置はまた、ビームランウェイ上でのＣＣＩ損傷マウスの能力を改善した。統計的有意性は、損傷の７日後［歩み：aｐ＜０．００１（＝２．２５８ｘ１０-6）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００２７）対ＣＣＩ損傷、所要時間：aｐ＜０．００１（＝２．９７９ｘ１０-7）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．００３９）対ＣＣＩ損傷、脚の滑り：aｐ＜０．００１（＝１．５６７ｘ１０-7）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］及び損傷の２１日後［歩み：aｐ＜０．００１（＝０．００５１）対対照、ｎｓ（＝０．２５３３）対ＣＣＩ損傷、所要時間：aｐ＜０．００１（＝０．０００３）対対照、ｎｓ（＝０．１２２８）対ＣＣＩ損傷、脚の滑り：aｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、bｐ＜０．０５（＝０．０７３６）対ＣＣＩ損傷］にスチューデントのｔ検定を使用して実施された。 図６Ｎは、ビームランウェイ上での所要時間を示す棒グラフである。ＮａＢの経口処置はまた、ビームランウェイ上でのＣＣＩ損傷マウスの能力を改善した。統計的有意性は、損傷の７日後［歩み：ａｐ＜０．００１（＝２．２５８ｘ１０－６）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝０．００２７）対ＣＣＩ損傷、所要時間：ａｐ＜０．００１（＝２．９７９ｘ１０－７）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝０．００３９）対ＣＣＩ損傷、脚の滑り：ａｐ＜０．００１（＝１．５６７ｘ１０－７）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］及び損傷の２１日後［歩み：ａｐ＜０．００１（＝０．００５１）対対照、ｎｓ（＝０．２５３３）対ＣＣＩ損傷、所要時間：ａｐ＜０．００１（＝０．０００３）対対照、ｎｓ（＝０．１２２８）対ＣＣＩ損傷、脚の滑り：ａｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、ｂｐ＜０．０５（＝０．０７３６）対ＣＣＩ損傷］にスチューデントのｔ検定を使用して実施された。 図６Ｏは、ビームランウェイ上での脚の滑りを示す棒グラフである。ＮａＢの経口処置はまた、ビームランウェイ上でのＣＣＩ損傷マウスの能力を改善した。統計的有意性は、損傷の７日後［歩み：ａｐ＜０．００１（＝２．２５８ｘ１０－６）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝０．００２７）対ＣＣＩ損傷、所要時間：ａｐ＜０．００１（＝２．９７９ｘ１０－７）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝０．００３９）対ＣＣＩ損傷、脚の滑り：ａｐ＜０．００１（＝１．５６７ｘ１０－７）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］及び損傷の２１日後［歩み：ａｐ＜０．００１（＝０．００５１）対対照、ｎｓ（＝０．２５３３）対ＣＣＩ損傷、所要時間：ａｐ＜０．００１（＝０．０００３）対対照、ｎｓ（＝０．１２２８）対ＣＣＩ損傷、脚の滑り：ａｐ＜０．００１（＝０．０００１）対対照、ｂｐ＜０．０５（＝０．０７３６）対ＣＣＩ損傷］にスチューデントのｔ検定を使用して実施された。 図６Ｐは、格子ランウェイにおける歩数を示す棒グラフである。ＮａＢ処置を受けたＣＣＩ損傷マウスは、格子ランウェイにおいて改善を示した。スチューデントのｔ検定を使用して、統計的有意性は、損傷の７日後［歩み：aｐ＜０．００１（＝９．３６４ｘ１０-9）対対照、bｐ＜０．００１（＝３．３９４ｘ１０-5）対ＣＣＩ損傷、所要時間：aｐ＜０．００１（＝１．３７７０ｘ１０-7）対対照、bｐ＜０．００１（＝３．３８８６ｘ１０-5） ｖｓ ＣＣＩ、脚の置き違え：aｐ＜０．００１（＝２．７３７ｘ１０-8）対対照、bｐ＜０．００１（＝５．９５４ｘ１０-6）対ＣＣＩ損傷］及び損傷の２１日後（歩み：aｐ＜０．００１（＝０．００１４）対対照、bｐ＜０．０５（＝０．０７１８）対ＣＣＩ損傷、所要時間：aｐ＜０．００１（＝５．５６２ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．０５（＝０．０７２）対ＣＣＩ損傷、脚の置き違え：aｐ＜０．００１（＝１．０７９ｘ１０-5）対対照、ｎｓ（＝０．２４６５）対ＣＣＩ損傷に実施された。ｎｓ－有意でない。 図６Ｑは、格子ランウェイにおける所要時間を示す棒グラフである。ＮａＢ処置を受けたＣＣＩ損傷マウスは、格子ランウェイにおいて改善を示した。スチューデントのｔ検定を使用して、統計的有意性は、損傷の７日後［歩み：ａｐ＜０．００１（＝９．３６４ｘ１０－９）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝３．３９４ｘ１０－５）対ＣＣＩ損傷、所要時間：ａｐ＜０．００１（＝１．３７７０ｘ１０－７）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝３．３８８６ｘ１０－５）対ＣＣＩ、脚の置き違え：ａｐ＜０．００１（＝２．７３７ｘ１０－８）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝５．９５４ｘ１０－６）対ＣＣＩ損傷］及び損傷の２１日後（歩み：ａｐ＜０．００１（＝０．００１４）対対照、ｂｐ＜０．０５（＝０．０７１８）対ＣＣＩ損傷、所要時間：ａｐ＜０．００１（＝５．５６２ｘ１０－５）対対照、ｂｐ＜０．０５（＝０．０７２）対ＣＣＩ損傷、脚の置き違え：ａｐ＜０．００１（＝１．０７９ｘ１０－５）対対照、ｎｓ（＝０．２４６５）対ＣＣＩ損傷に実施された。ｎｓ－有意でない。 図６Ｒは、格子ランウェイにおける脚の置き違えを示す棒グラフである。ＮａＢ処置を受けたＣＣＩ損傷マウスは、格子ランウェイにおいて改善を示した。スチューデントのｔ検定を使用して、統計的有意性は、損傷の７日後［歩み：ａｐ＜０．００１（＝９．３６４ｘ１０－９）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝３．３９４ｘ１０－５）対ＣＣＩ損傷、所要時間：ａｐ＜０．００１（＝１．３７７０ｘ１０－７）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝３．３８８６ｘ１０－５）対ＣＣＩ、脚の置き違え：ａｐ＜０．００１（＝２．７３７ｘ１０－８）対対照、ｂｐ＜０．００１（＝５．９５４ｘ１０－６）対ＣＣＩ損傷］及び損傷の２１日後（歩み：ａｐ＜０．００１（＝０．００１４）対対照、ｂｐ＜０．０５（＝０．０７１８）対ＣＣＩ損傷、所要時間：ａｐ＜０．００１（＝５．５６２ｘ１０－５）対対照、ｂｐ＜０．０５（＝０．０７２）対ＣＣＩ損傷、脚の置き違え：ａｐ＜０．００１（＝１．０７９ｘ１０－５）対対照、ｎｓ（＝０．２４６５）対ＣＣＩ損傷に実施された。ｎｓ－有意でない。
【図7】図７Ａは、手術の２１日後のＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の新規物体認識を示すヒートマップを示す。ＴＢＩの２時間後から、マウスへのＮａＢ及びＮａＦＯ（５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、水と混合された）の強制経口投与での処置を開始した。統計分析は、新規物体認識試験［探索時間：aｐ＜０．００１（＝２．５９８９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００３）対ＣＣＩ損傷］、バーンズ迷路試験［所要時間：aｐ＜０．００１（＝１．７５０９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝４．８８２４ｘ１０-5）対ＣＣＩ損傷及びエラー数：aｐ＜０．００１（＝３．２３４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］、Ｔ字型迷路［陽性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３５２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００４）対ＣＣＩ損傷及び陰性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３９２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００５）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定によって実施された。ｎｓ－有意でない。 図７Ｂは、手術の２１日後のＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）のバーンズ円形迷路試験の結果を示すヒートマップを示す。統計分析は、新規物体認識試験［探索時間：aｐ＜０．００１（＝２．５９８９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００３）対ＣＣＩ損傷］、バーンズ迷路試験［所要時間：aｐ＜０．００１（＝１．７５０９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝４．８８２４ｘ１０-5）対ＣＣＩ損傷及びエラー数：aｐ＜０．００１（＝３．２３４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］、Ｔ字型迷路［陽性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３５２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００４）対ＣＣＩ損傷及び陰性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３９２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００５）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定によって実施された。ｎｓ－有意でない。 図７Ｃは、新規物体認識試験中の手術の２１日後のＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の探索時間を示す棒グラフである。統計分析は、新規物体認識試験［探索時間：aｐ＜０．００１（＝２．５９８９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００３）対ＣＣＩ損傷］、バーンズ迷路試験［所要時間：aｐ＜０．００１（＝１．７５０９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝４．８８２４ｘ１０-5）対ＣＣＩ損傷及びエラー数：aｐ＜０．００１（＝３．２３４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］、Ｔ字型迷路［陽性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３５２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００４）対ＣＣＩ損傷及び陰性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３９２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００５）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定によって実施された。ｎｓ－有意でない。 図７Ｄは、バーンズ迷路試験中の手術の２１日後のＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の潜時を示す棒グラフである。統計分析は、新規物体認識試験［探索時間：aｐ＜０．００１（＝２．５９８９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００３）対ＣＣＩ損傷］、バーンズ迷路試験［所要時間：aｐ＜０．００１（＝１．７５０９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝４．８８２４ｘ１０-5）対ＣＣＩ損傷及びエラー数：aｐ＜０．００１（＝３．２３４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］、Ｔ字型迷路［陽性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３５２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００４）対ＣＣＩ損傷及び陰性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３９２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００５）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定によって実施された。ｎｓ－有意でない。 図７Ｅは、バーンズ迷路試験中の手術の２１日後のＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）のエラー数を示す棒グラフである。統計分析は、新規物体認識試験［探索時間：aｐ＜０．００１（＝２．５９８９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００３）対ＣＣＩ損傷］、バーンズ迷路試験［所要時間：aｐ＜０．００１（＝１．７５０９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝４．８８２４ｘ１０-5）対ＣＣＩ損傷及びエラー数：aｐ＜０．００１（＝３．２３４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］、Ｔ字型迷路［陽性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３５２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００４）対ＣＣＩ損傷及び陰性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３９２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００５）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定によって実施された。ｎｓ－有意でない。 図７Ｆは、Ｔ字型迷路中の術後２１日のＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の陽性ターンの数を示す棒グラフである。統計分析は、新規物体認識試験［探索時間：aｐ＜０．００１（＝２．５９８９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００３）対ＣＣＩ損傷］、バーンズ迷路試験［所要時間：aｐ＜０．００１（＝１．７５０９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝４．８８２４ｘ１０-5）対ＣＣＩ損傷及びエラー数：aｐ＜０．００１（＝３．２３４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］、Ｔ字型迷路［陽性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３５２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００４）対ＣＣＩ損傷及び陰性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３９２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００５）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定によって実施された。ｎｓ－有意でない。 図７Ｇは、Ｔ字型迷路中の術後２１日のＣＣＩによって誘導されたＴＢＩを有するマウス（群当たりｎ＝６）の陰性ターンの数を示す棒グラフである。統計分析は、新規物体認識試験［探索時間：aｐ＜０．００１（＝２．５９８９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００３）対ＣＣＩ損傷］、バーンズ迷路試験［所要時間：aｐ＜０．００１（＝１．７５０９ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝４．８８２４ｘ１０-5）対ＣＣＩ損傷及びエラー数：aｐ＜０．００１（＝３．２３４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００１）対ＣＣＩ損傷］、Ｔ字型迷路［陽性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３５２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００４）対ＣＣＩ損傷及び陰性ターン：aｐ＜０．００１（＝３．３９２４ｘ１０-5）対対照、bｐ＜０．００１（＝０．０００５）対ＣＣＩ損傷］について、スチューデントのｔ検定によって実施された。ｎｓ－有意でない。
【図8】対照（図８Ａ）、ＣＣＩ（図８Ｂ）、ＣＣＩ＋ＧＴＢ（図８Ｃ）、及びＣＣＩ＋ビヒクル（図８Ｄ）の脳切片におけるＧＦＡＰ及びｉＮＯＳの二重標識免疫蛍光の画像である。マウスを、ＣＣＩ損傷の誘導後、強制経口投与により５０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＴＢで処置した。７日間のＧＴＢ処置後、脳切片をＧＦＡＰ及びｉＮＯＳに対する二重標識免疫蛍光によって分析した。ＧＦＡＰに対して陽性の細胞を、海馬の皮質（図８Ｅ）及びＣＡ１領域（図８Ｆ）において計数した。同様に、ｉＮＯＳに対して陽性の細胞も、皮質（図８Ｇ）及びＣＡ１領域（図８Ｈ）において計数した。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の６つの切片の分析を表す。全てのマウス群（群当たりｎ＝４）由来の海馬領域の組織抽出物を、ＧＦＡＰ（図８Ｉ）及びｉＮＯＳ（図８Ｋ）に対して免疫ブロットした。アクチンをローディング対照として実行した。バンドをスキャンし、値（ＧＦＡＰ／アクチン）（図８Ｊ）及び（ｉＮＯＳ／アクチン）（図８Ｌ）を対照に対して提示した。これらの結果は、ＧＴＢの経口投与が、ＴＢＩを有するマウスの皮質及び海馬におけるインビボのアストログリア炎症を阻害することを示す。
【図9】経口ＧＴＢは、ＴＢＩを有するマウスの皮質及び海馬におけるインビボのミクログリア活性化を減少させる。マウスにおいてＴＢＩをＣＣＩ損傷によって誘導し、損傷の２４時間後、マウスを強制経口投与により５０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＴＢで処置した。ＧＴＢ処置の７日後、脳切片を、Ｉｂａ１及びｉＮＯＳに対して二重標識した（図９Ａ、対照；図９Ｂ、ＣＣＩ；図９Ｃ、ＣＣＩ＋ＧＴＢ；図９Ｄ、ＣＣＩ＋ビヒクル）。Ｉｂａ１に対して陽性の細胞を、海馬の皮質（図９Ｅ）及びＣＡ１領域（図９Ｆ）において計数した。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の２つの切片の分析を表す。全てのマウス群（群当たりｎ＝４）由来の海馬領域の組織抽出物を、Ｉｂａ１について免疫ブロットした（図９Ｇ）。アクチンをローディング対照として実行した。バンドをスキャンし、値（Ｉｂａ１／アクチン）（図９Ｈ）を対照に対して提示した。
【図10】ＧＴＢ処置によるＴＢＩマウスにおける病変体積の減少。マウスにおいてＴＢＩをＣＣＩ損傷によって誘導し、損傷の２４時間後、マウスを強制経口投与により５０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＴＢで処置した。図１０Ａ。損傷の２１日後、脳切片をＨ＆Ｅで染色し、Ｈ＆Ｅで染色された切片を一連に配置して、種々の群の病変空洞の体積を示した。図１０Ｂは、Ｈ＆Ｅ染色切片の例示的な画像を示す。図１０Ｃ。病変体積は、全てのマウス群において定量された。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施され、平均±ＳＤとして表され、脳の非病変側と病変側との間で病変体積を比較した。
【図11】ＧＴＢの経口投与によるＴＢＩマウスの海馬におけるＰＳＤ－９５、ＮＲ２Ａ、及びＧｌｕＲ１の回復。マウスにおいてＴＢＩをＣＣＩ損傷によって誘導し、損傷の２４時間後、マウスを強制経口投与により５０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＴＢで処置した。ＣＣＩ損傷の２１日後、脳切片を、ＮｅｕＮ及びＰＳＤ－９５に対して二重標識した（図１１Ａ、対照；図１１Ｂ、ＣＣＩ；図１１Ｃ、ＣＣＩ＋ＧＴＢ；図１１Ｄ、ＣＣＩ＋ビヒクル）。結果は、群当たり６匹のマウスの各々の１つの切片の分析を表す。全てのマウス群（群当たりｎ＝４）由来の海馬組織抽出物を、ＰＳＤ－９５、ＮＲ２Ａ、及びＧｌｕＲ１に対して免疫ブロットした。図１１Ｅ。アクチンをローディング対照として実行した。バンドをスキャンし、値（Ｉｂａ１／アクチン、図１１Ｆ；ＮＲ２Ａ／アクチン、図１１Ｇ；ＧｌｕＲ１／アクチン、図１１Ｈ）を対照に対して提示した。データを、平均＋ＳＤとして表す。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施された。
【図12】ＴＢＩマウスにおける空間学習及び記憶に対するＧＴＢの影響。マウスにおいてＴＢＩをＣＣＩ損傷によって誘導し、損傷の２４時間後、マウスを強制経口投与により５０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＴＢで処置した。ＣＣＩ損傷の２１日後、マウスを、新規物体認識試験（図１２Ａ、ヒートマップ；図１２Ｃ、探索時間）、バーンズ迷路（図１２Ｂ、ヒートマップ；図１２Ｄ、エラーの数；図１２Ｅ、潜時ｐｒ所要時間）、及びＴ字型迷路（図１２Ｆ、陽性ターン；図１２Ｇ、陰性ターン）によって試験した。各群で６匹のマウスを使用した。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くＴｕｋｅｙの事後検定によって実施された。
【図13】ＧＴＢ処置は、ＴＢＩマウスにおける運動機能を回復する。マウスにおいてＴＢＩをＣＣＩ損傷によって誘導し、損傷の２４時間後、マウスを強制経口投与により５０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＴＢで処置した。ＣＣＩ損傷の７日後、マウスを、オープンフィールド行動（図１３Ａ、Ｎｏｌｄｕｓシステムを使用することによって監視されたヒートマップ分析；図１３Ｂ、移動した距離；図１３Ｃ、速度；図１３Ｄ、中心頻度；図１３Ｅ、飼育）、ロトロッド（ｒｏｔｏ ｒｏｄ）（図１３Ｆ、潜時）、尾部吊り下げ試験（図１３Ｇ、不動時間）、ビーム歩行（図１３Ｈ、歩数；図１３Ｉ、所要時間；図１３Ｊ、滑り）、及び格子ランウェイ（図１３Ｋ、歩数；図１３Ｌ、所要時間；図１３Ｍ、置き違え）について試験した。各群で６匹のマウスを使用した。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くＴｕｋｅｙの事後検定によって実施された。
【図14】ＣＣＩ損傷の２１日目のＴＢＩマウスにおける運動機能に対するＧＴＢの効果。マウスにおいてＴＢＩをＣＣＩ損傷によって誘導し、損傷の２４時間後、マウスを強制経口投与により５０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＴＢで処置した。ＣＣＩ損傷の２１日後、マウスを、オープンフィールド行動（図１４Ａ、Ｎｏｌｄｕｓシステムを使用することによって監視されたヒートマップ分析；図１４Ｂ、移動した距離；図１４Ｃ、速度；図１４Ｄ、中心頻度；図１４Ｅ、飼育）、ロトロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）（図１４Ｆ、潜時）、尾部吊り下げ試験（図１４Ｇ、不動時間）、ビーム歩行（図１４Ｈ、歩数；図１４Ｉ、所要時間；図１４Ｊ、滑り）、及び格子ランウェイ（図１４Ｋ、歩数；図１４Ｌ、所要時間；図１４Ｍ、置き違え）について試験した。各群で６匹のマウスを使用した。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くＴｕｋｅｙの事後検定によって実施された。
【図15】乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）の乏突起膠細胞への成熟に対する安息香酸ナトリウム（ＮａＢ）の効果。ＯＰＣを、Ｐ１～Ｐ２の新生マウスの子から単離し、インビトロで４日間（ＤＩＶ）、ＯＰＣ培地中で培養し、続いて、ＦＧＦ及びＰＤＧＦの非存在下で１００μＭのＮａＢ及びギ酸ナトリウム（ＮａＦＯ）で処理した。図１５Ａ）無血清条件での１８時間の１００μＭのＮａＢの処理後、細胞を固定し、次いで、ＭＢＰ（赤色）及びＯＰＣマーカーＮＧ２（緑色）で二重免疫染色した。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。Ｂ）同様に、ＯＰＣを、同様の処理条件下でＰＬＰ（赤色）及びＡ２Ｂ５（緑色）で染色した。全細胞（ＤＡＰＩ＋）に対するパーセンテージとしてのＭＢＰ＋（図１５Ｃ）、ＮＧ２＋（図１５Ｄ）、ＰＬＰ＋（図１５Ｅ）、及びＡ２Ｂ５＋（図１５Ｆ）細胞の定量。スライド当たり平均５つのフィールド、合計３つのスライド。結果は、平均＋ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｇ）タンパク質発現について、細胞を無血清条件下で種々の用量のＮａＢで１８時間処理し、次いでＰＬＰ及びＭＯＧで免疫ブロットした。図１５Ｈ）ベータアクチンに対するバンドの密度測定分析を、ＰＬＰ及びＭＯＧに対して行った。ａｐ＜０．００１対対照ＰＬＰ、ｂｐ＜０．００５対対照ＭＯＧ。図１５Ｉ）細胞を無血清条件下で４時間、ＮａＢ（１００ｕＭ）及びＮａＦＯ（１００ｕＭ）で処理し、続いてリアルタイムＰＣＲによってミエリン特異的遺伝子のｍＲＮＡ発現を監視した（ａｐ＜０．０１対対照ＰＬＰ、ｂｐ＜０．０１対対照ＭＯＧ、ｃｐ＜０．０１対対照ＭＢＰ、ｄｐ＜０．０１対対照ＣＮＰａｓｅ）。ＯＰＣを、ランダムに配向したポリカプロラクトンナノファイバー（Ｎａｎｏｆｉｂｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カタログ番号Ｚ６９４５７６）の上部で７日間培養した。その後、これらの細胞を１００μＭのＮａＢ（図１５Ｊ）及びＮａＦＯ（図１５Ｋ）で更に２日間処理し、続いてＭＢＰ（赤色）に対する免疫蛍光分析を行った（図１５Ｊ、対照；図１５Ｋ、ＮａＢ；図１５Ｌ、ＮａＦＯ）。画像は、単一の赤色のチャネルで表示され、ナノファイバーの位相コントラスト画像とマージされた。ナノファイバーに付着したＯＰＣの代表的な３Ｄ構築画像もまた右側に示した。
【図16】経口ＮａＢは、クプリゾン中毒マウスの脳梁におけるインビボでのＯＰＣの成熟を刺激する。Ｃ５７／ＢＬ６マウス（８～１０週齢、雄）に、クプリゾン含有食（Ｅｎｖｉｇｏ）を５週間与え、続いて、強制経口投与によりＮａＢ（５０ｍｇ／ｋｇ体重／日）で処置した。図１６Ａ）ＮａＢでの３週間の処置後、脳梁切片をＰＬＰ及びＡ２Ｂ５に対して二重標識した。Ａ２Ｂ５（図１６Ｂ）及びＰＬＰ（図１６Ｃ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、５匹のマウス群の各々の１つの切片（切片当たり２つの画像）から定量した。結果は、群当たり５匹のマウスの平均＋ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１。
【図17】クプリゾン中毒マウスの脳梁におけるインビボでの髄鞘形成に対するＮａＢの効果。Ｃ５７／ＢＬ６マウス（８～１０週齢、雄、ｎ＝５）に、クプリゾン含有食（Ｅｎｖｉｇｏ）を５週間与え、続いて、強制経口投与によりＮａＢ（５０ｍｇ／ｋｇ体重／日）で処置した。ＮａＢでの３週間の処置後、脳梁切片をＭＢＰ（図１７Ａ）及びＰＬＰ（図１７Ｂ）免疫染色した。ＭＢＰ（図１７Ｃ）及びＰＬＰ（図１７Ｄ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、５匹のマウス群の各々の１つの切片（切片当たり２つの画像）から定量した。結果は、群当たり５匹のマウスの平均＋ＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。図１７Ｅ）脳梁切片を、ｌｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ（ＬＦＢ）で染色した。図１７Ｆ）電子顕微鏡研究のために、５０μｍの厚さの矢状切片を調製し、染色し、続いて、種々のパラメータについて脳梁切片の分析を行い、軸索の超微細構造を評価した。図１７Ｇ）Ｇスコアを、３つの群全てについて、群当たり７５個の軸索で計算した。図１７Ｈ）群当たり５匹のマウスの７つの無作為に選択された脳梁切片において、有髄軸索のパーセンテージを計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図18】シナメイン（Ｃｉｎｎａｍｅｉｎ）は、ＬＰＳ及びＩＦＮγ刺激マウスＲＡＷ ２６４．７マクロファージからのＮＯ産生の誘導を阻害する。図１８Ａ）種々の濃度のシナメインで６時間プレインキュベートされた細胞を、無血清条件下で１μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。２４時間の刺激後、グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬によって上清中の亜硝酸塩のレベルを測定した。図１８Ｂ）４００μＭのシナメインで種々の時間プレインキュベートされた細胞を、無血清条件下で１μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。２４時間の刺激後、上清中の亜硝酸塩のレベルを測定した。図１８Ｃ）種々の濃度のシナメインで６時間プレインキュベートされた細胞を、無血清条件下で２５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγで刺激した。２４時間の刺激後、上清中の亜硝酸塩のレベルを測定した。結果は、３つの独立した実験の平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ、有意でない。
【図19】シナメインは、初代マウスミクログリアにおけるＴＮＦαのＬＰＳ及びポリＩＣ誘導産生を阻害する。２日齢のマウスの子から単離されたミクログリアを、種々の濃度のシナメインで６時間インキュベートし、続いて、無血清条件下で１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（図１９Ａ）又は５０μｇ／ｍｌのポリＩＣ（図１９Ｂ）のいずれかで刺激した。２４時間の刺激後、ＥＬＩＳＡによって上清中のＴＮＦαのレベルを測定した。結果は、３つの独立した実験の平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ、有意でない。
【図20】シナメインは、ＬＰＳ及びポリＩＣ刺激初代マウスミクログリアからのＩＬ－１βの産生を抑制する。種々の濃度のシナメインで６時間プレインキュベートされた細胞を、無血清条件下で１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（図２０Ａ）又は５０μｇ／ｍｌのポリＩＣ（図２０Ｂ）のいずれかで刺激した。２４時間の刺激後、ＥＬＩＳＡによって上清中のＩＬ－１βのレベルを測定した。結果は、３つの独立した実験の平均＋ＳＤである。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0008】
Ａ．定義
中枢神経系損傷又は末梢神経系損傷を含む「神経系損傷」とは、外傷及び／又は疾患によって引き起こされる神経系への任意の損傷を指す。
中枢神経系損傷又は末梢神経系損傷を含む「神経系損傷」とは、外傷及び／又は疾患によって引き起こされる神経系への任意の損傷を指す。
【0009】
「中枢神経系」（ＣＮＳ）は、脳、脊髄、視覚系、嗅覚系、及び聴覚系を含む。ＣＮＳは、ニューロン及びグリア細胞（神経膠）の両方を含み、これらは、ニューロンの機能を支援する支持細胞である。乏突起膠細胞、星細胞、及びミクログリアは、ＣＮＳ内のグリア細胞である。乏突起膠細胞は、ＣＮＳにおいて軸索を髄鞘形成するが、星細胞は、血液脳関門に寄与し、血液タンパク質及び細胞からＣＮＳを分離し、ニューロンに対して多くの支持機能を果たす。ミクログリア細胞は、免疫系の機能を果たす。
【0010】
「中枢神経系損傷」とは、疾患ではなく外傷によって引き起こされる中枢神経系への損傷を指す。この用語は、運動機能、感覚機能、又はそれらの組み合わせの喪失又は障害をもたらす、中枢神経系への損傷を包含する。
【0011】
「末梢神経系」（ＰＮＳ）は、脳から生じる脳神経（視神経及び嗅神経を除く）、脊髄から生じる脊髄神経、感覚神経細胞体、及びそれらのプロセス、すなわち、ＣＮＳの外側の全ての神経組織を含む。ＰＮＳは、ニューロン及びグリア細胞（神経膠）の両方を含み、これらは、ニューロンの機能を支援する支持細胞である。ＰＮＳ内のグリア細胞は、シュワン細胞として知られており、軸索を取り囲む鞘を提供することにより、軸索を髄鞘形成する役割を果たす。
【0012】
「末梢神経系損傷」とは、疾患ではなく外傷によって引き起こされる末梢神経への損傷を指す。この用語は、ニューラプラキシーとして知られる、神経が無傷のままであるがシグナル伝達能力がダメージを受けている、最も低い程度の神経損傷を含む、全ての程度の神経損傷を包含する。この用語はまた、軸索断裂知られる、軸索がダメージを受けているが、周囲の接続組織が無傷のままである第２の程度を含む。最後に、この用語は、神経断裂として知られる、軸索及び接続組織の両方がダメージを受けている最後の程度を包含する。
【0013】
「外傷性脳損傷」又は「ＴＢＩ」は、外傷が脳にダメージを与える後天性脳損傷又は頭部損傷を指す。ダメージは、局在化され、すなわち、脳の１つの領域に限定されるか、又は脳の１つ以上の領域に影響を及ぼすびまん性であり得る。
【0014】
「脊髄損傷」とは、疾患ではなく外傷によって引き起こされる脊髄への損傷を意味する。脊髄及び神経根がダメージを受けている場所に応じて、症状は、例えば、痛みから麻痺、失禁に至るまで広く変化し得る。脊髄損傷は、様々なレベルの「不完全」で説明され、これは、対象に影響を及ぼさないことから、機能の完全な喪失を意味する「完全な」損傷まで変化し得る。脊髄損傷には多くの原因があるが、典型的には、自動車事故、転倒、スポーツ損傷、及び暴力による重大な外傷に関連する。略称「ＳＣＩ」は、脊髄損傷を意味する。
【0015】
「脊髄挫傷」とは、脊髄の一部分がその組織の一部分、特に脊髄の頭側及び尾側を接続する腹側神経線維を残して、押しつぶされ損傷になる疾患ではなく、外傷によって引き起こされる損傷を指す。
【0016】
「神経挫滅損傷」は、バット、外科用クランプ、又は神経の完全な切断をもたらさない他の挫滅物体などの鈍器による神経の外傷性圧迫を指す。
【0017】
「投与する」とは、化合物、塩、又は組成物を対象に送達するために使用される任意の方法を意味する。これらには、経口経路、十二指腸内経路、非経口注射（静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、血管内、又は輸液を含む）、局所、及び直腸投与が含まれる。当業者は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄ．；Ｐｅｒｇａｍｏｎ、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．において議論されているような、使用され得る投与技術に精通している。いくつかの態様では、化合物及び組成物は、経口投与される。
【0018】
「有効量」は、少なくとも１つの投与される薬剤又は化合物の、治療される損傷の症状のうちの１つ以上をある程度軽減又は予防するのに十分な量を指す。その結果は、損傷の徴候、症状、若しくは原因の低減及び／若しくは緩和、又は生体系の任意の他の所望の変化であり得る。例えば、治療的使用のための「有効量」は、治療される損傷に関連する症状の進行又は重症度の臨床的に著しい減少をもたらすのに必要な化合物の量である。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、用量漸増研究などの技術を使用して決定され得る。
【0019】
「対象」は、ヒトなどの哺乳動物対象を含む、任意の生体対象であり得る。
【0020】
「プロドラッグ」とは、対象に投与されると、例えば、体内の代謝により、直接的又は間接的のいずれかで、安息香酸塩をもたらすことができる任意の薬学的に許容される化合物又は塩を指す。
【0021】
「薬学的に許容される」は、活性成分の生物学的活性又は特性を無効にすることなく、かつ比較的非毒性である担体、希釈剤、又は賦形剤などの物質を指し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又はそれが含有される組成物の構成要素のうちのいずれとも有害な仕方で相互作用することなく、対象に投与され得る。
【0022】
「医薬組成物」は、任意選択で、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、又は賦形剤などの少なくとも１つの薬学的に許容される構成要素と混合される、生物学的に活性な化合物を含む組成物を指す。
【0023】
Ｂ．治療方法
一態様では、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか、又はその重症度を低減させることを必要とする対象において、それを行う方法は、対象に、有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグを投与し、それによって、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか、又はその重症度を低減させることを含む。
一態様では、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか、又はその重症度を低減させることを必要とする対象において、それを行う方法は、対象に、有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグを投与し、それによって、神経系損傷に関連する症状の進行を遅らせるか、又はその重症度を低減させることを含む。
【0024】
一態様では、安息香酸塩は、使用される場合、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、安息香酸カルシウム、２－アミノ安息香酸、３－アミノ安息香酸、４－アミノ安息香酸、又はそれらの任意の組み合わせである。
【0025】
一態様では、安息香酸塩のプロドラッグは、使用される場合、桂皮酸ベンジル、三安息香酸グリセリル、桂皮酸、酢酸ベンジル、ベンジルアルコール、安息香酸、キナ酸、フェニルアラニン、チロシン、又はそれらの任意の組み合わせである。
【0026】
様々な神経系障害は、開示された方法を使用して治療中であり得る。一態様では、対象における神経系損傷は、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷又は末梢神経損傷である。更なる態様では、神経系損傷は、脊髄損傷（ＳＣＩ）、脊髄挫傷、又は神経挫滅損傷である。例えば、神経系への損傷が脊髄損傷（ＳＣＩ）である場合、安息香酸塩又はそのプロドラッグは、皮節Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、又はＬ５のうちの１つ以上への外傷によって引き起こされる機能障害を含むが、これらに限定されない、脊髄の頸部、胸部、腰部、又は仙骨部への外傷によって引き起こされる神経系機能障害を改善し得る。
【0027】
一態様では、神経系損傷は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である。様々な態様では、ＴＢＩは、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、側頭葉、脳幹、又は小脳への損傷であり得る。いくつかの態様では、ＴＢＩは、軽度のＴＢＩである。更なる態様では、ＴＢＩは、中等度から重度のＴＢＩである。安息香酸塩及びそのプロドラッグは、様々な態様では、ＴＢＩの以下の症状のうちの１つ以上の検出可能な改善又はその進行の低減を引き起こし得る：頭痛、記憶の問題、注意欠陥、気分のむら及び欲求不満、疲労、視覚障害、記憶喪失、注意力又は集中力の低下、睡眠障害、めまい又は平衡感覚の喪失、易刺激性、感情的障害、憂鬱感、発作、吐き気、嗅覚喪失、光及び音に対する感受性、気分変化、迷う又は混乱、又は思考の遅さ。
【0028】
別の態様では、神経系損傷は、脱髄障害である。脱髄障害は、例えば、視神経炎、Ｘ副腎白質ジストロフィー、クラッベ病、進行性多巣性白質脳症、副腎脊髄神経障害、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、多発性硬化症、バロー病（Ｂａｌｏ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（同心円硬化症）、シャルコ・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ－Ｉ関連性骨髄症、視神経脊髄炎（デビック病）、シルダー病、横断性脊髄炎、又はそれらの組み合わせであり得る。
【0029】
概して、開示の方法で治療され得る損傷は、安息香酸塩又はそのプロドラッグを使用して緩和され得るか、遅らされ得るか、又は予防され得るいくつかの症状をもたらし得る。一態様では、有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグを投与することは、グリア炎症の低減、運動機能若しくは協調性の改善、又は学習若しくは記憶機能障害の改善をもたらす。更なる態様では、特に、治療される損傷がＣＮＳへの損傷である場合、有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグを投与することは、気うつ（ｍｅｎｔａｌ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）に関連する症状を予防するか、又はその重症度を低減させる。精神的うつ病の症状の非限定的な一例は、対象が従事するよう動機付けられている身体活動のレベルである。
【0030】
一態様では、神経系損傷が著しく進行する前に、安息香酸塩又はそのプロドラッグを投与することが有用であり得る。例えば、有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグは、神経系損傷後２４時間以内、例えば、神経系損傷後２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１時間以内に投与され得る。別の態様では、有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグは、神経系損傷の２４時間以上後に投与され得る。更なる態様では、有効量の安息香酸塩又はそのプロドラッグは、神経系損傷後２４時間以内に投与され得、安息香酸塩又はそのプロドラッグの投与は、一定期間、例えば、損傷後数日間、数週間、数ヶ月、又は数年間継続し得る。
【0031】
一態様では、対象は、投与するステップの前に、神経系損傷と診断されている。更なる態様では、対象は、投与するステップの前に、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷又は末梢神経損傷と診断されている。更なる態様では、対象は、投与するステップの前に、脊髄損傷（ＳＣＩ）、脊髄挫傷、又は神経挫滅損傷と診断されている。なお更なる態様では、対象は、投与するステップの前に外傷性脳損傷（ＴＢＩ）と診断されている。
【0032】
一態様では、投与するステップの前に、治療される対象は、尿素サイクル障害、グリシン脳症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、又は自閉症スペクトラム障害と診断されていないか、又はそれについて治療されていない。自閉症スペクトラム障害の例としては、アスペルガー症候群、小児崩壊性障害、及び広汎性発達障害が挙げられる。
【0033】
一態様では、治療される対象は、１２歳超である。更なる態様では、治療される対象は、少なくとも１８歳である。更に別の態様では、治療される対象は、少なくとも２１歳である。他の態様では、対象は、１２歳未満を含む任意の年齢であり得る。
【0034】
一態様では、安息香酸塩又はそのプロドラッグは、安息香酸塩又はそのプロドラッグと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物として投与され得、組成物は、組成物の０．１重量％超の安息香酸塩又はそのプロドラッグ、例えば、医薬組成物の総重量に基づいて、０．５重量％超、１重量％超、２重量％超、５重量％超、１０重量％超、１５重量％超、２０重量％超、３０重量％超、４０重量％超、又は５０重量％超の安息香酸塩又はそのプロドラッグ、最大９９重量％の安息香酸塩又はそのプロドラッグを含む。例えば、医薬組成物は、組成物の１．１重量％～５０重量％以上の範囲の量で安息香酸又はそのプロドラッグを含み得る。
【0035】
更なる態様では、医薬組成物は、損傷を治療するための活性成分として、安息香酸塩又はそのプロドラッグのみを含み得る。換言すれば、一態様では、安息香酸塩又はそのプロドラッグは、唯一の活性成分として役割を果たし得る。更なる態様では、本開示の医薬組成物は、安息香酸塩又はそのプロドラッグから本質的になるか、又は他の態様ではそれらからなる医薬品有効成分を含む。
【0036】
一態様では、安息香酸塩又はそのプロドラッグの１日の総用量は、投与経路などの様々な要因に応じて、対象に単回用量又は複数回用量として投与される、１００ｍｇ／日、１２０ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、１８０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２２５ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、４００ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、１５００ｍｇ／日、２０００ｍｇ／日、２５００ｍｇ／日、３０００ｍｇ／日、３５００ｍｇ／日、又は４０００ｍｇ／日である。更なる態様では、安息香酸塩又はそのプロドラッグの１日の総用量は、１０００ｍｇ／日～４０００ｍｇ／日、例えば、１０００ｍｇ／日～３０００ｍｇ／日、又は１０００ｍｇ／日～２０００ｍｇ／日である。
【0037】
一特定の態様では、安息香酸塩又はそのプロドラッグのこれらの１日の総用量は、単回用量又は複数回用量として経口投与され得る。一態様では、対象に投与される組成物は、経口投与に好適な形態で製剤化され得る。例えば、組成物は、乾燥粉末、錠剤、ロゼンジ、カプセル、顆粒、又は丸薬の形態で製剤化され得る。薬学的に許容される賦形剤としては、充填剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、潤滑剤、懸濁剤、湿潤剤、溶媒、界面活性剤、酸、香味剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルキレングリコール、セバシン酸、ジメチルスルホキシド、アルコール、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【0038】
Ｃ．実施例
以下の実施例は、本開示を更に例示する。本開示及び特許請求の範囲は、以下の実施例の範囲によって限定されるものではない。
以下の実施例は、本開示を更に例示する。本開示及び特許請求の範囲は、以下の実施例の範囲によって限定されるものではない。
【0039】
１．材料及び方法
ａ．動物
この研究には、Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから購入した雄のＣ５７ＢＬ６マウス（７～８週齢）を使用した。動物の維持及び外科手術処置は、Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ＣｏｍｍｉｔｔｅｅのＮＩＨガイドラインに従って実施され、Ｒｕｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．によって承認された。動物を、安定した温度及び１２時間の明暗サイクルを有する環境に収容した。水及び食物は自由に与えられた。
ａ．動物
この研究には、Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから購入した雄のＣ５７ＢＬ６マウス（７～８週齢）を使用した。動物の維持及び外科手術処置は、Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ＣｏｍｍｉｔｔｅｅのＮＩＨガイドラインに従って実施され、Ｒｕｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．によって承認された。動物を、安定した温度及び１２時間の明暗サイクルを有する環境に収容した。水及び食物は自由に与えられた。
【0040】
ｂ．制御された皮質衝撃処置
マウスにおける脳損傷を誘導するために、制御された皮質衝撃（ＣＣＩ）損傷技術を適用した。成体Ｃ５７ＢＬ６マウスを２％のイソフルランで麻酔し、気管挿管なしで正常に呼吸させた。体温は、外科手術中に加熱パッド上で３７℃に維持され、直腸プローブによって監視された。麻酔の深さは、任意の損傷を引き起こすことなく、つま先を穏やかにつまむことによって観察された。麻酔されたマウスの頭部を滅菌された電気シェーバーで剃り、皮膚をベタジン溶液で洗浄した。次いで、動物の頭部を定位固定フレームで固定し、ＣＣＩ技術を使用してＴＢＩを誘導した（図１Ａ～１Ｄ）。最初に、頭蓋骨を露出させるために正中線の皮膚切開を実施し、定位固定装置を使用して、座標－１．５ｍｍ ＡＰ及び－１．５ｍｍ ＭＬで露出した頭蓋骨の右側に直径４ｍｍの開頭術を行った。次いで、この穿頭孔で、硬膜が無傷である脳を露出した。外科手術用顕微鏡制御下で、１．０ｍｍの丸みを帯びた金属先端が取り付けられたＬｅｉｃａ Ｉｍｐａｃｔ Ｏｎｅ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｉｍｐａｃｔｏｒ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉ－ｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を、硬膜が無傷である脳表面に向かって垂直に傾けた。続いて、露出した脳領域の右側で、１．０ｍ／ｓの打撃速度で軽度の損傷を片側だけ誘導した。脳損傷の誘導中にクッションのような支持体として機能するように、滅菌スポンジ固定ボードを使用して頭の下を支持した。衝撃損傷後、大脳皮質にダメージが生じ、周囲領域に広範囲の構造的ダメージを引き起こした。偽群の動物は、同様の外科的処置を受けたが、ＣＣＩ損傷はなかった。次いで、操作された動物を定位固定ホルダーから取り出し、皮膚切開部を軽く縫合して切開領域を閉じた。全ての操作された動物を、体温を正常な限界内に維持するために保温ブランケットに入れた。これらの動物を、麻酔からの回復まで、及び術後次の連続した３日間にわたって監視した。
マウスにおける脳損傷を誘導するために、制御された皮質衝撃（ＣＣＩ）損傷技術を適用した。成体Ｃ５７ＢＬ６マウスを２％のイソフルランで麻酔し、気管挿管なしで正常に呼吸させた。体温は、外科手術中に加熱パッド上で３７℃に維持され、直腸プローブによって監視された。麻酔の深さは、任意の損傷を引き起こすことなく、つま先を穏やかにつまむことによって観察された。麻酔されたマウスの頭部を滅菌された電気シェーバーで剃り、皮膚をベタジン溶液で洗浄した。次いで、動物の頭部を定位固定フレームで固定し、ＣＣＩ技術を使用してＴＢＩを誘導した（図１Ａ～１Ｄ）。最初に、頭蓋骨を露出させるために正中線の皮膚切開を実施し、定位固定装置を使用して、座標－１．５ｍｍ ＡＰ及び－１．５ｍｍ ＭＬで露出した頭蓋骨の右側に直径４ｍｍの開頭術を行った。次いで、この穿頭孔で、硬膜が無傷である脳を露出した。外科手術用顕微鏡制御下で、１．０ｍｍの丸みを帯びた金属先端が取り付けられたＬｅｉｃａ Ｉｍｐａｃｔ Ｏｎｅ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｉｍｐａｃｔｏｒ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉ－ｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を、硬膜が無傷である脳表面に向かって垂直に傾けた。続いて、露出した脳領域の右側で、１．０ｍ／ｓの打撃速度で軽度の損傷を片側だけ誘導した。脳損傷の誘導中にクッションのような支持体として機能するように、滅菌スポンジ固定ボードを使用して頭の下を支持した。衝撃損傷後、大脳皮質にダメージが生じ、周囲領域に広範囲の構造的ダメージを引き起こした。偽群の動物は、同様の外科的処置を受けたが、ＣＣＩ損傷はなかった。次いで、操作された動物を定位固定ホルダーから取り出し、皮膚切開部を軽く縫合して切開領域を閉じた。全ての操作された動物を、体温を正常な限界内に維持するために保温ブランケットに入れた。これらの動物を、麻酔からの回復まで、及び術後次の連続した３日間にわたって監視した。
【0041】
マウスのような小さな実験動物を使用して、臨床的に関連するＴＢＩモデルを生成することは、ＴＢＩ研究では困難な作業である。ＴＢＩの影響は、脳へのダメージの程度に応じて、身体的及び心理的な結果が変化する場合がある。いくつかの症状は損傷の直後に現れる場合があるが、他は、数日又は数週間後に現れる場合がある。したがって、標準化の目的で、種々の速度で、固定された１ｍｍの丸みを帯びた先端を使用した。この研究では、マウスを３つの群に無作為に分け、それぞれ軽度、中等度、及び重度の損傷を誘導するために、ＣＣＩを３つの速度、すなわち１．０Ｖ、１．２５Ｖ、及び１．５０Ｖで１ｍｍの丸みを帯びた先端で適用した（図１Ｃ）。手術後１週間の終わりに、３群の動物全てに４％のパラホルムアルデヒドを灌流して、脳を取り出した。その後、脳切片を４０μｍの厚さで作製した。クレシルバイオレット染色を用いて、軽度損傷群において、皮質及び海馬領域における顕著な組織ダメージを明らかにする脳ダメージの組織病理学的特徴を研究した。しかしながら、この群のマウスでは、脳の対側に顕著なダメージは見られなかった。中等度の損傷群では、マウス脳の同側の皮質及び海馬領域の組織により多くのダメージが認められ、外科手術後のマウスの回復は非常に遅く、いくつかの場合では致命的であることが見出された。更に、重度の損傷群において、外科手術後の脳の同側の皮質及び海馬の両方に重篤な組織ダメージが認められた（図１Ｃ）。マウスの回復は最小限であり、生成された損傷は、多くの場合、このマウス群において致命的になった。したがって、３つのタイプの損傷群の組織病理学的観察に基づいて、軽度のタイプのＣＣＩ損傷（１ｍｍ先端及び１．０Ｖ）を選択して、脳損傷後の認知機能及び運動機能の改善におけるシナモン代謝産物ＮａＢの有益な効果を描写した（図１Ｃ）。
【0042】
ｃ．安息香酸ナトリウム又はギ酸ナトリウムでの処置
安息香酸ナトリウム（「ＮａＢ」）及びギ酸ナトリウム（「ＮａＦＯ」）を０．１％のメチルセルロース溶液中に可溶化した。ＣＣＩ損傷の２４時間から開始して、マウスをＮａＢ又はＮａＦＯ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）で１日１回、手術後７日間経口処置した。その後、経口処置を手術後２１日まで隔日で継続し、行動分析の後、マウスを組織学的及び生化学的研究のために犠牲にした。
安息香酸ナトリウム（「ＮａＢ」）及びギ酸ナトリウム（「ＮａＦＯ」）を０．１％のメチルセルロース溶液中に可溶化した。ＣＣＩ損傷の２４時間から開始して、マウスをＮａＢ又はＮａＦＯ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）で１日１回、手術後７日間経口処置した。その後、経口処置を手術後２１日まで隔日で継続し、行動分析の後、マウスを組織学的及び生化学的研究のために犠牲にした。
【0043】
ｄ．実験群及びＮａＢ／ＮａＦＯ処置
この研究で使用された実験設計を図１Ｄに示す。全てのマウスを以下の群に無作為化した：
この研究で使用された実験設計を図１Ｄに示す。全てのマウスを以下の群に無作為化した：
【0044】
群１：対照／偽の群（群当たりｎ＝６）：マウスは、損傷及び処置なしで外科手術を受けた。
【0045】
群２：ＣＣＩ群（群当たりｎ＝６）：マウスはＣＣＩ損傷を受け、処置は実施されなかった。
【0046】
群３：ＣＣＩ＋ＮａＢ処置（群当たりｎ＝６）：マウスをＣＣＩに供し、経口でのＮａＢ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）処置を、損傷の誘導の２４時間後に開始した。
【0047】
群４：ＣＣＩ＋ＮａＦＯ処置（群当たりｎ＝６）。マウスを脳損傷に供し、経口でのＮａＦＯ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）処置を、損傷の誘導の２４時間後に開始した。
【0048】
ｅ．ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングを、以前の研究に記載のとおりに行った。等量のタンパク質を、１０％又は１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ中で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に移した。ブロットを４℃で一晩、一次抗体でプローブした。以下は、この研究で使用される一次抗体であり、以下の表１に詳細に記載される：抗ｉＮＯＳ（１：１０００、ＢＤ Ｂｉｏ－ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｉｂａ１（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、抗ＧＦＡＰ（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、及び抗β－アクチン（１：５０００、Ａｂｃａｍ）。一晩のインキュベーションの後、一次抗体を除去し、ブロットを、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝液生理食塩水で洗浄し、対応する赤外線フルオロフォアタグ付き二次抗体（１：１０，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を室温で添加した。次いで、ブロットを二次抗体で１時間インキュベートした。その後、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナー（Ｌｉ－ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）でスキャンした。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、ＵＳＡ）を使用して定量した。
ウェスタンブロッティングを、以前の研究に記載のとおりに行った。等量のタンパク質を、１０％又は１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ中で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に移した。ブロットを４℃で一晩、一次抗体でプローブした。以下は、この研究で使用される一次抗体であり、以下の表１に詳細に記載される：抗ｉＮＯＳ（１：１０００、ＢＤ Ｂｉｏ－ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｉｂａ１（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、抗ＧＦＡＰ（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、及び抗β－アクチン（１：５０００、Ａｂｃａｍ）。一晩のインキュベーションの後、一次抗体を除去し、ブロットを、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝液生理食塩水で洗浄し、対応する赤外線フルオロフォアタグ付き二次抗体（１：１０，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を室温で添加した。次いで、ブロットを二次抗体で１時間インキュベートした。その後、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナー（Ｌｉ－ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）でスキャンした。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、ＵＳＡ）を使用して定量した。
【表1】
【0049】
ｆ．免疫組織化学
マウスをケタミン－キシラジン混合溶液で麻酔し、ＰＢＳ、次いで、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で灌流し、続いて、免疫蛍光顕微鏡検査のための脳の解離を行った。簡単に言えば、解剖された脳を１０％のスクロース中で３時間インキュベートし、次いで、続いて４℃で一晩、３０％のスクロースでインキュベートした。次いで、脳を－８０℃で最適切断温度培地（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈ）に埋め込み、従来の凍結切断の処理をした。凍結切片（厚さ４０μｍ）を冷却エタノール（－２０℃）で処理し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ中２％のＢＳＡでブロッキングし、２つの一次抗体で二重標識した（表１）。ＰＢＳＴでの３回の洗浄後、切片をＣｙ２及びＣｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でインキュベートした。切片を取り付け、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１蛍光顕微鏡下で観察した。計数分析は、タッチ計数モジュールの助けを借りてＯｌｙｍｐｕｓ Ｍｉｃｒｏｓｕｉｔｅ Ｖソフトウェアを使用して実施された。
マウスをケタミン－キシラジン混合溶液で麻酔し、ＰＢＳ、次いで、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で灌流し、続いて、免疫蛍光顕微鏡検査のための脳の解離を行った。簡単に言えば、解剖された脳を１０％のスクロース中で３時間インキュベートし、次いで、続いて４℃で一晩、３０％のスクロースでインキュベートした。次いで、脳を－８０℃で最適切断温度培地（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈ）に埋め込み、従来の凍結切断の処理をした。凍結切片（厚さ４０μｍ）を冷却エタノール（－２０℃）で処理し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ中２％のＢＳＡでブロッキングし、２つの一次抗体で二重標識した（表１）。ＰＢＳＴでの３回の洗浄後、切片をＣｙ２及びＣｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でインキュベートした。切片を取り付け、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１蛍光顕微鏡下で観察した。計数分析は、タッチ計数モジュールの助けを借りてＯｌｙｍｐｕｓ Ｍｉｃｒｏｓｕｉｔｅ Ｖソフトウェアを使用して実施された。
【0050】
ｇ．立体学的技術を使用した病変体積の定量
病変体積の推定は、Ｓｔｅｒｅｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用した不偏立体学のＣａｖａｌｉｅｒｉ法に基づいて実施された。１ｍｍの格子間隔１ｍｍを有するＣａｖａｌｉｅｒｉ 推定器を使用して、脳の同側及び対側半球の両方の体積を決定した。４番目のセクションごとに、無作為な開始点から開始して分析した。病変体積は、対側半球の体積から同側半球の体積を差し引いて推定した。次いで、未処置のマウスの脳切片で推定される病変空洞の体積を、薬物治療マウスの脳切片の病変体積と比較した。
病変体積の推定は、Ｓｔｅｒｅｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用した不偏立体学のＣａｖａｌｉｅｒｉ法に基づいて実施された。１ｍｍの格子間隔１ｍｍを有するＣａｖａｌｉｅｒｉ 推定器を使用して、脳の同側及び対側半球の両方の体積を決定した。４番目のセクションごとに、無作為な開始点から開始して分析した。病変体積は、対側半球の体積から同側半球の体積を差し引いて推定した。次いで、未処置のマウスの脳切片で推定される病変空洞の体積を、薬物治療マウスの脳切片の病変体積と比較した。
【0051】
ｈ．行動分析
ＣＣＩ損傷後の手術後７日目及び２１日目に動物の行動分析を実施した。行動試験のためのこれらの時点は、これらの時点で行動異常が見られたこれらの動物モデルを用いた以前の研究に基づいて選択された。
ＣＣＩ損傷後の手術後７日目及び２１日目に動物の行動分析を実施した。行動試験のためのこれらの時点は、これらの時点で行動異常が見られたこれらの動物モデルを用いた以前の研究に基づいて選択された。
【0052】
ｉ．オープンフィールド行動
オープンフィールド試験における動物の能力を、以前の研究で記載のとおりに分析した。簡単に言えば、各動物は、計測４０×４０ｃｍの正方形の形状の木製床を有し、高さ３０ｃｍの壁を有するオープンフィールド活動領域を探索するために、５分間自由に移動することを許された。Ｎｏｌｄｕｓコンピュータシステムに接続されたビデオコンピュータ６（Ｂａｓｌｅｒ Ｇｅｎ Ｉ Ｃａｍ－Ｂａｓｌｅｒ ａｃＡ １３００－６０）が、オープンフィールド活動領域上の上部に下向きに固定された。各マウスを活動領域の中央に個別に配置し、能力をライブビデオ追跡システムによって監視した。中央面積は、２０ｘ２０ｃｍ（総面積の半分）の正方形として任意に定義された。
オープンフィールド試験における動物の能力を、以前の研究で記載のとおりに分析した。簡単に言えば、各動物は、計測４０×４０ｃｍの正方形の形状の木製床を有し、高さ３０ｃｍの壁を有するオープンフィールド活動領域を探索するために、５分間自由に移動することを許された。Ｎｏｌｄｕｓコンピュータシステムに接続されたビデオコンピュータ６（Ｂａｓｌｅｒ Ｇｅｎ Ｉ Ｃａｍ－Ｂａｓｌｅｒ ａｃＡ １３００－６０）が、オープンフィールド活動領域上の上部に下向きに固定された。各マウスを活動領域の中央に個別に配置し、能力をライブビデオ追跡システムによって監視した。中央面積は、２０ｘ２０ｃｍ（総面積の半分）の正方形として任意に定義された。
【0053】
ｊ．ロータロッド
動物の前肢運動の協調及び平衡は、以前の研究に記載のとおり、ロータロッド試験を使用して観察された。簡単に言えば、各マウスをロッドの限られた部分に配置し、試験を、４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで５分間の滑らかに速度を増加させながら開始した。マウスがロッドから落下しなかった場合、５分後にロッドから取り出された。落下潜時は秒単位で測定され、分析に使用された。ＣＣＩ損傷後、各マウスは、試験セッション中に３つの試験でタスクを実施し、これらの３つの試験の平均スコアを個々のロータロッドスコアとして使用した。各ロッド上の試験は、マウスがロッドから落下したか、又は吊るしてロッドに保持された場合、不適切な回転が完了した場合に終了した。
動物の前肢運動の協調及び平衡は、以前の研究に記載のとおり、ロータロッド試験を使用して観察された。簡単に言えば、各マウスをロッドの限られた部分に配置し、試験を、４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで５分間の滑らかに速度を増加させながら開始した。マウスがロッドから落下しなかった場合、５分後にロッドから取り出された。落下潜時は秒単位で測定され、分析に使用された。ＣＣＩ損傷後、各マウスは、試験セッション中に３つの試験でタスクを実施し、これらの３つの試験の平均スコアを個々のロータロッドスコアとして使用した。各ロッド上の試験は、マウスがロッドから落下したか、又は吊るしてロッドに保持された場合、不適切な回転が完了した場合に終了した。
【0054】
ｋ．尾部吊り下げ試験
マウスを、以前の研究に記載の方法論を使用して尾部吊り下げ試験に供した。マウスを、床より５０ｃｍ上に非毒性粘着テープを使用して尾部によって６分間穏やかに逆さまに吊り下げた。不動時間は、マウスが能動的な動きなしに受動的にぶら下がっているだけの期間として定義された。不動時間の増加は、うつ病様行動として定義される。
マウスを、以前の研究に記載の方法論を使用して尾部吊り下げ試験に供した。マウスを、床より５０ｃｍ上に非毒性粘着テープを使用して尾部によって６分間穏やかに逆さまに吊り下げた。不動時間は、マウスが能動的な動きなしに受動的にぶら下がっているだけの期間として定義された。不動時間の増加は、うつ病様行動として定義される。
【0055】
ｌ．巣作り行動
５ｃｍｘ５ｃｍの圧縮された綿の正方形からなる巣を午後５時～午後６時にケージ内に置いた。翌朝午前９時～午前１０時に、実験手順に対して盲検である２人の観察者が、以下のように５点スケールを使用してマウスによって構築された巣の質をスコアリングした。スコア１（９０％超の巣が無傷）、スコア２（５０％～９０％の巣が無傷）、スコア３（１０％～５０％の巣が無傷であるが、認識可能な巣の場所がない）、スコア４（１０％未満の巣が無傷であり、巣は認識可能であるが平坦である）、スコア５（１０％未満の巣が無傷であり、巣は、マウス本体よりも高い壁で認識可能である）。
５ｃｍｘ５ｃｍの圧縮された綿の正方形からなる巣を午後５時～午後６時にケージ内に置いた。翌朝午前９時～午前１０時に、実験手順に対して盲検である２人の観察者が、以下のように５点スケールを使用してマウスによって構築された巣の質をスコアリングした。スコア１（９０％超の巣が無傷）、スコア２（５０％～９０％の巣が無傷）、スコア３（１０％～５０％の巣が無傷であるが、認識可能な巣の場所がない）、スコア４（１０％未満の巣が無傷であり、巣は認識可能であるが平坦である）、スコア５（１０％未満の巣が無傷であり、巣は、マウス本体よりも高い壁で認識可能である）。
【0056】
ｍ．ビームランウェイ
ビームランウェイは、滑らかな木材で作られ、計測長さ６５ｃｍ×幅０．７ｃｍ×高さ４ｃｍであった。一方の端に開口部のある黒色の箱を固定し、ビームの他方の端に嫌悪刺激（明るいランプ）を固定した。この試験を使用して、ビームを横断している間のマウスの複雑な協調及び平衡を評価し、以前の研究に記載のとおりの手順を実施した。マウスを光源の近くのビームの上に置き、光を「オン」にした。これにより、嫌悪刺激を避けるために動物が箱に入り、嫌悪刺激がオフになる。箱の内側で２分間休息を挟んで６回の反復を行った。測定されたパラメータは、箱に到達するまでの所要時間（秒）、及び対側の四肢の引きずり／滑りを伴う歩数であった。ビーム上での足の滑り及び滑りの数が計数されるたびに、エラーが考慮された。ビーム歩行分析は、手術後７日目及び２１日目に処置に対して盲検化された観察者によって実施された。
ビームランウェイは、滑らかな木材で作られ、計測長さ６５ｃｍ×幅０．７ｃｍ×高さ４ｃｍであった。一方の端に開口部のある黒色の箱を固定し、ビームの他方の端に嫌悪刺激（明るいランプ）を固定した。この試験を使用して、ビームを横断している間のマウスの複雑な協調及び平衡を評価し、以前の研究に記載のとおりの手順を実施した。マウスを光源の近くのビームの上に置き、光を「オン」にした。これにより、嫌悪刺激を避けるために動物が箱に入り、嫌悪刺激がオフになる。箱の内側で２分間休息を挟んで６回の反復を行った。測定されたパラメータは、箱に到達するまでの所要時間（秒）、及び対側の四肢の引きずり／滑りを伴う歩数であった。ビーム上での足の滑り及び滑りの数が計数されるたびに、エラーが考慮された。ビーム歩行分析は、手術後７日目及び２１日目に処置に対して盲検化された観察者によって実施された。
【0057】
ｎ．格子ランウェイ
棒間隔が１ｃｍの間隔の平行な格子棒で作られた格子ランウェイ（長さ６５ｃｍｘ幅８ｃｍｘ１ｃｍ間隔）は、試験セッション中にテーブル上の表面の上に保たれた。動物が格子から落下した場合、重篤な損傷を避けるために保護用の柔らかいパッドを格子ランウェイの下に配置した。各マウスは格子上を自由に歩くことが許され、ランウェイを横断する所要時間及び歩数が記録された。格子上での各成功裏な脚の配置を歩みとして記録した。しかしながら、足が滑って格子を通過するか、又は足が棒を逃し、バーの平面を通って下向きに延びる場合、エラーが考慮された。格子上の動物の運動行動は、ＣＣＩ損傷後７日目及び２１日目に処置に対して盲検化された観察者によって評価された。
棒間隔が１ｃｍの間隔の平行な格子棒で作られた格子ランウェイ（長さ６５ｃｍｘ幅８ｃｍｘ１ｃｍ間隔）は、試験セッション中にテーブル上の表面の上に保たれた。動物が格子から落下した場合、重篤な損傷を避けるために保護用の柔らかいパッドを格子ランウェイの下に配置した。各マウスは格子上を自由に歩くことが許され、ランウェイを横断する所要時間及び歩数が記録された。格子上での各成功裏な脚の配置を歩みとして記録した。しかしながら、足が滑って格子を通過するか、又は足が棒を逃し、バーの平面を通って下向きに延びる場合、エラーが考慮された。格子上の動物の運動行動は、ＣＣＩ損傷後７日目及び２１日目に処置に対して盲検化された観察者によって評価された。
【0058】
ｏ．バーンズ迷路試験
バーンズ迷路試験を、以前の研究に記載のとおりに行った［４４，４９，５８］。簡単に言えば、マウスを最初に連続して２日間訓練した後、３日目に検査した。各訓練セッションの後、迷路及び回避トンネルは、慣れ親しんだ物体からのマウスの臭いによる本能的な臭い回避を避けるために、中性洗剤で徹底的に洗浄された。３日目に、Ｎｏｌｄｕｓコンピュータシステムに接続されたビデオカメラ（Ｂａｓｌｅｒ Ｇｅｎ Ｉ Ｃａｍ－Ｂａｓｌｅｒ ａｃＡ １３００－６０）が迷路の上に配置され、回避トンネルに入るよう動物を動機付けるのに十分な光及び熱を生成する高電圧光で照らされた。能力をビデオ追跡システム（Ｎｏｌｄｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）によって監視した。認知行動パラメータは、潜時（４つの足全てが回避箱の床にある前の期間）及びエラー（４つの足全てが回避箱の床にある前の誤った応答）を測定することによって調査した。
バーンズ迷路試験を、以前の研究に記載のとおりに行った［４４，４９，５８］。簡単に言えば、マウスを最初に連続して２日間訓練した後、３日目に検査した。各訓練セッションの後、迷路及び回避トンネルは、慣れ親しんだ物体からのマウスの臭いによる本能的な臭い回避を避けるために、中性洗剤で徹底的に洗浄された。３日目に、Ｎｏｌｄｕｓコンピュータシステムに接続されたビデオカメラ（Ｂａｓｌｅｒ Ｇｅｎ Ｉ Ｃａｍ－Ｂａｓｌｅｒ ａｃＡ １３００－６０）が迷路の上に配置され、回避トンネルに入るよう動物を動機付けるのに十分な光及び熱を生成する高電圧光で照らされた。能力をビデオ追跡システム（Ｎｏｌｄｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）によって監視した。認知行動パラメータは、潜時（４つの足全てが回避箱の床にある前の期間）及びエラー（４つの足全てが回避箱の床にある前の誤った応答）を測定することによって調査した。
【0059】
ｐ．Ｔ字型迷路
マウスを最初に、２日間、食物を奪われた条件下でＴ字型迷路に慣らした。食物の報酬が、１０分間の訓練で少なくとも５回提供された。動物の任意の嗅覚の手がかりを使用する能力を最小限に抑えるために、各試験セッションの間にＴ字型迷路を中性洗剤溶液で洗浄した。食物の報酬の側は、常に視覚的な合図と関連した。動物が食物の報酬を消費するたびに、それは陽性ターンとみなされた。
マウスを最初に、２日間、食物を奪われた条件下でＴ字型迷路に慣らした。食物の報酬が、１０分間の訓練で少なくとも５回提供された。動物の任意の嗅覚の手がかりを使用する能力を最小限に抑えるために、各試験セッションの間にＴ字型迷路を中性洗剤溶液で洗浄した。食物の報酬の側は、常に視覚的な合図と関連した。動物が食物の報酬を消費するたびに、それは陽性ターンとみなされた。
【0060】
ｑ．新規物体認識（ＮＯＲ）試験
この試験は、環境中の新規物体を認識し、短期記憶を監視する動物の能力を評価する。最初に、マウスを、赤外線センサーで囲まれた正方形の新規の箱（長さ２０インチｘ高さ８インチ）に入れた。色、形、及び質感が異なる２つのプラスチック玩具（２．５～３インチのサイズ）を、互いに１８インチ離れた環境内の特定の場所に配置した。マウスは、環境及び物体を１５分間自由に探索することができ、次いで、個々のホームケージに戻した。３０分の間隔を開けた後、マウスは、２つの物体が同じ位置にある環境に戻されたが、今度は、慣れ親しんだ物体のうちの１つは、第３の新規物体に置き換えられた。マウスを再び、両方の物体を１５分間自由に探索させた。慣れ親しんだ物体及び新規物体は、各試験セッションの後、穏やかな洗剤で徹底的に洗浄された。
この試験は、環境中の新規物体を認識し、短期記憶を監視する動物の能力を評価する。最初に、マウスを、赤外線センサーで囲まれた正方形の新規の箱（長さ２０インチｘ高さ８インチ）に入れた。色、形、及び質感が異なる２つのプラスチック玩具（２．５～３インチのサイズ）を、互いに１８インチ離れた環境内の特定の場所に配置した。マウスは、環境及び物体を１５分間自由に探索することができ、次いで、個々のホームケージに戻した。３０分の間隔を開けた後、マウスは、２つの物体が同じ位置にある環境に戻されたが、今度は、慣れ親しんだ物体のうちの１つは、第３の新規物体に置き換えられた。マウスを再び、両方の物体を１５分間自由に探索させた。慣れ親しんだ物体及び新規物体は、各試験セッションの後、穏やかな洗剤で徹底的に洗浄された。
【0061】
ｒ．統計分析
類似のタイプ及び複雑さの以前の研究に基づいて、６匹のマウスは、全ての行動実験に対して８０％超の力を発揮すると予想される。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７を使用することによって、２群比較についてスチューデントのｔ検定を用いて実施され、多重比較のために適切な場合、一元配置ＡＮＯＶＡ続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を用いて実施された。データは、記載された図の凡例として、平均値±ＳＤ又は平均値±ＳＥＭとして表される。統計的有意性は、ｐ＜０．０５のレベルで決定された。
類似のタイプ及び複雑さの以前の研究に基づいて、６匹のマウスは、全ての行動実験に対して８０％超の力を発揮すると予想される。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７を使用することによって、２群比較についてスチューデントのｔ検定を用いて実施され、多重比較のために適切な場合、一元配置ＡＮＯＶＡ続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を用いて実施された。データは、記載された図の凡例として、平均値±ＳＤ又は平均値±ＳＥＭとして表される。統計的有意性は、ｐ＜０．０５のレベルで決定された。
【0062】
２．ＮａＢ処置は、ＣＣＩ誘導ＴＢＩマウスにおけるグリア活性化を減衰させる
最近の知見は、脳損傷を含む種々の神経炎症及び神経変性障害における重要な病理学的事象として、ミクログリア及びアストログリア活性化並びに関連する神経炎症を確立している。最初のＣＣＩ損傷の直後に、組織環境が改変して、グリア細胞を活性化する。したがって、ＣＣＩ損傷（図１）後、損傷後７日目のマウスの皮質及び海馬領域におけるＧＦＡＰ陽性星細胞（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｅ、及び図２Ｆ）及びＩｂａ１陽性ミクログリア（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）の数の顕著な増加が、偽対照と比較して観察された。海馬抽出物のウェスタンブロット分析もまた、ＧＦＡＰ（図２Ｉ及び図２Ｊ）及びＩｂａ１（図３Ｉ及び図３Ｊ）のこの増加を裏付けた。しかしながら、ＣＣＩ損傷ＴＢＩマウスのＮａＢでの経口処置は、ＧＦＡＰ陽性星細胞（図２Ａ～２Ｆ）及びＩｂａ１陽性ミクログリア（図３Ａ～３Ｆ）の両方の減少をもたらした。この結果は、ギ酸ナトリウム（ＮａＦＯ）が良いＴＢＩの海馬におけるグリア活性化を阻害することができないままであったため（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｅ、及び図２Ｆ並びに図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）、特異的であった。
最近の知見は、脳損傷を含む種々の神経炎症及び神経変性障害における重要な病理学的事象として、ミクログリア及びアストログリア活性化並びに関連する神経炎症を確立している。最初のＣＣＩ損傷の直後に、組織環境が改変して、グリア細胞を活性化する。したがって、ＣＣＩ損傷（図１）後、損傷後７日目のマウスの皮質及び海馬領域におけるＧＦＡＰ陽性星細胞（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｅ、及び図２Ｆ）及びＩｂａ１陽性ミクログリア（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）の数の顕著な増加が、偽対照と比較して観察された。海馬抽出物のウェスタンブロット分析もまた、ＧＦＡＰ（図２Ｉ及び図２Ｊ）及びＩｂａ１（図３Ｉ及び図３Ｊ）のこの増加を裏付けた。しかしながら、ＣＣＩ損傷ＴＢＩマウスのＮａＢでの経口処置は、ＧＦＡＰ陽性星細胞（図２Ａ～２Ｆ）及びＩｂａ１陽性ミクログリア（図３Ａ～３Ｆ）の両方の減少をもたらした。この結果は、ギ酸ナトリウム（ＮａＦＯ）が良いＴＢＩの海馬におけるグリア活性化を阻害することができないままであったため（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｅ、及び図２Ｆ並びに図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）、特異的であった。
【0063】
ＮａＢで処置されたＴＢＩマウスの海馬におけるＧＦＡＰ（図２Ｉ～２Ｊ）及びＩｂａ１（図３Ｉ～３Ｊ）のタンパク質のレベルの減少及び／又は正常化は、ウェスタンブロットからも明らかである。活性化グリア細胞は、神経炎症環境において亜硝酸ストレスを引き起こすために過剰な一酸化窒素を産生する誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を発現することが知られている。これに対応して、損傷後７日目のｉＮＯＳのレベルは、偽対照と比較して、ＴＢＩマウスの皮質及び海馬において高かった（図２及び図３）。二重標識免疫蛍光分析は、増加したｉＮＯＳが、ＧＦＡＰ発現星細胞（図２Ａ～２Ｈ）及びＩｂａ１陽性ミクログリア（図３Ａ～３Ｆ）の両方に存在したことを明らかにした。しかしながら、ＮａＦＯではなくＮａＢでのＴＢＩマウスの処置は、皮質及び海馬の両方においてｉＮＯＳの阻害をもたらした（図２Ｃ～２Ｄ及び図３Ｃ～３Ｄ）。これらの所見は、定量分析（図２Ｇ～２Ｈ）及びウェスタンブロット（図３Ｉ～３Ｊ）によって確認された。まとめると、これらの結果は、ＮａＢがＣＣＩ誘導ＴＢＩマウスのＣＮＳにおけるインビボでのグリア炎症を低減させることができることを示す。
【0064】
３．ＴＢＩを有するマウスにおける経口ＮａＢ刺激再髄鞘形成
プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）は、乏突起膠細胞のマーカーであり、Ａ２Ｂ５は、乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）のマーカーである。２１日の処置後、脳切片をＰＬＰ及びＡ２Ｂ５に対する抗体で二重標識した。図４の画像は、予想されるように、ＴＢＩを有するマウスの脳梁においてＰＬＰのレベルが非常に低く、多くのＡ２Ｂ５陽性ＯＰＣが脱髄領域に局在したことを示す。しかしながら、ＮａＢ処置は、ＴＢＩを有するマウスの脳梁におけるＰＬＰのレベルを顕著に増加させた。したがって、ＮａＢ処置はまた、ＴＢＩマウスの脳梁におけるＯＰＣの数を減少させた。これらの結果は、ＮａＢに特異的であり、ベンゼン環がないＮａＢに構造的に類似した分子であるＮａＦＯは、ＰＬＰのレベルを回復することがでず、ＴＢＩマウスの脳梁におけるＯＰＣの数を減少させることができないままであった。
プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）は、乏突起膠細胞のマーカーであり、Ａ２Ｂ５は、乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）のマーカーである。２１日の処置後、脳切片をＰＬＰ及びＡ２Ｂ５に対する抗体で二重標識した。図４の画像は、予想されるように、ＴＢＩを有するマウスの脳梁においてＰＬＰのレベルが非常に低く、多くのＡ２Ｂ５陽性ＯＰＣが脱髄領域に局在したことを示す。しかしながら、ＮａＢ処置は、ＴＢＩを有するマウスの脳梁におけるＰＬＰのレベルを顕著に増加させた。したがって、ＮａＢ処置はまた、ＴＢＩマウスの脳梁におけるＯＰＣの数を減少させた。これらの結果は、ＮａＢに特異的であり、ベンゼン環がないＮａＢに構造的に類似した分子であるＮａＦＯは、ＰＬＰのレベルを回復することがでず、ＴＢＩマウスの脳梁におけるＯＰＣの数を減少させることができないままであった。
【0065】
４．ＮａＢ処置はＣＣＩ誘導マウスにおける病変体積を低減させた
経口ＮａＢは、ＴＢＩマウスのＣＮＳにおけるグリア炎症を低減させたため、次いで、ＮａＢ処置が病変体積を低減させることができるかどうかを調査した。したがって、クレシルバイオレット染色切片において病変体積を測定し、未処置群と処置群との間で比較した。図５Ａは、種々のマウス群からの病変空洞の体積を証明するために連続的に配置されたクレシルバイオレット染色脳切片を示す。損傷の２１日後、偽対照においては何も観測されないことと比較して、ＣＣＩ誘導ＴＢＩマウスにおいて、皮質から始まり、海馬を介して外側脳室に接続する、拡大した空洞を含む典型的な病変が観察された（図５Ｂ）。他方では、ＮａＦＯではなくＮａＢの経口投与は、ＣＣＩ誘導マウスにおける病変空洞のサイズを低減させた。Ｃａｖａｌｉｅｒｉ立体学的技術を使用した病変体積の定量的分析は、未処置又はＮａＦＯで処置されたＴＢＩマウスのいずれかと比較した場合、ＮａＢの経口処置後、全ての半球における全ての病変体積が有意に低減したことを明らかにした（図５Ｃ）。
経口ＮａＢは、ＴＢＩマウスのＣＮＳにおけるグリア炎症を低減させたため、次いで、ＮａＢ処置が病変体積を低減させることができるかどうかを調査した。したがって、クレシルバイオレット染色切片において病変体積を測定し、未処置群と処置群との間で比較した。図５Ａは、種々のマウス群からの病変空洞の体積を証明するために連続的に配置されたクレシルバイオレット染色脳切片を示す。損傷の２１日後、偽対照においては何も観測されないことと比較して、ＣＣＩ誘導ＴＢＩマウスにおいて、皮質から始まり、海馬を介して外側脳室に接続する、拡大した空洞を含む典型的な病変が観察された（図５Ｂ）。他方では、ＮａＦＯではなくＮａＢの経口投与は、ＣＣＩ誘導マウスにおける病変空洞のサイズを低減させた。Ｃａｖａｌｉｅｒｉ立体学的技術を使用した病変体積の定量的分析は、未処置又はＮａＦＯで処置されたＴＢＩマウスのいずれかと比較した場合、ＮａＢの経口処置後、全ての半球における全ての病変体積が有意に低減したことを明らかにした（図５Ｃ）。
【0066】
５．経口ＮａＢは、ＴＢＩを有するマウスにおけるオープンフィールド行動及び運動活動を改善した
神経保護研究の最も重要な治療目的は、二次的な組織喪失を制限し、行動機能を維持又は改善することである。したがって、ＮａＢの経口投与がＣＣＩ損傷によって引き起こされる組織的ダメージだけでなく機能的不足も保護するかどうかを分析するために、全体的な歩行活動を調査した。Ｎｏｌｄｕｓコンピュータシステムに接続されたビデオカメラ６（Ｂａｓｌｅｒ Ｇｅｎ Ｉ Ｃａｍ－Ｂａｓｌｅｒ ａｃＡ １３００－６０）は、一般的な運動行動を記録するために、オープンフィールド活動領域上の上部に下向きに据え付けられたままであった。図６Ａ及び図６Ｆは、それぞれ、損傷の７日後及び２１日後のオープンフィールド試験におけるマウスの全体的な活動を要約するヒートマップを示す。未処置又はＮａＦＯで処置されたＴＢＩマウスのいずれかと比較して、損傷の７日後のＮａＢで処置されたＴＢＩマウスにおいて、一般的な運動活性は、有意な改善を示した（図６Ａ～６Ｅ）。機能的改善は、移動した距離（図６Ｂ）、速度（図６Ｃ）、中心頻度（図６Ｄ）、及び飼育行動（図６Ｅ）から明らかに可視化された。他方では、損傷の２１日後で、処置されたＴＢＩ群と未処置のＴＢＩ群との間で全体的な動きの有意な差は観察されなかった（図６）。
神経保護研究の最も重要な治療目的は、二次的な組織喪失を制限し、行動機能を維持又は改善することである。したがって、ＮａＢの経口投与がＣＣＩ損傷によって引き起こされる組織的ダメージだけでなく機能的不足も保護するかどうかを分析するために、全体的な歩行活動を調査した。Ｎｏｌｄｕｓコンピュータシステムに接続されたビデオカメラ６（Ｂａｓｌｅｒ Ｇｅｎ Ｉ Ｃａｍ－Ｂａｓｌｅｒ ａｃＡ １３００－６０）は、一般的な運動行動を記録するために、オープンフィールド活動領域上の上部に下向きに据え付けられたままであった。図６Ａ及び図６Ｆは、それぞれ、損傷の７日後及び２１日後のオープンフィールド試験におけるマウスの全体的な活動を要約するヒートマップを示す。未処置又はＮａＦＯで処置されたＴＢＩマウスのいずれかと比較して、損傷の７日後のＮａＢで処置されたＴＢＩマウスにおいて、一般的な運動活性は、有意な改善を示した（図６Ａ～６Ｅ）。機能的改善は、移動した距離（図６Ｂ）、速度（図６Ｃ）、中心頻度（図６Ｄ）、及び飼育行動（図６Ｅ）から明らかに可視化された。他方では、損傷の２１日後で、処置されたＴＢＩ群と未処置のＴＢＩ群との間で全体的な動きの有意な差は観察されなかった（図６）。
【0067】
続いて、損傷の７日後及び２１日後にロータロッド試験を使用して、ＣＣＩ損傷マウスの全ての群における運動協調及び平衡活動の回復も調査した。ＣＣＩ損傷後、処置のないマウスは、損傷の７日後に、転倒までの潜時の著しい減少を示し、この運動活性は、偽対照群と比較して、損傷後２１日間にわたってロータロッドで損なわれたままであった。しかしながら、ＮａＦＯではなくＮａＢでのＣＣＩ損傷マウスの処置は、ロータロッド試験（図６Ｌ）で適切な身体の動き及び平衡機能を維持することによって、長時間の潜時をもたらした。
【0068】
うつ病は、脳損傷の初期段階中で分かる一般的な症状である。したがって、ＣＣＩ損傷マウスにおけるうつ病様行動を監視した。ＴＢＩ研究における以前の研究は、マウスにおけるうつ病は、不動の期間の増加によって分析され得ることを実証している。したがって、この試験を行って、ＣＣＩ損傷マウスにおけるうつ病様行動に対するＮａＢの神経保護効果を調査した。損傷の７日後に、いずれの処置も行っていないＣＣＩマウスは、偽対照よりも有意に長い不動時間を示した（図６Ｋ）。他方では、ＮａＢで処置されたＣＣＩマウスは、未処置又はＮａＦＯで処置されたマウスのいずれかと比較して著しく少ない不動時間を示した。ＮａＢ処置時、不動の期間は正常なレベルに近かった。これらの結果は、ＮａＢが、ＣＣＩ損傷マウスにおけるうつ病様行動を制御することができることを示唆する。
【0069】
ＴＢＩ誘導ダメージは、常に脳と筋肉との間の接続を損ない、最終的には歩行運動に影響を及ぼす。したがって、ビーム及び格子上でのＣＣＩマウスの歩行関連障害は、これら２つの多面的なランウェイが、オープンフィールド行動試験上のものとは異なる動きのパターンを明らかにするように見えたため、分析された。先の研究では、これらのビーム及び格子ランウェイは、科学者が対側対同側の四肢の動きを分析して比較する機会を与えるため、片側ＴＢＩのモデルで特に有用であることが明らかになっている。したがって、ビーム及び格子ランウェイを使用した片側ＣＣＩモデルにおける歩行機能の回復に対するＮａＢの神経保護の役割を調査した。ＣＣＩマウスは、歩行中に対側骨盤肢を引きずる傾向があった。このタイプの行動は、偽対照では見られなかった。更に、偽対照は、外科手術後にビームを横断するための潜時又は脚の歩数に著しい変化を示さなかった。
【0070】
しかしながら、ＣＣＩマウスのいずれも、外科手術当日及び外科手術後翌日にビームを横断することができなかった（図６Ｍ～６Ｏ）。損傷の７日後に、処置のないＣＣＩマウスは、ビーム上で体の平衡を取るのに重大な欠損を示すか、又は足を滑らせ格子を通過させた。処置のないＣＣＩマウスは、偽対照と比較して、ビームを横断している間、より多くの潜時、歩み及び脚の欠陥、又は脚の置き違いを示す歩行行動の能力の低下を示した。格子分析について同様の結果が見られた（図６Ｐ～６Ｒ）。しかしながら、ＮａＦＯではなくＮａＢで処置すると、ＣＣＩ損傷マウスは、ビーム及び格子ランウェイでの歩行運動の著しい改善を示した。
【0071】
ＮａＢで処置されたＣＣＩマウスはまた、未処置又はＮａＦＯで処置されたＣＣＩマウスのいずれかと比較して、潜時、脚の歩み、脚の滑り、及び脚の置き違いにおいて有意な向上を示した（図６Ｍ～６Ｒ）。他方では、損傷の２１日後に、偽対照に関してこれらのパラメータの著しい変化が見られなかったように、ＣＣＩマウスは、ほぼ正常レベルにかなり回復した。その結果、ＮａＢ処置はまた、損傷の２１日後でのＣＣＩマウスのビーム歩行又は格子ランウェイのいずれで著しい保護を示さなかった。
【0072】
６．ＴＢＩを有するマウスにおいて、経口ＮａＢは空間学習及び記憶を保護した
ＴＢＩの生存者は、多くの場合、生涯にわたって学習及び記憶の問題に苦しんでいる。したがって、経口ＮａＢがＴＢＩマウスにおける記憶及び認知機能を保護するかどうかを調査するために、新規物体認識（ＮＯＲ）、バーンズ迷路、及びＴ字型迷路マスクに対するマウスの能力を監視した。図７Ａは、２１日間の処置後のマウスの新規物体認識を示すヒートマップを示す。図７Ｃは、この同じ試験の探索時間の結果を示す。
ＴＢＩの生存者は、多くの場合、生涯にわたって学習及び記憶の問題に苦しんでいる。したがって、経口ＮａＢがＴＢＩマウスにおける記憶及び認知機能を保護するかどうかを調査するために、新規物体認識（ＮＯＲ）、バーンズ迷路、及びＴ字型迷路マスクに対するマウスの能力を監視した。図７Ａは、２１日間の処置後のマウスの新規物体認識を示すヒートマップを示す。図７Ｃは、この同じ試験の探索時間の結果を示す。
【0073】
バーンズ円形迷路試験は、空間参照記憶を必要とする海馬依存性認知タスクである。図７Ｂは、処置の２１日後のＴＢＩマウスのバーンズ円形試験の結果を示すヒートマップを示し、図７Ｄは、潜時を示し、図７Ｅは、作製されたエラーの数を示す。ＴＢＩマウスは、報酬の穴を容易に見つけられず、より多くの時間（潜時）を必要とし、より多くのエラーを作製した。他方では、ＮａＢで処置されたＴＢＩマウスは、より少ない潜時及びより少ないエラーで標的の穴を見つけることにおいて、健常な対照マウスと同じくらいの能力を有していた。
【0074】
Ｔ字型迷路試験でも同様の結果が見出された。図５Ｆは、２１日間の処置後のこの試験中に行われた、陽性ターンの数を示し、図５Ｇは、陰性ターンの数を示す。ＴＢＩマウスは、偽対照よりも陽性ターンの数が少なく、陰性ターンの数が多かった。繰り返しになるが、ＮａＢ処置は、ＴＢＩマウスにおける海馬依存性記憶能力を著しく改善し、これは、より高い数の陽性ターン及びより低い数の陰性ターンによって示される。
【0075】
これらの結果はＮａＢに特異的であった。ＮａＢの陰性対照であるＮａＦＯは、ＴＢＩマウスにおける海馬依存性行動を改善することができないままであった。
【0076】
７．考察
ＴＢＩは米国における死亡及び障害の主な原因であるが、徹底的な調査にもかかわらず、定期的な医学的評価及びケアを除いて、ＴＢＩ患者の生活の質を改善するための効果的な治療は今日まで利用可能ではない。したがって、ＴＢＩの病理学的過程を調節し、行動転帰の改善をもたらすための安全で効果的な治療法を説明することは、重要な研究分野である。本研究で概説されたいくつかの証拠は、ＮａＢがＣＣＩ誘導マウスモデルにおいてＴＢＩの疾患プロセスを抑制することができるという結論を明確に支持する。ＴＢＩは大規模な病変空洞を引き起こしたが、ＣＣＩの２４時間後から開始した経口ＮａＢ処置は、病変体積を減少させ、ダメージを受けた海馬の構造組織の完全性を回復させた。対照的に、ベンゼン環のないＮａＢ類似体であるＮａＦＯでの処置は、そのような保護を示すことができないままであった。ＮａＢ処置はまた、ＴＢＩを有するマウスにおけるうつ病様行動を低減させ、運動機能障害を減衰させ、認知能力を増強した。更に、経口ＮａＢは、その安全性の実績と一致して、任意の副作用を引き起こさなかった（例えば、体重の減少、抜け毛、糞便のボル、感染症、不適切な行動など）。これらの結果は、経口ＮａＢがＴＢＩの治療に有益である可能性があり、ＮａＢがＴＢＩ患者に毒性であるべきではないことを示唆している。
ＴＢＩは米国における死亡及び障害の主な原因であるが、徹底的な調査にもかかわらず、定期的な医学的評価及びケアを除いて、ＴＢＩ患者の生活の質を改善するための効果的な治療は今日まで利用可能ではない。したがって、ＴＢＩの病理学的過程を調節し、行動転帰の改善をもたらすための安全で効果的な治療法を説明することは、重要な研究分野である。本研究で概説されたいくつかの証拠は、ＮａＢがＣＣＩ誘導マウスモデルにおいてＴＢＩの疾患プロセスを抑制することができるという結論を明確に支持する。ＴＢＩは大規模な病変空洞を引き起こしたが、ＣＣＩの２４時間後から開始した経口ＮａＢ処置は、病変体積を減少させ、ダメージを受けた海馬の構造組織の完全性を回復させた。対照的に、ベンゼン環のないＮａＢ類似体であるＮａＦＯでの処置は、そのような保護を示すことができないままであった。ＮａＢ処置はまた、ＴＢＩを有するマウスにおけるうつ病様行動を低減させ、運動機能障害を減衰させ、認知能力を増強した。更に、経口ＮａＢは、その安全性の実績と一致して、任意の副作用を引き起こさなかった（例えば、体重の減少、抜け毛、糞便のボル、感染症、不適切な行動など）。これらの結果は、経口ＮａＢがＴＢＩの治療に有益である可能性があり、ＮａＢがＴＢＩ患者に毒性であるべきではないことを示唆している。
【0077】
ＣＮＳにおけるグリア活性化及び炎症促進分子の上方調節は、ＴＢＩを含むいくつかの神経変性疾患の病因に関与する。ＴＢＩの直後に、脳内のミクログリア及びアストログリアが活性化され、長期間、毒性量の炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１β、ＴＮＦαなど）、炎症促進性酵素（例えば、誘導性一酸化窒素合成酵素又はｉＮＯＳ）、反応性酸素種などが産生され、最終的に軸索ダメージを引き起こすことが知られている。ここでは、ＮａＢ処置が、ＴＢＩを有するマウスの海馬におけるミクログリアマーカーＩｂａ１及びアストログリアマーカーＧＦＡＰのレベルを低減させ、ｉＮＯＳの発現を減少させることが示されている。したがって、ＮａＢ処置は、治療モードでＴＢＩの２４時間後から開始したが、ＴＢＩマウスにおけるグリア炎症を低減及び／又は正常化することができる。
【0078】
グリア細胞が活性化されるシグナル伝達機構はほとんど理解されていない。ＮａＢは、ミクログリアにおけるｉＮＯＳ及び炎症促進性サイトカインのＬＰＳ誘導発現を阻害することが報告されている。ＴＬＲ４は、ＬＰＳのプロトタイプ受容体である。しかしながら、ＮａＢは、ＬＰＳ刺激ミクログリアにおけるＴＬＲ４のレベルに影響を及ぼさないため、ＮａＢは、その受容体ＴＬＲ４に関与することなく、炎症促進分子のＬＰＳ誘導発現を妨げることを示す。興味深いことに、メバロン酸経路の最終生成物（コレステロール及びコエンザイムＱ）ではなく、中間体（ＨＭＧ－ＣｏＡ、メバロネート及びファルネシルピロホスフェート）が、ミクログリアにおけるＮａＢの抗炎症効果を逆転させる。ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤によるグリア細胞におけるＮＦ－κＢのＬＰＳ誘導活性化及びｉＮＯＳの発現の抑制は、ｉＮＯＳ遺伝子の上方調節におけるファルネシル化反応の重要な役割を提示する。ｐ２１ｒａｓの活性化におけるファルネシル化の役割と一致して、ｐ２１ｒａｓシグナル伝達が、グリア細胞における炎症促進分子の発現において重要な役割を果たすことが分かる。したがって、ＮａＢによるミクログリア細胞におけるｐ２１ｒａｓ活性化の抑制は、ＮａＢがｐ２１ｒａｓ活性化の抑制によりグリア炎症を減弱することを示す。
【0079】
これまで、ＴＢＩの進行を止めるために利用可能である有効な阻害療法はない。抗凝固剤は、血栓を予防し、血流を改善するために存在するが、恐怖及び神経質を低減するための抗不安薬、うつ病及び気分不安定の症状を治療するための抗うつ剤、発作を予防するための抗痙攣剤、筋肉痙攣を減少させるための筋弛緩剤は、他の抗凝固剤を除いて、周辺治療である。更に、これらの薬物のうちのいくつかは、いくつかの副作用を示す限られた症状の軽減を示す。他方では、利用可能なＴＢＩ療法に対してＮａＢのいくつかの利点が存在する。第１に、ＮａＢは、客観的に安全である。それは水溶性であり、過剰に消費されると、尿を通して分泌される。第２に、ＮａＢは、薬物治療の最も痛みの少ない経路である経口で摂取され得る。経口ＮａＢは、海馬におけるインビボでのグリア活性化を低減させ、ＴＢＩマウスにおける認知能力を改善した。第３に、ＮａＢは、他の既存の抗ＴＢＩ療法と比較して経済的である。第４に、血液脳関門（ＢＢＢ）を通る薬物の侵入は、ＣＮＳ障害の治療のための重要な問題である。ＴＢＩの初期段階では、ＢＢＢは損なわれたままであるが、時間とともに、ＢＢＢの完全性が改善され、したがって、ＢＢＢ透過性薬物は、ＴＢＩ患者の神経保護に役立つであろう。ＮａＢは、シナモンで経口処置されたマウスの脳においても検出されている。したがって、経口処置後、ＮａＢは脳に入る。
【0080】
８．食品添加物グリセリルトリベンゾエートによる制御された皮質衝撃損傷からのマウスの保護
ここでは、ＴＢＩの制御された皮質衝撃（ＣＣＩ）マウスモデルにおけるＧＴＢの神経保護効果を調査した。経口投与後、ＧＴＢは、ＣＣＩ誘導ＴＢＩマウスにおいて、グリア活性化を減弱させ、炎症促進分子のレベルを低減させ、病変体積を減少させ、シナプス構造を改善することができることを示す。機能的には、経口ＧＴＢは、ＴＢＩマウスにおける運動能力を回復し、かつ学習及び記憶を改善し、ＴＢＩにおけるＧＴＢの可能な治療的適用を強調する。
ここでは、ＴＢＩの制御された皮質衝撃（ＣＣＩ）マウスモデルにおけるＧＴＢの神経保護効果を調査した。経口投与後、ＧＴＢは、ＣＣＩ誘導ＴＢＩマウスにおいて、グリア活性化を減弱させ、炎症促進分子のレベルを低減させ、病変体積を減少させ、シナプス構造を改善することができることを示す。機能的には、経口ＧＴＢは、ＴＢＩマウスにおける運動能力を回復し、かつ学習及び記憶を改善し、ＴＢＩにおけるＧＴＢの可能な治療的適用を強調する。
【0081】
９．経口ＧＴＢによるＣＣＩ誘導ＴＢＩマウスにおけるアストログリア及びミクログリア活性化の減衰
星細胞及びミクログリアは、中枢神経系の２つの重要な細胞型である。しかしながら、過去３０年間にわたる研究により、活性化すると、これらの細胞が異なる炎症促進分子を放出して、ＴＢＩを含む種々の神経炎症傷害及び神経変性障害の病因に関与することが明らかとなった。
星細胞及びミクログリアは、中枢神経系の２つの重要な細胞型である。しかしながら、過去３０年間にわたる研究により、活性化すると、これらの細胞が異なる炎症促進分子を放出して、ＴＢＩを含む種々の神経炎症傷害及び神経変性障害の病因に関与することが明らかとなった。
【0082】
したがって、ＴＢＩマウスのＣＮＳにおけるグリア活性化に対する経口ＧＴＢの効果を調査した。最初に、アストログリア活性化を監視し、予想通り、ＣＣＩ損傷は、偽対照と比較して、損傷後７日目のＧＦＡＰ発現の増強よって明らかにされるように、皮質及び海馬におけるアストログリア活性化を誘導した（図８Ａ～８Ｂ）。この所見は、皮質（図８Ｅ）及び海馬（図８Ｆ）の両方におけるＧＦＡＰ陽性細胞の計数によって裏付けられた。ＴＢＩ後のＧＦＡＰの増加は、海馬抽出物のウェスタンブロット分析によって更に確認された（図８Ｉ～８Ｊ）。最近、５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量でのＧＴＢの経口投与が、マウスにおけるハンチントン病理を緩和し、多発性硬化症（ＭＳ）の動物モデルであるマウスにおいて実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の養子移入を阻害することを見出した。したがって、ここでは、ＣＣＩ損傷マウスを、強制経口投与により５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で、ＧＴＢで処置し、ＧＴＢ処置時にＴＢＩマウスの海馬におけるＧＦＡＰ陽性星細胞（図８Ａ～８Ｆ）及びＧＦＡＰタンパク質のレベル（図８Ｉ～８Ｊ）の減少を観察した。この結果は、ビヒクル処置でそのような変化を見出さなかったため、特異的であった（図８Ａ～８Ｆ及び８Ｉ～８Ｊ）。活性化星細胞は、神経炎症環境で亜硝酸ストレスを引き起こすために過剰な一酸化窒素を産生することが知られている誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を含む種々の炎症促進分子を発現する。
【0083】
したがって、ＧＴＢ処置及び未処置のＴＢＩマウスの海馬及び皮質におけるｉＮＯＳの状態を調査した。予想通り、また、偽対照と比較して、ＴＢＩマウスの脳におけるｉＮＯＳ陽性細胞（図８Ａ、８Ｂ、８Ｇ、及び８Ｈ）及びｉＮＯＳタンパク質のレベル（図８Ｋ～８Ｌ）の増加を見出した。多くのＧＦＡＰ陽性星細胞がｉＮＯＳと共局在化した（図８Ａ～８Ｄ）。しかしながら、アストログリア活性化の抑制と同様に、経口ＧＴＢもまた、ＴＢＩマウスの脳におけるｉＮＯＳ陽性細胞（図８Ａ、８Ｂ、８Ｇ、及び８Ｈ）及びｉＮＯＳタンパク質のレベル（図８Ｋ～８Ｌ）を減少させた。
【0084】
次いで、ミクログリア活性化を調査し、偽対照と比較して、ＴＢＩマウスの皮質及び海馬におけるＩｂａ１陽性ミクログリアの顕著な増加を見出した（図９Ａ、９Ｂ、９Ｅ、及び９Ｆ）。
【0085】
この結果を、海馬抽出物におけるＩｂａ１のウェスタンブロットによって確認した（図９Ｇ～９Ｈ）。二重標識実験はまた、ｉＮＯＳとのＩｂａ１陽性ミクログリアの共局在化を示した（図９Ａ～９Ｄ）。しかしながら、アストログリア活性化の減衰と同様に、ビヒクルではなくＧＴＢの経口投与は、ＴＢＩマウスの脳におけるＩｂａ１陽性星細胞の数（図９Ａ～９Ｆ）及びＩｂａ１タンパク質のレベル（図９Ｇ～９Ｈ）を低減させた。まとめると、これらの結果は、経口ＧＴＢが、ＴＢＩマウスの海馬におけるアストログリア及びミクログリア活性化の両方を減少させることができることを示唆する。
【0086】
１０．ＧＴＢの経口投与は、ＴＢＩのＣＣＩモデルにおける病変体積を低減させる
ＧＴＢ処置は、ＴＢＩマウスの脳におけるアストログリア及びミクログリア活性化を阻害したため、次いで、経口ＧＴＢが、損傷の２１日後に病変体積を低減させ得るかどうかを監視することを決定した。病変体積を測定するために、脳切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。図１０Ａは、種々のマウス群からの病変空洞の体積を示すために連続的に配置されたＨ＆Ｅ染色脳切片を表す。予想されるように、偽対照では病変がなかったことと比較して、ＴＢＩマウスにおいて、皮質から始まり、海馬を介して外側脳室に関与する、膨張した空洞を有する典型的な病変を見出した（図１０Ｂ）。しかしながら、アストログリア及びミクログリア炎症の抑制と一致して、ビヒクルではなくＧＴＢでの処置は、ＴＢＩマウスにおける病変空洞のサイズを低減した（図１０Ａ～１０Ｂ）。これは、Ｃａｖａｌｉｅｒｉ立体学的技術を使用した病変体積の定量的分析によっても裏付けられ、これは、未処置又はビヒクルで処置されたＴＢＩマウスのいずれかと比較して、ＧＴＢ処置時の全半球における総病変体積の減少を明らかにした（図１０Ｃ）。
ＧＴＢ処置は、ＴＢＩマウスの脳におけるアストログリア及びミクログリア活性化を阻害したため、次いで、経口ＧＴＢが、損傷の２１日後に病変体積を低減させ得るかどうかを監視することを決定した。病変体積を測定するために、脳切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。図１０Ａは、種々のマウス群からの病変空洞の体積を示すために連続的に配置されたＨ＆Ｅ染色脳切片を表す。予想されるように、偽対照では病変がなかったことと比較して、ＴＢＩマウスにおいて、皮質から始まり、海馬を介して外側脳室に関与する、膨張した空洞を有する典型的な病変を見出した（図１０Ｂ）。しかしながら、アストログリア及びミクログリア炎症の抑制と一致して、ビヒクルではなくＧＴＢでの処置は、ＴＢＩマウスにおける病変空洞のサイズを低減した（図１０Ａ～１０Ｂ）。これは、Ｃａｖａｌｉｅｒｉ立体学的技術を使用した病変体積の定量的分析によっても裏付けられ、これは、未処置又はビヒクルで処置されたＴＢＩマウスのいずれかと比較して、ＧＴＢ処置時の全半球における総病変体積の減少を明らかにした（図１０Ｃ）。
【0087】
１１．ＧＴＢ処置は、ＣＣＩ損傷マウスの脳におけるシナプス成熟を回復させる
最近の研究は、ＴＢＩが瞬時の機械的損傷と結果として生じる二次損傷プロセス（例えば、炎症）の組み合わせを介してシナプス構造及び機能に大きな影響を及ぼし、最終的にシナプス損失につながることを示した。例えば、 Ｗｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，によると、ＴＢＩは、活性化されたミクログリアによって媒介される慢性皮質炎症を引き起こし、最終的にシナプス機能障害をもたらす。
最近の研究は、ＴＢＩが瞬時の機械的損傷と結果として生じる二次損傷プロセス（例えば、炎症）の組み合わせを介してシナプス構造及び機能に大きな影響を及ぼし、最終的にシナプス損失につながることを示した。例えば、 Ｗｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，によると、ＴＢＩは、活性化されたミクログリアによって媒介される慢性皮質炎症を引き起こし、最終的にシナプス機能障害をもたらす。
【0088】
したがって、ＧＴＢ処置がグリア炎症を低減させるため、ＧＴＢがＴＢＩマウスにおけるシナプスを保護することができるかどうかを調査した。ＰＳＤ－９５は、シナプスの発達と成熟に関与している。ＮｅｕＮ及びＰＳＤ－９５の脳切片の二重標識は、偽対照マウスと比較して、損傷の２１日後のＰＳＤ－９５の減少によって示されるように、ＴＢＩマウスの皮質及び海馬におけるシナプス成熟の喪失を示した（図１１Ａ～１１Ｂ）。他方では、ＴＢＩマウスの皮質及び海馬におけるＮｅｕＮのそのような損失は観察されなかった（図１１Ａ～１１Ｂ）。海馬組織のウェスタンブロット分析も、偽マウスと比較して、ＴＢＩマウスの海馬におけるＰＳＤ－９５の著しい減少を確認した（図１１Ｅ～１１Ｆ）。しかしながら、アストログリア及びミクログリア炎症の抑制と一致して、ビヒクルではなくＧＴＢでの処置は、ＴＢＩマウスの脳におけるＰＳＤ－９５のレベルを上方調節した（図１１Ａ～１１Ｆ）。
【0089】
ＰＳＤ－９５に加えて、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１などの他の分子もまた、シナプス成熟に関与する。したがって、また、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１のレベルを監視し、偽対照マウスと比較して、損傷の２１日後のＴＢＩマウスの海馬におけるＮＲ２Ａ（図１１Ｅ及び１１Ｇ）及びＧｌｕＲ１（図１１Ｅ及び１１Ｈ）の両方の有意な減少を見出した。ＰＳＤ－９５の上方調節及び／又は回復と同様に、ＧＴＢ処置は、ＴＢＩマウスの海馬におけるＮＲ２Ａ（図１１Ｅ及び１１Ｇ）及びＧｌｕＲ１（図１１Ｅ及び１１Ｈ）のレベルを増加させた。これらの結果は、ビヒクル処置でのＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１のそのような増加を観察しなかったため、特異的であった（図１１Ｅ、１１Ｇ＆１１Ｈ）。これらの結果は、経口ＧＴＢが、ＴＢＩマウスの海馬におけるシナプス成熟を回復することができることを示唆する。
【0090】
１２．経口ＧＴＢは、ＴＢＩマウスの認知機能を保護する
多くのＴＢＩ生存者は、生涯にわたって認知障害に苦しんでいる。損なわれたシナプス変化がＴＢＩの認知障害に関与することが報告されている。ＧＴＢ処置がＴＢＩマウスの海馬及び皮質におけるシナプス発達及び成熟を保護及び／又は改善したため、ＧＴＢが損傷の２１日後にＴＢＩマウスにおける認知機能を保護することができるかどうかを調査した。短期記憶を監視するために、新規物体認識（ＮＯＲ）試験を用いたが、空間学習及び記憶のために、マウスの行動はバーンズ迷路及びＴ字型迷路で分析された。
多くのＴＢＩ生存者は、生涯にわたって認知障害に苦しんでいる。損なわれたシナプス変化がＴＢＩの認知障害に関与することが報告されている。ＧＴＢ処置がＴＢＩマウスの海馬及び皮質におけるシナプス発達及び成熟を保護及び／又は改善したため、ＧＴＢが損傷の２１日後にＴＢＩマウスにおける認知機能を保護することができるかどうかを調査した。短期記憶を監視するために、新規物体認識（ＮＯＲ）試験を用いたが、空間学習及び記憶のために、マウスの行動はバーンズ迷路及びＴ字型迷路で分析された。
【0091】
ＮＯＲタスクから明らかなように、ＴＢＩマウスは、偽対照マウスと比較して、新規物体とより少ない時間を費やした（図１２Ａ及び１２Ｃ）。他方では、ビヒクルではなくＧＴＢでの処置時に、ＴＢＩマウスは新規物体との有意に多くの時間を費やし（図１２Ａ及び１２Ｃ）、経口ＧＴＢでの短期記憶の改善を示した。バーンズ迷路は、空間参照記憶を必要とする海馬依存性記憶タスクである。処置のないＴＢＩマウスは、偽対照マウスと比較して、報酬の穴を容易に見つけられず（図１２Ｂ）、より多くのエラーを生じ（図１２Ｄ）、より多くの時間（潜時）を必要とした（図１２Ｅ）ことを示した。しかしながら、ビヒクルで処置ではなく、ＧＴＢで処置されたＴＢＩマウスは、未処置のＴＢＩマウスと比較して、バーンズ迷路（図１２Ｂ）上ではるかに良好に能力を発揮し、エラーを少なくし（図１２Ｄ）、標的穴を見つけるのにかかる時間を短くした（図１２Ｅ）。同様に、Ｔ字型迷路において、処置のないＴＢＩマウスは、偽対照マウスよりも少ない陽性ターン数（図１２Ｆ）及び多い陰性ターン数（図１２Ｇ）を示した。ＮＯＲタスク及びバーンズ迷路に一致して、ビヒクルではなくＧＴＢの経口投与は、未処置のＴＢＩマウスよりも高い数の陽性ターン（図１２Ｆ）及び低い数の陰性ターン（図１２Ｇ）によって示されるように、ＴＢＩマウスにおける海馬依存性記憶能力を著しく増強した。
【0092】
１３．ＧＴＢ処置は、ＣＣＩ損傷の７日後にＴＢＩマウスの運動機能を改善する
ＴＢＩ研究の主な治療目的は、行動機能を維持又は回復させることである。ＧＴＢ処置がＴＢＩマウスの認知機能を保護したため、次いで、ＧＴＢが全体的な運動活動も保護するかどうかを調査した。一般的な運動行動を記録するために、オープンフィールド活動領域上の上部に下向きに据え付けられたままの、Ｎｏｌｄｕｓコンピュータシステムに接続されたビデオカメラ６（Ｂａｓｌｅｒ Ｇｅｎ Ｉ Ｃａｍ－Ｂａｓｌｅｒ ａｃＡ １３００－６０）を用いた。図１３Ａは、ＣＣＩ損傷の７日後のオープンフィールド活動領域におけるマウスの全体的な動きをまとめたヒートマップを示す。
ＴＢＩ研究の主な治療目的は、行動機能を維持又は回復させることである。ＧＴＢ処置がＴＢＩマウスの認知機能を保護したため、次いで、ＧＴＢが全体的な運動活動も保護するかどうかを調査した。一般的な運動行動を記録するために、オープンフィールド活動領域上の上部に下向きに据え付けられたままの、Ｎｏｌｄｕｓコンピュータシステムに接続されたビデオカメラ６（Ｂａｓｌｅｒ Ｇｅｎ Ｉ Ｃａｍ－Ｂａｓｌｅｒ ａｃＡ １３００－６０）を用いた。図１３Ａは、ＣＣＩ損傷の７日後のオープンフィールド活動領域におけるマウスの全体的な動きをまとめたヒートマップを示す。
【0093】
予想通り、ＴＢＩマウスは、ＣＣＩ損傷後７日目のヒートマップ（図１３Ａ）、移動した距離（図１３Ｂ）、速度（図１３Ｃ）、中心頻度（図１３Ｄ）、及び飼育（図１３Ｅ）に関して、偽対照と比較してオープンフィールド活動の減少を示した。しかしながら、ビヒクルではなくＧＴＢでのＴＢＩマウスの処置は、オープンフィールド行動の有意な増加をもたらした（図１３Ａ～１３Ｅ）。
【0094】
次いで、ロトロッド試験を使用して、マウスの運動協調及び平衡活動を調査した。オープンフィールド活動と同様に、ＴＢＩマウスは、偽対照と比較して、ＣＣＩ損傷の７日後、転倒までの潜時の有意な減少を示した（図１３Ｆ）。他方では、ビヒクルではなくＧＴＢの経口投与は、潜時の増加によって見られるようにロトロッドの能力を改善した（図１３Ｆ）。
【0095】
うつ病は、特に脳損傷の初期段階中のＴＢＩの顕著な症状であり、尾部吊り下げ試験によってマウスにおいて監視され得る。したがって、この試験を実施して、ＴＢＩマウスにおけるうつ病様行動に対するＧＴＢ処置の効果を監視した。図１３Ｇから明らかなように、ＣＣＩ損傷の７日目のＴＢＩマウスは、偽対照よりも有意に高い不動時間を示し、偽マウスよりもＴＢＩマウスにおいてより多くの抑うつ行動を示した。しかしながら、ＧＴＢで処置されたＴＢＩマウスは、未処置又はビヒクルで処置されたＴＢＩマウス（図１３Ｇ）のいずれかよりも、尾部吊り下げ試験中に有意に少ない不動時間を示し、ＧＴＢによるうつ行動の阻害を示唆した。
【0096】
ＴＢＩは、脳と筋肉との間の接続にダメージを与え、それによって歩行運動を損なうことが知られている。したがって、歩行行動を監視するためにビーム歩行を用い、偽対照と比較して、ＴＢＩマウスの不十分な歩行運動を観察した（図１３Ｈ～１３Ｊ）。ＴＢＩマウスは、ビームを横断しながら、偽対照マウスよりも多くの歩み（図１３Ｈ）を使用し、より多くの時間（図１３Ｉ）を取り、より多く滑った（図１３Ｊ）。しかしながら、ビヒクルではなくＧＴＢの経口投与は、ＴＢＩマウスのビーム歩行を改善した（図１３Ｈ～１３Ｊ）。更に結果を確認するために、科学者が歩行活動を分析及び比較する機会を可能にする格子ランウェイも使用した。
【0097】
ビーム歩行で見出されたものと同様に、ＴＢＩマウスも、歩数（図１３Ｋ）、所要時間（図１３Ｌ）、及び置き違い（図１３Ｍ）の点で、偽対照と比較して、格子ランウェイ上での実施が乏しかった。この場合も同様に、ＧＴＢ処置は、格子ランウェイ上のＴＢＩマウスの能力を改善した（図１３Ｋ～１３Ｍ）。まとめると、これらの結果は、ＧＴＢ処置時、ＣＣＩ損傷の７日目でのＴＢＩマウスの運動能力の改善を示す。
【0098】
他方では、ＣＣＩ損傷の２１日目に多くの運動パラメータが自発的に改善し、ＧＴＢ処置後にも任意の有意な変化は観察されなかった（図１４Ａ～１４Ｍ）。例えば、オープンフィールド行動について試験された全てのパラメータ（図１４Ａ、ヒートマップ；図１４Ｂ、移動した距離；図１４Ｃ、速度；図１４Ｄ、中心頻度；図１４Ｅ、飼育）、並びにビーム歩行（図１４Ｈ、歩数；図１４Ｉ、所要時間）及び格子ランウェイ（図１４Ｋ、歩数）について試験されたいくつかのパラメータに有意な変化は見られなかった。尾部吊り下げ試験でのみ、未処置のＴＢＩマウスと比較して、ＴＢＩマウスに有意な障害が見られ、ＧＴＢ処置はまた、ＣＣＩ損傷の２１日目（図１４Ｇ）に、未処置又はビヒクルで処置されたＴＢＩマウスのいずれかよりも、尾部吊り下げ試験中の有意に少ない不動時間をもたらし、ＧＴＢがＴＢＩの後期段階であっても抑うつ行動を阻害することができることを示唆している。
【0099】
１４．結論
要約すると、ＴＢＩの前臨床モデルでは、香味料成分である経口ＧＴＢがグリア活性化を低減させ、病変空洞を減少させ、認知行動及び運動行動を保護することが実証された。発明者らの結果は、ＧＴＢの重要な神経保護効果を解読し、ＧＴＢがＴＢＩの治療的介入のために再利用され得ることを示唆する。
要約すると、ＴＢＩの前臨床モデルでは、香味料成分である経口ＧＴＢがグリア活性化を低減させ、病変空洞を減少させ、認知行動及び運動行動を保護することが実証された。発明者らの結果は、ＧＴＢの重要な神経保護効果を解読し、ＧＴＢがＴＢＩの治療的介入のために再利用され得ることを示唆する。
【0100】
１５．安息香酸ナトリウム（ＮａＢ）は、乏突起膠細胞への乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）の成熟を刺激する
ミエリンタンパク質の下方調節及びその後のミエリン鞘の喪失は、多発性硬化症及び外傷性脳損傷などの神経学的状態の病理学的特徴であると考えられる。そこで、再髄鞘形成に対するＮａＢの効果の探索を望んだ。乏突起膠細胞は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）及びプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）などのミエリン化タンパク質のその後の誘導とともに、ＮＧ２及びＡ２Ｂ５などの前駆体マーカーの低減の結果として、ＯＰＣから生成される。興味深いことに、ＮａＢがＯＰＣの乏突起膠細胞への分化を刺激したことを見出した（図１５Ａ～１５Ｆ）。他方では、ＮａＢの構造的類似体であるＮａＦＯは、ＯＰＣの乏突起膠細胞への成熟を促進しなかった（図１５Ａ～１５Ｆ）。これは、ＮａＢのＯＰＣ成熟効果の特異性を示している。したがって、ＮａＢ処理は、ＯＰＣにおけるＰＬＰ及びミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）のレベルを増加させた（図１５Ｇ～１５Ｈ）。これらの結果は、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧ、及びＣＮＰａｓｅのｍＲＮＡ分析によって裏付けられた（図１５Ｉ）。この知見の機能的意義を理解するために、合成繊維の髄鞘形成に対するＮａＢの効果を調査し、ＮａＦＯではなくＮａＢによる髄鞘形成の刺激を見出した（図１５Ｊ～１５Ｌ）。
ミエリンタンパク質の下方調節及びその後のミエリン鞘の喪失は、多発性硬化症及び外傷性脳損傷などの神経学的状態の病理学的特徴であると考えられる。そこで、再髄鞘形成に対するＮａＢの効果の探索を望んだ。乏突起膠細胞は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）及びプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）などのミエリン化タンパク質のその後の誘導とともに、ＮＧ２及びＡ２Ｂ５などの前駆体マーカーの低減の結果として、ＯＰＣから生成される。興味深いことに、ＮａＢがＯＰＣの乏突起膠細胞への分化を刺激したことを見出した（図１５Ａ～１５Ｆ）。他方では、ＮａＢの構造的類似体であるＮａＦＯは、ＯＰＣの乏突起膠細胞への成熟を促進しなかった（図１５Ａ～１５Ｆ）。これは、ＮａＢのＯＰＣ成熟効果の特異性を示している。したがって、ＮａＢ処理は、ＯＰＣにおけるＰＬＰ及びミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）のレベルを増加させた（図１５Ｇ～１５Ｈ）。これらの結果は、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧ、及びＣＮＰａｓｅのｍＲＮＡ分析によって裏付けられた（図１５Ｉ）。この知見の機能的意義を理解するために、合成繊維の髄鞘形成に対するＮａＢの効果を調査し、ＮａＦＯではなくＮａＢによる髄鞘形成の刺激を見出した（図１５Ｊ～１５Ｌ）。
【0101】
１６．ＮａＢが脱髄のクプリゾン中毒マウスモデルにおける脳梁における再髄鞘形成に及ぼす効果
次いで、マウス脳の脳梁におけるインビボでの再髄鞘形成に対するＮａＢの効果を調査した。脳梁は、ＭＳを含む種々の炎症性脱髄疾患において主に影響を受ける領域である。予想通り、対照マウスと比較して、クプリゾン中毒マウスの脳梁におけるミエリンタンパク質ＰＬＰの減少及びＯＰＣマーカーＡ２Ｂ５の増加を見出した（図１６Ａ～１６Ｃ）。しかしながら、ＮａＢ処置は、ＰＬＰのレベルを増加させ、Ａ２Ｂ５のレベルを減少させ（図１６Ａ～１６Ｃ）、ＮａＢが、クプリゾン中毒マウスの脳梁における再髄鞘形成を促進することができることを示唆している。ＭＢＰはミエリン完全性のマーカーであるため、ＭＢＰで脳梁切片を染色し、ＮａＢ処置後に増加したクプリゾン中毒マウスにおいてＭＢＰの喪失を見出した（図１７Ａ及び１７Ｃ）。ミエリン繊維の別の安定性マーカーであるＰＬＰの場合にも同様の結果が見出された（図１７Ｂ及び１７Ｄ）。これらの結果をＬＦＢ染色（図１７Ｅ）、及び電子顕微鏡による超微細構造の詳細（図１７Ｆ～１７Ｈ）によって確認した。
次いで、マウス脳の脳梁におけるインビボでの再髄鞘形成に対するＮａＢの効果を調査した。脳梁は、ＭＳを含む種々の炎症性脱髄疾患において主に影響を受ける領域である。予想通り、対照マウスと比較して、クプリゾン中毒マウスの脳梁におけるミエリンタンパク質ＰＬＰの減少及びＯＰＣマーカーＡ２Ｂ５の増加を見出した（図１６Ａ～１６Ｃ）。しかしながら、ＮａＢ処置は、ＰＬＰのレベルを増加させ、Ａ２Ｂ５のレベルを減少させ（図１６Ａ～１６Ｃ）、ＮａＢが、クプリゾン中毒マウスの脳梁における再髄鞘形成を促進することができることを示唆している。ＭＢＰはミエリン完全性のマーカーであるため、ＭＢＰで脳梁切片を染色し、ＮａＢ処置後に増加したクプリゾン中毒マウスにおいてＭＢＰの喪失を見出した（図１７Ａ及び１７Ｃ）。ミエリン繊維の別の安定性マーカーであるＰＬＰの場合にも同様の結果が見出された（図１７Ｂ及び１７Ｄ）。これらの結果をＬＦＢ染色（図１７Ｅ）、及び電子顕微鏡による超微細構造の詳細（図１７Ｆ～１７Ｈ）によって確認した。
【0102】
１７．シナメイン： 抗炎症剤
マクロファージ、ミクログリア、及び星細胞によって引き起こされる慢性炎症は、いくつかの自己免疫障害、炎症障害、及び神経変性障害の病因において重要な役割を果たす。活性化すると、マクロファージ、ミクログリア、及び星細胞は、炎症促進性サイトカイン（腫瘍壊死因子α又はＴＮＦα、インターロイキン１β又はＩＬ－１β、インターロイキン－６又はＩＬ－６など）、及び一酸化窒素（ＮＯ）を産生し、これは、最終的には、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、外傷性脳損傷などのような自己免疫障害、炎症損傷障害、及び神経変性障害に関与する。したがって、非毒性抗炎症薬の特定は、これらの自己免疫障害、炎症損傷障害、及び神経変性障害に有益であり得る。シナメインは、シナミン酸及びベンジルアルコールのエステル誘導体であり、香味剤として、またその抗真菌及び抗菌特性のために使用される。ここでは、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージ及び初代マウスミクログリア及び星細胞におけるシナメインの抗炎症特性を実証する。リポ多糖（ＬＰＳ）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）でのＲＡＷ ２６４．７マクロファージの刺激は、ＮＯの顕著な産生をもたらした（図１８Ａ～１８Ｃ）。しかしながら、６時間のシナメイン前処理は、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージにおけるＮＯのＬＰＳ及びＩＦＮγ誘導産生を有意に阻害した（図１８Ａ～１８Ｃ）。したがって、ＬＰＳ及びウイルス二本鎖ＲＮＡ模倣ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩＣ）は、初代マウスミクログリアにおけるＴＮＦα（図１９Ａ～１９Ｂ）、ＩＬ－１β（図２０Ａ～２０Ｂ）、及びＩＬ－６（図２１Ａ～２１Ｂ）の産生を刺激し、これは、シナメイン前処理によって強く阻害された。同様に、シナメインはまた、初代マウス星細胞におけるＴＮＦα及びＩＬ－６のポリＩＣ誘導産生を阻害した（図２２Ａ～２２Ｂ）。これらの結果は、シナメインを使用して、種々の自己免疫障害、炎症障害、及び神経変性障害における炎症を制御し得ることを示唆している。
マクロファージ、ミクログリア、及び星細胞によって引き起こされる慢性炎症は、いくつかの自己免疫障害、炎症障害、及び神経変性障害の病因において重要な役割を果たす。活性化すると、マクロファージ、ミクログリア、及び星細胞は、炎症促進性サイトカイン（腫瘍壊死因子α又はＴＮＦα、インターロイキン１β又はＩＬ－１β、インターロイキン－６又はＩＬ－６など）、及び一酸化窒素（ＮＯ）を産生し、これは、最終的には、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、外傷性脳損傷などのような自己免疫障害、炎症損傷障害、及び神経変性障害に関与する。したがって、非毒性抗炎症薬の特定は、これらの自己免疫障害、炎症損傷障害、及び神経変性障害に有益であり得る。シナメインは、シナミン酸及びベンジルアルコールのエステル誘導体であり、香味剤として、またその抗真菌及び抗菌特性のために使用される。ここでは、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージ及び初代マウスミクログリア及び星細胞におけるシナメインの抗炎症特性を実証する。リポ多糖（ＬＰＳ）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）でのＲＡＷ ２６４．７マクロファージの刺激は、ＮＯの顕著な産生をもたらした（図１８Ａ～１８Ｃ）。しかしながら、６時間のシナメイン前処理は、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージにおけるＮＯのＬＰＳ及びＩＦＮγ誘導産生を有意に阻害した（図１８Ａ～１８Ｃ）。したがって、ＬＰＳ及びウイルス二本鎖ＲＮＡ模倣ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩＣ）は、初代マウスミクログリアにおけるＴＮＦα（図１９Ａ～１９Ｂ）、ＩＬ－１β（図２０Ａ～２０Ｂ）、及びＩＬ－６（図２１Ａ～２１Ｂ）の産生を刺激し、これは、シナメイン前処理によって強く阻害された。同様に、シナメインはまた、初代マウス星細胞におけるＴＮＦα及びＩＬ－６のポリＩＣ誘導産生を阻害した（図２２Ａ～２２Ｂ）。これらの結果は、シナメインを使用して、種々の自己免疫障害、炎症障害、及び神経変性障害における炎症を制御し得ることを示唆している。
【0103】
本開示の特徴及び利点は、詳細な明細書から明らかであり、特許請求の範囲は、そのような特徴及び利点の全てをカバーする。当業者には多くの変形が想起され、本開示に記載のものに等しい任意の変形は、本開示の範囲内である。当業者は、本開示が基づいている概念が、本開示のいくつかの目的を実行するための他の方法及びシステムを設計するための基礎として使用され得ることを理解するであろう。その結果、特許請求の範囲は、説明又は実施例によって限定されるものとみなされるべきではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】