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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-04
(54)【発明の名称】眼疾患の局所治療のためのイソシクロスポリンＡ
(51)【国際特許分類】
A61K 38/12 20060101AFI20250128BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20250128BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250128BHJP
A61P 27/14 20060101ALI20250128BHJP
【ＦＩ】
A61K38/12
A61P27/02
A61P37/06
A61P27/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538018
(86)(22)【出願日】2022-12-22
(85)【翻訳文提出日】2024-08-21
(86)【国際出願番号】 EP2022087581
(87)【国際公開番号】W WO2023118487
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】21217735.6
(32)【優先日】2021-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】315012541
【氏名又は名称】ドムペ・ファルマチェウティチ・ソチエタ・ペル・アツィオーニ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100106080
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 晶子
(72)【発明者】
【氏名】マッキ，イラリア
【テーマコード（参考）】
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA24
4C084BA44
4C084DA11
4C084MA16
4C084MA27
4C084MA58
4C084NA14
4C084ZA331
(57)【要約】
本発明は、好ましくは角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患ならびに眼瞼辺縁の炎症性疾患から選ばれる眼の炎症性及び／又は自己免疫性疾患の個体における予防又は治療において眼に局所使用するためのイソシクロスポリンＡ、その塩、及びその眼科用組成物に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の個体における予防又は治療において眼に局所使用するためのイソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩。
【請求項2】
前記炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患が、角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患ならびに眼瞼辺縁の炎症性疾患から選ばれる、請求項１に記載の眼に局所使用するためのイソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩。
【請求項3】
前記角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患が、春季カタル（ＶＫＣ）、アトピー性角結膜炎（ＡＫＣ）、アレルギー性結膜炎、眼型酒さ、ブドウ膜炎、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、眼類天疱瘡（ＯＣＰ）、眼移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び免疫性角膜潰瘍から選ばれる、請求項１又は２に記載の眼に局所使用するためのイソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩。
【請求項4】
前記眼瞼辺縁の炎症性疾患が、炎症性翼状片及び慢性眼瞼炎から選ばれる、請求項１又は２に記載の眼に局所使用するためのイソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩。
【請求項5】
前記塩が、イソシクロスポリンＡの酢酸塩、アジピン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、２－ヒドロキシエチルスルホン酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、過硫酸塩、フェニル酢酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、キナ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルファミン酸塩、スルファニル酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩（ｐ－トルエンスルホン酸塩）、トリフルオロ酢酸塩、及びウンデカン酸塩から選ばれる、請求項１～４のいずれか１項に記載の眼に局所使用するためのイソシクロスポリンＡの眼科的に許容可能な塩。
【請求項6】
イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩と、少なくとも一つの眼科的に許容可能な賦形剤又は希釈剤とを含む眼科用製剤。
【請求項7】
前記眼科用製剤が、液体の眼科用製剤、好ましくは液体点眼製剤である、請求項６に記載の眼科用製剤。
【請求項8】
前記眼科用製剤が、半固体の眼科用製剤、好ましくはクリーム、軟膏又はゲルである、請求項６に記載の眼科用製剤。
【請求項9】
前記眼科用製剤が、投与前に眼科的に許容可能な希釈剤を添加することにより、請求項７又は８に記載の液体又は半固体の眼科用製剤を即席調製するための固体の眼科用製剤である、請求項６に記載の眼科用製剤。
【請求項10】
６～８、好ましくは６．４～７．８、さらに好ましくは６．５～７．５を含むｐＨを有する、請求項６～８のいずれか１項に記載の眼科用製剤。
【請求項11】
炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の個体における予防又は治療に使用するための、請求項６～１０のいずれか１項に記載の眼科用製剤。
【請求項12】
前記炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患が、角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患ならびに眼瞼辺縁の炎症性疾患から選ばれる、請求項１１に記載の眼科用製剤。
【請求項13】
炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の治療に適切な少なくとも一つの薬物をさらに含む、好ましくはコルチコステロイドをさらに含む、請求項６～１０のいずれか１項に記載の眼科用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イソシクロスポリンＡ、その塩及び医薬組成物、ならびに炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の個体における予防又は治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
シクロスポリンＡは、真菌トリポクラジウム・インフラタム(Tolypocladium Inflatum)から得られた中性親油性環状ウンデカペプチドで、７個のＮ－メチルアミノ酸残基と、１位に異常アミノ酸（４Ｒ）－４－（［Ｅ］－２－ブテニル）－４－Ｎ－メチル－（Ｌ）－トレオニン（ＭｅＢｍｔ）を含有する。
【0003】
シクロスポリンは最初、移植臓器の臓器拒絶反応を予防するための免疫抑制薬として承認された。
眼科では、シクロスポリンＡは当初、角膜移植後に投与するための研究がなされていたが、後に、ブドウ膜炎、春季カタル（ＶＫＣ）、角結膜炎（ＡＫＣ）及びドライアイ疾患（ＤＥＤ）などのいくつかの眼の炎症性疾患にも有効であることが示された（Ｆｅｒｏｚｅら，Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１９，３１：１８２－１９０；Ｐｒａｂｈｕら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２０１６，１００：３４５－３４７）。
眼科では、シクロスポリンＡは当初、角膜移植後に投与するための研究がなされていたが、後に、ブドウ膜炎、春季カタル（ＶＫＣ）、角結膜炎（ＡＫＣ）及びドライアイ疾患（ＤＥＤ）などのいくつかの眼の炎症性疾患にも有効であることが示された（Ｆｅｒｏｚｅら，Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１９，３１：１８２－１９０；Ｐｒａｂｈｕら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２０１６，１００：３４５－３４７）。
【0004】
この分子は疎水性であるため、当初は眼科適応でも静脈内注射又は経口投与などの全身経路で投与されていた。これらの投与経路により、治療濃度の有効成分が眼内液（房水又は硝子体液）や眼球外器官又は付属器（角膜、結膜及び涙腺）に到達できた。しかしながら、腎毒性及び高血圧などの深刻な全身副作用が発生したため、当該分子の局所投与に適切な製剤の研究が促進された（Ｌａｌｌｅｍａｎｄら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２００３，５６：３０７－３１８)。
【0005】
眼に局所使用するためのシクロスポリンＡの点眼製剤の開発は、この分子の疎水性及び極端に低い水溶解度（６．６ｍｇ／ｍｌ）のために妨げられており、一般的に使用されている水性の眼科用ビヒクルを基剤とする製剤を調製することはできない。
【0006】
シクロスポリンＡは当初ヒマシ油やコーン油のような油性溶媒中の溶液の形態で製剤化されていたが、これらは後に水中油型エマルション及びミセルベース溶液に置き換わった（ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２０１９：１３ １１１５－１１２２）。
【0007】
しかしながら、後者の製剤に必要な界面活性剤の存在は角膜に悪影響を及ぼし、視覚のぼやけをもたらすことが判明した。さらに、エマルションは適用すると眼に迅速拡散するという利点を有するが、エマルション由来の親油性薬物のバイオアベイラビリティが低いため、ただでさえ厳しい水性の眼内環境中で利用できる有効成分の量はなお限られている（Ｊｅｒｋｉｎｓら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２０２０：１４ ４８１－４８９）。
【0008】
シクロスポリンが難溶性であることと、現在入手できる眼科用製剤の大部分に角膜に悪影響を及ぼす界面活性剤が含まれていることが、眼科的治療の観点から見たシクロスポリンの使用に対する主要な制約であり、おそらくは忍容性の低さと臨床試験で報告される応答のばらつきの大きさの原因でもある。
【0009】
イソシクロスポリンＡはシクロスポリンＡの異性体で、１位の残基（Ｎ－メチル－（４Ｒ）－４－ブタ－２Ｅ－エン－１－イル－４－ メチル－（Ｌ）トレオニル）がＮ－原子ではなく３’－Ｏ－原子を介して１１位の残基に結合している点がシクロスポリンＡとは異なる。イソシクロスポリンＡは当初シクロスポリンＡの酸処理によって形成される再配列分解産物(rearranged degradation product)として同定された。イソシクロスポリンＡは、それ自体に何の生物活性もなく、全身投与された場合、インビボで非常にゆっくりと対応する活性シクロスポリン形に変換されると記述されている（ＷＯ１９９３０１７０３９Ａ１、５ページ及び１５ページ）。特に、この分子は、５より高いｐＨでシクロスポリンＡに定量的に変換されることが示されている。詳しくは、イソシクロスポリンの異性化速度はｐＨ８～１０で最大であるが（Ｏｌｉｙａｉ Ｒ，Ｓｔｅｌｌａ ＶＪ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，１９９２，Ｍａｙ；９（５）：６１７－２２）、最も遅い変換速度はｐＨ６～８で観察されている。特に、ｐＨ７．４で変換は最小となり、変換半減期は２１．７時間である（Ｂｕｎｄｇａａｒｄら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，８２（１９９２）：８５－９０参照）。
【0010】
シクロスポリンＡへの緩やかな変換能力と水中での高い溶解度を考慮すると、イソシクロスポリンＡは、安定性を向上させ、シクロスポリンのピーク血中濃度に関連する副作用を回避するために、経口投与用のシクロスポリンＡのプロドラッグとしての用途が提案されている。
【0011】
この関連で、ＷＯ１９９３０１７０３９Ａ１には、溶解性及び安定性の向上といった改良されたガレヌス製剤的特徴を提供する、イソシクロスポリンＡを含むイソシクロスポリンの酸付加塩が記載されている。この文書には、これらの塩は、経口投与された場合、緩やかな速度で活性分子を放出し、血液中のシクロスポリンを一定濃度に維持するので、シクロスポリンの経口投与用プロドラッグとして特に有用であると開示されている。
【0012】
しかしながら、イソシクロスポリンＡを眼に局所使用することは、その環境でのこの分子の遅い変換速度を考慮すると実用的でないと考えられている。実際、イソシクロスポリンＡからシクロスポリンＡへの相互変換速度はとても遅いので、この分子が眼表面に滞留している間にシクロスポリンＡが実質的に形成されることはない。上記のように、６～８のｐＨ値で変換速度は最も遅くなり、特にｐＨ７．４でイソシクロスポリンＡからシクロスポリンＡへの５０％変換に要する時間は２１．７時間であることが記載されている（Ｂｕｎｄｇａａｒｄら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，８２（１９９２）：８５－９０）。
【0013】
上記に鑑み、出願人の知識では、イソシクロスポリンＡは何の薬理活性も発揮しないと予想されたため、眼への局所用途のためのシクロスポリンＡの実現可能な代替品と考えられたことはなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】国際特許公開第１９９３／０１７０３９号（ＷＯ１９９３０１７０３９Ａ１）
【非特許文献】
【0015】
【非特許文献1】Feroze et al, J Ophthalmol 2019, 31: 182-190
【非特許文献2】Prabhu et al, British Journal of Ophthalmology 2016, 100: 345-347
【非特許文献3】Lallemand et al, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2003, 56: 307-318
【非特許文献4】de Oliveira et al, Clinical Ophthalmology 2019:13 1115-1122
【非特許文献5】Jerkins et al, Clinical Ophthalmology 2020:14 481-489
【非特許文献6】Oliyai R, Stella VJ, Pharm Res, 1992, May;9(5):617-22
【非特許文献7】Bundgaard et al, International Journal of Pharmaceutics, 82 (1992):85-90
【発明の概要】
【0016】
出願人は今回、驚くべきことに、イソシクロスポリンＡは、眼に局所投与された場合、シクロスポリンＡへの変換とは無関係の生物活性を思いがけず示すことを見出した。上記のように、この知見は背景技術文献に基づいては全く予測できないことである。
【0017】
さらに驚くべきことに、実験の項に炎症性眼表面疾患の関連動物モデルで実施されたインビボ試験によって示されているように、出願人は、イソシクロスポリンＡによる治療はシクロスポリンＡと比べていくつかの薬理学的関連パラメーターでより高い有効性を示すことを観察した。
【0018】
また、本発明者らは、イソシクロスポリンＡは、文献に炎症性及びアレルギー性疾患の症状に関与すると記載されているＴＲＰＶ３及びＴＲＰＭＬ２イオンチャネルの活性を阻害できることも見出した(Ｔａｋａｈｉｒｏ Ｙａｍａｄａら，Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１０ Ｊａｎ；９０（１）：１２１－１２９；ＭＰ Ｃｕａｊｕｎｇｃｏら，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．２０１６ Ｆｅｂ；４６８（２）：１７７－９２；及びＥｖａ Ｐｌｅｓｃｈら，ｅＬｉｆｅ．２０１８；７：ｅ３９７２０)。さらに、シクロスポリンＡとは異なり、イソシクロスポリンＡは、炎症性及びアレルギー性の眼疾患においては望ましくないＴＲＰＣ４チャネルの活性化によって誘導される上皮細胞の過剰増殖を刺激しない。
【0019】
そこで、本発明の第一の目的は、炎症性及び／又は自己免疫性の眼疾患の予防又は治療に眼に局所的に使用するためのイソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩である。
【0020】
好ましくは、前記炎症性及び／又は自己免疫性の眼疾患は、角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患ならびに眼瞼辺縁の炎症性疾患から選ばれる。
本発明の第二の目的は、イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩と少なくとも一つの眼科的に許容可能な賦形剤又は希釈剤とを含む眼科用製剤である。
本発明の第二の目的は、イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩と少なくとも一つの眼科的に許容可能な賦形剤又は希釈剤とを含む眼科用製剤である。
【0021】
本発明の更なる目的は、好ましくは角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患ならびに眼瞼辺縁の炎症性疾患から選ばれる炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の予防又は治療法であって、該方法は、それを必要としている個体に有効量のイソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩及び／又はその眼科用製剤を局所投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明の第一の目的は、炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の個体における予防又は治療において眼に局所使用するためのイソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩である。
【0024】
好ましくは、前記炎症性及び／又は自己免疫性の疾患は、角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患ならびに眼瞼辺縁の炎症性疾患から選ばれる。
角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患は、局所的炎症状態によって誘導された、角膜及び結膜を覆う上皮の損傷を特徴とする疾患である。
角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患は、局所的炎症状態によって誘導された、角膜及び結膜を覆う上皮の損傷を特徴とする疾患である。
【0025】
眼瞼辺縁の炎症性疾患は、眼瞼の一般的及び持続的炎症を特徴とする疾患である。
特に、本発明によれば、前記炎症性及び／又は自己免疫性の眼疾患は、春季カタル（ＶＫＣ）、アトピー性角結膜炎（ＡＫＣ）、アレルギー性結膜炎、眼型酒さ、ブドウ膜炎、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、眼類天疱瘡（ＯＣＰ）、眼移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、免疫性角膜潰瘍、炎症性翼状片及び慢性眼瞼炎から選ばれる。
特に、本発明によれば、前記炎症性及び／又は自己免疫性の眼疾患は、春季カタル（ＶＫＣ）、アトピー性角結膜炎（ＡＫＣ）、アレルギー性結膜炎、眼型酒さ、ブドウ膜炎、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、眼類天疱瘡（ＯＣＰ）、眼移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、免疫性角膜潰瘍、炎症性翼状片及び慢性眼瞼炎から選ばれる。
【0026】
本発明によれば、前記イソシクロスポリンＡ又はその塩は、前記個体の眼に局所投与される。
本発明によれば、“予防”という用語は、障害又は病的事象が確立又は発生する前に、これを部分的に又は完全に予防することを指す。
本発明によれば、“予防”という用語は、障害又は病的事象が確立又は発生する前に、これを部分的に又は完全に予防することを指す。
【0027】
本発明の一態様によれば、予防は、障害又は病的事象が完全に阻止される完全予防である。
本発明の代替の態様によれば、予防は、障害又は病的事象の発生を遅らせる及び／又はその重症度を軽減させる部分的予防である。
本発明の代替の態様によれば、予防は、障害又は病的事象の発生を遅らせる及び／又はその重症度を軽減させる部分的予防である。
【0028】
本発明によれば、“治療”という用語は、障害又は病的事象が既に確立又は発生した後に、これを完全に逆転する又はその重症度もしくは進行を軽減することを指す。
本発明によれば、“個体”という用語は、ヒト又は動物、好ましくはヒトを指す。
本発明によれば、“個体”という用語は、ヒト又は動物、好ましくはヒトを指す。
【0029】
好ましくは、イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩を用いて治療できる前記炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患は、コルチゾン及び類似のコルチコステロイドによる治療で改善又は回復を示す眼疾患である。
【0030】
イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩を用いて治療できる角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患は、好ましくは、春季カタル（ＶＫＣ）、アトピー性角結膜炎（ＡＫＣ）、アレルギー性結膜炎、眼型酒さ、ブドウ膜炎、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、眼類天疱瘡（ＯＣＰ）、眼移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び免疫性角膜潰瘍から選ばれる。好ましくは、前記アレルギー性結膜炎は、季節性又は通年性のアレルギー性結膜炎である。
【0031】
イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩を用いて治療できる眼瞼辺縁の炎症性疾患は、例えば、炎症性翼状片及び慢性眼瞼炎である。
本発明によれば、好ましくは前記イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩は、上記の一つ、二つ又はそれ以上の炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の予防及び治療のために使用できる。
本発明によれば、好ましくは前記イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩は、上記の一つ、二つ又はそれ以上の炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の予防及び治療のために使用できる。
【0032】
本発明によれば、前記イソシクロスポリンＡ又は前記その塩は、前記個体の眼の眼表面又は眼瞼辺縁に局所適用される。
好適な態様によれば、前記イソシクロスポリンＡ又は前記その塩は、以下に記載されるような眼科用の液体又は半液体製剤によって前記個体の眼の眼表面に局所適用される。
好適な態様によれば、前記イソシクロスポリンＡ又は前記その塩は、以下に記載されるような眼科用の液体又は半液体製剤によって前記個体の眼の眼表面に局所適用される。
【0033】
好ましくは、前記イソシクロスポリンＡ又は前記その塩は、医学的状況及び治療される疾患の重症度に応じて１日１回、２回、３回、４回、又はそれ以上の回数投与される。
本発明の好適な態様によれば、前記眼科的に許容可能な塩はイソシクロスポリンＡの酸付加塩である。
本発明の好適な態様によれば、前記眼科的に許容可能な塩はイソシクロスポリンＡの酸付加塩である。
【0034】
好ましくは、前記イソシクロスポリンＡの眼科的に許容可能な塩は、イソシクロスポリンＡの酢酸塩、アジピン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、２－ヒドロキシエチルスルホン酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、過硫酸塩、フェニル酢酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、キナ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルファミン酸塩、スルファニル酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩（ｐ－トルエンスルホン酸塩）、トリフルオロ酢酸塩、及びウンデカン酸塩から選ばれる。
【0035】
さらに好ましくは、前記塩は、イソシクロスポリンＡの塩酸塩又はトリフルオロ酢酸塩である。
本発明の酸付加塩は、好ましくは、イソシクロスポリンＡの１位にある残基のアルファ－Ｎ原子の位置で形成される。
本発明の酸付加塩は、好ましくは、イソシクロスポリンＡの１位にある残基のアルファ－Ｎ原子の位置で形成される。
【0036】
本発明による塩の製造法は周知であり、例えば特許出願ＷＯ１９９３０１７０３９Ａ１に記載されている。
本発明の第二の目的は、有効成分としてイソシクロスポリンＡ又は上に定義のようなその眼科的に許容可能な塩と、少なくとも一つの眼科的に許容可能な賦形剤又は希釈剤とを含む眼科用製剤である。
本発明の第二の目的は、有効成分としてイソシクロスポリンＡ又は上に定義のようなその眼科的に許容可能な塩と、少なくとも一つの眼科的に許容可能な賦形剤又は希釈剤とを含む眼科用製剤である。
【0037】
好適な態様によれば、前記眼科用製剤は液体の眼科用製剤、好ましくは液体点眼製剤である。
上記眼科用液体製剤は、単相性の液体製剤、好ましくは溶液、さらに好ましくは水溶液、又は二相性の液体製剤、好ましくはエマルション、さらに好ましくはマイクロエマルションでありうる。
上記眼科用液体製剤は、単相性の液体製剤、好ましくは溶液、さらに好ましくは水溶液、又は二相性の液体製剤、好ましくはエマルション、さらに好ましくはマイクロエマルションでありうる。
【0038】
上記眼科用液体製剤は、好ましくは、ビヒクルとして生理食塩水を含有する。
別の好適な態様によれば、前記眼科用製剤は、半固体の眼科用製剤、好ましくはクリーム、軟膏又はゲルである。
別の好適な態様によれば、前記眼科用製剤は、半固体の眼科用製剤、好ましくはクリーム、軟膏又はゲルである。
【0039】
さらに別の好適な態様によれば、前記眼科用製剤は、投与前に眼科的に許容可能な希釈剤を添加することにより、上記の液体又は半固体の眼科用製剤を即席調製するための固体の眼科用製剤である。
【0040】
好ましくは、前記固体の眼科用製剤は粉末の形態であり、さらに好ましくは、それは凍結乾燥粉末の形態である。
好ましくは、前記液体又は半固体の眼科用製剤は、６～８、さらに好ましくは６．４～７．８、なおさらに好ましくは６．５～７．５を含むｐＨを有する。実際、これらの条件で、イソシクロスポリンＡからシクロスポリンＡへの相互変換速度は最小であることが知られており、最終生成物の安定性が確保される（ｐＨ７．４、３７℃で、５０％の変換に２１．７時間かかる。Ｂｕｎｄｇａａｒｄら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，８２（１９９２）：８５－９０）。
好ましくは、前記液体又は半固体の眼科用製剤は、６～８、さらに好ましくは６．４～７．８、なおさらに好ましくは６．５～７．５を含むｐＨを有する。実際、これらの条件で、イソシクロスポリンＡからシクロスポリンＡへの相互変換速度は最小であることが知られており、最終生成物の安定性が確保される（ｐＨ７．４、３７℃で、５０％の変換に２１．７時間かかる。Ｂｕｎｄｇａａｒｄら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，８２（１９９２）：８５－９０）。
【0041】
好ましくは、前記液体又は半固体の眼科用製剤は、製剤を所望ｐＨに維持することができる緩衝液を含有する。
緩衝液は、好ましくは、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液及びホウ酸緩衝液から選ばれるが、これらに限定されない。必要に応じて、これらの製剤のｐＨを調整するために酸又は塩基を使用することもできる。
緩衝液は、好ましくは、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液及びホウ酸緩衝液から選ばれるが、これらに限定されない。必要に応じて、これらの製剤のｐＨを調整するために酸又は塩基を使用することもできる。
【0042】
好ましくは、本発明による眼科用製剤は、眼科的に許容可能な界面活性剤、保存剤、安定剤、張度調整剤、粘度調整剤、抗酸化剤及びキレート化剤から選ばれる一つ又は複数の賦形剤も含有する。
【0043】
界面活性剤は（一つ又は複数）は、賦形剤又は活性薬の溶解、組成物中の固体又は液体の分散、湿潤性（濡れ）の増強、液滴サイズの修正、又はいくつかのその他の目的を補助するために使用できる。
【0044】
好ましくは、本発明による眼科用製剤中に含有される界面活性剤は、アルコール、アミンオキシド、ブロックポリマー、カルボキシル化アルコール又はアルキルフェノールエトキシレート、カルボン酸／脂肪酸、エトキシル化アルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アリールフェノール、エトキシル化脂肪酸、エトキシル化脂肪酸エステル又は油（動物性及び植物性）、脂肪酸エステル、脂肪酸メチルエステルエトキシレート、グリセロールエステル、グリコールエステル、ラノリン系誘導体、レシチン及びレシチン誘導体、リグニン及びリグニン誘導体、メチルエステル、モノグリセリド及び誘導体、ポリマー性界面活性剤、プロポキシル化及びエトキシル化脂肪酸、アルキルフェノール、タンパク質系界面活性剤、サルコシン誘導体、ソルビタン誘導体、スクロースならびにグルコースエステル及び誘導体から選ばれる。
【0045】
好ましくは、本発明による眼科用製剤中に含有される保存剤は、カチオン性保存剤、好ましくは第四アンモニウム化合物、さらに好ましくは塩化ベンザルコニウム又は塩化ポリドロニウム（polyquad）；グアニジン系保存剤、好ましくはＰＨＭＢ又はクロルヘキシジン；クロロブタノール；水銀保存剤、好ましくは、チメロサール、酢酸フェニル水銀及び硝酸フェニル水銀から選ばれる；酸化保存剤、好ましくは安定化オキシクロロ複合体、さらに好ましくは安定化二酸化塩素、例えば市販製品のＰｕｒｉｔｅ（登録商標）；パラベン、例えばメチルパラベン及びポリプロピルパラベンから選ばれる。
【0046】
一態様によれば、本発明による眼科用製剤は保存剤を含有しない。
好ましくは、本発明による眼科用製剤中に含有される張度調整剤は、塩、好ましくは塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ソルビトール、トレハロース、マンニトール及びグリセリンから選ばれる。
好ましくは、本発明による眼科用製剤中に含有される張度調整剤は、塩、好ましくは塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ソルビトール、トレハロース、マンニトール及びグリセリンから選ばれる。
【0047】
好ましくは、本発明による眼科用製剤の室温における粘度は２５～５０ｃｐｓである。所望粘度にするために粘度調整剤を製剤に添加してもよい。
好ましくは、本発明による眼科用液体製剤中に含有される粘度調整剤は、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ヒアルロン酸、カルボマー、アクリレート、セルロース誘導体、デキストラン、ポリアクリル酸、ポビドン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、キトサン、ジェランガム、及びキサンタンガムから選ばれる。好ましくは、前記セルロース誘導体は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースから選ばれる。
好ましくは、本発明による眼科用液体製剤中に含有される粘度調整剤は、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ヒアルロン酸、カルボマー、アクリレート、セルロース誘導体、デキストラン、ポリアクリル酸、ポビドン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、キトサン、ジェランガム、及びキサンタンガムから選ばれる。好ましくは、前記セルロース誘導体は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースから選ばれる。
【0048】
好ましくは、本発明による眼科用製剤中に含有される抗酸化剤は、クエン酸塩、Ｌ－メチオニン、システイン、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソール及びブチル化ヒドロキシトルエンから選ばれる。
【0049】
好ましくは、本発明による眼科用製剤中に含有されるキレート化剤は、エデト酸二ナトリウムである。
好ましくは、前記眼科用液体製剤がエマルションの場合、該製剤はさらに一つ又は複数の油を含有する。
好ましくは、前記眼科用液体製剤がエマルションの場合、該製剤はさらに一つ又は複数の油を含有する。
【0050】
好ましくは、前記油は、アニス油、ヒマシ油、丁子油、カッシア油、シナモン油、アーモンド油、コーン油、落花生油、綿実油、サフラワー油、トウモロコシ油、亜麻仁油、菜種油、大豆油、オリーブ油、キャラウェイ油、ローズマリー油、ピーナッツ油、ペパーミント油、ヒマワリ油、ユーカリ油、及びゴマ油から選ばれる。
【0051】
好適な態様によれば、本発明による製剤はエタノールを含有しない。
本発明による眼科用製剤は、さらに、炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の予防又は治療に使用される一つ又は複数の薬物及び／又はシクロスポリンを含むこともできる。
本発明による眼科用製剤は、さらに、炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の予防又は治療に使用される一つ又は複数の薬物及び／又はシクロスポリンを含むこともできる。
【0052】
本発明の更なる目的は、上に定義されているような、角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患ならびに眼瞼辺縁の炎症性疾患から選ばれる炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の個体の予防又は治療で眼に局所使用するための上記製剤である。
【0053】
本記載は、角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患ならびに眼瞼辺縁の炎症性疾患から選ばれる少なくとも一つの炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の予防又は治療法にも関し、該方法は、それを必要としている個体に有効量のイソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩及び／又は上記の眼科用製剤を局所投与することを含む。
【0054】
イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩を用いて治療できる角膜及び眼表面の炎症性及び／又は自己免疫性疾患は、好ましくは、春季カタル（ＶＫＣ）、アトピー性角結膜炎（ＡＫＣ）、アレルギー性結膜炎、眼型酒さ、ブドウ膜炎、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、眼類天疱瘡（ＯＣＰ）、眼移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び免疫性角膜潰瘍から選ばれる。
【0055】
好ましくは、前記アレルギー性結膜炎は、季節性又は通年性のアレルギー性結膜炎である。
イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩を用いて治療できる眼瞼辺縁の炎症性疾患は、炎症性翼状片及び慢性眼瞼炎である。
イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩を用いて治療できる眼瞼辺縁の炎症性疾患は、炎症性翼状片及び慢性眼瞼炎である。
【0056】
本発明によれば、治療法は、上記の一つ、二つ又はそれ以上の炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の予防及び治療のために、イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩及び／又は上記のような眼科用製剤を眼に局所投与することを含む。
【0057】
好ましくは、前記イソシクロスポリンＡ又は前記その塩、又は眼科用製剤は、前記個体の眼の眼表面又は眼瞼辺縁に局所適用される。
好適な態様によれば、前記イソシクロスポリンＡ又は前記その塩は、眼科用の液体又は半液体製剤によって前記個体の眼の眼表面に局所適用される。
好適な態様によれば、前記イソシクロスポリンＡ又は前記その塩は、眼科用の液体又は半液体製剤によって前記個体の眼の眼表面に局所適用される。
【0058】
好ましくは、前記イソシクロスポリンＡ又は前記その塩は、医学的状況及び治療される疾患の重症度に応じて１日１回、２回、３回、４回、又はそれ以上の回数投与される。
一態様によれば、治療法は、イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩及び／又は上記眼科用製剤の眼への局所投与と共に、炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の予防又は治療に使用されている一つ又は複数の薬物の投与を含む。
一態様によれば、治療法は、イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩及び／又は上記眼科用製剤の眼への局所投与と共に、炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の予防又は治療に使用されている一つ又は複数の薬物の投与を含む。
【0059】
炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の治療に一般的に使用されている薬物は、コルチコステロイド及び当該技術分野で公知のその他の抗炎症薬、免疫抑制薬及び／又は免疫調節薬である。
【0060】
一態様において、治療法は、イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩及び／又は上記眼科用製剤の投与と共に、シクロスポリンの投与を含む。
イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩又は眼科用製剤の眼への局所投与は、炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の治療に一般的に使用されている一つ又は複数の薬物の投与の前、同時、又は後でありうる。
イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩又は眼科用製剤の眼への局所投与は、炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患の治療に一般的に使用されている一つ又は複数の薬物の投与の前、同時、又は後でありうる。
【0061】
特に好適な態様によれば、イソシクロスポリンＡ又はその眼科的に許容可能な塩及び／又はその眼科用製剤を用いて治療できる前記炎症性及び／又は自己免疫性眼疾患は、コルチゾン及び類似のコルチコステロイドによる治療で改善又は回復を示す眼疾患である。
【0062】
従って、この好適な態様に従って、イソシクロスポリンＡ、又はその眼科的に許容可能な塩、又はイソシクロスポリンＡと少なくとも一つの眼科的に許容可能な賦形剤又は希釈剤とを含む眼科用製剤は、コルチゾン及び類似のコルチコステロイドによる治療の前、同時又は後に投与される。
【実施例】
【0063】
実験の項
実施例１－角膜フルオレセイン染色
イソシクロスポリンＡ点眼製剤の有効性を、スコポラミンで角膜上皮損傷を誘導したマウスモデルで評価した。
実施例１－角膜フルオレセイン染色
イソシクロスポリンＡ点眼製剤の有効性を、スコポラミンで角膜上皮損傷を誘導したマウスモデルで評価した。
【0064】
詳しくは、１５匹のマウス（Ｎ＝５／群）を処置前（ベースライン時）に３群に無作為に割り振り、以前の記載のとおり（Ｙｅｈ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ，２００３，４４（１）：１２４－９）、０．５ｍｇ／０．２ｍｌの臭化水素酸スコポラミンの皮下注射プロトコルで処置することによりドライアイを誘導した。
【0065】
実験群は、何の点眼処置も受けなかった対照群（“ＣＴＲＬ”群）と、２つの処置群、すなわち、２％Ｔｗｅｅｎ ８０入りのリン酸緩衝液中に０．０５％のシクロスポリンＡトリフルオロアセテートを含有する従来のシクロスポリンＡトリフルオロアセテート眼科用懸濁液で処置された１群（“旧”群）と、２％Ｔｗｅｅｎ ８０入りのリン酸緩衝液中に０．０５％のイソシクロスポリンＡトリフルオロアセテートを含有する対応するイソシクロスポリンＡトリフルオロアセテート眼科用溶液で処置されたもう１群（“新”群）で構成された。
【0066】
処置群では、１０マイクロリットルの試験製剤を、最初のスコポラミン注射後第１日目から２５日間、各マウスに１日３回両眼に点眼した。処置はコード化（暗号化）され、グループの割り付けは、処置を投与する技術者及び実験の結果を評価する研究者には盲検化された。グループの識別(identification)は分析の最後に明らかにされた。
【0067】
インビボのフルオレセイン染色は、スコポラミン処置後０、９、１１、１７、２２、及び２５日目に各群で実施し、角膜上皮欠損がないか確認した。
角膜フルオレセイン染色は、上皮の生存性を評価するための有益な臨床ツールである。
角膜フルオレセイン染色は、上皮の生存性を評価するための有益な臨床ツールである。
【0068】
デジタル画像は、細隙灯下でコバルトブルーの光を用いて１０倍の倍率で取得され、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してフルオレセイン染色について半自動的に分析された。
図１に示されているように、イソシクロスポリンＡ眼科用溶液で処置された群（新）では、シクロスポリンＡによる処置群（旧）又は非処置群と比べて、上皮損傷が少ないことが観察された（角膜フルオレセイン染色によって示されている通り）。
図１に示されているように、イソシクロスポリンＡ眼科用溶液で処置された群（新）では、シクロスポリンＡによる処置群（旧）又は非処置群と比べて、上皮損傷が少ないことが観察された（角膜フルオレセイン染色によって示されている通り）。
【0069】
興味深いことに、この効果は研究の最初の１７日間で大きく、９日目に統計的有意に達していた。このことは、角膜上皮治癒に対するイソシクロスポリン製剤の直接的な効果を示唆するものである（長期間の眼の潤滑（点眼）とは無関係である）。
【0070】
涙液分泌についても、Ｒｏｓｓｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｉｔａｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｍａｒ；１５０（１）：１５－２１に記載されているように、修正Ｓｃｈｉｒｍｅｒ試験により２２日目及び２５日目に全動物で測定した。
【0071】
図２から分かるように、両時点における涙液分泌にも異なる処置群間で有意差が観察され、イソシクロスポリン処置群で有意に高いレベルであった。
サンプル動物では眼組織に吸収されたシクロスポリン及びイソシクロスポリンのレベルも評価された。３つの異なる時点、すなわち１日目（最初の処置の５分後）、２日目（最初の処置の５分後）、及び７日目（最初の処置の５分後）に、３匹のマウス／群のサブグループで関係組織の生検を実施した。
サンプル動物では眼組織に吸収されたシクロスポリン及びイソシクロスポリンのレベルも評価された。３つの異なる時点、すなわち１日目（最初の処置の５分後）、２日目（最初の処置の５分後）、及び７日目（最初の処置の５分後）に、３匹のマウス／群のサブグループで関係組織の生検を実施した。
【0072】
組織を遠心分離し、ホモジナイズし、凍結乾燥させた。１ｍｇの凍結乾燥組織を室温でＥｔＯＡｃ（０．５ｍｌ）により抽出し、有機溶液をＨＰＬＣで分析して、シクロスポリンＡとイソシクロスポリンＡの組織濃度及び相対量を評価した。
【0073】
ＨＰＬＣ分析のクロマトグラフィー条件を以下の表Ａ及びＢに示す。
表Ａ
表Ａ
【0074】
【表A】
【0075】
表Ｂ：移動相（グラジエント）
【0076】
【表B】
【0077】
移動相Ａ：
０．５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１０００ｍｌの水に溶解。
移動相Ｂ：
０．５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１０００ｍｌのアセトニトリルに溶解。
０．５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１０００ｍｌの水に溶解。
移動相Ｂ：
０．５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１０００ｍｌのアセトニトリルに溶解。
【0078】
得られたデータによれば、イソシクロスポリンＡはシクロスポリンＡと比べて眼表面及び眼内組織に高い生体内分布を示し（＞１０倍）、同じ処置を受けた異なる動物間でのばらつきが著しく小さかった。
【0079】
角膜、結膜、及び眼内組織（強膜及びブドウ膜）におけるイソシクロスポリンＡ及びシクロスポリンＡの平均検出レベル（ｎｇ／ｍｇ）を以下の表Ｃに報告する。
表Ｃ
角膜、結膜、及び眼内組織におけるイソシクロスポリンＡ及びシクロスポリンＡの生体内分布
表Ｃ
角膜、結膜、及び眼内組織におけるイソシクロスポリンＡ及びシクロスポリンＡの生体内分布
【0080】
【表C】
【0081】
眼内組織におけるイソシクロスポリンＡ及びシクロスポリンＡの生体内分布は、強膜及びブドウ膜で評価されたが、これらは切開時に分離されなかった。従って、上記表Ｃ中の“合算”という用語は、切開時に分離されなかった強膜とブドウ膜における生体内分布レベルの評価を指す。
【0082】
眼組織内でのイソシクロスポリンＡからシクロスポリンＡへの経時的変換についても測定したが、予想通り単回投与後及び反復投与後とも最小であった。得られたデータから、観察された有効性は明らかにイソシクロスポリンＡの直接的な効果に起因することが示されているため、新規かつ独立した作用機序が導き出されている。
【0083】
実施例２－眼のアルカリ熱傷ラットモデルにおける局所適用されたイソシクロスポリンＡ点眼薬の抗炎症特性
実施例１のイソシクロスポリンＡトリフルオロアセテート製剤を、アルカリによる眼熱傷急性ラットモデルでも試験した。熱傷は、１ＮのＮａＯＨに浸漬したろ紙ディスクを角膜に１０秒間適用することによって誘導された。
実施例１のイソシクロスポリンＡトリフルオロアセテート製剤を、アルカリによる眼熱傷急性ラットモデルでも試験した。熱傷は、１ＮのＮａＯＨに浸漬したろ紙ディスクを角膜に１０秒間適用することによって誘導された。
【0084】
実験群（各群ｎ＝６）は、何の点眼処置も受けなかった対照群（“ＣＴＲＬ”群）と、上記イソシクロスポリン眼科用溶液で処置（１０マイクロリットルの試験製剤を各マウスに２４時間で３回点眼）された群（“新”群）で構成された。
【0085】
次に、結膜の炎症性浸潤を処置終了時に測定した。
処置群では非処置群と比べて炎症性浸潤に顕著な低減が観察されたため、局所適用されたイソシクロスポリン点眼薬の活性な抗炎症特性がさらに確認された。
処置群では非処置群と比べて炎症性浸潤に顕著な低減が観察されたため、局所適用されたイソシクロスポリン点眼薬の活性な抗炎症特性がさらに確認された。
【0086】
さらに、これらの動物でも上記のようなイソシクロスポリンＡからシクロスポリンＡへの変換を評価したが、眼表面及び／又は眼内組織のどちらにも顕著な相互変換は観察されなかった。
【0087】
実施例３－Ｄｒａｉｚｅ眼刺激試験
典型的なＤｒａｉｚｅ眼刺激試験を６匹の健常ウサギ（３匹／群）の右眼で実施し、シクロスポリンＡに優るイソシクロスポリンＡの眼科用局所製剤の忍容性を比較した（Ｄｒａｉｚｅ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９４４），８２：３７７－３９０）。
典型的なＤｒａｉｚｅ眼刺激試験を６匹の健常ウサギ（３匹／群）の右眼で実施し、シクロスポリンＡに優るイソシクロスポリンＡの眼科用局所製剤の忍容性を比較した（Ｄｒａｉｚｅ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９４４），８２：３７７－３９０）。
【0088】
どちらの群でも、目をこするなどの行動反応や眼刺激の徴候（すなわち結膜反応、腫脹及び／又は分泌物）は観察されなかった。
しかしながら、シクロスポリンＡ処置動物ではまばたき率の増加が観察されたため、Ｌｉらの記載によるウサギまばたき法（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００８；３６３（１-２）：１７７－１８２）も実施した。すなわち、点眼薬の投与１０秒後にウサギのまばたき頻度を２分間記録した。
しかしながら、シクロスポリンＡ処置動物ではまばたき率の増加が観察されたため、Ｌｉらの記載によるウサギまばたき法（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００８；３６３（１-２）：１７７－１８２）も実施した。すなわち、点眼薬の投与１０秒後にウサギのまばたき頻度を２分間記録した。
【0089】
頻度は、イソシクロスポリンＡ群（５±１）と比べてシクロスポリンＡ群（９±１）で高かった。ｐ＜０．０５。
実施例４－ＦＬＩＰＲアッセイ
いくつかの炎症性及び／又はアレルギー性眼疾患に関与しているイオンチャネルの活性化を調節するイソシクロスポリンＡ及びシクロスポリンＡの能力をＦＬＩＰＲアッセイで試験した。
実施例４－ＦＬＩＰＲアッセイ
いくつかの炎症性及び／又はアレルギー性眼疾患に関与しているイオンチャネルの活性化を調節するイソシクロスポリンＡ及びシクロスポリンＡの能力をＦＬＩＰＲアッセイで試験した。
【0090】
ＦＬＩＰＲアッセイは、膜透過性蛍光色素を用いてイオンチャネルのターゲットをスクリーニングするために使用される。特に、顕著なＣａ透過性を有するイオンチャネルのターゲットは細胞内カルシウムの増加をもたらすため、カルシウム感受性色素を用いて測定できる（Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｒ．Ａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．ＦＬＩＰＲＴＭ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ＧＰＣＲ ａｎｄ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｔａｒｇｅｔｓ．Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ［インターネット］．ベセスダ（メリーランド州）：Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；２００４）。
【0091】
詳しくは、３０μＭの濃度のイソシクロスポリンＡ又はシクロスポリンＡを含有する上記製剤を、イオンチャネルＴＲＰＶ３、ＴＲＰＭＬ２又はＴＲＰＣ４を活性化又は阻害するそれらの能力についてＦＬＩＰＲアッセイで試験した。ＴＲＰＶ３は、ＶＫＣ及びＡＫＣなどの眼表面疾患の二つの特徴的側面である痒みと炎症に重要な役割を演ずるイオンチャネルである。
【0092】
ＴＲＰＭＬ２は、免疫応答及び炎症反応の点で重要な役割を有するイオンチャネルである。
ＴＲＰＣ４は、角膜上皮によって発現されているイオンチャネルで、上皮細胞の増殖及び遊走に役割を果たしている。
ＴＲＰＣ４は、角膜上皮によって発現されているイオンチャネルで、上皮細胞の増殖及び遊走に役割を果たしている。
【0093】
詳しくは、ヒトＴＲＰ細胞をトリプシン処理し、カウントし、そして黒色の透明底９６ウェルプレートにウェルあたり５０，０００細胞の密度で播種し、一晩インキュベートする。翌日、培地を細胞プレートから除去し、２５μｌのアッセイ緩衝液を加える。赤色膜電位(Red membrane potential)色素又はカルシウム５(Calcium 5)色素溶液（１０μｌ）をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートする。膜電位色素を用いてＴＲＰＶ３、ＴＲＰＭＬ２及びＴＲＰＣ４を試験する。
【0094】
色素溶液はアッセイ緩衝液中に調製される。化合物希釈を１００％ＤＭＳＯ又はｄＨ２Ｏ中で実施した後、細胞プレートに添加する直前に、短時間（＜１０分）中間希釈（５％ＤＭＳＯ／アッセイ緩衝液又は５％ｄＨ２Ｏ／アッセイ緩衝液）に移す。
【0095】
アゴニスト試験の場合：色素とのインキュベーション後、プレートをＦＬＩＰＲに配置し、蛍光を１．５２秒ごとにモニターする。２０秒後、ＩｓｏＣｓＡ、ＣｓＡ又は標準アゴニストをウェルに加え、蛍光を５分間、ｅｘ／ｅｍ（励起／発光波長）：４８８ｎｍ／５１０～５７０ｎｍでモニターする。
【0096】
アンタゴニスト試験の場合：色素とのインキュベーション後、イソシクロスポリンＡ又はシクロスポリンＡを手動マルチチャンネルを用いて加え、室温で１０分間インキュベートする。プレートをＦＬＩＰＲに配置し、蛍光を１．５２秒ごとにモニターする。２０秒後、１０μｌの適切な標準アゴニストを加え、蛍光を５分間、ｅｘ／ｅｍ：４８８ｎｍ／５１０～５７０ｎｍでモニターする。
【0097】
アッセイの正当性を立証するために、参照アゴニスト及びアンタゴニストを各チャネルに対して試験し、値が許容範囲内であることをチェックする。
試験化合物及び参照化合物の活性化率及び阻害率の値について評価した。
試験化合物及び参照化合物の活性化率及び阻害率の値について評価した。
【0098】
シクロスポリンＡと比べてイソシクロスポリンＡに有意なアゴニスト活性は検出されなかったが、顕著な阻害効果が観察された。阻害アッセイの結果を以下の表１～３に報告する。
【0099】
表１に、イソシクロスポリンＡ、シクロスポリンＡ及び参照化合物によるＴＲＰＶ３の阻害率を報告する。
以下のデータから分かるように、イソシクロスポリンＡ（表中ＩｓｏＣｓＡ）は、このチャネルに、シクロスポリンＡ（表中ＣｓＡ）より４倍以上拮抗する能力を有している。
以下のデータから分かるように、イソシクロスポリンＡ（表中ＩｓｏＣｓＡ）は、このチャネルに、シクロスポリンＡ（表中ＣｓＡ）より４倍以上拮抗する能力を有している。
【0100】
表１－ＴＲＰＶ３の阻害率
【0101】
【表1】
【0102】
表中、２－ＡＰＢは２－アミノエトキシジフェニルボレート（ボリナート）（アゴニスト）であり、ＲＲはルテニウムレッド（アンタゴニスト）である。２－ＡＰＢは参照標準アゴニスト、すなわち受容体を活性化して生物学的応答を引き起こすので、そのＴＲＰＶ３の阻害率は０％に等しいと見なされる。
【0103】
表２に、イソシクロスポリンＡ、シクロスポリンＡ及び参照化合物によるＴＲＰＭＬ２の阻害率を報告する。
以下のデータから分かるように、イソシクロスポリンＡ（表中Ｉｓｏ－ＣｓＡ）は、このチャネルに、シクロスポリンＡ（表中ＣｓＡ）と比べて２倍以上拮抗する能力を有している。
以下のデータから分かるように、イソシクロスポリンＡ（表中Ｉｓｏ－ＣｓＡ）は、このチャネルに、シクロスポリンＡ（表中ＣｓＡ）と比べて２倍以上拮抗する能力を有している。
【0104】
表２－ＴＲＰＭＬ２の阻害率
【0105】
【表2】
【0106】
表中、ＣａＣｌ２はアゴニストであり、ガドリニウムＧｄ３はアンタゴニストである。
ＣａＣｌ２はアゴニストとして作用する、すなわち受容体を活性化して生物学的応答を引き起こすので、そのＴＲＰＭＬ２の阻害率は０％に等しいと見なされる。
ＣａＣｌ２はアゴニストとして作用する、すなわち受容体を活性化して生物学的応答を引き起こすので、そのＴＲＰＭＬ２の阻害率は０％に等しいと見なされる。
【0107】
ＴＲＰＣ４は、角膜上皮によって発現されているイオンチャネルで、上皮細胞の増殖及び遊走に役割を果たしている（Ｈｕａ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｓｅｐ １６；２８０（３７）：３２２３０－７）。春季カタル（ＶＫＣ）及びアトピー性角結膜炎（ＡＫＣ）は眼表面の過剰増殖現象を特徴とする。従って、これらの病状において上皮の増殖と遊走を促進できる分子は有害でありうる。
【0108】
表３に、イソシクロスポリンＡ、シクロスポリンＡ及び参照化合物によるＴＲＰＣ４の活性化率を報告する。
以下のデータから、イソシクロスポリンＡ（表中Ｉｓｏ－ＣｓＡ）はこのチャネルの活性化に何の影響も及ぼしていないが、シクロスポリンＡ（表中ＣｓＡ）はアゴニストとして作用するため、その活性化により望まざる副作用をもたらすことが分かる。
以下のデータから、イソシクロスポリンＡ（表中Ｉｓｏ－ＣｓＡ）はこのチャネルの活性化に何の影響も及ぼしていないが、シクロスポリンＡ（表中ＣｓＡ）はアゴニストとして作用するため、その活性化により望まざる副作用をもたらすことが分かる。
【0109】
表３－ＴＲＰＣ４の活性化率
【0110】
【表3】
【0111】
表中、エングレリンＡ(Englerin A)はアゴニストであり、ガドリニウムＧＤ３はアンタゴニストである。
ＧＤ３はアンタゴニストとして作用する、すなわち受容体を阻害して生物学的応答を引き起こすので、そのＴＲＰＣ４の活性化率は０％に等しいと見なされる。
ＧＤ３はアンタゴニストとして作用する、すなわち受容体を阻害して生物学的応答を引き起こすので、そのＴＲＰＣ４の活性化率は０％に等しいと見なされる。
【図1】
【図2】
【国際調査報告】