特表 2025-503473 ＡＬＫ関連疾患の治療的処置におけるＮｅｇｒ１タンパク質及びその生物学的に活性な断片の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-04

(54)【発明の名称】ＡＬＫ関連疾患の治療的処置におけるＮｅｇｒ１タンパク質及びその生物学的に活性な断片の使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/48 20060101AFI20250128BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20250128BHJP

【ＦＩ】

C07K14/48 ZNA

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/18

A61P25/28

A61P35/00

A61K31/7088

A61K47/60

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537486

(86)(22)【出願日】2022-12-21

(85)【翻訳文提出日】2024-08-19

(86)【国際出願番号】 EP2022087229

(87)【国際公開番号】W WO2023118291

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】102021000032243

(32)【優先日】2021-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523440341

【氏名又は名称】フォンダッツィオーネ テレソン イーティーエス

(71)【出願人】

【識別番号】521035417

【氏名又は名称】ウニヴェルシタ・デッリ・ストゥーディ・ディ・トレント

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡ ＤＥＧＬＩ ＳＴＵＤＩ ＤＩ ＴＲＥＮＴＯ

(74)【代理人】

【識別番号】100142594

【弁理士】

【氏名又は名称】阪中 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100090686

【弁理士】

【氏名又は名称】鍬田 充生

(72)【発明者】

【氏名】ピッコリ， ジョヴァンニ

(72)【発明者】

【氏名】ピスケーダ， フランチェスカ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076CC01

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF63

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084CA28

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZA151

4C084ZB261

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA15

4C086ZB26

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA21

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、ＡＬＫを阻害するか又はＡＬＫを低下させる活性を有する新規Ｎｅｇｒ１タンパク質断片及びそれをコードする核酸、並びに癌及びタウオパチーなどのＡＬＫ関連疾患の治療的処置におけるＮｅｇｒ１タンパク質、その断片及びそれをコードする核酸の使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍疾患及びタウオパチー（taupathies）から選択される疾患の治療的処置に使用するための、単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片であって、ＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させることができ、かつ前記断片が少なくとも６アミノ酸長を有する、単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項2】

前記単離されたＮｅｇｒ１タンパク質が、以下（ｉ）～（ｉｉｉ）からなる群より選択される、請求項１記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片：
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５を含むか、本質的に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５からなるか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５からなる、アミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、かつＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させることができる、アミノ酸配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、かつ生物学的に活性のある最小配列（minimum biologically active sequence）である配列番号６又は配列番号７を含む、アミノ酸配列

【請求項3】

前記生物学的に活性な断片が、生物学的に活性のある最小配列である配列番号６又は配列番号７を含む、請求項２記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項4】

前記生物学的に活性な断片が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される、請求項１記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項5】

安定性を増大させる修飾（stability-increasing modification）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項6】

前記安定性を増大させる修飾が、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、側鎖修飾、アミノ酸修飾、骨格修飾及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項５記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項7】

前記安定性を増大させる修飾が、ＰＥＧ化（PEGylation）、環化、Ｎ－メチル化、少なくとも２つのアミノ酸残基の対応するＤ－立体異性体への置換、骨格内の少なくとも２つのアミドのスルホンアミドへの置換、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項５記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項8】

前記疾患が腫瘍疾患であり、かつ前記使用が、抗腫瘍活性を有する化合物若しくは物質又は放射線療法剤との同時的、個別的又は連続的な併用使用である、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項9】

前記抗腫瘍活性を有する化合物若しくは物質が、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、エトポシド、トポテカン、メルファラン、ブスルファン、チオテパ、ジヌツキシマブ、ジヌツキシマブ ベータ、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、ロルラチニブ、エンサルチニブ、エヌトレクチニブ及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項８記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項10】

前記腫瘍疾患が、神経芽腫、神経節膠腫、神経節細胞腫、肺の腺癌、腎細胞癌、食道扁平上皮癌、乳癌、甲状腺癌、結腸腺癌、膠芽腫、食道扁平上皮癌、悪性黒色腫、卵巣癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）及び炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項11】

前記疾患がタウオパチー（taupathy）であり、かつ前記使用が、タウオパチーの治療的処置に有効な化合物又は物質との同時的、個別的又は連続的な併用使用である、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項12】

前記タウオパチーが、アルツハイマー病、脳炎後パーキンソニズム、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、グアム島パーキンソン認知症複合（Parkinson-dementia complex of Guam）、１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症及びパーキソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、空胞型タウオパチー（Vacuolar tauopathy）、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）からなる群より選択される、請求項１～７及び１１のいずれか一項に記載の使用のための単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【請求項13】

Ｎｅｇｒ１タンパク質の断片であり、かつＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させることができる、少なくとも６アミノ酸長の単離されたペプチド又はポリペプチド。

【請求項14】

下記（ｉ）及び（ｉｉ）からなる群より選択されるＮｅｇｒ１タンパク質の断片である、請求項１３記載の単離されたペプチド又はポリペプチド：
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５を含むか、本質的に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５からなるか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５からなる、アミノ酸配列；及び
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる、アミノ酸配列

【請求項15】

生物学的に活性のある最小配列である配列番号６又は配列番号７を含む、請求項１４記載の単離されたペプチド又はポリペプチド。

【請求項16】

配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される、請求項１５記載の単離されたペプチド又はポリペプチド。

【請求項17】

安定性を増大させる修飾を含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の単離されたペプチド又はポリペプチド。

【請求項18】

前記安定性を増大させる修飾が、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、側鎖修飾、アミノ酸修飾、骨格修飾及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１７記載の単離されたペプチド又はポリペプチド。

【請求項19】

前記安定性を増大させる修飾が、ＰＥＧ化、環化、Ｎ－メチル化、少なくとも２つのアミノ酸残基の対応するＤ－立体異性体への置換、ペプチド骨格内の少なくとも２つのアミドのスルホンアミドへの置換、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１７記載の単離されたペプチド又はポリペプチド。

【請求項20】

請求項１３～１６のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。

【請求項21】

腫瘍疾患及びタウオパチーから選択される疾患の治療的処置に使用するための、Ｎｅｇｒ１タンパク質又は請求項１３～１６のいずれか一項に記載のペプチド若しくはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。

【請求項22】

請求項１３～１６のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター。

【請求項23】

請求項２１記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項24】

請求項１３～１９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド若しくはポリペプチド又は請求項２１記載の単離された核酸と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項25】

腫瘍疾患又はタウオパチー（thaupaty）に罹患した被験体のＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させるのに使用するための、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な断片。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオ医薬品（biopharmaceuticals）の分野にある。

【0002】

特に、本発明は、Ｎｅｇｒ１タンパク質をベースとしたバイオ医薬品、及びＡＬＫ関連疾患の治療（処置）におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

Ｎｅｇｒ１（Neuronal growth regulator 1（ニューロン成長調節因子１））は、膜露出接着タンパク質（membrane exposed adhesion proteins）である免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＬＯＮファミリー）に属する。Ｎｅｇｒ１は、３つのＮ－グリコシル化Ｃ２型Ｉｇ様（免疫グロブリン様）ドメインを含み、Ｎ末端シグナル配列を有する。推定ＧＰＩ付加部位は、このタンパク質のＣ末端の近くに存在する。

【0004】

Ｎｅｇｒ１は、脳内で高レベルに発現され、その発現は、出生後に脳が発達する間に徐々に増加し、成人期には定常状態レベルに達する（Miyata et al. 2003（非特許文献１））。Ｎｅｇｒ１発現は、海馬ニューロンのシナプス形成、神経突起伸長、及び樹状突起スパインの可塑性を調節する（Pischedda et al. 2014（非特許文献２）；Pischedda and Piccoli 2015（非特許文献３））。Ｎｅｇｒ１は、ＦＧＦＲ２との機能的かつ物理的な相互作用を介して、皮質領域における上層の形成及び適切な皮質－海馬の接続性の確立を制御する（Pischedda et al., 2014（非特許文献２）；Pischedda and Piccoli, 2015（非特許文献３）；Szczurkowska et al., 2018（非特許文献４））。

【0005】

Ｎｅｇｒ１は、多くの型のヒト癌組織において一般に下方制御された遺伝子として同定されている（Bobyn et al. 2020（非特許文献５）；Kim et al. 2014（非特許文献６））。例えば、ＩｇＬＯＮファミリーの発現により、散発性上皮性卵巣腫瘍及び転移性神経芽腫（転移性神経芽細胞種）が変質することが観察されており（Takita et al. 2011（非特許文献７）及びMcKie et al. 2012（非特許文献８））、これらの遺伝子が腫瘍抑制因子としての役割を果たす可能性を示唆している。

【0006】

神経芽腫（ＯＲＰＨＡ：６３５）は、１５歳未満の乳児及び小児における固形腫瘍の約１０％を示し、この年齢層における年間発生率は約１／７０，０００である。

【0007】

神経芽腫は、傍脊椎神経節又は副腎髄質などの交感神経系組織に影響を及ぼして、胸部、頸部、骨盤及び／又は腹部において顕著な腫瘤を生成する可能性がある（Mahapatra and Challagundla 2021（非特許文献９））。

【0008】

神経芽腫は、高頻度のＭＹＣＮ増幅、１ｐ３６及び１１ｑにおけるヘテロ接合性の消失、並びに１７ｑからの遺伝物質の獲得を含む、様々な遺伝的変化を有する。未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）は、非ホジキンリンパ腫のサブタイプ（ＮＰＭ－ＡＬＫ）及び肺の腺癌（ＥＭＬ４－ＡＬＫ）における融合キナーゼとして最初に同定され、進行性神経芽腫及び他の癌における遺伝子変異（genetic alteration）においてしばしば標的にされている。ＡＬＫ遺伝子及びＭＹＣＮ遺伝子は、染色体２ｐの近傍に局在する。したがって、ＭＹＣＮ遺伝子座の増幅は、ＡＬＫ遺伝子にも影響を及ぼす可能性がある。さらに、ＡＬＫはＭＹＣＮ転写を促進し（Schoenherr et al． 2012（非特許文献１０））、そしてＡＬＫはＭＹＣＮの直接的な転写標的である（Hasan et al. 2013（非特許文献１１））。このようなポジティブフィードバックループは、持続的な腫瘍成長（増殖）を支持する（Janoueix-Lerosey et al. 2008（非特許文献１２））。

【0009】

臨床的には、神経芽腫は、低リスクと高リスクとに分類される。リスク分類は、神経芽腫患者が治癒する見込み（probability）を予測し、その予測によってその患者の治療（処置）をどの程度集中的に行うべきかを判断するのに役立つ。例えば、外科手術単独などの限定的な（limited）治療で治癒できることが予想される患者は、低リスク群に分類される。そうではなく、より高リスクの患者は、より集中的な治療を必要とする可能性が高い患者である。リスク分類は、癌のステージ（程度）、並びに予後に影響を及ぼす可能性のある他の要因（その主なものは年齢）に基づいている。低リスク患者の５年生存率は９５％を超えるが、高リスク患者では４０％まで低下する（Bhoopathi et al. 2021（非特許文献１３））。

【0010】

外科的な介入治療（surgical intervention）は、単独で又は最小化学療法治療（minimal chemotherapy treatment）と組み合わせて、低リスクの場合に生存率を増加させることができる。しかし、進行期の神経芽腫は、近年治療が進歩しているにもかかわらず、最も難治性の小児癌の１つである。ステージＩＩＩ及びＩＶの患者［国際神経芽腫病期分類（ＩＮＳＳ）に従う分類］では、しばしば、化学療法後に早期に再発が起こるが、集学的治療を包含する治療戦略は、高リスク患者の予後を改善し得る。腫瘍のこのような再発は、しばしば、より侵襲的な成長（増殖）（aggressive growth）、化学療法に対する耐性、及び転移に関連する（Speleman et al. 2016（非特許文献１４））。

【0011】

転移性神経芽腫の患者の長期生存率は低いが、これは非増殖性腫瘍細胞（non-proliferating tumour cells）が大量に存在することが一因である。神経芽腫の患者の術後合併症率（surgical complication rates）は、腫瘍のステージに応じて、５～２５％の範囲にわたる。後遺障害は、多様で深刻な症状を示す可能性があるので、考慮されるべきである。神経芽腫の治療に使用される化学療法レジメンは、心肺毒性（アントラサイクリン）、聴器毒性（シスプラチン）、腎不全（イホスファミド及びシスプラチン）、不妊及び不能（アルキル化剤及び放射線療法）、二次癌並びに心理的影響を含む長期毒性をもたらす可能性がある。

【0012】

したがって、神経芽腫の治療に有効な新規治療剤を見出す必要性がある。しかし、この必要性は、神経芽腫のみに限定されるものではなく、実質的にすべての種類の腫瘍に及ぶものである。なぜなら、腫瘍は、従来の治療法に対して耐性を獲得できることが知られており、薬物耐性腫瘍の有病率（prevalence）の増加により、新たな治療を提供するための継続的な研究が必要とされるからである。また、特定の患者の腫瘍の生物学的特徴を含む多くの要因に応じて、抗癌療法に対する反応が患者ごとに異なることも知られている。このことは、新たなかつ差別化された抗腫瘍剤を開発するために、継続的な研究が必要であることにもつながる。

【0013】

従来技術には、Ｎｅｇｒ１の一過性発現（Ｎｅｇｒ１発現ベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞トランスフェクション（細胞導入）による）が、種々の神経芽腫株における細胞成長（増殖）を阻害することが教示されている（Takita et al. 2011（非特許文献７））。Kim et al. 2014（非特許文献６）には、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ－３におけるＮｅｇｒ１過剰発現が発癌表現型の減衰をもたらすことが示されている。

【0014】

しかし、前述の刊行物は、腫瘍組織における遺伝子発現プロファイルに関する研究論文であり、癌患者に対して具体的に実現可能でかつ効果的な治療法を提供するという問題に対処していない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Miyata S., Matsumoto N., Taguchi K., Akagi A., Iino T., Funatsu N., Maekawa S. (2003) Biochemical and ultrastructural analyses of IgLON cell adhesion molecules, Kilon and OBCAM in the rat brain. Neuroscience 117, 645-658.

【非特許文献2】Pischedda F., Szczurkowska J., Cirnaru M.D., Giesert F., Vezzoli E., Ueffing M., Sala C., et al. (2014) A cell surface biotinylation assay to reveal membrane-associated neuronal cues: Negr1 regulates dendritic arborization. Mol. Cell Proteomics 13, 733-748.

【非特許文献3】Pischedda F., Piccoli G. (2015) The IgLON Family Member Negr1 Promotes Neuronal Arborization Acting as Soluble Factor via FGFR2. Front Mol Neurosci 8, 89.

【非特許文献4】Szczurkowska J., Pischedda F., Pinto B., Manago F., Haas C. A., Summa M., Bertorelli R., et al. (2018) NEGR1 and FGFR2 cooperatively regulate cortical development and core behaviours related to autism disorders in mice. Brain.

【非特許文献5】Bobyn A., Zarrei M., Zhu Y., Hoffman M., Brenner D., Resnick A. C., Scherer S. W., Gallo M. (2020) Ancestry and frequency of genetic variants in the general population are confounders in the characterization of germline variants linked to cancer. BMC Med Genet 21, 92.

【非特許文献6】Kim H., Hwang J.-S., Lee B., Hong J., Lee S. (2014) Newly Identified Cancer-Associated Role of Human Neuronal Growth Regulator 1 (NEGR1). J Cancer 5, 598-608.

【非特許文献7】Takita J., Chen Y., Okubo J., Sanada M.,Adachi M., Ohki K., Nishimura R., et al. (2011) Aberrations of NEGR1 on 1p31 and MYEOV on 11q13 in neuroblastoma. Cancer Sci. 102, 1645-1650.

【非特許文献8】McKie A. B., Vaughan S., Zanini E., Okon I.S., Louis L., Sousa C. de, Greene M. I., et al. (2012) The OPCML tumor suppressor functions as a cell surface repressor-adaptor, negatively regulating receptor tyrosine kinases in epithelial ovarian cancer. Cancer Discov 2, 156-171.

【非特許文献9】Mahapatra S., Challagundla K. B. (2021) Neuroblastoma, in StatPearls. StatPearls Publishing, Treasure Island (FL).

【非特許文献10】Schoenherr C., Ruuth K., Kamaraj S., Wang C.-L., Yang H.-L., Combaret V., Djos A., et al. (2012) Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) regulates initiation of transcription of MYCN in neuroblastoma cells. Oncogene 31, 5193-5200.

【非特許文献11】Hasan M. K., Nafady A., Takatori A., Kishida S., Ohira M., Suenaga Y., Hossain S., et al. (2013) ALK is a MYCN target gene and regulates cell migration and invasion in neuroblastoma. Sci Rep 3, 3450.

【非特許文献12】Janoueix-Lerosey I., Lequin D., Brugieres L., Ribeiro A., Pontual L. de, Combaret V., Raynal V., et al. (2008) Somaticand germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature 455, 967-970.

【非特許文献13】Bhoopathi P., Mannangatti P., Emdad L., Das S. K., Fisher P. B. (2021) The quest to develop an effective therapy for neuroblastoma. J Cell Physiol.

【非特許文献14】Speleman F., Park J. R., Henderson T. O.(2016) Neuroblastoma: A Tough Nut to Crack. Am Soc Clin Oncol Educ Book 35,e548-557.

【発明の概要】

【0016】

従来技術の短所及び欠点を克服するために、本発明者らは、まず、可溶型の完全長Ｎｅｇｒ１タンパク質を用いた様々な癌細胞株の異所性治療（ectopic treatment）の効果を研究し、Ｎｅｇｒ１がｉｎ ｖｉｔｒｏでの癌細胞増殖及びｅｘ ｖｉｖｏでの腫瘍体積を有意に減少できることを見出した。この発見は予想外のものである。なぜなら、従来技術は、可溶型のＮｅｇｒ１タンパク質を用いた治療が、実際に実現可能であり、かつ癌の成長（増殖）を阻止するのに有効であることを教示も示唆もしていないからである。

【0017】

次いで、本発明者らは、検出された完全長Ｎｇｒ１タンパク質の抗腫瘍活性を分析し、原因となるドメイン、すなわち、ヒトＮｅｇｒ１のＩ／ＰｅｐＡ（ａａ１－１２７）ドメインを同定した。これにより、本発明者らは、抗腫瘍活性に必要な最小活性配列（minimum active sequence）である、完全長Ｎｅｇｒ１タンパク質内のアミノ酸ストレッチ（amino acid stretch）を同定した。この結果は、完全長タンパク質の抗腫瘍活性を保持する様々なＮｅｇｒ１の活性な断片（Ｎｅｇｒ１活性断片）を提供できるため、極めて有利である。したがって、表現「Ｎｅｇｒ１の活性な断片（単数又は複数）」又はより単純に「活性な断片（単数又は複数）」は、ＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させることができるＮｅｇｒ１タンパク質の単離されたペプチド又はポリペプチド断片（単数又は複数）を示す。

【0018】

いくつかの点では、ペプチド又はポリペプチド断片は、タンパク質全長よりも有利である可能性がある。なぜなら、完全長タンパク質の調製には、複雑でかつ高価な生物学的手順が必要となる可能性があるのに対して、より小さな断片は、ペプチド合成によって調製できるからである。さらに、完全長ヒトＮｅｇｒ１タンパク質の分子量が天然型では３８，７１９Ｄａであり、グリコシル化により５０ｋＤａを超えることを考慮すると、ペプチド又はポリペプチド断片の分子量が低いほど、活性及び生体内分布が改善される可能性がある。

【0019】

本発明者らはまた、Ｎｅｇｒ１及びその活性な断片（フラグメント）の抗腫瘍活性が、処理された細胞におけるＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させる能力と相関していることを見出した。

【0020】

ＡＬＫの変異型は、神経芽腫のみならず、とりわけ甲状腺癌及び腎臓癌を含む、広範な他のヒト腫瘍型にも関与していることが知られている。さらに、腫瘍形成性（発癌性）ＡＬＫ遺伝子の転座又は逆位は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）及び他の固形腫瘍のまれな症例で見出されている（Villa et al., 2021）。

【0021】

また、ＡＬＫがタウ（tau）のリン酸化及び凝集を促進すること（Park et al., 2021)、病理学的なタウ凝集がアルツハイマー病並びに、とりわけ脳炎後パーキンソニズム、慢性外傷性脳症、グアム島パーキンソン認知症複合（Parkinson-dementia complex of Guam）、及びＭＡＰＴ変異に起因するＦＴＤＰ－１７を含む、いくつかの他のタウオパチー（タウパチー、taupathies）において生じることも知られている。

【0022】

したがって、Ｎｅｇｒ１タンパク質及びその生物学的に活性な断片は、脳内の異常タウタンパク質の蓄積を特徴とする神経変性障害などのタウオパチーの治療にも有効であると予測される。

【0023】

したがって、本発明の一態様は、腫瘍疾患及びタウオパチーからなる群より選択される疾患の治療的処置（治療的療法）に使用するための、単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な、少なくとも６アミノ酸長の断片であって、ここで、Ｎｅｇｒ１の生物学的に活性な断片は、ＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させる能力を有する。

【0024】

本明細書において、表現「Ｎｅｇｒ１タンパク質」には、とりわけヒトＮｅｇｒ１タンパク質、並びにマウスなどの他の動物種由来のそのオーソログが含まれる。

【0025】

ヒト及びマウスＮｅｇｒ１の主なアイソフォームのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅから、それぞれ、アクセッション番号Ｑ７Ｚ３Ｂ１及びＱ８０Ｚ２４で入手可能である。

【0026】

ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ７Ｚ３Ｂ１（ＮＥＧＲ１＿ＨＵＭＡＮ）
ＭＤＭＭＬＬＶＱＧＡＣＣＳＮＱＷＬＡＡＶＬＬＳＬＣＣＬＬＰＳＣＬＰＡＧＱＳＶＤＦＰＷＡＡＶＤＮＭＭＶＲＫＧＤＴＡＶＬＲＣＹＬＥＤＧＡＳＫＧＡＷＬＮＲＳＳＩＩＦＡＧＧＤＫＷＳＶＤＰＲＶＳＩＳＴＬＮＫＲＤＹＳＬＱＩＱＮＶＤＶＴＤＤＧＰＹＴＣＳＶＱＴＱＨＴＰＲＴＭＱＶＨＬＴＶＱＶＰＰＫＩＹＤＩＳＮＤＭＴＶＮＥＧＴＮＶＴＬＴＣＬＡＴＧＫＰＥＰＳＩＳＷＲＨＩＳＰＳＡＫＰＦＥＮＧＱＹＬＤＩＹＧＩＴＲＤＱＡＧＥＹＥＣＳＡＥＮＤＶＳＦＰＤＶＲＫＶＫＶＶＶＮＦＡＰＴＩＱＥＩＫＳＧＴＶＴＰＧＲＳＧＬＩＲＣＥＧＡＧＶＰＰＰＡＦＥＷＹＫＧＥＫＫＬＦＮＧＱＱＧＩＩＩＱＮＦＳＴＲＳＩＬＴＶＴＮＶＴＱＥＨＦＧＮＹＴＣＶＡＡＮＫＬＧＴＴＮＡＳＬＰＬＮＰＰＳＴＡＱＹＧＩＴＧＳＡＤＶＬＦＳＣＷＹＬＶＬＴＬＳＳＦＴＳＩＦＹＬＫＮＡＩＬＱ（配列番号１）

【0027】

ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ８０Ｚ２４（ＮＥＧＲ１＿ＭＯＵＳＥ）
ＭＶＬＬＡＱＧＡＣＣＳＮＱＷＬＡＡＶＬＬＳＬＣＳＣＬＰＡＧＱＳＶＤＦＰＷＡＡＶＤＮＭＬＶＲＫＧＤＴＡＶＬＲＣＹＬＥＤＧＡＳＫＧＡＷＬＮＲＳＳＩＩＦＡＧＧＤＫＷＳＶＤＰＲＶＳＩＳＴＬＮＫＲＤＹＳＬＱＩＱＮＶＤＶＴＤＤＧＰＹＴＣＳＶＱＴＱＨＴＰＲＴＭＱＶＨＬＴＶＱＶＰＰＫＩＹＤＩＳＮＤＭＴＩＮＥＧＴＮＶＴＬＴＣＬＡＴＧＫＰＥＰＶＩＳＷＲＨＩＳＰＳＡＫＰＦＥＮＧＱＹＬＤＩＹＧＩＴＲＤＱＡＧＥＹＥＣＳＡＥＮＤＶＳＦＰＤＶＫＫＶＲＶＩＶＮＦＡＰＴＩＱＥＩＫＳＧＴＶＴＰＧＲＳＧＬＩＲＣＥＧＡＧＶＰＰＰＡＦＥＷＹＫＧＥＫＲＬＦＮＧＱＱＧＩＩＩＱＮＦＳＴＲＳＩＬＴＶＴＮＶＴＱＥＨＦＧＮＹＴＣＶＡＡＮＫＬＧＴＴＮＡＳＬＰＬＮＰＰＳＴＡＱＹＧＩＴＧＳＡＣＤＬＦＳＣＷＳＬＡＬＴＬＳＳＶＩＳＩＦＹＬＫＮＡＩＬＱ（配列番号２）

【0028】

マウスＮｅｇｒ１タンパク質のさらなるアイソフォームは、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅから、アクセッション番号Ａ０Ａ４Ｗ９、Ｈ３ＢＫＵ７及びＤ３Ｚ４Ｔ６で入手可能である。

【0029】

ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ４Ｗ９（Ａ０Ａ４Ｗ９＿ＭＯＵＳＥ）
ＭＶＬＬＡＱＧＡＣＣＳＮＱＷＬＡＡＶＬＬＳＬＣＳＣＬＰＡＧＱＳＶＤＦＰＷＡＡＶＤＮＭＬＶＲＫＧＤＴＡＶＬＲＣＹＬＥＤＧＡＳＫＧＡＷＬＮＲＳＳＩＩＦＡＧＧＤＫＷＳＶＤＰＲＶＳＩＳＴＬＮＫＲＤＹＳＬＱＩＱＮＶＤＶＴＤＤＧＰＹＴＣＳＶＱＴＱＨＴＰＲＴＭＱＶＨＬＴＶＱＶＰＰＫＩＹＤＩＳＮＤＭＴＩＮＥＧＴＮＶＴＬＴＣＬＡＴＧＫＰＥＰＶＩＳＷＲＨＩＳＰＳＡＫＰＦＥＮＧＱＹＬＤＩＹＧＩＴＲＤＱＡＧＥＹＥＣＳＡＥＮＤＶＳＦＰＤＶＫＫＶＲＶＩＶＮＦＡＰＴＩＱＥＩＫＳＧＴＶＴＰＧＲＳＧＬＩＲＣＥＧＡＧＶＰＰＰＡＦＥＷＹＫＧＥＫＲＬＦＮＧＱＱＧＩＩＩＱＮＦＳＴＲＳＩＬＴＶＴＮＶＴＱＥＨＦＧＮＹＴＣＶＡＡＮＫＬＧＴＴＮＡＳＬＰＬＮＱＳＳＩＰＷＱＶＦＦＭＬＫＶＳＦＬＬＶＣＩＬ（配列番号３）

【0030】

ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｈ３ＢＫＵ７（Ｈ３ＢＫＵ７＿ＭＯＵＳＥ）
ＭＶＬＬＡＱＧＡＣＣＳＮＱＷＬＡＡＶＬＬＳＬＣＳＣＬＰＡＧＱＳＶＤＦＰＷＡＡＶＤＮＭＬＶＲＫＧＤＫＷＳＶＤＰＲＶＳＩＳＴＬＮＫＲＤＹＳＬＱＩＱＮＶＤＶＴＤＤＧＰＹＴＣＳＶＱＴＱＨＴＰＲＴＭＱＶＨＬＴＶＱＶＰＰＫＩＹＤＩＳＮＤＭＴＩＮＥＧＴＮＶＴ（配列番号４）

【0031】

ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｄ３Ｚ４Ｔ６（Ｄ３Ｚ４Ｔ６＿ＭＯＵＳＥ）
ＭＶＬＬＡＱＧＡＣＣＳＮＱＷＬＡＡＶＬＬＳＬＣＳＣＬＰＡＧＱＳＶＤＦＰＷＡＡＶＤＮＭＬＶＲＫＧＤＴＡＶＬＲＣＹＬＥＤＧＡＳＫＧＡＷＬＮＲＳＳＩＩＦＡＧＧＤＫＷＳＶＤＰＲＶＳＩＳＴＬＮＫＲＤＹＳＬＱＩＱＮＶＤＶＴＤＤＧＰＹＴＣＳＶＱＴＱＨＴＰＲＴＭＱＶＨＬＴＶＱＶＰＰＫＩＹＤＩＳＮＤＭＴＩＮＥＧＴＮＶＴＬＴＣＬＡＴＧＫＰＥＰＶＩＳＷＲＨＩＳＰＳＡＫＰＦＥＮＧＱＹＬＤＩＹＧＩＴＲＤＱＡＧＥＹＥＣＳＡＥＮＤＶＳＦＰＤＶＫＫＶＲＶＩＶＮＦＡＰＴＩＱＥＩＫＳＧＴＶＴＰＧＲＳＧＬＩＲＣＥＧＡＧＶＰＰＰＡＦＥＷＹＫＧＥＫＲＬＦＮＧＱＱＧＩＩＩＱＮＦＳＴＲＳＩＬＴＶＴＮＶＴＱＥＨＦＧＮＹＴＣＶＡＡＮＫＬＧＴＴＮＡＳＬＰＬＮＬＷＣＨＬＱＭＣＷＡＨＳＷＱＣＣＬＤＩＬＱＡ（配列番号５）

【0032】

表現「Ｎｅｇｒ１タンパク質」には、さらに、上記で同定されたヒト及びマウスＮｅｇｒ１タンパク質のいずれか１つに由来し、１又は複数のアミノ酸残基が置換されたバリアント（variant）タンパク質も含まれ、バリアントタンパク質は、上記で同定されたヒト及びマウスＮｅｇｒ１タンパク質のいずれか１つと少なくとも９０％同一である。

【0033】

アミノ酸置換を行う際、一般的には、置換されるアミノ酸残基は、保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）であってもよく、例えば、極性残基は極性残基に、親水性残基は親水性残基に、疎水性残基は疎水性残基に、正に荷電した残基は正に荷電した残基に、又は負に荷電した残基は負に荷電した残基に置換される。

【0034】

ヒトＮｅｇｒ１と少なくとも９０％の同一性％を示すＵｎｉＰｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ内のすべてのアミノ酸配列は、ニューロン成長調節因子１（Ｎｅｇｒ１）タンパク質であるので、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５と少なくとも９０％同一であるバリアントタンパク質は、ＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させる能力を保持することが予測される。

【0035】

２つの配列間の配列比較及びパーセント（％）同一性の決定は、ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスを使用するｂｌａｓｔｐ（ｂｌａｓｔｐ ＢＬＡＳＴＰ ２．９．０＋）プログラムなどの数学的アルゴリズムを用いて行われる。

【0036】

したがって、本発明の好ましい一実施形態は、腫瘍疾患又はタウオパチー（タウパチー）の治療的処置に使用するための、単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又はその生物学的に活性な、少なくとも６アミノ酸長の断片であって、ここで、単離されたＮｅｇｒ１タンパク質は、以下（ｉ）及び（ｉｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５を含むか、本質的に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５からなるか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５からなる、アミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、かつＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させることができる、アミノ酸配列

【0037】

上記の％同一性の範囲は、以下：配列番号１と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％；配列番号２と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％；配列番号３と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％；配列番号４と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％；配列番号５と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％の実施形態を含む。

【0038】

以下の実験の項で説明されるように、本発明者らは、配列番号６が、ＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させる生物学的活性を維持する、Ｎｅｇｒ１アミノ酸配列の活性のある最小配列（最小活性配列）であることを見出した。本発明者らはまた、驚くべきことに、Ｗ（トリプトファン）がＩ（イソロイシン）に置換された、上記の生物学的に活性のある最小配列（生物学的に活性な最小配列、minimum biologically active sequence）のバリアント（多様体）（配列番号７）が、配列番号６のＡＬＫ発現低下活性を保持することを見出した。

【0039】

したがって、本発明の好ましい別の実施形態は、腫瘍疾患又はタウオパチーの治療的処置に使用するための、単離されたＮｅｇｒ１タンパク質又は生物学的に活性な断片であって、ここで、単離されたＮｅｇｒ１タンパク質は、以下（ｉｉｉ）からなる群より選択される：
（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、かつ生物学的に活性のある最小配列である配列番号６又は配列番号７を含む、アミノ酸配列

【0040】

本発明者らの知る限りでは、ＡＬＫタンパク質の発現レベルを低下させることができるＮｅｇｒ１タンパク質の生物学的に活性な断片である単離されたペプチド又はポリペプチドは、それ自体、従来技術において開示されていない。

【0041】

したがって、本発明の範囲には、少なくとも６アミノ酸長を有しかつＡＬＫタンパク質発現レベルを低下させることができるＮｅｇｒ１タンパク質の断片である、単離されたペプチド又はポリペプチドも含まれ、ここで、表現「Ｎｅｇｒ１タンパク質」には、上記で定義されたアイソフォーム、オーソログ及びバリアントタンパク質が含まれる。

【0042】

このような断片の例には、Ｎｅｇｒ１タンパク質のアミノ酸配列由来の６～９６個のアミノ酸が含まれ、ここで、表現「Ｎｅｇｒ１タンパク質」には、上記で定義されたアイソフォーム、オーソログ及びバリアントタンパク質が含まれる。このような断片のさらなる例には、上記で定義されたＮｅｇｒ１タンパク質のアミノ酸配列由来の６～３５個のアミノ酸又は６～７０個のアミノ酸又は３５～７０個のアミノ酸が含まれる。具体的な例は、上記で定義されたＮｅｇｒ１タンパク質のアミノ酸配列由来の６、３３、７０又は９６個のアミノ酸を含む断片である。

【0043】

このような断片の好ましい実施形態としては、生物学的に活性のある最小配列である配列番号６又は配列番号７が挙げられる。

【0044】

このような断片の最も好ましい実施形態は、「ＰｅｐＡ」である配列番号８；「ＰｅｐＡ－１」である配列番号９；「ＰｅｐＡ－２」である配列番号１０；「ＰｅｐＡ－３」である配列番号１１；生物学的に活性のある最小配列である配列番号６；「ＰｅｐＡバリアント」である配列番号１２；「ＰｅｐＡ－１バリアント」である配列番号１３；「ＰｅｐＡ－２バリアント」である配列番号１４；「ＰｅｐＡ－３バリアント」である配列番号１５；及び生物学的に活性のある最小配列のバリアント（minimum variant biologically active sequence）である配列番号７である。

【0045】

本発明のペプチド又はポリペプチドは、完全長Ｎｅｇｒ１タンパク質と比較して、アミノ酸配列が短く立体障害が低いことが有利であり、その結果、合成が容易になり、かつ細胞膜への浸透が容易になる可能性がある。通常、ペプチド又はポリペプチド断片は、活性、特異性及び親和性が高く、最小限の薬物－薬物相互作用並びに生物学的及び化学的多様性も有する。薬物としてのペプチド又はポリペプチドのさらなる利点は、通常、特定の器官（例えば、腎臓又は肝臓）に蓄積されないため、毒性の副作用を最小限に抑えることができることである。通常、前記ペプチド又はポリペプチドはまた、組み換え抗体又はタンパク質よりも免疫原性が低い。

【0046】

このような特徴により、本発明のペプチド又はポリペプチドは治療薬としての使用に特に適しているが、前述のように、完全長Ｎｅｇｒ１タンパク質も有効である。

【0047】

本発明の範囲には、上記で定義されたＮｅｇｒ１ペプチド又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、並びに腫瘍疾患又はタウオパチーの治療的処置におけるその使用も含まれる。

【0048】

また、本発明の範囲内には、上記で定義されたＮｅｇｒ１ペプチド又はポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列を含む発現ベクター（好ましくは、ウイルス発現ベクター）、並びに前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。

【0049】

限定されない例として、３３ａａペプチド「ＰｅｐＡ－１」又は「ＰｅｐＡ－１バリアント」のヒト細胞での発現に最適化されたヌクレオチド配列を以下に示す：

【0050】

ＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＧＡＴＡＡＧＴＧＧＴＣＣＧＴＧＧＡＣＣＣＴＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧ（ＰｅｐＡ－１ ｎｔ配列）（配列番号２１）

【0051】

ＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＣＣＴＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧ（ＰｅｐＡ－１バリアント ｎｔ配列）（配列番号２２）

【0052】

この２つの配列の上流に、血清アルブミンプレプロタンパク質ＮＰ＿０００４６８のリーダー配列を挿入してもよい：

【0053】

ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＴＣＴ（血清アルブミンプレプロタンパク質ＮＰ＿０００４６８のリーダー配列）（配列番号２３）

【0054】

上記の核酸に基づいて、２つの発現ベクターを構築することができ、それぞれ、以下の外因性核酸の１つを含む：

【0055】

ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＴＣＴＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＧＡＴＡＡＧＴＧＧＴＣＣＧＴＧＧＡＣＣＣＴＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧ（リーダー配列＋ＰｅｐＡ－１）（配列番号２４）

【0056】

ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＴＣＴＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＣＣＴＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧ（リーダー配列＋ＰｅｐＡ－１バリアント）（配列番号２５）

【0057】

これらの核酸は、以下のペプチドをコードする：ＰｅｐＡ－１をコードする配列番号２４を最適化したペプチド、及びヒト細胞での発現のために配列番号５を最適化したペプチド。

【0058】

ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＤＧＡＳＫＧＡＷＬＮＲＳＳＩＩＦＡＧＧＤＫＷＳＶＤＰＲＶＳＩＳＴＬ（リーダー配列＋ＰｅｐＡ－１）（配列番号２６）

【0059】

ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＤＧＡＳＫＧＡＷＬＮＲＳＳＩＩＦＡＧＧＤＫＩＳＶＤＰＲＶＳＩＳＴＬ（リーダー配列＋ＰｅｐＡ－１バリアント）（配列番号２７）。

【0060】

当業者は、Ｎｅｇｒ１をコードする公知のヌクレオチド配列に基づいて、組み換えＤＮＡ技術の分野で利用可能な通常の一般的知識を用いて、過度の負担なしに、本発明の核酸、発現ベクター及び宿主細胞のさらなる実施形態を設計及び製造することができる。

【0061】

治療用途に関する限り、治療される好ましい腫瘍疾患は、神経芽腫、神経節膠腫、神経節細胞腫、肺の腺癌、腎細胞癌、食道扁平上皮癌、乳癌、甲状腺癌、結腸腺癌、膠芽腫、食道扁平上皮癌、悪性黒色腫（メラノーマ）、卵巣癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）及び炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）からなる群より選択される。

【0062】

治療される好ましいタウオパチーは、アルツハイマー病、脳炎後パーキンソニズム、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、グアム島パーキンソン認知症複合、１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症及びパーキソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、空胞型タウオパチー（Vacuolar tauopathy）、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）からなる群より選択される。

【0063】

Ｎｅｇｒ１タンパク質及びその生物学的に活性な断片は、有効成分（活性成分）及び１又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤（添加剤、excipient）を含む医薬組成物に配合されてもよい。

【0064】

当業者は、とりわけ、治療される特定の疾患及び患者の特徴（特性）を含むいくつかの要因に応じて、投与経路、医薬品剤形（pharmaceutical dosage form）及び投与される有効成分の用量（dose）を選択することができる。

【0065】

本発明の使用のためのＮｅｇｒ１タンパク質及びその生物学的に活性な断片は、併用療法として、すなわち、抗腫瘍活性を有する化合物若しくは物質又は放射線療法剤との同時的（simultaneous）、個別的（separate）又は連続的（sequential）な併用投与として、腫瘍に罹患した患者に投与されてもよい。

【0066】

好ましい一実施形態によると、抗腫瘍活性を有する化合物又は物質は、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、エトポシド、トポテカン、メルファラン、ブスルファン、チオテパ、ジヌツキシマブ、ジヌツキシマブ ベータ、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、ロルラチニブ、エンサルチニブ、エヌトレクチニブ及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。

【0067】

同様に、本発明の使用のためのＮｅｇｒ１タンパク質及びその生物学的に活性な断片は、併用療法として、すなわち、タウオパチーの治療的処置に有効な化合物又は物質との同時的、個別的又は連続的な併用投与によって、タウオパチーに罹患した患者に投与されてもよい。

【0068】

本発明のさらなる特徴及び利点は、添付の図面を参照して、本発明者らが実施した実験の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0069】

【図1】図１は、本発明者らが得た実験結果を示しており、Ｎｅｇｒ１の過剰発現がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで神経芽腫の成長（増殖）を阻止することを示す。（Ａ）ヒト神経芽腫（ＳＨ５Ｙ）、膠芽腫（Ｕ８７）、マウス神経芽腫（Ｎ２ａ）及びマウス初代皮質ニューロンのウエスタンブロット分析。サンプルを抗Ｎｅｇｒ１抗体及び抗アクチン抗体で染色した。（Ｂ）野生型Ｎ２ａ細胞並びにＮｅｇｒ１を安定的に発現する３つの異なるクローン（コロニー３、７及び１１）の増殖率を分析した。Ｎ２ａクローンを０日目に一定量（２００００個の細胞）で播種した。細胞数をＤＩＶ５にカウントした；ｎ＝１２、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 野生型。（Ｃ）２００００個のＮ２ａ野生型又は安定発現Ｎｅｇｒ１（ｃｏｌ３及び１１）細胞を軟寒天に播種し、１４日間培養した。次に、細胞をクリスタルバイオレットで染色した。（Ｄ）コロニー（５０個を超える細胞を含むクラスター）の数を示すグラフである；ｎ＝６、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 野生型。（Ｅ）１００万個のＮ２ａ細胞（野生型、クローン３、及びクローン１１）を、ＣＤ１免疫不全ヌードマウスに皮下注射した。注射の３、５、７、９、１３及び１５日後に、腫瘍の成長（増殖）をモニターした。画像は２つの代表的な腫瘤塊（tumor mass）を示し、スケールバー＝１ｃｍである。（Ｆ）腫瘍体積を示すグラフである；ｎ＝６、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 野生型。

【図2】図２は、本発明者らが得た実験結果を示しており、本発明の一実施形態であるＰｅｐＡがｉｎ ｖｉｔｒｏで神経芽腫の成長（増殖）を阻止することを示す。（Ａ）組み換えＧＦＰ又はＮｅｇｒ１（２００ｎｇ、毎日）で処理した野生型Ｎ２ａ細胞の増殖率を分析した。Ｎ２ａクローンを０日目に一定量（２００００個の細胞）で播種し、５日間培養した。培養生存能力（culture viability）をＭＴＴアッセイによって測定した。処理していない培養に対する倍率（fold-over）として表される細胞生存能力（cell viability）を示すグラフである；ｎ＝１０、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 ＧＦＰ。（Ｂ）ＮＣＢＩ（ＮＰ＿７７６１６９．２．）で報告されているＮｅｇｒ１ ＩｇＧ様ドメインの境界を示す図（cartoon）である。組み換えＧＦＰ、Ｎｅｇｒ１又はＮｅｇｒ１由来のＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ及びＰｅｐＣ（２００ｎｇ、毎日）で処理した野生型Ｎ２ａ細胞の増殖率を分析した。Ｎ２ａ細胞を０日目に一定量（２００００個の細胞）で播種し、５日間培養した。５日目における細胞数を示すグラフである；ｎ＝１２、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 ＧＦＰ。（Ｃ）組み換えＧＦＰ、Ｎｅｇｒ１又はＰｅｐＡ（２００ｎｇ、毎日）で処理したＵ８７、ＳＫ－ＭＥＬ５、ＭＣＦ７、Ａ５４９及びＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の増殖率を分析した。細胞を０日目に一定量（２００００個の細胞）で播種し、５日間培養した。培養生存能力をＭＴＴアッセイによって測定した。ビヒクルに対する倍率として表される細胞生存能力を示すグラフである；ｎ＝８、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 ＧＦＰ。

【図3】図３は、本発明者らが得た実験結果を示しており、ＰｅｐＡがｉｎ ｖｉｖｏで神経芽腫の成長（増殖）を阻止することを示す。（Ａ）１００万個のＮ２ａ細胞を、ＣＤ１免疫不全ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、２μｇのＧＦＰ又はＰｅｐＡをｉｎ ｓｉｔｕで注射した。この処置を１日おきに繰り返した。注射の１～９日後に、腫瘍の成長（増殖）をモニターした。１日目に対する倍率として表される腫瘍体積の成長（増殖）を示すグラフである；ｎ＝９、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 ＧＦＰ。（Ｂ）腫瘍、肝臓及び腎臓におけるＧＦＰ及びＰｅｐＡの存在を、ＳＴＲＥＰプルダウン（STREP-pulldown）によって調査した。（Ｃ）ＧＦＰ又はＰｅｐＡで処理した腫瘍から採取した２０μｍ厚の薄片を、免疫蛍光法によって分析した。試料を抗ＣＤ３４抗体（未熟な血管を染色する、赤）及びＤＡＰＩ（細胞核を視覚化する、青）で染色した。（Ｄ～Ｅ）血管数（Ｅ）及び平均面積（任意単位）（Ｅ）を示すグラフである；ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５ 対 ＧＦＰ。

【図4】図４は、本発明者らが得た実験結果を示しており、可溶性のＮｅｇｒ１由来ペプチド（すなわち、ＰｅｐＡ－１、ＰｅｐＡ－２及びＰｅｐＡ－３）がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで神経芽腫の成長（増殖）をさらに阻止することを示す。（Ａ）上記のペプチドの境界を示す図である。（Ｂ）組み換えＧＦＰ、ＰｅｐＡ、ＰｅｐＡ－１、ＰｅｐＡ－２又はＰｅｐＡ－３（５００ｎｇ、毎日）で処理した野生型Ｎ２ａ細胞の増殖率を分析した。Ｎ２ａ細胞を０日目に一定量（２００００個の細胞）で播種し、５日間培養し、最終的にＭＴＴアッセイによって測定した。ＧＦＰ値に正規化した、５日目における細胞活力（cell vitality）を示すグラフである；ｎ＝１０、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 ＧＦＰ。（Ｃ）ビヒクル、ロルラチニブ、ＧＦＰ、ｒＮｅｇｒ１及びＰｅｐＡ－１（３μＭ、毎日）で処理した野生型Ｎ２ａ細胞の増殖率を分析した。Ｎ２ａ細胞を０日目に一定量（２００００個の細胞）で播種し、５日間培養し、最終的にＭＴＴアッセイによって測定した。ビヒクル（ロルラチニブに対して）又はＧＦＰ（ｒＮｅｇｒ１及びＰｅｐＡ－１に対して）処理時に測定した値に正規化した、５日目における細胞活力を示すグラフである；ｎ＝１０、^＊＊＊ｐ＜０．０１ 対 ビヒクル、°°°ｐ＜０．０１ 対 ＧＦＰ。（Ｄ）初代皮質ニューロンを、ＤＩＶ７から毎日、４０－８０－１６０－２００ｎｇ／ｍｌのＰｅｐＡ－１又はＧＦＰで処理した。５日後、細胞毒性をＭＴＴによって評価した。ＧＦＰ値に正規化した細胞活力を示すグラフである；ｎ＝６。（Ｅ）１００万個のＮ２ａ細胞を、ＣＤ１免疫不全ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、２μｇのＧＦＰ又はＰｅｐＡ－１をｉｎ ｓｉｔｕで注射した。この処置を１日おきに繰り返した。注射の３、５、７及び１０日後に、腫瘍の成長（増殖）をモニターした。１日目に対する倍率として表される腫瘍体積の成長（増殖）を示すグラフである；ｎ＝３、^＊ｐ＜０．０５ 対 ＧＦＰ。

【図5】図５は、本発明者らが得た実験結果を示しており、合成ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで神経芽腫の成長（増殖）を阻止することを示す。（Ａ）１００万個のＮ２ａ細胞を、ＣＤ１免疫不全ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、１０μｇのＰＥＧ－スクランブル（PEG-scramble）ペプチド又はＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１をｉｎ ｓｉｔｕで注射した。この処置を１日おきに繰り返した。注射後、腫瘍の成長（増殖）を毎日モニターした。１日目に対する倍率として表される腫瘍体積の成長（増殖）を示すグラフである；ｎ＝６、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 ＰＥＧ－スクランブル。（Ｂ）１００万個のＮ２ａ細胞を、ＣＤ１免疫不全ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、１５０μｇのＰＥＧ－スクランブルペプチド又はＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１を腹腔内注射した。この処置を１日おきに繰り返した。注射後、腫瘍の成長（増殖）を毎日モニターした。１日目に対する倍率として表される腫瘍体積の成長（増殖）を示すグラフである；ｎ＝６～８、^＊ｐ＜０．０５ 対 ＰＥＧ－スクランブル。

【図6】図６は、本発明者らが得た実験結果を示しており、ペプチドＰｅｐＡがＡＬＫシグナル伝達を調節することを示す。（Ａ）ＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ及びＰｅｐＣの境界を示す図である。（Ｂ）５００００個のＮ２ａ細胞を、５日間毎日、３００ｎｇ／ｍｌのＧＦＰ、ｒＮｅｇｒ１又はＰｅｐＡで処理した。ＤＩＶ５に、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＡＬＫ及びＭＹＣＮについてのタンパク質発現レベル並びにアクチン及びＳ６リボソームタンパク質についてのタンパク質発現レベルを評価した。（Ｃ～Ｄ）アクチン及びＳ６ＲＰ量に対して正規化し、ＧＦＰ処理した細胞の倍率として表されるＡＬＫレベル（Ｃ）及びＭＹＣレベル（Ｄ）を示すグラフである；ｎ＝６、^＊ｐ＜０．０５ 対 ＧＦＰ。（Ｅ）５００００個のＮ２ａ細胞を、５日間毎日、３μＭのＧＦＰ、ロルラチニブ又はＰｅｐＡ－１で処理した。ＤＩＶ５では、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＡＬＫ及びＭＹＣＮについてのタンパク質発現レベル並びにアクチン及びＳ６リボソームタンパク質についてのタンパク質発現レベルを評価した。（Ｆ～Ｇ）アクチン及びＳ６ＲＰ量で正規化し、ＧＦＰ処理した細胞に対する倍率として表されるＡＬＫレベル（Ｆ）及びＭＹＣレベル（Ｇ）を示すグラフである；ｎ＝６、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１ 対 ＧＦＰ。（Ｈ）１５００００個のＮ２ａ細胞を、３μＭのＧＦＰ、ロルラチニブ又はＰｅｐＡ－１で１０分間処理した。次に、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＡＫＴ、リン酸化ＡＫＴ（phospho-AKT）、ＥＲＫ１／２及びリン酸化ＥＲＫ１／２（phospho-ERK1/2）についてのタンパク質発現レベル並びにＳ６リボソームタンパク質についてのタンパク質発現レベルを評価した。（Ｉ～Ｊ）ビヒクルで処理した細胞に対する倍率として表されるｐＡＫＴ／ＡＫＴ比（Ｉ）及びｐＥＲＫ／ＥＲＫ比（Ｊ）を示すグラフである；ｎ＝６、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１ 対 ビヒクル。

【図7】図７は、本発明者らが得た実験結果を示しており、ＰｅｐＡ－１の合成バージョン及び生物学的に活性のある最小配列のバリアントを含むスクランブルペプチドがＡＬＫシグナル伝達を調節することを示す。（Ａ）生物学的に活性のある最小配列ＧＤＫＷＳＶ（配列番号８）の位置を示す図である（出典ＰＤＢ：６ＤＬＤ）。（Ｂ）合成ペプチドの配列。（Ｃ）１５００００個のＮ２ａ細胞を、ビヒクル又は以下の合成ペプチド（１０μＭ、１０分 １０μＭ）で処理した：スクランブルペプチド、ＰｅｐＡ－１由来ペプチドであるが生物学的に活性のある最小配列のバリアントＧＤＫＩＳＶ（配列番号９）を含むｓｃｒ－ＧＤＫＩＳＶ、及びＰｅｐＡ－１。次に、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＥＲＫ１／２及びリン酸化ＥＲＫ１／２の発現レベルを評価した。（Ｄ）ビヒクルに対する倍率としてリン酸化ＥＲＫ／ＥＲＫ（phospho-ERK/ERK）比を示すグラフである；ｎ＝８、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．０１ 対 ビヒクル。（Ｅ）１５００００個のＮ２ａ細胞を、３μＭ又は３０μＭのビヒクル、ロルラチニブ又はＧＤＫＷＳＶペプチドで１０分間処理した。次に、培養物をドットブロッティングのために処理し、ＥＲＫ１／２及びリン酸化ＥＲＫ１／２の発現レベルを評価した。（Ｆ）ビヒクルに対する倍率としてリン酸化ＥＲＫ／ＥＲＫ比を示すグラフである；ｎ＝５、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 ビヒクル。（Ｇ）１５００００個のＮ２ａ細胞を、以下の合成ペプチド（１０μＭ、１０分 １０μＭ）で処理した：スクランブルペプチド、ＰｅｐＡ－１、及びＰｅｐＡ－１由来ペプチドであるがＧＤＫＩＳＶヘキサペプチド（esapeptide）の代わりにスクランブル配列を有するＰｅｐＡ－１ ６ａａスクランブル。次に、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＥＲＫ１／２及びリン酸化ＥＲＫ１／２の発現レベルを評価した。（Ｈ）ビヒクルに対する倍率としてリン酸化ＥＲＫ／ＥＲＫ比を示すグラフである；ｎ＝４、^＊＊＊ｐ＜０．０１ 対 他の条件。

【図8】図８は、ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１と称されるＰｅｐＡ－１のＰＥＧ化（ペグ化、pegylated）型の有効性（efficacy）に関して、本発明者らが得た実験結果を示している。（Ａ）１５００００個のＮ２ａ細胞を、３μＭ又は３０μＭのビヒクル、ロルラチニブ又はＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１で１０分間処理した。次に、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＥＲＫ１／２及びリン酸化ＥＲＫ１／２についてのタンパク質発現レベルを評価した。（Ｂ）３０μＭで処理したときのビヒクルに対する倍率としてリン酸化ＥＲＫ／ＥＲＫ比を示すグラフである；ｎ＝８、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 ビヒクル。（Ｃ）１５００００個のＮ２ａ細胞を、５μＭのビヒクル、ロルラチニブ、スクランブルペプチド又はＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１で２４時間又は４８時間処理した。次に、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＡＬＫについてのタンパク質発現レベルを評価した。対照に対する倍率として、正規化したＡＬＫ光学密度を示すグラフである；ｎ＝４、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１、°°ｐ＜０．０１ 対 スクランブルペプチド。（Ｄ）１５００００個のＮ２ａ細胞を、ビヒクル、ロルラチニブ＋スクランブルペプチド、又はロルラチニブ＋ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１で、５μＭで２４時間処理した。次に、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＡＬＫについてのタンパク質発現レベルを評価した。ビヒクルに対する倍率として、正規化したＡＬＫ光学密度を示すグラフである；ｎ＝４、^＊＊ｐ＜０．０１ 対 スクランブルペプチド。

【発明を実施するための形態】

【0070】

本発明者らが得た結果を、以下に詳細に説明する。

【0071】

第１の一連の実験では、本発明者らは、Ｎｅｇｒ１タンパク質が脳癌由来細胞株ＳＨ５Ｙ（ヒト神経芽腫）、Ｕ８７（膠芽腫）及びＮ２ａ（マウス神経芽腫）において下方制御されることを（観察によって）認めた。本発明者らはまた、Ｎ２ａ細胞における異所性Ｎｅｇｒ１発現によって細胞増殖が有意に低下すること、及びＮｅｇｒ１発現Ｎ２ａ細胞クローンでは軟寒天上でコロニーを生成する能力が大幅に低下することを見出した。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの癌の進行を調査するための確立されたツールである異種移植（Xenograft）マウスモデルを用いるｉｎ ｖｉｖｏ研究において、本発明者らは、皮下注射（s.c.）したＮｅｇｒ１発現Ｎ２ａ細胞由来の腫瘍のサイズが、野生型Ｎ２ａ細胞由来の腫瘍のサイズよりも有意に小さいことを認めた。

【0072】

これらの知見は、Ｎｅｇｒ１の過剰発現がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で癌の成長（増殖）を阻止できることを実証する。

【0073】

第２の一連の実験では、本発明者らは、ナイーブＮ２ａ細胞を可溶性組み換え完全長Ｎｅｇｒ１タンパク質で処理したところ、Ｎ２ａの成長（増殖）が有意に低下することを認めた。

【0074】

本発明者らはまた、抗新生物（抗腫瘍）活性を発揮できる最小アミノ酸配列を同定することを目的とした一連の実験を行った。Ｎｅｇｒ１タンパク質は、３つのＩｇＧ様ドメインを含む。ヒト完全長Ｎｅｇｒ１タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢから、アクセッション番号Ｑ７Ｚ３Ｂ１（ＮＥＧＲ１＿ＨＵＭＡＮ）で入手可能であり、添付の配列表において配列番号１として指定されている。したがって、本発明者らは、１つ１つのＩｇＧ様ドメインをクローニング（クローン化）し、特徴付けた。Ｎｅｇｒ１の３つのＩｇＧ様ドメインを、以下、ＰｅｐＡ（配列番号８）、ＰｅｐＢ（配列番号１６）及びＰｅｐＣ（配列番号１７）と称する。ナイーブＮ２ａ細胞をＮｅｇｒ１、ＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、ＰｅｐＣ又は対照としてのＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）（ＧＦＰは完全長Ｎｅｇｒ１とほぼ同じサイズである。）で処理したところ、本発明者らは、Ｎｅｇｒ１及びＰｅｐＡがＮ２ａの増殖を有意に低下させるのに対し、ＰｅｐＢ及びＰｅｐＣはＮ２ａの増殖を有意に低下させないことを認めた。本発明者らはまた、Ｎｅｇｒ１及びＰｅｐＡが他の癌細胞株、すなわち、Ｕ８７（膠芽腫）、ＳＫ－Ｍｅｌ５（悪性黒色腫）、ＭＣＦ７（乳腺腺癌）、Ａ５４９（腺癌性肺胞基底上皮細胞（adenocarcinomic alveolar basal epithelial cells））及びＳＨ－ＳＹ５Ｙ（神経芽腫）の成長（増殖）を阻止する能力について試験した。ｒＮｅｇｒ１及びＰｅｐＡで処理したところ、分析したすべての癌株の成長（増殖）が有意に低下した。

【0075】

ＰｅｐＡの抗腫瘍活性は、６週齢のＣＤ１ヌードマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験においても確認され、この実験において、本発明者らは、同所性ＰｅｐＡ処置により腫瘍の成長（増殖）が大きく（robust）低下することを認めた。さらに、本発明者らは、ｉｎ ｓｉｔｕ投与したところ、ＰｅｐＡが腫瘍、肝臓及び腎臓に存在するのに対して、対照として用いたＧＦＰタンパク質は主に腫瘍に存在することを見出した。このことは、ＰｅｐＡが血流に到達して体内に分布できることを示唆している。さらに、本発明者らは、ＣＤ３４タンパク質を検出することにより腫瘍の新生血管形成を分析し、ＰｅｐＡで処理した腫瘍では血管新生が大幅に減少していることを認めた。

【0076】

ＰｅｐＡの生物学的に活性のある最小配列をさらに絞り込むために、本発明者らは、ＰｅｐＡ構造のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析（コンピュータによる分析）を行った。本発明者らは、ＰｅｐＡのアミノ酸配列全体にわたる３つの部分的に重複するペプチドをクローニングし、特徴付けた。これらのペプチドを、以下、ＰｅｐＡ－１（配列番号９）、ＰｅｐＡ－２（配列番号１０）及びＰｅｐＡ－３（配列番号１１）と称する。Ｎ２ａ細胞をＧＦＰ（対照）、ＰｅｐＡ、ＰｅｐＡ－１、ＰｅｐＡ－２又はＰｅｐＡ－３で処理したところ、本発明者らは、試験したすべてのＮｅｇｒ１由来ペプチドがＮ２ａの成長（増殖）を有意に低下させるが、ＰｅｐＡ－１及びＰｅｐＡ－３がより強く低下させることを認めた。さらに、ＭＴＴアッセイにおいて、本発明者らは、ｒＮｅｇｒ１、ＰｅｐＡ－１及びロルラチニブ（ＦＤＡにより承認されたＡＬＫ阻害剤）がＮ２Ａの成長（増殖）を同程度に低下させることを認めた。注目すべきことに、本発明者らはさらに、濃度を増大させたＰｅｐＡ－１による処理では、ＧＦＰによる処理と比較して、初代皮質ニューロンにおいて高い毒性が引き起こされないことを認めた。ＰｅｐＡ－１の有意な抗新生物活性は、６週齢のヌードマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでも確認された。

【0077】

生物学的証拠は、ヒトＮｅｇｒ１タンパク質がＰｅｐＡ－１のアミノ酸配列の＋１０位に対応する位置でグリコシル化されていることを示唆しているので、本発明者らは、ＰｅｐＡ－１のＰＥＧ化バージョンを作製し、Ｎ２ａ細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ及び６週齢のＣＤ１ヌードマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏの両方で抗腫瘍活性を有することを確認した。

【0078】

本発明者らはまた、本発明のＮｅｇｒ１由来ペプチドの抗腫瘍活性の根底にある分子機構を、ＡＬＫ－ＭＹＣＮ経路で特定することにより明らかにした。本発明者らは、Ｎ２ａ細胞をＰｅｐＡ又はＰｅｐＡ－１で処理することにより、ＡＬＫ受容体及びＭＹＣＮ転写因子タンパク質の発現レベルが低下し、ＥＲＫキナーゼ及びＡＫＴキナーゼのリン酸化も減少することを認めた。

【0079】

重要なことに、本発明者らはまた、抗腫瘍活性に必要なＮｅｇｒ１の生物学的に活性のある最小配列、すなわち、ＧＤＫＷＳＶ（配列番号６）を同定した。この配列は、生物学的に活性であることが示されたすべてのＮｅｇｒ１由来ペプチド、すなわち、ＰｅｐＡ、ＰｅｐＡ－１、ＰｅｐＡ－２及びＰｅｐＡ－３に存在するが、不活性であることが示されたＰｅｐＢ及びＰｅｐＣには存在しない。

【0080】

上記の実験結果に基づいて、配列番号８（ＰｅｐＡ）のＮｅｇｒ１ペプチドのみならず、配列番号８の４５位と５０位との間に位置する生物学的に活性のある最小配列である配列番号８６を含む少なくとも６アミノ酸長のＮｅｇｒ１ペプチド断片も抗腫瘍活性を有すると結論付けることができる。

【0081】

このようなペプチド断片の例示的な例は、ＰｅｐＡ－１（配列番号９）、ＰｅｐＡ－２（配列番号１０）及びＰｅｐＡ－３（配列番号１１）であるが、これらに限定されない。さらなる例示的な例は、配列番号６のアミノ酸配列からなるヘキサペプチドである。

【0082】

本発明者らが得た結果はまた、生物学的に活性のある最小配列である配列番号６が配列番号７に置き換えられている、上記で定義されたＮｅｇｒ１ペプチドの機能的バリアントも抗腫瘍活性を有することを示す。

【0083】

このようなバリアントペプチド断片の例示的な例は、ＰｅｐＡ－１ｖ（配列番号１３）、ＰｅｐＡ－２ｖ（配列番号１４）及びＰｅｐＡ－３ｖ（配列番号１５）であるが、これらに限定されない。さらなる例示的な例は、配列番号７のアミノ酸配列からなるヘキサペプチドである。

【0084】

本発明のすべてのＮｅｇｒ１断片は、ＰＥＧ化型で提供することができる。ＰＥＧ化型は、天然に存在するヒトＮｅｇｒ１タンパク質のグリコシル化型に似せたものである。

【0085】

さらに、Ｎｅｇｒ１タンパク質及びその生物学的に活性な断片、ペプチド又はポリペプチドは、いずれも、その薬物動態的特性を改善するために、例えば、効力を増大し、活性を持続し、及び／又は半減期を延長するために、修飾された形態（修飾型）で提供されてもよい。このような修飾としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化（ペグ化、pegylation）、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への結合などが挙げられる。多数の化学的修飾のいずれかが、公知の技術によって行われてもよい。当業者にそれ自体公知のこのような修飾の具体的で例示的な例としては、以下が挙げられ、本発明の文脈で使用されてもよい：
・Kong and Heinis 2021に開示されている環状ペプチド；
・Vlieghe et al. 2010に開示されている少なくとも２つのＤ－アミノ酸の含有；
・Hook et al. 2005に開示されている少なくとも２つのβ－アミノ酸の含有；
・Linde et al. 2008に開示されているＮ－メチル化；
・Daepp et al. 2012に開示されている異なるＰＥＧ基の含有；及び／又は
・de Bont et al. 1999に開示されているペプチド骨格の少なくとも２つのアミドのスルホンアミドによる置換。

【0086】

以下の実験の項は、例示のみを目的として提供されており、添付の請求の範囲に定められる本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0087】

実験の項
材料及び方法
コンストラクト及びペプチド

【0088】

ｍＮｅｇｒ１ ｃＤＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ クローン Ｃ３３４２ＩＲＣＫｐ５０１４Ｐ０５７－ｒｚｐｄｍ１３－２１）を、ｓｔｒｅｐ－ＦＬＡＧ ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。ｍＮｅｇｒ１－ペプチドを、ｓｔｒｅｐ－ＦＬＡＧ ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。

【0089】

スクランブル：
ＤＧＧＳＫＧＧＦＡＤＬＳＳＩＩＷＡＲＷＮＫＡＲＶＤＰＬＶＳＩＳＴＳ（配列番号１８）
スクランブル－ＧＤＫＩＳＶ：
ＮＲＧＤＫＩＳＶＳＶＳＳＳＳＧＧＲＡＷＤＷＤＩＡＫＰＧＬＡＩＬＴＦ（配列番号１９）
ＰｅｐＡ－１－６ａａスクランブル：
ＤＧＡＳＫＧＡＷＬＮＲＳＳＩＩＦＡＧＶＷＧＳＫＤＤＰＲＶＳＩＳＴＬ（配列番号２０）

【0090】

細胞培養及びトランスフェクション

【0091】

Ｎ２ａ（Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１３１）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、Ｕ８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ１４）、ＳＫＭＥＬ５（ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ７０）、ＭＣＦ７ ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－２２、Ａ５４９ ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１８５、及びＳＨＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ ２２６６（商標））細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％グルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）で、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃で培養した。皮質ニューロン培養物を、マウス胚（Ｅ１７．５－１８．５；Ｃ５７ＢＬ／６株）から調製した。

【0092】

高密度（７５０～１０００細胞／ｍｍ^２）ニューロン培養物を、以前に記載された２４穴プラスチック組織培養プレートに播種して増殖させた（Iwaki; Bibby Sterilin）（Pischedda et al. 2018）。

【0093】

Ｎ２ａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、異なるコンストラクトで、４８時間トランスフェクトした。ｍＮｅｇｒ１を発現する安定したＮ２ａクローンを、ネオマイシンセレクション（１ｍｇ／ｍｌ）によって単離した。

【0094】

ＳＴＲＥＰ樹脂による精製
関連するコンストラクト（relative construct）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、４℃で１時間、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０，５％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸ナトリウム）中に溶解し、次いで、ストレプトアビジンによる免疫沈降（streptavidin immunoprecipitation）のために処理した。タンパク質を、４℃で１時間穏やかに攪拌しながら、ＳＴＲＥＰ樹脂から溶出緩衝液（２．５ｍＭデスチオビオチン、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶出した。タンパク質の濃度を標準Ｂｒａｄｆｏｒｄ（ブラッドフォード）アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって測定し、タンパク質の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色によって評価した。合成ペプチドは、ジェンスクリプト、オランダ（Genscript Nederland）で購入した。マウス組織を、４℃で１時間、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、組織１ｍｇにつき１ｍｌ（1ml/mg of tissue））中に溶解し、次いで、ストレプトアビジン免疫沈降のために処理した。タンパク質を、ＳＴＲＥＰ樹脂からレムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液中に溶出した。

【0095】

ＭＴＴアッセイ
３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを実施して、培養物の活力（culture vitality）を評価した。９６穴プレートで、Ｎ２ａ細胞を濃度５×１０^３細胞／ｃｍ^２で培養した。処理条件を結果の項に示す。処理の最後に、ＭＴＴ溶液を、最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬで細胞培地に添加した。３７℃で３０分インキュベーションした。次に、培地を除去し、ホルマザン沈殿物をＤＭＳＯ（２００μＬ）中に収集した。細胞生存能力の代わりとして、吸光度を、分光光度計（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて５７０ｎｍで測定した。対照条件に対する相対的な細胞生存能力の倍率を表す。

【0096】

ウエスタンブロッティング
タンパク質レベル及び相対的リン酸化を、ウエスタンブロッティングによって評価した。簡単に説明すると、ＰＢＳで洗浄した後、細胞を溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸ナトリウム）に可溶化した。１時間穏やかに攪拌した後、溶解産物（ライセート）を、１６，０００ｇで２０分間遠心分離して清澄化した。すべての実験手順を４℃で実施した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）によって評価した。ウエスタンブロッティング実験について、等量のタンパク質を、０．２５％ ５×レムリー緩衝液で希釈した。サンプルを１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、８０Ｖで１２０分間、４℃でニトロセルロース膜（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に転写した。一次抗体は以下のとおりであった：βアクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）、ＡＬＫ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－３９８７９１）、Ｎ－ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－５６７２９）、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（１３７Ｆ５） Ｒａｂｂｉｔ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｋｔ（ｐａｎ）（１１Ｅ７） Ｒａｂｂｉｔ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ）ＸＰ（登録商標） Ｒａｂｂｉｔ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓ６ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（５Ｇ１０） Ｒａｂｂｉｔ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。抗体を、ブロッキング緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、及び５％脱脂粉乳）に一晩浸した（applied）。タンパク質をＥＣＬ ｐｒｉｍｅ検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。ＥＣＬシグナルを、イメージングＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈシステム（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｔａｌｙ、イタリア国セグラーテ）を用いて取得した。特定のバンドの光学密度を、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏ Ｒａｄ）で定量化した。

【0097】

動物
１００万個のＮ２ａ細胞を１５０μｌのＤＭＥＭ高グルコースに懸濁し、マイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いる注射によって、８週齢のｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の左後足部（left rear paw）に皮下投与した。動物に関するすべての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｉｅｓ（認定（authorization）５５９／２０１６－ＰＲ）によって承認された。

【0098】

免疫蛍光法
腫瘍を解剖し、４％ＰＦＡに２時間浸漬して後固定し、次いで、ＯＣＴに入れて、処理するまで－８０℃で保存した。Ｌｅｉｃａクリオスタットで連続切片化して１４μｍの切片を得、Ｐｏｌｙｓｉｎｅ Ｓｌｉｄｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に載置した。薄片を、２．５％ＢＳＡ、１０％ＮＧＳ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（トリトン）Ｘ－１００、ＰＢＳ １Ｘ中に、室温（ＲＴ）で１時間浸し、一次抗体（抗ＣＤ３４抗体［ＥＰ３７３Ｙ］、ＡＢＣＡＭ、ａｂ８１２８９）とともに４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。ＰＢＳ １Ｘ－０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で３回洗浄した後、切片を、結合二次抗体（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１１－５８５－００３）とともに室温で１時間インキュベートした。その後、薄片を、ＰＢＳ １Ｘ－０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で３回すすぎ、ＰＢＳ １Ｘで１回すすぎ、次いで、水性封入剤に封入した。切片を、４０倍（40X）対物レンズを装備したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２で画像を取得するまで、４℃で暗所に保管した。

【0099】

統計分析及びガイドライン
すべてのデータを、最小、最大及び中央値を示す箱ひげ図として表した。データ分布の正規性を、ダゴスティーノ及びピアソンのオムニバス正規性検定（D’Agostino and Pearson omnibus normality test）、続いて対応のないスチューデントのｔ検定（unpaired Student’s t test）、分散分析（ANOVA）に続くテューキーの事後検定（Tuckey’s post-hoc test）又は二元配置分散分析（two-way ANOVA）に続くボンフェローニ若しくはスチューデントの事後t検定（Bonferroni or Student’s t post-hoc test）を用いて適宜決定した。実験数（ｎ）及び有意水準（ｐ）を、本文全体にわたって示す。すべての方法を、関連するガイドライン及び国の規制に従って実施した。

【0100】

結果
Ｎｅｇｒ１過剰発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで癌の成長（増殖）を阻止する。
ヒト神経芽腫（ＳＨ５Ｙ）、膠芽腫（Ｕ８７）、マウス神経芽腫（Ｎ２ａ）から得たタンパク質サンプルを、ウエスタンブロッティングによって処理した。本発明者らは、Ｎｅｇｒ１タンパク質が脳癌由来株において下方制御されることを認めた。対照的に、Ｎｅｇｒ１は、終末分化した（terminally differentiated）マウス皮質ニューロンにおいて検出できた（図１Ａ）。次に、本発明者らは、Ｎｅｇｒ１タンパク質レベルが細胞増殖と相関しているか否かを評価した。この目的のために、Ｓｔｒｅｐ－ＦＬＡＧ Ｎｅｇｒ１融合タンパク質を発現するいくつかのＮ２ａクローンを生成し、特徴付けた。Ｎ２ａクローンを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで０日目（ＤＩＶ０）に一定量（２００００個の細胞）で播種した。ＤＩＶ５に細胞増殖を評価した。異所性Ｎｅｇｒ１発現によってＮ２ａ増殖が有意に減少することを見出した（図１Ｂ）。

【0101】

癌細胞が固体表面から独立して成長（増殖）できることは公知である。このような足場非依存性成長（増殖）は、発癌のホールマーク（特徴、hallmark）である。この特徴は、軟寒天マトリックス内でのコロニー成長をモニターすることによってｉｎ ｖｉｔｒｏで再現できる。したがって、軟寒天コロニー形成アッセイは、細胞が悪性形質転換したか否かを試験する。したがって、一定量（２００００個の細胞）の野生型及びＮｅｇｒ１発現細胞を軟寒天に播種し、１４日間培養した。次に、細胞を、クリスタルバイオレット染色によって可視化した。コロニー（５０個を超える細胞を含むクラスター）の数をスコア化することによって、本発明者らは、Ｎｅｇｒ１発現Ｎ２ａ細胞クローンでは軟寒天上でコロニーを生成する能力が大幅に低下することを認めた（図１Ｃ～Ｄ）。

【0102】

異種移植マウスモデルは、ｉｎ ｖｉｖｏでの癌の進行を調べるための確立された手段である。この目的のために、１００万個のＮ２ａ細胞（ナイーブ、クローン３及びクローン１１）を、免疫不全ＣＤ１ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍のサイズをノギスで測定することによって、腫瘍体積をｅｘ－ｖｉｖｏでモニターした。腫瘍体積を、楕円体の式（長さ×幅×高さ×０．５２）を用いて計算した。本発明者らは、Ｎｅｇｒ１発現細胞由来の腫瘍のサイズが野生型Ｎ２ａ細胞由来の腫瘍のサイズよりも有意に小さいことを認めた（図１Ｅ～Ｆ）。

【0103】

可溶性Ｎｅｇｒ１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで癌の成長（増殖）を阻止する。
生理学的レベルでは、Ｎｅｇｒ１は、ＧＰＩアンカー型膜結合タンパク質として、及び金属プロテアーゼ切断時に放出される可溶性タンパク質として存在している（Sanz et al. 2015；Pischedda and Piccoli 2015）。したがって、本発明者らは、可溶性組み換えＮｅｇｒ１（Ｎｅｇｒ１）による異所性処理が癌細胞の成長（増殖）を調節できるか否かについて研究した。この目的のために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞から、Ｓｔｒｅｐ－ＦＬＡＧ Ｎｅｇｒ１及びＳｔｒｅｐ－ＧＦＰを発現して精製した。後者は、対照として使用した生物学的に不活性なタンパク質である。次に、１００００個のナイーブＮ２ａ細胞を播種し、２００ｎｇのｒＮｅｇｒ１又はＧＦＰで毎日処理した。ＤＩＶ５に、細胞の成長（増殖）をＭＴＴアッセイによって評価した。本発明者らは、Ｎｅｇｒ１での処理により、Ｎ２ａの成長（増殖）が有意に低下することを認めた（図２Ａ）。

【0104】

次に、本発明者らは、Ｎｅｇｒ１抗新生物作用を発揮できる最小配列を同定することを目的とした。Ｎｅｇｒ１タンパク質は、３つのＩｇＧ様ドメインを含む。したがって、本発明者らは、１つ１つのＩｇＧ様ドメインをｓｔｒｅｐ－ＦＬＡＧタグ付き組み換えタンパク質としてクローニングし、特徴付けた。本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞から、これら３つのドメイン（以下、ＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、ＰｅｐＣと称する）を発現して精製した。

【0105】

次に、１００００個のナイーブＮ２ａ細胞を播種し、２００ｎｇのＮｅｇｒ１、ＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、ＰｅｐＣ又はＧＦＰで毎日処理した。ＤＩＶ５に、細胞数を評価した。本発明者らは、Ｎｅｇｒ１及びＰｅｐＡでの処理により、Ｎ２ａの増殖が有意に低下することを認めた（図２Ｂ）。

【0106】

次に、Ｎｅｇｒ１及びペプチドＰｅｐＡがヒト癌由来の細胞株、すなわち、Ｕ８７（膠芽腫）、ＳＫ－Ｍｅｌ５（悪性黒色腫）、ＭＣＦ７（乳腺腺癌）、Ａ５４９（腺癌性肺胞基底上皮細胞）及びＳＨ－ＳＹ５Ｙ（神経芽腫）の成長（増殖）を阻止する能力を試験した。この目的のために、各株を、２００ｎｇのＧＦＰ、ｒＮｅｇｒ１又はＰｅｐＡで毎日処理した。ＤＩＶ５に、細胞の成長（増殖）をＭＴＴアッセイによって評価した。ｒＮｅｇｒ１及びＰｅｐＡでの処理により、試験したすべての癌株の成長（増殖）が有意に低下することを見出した（図２Ｃ）。このような結果は、外胚葉起源の癌細胞株（小細胞肺癌、乳癌、悪性黒色腫、神経芽腫及び膠芽腫を含む）において実験的に検出された受容体ＡＬＫの発現と十分に一致している（Dirks et al. 2002）。

【0107】

ＰｅｐＡの抗新生物活性をさらに評価するために、１００万個のＮ２ａ細胞を、６週齢のＣＤ１ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、２μｇのＧＦＰ又はＰｅｐＡをｉｎ ｓｉｔｕで注射した。この処置を１日おきに繰り返し、腫瘍の成長（増殖）を毎日モニターした。ＰｅｐＡ処置により腫瘍の成長（増殖）が大きく低下することを認めた（図３Ａ）。

【0108】

注射後９日目（又は腫瘍が２．５ｃｍ^３の体積に達した場合にはそれよりも早い日）に、動物を安楽死させ、マウスの組織を採取してＧＦＰ及びＰｅｐＡの存在を分析した。特に、ＳＴＲＥＰ樹脂へ固定化することにより、本発明者らは、ＰｅｐＡが腫瘍、肝臓及び腎臓に存在する一方、ＧＦＰタンパク質は主に腫瘍に存在することを認めた（図３Ｂ）。この生化学的証拠は、ＰｅｐＡが血流に到達して体内に分布できることを示唆している。

【0109】

癌の成長（増殖）は血管新生を必要とし、血管新生を誘発する。特に、癌腫瘤は、ＣＤ３４タンパク質で修飾された未熟な血管の存在によって特徴付けられる。したがって、本発明者らは、ＣＤ３４タンパク質を検出することによって腫瘍の新生血管形成を分析した。ＰｅｐＡで処理した腫瘍は、ＣＤ３４で染色された総面積及び平均血管面積の点から、血管新生が大幅に低下していた（図３Ｃ～Ｅ）。

【0110】

３３アミノ酸長の生物学的抗新生物性ペプチドの特徴付け
ＰｅｐＡ内の生物学的に活性のある最小配列をさらに絞り込むために、ＰｅｐＡ構造をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析した。予測された二次構造と一致して、本発明者らは、ＰｅｐＡ配列をカバーする３つのペプチドをクローニングし、特徴付けた（図４Ａ）。３つのペプチドを、ＨＥＫ２９３細胞から、ｓｔｒｅｐ－ＦＬＡＧタグ付き組み換えペプチドとして発現し、精製した。これら３つのペプチドを、以下、ＰｅｐＡ－１（３３アミノ酸）、ＰｅｐＡ－２（７０アミノ酸）、ＰｅｐＡ－３（７０アミノ酸）と称する。これら３つのペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を評価するために、１００００個のナイーブＮ２ａ細胞を播種し、５００ｎｇ／ｍｌのＧＦＰ、ＰｅｐＡ、ＰｅｐＡ－１、ＰｅｐＡ－２及びＰｅｐＡ－３で毎日処理した。ＤＩＶ５に、細胞の成長（増殖）をＭＴＴアッセイによって評価した。本発明者らは、最小ペプチドＰｅｐＡ－１が、Ｎ２ａの成長（増殖）を有意に低下させることを認めた（図４Ｂ）。

【0111】

ＰｅｐＡ１の有効性をさらに調べるために、ビヒクル、ロルラチニブ（Lorlatininb）（ＦＤＡにより承認されたＡＬＫ阻害剤）、ＧＦＰ、ｒＮｅｇｒ１及びＰｅｐＡ－１による慢性処理（毎日、すべての分子を３μＭ）に対するＮ２Ａ細胞の増殖を調査した。ＤＩＶ５に、細胞の活力をＭＴＴアッセイによって評価した。ｒＮｅｇｒ１、ＰｅｐＡ－１及びロルラチニブは、Ｎ２Ａの成長（増殖）を同程度に低下させた（図４Ｃ）。興味深いことに、濃度を増大させたＰｅｐＡ－１による処理（毎日、ＤＩＶ７から１２まで）は、ＧＦＰによる処理に比べて、ＤＩＶ１２の初代皮質ニューロンに対する過剰な毒性を引き起こさなかった（図４Ｄ）。

【0112】

次に、１００万個のＮ２ａ細胞を、６週齢のヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、２μｇのＧＦＰ又はＰｅｐＡ－１をｉｎ ｓｉｔｕで注射した。この処置を１日おきに繰り返し、腫瘍の成長（増殖）を毎日モニターした。本発明者らは、ＰｅｐＡ－１処置により成長（増殖）が大きく低下することを認めた（図４Ｅ）。

【0113】

３３アミノ酸長の合成抗新生物性ペプチドの特徴付け
生物学的証拠は、ＰｅｐＡ１が＋１０位のアスパラギン残基（Ｎ）でグリコシル化されていることを示唆している。本発明者らは、グリコシル化に似せるために、ＰｅｐＡ－１配列のＮ末端にミニＰＥＧ１部分（ＭＷ：１５２Ｄａ）が結合している合成ペプチドを設計した。得られたペプチド（以下、ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１と称する）は、５ｍｇ／ｍｌの濃度で水に可溶である。

【0114】

ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１の抗新生物活性を評価するために、１００万個のＮ２ａ細胞を、６週齢のＣＤ１ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、１０μｇのＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１又はＰＥＧ－スクランブルペプチドをｉｎ ｓｉｔｕで注射した。処置を１日おきに繰り返し、腫瘍の成長（増殖）を毎日モニターした。本発明者らは、ＰｅｐＡ処置により腫瘍の成長（増殖）が大きく低下することを認めた（図５Ａ）。

【0115】

最後に、本発明者らは、全身投与によるＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１の有効性を試験した。この目的のために、１００万個のＮ２ａ細胞を、６週齢のＣＤ１ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、１５０μｇのＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１又はＰＥＧ－スクランブルペプチドを腹腔内注射した。この処置を１日おきに繰り返し、腫瘍の成長（増殖）を毎日モニターした。本発明者らは、ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１処置により腫瘍（増殖）の成長が大きく低下することを認めた（図５Ｂ）。

【0116】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで癌細胞の成長（増殖）に大きな効果が認められたことから、本発明者らは、Ｎｅｇｒ１由来ペプチドによって誘発された抗新生物性効果の根底にある分子機構の解明を目指した（図６Ａ）。ＡＬＫ受容体の活性の変化及び遺伝子増幅、並びにそれに伴う下流のＭＹＣＮ転写因子の発現の増加は、神経芽腫の重要な分子ホールマーク（molecular hallmarks）である。さらに、ＡＬＫ遺伝子は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を含むいくつかの悪性腫瘍において、腫瘍形成的に変化する可能性がある。

【0117】

本発明者らは、ｒＮｅｇｒ１又はＰｅｐＡによる処理がＡＬＫ－ＭＹＣＮ経路に影響を及ぼすか否かをモニターした。この目的のために、５００００個のＮ２ａ細胞を、５日間毎日、３００ｎｇ／ｍｌのＧＦＰ、ｒＮｅｇｒ１又はＰｅｐＡで処理した。ＤＩＶ５に、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＡＬＫ及びＭＹＣＮタンパク質の発現レベルを評価した。ＰｅｐＡ処理により、ＡＬＫ及びＭＹＣＮタンパク質レベルが大きく低下した（図６Ｂ～Ｄ）。

【0118】

次に、５００００個のＮ２ａ細胞を、５日間毎日、３μＭのＧＦＰ、ロルラチニブ又はＰｅｐＡ－１（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。ＤＩＶ５に、培養物をウエスタンブロッティングのために処理し、ＡＬＫ及びＭＹＣＮタンパク質の発現を評価した。注目すべきことに、本発明者らは、ＰｅｐＡ－１による慢性処理により、ＡＬＫ及びＭＹＣ－Ｎの強力な下方制御が引き起こされることを認めた（図６Ｅ～Ｇ）。

【0119】

ＡＬＫは、ＥＲＫキナーゼ及びＡＫＴキナーゼのリン酸化を伴うシグナル伝達カスケードを誘発する。したがって、上記の知見を補完するために、本発明者らは、ＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化に対するＰｅｐＡ－１の影響を評価した。急性処理（３μＭ、１０分）では、ＰｅｐＡ－１は、ＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を有意に低下させた（図６Ｈ～Ｊ）。

【0120】

さらに、Ｎ２ａ細胞を、以下の合成ペプチドで処理した：ＰｅｐＡ－１の合成バージョン（ｓｙｎＰｅｐＡ－１）、ＧＤＫＩＳＶ配列を含むスクランブルペプチド（ｓｃｒ－ＧＤＫＩＳＶ、酸化される可能性のあるＷ（トリプトファン）をＩ（イソロイシン）に置換したもの）及びスクランブルペプチド（１０μＭ、１０分）。注目すべきことに、本発明者らは、ｓｃｒ－ＧＤＫＩＳＶ及びｓｙｎＰｅｐＡ－１がＥＲＫ１／２のリン酸化を低下させることを見出した（図７Ｃ～Ｄ）。

【0121】

補完的なアプローチとして、Ｎ２ａ細胞を、ＧＤＫＷＳＶ配列がスクランブル配列に置き換えられたＰｅｐＡ－１由来ペプチドで処理した（ＰｅｐＡ－１－６ａａスクランブル、１０μＭ、１０分）。本発明者らは、ＰｅｐＡ－１－６ａａスクランブルがＥＲＫのリン酸化を変化させないことを認めた（図７Ｅ～Ｆ）。

【0122】

最後に、ＧＤＫＷＳＶペプチド単独の生物学的活性を試験した。この目的のために、１５００００個のＮ２ａ細胞を、合成ＧＤＫＷＳＶペプチド又はＡＬＫ阻害剤であるロルラチニブで処理した（３０ｎＭ、１０分）。ドットプロットにより、本発明者らは、ＧＤＫＷＳＶペプチドによる処理が、ＥＲＫ１／２のリン酸化の大幅な低下と相関していることを認めた（図７Ｅ～Ｆ）。この知見は、ヘキサペプチドＧＤＫＷＳＶがＰｅｐＡ－１ペプチドの生物学的活性の維持に不可欠であることを示唆している。最終的に、本発明者らは、ＰＥＧ－ＰｅｐＡ１の薬力学的特性をモニターした。急性処理（３０μＭ、１０分）により、ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１は、ＥＲＫのリン酸化を有意に低下させた（図８Ａ～Ｂ）。

【0123】

本発明者らは、ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１とロルラチニブとの併用効果についても研究した。本発明者らは、長期間の処理では、ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１がＡＬＫタンパク質のレベルを有意に低下させる一方、ロルラチニブは受容体の強力な上方制御を誘導することを認めた（いずれも５μＭ、２４時間又は４８時間、図８Ｃ）。注目すべきことに、ＰＥＧ－ＰｅｐＡ－１の同時投与は、ロルラチニブによる長期間の処理で認められたＡＬＫタンパク質のレベルを有意に低下させた（５μＭ、２４時間、図８Ｄ）。

【0124】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】