特表 2025-503476 操作された細菌における遺伝子療法ベクターの生産

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-04

(54)【発明の名称】操作された細菌における遺伝子療法ベクターの生産

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20250128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20250128BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/69 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20250128BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/55

C12N15/54

C12N15/09 100

C12N1/15

C12N1/19

C12N5/10

C12N5/071

C12N15/85 Z

C12N15/69 Z

A61K48/00

A61K47/36

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537513

(86)(22)【出願日】2022-12-20

(85)【翻訳文提出日】2024-08-09

(86)【国際出願番号】 US2022082078

(87)【国際公開番号】W WO2023122625

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】63/291,871

(32)【優先日】2021-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】523089036

【氏名又は名称】アルデブロン，エル．エル．シー．

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ホ ジン

(72)【発明者】

【氏名】ケネディ ジョディ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA95

4C076EE30

4C076EE57

4C084AA13

4C084NA13

4C084ZB211

4C084ZB212

(57)【要約】

本明細書において、環状ＤＮＡベクターを生産するように細菌細胞を操作する改良された方法、そのような方法によって生産された環状ＤＮＡベクター、及びそのような環状ＤＮＡベクターを含む医薬組成物が提供される。本明細書において提供される方法は、環状ＤＮＡベクターの高純度組成物の大規模生産に適している。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作された細菌細胞であって、
（ａ）細菌ゲノム内に組み込まれた細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子と、
（ｂ）（ｉ）コーディング配列、及び（ｉｉ）前記複製タンパク質に依存する複製起点を含む環状ＤＮＡベクターと、
を含む、操作された細菌細胞。

【請求項2】

前記複製起点は、５０塩基対未満の長さである、請求項１に記載の操作された細菌細胞。

【請求項3】

前記複製起点及び前記複製タンパク質は、ＣｏｌＥ２関連プラスミドに由来する、請求項１又は２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項4】

前記ＣｏｌＥ２関連プラスミドは、ＣｏｌＥ２－Ｐ９である、請求項３に記載の操作された細菌細胞。

【請求項5】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、第１の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項6】

前記第１の誘導性プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターである、請求項５に記載の操作された細菌細胞。

【請求項7】

前記細菌ゲノム内に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（Ｔ７ＲＮＡＰ）を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項8】

前記Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子は、第２の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項７に記載の操作された細菌細胞。

【請求項9】

前記第２の誘導性プロモーターは、Ｐ_ｔａｃである、請求項８に記載の操作された細菌細胞。

【請求項10】

前記細菌ゲノム内に組み込まれた外因性制限酵素をコードする遺伝子を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項11】

前記外因性制限酵素をコードする遺伝子は、第３の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項１０に記載の操作された細菌細胞。

【請求項12】

前記第３の誘導性プロモーターは、Ｐ_ｂａｄである、請求項１１に記載の操作された細菌細胞。

【請求項13】

前記細菌ゲノムは、前記外因性制限酵素についての認識配列を含まない、請求項１１又は１２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項14】

前記コーディング配列は、治療用遺伝子又は治療用核酸をコードする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項15】

前記コーディング配列は、真核生物配列である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項16】

前記複製起点は、前記環状ＤＮＡベクター内の唯一の細菌性配列である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項17】

前記操作された細菌細胞は、少なくとも２０コピーの前記環状ＤＮＡベクターを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項18】

前記操作された細菌細胞は、少なくとも２０回の細胞分裂を通じて前記環状ＤＮＡベクターを維持することができる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項19】

前記操作された細菌細胞は、１コピー以上の前記環状ＤＮＡベクター以外のゲノム外環状ＤＮＡ分子を一切含まない、請求項１～１８のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項20】

操作された細菌細胞当たりの前記環状ＤＮＡベクターの平均コピー数は、少なくとも１０である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞を複数含む培養物。

【請求項21】

少なくとも１０^７個の操作された細菌細胞を含む、請求項２０に記載の培養物。

【請求項22】

操作された細菌細胞であって、
（ａ）細菌ゲノム内に組み込まれた細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子と、
（ｂ）（ｉ）コーディング配列、及び前記細菌性複製タンパク質に依存する複製起点を含み、選択可能なマーカーを含まない、第１のセグメント、並びに（ｉｉ）選択可能なマーカーを含む第２のセグメントを含み、前記第１のセグメントが、少なくとも１つの外因性制限酵素又は外因性リコンビナーゼについての認識配列によって両側で挟まれている、プラスミドと、
を含む、操作された細菌細胞。

【請求項23】

前記第１のセグメントを両側で挟んでいる前記認識配列は、同じものである、請求項２２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項24】

前記第１のセグメントを両側で挟んでいる前記認識配列は、異なっている、請求項２２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項25】

前記第２のセグメントは、複製起点を更に含み、ここで、前記第２のセグメントにおける前記複製起点は、前記第１のセグメントにおける前記複製起点とオーソロガスである、請求項２２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項26】

前記複製起点は、５０塩基対未満の長さである、請求項２２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項27】

前記複製起点及び前記複製タンパク質は、ＣｏｌＥ２関連プラスミドに由来する、請求項２２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項28】

前記ＣｏｌＥ２関連プラスミドは、ＣｏｌＥ２－Ｐ９である、請求項２２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項29】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、第１の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項30】

前記第１の誘導性プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターである、請求項２９に記載の操作された細菌細胞。

【請求項31】

前記細菌ゲノム内に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（Ｔ７ＲＮＡＰ）を更に含む、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項32】

前記Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子は、第２の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項３１に記載の操作された細菌細胞。

【請求項33】

前記第２の誘導性プロモーターは、Ｐ_ｔａｃである、請求項３２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項34】

前記細菌ゲノム内に組み込まれた前記外因性制限酵素又は前記外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子を更に含む、請求項２２～３３のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項35】

前記外因性制限酵素又は前記外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、第３の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項３４に記載の操作された細菌細胞。

【請求項36】

前記第３の誘導性プロモーターは、Ｐ_ｂａｄである、請求項３５に記載の操作された細菌細胞。

【請求項37】

前記細菌ゲノムは、前記外因性制限酵素又は前記外因性リコンビナーゼについての認識配列を含まない、請求項２２～３６のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項38】

前記コーディング配列は、治療用遺伝子又は治療用核酸をコードする、請求項２２～３７のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項39】

前記コーディング配列は、真核生物配列である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項40】

前記外因性制限酵素又は前記外因性リコンビナーゼを更に含む、請求項２２～３９のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項41】

環状ＤＮＡベクターを作製する方法であって、
（ａ）細菌細胞内のプラスミドと外因性制限酵素とを接触させて前記プラスミドから第１のセグメントを切り出す工程と、
ここで、前記第１のセグメントは、前記外因性制限酵素についての認識配列によって両側で挟まれており、かつ前記第１のセグメントは、コーディング配列、及び細菌性複製タンパク質に依存する複製起点を含み、これによって相補的なオーバーハングを有する５’末端及び３’末端を含む、線状ＤＮＡ断片が生成される；
（ｂ）前記線状ＤＮＡ断片の５’末端及び３’末端を互いにライゲーションして前記環状ＤＮＡベクターを生成する工程と、
を含む、方法。

【請求項42】

工程（ａ）の前に、前記プラスミドは、選択可能なマーカーを含む第２のセグメントを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記第２のセグメントは、複製起点を更に含み、ここで、前記第２のセグメントにおける前記複製起点は、前記第１のセグメントにおける前記複製起点とオーソロガスである、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記第１のセグメントは、選択可能なマーカーを含まない、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記細胞内の前記プラスミドと前記外因性制限酵素との接触は、前記細胞内での前記外因性制限酵素の発現の誘導を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記外因性制限酵素をコードする遺伝子は、誘導性プロモーターと作動的に結合されて前記細菌ゲノム内に組み込まれている、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記誘導性プロモーターは、Ｐ_ｂａｄであり、かつ前記細胞内での前記外因性制限酵素の発現の誘導は、前記細胞へのアラビノースの供給を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記細胞内の前記プラスミドと前記外因性制限酵素との接触は、前記細菌細胞の外部から前記細胞内への前記外因性制限酵素の導入を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記ライゲーションは、外因性リガーゼによって行われる、請求項４１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記外因性リガーゼは、前記細菌ゲノム内に組み込まれた遺伝子から発現される、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記外因性リガーゼは、前記細菌細胞の外部から前記細菌細胞内に導入される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記細菌細胞は、前記ゲノム内に組み込まれた前記細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子を含む、請求項４１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、前記細菌性複製タンパク質を第１の発現レベル及び第２の発現レベルで発現することができる誘導性プロモーターに作動的に結合されており、ここで、前記第１の発現レベルは、前記第２の発現レベルよりも低い、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記細菌性複製タンパク質の前記第１の発現レベルにより前記複製起点が第１のコピー数で維持され、かつ前記細菌性複製タンパク質の前記第２の発現レベルにより前記複製起点が第２のコピー数で維持され、ここで、前記第１のコピー数は、細胞当たり５コピー未満、１０コピー未満、１５コピー未満、２０コピー未満、又は５０コピー未満であり、かつ前記第２のコピー数は、細胞当たり少なくとも２０コピー、少なくとも５０コピー、少なくとも１００コピー、又は少なくとも２００コピーである、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記細菌性複製遺伝子は、工程（ｂ）の前に前記第１の発現レベルで発現され、かつ工程（ｂ）の前に前記第２の発現レベルで発現されない、請求項５３に記載の方法。

【請求項56】

前記細菌性複製遺伝子は、工程（ｂ）の後に前記第２の発現レベルで発現される、請求項５４又は５５に記載の方法。

【請求項57】

前記誘導性プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに依存するＰＴ７である、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記細菌細胞は、前記ゲノム内に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（Ｔ７ＲＮＡＰ）を含む、請求項４１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子は、誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記誘導性プロモーターは、Ｐ_ｔａｃである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記プラスミドの前記第２のセグメントは、前記Ｐ_ｔａｃプロモーターからの発現を抑制することができるラクトース阻害タンパク質をコードするＬａｃＩ遺伝子を更に含み、かつ前記細菌性複製遺伝子の発現は、前記ラクトース阻害タンパク質の発現によって前記第１の発現レベル以下で維持される、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

工程（ｂ）の後に前記ラクトース阻害タンパク質の発現が減少し、それによって前記細菌性複製遺伝子が誘導されて前記第２の発現レベルで発現され、かつ前記環状ＤＮＡベクターが前記第２のコピー数で維持される、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記プラスミド上の前記選択可能なマーカーが継続的な成長に必要とされない条件下で前記細胞を培養し、それによって前記選択可能なマーカーを欠く前記細菌細胞の後代の集団を生成することを更に含む、請求項４１～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記集団は、少なくとも５０回の倍化の後に前記環状ＤＮＡベクターを細胞当たり少なくとも２０コピーの平均コピー数で維持する、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記環状ＤＮＡベクターを精製することを更に含む、請求項６３又は６４に記載の方法。

【請求項66】

前記複製起点は、５０塩基対未満の長さである、請求項４１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記複製起点及び前記複製タンパク質は、ＣｏｌＥ２関連プラスミドに由来する、請求項４１～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記ＣｏｌＥ２関連プラスミドは、ＣｏｌＥ２－Ｐ９である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

環状ＤＮＡベクターを作製する方法であって、
（ａ）請求項２２～４０のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞を得ることと、
（ｂ）前記プラスミドと前記外因性制限酵素とを接触させて、前記プラスミドの前記第１のセグメントを切り出し、それによって相補的なオーバーハングによって両側で挟まれた線状ＤＮＡ断片を生成することと、
（ｃ）前記線状ＤＮＡ断片をセルフライゲーションさせて、前記環状ＤＮＡベクターを生成することと、
を含む、方法。

【請求項70】

環状ＤＮＡベクターを作製する方法であって、
（ａ）請求項２２～４０のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞を得ることと、
（ｂ）前記プラスミドと、前記第１のセグメントを両側で挟んでいる前記認識配列を認識する前記外因性リコンビナーゼとを接触させることと、
を含む、方法。

【請求項71】

医薬組成物であって、
（ａ）請求項４１～７０のいずれか一項に記載の方法によって生産された環状ＤＮＡベクターと、
（ｂ）被験体に前記医薬組成物を送達する際に使用するのに適した担体と、
を含む、医薬組成物。

【請求項72】

コーディング配列、及び５０塩基対未満の長さである複製起点を含み、選択可能なマーカーを欠いている環状ＤＮＡベクターを含む、操作された細菌細胞。

【請求項73】

前記操作された細菌細胞は、１コピー以上の前記環状ＤＮＡベクター以外のゲノム外ＤＮＡ分子を一切含まない、請求項７２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項74】

前記操作された細菌細胞は、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含まない、請求項７２又は７３に記載の操作された細菌細胞。

【請求項75】

前記操作された細菌細胞は、ゲノム外ＤＮＡ分子上に選択可能なマーカーを含まない、請求項７２～７４のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項76】

前記複製起点は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９プラスミドに由来する、請求項７２～７５のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項77】

前記複製起点を認識する細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子を更に含む、請求項７２～７６のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項78】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９プラスミドに由来する、請求項７７に記載の操作された細菌細胞。

【請求項79】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、前記細菌ゲノム内に組み込まれている、請求項７７又は７８に記載の操作された細菌細胞。

【請求項80】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項７７～７９のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項81】

前記環状ＤＮＡベクターは、組換え部位を更に含む、請求項７２～８０のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項82】

前記環状ＤＮＡベクターは、前記複製起点及び存在する場合には前記組換え部位の他に細菌性（又は他の原核生物若しくはファージ）配列を一切含まない、請求項７２～８１のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項83】

前記複製起点及び前記組換え部位は、合わせて９０塩基対以下の長さである、請求項８１に記載の操作された細菌細胞。

【請求項84】

リコンビナーゼをコードする遺伝子を更に含む、請求項７２～８３のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項85】

前記細菌細胞は、少なくとも１０コピーの前記環状ＤＮＡベクターを含む、請求項７２～８３のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項86】

操作された細菌細胞であって、
（ａ）コーディング配列、及び５０塩基対未満の長さである複製起点を含み、選択可能なマーカーを含まない、第１のセグメントと、
（ｂ）選択可能なマーカーを含む第２のセグメントと、
を含み、前記第１のセグメントが、外因性リコンビナーゼについての認識配列によって両側で挟まれている、プラスミドを含む、操作された細菌細胞。

【請求項87】

前記複製起点を認識する細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子をコードする遺伝子を更に含む、請求項８６に記載の操作された細菌細胞。

【請求項88】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、前記細菌ゲノム内に組み込まれている、請求項８７に記載の操作された細菌細胞。

【請求項89】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、第１の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項８７又は８８に記載の操作された細菌細胞。

【請求項90】

前記複製起点及び前記複製タンパク質は、ＣｏｌＥ２関連プラスミドに由来する、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項91】

前記ＣｏｌＥ２関連プラスミドは、ＣｏｌＥ２－Ｐ９である、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項92】

前記外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子を更に含む、請求項８６～９１のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項93】

前記外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、前記細菌ゲノム内に組み込まれている、請求項９２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項94】

前記外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、プラスミド又は細菌人工染色体上にある、請求項９２に記載の操作された細菌細胞。

【請求項95】

前記外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、第２の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項９２～９４のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項96】

前記第２の誘導性プロモーターは、クミン酸誘導性プロモーターである、請求項９５に記載の操作された細菌細胞。

【請求項97】

前記リコンビナーゼは、Ｂｘｂ１である、請求項９２～９６のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞。

【請求項98】

前記認識配列は、ａｔｔＰ－ＧＡ及びａｔｔＢ－ＧＡを含む、請求項９７に記載の操作された細菌細胞。

【請求項99】

環状ＤＮＡベクターを作製する方法であって、請求項８６～９８のいずれか一項に記載の操作された細菌細胞において前記プラスミドの組換えを誘導することを含む、方法。

【請求項100】

前記プラスミドの組換えの誘導は、前記操作された細菌細胞における前記外因性リコンビナーゼの発現の誘導を含む、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

環状ＤＮＡベクターを生産する方法であって、操作された細菌細胞においてプラスミドの組換えを誘導することを含み、ここで、
（ａ）前記プラスミドは、
（ｉｉ）コーディング配列、及び５０塩基対未満の長さである複製起点を含み、選択可能なマーカーを含まない、第１のセグメントと、
ここで、前記第１のセグメントは、外因性リコンビナーゼについての認識配列によって両側で挟まれている；
（ｉｉ）選択可能なマーカーを含む第２のセグメントと、
を含み、かつ、
（ｂ）前記操作された細菌細胞は、前記外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、ここで、前記誘導により前記プラスミドの組換えが引き起こされ、それによって前記第１のセグメントを含む前記環状ＤＮＡベクターが生産される、方法。

【請求項102】

前記操作された細菌細胞は、前記複製起点を認識する細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子を更に含む、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、前記細菌ゲノム内に組み込まれている、請求項１０１又は１０２に記載の方法。

【請求項104】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、第１の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項１０２又は１０３に記載の方法。

【請求項105】

前記複製起点は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９複製起点である、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記Ｒｅｐ遺伝子は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９ Ｒｅｐ遺伝子である、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記外因性リコンビナーゼは、プラスミド又は細菌人工染色体上にある、請求項１０１～１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、第２の誘導性プロモーターに作動的に結合されている、請求項１０１～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

前記プラスミドの組換えの誘導は、前記外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子の発現の誘導を含む、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記プラスミドの組換えの誘導は、前記プラスミドの前記操作された細菌細胞内への導入を含み、ここで、前記導入時に、前記外因性リコンビナーゼが前記操作された細菌細胞内で発現される、請求項１０１～１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

前記外因性リコンビナーゼは、前記導入時に非誘導レベルで発現される、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記外因性リコンビナーゼは、Ｂｘｂ１であり、かつ前記認識配列は、ａｔｔＰ－ＧＡ及びａｔｔＢ－ＧＡを含む、請求項１０１～１１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項113】

Ｂｘｂ１をコードする遺伝子は、クミン酸誘導性プロモーターに作動的に結合されており、前記操作された細菌細胞は、前記導入時にクミン酸の不存在下で維持され、かつ前記Ｂｘｂ１は、前記導入時に非誘導レベルで発現される、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

医薬組成物であって、
（ａ）請求項９９～１１３のいずれか一項に記載の方法によって生産された環状ＤＮＡベクターと、
（ｂ）被験体に前記医薬組成物を送達する際に使用するのに適した担体と、
を含む、医薬組成物。

【請求項115】

環状ＤＮＡベクターであって、
（ａ）真核生物プロモーターと、
（ｂ）真核生物コーディング配列と、
（ｃ）５０ｂｐ未満の長さである細菌性複製起点と、
を含み、ここで、前記環状ＤＮＡベクターは、選択可能なマーカーを欠いている、環状ＤＮＡベクター。

【請求項116】

前記真核生物コーディング配列の３’末端は、前記細菌性複製起点を含む配列によって前記プロモーターの５’末端に連結されており、ここで、前記細菌性複製起点を含む配列は、１００ｂｐ未満の長さである、請求項１１５に記載の環状ＤＮＡベクター。

【請求項117】

医薬組成物であって、
（ｄ）請求項１１５又は１１６に記載の環状ＤＮＡベクターと、
（ｅ）被験体に前記医薬組成物を送達する際に使用するのに適した担体と、
を含む、医薬組成物。

【請求項118】

請求項１１５又は１１６に記載の環状ＤＮＡベクターを含む、宿主細胞。

【請求項119】

前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１１８に記載の宿主細胞。

【請求項120】

前記宿主細胞は、ヒト細胞である、請求項１１８又は１１９に記載の宿主細胞。

【請求項121】

前記宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分離されている、請求項１１７～１２０のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［相互参照］
本出願は、２０２１年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／２９１，８７１号の利益を主張し、この全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

【0002】

概して、本開示は、操作された細菌内の治療用ベクターを含む。

【背景技術】

【0003】

遺伝子療法は、ヒト患者における多岐にわたる疾患及び障害を治療する有望な手法として浮上しつつある。組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにより、ヒト患者及び様々なモデル系における高効率の遺伝子導入の実績が確立されている。ｒＡＡＶベクターのゲノムは、これらが標的細胞の寿命にわたってｉｎ ｖｉｖｏで環状エピソームとして残存することができるという利点がある。一方、ｒＡＡＶベースのベクターには、最大ペイロードの制限、免疫原性、及び製造の非効率性等の大きな不利点がある。

【0004】

ｒＡＡＶ技術におけるこれらの課題の一部に対処するのに、近年、非ウイルス性の代替手段が勢いを増している。しかしながら、ｒＡＡＶの効率性及び残存性を備えた拡張可能な非ウイルス性遺伝子療法プラットフォームの開発は難しいことが分かっている。例えば、従来の細菌性プラスミドＤＮＡベクターは、遺伝子送達における汎用性のあるツールではあるが、抗生物質耐性遺伝子及び転写制御エレメント等のプラスミドＤＮＡベクターの細菌性構成要素を豊富に有するため、免疫原性及び転写サイレンシングによる遺伝子発現の喪失につながる可能性があるという点で制限される。

【0005】

バックボーン構成要素を除去することによりプラスミドＤＮＡベクターを改良する様々な取り組みにもかかわらず、最小限の細菌性エレメントを有する非ウイルス性のベクター及びそれらを大規模に効率的に生産する方法が求められている。

【発明の概要】

【0006】

本明細書において、細菌によって生産される環状ＤＮＡベクター（例えば、治療用環状ＤＮＡベクター）、及び親プラスミド、例えば、細菌細胞（例えば、操作された細菌細胞）内の親プラスミドから、環状ＤＮＡベクターを生産するのに使用することができる細菌細胞（例えば、操作された細菌細胞）が開示されている。本明細書において提供される治療用環状ＤＮＡベクターは、小さな（例えば、５０塩基対未満の）複製起点を含み、かつ選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を欠いていることから、ベクター内の外来配列によって引き起こされるリスクが軽減され得る。そのため、このような細菌によって生産される環状ＤＮＡベクターを治療用途向けに効率的かつ大規模に生産することができる。

【0007】

本明細書に開示される実施の形態には、（ａ）細菌ゲノム内に組み込まれた細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子と、（ｂ）（ｉ）コーディング配列、及び（ｉｉ）複製タンパク質に依存する複製起点を含む環状ＤＮＡベクターとを含み、環状ＤＮＡベクターが選択可能なマーカーを含まない、操作された細菌細胞が含まれる。幾つかの実施の形態において、複製起点は、５０塩基対未満の長さである。幾つかの実施の形態において、複製起点及び複製タンパク質は、ＣｏｌＥ２関連プラスミドに由来する。幾つかの実施の形態において、ＣｏｌＥ２関連プラスミドは、ＣｏｌＥ２－Ｐ９である。

【0008】

幾つかの実施の形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、第１の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。幾つかの実施の形態において、第１の誘導性プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターである。幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、細菌ゲノム内に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（Ｔ７ＲＮＡＰ）を更に含む。幾つかの実施の形態において、Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子は、第２の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。幾つかの実施の形態において、第２の誘導性プロモーターは、Ｐ_ｔａｃである。

【0009】

幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、細菌ゲノム内に組み込まれた外因性制限酵素をコードする遺伝子を更に含む。幾つかの実施の形態において、外因性制限酵素をコードする遺伝子は、第３の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。幾つかの実施の形態において、第３の誘導性プロモーターは、Ｐ_ｂａｄである。幾つかの実施の形態において、細菌ゲノムは、外因性制限酵素についての認識配列を含まない。

【0010】

幾つかの実施の形態において、環状ＤＮＡベクターをコードするコーディング配列は、治療用遺伝子又は治療用核酸を含む。幾つかの実施の形態において、コーディング配列は真核生物配列（例えば、哺乳動物細胞において発現可能な配列）である。

【0011】

幾つかの実施の形態において、複製起点は、環状ＤＮＡベクター内の唯一の細菌性配列である。

【0012】

幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、少なくとも２０コピーの環状ＤＮＡベクターを含む。幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、少なくとも２０回の細胞分裂を通じて環状ＤＮＡベクターを維持することができる。

【0013】

幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、１コピー以上の環状ＤＮＡベクター以外のゲノム外環状ＤＮＡ分子を一切含まない。

【0014】

本明細書に開示される実施の形態には、本明細書に記載される操作された細菌細胞のいずれかを複数含む培養物であって、操作された細菌細胞当たりの環状ＤＮＡベクターの平均コピー数が少なくとも１０である、培養物が含まれる。幾つかの実施の形態において、培養物は少なくとも１０^７個の操作された細菌細胞を含む。

【0015】

本明細書に開示される実施の形態には、操作された細菌細胞であって、（ａ）細菌ゲノム内に組み込まれた細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子と、（ｂ）（ｉ）コーディング配列、及び細菌性複製タンパク質に依存する複製起点を含み、選択可能なマーカーを含まない、第１のセグメント、並びに（ｉｉ）選択可能なマーカーを含む第２のセグメントを含み、第１のセグメントが、少なくとも１つの外因性制限酵素又は外因性リコンビナーゼについての認識配列によって両側で挟まれている、プラスミドとを含む、操作された細菌細胞が含まれる。幾つかの実施の形態において、第１のセグメントを両側で挟んでいる認識配列は、同じものである。幾つかの実施の形態において、第１のセグメントを両側で挟んでいる認識配列は、異なっている。幾つかの実施の形態において、第２のセグメントは、複製起点を更に含み、ここで、第２のセグメントにおける複製起点は、第１のセグメントにおける複製起点とオーソロガスである。

【0016】

幾つかの実施の形態において、複製起点は、５０塩基対未満の長さである。幾つかの実施の形態において、複製起点及び複製タンパク質は、ＣｏｌＥ２関連プラスミドに由来する。幾つかの実施の形態において、ＣｏｌＥ２関連プラスミドは、ＣｏｌＥ２－Ｐ９である。

【0017】

幾つかの実施の形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、第１の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。幾つかの実施の形態において、第１の誘導性プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターである。幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、細菌ゲノム内に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（Ｔ７ＲＮＡＰ）を更に含む。幾つかの実施の形態において、Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子は、第２の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。幾つかの実施の形態において、第２の誘導性プロモーターは、Ｐ_ｔａｃである。

【0018】

幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、細菌ゲノム内に組み込まれた外因性制限酵素又は外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子を更に含む。幾つかの実施の形態において、外因性制限酵素又は外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、第３の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。幾つかの実施の形態において、第３の誘導性プロモーターは、Ｐ_ｂａｄである。幾つかの実施の形態において、細菌ゲノムは、外因性制限酵素又は外因性リコンビナーゼについての認識配列を含まない。

【0019】

幾つかの実施の形態において、第１のセグメントのコーディング配列は治療用遺伝子又は治療用核酸をコードする。幾つかの実施の形態において、コーディング配列は真核生物配列（例えば、哺乳動物細胞において発現可能な配列）である。

【0020】

幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、外因性制限酵素又は外因性リコンビナーゼを更に含む。

【0021】

本明細書に開示される実施の形態には、環状ＤＮＡベクターを作製する方法であって、（ａ）細菌細胞内のプラスミドと外因性制限酵素とを接触させてプラスミドから第１のセグメントを切り出す工程と、ここで、第１のセグメントは、外因性制限酵素についての認識配列によって両側で挟まれており、かつ第１のセグメントは、コーディング配列、及び細菌性複製タンパク質に依存する複製起点を含み、これによって相補的なオーバーハングを有する５’末端及び３’末端を含む、線状ＤＮＡ断片が生成される；（ｂ）線状ＤＮＡ断片の５’末端及び３’末端を互いにライゲーションして環状ＤＮＡベクターを生成する工程とを含む、方法が含まれる。幾つかの実施の形態において、工程（ａ）の前に、プラスミドは、選択可能なマーカーを含む第２のセグメントを含む。幾つかの実施の形態において、第２のセグメントは、複製起点を更に含み、ここで、第２のセグメントにおける複製起点は、第１のセグメントにおける複製起点とオーソロガスである。幾つかの実施の形態において、第１のセグメントは、選択可能なマーカーを含まない。

【0022】

幾つかの実施の形態において、細胞内のプラスミドと外因性制限酵素との接触は、細胞内での外因性制限酵素の発現の誘導を含む。幾つかの実施の形態において、外因性制限酵素をコードする遺伝子は、誘導性プロモーターと作動的に結合されて細菌ゲノム内に組み込まれている。幾つかの実施の形態において、誘導性プロモーターは、Ｐ_ｂａｄであり、かつ細胞内での外因性制限酵素の発現の誘導は、細胞へのアラビノースの供給を含む。幾つかの実施の形態において、細胞内のプラスミドと外因性制限酵素との接触は、細菌細胞の外部から細胞内への外因性制限酵素の導入を含む。

【0023】

幾つかの実施の形態において、ライゲーションは、外因性リガーゼによって行われる。幾つかの実施の形態において、外因性リガーゼは、細菌ゲノム内に組み込まれた遺伝子から発現される。幾つかの実施の形態において、外因性リガーゼは、細菌細胞の外部から細菌細胞内に導入される。

【0024】

幾つかの実施の形態において、細菌細胞は、ゲノム内に組み込まれた細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子を含む。幾つかの実施の形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、細菌性複製タンパク質を第１の発現レベル及び第２の発現レベルで発現することができる誘導性プロモーターに作動的に結合されており、ここで、第１の発現レベルは、第２の発現レベルよりも低い。幾つかの実施の形態において、細菌性複製タンパク質の第１の発現レベルにより複製起点が第１のコピー数で維持され、かつ細菌性複製タンパク質の第２の発現レベルにより複製起点が第２のコピー数で維持され、ここで、第１のコピー数は、細胞当たり５コピー未満、１０コピー未満、１５コピー未満、２０コピー未満、又は５０コピー未満であり、かつ第２のコピー数は、細胞当たり少なくとも２０コピー、少なくとも５０コピー、少なくとも１００コピー、又は少なくとも２００コピーである。幾つかの実施の形態において、細菌性複製遺伝子は、工程（ｂ）の前に第１の発現レベルで発現され、かつ工程（ｂ）の前に第２の発現レベルで発現されない。幾つかの実施の形態において、細菌性複製遺伝子は、工程（ｂ）の後に第２の発現レベルで発現される。幾つかの実施の形態において、誘導性プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに依存するＰＴ７である。幾つかの実施の形態において、細菌細胞は、ゲノム内に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（Ｔ７ＲＮＡＰ）を含む。幾つかの実施の形態において、Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子は、誘導性プロモーターに作動的に結合されている。幾つかの実施の形態において、誘導性プロモーターは、Ｐ_ｔａｃである。幾つかの実施の形態において、プラスミドの第２のセグメントは、Ｐ_ｔａｃプロモーターからの発現を抑制することができるラクトース阻害タンパク質をコードするＬａｃＩ遺伝子を更に含み、かつ細菌性複製遺伝子の発現は、ラクトース阻害タンパク質の発現によって第１の発現レベル以下で維持される。幾つかの実施の形態において、工程（ｂ）の後にラクトース阻害タンパク質の発現が減少し、それによって細菌性複製遺伝子が誘導されて第２の発現レベルで発現され、かつ環状ＤＮＡベクターが第２のコピー数で維持される。

【0025】

幾つかの実施の形態において、環状ＤＮＡベクターを作製する方法は、プラスミド上の選択可能なマーカーが継続的な成長に必要とされない条件下で細胞を培養し、それによって選択可能なマーカーを欠く細菌細胞の後代の集団を生成することを更に含む。幾つかの実施の形態において、上記集団は少なくとも５０回の倍化の後も環状ＤＮＡベクターを維持する。幾つかの実施の形態において、上記集団は、少なくとも１００回の倍化、例えば、少なくとも１５０回の倍化、少なくとも２００回の倍化、少なくとも２５０回の倍化、又は少なくとも２９０回の倍化の後も環状ＤＮＡベクターを維持する。幾つかの実施の形態において、上記集団は、少なくとも５０回の倍化の後も環状ＤＮＡベクターを細胞当たり少なくとも２０コピーの平均コピー数で維持する。幾つかの実施の形態において、上記集団は、少なくとも１００回の倍化の後も環状ＤＮＡベクターを細胞当たり少なくとも２０コピーの平均コピー数で維持する。幾つかの実施の形態において、上記集団は、少なくとも１５０回の倍化、少なくとも２００回の倍化、少なくとも２５０回の倍化、又は少なくとも２９０回の倍化の後も環状ＤＮＡベクターを細胞当たり少なくとも２０コピーの平均コピー数で維持する。幾つかの実施の形態において、上記方法は環状ＤＮＡベクターを精製することを更に含む。

【0026】

幾つかの実施の形態において、複製起点は５０塩基対未満の長さ（例えば、４５塩基対未満の長さ、又は約４０塩基対の長さ）である。幾つかの実施の形態において、複製起点及び複製タンパク質はＣｏｌＥ２関連プラスミドに由来する。幾つかの実施の形態において、ＣｏｌＥ２関連プラスミドはＣｏｌＥ２－Ｐ９である。幾つかの実施の形態において、複製起点は、配列番号２（又は逆相補鎖）又はその機能的変異体（例えば、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、配列番号２と少なくとも９２％の配列同一性、配列番号２と少なくとも９４％の配列同一性、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性、配列番号２と少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２と少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２と１００％の配列同一性）を有する機能的変異体）を含むか、又はそれらからなる。幾つかの実施の形態において、複製起点は、配列番号３（又は逆相補鎖）又はその機能的変異体（例えば、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、配列番号３と少なくとも９２％の配列同一性、配列番号３と少なくとも９４％の配列同一性、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性、配列番号３と少なくとも９６％の配列同一性、配列番号３と少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号３と１００％の配列同一性）を有する機能的変異体）を含むか、又はそれらからなる。幾つかの実施の形態において、複製起点は、配列番号４（又は逆相補鎖）又はその機能的変異体（例えば、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、配列番号４と少なくとも９２％の配列同一性、配列番号４と少なくとも９４％の配列同一性、配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性、配列番号４と少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４と少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４と少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４と１００％の配列同一性）を有する機能的変異体）を含むか、又はそれらからなる。

【0027】

本明細書に開示される実施の形態には、環状ＤＮＡベクターを作製する方法であって、（ａ）コーディング配列、及び細菌性複製タンパク質に依存する複製起点を含む第１のセグメントを含む親プラスミドを含む、本明細書に記載される操作された細菌細胞のいずれかを得ることと、ここで、第１のセグメントは選択可能なマーカーを含まず、かつ第１のセグメントは少なくとも１種の外因性制限酵素についての認識配列によって両側で挟まれている；（ｂ）該プラスミドと外因性制限酵素とを接触させて、該プラスミドの第１のセグメントを切り出し、それによって相補的なオーバーハングによって両側で挟まれた線状ＤＮＡフラグメントを生成することと、（ｃ）線状ＤＮＡフラグメントをセルフライゲーションさせて環状ＤＮＡベクターを生成することとを含む、方法が含まれる。

【0028】

本明細書に開示される実施の形態には、環状ＤＮＡベクターを作製する方法であって、（ａ）コーディング配列、及び細菌性複製タンパク質に依存する複製起点を含む第１のセグメントを含む親プラスミドを含む本明細書に記載される操作された細菌細胞のいずれかを得ることと、ここで、第１のセグメントは選択可能なマーカーを含まず、かつ第１のセグメントは少なくとも１種の外因性リコンビナーゼについての認識配列によって両側で挟まれている；（ｂ）該プラスミドと第１のセグメントを両側で挟んでいる認識配列を認識する外因性リコンビナーゼとを接触させることとを含む、方法が含まれる。

【0029】

本明細書に開示される実施の形態には、医薬組成物であって、（ａ）本明細書に記載される方法のいずれかによって生産された環状ＤＮＡベクターと、（ｂ）被験体に医薬組成物を送達する際に使用するのに適した担体とを含む、医薬組成物が含まれる。

【0030】

別の態様において、コーディング配列、及び５０塩基対未満の長さである複製起点を含み、選択可能なマーカーを欠いている環状ＤＮＡベクターを含む操作された細菌細胞（例えば、Ｅ．コリ（E. coli））が提供される。幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、１コピー以上の環状ＤＮＡベクター以外にゲノム外ＤＮＡ分子を一切含まない。幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含まない。幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、ゲノム外ＤＮＡ分子上に選択可能なマーカーを含まない。幾つかの実施の形態において、複製起点はＣｏｌＥ２関連プラスミド（例えば、ＣｏｌＥ２－Ｐ９プラスミド）に由来する。幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、複製起点を認識する細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子を更に含む（例えば、Ｒｅｐ遺伝子はＣｏｌＥ２－Ｐ９プラスミド（例えば、配列番号１）に由来する）。幾つかの実施の形態において、Ｒｅｐ遺伝子は細菌ゲノム内に組み込まれている。幾つかの実施の形態において、Ｒｅｐ遺伝子は誘導性プロモーターに作動的に結合されている。

【0031】

幾つかの実施の形態において、環状ＤＮＡベクターは、組換え部位（例えば、ａｔｔＬ部位（例えば、ａｔｔＬ－ＧＡ）又はａｔｔＲ部位）を更に含む。

【0032】

幾つかの実施の形態において、環状ＤＮＡベクターは、複製起点及び存在する場合には組換え部位の他に細菌性（又は他の原核生物若しくはファージ）配列を一切含まない。幾つかの実施の形態において、複製起点及び組換え部位は、合わせて９０塩基対以下の長さである。

【0033】

幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、リコンビナーゼをコードする遺伝子を更に含む。

【0034】

幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、少なくとも１０コピーの環状ＤＮＡベクターを含む。

【0035】

別の態様において、操作された細菌細胞であって、（ａ）コーディング配列、及び５０塩基対未満の長さである複製起点を含み、選択可能なマーカーを含まない、第１のセグメントと、（ｂ）選択可能なマーカーを含む第２のセグメントとを含み、第１のセグメントが、外因性リコンビナーゼについての認識配列によって両側で挟まれている、プラスミドを含む、操作された細菌細胞が本明細書において提供される。幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、複製起点を認識する細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子をコードする遺伝子を更に含む。幾つかの実施の形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、細菌ゲノム内に組み込まれている。幾つかの実施の形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、第１の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。

【0036】

幾つかの実施の形態において、複製起点及び複製タンパク質は、ＣｏｌＥ２関連プラスミド、例えばＣｏｌＥ２－Ｐ９に由来する。

【0037】

幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子を更に含む。幾つかの実施の形態において、外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、細菌ゲノム内に組み込まれている。幾つかの実施の形態において、外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、プラスミド又は細菌人工染色体上にある。幾つかの実施の形態において、外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、第２の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。幾つかの実施の形態において、第２の誘導性プロモーターは、クミン酸誘導性プロモーターである。

【0038】

幾つかの実施の形態において、リコンビナーゼは、Ｂｘｂ１である。幾つかの実施の形態において、認識配列は、ａｔｔＰ－ＧＡ及びａｔｔＢ－ＧＡを含む。

【0039】

別の態様において、環状ＤＮＡベクターを作製する方法であって、上述の態様のいずれか１つの操作された細菌細胞内のプラスミドの組換えを誘導することを含む、方法が本明細書において提供される。幾つかの実施の形態において、プラスミドの組換えの誘導は、操作された細菌細胞における外因性リコンビナーゼの発現の誘導を含む。

【0040】

別の態様において、環状ＤＮＡベクターを生産する方法であって、操作された細菌細胞においてプラスミドの組換えを誘導することを含み、ここで、（ａ）プラスミドは、（ｉ）コーディング配列、及び５０塩基対未満の長さである複製起点を含み、選択可能なマーカーを含まない、第１のセグメントと、ここで、第１のセグメントは、外因性リコンビナーゼについての認識配列によって両側で挟まれている；（ｉｉ）選択可能なマーカーを含む第２のセグメントとを含み、かつ、（ｂ）操作された細菌細胞は、外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、ここで、誘導によりプラスミドの組換えが引き起こされ、それによって第１のセグメントを含む環状ＤＮＡベクターが生産される、方法が提供される。

【0041】

幾つかの実施の形態において、操作された細菌細胞は、複製起点を認識する細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子を更に含む。幾つかの実施の形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、細菌ゲノム内に組み込まれている。幾つかの実施の形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、第１の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。

【0042】

幾つかの実施の形態において、複製起点は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９複製起点であり、及び／又はＲｅｐ遺伝子は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９ Ｒｅｐ遺伝子である。

【0043】

幾つかの実施の形態において、外因性リコンビナーゼは、プラスミド又は細菌人工染色体上にある。幾つかの実施の形態において、外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、第２の誘導性プロモーターに作動的に結合されている。

【0044】

幾つかの実施の形態において、プラスミドの組換えの誘導は、外因性リコンビナーゼをコードする遺伝子の発現の誘導を含む。幾つかの実施の形態において、プラスミドの組換えの誘導は、プラスミドの操作された細菌細胞内への導入を含み、ここで、導入時に、外因性リコンビナーゼが操作された細菌細胞内で発現される。幾つかの実施の形態において、外因性リコンビナーゼは、導入時に非誘導レベルで発現される。

【0045】

幾つかの実施の形態において、外因性リコンビナーゼは、Ｂｘｂ１であり、かつ認識配列は、ａｔｔＰ－ＧＡ及びａｔｔＢ－ＧＡを含む。幾つかの実施の形態において、Ｂｘｂ１をコードする遺伝子は、クミン酸誘導性プロモーターに作動的に結合されており、操作された細菌細胞は、導入時にクミン酸の不存在下で維持され、かつＢｘｂ１は、導入時に非誘導レベルで発現される。

【0046】

別の態様において、（ａ）真核生物プロモーター、（ｂ）真核生物コーディング配列、及び（ｃ）５０ｂｐ未満の長さである細菌性複製起点を含み、選択可能なマーカーを欠いている環状ＤＮＡベクター（例えば、操作された環状ＤＮＡベクター）が提供される。幾つかの実施の形態において、真核生物コーディング配列の３’末端は、細菌性複製起点を含む配列によってプロモーターの５’末端に連結されており、ここで、細菌性複製起点を含む配列は１００ｂｐ未満の長さである。幾つかの実施の形態において、環状ＤＮＡベクターは単量体スーパーコイル状である。

【0047】

別の態様において、（ａ）真核生物プロモーター、（ｂ）真核生物コーディング配列、及び（ｃ）５０ｂｐ未満の長さである細菌性複製起点を含み、選択可能なマーカーを欠いている環状ＤＮＡベクターを含む医薬組成物が提供される。幾つかの実施の形態において、真核生物コーディング配列の３’末端は、細菌性複製起点を含む配列によってプロモーターの５’末端に連結されており、ここで、細菌性複製起点を含む配列は１００ｂｐ未満の長さであり、かつ医薬組成物を被験体に送達する際に使用するのに適した担体。

【0048】

別の態様において、（ａ）真核生物プロモーター、（ｂ）真核生物コーディング配列、及び（ｃ）５０ｂｐ未満の長さである細菌性複製起点を含み、選択可能なマーカーを欠いている環状ＤＮＡベクターを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）が提供される。幾つかの実施の形態において、真核生物コーディング配列の３’末端は、細菌性複製起点を含む配列によってプロモーターの５’末端に連結されており、ここで、細菌性複製起点を含む配列は１００ｂｐ未満の長さである。幾つかの実施の形態において、宿主細胞はコーディング配列によってコードされるタンパク質を発現する。幾つかの実施の形態において、宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで分離されている。幾つかの実施の形態において、環状ＤＮＡベクターはエレクトロポレーションによって宿主細胞内にトランスフェクションされる。

【0049】

本開示の特徴は添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本開示の特徴及び利点は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態及び添付の図面を参照することによってより良好に理解される。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】Ｅ．コリの拡大培養に対してプラスミドに安定性を与える能力について３つのＣｏｌＥ２－Ｐ９複製起点を試験した安定性研究からの結果を示す表を示す図である。

【図2】本明細書に開示される実施形態において使用することができる親プラスミドをアセンブリする方法の一例を示す図である。

【図3】本明細書に開示される実施形態に従って試験環状ＤＮＡベクターを生産する実験手順を示す図である。

【図4】クロラムフェニコールを含む（「Ｃｍ」、レーン７～レーン１２）又はクロラムフェニコールを含まない（「Ｃｍなし」、レーン１～レーン６）富栄養培地中で成長させた操作された細菌から精製された染色体外ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。レーン２、レーン３、レーン５、レーン８、レーン９、及びレーン１１は、試験親プラスミドからの組換えによって生産された試験環状ＤＮＡベクターに対応するバンドを示している。レーン１、レーン４、レーン７、及びレーン１０は、試験親プラスミドに対応するバンドを示している。

【図5】クロラムフェニコール（「Ｃｍ」）を含む場合又は含まない場合の示された成長培地中のｓｆＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示すグラフを示す図である。ＺＢ＝Ｚｙｍｏブロス、ＴＢ＝Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス、ＳＢ＝Ｓｕｐｅｒブロス、ＳＯＢ＝Ｓｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌブロス、ＳＯＣ＝カタボライト抑制を伴うＳｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌブロス（Super Optimal Broth with Catabolite Repression）、ＬＢ＝Ｌｕｒｉａブロス。

【図6】対抗選択を使用して本発明の環状ＤＮＡベクターを生産する例示的なプロセスを示す図式チャートを示す図である。

【図7A-7F】細菌人工染色体（ＢＡＣ）に基づいてＢｘｂ１を発現させて環状ＤＮＡベクターを生産する方法の内容を示す概略図である。図７Ａは、宿主ゲノム内に組み込まれたＲｅｐ遺伝子である。図７Ｂ及び図７Ｃは２つの代替的なＢＡＣ設計である。図７ＢのＢｘｂ１はクミン酸誘導性プロモーターによって駆動されるのに対し、図７ＣのＢｘｂ１はアラビノース誘導性プロモーターによって駆動される。図７Ｄは、テンプレートプラスミドであり、これは、Ｂｘｂ１による組換えにより図７Ｅの環状ＤＮＡベクター及び図７Ｆの副産物となる。環状ＤＮＡベクターは複製起点を含み、（任意に）副産物はＰｈｅＳ対抗選択マーカーを含むため、宿主細菌が複製され拡大培養されるにつれて、環状ＤＮＡベクターが優勢な種となる。

【図8A-8B】ＢＡＣ１６９６を使用した形質転換後、それぞれ２４時間及び７２時間の時点でのクローンの蛍光を示す写真を示す図である。

【図9A-9B】ＢＡＣ１６９７を使用した形質転換後、それぞれ２４時間及び７２時間の時点でのクローンの蛍光を示す写真を示す図である。

【図10】クミン酸誘導物質との接触から２４時間後のクローンの蛍光を示す一式の写真を示す図である。

【図11】アラビノース誘導物質との接触から２４時間後のクローンの蛍光を示す一式の写真を示す図である。

【図12】ＬＢ寒天プレート上で様々な条件下にて一晩インキュベートされた再画線された１６９６コロニーの蛍光を示す一連の写真を示す図である。

【図13】ＬＢ寒天プレート上で様々な条件下にて一晩インキュベートされた再画線された１６９７コロニーの蛍光を示す一連の写真を示す図である。

【図14】１６９６及び１６９７の両方についての対抗選択された培養物中に環状ＤＮＡベクターが存在することを示すゲル電気泳動実験の写真を示す図である。理論的なバンドを示す消化マップが写真の左側に示されている。

【図15A】例示的なＡＢＣＡ４テンプレートプラスミドのプラスミドマップを示す図である。

【図15B】図１５Ａのテンプレートプラスミドから得られるＡＢＣＡ４環状ＤＮＡベクターのプラスミドマップを示す図である。

【図16A】実施例７に記載される環状ＤＮＡコンストラクト消化物についてのバンド形成パターンを示す理論的なゲルマップを示す図である。

【図16B】図１６Ａに対応する実際のバンド形成パターンを示すゲルの写真を示す図である。

【図17A】テンプレートプラスミドと一緒での２時間のＫａｎ耐性インキュベーションを使用して生産された精製されたＡＢＣＡ４環状ＤＮＡベクターからのロングリードシーケンシングデータを示すヒストグラムを示す図である。主ピークはＢＡＣ及び二量体環状ＤＮＡベクターである。

【図17B】テンプレートプラスミドと一緒での一晩のＫａｎ耐性インキュベーションを使用して生産された精製されたＡＢＣＡ４環状ＤＮＡベクターからのロングリードシーケンシングデータを示すヒストグラムを示す図である。主ピークは単量体環状ＤＮＡベクター及びＢＡＣである。

【図18】細菌宿主においてＢｘｂ１を発現するのに有用なヘルパープラスミドの構成要素を示すプラスミドマップを示す図である。

【図19】図１８のヘルパープラスミドによるＢｘｂ１発現の結果としての、バックボーン副産物を含まない環状ＤＮＡベクターを含む緑色蛍光コロニー（丸で囲んだ）を示す写真を示す図である。

【図20】Ｂｘｂ１を宿主細胞ゲノム内に組み込むプロセスを示す一式の図である。

【図21】Ｂｘｂ１の組込みについての２つの陽性クローンを示すゲルの写真を示す図である。１６９６プラスミドコントロールが左下に３連で示されている。

【図22】細菌によって生産されるＡＢＣＡ４環状ＤＮＡベクターでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞がＡＢＣＡ４タンパク質を発現することを示すウェスタンブロットの写真を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0051】

本明細書において、操作された細菌細胞内の親プラスミドから環状ＤＮＡベクターを生産する改良された方法、及び関連する組成物が提供される。過去には、バックボーン構成要素を除去することによってプラスミドＤＮＡベクターを改良する取り組みがあった。例えば、組換えを使用してプラスミドからバックボーンを除去し、ミニサークルベクター及び環状バックボーン副産物を生成することで、細菌細胞内でミニサークルを作製する。しかしながら、ミニサークルは、それを単離するのに、類似の構造を有するバックボーン副産物からの精製が必要となるため、大規模に生産することが困難である。ベクターに複製起点及び選択可能なマーカーを含めることによって正の選択による精製をより容易にするように、ナノプラスミド等の代替的なベクタータイプが設計されている。しかし、このような異質なエレメントは比較的大きく、一般的には数百塩基対の長さであり、患者にとって異物である。

【0052】

本明細書において、細菌によって生産される環状ＤＮＡベクター（例えば、治療用環状ＤＮＡベクター）、及び親プラスミド、例えば、細菌細胞（例えば、操作された細菌細胞）の内部の親プラスミドから、環状ＤＮＡベクターを生産するのに使用することができる細菌細胞（例えば、操作された細菌細胞）が開示されている。本明細書において提供される治療用環状ＤＮＡベクターは、小さな（例えば、５０塩基対未満の）複製起点を含み、かつ選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を欠いているため、ベクター内の外来配列によって引き起こされるリスクが軽減され得る。そのため、このような細菌によって生産される環状ＤＮＡベクターを治療用途向けに効率的かつ大規模に生産することができる。さらに、ＲＮＡＰＩＩアレスト部位等の細菌性プラスミドＤＮＡ配列を排除又は低減することによって、環状ＤＮＡベクターの転写サイレンシングを低減又は排除することができるため、個体におけるベクター配列の残存がもたらされる。本発明の特定の実施形態において、免疫原性構成要素（例えば、細菌エンドトキシン、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はＣｐＧモチーフ等の細菌性シグネチャー）が本環状ＤＮＡベクターには存在せず、又は医薬用途若しくは実験室用途に適した非常に低いレベルで存在するため、宿主の免疫応答を刺激するリスクはプラスミドＤＮＡベクター等の従来のＤＮＡベクターに比べて低減される。開示された実施形態のこれらの態様及び他の態様について、以下でより詳細に論じる。

【0053】

Ｉ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形（"a", "an" and "the"）は、文脈上特段の明確な規定がない限り、複数の指示対象を含む。また、「又は」という用語は、文脈上特段の明確な規定がない限り、一般に「及び／又は」を含む意味において使用されることにも留意されたい。本明細書において使用される「及び／又は」及び「それらのあらゆる組合せ」という用語、並びにそれらの文法的同義語は区別なく使用され得る。これらの用語は、あらゆる組合せが具体的に企図されていることを意味し得る。例示のみを目的として、次の語句「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」又は「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらのあらゆる組合せ」は、「Ａを個別に、Ｂを個別に、Ｃを個別に、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ及びＣ、並びにＡ、Ｂ、及びＣ」を意味し得る。「又は」という用語は、文脈上離接的な使用を具体的に指示していない限り、接続的にも又は離接的にも使用され得る。

【0054】

本明細書及び請求項（複数の場合もある）において使用される場合、「含む（comprising）」（及び「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」等の含む（comprising）のあらゆる形態）、「有する（having）」（及び「有する（have）」及び「有する（has）」等の有する（having）のあらゆる形態）、「含む（including）」（及び「含む（includes）」及び「含む（include）」等の含む（including）のあらゆる形態）、又は「含む（containing）」（及び「含む（contains）」及び「含む（contain）」等の含む（containing）のあらゆる形態）という語は、包括的又はオープンエンド型であって、挙げられていない追加の要素又は方法工程を除外するものではない。本明細書において論じられる実施形態はいずれも、本開示のあらゆる方法又は組成物に関して実装され得ることが企図され、その逆も同様である。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を実現することができる。

【0055】

本明細書における「幾つかの実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」、又は「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、又は特性が本開示の少なくとも幾つかの実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。この説明の或る特定の具体的な詳細は、様々な実施形態の徹底した理解がもたらされるように示されている。しかしながら、当業者であれば、これらの詳細がなくても本開示を実施することができることを理解するであろう。他の例では、実施形態の説明が不必要に不明瞭となるのを避けるために、よく知られた構造については詳細に示すことも説明することもしていない。

【0056】

本明細書において使用される場合、「誘導性プロモーター」は、刺激に応じて発現がオンになり得る又は増加し得るプロモーターを指す。刺激は、例えば、特定の分子又は培養条件の存在であり得る。刺激はまた、例えば、特定の分子又は培養条件の不存在であり得る。本明細書において使用される場合、「誘導性プロモーター」としては、プロモーターからの発現を抑制する特定の分子の存在等の条件、又は他の培養条件を除去することによって発現がオンになり得る又は増加し得るプロモーターが挙げられる。幾つかの実施形態において、誘導性プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター、Ｐ_ｔａｃプロモーター、Ｐ_ｂａｄプロモーター、ＰＴ７プロモーター、又はそれらの組合せである。幾つかの実施形態において、誘導性プロモーターは細菌ゲノム内に組み込まれ、例えば、Ｒｅｐタンパク質、制限酵素、又は組換え酵素をコードする遺伝子等の遺伝子に作動的に連結されている。

【0057】

本明細書において使用される場合、「外因性」とは、生物、細胞、組織、又は系から導入されるか、又はそれらの外部で生産されるあらゆる物質に対して言及される。例えば、操作された細菌細胞内に外因性制限酵素が存在する本明細書に記載される実施形態において、外因性制限酵素は、操作された細菌細胞の外部から操作された細菌細胞へと外因性制限酵素が導入されていなければ、操作された細菌細胞内に存在しないはずのものである。例えば、外因性制限酵素をコードする遺伝子を細菌細胞内に導入するか、又はエレクトロポレーション等により細胞膜を越えて細胞内に制限酵素を導入することによって、外因性制限酵素を操作された細菌細胞内に導入することができる。本明細書に記載される実施形態には、例えば、外因性リガーゼ及び外因性リコンビナーゼも含まれる。

【0058】

本明細書において使用される場合、「親プラスミド」は、ベクター配列（以下に定義される）と「バックボーン配列」（以下に定義される）との両方を含むプラスミドである。本明細書に開示される実施形態には、ベクター配列からバックボーン配列を除去することを含む、環状ＤＮＡベクターを作製する方法が含まれる。

【0059】

本明細書において使用される場合、親プラスミドの「ベクター配列」とは、複製起点及び対象遺伝子のコーディング配列を含むプラスミドＤＮＡの一部を指す。本明細書の実施形態の一部の記載において、ベクター配列はプラスミドの「第１のセグメント」と呼ばれる。

【0060】

本明細書において使用される場合、親プラスミドの「バックボーン配列」とは、薬物耐性遺伝子又はその断片等の１つ以上の選択可能なマーカーを含むベクター配列の外側のプラスミドＤＮＡの一部を指す。本明細書の実施形態の一部の記載において、バックボーン配列はプラスミドの「第２のセグメント」と呼ばれる。

【0061】

本明細書において使用される場合、「複製タンパク質」は、複製タンパク質に対応する複製起点配列での複製の開始に必要なタンパク質である。複製起点が特定の複製起点配列での複製の開始の場合に所与の複製タンパク質に依存している場合、その複製起点配列はその複製タンパク質に対応する。一例として、ＣｏｌＥ２－Ｐ９プラスミドによってコードされる複製タンパク質はＣｏｌＥ２－Ｐ９ ｏｒｉ配列に対応する。すなわち、ＣｏｌＥ２－Ｐ９複製タンパク質は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９ ｏｒｉ配列でのＤＮＡ複製の開始に必要である。

【0062】

本明細書において使用される場合、核酸配列の「機能的変異体」は、天然に存在する核酸配列等の参照核酸配列と少なくとも１つの核酸残基の点で異なり、ここで、変異体の関連する機能的活性は、参照核酸配列の関連する機能的活性のレベルの少なくとも９０％である（例えば、参照核酸配列の関連する機能と実質的に同様である）。この文脈において、少なくとも１つの核酸残基における相違は、例えば、或る核酸残基から別の核酸への突然変異、欠失、又は挿入にあり得る。変異体は、参照核酸配列によってコードされる治療用タンパク質又はその断片の相同体、アイソフォーム、又は転写変異体をコードする場合があり、ここで、相同体、アイソフォーム、又は転写変異体は、それぞれ本明細書において定義される同一性又は相同性の程度によって特徴付けられる。

【0063】

幾つかの場合においては、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能的変異体は、少なくとも１つの核酸置換（例えば、１個～１００個の核酸若しくはアミノ酸の置換、１個～５０個の核酸若しくはアミノ酸の置換、１個～２０個の核酸若しくはアミノ酸の置換、１個～１０個の核酸若しくはアミノ酸の置換、例えば、１個の核酸若しくはアミノ酸の置換、２個の核酸若しくはアミノ酸の置換、３個の核酸若しくはアミノ酸の置換、４個の核酸若しくはアミノ酸の置換、５個の核酸若しくはアミノ酸の置換、６個の核酸若しくはアミノ酸の置換、７個の核酸若しくはアミノ酸の置換、８個の核酸若しくはアミノ酸の置換、９個の核酸若しくはアミノ酸の置換、又は１０個の核酸若しくはアミノ酸の置換）を含む。同じクラスからのアミノ酸での交換を有する発現されたポリペプチドをもたらす核酸の置換を本明細書において保存的置換と呼ぶ。特に、これらは、脂肪族側鎖、正又は負に帯電した側鎖、側鎖又はアミノ酸中に芳香族基を有するアミノ酸であり、その側鎖は、水素架橋、例えばヒドロキシル官能基を有する側鎖を形成することができる。保存的置換により、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は、対応する極性側鎖を有する別のアミノ酸によって置き換えられてもよく、又は、例えば、疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸は、対応する疎水性側鎖を有する別のアミノ酸によって置き換えられてもよい（例えば、セリン（スレオニン）がスレオニン（セリン）によって、又はロイシン（イソロイシン）がイソロイシン（ロイシン）によって）。

【0064】

２つの配列（例えば、核酸配列、例えば、ＤＮＡ又はアミノ酸配列）が同一であるパーセンテージを決定するために、配列を、その後に互いに比較するために整列させることができる。この目的のため、ギャップを第１の配列の配列に挿入し、第２の配列の対応する位置にある構成要素を比較することができる。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置の場合と同じ構成要素によって占められている場合、２つの配列はこの位置において同一である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、同一位置の数を位置の総数で割った関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを使用して決定され得る。使用され得る数学的アルゴリズムの好ましいが限定的ではない例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877、又はAltschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムを、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムに統合することができる。本発明の配列と或る程度同一である配列を、このプログラムによって同定することができる。

【0065】

本明細書において使用される場合、「両側で挟む」、「両側で挟んでいる」、及び「両側で挟まれる」という用語は、核酸分子（例えば、プラスミド）上の、核酸分子の参照領域の外側にある一対の領域又は点に対して言及される。幾つかの実施形態において、核酸上の参照領域を両側で挟んでいる一対の領域又は点は、参照領域に隣接（すなわち、当接）している（すなわち、参照点と両側で挟んでいる点との間に介在塩基が存在しない）。他の実施形態において、参照領域を両側で挟む核酸分子上の一対の領域又は点は、１つ以上の介在塩基（例えば、最大１０００個の介在塩基）によって参照領域から隔離されている。例えば、第１の制限部位が所与の配列の２００塩基上流にあり、かつ第２の制限部位が所与の配列の１００塩基下流にある場合、第１の制限部位及び第２の制限部位がその配列を両側で挟むと言われる。幾つかの実施形態において、両側で挟んでいる領域又は点と参照領域との間の全ての介在配列には細菌性配列がない。このような実施形態において、ベクター配列を両側で挟んでいる制限部位又は組換え部位で親プラスミドから切り出されたベクター配列をセルフライゲーションさせることによって生産された環状ＤＮＡベクターには、ｏｒｉ配列以外の細菌性配列は存在しない。例えば、このような実施形態において、ベクター配列を両側で挟んでいる部位を切断する外因性制限酵素は、治療用配列の５’末端と３’末端との間に配列を有するが、この領域には細菌性配列（例えば、薬物耐性遺伝子）が含まれない環状ＤＮＡベクターを生産することができる。このような介在配列は、例えば外因性制限酵素によって生成されたオーバーハング塩基に対応する、粘着末端ライゲーションからの人為構造であり得る。

【0066】

「ＡＢＣＡ４」という用語は、特段の指摘がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源のあらゆる本来のＡＢＣＡ４だけでなく、機能的変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、それらの突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及び断片も指す。機能的変異体は、既知のＡＢＣＡ４シグナル伝達に基づいて決定され得る。ＡＢＣＡ４には、全長のプロセシングされていないＡＢＣＡ４だけでなく、細胞内での本来のプロセシングから得られるあらゆる形式のＡＢＣＡ４も包含される。例示的なヒトＡＢＣＡ４配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９０７３又はＮＭ＿０００３５０として提供されている。

【0067】

「ＭＹＯ７Ａ」という用語は、特段の指摘がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源のあらゆる本来のＭＹＯ７Ａ（ＤＦＮＢ２、ＭＹＵ７Ａ、ＮＳＲＤ２、ＵＳＨ１Ｂ、ＤＦＮＡ１１、又はＭＹＯＶＩＩＡとしても知られる）だけでなく、機能的変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、それらの突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及び断片も指す。機能的変異体は、既知のＭＹＯ７Ａシグナル伝達に基づいて決定され得る。ＭＹＯ７Ａには、全長のプロセシングされていないＭＹＯ７Ａだけでなく、細胞内での本来のプロセシングから得られるあらゆる形態のＭＹＯ７Ａも包含される。例示的なヒトＭＹＯ７Ａ配列は、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）遺伝子ＩＤ：４６４７として提供されている。

【0068】

本明細書において使用される場合、「自己複製ＲＮＡ分子」という用語は、１つの複製起点から複製するＲＮＡを含む自己複製遺伝子エレメントを指す。

【0069】

本明細書において使用される場合、「作動的に連結された（operatively linked）」又は「作動的に結合された（operatively coupled）」という用語は、要素の配置を指し、ここで、そのように記載された構成要素は、それらの通常の機能を果たすように構成される。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるときに「動作可能に連結」又は「作動的に結合」される。例えば、プロモーターは、１つ以上の異種遺伝子の転写に影響を及ぼす場合、１つ以上の異種遺伝子に作動的に連結される。さらに、コーディング配列に作動的に連結された制御エレメントは、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる。制御エレメントは、その発現を指示するように機能する限り、コーディング配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列が、プロモーター配列とコーディング配列との間に存在する可能性があり、プロモーター配列は依然としてコーディング配列に「動作可能に連結されている」又は「作動的に結合されている」と考えることができる。

【0070】

本明細書において使用される場合、「ベクター」は、対象の配列を担持することができる核酸分子を指し、標的細胞に連結され、次いで、対象の配列を標的細胞に転写させ、複製させ、プロセシングさせ、及び／又は発現させることができる。標的細胞又は宿主細胞がベクターの対象の配列をプロセシングした後は、対象の配列はベクターとは見なされない。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは自律複製が可能であり、かつ細菌性複製起点及び選択可能なマーカーを含む細菌バックボーンを含む環状二本鎖ＤＮＡループを指し、その中に追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる。別のタイプのベクターは、ファージベクターである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここでは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。或る特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、或る特定のベクターは、それらが作動的に連結している遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」又は「発現ベクター」）と称される。

【0071】

本明細書において使用される場合、「個体」及び「被験体」という用語は区別なく使用され、例えば、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物による治療又は予防を必要とするあらゆる哺乳動物を含む。幾つかの実施形態において、個体又は被験体はヒトである。他の実施形態において、個体又は被験体は非ヒト哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウサギ、ネコ、又はイヌ）である。個体又は被験体は雄であっても又は雌であってもよい。

【0072】

本明細書において使用される場合、環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物の「有効量」又は「有効用量」とは、例えば、選択された投与形態、投与経路、及び／又は投与スケジュールに従って個体に投与される場合、所望の生物学的効果、薬理学的効果、又は治療的効果を達成するのに十分な量を指す。当業者には理解されるように、有効な特定の組成物の絶対量は、所望の生物学的エンドポイント又は薬理学的エンドポイント、送達される作用物質、標的組織等のような要因に応じて変動し得る。当業者であれば、「有効量」を、単回用量において又は多回用量の使用を通じて細胞と接触させ、又は被験体に投与することができることを更に理解するであろう。疾患を治療する組成物の有効量は、参照集団、例えば未処置集団若しくはプラセボ集団、又は標準治療による治療を受けている集団と比べて、疾患の進行を遅らせ、若しくは疾患の進行を止め、又は部分的奏効若しくは完全奏効を高めることができる。

【0073】

本明細書において使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」等の文法的変形例）は、治療される個体の自然な経過を変えようとする臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理学の経過中のいずれかに行うことができる。治療の望ましい効果としては、限定されるものではないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の軽減、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び予後の改善が挙げられる。幾つかの実施形態において、本発明の環状ＤＮＡベクターは、疾患の発症を遅らせるため、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。

【0074】

「発現のレベル」又は「発現レベル」という用語は区別なく使用され、一般に、生体試料（例えば、網膜）中のポリヌクレオチド、又はアミノ酸産物若しくはタンパク質の量を指す。「発現」は、一般に、遺伝子コードされた情報が細胞内に存在し、動作する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本発明によれば、「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、又はタンパク質の翻訳後修飾を指す場合がある。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたタンパク質、又は翻訳後修飾されたタンパク質の断片も、それらが選択的スプライシングによって生成された転写産物若しくは分解された転写産物に由来するか、又は例えばタンパク質分解による、タンパク質の翻訳後プロセシングに由来するかにかかわらず、発現されたとみなされるものとする。「発現された遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写された後、タンパク質に翻訳されるものを含み、ＲＮＡに転写されるがタンパク質に翻訳されないもの（例えば、トランスファーＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）も含む。

【0075】

本明細書において使用される場合、「発現残存性」という用語は、対象の配列又はその機能部分（例えば、環状ＤＮＡベクターの１つ以上のコーディング配列）が、トランスフェクトされた細胞（「細胞内残存性」）又はトランスフェクトされた細胞の任意の後代（「世代間残存性」）において発現可能である期間を指す。対象の配列、例えば、治療用配列又はその機能部分は、例えば、ＤＮＡメチル化及び／又はヒストンメチル化及びコンパクションによってサイレンシングされない場合に発現可能であり得る。発現残存性は、（ｉ）標的細胞又はその後代における配列から転写されるｍＲＮＡ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、又は任意の他の適切な方法を介して）、及び（ｉｉ）標的細胞又はその後代における配列から翻訳されたタンパク質（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、又は任意の他の適切な方法を介して）を検出又は定量化することによって評価することができる。幾つかの例において、発現残存性は、（ｉ）標的細胞又はその後代において治療用配列から転写されるｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）標的細胞又はその後代において治療用配列から翻訳されたタンパク質のいずれか又は両方と併せて、標的細胞又はその後代における治療用ＤＮＡを検出又は定量化することによって評価される（例えば、標的細胞における環状ＤＮＡベクターの存在、例えば、エピソームＤＮＡコピー数解析による）。対象の配列、又はその機能部分の発現残存性を、当該技術分野において知られている任意の遺伝子発現を特性評価する方法を用いて、本発明のベクターに存在しない１つ以上の細菌シグネチャーを有するコントロールベクター等の参照ベクター（例えば、プラスミド）に対して、定量化することができる。発現残存性は、ベクターの投与後の任意の所与の時点で定量化することができる。例えば、幾つかの実施形態において、本発明の環状ＤＮＡベクターの発現は、環状ＤＮＡベクターの投与から２週間後に標的細胞又はその後代において検出可能である場合、投与後少なくとも２週間持続する。幾つかの実施形態において、遺伝子の発現は、投与後１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、又はそれより長い間、標的細胞において検出可能である場合、標的細胞において「持続する」。幾つかの実施形態において、配列の発現は、所与の期間後（例えば、投与後１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、又はそれより長い間）、元の発現レベルの任意の検出可能な割合（例えば、元の発現量の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも１００％）が残存する場合、投与後所与の期間持続すると言われる。

【0076】

本明細書において使用される場合、「細胞内残存性」とは、配列又はその機能的部分（例えば、環状ＤＮＡベクターの１つ以上のコーディング配列）が、それらがトランスフェクションされた細胞（例えば、有糸分裂後細胞又は静止細胞等の標的細胞）において発現可能である期間を指す。細胞内残存性は、（ｉ）標的細胞における配列から転写されたｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）標的細胞における配列から翻訳されたタンパク質を検出又は定量化することによって評価され得る。幾つかの場合においては、細胞内残存性は、標的細胞におけるＤＮＡ（例えば、標的細胞内の環状ＤＮＡベクターの存在）と組み合わせて、（ｉ）標的細胞における配列から転写されたｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）標的細胞における配列から翻訳されたタンパク質のいずれか又は両方を検出又は定量化することによって評価される。幾つかの実施形態において、本発明の環状ＤＮＡベクターは、参照ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡベクター）と比べて細胞内残存性の向上を示す。

【0077】

本明細書において使用される場合、「世代間残存性」とは、配列又はその機能的部分（例えば、ＤＮＡベクターの１つ以上のコーディング配列）が、遺伝子がトランスフェクションされた細胞の後代（例えば、環状ＤＮＡベクターを介して遺伝子がトランスフェクションされた細胞の第１世代、第２世代、第３世代、又は第４世代の子孫等の標的細胞の後代）において発現可能である期間を指す。世代間残存性は、細胞分裂を越えた遺伝子のあらゆる希釈を考慮するため、分裂中の組織におけるベクターの残存性を経時的に測定するのに役立つ可能性がある。幾つかの実施形態において、本発明の環状ＤＮＡベクターは、参照ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡベクター）と比べて世代間残存性の向上を示す。世代間残存性は、（ｉ）標的細胞の後代におけるベクター配列から転写されたｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）標的細胞の後代におけるベクター配列から翻訳されたタンパク質を検出又は定量化することによって評価され得る。幾つかの場合においては、細胞内残存性は、標的細胞の後代におけるＤＮＡ（例えば、標的細胞の後代における環状ＤＮＡベクターの存在）と組み合わせて、（ｉ）標的細胞の後代における配列から転写されたｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）標的細胞の後代における配列から翻訳されたタンパク質のいずれか又は両方を検出又は定量化することによって評価される。幾つかの実施形態において、本発明の環状ＤＮＡベクターは、参照ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡベクター）と比べて世代間残存性の向上を示す。

【0078】

本明細書において使用される場合、ＤＮＡ分子の「コピー数」という用語は、所与の細胞集団における細胞当たりのＤＮＡ分子の平均コピー数を指す。

【0079】

「薬学的に許容可能な」という用語は、ヒト等の哺乳動物への投与に安全であることを意味する。幾つかの実施形態において、薬学的に許容可能な組成物は、動物、より詳細にはヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認識される薬局方において列挙されている。

【0080】

「担体」という用語は、本発明のベクター又は組成物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。適切な医薬担体の例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA., 23rd edition, 2020に記載されている。

【0081】

本明細書において使用される場合、「約」という用語は、特段の指定がない限り、参照値から±１０％の変動範囲内の値を指す。

【0082】

様々な出典又は参考文献の間で定義に何らかの対立がある場合、本明細書において示される定義が優先されるものとする。

【0083】

他に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができ、好適な方法及び材料を下記に説明する。

【0084】

本開示全体を通じて、数値的特徴は範囲形式で示される。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔性のためのものであり、あらゆる実施形態の範囲に対する不動の限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、文脈上明確な規定がない限り、全ての可能な部分範囲だけでなく、その範囲内の下限の単位の１０分の１までの個々の数値も具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１～６等の範囲の記載は１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等のような部分範囲だけでなく、その範囲内の個々の値、例えば１．１、２、２．３、５、及び５．９も具体的に開示したものとみなされるべきである。これは範囲の広さに関係なく適用される。これらの介在範囲の上限及び下限は、独立してより小さな範囲に含まれる場合もあり、また、指定された範囲内のあらゆる具体的に除外された限界を条件として、本発明に包含される。指定された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、文脈上特段の規定がない限り、それらの含まれる限界の一方又は両方を除く範囲も本発明に含まれる。

【0085】

ＩＩ．細菌において環状ＤＮＡベクターを生産する方法
本明細書に開示される実施形態には、操作された細菌細胞において環状ＤＮＡベクターを生産する方法が含まれる。本明細書に開示される操作された細菌細胞を使用して、親プラスミドから環状ＤＮＡベクターを生産することができる。幾つかの実施形態において、操作された細菌細胞は、細菌ゲノム内に組み込まれた細菌性複製タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子と親プラスミドとを含む。幾つかの実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、例えばプラスミド（例えば、ヘルパープラスミド）又は細菌人工染色体（「ＢＡＣ」）等の染色体外ＤＮＡ分子上に含まれる。幾つかの実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は親プラスミド上に含まれる。親プラスミドはベクター配列とバックボーン配列とを含む。ベクター配列は、Ｒｅｐ遺伝子に対応するｏｒｉ配列を含み、選択可能なマーカーを含まない。バックボーン配列は、選択可能なマーカーを含み、ベクター配列に含まれるｏｒｉ配列を含まないが、一部の実施形態においては、異なるｏｒｉ配列を含んでよい。親プラスミドはまた、ベクター配列を両側で挟んでいる制限酵素認識配列又は部位特異的組換え配列を有し、これらは、制限消化又は部位特異的組換えによってプラスミドバックボーン配列を細胞の内部でベクター配列から分離することができるように配置されている。制限消化の場合、次いで、ベクター配列のセルフライゲーションによって環状ＤＮＡベクターが形成される。部位特異的組換えの場合、組換えが完了すると環状ＤＮＡベクターが形成される。ベクター配列の分離及び環状ＤＮＡベクターの形成後にｒｅｐタンパク質が発現されると、環状ＤＮＡベクターが選択可能なマーカーを欠いているにもかかわらず、環状ＤＮＡベクターが高コピー数で維持され得る。対照的に、培養条件を変更して選択可能なマーカーについての選択圧を取り除くことにより、分離後の操作された細菌細胞におけるプラスミドバックボーン配列の維持を回避することができる。親プラスミドが維持されない条件下で、高コピー数の環状ＤＮＡベクターを有する細菌細胞集団を培養すると、高収率の高純度環状ＤＮＡベクターを効率的に生産することができる。

【0086】

１．操作された細菌細胞
本明細書に開示される環状ＤＮＡベクターを生産する方法には、例えば操作されたＥ．コリ細菌細胞又は他の適切な細菌を含み得る操作された細菌細胞の使用が含まれる。幾つかの実施形態において、操作された細菌細胞は、細菌ゲノム内に組み込まれた複製タンパク質をコードする外因性Ｒｅｐ遺伝子と、Ｒｅｐ遺伝子に対応するｏｒｉ配列を有する親プラスミドとを含む。幾つかの実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は細菌ゲノム内に組み込まれずに、プラスミド又はＢＡＣ等の染色体外ＤＮＡ分子上に存在する。

【0087】

幾つかの実施形態において、操作された細菌細胞は、細菌ゲノム内に組み込まれた外因性Ｒｅｐ遺伝子を有する。当該技術分野においてよく知られる組込みカセット及び組込み手順を含む、あらゆる適切な染色体組込みプロセスを使用して、Ｒｅｐ遺伝子を細菌ゲノム内に導入することができる。幾つかの実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子はＣｏｌＥ２－Ｐ９複製タンパク質又は関連タンパク質をコードする。幾つかの例示的な実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣｏｌＥ２－Ｐ９複製タンパク質をコードする。他の適切な複製タンパク質としては、例えば、ＣｏｌＥ３－ＣＡ３８等のＣｏｌＥ２－Ｐ９に関連するものを含む、天然に存在するプラスミドによってコードされる複製タンパク質が挙げられる。複製タンパク質は、本明細書に記載される実施形態において、それらの対応する複製起点配列と組み合わせて使用され得る。

【0088】

親プラスミドのベクター配列において含まれるｏｒｉ配列は、これが操作された細菌細胞のゲノム内に組み込まれている又はその他に操作された細菌細胞内に、例えばプラスミド若しくはＢＡＣ上に存在するＲｅｐ遺伝子と対応するように選択される。幾つかの例示的な実施形態において、ｏｒｉは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む。したがって、本明細書に開示される操作された細菌細胞の実施形態には、親プラスミド及び／又は環状ＤＮＡベクターの複製を可能にする複製タンパク質と複製起点配列との機能的なペアが含まれる。幾つかの実施形態において、ベクター配列に存在するｏｒｉ配列は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９ ｏｒｉ配列又はその機能的断片である。幾つかの実施形態において、ベクター配列に存在するｏｒｉ配列は、配列番号２に示されるＤＮＡ配列を有するＣｏｌＥ２－Ｐ９ ｏｒｉ配列の機能的断片である。配列番号２に示される４０塩基対の機能的断片は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９を発現する細胞におけるベクターの複製を支持することが可能である。幾つかの実施形態において、より短い又はより長い機能的断片を使用することができる。幾つかの実施形態において、ＣｏｌＥ２－Ｐ９の３１塩基対の断片を使用することができる。他の適切なｏｒｉ配列としては、限定されるものではないが、適切なＲｅｐタンパク質に対応するｏｒｉ配列及びその機能的断片、例えばＣｏｌＥ３－ＣＡ３８のｏｒｉ配列等が挙げられる。幾つかの実施形態において、ｏｒｉは、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５１ヌクレオチド、５２ヌクレオチド、５３ヌクレオチド、５４ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、５６ヌクレオチド、５７ヌクレオチド、５８ヌクレオチド、５９ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、又は４００ヌクレオチドの長さ以下又はそれ未満である。幾つかの実施形態において、ｏｒｉ配列は、天然に存在するｏｒｉの機能的改変型、例えば、複製開始を支持する能力を依然として保持しながら、対応する天然に存在するｏｒｉ配列よりも短くなるよう改変されたｏｒｉ配列等である。幾つかの実施形態において、ｏｒｉ配列は天然に存在するｏｒｉ配列である。

【0089】

幾つかの実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は誘導性プロモーターに作動的に連結されている。適切な誘導性プロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって誘導されるＰ_Ｔ７プロモーター、熱誘導性Ｐ_Ｌプロモーター、ＬａｃＩによって抑制可能（したがって、ＬａｃＩの不存在又は除去によって誘導可能）なＰ_ｔａｃプロモーター、アラビノースによって誘導可能なＰ_ｂａｄプロモーターが挙げられる。本明細書に開示される実施形態において、例えばバクテリオファージプロモーター（例えば、Ｐ_Ｌｓ１ｃｏｎ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）及び細菌プロモーター（例えば、ＰｍｇｒＢ、ｐＬｌａｃＯ、Ｐｔｒｃ２、ｐＬｔｅｔＯ、Ｐｌａｃ／ａｒａ、Ｐｍ）を含む、当該技術分野において知られる他の誘導性プロモーターを使用することもできる。本開示により使用される細菌プロモーターの例としては、限定されるものではないが、正に制御されるＥ．コリプロモーター、例えば正に制御されるσ^７０プロモーター（例えば、誘導性ｐＢａｄ／ａｒａＣプロモーター、Ｌｕｘカセット右プロモーター、改変型ラムダＰｒｍプロモーター、ｐｌａｃ Ｏｒ２－６２（正）、別個にＲＥＮ部位を有するｐＢａｄ／ＡｒａＣ、ｐＢａｄ、Ｐ（Ｌａｓ）ＴｅｔＯ、Ｐ（Ｌａｓ）ＣＩＯ、Ｐ（Ｒｈｌ）、Ｐｕ、ＦｅｃＡ、ｐＲＥ、ｃａｄＣ、ｈｎｓ、ｐＬａｓ、ｐＬｕｘ）、σ^Ｓプロモーター（例えば、Ｐｄｐｓ）、σ^３２プロモーター（例えば、熱ショック）、及びσ^５４プロモーター（例えば、ｇｌｎＡｐ２）、負に制御されるＥ．コリプロモーター、例えば負に制御されるσ^７０プロモーター（例えば、プロモーター（ＰＲＭ＋）、改変型ラムダＰｒｍプロモーター、ＴｅｔＲ－ＴｅｔＲ－４Ｃ Ｐ（Ｌａｓ）ＴｅｔＯ、Ｐ（Ｌａｓ）ＣＩＯ、Ｐ（Ｌａｃ）ＩＱ、ＲｅｃＡ＿ＤｌｅｘＯ＿ｄＬａｃＯ１、ｄａｐＡｐ、ＦｅｃＡ、Ｐｓｐａｃ－ｈｙ、ｐｃＩ、ｐｌｕｘ－ｃＩ、ｐｌｕｘ－ｌａｃ、ＣｉｎＲ、ＣｉｎＬ、グルコース制御された改変型Ｐｒ、改変型Ｐｒｍ＋、ＦｅｃＡ、Ｐｃｙａ、ｒｅｃ Ａ（ＳＯＳ）、Ｒｅｃ Ａ（ＳＯＳ）、ＥｍｒＲ＿制御（EmrR_regulated）、ＢｅｔＩ＿制御（BetI_regulated）、ｐＬａｃ＿ｌｕｘ、ｐＴｅｔ＿Ｌａｃ、ｐＬａｃ／Ｍｎｔ、ｐＴｅｔ／Ｍｎｔ、ＬｓｒＡ／ｃＩ、ｐＬｕｘ／ｃＩ、ＬａｃＩ、ＬａｃＩＱ、ｐＬａｃＩＱ１、ｐＬａｓ／ｃＩ、ｐＬａｓ／Ｌｕｘ、ｐＬｕｘ／Ｌａｓ、ＬｅｘＡ結合部位を有するｐＲｅｃＡ、リバースｂＢａ＿Ｒ００１１、ｐＬａｃＩ／ａｒａ－１、ｐＬａｃＩｑ、ｒｒｎＢ Ｐ１、ｃａｄＣ、ｈｎｓ、ＰｆｈｕＡ、ｐＢａｄ／ａｒａＣ、ｎｈａＡ、ＯｍｐＦ、ＲｃｎＲ）、σ^Ｓプロモーター（例えば、代替的なシグマ因子σ^３８を有するＬｕｔｚ－Ｂｕｊａｒｄ ＬａｃＯ）、σ^３２プロモーター（例えば、代替的なシグマ因子σ^３２を有するＬｕｔｚ－Ｂｕｊａｒｄ ＬａｃＯ）、及びσ^５４プロモーター（例えば、ｇｌｎＡｐ２）、負に制御されるＢ．サブチリス（B. subtilis）プロモーター、例えば抑制可能なＢ．サブチリスσ^Ａプロモーター（例えば、グラム陽性ＩＰＴＧ誘導性、Ｘｙｌ、ｈｙｐｅｒ－ｓｐａｎｋ）、及びσ^Ｂプロモーターが挙げられる。他の誘導性細菌プロモーターを本開示に従って使用することができる。例えば、ｐＣｙｍＲＣ等のクミン酸誘導性プロモーターを、幾つかの実施形態において使用することができる。

【0090】

幾つかの実施形態において、複製タンパク質の発現レベルは、対応するｏｒｉ配列を含む親プラスミド又は環状ＤＮＡベクターのコピー数に影響を及ぼす。したがって、比較的低いコピー数（例えば、細胞当たり５コピー未満、１０コピー未満、又は２０コピー未満の平均）が望ましい場合、操作された細菌細胞は、複製タンパク質が比較的低いレベルで発現される条件において維持され得る。比較的高いコピー数（例えば、細胞当たり２０コピー超、５０コピー超、又は１００コピー超の平均）が望まれる場合、操作された細菌細胞は、複製タンパク質が誘導性プロモーターから比較的高いレベルで発現される条件において維持され得る。幾つかの実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、非誘導条件において第１の発現レベルをもたらし、対応するｏｒｉ配列を含む親プラスミド又は環状ＤＮＡベクターのより高いコピー数をもたらすより高い第２の発現レベルをもたらすように誘導することができる誘導性プロモーターに作動的に連結されている。幾つかの実施形態において、親プラスミドのベクター配列とバックボーン配列とが分離される前に、操作された細菌細胞における親プラスミドを低いコピー数で維持することが有利である。ベクター配列とバックボーン配列とが制限消化によって分離される実施形態において、比較的低いコピー数を有すると、線状化されたベクター配列をバックボーン配列又はベクター配列の他のコピーとライゲーションするのではなく、セルフライゲーションさせることを確実にするのに役立ち得る。ベクター配列をバックボーン配列から分離し、環状ＤＮＡベクターを形成した後、幾つかの実施形態において、高収率の環状ＤＮＡベクターを生産するのに、ｏｒｉ配列を含む環状ＤＮＡベクターを比較的高いコピー数で維持することが有利である。したがって、幾つかの実施形態において、操作された細菌細胞内で環状ＤＮＡベクターが形成された後に、例えば、Ｒｅｐ遺伝子に作動的に連結された誘導性プロモーターからより高い発現を誘導する分子を加えることによって、複製タンパク質のより高い発現レベルが誘導される。幾つかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ベクター配列がバックボーン配列から分離される後まで非誘導状態で維持される。幾つかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ベクター配列がバックボーン配列から分離された後に誘導される。幾つかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ベクター配列がバックボーン配列から分離されたと同時に誘導される。幾つかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ベクター配列がバックボーン配列から分離される前に誘導される。

【0091】

幾つかの実施形態において、親プラスミドのコピー数は、細胞当たり少なくとも約、最大で約、又は約１コピー、約２コピー、約３コピー、約４コピー、約５コピー、約６コピー、約７コピー、約８コピー、約９コピー、約１０コピー、約１１コピー、約１２コピー、約１３コピー、約１４コピー、約１５コピー、約１６コピー、約１７コピー、約１８コピー、約１９コピー、約２０コピー、約３０コピー、約４０コピー、約５０コピー、約６０コピー、約７０コピー、約８０コピー、約９０コピー、約１００コピー、約１１０コピー、約１２０コピー、約１３０コピー、約１４０コピー、約１５０コピー、約１６０コピー、約１７０コピー、約１８０コピー、約１９０コピー、約２００コピー、約２５０コピー、約３００コピー、約３５０コピー、約４００コピー、約４５０コピー、約５００コピー、約５５０コピー、約６００コピー、約６５０コピー、約７００コピー、約７５０コピーのコピー数で、又はこれらの値のいずれか２つの間で維持される。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターのコピー数は、細胞当たり少なくとも約、最大で約、又は約１０コピー、約１１コピー、約１２コピー、約１３コピー、約１４コピー、約１５コピー、約１６コピー、約１７コピー、約１８コピー、約１９コピー、約２０コピー、約２５コピー、約３０コピー、約３５コピー、約４０コピー、約４５コピー、約５０コピー、約５５コピー、約６０コピー、約６５コピー、約７０コピー、約７５コピー、約８０コピー、約８５コピー、約９０コピー、約９５コピー、約１００コピー、約１１０コピー、約１２０コピー、約１３０コピー、約１４０コピー、約１５０コピー、約１６０コピー、約１７０コピー、約１８０コピー、約１９０コピー、約２００コピー、約２５０コピー、約３００コピー、約３５０コピー、若しくは約４００コピーで、又はこれらの値のいずれか２つの間で維持される。

【0092】

幾つかの実施形態において、操作された細菌細胞ゲノム内に組み込まれたＲｅｐ遺伝子は、構成的プロモーター又は非誘導性プロモーターの制御下にある。幾つかの実施形態において、複製タンパク質の発現は、ベクター配列がバックボーン配列から分離される前、その間、又はその後に調整されない。幾つかの実施形態において、分離前の親プラスミド及び分離後の環状ＤＮＡベクターは、細胞当たり少なくとも約、最大で約、又は約１コピー、約２コピー、約３コピー、約４コピー、約５コピー、約６コピー、約７コピー、約８コピー、約９コピー、約１０コピー、約１１コピー、約１２コピー、約１３コピー、約１４コピー、約１５コピー、約１６コピー、約１７コピー、約１８コピー、約１９コピー、約２０コピー、約２５コピー、約３０コピー、約３５コピー、約４０コピー、約４５コピー、約５０コピー、約５５コピー、約６０コピー、約６５コピー、約７０コピー、約７５コピー、約８０コピー、約８５コピー、約９０コピー、約９５コピー、約１００コピー、約１１０コピー、約１２０コピー、約１３０コピー、約１４０コピー、約１５０コピー、約１６０コピー、約１７０コピー、約１８０コピー、約１９０コピー、若しくは約２００コピーのコピー数で、又はこれらの値のいずれか２つの間で維持される。

【0093】

親プラスミド又は親プラスミドから分離されたベクター配列に加えて、操作された細菌は、ヘルパープラスミド又はＢＡＣ等の他の染色体外ＤＮＡ分子も含み得る。染色体外ＤＮＡ分子は、例えば、外因性リコンビナーゼ、制限酵素、複製タンパク質、リガーゼ、選択可能なマーカー、対抗選択マーカー、又はレポーター遺伝子をコードしていてよい。幾つかの実施形態において、ベクター配列以外の染色体外ＤＮＡ分子を操作された細菌細胞から除去した後、操作された細菌細胞の培養物から環状ＤＮＡベクターを精製する。幾つかの実施形態において、選択圧を適用せずに染色体外ＤＮＡ分子を維持する条件下で細胞を培養することによって、又は染色体外ＤＮＡ分子を含む細胞の成長を低減若しくは排除する対抗選択条件下で細胞を培養することによって、染色体外ＤＮＡ分子を操作された細菌細胞から除去することができる。

【0094】

幾つかの実施形態において、操作された細菌細胞内に含まれる染色体外ＤＮＡ分子には、細胞内の染色体外ＤＮＡ分子の存在を追跡するのに使用することができるレポーターコンストラクトが含まれる。例えば、親プラスミドのバックボーン配列又はヘルパープラスミド若しくはＢＡＣは、ＧＦＰ又はＲＦＰ等の視覚的に検出可能なタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。その場合、紫外光下でコロニーの色を視覚的に観察することで、コロニーの細胞内に染色体外ＤＮＡ分子が存在するかどうかを明らかにすることができる。このようにして、所与の染色体外ＤＮＡ分子を欠いているコロニーを検出することができる。他の様式で検出することができる他の適切なレポーターコンストラクトを使用して、操作された細菌細胞又はコロニーが所与の染色体外ＤＮＡ分子を含むかどうかを判定することもできる。

【0095】

Ｂ．親プラスミド
本明細書に開示される操作された細菌の実施形態には、２つの制限部位又は組換え部位によって互いに分離されるベクター配列及びバックボーン配列を含む親プラスミド（テンプレートプラスミド又はプラスミドテンプレートとも呼ばれる）が含まれる。

【0096】

ベクター配列は、ｏｒｉ配列と、幾つかの実施形態において、治療用コーディング配列、レポーターコンストラクト、又はそれらの組合せである対象配列とを含む。ベクター配列は、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクターの実施形態のあらゆる構成要素を含み得る。幾つかの実施形態において、ベクター配列はｏｒｉ配列以外に細菌起源の配列を一切含まない。幾つかの実施形態において、親プラスミドは、ｏｒｉ配列及び／又は治療用配列又はレポーターコンストラクトのすぐ隣に制限部位又は組換え部位を含むため、環状ＤＮＡベクターとなるベクター配列に含まれる異質なＤＮＡ又は非機能的ＤＮＡは存在しない。

【0097】

幾つかの実施形態において、バックボーン配列は、選択可能なマーカーを含み、組み込まれたＲｅｐ遺伝子によってコードされる外因性複製タンパク質に対応するｏｒｉ配列を含まない。幾つかの実施形態において、バックボーン配列は、組み込まれたＲｅｐ遺伝子に対応しない、すなわち、ベクター配列内のｏｒｉ配列及び組み込まれたＲｅｐ遺伝子に対してオーソロガスであるｏｒｉ配列を含む。幾つかの実施形態において、バックボーン配列に含まれる選択可能なマーカーは、細胞の成長又は生存に選択可能なマーカーが必要である条件下で培養された操作された細菌細胞の集団において親プラスミドが維持されることを確実にするのに役立つ。例えば、幾つかの実施形態において、選択可能なマーカーは抗生物質耐性遺伝子である。操作された細菌細胞を対応する抗生物質の存在下で培養すると、選択圧がかかるため、操作された細菌細胞の集団において親プラスミドが維持される。しかしながら、成長培地を抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を欠いた培地に変更すること等によって選択圧を取り除くと、抗生物質耐性遺伝子を含むＤＮＡ分子が集団から失われる可能性があり、特にそのようなＤＮＡ分子がｏｒｉ配列を含まない場合にその可能性がある。したがって、ベクター配列がバックボーン配列から分離された後、培養条件によりバックボーン配列を維持する選択圧がかからないと、バックボーン配列は集団から失われるか、又は大量に維持することができなくなる可能性がある。

【0098】

幾つかの実施形態において、バックボーン配列は対抗選択マーカーを含む。対抗選択マーカーは、バックボーン配列を含まない細胞を選択的に成長させる方法を提供し得る。幾つかの実施形態において、ベクター配列がバックボーン配列から分離された後、対抗選択条件下で細胞を成長させることにより、純度が高められ、培養物中及び／又は精製されたベクター配列を含む組成物中のバックボーン配列の量が減少する可能性がある。適切な対抗選択マーカーは当該技術分野において知られており、例えば、ｐｈｅＳ、ｓａｃＢ、ｔｈｙＡ、ｌａｃＹ、ｇａｔａ－１、ｃｃｄＢ、ｒｐｓＬ、又はｔｅｔＡＲを含み得る。

【0099】

親プラスミド内のベクター配列を両側で挟んでいる制限部位又は組換え部位を、ベクター配列内に存在しないあらゆる適切な制限部位又は組換え部位から選択することができる。

【0100】

Ｃ．制限消化及びライゲーション
本明細書に開示される実施形態には、制限消化を行って、ベクター配列を親プラスミドのバックボーン配列から分離する工程が含まれる。幾つかの実施形態において、制限消化は操作された細菌細胞内で行われる。幾つかの実施形態において、親プラスミドを消化する制限酵素は、操作された細菌細胞内に導入された外因性制限酵素遺伝子から発現される外因性制限酵素である。幾つかの実施形態において、外因性遺伝子は、操作された細菌細胞のゲノム内に組み込まれている。幾つかの実施形態において、外因性遺伝子は、操作された細菌細胞内のプラスミド又はＢＡＣ上にコードされている。幾つかの実施形態において、ベクター配列を親プラスミドのバックボーン配列から分離することが所望されるようなときまで、制限酵素の発現の誘導を抑制又は遅延させる必要がある。したがって、幾つかの実施形態において、外因性遺伝子は誘導性プロモーターに作動的に連結されている。分離が所望される場合、制限酵素の発現を誘導し、分離を進めることができる。

【0101】

幾つかの実施形態において、ベクター配列をバックボーン配列から分離するのに使用される制限酵素は、細胞膜を越えて操作された細菌細胞内に導入される外因性制限酵素である。幾つかの実施形態において、これはエレクトロポレーションによって達成される。エレクトロポレーション手順及び消化手順の非限定的な例は次の通りである。親プラスミドを有する操作されたエレクトロコンピテントなＥ．コリを、ＳＯＢ中で３０℃にて０．８のＯＤまで培養する。細菌を氷冷した１０％のグリセロールで３回洗浄し、１０％のグリセロール中に再懸濁する。それぞれ０．５μｌの制限酵素及びリガーゼをエレクトロコンピテントな細胞と混合し、１μｇのＤＮＡを１０単位の制限酵素で消化させる。混合物をキュベット（１ｍｍギャップ）に移し、エレクトロポレーター（ＢＴＸ）を使用して１８００ボルトの設定を用いてエレクトロポレーションする。細胞をＳＯＣ中で３７℃にて１時間成長させることによってレスキューし、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレート上にプレーティングする。コロニーを成長させ、QIAGENのミニプレップキットを使用してＤＮＡを精製する。

【0102】

ベクター配列を分離した後、ベクター配列をセルフライゲーションさせることによって環状ＤＮＡベクターを形成することができる。幾つかの実施形態において、ライゲーションは操作された細菌細胞内で行われる。幾つかの実施形態において、ベクター配列の末端を接合するリガーゼは、操作された細菌細胞内に導入された外因性リガーゼ遺伝子から発現される外因性リガーゼである。リガーゼは、例えば、Ｔ３リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、又はＴ７リガーゼであり得る。幾つかの実施形態において、外因性リガーゼ遺伝子は、操作された細菌細胞のゲノム内に組み込まれている。幾つかの実施形態において、外因性リガーゼ遺伝子は、操作された細菌細胞内のプラスミド上にコードされている。幾つかの実施形態において、ベクター配列を親プラスミドのバックボーン配列から分離することが達成されるようなときまで、リガーゼの発現を抑制するか、又は誘導しない。したがって、幾つかの実施形態において、外因性リガーゼ遺伝子は誘導性プロモーターに作動的に連結されている。

【0103】

幾つかの実施形態において、リガーゼは、細胞膜を越えて操作された細菌細胞内に導入される外因性リガーゼである。幾つかの実施形態において、これはエレクトロポレーションによって達成され、上記のエレクトロポレーションプロトコルに従って行うことができる。幾つかの実施形態において、制限酵素及びリガーゼのエレクトロポレーションは、制限酵素及びリガーゼ酵素の両方が単回のエレクトロポレーション工程で細胞に入る単回の工程で行われる。幾つかの実施形態において、制限酵素（複数の場合もある）及びリガーゼは細胞に別々に加えられる。

【0104】

幾つかの実施形態において、ベクター配列のセルフライゲーションは、操作された細菌細胞によって生産される内因性リガーゼによって達成される。

【0105】

幾つかの実施形態において、外因性制限酵素及び外因性リガーゼは、操作された細菌細胞内に同時に存在する。幾つかの実施形態において、外因性制限酵素を（例えば、外因性制限酵素のエレクトロポレーション、外因性制限酵素をコードするＤＮＡ分子による形質転換、又は誘導性プロモーターの制御下での外因性制限酵素遺伝子の発現の誘導によって）操作された細菌細胞内に導入した後に、外因性リガーゼを（例えば、外因性リガーゼのエレクトロポレーション、外因性リガーゼをコードするＤＮＡ分子による形質転換、又は誘導性プロモーターの制御下での外因性リガーゼ遺伝子の発現の誘導によって）操作された細菌細胞内に導入する。幾つかの実施形態において、外因性制限酵素を操作された細菌細胞内に導入した後に、外因性リガーゼを操作された細菌細胞内に導入する。幾つかの実施形態において、外因性制限酵素を、操作された細菌細胞内に外因性リガーゼと同時に導入する。

【0106】

Ｄ．部位特異的組換え
部位特異的組換えを、配列間の部位特異的組換えをもたらす様々な系を使用して実施することができる。幾つかの実施形態において、部位特異的組換えには、リコンビナーゼの存在下で互いに組換えを可能にする２つの特異的な配列が必要とされる。

【0107】

幾つかの実施形態において、ベクター配列をプラスミド配列から分離するリコンビナーゼは、操作された細菌細胞内に導入された外因性リコンビナーゼ遺伝子から発現される外因性リコンビナーゼである。幾つかの実施形態において、外因性リコンビナーゼ遺伝子は、操作された細菌細胞のゲノム内に組み込まれている。幾つかの実施形態において、外因性リコンビナーゼ遺伝子は、操作された細菌細胞内のプラスミド又はＢＡＣ上にコードされている。幾つかの実施形態において、ベクター配列を親プラスミドのバックボーン配列から分離することが所望されるようなときまで、リコンビナーゼの発現の誘導を抑制又は遅延させる必要がある。したがって、幾つかの実施形態において、外因性リコンビナーゼ遺伝子は、本明細書に開示される誘導性プロモーターのいずれか等の誘導性プロモーターに作動的に連結されている。分離が所望される場合、外因性リコンビナーゼの発現を誘導し、分離を進めることができる。幾つかの実施形態において、外因性リコンビナーゼは、親プラスミドが操作された細菌細胞内に導入されたときに発現され、これによってリコンビナーゼの発現を誘導する必要なしに、親プラスミドの組換えを起こさせることができる。幾つかの実施形態において、親プラスミドが操作された細菌細胞内に導入されたときに、リコンビナーゼは比較的低いレベルで発現される。一例として、幾つかの実施形態において、操作された細菌細胞には、非誘導条件下で低レベルの発現をもたらす誘導性プロモーターに作動的に結合された外因性リコンビナーゼ遺伝子（これは、例えば、親プラスミドを操作された細菌細胞内に導入する前に、細菌染色体内に組み込まれていてよく、又は細菌細胞内に存在するプラスミド若しくはＢＡＣ上に含まれていてよい）が含まれていてよい。外因性リコンビナーゼの適切に低い発現レベルを有する操作された細菌細胞内に親プラスミドを導入すると、親プラスミドのバックボーン配列上の選択可能なマーカーについて選択的な培地上でコロニーの成長が可能となり得ると同時に、親プラスミドの十分な組換えが誘導されて、バックボーン配列から分離されたベクター配列を有するコロニーにおいて細胞集団も生成される。

【0108】

幾つかの実施形態において、ベクター配列をバックボーン配列から分離するのに使用されるリコンビナーゼは、細胞膜を越えて操作された細菌細胞内に導入される外因性リコンビナーゼである。幾つかの実施形態において、これはエレクトロポレーションによって達成される。エレクトロポレーション手順及び組換え手順の非限定的な例は次の通りである。親プラスミドを有する操作されたエレクトロコンピテントなＥ．コリを、ＳＯＢ中で３０℃にて０．８のＯＤまで培養する。細菌を氷冷した１０％のグリセロールで３回洗浄し、１０％のグリセロール中に再懸濁する。１μｌのＣｒｅ（１５単位、NEB、Ｍ０２９８Ｍ）を５０μｌのエレクトロコンピテントな細胞と混合する。混合物をキュベット（１ｍｍギャップ）に移し、エレクトロポレーター（ＢＴＸ）を使用して１８００ボルトの設定を用いてエレクトロポレーションする。細胞をＳＯＣ中で３７℃にて１時間成長させることによってレスキューし、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレート上にプレーティングする。コロニーを成長させ、QIAGENのミニプレップキットを使用してＤＮＡを精製する。１μｇのＤＮＡを１０単位の制限酵素で消化する。

【0109】

本明細書に開示される実施形態において使用される特定の組換え系は、様々な起源のものであり得る。特に、使用される特定の配列及びリコンビナーゼは、バクテリオファージλのインテグラーゼファミリー又はトランスポゾンＴｎ３のリゾルバーゼファミリー等の様々な構造クラスに属し得る。

【0110】

バクテリオファージλのインテグラーゼファミリーに属するリコンビナーゼには、例えば、ファージラムダ（Landy et al., Science 197: 1147, 1977）、Ｐ２２、及びφ８０（Leong et al., J. Biol. Chem. 260: 4468,1985）のインテグラーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenza）のＨＰ１（Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 6859,1992）、ファージＰ１のＣｒｅインテグラーゼ（これはＬｏｘＰ部位を認識して組換えを引き起こす）、プラスミドｐＳＡＭ２のインテグラーゼ（欧州特許第３５０，３４１号）、或いは２μプラスミドのＦＬＰリコンビナーゼが含まれる。バクテリオファージλのインテグラーゼファミリーの部位特異的な系による組換えによって環状ＤＮＡベクターを調製する実施形態において、得られる環状ＤＮＡベクターは一般に、対応するバクテリオファージ又はプラスミドの２つのａｔｔ付着配列間の組換えから得られる配列を含む。

【0111】

トランスポゾンＴｎ３のファミリーに属するリコンビナーゼには、例えば、トランスポゾンＴｎ３又はトランスポゾンＴｎ２１及びＴｎ５２２のリゾルバーゼ（Stark et al., Trends Genet, 8, 432-439,1992）、バクテリオファージｍｕのＧｉｎインベルターゼ、或いはＲＰ４のｐａｒ断片のリゾルバーゼ等のプラスミドのリゾルバーゼ（Albert et al., Mol. Microbiol. 12: 131, 1994）が含まれる。トランスポゾンＴｎ３のファミリーの部位特異的な系による組換えによって環状ＤＮＡベクターを調製する実施形態において、得られる環状ＤＮＡベクターは一般に、当該トランスポゾンのリゾルバーゼの２つの認識配列間の組換えから得られる配列を含む。

【0112】

幾つかの実施形態において、親プラスミド上の部位特異的組換え配列はバクテリオファージに由来する。幾つかの実施形態において、これらの配列は、バクテリオファージインテグラーゼの付着配列（ａｔｔＰ配列及びａｔｔＢ配列）又はこのような付着配列から誘導された配列である。これらの配列は、エクシジョナーゼの有無にかかわらず、インテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの存在下で互いに特異的に組換えを行うことが可能である。「このような付着配列から誘導された配列」という用語には、適切なリコンビナーゼの存在下で特異的に組換えを行う能力を保持するバクテリオファージの付着配列の改変（複数の場合もある）によって得られる配列が含まれる。したがって、このような配列は、これらの配列の縮小された断片であるか、或いは他の配列（制限部位等）の付加によって拡張された断片であり得る。これらはまた、例えばａｔｔＰ－ＧＡ付着配列及びａｔｔＢ－ＧＡ付着配列等の突然変異、特に点突然変異によって得られた変異体であり得る。

【0113】

幾つかの実施形態において、使用される認識配列及びリコンビナーゼは、例えば、Ｆｌｐ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、λインテグラーゼ、若しくはＨＰ１インテグラーゼ等のチロシンリコンビナーゼファミリーのメンバー、又は例えば、φＢＴ１、ＴＰ９０１、Ｂｘｂ１、ＭＲ１１、Ａ１１８、φＫ３８、φＣ３１、若しくはＷβ等のセリンリコンビナーゼファミリーのメンバーに由来する。

【0114】

幾つかの実施形態において、認識配列及びリコンビナーゼは、Ｂｘｂ１に由来する（例えば、外因性リコンビナーゼはＢｘｂ１であり、かつ認識配列はａｔｔＰ－ＧＡ及びａｔｔＢ－ＧＡである）。

【0115】

Ｅ．細胞の培養による環状ＤＮＡベクターの増幅
本明細書に記載される実施形態に従って、操作された細菌細胞内で環状ＤＮＡベクターを形成させた後、環状ＤＮＡベクターを含む操作された細菌細胞の集団を培養することによって、生産される環状ＤＮＡベクターの量を増加させることができる。培養条件は、細菌細胞の成長及び環状ＤＮＡベクターの追加のコピーの生産を最大化するように選択され得る。幾つかの実施形態において、培養条件は、複製タンパク質の高レベルの発現を誘導し、それによって対応するｏｒｉ配列を有する環状ＤＮＡベクターの高コピー数を支持するように選択される。幾つかの実施形態において、培養条件は、選択可能なマーカーを含むバックボーン配列の維持についての選択圧を取り除くように選択されるため、バックボーン配列は細胞分裂を通じて維持されない。幾つかの実施形態において、バックボーン配列上に存在する対抗選択マーカーについての対抗選択圧を与える培養条件が選択されるため、バックボーン配列を含む細胞は成長能力が低下するか、又は成長することができない。

【0116】

幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターを含む操作された細菌細胞の集団を培養することにより、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回、少なくとも５５回、少なくとも６０回、少なくとも６５回、少なくとも７０回、少なくとも７５回、少なくとも８０回、少なくとも８５回、少なくとも９０回、少なくとも９５回、又は少なくとも１００回の細胞分裂を通じて、そのような培養された細胞内の環状ＤＮＡベクターの維持がもたらされる。幾つかの実施形態において、操作された細菌細胞の培養された集団は、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回、少なくとも５５回、少なくとも６０回、少なくとも６５回、少なくとも７０回、少なくとも７５回、少なくとも８０回、少なくとも８５回、少なくとも９０回、少なくとも９５回、又は少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１コピー、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、少なくとも８コピー、少なくとも９コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも１１コピー、少なくとも１２コピー、少なくとも１３コピー、少なくとも１４コピー、少なくとも１５コピー、少なくとも１６コピー、少なくとも１７コピー、少なくとも１８コピー、少なくとも１９コピー、少なくとも２０コピーの平均コピー数（例えば、少なくとも１０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１コピー（例えば、少なくとも１０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも５コピー、少なくとも１０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１０コピー、又は少なくとも１０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも２０コピー）、少なくとも２０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１コピー（例えば、少なくとも２０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも５コピー、少なくとも２０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１０コピー、又は少なくとも２０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも２０コピー）、少なくとも５０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１コピー（例えば、少なくとも５０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも５コピー、少なくとも５０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１０コピー、又は少なくとも５０回の倍化の後に細胞当たり少なくとも２０コピー）、又は少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１コピー（例えば、少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり少なくとも５コピー、少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１０コピー、又は少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり少なくとも２０コピー））で環状ＤＮＡベクターを維持する。幾つかの実施形態において、ベクター配列をバックボーン配列から分離した後のバックボーン配列の平均コピー数は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回、少なくとも５５回、少なくとも６０回、少なくとも６５回、少なくとも７０回、少なくとも７５回、少なくとも８０回、少なくとも８５回、少なくとも９０回、少なくとも９５回、又は少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり５コピー未満、４コピー未満、３コピー未満、２コピー未満、１コピー未満、０．５コピー未満、０．１コピー未満、０．０１コピー未満若しくは０．００１コピー未満であるか、又は検出不能である（例えば、少なくとも１回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満（例えば、少なくとも１０回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満、少なくとも２０回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満、少なくとも５０回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満、又は少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満）、少なくとも１回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満（例えば、少なくとも１０回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満、少なくとも２０回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満、少なくとも５０回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満、又は少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満）、少なくとも１回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満（例えば、少なくとも１０回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満、少なくとも２０回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満、少なくとも５０回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満、又は少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満）、又は少なくとも１回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満（例えば、少なくとも１０回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満、少なくとも２０回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満、少なくとも５０回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満、又は少なくとも１００回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満））。幾つかの実施形態において、ベクター配列をバックボーン配列から分離した後のバックボーン配列の平均コピー数は、最大１回、最大２回、最大３回、最大４回、最大５回、最大６回、最大７回、最大８回、最大９回、最大１０回、最大１１回、最大１２回、最大１３回、最大１４回、最大１５回、最大１６回、最大１７回、最大１８回、最大１９回、最大２０回、最大２５回、最大３０回、最大３５回、最大４０回、最大４５回、最大５０回、最大５５回、最大６０回、最大６５回、最大７０回、最大７５回、最大８０回、最大８５回、最大９０回、最大９５回、又は最大１００回の倍化の後に細胞当たり５コピー未満、４コピー未満、３コピー未満、２コピー未満、１コピー未満、０．５コピー未満、０．１コピー未満、０．０１コピー未満若しくは０．００１コピー未満であるか、又は検出不能である（例えば、最大１回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満（例えば、最大１０回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満、最大２０回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満、最大５０回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満、又は最大１００回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満）、最大１回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満（例えば、最大１０回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満、最大２０回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満、最大５０回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満、又は最大１００回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満）、最大１回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満（例えば、最大１０回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満、最大２０回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満、最大５０回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満、又は最大１００回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満）、又は最大１回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満（例えば、最大１０回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満、最大２０回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満、最大５０回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満、又は最大１００回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満））。

【0117】

幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターを含む操作された細菌細胞の集団を培養することにより、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回、少なくとも５５回、少なくとも６０回、少なくとも６５回、少なくとも７０回、少なくとも７５回、少なくとも８０回、少なくとも８５回、少なくとも９０回、少なくとも９５回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも２９０回、少なくとも２９４回、少なくとも３００回、少なくとも３５０回、少なくとも４００回、少なくとも４５０回、又は少なくとも５００回の細胞分裂を通じて、そのような培養された細胞内の環状ＤＮＡベクターの維持がもたらされる（例えば、サンガーシーケンシングによって確認される）。幾つかの実施形態において、操作された細菌細胞の培養された集団は、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回、少なくとも５５回、少なくとも６０回、少なくとも６５回、少なくとも７０回、少なくとも７５回、少なくとも８０回、少なくとも８５回、少なくとも９０回、少なくとも９５回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも２９０回、少なくとも２９４回、少なくとも３００回、少なくとも３５０回、少なくとも４００回、少なくとも４５０回、又は少なくとも５００回の倍化の後に細胞当たり少なくとも１コピー、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、少なくとも８コピー、少なくとも９コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも１１コピー、少なくとも１２コピー、少なくとも１３コピー、少なくとも１４コピー、少なくとも１５コピー、少なくとも１６コピー、少なくとも１７コピー、少なくとも１８コピー、少なくとも１９コピー、少なくとも２０コピーの平均コピー数で環状ＤＮＡベクターを維持する。幾つかの実施形態において、ベクター配列をバックボーン配列から分離した後のバックボーン配列の平均コピー数は、最大１回、最大２回、最大３回、最大４回、最大５回、最大６回、最大７回、最大８回、最大９回、最大１０回、最大１１回、最大１２回、最大１３回、最大１４回、最大１５回、最大１６回、最大１７回、最大１８回、最大１９回、最大２０回、最大２５回、最大３０回、最大３５回、最大４０回、最大４５回、最大５０回、最大５５回、最大６０回、最大６５回、最大７０回、最大７５回、最大８０回、最大８５回、最大９０回、最大９５回、最大１００回、１５０回、最大２００回、最大２５０回、最大２９０回、最大２９４回、最大３００回、最大３５０回、最大４００回、最大４５０回、又は最大５００回の倍化の後に細胞当たり５コピー未満、４コピー未満、３コピー未満、２コピー未満、１コピー未満、０．５コピー未満、０．１コピー未満、０．０１コピー未満若しくは０．００１コピー未満であるか、又は検出不能である（例えば、最大１回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満（例えば、最大１０回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満、最大２０回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満、最大５０回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満、又は最大５００回の倍化の後に細胞当たり０．００１コピー未満）、最大１回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満（例えば、最大１０回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満、最大２０回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満、最大５０回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満、又は最大１００回の倍化の後に細胞当たり０．０１コピー未満）、最大１回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満（例えば、最大１０回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満、最大２０回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満、最大５０回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満、又は最大１００回の倍化の後に細胞当たり０．１コピー未満）、又は最大１回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満（例えば、最大１０回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満、最大２０回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満、最大５０回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満、又は最大１００回の倍化の後に細胞当たり１コピー未満））。

【0118】

幾つかの実施形態には、環状ＤＮＡベクター又は親プラスミドの平均コピー数が細胞当たり少なくとも１コピー、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、少なくとも８コピー、少なくとも９コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも１１コピー、少なくとも１２コピー、少なくとも１３コピー、少なくとも１４コピー、少なくとも１５コピー、少なくとも１６コピー、少なくとも１７コピー、少なくとも１８コピー、少なくとも１９コピー、少なくとも２０コピー、少なくとも２５コピー、少なくとも３０コピー、少なくとも３５コピー、少なくとも４０コピー、少なくとも４５コピー、少なくとも５０コピー、少なくとも５５コピー、少なくとも６０コピー、少なくとも６５コピー、少なくとも７０コピー、少なくとも７５コピー、少なくとも８０コピー、少なくとも８５コピー、少なくとも９０コピー、少なくとも９５コピー、若しくは少なくとも１００コピーであるか、又はこれらの値のいずれか２つの間である操作された細菌細胞の培養物が含まれる。幾つかの実施形態において、この培養物は、少なくとも１０^５個、少なくとも１０^６個、少なくとも１０^７個、少なくとも１０^８個、少なくとも１０^９個、少なくとも１０^１０個、少なくとも１０^１１個、若しくは少なくとも１０^１２個の総細胞、又はこれらの値のいずれか２つの間を含む。幾つかの実施形態において、この培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１０^４個、少なくとも１０^５個、少なくとも１０^６個、少なくとも１０^７個、少なくとも１０^８個、少なくとも１０^９個、若しくは少なくとも１０^１０個の細胞、又はこれらの値のいずれか２つの間を含む。

【0119】

Ｅ．環状ＤＮＡベクターの回収
本明細書に開示される実施形態によって生産された環状ＤＮＡベクターを、当該技術分野において知られる抽出手順及び精製手順によって、操作された細菌の培養物から回収することができる。幾つかの実施形態において、培養された操作された細菌細胞１リットル当たり少なくとも０．００１ｍｇ、少なくとも０．０１ｍｇ、少なくとも０．１ｍｇ、少なくとも０．２ｍｇ、少なくとも０．３ｍｇ、少なくとも０．４ｍｇ、少なくとも０．５ｍｇ、少なくとも０．６ｍｇ、少なくとも０．７ｍｇ、少なくとも０．８ｍｇ、少なくとも０．９ｍｇ、少なくとも１．０ｍｇ、少なくとも１．１ｍｇ、少なくとも１．２ｍｇ、少なくとも１．３ｍｇ、少なくとも１．４ｍｇ、少なくとも１．５ｍｇ、少なくとも１．６ｍｇ、少なくとも１．７ｍｇ、少なくとも１．８ｍｇ、少なくとも１．９ｍｇ、少なくとも２．０ｍｇ、少なくとも２．５ｍｇ、少なくとも３．０ｍｇ、少なくとも３．５ｍｇ、少なくとも４．０ｍｇ、少なくとも４．５ｍｇ、又は少なくとも５．０ｍｇの環状ＤＮＡベクターを回収することができる。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターは、エンドトキシン等の細菌性汚染物質の量を医薬組成物における使用に許容可能なレベルまで低減する精製手順を経る。適切な精製手順としては、陰イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー手順が挙げられる。

【0120】

幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターは、操作された細菌細胞の培養物中に維持され得るバックボーン配列による汚染を更に避けるのにゲル電気泳動によって精製される。幾つかの実施形態において、バックボーン配列による環状ＤＮＡベクターの検出可能な汚染を避けるのに精製は必要ない。

【0121】

幾つかの実施形態において、バックボーン配列又は何らかの他の染色体外ＤＮＡ分子によって精製産物が汚染されることなく、環状ＤＮＡベクターを、本明細書に記載される操作された細菌細胞の培養物から精製することができる。幾つかの実施形態において、本明細書に開示される操作された細菌細胞から精製された単離された環状ＤＮＡベクターの組成物には、バックボーン配列を含むＤＮＡが１０ｎｇ／ｍｌ未満、１ｎｇ／ｍｌ未満、０．１ｎｇ／ｍｌ未満、０．０１ｎｇ／ｍｌ未満、０．００１ｎｇ／ｍｌ未満、又は０．０００１ｎｇ／ｍｌ未満含まれている。幾つかの実施形態において、バックボーン配列を含むＤＮＡは、定量的ＰＣＲによって組成物中で検出不能である。幾つかの実施形態において、これらの純度レベルは、操作された細菌細胞から環状ＤＮＡベクターを単離した後にゲル精製工程又はカラム精製工程を実施することなく達成される。

【0122】

幾つかの実施形態において、本明細書に開示される環状ＤＮＡベクターを作製する方法は、米国食品医薬品局によって公布され、連邦規則集第２１章第２１０条及び第２１１条に規定されている基準に従った現行の適正製造規範（ＧＭＰ）に準拠しており、これらは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。

【0123】

ＩＩＩ．環状ＤＮＡベクター
本明細書において、本明細書に記載される生産方法のいずれかによって生産された環状ＤＮＡベクターが提供される。幾つかの場合においては、このような環状ＤＮＡベクターは、例えばＡＡＶベクターと同様にして、エピソームとして細胞内（例えば、分裂中の細胞内、又は有糸分裂後の細胞等の静止細胞内）に残存する。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、環状ＤＮＡベクターは非組込みベクターであってよい。本明細書において提供される環状ＤＮＡベクターは、ウイルスベクター（例えば、ウイルスタンパク質）及び細菌性プラスミドＤＮＡに固有の構成要素、例えば免疫原性構成要素（例えば、免疫原性細菌性シグネチャー（例えば、ＣｐＧアイランド又はＣｐＧモチーフ））又は追加的な構成要素、又はその他に残存性の低下に関連する構成要素（例えば、ＣｐＧアイランド又はＣｐＧモチーフ）がない裸のＤＮＡベクターであり得る。本明細書に記載されるように生産される環状ＤＮＡベクターは、１つ以上の治療用配列を特徴とし、プラスミドバックボーンエレメント（例えば、薬物耐性遺伝子）を欠いている場合がある。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターは組換え部位を欠いている。幾つかの実施形態において、特に、組換えを使用してプラスミドバックボーン配列からベクター配列を除去する実施形態において、環状ＤＮＡベクターは組換え部位を含む。

【0124】

幾つかの実施形態において、上記ベクターは、ＤＮＡの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は本質的に全て）が、免疫原性構成要素（例えば、免疫原性細菌性シグネチャー（例えば、ＣｐＧモチーフ））又は追加的な構成要素、又はその他に残存性の低下に関連する構成要素（例えば、ＣｐＧアイランド）等の細菌性プラスミドＤＮＡの１つ以上のエレメントを欠いているＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、ＤＮＡの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は本質的に全て）はＣｐＧメチル化を欠いている。幾つかの実施形態において、上記ベクターは、ＤＮＡの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は本質的に全て）がＤａｍメチル化及びＤｃｍメチル化等の細菌性メチル化シグネチャーを欠いているＤＮＡを含む。例えば、幾つかの実施形態において、上記ベクターは、ＧＡＴＣ配列の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は本質的に全て）が（例えば、Ｄａｍメチラーゼにより）メチル化されていないＤＮＡを含む。追加的に又は代替的に、上記ベクターは、ＣＣＡＧＧ配列及び／又はＣＣＴＧＧ配列の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は本質的に全て）が（例えば、Ｄｃｍメチラーゼにより）メチル化されていないＤＮＡを含む。

【0125】

幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターはｉｎ ｖｉｖｏで残存性がある（例えば、環状ＤＮＡベクターは、参照ベクター、例えば、細菌内で生産された環状ＤＮＡベクター、又は本発明のベクター、例えば、プラスミドＤＮＡには存在しない１つ以上の細菌性シグネチャーを有する環状ＤＮＡベクターと比べて、発現残存性（例えば、細胞内残存性及び／又は世代間残存性）及び／又は治療的残存性の改善を示す）。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターの発現残存性は、参照ベクターよりも５％～５０％大きい、５０％～１００％大きい、１倍～５倍又は５倍～１０倍（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、又はそれ以上）大きい。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターの細胞内残存性は、参照ベクターよりも５％～５０％大きい、５０％～１００％大きい、１倍～５倍又は５倍～１０倍（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、又はそれ以上）大きい。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターの世代間残存性は、参照ベクターよりも５％～５０％大きい、５０％～１００％大きい、１倍～５倍又は５倍～１０倍（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、又はそれ以上）大きい。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターの治療的残存性は、参照ベクターよりも５％～５０％大きい、５０％～１００％大きい、１倍～５倍又は５倍～１０倍（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、又はそれ以上）大きい。幾つかの実施形態において、参照ベクターは、（ａ）比較される環状ＤＮＡベクターと同じコーディング配列を有し、かつ（ｂ）比較される環状ＤＮＡベクターには存在しない１つ以上の細菌性シグネチャーを有し、そのシグネチャーに、例えば、抗生物質耐性遺伝子又は他の選択可能なマーカーが含まれ得る環状ベクター又はプラスミドである。

【0126】

幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターの発現は、投与後１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、又はそれ以上にわたって残存する。特定の実施形態において、環状ＤＮＡベクターは、投与後１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、又はそれ以上の細胞内残存性及び／又は世代間残存性を示す。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターの治療的残存性は、投与後１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、又はそれ以上にわたって持続する。

【0127】

幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターの発現及び／又は治療効果は、１週間～４週間、１ヶ月～４ヶ月、又は４ヶ月～１年（例えば、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、又はそれ以上）にわたって残存する。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターの発現レベルは、トランスフェクション後１週間以上、例えば、２週間、３週間、５週間、７週間、９週間以上、１３週間以上、１８週間以上において、最初の１日以内、２日以内、又は３日以内に観察されたレベルから９０％より多く、５０％より多く、又は１０％より多く減少しない。

【0128】

環状ＤＮＡベクターは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体等であってよい。幾つかの好ましい実施形態において、環状ＤＮＡベクターは単量体である。幾つかの実施形態において、このＤＮＡベクターはスーパーコイル状である。環状ＤＮＡベクターは、操作された細菌細胞内の内因性プロセス、又はトポイソメラーゼ（例えば、ジャイレース）での処理により、スーパーコイル状であってよい。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターは単量体スーパーコイル状の環状ＤＮＡ分子である。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターにはニックが入っている。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターは開環状である。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターは二本鎖環状である。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターを含む組成物は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％のスーパーコイル状単量体を含む。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターを含む組成物は、外因性トポイソメラーゼによる処理なしで、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％のスーパーコイル状単量体を含む。

【0129】

ＩＶ．治療用配列
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクターのコーディング配列は、１つ以上のタンパク質コーディングドメイン及び／又は１つ以上の非タンパク質コーディングドメイン（例えば、治療用核酸）を含み得る治療用配列を含む。

【0130】

治療用タンパク質をコードする治療用ドメインを含む特定の実施形態において、治療用配列は、５’→３’方向に連結された、プロモーター及び単一の治療用タンパク質コーディングドメイン（例えば、単一の転写単位）、プロモーター及び２つ以上の治療用タンパク質コーディングドメイン（例えば、マルチシストロン性単位）、又は第１の転写単位及び１つ以上の追加の転写単位（例えば、多重転写単位）を含む。このようなタンパク質をコードする治療用配列はいずれも、ポリアデニル化部位、制御エレメント、エンハンサー、ＤＮＡを標識する配列（例えば、抗体認識用）、ＰＣＲ増幅部位、制限酵素部位を規定する配列、部位特異的リコンビナーゼ認識部位、核酸に結合する及び／又は核酸を修飾するタンパク質によって認識される配列、リンカー、スプライス部位、プレｍＲＮＡ結合ドメイン、制御配列、及び／又は治療用核酸（例えば、マイクロＲＮＡをコードする配列）等の非タンパク質コーディングドメインを更に含んでいてよい。治療用タンパク質コーディングドメインは、全長タンパク質コードドメイン（例えば、本来の遺伝子又はその天然の変異体に対応する）、又は短縮されたタンパク質コードドメイン（例えば、ミニ遺伝子）等のその機能的部分であり得る。

【0131】

幾つかの実施形態において、治療用配列は、単量体タンパク質（例えば、生理学的条件下で二次構造を有する単量体タンパク質、例えば、生理学的条件下で二次構造及び三次構造を有する単量体タンパク質、例えば、生理学的条件下で二次構造、三次構造、及び四次構造を有する単量体タンパク質）をコードする。追加的に又は代替的に、治療用配列は、多量体タンパク質（例えば、二量体タンパク質（例えば、ホモ二量体タンパク質又はヘテロ二量体タンパク質）、三量体タンパク質等）をコードしてもよい。

【0132】

特定の場合においては、治療用配列としては、眼遺伝子が挙げられる。幾つかの実施形態において、眼遺伝子は、例えば光受容細胞及び／又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含み得る、例えば網膜組織等の眼組織において発現される遺伝子である。幾つかの実施形態において、本明細書に開示される発現コンストラクト内のコーディング配列はヒトＡＢＣＡ４遺伝子配列又はヒトＭＹＯ７Ａ遺伝子配列である。例示的なヒトＡＢＣＡ４遺伝子配列は、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）参照配列：ＮＧ＿００９０７３として提供されている。例示的なＡＢＣＡ４タンパク質のアミノ酸配列はタンパク質アクセッション番号Ｐ７８３６３．３によって示されている。例示的なヒトＭＹＯ７Ａ遺伝子配列はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４６４７として提供されている。例示的なＭＹＯ７Ａタンパク質のアミノ酸配列はタンパク質アクセッション番号Ｑ１３４０２によって示されている。

【0133】

幾つかの実施形態において、治療用配列は抗体、又はその部分、フラグメント、若しくは変異体をコードする。抗体には、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、（Ｆａｂ’）２（化学的に連結されたＦ（ａｂ’）２を含む）、及びナノボディ等の抗原に結合することが可能なフラグメントが含まれる。抗体のパパイン消化により、それぞれ単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、その容易に結晶化する能力を反映した名称の残留「Ｆｃ」フラグメントとが生ずる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。抗体にはキメラ抗体及びヒト化抗体も含まれる。さらに、本明細書において提供される全ての抗体コンストラクトについては、他の生物由来の配列を有する変異体も企図される。したがって、ヒト型の抗体が開示される場合、当業者は、ヒト配列ベースの抗体をマウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ等の配列に変換する方法を理解するであろう。抗体フラグメントには、単鎖ｓｃＦｖ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、タンデムトリ－ｓｄｃＦｖ、ミニボディ、ナノボディ等のいずれかの方向性も含まれる。幾つかの実施形態において、例えば抗体がｓｃＦｖである場合、治療用遺伝子配列の単一のポリヌクレオチドは、重鎖及び軽鎖の両方が一緒に連結されたものを含む単一のポリペプチドをコードする。抗体フラグメントには、ナノボディ（例えば、ｓｄＡｂ、軽鎖を有しない重鎖の可変ドメインのペア等の単一の単量体ドメインを有する抗体）も含まれる。多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体等）は、当該技術分野において知られており、本発明の治療用遺伝子配列の発現産物として考慮される。

【0134】

幾つかの場合においては、治療用配列は、それぞれ少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも１０００アミノ酸、少なくとも１５００アミノ酸、少なくとも２０００アミノ酸、少なくとも２５００アミノ酸、少なくとも３０００アミノ酸、又はそれ以上（例えば、２５アミノ酸～５０００アミノ酸、５０アミノ酸～５０００アミノ酸、１００アミノ酸～５０００アミノ酸、２００アミノ酸～５０００アミノ酸、５００アミノ酸～５０００アミノ酸、１０００アミノ酸～５０００アミノ酸、１５００アミノ酸～５０００アミノ酸、又は２０００アミノ酸～５０００アミノ酸、例えば、２５アミノ酸～４０００アミノ酸、５０アミノ酸～４０００アミノ酸、１００アミノ酸～４０００アミノ酸、２００アミノ酸～４０００アミノ酸、５００アミノ酸～４０００アミノ酸、１０００アミノ酸～４０００アミノ酸、１５００アミノ酸～４０００アミノ酸、又は２０００アミノ酸～４０００アミノ酸、例えば、２５アミノ酸～３０００アミノ酸、５０アミノ酸～３０００アミノ酸、１００アミノ酸～３０００アミノ酸、２００アミノ酸～３０００アミノ酸、５００アミノ酸～３０００アミノ酸、１０００アミノ酸～３０００アミノ酸、１５００アミノ酸～３０００アミノ酸、又は２０００アミノ酸～３０００アミノ酸）の長さを有する１つ以上のタンパク質（例えば、単一のタンパク質、２つのタンパク質、３つのタンパク質、４つのタンパク質、又はそれ以上）をコードする。このような治療用配列が２つ以上のタンパク質をコードする実施形態において、治療用配列は、マルチシストロン性治療用配列又は多重転写単位治療用配列であり得る。このようなマルチシストロン性治療用配列は、例えば、本明細書の実施例７に記載されるＦｌｔ３Ｌ、ＩＬ－１２、及びＸＣＬ１をコードするトリシストロン性カセットであってよい。

【0135】

タンパク質をコードしない治療用配列を含む実施形態において、治療用配列はタンパク質コードドメイン（例えば、治療用タンパク質コーディングドメイン）を欠いている。例えば、幾つかの実施形態において、治療用配列には、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする配列又は免疫活性化治療用核酸（例えば、ＴＬＲアゴニスト）等のタンパク質をコードしない治療用核酸が含まれる。

【0136】

幾つかの実施形態において、治療用配列又は他の対象配列（これは、発現又は残存性を測定するのに使用されるレポーター遺伝子等の非治療用コーディング配列を含み得る）は、０．１Ｋｂ～１００Ｋｂの長さである（例えば、この配列は、０．２Ｋｂ～９０Ｋｂ、０．５Ｋｂ～８０Ｋｂ、１．０Ｋｂ～７０Ｋｂ、１．５Ｋｂ～６０Ｋｂ、２．０Ｋｂ～５０Ｋｂ、２．５Ｋｂ～４５Ｋｂ、３．０Ｋｂ～４０Ｋｂ、３．５Ｋｂ～３５Ｋｂ、４．０Ｋｂ～３０Ｋｂ、４．５Ｋｂ～２５Ｋｂ、４．６Ｋｂ～２４Ｋｂ、４．７Ｋｂ～２３Ｋｂ、４．８Ｋｂ～２２Ｋｂ、４．９Ｋｂ～２１Ｋｂ、５．０Ｋｂ～２０Ｋｂ、５．５Ｋｂ～１８Ｋｂ、６．０Ｋｂ～１７Ｋｂ、６．５Ｋｂ～１６Ｋｂ、７．０Ｋｂ～１５Ｋｂ、７．５Ｋｂ～１４Ｋｂ、８．０Ｋｂ～１３Ｋｂ、８．５Ｋｂ～１２．５Ｋｂ、９．０Ｋｂ～１２．０Ｋｂ、９．５Ｋｂ～１１．５Ｋｂ、又は１０．０Ｋｂ～１１．０Ｋｂの長さ、例えば、０．１Ｋｂ～０．５Ｋｂ、０．５Ｋｂ～１．０Ｋｂ、１．０Ｋｂ～２．５Ｋｂ、２．５Ｋｂ～４．５Ｋｂ、４．５Ｋｂ～８Ｋｂ、８Ｋｂ～１０Ｋｂ、１０Ｋｂ～１５Ｋｂ、１５Ｋｂ～２０Ｋｂの長さ又はそれ以上、例えば、０．１Ｋｂ～０．２５Ｋｂ、０．２５Ｋｂ～０．５Ｋｂ、０．５Ｋｂ～１．０Ｋｂ、１．０Ｋｂ～１．５Ｋｂ、１．５Ｋｂ～２．０Ｋｂ、２．０Ｋｂ～２．５Ｋｂ、２．５Ｋｂ～３．０Ｋｂ、３．０Ｋｂ～３．５Ｋｂ、３．５Ｋｂ～４．０Ｋｂ、４．０Ｋｂ～４．５Ｋｂ、４．５Ｋｂ～５．０Ｋｂ、５．０Ｋｂ～５．５Ｋｂ、５．５Ｋｂ～６．０Ｋｂ、６．０Ｋｂ～６．５Ｋｂ、６．５Ｋｂ～７．０Ｋｂ、７．０Ｋｂ～７．５Ｋｂ、７．５Ｋｂ～８．０Ｋｂ、８．０Ｋｂ～８．５Ｋｂ、８．５Ｋｂ～９．０Ｋｂ、９．０Ｋｂ～９．５Ｋｂ、９．５Ｋｂ～１０Ｋｂ、１０Ｋｂ～１０．５Ｋｂ、１０．５Ｋｂ～１１Ｋｂ、１１Ｋｂ～１１．５Ｋｂ、１１．５Ｋｂ～１２Ｋｂ、１２Ｋｂ～１２．５Ｋｂ、１２．５Ｋｂ～１３Ｋｂ、１３Ｋｂ～１３．５Ｋｂ、１３．５Ｋｂ～１４Ｋｂ、１４Ｋｂ～１４．５Ｋｂ、１４．５Ｋｂ～１５Ｋｂ、１５Ｋｂ～１５．５Ｋｂ、１５．５Ｋｂ～１６Ｋｂ、１６Ｋｂ～１６．５Ｋｂ、１６．５Ｋｂ～１７Ｋｂ、１７Ｋｂ～１７．５Ｋｂ、１７．５Ｋｂ～１８Ｋｂ、１８Ｋｂ～１８．５Ｋｂ、１８．５Ｋｂ～１９Ｋｂ、１９Ｋｂ～１９．５Ｋｂ、１９．５Ｋｂ～２０Ｋｂ、２０Ｋｂ～２１Ｋｂ、２１Ｋｂ～２２Ｋｂ、２２Ｋｂ～２３Ｋｂ、２３Ｋｂ～２４Ｋｂ、２４Ｋｂ～２５Ｋｂの長さ又はそれ以上、例えば、約４．５Ｋｂ、約５．０Ｋｂ、約５．５Ｋｂ、約６．０Ｋｂ、約６．５Ｋｂ、約７．０Ｋｂ、約７．５Ｋｂ、約８．０Ｋｂ、約８．５Ｋｂ、約９．０Ｋｂ、約９．５Ｋｂ、約１０Ｋｂ、約１１Ｋｂ、約１２Ｋｂ、約１３Ｋｂ、約１４Ｋｂ、約１５Ｋｂ、約１６Ｋｂ、約１７Ｋｂ、約１８Ｋｂ、約１９Ｋｂ、約２０Ｋｂの長さ又はそれ以上である）。幾つかの実施形態において、治療用配列は、少なくとも１０Ｋｂ（例えば、１０Ｋｂ～１５Ｋｂ、１５Ｋｂ～２０Ｋｂ、又は２０Ｋｂ～３０Ｋｂ、例えば、１０Ｋｂ～１３Ｋｂ、１０Ｋｂ～１２Ｋｂ、又は１０Ｋｂ～１１Ｋｂ、例えば、１０Ｋｂ～１１Ｋｂ、１１Ｋｂ～１２Ｋｂ、１２Ｋｂ～１３Ｋｂ、１３Ｋｂ～１４Ｋｂ、又は１４Ｋｂ～１５Ｋｂ）である。幾つかの実施形態において、上記配列は、少なくとも１１００ｂｐの長さ（例えば、１１００ｂｐ～１００００ｂｐ、１１００ｂｐ～８０００ｂｐ、又は１１００ｂｐ～５０００ｂｐの長さ）である。幾つかの実施形態において、上記配列は、少なくとも２５００ｂｐの長さ（例えば、２５００ｂｐ～１５０００ｂｐ、２５００ｂｐ～１００００ｂｐ、又は２５００ｂｐ～５０００ｂｐの長さ、例えば、２５００ｂｐ～５０００ｂｐ、５０００ｂｐ～７５００ｂｐ、７５００ｂｐ～１００００ｂｐ、１００００ｂｐ～１２５００ｂｐ、又は１２５００ｂｐ～１５０００ｂｐ）である。幾つかの実施形態において、上記配列は、少なくとも８０００ｂｐ、少なくとも９０００ｂｐ、少なくとも１００００ｂｐ、少なくとも１１０００ｂｐ、少なくとも１２０００ｂｐ、少なくとも１３０００ｂｐ、少なくとも１４０００ｂｐ、少なくとも１５０００ｂｐ、少なくとも１６０００ｂｐ（例えば、１１０００ｂｐ～１６０００ｂｐ、１２０００ｂｐ～１６０００ｂｐ、１３０００ｂｐ～１６０００ｂｐ、１４０００ｂｐ～１６０００ｂｐ、又は１５０００ｂｐ～１６０００ｂｐ）である。特定の実施形態において、上記配列は、タンパク質をコードするのに十分な大きさであり、オリゴヌクレオチド療法薬ではない（例えば、アンチセンス療法薬、ｓｉＲＮＡ療法薬、ｓｈＲＮＡ療法薬等ではない）。

【0137】

幾つかの実施形態において、治療用コーディング配列又は非治療用コーディング配列等の対象配列の３’末端は、５０ｂｐ以下（例えば、３ｂｐ～３４ｂｐ、４ｂｐ～２０ｂｐ、５ｂｐ～１２ｂｐ、又は６ｂｐ～１０ｂｐ、例えば、３ｂｐ～５ｂｐ、４ｂｐ～６ｂｐ、８ｂｐ～１２ｂｐ、１２ｂｐ～１８ｂｐ、１８ｂｐ～２４ｂｐ、２４ｂｐ～３０ｂｐ、３０ｂｐ～３５ｂｐ、又は３５ｂｐ～４０ｂｐ、例えば、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３１ｂｐ、３２ｂｐ、３３ｂｐ、３４ｂｐ、３５ｂｐ、３６ｂｐ、３７ｂｐ、３８ｂｐ、３９ｂｐ、４０ｂｐ、４１ｂｐ、４２ｂｐ、４３ｂｐ、４４ｂｐ、４５ｂｐ、４６ｂｐ、４７ｂｐ、４８ｂｐ、４９ｂｐ、又は５０ｂｐ）の非細菌性配列（例えば、組換え部位、例えば組換えｓｃａｒ）によって環状ＤＮＡベクター内のｏｒｉ配列の５’末端に接続されている。

【0138】

幾つかの実施形態において、治療用コーディング配列又は非治療用コーディング配列等の対象配列の３’末端は、３０ｂｐ以下（例えば、３ｂｐ～２４ｂｐ、４ｂｐ～１８ｂｐ、５ｂｐ～１２ｂｐ、又は６ｂｐ～１０ｂｐ、例えば、３ｂｐ～５ｂｐ、４ｂｐ～６ｂｐ、８ｂｐ～１２ｂｐ、１２ｂｐ～１８ｂｐ、１８ｂｐ～２４ｂｐ、又は２４ｂｐ～３０ｂｐ、例えば、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、又は３０ｂｐ）の非細菌性配列によって環状ＤＮＡベクター内のｏｒｉ配列の５’末端に接続されている。

【0139】

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクターに含まれる対象配列は、タンパク質をコードする治療用ドメイン又はタンパク質をコードしない治療用ドメインに加えて、レポーター配列を含む。幾つかの実施形態において、治療用配列はレポーター配列を欠いている。幾つかの実施形態において、対象配列はレポーター配列を含み、治療用配列を含まない。レポーター配列は、例えば、レポーター遺伝子であり得る。このようなレポーター遺伝子は、例えば特定の細胞及び組織における治療用遺伝子配列の発現を検証するのに有用であり得る。環状ＤＮＡベクターに提供され得るレポーター配列としては、限定されるものではないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野においてよく知られるその他のものをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。レポーター配列は、その発現を駆動する制御エレメントと会合したとき、酵素アッセイ、放射線アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイ、又はその他の分光アッセイ、蛍光活性化セルソーティングアッセイ、並びに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む従来の手段によって検出可能なシグナルをもたらす。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを媒介するベクターの存在がβ－ガラクトシダーゼ活性のアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼである場合、シグナルを媒介するベクターをルミノメーターにおいて発色又は発光によって視覚的に測定することができる。

【0140】

治療用配列又はその他の対象配列の一部として、本発明の環状ＤＮＡベクターは、標的細胞における転写、翻訳、及び／又は発現を調節又は改善する従来の制御エレメントを含んでよい。適切な制御エレメントは国際公開第２０２１／０５５７６０号に記載されており、これは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。

【0141】

幾つかの場合においては、自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）レプリカーゼをコードする配列（例えば、自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列）と、（ｉｉ）異種調節遺伝子とを含む。ポリメラーゼはアルファウイルスレプリカーゼ、例えば、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４の１つ、２つ、３つ、又は４つ全てを含むアルファウイルスレプリカーゼであり得る。幾つかの場合においては、ポリメラーゼはＶＥＥレプリカーゼ、例えば、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４の１つ、２つ、３つ、又は４つ全てを含むＶＥＥレプリカーゼである。

【0142】

本発明の幾つかの場合においては、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質（例えば、カプシドタンパク質）をコードしない。このような自己複製ＲＮＡは、細胞内で自身のゲノムＲＮＡコピーの生成につながり得るが、ＲＮＡを含むビリオンの生成にはつながり得ない。これらのビリオンを生成することができないということは、野生型のアルファウイルスとは異なり、自己複製するＲＮＡ分子が感染性形態でそれ自体存続することができないことを意味する。サブゲノム転写物がアルファウイルスビリオンの構造タンパク質ではなく、異種調節タンパク質（複数の場合もある）をコードするように、アルファウイルスの構造タンパク質を、対象の異種調節タンパク質（複数の場合もある）をコードする遺伝子（複数の場合もある）によって置き換えることができる。

【0143】

したがって、幾つかの場合においては、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は２つのオープンリーディングフレームを有し得る。第１（５’）のオープンリーディングフレームはレプリカーゼをコードし、第２（３’）のオープンリーディングフレームは１つ以上（例えば、２つ又は３つ）の治療用タンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、このＲＮＡは、例えば更なる遺伝子をコードするか、又は補助ポリペプチド（accessory polypeptides）をコードする追加の（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有してよい。

【0144】

適切な自己複製ＲＮＡ分子は様々な長さを有し得る。本発明の幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子の長さは５０００ヌクレオチド～５００００ヌクレオチド（すなわち、５ｋｂ～５０ｋｂ）である。幾つかの場合において、自己複製ＲＮＡ分子は、５ｋｂ～２０ｋｂの長さ（例えば、６ｋｂ～１８ｋｂ、７ｋｂ～１６ｋｂ、８ｋｂ～１４ｋｂ、又は９ｋｂ～１２ｋｂの長さ、例えば、５ｋｂ～６ｋｂ、６ｋｂ～７ｋｂ、７ｋｂ～８ｋｂ、８ｋｂ～９ｋｂ、９ｋｂ～１０ｋｂ、１０ｋｂ～１１ｋｂ、１１ｋｂ～１２ｋｂ、１２ｋｂ～１３ｋｂ、１３ｋｂ～１４ｋｂ、１４ｋｂ～１５ｋｂ、１５ｋｂ～１６ｋｂ、１６ｋｂ～１８ｋｂ、又は１８ｋｂ～２０ｋｂの長さ、例えば、約５ｋｂ、約６ｋｂ、約７ｋｂ、約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１０．５ｋｂ、約１１ｋｂ、約１１．５ｋｂ、約１２ｋｂ、約１２．５ｋｂ、約１３ｋｂ、約１４ｋｂ、約１５ｋｂ、約１６ｋｂ、約１７ｋｂ、約１８ｋｂ、約１９ｋｂ、又は約２０ｋｂの長さ）である。

【0145】

自己複製ＲＮＡ分子は３’ポリＡテールを有してよい。さらに、自己複製ＲＮＡ分子は、ポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含んでよい。

【0146】

特定の実施形態において、本発明によるＲＮＡは、ルシフェラーゼ等のレポーター分子、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質をコードしない。

【0147】

幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡによってコードされるレプリカーゼは、本明細書に記載されるレプリカーゼのいずれかの変異体であり得る。幾つかの実施形態において、変異体は機能的断片（例えば、タンパク質と機能的に類似又は機能的に等価なタンパク質の断片）である。

【0148】

Ｖ．医薬組成物
効率の向上により、本発明の方法は、環状ＤＮＡベクターを含む医薬組成物の拡張可能な製造に特に適したものとなる。本明細書に記載される環状ＤＮＡベクターを生産する方法のいずれも、薬学的に許容可能な担体中に環状ＤＮＡベクターを含む医薬組成物の生産に適応させることができる。

【0149】

本明細書に記載される方法のいずれかの一部として、下流の精製プロセスを容易に適用することができる。例えば、様々なクロマトグラフィー工程が当該技術分野において知られており、これを細菌副産物、エンドトキシン、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヘルパープラスミド等の除去に適切に適応させることができる。幾つかの場合においては、細菌によって生産される環状ＤＮＡベクターの医薬組成物は、陰イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製される。

【0150】

幾つかの実施形態において、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容可能な担体中に少なくとも１．０ｍｇ（例えば、１．０ｍｇ～１０ｇ、１．０ｍｇ～５．０ｇ、１．０ｍｇ～１．０ｇ、１．０ｍｇ～５００ｍｇ、１．０ｍｇ～２００ｍｇ、１．０ｍｇ～１００ｍｇ、１．０ｍｇ～５０ｍｇ、１．０ｍｇ～２５ｍｇ、１．０ｍｇ～２０ｍｇ、１．０ｍｇ～１５ｍｇ、１．０ｍｇ～１０ｍｇ、１．０ｍｇ～５．０ｍｇ、２．０ｍｇ～１０ｇ、２．０ｍｇ～５．０ｇ、２．０ｍｇ～１．０ｇ、２．０ｍｇ～５００ｍｇ、２．０ｍｇ～２００ｍｇ、２．０ｍｇ～１００ｍｇ、２．０ｍｇ～５０ｍｇ、２．０ｍｇ～２５ｍｇ、２．０ｍｇ～２０ｍｇ、２．０ｍｇ～１５ｍｇ、２．０ｍｇ～１０ｍｇ、２．０ｍｇ～５．０ｍｇ、５．０ｍｇ～１０ｇ、５．０ｍｇ～５．０ｇ、５．０ｍｇ～１．０ｇ、５．０ｍｇ～５００ｍｇ、５．０ｍｇ～２００ｍｇ、５．０ｍｇ～１００ｍｇ、５．０ｍｇ～５０ｍｇ、５．０ｍｇ～２５ｍｇ、５．０ｍｇ～２０ｍｇ、５．０ｍｇ～１５ｍｇ、５．０ｍｇ～１０ｍｇ、１０ｍｇ～１０ｇ、１０ｍｇ～５．０ｇ、１０ｍｇ～１．０ｇ、１０ｍｇ～５００ｍｇ、１０ｍｇ～２００ｍｇ、１０ｍｇ～１００ｍｇ、１０ｍｇ～５０ｍｇ、１０ｍｇ～２５ｍｇ、１０ｍｇ～２０ｍｇ、又は１０ｍｇ～１５ｍｇ）の環状ＤＮＡベクターを含む。

【0151】

幾つかの実施形態において、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容可能な担体中に少なくとも２．０ｍｇの環状ＤＮＡベクターを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法のいずれかによって生産される医薬製剤は、薬学的に許容可能な担体中に少なくとも５．０ｍｇの環状ＤＮＡベクターを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法のいずれかによって生産される医薬製剤は、薬学的に許容可能な担体中に少なくとも１０．０ｍｇの環状ＤＮＡベクターを含む。

【0152】

幾つかの実施形態において、本発明の医薬製剤には実質的に不純物が存在しない。例えば、幾つかの実施形態において、医薬製剤は、２．０％未満の質量基準のタンパク質含有量（例えば、１．９％未満、１．８％未満、１．７％未満、１．６％未満、１．５％未満、１．４％未満、１．３％未満、１．２％未満、１．１％未満、１．０％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０５％未満、又は０．０１％未満の質量基準のタンパク質含有量）を含む。幾つかの場合においては、タンパク質含有量はビシンコニン酸アッセイによって決定される。追加的に又は代替的に、タンパク質含有量はＥＬＩＳＡによって決定される。

【0153】

幾つかの場合においては、医薬製剤は、５．０％未満の質量基準のＲＮＡ含有量（例えば、４．５％未満、４．０％未満、３．５％未満、３．０％未満、２．５％未満、２．０％未満、１．９％未満、１．８％未満、１．７％未満、１．６％未満、１．５％未満、１．４％未満、１．３％未満、１．２％未満、１．１％未満、１．０％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０５％未満、又は０．０１％未満の質量基準のＲＮＡ含有量）を含む。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ含有量はアガロースゲル電気泳動によって決定される。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ含有量は定量的ＰＣＲによって決定される。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ含有量は蛍光アッセイ（例えば、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）によって決定される。

【0154】

幾つかの実施形態においては、医薬製剤は、５．０％未満の質量基準のｇＤＮＡ含有量（例えば、４．５％未満、４．０％未満、３．５％未満、３．０％未満、２．５％未満、２．０％未満、１．９％未満、１．８％未満、１．７％未満、１．６％未満、１．５％未満、１．４％未満、１．３％未満、１．２％未満、１．１％未満、１．０％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０５％未満、又は０．０１％未満の質量基準のｇＤＮＡ含有量）を含む。幾つかの実施形態において、ｇＤＮＡ含有量はアガロースゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動によって決定される。幾つかの実施形態において、ｇＤＮＡ含有量は定量的ＰＣＲによって決定される。幾つかの実施形態において、ｇＤＮＡ含有量はサザンブロットによって決定される。

【0155】

幾つかの実施形態において、医薬製剤は４０ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンを含む。幾つかの実施形態において、医薬製剤は２０ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンを含む。幾つかの実施形態において、医薬製剤は１０ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンを含む。幾つかの実施形態において、医薬製剤は、例えばカブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）アッセイによって測定した場合に、５ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシン（例えば、４ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシン、３ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシン、２ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシン、１ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシン、０．５ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシン）を含む。

【0156】

幾つかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、米国食品医薬品局によって公布され、連邦規則集第２１章第２１０条及び第２１１条に規定されている基準に従った現行の適正製造規範（ＧＭＰ）に準拠しており、これらは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。

【0157】

本明細書において提供される医薬組成物は、治療される個体（例えば、ヒト患者）に対して無毒である賦形剤及び／又は安定剤等の１種以上の薬学的に許容可能な担体を、使用される投薬量及び濃度で含んでよい。幾つかの実施形態において、薬学的に許容可能な担体は水性ｐＨ緩衝溶液である。薬学的に許容可能な担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール若しくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はｔｗｅｅｎ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びｐｌｕｒｏｎｉｃ等の非イオン界面活性剤が挙げられる。

【0158】

医薬組成物を液体形態で提供する場合、薬学的に許容可能な担体は、水（例えば、パイロジェンフリー水）、等張食塩水、又は緩衝水溶液、例えば、リン酸緩衝溶液又はクエン酸緩衝溶液であり得る。医薬組成物の注射は、水、又は例えば、ナトリウム塩（例えば、少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩）、カルシウム塩（例えば、少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩）、若しくはカリウム塩（例えば、少なくとも３ｍＭのカリウム塩）を含有する水性緩衝液等の緩衝液中で行うことができる。特定の実施形態によると、ナトリウム塩、カルシウム塩、又はカリウム塩は、それらのハロゲン化物、例えば、塩化物、ヨウ化物、又は臭化物の形態、それらの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、又は硫酸塩等の形態で生じ得る。限定されるものではないが、ナトリウム塩の例としては、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ_２ＣＯ_２、ＮａＨＣＯ_２、及びＮａ_２ＳＯ_４が挙げられる。カリウム塩の例としては、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ_２ＣＯ_２、ＫＨＣＯ_２、及びＫ_２ＳＯ_４が挙げられる。カルシウム塩の例としては、例えば、ＣａＣｌ_２、ＣａＩ_２、ＣａＢｒ_２、ＣａＣＯ_２、ＣａＳＯ_４、及びＣａ（ＯＨ）_２が挙げられる。さらに、上述のカチオンの有機アニオンが緩衝液中に含有されていてもよい。特定の実施形態によると、上で定義された注射目的に適した緩衝液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）又は塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含有していてもよく、更なるアニオンが存在していてもよい。ＣａＣｌ_２をＫＣｌ等の別の塩に置き換えることもできる。幾つかの実施形態において、注射緩衝液中の塩は、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、及び少なくとも０．０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）の濃度で存在する。注射緩衝液は、特定の参照媒体を基準にして高張、等張、又は低張であってもよく、すなわち、緩衝液は、特定の参照媒体を基準にして、より高い、同一の又はより低い塩含有量を有していてもよく、好ましくは、浸透圧又は他の濃度効果による細胞の損傷を引き起こさない濃度の上述の塩が使用され得る。参照媒体は、血液、リンパ液、細胞質液、他の体液、又は一般的な緩衝液等の液体であり得る。かかる一般的な緩衝液又は液体は、当業者に既知である。乳酸リンゲル液が、液体基剤として特に好ましい。

【0159】

１つ以上の適合性の固体又は液体の充填剤、希釈剤、又は封入化合物が個体（person）への投与に適し得る。本発明による医薬組成物の構成成分は、典型的な使用条件下で本発明による（医薬）組成物の薬学的有効性を大幅に低下させる相互作用が生じないような方法で、本明細書において定義される本発明による核酸ベクターと混合することが可能である。薬学的に許容可能な担体、充填剤及び希釈剤は、治療される個体への投与に適したものとなるように、十分に高い純度及び十分に低い毒性を有し得る。薬学的に許容可能な担体、充填剤、又はその構成成分として使用することができる化合物の幾つかの例は、ラクトース、グルコース、トレハロース、及びスクロース等の糖；トウモロコシデンプン若しくはジャガイモデンプン等のデンプン；デキストロース；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース等のセルロース及びその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；獣脂；ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム等の固体流動促進剤；硫酸カルシウム；ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びカカオ由来の油等の植物油；ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール等のポリオール；又はアルギン酸である。

【0160】

薬学的に許容可能な担体の選択は、医薬組成物を投与する方法に応じて決定することができる。

【0161】

注射に適した単位投与形態としては、水、生理食塩水、及びそれらの混合物の滅菌溶液が挙げられる。かかる溶液のｐＨは、約７．４に調整することができる。注射に適した担体としては、ヒドロゲル、制御放出又は遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸、及びコラーゲンマトリックスが挙げられる。局所適用に適した薬学的に許容可能な担体には、ローション、クリーム、ゲル等への使用に適したものが含まれる。医薬組成物を経口投与する場合、錠剤、カプセル等が好ましい単位投与形態である。

【0162】

医薬組成物に含まれ得る更なる添加剤は、ｔｗｅｅｎ等の乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤、着色剤、医薬担体、安定剤、酸化防止剤、及び防腐剤である。

【0163】

本発明による医薬組成物は、液体で、又は乾燥（例えば、凍結乾燥）形態で提供され得る。特定の実施形態において、医薬組成物の核酸ベクターは、凍結乾燥形態で提供される。本発明の核酸ベクターを含む凍結乾燥組成物は、投与前に、有利には水性担体をベースとする好適な緩衝液、例えば、乳酸リンゲル液、リンゲル液、又はリン酸緩衝溶液中で再構成することができる。

【0164】

本発明の或る特定の実施形態において、本発明の環状ＤＮＡベクターのいずれかを、１つ以上のカチオン性若しくはポリカチオン性の化合物、例えば、カチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー、カチオン性若しくはポリカチオン性のペプチド若しくはタンパク質、例えば、プロタミン、カチオン性若しくはポリカチオン性の多糖、及び／又はカチオン性若しくはポリカチオン性の脂質と複合体形成させることができる。

【0165】

特定の実施形態によると、本発明の環状ＤＮＡベクターを脂質と複合体形成させて、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を形成することができる。したがって、一実施形態において、医薬組成物は、環状ＤＮＡベクターを含むリポソーム、リポプレックス、及び／又は脂質ナノ粒子を含む。

【0166】

脂質ベースの製剤は、その生体適合性及びその大規模生産の容易さから、核酸ベクターの効果的な送達系であり得る。カチオン性脂質は、核酸の送達のための合成材料として広く研究されている。混合後に、核酸がカチオン性脂質によって縮合され、リポプレックスとして知られる脂質／核酸複合体が形成される。これらの脂質複合体は、ヌクレアーゼの作用から遺伝物質を保護し、負に帯電した細胞膜と相互作用することによって遺伝物質を細胞内に送達することができる。リポプレックスは、正に帯電した脂質と負に帯電した核酸とを生理的ｐＨで直接混合することによって作製することができる。

【0167】

従来のリポソームは、カチオン性、アニオン性、又は中性のリン脂質とコレステロールとで構成され得る脂質二重層を含み、脂質二重層が水性コアを取り囲む。脂質二重層及び水性空間はどちらも、それぞれ疎水性又は親水性の化合物を組み込むことができる。リポソームの特性及びｉｎ ｖｉｖｏでの挙動は、親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をリポソーム表面に付加して、立体安定化をもたらすことによって変更することができる。さらに、リポソームは、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物）を、その表面に又は付着させるＰＥＧ鎖の末端に付着させることによって特異的標的化に使用することができる。

【0168】

リポソームは、水性コンパートメントを取り囲むリン脂質二重層で構成されたコロイド状の脂質ベース及び界面活性剤ベースの送達系である。リポソームは、球形の小胞として存在することができ、サイズは２０ｎｍ～数ミクロンの範囲であり得る。カチオン性脂質ベースのリポソームは、負に帯電した核酸と静電相互作用によって複合体形成させることができ、ｉｎ ｖｉｖｏ臨床用途に必要とされる生体適合性、低毒性、及び大規模生産の可能性をもたらす複合体を生じる。リポソームは、取込みのために原形質膜と融合することができる。細胞内に入ると、リポソームがエンドサイトーシス経路によってプロセシングされ、遺伝物質が続いてエンドソーム／担体から細胞質へと放出される。

【0169】

カチオン性リポソームは、環状ＤＮＡベクターの送達系として機能することができる。ＭＡＰ、（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルスルフェート）等のカチオン性脂質は、負に帯電した核酸と静電相互作用によって複合体又はリポプレックスを形成して、ナノ粒子を形成することができ、高いｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率をもたらす。さらに、核酸ベクター送達のための中性脂質ベースのナノリポソーム、例えば、中性１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）ベースのナノリポソームが利用可能である。

【0170】

このため、本発明の一実施形態において、環状ＤＮＡベクターをカチオン性脂質及び／又は中性脂質と複合体形成させ、それにより、本医薬組成物において、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス又は中性脂質ベースのナノリポソームを形成する。

【0171】

特定の実施形態において、医薬組成物は、カチオン性若しくはポリカチオン性の化合物、及び／又はポリマー担体とともに配合される本発明の環状ＤＮＡベクターを含む。したがって、本発明の更なる実施形態において、本明細書において定義される環状ＤＮＡベクターは、任意に約５：１（ｗ／ｗ）～約０．２５：１（ｗ／ｗ）、例えば、約５：１（ｗ／ｗ）～約０．５：１（ｗ／ｗ）、例えば、約４：１（ｗ／ｗ）～約１：１（ｗ／ｗ）若しくは約３：１（ｗ／ｗ）～約１：１（ｗ／ｗ）、例えば、約３：１（ｗ／ｗ）～約２：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択される核酸ベクターとカチオン性若しくはポリカチオン性の化合物及び／又はポリマー担体との重量比で、又は任意に約０．１～１０の範囲、例えば、約０．３～４若しくは０．３～１の範囲、例えば、約０．５～１若しくは０．７～１の範囲、例えば、約０．３～０．９若しくは０．５～０．９の範囲の核酸ベクターとカチオン性若しくはポリカチオン性の化合物及び／又はポリマー担体との窒素／リン酸（Ｎ／Ｐ）比で、カチオン性若しくはポリカチオン性の化合物又はポリマー担体と会合又は複合体形成させる。例えば、環状ＤＮＡベクターと１つ以上のポリカチオンとのＮ／Ｐ比は、約０．３～４、約０．５～２、約０．７～２及び約０．７～１．５の範囲を含む約０．１～１０の範囲である。

【0172】

本明細書に記載される核酸ベクターは、トランスフェクション効率及び／又は本発明による調節遺伝子の発現を増加させるためのビヒクル、トランスフェクション剤又は複合体形成剤と会合させることもできる。

【0173】

幾つかの例において、本発明による環状ＤＮＡベクターを１つ以上のポリカチオン、好ましくはプロタミン又はオリゴフェクタミンと複合体形成させる。トランスフェクション剤又は複合体形成剤として使用され得る更なるカチオン性又はポリカチオン性の化合物としては、カチオン性多糖、例えばキトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カチオン性脂質、例えばＤＯＴＭＡ：［１－（２，３－）プロピル）］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ－Ｃ１４－アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＬＥＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＭＡＰ：ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ－６－１４：Ｏ，Ｏ－ジテトラデカノイル－Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ－［（２，３－ジオクタデシルオキシプロピル）（２－ヒドロキシエチル）］－ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ－［２（２，３－ジヘキサデシルオキシプロピル－オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ－［２（２，３－ジヘキサデシルオキシプロピル－オキシスクシニルオキシ）エチル］－トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、又はカチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー、例えば修飾ポリアミノ酸、例えばβ－アミノ酸ポリマー若しくは逆ポリアミド等、修飾ポリエチレン、例えばＰＶＰ（ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジニウムブロミド））等、修飾アクリレート、例えばｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート））等、修飾アミドアミン、例えばｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等、修飾ポリβ－アミノエステル（ＰＢＡＥ）、例えばジアミン末端修飾１，４－ブタンジオールジアクリレート－ｃｏ－５－アミノ－１－ペンタノールポリマー等、デンドリマー、例えばポリプロピルアミンデンドリマー若しくはｐＡＭＡＭベースのデンドリマー等、ポリイミン（類）、例えばＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）等、ポリアリルアミン、糖骨格ベースのポリマー、例えばシクロデキストリンベースのポリマー、デキストランベースのポリマー、キトサン等、シラン骨格ベースのポリマー、例えばＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳコポリマー等、１つ以上のカチオン性ブロック（例えば上述のようなカチオン性ポリマーから選択される）と１つ以上の親水性若しくは疎水性のブロック（例えばポリエチレングリコール）との組合せからなるブロックポリマー等を挙げることができる。

【0174】

特定の実施形態によると、医薬組成物は、ポリマー担体内に封入されるか、又はポリマー担体に付着した環状ＤＮＡベクターを含む。本発明に従って使用されるポリマー担体は、ジスルフィド架橋カチオン性構成要素によって形成されたポリマー担体であり得る。ジスルフィド架橋カチオン性構成要素は、互いに同じであっても、又は異なっていてもよい。ポリマー担体は、更なる構成要素を含有することもできる。本発明に従って使用されるポリマー担体が、本明細書に記載されるようにジスルフィド結合によって架橋された、カチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマー、及び任意に本明細書において定義される更なる構成要素の混合物を含むことも特に好ましい。この文脈において、国際公開第２０１２／０１３３２６号の開示が引用することにより本明細書の一部をなす。この文脈において、ジスルフィド架橋によってポリマー担体の基礎を形成するカチオン性構成要素は、通例、この目的に適した任意の好適なカチオン性又はポリカチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマー、特に本明細書において定義される核酸ベクター又は組成物に含まれる更なる核酸と複合体形成し、それにより好ましくは核酸ベクターを縮合させることが可能な任意のカチオン性又はポリカチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマーから選択される。カチオン性又はポリカチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマーは、直鎖状分子であってもよいが、分岐したカチオン性又はポリカチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマーを使用することもできる。

【0175】

医薬組成物の一部として含まれる、本発明による環状ＤＮＡベクターを複合体形成させるために使用され得る、ポリマー担体の全てのジスルフィド架橋のカチオン性又はポリカチオン性のタンパク質、ペプチド又はポリマーは、本明細書において言及されるようなポリマー担体のカチオン性構成要素としての少なくとも１つの更なるカチオン性又はポリカチオン性のタンパク質、ペプチド又はポリマーとの縮合の際にジスルフィド結合を形成することが可能な少なくとも１つのＳＨ部分（例えば、少なくとも１つのシステイン残基、又はＳＨ部分を示す任意の更なる化学基）を含み得る。

【0176】

本発明の環状ＤＮＡベクターを複合体形成させるために使用される、かかるポリマー担体は、ジスルフィド架橋カチオン性（又はポリカチオン性）構成要素によって形成され得る。特に、少なくとも１つのＳＨ部分を含むか、又は少なくとも１つのＳＨ部分を含むように付加的に修飾されたポリマー担体のかかるカチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質又はポリマーは、複合体形成剤としてタンパク質、ペプチド、及びポリマーから選択することができる。

【0177】

他の実施形態において、本発明による環状ＤＮＡベクターは、任意の更なるビヒクル、トランスフェクション剤、又は複合体形成剤と会合させることなく、好適な緩衝液中に裸で投与され得る。

【0178】

ＶＩ．使用方法
本明細書において、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物のいずれかを被験体に投与することによって、誘導を必要とする被験体における対象配列（例えば、治療用配列）の発現（例えば、残存性発現）を誘導する方法（例えば、遺伝子療法レジメンの一部として）が提供される。サザンブロッティング又はＰＣＲ分析等により宿主細胞の核酸配列（例えば、ＲＮＡ配列、例えば、ｍＲＮＡ配列）を調べることによって、被験体の標的細胞又は標的組織を特徴付けて、送達された治療用配列の存在（例えば、残存性）を検出又は定量化することができる。代替的に、治療用配列の送達によって治療される疾患（例えば、治療用配列によって標的とされる欠陥又は突然変異に関連する）の進行をモニタリングすることによって、被験体における治療用配列の発現を（例えば、定量的又は定性的に）特徴付けることができる。幾つかの実施形態において、治療用配列の転写又は発現（例えば、残存性転写又は残存性発現）は、疾患に関連する１つ以上の症状の減少を観察することによって確認される。

【0179】

したがって、本発明の実施形態には、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物のいずれかを被験体に投与することによって、被験体における疾患を治療する方法が含まれる。本明細書に記載される環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物のいずれかを、１μｇ～１０ｍｇのＤＮＡ（例えば、５μｇ～５．０ｍｇ、１０μｇ～２．０ｍｇ、又は１００μｇ～１．０ｍｇのＤＮＡ、例えば、１０μｇ～２０μｇ、２０μｇ～３０μｇ、３０μｇ～４０μｇ、４０μｇ～５０μｇ、５０μｇ～７５μｇ、７５μｇ～１００μｇ、１００μｇ～２００μｇ、２００μｇ～３００μｇ、３００μｇ～４００μｇ、４００μｇ～５００μｇ、５００μｇ～１．０ｍｇ、１．０ｍｇ～５．０ｍｇ、又は５．０ｍｇ～１０ｍｇのＤＮＡ、例えば、約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約３００μｇ、約３５０μｇ、約４００μｇ、約４５０μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約７５０μｇ、約１．０ｍｇ、約２．０ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５．０ｍｇ、約７．５ｍｇ、又は約１０ｍｇのＤＮＡ）の投薬量において被験体に投与することができる。

【0180】

幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物の投与は、他の遺伝子療法ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡベクター及びウイルスベクター）の投与と比較して、被験体における免疫応答を誘導する可能性が低い。

【0181】

幾つかの場合においては、本明細書において提供される環状ＤＮＡベクター及びその医薬組成物は、免疫応答を惹起することなく、又は上記で論じたプラスミドＤＮＡベクター若しくはＡＡＶベクター等の参照ベクターと比べて免疫応答の低下を誘導することなく、標的細胞をトランスフェクションすることができるため、繰り返し投与するのに適している。したがって、本発明は、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクター及び医薬組成物を繰り返し投与する方法を提供する。上述の投与量のいずれかを適切な頻度及び期間で繰り返すことができる。幾つかの実施形態において、被験体は、１日当たり約２回、１日当たり約１回、１週間当たり約５回、１週間当たり約４回、１週間当たり約３回、１週間当たり約２回、１週間当たり約１回、１ヶ月当たり約２回、１ヶ月当たり約１回、６週間に約１回、２ヶ月に約１回、３ヶ月に約１回、４ヶ月に約１回、１年当たり２回、１年に１回、又はより少ない頻度で投与を受ける。幾つかの実施形態において、投与回数及び投与頻度は標的細胞のターンオーバー速度に対応する。本明細書に記載されるベクターを使用してトランスフェクションされた長寿命の有糸分裂後標的細胞においては、標的細胞内での異種遺伝子の発現を相当な期間にわたって維持するのにベクターの単回投与で十分であることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態において、本明細書において提供される環状ＤＮＡベクターは単回投与で被験体に投与され得る。環状ＤＮＡベクターが被験体に送達される回数は、臨床的（例えば、治療的）便益を維持するのに必要とされる回数であり得る。

【0182】

本発明の方法は、あらゆる適切な経路による環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物の投与を含む。環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物を、全身的又は局部的に、例えば、静脈内で、眼内で（例えば、硝子体内で（例えば、硝子体内注射による）、網膜下で、点眼により、眼内で、眼窩内で）、筋肉内で、皮内で、肝臓内で、脳内で、筋肉内で、経皮で、動脈内で、腹腔内で、病変内で、頭蓋内で、関節内で、前立腺内で、胸膜腔内で、気管内で、髄腔内で、鼻腔内で、膣内で、直腸内で、腫瘍内で、皮下で、結膜下で、膀胱内で、粘膜内で、心膜内で、臍帯内で、経口で、局所的で、経真皮で、吸入により、エアロゾル化により、注射により（例えば、ジェット注射により）、エレクトロポレーションにより、移植により、注入により（例えば、持続注入により）、標的細胞を直接浸す局部灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリーム剤において、又は脂質組成物において投与することができる。

【0183】

本明細書に記載される環状ＤＮＡベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロトランスファー（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション）によって細胞内に送達することができる。ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションは、皮膚、骨格筋、或る特定の腫瘍型、及び肺上皮等の或る特定の組織において実証されている。ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションによる細胞への裸のＤＮＡの送達は、ＤＮＡを標的組織に投与した後に電界を印加して、孔を生成することにより組織内の細胞膜透過性を一時的に高め、ＤＮＡ分子が細胞膜を通過することができるようにすることを含む。一例として、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションを使用した皮膚への送達は、Cha & Daud Hum. Vaccin. Immunother. 2012, 8(11):1734-1738に記載されており、これは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。骨格筋のｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションは、Sokolowska & Blachnio-Zabielska , Int. J. Molecular Sci. 2019, 20:2776に記載されており、これは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションを使用した腫瘍内送達は、Aung et al. Gene Therapy 2009, 16:830-839に記載されており、これは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。肺細胞内へのＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションは、Pringle et al. J. Gene Med. 2007, 9:369-380に記載されており、これは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。眼球内の細胞（例えば、網膜細胞及び／又は光受容細胞）への環状ＤＮＡベクターのｉｎ ｖｉｖｏエレクトロトランスファーは、国際公開第２０２２／１９８１３８号の国際特許公報に記載されており、これは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。幾つかの場合においては、環状ＤＮＡベクターを眼に投与した後、眼の内部（例えば、網膜から約１ｍｍ以内）に電極を配置し、環状ＤＮＡベクターを標的細胞にエレクトロトランスファーするのに適した条件で（例えば、それぞれ１０Ｖ～１００Ｖの６回～１０回のパルスを印加することによって）電極を介して標的眼組織内に電界を伝えることができる。哺乳動物組織において電界を伝えるのに適した電極を備えた装置及びシステムは市販されており、本明細書に開示される方法において有用であり得る。幾つかの場合においては、電界はニードル（例えば、硝子体液内又は網膜下腔内に配置されたニードル）を備える電極を介して伝えられる。適切なニードル電極としては、IGEA（商標）により販売されるＣＬＩＮＩＰＯＲＡＴＯＲ（商標）電極及びAMBU（商標）により販売されるニードル電極が挙げられる。本発明の方法は、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクターのいずれか、又はその医薬組成物を、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロトランスファーを介して皮膚、骨格筋、腫瘍（例えば、黒色腫を含む）、眼、及び肺に投与することを含む。

【0184】

追加的に又は代替的に、環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物を、個々の患者から外植された（又はその他に、例えば分化の誘導から得られた）細胞等によってｅｘ ｖｉｖｏで宿主細胞に投与し、続いて、例えばベクターが導入された細胞を選択した後、宿主細胞を患者に再移植することができる。したがって、幾つかの態様において、本開示は、疾患を治療するトランスフェクションされた宿主細胞及びその投与方法を提供する。

【0185】

追加的に又は代替的に、本発明には、本発明の単離されたＤＮＡベクター（又はその組成物）を被験体に投与することによって、疾患又は障害を患う被験体を治療する方法が含まれる。

【0186】

本明細書に記載される環状ＤＮＡベクターのいずれかのトランスフェクション効率の評価を、当該技術分野において知られる又は本明細書に記載されるあらゆる方法を使用して実施することができる。トランスフェクションされた細胞の分離を標準的な技術に従って実施することもできる。例えば、治療用遺伝子を含む細胞は、異種遺伝子を含む細胞（単数又は複数）の特定及び分離を助ける異種遺伝子の配列によってコードされる蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）又は他のレポータータンパク質等の可視マーカーを発現することができる。サザンブロッティング又はＰＣＲ分析等により宿主細胞の核酸配列（例えば、ＲＮＡ配列、例えば、ｍＲＮＡ配列）を調べることによって、治療用遺伝子を含む細胞を特徴付けて、ベクターに含まれる異種遺伝子の存在についてアッセイすることもできる。

【0187】

したがって、本発明の方法は、本明細書に記載される遺伝子をコードする環状ＤＮＡベクターのいずれかを被験体に投与した後、引き続き、被験体における遺伝子の発現を検出することを含む。発現を、投与から１週間後～４週間後、投与から１ヶ月後～４ヶ月後、投与から４ヶ月後～１年後、投与から１年後～５年後、又は投与から５年後～２０年後（例えば、投与から少なくとも１週間後、少なくとも２週間後、少なくとも１ヶ月後、少なくとも４ヶ月後、少なくとも１年後、少なくとも２年後、少なくとも５年後、少なくとも１０年後）に検出することができる。これらの検出時点のいずれにおいても、環状ＤＮＡベクターの残存性（例えば、エピソーム残存性）が観察され得る。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターの残存性は、参照ベクター（例えば、細菌において生産された環状ベクター、又は本発明のベクターには存在しない１つ以上の細菌性シグネチャーを有する環状ベクター）よりも５％～５０％大きい、５０％～１００％大きい、１倍～５倍又は５倍～１０倍（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、又はそれ以上）大きい。

【0188】

ＶＩＩ．キット及び製造品
本発明の別の態様において、環状ＤＮＡベクターのいずれか又はその医薬組成物を含む製造品又はキットが本明細書に記載されている。製造品には、容器と、容器上の又は容器に付属したラベル又は添付文書とが含まれる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、静注液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、組成物を単独で又は病態の治療、予防、及び／又は診断に有効な別の組成物と組み合わせて収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は静注液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性作用物質は、本発明の環状ＤＮＡベクター、又は環状ＤＮＡベクターを含む医薬組成物である。ラベル又は添付文書は、組成物がその内容物で治療可能な病態の治療に使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）環状ＤＮＡベクター又はその医薬組成物を含む組成物が中に収容された第１の容器と、（ｂ）追加の療法剤を含む組成物が中に収容された第２の容器とを含む。製造品は、組成物を使用して特定の病態を治療することができることを示す添付文書を更に含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液等の薬学的に許容可能な担体又は上記に開示される薬学的に許容可能な担体のいずれかを収容する第２（又は第３）の容器を更に含んでいてもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器又は他の送達デバイスを含む、商業的な観点及び利用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。

【実施例】

【0189】

実施例１．ＣｏｌＥ２－Ｐ９複製起点は安定したプラスミド維持をもたらす
プラスミド内に配置されたＣｏｌＥ２－Ｐ９複製起点（ｏｒｉ）がＥ．コリにおいてプラスミドの安定した維持をもたらすかどうかを試験するのに、ｏｒｉの３つの別形（配列番号２～配列番号４）のうちの１つ、Ｒ６Ｋ起点、及びカルベニシリン耐性マーカーを含むプラスミドを構築し、ｐｉｒ^＋細胞において調製した。プラスミドをＳ１０３７へと形質転換し、カルベニシリンが補充されたＬＢ寒天プレート上で選択した。各プレートからのコロニーを、抗生物質を含まないＬＢ中で３７℃にて培養した。一晩培養物を、抗生物質を含まない新しいＬＢ中で１０００倍希釈し、３７℃で培養した。５回の継代後、各一晩培養物を、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレート上に再画線し、３７℃で一晩成長させた。各プレートから、２０個のコロニーを、カルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上又は含まないＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。合計６日後（その間に推定２１０回以上の集団倍化が起こった）、全ての起源変異体についてのコロニーサイズは正常であり、３つの全ての起源変異体についての２０個のコロニー全てにおいてプラスミドが検出された（図１）。これらの結果は、４０ｂｐの複製起点により、Ｅ．コリにおいて多くの集団倍化にわたってプラスミドを安定した状態に保つことができることを示している。

【0190】

実施例２．環状ＤＮＡベクターの生産用の親プラスミドの生産
図２は、本明細書に開示される実施形態に従って環状ＤＮＡベクターを生産するのに使用することができる親プラスミドの生産プロセスの一例を示している。転写単位の個々の構成要素をゴールデンゲートアセンブリによってアセンブリして、転写単位とする。次いで、転写単位をゴールデンゲートアセンブリによってアセンブリして、親プラスミドとする。この実施例において、親プラスミドはＬｏｘＰ組換え部位配列を含み、これはベクター配列（ｏｒｉ及びＭＹＯ７Ａ遺伝子を含むセグメント）を両側で挟んでおり、かつベクター配列をバックボーン配列（ＳｐｅｃＲ遺伝子、ＫａｎＲ遺伝子、及びＲＦＰ遺伝子を含むセグメント）から分離する。

【0191】

実施例３．親プラスミドからの環状ＤＮＡベクターのｉｎ ｖｉｖｏ生産
図３は、環状ＤＮＡベクターをｉｎ ｖｉｖｏ生産する実験プロセスを示している。ゴールデンゲートアセンブリ法を使用して、ＬｏｘＰ組換え部位によって両側で挟まれたベクター配列を含む試験親プラスミドを生産する。試験親プラスミドの試験ベクター配列は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９ ｏｒｉ配列とレポーター遺伝子（ｓｆＧＦＰ）とを含む。実験の目的上、試験ベクター配列はまたクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）を含むが、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクターの実施形態は抗生物質耐性遺伝子を欠いている。試験親プラスミドはまた、抗生物質耐性遺伝子のＳｐｅｃＲ及びＫａｎＲとレポーター遺伝子（ＲＦＰ）とを含む試験バックボーン配列を含む。試験親プラスミドを、ゲノム内に組み込まれた構成的プロモーター（Ｊ２３１１９）の制御下のＣｏｌＥ２－Ｐ９ Ｒｅｐ遺伝子を有する操作されたＥ．コリ細胞へと形質転換した。試験ベクター配列を両側で挟んでいるＬｏｘＰ部位の代わりに、試験ベクター配列を両側で挟んでいる２つのＩ－ＰｐｏＩ制限部位、２つのＩ－ＳｃｅＩ制限部位、２つのＰＩ－ＳｃｅＩ制限部位、２つのＩ－ＣｅｕＩ制限部位、又は１つのＰＩ－ＰｓｐＩ制限部位及び１つのＳｃｅＩ制限部位を有する更なる型の試験親プラスミドを作製した。ＬｏｘＰ部位を有する試験親プラスミドをｐ１６０３と呼び、２つのＰＩ－ＳｃｅＩ制限部位を有する試験親プラスミドをｐ１６００と呼ぶ。

【0192】

親試験プラスミドを有する細菌コロニーは、ＲＦＰ蛍光が陽性であることによって特定された。Ｃｒｅリコンビナーゼを、ｐ１６０３を有する細胞内にエレクトロポレーションして、ＬｏｘＰ部位での組換えを誘導し、試験環状ＤＮＡベクターを生産した。Ｃｒｅエレクトロポレーションについての手順は次の通りであった。親プラスミドを有する操作されたエレクトロコンピテントなＥ．コリを、ＳＯＢ中で３０℃にて０．８のＯＤまで培養した。Ｅ．コリを氷冷した１０％のグリセロールで３回洗浄し、１０％のグリセロール中に再懸濁した。１μｌのＣｒｅ（１５単位、NEB、Ｍ０２９８Ｍ）を５０μｌのエレクトロコンピテントな細胞と混合した。混合物をキュベット（１ｍｍギャップ）に移し、エレクトロポレーター（ＢＴＸ）を使用して１８００ボルトの設定を用いてエレクトロポレーションした。細胞をＳＯＣ中で３７℃にて１時間成長させることによってレスキューし、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。コロニーを成長させ、QIAGENのミニプレップキットを使用してＤＮＡを精製した。エレクトロポレーションした細胞を、抗生物質を含まないＬＢプレート上に塗抹した。ＬＢプレート上のＧＦＰ陽性のコロニーを、カナマイシン（Ｋａｎ）及びスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）を含むＬＢ上に画線し、試験バックボーン配列の喪失（Ｋａｎ／Ｓｐｅｃ感受性コロニー）について試験した。

【0193】

図４は、個々のコロニーの培養物から精製されたゲノム外ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動を示しており、（１）試験環状ＤＮＡベクターがｐ１６０３を有する細胞のＣｒｅエレクトロポレーションによって生産されたこと、及び（２）試験環状ＤＮＡベクターが選択圧の不存在下で細胞内に維持されたことを示している。レーン２、レーン３、及びレーン５は、Ｃｒｅエレクトロポレーション後にＧＦＰ陽性かつＫａｎ／Ｓｐｅｃ感受性であり、かつクロラムフェニコールを欠いた富栄養培地中で成長させたｐ１６０３形質転換細胞に由来するゲノム外ＤＮＡを示している。これらのレーンにおけるバンドは、試験環状ＤＮＡベクターに予想されるサイズであるおよそ１５００ｂｐに向かって流れることから、これはＣｒｅエレクトロポレーションによって試験環状ＤＮＡベクターの生産がもたらされたことを示している。レーン８、レーン９、及びレーン１１はそれぞれレーン２、レーン３、及びレーン５に対応するが、クロラムフェニコールを含む富栄養培地中で成長されたものである。レーン２、レーン３、及びレーン５におけるＤＮＡの存在量はレーン８、レーン９、及びレーン１１と同様であったことから、これは環状ＤＮＡベクターが選択圧なしに細胞内で維持されることを示している。レーン４は、Ｃｒｅエレクトロポレーション後にＧＦＰ陽性、ＲＦＰ陽性、かつＫａｎ／Ｓｐｅｃ耐性であるｐ１６０３形質転換細胞に由来するゲノム外ＤＮＡを示している。このレーンにおけるバンドは、試験親プラスミドに予想されるサイズであるおよそ５０００ｂｐに向かって流れる。レーン１０はレーン４に対応するが、クロラムフェニコールを含む培地中で成長させた細胞由来のＤＮＡを示している。レーン１は、ｐ１６００形質転換細胞からのＧＦＰ陽性、ＲＦＰ陽性、Ｋａｎ／Ｓｐｅｃ耐性コロニーから精製された染色体外ＤＮＡを示している。このレーンにおけるバンドは、試験親プラスミドに予想されるサイズであるおよそ５０００ｂｐに向かって流れる。レーン７はレーン１に対応するが、クロラムフェニコールを含む培地中で成長させた細胞由来のＤＮＡを示している。レーン６は、ＣｏｌＥ２－Ｐ９ ｏｒｉを欠くプラスミドで形質転換され、かつクロラムフェニコールを欠いた培地中で成長させた同じ操作されたＥ．コリ細胞から精製された染色体外ＤＮＡを示している。この培養物からは検出可能なプラスミドは回収されなかったことから、選択圧の不存在下でプラスミドの維持にはこのｏｒｉが必要とされることが示唆され得る。レーン１２は、レーン６に使用したのと同じ細胞の培養物であるが、クロラムフェニコールの存在下で成長させた培養物から精製されたＤＮＡを示している。これらの細胞からプラスミドが回収されたことから、選択圧により細胞内でプラスミドが維持されたことが示唆され得る。

【0194】

実施例４．ＣｏｌＥ２－Ｐ９ ｏｒｉを有する環状ＤＮＡベクターは、選択圧なしでＣｏｌＥ２－Ｐ９複製タンパク質を発現する操作された細胞内で維持される
ＣｏｌＥ２－Ｐ９由来のｏｒｉ配列（例えば、配列番号２）を有する環状ＤＮＡベクターが選択圧の不存在下にＣｏｌＥ２－Ｐ９複製タンパク質（例えば、配列番号１）を発現する細胞内で維持され得ることを試験するのに、実施例２に記載されるＣｒｅ組換えによって生産された試験環状ＤＮＡベクターを有する細胞を、クロラムフェニコールを含む及び含まない様々なブロス中で培養した。各培養物中のｓｆＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを定量化した。結果を図５に示す。試験環状ＤＮＡベクターは、クロラムフェニコールを含む場合及び含まない場合のＳＯＣ培地以外の全ての培地において高レベルで維持されたが、ＳＯＣ培地ではクロラムフェニコールを含む場合及び含まない場合の両方で維持レベルがより低かった。

【0195】

試験環状ＤＮＡベクターを、クロラムフェニコールを含まないＴＢ培養物及びＺＢ培養物から精製し、定量化した。ＴＢ培養物では０．３３ｍｇ／Ｌの試験環状ＤＮＡベクターが得られ、ＳＢ培養物では０．４５ｍｇ／Ｌの試験環状ＤＮＡベクターが得られた。これらの結果により、環状ＤＮＡベクターが選択圧に関係なく維持されたことが裏付けられる。

【0196】

実施例５．対抗選択を用いた環状ＤＮＡベクターのｉｎ ｖｉｖｏ生産プロセス
図６は、対抗選択を使用して本発明の環状ＤＮＡベクターを生産する例示的なプロセスを示している。この実施例における導入遺伝子はＡＢＣＡ４であるが、ＡＢＣＡ４を駆動するプロモーターを他の導入遺伝子カセットに置き換えることが可能であることは理解されるであろう。０日目に、本明細書に記載されるプロセスのいずれかを使用して、Ｒｅｐ遺伝子を発現するコンピテントな操作された細菌細胞を（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）上にコードされたリコンビナーゼを細胞に形質転換することによって）調製する。１日目に、細胞をＫａｎが補充されたＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、テンプレートプラスミドを加える。この実施例において、テンプレートプラスミドは、プロモーター及び複製起点（ｏｒｉ）の下流にＡＢＣＡ４導入遺伝子を含んでいた。このｏｒｉ－ＡＢＣＡ４カセットは、組換え部位（ａｔｔＰ－ＧＡ及びａｔｔＢ－ＧＡ）によって両側で挟まれていた。プラスミドの反対側（バックボーン領域）には、選択可能なマーカー、すなわち、抗生物質耐性遺伝子のＳｐＲ及びＫａｎＲ、対抗選択マーカーのＰｈｅＳ、並びに蛍光マーカーのＲＦＰがあった。２日目に、赤色のコロニーから白色のコロニーを選び出し、４ＣＰが補充されたＬＢ中で成長させて対抗選択を行った。３日目に、環状ＤＮＡベクターを精製する。

【0197】

実施例６．環状ＤＮＡベクターの生産についての誘導性Ｂｘｂ１の試験
Ｂｘｂ１が環状ＤＮＡベクターを生産する外因性リコンビナーゼとして有効であり得るかどうかを試験するのに、Ｂｘｂ１リコンビナーゼを細菌人工染色体（ＢＡＣ）上にコード化し、構成的プロモーターによって駆動されるゲノム内に組み込まれたＲｅｐ遺伝子（配列番号１）を有する宿主Ｅ．コリへと形質転換した（図７Ａ）。２つの誘導性Ｂｘｂ１ ＢＡＣを試験した。１６９６（図７Ｂ、配列番号５）はクミン酸誘導性プロモーター及びクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性（ＣｍＲ）遺伝子を含んでおり、１６９７（図７Ｃ、配列番号６）はアラビノース誘導性プロモーター及びＣｍＲ遺伝子を含んでいた。各ＢＡＣをエレクトロポレーションによってＳ１０３７細胞へと形質転換し、クロラムフェニコールの存在下でプレーティングした。

【0198】

次に、細胞をレポーター導入遺伝子としてＧＦＰを有するテンプレートプラスミドで形質転換した（図７Ｄ）。ＣｏｌＥ２－Ｐ９複製起点（ｏｒｉ）はＧＦＰ及びそのプロモーターの上流に配置されており、組換え部位（ａｔｔＰ－ＧＡ及びａｔｔＢ－ＧＡ）によりｏｒｉ－ＧＦＰカセットが両側で挟まれていた。プラスミドの反対側（バックボーン領域）には、選択可能なマーカー（抗生物質耐性遺伝子のＳｐＲ及びＫａｎＲ、対抗選択マーカーのＰｈｅＳ、並びに蛍光マーカーのＲＦＰ）があった。したがって、テンプレートプラスミドを含む細胞は、ＧＦＰ^＋、ＲＦＰ^＋、Ｋａｎ耐性、Ｓｐｅｃ耐性、及び４ＣＰ感受性であるのに対し、環状ＤＮＡベクターのみを含む細胞（図７Ｅ）（バックボーン副産物を含まない（図７Ｆ））は、ＧＦＰ^＋、ＲＦＰ^－、Ｋａｎ感受性、Ｓｐｅｃ感受性、及び４ＣＰ耐性である。

【0199】

テンプレートプラスミドを、誘導物質を用いずにＳ１０３７細胞へとエレクトロポレーションし、Ｃｍ＋Ｋａｎプレート上にプレーティングした。形質転換から２４時間後及び７２時間後の結果を図８及び図９に示す。図８Ａ及び図８Ｂは、１６９６ＢＡＣを有するコロニーの大部分が、それぞれ形質転換から２４時間後及び７２時間後に緑色であったことを示している。赤色のコロニーが少数観察された。緑色のコロニーを選択し、サンガーシーケンシング及びゲル電気泳動によって環状ＤＮＡベクターの存在及び配列を確認した。１６９６とは対照的に、図９Ａ及び図９Ｂは、１６９７ＢＡＣを有するコロニーの殆どが、それぞれ形質転換から２４時間後及び７２時間後に黄色であったのに対し、７２時間の時点で緑色のコロニーが少数観察されたことを示している（図９Ｂ）。

【0200】

Ｃｍ及びアラビノース誘導物質の効果を評価するのに、各プレートから様々な色のコロニーを採取し、Ｃｍ及びクミン酸又はアラビノースのいずれかとともに２４時間インキュベートした。結果を図１０（１６９６）及び図１１（１６９７）に示す。次に、各培養物を５００倍希釈し、４ＣＰが補充されたＬＢ中で誘導物質を用いて又は誘導物質を用いずに一晩成長させて、対抗選択を行った。一晩培養物をそのままのＬＢ寒天プレート上に再画線し、蛍光を観察した。結果を図１２（１６９６）及び図１３（１６９７）に示す。各プレートからの単コロニーを４ＣＰが補充されたＬＢ中で一晩成長させ、少量調製し、消化マッピング（ＢｓａＩ）を行った。ゲル電気泳動の結果を図１４に示す。それぞれの予想される種１～種４について予測されるバンドを以下の表１に示す：

【0201】

【表1】

【0202】

いずれかの種類のＢＡＣ（１６９６又は１６９７）を有するコロニーでは、いずれかの誘導物質を添加するとＧＦＰ発現コロニーが増加するように見えたことから、これは誘導物質の不存在下にＢｘｂ１の発現が起こったことを示している。実際、テンプレートプラスミドの形質転換及びＣｍ／Ｋａｎプレート上へのプレーティングの後に、Ｂｘｂ１組換えは既に起こっていた。１６０６ＢＡＣを含む細菌において、非誘導のＢｘｂ１によって９０％を超える緑色のコロニーが得られたことから、これは９０％超がテンプレートプラスミドを殆ど含まない又は全く含まない環状ＤＮＡベクターを含んでいたことを示している。

【0203】

実施例７．治療用導入遺伝子を含む環状ＤＮＡベクターの生産
この研究において、様々な種類の治療用導入遺伝子、すなわち、（１）ＡＢＣＡ４、（２）ＩＬ－１２、並びに（３）Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－１２、及びＸＣＬ１をコードするトリシストロン性カセットを含む環状ＤＮＡベクターを作製した。ＡＢＣＡ４コンストラクト及びＩＬ－１２コンストラクトはＣＡＧプロモーターを含み、トリシストロン性コンストラクトは３つの遺伝子それぞれの上流にＣＡＧプロモーターを含んでいた。ＡＢＣＡ４テンプレートプラスミド及び得られる環状ＤＮＡベクターについての例示的な配列は、それぞれ図１５Ａ（配列番号７）及び図１５Ｂ（配列番号８）によって示されている。

【0204】

最初に、Ｓ１０３７細胞を１６９６ＢＡＣで形質転換し、一晩成長させた。１日後、細胞をコンピテント化し、ＡＢＣＡ４、ＩＬ－１２、又はトリシストロン性カセットをコードするテンプレートプラスミドで形質転換した。細胞をＫａｎが補充されたＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。３日間の培養後に、小さな白色のコロニーを採取し（赤色のコロニーは残す）、ＬＢ＋４ＣＰ中で一晩成長させて対抗選択を行った後に精製した。

【0205】

精製されたコンストラクトを、ＢｓａＩによる消化マッピングを使用して各群における単コロニーからスクリーニングした。図１６Ａ（理論上のゲルプロファイル）及び図１６Ｂ（実際のゲルプロファイル）に示されるように、全てのコロニーで、予想されるサイズの環状ＤＮＡベクターのバンドが得られた。これらの結果により、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクターの生産プロセスを、様々なサイズ及び構成（例えば、マルチシストロン性）の導入遺伝子を有する環状ＤＮＡベクターを効率的に生産するのに広く利用することができることが裏付けられる。

【0206】

実施例８．細菌の成長及びスケールアップに対する環状ＤＮＡベクターの安定性
本明細書に記載されるベクター系の有意義な利点は、選択マーカーを用いずに（例えば、選択可能なマーカー及びその他の細菌バックボーンエレメントを培養物から除去した後に）環状ＤＮＡベクターを有する細菌細胞を成長させることができることである。この目的に向けて、出願人は、治療用導入遺伝子を含む環状ＤＮＡベクターが、ベクター生産のスケールアップに伴う多くの細胞分裂にわたって細菌培養物において安定的に発現され得るかどうかを試験した。

【0207】

実施例７と同様に、バックボーンを含まないＡＢＣＡ４をコードする環状ＤＮＡベクターを含むと特定された細胞の一晩培養（各１４時間～１６時間）を７夜連続にわたって行った。７回目の培養後、シーケンシングによって環状ＤＮＡベクターの存在を確認した。１時間当たり３回の平均分裂速度に基づくと、この培養物は少なくとも２９４回の分裂を経ており、驚くべきことに、選択が行われていないにもかかわらず、環状ＤＮＡベクターの発現を維持していた。

【0208】

この特筆すべき安定性を活用することで、細胞をスケールアップして、ＡＢＣＡ４導入遺伝子を含む環状ＤＮＡベクターをより大量に生産した。細胞をＬＢプレート上に再画線し、成長させて、２．５Ｌの調製物を生産した。グリセロールストックを生産し、このストックを再画線して、２５Ｌの調製物を生産した。この調製物から環状ＤＮＡベクターを精製し、これにより１８ｍｇの環状ＤＮＡベクターが得られた。

【0209】

実施例９．単量体環状ＤＮＡベクターの検出
この研究において、１６９６ＢＡＣを使用して生産されたＡＢＣＡ４導入遺伝子を含む環状ＤＮＡベクターをシーケンシングして、環状ＤＮＡベクターが単量体の形態（別のテンプレートプラスミドとのトランスの組換えから得ることができる二量体とは異なる）であることを確認した。この研究において、Ｓ１０３７細菌を２５μｇ／ｍＬのＫａｎを含むＬＢブロス中で３７℃にて２時間培養した。次に、細胞を４ＣＰ及び１０ｎｇのＤＮＡを含むプレートに移し、３７℃で一晩インキュベートした。試料を、従来の方法を使用したロングリードシーケンシング（Oxford Nanopore）によって分析した。図１７Ａに示されるように、単量体のピークが観察され、二量体は観察されなかった。対照的に、培養物をＫａｎとともに一晩インキュベートした場合、環状ＤＮＡベクターは主に二量体であった（図１７Ｂ）。

【0210】

実施例１０．Ｂｘｂ１ヘルパープラスミドを使用して作製された環状ＤＮＡベクター
ＢＡＣ－Ｂｘｂ１の代替戦略として、ヘルパープラスミドを使用して宿主細胞に形質転換されたＢｘｂ１を使用して環状ＤＮＡベクターを作製した。クミン酸誘導性プロモーター（ＣｕＯ）を含む例示的なヘルパープラスミドを図１８に示す。さらに、ヘルパープラスミドは温度感受性のバックボーンを含むため、環状ＤＮＡベクターの生産後にヘルパープラスミドを除去することが可能であった。このヘルパープラスミドのＤＮＡ配列は、配列番号１１によって示されている。この方法において使用された宿主細胞は、同様の実施例の場合と同じもの、すなわち、構成的プロモーターによって駆動される宿主ゲノム内に組み込まれたＲｅｐ（配列番号１）を有するＳ１０３７細胞であった。テンプレートプラスミドは実施例６（図７Ｄ）の場合と同じものであった。

【0211】

この研究において、ヘルパープラスミドをＳ１０３７細胞へと形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（ｃａｒｂ１００）とともに一晩インキュベートした。次いで、プラスミドテンプレートを形質転換し、ｃａｒｂ１００及び５００μＭのＣｕｍａとともにプレーティングし、細胞を３０℃で成長させた。このヘルパープラスミド手法を使用することで、幾つかの緑色のコロニーが観察された（図１９）ことから、これはバックボーン副産物を含まない環状ＤＮＡベクターを含む細胞の生産に成功したことを示している。

【0212】

実施例１１．Ｂｘｂ１を宿主ゲノム内に組み込むことによって作製された環状ＤＮＡベクター
本明細書において提供されるリコンビナーゼの別の供給源は、細菌宿主ゲノム内への組込みを介したものである。この実施例においては、図２０に例示されるプロセスに従ってＢｘｂ１の組込みを実施した。最初に、λｒｅｄ組換えヘルパープラスミドを有するＳ１０３７細胞を０．２％のアラビノースとともに成長させ、エレクトロコンピテント化した。次いで、５００ｎｇの線状化された１６９６ＢＡＣをエレクトロポレーションした。ＢＡＣ１６９６をｒｓｄ－ｔｈｉＣ遺伝子座へと組み込んだ後、λｒｅｄ組換えプラスミドを除去した。

【0213】

得られたコロニーに対してコロニーＰＣＲを実施し、ゲル電気泳動を使用して陽性クローンを特定した（図２１）。得られた細胞は、ゲノム組込みによってＲｅｐ及びＢｘｂ１の両方を発現するように操作されている。

【0214】

実施例１２．ＣｏｌＥ２－Ｐ９ ｏｒｉを有する環状ＤＮＡベクターによるＡＢＣＡ４タンパク質の発現
ＣｏｌＥ２由来の複製起点を有する細菌によって生産される環状ＤＮＡベクターがヒト細胞においてタンパク質を発現することが可能かどうかを判定するのに、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子を有するそのような環状ＤＮＡベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクションし、ＡＢＣＡ４タンパク質の発現をウェスタンブロットによって評価するｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を実施した。

【0215】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートにおいて０．５ｍＬの標準培地中に１５００００個の細胞で播種した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクションの時点で、細胞は６０％～８０％のコンフルエンスであった。細胞にリポフェクタミン３０００（Invitrogen）を使用して製造業者のプロトコルに従って環状ＤＮＡベクターをトランスフェクションした。１ウェル当たりに加えられたＤＮＡの総量は５００ｎｇであった。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取して、ベータアクチンをコントロールとして使用してウェスタンブロットにより分析した。ウェスタンブロットの結果を図２２に示し、各レーンを以下の表２において特定する。

【0216】

【表2】

【0217】

これらの結果は、ＣｏｌＥ２由来の起源を有する細菌によって生産される環状ＤＮＡベクターがＨＥＫ２９３Ｔヒト細胞においてそれらのＡＢＣＡ４導入遺伝子を発現したことを示している。

【0218】

【表3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

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【国際調査報告】