特表 2025-503500 セストリン－ＭＡＰＫ複合体阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-04

(54)【発明の名称】セストリン－ＭＡＰＫ複合体阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/64 20060101AFI20250128BHJP

   C07K 5/12 20060101ALI20250128BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20250128BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20250128BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 15/10 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20250128BHJP

【ＦＩ】

C07K7/64

C07K5/12 ZNA

C07K14/47

C12N15/11 Z

C12N15/12

C12N5/0781

C12N5/0783

A61K38/12

A61K48/00

A61K39/39

A61P31/04

A61P31/10

A61P31/12

A61P33/00

A61P31/00

A61P37/02

A61P43/00 107

A61P35/00

A61P11/00

A61P25/08

A61P25/24

A61P3/04

A61P3/00

A61P19/10

A61P15/10

A61P25/00

A61P25/28

【審査請求】有

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024538274

(86)(22)【出願日】2021-12-24

(85)【翻訳文提出日】2024-08-09

(86)【国際出願番号】 IT2021000059

(87)【国際公開番号】W WO2023119337

(87)【国際公開日】2023-06-29

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524235821

【氏名又は名称】セントセル リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100227008

【弁理士】

【氏名又は名称】大賀 沙央里

(72)【発明者】

【氏名】ラナ，アレッシオ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA16

4C084BA24

4C084CA59

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA06

4C084ZA12

4C084ZA16

4C084ZA59

4C084ZA70

4C084ZA81

4C084ZA97

4C084ZB07

4C084ZB26

4C084ZB32

4C084ZB33

4C084ZB35

4C084ZB37

4C084ZC52

4C085AA38

4C085EE06

4C085FF13

4C085FF17

4H045AA10

4H045BA01

4H045BA09

4H045BA13

4H045BA35

4H045CA40

4H045EA20

4H045EA22

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、セストリンに由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体を提供する。環状ポリペプチドは、感染性疾患（ウイルス性および細菌性）ならびに加齢関連状態、例えば癌および神経変性障害、特に、Ｔ細胞により媒介される免疫系応答の障害に関連するまたはそれにより引き起こされる状態を処置し、予防し、または寛解させる際に用いることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

セストリンに由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項2】

前記環状ポリペプチド、誘導体、または類似体がセストリン１に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、任意に、セストリン１が、実質的に配列番号１、２、もしくは３によって表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、請求項１に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項3】

前記環状ポリペプチド、誘導体、または類似体が、セストリン２に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、任意に、セストリン２が、実質的に配列番号４で表されるアミノ酸配列またはそのバリアントもしくは断片を含む、請求項１に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項4】

前記環状ポリペプチド、誘導体、または類似体が、セストリン３に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、任意に、セストリン３が、実質的に配列番号５、６、もしくは７で表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、請求項１に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項5】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２を形成する最初の１６０アミノ酸に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる、請求項３に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項6】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、および／またはセストリン３のドメインＡと、および／またはドメインＡとＣとの界面で結合するように構成される、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項7】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、２個から１５個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から９個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から８個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは４個から７個のアミノ酸を含むまたはそれからなる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項8】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、５個のアミノ酸残基を含むまたはそれからなる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項9】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に：
（ｉ）配列番号８～８４、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｉｉ）配列番号５８、５９、６３、６５、８６、８７、９２、９４～９７、１０７、１１３、１１４、１１６～１１９、１２１～１２４、１２６、１３０、１３３、１４８、１５０、１５４、１５５、１５９～１６２、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｉｉｉ）配列番号１７０～１７２、１７４、１７９、１８７、１９０、１９６～１９９、もしくは２０２、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｉｖ）配列番号５８～６０、６２、６４、８８～９１、９３、９８～１１２、１１５、１２０、１２５、１２７～１２９、１３１、１３２、もしくは１３４～１４７、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖ）配列番号４７、５８もしくは７７、６２～６５、７１～７３、１４９、１５１～１５３、１５６～１５８、１６３～１６９、１７３、１７５、１７６、１８０～１８６、１８８、１８９、１９１～１９５、２００、２０１、もしくは２０３～２０５、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉ）配列番号８９～９１、９７、２０６～２１８、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉｉ）配列番号１７６、１８０、２１９～２３４、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉｉｉ）配列番号２３５～２４７、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉｖ）配列番号２４８～２６０、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｖ）配列番号５８、５９、６２～６５、またはその機能性バリアントもしくは断片；または
（ｖｖｉ）配列番号２６１～２６９、またはその機能性バリアントもしくは断片
のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項10】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号２２、４７、もしくは７７で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片を含むまたはそれからなる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項11】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、Ｌ－アミノ酸単独からなり、またはＤ－アミノ酸単独からなり、またはＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の両方からなる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項12】

配列番号８～８４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項13】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、およびセストリン３、好ましくはそのドメインＡに結合するおよび／またはそれを阻害する、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項14】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、
（ｉ）セストリン２に選択的に結合するおよび／もしくはそれを阻害する；
（ｉｉ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含む；
（ｉｉｉ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン３とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含む；
（ｉｖ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含まない；
（ｖ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン３とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含まない；
（ｖｉ）異なる位置におけるセストリン１相同性（化学的類似性）領域を含む；
（ｖｉｉ）異なる位置におけるセストリン３相同性（化学的類似性）領域を含む；
（ｖｉｉｉ）セストリン２とのセストリン１の配列重複および／もしくは化学的類似性を含む；
（ｖｉｖ）セストリン２とのセストリン３の配列重複および／もしくは化学的類似性を含む；
（ｖｖ）全ての３つのセストリンの間で完全に重複する配列からなるもしくはそれを含む；ならびに／または
（ｖｖｉ）セストリン１とセストリン３の間で完全に重複する配列からなるもしくはそれを含む、
前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項15】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、式（Ｉ）

【化1】

を含むまたはそれからなる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項16】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、以下の結合またはコンジュゲーションを含む、
（ｉ）末端のＮＨ_２基とＣＯＯＨ基（すなわち、ペプチド結合）；
（ｉｉ）ＮＨ_２基とＮＨ_２基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｉｉｉ）ＮＨ_２基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、一級アミド結合）；
（ｉｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＮＨ_２基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｖ）ＮＨ_２基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシルアミン結合）；
（ｖｉ）ＮＨ_２基とＳＨ基（すなわち、チオール－ヒドロキシルアミン結合）；
（ｖｉｉ）ＮＨ_２基とＳＲ基（すなわち、ヒドロスルフィド結合）；
（ｖｉｉｉ）ＣＯＯＨ基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、アミド結合）；
（ｉｘ）ＣＯＯＨ基とＣＯＯＨ基（すなわち、ジカルボン酸結合）；
（ｘ）ＣＯＯＨ基とＮ＝ＮＨ基（すなわち、カルボキシル－アミドゲン結合）；
（ｘｉ）ＣＯＯＨ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシカルボキシル結合）；
（ｘｉｉ）ＣＯＯＨ基とＳＨ基（すなわち、チオール結合）；
（ｘｉｉｉ）ＣＯＯＨ基とＳＲ基（すなわち、チオール結合）；
（ｘｉｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、アミドゲン結合）；
（ｘｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＯＨ基（すなわち、Ｎ－ヒドロキシルアミン結合）；
（ｘｖｉ）ＣＯＮＨ_２基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、ジアミド結合）；
（ｘｖｉｉ）ＣＯＮＨ_２基とＳＲ基（すなわち、ｓ－アミド結合）；
（ｘｖｉｉｉ）ＳＲ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシ－チオール結合）；
（ｘｉｘ）ＳＲ基とＮＨ基（すなわち、チオールアミン結合）；
（ｘｘ）ＮＨ_２基とＮＨ基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｘｘｉ）ＣＯＯＨ基とＮＨ基（すなわち、アミノ－プロパン酸結合）；
（ｘｘｉｉ）ＳＨ基とＯＨ基（すなわち、親水性結合）；
（ｘｘｉｉｉ）ＳＨ基とＮＨ基（すなわち、アミノ－チオール結合）；
（ｘｘｉｖ）ＯＨ基とＮＨ基（すなわち、ヒドロキシルアミン結合）；
（ｘｘｖ）ＯＨ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシ結合）；
（ｘｘｖｉ）ＣＯＮＨ_２基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシアミド結合）；
（ｘｘｖｉｉ）ＳＨ基とＳＨ基（すなわち、ジチオール結合）；
（ｘｘｖｉｉｉ）ＣＯＮＨ_２基とＮＨ基（すなわち、ヒドロキシアミド結合）；または
（ｘｘｉｘ）ＮＨ基とＮＨ基（すなわち、ジアンモニウム結合）
請求項１５に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項17】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、以下の配列番号８５として本明細書に提供されるコンセンサスまたは再現性配列を含むまたはそれからなる：
ｘ_１ｘ_２ｘ_３ｘ_４ｘ_５ ［配列番号８５］
（式中、ｘ_１は、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｅ、Ｎ、Ｙ、Ｓ、Ｑ、もしくはＴであり、好ましくは、ｘ_１は、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、もしくはＤであり；
ｘ_２は、Ｙ、Ａ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｅ、Ｉ、Ｄ、Ｓ、Ｑ、ＮもしくはＴであり、好ましくはｘ_２が、Ｙ、Ａ、ＬもしくはＲであり；
ｘ_３は、Ｌ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｃ、Ｖ、ＰもしくはＮであり、好ましくはｘ_３が、Ｌ、Ａ、ＳもしくはＲであり；
ｘ_４は、Ｌ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｋ、Ｄ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｃ、Ｔ、Ｐ、Ｎ、ＲもしくはＹであり、好ましくはｘ_４が、Ｌ、ＡもしくはＥであり；
および／または
ｘ_５は、Ｌ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｋ、Ｉ、Ｐ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、もしくはＭであり、好ましくは、ｘ_５は、Ｌ、Ｒ、Ａ、もしくはＥである）
前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項18】

前記ポリペプチド、その誘導体または類似体の環化が、セストリン２（配列番号４）のアミノ酸残基４、９、１０、１５、１６、１９、２０、２１、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４６、５０、５６、６１、６３、６５、６６、６７、７１、７３、８４、９１、９４、９６、９９、１０３、１０８、１０９、１１０、１３１、１３４、１４７、１８５、２０４、２１７、２２０、２２６、２２８、２３０、２３３、２３４、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４４、２４９、２５１、２５２、２５５、２５６、２７２、２７３、２７４、２７７、２８４、２９２、２９８、２９９、３０１、３０３、３０４、３０６、３０９、３１０、３１１、３１３、３１４、３１９、３３１、３３３、３３４、３４３、３５９、３６９、４３１、４４２、もしくは４６７、および／またはセストリン１（配列番号１）のアミノ酸残基１～６８、７２、７７、７８、７９、８４、８５、８８、８９、９０、９３、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０４、１０９、１１３、１１９、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３５、１３７、１４８、１５５、１５８、１６０、１６３、１６７、１７２、１７３、１７４、１９５、１９８、２１１、２４９、２６８、２８１、２８４、２９０、２９２、２９４、２９７、２９８、３００～３１２、３１５、３１９、３２０、３２１、３２３、３２５、３２６、３２９、３３０、３４６、３４７、３５０、３５７、３６５、３７１、３７２、３７４、３７６、３７８、３８１、３８２、３８３、３８５、３８６、３９１、４０３、４０５、４１４、４３０、４４０、５０２、５１３、もしくは５３８で起こる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項19】

前記ポリペプチド、その誘導体または類似体の環化が、セストリン２（配列番号４）のアミノ酸残基１、２、４、５、１０、１１、１４～２９、３４、３５、３６、３９、４０、４１、５０、５６、５９、６１、６３、６６、６９、７０、７１、８１、８７、９１、９４、９６、９９、１０３、１０８、１０９、１１０、１３１、１３４、１４２、１４３、１４７、１５１、１８０、１９２、２０４、２１７、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４６、２４９、２５１、２５５、２５６、２７２、２７３、２７７、２８９、２９９、３０１、３０２、３０３、３０６、３０７、３１０、３１３、３１４、３２０、３３１、３３３、３３４、３５７、３５９、３６９、３８０、３４２、もしくは３６７、および／またはセストリン３（配列番号５）のアミノ酸残基１～１４、１６、１７、２２、２３、３０、３１、３２、３５、３６、３７、４６、５２、５５、５７、５９、６２、６５、６６、６７、７７、８３、８７、９０、９２、９５、９９、１０４、１０５、１０６、１２７、１３０、１３８、１３８、１４３、１４７、１７６、１８８、２００、２１３、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２７、２２９、２３０、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５３、２５５、２５９、２６０、２７６、２８０、２９２、３０２、３０４、３０５、３０８、３０９、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２５、３２６、３３２、３４３、３４５、３４６、３６９、３７１、３８１、３９２、４５４、もしくは４７９で起こる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項20】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫細胞におけるセストリン、好ましくは、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および／またはＴ細胞（Ｔリンパ球）におけるセストリンを標的とする、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項21】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるセストリン、好ましくはＣＤ４＋ ＣＤ２７＋ ＣＤ２８＋ 細胞および／またはＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８＋ 細胞におけるセストリン、より好ましくはＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ Ｔ細胞（老化Ｔ細胞）におけるセストリンを標的とする、請求項２０に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項22】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、サイトカイン産生を誘導しまたは回復させ、好ましくは、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、および／またはＩＬ－４の産生を誘導しまたは回復させる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項23】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫老化を防止しまたは反転させる、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項24】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫系を若返らせるように構成される、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項25】

免疫系を若返らせることが、（ｉ）抗原刺激に対する免疫細胞応答性を回復させること；（ｉｉ）免疫細胞におけるテロメア長および／もしくはテロメラーゼ活性を回復させること；（ｉｉｉ）免疫細胞における抗原特異的増殖および／もしくはサイトカイン産生を回復させること；ならびに／または（ｉｖ）Ｂ細胞および／もしくはＣＤ８^＋ Ｔ細胞および／もしくはナチュラルキラー細胞増殖による抗原特異的抗体産生を回復させることを含む、請求項２４に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項26】

治療における使用のための、前記請求項のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項27】

治療における使用のための、請求項１～２５のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体をコードする核酸。

【請求項28】

微生物感染、加齢関連状態、またはＴ細胞媒介性疾患を処置し、予防し、または寛解させる際における使用のための、請求項１～２５のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸。

【請求項29】

前記微生物感染が、細菌性、ウイルス性、真菌性、または原生生物である、請求項２８に記載の使用のための環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項30】

前記加齢関連状態が、免疫系の加齢および／または減退に伴う、それにより引き起こされる、または関連する状態であり、任意に、前記加齢関連状態が、セストリン依存性ｓＭＡＣ活性化および／または免疫老化により特徴付けられる、請求項２８に記載の使用のための環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項31】

前記加齢関連状態が、癌（例えば、小児神経芽細胞腫、メラノーマ、肝臓、膵臓、精巣、もしくは膵臓の癌）、喫煙誘発性肺気腫、てんかん、うつ病、代謝疾患（肥満を含む）、骨粗鬆症、勃起不全、不妊、または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病もしくは認知症からなる群から選択される、請求項２８に記載の使用のための環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項32】

請求項１～２５のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸、およびワクチンを含む組成物。

【請求項33】

免疫応答を刺激する際における、好ましくはワクチンブースターとしての使用のための、請求項１～２５のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸。

【請求項34】

請求項１～２５のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸の治療有効量、および任意に薬学的に許容される媒体を含む、医薬組成物。

【請求項35】

請求項１～２５のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸の治療有効量を、薬学的に許容される媒体と組み合わせるステップを含む、請求項３４に記載の医薬組成物を作製するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、セストリン－ＭＡＰＫ複合体（ｓＭＡＣ）の阻害剤（本明細書においてｓＭＡＣの破壊剤（disruptors of sMAC）（すなわち、「ＤＯＳ」）とも呼ばれる）、特に、排他的ではないが、ｓＭＡＣの環状ポリペプチド（ＤＯＳ）阻害剤に関する。本発明はまた、感染性疾患（ウイルス性、細菌性、および原生生物）ならびに加齢関連状態、例えば癌および神経変性障害を処置し、予防し、または寛解させる際におけるこれらのＤＯＳ化合物の使用に関する。本発明は特に、加齢、またはＴ細胞により媒介される免疫系応答の障害に関連するまたはそれにより引き起こされる状態を処置することに関する。本発明はまた、ＤＯＳ化合物を含む医薬組成物、およびそのようなＤＯＳ化合物を作製する方法にも及ぶ。

【背景技術】

【0002】

世界中の人口動態は、より高齢へとシフトし続けており、老年人口は、２０５０年までには、２０億人超に達すると予想されている（Lutz et al., 2008）。健康的な加齢に課せられる一つの難題は、免疫老化であり、それは、より高齢の個体の、癌、神経変性および感染性疾患、例えば、インフルエンザおよび他の生命を脅かす大発生、例えば、つい最近のコロナウイルスパンデミックなどのリスクを増加させやすくする（Akbar et al., 2016; Dorshkind et al., 2009）。ワクチン接種は、より若い人々において免疫を高めるための効率的な方法であるが、高齢者および免疫不全者におけるいかなるワクチン接種ストラテジーの有効性も、非常に損なわれ、入院の増加をもたらし、高い罹患率および死亡率を伴う（Goronzy and Weyand, 2013; Levin, 2012; Yousefzadeh et al., 2021）。現在、高齢者において長続きする免疫防御を回復するためのストラテジー、特に、免疫系を若返らせ、ワクチン接種個体間での感染の伝播を止めることを目指すアプローチは欠けている。したがって、加齢における生活の質を向上させるための新しいストラテジーを実行する緊急の必要性がある。

【0003】

老化の特徴を示す免疫細胞は、加齢中、増加する（Weng et al., 2009）。実際、より高齢の個体において、免疫細胞の５０％超は老化である。Ｔ細胞は老化へと進むにつれて、共刺激受容体ＣＤ２７およびＣＤ２８の連続的喪失がある。初期ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＣＤ２７＋ ＣＤ２８＋であり、中間期におけるそれらはＣＤ２７－ ＣＤ２８＋であり、老化ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団はＣＤ２７－ ＣＤ２８－である（Lanna et al., 2014）。

【0004】

セストリンとして知られたストレス分子は、ヒトにおいてＳｅｓｎ１、Ｓｅｓｎ２、およびＳｅｓｎ３遺伝子によりコードされる。セストリンはＴ細胞中に蓄積し、ＡＭＰ応答性タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）と結合して、活性化する（Lanna et al., 2017）。ＡＭＰＫは、増加した細胞内ＡＭＰ／ＡＴＰ比に応答して活性化される、触媒性αサブユニットならびに制御性βおよびγサブユニットからなるヘテロ三量体タンパク質である。次に、ＡＭＰＫの活性化は、自己リン酸化を通してのグローバルな（ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）活性化を協調する（図１参照）。

【0005】

細胞外制御タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、およびｐ３８を含むＭＡＰＫの３つの主なサブグループが同定されている（Johnson and Lapadat, 2002）。ＭＡＰＫシグナル伝達酵素は、老化、加齢、および代謝を含む哺乳動物の生理機能の多様な側面に関与している。例えば、図１に示されているように、ＪＮＫはＴＣＲ－ＣＤ２８シグナル伝達を阻害し、ｐ３８はテロメラーゼ活性を阻害し、ＥＲＫはＤＮＡ損傷を増加させ、全てが、加齢中の老化Ｔ細胞の蓄積に寄与する（Lanna et al., 2017）。

【発明の概要】

【0006】

本発明者らは、免疫阻害性タンパク質の巨大複合体である、セストリン－ＭＡＰＫ複合体（ｓＭＡＣ）が、加齢中、免疫学的細胞（例えば、Ｔ細胞）内に蓄積し、老化性機能不全状態を引き起こすことを以前、示している（Lanna et al, Nature Immunology, 2014 and 2017；国際公開第２０１８／１００４１０号）。したがって、本発明者らは、セストリンを標的として阻害することにより、セストリン依存性ｓＭＡＣ活性化が破壊され、その結果として、免疫老化の防止、遅延、または反転を生じ得ると仮定した。

【0007】

現在、ｓＭＡＣを能動的に標的として阻害する既知の薬物はない。ｍＴＯＲ阻害剤の持続投与などのある特定の実験アプローチが、高齢者において免疫老化と戦い、ワクチン接種効力を向上させると提案されているが、これらのアプローチはわずかな効果を示しているだけである（Mannick et al., 2014）。例えば、そのようなアプローチは、ワクチン接種後、抗体力価の２０％増加を超えていない（Mannick et al., 2014）。追加として、これらのアプローチは、それらが、ワクチン接種プロトコールが開始できる前に、毎日８週間投与されなければならないため、高い費用および困難な順守を伴う（Mannick et al., 2014）。セノリティクス（senolytics）での他の実験アプローチは理想にほど遠く、若返りを達成するために老化免疫細胞を殺すことは、年齢進行性胸腺退縮による重度の免疫不全をもたらし得るからである（Carpenter et al., 2021）。追加として、ｓＭＡＣ活性化を防止するために小分子阻害剤によりセストリンを標的とすることは、セストリンが酵素活性を欠き、標的とする明らかな触媒ドメインをもたないという事実により、さらに複雑にされている（Budanov et al., 2010）。

【0008】

したがって、セストリン依存性ｓＭＡＣ活性化および免疫老化を直接的に標的と防止し、結果として、加齢中、免疫を生き返らせることができる向上した治療の大きな必要性がある。

【0009】

実施例に記載されているように、本発明者らは、ＤＯＳ化合物（ｓＭＡＣの破壊剤）と名付けられた、ｓＭＡＣの新規な阻害剤を作製している。これらのＤＯＳ化合物は、（たいていの実施形態において）五量体の環状ペプチドであり、直接的にセストリンをプロテアソーム分解へ仕向けることにより、ナノモル量でｓＭＡＣを阻害する。驚くべきことに、これらの新規なＤＯＳ化合物が、ワクチンの存在下と非存在下の両方において、単一用量で長期免疫防御を与え得ることを本発明者らは観察し、ワクチンの非存在下では、非常に予想外のことであった。これは、ワクチンと共に事前投与（免疫化の数週間前）を必要とする（ｍＴＯＲＣ１阻害剤）（Mannick et al., 2014）かまたはメモリー免疫応答が生じる時にタイミングを合わせる必要がある（ＡＭＰＫ活性化因子）（Pearce et al., 2009）かのいずれかであるｍＴＯＲＣ１阻害剤またはＡＭＰＫ活性化因子と比較して、特に有利である。ＤＯＳ化合物は、細胞死を誘導することはないが、代わりに、加齢した免疫系をリプログラミングして、それを効果的に「若返らせる」ことができる。有利には、老化細胞を殺すよりむしろ、若返らせることができると、高齢者において免疫を保存し、かつヒト寿命をさらに延ばす可能性がある。

【0010】

したがって、本発明の第１の態様によれば、セストリンに由来するアミノ酸配列またはその短縮体（truncation：トランケーション）を含むまたはそれからなる、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体（analogue：アナログ）が提供される。

【0011】

セストリンはストレス誘導性代謝タンパク質であり、ヒトは、３つのセストリンタンパク質、セストリン１、セストリン２、およびセストリン３を発現する（Lee et al., 2013）。セストリンタンパク質のそれぞれは、それぞれ、遺伝子Ｓｅｓｎ１、Ｓｅｓｎ２、およびＳｅｓｎ３によりコードされている。

【0012】

したがって、一実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる。

【0013】

ヒトセストリン１（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ：２７２４４）の１つのアイソフォームのタンパク質配列は、４９２アミノ酸長であり、以下のように、配列番号１として本明細書に提供される：

【0014】

【化1】

【0015】

ヒトセストリン１（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ：２７２４４）の別のアイソフォームのタンパク質配列は、５５１アミノ酸長であり、以下のように、配列番号２として本明細書に提供される：

【0016】

【化2】

【0017】

ヒトセストリン１（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ：２７２４４）の別のアイソフォームのタンパク質配列は、４２６アミノ酸長であり、以下のように、配列番号３として本明細書に提供される：

【0018】

【化3】

【0019】

したがって、好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、セストリン１が、実質的に配列番号１、２、もしくは３で表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片（fragment：フラグメント）を有する。

【0020】

あるいは、別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる。

【0021】

セストリン２（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ：８３６６７）の１つのアイソフォームのタンパク質配列は４８０アミノ酸長であり、以下のように、配列番号４として本明細書に提供される：

【0022】

【化4】

【0023】

したがって、好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、セストリン２が、実質的に配列番号４で表されるアミノ酸配列またはそのバリアントもしくは断片を有する。

【0024】

あるいは、別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン３に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる。

【0025】

ヒトセストリン３（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ：１４３６８６）の１つのアイソフォームのタンパク質配列は４９２アミノ酸長であり、以下のように、配列番号５として本明細書に提供される：

【0026】

【化5】

【0027】

ヒトセストリン３（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ：１４３６８６）の別の実施形態のタンパク質配列は３２１アミノ酸長であり、以下のように、配列番号６として本明細書に提供される：

【0028】

【化6】

【0029】

ヒトセストリン３（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ：１４３６８６）の別の実施形態のタンパク質配列は３５３アミノ酸長であり、以下のように、配列番号７として本明細書に提供される：

【0030】

【化7】

【0031】

したがって、好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン３に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、セストリン３が、実質的に配列番号５、６、もしくは７で表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を有する。

【0032】

しかしながら、好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる。

【0033】

環状ポリペプチドは、Ｎ末端とＣ末端が、アミノ酸の環状鎖を形成するペプチド結合で一緒に自分自身と連結している、ペプチド鎖であり（Joo, 2012）、これまで、セストリン１、２、もしくは３（好ましくはセストリン２）のいずれかに由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含む環状ペプチドが開発されたことはない。

【0034】

用語「その誘導体または類似体」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖またはペプチドバックボーン性質を有する残基（天然アミノ酸か、非天然アミノ酸か、またはアミノ酸模倣体かに関わらず）によって置き換えられている、ポリペプチドを意味し得る。追加として、そのようなペプチドの末端は、アセチル基またはアミド基に類似した性質を有するＮ末端および／またはＣ末端保護基によって保護され得る。

【0035】

本発明によるポリペプチドの誘導体および類似体には、インビボでのペプチドの半減期を増加しているそれらも挙げられ得る。例えば、本発明のペプチドの誘導体または類似体には、そのペプチドのペプトイドおよびレトロペプトイド（retropeptoid）誘導体、そのペプチドのペプチド－ペプトイドのハイブリッド、ならびにそのペプチドのＤ－アミノ酸誘導体が挙げられ得る。

【0036】

ペプトイドまたはポリ－Ｎ－置換グリシンは、側鎖が、アミノ酸内にある場合のようにアルファ－炭素へ付加されているのではなく、ペプチドバックボーンの窒素原子へ付加されている、ペプトイド模倣体の類である。本発明のペプチドのペプトイド誘導体は、そのペプチドの構造の知識から容易にデザインされ得る。レトロペプトイド（全てのアミノ酸が、ペプトイド残基によって逆の順序で置き換えられている）もまた、本発明による適切な誘導体である。レトロペプトイドは、ペプチド、または１個のペプトイド残基を含有するペプトイド－ペプチドハイブリッドと比較して、リガンド結合性溝において反対方向で結合することが予想される。結果として、ペプトイド残基の側鎖は、最初のペプチドにおける側鎖と同じ方向を指すことができる。ペプチドの（Ｌ－アミノ酸よりむしろ）Ｄ－アミノ酸誘導体は、プロテアーゼによるペプチドの望ましくない分解を減少させる。用語「に由来する」は、セストリン１、２、または３（好ましくはセストリン２）およびその一部分に存在し、またはそれを形成するアミノ酸配列の誘導体または改変であるアミノ酸配列を意味し得る。

【0037】

用語「その短縮体」は、セストリン１、２、または３（好ましくはセストリン２）に由来する環状ポリペプチドが、アミノ酸の除去によりサイズが低下していることを意味し得る。アミノ酸の減少は、本発明の環状ポリペプチドへの環化の前のペプチドのＣ末端および／もしくはＮ末端からの残基の除去によって達成され得、または環化前にペプチドのコア内からの１個もしくは複数のアミノ酸の欠失によって達成され得る。

【0038】

好ましくは、環状ポリペプチドは精製および／または単離され、すなわち、それは、天然に見出されず、さらにより好ましくは、後で記載されているように、新たに合成される。

【0039】

セストリン２（配列番号４）の最初の１６０個のアミノ酸残基が、セストリン－ＡＭＰＫ相互作用に関与していると考えられることが示されている（Budanov and Karin, 2008）。したがって、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２を形成する最初の１６０アミノ酸に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、好ましくはセストリン２が、実質的に配列番号４で表されるアミノ酸配列またはそのバリアントもしくは断片を含むことが好ましい。

【0040】

あるいは、別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１を形成する最初の１６０アミノ酸に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、好ましくはセストリン１が、実質的に配列番号１、２、もしくは３で表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含むことが好ましい。

【0041】

あるいは、別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン３を形成する最初の１６０アミノ酸に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、好ましくはセストリン３が、実質的に配列番号５、６、もしくは７で表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含むことが好ましい。最も好ましくは、セストリン３は、実質的に配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む。

【0042】

実施例で論じられ、図２７に示されているように、本発明者らは、ＤＯＳ化合物が、セストリン２のドメインＡ内で、ドメインＢおよびＣとの界面で、かつ重要なことには、二重アスパラギン酸（Ｄ４０６／Ｄ４０７）ＧＡＴＯＲ／ｍＴＯＲＣ１制御部位（Kim et al., 2015）から遠く離れて、結合する可能性が高いことを見出した。実際、ビオチン化化合物は、Ｔ細胞において、ｓＭＡＣと結合するが、ｇａｔｏｒ／ｍＴＯＲＣ１複合体のエレメントとは結合しないことが見出された（図８Ｄ）。したがって、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２のドメインＡと結合するように構成されることが好ましい。さらにより好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２のドメインＡと、セストリン２のドメインＢおよびドメインＣとの界面で結合するように構成される。好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２の二重アスパラギン酸（Ｄ４０６／Ｄ４０７）ＧＡＴＯＲ／ｍＴＯＲＣ１制御部位から遠く離れて（すなわち、それとは結合しない）結合するように構成される。

【0043】

追加として、ＤＯＳ化合物はまた、セストリン１および３のドメインＡ内で結合すると予想される。したがって、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１および／またはセストリン３のドメインＡと結合するように構成されることが好ましい。さらにより好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１および／またはセストリン３のドメインＡと、セストリン１および／またはセストリン３のドメインＢおよびドメインＣとの界面で結合するように構成される。好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１および／またはセストリン３のＧＡＴＯＲ／ｍＴＯＲＣ１制御部位から遠く離れて（すなわち、それとは結合しない）結合するように構成される。セストリン１およびセストリン３における制御部位は、必ずしも同一であるとは限らず、特に、セストリン３において、それのＧＡＴＯＲとの相互作用が、恒常的である（例えば、ロイシン欠乏に対して感受性がない）ことが見出されたからであることに留意されたい（Wolfson et al., 2016）。

【0044】

好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、２個から２０個のアミノ酸残基、より好ましくは２個から１５個のアミノ酸残基、より好ましくは２個から１０個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは２個から７個のアミノ酸を含むまたはそれからなる。好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、３個から２０個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から１５個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から１０個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは３個から７個のアミノ酸を含むまたはそれからなる。好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、４個から２０個のアミノ酸残基、より好ましくは４個から１５個のアミノ酸残基、より好ましくは４個から１０個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは４個から７個のアミノ酸を含むまたはそれからなる。

【0045】

好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、２個から１５個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から９個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から８個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは４個から７個のアミノ酸を含むまたはそれからなる。

【0046】

最も好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、５個のアミノ酸残基を含むまたはそれからなる。

【0047】

一実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、以下のような配列番号８～８４のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる：

【0048】

【表1】

【0049】

したがって、本発明による好ましい環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号８～８４またはその機能性バリアントもしくは断片のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。第１の態様のペプチドは、本明細書ではＤＯＳ化合物、すなわちｓＭＡＣの破壊剤と呼ばれる。

【0050】

図３０および３１に示されているように、環状ポリペプチドはＤＯＳ_ａｌｔと呼ばれる場合があり、すなわち、同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１／３とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を有する環状ポリペプチドである。あるいは、環状ポリペプチドは、ＤＯＳ_ｓｅｌと呼ばれる場合があり、すなわち、同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１／３とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を有しない環状ポリペプチドである。選択的阻害が好ましい状況において、必須モチーフがない選択的化合物が望ましくあり得ることは留意されたい。例として、配列番号１６７（ＤＯＳｓｅｌ３^＊＊＊、ＲＧＧＧＳ）は、セストリン３が疾患発生において役割を果たす状態であるてんかんについての最も好ましい選択的阻害剤であり得る（Johnson et al., 2015）。

【0051】

あるいは、図３２および３３に示されているように、環状ポリペプチドは、ＤＯＳ_ｓｉｍと呼ばれる場合があり、すなわち、ｂｌａｓｔ検索が、異なる位置で相同性（化学的類似性）領域を同定している場合である。さらに、２つの型のコンセンサス配列；配列が任意の２つのセストリンの間で重複しおよび／または化学的類似性を有し、それらが本明細書でＤＯＳ_ｃｏｎと呼ばれる第１の型（図３４および図３５）；配列が全ての３つのセストリンの間で完全に重複している第２の型（これらはＤＯＳ_{ｓｕｐｅｒｃｏｎ}として示されている（図３６））の存在に留意されたい。

【0052】

したがって、別の実施形態において、本発明による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号５８、５９、６３、６５、８６、８７、９２、９４～９７、１０７、１１３、１１４、１１６～１１９、１２１～１２４、１２６、１３０、１３３、１４８、１５０、１５４、１５５、１５９～１６２、１７０～１７２、１７４、１７９、１８７、１９０、１９６～１９９、もしくは２０２で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片のいずれか１つを含むまたはそれからなる。これらの環状ペプチドはＤＯＳ_ａｌｔ環状ポリペプチドと呼ばれる。

【0053】

あるいは、さらに別の実施形態において、本発明による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号５８～６０、６２～６５、７１～７３、８８～９１、９３、９８～１１２、１１５、１２０、１２５、１２７～１２９、１３１、１３２、１３４～１４７、１４９、１５１～１５３、１５６～１５８、１６３～１６９、１７３、１７５、１７６、１８０～１８６、１８８、１８９、１９１～１９５、２００、２０１、もしくは２０３～２０５で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片のいずれか１つを含むまたはそれからなる。これらの環状ペプチドはＤＯＳ_ｓｅｌ環状ポリペプチドと呼ばれる。

【0054】

あるいは、さらに別の実施形態において、本発明による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号８９～９１、９７、１７６、１８０、もしくは２０６～２３４で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片のいずれか１つを含むまたはそれからなる。これらの環状ペプチドはＤＯＳ_ｓｉｍ環状ポリペプチドと呼ばれる。

【0055】

あるいは、さらに別の実施形態において、本発明による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号５４、５６、５７、１７７、１７８、２３５～２６９で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片のいずれか１つを含むまたはそれからなる。これらの環状ペプチドはＤＯＳ_ｃｏｎ環状ポリペプチドと呼ばれる。

【0056】

あるいは、さらに別の実施形態において、本発明による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号５８、５９、６２～６５、１０７で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片のいずれか１つを含むまたはそれからなる。これらの環状ペプチドはＤＯＳ_{ｓｕｐｅｒｃｏｎ}環状ポリペプチドと呼ばれる。

【0057】

アミノ酸がＬ型またはＤ型であり得ることは当業者に周知である。したがって、一実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、Ｌ－アミノ酸単独からなる。したがって、この実施形態において、本発明の環状ポリペプチドはＬ－鏡像異性体であることが理解されるであろう。あるいは、別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、Ｄ－アミノ酸単独からなる。したがって、この実施形態において、本発明の環状ポリペプチドはＤ－鏡像異性体である。あるいは、別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の両方を含む。本発明の環状ポリペプチドに与えられた名称は、それらがＤ－鏡像異性体であるかＬ－鏡像異性体であるかを示し、例えば、ＤＯＳ４６Ｌ（配列番号２２）はＬ－鏡像異性体であり、一方、ＤＯＳ４６ＤはＤ－鏡像異性体である。

【0058】

最も好ましい環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号２２で表されるアミノ酸配列またはその機能性バリアントもしくは断片を含むまたはそれからなる。さらにより好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号２２で表されるＬ－鏡像異性体を含むまたはＬ－アミノ酸配列からなる。このペプチドは本明細書ではＤＯＳ４６Ｌと呼ばれる。

【0059】

別の好ましい環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号７７で表されるアミノ酸配列またはその機能性バリアントもしくは断片を含むまたはそれからなる。さらにより好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号７７で表されるＤ－鏡像異性体を含むまたはＤ－アミノ酸配列からなる。このペプチドは本明細書ではＤＯＳ１４４Ｄと呼ばれる。

【0060】

別の好ましい環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号４７で表されるアミノ酸配列またはその機能性バリアントもしくは断片を含むまたはそれからなる。さらにより好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号４７で表されるＬ－鏡像異性体を含むまたはＬ－アミノ酸配列からなる。このペプチドは本明細書ではＤＯＳ１０４Ｌと呼ばれる。

【0061】

本明細書に記載されたポリペプチドまたはペプチドは、当業者に一般的に知られた標準ペプチド合成方法を用いて新規に合成され得、したがって、その後、本明細書に記載された治療的適用のいずれかに用いられ得ることが理解されるであろう。したがって、ペプチドのいずれも、本明細書に提供される配列の隣接アミノ酸間にペプチド結合を形成して、完全な配列長へ構築する、すなわち、１番目のアミノ酸が提供され、それへ２番目のアミノ酸が付着するなど、ペプチドの所望の長さまで続くことにより作製することができる。それゆえに、完全なセストリン１、２、もしくは３の配列（好ましくはセストリン２）またはそのより短い短縮体から始めて、所望のペプチド長に達するまでＮ末端および／またはＣ末端からアミノ酸を除去することによりポリペプチドの長さを減少させる必要はない。実際、速さ、便利さ、および費用のために、ポリペプチド、またはその生物学的活性のあるバリアントもしくは断片は、新規のペプチド合成方法を用いて作出されることが好ましい。いったんポリペプチドまたはペプチドが合成されたならば、その後、それらは環化を起こすことができる。

【0062】

配列番号８～８４として表された配列のいずれも容易に環化して、第１の態様の環状ポリペプチド、または誘導体もしくは類似体を形成し得ることが理解されるであろう。例えば、ペプチドの環化は、側鎖－側鎖、頭部－側鎖、尾部－側鎖、頭部－尾部（Ｃ末端－Ｎ末端）、またはバックボーン－バックボーンの環化技術によって達成することができる。一つの好ましい実施形態において、頭部－尾部の環化は、環状ポリペプチドが作製される好ましい方法である。環状ポリペプチドは、古典的溶液（液）相直鎖ペプチド環化かまたは樹脂（固体）に基づいた環化かのいずれかを用いて合成され得る。この実施形態において、ポリペプチドは、環化切断アプローチを用いて作製され、そのアプローチにおいて、環状ポリペプチドは、段階的な直鎖ペプチド合成後の環化により合成される。この方法の利点は、側鎖が繋ぎ止められる必要がないことであり、そのアプローチをより一般的なものにしている。好ましくは、使用前に、結果として生じた、環状ペプチドの試料をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより分析することができる。

【0063】

好ましい実施形態において、環化は、アミド結合を通して達成される。あるいは、環化は、エステル結合またはジスルフィド結合を通して達成され得る。

【0064】

したがって、第２の態様において、配列番号８～８４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が提供される。

【0065】

実施例に記載されているように、本発明者らは、セストリン２に由来するＤＯＳ化合物（例えば、ＤＯＳ４６Ｌ）（すなわち、第１の態様のポリペプチド）は、ｓＭＡＣ複合体内のセストリン２に加えて、セストリン１およびセストリン３タンパク質に結合しそれを阻害することを示した（図８Ｄ）。実際、本発明者らは、ＤＯＳ化合物のいくつかが、全ての３つのセストリンタンパク質（セストリン１、セストリン２、およびセストリン３）にわたって保存されまたは相同性を有することを発見し、そのことは、同じ結合／阻害性質を維持することが予想される。これらの化合物は、汎阻害剤と呼ばれる。しかしながら、本発明者らはまた、ＤＯＳ化合物のいくつかが、セストリンの１つまたは２つのアイソフォームを特異的に結合または阻害することができるのみである、すなわち、それらが選択的阻害剤であることを発見した。

【0066】

しかしながら、直接的結合は、ＤＯＳセストリン阻害機能の必須条件ではないことは考慮されるべきである。例えば、ＤＯＳ４６Ｌは、インビトロで組換え型セストリン３と直接的には結合しないが、それは、ｓＭＡＣ全体を有する実在の細胞（最も好ましくは、Ｔ細胞）においてセストリン３と複合体を形成して見出され、それが、結果として、ｓＭＡＣ複合体破壊による汎セストリン阻害を生じる（図８Ｂ～Ｄ）。

【0067】

したがって、一実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、およびセストリン３に結合しおよび／またはそれを阻害し得る。この実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、およびセストリン３の阻害剤（またはアンタゴニスト）である。あるいは、別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、および／またはセストリン３に選択的に結合しおよび／またはそれを阻害し得る。この実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、および／またはセストリン３の選択的阻害剤である。

【0068】

別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２に結合せずおよび／またはそれを阻害せず、セストリン１および／またはセストリン３に選択的に結合しおよび／またはそれを阻害し得る。この実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１および／またはセストリン３の選択的阻害剤である。

【0069】

別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン３に結合せずおよび／またはそれを阻害せず、セストリン１および／またはセストリン２に選択的に結合しおよび／またはそれを阻害し得る。この実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１および／またはセストリン２の選択的阻害剤である。

【0070】

別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１に結合せずおよび／またはそれを阻害せず、セストリン２および／またはセストリン３に選択的に結合しおよび／またはそれを阻害し得る。この実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２および／またはセストリン３の選択的阻害剤である。

【0071】

一実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１の選択的阻害剤であり、セストリン１が、実質的に配列番号１、２、もしくは３で表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を有する。

【0072】

好ましくは、この実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１の選択的阻害剤であり、実質的に配列番号５８～６０、６２、６４、８８～９１、９３、９８～１１２、１１５、１２０、１２５、１２７～１２９、１３１、１３２、または１３４～１４７で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。さらにより好ましくは、セストリン１の選択的阻害剤は、図３０に見出すことができ、ＤＯＳｓｅｌ^＊として示されている。例として、配列番号１３８はセストリン１の選択的ＤＯＳ阻害剤である。その配列はＰＬＰＬＨである。

【0073】

別の実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン３の選択的阻害剤であり、セストリン３が、実質的に配列番号５、６、もしくは７で表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を有する。

【0074】

好ましくは、この実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン３の選択的阻害剤であり、実質的に配列番号４７、５８もしくは７７、６２～６５、７１～７３、１４９、１５１～１５３、１５６～１５８、１６３～１６９、１７３、１７５、１７６、１８０～１８６、１８８、１８９、１９１～１９５、２００、２０１、または２０３～２０５で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。さらにより好ましくは、セストリン３の選択的阻害剤は、図３１に見出すことができ、ＤＯＳｓｅｌ^＊＊＊として示されている。例として、配列番号１６７はセストリン３の選択的ＤＯＳ阻害剤である。その配列はＲＧＧＧＳである。

【0075】

本発明者は、図２６に示されているように、一般式を作成している。

【0076】

【化8】

【0077】

したがって、好ましくは、本発明の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、式（Ｉ）の環化形態を含むまたはそれからなる。

【0078】

式（Ｉ）のＲ基は、最も好ましくは、当業者に周知の標準アミノ酸から選択されることが理解されるであろう。したがって、式（Ｉ）のＲ基は、以下のアミノ酸のいずれか１個から選択され得る：アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、および／またはチロシン。加えて、一般式における任意のアミノ酸が、当業者に知られている非天然バリアントで置換され得るという可能性が観察される。

【0079】

誤解を避けるために記すと、用いられ得る非天然アミノ酸には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、ベータ－アラニン、ベータ－アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、ピペリジン酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、２，４－ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ－ヒドロキシリジン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルグリシン、サルコシン、Ｎ－メチルイソロイシン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン。

【0080】

一実施形態において、式（Ｉ）を含むまたはそれからなる環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体を作出する、
（ｉ）末端のＮＨ_２基とＣＯＯＨ基（すなわち、ペプチド結合）；
（ｉｉ）ＮＨ_２基とＮＨ_２基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｉｉｉ）ＮＨ_２基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、一級アミド結合）；
（ｉｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＮＨ_２基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｖ）ＮＨ_２基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシルアミン結合）；
（ｖｉ）ＮＨ_２基とＳＨ基（すなわち、チオール－ヒドロキシルアミン結合）；
（ｖｉｉ）ＮＨ_２基とＳＲ基（すなわち、ヒドロスルフィド結合）；
（ｖｉｉｉ）ＣＯＯＨ基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、アミド結合）；
（ｉｘ）ＣＯＯＨ基とＣＯＯＨ基（すなわち、ジカルボン酸結合）；
（ｘ）ＣＯＯＨ基とＮ＝ＮＨ基（すなわち、カルボキシル－アミドゲン結合）；
（ｘｉ）ＣＯＯＨ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシカルボキシル結合）；
（ｘｉｉ）ＣＯＯＨ基とＳＨ基（すなわち、チオール結合）；
（ｘｉｉｉ）ＣＯＯＨ基とＳＲ基（すなわち、チオール結合）；
（ｘｉｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、アミドゲン結合）；
（ｘｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＯＨ基（すなわち、Ｎ－ヒドロキシルアミン結合）；
（ｘｖｉ）ＣＯＮＨ_２基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、ジアミド結合）；
（ｘｖｉｉ）ＣＯＮＨ_２基とＳＲ基（すなわち、ｓ－アミド結合）；
（ｘｖｉｉｉ）ＳＲ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシ－チオール結合）；
（ｘｉｘ）ＳＲ基とＮＨ基（すなわち、チオールアミン結合）；
（ｘｘ）ＮＨ_２基とＮＨ基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｘｘｉ）ＣＯＯＨ基とＮＨ基（すなわち、アミノ－プロパン酸結合）；
（ｘｘｉｉ）ＳＨ基とＯＨ基（すなわち、親水性結合）；
（ｘｘｉｉｉ）ＳＨ基とＮＨ基（すなわち、アミノ－チオール結合）；
（ｘｘｉｖ）ＯＨ基とＮＨ基（すなわち、ヒドロキシルアミン結合）；
（ｘｘｖ）ＯＨ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシ結合）；
（ｘｘｖｉ）ＣＯＮＨ_２基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシアミド結合）；
（ｘｘｖｉｉ）ＳＨ基とＳＨ基（すなわち、ジチオール結合）；
（ｘｘｖｉｉｉ）ＣＯＮＨ_２基とＮＨ基（すなわち、ヒドロキシアミド結合）；または
（ｘｘｉｘ）ＮＨ基とＮＨ基（すなわち、ジアンモニウム結合）
の結合またはコンジュゲーションを含むが、それらに限定されない。

【0081】

頭部－尾部のＮＨ_２－ＣＯＯＨ環化とは異なる上記の結合のいずれも、分子の任意の地点において起こって、ＤＯＳ_ａｌｔ（同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１／３とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を有する環状ポリペプチド）、ＤＯＳ_ｓｅｌ（同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１／３とセストリン２との間に保存されたアミノ酸残基を有しない環状ポリペプチド）、およびＤＯＳ_ｓｉｍ（ｂｌａｓｔ検索が、異なる位置で、相同性、例えば、化学的類似性の領域を同定している）を生成し得る。最も好ましくは、環化は、配列における必須のアミノ酸を破壊すべきではない。誤解を避けるために記すと、ここでの必須とは、Ｂｌａｓｔ検索上で少なくとも１つの他のセストリンタンパク質において保存されているアミノ酸を意味する。進化および／または選択的スプライシング中に起こるフレームシフトの結果として、そのタンパク質の異なる位置における、いかなるセストリンにもわたる少なくとも３アミノ酸の保存モチーフ（五量体配列内で必ずしも連続しているとは限らない）の存在にも注目される。誤解を避けるために記すと、保存モチーフもまた必須と見なされるべきである。例として、ＤＯＳ４６Ｌの保存モチーフはＦＩＰであり、一方、ＤＯＳ１４４Ｄの保存モチーフはＷＬ－Ｇである。ＤＯＳ４６ＬをＤＯＳ１４４Ｄと比較して、本発明者らは、ＤＯＳ４６Ｌにおける頭部（Ａ）－尾部（Ｖ）の環化が末端の非必須ＡおよびＶ（頭部におけるアラニンおよび尾部におけるバリン）を必要とし、その結果として、頭部（Ｅ）－尾部（Ｇ）の環化が必須アミノ酸（尾部におけるＧ、グリシン）を破壊するＤＯＳ１４４Ｄにおける頭部－尾部の環化より、良い結果を生じている（図３）ことを発見した。その結果は、必須アミノ酸に対する非必須アミノ酸への環化の優位性を示した。

【0082】

一実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、以下のように：
ｘ_１ｘ_２ｘ_３ｘ_４ｘ_５ ［配列番号８５］
（式中、ｘ_１、ｘ_２、ｘ_３、ｘ_４、またはｘ_５は任意のアミノ酸残基である）
配列番号８５として本明細書に提供されるコンセンサスまたは再現性（recurrentem）配列を含むまたはそれからなる。一実施形態において、ｘ_１、ｘ_２、ｘ_３、ｘ_４、またはｘ_５は、無極性かつ中性のアミノ酸、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、またはＶであり得る。

【0083】

別の実施形態において、ｘ_１、ｘ_２、ｘ_３、ｘ_４、またはｘ_５は、極性かつ中性のアミノ酸、すなわち、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｎ、またはＱであり得る。

【0084】

別の実施形態において、ｘ_１、ｘ_２、ｘ_３、ｘ_４、またはｘ_５は、極性かつ塩基性のアミノ酸、すなわち、Ｈ、Ｋ、またはＲであり得る。

【0085】

別の実施形態において、ｘ_１、ｘ_２、ｘ_３、ｘ_４、またはｘ_５は、極性かつ酸性のアミノ酸、すなわち、ＤまたはＥであり得る。

【0086】

好ましくは、ｘ_１は、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｅ、Ｎ、Ｙ、Ｓ、Ｑ、もしくはＴであり；
ｘ_２は、Ｙ、Ａ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｅ、Ｉ、Ｄ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、ＷもしくはＴであり；
ｘ_３は、Ｌ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｃ、Ｖ、Ｐ、ＩもしくはＮであり；
ｘ_４は、Ｌ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｋ、Ｄ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｃ、Ｔ、Ｐ、Ｎ、Ｒ、もしくはＹであり；および／または
ｘ_５は、Ｌ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｋ、Ｉ、Ｐ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、もしくはＭである。

【0087】

したがって、一実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、配列番号８５またはそのバリアントもしくは断片に示されているアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

【0088】

好ましくは、配列番号８５において、ｘ_１は、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、またはＤである。好ましくは、ｘ_２は、Ｙ、Ａ、Ｌ、またはＲである。好ましくは、ｘ_３は、Ｌ、Ａ、Ｓ、またはＲである。好ましくは、ｘ_４は、Ｌ、Ａ、またはＥである。好ましくは、ｘ_５は、Ｌ、Ｒ、Ａ、またはＥである。好ましくは、環化は、コンセンサス位置内のアミノ酸で起こるべきではない。万一、環化がコンセンサス位置内の２個以上のアミノ酸間で起こる場合、ソフトウェアに基づいたアラインメントを用いて、再現性がより低いものが好まれるように、どのアミノ酸が環化のために選択されるべきかを決定し得る。

【0089】

コンセンサス性または再現性の他に、かつそれに加えて、最も好ましくは少なくとも２つのセストリンタンパク質において保存されかつターゲティングでの汎セストリン阻害の原因となる少なくとも３アミノ酸（必ずしも連続しているとは限らない）の、上記で指摘されているような保存モチーフ（コンセンサス）の存在が注目される。それは、タンパク質におけるそれらの正確な位置を問わず（例えば、最も好都合には、最初の１６０アミノ酸内であるが、そのタンパク質内のどこでも存在し得る）、おそらくタンパク質進化および／または選択的スプライシングによる可能性が高い、フレームシフトの結果である。したがって、これらのモチーフは、コンピュータに基づいた検索で明らかとならないが、それらは、１個前方の位置から開始して（例として、１アミノ酸ペースで）、ＤＯＳ配列をフレームシフトした時現れる。上述のように、例として、このフレームシフトによって、好ましいＤＯＳ化合物のうちの２つ、ＤＯＳ４６ＬおよびＤＯＳ１４４Ｄ内にＦＩＰおよびＷＬ－Ｇモチーフ（それぞれ、セストリン１、セストリン３、または両方のいずれかに存在する）の存在を本発明者らは発見することができた。

【0090】

したがって、好ましくは、環化は、セストリン機能に必須ではないアミノ酸残基で起こる。例えば、セストリン機能に必須ではないアミノ酸残基は、３つのセストリンのいずれにおいても、またはそのタンパク質全体を通してのそれらの保存モチーフのいずれの内においても保存されていないものであり得る。

【0091】

別の実施形態において、セストリン２とセストリン１の間でのアラインメント（図２８）を考慮すると、ポリペプチド、その誘導体または類似体の環化は、セストリン２（配列番号４）のアミノ酸残基４、９、１０、１５、１６、１９、２０、２１、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４６、５０、５６、６１、６３、６５、６６、６７、７１、７３、８４、９１、９４、９６、９９、１０３、１０８、１０９、１１０、１３１、１３４、１４７、１８５、２０４、２１７、２２０、２２６、２２８、２３０、２３３、２３４、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４４、２４９、２５１、２５２、２５５、２５６、２７２、２７３、２７４、２７７、２８４、２９２、２９８、２９９、３０１、３０３、３０４、３０６、３０９、３１０、３１１、３１３、３１４、３１９、３３１、３３３、３３４、３４３、３５９、３６９、４３１、４４２、もしくは４６７、および／またはセストリン１（配列番号１）のアミノ酸残基１～６８、７２、７７、７８、７９、８４、８５、８８、８９、９０、９３、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０４、１０９、１１３、１１９、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３５、１３７、１４８、１５５、１５８、１６０、１６３、１６７、１７２、１７３、１７４、１９５、１９８、２１１、２４９、２６８、２８１、２８４、２９０、２９２、２９４、２９７、２９８、３００～３１２、３１５、３１９、３２０、３２１、３２３、３２５、３２６、３２９、３３０、３４６、３４７、３５０、３５７、３６５、３７１、３７２、３７４、３７６、３７８、３８１、３８２、３８３、３８５、３８６、３９１、４０３、４０５、４１４、４３０、４４０、５０２、５１３、もしくは５３８で起こる。

【0092】

別の実施形態において、セストリン２とセストリン３の間でのアラインメント（図２９）を考慮すると、ポリペプチド、その誘導体または類似体の環化は、セストリン２（配列番号４）のアミノ酸残基１、２、４、５、１０、１１、１４～２９、３４、３５、３６、３９、４０、４１、５０、５６、５９、６１、６３、６６、６９、７０、７１、８１、８７、９１、９４、９６、９９、１０３、１０８、１０９、１１０、１３１、１３４、１４２、１４３、１４７、１５１、１８０、１９２、２０４、２１７、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４６、２４９、２５１、２５５、２５６、２７２、２７３、２７７、２８９、２９９、３０１、３０２、３０３、３０６、３０７、３１０、３１３、３１４、３２０、３３１、３３３、３３４、３５７、３５９、３６９、３８０、３４２、もしくは３６７、および／またはセストリン３（配列番号５）のアミノ酸残基１～１４、１６、１７、２２、２３、３０、３１、３２、３５、３６、３７、４６、５２、５５、５７、５９、６２、６５、６６、６７、７７、８３、８７、９０、９２、９５、９９、１０４、１０５、１０６、１２７、１３０、１３８、１３８、１４３、１４７、１７６、１８８、２００、２１３、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２７、２２９、２３０、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５３、２５５、２５９、２６０、２７６、２８０、２９２、３０２、３０４、３０５、３０８、３０９、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２５、３２６、３３２、３４３、３４５、３４６、３６９、３７１、３８１、３９２、４５４、もしくは４７９で起こる。

【0093】

好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫細胞におけるセストリンを標的とする。より好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および／またはＴ細胞（Ｔリンパ球）におけるセストリンを標的とする。さらにより好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるセストリンを標的とする。さらにより好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、ＣＤ４＋ ＣＤ２７＋ ＣＤ２８＋細胞および／またはＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８＋細胞におけるセストリンを標的とする。より好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、ＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ Ｔ細胞（すなわち、老化Ｔ細胞）におけるセストリンを標的とする。

【0094】

好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、サイトカイン産生を誘導しまたは回復させる。例えば、好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、ＩＬ－１０、および／またはＩＬ－４の産生を誘導しまたは回復させる。好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫細胞における、さらにより好ましくは、Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を誘導しまたは回復させる。最も好ましくは、Ｔ細胞は老化Ｔ細胞である。

【0095】

好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫老化を防止しまたは反転させる。

【0096】

免疫老化は、自然に加齢により引き起こされる免疫系の緩やかな劣化である（Montecino-Rodriguez et al., 2013）。免疫老化は、宿主の感染に対して応答する能力と、長期免疫記憶の、特にワクチン接種による、発生の両方に影響を及ぼす（Goronzy and Weyand, 2013）。免疫老化は、高齢者の中での罹患および／または死亡の頻度の増加の主な要因であると考えられている。免疫老化は、短いテロメア、内因性ＤＮＡ損傷、テロメラーゼ活性の欠乏、または本発明者により最近、発見されたように（Lanna (Group), 2020）、抗原提示細胞からＴ細胞へのテロメア移動の喪失、およびセストリン発現の増加により引き起こされる、抗原刺激に対する応答性の喪失と共に、老化リンパ球、特に老化Ｔ細胞の年齢依存性蓄積により引き起こされる。本化合物は、抗原提示細胞からＴ細胞への両方のテロメア移動を回復させることができ、その結果として、図２３に示されているように、テロメアを獲得したＴ細胞におけるテロメア伸長を生じる。したがって、好ましくは、本発明による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリンに結合しそれを阻害し、その結果として、免疫老化の防止を生じる。

【0097】

好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫系を若返らせるように構成される。

【0098】

「免疫系を若返らせること」とは、抗原刺激に対する免疫細胞、特にＴ細胞の応答性を回復させることを意味し得る。追加として、免疫系を若返らせることとは、免疫細胞におけるテロメアの長さおよび／もしくは移動、ならびに／またはテロメラーゼ活性を回復させることを意味し得る。免疫系を若返らせることとはまた、免疫細胞、好ましくはＴ細胞における抗原特異的増殖および／またはサイトカイン産生を回復させることを意味し得る。加えて、若返りは、Ｂ細胞および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞増殖による抗原特異的抗体産生を回復させることを意味し得る。

【0099】

実施例に記載されているように、本発明者らは、本発明の新規な環状ポリペプチド、誘導体、または類似体（すなわち、ＤＯＳ化合物）を作製しており、それらは、単一用量で加齢中に免疫を生き返らせることができる。例えば、本発明者らは、それらの環状ペプチド（ＤＯＳ）の単回注射が、老齢マウスにおいて抗ウイルス応答を回復させたことを見出しており、それゆえに、驚くべきことに、ＤＯＳが次世代ワクチン製剤へ加えられ得ることを示している。追加として、本発明者らは、ＤＯＳ化合物が、幹様長命メモリーＴ細胞のレベルを増加させながら、老化Ｔ細胞を減少させたことを示している（Gattinoni et al., 2009, 2011）。したがって、その化合物は、細胞、例えば、移植のための骨髄常在細胞において、幹様状態を誘導しまたは幹細胞性を増加させるために用いることができる（Copelan, 2006）。ＤＯＳ化合物はまた、ＤＯＳ処置により、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、およびＩＬ－１０などのサイトカインのレベルを増加させ、したがって、いくつかの加齢関連状態を予防し、寛解させ、もしくは処置するために用いることができ、またはそれらは、図２５に示されているように、抗原特異的様式での免疫刺激剤として作用する。

【0100】

したがって、本発明の第３の態様において、治療における使用のための、第１または第２の態様による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が提供される。

【0101】

本発明の第４の態様において、治療における使用のための、第１または第２の態様による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体をコードする核酸が提供される。

【0102】

核酸分子は、単離または精製された核酸配列であり得る。核酸配列は、ＤＮＡ配列であり得る。核酸分子は合成ＤＮＡを含み得る。核酸分子はｃＤＮＡを含み得る。核酸は、異種性プロモーターと作動可能に連結され得る。環状ポリペプチド、その誘導体または類似体をコードする核酸配列は、治療における使用のためにまたはクローニングを目的として、遺伝的構築物へ組み入れられ得る。

【0103】

したがって、一つの好ましい実施形態において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体をコードする核酸分子は遺伝的構築物である。より好ましくは、核酸分子または遺伝的構築物は組換えベクター内で提供される。

【0104】

本発明の遺伝的構築物は、発現カセットの形をとり得、その発現カセットは、宿主細胞における、コードされた環状ポリペプチド、その誘導体または類似体の発現に適し得る。遺伝的構築物は、それがベクター内に組み入れられることなしに、宿主細胞へ導入され得る。例として、核酸分子であり得る遺伝的構築物は、リポソームまたはウイルス粒子内に組み入れられ得る。

【0105】

あるいは、精製された核酸分子（例えば、ヒストンを含まないＤＮＡまたは裸のＤＮＡ）が、宿主細胞へ適切な手段、例えば、直接的エンドサイトーシスの取込みにより直接的に挿入され得る。クローニングを目的として、構築物は、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合、または弾道的衝撃により宿主対象の細胞（例えば、細菌、真核生物、または動物の細胞）へ直接的に導入され得る。

【0106】

あるいは、本発明の遺伝的構築物は、微粒子銃を用いて宿主細胞へ直接的に導入され得る。あるいは、遺伝的構築物は、適切な宿主細胞における発現のために、組換えベクター内に存在し得る。処置されている対象への投与について、構築物は、ＡＡＶなどのファージ送達系に含有され得る。

【0107】

組換えベクターは、プラスミド、コスミド、またはファージであり得る。そのような組換えベクターは、宿主細胞を遺伝的構築物で形質転換するのに、およびそこにおいて発現カセットを複製するのに有用である。当業者は、本発明の遺伝的構築物が、発現を目的として、多くの型のバックボーンベクターと組み合わせられ得ることを理解するであろう。組換えベクターは、様々な他の機能性エレメント、例えば、遺伝子発現を開始するための適切なプロモーターを含み得る。例として、組換えベクターは、それが、宿主細胞のサイトゾルにおいて自律的に複製するようにデザインされ得る。この場合、ＤＮＡ複製を誘導または制御するエレメントが組換えベクター内に必要とされ得る。あるいは、組換えベクターは、それが宿主細胞のゲノムへ組み込まれるようにデザインされ得る。この場合、標的組込み（例えば、相同組換えによる）を好むＤＮＡ配列が想定される。

【0108】

クローニングを促進するために、組換えベクターはまた、クローニング工程において選択マーカーとして、すなわち、トランスフェクトまたは形質転換されている細胞の選択を可能にするために、および異種性ＤＮＡを組み入れたベクターを有する細胞の選択を可能にするために、用いられ得る遺伝子をコードするＤＮＡを含み得る。あるいは、選択マーカー遺伝子は、目的の遺伝子を含有するベクターと同時に用いられ得る異なるベクター内にあり得る。ベクターはまた、コード配列の発現を制御することに関与するＤＮＡ、または発現した環状ポリペプチドを宿主細胞のある特定の部分へとターゲティングするためのＤＮＡを含み得る。

【0109】

第５の態様において、微生物感染、加齢関連状態、またはＴ細胞媒介性疾患を処置し、予防し、または寛解させる際における使用のための、第１もしくは第２の態様による環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸が提供される。

【0110】

第６の態様において、対象において微生物感染、加齢関連状態、またはＴ細胞媒介性疾患を処置し、予防し、または寛解させる方法であって、そのような処置を必要としている対象へ、第１もしくは第２の態様による環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸の治療有効量を投与するステップを含む、方法が提供される。

【0111】

微生物感染は細菌性、ウイルス性、真菌性、または原生生物であり得る。

【0112】

加齢関連状態は、免疫系の加齢および／または減退に伴う、それにより引き起こされる、または関連する状態である。好ましくは、加齢関連状態は、セストリン依存性ｓＭＡＣ活性化および／または免疫老化により特徴付けられる（Lanna et al., 2017）。例えば、加齢関連状態は、癌（例えば、小児神経芽細胞腫、メラノーマ、肝臓、膵臓、精巣、もしくは膵臓の癌（Guo et al., 2020；Kumar et al., 2018；Wang et al., 2018；Won et al., 2019；Zhao et al., 2017））、喫煙誘発性肺気腫（Heidler et al., 2013）、てんかん（Johnson et al., 2015）、うつ病（Kato et al., 2019）、代謝疾患（EL-Ashmawy and Ahmed, 2019）、骨粗鬆症（Oh et al., 2021）、または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病（Rai et al., 2016）もしくは認知症（Chen et al., 2019）、加えて、勃起不全、不妊、および多嚢胞性卵巣症候群（Xu et al., 2021）からなる群から選択され得る。

【0113】

Ｔ細胞媒介性疾患は、感染性疾患（例えば、微生物感染）、癌、自己免疫障害（例えば、Ｉ型糖尿病を含む）、炎症性障害、様々な傷害（化学的、電気的、物理的）、潰瘍、および火傷を含む皮膚障害からなる群から選択される疾患であり得る。

【0114】

特に実施例および図５に示されているように、いくつかのＤＯＳ化合物は、全ての３つのセストリンを阻害する能力を有し（例えば、ＤＯＳ４６ＬおよびＤＯＳ１４４Ｄ）、したがって、汎阻害剤として定義することができる。他のものは、１つまたは２つのセストリンだけを阻害し（例えば、ＤＯＳ１０４ＤおよびＤＯＳ１１７Ｌ）、したがって、選択的阻害剤として定義することできる。したがって、これは、処置される状態に依存して、ｓＭＡＣを不活化する汎阻害剤かまたは選択的阻害剤かのいずれかを選択する可能性を示している。例として、ある特定の治療的アプローチ、例えば、細菌またはウイルス感染に対するワクチン接種は、セストリンの汎阻害（例えば、ＤＯＳ４６Ｌによる）から恩恵を受け得、一方、他の状態、例えば、てんかんは、セストリン３により調節され（Johnson et al., 2015）、選択的セストリン３阻害剤、例えば、ＤＯＳ１１７Ｌから恩恵を受け得る。

【0115】

したがって、一実施形態において、てんかんを処置し、予防し、または寛解させる際における使用のための、実質的に配列番号４７、５８もしくは７７、６２～６５、７１～７３、１４９、１５１～１５３、１５６～１５８、１６３～１６９、１７３、１７５、１７６、１８０～１８６、１８８、１８９、１９１～１９５、２００、２０１、または２０３～２０５で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が提供される。これらのペプチドがセストリン３を阻害することが理解されるであろう。

【0116】

別の実施形態において、微生物感染を処置し、予防し、または寛解させる際における使用のための、実質的に配列番号８、１３、１４、１５、３８、６８、または７０で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が提供される。これらのペプチドがセストリン１、２、および３のそれぞれを阻害することが理解されるであろう。

【0117】

第７の態様において、第１もしくは第２の態様の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸、およびワクチンを含む組成物が提供される。

【0118】

第８の態様において、免疫応答を刺激する際における、好ましくはワクチンブースターとしての使用のための、第１もしくは第２の態様の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸が提供される。

【0119】

ワクチンは、任意の抗微生物性ワクチン、例えば、抗ウイルス、抗細菌、抗真菌、または抗原生生物ワクチンであり得る。

【0120】

好ましくは、第１または第２の態様の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を刺激する際において使用される。

【0121】

本発明による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が、微生物（例えば、細菌またはウイルス）感染または加齢関連状態を処置し、寛解させ、または予防するための単剤治療（すなわち、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体の使用）に用いられ得る薬物に使用され得ることが理解されるであろう。例えば、ＤＯＳ（例えば、ＤＯＳ４６Ｌ）の単剤治療の使用は、図１８において単一用量投与後に実証された。この例において、ＤＯＳの単回注射は、ウイルス感染（Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８／５４）の致死的曝露による動物の死を防止した。とりわけ、その効果は長期間持続している（例えば、ＤＯＳの皮下投与から８週間後のウイルス曝露時における防御）。

【0122】

あるいは、本発明による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、微生物（例えば、細菌またはウイルス）感染を処置し、寛解させ、または予防するために、既知の治療、例えば、コロナウイルスまたはインフルエンザなどの感染を予防するためのワクチン製剤の補助として、またはそれと併用して、用いられ得る。例えば、ＤＯＳ（例えば、ＤＯＳ４６ＬまたはＤＯＳ１４４Ｄ）の組合せ使用は、図１５において、インフルエンザワクチン（ＦＬＵＡＤ）と共の単一用量投与後に実証された。したがって、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫細胞が若返ることができるように、ワクチン製剤と共に投与することができる。

【0123】

あるいは、本発明による環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、加齢関連状態を処置し、寛解させ、または予防するために、既知の治療の補助として、またはそれと併用して、用いられ得る。例えば、環状ポリペプチド、誘導体、または類似体は、チェックポイント阻害剤などの癌免疫療法薬と組み合わせて用いられ得る。

【0124】

本発明による環状ポリペプチドは、特に組成物が用いられる様式に依存して、いくつかの異なる形をもつ組成物中に組み合わせられ得る。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ハイドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または処置を必要としているヒトもしくは動物に投与され得る任意の他の適切な形をとり得る。本発明による薬物の媒体が、それが与えられる対象によって十分許容されるものであるべきであることが理解されるであろう。

【0125】

本発明による環状ポリペプチドを含む薬物は、いくつかの様式で用いられ得る。例として、経口投与が必要とされ得、その場合、環状ポリペプチドは、例えば、錠剤、カプセル、または液体の形をとって経口摂取され得る組成物内に含有され得る。あるいは、環状ポリペプチドは、タンパク質分解に対する抵抗性を与えることにより経口投与に有利に働くように、例えばメチル化により、修飾され得る。環状ポリペプチドを投与するための代替の選択肢は、鼻腔用スプレーを用いることであろう。したがって、本発明の環状ポリペプチドを含む組成物は、吸入により（例えば、鼻腔内に）投与され得る。組成物はまた、局所使用のために製剤化され得る。例として、クリームまたは軟膏が皮膚に塗布され得る。

【0126】

本発明による環状ポリペプチドはまた、持続または遅延放出性デバイス内に組み入れられ得る。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入され得、薬物は、数週間またはさらに数ヶ月間にわたって放出され得る。デバイスは、処置部位に少なくとも隣接して位置付けられ得る。そのようなデバイスは、本発明により用いられる環状ポリペプチドでの長期処置が必要とされかつそれが通常には頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を必要とする場合、特に有利であり得る。

【0127】

好ましい実施形態において、本発明による薬物は、血流への注射により、または処置を必要とする部位へ直接的に、対象へ投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）、または皮下（ボーラスまたは注入）、または皮内（ボーラスまたは注入）であり得る。

【0128】

必要とされる環状ポリペプチド、その類似体または誘導体の量が、それの生物学的活性および生物学的利用率によって決定され、次にそれが、投与様式、環状ポリペプチドの生理化学的性質、およびそれが単剤治療として用いられているのかまたは併用治療で用いられているのかに依存することが理解されるであろう。投与の頻度もまた、処置されている対象内の環状ポリペプチドの半減期によって影響される。投与されるべき最適な投薬量は、当業者によって決定され得、使用される特定の環状ポリペプチド、医薬組成物の強度、投与様式、および処置されるべき状態の進行によって異なる。処置されている特定の対象に依存する追加の因子、例えば、対象の年齢、体重、性別、食事、および投与の時間は、投薬量を調整する必要性を生じる。

【0129】

一般的に、本発明による環状ポリペプチドの０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の一日量が、どの環状ポリペプチドが用いられるかに依存して、細菌もしくはウイルス感染または加齢関連状態を処置し、寛解させ、または予防するために用いられ得る。より好ましくは、一日量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは、およそ０．１μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは、およそ０．１μｇ／ｋｇから１０μｇ／ｋｇ体重である。

【0130】

環状ポリペプチドは、細菌もしくはウイルス感染または加齢関連状態の発生の前、中、または後に投与され得る。一日量は、単回投与（例えば、１日１回の注射または鼻腔用スプレーの吸入）として与えられ得る。あるいは、環状ポリペプチドは、１日に２回またはそれ以上の投与を必要とし得る。例として、環状ポリペプチドは、０．０７μｇから７００ｍｇ（すなわち、７０ｋｇの体重と仮定して）の１日２回（または、処置されている細菌もしくはウイルス感染または加齢関連状態の重症度に依存して、それ以上）の服用として投与され得る。処置を受ける患者は、目が覚めた時に１回目の服用、その後、夜に２回目の服用（２回投与計画においての場合）、またはその後、３時間もしくは４時間ごとの間隔で服用し得る。あるいは、持続放出性デバイスが、繰り返し投与を施す必要性なしに、本発明による環状ポリペプチドの最適な用量を患者へ供給するために用いられ得る。

【0131】

製薬業界（例えば、インビボ実験、臨床試験など）により通常、用いられるものなどの公知の手順が、本発明による環状ポリペプチドの特定の製剤および正確な治療計画（例えば、作用物質の一日量および投与の回数）を形成するために用いられ得る。本発明者らは、それらが、初めて、本発明の環状ポリペプチドの使用に基づいた、抗ｓＭＡＣ組成物を示唆するものだと考えている。

【0132】

したがって、本発明の第９の態様において、第１もしくは第２の態様による環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸の治療有効量、および任意に薬学的に許容される媒体を含む医薬組成物が提供される。

【0133】

本発明はまた、第１０の態様において、第１もしくは第２の態様による環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸の治療有効量を、薬学的に許容される媒体と組み合わせるステップを含む、第９の態様による医薬組成物を作製するための方法を提供する。

【0134】

「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または飼い慣らされた動物であり得る。したがって、本発明による薬物は、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、ウマ）、ペットを処置するために用いられ得、または他の獣医学的適用において用いられ得る。しかしながら、最も好ましくは、対象はヒトである。さらにより好ましくは、対象は少なくとも５０歳、６０歳、７０歳、８０歳、９０歳、または１００歳である。

【0135】

環状ポリペプチドの「治療有効量」は、対象へ投与される時に微生物（例えば、細菌、またはウイルス、または原生生物、または寄生生物）感染もしくは加齢関連状態を処置しまたは所望の効果を生じるために必要とされる活性物質の量である、任意の量である。

【0136】

例えば、用いられる環状ポリペプチドの治療有効量は、約０．００１ｍｇから約８００ｍｇまで、好ましくは約０．０１ｍｇから約５００ｍｇまでであり得る。環状ポリペプチドの量が、約０．１ｍｇから約１００ｍｇまでの量であることは好ましい。

【0137】

本明細書で言及される場合、「薬学的に許容される媒体」は、医薬組成物を製剤化する際において有用であると当業者に知られている、任意の既知の化合物、または既知の化合物の組合せである。

【0138】

一実施形態において、薬学的に許容される媒体は固体であり得、組成物は、粉末または錠剤の形をとり得る。固体の薬学的に許容される媒体には、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、色素、増量剤、流動促進剤、圧縮補助剤、不活性結合剤、甘味剤、保存剤、コーティング剤、または錠剤の崩壊剤として働き得る１つまたは複数の物質が挙げられ得る。媒体はまた、封入材料であり得る。粉末において、媒体は、本発明による微粉化活性物質と混合される微粉化固体である。錠剤において、活性物質（すなわち、モジュレーター）は、必要な圧縮特性を有する媒体と適切な割合で混合され、望まれる形およびサイズで圧縮され得る。粉末および錠剤は、好ましくは、最高９９％の活性物質を含有する。適切な固体媒体には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、乳糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態において、薬学的媒体は、ゲルであり得、組成物は、クリームまたは同種のものの形をとり得る。

【0139】

しかしながら、薬学的媒体は液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形をとる。液体媒体は、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル剤、および加圧組成物を調製することに用いられる。本発明による活性物質（環状ポリペプチド）は、水、有機溶媒、両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの薬学的に許容される液体媒体中に溶解または懸濁され得る。液体媒体は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、濃厚剤、着色剤、粘性調節剤、安定剤、または浸透圧調節剤などの他の適切な薬学的添加物を含有し得る。経口および非経口投与のための液体媒体の適切な例には、水（一部には、上記のような添加物、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を含有する）、アルコール（例えば、一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコール）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分留ココナッツ油および落花生油）が挙げられる。非経口投与について、媒体はまた、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであり得る。滅菌液体媒体は、非経口投与のための滅菌液状組成物において有用である。加圧組成物についての液体媒体は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴霧剤であり得る。

【0140】

滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、くも膜下腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、および特に皮下の注射により利用することができる。環状ポリペプチドは、投与時点に、滅菌水、食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を用いて溶解または懸濁し得る滅菌固体組成物として調製され得る。

【0141】

本発明の環状ポリペプチドおよび組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張性にするための十分な食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシアゴム、ゼラチン、ソルビタンモノオレイン酸、ポリソルベート８０（エチレンオキシドと共重合した、ソルビトールおよびそれの無水物のオレイン酸エステル）およびその他同種類のものを含有する滅菌溶液または懸濁液の形で経口投与され得る。本発明により用いられる環状ポリペプチドはまた、液体かまたは固体かのいずれかの組成物の形で経口投与することができる。経口投与に適した組成物には、丸剤、カプセル、顆粒、錠剤、および粉末などの固体の形、ならびに溶液、シロップ、エリキシル剤、および懸濁液などの液体の形が挙げられる。非経口投与に有用な形には、滅菌溶液、乳濁液、および懸濁液が挙げられる。

【0142】

本発明が、実質的に本明細書で言及された配列のいずれかのアミノ酸または核酸配列（その機能性バリアントまたは機能性断片を含む）を含む、任意の核酸もしくはペプチド、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体に及ぶことが理解されるであろう。３つのセストリン中に異なる位置で見出すことができる少なくとも３アミノ酸の保存モチーフの存在が、タンパク質配列進化および／または選択的スプライシングの結果である可能性が高いことも注目される。例えば、ＦＩＰは、わずかに異なる位置ではあるが、セストリン１と３の両方において見出される、ＤＯＳ４６Ｌの保存ドメインであり、それでもなお強力な汎セストリン阻害を生じる。用語「実質的に、アミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「機能性バリアント」、および「機能性断片」は、本明細書で言及された配列のいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％配列同一性、例えば、配列番号１～２３５として同定された配列との４０％同一性などを有する配列であり得る。

【0143】

言及された配列のいずれかとの６０％より高い、好ましくは６５％より高い、より好ましくは７０％より高い、さらにより好ましくは７５％より高い、なおより好ましくは８０％より高い配列同一性である、配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた構想される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、言及された配列のいずれかとの少なくとも８５％同一性、より好ましくは、本明細書で言及された配列のいずれかとの少なくとも９０％同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％同一性、最も好ましくは少なくとも９９％同一性を有する。

【0144】

当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性を計算する方法を理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性を計算するために、その２つの配列のアラインメントがまず、調製されなければならず、その後、配列同一性値が計算される。２つの配列についてのパーセンテージ同一性は、以下に依存して異なる値をとり得る：（ｉ）配列をアラインメントするために用いられる方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムにおいて実行される）、または３Ｄ比較からの構造アラインメント；および（ｉｉ）アラインメント方法に用いられるパラメータ、例えば、局所対大域アラインメント、用いられるペア－スコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ、例えば、関数形式および定数。

【0145】

アラインメントを作成したならば、２つの配列間のパーセンテージ同一性を計算する多くの異なる方法がある。例えば、同一の数を以下で割り得る：（ｉ）最も短い配列の長さ；（ｉｉ）アラインメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均の長さ；（ｉｖ）ギャップではない位置の数；または（ｉｖ）オーバーハングを除く、等しくされた位置の数。さらに、パーセンテージ同一性がまた、長さに強く依存することが理解されるであろう。したがって、配列のペアが短ければ短いほど、配列同一性が高くなることが偶然に起こると予想され得る。

【0146】

したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントが複雑な過程であることが理解されるであろう。人気があるマルチプルアラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680；Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882）は、本発明に従ってタンパク質またはＤＮＡのマルチプルアラインメントを作成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷについての適切なパラメータは以下の通りであり得る：ＤＮＡアラインメントについて：ギャップ開始ペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、およびマトリックス＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。タンパク質アラインメントについて：ギャップ開始ペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、およびマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質アラインメントについて：ＥＮＤＧＡＰ＝－１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者は、最適な配列アラインメントのためにこれらを始めとするパラメータを変えることが必要であり得ることがわかるであろう。

【0147】

好ましくは、その後、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性の計算は、そのようなアラインメントから（Ｎ／Ｔ）×１００として計算され得、式中、Ｎは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含みかつオーバーハングを含むか除くかのいずれかでの、比較される位置の総数である。好ましくは、オーバーハングは、計算に含まれる。したがって、２つの配列間のパーセンテージ同一性を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば上記に示されている、適切なセットのパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アラインメントを調製するステップ；ならびに（ｉｉ）ＮおよびＴの値を以下の式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）×１００へ挿入するステップを含む。

【0148】

類似した配列を同定するための代替方法は、当業者に知られているであろう。例えば、実質的に類似したヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列またはそれらの相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、フィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡと、３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、およそ４５℃でハイブリダイズし、続いて、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、およそ２０～６５℃で少なくとも１回洗浄されることを意味する。あるいは、実質的に類似したポリペプチドは、配列番号１～２３５に示された配列と、少なくとも１個だが、５個未満、１０個未満、２０個未満、５０個未満、または１００個未満のアミノ酸だけ、異なり得る。

【0149】

遺伝暗号の縮重により、本明細書に記載された任意の核酸配列が、それによりコードされたタンパク質の配列に実質的に影響することなく、変わりまたは変化して、その機能性バリアントを与え得ることは明らかである。適切なヌクレオチドバリアントは、配列内で同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した配列を有し、それゆえに、サイレント変化を生じるものである。他の適切なバリアントは、置換するアミノ酸と類似した生物物理学的性質の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変化して、保存的変化を生じている配列の全部または一部分を含むことを除いて、相同ヌクレオチド配列を有するものである。例えば、小さく、無極性で、疎水性のアミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが挙げられる。大きく、無極性で、疎水性のアミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。極性の中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。したがって、どのアミノ酸が、類似した生物物理学的性質を有するアミノ酸で置き換えられ得るかが理解され、当業者は、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。例として、図３２～３３におけるコンセンサスでＤＯＳ_ｓｉｍの化合物を作製するためにそのことが考慮されている。

【0150】

本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約、および図面を含む）に記載された特徴の全部、および／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスのステップの全部は、上記の態様のいずれかと任意の組合せで、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部がお互いに排他的である場合の組合せを除いて、組み合わせられ得る。

【0151】

本発明のより良い理解のために、およびそれの実施形態がどのように実行へ移され得るかを示すために、今、例として、添付の図について言及する。

【図面の簡単な説明】

【0152】

【図1】老化Ｔ細胞におけるセストリン－ＭＡＰＫ複合体（ｓＭＡＣ）のモデルを示す図である。

【図2】ＡＭＰＫ１活性のパーセンテージにより示された場合の、本発明のポリペプチド（すなわち、本明細書でＤＯＳペプチドと呼ばれる）の様々な実施形態の阻害活性を示す図である。ＤＯＳペプチド阻害活性を、組換えセストリン１およびセストリン２の存在下での、ＡＭＰＫキナーゼ反応アッセイにおけるＡＴＰ消費によりスクリーニングした。

【図3】本発明のポリペプチド（ＤＯＳ化合物）の効力を示す図である。ＩＣ５０用量を、有意なセストリン２阻害を示す化合物について計算した。ｌｏｇ濃度値が示されている。

【図4】Ｔ細胞におけるＤＯＳの細胞透過性およびそれのｓＭＡＣへの配置を示す図である。（Ａ～Ｂ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、健康なドナー由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離し、ＤＯＳ化合物で処置した。（Ａ）ＤＯＳ－ＦＩＴＣおよびＣＤ３－ＡＦ５９４で染色されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の代表的な共焦点画像。（Ｂ）ＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ 細胞（Ｔ_ｓｅｎ）およびＣＤ４＋ ＣＤ２７＋ ＣＤ２８＋ 細胞（Ｔ_ｅｒｌ）におけるフローサイトメトリーによるＤＯＳ４６Ｌ透過の定量化。（Ｃ）ｓＭＡＣが存在するＥＲ（ＫＤＥＬ ＥＲマーカー）におけるＤＯＳの局在。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図5】ＤＯＳ化合物によるシグナル破壊を示すヒートマップを示す図である。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を健康なドナー由来のＰＢＭＣから単離し、ＤＯＳ化合物で４時間処置し、イムノブロット分析のために収集した。セストリン１、セストリン２、セストリン３、ｐ－ｍＴＯＲ１、ｐ－ＪＮＫ、ｐ－ＡＭＰＫ、ｐ－ＥＲＫ１／２、およびｐ－ｐ３８のヒートマップは、３～９つの実験の平均を表す。ヒストン３を対照として用いた。

【図6】ＤＯＳ４６ＬによるｓＭＡＣ破壊を示す図である。（Ａ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、健康なドナー由来のＰＢＭＣから精製し、ＤＯＳ４６Ｌ（１０ｕＭ）で、示された時間の間処置した。ＡＭＰＫのセストリン２との結合を、免疫沈降したセストリン２の総レベルに対して定量化し、ＥＬＩＳＡにより検出した。ＩｇＧ免疫沈降物はバックグラウンド対照としての役割を果たした。（Ｂ）細胞を、プロテアソーム阻害剤ＭＧ－１３２（１０ｕＭ）で３０分間前処置し、続いて、ＤＯＳ４６Ｌ（１０ｕＭ）で４時間処置した。細胞を、イムノブロット分析のために収集し、または免疫沈降へ進めた。セストリン２、ｐ３８、およびＡＭＰＫのレベルをイムノブロッティングにより評価した。Ｈ３をローディング対照として用いた。３つの実験の代表的な画像が示されている。（Ｃ）セストリン２免疫沈降物およびそれらの溶解物におけるユビキチン、セストリン２、およびヒストン３のイムノブロットレベルを分析した。代表的な画像が示されている（上部）。セストリン２免疫沈降物におけるユビキチン化タンパク質の平均値（下部）が示されている。結果は、４つの繰り返し実験の平均値±ＳＤとして示されている。データを分析するためにスチューデントＴ検定を用いた。^＊＊ｐ＜０．０１

【図7】ＤＯＳ４６Ｌの滴定を示す図である。（Ａ～Ｂ）ＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ Ｔ細胞を、健康なドナー由来のＰＢＭＣから単離し、増加性用量のＤＯＳ４６Ｌ化合物で４時間処置し、イムノブロット分析のために収集した。（Ａ）セストリン２、ｐ－ｐ３８、およびＨ２Ｂのレベルをイムノプロットにより評価した。（Ｂ）セストリン２の定量化を、ヒストン３をローディング対照として、分析した。少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭが表されている。値は、一元配置ＡＮＯＶＡ検定、その後、チューキーの事後検定を用いて、比較されている。（Ｃ～Ｄ）ＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ Ｔ細胞を、ＤＯＳ４６Ｌ化合物（１０ｕＭ）で０．５時間、１時間、２時間、および４時間処置し、示された時点においてイムノブロット分析のために収集した。（Ｃ）セストリン１、セストリン２、およびセストリン３のレベルをイムノブロットにより評価した。ヒストン３をローディング対照として用いた。（Ｄ）ヒストン３をローディング対照としての、セストリン１、セストリン２、およびセストリン３の定量化。少なくとも４つの独立した実験の平均値±ＳＥＭが表されている。値は、一元配置ＡＮＯＶＡ検定、その後、チューキーの事後検定またはスチューデントＴ検定を用いて、比較されている。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１

【図8】ＤＯＳ４６ＬのｓＭＡＣとの結合を示す図である。（Ａ）ビオチン化ＤＯＳ４６Ｌを、フラグ－組換えセストリンと混合し、ストレプトアビジンで免疫沈降させ、フラグ－セストリンに関してイムノブロットした。ＤＯＳ４６Ｌはセストリンと直接的に結合する。３つの実験からの代表的な画像が示されている。（Ｂ～Ｃ）組換えセストリンはお互いに結合しない。（Ｄ）ＤＯＳ４６Ｌは、ＣＤ４ Ｔ細胞におけるｓＭＡＣ複合体全体と結合する。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、健康なドナー由来のＰＢＭＣから単離し、ビオチン化ＤＯＳ４６Ｌ化合物（１０ｕＭ）で４時間処置した。細胞を、免疫沈降分析のために収集した。

【図9】セストリン有りまたは無しで、ＤＯＳの存在下での細胞増殖を示す図である。ＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ Ｔ細胞を、健康なドナー由来のＰＢＭＣから精製し、セストリンを除去するためにレンチウイルスベクターを形質導入し、ＣＴＶ（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）で染色し、ＤＯＳ４６Ｌ化合物（１０ｕＭ）で９６時間処置した。細胞増殖を、ＦＡＣＳ分析により評価した。ｓｈＣｔｒｌ Ｔ細胞は、セストリンを発現した。９つの実験の代表。

【図10】ＤＯＳ４６Ｌの免疫若返りを示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣを、健康なドナー由来のＰＢＭＣから精製し、ＤＯＳ４６Ｌ化合物（１０ｕＭ）で１２日間処置した。老化Ｔ細胞および幹細胞を、ＦＡＣＳ分析を用いて分析した。（Ｂ～Ｃ）未処置の試料に対する比率が表されている。各ドットは、個々のドナーである。（Ｄ）ＤＯＳ４６Ｌで２４時間処置されたＴ細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を、Ｓｅａｈｏｒｓｅにより測定した。ＤＯＳ４６Ｌによる脂肪酸酸化（ＦＡＯ）の誘導。（Ｅ）ＦＡＯ指数を、Ｓｅａｈｏｒｓｅによる、ＦＡＯ阻害剤エトモキシルの存在下または非存在下での、対照とＤＯＳ４６Ｌ処置Ｔ細胞の間のＯＣＲ差により計算した。データを分析するためにスチューデントＴ検定を用いた。^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図11】ＤＯＳによるサイトカイン産生を示す図である。ＰＢＭＣを、健康なドナーから精製し、ＤＯＳ４６Ｌ化合物（１０ｕＭ）で１２日間処置し、その後、ＦＡＣＳ分析により分析した。１２日間のＤＯＳ４６Ｌ刺激後の老化Ｔ細胞におけるサイトカイン分析。サイトカイン産生細胞の数は下線が引かれている。

【図12】ＤＯＳによるインビトロＩｇＧ定量化を示す図である。（Ａ）ＰＢＭＣを全血から単離し、様々なＤＯＳ化合物（１０ｕＭ）で処置した。ＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。（Ｂ）ＤＯＳ化合物（１０ｕＭ）で処置されたマウス脾細胞。ＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。データを分析するために、チューキーの事後補正検定と共のＡｎｏｖａを用いた。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１

【図13】ＤＯＳ処置されたマウス血液および組織におけるセストリンのレベルを示す図である。（Ａ～Ｂ）老齢マウスに、ＤＯＳ４６Ｌ化合物（０．１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）を皮下に接種した。接種後０時間目、４８時間目、７２時間目、および８週間目に血液を採取した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団においてセストリン２の薬力学をＦＡＣＳにより分析した。（Ｃ）ＤＯＳ４６Ｌの単回投与（０．１ｍｇ／Ｋｇ）から１０日後の、老齢マウスからの脾臓におけるセストリン発現の長期ｍＲＮＡサイレンシング。未処置の同齢の対照が示されている。（Ｄ）ＤＯＳ処置から７２時間後、マウスを屠殺し、老組織を収集して、異なる器官におけるセストリンレベルをイムノブロッティングにより分析した。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図14】免疫化後のＤＯＳの長期効果を示す図である。老齢マウスに、ＤＯＳ化合物（０．１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）を皮下に接種した。免疫化から１８日後（Ａ）、３６日後（Ｂ）、および８週間後（Ｃ）、血液を採取した。（Ｄ）１８日間のＤＯＳ４６での処置後のマウス由来の血液におけるＩｇＧレベルとセストリン２との間の相関曲線。スチューデントＴ検定を適用した。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【図15】ワクチン接種と共のＤＯＳの臨床効果を示す図である。老齢マウスに、ＤＯＳ化合物の存在下または非存在下でワクチン接種し、６ヶ月後、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８／５４を感染させた。マウスを１４日間モニターし、彼らの生存（Ａ）、臨床スコア（Ｂ）、および体重（Ｃ）を分析した。疾患重症度は（Ｄ）に要約されている。ボンフェローニ事後補正検定と共のＡＮＯＶＡ。^＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊ｐ＜０．００１

【図16】感染前および後のインフルエンザ特異的ＩｇＧ抗体およびそれらの中和効果の分析を示す図である。（Ａ）ワクチン接種されかつＨ１Ｎ１ ＰＲ８／５４に感染した若齢マウスおよび老齢マウス由来の血液中の循環インフルエンザ特異的ＩｇＧ抗体の存在を、ＥＬＩＳＡにより評価した。（Ｂ）ワクチン接種されかつＤＯＳ４６Ｌ（０．１ｍｇ／Ｋｇ）で処置された若齢マウスおよび老齢マウス由来の血清の中和効果を、６ヶ月後、評価し、続いて、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８／５４を感染させ、そのウイルスに対するマイクロ中和アッセイを行った。グラフは、ウイルス成長の阻害のパーセンテージを示す。各ドットは、期間中通しての個々のマウスである。ボンフェローニ事後補正検定と共のＡＮＯＶＡを用いた。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。

【図17】感染マウスの肺におけるＤＯＳによるインビボ免疫活性化を示す図である。ＤＯＳ化合物（単一用量）有りまたは無しで、ＦＬＵＡＤでワクチン接種され、その後、６ヶ月後、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８／５４に感染した老齢マウス由来の肺ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるサイトカイン産生。ワクチン接種された若齢マウスは対照としての役割を果たした。群あたり１０匹の動物の代表。

【図18】ＤＯＳのみで処置されたマウスの生存データを示す図である。（Ａ）老齢マウスを、ＤＯＳで処置しまたは処置せず、その後、７２時間後または１０週間後（長期）、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８／５４に感染させた。マウスを１４日間モニターし、彼らの生存を分析した。ＤＯＳで処置されなかった若齢マウスもまた示されている。ワクチン接種の非存在下、短期間と長期間の両方におけるインフルエンザ感染（３．５×１０^５個のウイルス粒子）からマウスを防御するＤＯＳの予防作用に注目されたい。臨床スコアは右側に示されている。群あたり７～１０匹のマウスが示されている。若齢マウスは対照としての役割を果たした。（Ｂ）ＤＯＳのみで１０日間処置されかつＨ１Ｎ１ ＰＲ８／５４に感染した老齢マウスにおけるＩｇＧ力価。若齢対照および老齢対照もまた示されている。各ドットは個々のマウスである。（Ｃ）ＤＯＳ処置以来長期感染したマウスの血清に実施されたマイクロ中和アッセイ。老齢対照および若齢対照もまた示されている。ＤＯＳのみの中和効果が、ワクチン接種されたマウスの中和効果に匹敵することに注目されたい。ボンフェローニ事後補正検定と共のＡＮＯＶＡ。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図19】老齢マウスの肺からのＤＯＳ化合物によるウイルスクリアランスを示す図である。肺を、感染後６日目に取り出した。（Ａ）剖検肺分析および（Ｂ）ウイルスクリアランスを、ハウスキーピング遺伝子Ｌ３４に対して標準化されたウイルスタンパク質ＰＡの非存在により測定した。Ｈ１Ｎ１の感染の２日前にＤＯＳ４６Ｌで処置されなかったまたは処置された老齢マウスの肺由来の細胞においてｑＰＣＲを実施した。マンホイットニー検定を用いた。^＊ｐ＜０．０５。

【図20】インビボでの幹様メモリーＴ細胞へのＤＯＳ効果を示す図である。ＣＤ９５^＋ ＣＤ６２Ｌ^＋ ＣＤ４４^－ ＣＤ４^＋ メモリーＴ細胞の中での幹様生成の時間経過を、ＤＯＳ４６Ｌ（０．１ｍｇ）の注射後１０日目、２１日目、３０日目、および８週間目に、マウスの脾臓においてＦＡＣＳ分析によりモニターした。結果は、群あたり少なくとも３匹のマウスを代表する。

【図21】ＤＯＳによるチェックポイント阻害を示す図である。ＤＯＳ（１０ｍＭ）の存在下または非存在下、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で１２日間活性化された初代ヒト老化ＣＤ２７^－ ＣＤ２８^－ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞におけるＰＤ１およびＴｉｍ３発現。結果は６人のドナーを代表する。チェックポイント阻害剤陽性細胞のパーセンテージが示されている。ＤＯＳはチェックポイント発現を阻害する。ＵＮは未処置の対照を表す。スチューデントｔ検定を用いた。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．００１。

【図22】ＤＯＳ化合物による癌細胞死の誘導を示す図である。（左）不死化小児神経芽細胞腫細胞株（ｓｈ－ｓｙ５ｙ）を、異なる濃度のＤＯＳ４６ＬおよびＤＯＳ１４４Ｄ（１ｕＭから２０ｕＭまで）で４８時間処置し、その後、生死判別染色に関してＦＡＣＳにより分析した。（右）乳癌細胞株（ＭＣＦ－７）を、一定濃度のＤＯＳ４６ＬおよびＤＯＳ１４４Ｄ（２０ｕＭ）で４８時間処置し、その後、生死判別色素染色に関してＦＡＣＳにより分析した。ＵＮは未処置の対照を表す。３連の培養物の結果が示されている。

【図23】ＤＯＳの存在下でのＡＰＣからＴ細胞へのテロメアのライブでの移動を示す図である。（Ａ、左）：Ｔｅｌ Ｃのチャネルにおけるベースライン蛍光を示すＴ細胞；（Ａ、中央）：ＡＰＣと培養された、ＤＯＳで処置されたＴ細胞；（Ａ、右）：ＤＯＳの非存在下でＡＰＣと共培養されたＴ細胞。ＤＯＳはテロメア移動を約２倍、増強する。３つの実験の代表。（Ｂ）：テロメア延長をｑＰＣＲにより定量化した。ＡＰＣに曝露されかつＤＯＳ４６Ｌで処置されたまたは処置されなかったＴ細胞におけるシナプス駆動型テロメア延長（Δｋｂ）。５人のドナーからの結果が示されている。テロメア長における回復が、若いＴ細胞において観察された延長と類似していることが注目される（Lanna (Group), 2020）。マンホイットニー検定を用いた。^＊ｐ＜０．０５。

【図24】ＤＯＳによるＣＯＶＩＤ特異的抗体の刺激を示す図である。高齢のドナー（７５～９５歳）由来のＰＢＭＣを全血から単離し、様々なＤＯＳ４６ＬまたはＤＯＳ１３２Ｌ化合物（１０μＭ）で処置した。ＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図25】ＤＯＳによる抗原特異的増殖の誘導を示す図である。代理ＣＤ３／ＩＬ２活性化（Ａ）または特異的抗原を負荷されたＡＰＣ（Ｂ）と共にＤＯＳ化合物で３日間処置された老化ヒトＣＤ２７^－ ＣＤ２８^－ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞における回復した増殖（Ｋｉ６７^＊）を示すフローサイトメトリーアッセイ。ＤＯＳが、用いられた抗原と無関係にＴ細胞増殖を刺激することに注目されたい。（Ａ）において５人のドナー、（Ｂ）において４人のドナーを代表する実験。データを分析するためにスチューデントＴ検定を用いた。^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図26】本発明の環状ポリペプチドを作製するための、式（Ｉ）および異なる結合選択肢を示す図である。

【図27-1】セストリン２との本発明の環状ポリペプチド、特にＤＯＳ４６Ｌのドッキングを示す図である。

【図27-2】同上。

【図28】ヒトセストリン２とヒトセストリン１のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。^＊は保存されたアミノ酸を示す；^＊＊は化学的に類似したアミノ酸を示す。

【図29】ヒトセストリン２とヒトセストリン３のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。^＊は保存されたアミノ酸を示す；^＊＊は化学的に類似したアミノ酸を示す。

【図30-1】セストリン１およびセストリン２に由来する環状ポリペプチド（ＤＯＳ化合物）の比較を示す図である。保存されたアミノ酸残基は下線が引かれている。セストリン１とセストリン２の間での保存されたアミノ酸残基を有する環状ポリペプチドは、ＤＯＳ代替的バリアント、すなわち、「ＤＯＳ_ａｌｔ」と名付けられている。セストリン１とセストリン２の間での保存されたアミノ酸残基を有しない環状ポリペプチドは、選択的ＤＯＳ化合物、すなわち、「ＤＯＳ_ｓｅｌ」と名付けられている。

【図30-2】同上。

【図30-3】同上。

【図31-1】セストリン２およびセストリン３に由来する環状ポリペプチド（ＤＯＳ化合物）の比較を示す図である。保存されたアミノ酸残基は下線が引かれている。セストリン２とセストリン３の間での保存されたアミノ酸残基を有する環状ポリペプチドは、ＤＯＳ代替的バリアント、すなわち、「ＤＯＳ_ａｌｔ」と名付けられている。セストリン２とセストリン３の間での保存されたアミノ酸残基を有しない環状ポリペプチドは、選択的ＤＯＳ化合物、すなわち、「ＤＯＳ_ｓｅｌ」と名付けられている。^{＊＊＊＊＊}は、セストリン２とセストリン３の間で実際に保存されている代替的化合物を示す。

【図31-2】同上。

【図31-3】同上。

【図32】セストリン１についてのＤＯＳ_ｓｉｍ環状ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。ＤＯＳ_ｓｉｍ環状ポリペプチドは、ｂｌａｓｔ検索がセストリン１と２の間において異なる位置で相同性（化学的類似性）領域を同定しているものである。

【図33】セストリン３についてのＤＯＳ_ｓｉｍ環状ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。ＤＯＳ_ｓｉｍ環状ポリペプチドは、ｂｌａｓｔ検索がセストリン３と２の間において異なる位置で相同性（化学的類似性）領域を同定しているものである。

【図34】セストリン２とセストリン１の間でのＤＯＳ_ｃｏｎ環状ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。ＤＯＳ_ｃｏｎは、任意の２つのセストリンの間で重複しおよび／または化学的類似性を有するものである。

【図35】セストリン２とセストリン３の間でのＤＯＳ_ｃｏｎ環状ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。ＤＯＳ_ｃｏｎは、任意の２つのセストリンの間で重複しおよび／または化学的類似性を有するものである。

【図36】ＤＯＳ_{ｓｕｐｅｒｃｏｎ}環状ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。ＤＯＳ_{ｓｕｐｅｒｃｏｎ}は、全ての３つのセストリンの間で重複しおよび／または化学的類似性を有するものである。

【実施例】

【0153】

本発明者らは、ＤＯＳ（ｓＭＡＣの破壊剤）と名付けられた、セストリン－ＭＡＰＫ複合体（ｓＭＡＣ）の新規な環状ポリペプチド阻害剤を作製し、これらのポリペプチドＤＯＳ化合物が、セストリンをプロテアソーム分解へとターゲティングすることにより、ｓＭＡＣをナノモル量で阻害し得ることを実証している。

【0154】

材料および方法
ペプチドライブラリーを用いた、セストリン１によるＡＭＰＫ１刺激の阻害のインビトロスクリーニング
１．組換えタンパク質ＡＭＰＫ１（５ｎｇ）およびＤＯＳペプチド（２０ｎｇ）を室温で３０分間インキュベートした；
２．セストリン１／ＡＴＰ／ＡＭＰ／ＳＡＭｓｉｔｅ（１ｕｇ）を加え、室温で１時間インキュベートした；
３．２０μｌ ＡＤＰ－Ｇｌｏ試薬を加え、室温で４０分間インキュベートした；
４．その後、４０μｌのキナーゼ検出試薬を加え、室温で３０分間インキュベートした；
５．ＥＬＩＳＡリーダーで結果が得られた。

【0155】

ＣＤ３＋ 細胞におけるＤＯＳ局在についての免疫蛍光
１．精製されたＴ細胞を、２４ウェルプレートに１×１０^６細胞／ウェルの濃度でプレーティングした
２．細胞を、１０μＭのＤＯＳ－ＦＩＴＣで４時間処置した
３．その後、収集し、５００ｇで５分間遠心分離した
４．氷冷ＰＢＳで２回洗浄した
５．細胞を、２００ｕｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ポリリジンで前処置されたカバーグラスにプレーティングした
６．細胞を、氷中で４％のホルムアルデヒドで２０分間固定した
７．ＰＢＳで３回洗浄した
８．ＰＢＳ－ＢＳＡ５％でブロッキングした
９．その後、細胞を一次抗体（抗ＣＤ３ １：１００）と４℃で一晩インキュベートした
１０．ＰＢＳで３回洗浄した
１１．その後、二次抗体（ＡＦ－５９４とコンジュゲートされた抗マウス；１：２５０）と室温で１時間インキュベートした
１２．ＰＢＳで３回洗浄した
１３．細胞を、ＰＢＳ中Ｔｒｉｔｏｎ ０．２５％で２分間透過処理した
１４．続いて、１：１００希釈された抗体 抗ＫＤＥＬ（Ａｂｃａｍ）および抗セストリン２（Ｇｅｎｔｅｘ）と４℃で一晩インキュベートした
１５．ＰＢＳで３回洗浄した
１６．その後、１：２５０希釈された二次抗体 ６４７コンジュゲート型抗マウスまたは５９４コンジュゲート型抗ウサギと室温で１時間インキュベートした
１７．全て、ＰＢＳで３回洗浄した
１８．カバーグラスを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング封入剤ＤＡＰＩ＋でマウンティングした
１９．共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓで画像を取得した

【0156】

ウェスタンブロッティングプロトコール
１．ＣＤ４＋ 細胞を、適切なマイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてＰＢＭＣから分離した
２．細胞を、ホールＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、２４マルチウェルプレートにプレーティングした
３．その後、ＤＯＳ化合物で４時間活性化した
４．その後、細胞を、収集し、ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（ホスフェート阻害剤を含むＲＩＰＡ）中に再懸濁した
５．細胞溶解混合物を、氷上で２０分間インキュベートした
６．試料を、最高速度で２０分間遠心分離した
７．上清を収集し、Ｌｅｍｍｌｉ緩衝液＋β－メルカプトエタノールを加えた
８．その後、試料を９５℃で５分間煮沸した
９．試料を、ポリアクリルアミドゲル上にロードし、ＴＲＩＳ－グリシン－ＳＤＳランニング緩衝液中で流しておいた
１０．流動が完了したならば、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いることにより、そのタンパク質をゲルからニトロセルロース膜へ転写した
１１．膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ－ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、５％無脂肪乳中で１時間ブロッキングした
１２．続いて、一次抗体と一晩インキュベートした
１３．次の日、膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ－ＴＢＳ緩衝液で、それぞれ少なくとも３０分間で３回洗浄した
１４．その後、二次抗体を１時間加えた
１５．膜を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－ＴＢＳ緩衝液で、それぞれ少なくとも３０分間で３回洗浄した
１６．ＥＣＬ溶液を用いてシグナルを発生させた

【0157】

セストリン２の免疫沈降
１．細胞ペレットを、１００μＬの変性溶解緩衝液で溶解した
２．その後、最高速度で２～３秒間激しくボルテックスすることにより十分混合した。
３．その後、試料を９５℃で５分間煮沸した。
４．その後、試料を、９００μｌの非変性溶解緩衝液で希釈し、穏やかに混合した。
５．その後、細胞溶解物を、１ｍＬシリンジに付着した針の中に５～１０回通過させ、または超音波処理した。
６．その後、氷上で５分間インキュベートした
７．試料を、４℃で２０分間最高速度で回転させることによりプレクリーニングした。
８．上清を新しいチューブに収集した
９．７ｕｌ（５ｕｇ）のＳＥＳＮ２（ａｂｃａｍ）一次抗体を上清へ直接加え、ローター上、４℃で一晩インキュベートした
１０．２００ｕｌのプロテインＡ／ＧビーズをＩＰ緩衝液中で４～５回洗浄し、その後、ＢＳＡを含むＩＰ緩衝液中で一晩ブロッキングし、ローター上、４℃で放置した。
１１．次の日、５０ｕｌのプロテインＡ／Ｇビーズを試料に加え、ローター上、４℃で３時間インキュベートした
１２．タンパク質－ビーズのコンジュゲートを、ＩＰ緩衝液中、３０００ｇで２～３分間回転させることにより５～１０回洗浄した
１３．その後、１×Ｌａｅｍｍｌｉ還元剤を加え、試料を９５℃で１０分間煮沸した
１４．続いて、ウェスタンブロッティングプロトコールを実施した

【0158】

細胞抽出物からのタンパク質のインビトロプルダウン
１．５×１０^６細胞を、２００ｕｌのＰＥ緩衝液（ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤を補充）中に溶解し、氷上で３０分間インキュベートした；
２．細胞抽出物を１８００μｌのＰＤ緩衝液と混合した；
３．抽出物を、最高速度で３０分間の遠心分離により、プレクリアリングした；
４．その後、６００ｕｌの上清をＤＯＳ－ビオチン（２０μＭ濃度）と４℃で一晩インキュベートした；
５．ストレプトアビジン－アガロースビーズ（１０００μｌ）を、ＰＤ緩衝液で洗浄し、５％ＢＳＡで一晩ブロッキングした；
６．ビーズを再び洗浄し、細胞抽出物と室温で１時間インキュベートした
７．続いて、ビーズをＰＤ緩衝液で洗浄した
８．タンパク質を、５０μｌのＬａｅｍｍｌｉ １×で溶出した

【0159】

ＨＥＫ２９３細胞におけるレンチウイルス産生
１．０日目：ＨＥＫ２９３細胞を、次の日に７０％コンフルエンスを生じるように、ある特定の濃度において細胞培養フラスコｔ７５中にプレーティングした（それぞれについて、レンチウイルスを、ＨＥＫ２９３細胞の２個のフラスコｔ７５中にプレーティングした）。
２．１日目：リポフェクタミンＬＴＸ試薬をＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に用いることにより、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした；
３．具体的には、トランスフェクション前に、培地を除去し、５ｍＬ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ血清低減培地（Ｇｉｂｃｏ）を各フラスコへ加えた；
４．４μｇのＤＮＡを１０μｌリポフェクタミン２０００およびＰＬＵＳ試薬と１：１の比で組み合わせることにより、プラスミドＤＮＡ－ＰＬＵＳ脂質複合体を得た。その混合物を室温で１０分間インキュベートした。レンチウイルス粒子の産生について、細胞に、以下の３つのプラスミド：ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇエンベロープベクター（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）；ｐ．８９１パッケージングベクター；ｐ－ＳＩＲＥＮ－スクランブル／ｐ－ＳＩＲＥＮ－ｓｈｓｅｓｎ１／ｐ－ＳＩＲＥＮ－ｓｈｓｅｓｎ２／ｐ－ＳＩＲＥＮ－ｓｈｓｅｓｎ３を同時トランスフェクトした。
５．その後、ＤＮＡ－脂質複合体を細胞へ液滴で加えた；
６．トランスフェクションから５時間後、培地を慎重に吸引し、１５ｍＬの新鮮なＤＭＥＭ完全培地に置き換えた；
７．細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
８．３日目：レンチウイルスを含有する培地を、トランスフェクション後４８時間目に収集し、細胞を、新鮮な培地に置き換えた。
９．４日目：レンチウイルスを含有する培地をまた、トランスフェクション後７２時間目に採取した。

【0160】

レンチウイルス濃度
１．Ｌｅｎｔｉ－Ｐａｃレンチウイルス濃縮溶液（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を用いて、レンチウイルス粒子を濃縮した。
２．レンチウイルス粒子を含有する培地を、４℃、２０００ｇで１０分間遠心分離した；
３．その後、Ｌｅｎｔｉ－Ｐａｃ濃縮溶液と５：１の比で混合した；
４．０～４℃で一晩インキュベートし、４℃、３５００ｇで２５分間遠心分離した；
５．上清を慎重に捨てた
６．ウイルスペレットを１００μＬのＰＢＳで再懸濁した
７．ウイルスアリコートを－８０℃で保存した。

【0161】

ＣＴＶ染色
１．形質導入細胞を収集した
２．細胞上清を遠心分離し、細胞ペレットを５μＭのＣＴＶを含む温かいＰＢＳ中に再懸濁した
３．続いて、３７℃で１０分間インキュベートした
４．冷たいＰＢＳを加え、細胞を遠心分離した
５．その後、細胞を培地中に再懸濁し、カウントした
６．これらの細胞のアリコートをＦＡＣＳによりチェックした
７．その後、細胞を２００μＬ中のＤＯＳで刺激し、１２日間培養させておいた

【0162】

ＲＮＡ抽出、逆転写、およびｑＰＣＲ
１．適切なマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ＣＤ４＋ 細胞をマウス脾臓から精製した
２．「ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＤ４＋ 細胞から全ＲＮＡを抽出した。
３．ＲＮＡ濃度を、ＮＡＮＯ－ＤＲＯＰ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により取得した。
４．キット「ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット」（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からアドバイスされたプロトコールに従って、１μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写した。
５．ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ Ｈｉ ＲＯＸキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）というキットを用いて、ｑＰＣＲ反応を、試料あたり１００μｇのｃＤＮＡに関して実施した。
６．ヒトセストリンの調査について、以下のＴａｑｍａｎプローブを用いた：
－ セストリン１ Ｈｓ００９０２７８２＿ｍ１、
－ セストリン２ Ｈｓ００２３０２４１＿ｍ１、
－ セストリン３ Ｈｓ００９１４８７０＿ｍ１
－ ＲＰＬＰＯ Ｈｓ００４２０８９５＿ｇＨ（ハウスキーピング対照として用いられた）
マウスセストリン２の調査について、以下のプライマーを用いた：
－ Ｆｗ ＴＣＴＣＧＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＣ
－ Ｒｗ ＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＡＧ
ＲＰＬ３４についての標準プライマーを、ハウスキーピング対照として用いた
Ｈ１Ｎ１ウイルスのＰＡウイルスタンパク質の調査について、以下のプライマーを用いた：
－ Ｆｗ ＣＧＧＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡ
－ Ｒｗ ＣＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡ
７．ｑＰＣＲ反応を、「ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ」機械（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることにより行った

【0163】

細胞代謝についてのＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ
１．適切なマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ＣＤ４＋ 細胞をＰＢＭＣから精製した
２．精製されたＣＤ４＋ 細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）で活性化し、１０μＭにおけるＤＯＳ４６Ｌで一晩処置した。
３．次の日、通常の成長培地を細胞から除去し、０．５ｍＭグルコース、１ｍＭグルタミンおよび１％ＦＢＳを加えた基本ＤＭＥＭで構成される「基質制限成長培地」を加えた。
４．その後、インキュベーターにおいて、細胞をこの培地と４時間インキュベートした。
５．その後、細胞をカウントし、ポリリジンで前処置されたＸＦ９６ウェルプレート内に、２×１０^５細胞／ウェルの濃度でプレーティングした。
６．その後、細胞に、２ｍＭのグルコースおよび０．５ｍＭ Ｌ－カルニチンを含むＸＦ ＤＭＥＭで構成された「アッセイ培地」を追加した。
７．アッセイを実行する直前に、細胞を１×パルミテート－ＢＳＡまたは１×ＢＳＡで処置した。
８．アッセイ中、細胞を、異なる時点に、Ｅｔｏｍｏｘｉｒ（４μＭ）、オリゴマイシン（１．５μＭ）、ＦＣＣＰ（１μＭ）、およびロテノン／アンチマイシンＡ（０．５μＭ）で処置した。
９．Ｓｅａｈｏｒｓｅ機械は、１２０分間の時間、異なる時点にＯＣＲ値を読み取った。

【0164】

ＤＯＳでのＰＢＭＣインビトロ処置
１．ＰＢＭＣを解凍し、５ｍＬの培地中に再懸濁した
２．インキュベーター内に一晩放置した
３．適切なマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ 細胞を精製した
４．その後、細胞を、平底９６ウェルプレートにおいて、ＤＯＳ化合物の存在下または非存在下、ＣＤ３ ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１０^６細胞について２０ｕＬ）で一晩刺激した
５．細胞をインキュベーター内に１２日間放置し、その後、それらを分析した。

【0165】

免疫化後のＩｇＧ産生の決定
１．ウイルスＨ１Ｎ１に特異的な血漿ＩｇＧの分析を、免疫化後１８日目および３６日目にＥＬＩＳＡにより実施した
２．抗原（ＦＬＵＡＤ）を、９６ウェルプレート内にコーティングした；ウェルあたり５０μｌ、希釈１：４０（１２ｍｌのＰＢＳ＋３００μｌ ＦＬＵＡＤ）
３．その後、ＰＢＳ ０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０中で洗浄した
４．そして、ＰＢＳ ０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０中４％ミルクで、室温で２時間ブロッキングした
５．その後、マウス血漿を、ブロッキングされたプレートへ、０．１％ミルク ＰＢＳ ０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０中希釈１：２００で加えた
６．プレートを４℃で一晩インキュベートした
７．ＰＢＳ ０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０で１回洗浄した
８．その後、０．１％ミルク ＰＢＳ ０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０中に１：２５０希釈された抗マウスＩｇＧ１ビオチンコンジュゲート型抗体を加え、室温で２時間インキュベートした
９．プレートを、ＰＢＳ ０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０で２回洗浄した
１０．ＰＢＳ ０．５％ｔｗｅｅｎ－２０中１：３０００希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲート型抗体を加え、室温で１時間放置した
１１．続いて、ＰＢＳ ０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した
１２．ＴＭＢ基質をウェルに加え、発色するまで、１５～３０分間放置した
１３．その反応を、停止溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で停止させた
１４．ＥＬＩＳＡリーダーにより吸光度を４５０ｎｍにおいて検出した

【0166】

テロメアのライブでの移動
１．適切なマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ＣＤ４＋ 細胞をＰＢＭＣから精製した
２．ＣＤ４＋ 細胞およびＣＤ４－ 細胞を収集した
３．続いて、ＣＤ４＋ 細胞を用いて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ精製キットによりＣＤ２７－およびＣＤ２８－ 細胞を精製した。
４．１×１０^７個のＣＤ４－ 細胞をウェル（６ウェルプレート）の中央にスポットでプレーティングし、ＤＯＳ４６Ｌ １０μＭで処置し、２．３０時間付着させておいた。
５．並行して、５×１０^５個のＣＤ２７－／ＣＤ２８－ 細胞もまた、ＤＯＳ４６Ｌ １０μＭで２．３０時間処置した。
６．その後、ＣＤ４－ 細胞を、ＰＢＳ中１：５０希釈されたＴｅｌＣ－Ｃｙ５プローブ（ＰＮＡ ｂｉｏ Ｌｉｎｋ）で５分間染色した
７．染色されたＣＤ４－ 細胞を含有する各ウェルにおいて、ガラスビーズを加えた；プレートを２分間穏やかに動かして、細胞膜にポアを生じさせた
８．細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離した
９．ペレットを再懸濁し、ＣＤ４－ 細胞をカウントした
１０．ＣＤ４＋ 細胞をＣＤ４－ 細胞と比１：３で混合した
１１．その後、組み合わされたＣＤ４＋ 細胞とＣＤ４－ 細胞を、１：１のＣＭＶとＥＢＶの混合物で刺激した
１２．細胞を一晩インキュベートした
１３．次の日、細胞を、表面タンパク質について染色し、フローサイトメーターで分析した。

【0167】

マイクロ中和アッセイ
１．マウス血清を、１：２００希釈し、１：１００００希釈されたＨ１Ｎ１ウイルスと、３７℃で１時間インキュベートした
２．その後、ＭＤＣＫ細胞を、ウェル（９６ウェルプレート）あたり１５，０００細胞の濃度で加え、５％のＣＯ２と３７℃で一晩インキュベートした。
３．次の日、細胞を、ＰＢＳ中８０％の冷たいアセトンで固定した
４．１：２５０希釈された一次抗体の抗インフルエンザＡ ＮＰをウェルに加え、室温で１時間インキュベートした
５．プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．３％で２回洗浄した
６．１：２５００希釈された二次抗体（ＨＲＰ標識型ヤギ抗マウスＩｇＧ）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。
７．プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．３％で２回洗浄した
８．ＴＭＢ基質を各ウェルに加え、色が変化するまで放置した。
９．その反応を、停止溶液（Ｔｈｅｒｍｏｓ Ｆｉｓｈｅｒ）で停止させ、Ｏ．Ｄを、ＥＬＩＳＡリーダーで７５０ｎｍにおいて取得した。

【0168】

インビトロキナーゼアッセイ
１．セストリンまたはＡＭＰＫ免疫沈降物を、溶解緩衝液中で２回、キナーゼ緩衝液中で２回洗浄した（全て、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製）。
２．免疫沈降物を、３０℃で３０分間、２００μＭ ＡＴＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の存在下もしくは非存在下、未処置のままにし、または１０μＭの環状ＤＯＳ化合物で処置した。
３．試料をＰＢＳで再懸濁した
４．ＥＬＩＳＡプレートを、キナーゼ反応生成物で、４℃で一晩コーティングした
５．その後、プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．５％中４％ミルクで１時間ブロッキングした。
６．ＭＡＰＫ活性を、抗体の抗リン酸化ｐ３８（Ｄ３Ｆ９、Ｃｅｌｌ－Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を用いることにより、または抗リン酸化ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（８１Ｅ１１）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）およびリン酸化ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（ＥＲＫ １／２）（Ｄ１３．１４．４Ｅ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を用いることにより、評価した。全ての抗体は、１：１００希釈され、室温で２時間インキュベートされた。
７．プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．５％で２回洗浄した
８．１：２０００希釈された二次の抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲート型抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を各ウェルに加え、室温で１時間放置した。
９．プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．５％で３回洗浄した
１０．ＴＭＢ基質を、発色するまで加えた；その反応を、停止溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で停止させた
１１．吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。
１２．インビトロキナーゼアッセイデータは、免疫共沈降したＭＡＰＫの総量に対して標準化された３連のウェルの４５０ｎｍ吸光度±ｓ．ｅ．ｍの倍数増加に比例するものとして示された。

【0169】

マウス生存
１．マウス（系統ＣＳ７Ｂ）に、２つの異なる用量０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇにおけるＤＯＳ（４６Ｌ、１４４Ｄ、および１４４Ｌ）と１：２０で組み合わされたＦｌｕａｄワクチン（ＧＳＫ）を注射した。群の数＝８
２．マウスを、群について８匹の動物である、５つの群へ分けた。群は以下のものであった：
－ 群１：ＤＯＳなしのＦｌｕａｄをワクチン接種された老齢マウス（月齢１８ヶ月）；
－ 群２：Ｆｌｕａｄ＋２つの用量でのＤＯＳ４６Ｌをワクチン接種された老齢マウス（月齢１８ヶ月）；
－ 群３：Ｆｌｕａｄ＋ＤＯＳ１４４Ｄをワクチン接種された老齢マウス（月齢１８ヶ月）；
－ 群４：Ｆｌｕａｄ＋ＤＯＳ１４４Ｌをワクチン接種された老齢マウス（月齢１８ヶ月）；
－ 群５：ＤＯＳなしのＦｌｕａｄをワクチン接種された若齢マウス（月齢８ヶ月）
３．ワクチン接種から４ヶ月後、マウスにＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス（ウイルスｐｆｕ ６×１０^５）を感染させた
４．マウスを１５日間モニターした：体重、疾患進行、臨床スコア、生存データを取得した。
５．１５日後、マウスを屠殺し、組織を収集した（血液、肺、脾臓、および胸腺）。

【0170】

動態ＤＯＳ
１．マウス（若齢および老齢）にＤＯＳ４６Ｌ（０．１ｍｇまたは１ｍｇ）を皮下注射し、その後、２時間目、４時間目、２４時間目、４８時間目に頬から採血した
２．ＰＢＭＣを精製した
３．細胞を、Ｔ細胞表面タンパク質について、３０分間染色した
４．ＰＢＳで洗浄した
５．細胞を、ＰＢＳ－固定緩衝液（１：１）で固定し、３７℃で１０分間インキュベートした
６．ＰＢＳで洗浄し、遠心分離した
７．その後、冷たいＰｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ）を細胞に加え、暗闇中、４℃で２０分間インキュベートした
８．ＰＢＳで洗浄した
９．細胞を、抗体の抗セストリン２（１：１００）（ＧｅｎＴｅｘ）で氷中、２０分間染色した
１０．ＰＢＳ中で洗浄した
１１．細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ機械で分析した

【0171】

ＤＯＳでのみ処置されかつＨ１Ｎ１ウイルスに感染したマウス
１．マウス（系統ＣＳ７Ｂ）を、以下の３つの群に分けた：
－ 群１：０．１ｍｇ／ｋｇにおけるＤＯＳ４６Ｌを皮下注射された１０匹の老齢マウス（月齢１８ヶ月）
－ 群２：ＤＯＳを注射されなかった１０匹の老齢マウス（月齢１８ヶ月）
－ 群３：ＤＯＳを注射されなかった３匹の若齢マウス（月齢８ヶ月）
２．ＤＯＳ投与から４８時間後、全ての群からの全てのマウスに、鼻腔内様式でマウスあたり３．５×１０^５ＰＦＵの濃度でのウイルスＨ１Ｎ１を感染させた。
３．臨床スコアを各マウスについて感染から１日目から１０日目まで記録した。臨床スコアは以下のパラメータ評価を含む：
－ 体重
－ 挙動
－ 毛の状態
－ 胸呼吸
－ 眼の状態
４．マウスを、それらが１３の臨床スコア（倫理委員会に認められた重症度のグレード）に達した時、屠殺した。組織を各マウスから収集した（血液、肺、脾臓、および胸腺）。

【0172】

テロメア長定量化アッセイ
１．適切なマイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ＣＤ４－ 細胞およびＣＤ４＋ 細胞をＰＢＭＣから精製した
２．その後、ＣＤ４＋ 細胞を用いて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ精製キットを用いることにより、ＣＤ２７－およびＣＤ２８－ 細胞を精製した。
３．ＣＤ４－細胞およびＣＤ４＋／ＣＤ２７－／ＣＤ２８－ 細胞のペレットを凍結した。
４．４×１０^６個のＣＤ４－ 細胞を１×１０^６個のＣＤ４＋／ＣＤ２７－／ＣＤ２８－ 細胞と、ＤＯＳ ４６Ｌ １０μＭの存在下または非存在下で混合した。
１４．混合された細胞を、ＣＭＶとＥＢＶの１：１混合物で一晩刺激した
１５．次の日、冷たいＰＢＳを用いることによりシリンジで、ＣＤ４－ 細胞をＣＤ４＋／ＣＤ２７－／ＣＤ２８－ 細胞とのコンジュゲートから脱離させた
５．その後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ精製キットを用いることにより、ＣＤ４－ 細胞をＣＤ４＋ 細胞から精製した。
１６．その後、コンジュゲート後のＣＤ４－ 細胞ペレットおよびＣＤ４＋ 細胞ペレットを凍結した。
１７．ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることにより、凍結細胞ペレットからのゲノムＤＮＡを抽出した
１８．ｑＰＣＲ反応を、「絶対ヒトテロメア長定量化ｑＰＣＲアッセイキット」（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により示唆されたプロトコールに従って実施した
１９．上述されたキットにより示唆された式に従って、テロメア長をΔＣＴから計算した。

【0173】

ＤＯＳ化合物のデザイン
本発明者らは、タンパク質セストリン２に関するＤＯＳ化合物をデザインした。しかしながら、ＤＯＳ化合物を、潜在的にセストリン１およびセストリン３に対して活性があり得るものへ広げるために、図２８および２９に示されているように、本発明者らは、セストリン２についてデザインされたＤＯＳ化合物を、セストリン１および３のタンパク質配列に対してアラインメントした。

【0174】

そうすることで、本発明者らは、セストリン１またはセストリン３と特異的に結合するが、セストリン２と結合しないＤＯＳ化合物を同定し、それゆえに、これらを選択的ＤＯＳ化合物と名付けた。これらの化合物について、およびセストリン２配列と部分的にマッチした全ての化合物について、本発明者らは、特定の式に従って、ＤＯＳ配列を構成するアミノ酸に存在する反応性化学基間で自然にまたは合成的に起こり得る可能な化学結合を予測した。

【0175】

機能性化合物の形成をもたらし得る可能な環状二次構造形成の全部を報告するために、本発明者らは、結合の各型について特定のコードを用いた。その時、各コードについて、結合に関与するアミノ酸の文字を結びつけた。具体的には、アミノ酸が、１つより多い特定の反応基を有する場合には、彼らは、各基についての番号をそのアミノ酸の文字に割り当てた。例えば、アルギニンは利用可能な３つのＮＨ基を提示し、本発明者らはそれらをＲ２、Ｒ３、およびＲ４と名付けた。彼らは、アルギニンがアミノ酸配列のＮ末端に位置する場合に利用可能な追加のＮＨ基を指すためにコードＲ’を用いた。

【0176】

ＤＯＳ合成
環状ペプチドＤＯＳ化合物を合成するために、１番目のアミノ酸のアミノ官能性が除去可能なアミノ保護基（例えば、ベンゾイルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（ｔ－Ｂｏｃ）、および９－フルオレン－メトキシカルボニル（ＦＭＯＣ））で保護され、かつ２番目のアミノ酸のカルボキシル官能性が、除去可能なカルボキシル保護基で保護されるような通常の保護および活性化化学を用いた。カルボキシル基は、酸または塩基不安定性エステル、例えば、メチル、エチル、ベンジル、またはトリメチルシリルエステルを形成することにより保護され得る。保護後、１番目および２番目のアミノ酸が、もっぱら、それぞれのＬ／Ｄ－アミノ酸だけで構成される、すなわち、Ｌ／Ｄ－Ａｒｇ、Ｌ／Ｄ－Ｇｌｙ、およびＬ／Ｄ－Ａｓｐで構成される溶液中で反応する。カップリング反応後、１番目のアミノ酸のアミノ基の選択的脱保護が、２番目のアミノ酸のカルボキシル保護基を除去しない条件下での酸性加水分解により達成される。その手順が、保護された追加のアミノ酸に関して繰り返される。周知のメリフィールド、ＦＭＯＣ、およびＭｅＤＢｚ樹脂などの固相合成は、本発明のＤＯＳペプチドを合成するために用いられ得る。直鎖ペプチドは、まず、天然のセストリンから引き出され、続いて環化される。

【0177】

[実施例１]
ＤＯＳ化合物の発見
セストリンのファーストインクラスの阻害剤を開発するために、本発明者らは、細菌性に精製されたタンパク質（セストリン１およびセストリン２）での最小インビトロアッセイをデザインした。セストリンは、ヘテロ三量体アルファ－ベータ－ガンマのキナーゼである、ＡＭＰＫを標的とし、そのＡＭＰＫは、ｓＭＡＣ内のセストリン依存性ＭＡＰＫ活性化を協調する。ＡＴＰ媒介性キナーゼ反応により検出されるＡＭＰＫの活性化後、１５６個の異なる配列を、インビトロＥＬＩＳＡアッセイにより試験し、その結果は図２に示されている。

【0178】

セストリン２（配列番号４）のアミノ酸残基１～１６０間の領域に基づいて五量体配列を合理的にデザインしたが、これは、この領域全体がセストリン－ＡＭＰＫ相互作用に必須であることが示されたからである。追加として、５個のアミノ酸は、阻害機能を有する細胞透過性ペプチドを作製するための限界の長さであると考えられる。このアプローチは、いくつかの有望な阻害性セストリン断片（ＩＳＦ）、セストリン２についての７４個およびセストリン１についての５０個を同定し、それらは、アッセイにおいてＡＭＰＫ活性を４０～１００％、抑止することができた（図２参照）。残りの配列は、ＡＭＰＫを阻害することができず、したがって、これらはさらなる分析から除外された。

【0179】

しかしながら、本発明者らは、Ｔ細胞のＩＳＦとのインキュベーションが、セストリンまたはＡＭＰＫリン酸化の阻害を生じることができず、限られた細胞透過性および／または安定性を示唆したことを発見した。したがって、これらの課題を克服するために、本発明者らは、インビトロスクリーニングにおいて同定されたＩＳＦについて頭部－尾部の環状ペプチド模倣体（Ｌ－バリアントとＤ－バリアントの両方）を作製した。下記で説明される理由のために、本発明者らは、これらの環状ペプチド模倣体をｓＭＡＣの破壊剤（ＤＯＳ）化合物と改名した。

【0180】

[実施例２]
ＤＯＳ化合物のｓＭＡＣを不活化する能力
試験されたＤＯＳ化合物の全部の中で、本発明者らは、ｓＭＡＣ不活化において最も効果的な化合物としてＤＯＳ４６ＬおよびＤＯＳ１４４Ｄを同定した。例えば、ＤＯＳ４６Ｌは、ｓＭＡＣ経路を９０％、サイレンシングした。したがって、例として、本発明者らは、以下の研究の大部分についてＤＯＳ４６Ｌ（配列番号２２）およびＤＯＳ１４４Ｄ（配列番号７７）に焦点を合わせた。

【0181】

次に、本発明者らは、ＤＯＳ化合物、ＤＯＳ４６ＬおよびＤＯＳ１４４Ｄの、ＡＭＰＫ１／セストリン２活性への滴定研究を行った。図３に示されているように、滴定研究は、ＤＯＳ化合物が、インビトロでの組換えタンパク質に関して、セストリン駆動性ＡＭＰＫ活性化をナノモル量で抑制し得る（ＤＯＳ４６Ｌ、ＩＣ５０ ０．０９６ｍＭ；ＤＯＳ１４４Ｄ、０．８４４ｍＭ）ことを示し、その新たに作製されたＤＯＳ化合物の効力を実証した。

【0182】

次に、本発明者らは、ＤＯＳ化合物のＴ細胞を透過する能力を試験した。図４に示されているように、ＤＯＳ化合物（ＤＯＳ４６Ｌ）は、Ｔ細胞、特に老化ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ 集団を透過することができた。同様の結果は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞および主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、およびＢ細胞に関して得られた。ＤＯＳ化合物がＡＰＣへ加えられた時、それらは、若返りに用いられ得るテロメア小胞の放出を自発的に引き起こした。

【0183】

１０μＭ濃度での全ＣＤ４^＋ Ｔ細胞において試験した場合、ＤＯＳ化合物は、図５に示されているように、全ｓＭＡＣシグナル伝達を阻害した。これは、セストリン１、２、および３の発現、ならびにＡＭＰＫおよびＭＡＰＫリン酸化の下方制御により示された。したがって、これは、活性セストリン阻害が、セストリン依存性ｓＭＡＣ活性化の破壊をもたらし、その結果として、ＭＡＰＫシグナル伝達の下方制御を生じることを示している。

【0184】

図５に示されているように、いくつかのＤＯＳ化合物（例えば、ＤＯＳ４６ＬおよびＤＯＳ１４４Ｄ）は、全ての３つのセストリンを阻害する能力を有し、したがって、汎阻害剤として定義することができる。他のもの（例えば、ＤＯＳ１０４ＤおよびＤＯＳ１１７Ｌ）は、１つまたは２つのセストリンのみを機能的に阻害し、したがって、選択的阻害剤として定義することができる。したがって、これは、処置されるべき状態に依存して、ｓＭＡＣを不活化するために汎阻害剤かまたは選択的阻害剤かのいずれかを選択する可能性を示している。例として、ある特定の治療アプローチ、例えば、細菌、ウイルス、または寄生生物感染に対するワクチン接種は、セストリンの汎阻害（例えば、ＤＯＳ４６Ｌによる）から恩恵を受け得、一方、てんかんなどの他の状態は、セストリン３により調節され、ＤＯＳ１１７Ｌなどの選択的セストリン３阻害剤から恩恵を受け得る。

【0185】

次に、セストリン２免疫沈降と連結されたＥＬＩＳＡを用いて、本発明者らは、インビトロでのＤＯＳ化合物（ＤＯＳ４６Ｌ）のセストリン免疫沈降物への直接的な添加がまた、セストリン－ＡＭＰＫ相互作用を破壊し、それがｓＭＡＣ複合体内のグローバルなＭＡＰＫ活性化（ＥＲＫ、ｐ３８、およびＪＮＫ）を抑制することを確認した（図６）。例えば、図６Ａに示されているように、ＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＡＭＰＫのセストリン２との結合が、ＤＯＳ４６Ｌでの１時間または２時間の処置後に減少した。

【0186】

図７を参照して、ＤＯＳ４６Ｌに曝露された老化ＣＤ４＋ Ｔ細胞における滴定研究は、ＤＯＳ化合物が、ナノモル量（１６ｎＭ）から開始して、処置から４時間以内にｓＭＡＣ活性化を抑制することを示した。これは、組換えタンパク質に関して行われた以前の観察と類似し、実在の細胞におけるその新たに作製された阻害剤の効力を確認している。

【0187】

プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２およびＤＯＳ４６ＬでのＣＤ４＋ Ｔ細胞の処置は、セストリン、加えてＡＭＰＫの阻害が、プロテアソーム媒介性分解によることを示唆した。これは、図６Ｂに示されているように、その効果がプロテアソーム阻害剤で前処置された細胞において消滅するからである。本発明者らはまた、ＤＯＳ４６Ｌに曝露されているＴ細胞における増加した量のユビキチン化セストリン２を免疫沈降した（図６Ｃ）。したがって、これらのデータは、ＤＯＳ化合物がｓＭＡＣのファーストインクラスの阻害剤であり、その複合体をセストリンの地点で標的とし、それにより、ユビキチン化を通してｓＭＡＣ分解を誘導することを示している。

【0188】

図８を参照して、ＤＯＳ４６Ｌのビオチン化バリアントでの免疫沈降およびフラグ付きのセストリンへのイムノブロットは、ＤＯＳがセストリン１およびセストリン２と直接的に結合することを示した（図８Ａ）。遊離ビオチンでの対照沈降物中にセストリンは見出されず、インビトロで、直接的なＤＯＳ４６Ｌ－セストリン結合を実証した。対照的に、セストリンは、お互いに結合せず、セストリンが、一緒に複合体を形成して見出されるために、ｓＭＡＣ内にある必要があることを示唆した（図８Ｂ～Ｃ）。実在の細胞において、ビオチン化ＤＯＳ４６Ｌは、ｓＭＡＣ（セストリン１、２、および３、加えてＡＭＰＫおよびＭＡＰＫ）内に見出されたが、ＧＡＴＯＲ複合体のエレメント（ＷＤＲ５９およびｍＴＯＲ；図８Ｄ）と共には見出されなかった。沈着されたセストリン２結晶構造に基づいた分子ドッキング予測についての最先端のＡｌｐｈａＦｏｌｄアルゴリズムを用いて、選択的相互作用もまた研究した。これらの研究により、本化合物が、セストリン２のドメインＡにおいて、ドメインＢおよびＣとの界面で、重要なことには、ＧＡＴＯＲ／ｍＴＯＲＣ１制御部位（ドメインＣ；図２７）から遠く離れて、結合する可能性が高いことが明らかにされた。これらのデータは、ＤＯＳが、ファーストインクラスの選択的ｓＭＡＣ阻害剤であることを示している。

【0189】

ＤＯＳ化合物の特異性を、ｓｈＲＮＡ送達により作製された「セストリンヌル」Ｔ細胞においてさらに試験した。ＤＯＳ化合物は、ｓｈＣｔｒｌ（対照）において老化ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖を回復させたが、セストリンヌルＴ細胞においては回復させなかった（図９）；これは、試験された全ての９つのドナーにおいて確認された。この所見は、ＤＯＳ化合物がＴ細胞機能を、セストリンを介して調節するという事実を裏付けている。

【0190】

[実施例３]
ＤＯＳ化合物の免疫系を若返らせる能力
ＤＯＳで１２日間処置された、健康なドナー由来のＰＢＭＣの免疫表現型検査は、老化ＣＤ４＋ Ｔ細胞の５０％低下、ならびに免疫若返りの特性である、幹様メモリーＴ細胞およびナイーブＴ細胞の同時の増加を示した（図１０Ａ～Ｂ）。若返った能力はまた、ＤＯＳ処置Ｔ細胞における酸化的代謝および脂肪燃焼（ＦＡＯ）の増加によっても示されている（Ｓｅａｈｏｒｓｅ実験）（図１０Ｃ～Ｄ）。

【0191】

老化ＣＤ８＋ Ｔ細胞においても当てはまる。加えて、刺激されたＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるサイトカインの分析により、ＤＯＳ処置によるＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、およびＩＬ－４の産生の増加が明らかにされ、それらは全て、Ｔ細胞－Ｂ細胞協調および抗体産生を促進する十分確立された因子である（図１１）（Bot et al 2000）。

【0192】

実際、高齢のドナー（７０～８５歳）から単離された初代ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）へのＤＯＳの添加は、インビトロでのインフルエンザ特異的ＩｇＧ抗体産生を、ＤＯＳで処置されていない若いドナー細胞（２０～４０歳）において観察されたレベルまで回復させるのに十分であった（図１２Ａ）。この効果はまた、マウス脾細胞培養物においても観察され、最高３倍のインフルエンザ特異的ＩｇＧ抗体産生に達した（図１２Ｂ）。顕著には、本発明者らは、熱失活したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を用いた場合、同様の結果を得た（図２４）。したがって、これらのデータは、ＤＯＳ化合物が有効なワクチンブースターとして用いられ得ることを示している。

【0193】

インビボでのＤＯＳ活性を２つの異なる用量で試験した。Ｔ細胞セストリンの阻害は、ＤＯＳ化合物を注射されたマウスの血液においてロバストであり、４８時間後、明らかであり、７２時間目にピークに達し（最高８０％セストリン阻害）、８週間目まで安定的に持続した（図１３Ａ）。長期セストリン下方制御は、転写サイレンシングによる可能性が高く、ＤＯＳ処置マウス由来の試料が、未処置の同齢の動物と比較して、ＤＯＳ投与の１０日目から始まった、低下したｍＲＮＡセストリン発現を示し（Lanna et al., 2017）、それは若齢マウスに存在する発現レベルと類似していたからである。したがって、ＤＯＳはｓＭＡＣを３段機構で阻害する；１段目では、それらがＡＭＰＫ－セストリン制御結合の破壊を誘導する（例えば、２時間以内）；２段目では、それらが、その解離したタンパク質を、ユビキチン媒介性プロテアソーム分解へ仕向ける（例えば、４時間以内）；最後に、それらは、セストリンｍＲＮＡ発現を転写的にサイレンシングし（例えば、１０日目から始まる）、その結果として、単一用量投与で永久の若返りを生じる。若齢マウスおよび老齢マウスは、類似した傾向を示し、ＤＯＳの、セストリンを異なる年齢において阻害する能力を示した。本化合物が、老齢マウスにおいて非常に低い投薬量（０．１ｍｇ／Ｋｇ）で有効であるという事実は、ｓＭＡＣだけをもち、ｍＴＯＲをもたない老Ｔ細胞に対する特異性の増強を示唆している。さらに、採取された器官におけるイムノブロッティングは、循環血液細胞においてだけでなく、脳、心臓、肝臓、腎臓、および肺においてもセストリン阻害を示した（図１３Ｃ）。これは、ＤＯＳが、それゆえに、セストリン／ｓＭＡＣ活性化により特徴付けられる様々な状態において用いられ得ることを例証している。

【0194】

長く持続する薬力学的効果から着想を得て、本発明者らは、ＤＯＳの単回注射が、老齢マウス（月齢１６ヶ月中央値）においてワクチン応答性を回復させるのに十分であるかどうかを試験することにした。顕著なことには、ワクチンと共のＤＯＳ４６Ｌの単一用量投与（０．１ｍｇ／Ｋｇ）は、ワクチン接種後２週間目、４週間目、および８週間目にインフルエンザ特異的抗体力価を、ＤＯＳの非存在下でワクチン接種された若齢マウス（月齢３ヶ月中央値）に観察されたレベルまで完全に回復させた（図１４Ａ～Ｃ）。インビボでのＩｇＧ刺激効果は、それが、血液中のＤＯＳ誘導性Ｔ細胞セストリン下方制御と強く相関するため、セストリン依存性である可能性が高い（図１４Ｄ）。同様の結果は、別のｓＭＡＣ阻害剤、ＤＯＳ１４４Ｄに関して得られた。これらのデータは、インビボでのファーストインクラスのｓＭＡＣ阻害剤による、加齢中のワクチン応答性の回復を実証している。

【0195】

長く持続する保護を、ＤＯＳと共のワクチン接種から６ヶ月後の６×１０^５ＰＦＵの生きているＨ１Ｎ１ ＰＲ８／５４ウイルス粒子の致死的接種および１４日間のモニタリングにより試験した。図１５は、ワクチン接種された若齢マウス（ｎ＝８）と同一の、感染におけるＤＯＳ処置マウス（ｎ＝８）の１００％生存を示している。対照的に、ＤＯＳの非存在下でワクチン接種された老齢コホートは、ほんの１５％生存を示した（ｎ＝７）。生存データは、ＤＯＳ４６ＬおよびＤＯＳ１４４Ｄについて類似しているが、さらにＤＯＳ４６Ｌは、非常に低い用量（０．１ｍｇ／Ｋｇ）においてより効果的であり、インビトロで示されたそれのより高い効力と一致している。ＤＯＳの有益な効果をまた、挙動、毛、呼吸、眼、および体重を含む臨床スコアによりモニターした。

【0196】

剖検分析により、ＤＯＳ処置マウスの組織（例えば、肺）に浸潤したリンパ球が、高レベルのＩＦＮガンマおよびＩＬ１０、すなわち、肺ウイルス感染からの炎症および免疫防御に関与するサイトカインを示したことが明らかにされた（図１７）。合わせると、これらのデータは、ＤＯＳを、高齢者において免疫を回復させるために次世代のワクチン製剤に加えることができる新しいクラスの化合物であると同定している。

【0197】

しかしながら、インビボでのたったＤＯＳ単独の単回処置だけで、ＤＯＳ処置後すぐ（２日目）と長期プロトコールにおいて（８週間）の両方で、老齢マウスにおける致命的インフルエンザ感染に対して免疫防御をブーストするのに十分である（図１８Ａ）。ＩｇＧ－Ｈ１Ｎ１特異的抗体力価およびそれらの中和効果もまた、ＤＯＳのみのレジメンで老齢マウスにおいて、ＤＯＳ４６Ｌと共のワクチンで処置されたマウスと類似して、回復した（図１６および図１８）。図１９は、未処置の同齢の感染した老齢対照と比較した、ＤＯＳ４６Ｌ処置動物における肺壊死からの保護を示している。結果的に、実際、ＤＯＳ処置動物の肺におけるリアルタイムｑＰＣＲが、ＤＯＳを注射されなかった老齢マウスより、はるかに低い量のＨ１Ｎ１ウイルス力価を示した。長期若返り効果はまた、ＤＯＳ４６Ｌで処置された動物における永久的幹様生成によっても観察され、それは、ＤＯＳの免疫予防効果に関連し得る最長８週間まで調べられた。

【0198】

ＤＯＳレジメンは、完全に免疫を若返らせかつ抗原特異的機能を回復させ、その結果として、ＣＯＶＩＤ（図２４）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）（図２５）について示されているようにウイルスからの非常に幅広い免疫防御、加えて、結核ＢＣＧワクチンについてのような細菌からの防御を生じるという理由により、ワクチン接種に補完的であるだけでなく、ワクチン接種に代わるものでもあり得る。したがって、これは、ＤＯＳ化合物が、一般的には予防的抗ウイルスおよび抗微生物の化合物として、加えてワクチンブースターとして用いられ得ることを示している。

【0199】

癌は、Ｔ細胞上のチェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１およびＴＩＭ－３を調節することにより、免疫系を逃避できることは当業者に周知である（Robert, Nature Communication 2020）。追加して、セストリンが様々な種類の癌および疾患において重要なメディエーターであることは、文献において十分に立証されている。表現型分析によってさらに、ＤＯＳ処置Ｔ細胞が、免疫回避のために癌により利用されかつチェックポイント阻害剤抵抗性治療の原因である免疫チェックポイント阻害剤受容体ＰＤ－１およびＴＩＭ３を下方制御することが示された（図２１）。したがって、ＤＯＳ誘導性チェックポイント阻害剤下方制御は、癌細胞が免疫応答を回避するのを阻止し得る。したがって、チェックポイント阻害剤とＤＯＳの併用治療、加えて、ＤＯＳの単独での処置は有益であり得る。例えば、ＤＯＳ化合物は、単独で作用して、癌細胞、特に、非常に悪い予後の小児科疾患である、神経芽細胞腫、および乳癌の細胞の死を誘導し得る（図２２）。

【0200】

結論
本発明者らは、ＤＯＳ（ｓＭＡＣの破壊剤）と名付けられた、ｓＭＡＣの新規な阻害剤（環状ポリペプチド）を作製し、これらのＤＯＳ化合物が、セストリンをプロテアソーム分解へ仕向けることにより、ナノモル量でｓＭＡＣを阻害できることを実証している。有利には、本発明者らは、新規なＤＯＳ化合物が、ワクチンの存在下と非存在下の両方において、単一用量で、細菌またはウイルス感染に対する長期免疫防御を提供できることを実証した。さらに、本発明者らは、ＤＯＳ化合物が、ＤＯＳ処置で、老化Ｔ細胞を減少させ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、およびＩＬ－４などのサイトカインのレベルを増加させ得ることを示している。したがって、有利には、これは、ＤＯＳ化合物の、高齢者において加齢した免疫系を若返らせる能力、いくつかの細菌またはウイルス感染、加えて、癌および神経変性疾患を含む加齢関連状態を予防し、処置し、または寛解させる能力を示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27-1】

【図27-2】

【図28】

【図29】

【図30-1】

【図30-2】

【図30-3】

【図31-1】

【図31-2】

【図31-3】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【手続補正書】

【提出日】2024-12-23

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

セストリンに由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項2】

前記環状ポリペプチド、誘導体、または類似体がセストリン１に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、任意に、セストリン１が、実質的に配列番号１、２、もしくは３によって表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、請求項１に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項3】

前記環状ポリペプチド、誘導体、または類似体が、セストリン２に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、任意に、セストリン２が、実質的に配列番号４で表されるアミノ酸配列またはそのバリアントもしくは断片を含む、請求項１に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項4】

前記環状ポリペプチド、誘導体、または類似体が、セストリン３に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、任意に、セストリン３が、実質的に配列番号５、６、もしくは７で表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、請求項１に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項5】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２を形成する最初の１６０アミノ酸に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる、請求項３に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項6】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、および／またはセストリン３のドメインＡと、および／またはドメインＡとＣとの界面で結合するように構成される、請求項１～５のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項7】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、２個から１５個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から９個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から８個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは４個から７個のアミノ酸を含むまたはそれからなる、請求項１～６のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項8】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、５個のアミノ酸残基を含むまたはそれからなる、請求項１～７のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項9】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に：
（ｉ）配列番号８～８４、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｉｉ）配列番号５８、５９、６３、６５、８６、８７、９２、９４～９７、１０７、１１３、１１４、１１６～１１９、１２１～１２４、１２６、１３０、１３３、１４８、１５０、１５４、１５５、１５９～１６２、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｉｉｉ）配列番号１７０～１７２、１７４、１７９、１８７、１９０、１９６～１９９、もしくは２０２、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｉｖ）配列番号５８～６０、６２、６４、８８～９１、９３、９８～１１２、１１５、１２０、１２５、１２７～１２９、１３１、１３２、もしくは１３４～１４７、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖ）配列番号４７、５８もしくは７７、６２～６５、７１～７３、１４９、１５１～１５３、１５６～１５８、１６３～１６９、１７３、１７５、１７６、１８０～１８６、１８８、１８９、１９１～１９５、２００、２０１、もしくは２０３～２０５、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉ）配列番号８９～９１、９７、２０６～２１８、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉｉ）配列番号１７６、１８０、２１９～２３４、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉｉｉ）配列番号２３５～２４７、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉｖ）配列番号２４８～２６０、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｖ）配列番号５８、５９、６２～６５、またはその機能性バリアントもしくは断片；または
（ｖｖｉ）配列番号２６１～２６９、またはその機能性バリアントもしくは断片
のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１～８のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項10】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号２２、４７、もしくは７７で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片を含むまたはそれからなる、請求項１～９のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項11】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、配列番号２２で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片を含むまたはそれからなる、請求項１０に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項12】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、配列番号４７で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片を含むまたはそれからなる、請求項１０に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項13】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、配列番号７７で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片を含むまたはそれからなる、請求項１０に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項14】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、Ｌ－アミノ酸単独からなり、またはＤ－アミノ酸単独からなり、またはＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の両方からなる、請求項１～１３のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項15】

配列番号８～８４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項16】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、およびセストリン３、好ましくはそのドメインＡに結合するおよび／またはそれを阻害する、請求項１～１５のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項17】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、
（ｉ）セストリン２に選択的に結合するおよび／もしくはそれを阻害する；
（ｉｉ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含む；
（ｉｉｉ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン３とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含む；
（ｉｖ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含まない；
（ｖ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン３とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含まない；
（ｖｉ）異なる位置におけるセストリン１相同性（化学的類似性）領域を含む；
（ｖｉｉ）異なる位置におけるセストリン３相同性（化学的類似性）領域を含む；
（ｖｉｉｉ）セストリン２とのセストリン１の配列重複および／もしくは化学的類似性を含む；
（ｖｉｖ）セストリン２とのセストリン３の配列重複および／もしくは化学的類似性を含む；
（ｖｖ）全ての３つのセストリンの間で完全に重複する配列からなるもしくはそれを含む；ならびに／または
（ｖｖｉ）セストリン１とセストリン３の間で完全に重複する配列からなるもしくはそれを含む、
請求項１～１６のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項18】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、式（Ｉ）

【化1】

を含むまたはそれからなる、請求項１～１７のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項19】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、以下の結合またはコンジュゲーションを含む、
（ｉ）末端のＮＨ_２基とＣＯＯＨ基（すなわち、ペプチド結合）；
（ｉｉ）ＮＨ_２基とＮＨ_２基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｉｉｉ）ＮＨ_２基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、一級アミド結合）；
（ｉｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＮＨ_２基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｖ）ＮＨ_２基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシルアミン結合）；
（ｖｉ）ＮＨ_２基とＳＨ基（すなわち、チオール－ヒドロキシルアミン結合）；
（ｖｉｉ）ＮＨ_２基とＳＲ基（すなわち、ヒドロスルフィド結合）；
（ｖｉｉｉ）ＣＯＯＨ基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、アミド結合）；
（ｉｘ）ＣＯＯＨ基とＣＯＯＨ基（すなわち、ジカルボン酸結合）；
（ｘ）ＣＯＯＨ基とＮ＝ＮＨ基（すなわち、カルボキシル－アミドゲン結合）；
（ｘｉ）ＣＯＯＨ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシカルボキシル結合）；
（ｘｉｉ）ＣＯＯＨ基とＳＨ基（すなわち、チオール結合）；
（ｘｉｉｉ）ＣＯＯＨ基とＳＲ基（すなわち、チオール結合）；
（ｘｉｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、アミドゲン結合）；
（ｘｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＯＨ基（すなわち、Ｎ－ヒドロキシルアミン結合）；
（ｘｖｉ）ＣＯＮＨ_２基とＣＯＮＨ_２基（すなわち、ジアミド結合）；
（ｘｖｉｉ）ＣＯＮＨ_２基とＳＲ基（すなわち、ｓ－アミド結合）；
（ｘｖｉｉｉ）ＳＲ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシ－チオール結合）；
（ｘｉｘ）ＳＲ基とＮＨ基（すなわち、チオールアミン結合）；
（ｘｘ）ＮＨ_２基とＮＨ基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｘｘｉ）ＣＯＯＨ基とＮＨ基（すなわち、アミノ－プロパン酸結合）；
（ｘｘｉｉ）ＳＨ基とＯＨ基（すなわち、親水性結合）；
（ｘｘｉｉｉ）ＳＨ基とＮＨ基（すなわち、アミノ－チオール結合）；
（ｘｘｉｖ）ＯＨ基とＮＨ基（すなわち、ヒドロキシルアミン結合）；
（ｘｘｖ）ＯＨ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシ結合）；
（ｘｘｖｉ）ＣＯＮＨ_２基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシアミド結合）；
（ｘｘｖｉｉ）ＳＨ基とＳＨ基（すなわち、ジチオール結合）；
（ｘｘｖｉｉｉ）ＣＯＮＨ_２基とＮＨ基（すなわち、ヒドロキシアミド結合）；または
（ｘｘｉｘ）ＮＨ基とＮＨ基（すなわち、ジアンモニウム結合）
請求項１８に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項20】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、以下の配列番号８５として本明細書に提供されるコンセンサスまたは再現性配列を含むまたはそれからなる：
ｘ_１ｘ_２ｘ_３ｘ_４ｘ_５ ［配列番号８５］
（式中、ｘ_１は、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｅ、Ｎ、Ｙ、Ｓ、Ｑ、もしくはＴであり、好ましくは、ｘ_１は、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、もしくはＤであり；
ｘ_２は、Ｙ、Ａ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｅ、Ｉ、Ｄ、Ｓ、Ｑ、ＮもしくはＴであり、好ましくはｘ_２が、Ｙ、Ａ、ＬもしくはＲであり；
ｘ_３は、Ｌ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｃ、Ｖ、ＰもしくはＮであり、好ましくはｘ_３が、Ｌ、Ａ、ＳもしくはＲであり；
ｘ_４は、Ｌ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｋ、Ｄ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｃ、Ｔ、Ｐ、Ｎ、ＲもしくはＹであり、好ましくはｘ_４が、Ｌ、ＡもしくはＥであり；
および／または
ｘ_５は、Ｌ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｋ、Ｉ、Ｐ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、もしくはＭであり、好ましくは、ｘ_５は、Ｌ、Ｒ、Ａ、もしくはＥである）
請求項１～１９のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項21】

前記ポリペプチド、その誘導体または類似体の環化が、セストリン２（配列番号４）のアミノ酸残基４、９、１０、１５、１６、１９、２０、２１、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４６、５０、５６、６１、６３、６５、６６、６７、７１、７３、８４、９１、９４、９６、９９、１０３、１０８、１０９、１１０、１３１、１３４、１４７、１８５、２０４、２１７、２２０、２２６、２２８、２３０、２３３、２３４、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４４、２４９、２５１、２５２、２５５、２５６、２７２、２７３、２７４、２７７、２８４、２９２、２９８、２９９、３０１、３０３、３０４、３０６、３０９、３１０、３１１、３１３、３１４、３１９、３３１、３３３、３３４、３４３、３５９、３６９、４３１、４４２、もしくは４６７、および／またはセストリン１（配列番号１）のアミノ酸残基１～６８、７２、７７、７８、７９、８４、８５、８８、８９、９０、９３、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０４、１０９、１１３、１１９、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３５、１３７、１４８、１５５、１５８、１６０、１６３、１６７、１７２、１７３、１７４、１９５、１９８、２１１、２４９、２６８、２８１、２８４、２９０、２９２、２９４、２９７、２９８、３００～３１２、３１５、３１９、３２０、３２１、３２３、３２５、３２６、３２９、３３０、３４６、３４７、３５０、３５７、３６５、３７１、３７２、３７４、３７６、３７８、３８１、３８２、３８３、３８５、３８６、３９１、４０３、４０５、４１４、４３０、４４０、５０２、５１３、もしくは５３８で起こる、請求項１～２０のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項22】

前記ポリペプチド、その誘導体または類似体の環化が、セストリン２（配列番号４）のアミノ酸残基１、２、４、５、１０、１１、１４～２９、３４、３５、３６、３９、４０、４１、５０、５６、５９、６１、６３、６６、６９、７０、７１、８１、８７、９１、９４、９６、９９、１０３、１０８、１０９、１１０、１３１、１３４、１４２、１４３、１４７、１５１、１８０、１９２、２０４、２１７、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４６、２４９、２５１、２５５、２５６、２７２、２７３、２７７、２８９、２９９、３０１、３０２、３０３、３０６、３０７、３１０、３１３、３１４、３２０、３３１、３３３、３３４、３５７、３５９、３６９、３８０、３４２、もしくは３６７、および／またはセストリン３（配列番号５）のアミノ酸残基１～１４、１６、１７、２２、２３、３０、３１、３２、３５、３６、３７、４６、５２、５５、５７、５９、６２、６５、６６、６７、７７、８３、８７、９０、９２、９５、９９、１０４、１０５、１０６、１２７、１３０、１３８、１３８、１４３、１４７、１７６、１８８、２００、２１３、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２７、２２９、２３０、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５３、２５５、２５９、２６０、２７６、２８０、２９２、３０２、３０４、３０５、３０８、３０９、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２５、３２６、３３２、３４３、３４５、３４６、３６９、３７１、３８１、３９２、４５４、もしくは４７９で起こる、請求項１～２１のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項23】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫細胞におけるセストリン、好ましくは、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および／またはＴ細胞（Ｔリンパ球）におけるセストリンを標的とする、請求項１～２２のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項24】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるセストリン、好ましくはＣＤ４＋ ＣＤ２７＋ ＣＤ２８＋ 細胞および／またはＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８＋ 細胞におけるセストリン、より好ましくはＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ Ｔ細胞（老化Ｔ細胞）におけるセストリンを標的とする、請求項２３に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項25】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、サイトカイン産生を誘導しまたは回復させ、好ましくは、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、および／またはＩＬ－４の産生を誘導しまたは回復させる、請求項１～２４のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項26】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫老化を防止しまたは反転させる、請求項１～２５のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項27】

前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫系を若返らせるように構成される、請求項１～２６のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項28】

免疫系を若返らせることが、（ｉ）抗原刺激に対する免疫細胞応答性を回復させること；（ｉｉ）免疫細胞におけるテロメア長および／もしくはテロメラーゼ活性を回復させること；（ｉｉｉ）免疫細胞における抗原特異的増殖および／もしくはサイトカイン産生を回復させること；ならびに／または（ｉｖ）Ｂ細胞および／もしくはＣＤ８^＋ Ｔ細胞および／もしくはナチュラルキラー細胞増殖による抗原特異的抗体産生を回復させることを含む、請求項２７に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項29】

治療における使用のための、請求項１～２８のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項30】

治療における使用のための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体をコードする核酸。

【請求項31】

微生物感染、加齢関連状態、またはＴ細胞媒介性疾患を処置し、予防し、または寛解させる際における使用のための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸。

【請求項32】

前記微生物感染が、細菌性、ウイルス性、真菌性、または原生生物である、請求項３１に記載の使用のための環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項33】

前記加齢関連状態が、免疫系の加齢および／または減退に伴う、それにより引き起こされる、または関連する状態であり、任意に、前記加齢関連状態が、セストリン依存性ｓＭＡＣ活性化および／または免疫老化により特徴付けられる、請求項３１に記載の使用のための環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項34】

前記加齢関連状態が、癌（例えば、小児神経芽細胞腫、メラノーマ、肝臓、膵臓、精巣、もしくは膵臓の癌）、喫煙誘発性肺気腫、てんかん、うつ病、代謝疾患（肥満を含む）、骨粗鬆症、勃起不全、不妊、または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病もしくは認知症からなる群から選択される、請求項３１に記載の使用のための環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

【請求項35】

請求項１～２８のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸、およびワクチンを含む組成物。

【請求項36】

免疫応答を刺激する際における、好ましくはワクチンブースターとしての使用のための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸。

【請求項37】

請求項１～２８のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸の治療有効量、および任意に薬学的に許容される媒体を含む、医薬組成物。

【請求項38】

請求項１～２８のいずれか一項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸の治療有効量を、薬学的に許容される媒体と組み合わせるステップを含む、請求項３７に記載の医薬組成物を作製するための方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２００

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0200】

結論
本発明者らは、ＤＯＳ（ｓＭＡＣの破壊剤）と名付けられた、ｓＭＡＣの新規な阻害剤（環状ポリペプチド）を作製し、これらのＤＯＳ化合物が、セストリンをプロテアソーム分解へ仕向けることにより、ナノモル量でｓＭＡＣを阻害できることを実証している。有利には、本発明者らは、新規なＤＯＳ化合物が、ワクチンの存在下と非存在下の両方において、単一用量で、細菌またはウイルス感染に対する長期免疫防御を提供できることを実証した。さらに、本発明者らは、ＤＯＳ化合物が、ＤＯＳ処置で、老化Ｔ細胞を減少させ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、およびＩＬ－４などのサイトカインのレベルを増加させ得ることを示している。したがって、有利には、これは、ＤＯＳ化合物の、高齢者において加齢した免疫系を若返らせる能力、いくつかの細菌またはウイルス感染、加えて、癌および神経変性疾患を含む加齢関連状態を予防し、処置し、または寛解させる能力を示している。

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ セストリンに由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［２］ 前記環状ポリペプチド、誘導体、または類似体がセストリン１に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、任意に、セストリン１が、実質的に配列番号１、２、もしくは３によって表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、［１］に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［３］ 前記環状ポリペプチド、誘導体、または類似体が、セストリン２に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、任意に、セストリン２が、実質的に配列番号４で表されるアミノ酸配列またはそのバリアントもしくは断片を含む、［１］に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［４］ 前記環状ポリペプチド、誘導体、または類似体が、セストリン３に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含みまたはそれからなり、任意に、セストリン３が、実質的に配列番号５、６、もしくは７で表されるアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、［１］に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［５］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン２を形成する最初の１６０アミノ酸に由来するアミノ酸配列またはその短縮体を含むまたはそれからなる、［３］に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［６］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、および／またはセストリン３のドメインＡと、および／またはドメインＡとＣとの界面で結合するように構成される、［１］～［５］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［７］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、２個から１５個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から９個のアミノ酸残基、より好ましくは３個から８個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは４個から７個のアミノ酸を含むまたはそれからなる、［１］～［６］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［８］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、５個のアミノ酸残基を含むまたはそれからなる、［１］～［７］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［９］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に：
（ｉ）配列番号８～８４、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｉｉ）配列番号５８、５９、６３、６５、８６、８７、９２、９４～９７、１０７、１１３、１１４、１１６～１１９、１２１～１２４、１２６、１３０、１３３、１４８、１５０、１５４、１５５、１５９～１６２、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｉｉｉ）配列番号１７０～１７２、１７４、１７９、１８７、１９０、１９６～１９９、もしくは２０２、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｉｖ）配列番号５８～６０、６２、６４、８８～９１、９３、９８～１１２、１１５、１２０、１２５、１２７～１２９、１３１、１３２、もしくは１３４～１４７、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖ）配列番号４７、５８もしくは７７、６２～６５、７１～７３、１４９、１５１～１５３、１５６～１５８、１６３～１６９、１７３、１７５、１７６、１８０～１８６、１８８、１８９、１９１～１９５、２００、２０１、もしくは２０３～２０５、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉ）配列番号８９～９１、９７、２０６～２１８、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉｉ）配列番号１７６、１８０、２１９～２３４、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉｉｉ）配列番号２３５～２４７、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｉｖ）配列番号２４８～２６０、またはその機能性バリアントもしくは断片；
（ｖｖ）配列番号５８、５９、６２～６５、またはその機能性バリアントもしくは断片；または
（ｖｖｉ）配列番号２６１～２６９、またはその機能性バリアントもしくは断片
のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、［１］～［８］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１０］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号２２、４７、もしくは７７で表されるアミノ酸配列、またはその機能性バリアントもしくは断片を含むまたはそれからなる、［１］～［９］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１１］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、Ｌ－アミノ酸単独からなり、またはＤ－アミノ酸単独からなり、またはＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の両方からなる、［１］～［１０］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１２］ 配列番号８～８４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１３］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、セストリン１、セストリン２、およびセストリン３、好ましくはそのドメインＡに結合するおよび／またはそれを阻害する、［１］～［１２］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１４］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、
（ｉ）セストリン２に選択的に結合するおよび／もしくはそれを阻害する；
（ｉｉ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含む；
（ｉｉｉ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン３とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含む；
（ｉｖ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン１とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含まない；
（ｖ）同じ位置におけるｂｌａｓｔ検索上でセストリン３とセストリン２の間に保存されたアミノ酸残基を含まない；
（ｖｉ）異なる位置におけるセストリン１相同性（化学的類似性）領域を含む；
（ｖｉｉ）異なる位置におけるセストリン３相同性（化学的類似性）領域を含む；
（ｖｉｉｉ）セストリン２とのセストリン１の配列重複および／もしくは化学的類似性を含む；
（ｖｉｖ）セストリン２とのセストリン３の配列重複および／もしくは化学的類似性を含む；
（ｖｖ）全ての３つのセストリンの間で完全に重複する配列からなるもしくはそれを含む；ならびに／または
（ｖｖｉ）セストリン１とセストリン３の間で完全に重複する配列からなるもしくはそれを含む、
［１］～［１３］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１５］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、式（Ｉ）

【化9】

を含むまたはそれからなる、［１］～［１４］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１６］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、以下の結合またはコンジュゲーションを含む、
（ｉ）末端のＮＨ _２ 基とＣＯＯＨ基（すなわち、ペプチド結合）；
（ｉｉ）ＮＨ _２ 基とＮＨ _２ 基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｉｉｉ）ＮＨ _２ 基とＣＯＮＨ _２ 基（すなわち、一級アミド結合）；
（ｉｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＮＨ _２ 基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｖ）ＮＨ _２ 基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシルアミン結合）；
（ｖｉ）ＮＨ _２ 基とＳＨ基（すなわち、チオール－ヒドロキシルアミン結合）；
（ｖｉｉ）ＮＨ _２ 基とＳＲ基（すなわち、ヒドロスルフィド結合）；
（ｖｉｉｉ）ＣＯＯＨ基とＣＯＮＨ _２ 基（すなわち、アミド結合）；
（ｉｘ）ＣＯＯＨ基とＣＯＯＨ基（すなわち、ジカルボン酸結合）；
（ｘ）ＣＯＯＨ基とＮ＝ＮＨ基（すなわち、カルボキシル－アミドゲン結合）；
（ｘｉ）ＣＯＯＨ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシカルボキシル結合）；
（ｘｉｉ）ＣＯＯＨ基とＳＨ基（すなわち、チオール結合）；
（ｘｉｉｉ）ＣＯＯＨ基とＳＲ基（すなわち、チオール結合）；
（ｘｉｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＣＯＮＨ _２ 基（すなわち、アミドゲン結合）；
（ｘｖ）Ｎ＝ＮＨ基とＯＨ基（すなわち、Ｎ－ヒドロキシルアミン結合）；
（ｘｖｉ）ＣＯＮＨ _２ 基とＣＯＮＨ _２ 基（すなわち、ジアミド結合）；
（ｘｖｉｉ）ＣＯＮＨ _２ 基とＳＲ基（すなわち、ｓ－アミド結合）；
（ｘｖｉｉｉ）ＳＲ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシ－チオール結合）；
（ｘｉｘ）ＳＲ基とＮＨ基（すなわち、チオールアミン結合）；
（ｘｘ）ＮＨ _２ 基とＮＨ基（すなわち、ヒドラジン結合）；
（ｘｘｉ）ＣＯＯＨ基とＮＨ基（すなわち、アミノ－プロパン酸結合）；
（ｘｘｉｉ）ＳＨ基とＯＨ基（すなわち、親水性結合）；
（ｘｘｉｉｉ）ＳＨ基とＮＨ基（すなわち、アミノ－チオール結合）；
（ｘｘｉｖ）ＯＨ基とＮＨ基（すなわち、ヒドロキシルアミン結合）；
（ｘｘｖ）ＯＨ基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシ結合）；
（ｘｘｖｉ）ＣＯＮＨ _２ 基とＯＨ基（すなわち、ヒドロキシアミド結合）；
（ｘｘｖｉｉ）ＳＨ基とＳＨ基（すなわち、ジチオール結合）；
（ｘｘｖｉｉｉ）ＣＯＮＨ _２ 基とＮＨ基（すなわち、ヒドロキシアミド結合）；または
（ｘｘｉｘ）ＮＨ基とＮＨ基（すなわち、ジアンモニウム結合）
［１５］に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１７］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、以下の配列番号８５として本明細書に提供されるコンセンサスまたは再現性配列を含むまたはそれからなる：
ｘ _１ ｘ _２ ｘ _３ ｘ _４ ｘ _５ ［配列番号８５］
（式中、ｘ _１ は、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｅ、Ｎ、Ｙ、Ｓ、Ｑ、もしくはＴであり、好ましくは、ｘ _１ は、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、もしくはＤであり；
ｘ _２ は、Ｙ、Ａ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｅ、Ｉ、Ｄ、Ｓ、Ｑ、ＮもしくはＴであり、好ましくはｘ _２ が、Ｙ、Ａ、ＬもしくはＲであり；
ｘ _３ は、Ｌ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｃ、Ｖ、ＰもしくはＮであり、好ましくはｘ _３ が、Ｌ、Ａ、ＳもしくはＲであり；
ｘ _４ は、Ｌ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｋ、Ｄ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｃ、Ｔ、Ｐ、Ｎ、ＲもしくはＹであり、好ましくはｘ _４ が、Ｌ、ＡもしくはＥであり；
および／または
ｘ _５ は、Ｌ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｋ、Ｉ、Ｐ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、もしくはＭであり、好ましくは、ｘ _５ は、Ｌ、Ｒ、Ａ、もしくはＥである）
［１］～［１６］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１８］ 前記ポリペプチド、その誘導体または類似体の環化が、セストリン２（配列番号４）のアミノ酸残基４、９、１０、１５、１６、１９、２０、２１、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４６、５０、５６、６１、６３、６５、６６、６７、７１、７３、８４、９１、９４、９６、９９、１０３、１０８、１０９、１１０、１３１、１３４、１４７、１８５、２０４、２１７、２２０、２２６、２２８、２３０、２３３、２３４、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４４、２４９、２５１、２５２、２５５、２５６、２７２、２７３、２７４、２７７、２８４、２９２、２９８、２９９、３０１、３０３、３０４、３０６、３０９、３１０、３１１、３１３、３１４、３１９、３３１、３３３、３３４、３４３、３５９、３６９、４３１、４４２、もしくは４６７、および／またはセストリン１（配列番号１）のアミノ酸残基１～６８、７２、７７、７８、７９、８４、８５、８８、８９、９０、９３、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０４、１０９、１１３、１１９、１２４、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３５、１３７、１４８、１５５、１５８、１６０、１６３、１６７、１７２、１７３、１７４、１９５、１９８、２１１、２４９、２６８、２８１、２８４、２９０、２９２、２９４、２９７、２９８、３００～３１２、３１５、３１９、３２０、３２１、３２３、３２５、３２６、３２９、３３０、３４６、３４７、３５０、３５７、３６５、３７１、３７２、３７４、３７６、３７８、３８１、３８２、３８３、３８５、３８６、３９１、４０３、４０５、４１４、４３０、４４０、５０２、５１３、もしくは５３８で起こる、［１］～［１７］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［１９］ 前記ポリペプチド、その誘導体または類似体の環化が、セストリン２（配列番号４）のアミノ酸残基１、２、４、５、１０、１１、１４～２９、３４、３５、３６、３９、４０、４１、５０、５６、５９、６１、６３、６６、６９、７０、７１、８１、８７、９１、９４、９６、９９、１０３、１０８、１０９、１１０、１３１、１３４、１４２、１４３、１４７、１５１、１８０、１９２、２０４、２１７、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４６、２４９、２５１、２５５、２５６、２７２、２７３、２７７、２８９、２９９、３０１、３０２、３０３、３０６、３０７、３１０、３１３、３１４、３２０、３３１、３３３、３３４、３５７、３５９、３６９、３８０、３４２、もしくは３６７、および／またはセストリン３（配列番号５）のアミノ酸残基１～１４、１６、１７、２２、２３、３０、３１、３２、３５、３６、３７、４６、５２、５５、５７、５９、６２、６５、６６、６７、７７、８３、８７、９０、９２、９５、９９、１０４、１０５、１０６、１２７、１３０、１３８、１３８、１４３、１４７、１７６、１８８、２００、２１３、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２７、２２９、２３０、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５３、２５５、２５９、２６０、２７６、２８０、２９２、３０２、３０４、３０５、３０８、３０９、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２５、３２６、３３２、３４３、３４５、３４６、３６９、３７１、３８１、３９２、４５４、もしくは４７９で起こる、［１］～［１８］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［２０］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫細胞におけるセストリン、好ましくは、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および／またはＴ細胞（Ｔリンパ球）におけるセストリンを標的とする、［１］～［１９］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［２１］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるセストリン、好ましくはＣＤ４＋ ＣＤ２７＋ ＣＤ２８＋ 細胞および／またはＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８＋ 細胞におけるセストリン、より好ましくはＣＤ４＋ ＣＤ２７－ ＣＤ２８－ Ｔ細胞（老化Ｔ細胞）におけるセストリンを標的とする、［２０］に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［２２］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、サイトカイン産生を誘導しまたは回復させ、好ましくは、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、および／またはＩＬ－４の産生を誘導しまたは回復させる、［１］～［２１］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［２３］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫老化を防止しまたは反転させる、［１］～［２２］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［２４］ 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、免疫系を若返らせるように構成される、［１］～［２３］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［２５］ 免疫系を若返らせることが、（ｉ）抗原刺激に対する免疫細胞応答性を回復させること；（ｉｉ）免疫細胞におけるテロメア長および／もしくはテロメラーゼ活性を回復させること；（ｉｉｉ）免疫細胞における抗原特異的増殖および／もしくはサイトカイン産生を回復させること；ならびに／または（ｉｖ）Ｂ細胞および／もしくはＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞および／もしくはナチュラルキラー細胞増殖による抗原特異的抗体産生を回復させることを含む、［２４］に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［２６］ 治療における使用のための、［１］～［２５］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［２７］ 治療における使用のための、［１］～［２５］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体をコードする核酸。
［２８］ 微生物感染、加齢関連状態、またはＴ細胞媒介性疾患を処置し、予防し、または寛解させる際における使用のための、［１］～［２５］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸。
［２９］ 前記微生物感染が、細菌性、ウイルス性、真菌性、または原生生物である、［２８］に記載の使用のための環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［３０］ 前記加齢関連状態が、免疫系の加齢および／または減退に伴う、それにより引き起こされる、または関連する状態であり、任意に、前記加齢関連状態が、セストリン依存性ｓＭＡＣ活性化および／または免疫老化により特徴付けられる、［２８］に記載の使用のための環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［３１］ 前記加齢関連状態が、癌（例えば、小児神経芽細胞腫、メラノーマ、肝臓、膵臓、精巣、もしくは膵臓の癌）、喫煙誘発性肺気腫、てんかん、うつ病、代謝疾患（肥満を含む）、骨粗鬆症、勃起不全、不妊、または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病もしくは認知症からなる群から選択される、［２８］に記載の使用のための環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
［３２］ ［１］～［２５］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸、およびワクチンを含む組成物。
［３３］ 免疫応答を刺激する際における、好ましくはワクチンブースターとしての使用のための、［１］～［２５］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸。
［３４］ ［１］～［２５］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸の治療有効量、および任意に薬学的に許容される媒体を含む、医薬組成物。
［３５］ ［１］～［２５］のいずれかに記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸の治療有効量を、薬学的に許容される媒体と組み合わせるステップを含む、［３４］に記載の医薬組成物を作製するための方法。

【国際調査報告】