特表 2025-503698 分泌タンパク質細胞ライブラリーにおける可溶性タンパク質機能の分析、スクリーニングおよび選択

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-04

(54)【発明の名称】分泌タンパク質細胞ライブラリーにおける可溶性タンパク質機能の分析、スクリーニングおよび選択

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20250128BHJP

   C12Q 1/6897 20180101ALI20250128BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20250128BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20250128BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20250128BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20250128BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20250128BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20250128BHJP

   C12N 15/65 20060101ALN20250128BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20250128BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C12Q1/6897 Z ZNA

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6869 Z

G01N33/53 M

G01N33/53 D

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

G01N33/536 D

G01N33/536 C

C12N15/12

C12N15/65 Z

C12N15/13

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024541964

(86)(22)【出願日】2022-11-11

(85)【翻訳文提出日】2024-09-11

(86)【国際出願番号】 US2022079745

(87)【国際公開番号】W WO2023136945

(87)【国際公開日】2023-07-20

(31)【優先権主張番号】63/299,315

(32)【優先日】2022-01-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/398,085

(32)【優先日】2022-08-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】506365393

【氏名又は名称】マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー

(71)【出願人】

【識別番号】592017633

【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション

(71)【出願人】

【識別番号】516385790

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ カンザス

(74)【代理人】

【識別番号】100134832

【弁理士】

【氏名又は名称】瀧野 文雄

(74)【代理人】

【識別番号】100165308

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 俊明

(74)【代理人】

【識別番号】100115048

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 康弘

(72)【発明者】

【氏名】デコスキー ブランドン

(72)【発明者】

【氏名】グティエレス マティアス エフ．

(72)【発明者】

【氏名】チュン チェンユ

(72)【発明者】

【氏名】ファハド アーメッド

(72)【発明者】

【氏名】ボイル ニコレーン

(72)【発明者】

【氏名】ジン シュヤン

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045AA40

2G045CB01

2G045DA13

2G045DA14

2G045DA36

2G045FB02

2G045FB03

2G045FB07

2G045FB12

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ07

4B063QQ08

4B063QQ09

4B063QQ10

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ79

4B063QR08

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS32

4B063QX02

4B063QX10

(57)【要約】

本明細書には、単一細胞形式での可溶性ポリペプチドの機能試験に関連する方法、組成物、システムおよびキットが開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することを含み、
前記細胞が細胞表面タンパク質を提示し、
前記細胞が、
（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、
（ｉｉ）前記試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化する場合にレポーター分子を発現するように操作される、
スクリーニング方法。

【請求項2】

（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することを含み、
前記細胞が細胞表面タンパク質を提示し、
前記細胞が、
（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、
（ｉｉ）前記試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しない場合にレポーター分子を発現するように操作される、
スクリーニング方法。

【請求項3】

（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞を試験試薬と接触させる工程であって、
前記細胞が細胞表面タンパク質を提示し、
前記細胞が、
（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、
（ｉｉ）前記試験ポリペプチドまたは前記試験試薬のうちの１つが前記細胞表面タンパク質を活性化する場合にレポーター分子を発現するように操作されている工程、
（ｂ）前記レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出する工程を含む、
スクリーニング方法。

【請求項4】

（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞をレポーター分子を含む試験試薬と接触させる工程であって、
前記細胞が細胞表面タンパク質を提示し、
前記試験試薬が、前記細胞によって提示される前記細胞表面タンパク質に結合し、試薬－タンパク質複合体を形成することができ、試薬－受容体複合体が形成されると、前記試験試薬が前記細胞への侵入を獲得し、
前記細胞が、
（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌するように操作されている工程、
（ｂ）前記細胞における前記レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出する工程を含む、
スクリーニング方法。

【請求項5】

前記細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、植物細胞または細菌細胞を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記細胞表面タンパク質が内因性受容体を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記細胞が、前記細胞表面タンパク質を発現するように操作される、請求項１～４に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞表面タンパク質が異種受容体を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記試験ポリペプチドの分泌が構成的である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記試験ポリペプチドの分泌が誘導性である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

単離され、遺伝子操作された単一の前記細胞が、マルチウェルプレートのウェル内にある、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

単離され、遺伝子操作された単一の前記細胞が、マイクロチップのチャンバ内にある、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

単離され、遺伝子操作された単一の前記細胞が、エマルジョン液滴などのマイクロ流体液滴中にある、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

単離され、遺伝子操作された単一の前記細胞が、Ｎａｎｏｐｅｎ（商標）内にある、請求項１～４に記載の方法。

【請求項15】

前記レポーター分子が、蛍光マーカー、酵素、タグ付きタンパク質、または核酸配列を含む、請求項１～４に記載の方法。

【請求項16】

前記細胞がヒト細胞を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

前記レポーター分子が、核酸配列、場合によりバーコード配列を含み、前記レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することが、増幅反応および配列決定反応、場合により単一細胞配列決定反応の１つまたは複数を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記レポーター分子が蛍光部分を含み、前記レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することが蛍光活性化細胞を選別することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

異種試験ポリペプチドをコードするＤＮＡを配列決定することをさらに含む、請求項１～４に記載の方法。

【請求項20】

異種試験ペプチドが受容体リガンドのバリアントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記バリアントがリガンドバリアントのライブラリーに由来する、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質リガンドのバリアントを含み、前記試験試薬が野生型リガンドによる受容体活性化のアゴニストまたはアンタゴニストを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項23】

前記試験試薬が細胞表面タンパク質リガンドを含み、前記試験ポリペプチドが、リガンドによる受容体活性化の潜在的アゴニストまたはアンタゴニストのライブラリーに由来する、請求項３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記試験ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

前記抗体または抗原結合断片が、抗体または抗原結合断片のライブラリーに由来する、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記試験試薬が、ウイルス、ウイルス様粒子、偽ウイルスおよび組換えウイルス粒子のうちの１つまたは複数を含み、前記細胞表面タンパク質が、細胞へのウイルス侵入の構成要素を含む、請求項４のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

前記ウイルスが、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣまたはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、インフルエンザＡ、ＢまたはＣから選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ウイルスが、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エスプタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、および黄熱ウイルスから選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含み、前記細胞表面タンパク質がヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項30】

前記細胞が、膜貫通セリンプロテアーゼ２（ＴＭＰＲＳＳ２）を発現するように操作される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

請求項１～４のいずれかに記載の前記遺伝子操作された細胞を含む組成物、キットまたはシステム。

【請求項32】

（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクター、
（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、前記異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化されるベクターを含むキットであって、
前記ベクターの１つ以上が発現ベクターであってもよく、または前記ベクターの１つ以上がインテグレーションベクターであってもよい、
キット。

【請求項33】

（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクター、
（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、前記異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しないと活性化されるベクターを含むキットであって、
前記ベクターの１つ以上が発現ベクターであってもよく、または前記ベクターの１つ以上がインテグレーションベクターであってもよい、
キット。

【請求項34】

（１）試験試薬、および（２）
（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクター、
（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、前記異種試験ポリペプチドまたは試験試薬のいずれかが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化されるベクターを含むキットであって、
前記ベクターの１つ以上が発現ベクターであってもよく、または前記ベクターの１つ以上がインテグレーションベクターであってもよい、
キット。

【請求項35】

（１）レポーター分子を含む試験試薬、および（２）
（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクターを含むキットであって、
前記ベクターの１つ以上が発現ベクターであってもよく、または前記ベクターの１つ以上がインテグレーションベクターであってもよい、
キット。

【請求項36】

前記１つ以上の核酸が、（ｃ）細胞表面タンパク質をさらにコードする、請求項３２～３４のいずれかに記載のキット。

【請求項37】

前記異種試験ポリペプチドがプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３２～３４のいずれかに記載のキット。

【請求項38】

前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項３７に記載のキット。

【請求項39】

前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項３７に記載のキット。

【請求項40】

前記レポーター分子が、蛍光マーカー、酵素、タグ付きタンパク質、または核酸配列を含む、請求項３２～３４のいずれかに記載のキット。

【請求項41】

前記試験試薬が、ウイルス、ウイルス様粒子、偽ウイルス、および組換えウイルス粒子の１つまたは複数を含む、請求項３５に記載のキット。

【請求項42】

前記ウイルスが、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣまたはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、およびインフルエンザＡ、ＢまたはＣから選択される、請求項４１に記載のキット。

【請求項43】

前記ウイルスが、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エスプタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、および黄熱ウイルスから選択される、請求項４１に記載のキット。

【請求項44】

前記偽ウイルスが、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣもしくはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、またはインフルエンザＡ、ＢもしくはＣに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、請求項４１に記載のキット。

【請求項45】

前記偽ウイルスが、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エスプタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、または黄熱ウイルスに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、請求項４１に記載のキット。

【請求項46】

前記異種試験ペプチドが、抗体またはその一部を含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項47】

前記異種試験ペプチドが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）またはナノボディである、請求項４６に記載のキット。

【請求項48】

（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、
（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、前記異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化される核酸を含む
遺伝子操作された細胞を含む、
キット。

【請求項49】

（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、
（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、前記異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しないと活性化される核酸を含む
遺伝子操作された細胞を含む、
キット。

【請求項50】

（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、
（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、前記異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化される核酸を含む、
遺伝子操作された細胞、および場合により
（３）試験試薬を含む、
キット。

【請求項51】

（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、
（２）遺伝子操作された細胞、
（３）レポーター分子を含む試験試薬、
を含むキットであって、
前記試験試薬が、前記細胞によって提示される細胞表面タンパク質に結合し、試薬－表面タンパク質複合体を形成することができ、前記試験試薬は前記試薬－タンパク質複合体が形成されると前記細胞への侵入を獲得する、
キット。

【請求項52】

前記遺伝子操作された細胞が、
（ｃ）異種細胞表面タンパク質をコードする核酸をさらに含む、
請求項４８～５１のいずれかに記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２２年１月１３日に出願された米国仮出願第６３／２９９，３１５号および２０２２年８月１５日に出願された米国仮出願第６３／３９８，０８５号の優先権を主張する。両出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

［連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載］
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＤＰ５ＯＤ２３１１８の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0003】

［電子的配列リストの参照］
電子的配列表（６３１０２０．００１５３．ｘｍｌ；サイズ：３６，３５８バイト；作成日２０２２年１１月８日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0004】

本技術は、一般に、例えば、創薬の分野に適用される可溶性ペプチドの分析およびスクリーニングに有用な方法および組成物に関する。本明細書中に開示される方法、システム、キットおよび組成物は、抗体、タンパク質またはペプチドの大きなライブラリーから活性な抗体、タンパク質またはペプチドを迅速、効率的かつ正確にスクリーニングおよび選択するためのツールを提供する。

【背景技術】

【0005】

可溶性タンパク質の機能を分析する創薬のための多くのアッセイは、かなりの量の精製タンパク質を必要とし、ロースループットまたはミディアムスループット（＜１０，０００）アッセイを使用してウェルプレート中でタンパク質の機能を試験する。例としては、細胞ベースのアッセイ、ウイルス中和アッセイ、または細胞活性ベースのタンパク質機能活性化アッセイが挙げられる。バイオテクノロジー発見目的にとって最も重大なことに、タンパク質を発現、精製および分析するプロセスは、バリアントライブラリーからの機能性タンパク質またはペプチドバリアントの直接選択と容易に適合しない。機能を試験するために可溶性スクリーニングまたは細胞活性ベースのアッセイを頻繁に必要とする薬物クラスの重要な例としては、ウイルスを中和する抗体、タンパク質またはペプチド、表面細胞受容体を活性化する抗体、タンパク質またはペプチド、および表面細胞受容体の活性化を遮断する抗体、タンパク質またはペプチドが挙げられる。したがって、可溶性タンパク質またはペプチド機能についての改善された迅速なアッセイに対する需要が存在する。

【発明の概要】

【0006】

本明細書には、単一細胞形式での可溶性ポリペプチドの機能試験に関連する方法、組成物、システムおよびキットが開示される。

【0007】

いくつかの態様では、スクリーニング方法が提供される。

【0008】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することを含み、細胞は、細胞表面タンパク質を提示し、細胞は、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化する場合にレポーター分子を発現するように操作される。

【0009】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することを含み、細胞は、細胞表面タンパク質を提示し、細胞は、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しない場合にレポーター分子を発現するように操作される。

【0010】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞を試験試薬と接触させる工程であって、細胞が表面タンパク質を提示し、細胞が（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドまたは試験試薬の１つが細胞表面タンパク質を活性化する場合にレポーター分子を発現するように操作されている工程；（ｂ）レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出する工程を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞をレポーター分子を含む試験試薬と接触させる工程であって、細胞が細胞表面タンパク質を提示し、試験試薬が、細胞によって提示される細胞表面タンパク質に結合し、試薬－受容体複合体を形成することができ、試薬－受容体複合体が形成されると、試験試薬が細胞への侵入を獲得し、細胞が、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌するように操作されている工程；（ｂ）細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出する工程を含む。

【0012】

前述の方法のいくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞または細菌細胞を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、内因性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞表面タンパク質を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、異種タンパク質を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、試験ポリペプチドの分泌は構成的である。いくつかの実施形態では、試験ポリペプチドの分泌は誘導性である。

【0015】

いくつかの実施形態では、単離され、遺伝子操作された単一の細胞は、マルチウェルプレートのウェル内、マイクロ流体液滴、例えばエマルジョン液滴中のマイクロチップのチャンバ内、またはＮａｎｏｐｅｎ（商標）内にある。

【0016】

前述の方法のいくつかの実施形態では、レポーター分子は、蛍光マーカー、酵素、タグ付きタンパク質、または核酸配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、レポーター分子は、核酸配列、場合によりバーコード配列を含み、レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することは、増幅反応および配列決定反応、場合により単一細胞配列決定反応の１つまたは複数を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、レポーター分子は蛍光部分を含み、レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することは蛍光活性化細胞選別を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、方法は、異種試験ポリペプチドをコードする核酸を配列決定することをさらに含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、異種試験ペプチドは、受容体リガンドのバリアントを含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、バリアントは、リガンドバリアントのライブラリーに由来する。

【0023】

いくつかの実施形態では、試験ポリペプチドは、細胞表面タンパク質リガンドのバリアントを含み、試験試薬は、野生型リガンドによるタンパク質活性化のアゴニストまたはアンタゴニストを含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、試験試薬は細胞表面タンパク質リガンドを含み、試験ポリペプチドは、リガンドによる受容体活性化の潜在的アゴニストまたはアンタゴニストのライブラリーに由来する。いくつかの実施形態では、試験ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片のライブラリーに由来する。

【0025】

いくつかの実施形態では、試験試薬は、ウイルス、ウイルス様粒子、偽ウイルスおよび組換えウイルス粒子のうちの１つまたは複数を含み、細胞表面タンパク質は、細胞へのウイルス侵入の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣまたはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、インフルエンザＡ、ＢまたはＣから選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エスプタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、および黄熱ウイルスから選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含み、細胞表面タンパク質はヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）を含み、いくつかの実施形態では、細胞は膜貫通セリンプロテアーゼ２（ＴＭＰＲＳＳ２）を発現するように操作される。

【0026】

いくつかの態様では、前述の実施形態のいずれかの遺伝子操作された細胞を含む組成物、キットまたはシステムが提供される。

【0027】

いくつかの態様では、キットが提供される。

【0028】

いくつかの実施形態では、キットは、（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクター；（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化されるベクターを含み、ベクターの１つ以上は発現ベクターであってもよく、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。

【0029】

いくつかの実施形態では、キットは、（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクター；（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しないと活性化されるベクターを含み、ベクターの１つ以上は発現ベクターであってもよく、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。

【0030】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）試験試薬、および（２）（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクター；（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、異種試験ポリペプチドまたは試験試薬のいずれかが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化されるベクターを含み、ベクターの１つ以上は発現ベクターであってもよく、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。

【0031】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）レポーター分子を含む試験試薬、および（２）（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクターを含み、ベクターの１つ以上は発現ベクターであってもよく、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。

【0032】

前述のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、１つ以上の核酸は、（ｃ）細胞表面タンパク質をさらにコードする。いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。

【0033】

いくつかの実施形態では、レポーター分子は、蛍光マーカー、酵素、タグ付きタンパク質、または核酸配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、試験試薬は、ウイルス、ウイルス様粒子、偽ウイルス、および組換えウイルス粒子を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣまたはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、およびインフルエンザＡ、ＢまたはＣから選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エスプタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、および黄熱ウイルスから選択される。いくつかの実施形態では、偽ウイルスは、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣもしくはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、またはインフルエンザＡ、ＢもしくはＣに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、偽ウイルスは、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エスプタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルスまたは黄熱ウイルスに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、異種試験ペプチドは、抗体またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、異種試験ペプチドは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）またはナノボディである。

【0036】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化される核酸を含む遺伝子操作された細胞を含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しない場合に活性化される核酸を含む遺伝子操作された細胞を含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化される核酸を含む、遺伝子操作された細胞、および場合により（３）試験試薬を含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）遺伝子操作された細胞、（３）レポーター分子を含む試験試薬であって、細胞によって提示される細胞表面タンパク質に結合し、試薬－受容体複合体を形成することができ、試薬－受容体複合体が形成されると、細胞への侵入を獲得する試験試薬を含む。

【0040】

前述のキットのいずれかのいくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、（ｃ）異種細胞表面タンパク質をコードする核酸をさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1a-b】図１ａは、細胞株を修飾してウイルスまたは偽ウイルスの侵入を許容させるために使用される（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２。図１ｂは、細胞株を修飾してウイルスまたは偽ウイルスの侵入を許容させるために使用される（ｂ）ＨＩＶの受容体発現プラスミド。

【図2】抗体分泌も可能である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対してＡＣＥ２およびＴＭＰＲＳＳ２を発現する細胞の生成であり、抗体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の大規模な区画ベースのライブラリースクリーニングを可能にする。

【図3】細胞株の生成は、ＡＣＥ２、ＴＭＰＲＳＳ２およびＩｇＧ遺伝子を含み、感染についての機能的読み出しと共に、タンパク質分泌（この場合、ＩｇＧ）をウイルス感染に連結することによって単一細胞ベースで中和アッセイを行うことを可能にする。

【図4a】単一細胞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイのための細胞株の開発。（ａ）導入遺伝子挿入のための部位特異的ＴＡＲＧＡＴＴ細胞株へのＡＣＥ２およびＴＭＰＲＳＳ２の組み込み。

【図4b】単一細胞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイのための細胞株の開発。（ｂ）ＴＡＲＧＡＴＴ細胞における対になったＶＨ：ＶＬライブラリークローニング。

【図5】フローサイトメトリー分析による、異なる量のウイルスを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス感染力の評価。

【図6a-b】図６ａは、タンパク質またはペプチドの分泌を可能にすることができるベクターの２つの例である、（ａ）ｐＣＭＶ－ＥＦ１ａベクター。この場合、分泌タンパク質はＩｇＧである。図６ｂは、タンパク質またはペプチドの分泌を可能にすることができるベクターの２つの例である、（ｂ）ｐＢＩベクターのベクターマップ。この場合、分泌タンパク質はＩｇＧである。

【図7】一過性ＩｇＧ発現についてのＩｇＧ収量のＥＬＩＳＡ定量化比較。異なるリーダーペプチド配列の組み合わせは、異なるレベルの分泌タンパク質発現を提供することができる。

【図8】ＩｇＧ発現のためのＦＲＴ／ＦＬＰベースの部位特異的インテグレーションシステム。

【図9】ＩｇＧ発現のためのインテグラーゼベースの部位特異的インテグレーションシステム。

【図10】可溶性タンパク質機能の分析のための細胞株へのＩｇＧ発現のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９相同組換え修復システム。

【図11】分泌タンパク質アッセイのために哺乳動物細胞中にライブラリーをクローニングするための、いくつかの可能な分泌タンパク質発現プラットフォームの概要。

【図12a-b】図１２ａは、単一方向形式でのＩｇＧの発現。（ａ）単鎖可変領域フラグメントとしてのＩｇＧの発現。図１２ｂは、単一方向形式でのＩｇＧの発現。（ｂ）ｐ２Ａ切断ペプチドによるバイシストロニック形式での完全ＩｇＧの発現。

【図13】ＨＥＫＡＣＥ２細胞のフローサイトメトリーによるＶＲＣ０１および９１０－３０の中和活性。

【図14a-b】図１４ａは、中和アッセイのために連結された抗体分泌およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染。（ａ）ＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２によって分泌されたＩｇＧのＥＬＩＳＡ標準曲線。分泌ｍＡｂの濃度を各バーの上に報告する。ＩｇＧ分泌細胞は偽ウイルス感染を予防した。９１０－３０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩＣ_５０は約０．２μｇ／ｍＬである。図１４ｂは、中和アッセイのために連結された抗体分泌およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染。（ｂ）２つの異なるリーダーペプチド（ＬＰ４またはＬＰ５）を用いた、中和ｍＡｂ（第１、第２、第５、第６群）または非中和ｍＡｂ（第３および第４群）を発現するＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２細胞の９６ウェル中和アッセイ。分泌ｍＡｂの濃度を各バーの上に報告する。ＩｇＧ分泌細胞は偽ウイルス感染を予防した。９１０－３０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩＣ_５０は約０．２μｇ／ｍＬである。

【図15a-b】図１５ａは、単一細胞単離およびエマルジョン液滴内での抗体分泌。（ａ）単一細胞を８０μｍの液滴にカプセル封入し、光学顕微鏡によって分析した。上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって分析して抗体濃度を決定した（ａｖｇ．＋／－ｓｔ．ｄｅｖ．）。液滴中の濃度は、２日目までに急速に０．５μｇ／ｍＬを超えた。＊外挿が標準曲線をわずかに上回る。図１５ｂは、単一細胞単離およびエマルジョン液滴内での抗体分泌。（ｂ）細胞をバルク細胞培養または液滴内のいずれかでインキュベートし、抗体を分泌させた。上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって分析して抗体濃度を決定した（ａｖｇ．＋／－ｓｔ．ｄｅｖ．）。液滴中の濃度は、２日目までに急速に０．５μｇ／ｍＬを超えた。＊外挿が標準曲線をわずかに上回る。

【図16a-b】図１６ａは、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する自然に対となったヒト抗体をマッピングするためのハイスループット単一細胞中和アッセイの例。（ａ）抗体を分泌する単一のＴＡＲＧＡＴＴ－ＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２細胞をエマルジョン液滴の内部に捕捉する。選別されたライブラリーのＤＮＡアンプリコンは、定量分析およびその後の抗体発現のために回収される。再生可能ライブラリーを多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスに対して別々に、または偽ウイルスパネルに対して繰り返しスクリーニングして、広範ｖｓ．株特異的抗体のために選択をすることができる。図１６ｂは、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する自然に対となったヒト抗体をマッピングするためのハイスループット単一細胞中和アッセイの例。（ｂ）約２４時間の抗体分泌後、単一細胞液滴がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス液滴と混同される。十分な濃度で中和抗体を分泌する細胞は、感染から保護される。非感染ＧＦＰ－細胞は、複数回のスクリーニングラウンドに進めることができる。選別されたライブラリーのＤＮＡアンプリコンは、定量分析およびその後の抗体発現のために回収される。再生可能ライブラリーを多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスに対して別々に、または偽ウイルスパネルに対して繰り返しスクリーニングして、広範ｖｓ．株特異的抗体のために選択をすることができる。

【図16c】多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する自然に対となったヒト抗体をマッピングするためのハイスループット単一細胞中和アッセイの例。（ｃ）細胞をＧＦＰ－集団とＧＦＰ＋集団とに分類する。非感染ＧＦＰ－細胞は、複数回のスクリーニングラウンドに進めることができる。選別されたライブラリーのＤＮＡアンプリコンは、定量分析およびその後の抗体発現のために回収される。再生可能ライブラリーを多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスに対して別々に、または偽ウイルスパネルに対して繰り返しスクリーニングして、広範ｖｓ．株特異的抗体のために選択をすることができる。

【図17】黄熱ウイルス（ＹＦＶ）の、抗ＹＦＶモノクローナル抗体分泌細胞における中和検出。ｍＡｂ－１７を分泌する細胞は、ＹＦＶ ＲＶＰ感染から保護された。ｍＡｂ－１７を発現していない細胞は、ＲＶＰ曝露後に発現したＧＦＰによって実証されるようにＲＶＰに感染した。

【図18a-b】図１８ａは、異なるリーダーペプチドおよびプロモーター組み合わせを使用した抗体発現のＥＬＩＳＡ定量化。（ａ）リーダーペプチドアミノ酸配列およびリーダーペプチド対名の表。図１８ｂは、異なるリーダーペプチドおよびプロモーター組み合わせを使用した抗体発現のＥＬＩＳＡ定量化。（ｂ）抗体の重鎖および軽鎖の発現を駆動するための最小ヒトサイトメガロウイルス（ｍｉｎｉＣＭＶ）双方向プロモーター、ならびに抗体の重鎖を発現するためのＣＭＶおよび軽鎖の発現を駆動するヒト伸長因子－１アルファ（Ｅｆ１α）からなる二重プロモーターのプラスミド図。

【図18c-d】図１８ｃは、異なるリーダーペプチドおよびプロモーター組み合わせを使用した抗体発現のＥＬＩＳＡ定量化。（ｃ）各ベクターにおける異なるリーダーペプチドの組み合わせを用いたＶＲＣ０１一過性発現レベルのサンドイッチＥＬＩＳＡ定量化。図１８ｄは、異なるリーダーペプチドおよびプロモーター組み合わせを使用した抗体発現のＥＬＩＳＡ定量化。（ｄ）各ベクターにおける異なるリーダーペプチドの組み合わせを用いたＣＲ３０２２一過性発現レベルのサンドイッチＥＬＩＳＡ定量化。

【図19】哺乳動物細胞における抗体分泌のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９インテグレーションシステム。

【図20】抗体分泌のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９インテグレーションシステムを使用して中和を実証した。

【図21】細胞分泌抗体の定量化により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の使用で抗体分泌が達成されることを実証した。

【図22】抗体遺伝子の哺乳動物細胞へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースのゲノム挿入の検証。

【図23】ｍＡｂ ２－１５配列のＴＡＲＧＡＴＴ遺伝子インテグレーション。

【図24】ＴＡＲＧＡＴＴ１２－１５細胞から分泌された抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体、２－１５の中和活性。

【図25】ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５細胞からの抗体分泌の定量化。

【図26a-b】図２６ａは、（ａ）ダウンストリームプライマーセットを使用したゲノムＰＣＲのゲル電気泳動により、ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５細胞の遺伝子インテグレーションの成功を検証する。図２６ｂは、（ｂ）インターナルＰＣＲコントロールとしてヒトコントロールプライマーセットを用いたＰＣＲ反応（パネルｂ）。

【図27】抗ＨＩＶ－１モノクローナル抗体を分泌する細胞におけるＨＩＶ－１中和検出。ＶＲＣ３４を分泌する細胞はＨＩＶ－１偽ウイルス感染から保護された；ＶＲＣ３４を発現しない細胞は、Ｗ６Ｍ．ＥｎＶ．Ｃ２ ＨＩＶ－１偽ウイルス曝露後に発現したＧＦＰによって実証されるように、偽ウイルスに感染した。各条件でｎ＝２反復を実行した。初期細胞密度は２，５００細胞／ウェルであった。偽ウイルス粒子で希釈物を作製した；細胞数および抗体濃度は、偽ウイルス希釈物全体で一定に保持された。ＷＴ－野生型、ＮＣ－陰性対照（偽ウイルス粒子を添加しない）。

【図28】電気融合を用いた液滴混同上：液滴混同がオフである。細胞を含有する液滴およびローダミンを含有する液滴は、明視野においてもローダミン蛍光を測定する場合でも明確に分離されている。下：１．６Ｖの設定で電場を使用して液滴混同がオンである。細胞を含有する液滴は、ローダミン１１０チャネルに示すように、顕微鏡を使用した視認性のためにローダミン１１０色素と混同する。矢印は、液滴内の細胞の存在を示す。液滴混同電圧が「オフ」である場合、ローダミンは細胞含有液滴中に存在せず、液滴混同電圧が「オン」である場合、ローダミンは細胞を含有する液滴内に存在し、液滴の混同に成功したことを示す。

【図29】ハイスループットアッセイで分析された細胞株由来の可変重鎖配列のＰＣＲ増幅。細胞集団ライブラリーを、ＤＮＡ回収の前にフローサイトメーターを使用してＧＦＰ－発現またはＧＦＰ＋発現について選別した。これらのデータは、ハイスループット液滴ベースの細胞分泌タンパク質機能アッセイにおいて利用される細胞のＤＮＡ配列を回収する、本発明者らの能力を実証する。

【図30】合成ライブラリーを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２液滴中和アッセイの実施。ＶＲＣ０１、ＣＲ３０２２ ９１０－３０またはｍＡｂ １－２０のいずれかを発現するＨＥＫ２９３／ＡＣＥ２細胞をプールし、単一細胞を捕捉し、２４時間抗体を分泌させた。細胞および抗体を含有する液滴を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄ６１４Ｇ ＲＶＰを含有する液滴と混同させ、２４時間感染させた。感染後、細胞を液滴から回収し、放置した。２日後、ＧＦＰ－／ｍＣｈｅｒｒｙ＋（細胞感染無し／ｍＡｂ産生）およびＧＦＰ＋／ｍＣｈｅｒｒｙ＋（細胞感染／ｍＡｂ産生）細胞を選別した。配列決定のために両方の集団からｇＤＮＡを抽出し、回収したＧＦＰ－／ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の１０％を液滴中和アッセイの第２ラウンド用に増殖させた。ＧＦＰ＋集団ではいくつかのクローンについて観察されたリードがゼロであり、これらの中和抗体クローンの感染事象の完全な欠如を反映し、非常に高いアッセイ精度で予想される結果を提供した。（ＧＦＰ－リード有病率／ＧＦＰ＋リード有病率）として定義されるリード倍率変化のクローン画分のための割り算は、利用可能なリードがゼロである場合（例えば、特定の抗体クローンの液滴内の完全な中和を示している）、ゼロで除算するエラーが生じ得る。数学的には、ゼロによる除算の最も近い近似は無限大であるが、これらの倍率変化は、他のクローンとの比較のために、ここでは９，９９９の値で人工的に推定された。

【図31】合成ライブラリーを用いたＨＩＶ－１偽ウイルスを使用する液滴中和アッセイ。７２Ａ１、ＶＲＣ０１またはＶＲＣ３４のいずれかを発現するＴＺＭ／ＧＦＰ細胞をプールした。次に、単一細胞を捕捉し、２４時間抗体を分泌させた。細胞および抗体を含有する液滴を次に、ＨＩＶ偽ウイルス（配列ＢＧ５０５．Ｗ６Ｍ．Ｅｎｖ．Ｃ２を用いて生成）を含有する液滴と混同させ、２４時間感染させた。感染後、細胞を液滴から回収し、放置した。２日後、ＧＦＰ－／ｍＣｈｅｒｒｙ＋（細胞感染無し／ｍＡｂ産生）およびＧＦＰ＋／ｍＣｈｅｒｒｙ＋（細胞感染／ｍＡｂ産生）細胞を選別した。ｇＤＮＡを両方の集団から抽出した。非中和抗体（７２Ａ１）はＧＦＰ＋集団において高度に濃縮され、低い中和活性を示した。この図は、選別された細胞ライブラリーのＮＧＳ分析を使用して、ＨＩＶ－１偽ウイルスアッセイのための液滴内の中和アッセイを首尾よく実施する能力を実証する。

【発明を実施するための形態】

【0042】

本発明は、以下、本出願全体を通して示されるいくつかの定義を使用して本明細書に記載される。

【0043】

特に指定または文脈によって示されない限り、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は「１つ以上」を意味する。例えば、「腫瘍細胞凝集の阻害剤」は、「腫瘍細胞凝集の１つ以上の阻害剤」を意味すると解釈されるべきである。

【0044】

本明細書で使用される場合、「約」、「およそ」、「実質的に」、および「有意に」は、当業者によって理解され、それらが使用される文脈上である程度変動する。これらの用語が使用される文脈を考慮すると、当業者には明確でないこれらの用語の使用がある場合、「約」および「およそ」は、特定の用語の±１０％以下を意味し、「実質的に」および「有意に」は、特定の用語の±１０％超を意味する。

【0045】

本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同じ意味を有し、これらの後者の用語は「オープン」移行句であり、これらの移行句に続く列挙された要素のみに特許請求の範囲を限定しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語に包含されるが、特許請求の範囲をこの移行句に続く列挙された要素のみに限定する「クローズド」移行句として解釈されるべきである。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語に包含されるが、この移行句に続く追加の要素を可能にするが、それらの追加の要素が特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しない場合に限り、「部分的クローズド」移行句として解釈されるべきである。

【0046】

本明細書で使用される場合、「タンパク質、」、「ペプチド、」および「ポリペプチド」という用語は互換的に使用される。

【0047】

本明細書で使用される場合、「マイクロウェル」という用語は、０．１ミクロン～４，９９９ミクロンの少なくとも一次元の直径または幅を有する密閉または部分的に密閉された区画として定義される。マイクロウェルの他の次元のうちの１つ、２つが開放され、より広いリザーバに接続されてもよく、されなくてもよい。

【0048】

可溶性タンパク質ライブラリーの機能的スクリーニングのための、迅速、ハイスループットかつ費用効果的な方法、組成物、システムおよびキットが本明細書に開示される。

【0049】

例として、本明細書に記載されるように、ウイルス感染および同時の抗体分泌を許容する細胞株を生成して、産生された抗体のウイルス中和特徴を分析した。

【0050】

いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に感受性であり、抗体またはその抗原結合断片も分泌する細胞株が作製される。いくつかの実施形態では、抗体分泌細胞のウイルス感染（ＳＡＲＳ－ｃｏＶ－２感染）を中和、予防、または低減する分泌抗体の能力が分析される。

【0051】

いくつかの実施形態では、ＨＩＶ感染症に感受性であり、抗ＨＩＶ抗体も分泌する細胞株が作製される。いくつかの実施形態では、抗体分泌細胞のウイルス感染（ＨＩＶ感染）を中和、予防、または低減する分泌抗体の能力が分析される。

【0052】

いくつかの実施形態では、既にウイルス感染に対して許容可能な細胞株（例えば、黄熱ウイルス組換えウイルス粒子を有するＲａｊｉ－ＤＣ－ＳＩＧＮ）が使用される。

【0053】

いくつかの実施形態では、抗体発現は、自然にウイルス感染することができる哺乳動物細胞株中に操作され得る。いくつかの実施形態では、細胞株は、ウイルス侵入の少なくとも１つの構成要素（例えば、異種細胞表面分子）を発現するように操作される。

【0054】

いくつかの実施形態では、異種ポリペプチド（潜在的リガンドまたは潜在的リガンド受容体アンタゴニストもしくはアゴニストなど）は、リガンド受容体アゴニズムまたはアンタゴニズムの分析（例えば、ＰＤ－１表面受容体について）を目的として作製された細胞株において発現される。

【0055】

［スクリーニング方法］

【0056】

先行技術で現在知られている分泌ポリペプチド分子の機能分析のための代替アプローチは、（例えば、ＡｂＣｈｅｃｋ社によって販売されているマイクロ流体機能的選別サービスによって、同様にＬｉｎ ｅｔ ａｌ．による例（Ｌｉｎ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，（２０２２）．Ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，２２（１３），２５７８－２５８９）によって示されるように、センサー細胞およびポリペプチド分泌細胞の選別と共に、多細胞液滴区画化を必要とする。これらの単一液滴内二重細胞アプローチは、単一細胞液滴システムと比較して、一般にスループットがはるかに低い。さらに、これらのプラットフォームは、複数の細胞を含有する液滴の選別および選択を可能にするための、技術的複雑さを呈する。対照的に、本発明者らのアプローチは、抗体の活性に関連する選択マーカーに連結されたポリペプチド分泌細胞の回収を可能にし、所望の活性を示す細胞の容易な選択を可能にする。

【0057】

いくつかの代替的な公開されたアプローチは、ウイルス中和（例えば、ＡＣＥ２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合タンパク質への結合の遮断（例えば、Ｓｈｉａｋｏｌａｓ，Ａ．Ｒ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎ．Ｖ．，Ｗａｌｌ，Ｓ．Ｃ．，Ｓｕｒｙａｄｅｖａｒａ，Ｎ．，Ｗｒａｐｐ，Ｄ．，Ｐｅｒｉａｓａｍｙ，Ｓ．，Ｐｉｌｅｗｓｋｉ，Ｋ．Ａ．，Ｒａｊｕ，Ｎ．，Ｎａｒｇｉ，Ｒ．，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｌ．Ｍ．，Ｓｅｔｌｉｆｆ，Ｉ．，Ｃｒｏｗｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｕｋｒｅｙｅｖ，Ａ．，Ｃａｒｎａｈａｎ，Ｒ．Ｈ．，ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．＆Ｇｅｏｒｇｉｅｖ、Ｉ．Ｓ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｖｉａ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｂｌｏｃｋｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０２２）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２２－０１２３２－２を参照されたい）を含む、ポリペプチド活性のプロキシシグナルとしての受容体結合の妨害について、分泌ポリペプチドをスクリーニングし得る。

【0058】

しかしながら、受容体結合阻害についてのスクリーニングは、中和について直接スクリーニングするものではなく、受容体結合の妨害についてのスクリーニング時に選択ラウンドから見逃されるであろう多くの抗体が存在する。さらに、リガンド遮断についてのスクリーニングは、アゴニスト抗体を効率的に選択することができない。対照的に、本明細書では、本発明者らは、現在の技術を直接使用して中和およびアゴニスト抗体についてスクリーニングする能力を実証する。

【0059】

本明細書に開示されるように、スループットおよびアッセイの簡便性を向上させるために、液滴内の複数の細胞ではなく単一の細胞を使用してハイスループットアッセイを実現することが非常に有利である。さらに、液滴の選別ではなく、単一の細胞の選別ができることは有利であり、なぜなら、液滴の選別が多くの場合、実施するために特殊化され、かつ／またはカスタマイズされた装置を必要とするのに対して、単一の細胞は、より広範囲の細胞装置（例えば、複数の異なるベンダから入手可能な多様なタイプのＦＡＣＳマシン）を使用して選別され得るからである。

【0060】

いくつかの代替アプローチは、液滴内のポリペプチド分泌細胞（例えば、Ｇｅｒａｒｄ，Ａ．，Ｗｏｏｌｆｅ，Ａ．，Ｍｏｔｔｅｔ，Ｇ．，Ｒｅｉｃｈｅｎ，Ｍ．，Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎ，Ｃ．，Ｍｅｎｒａｔｈ，Ｖ．，Ｅｌｌｏｕｚｅ，Ｓ．，Ｐｏｉｔｏｕ，Ａ．，Ｄｏｉｎｅａｕ，Ｒ．，Ｂｒｉｓｅｎｏ－Ｒｏａ，Ｌ．，Ｃａｎａｌｅｓ－Ｈｅｒｒｅｒｉａｓ，Ｐ．，Ｍａｒｙ，Ｐ．，Ｒｏｓｅ，Ｇ．，Ｏｒｔｅｇａ，Ｃ．，Ｄｅｌｉｎｃｅ，Ｍ．，Ｅｓｓｏｎｏ，Ｓ．，Ｊｉａ，Ｂ．，Ｉａｎｎａｓｃｏｌｉ，Ｂ．，Ｇｏｆｆ，Ｏ．Ｒ．－Ｌ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｏｕｓｓｅ，Ｙ．，Ｓｈｅｎ，Ｂ．，Ｇｒｏｓｓｅｌｉｎ，Ｋ．，Ｓａｕｄｅｍｏｎｔ，Ｂ．，Ｓａｕｔｅｌ－Ｃａｉｌｌｅ，Ａ．，Ｇｏｄｉｎａ，Ａ．，ＭｃＮａｍａｒａ，Ｓ．，Ｅｙｅｒ，Ｋ．，Ｍｉｌｌｏｔ，Ｇ．Ａ．，Ｂａｕｄｒｙ，Ｊ．，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｐ．，Ｎｉｚａｋ，Ｃ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ａ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，Ｂｒｕｈｎｓ，Ｐ．＆Ｂｒｅｎａｎ，Ｃ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １－７（２０２０）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４６６－７を参照のこと）、例えば、抗体を分泌する形質細胞についての結合アッセイスクリーニングを行う。しかしながら、これらの技術は、複雑で非効率的な液滴ベースの選別を必要とし、形質細胞の使用は、中和アッセイ、およびＧＰＣＲのような膜タンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニスト分子の選択の大部分を妨げる。対照的に、本発明者らのアプローチは、標準的なＦＡＣＳ装置を使用して細胞を直接選別することを可能にし、膜タンパク質ベースの選択およびウイルス中和アッセイの広範囲に順応性があることは、先行技術に記載された技術と比較して大きな利点を示す。

【0061】

本明細書に記載の手順は、必要に応じて、手順の１つの変形例としてマイクロ流体チップ上で細胞液滴を選別する（例えば、エマルジョンを破壊して細胞を回収する前に液滴を選別する）ことによって実施することができる。

【0062】

本開示の一態様では、スクリーニング方法が提供される。いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することを含み、細胞は、細胞表面タンパク質を提示し、細胞は、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化する場合にレポーター分子を発現するように操作される。

【0063】

本明細書で使用される場合、「細胞表面タンパク質を提示する」とは、目的の細胞が細胞表面に局在する細胞表面タンパク質を有することを指す。細胞表面タンパク質の局在化は、細胞表面タンパク質自体の固有の分子特性に依存し得る。さらに、細胞表面タンパク質の局在化は、タンパク質の機能のために必要とされ得る。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、内在性膜タンパク質である。いくつかの実施態様では、細胞表面タンパク質は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）部分によって細胞表面に局在化される。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、細胞膜を越えて細胞内にシグナルを伝達することができる。他の実施形態では、細胞表面タンパク質は、例えばレポーター分子を含み得る試験試薬の侵入を可能にするために存在する。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は細胞によって発現され、次いで細胞膜に局在する。他の実施形態では、細胞表面タンパク質は、当技術分野で公知の手段、例えばエキソソーム、マイクロベシクル、リポソーム、などによって細胞に送達される。

【0064】

本明細書で使用される場合、「細胞表面タンパク質」は、任意の細胞表面関連タンパク質またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、受容体ライゲーション時に細胞内でシグナルを伝達することができるリガンドのためのタンパク質である。したがって、いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、細胞表面受容体を含む。

【0065】

本明細書で使用される場合、「検出する」は、細胞内の１つ以上のレポーターによって提供される情報を取得することを指す。したがって、いくつかの実施形態では、検出は、自動化された装置、例えば、フローサイトメーター、蛍光光度計、ルミノメーター、顕微鏡、デジタルカメラ、プレートリーダなどによって、またはヒトの目によって実行され得る。他の実施形態では、検出は、核酸の配列決定に関連する技術、例えばサンガーシーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）などを使用して行われる。

【0066】

本明細書で使用される場合、「レポーター分子」は、細胞の特定の分子状態を示す目的の細胞によって発現される分子を指す。例えば、いくつかの実施形態では、細胞株は、受容体アゴニズムまたはアンタゴニズムに応答してシグナル（例えば、レポーター分子の発現）を提供するように操作される。したがって、レポーター分子は、細胞の状態、すなわち、目的の受容体がライゲーションされているか、またはライゲーションされるのを防止されているかを示す。例示的なレポーター分子には、蛍光タンパク質、発光タンパク質、酵素、タグ付きタンパク質、核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。

【0067】

例示的な蛍光タンパク質には、以下に提供される分子およびその機能的バリアントが含まれるが、これらに限定されない：

【0068】

以下の配列を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）：
ＭＳＫＧＥＥＬＦＴＧ ＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧ ＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳ ＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧ ＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴ ＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬ ６０
ＶＴＴＦＳＹＧＶＱＣ ＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱ ＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥ ＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦ ＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡ ＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶ １２０
ＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦ ＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫ ＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶ ＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧ ＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮ ＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤ １８０
ＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤ ＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹ ＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤ ＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬ ＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴ ＨＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号１）

【0069】

以下の配列を有する赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）：
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨ ＧＳＡＨＧＬＴＤＤＭ ＴＭＨＦＲＭＥＧＣＶ ＤＧＨＫＦＶＩＥＧＮ ＧＮＧＮＰＦＫＧＫＱ ＦＩＮＬＣＶＩＥＧＧ ６０
ＰＬＰＦＳＥＤＩＬＳ ＡＡＦＸＮＲＬＦＴＥ ＹＰＥＧＩＶＤＹＦＫ ＮＳＣＰＡＧＹＴＷＨ ＲＳＦＲＦＥＤＧＡＶ ＣＩＣＳＡＤＩＴＶＮ １２０
ＶＲＥＮＣＩＹＨＥＳ ＴＦＹＧＶＮＦＰＡＤ ＧＰＶＭＫＫＭＴＴＮ ＷＥＰＳＣＥＫＩＩＰ ＩＮＳＱＫＩＬＫＧＤ ＶＳＭＹＬＬＬＫＤＧ １８０
ＧＲＹＲＣＱＦＤＴＩ ＹＫＡＫＴＥＰＫＥＭ ＰＤＷＨＦＩＱＨＫＬ ＮＲＥＤＲＳＤＡＫＮ ＱＫＷＱＬＩＥＨＡＩ ＡＳＲＳＡＬＰ（配列番号２）

【0070】

以下の配列を有する黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）：
ＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶ ＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶ ＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥ ＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬ ＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫ ＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴ ６０
ＴＦＸＬＱＣＦＡＲＹ ＰＤＨＭＫＲＨＤＦＦ ＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱ ＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧ ＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦ ＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥ １２０
ＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧ ＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮ ＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡ ＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮ ＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧ ＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱ １８０
ＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬ ＬＰＤＮＨＹＬＳＹＱ ＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫ ＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶ ＴＡＡＧＩ（配列番号３）

【0071】

以下の配列を有する青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）：
ＭＳＫＧＥＥＬＦＴＧ ＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧ ＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳ ＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧ ＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴ ＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬ ６０
ＶＴＴＦＸＶＱＣＦＳ ＲＹＰＤＨＭＫＲＨＤ ＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹ ＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤ ＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶ ＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲ １２０
ＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥ ＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥ ＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩ ＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫ ＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥ ＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹ １８０
ＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰ ＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳ ＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮ ＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥ ＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧ ＭＤＥＬＹＫ（配列番号４）

【0072】

以下の配列を有するシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴ ＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤ ＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶ ＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ ＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴ ＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴ ６０
ＬＶＴＴＬＸＶＱＣＦ ＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨ ＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧ ＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫ ＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥ ＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮ １２０
ＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫ ＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬ ＥＹＮＡＩＳＤＮＶＹ ＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩ ＫＡＮＦＫＩＲＨＮＩ ＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨ １８０
ＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧ ＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬ ＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰ ＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬ ＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬ ＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号５）
または
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴ ＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤ ＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶ ＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ ＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴ ＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴ ６０
ＬＶＴＴＬＸＶＱＣＦ ＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨ ＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧ ＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫ ＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥ ＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮ １２０
ＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫ ＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬ ＥＹＮＹＩＳＨＮＶＹ ＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩ ＫＡＮＦＫＩＲＨＮＩ ＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨ １８０
ＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧ ＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬ ＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰ ＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬ ＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬ ＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号６）

【0073】

以下の配列を有するｍＣｈｅｒｒｙ：
ＭＶＳＫＧＥＥＤＮＭ ＡＩＩＫＥＦＭＲＦＫ ＶＨＭＥＧＳＶＮＧＨ ＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧ ＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫ ＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰ ６０
ＦＡＷＤＩＬＳＰＱＦ ＭＹＧＳＫＡＹＶＫＨ ＰＡＤＩＰＤＹＬＫＬ ＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲ ＶＭＮＦＥＤＧＧＶＶ ＴＶＴＱＤＳＳＬＱＤ １２０
ＧＥＦＩＹＫＶＫＬＲ ＧＴＮＦＰＳＤＧＰＶ ＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡ ＳＳＥＲＭＹＰＥＤＧ ＡＬＫＧＥＩＫＱＲＬ ＫＬＫＤＧＧＨＹＤＡ １８０
ＥＶＫＴＴＹＫＡＫＫ ＰＶＱＬＰＧＡＹＮＶ ＮＩＫＬＤＩＴＳＨＮ ＥＤＹＴＩＶＥＱＹＥ ＲＡＥＧＲＨＳＴＧＧ ＭＤＥＬＹＫ（配列番号７）

【0074】

例示的な発光タンパク質には、限定されないが、以下が含まれる：

【0075】

以下の配列を有するウミシイタケルシフェラーゼ：
ＭＴＳＫＶＹＤＰＥＬ ＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷ ＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬ ＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥ ＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬ ＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷ ６０
ＲＨＶＶＰＨＶＥＰＶ ＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧ ＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧ ＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹ ＬＴＥＷＦＫＨＬＮＬ ＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤ １２０
ＷＧＡＣＬＡＦＨＹＣ ＹＥＨＱＤＲＩＫＡＶ ＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩ ＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥ ＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥ ＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦ １８０
ＦＶＥＴＭＬＰＳＫＩ ＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡ ＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧ ＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰ ＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫ ＰＤＶＶＥＩＶＲＮＹ ２４０
ＮＡＹＬＲＡＳＨＤＬ ＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧ ＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡ ＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫ ＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤ ＡＰＤＥＭＧＮＹＩＫ ３００
ＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥ Ｑ（配列番号８）

【0076】

以下の配列を有するホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ：
ＭＥＤＡＫＮＩＫＫＧ ＰＡＰＦＹＰＬＥＤＧ ＴＡＧＥＱＬＨＫＡＭ ＫＲＹＡＬＶＰＧＴＩ ＡＦＴＤＡＨＩＥＶＮ ＩＴＹＡＥＹＦＥＭＳ ６０
ＶＲＬＡＥＡＭＫＲＹ ＧＬＮＴＮＨＲＩＶＶ ＣＳＥＮＳＬＱＦＦＭ ＰＶＬＧＡＬＦＩＧＶ ＡＶＡＰＡＮＤＩＹＮ ＥＲＥＬＬＮＳＭＮＩ １２０
ＳＱＰＴＶＶＦＶＳＫ ＫＧＬＱＫＩＬＮＶＱ ＫＫＬＰＩＩＱＫＩＩ ＩＭＤＳＫＴＤＹＱＧ ＦＱＳＭＹＴＦＶＴＳ ＨＬＰＰＧＦＮＥＹＤ １８０
ＦＶＰＥＳＦＤＲＤＫ ＴＩＡＬＩＭＮＳＳＧ ＳＴＧＳＰＫＧＶＡＬ ＰＨＲＴＡＣＶＲＦＳ ＨＡＲＤＰＩＦＧＮＱ ＩＩＰＤＴＡＩＬＳＶ ２４０
ＶＰＦＨＨＧＦＧＭＦ ＴＴＬＧＹＬＩＣＧＦ ＲＶＶＬＭＹＲＦＥＥ ＥＬＦＬＲＳＬＱＤＹ ＫＩＱＳＡＬＬＶＰＴ ＬＦＳＦＦＡＫＳＴＬ ３００
ＩＤＫＹＤＬＳＮＬＨ ＥＩＡＳＧＧＡＰＬＳ ＫＥＶＧＥＡＶＡＫＲ ＦＨＬＰＧＩＲＱＧＹ ＧＬＴＥＴＴＳＡＩＬ ＩＴＰＥＧＤＤＫＰＧ ３６０
ＡＶＧＫＶＶＰＦＦＥ ＡＫＶＶＤＬＤＴＧＫ ＴＬＧＶＮＱＲＧＥＬ ＣＶＲＧＰＭＩＭＳＧ ＹＶＮＤＰＥＡＴＮＡ ＬＩＤＫＤＧＷＬＨＳ ４２０
ＧＤＩＡＹＷＤＥＤＥ ＨＦＦＩＶＤＲＬＫＳ ＬＩＫＹＫＧＣＱＶＡ ＰＡＥＬＥＳＩＬＬＱ ＨＰＮＩＦＤＡＧＶＡ ＧＬＰＧＤＤＡＧＥＬ ４８０
ＰＡＡＶＶＶＬＥＨＧ ＫＴＭＴＥＫＥＩＶＤ ＹＶＡＳＱＶＴＴＡＫ ＫＬＲＧＧＶＶＦＶＤ ＥＶＰＫＧＬＴＧＫＬ ＤＡＲＫＩＲＥＩＬＩ ５４０
ＫＡＫＫＧＧＫＳＫＬ（配列番号９）

【0077】

本明細書で使用される場合、「発現」は、ＤＮＡを含む核酸のＲＮＡへの転写、またはＲＮＡのタンパク質もしくはポリペプチドへの翻訳のいずれか、またはＤＮＡのＲＮＡへの転写とＲＮＡのタンパク質もしくはポリペプチドへの翻訳の両方を指す。

【0078】

本明細書に開示される方法は、候補分子の迅速なハイスループット試験を可能にする、効率的な単一細胞プラットフォームを利用する。したがって、本明細書で使用される場合、「単一の単離された細胞」は、反応容器、例えば、マルチウェルプレート、マイクロチップ、マイクロ流体チップ、Ｎａｎｏｐｅｎ（商標）等の中の他の細胞から物理的に分離された細胞を指す。

【0079】

本開示の方法、組成物、システムおよびキットは、「遺伝子操作された細胞」を利用する。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」またはその文法的変形は、人の手によって行われる１つまたは複数の遺伝子組換えを有する細胞を指す。そのような組換えは、例えば、導入された核酸または外因性核酸の発現を含む。外因性核酸を導入する方法は、当技術分野で公知であり、トランスフェクション、リポフェクション、ウイルス形質導入、例えばレトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルス形質導入を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、細胞のゲノムに組み込まれた核酸を含み、他の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、エピソームに含有される核酸を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、１つ以上のプロモーターまたは１つ以上のエンハンサー配列によって作動可能に制御される目的の遺伝子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的活性を有し得る、すなわち、プロモーターはその制御下の核酸の転写を連続的に指示する。例示的な構成的プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび伸長因子１α（ＥＦ１ａ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態において、１つ以上のプロモーターは誘導性であり、それらが別の分子の付加に応答することを意味している。例示的な誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導性プロモーター、クメート誘導性プロモーターおよびエストロゲン受容体ベースのタモキシフェン誘導性プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、下流配列の発現レベルが比較的高い「強」プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、下流配列の発現レベルが比較的低い「弱」プロモーターである。限定ではなく例として、哺乳動物ＣＭＶプロモーターは、一般に、当業者によって強プロモーターであるとみなされる。

【0081】

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、単一細胞を、目的のタンパク質「細胞表面タンパク質」、および「異種試験ペプチド」と呼ばれる潜在的な目的のリガンドの両方の発現源として使用する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、異種試験ペプチドによる目的の受容体のライゲーションの成功、いくつかの例では下流シグナル伝達に応答してレポーターを発現する。スクリーニングされる各細胞は、受容体自体に加えて、目的の受容体のための異なる潜在的リガンド、および受容体のライゲーションを示すレポーター分子を発現するように操作される。したがって、多くのそのような細胞のスクリーニングは、受容体のための複数のリガンドを明らかにする。

【0082】

いくつかの実施形態では、異種試験ペプチドは、抗体またはその抗原結合断片、例えば単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、ナノボディまたはＦａｂ断片である。本明細書で使用される場合、「単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）」は、リンカーによって融合された単一の免疫グロブリン重鎖および単一の免疫グロブリン軽鎖を指す。本明細書で使用される場合、「ナノボディ」は、単一のモノマー可変抗体ドメインを含むタンパク質を指す。「Ｆａｂ」断片は、抗体の抗原結合領域を指す。

【0083】

いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質のリガンドは公知であり、異種試験ポリペプチドの構造または配列は、公知のリガンドのものに基づく。

【0084】

いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することを含み、細胞は、細胞表面タンパク質を提示し、細胞は、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しない場合にレポーター分子を発現するように操作される。したがって、そのような実施形態では、細胞表面タンパク質の活性化の防止は、レポーター分子の発現によって明らかにされる。

【0085】

スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、（ａ）単離され、遺伝子操作された単一細胞を試験試薬と接触させる工程であって、細胞が細胞表面タンパク質を提示し、細胞が（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドまたは試験試薬のうちの１つが細胞表面タンパク質を活性化すれば、レポーター分子を発現するように操作されている工程、（ｂ）レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出する工程を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、試験試薬は、細胞表面タンパク質のリガンドであり、異種試験ポリペプチドは、細胞表面タンパク質の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストである。他の実施形態では、試験試薬は、細胞表面タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストであり、異種試験ポリペプチドは、細胞表面タンパク質の潜在的なリガンドである。

【0087】

いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞をレポーター分子を含む試験試薬と接触させる工程であって、細胞が細胞表面タンパク質を提示し、試験試薬が、細胞によって提示される細胞表面タンパク質に結合し、試薬－タンパク質複合体を形成することができ、試薬－タンパク質複合体が形成されると、試験試薬が細胞へ侵入することができ、細胞が、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌するように操作されている工程；（ｂ）細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出する工程を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、試験試薬は感染性因子であるか、または感染性因子に由来する。いくつかの実施形態では、試験試薬はウイルスであるか、またはウイルスに由来する。例示的な非限定的なウイルスとしては、例えば、コロナウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、フラビウイルス、レンチウイルス、インフルエンザＡ、Ｂ、ＣまたはＤウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、試験試薬は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、黄熱ウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、エプスタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、またはデングウイルスであるか、それらに由来する。いくつかの実施形態では、試験試薬は偽ウイルスである。本明細書で使用される場合、「偽ウイルス」は、多くの場合レトロウイルス、レンチウイルス、例えばＨＩＶ、または水疱性口内炎ウイルスに基づく複製能力のないウイルスまたはウイルス様粒子を指し、別のウイルス由来の重要なウイルス因子、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質（スパイクタンパク質）をさらに含む。したがって、偽ウイルスを使用する研究者への感染のリスクが、野生型ウイルスの使用と比較して軽減される一方、本明細書に開示される方法、組成物およびキットのように、野生型ウイルスに対する新規中和剤の発見のためのツールとして有用である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、哺乳動物、魚、鳥類、植物、昆虫、酵母または細菌に感染することができる。

【0089】

いくつかの実施形態では、試験試薬はレポーター分子を含む。したがって、レポーター分子を含む試験薬剤が細胞表面タンパク質に結合し、細胞内への侵入を得ると、細胞はレポーター分子を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、試験試薬と複合体を形成し、試験試薬の細胞への侵入を触媒するために必要な受容体である。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、受容体ライゲーション時に細胞内でシグナルを伝達することができるリガンドのための受容体である。

【0091】

例示的な細胞表面タンパク質には、限定されないが、以下が含まれる：

【0092】

以下のアミノ酸配列を有する、ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ－２）：
ＭＳＳＳＳＷＬＬＬＳ ＬＶＡＶＴＡＡＱＳＴ ＩＥＥＱＡＫＴＦＬＤ ＫＦＮＨＥＡＥＤＬＦ ＹＱＳＳＬＡＳＷＮＹ ＮＴＮＩＴＥＥＮＶＱ ６０
ＮＭＮＮＡＧＤＫＷＳ ＡＦＬＫＥＱＳＴＬＡ ＱＭＹＰＬＱＥＩＱＮ ＬＴＶＫＬＱＬＱＡＬ ＱＱＮＧＳＳＶＬＳＥ ＤＫＳＫＲＬＮＴＩＬ １２０
ＮＴＭＳＴＩＹＳＴＧ ＫＶＣＮＰＤＮＰＱＥ ＣＬＬＬＥＰＧＬＮＥ ＩＭＡＮＳＬＤＹＮＥ ＲＬＷＡＷＥＳＷＲＳ ＥＶＧＫＱＬＲＰＬＹ １８０
ＥＥＹＶＶＬＫＮＥＭ ＡＲＡＮＨＹＥＤＹＧ ＤＹＷＲＧＤＹＥＶＮ ＧＶＤＧＹＤＹＳＲＧ ＱＬＩＥＤＶＥＨＴＦ ＥＥＩＫＰＬＹＥＨＬ ２４０
ＨＡＹＶＲＡＫＬＭＮ ＡＹＰＳＹＩＳＰＩＧ ＣＬＰＡＨＬＬＧＤＭ ＷＧＲＦＷＴＮＬＹＳ ＬＴＶＰＦＧＱＫＰＮ ＩＤＶＴＤＡＭＶＤＱ ３００
ＡＷＤＡＱＲＩＦＫＥ ＡＥＫＦＦＶＳＶＧＬ ＰＮＭＴＱＧＦＷＥＮ ＳＭＬＴＤＰＧＮＶＱ ＫＡＶＣＨＰＴＡＷＤ ＬＧＫＧＤＦＲＩＬＭ ３６０
ＣＴＫＶＴＭＤＤＦＬ ＴＡＨＨＥＭＧＨＩＱ ＹＤＭＡＹＡＡＱＰＦ ＬＬＲＮＧＡＮＥＧＦ ＨＥＡＶＧＥＩＭＳＬ ＳＡＡＴＰＫＨＬＫＳ ４２０
ＩＧＬＬＳＰＤＦＱＥ ＤＮＥＴＥＩＮＦＬＬ ＫＱＡＬＴＩＶＧＴＬ ＰＦＴＹＭＬＥＫＷＲ ＷＭＶＦＫＧＥＩＰＫ ＤＱＷＭＫＫＷＷＥＭ ４８０
ＫＲＥＩＶＧＶＶＥＰ ＶＰＨＤＥＴＹＣＤＰ ＡＳＬＦＨＶＳＮＤＹ ＳＦＩＲＹＹＴＲＴＬ ＹＱＦＱＦＱＥＡＬＣ ＱＡＡＫＨＥＧＰＬＨ ５４０
ＫＣＤＩＳＮＳＴＥＡ ＧＱＫＬＦＮＭＬＲＬ ＧＫＳＥＰＷＴＬＡＬ ＥＮＶＶＧＡＫＮＭＮ ＶＲＰＬＬＮＹＦＥＰ ＬＦＴＷＬＫＤＱＮＫ ６００
ＮＳＦＶＧＷＳＴＤＷ ＳＰＹＡＤＱＳＩＫＶ ＲＩＳＬＫＳＡＬＧＤ ＫＡＹＥＷＮＤＮＥＭ ＹＬＦＲＳＳＶＡＹＡ ＭＲＱＹＦＬＫＶＫＮ ６６０
ＱＭＩＬＦＧＥＥＤＶ ＲＶＡＮＬＫＰＲＩＳ ＦＮＦＦＶＴＡＰＫＮ ＶＳＤＩＩＰＲＴＥＶ ＥＫＡＩＲＭＳＲＳＲ ＩＮＤＡＦＲＬＮＤＮ ７２０
ＳＬＥＦＬＧＩＱＰＴ ＬＧＰＰＮＱＰＰＶＳ ＩＷＬＩＶＦＧＶＶＭ ＧＶＩＶＶＧＩＶＩＬ ＩＦＴＧＩＲＤＲＫＫ ＫＮＫＡＲＳＧＥＮＰ ７８０
ＹＡＳＩＤＩＳＫＧＥ ＮＮＰＧＦＱＮＴＤＤ ＶＱＴＳＦ（配列番号１０）

【0093】

以下の配列を有する、ヒトプログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ－１）：
ＭＥＤＡＫＮＩＫＫＧ ＰＡＰＦＹＰＬＥＤＧ ＴＡＧＥＱＬＨＫＡＭ ＫＲＹＡＬＶＰＧＴＩ ＡＦＴＤＡＨＩＥＶＮ ＩＴＹＡＥＹＦＥＭＳ ６０
ＶＲＬＡＥＡＭＫＲＹ ＧＬＮＴＮＨＲＩＶＶ ＣＳＥＮＳＬＱＦＦＭ ＰＶＬＧＡＬＦＩＧＶ ＡＶＡＰＡＮＤＩＹＮ ＥＲＥＬＬＮＳＭＮＩ １２０
ＳＱＰＴＶＶＦＶＳＫ ＫＧＬＱＫＩＬＮＶＱ ＫＫＬＰＩＩＱＫＩＩ ＩＭＤＳＫＴＤＹＱＧ ＦＱＳＭＹＴＦＶＴＳ ＨＬＰＰＧＦＮＥＹＤ １８０
ＦＶＰＥＳＦＤＲＤＫ ＴＩＡＬＩＭＮＳＳＧ ＳＴＧＳＰＫＧＶＡＬ ＰＨＲＴＡＣＶＲＦＳ ＨＡＲＤＰＩＦＧＮＱ ＩＩＰＤＴＡＩＬＳＶ ２４０
ＶＰＦＨＨＧＦＧＭＦ ＴＴＬＧＹＬＩＣＧＦ ＲＶＶＬＭＹＲＦＥＥ ＥＬＦＬＲＳＬＱＤＹ ＫＩＱＳＡＬＬＶＰＴ ＬＦＳＦＦＡＫＳＴＬ ３００
ＩＤＫＹＤＬＳＮＬＨ ＥＩＡＳＧＧＡＰＬＳ ＫＥＶＧＥＡＶＡＫＲ ＦＨＬＰＧＩＲＱＧＹ ＧＬＴＥＴＴＳＡＩＬ ＩＴＰＥＧＤＤＫＰＧ ３６０
ＡＶＧＫＶＶＰＦＦＥ ＡＫＶＶＤＬＤＴＧＫ ＴＬＧＶＮＱＲＧＥＬ ＣＶＲＧＰＭＩＭＳＧ ＹＶＮＤＰＥＡＴＮＡ ＬＩＤＫＤＧＷＬＨＳ ４２０
ＧＤＩＡＹＷＤＥＤＥ ＨＦＦＩＶＤＲＬＫＳ ＬＩＫＹＫＧＣＱＶＡ ＰＡＥＬＥＳＩＬＬＱ ＨＰＮＩＦＤＡＧＶＡ ＧＬＰＧＤＤＡＧＥＬ ４８０
ＰＡＡＶＶＶＬＥＨＧ ＫＴＭＴＥＫＥＩＶＤ ＹＶＡＳＱＶＴＴＡＫ ＫＬＲＧＧＶＶＦＶＤ ＥＶＰＫＧＬＴＧＫＬ ＤＡＲＫＩＲＥＩＬＩ ５４０
ＫＡＫＫＧＧＫＳＫＬ（配列番号１１）

【0094】

以下の配列を有する、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）：
ＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫ ＡＱＬＮＬＡＴＲＴＷ ＰＣＴＬＬＦＦＬＬＦ ＩＰＶＦＣＫＡＭＨＶ ＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳ ＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹ ６０
ＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲ ＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱ ＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭ ＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤ ＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮ ＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲ １２０
ＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫ ＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹ ＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹ ＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳ ＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶ ＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬ １８０
ＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬ ＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶ ＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥ ＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩ ＰＩＮ（配列番号１２）

【0095】

以下の配列を有する、ヒト４－１ＢＢ：
ＭＧＮＳＣＹＮＩＶＡ ＴＬＬＬＶＬＮＦＥＲ ＴＲＳＬＱＤＰＣＳＮ ＣＰＡＧＴＦＣＤＮＮ ＲＮＱＩＣＳＰＣＰＰ ＮＳＦＳＳＡＧＧＱＲ ６０
ＴＣＤＩＣＲＱＣＫＧ ＶＦＲＴＲＫＥＣＳＳ ＴＳＮＡＥＣＤＣＴＰ ＧＦＨＣＬＧＡＧＣＳ ＭＣＥＱＤＣＫＱＧＱ ＥＬＴＫＫＧＣＫＤＣ １２０
ＣＦＧＴＦＮＤＱＫＲ ＧＩＣＲＰＷＴＮＣＳ ＬＤＧＫＳＶＬＶＮＧ ＴＫＥＲＤＶＶＣＧＰ ＳＰＡＤＬＳＰＧＡＳ ＳＶＴＰＰＡＰＡＲＥ １８０
ＰＧＨＳＰＱＩＩＳＦ ＦＬＡＬＴＳＴＡＬＬ ＦＬＬＦＦＬＴＬＲＦ ＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬ ＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲ ＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧ ２４０
ＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥ ＧＧＣＥＬ（配列番号１３）

【0096】

以下の配列を有する、ヒトＡ型肝炎ウイルス細胞性受容体２（ＴＩＭ－３）：
ＭＦＳＨＬＰＦＤＣＶ ＬＬＬＬＬＬＬＬＴＲ ＳＳＥＶＥＹＲＡＥＶ ＧＱＮＡＹＬＰＣＦＹ ＴＰＡＡＰＧＮＬＶＰ ＶＣＷＧＫＧＡＣＰＶ ６０
ＦＥＣＧＮＶＶＬＲＴ ＤＥＲＤＶＮＹＷＴＳ ＲＹＷＬＮＧＤＦＲＫ ＧＤＶＳＬＴＩＥＮＶ ＴＬＡＤＳＧＩＹＣＣ ＲＩＱＩＰＧＩＭＮＤ １２０
ＥＫＦＮＬＫＬＶＩＫ ＰＡＫＶＴＰＡＰＴＲ ＱＲＤＦＴＡＡＦＰＲ ＭＬＴＴＲＧＨＧＰＡ ＥＴＱＴＬＧＳＬＰＤ ＩＮＬＴＱＩＳＴＬＡ １８０
ＮＥＬＲＤＳＲＬＡＮ ＤＬＲＤＳＧＡＴＩＲ ＩＧＩＹＩＧＡＧＩＣ ＡＧＬＡＬＡＬＩＦＧ ＡＬＩＦＫＷＹＳＨＳ ＫＥＫＩＱＮＬＳＬＩ ２４０
ＳＬＡＮＬＰＰＳＧＬ ＡＮＡＶＡＥＧＩＲＳ ＥＥＮＩＹＴＩＥＥＮ ＶＹＥＶＥＥＰＮＥＹ ＹＣＹＶＳＳＲＱＱＰ ＳＱＰＬＧＣＲＦＡＭ ３００
Ｐ（配列番号１４）

【0097】

以下の配列を有する、ヒトリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）：
ＭＷＥＡＱＦＬＧＬＬ ＦＬＱＰＬＷＶＡＰＶ ＫＰＬＱＰＧＡＥＶＰ ＶＶＷＡＱＥＧＡＰＡ ＱＬＰＣＳＰＴＩＰＬ ＱＤＬＳＬＬＲＲＡＧ ６０
ＶＴＷＱＨＱＰＤＳＧ ＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬ ＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳ ＳＷＧＰＲＰＲＲＹＴ ＶＬＳＶＧＰＧＧＬＲ ＳＧＲＬＰＬＱＰＲＶ １２０
ＱＬＤＥＲＧＲＱＲＧ ＤＦＳＬＷＬＲＰＡＲ ＲＡＤＡＧＥＹＲＡＡ ＶＨＬＲＤＲＡＬＳＣ ＲＬＲＬＲＬＧＱＡＳ ＭＴＡＳＰＰＧＳＬＲ １８０
ＡＳＤＷＶＩＬＮＣＳ ＦＳＲＰＤＲＰＡＳＶ ＨＷＦＲＮＲＧＱＧＲ ＶＰＶＲＥＳＰＨＨＨ ＬＡＥＳＦＬＦＬＰＱ ＶＳＰＭＤＳＧＰＷＧ ２４０
ＣＩＬＴＹＲＤＧＦＮ ＶＳＩＭＹＮＬＴＶＬ ＧＬＥＰＰＴＰＬＴＶ ＹＡＧＡＧＳＲＶＧＬ ＰＣＲＬＰＡＧＶＧＴ ＲＳＦＬＴＡＫＷＴＰ ３００
ＰＧＧＧＰＤＬＬＶＴ ＧＤＮＧＤＦＴＬＲＬ ＥＤＶＳＱＡＱＡＧＴ ＹＴＣＨＩＨＬＱＥＱ ＱＬＮＡＴＶＴＬＡＩ ＩＴＶＴＰＫＳＦＧＳ ３６０
ＰＧＳＬＧＫＬＬＣＥ ＶＴＰＶＳＧＱＥＲＦ ＶＷＳＳＬＤＴＰＳＱ ＲＳＦＳＧＰＷＬＥＡ ＱＥＡＱＬＬＳＱＰＷ ＱＣＱＬＹＱＧＥＲＬ ４２０
ＬＧＡＡＶＹＦＴＥＬ ＳＳＰＧＡＱＲＳＧＲ ＡＰＧＡＬＰＡＧＨＬ ＬＬＦＬＩＬＧＶＬＳ ＬＬＬＬＶＴＧＡＦＧ ＦＨＬＷＲＲＱＷＲＰ ４８０
ＲＲＦＳＡＬＥＱＧＩ ＨＰＰＱＡＱＳＫＩＥ ＥＬＥＱＥＰＥＰＥＰ ＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰ ＥＰＥＱＬ（配列番号１５）

【0098】

ｈＡＣＥ－２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞への侵入に必要であり、一方、ＴＭＰＲＳＳ２は細胞へのウイルスの侵入を促進する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ｈＡＣＥ－２およびＴＭＰＲＳＳ２の両方を含み得る。

【0099】

以下の配列を有する、ヒト膜貫通セリンプロテアーゼ２（ＴＭＰＲＳＳ２）：
ＭＡＬＮＳＧＳＰＰＡ ＩＧＰＹＹＥＮＨＧＹ ＱＰＥＮＰＹＰＡＱＰ ＴＶＶＰＴＶＹＥＶＨ ＰＡＱＹＹＰＳＰＶＰ ＱＹＡＰＲＶＬＴＱＡ ６０
ＳＮＰＶＶＣＴＱＰＫ ＳＰＳＧＴＶＣＴＳＫ ＴＫＫＡＬＣＩＴＬＴ ＬＧＴＦＬＶＧＡＡＬ ＡＡＧＬＬＷＫＦＭＧ ＳＫＣＳＮＳＧＩＥＣ １２０
ＤＳＳＧＴＣＩＮＰＳ ＮＷＣＤＧＶＳＨＣＰ ＧＧＥＤＥＮＲＣＶＲ ＬＹＧＰＮＦＩＬＱＶ ＹＳＳＱＲＫＳＷＨＰ ＶＣＱＤＤＷＮＥＮＹ １８０
ＧＲＡＡＣＲＤＭＧＹ ＫＮＮＦＹＳＳＱＧＩ ＶＤＤＳＧＳＴＳＦＭ ＫＬＮＴＳＡＧＮＶＤ ＩＹＫＫＬＹＨＳＤＡ ＣＳＳＫＡＶＶＳＬＲ ２４０
ＣＩＡＣＧＶＮＬＮＳ ＳＲＱＳＲＩＶＧＧＥ ＳＡＬＰＧＡＷＰＷＱ ＶＳＬＨＶＱＮＶＨＶ ＣＧＧＳＩＩＴＰＥＷ ＩＶＴＡＡＨＣＶＥＫ ３００
ＰＬＮＮＰＷＨＷＴＡ ＦＡＧＩＬＲＱＳＦＭ ＦＹＧＡＧＹＱＶＥＫ ＶＩＳＨＰＮＹＤＳＫ ＴＫＮＮＤＩＡＬＭＫ ＬＱＫＰＬＴＦＮＤＬ ３６０
ＶＫＰＶＣＬＰＮＰＧ ＭＭＬＱＰＥＱＬＣＷ ＩＳＧＷＧＡＴＥＥＫ ＧＫＴＳＥＶＬＮＡＡ ＫＶＬＬＩＥＴＱＲＣ ＮＳＲＹＶＹＤＮＬＩ ４２０
ＴＰＡＭＩＣＡＧＦＬ ＱＧＮＶＤＳＣＱＧＤ ＳＧＧＰＬＶＴＳＫＮ ＮＩＷＷＬＩＧＤＴＳ ＷＧＳＧＣＡＫＡＹＲ ＰＧＶＹＧＮＶＭＶＦ ４８０
ＴＤＷＩＹＲＱＭＲＡ ＤＧ（配列番号１６）

【0100】

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭＳ）および免疫受容体チロシン系スイッチモチーフを含有する膜貫通タンパク質であり、ＰＤ－１がＴ細胞受容体ＴＣＲシグナルを負に調節することを示唆する。したがって、ＰＤ－１シグナル伝達を遮断する薬剤は、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させ、癌を治療するために首尾よく使用されている。

【0101】

ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合し、共阻害シグナルをＴ細胞に伝達する膜貫通タンパク質である。したがって、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達を遮断する薬剤は、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させ、癌を治療するために首尾よく使用されている。

【0102】

４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、またはＴＮＦＲＳＦ９）は、Ｔ細胞のエフェクター機能を刺激するように作用する膜タンパク質である。したがって、４－１ＢＢシグナル伝達を調節する薬剤は、ヒト疾患の治療に有用であり得る。例えば、４－１ＢＢを刺激する薬剤は、腫瘍浸潤リンパ球を活性化して癌細胞を破壊するのに有用であり得、一方、４－１ＢＢシグナル伝達に拮抗する薬剤は、ヒトにおいて自己免疫を予防するか、または移植関連症状を治療するのに有用であり得る。

【0103】

ヒトＡ型肝炎ウイルス細胞性受容体２（ＴＩＭ－３）は、Ｔ細胞において阻害性分子として作用する膜貫通タンパク質である。したがって、ＴＩＭ－３シグナル伝達を低減または遮断する薬剤は、癌免疫療法に有用であり得る。

【0104】

ヒトリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）は、Ｔ細胞において阻害性分子として作用する膜貫通タンパク質である。したがって、ＬＡＧ３シグナル伝達を低減または遮断する薬剤は、癌免疫療法において有用であり得る。

【0105】

いくつかの実施形態では、細胞によって分泌される異種試験ペプチドは、ウイルスを中和するかまたは細胞機能を変化させてウイルス感染を予防し得る任意のタンパク質を含む。例示的な分泌タンパク質には、インターフェロンバリアント、グリフィシン、ペプチド、受容体トラップ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の可溶性ＡＣＥ２バリアント、またはＨＩＶ－１の可溶性ＣＤ４バリアント）が含まれ得る。

【0106】

スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、方法は、異種試験ポリペプチドをコードする核酸を増幅および／または配列決定することをさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、レポーター分子を発現する細胞が、当該分野で公知の方法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズ濃縮によってレポーター分子を発現しない細胞から分離され得、各群を配列決定して、所与のシステムにおけるレポーターの発現または発現の欠如に関連する異種試験ポリペプチドをコードする配列のライブラリーを作製する。

【0107】

いくつかの実施形態では、レポーター分子は核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列はバーコード配列を含む。本明細書で使用される場合、「バーコード」または「バーコード配列」は、特定の状態、例えば細胞表面タンパク質のライゲーションを識別するために使用される固有のヌクレオチド配列を指す。バーコード配列は、適切には、バーコードが容易に識別できるように発現される細胞に存在するゲノム、トランスクリプトーム、外因性発現ベクターなどには見られない配列を含む。

【0108】

本技術は、特定の細胞型または特定の細胞株に限定されず、原核細胞（例えば、細菌）、酵母、哺乳動物、鳥類、魚類、または植物細胞を含む任意の適切な細胞が、ウイルス感染中和アッセイおよびポリペプチド－受容体活性（例えば、抗体、リガンド、受容体、アゴニスト、アンタゴニストなど）の試験の両方に使用され得る。本明細書に開示されるスクリーニングアッセイ、例えば中和アッセイに有用な例示的な非限定的細胞株には、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ－７ ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＨＥＫ２９３、ＨＴ－１０８０、Ｈｕｈ－７、ＰＥＲ．Ｃ６、およびそれらのバリアントなどが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞株、例えばＲａｊｉ、ＡＲＨ－７７、ＭＯＰＣ－３１５、ＭＯＰＣ－２１、その他を使用することができる。

【0109】

例として、いくつかの実施形態では、昆虫細胞を、昆虫細胞と適合性のレポーターと共に使用することができる。いくつかの実施形態では、レポーターは、昆虫細胞ウイルスによって誘導され得る。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、細菌細胞と適合性のレポーターと共に使用され得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、バクテリオファージ感染によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物細胞と適合性のレポーターと共に使用され得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、植物細胞ウイルスによって誘導され得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞に適合するレポーター、例えば蛍光マーカー、酵素、タグ付きタンパク質、または核酸の発現と共に使用され得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、レポーターは、哺乳動物細胞ウイルスによって誘導され得る。

【0110】

いくつかの実施形態では、アッセイ読み出しはフルオロフォア発現であり得る。いくつかの実施形態において、アッセイ読み出しは、次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）ＮＧＳベースのシグナルまたは集積化ＮＧＳバーコードに基づいてもよい。いくつかの実施形態では、アッセイ読み出しは、細胞増殖または細胞死であり得る。

【0111】

いくつかの例では、選択マーカーを使用して、抗体および／またはウイルス侵入受容体をコードする核酸で形質転換された細胞を選択することができる。

【0112】

本明細書で使用される場合、「選択マーカー」は、選択マーカーをコードする核酸および目的の核酸を含む所望の核酸を発現する細胞の選択を可能にする任意の分子を指す。例えば、一実施形態では、本開示の細胞は、抗体をコードし、蛍光分子、例えば蛍光タンパク質（選択マーカー）をコードする核酸を含む核酸を発現する。したがって、前述の例では、所望の核酸を発現している細胞を、その核酸を発現していない細胞から当該分野で公知の蛍光分子を発現している細胞を分離する方法、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して分離することができる。選択マーカーを発現している細胞を分離する他の方法は、当技術分野で公知であり、限定されないが、抗体および磁気ビーズ分離を含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、目的の核酸を発現している細胞に生存優位性を付与する。例えば、いくつかの実施形態では、選択マーカーは、抗生物質、例えばブラストサイジン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ｚｅｏｃｉｎ、Ｇ４１８／ジェネテシン、または^（１）その他に対する耐性を付与する。したがって、耐性を付与する分子が目的の核酸にコードされている抗生物質で細胞を処理すると、目的の核酸を発現している細胞を選択し、したがって選択マーカーとして作用する。

【0113】

したがって、いくつかの実施形態では、レポーターは選択マーカーを含む。しかしながら、レポーターは、いくつかの実施形態において、選択マーカーを含み得るが、レポーターは、開示された組成物またはキットを使用して開示された方法を実施する当業者に、レポーターが発現される細胞の状態の変化、例えば、ウイルスによる感染、細胞シグナル伝達事象の存在、細胞シグナル伝達事象の欠如などを示すように機能する。

【0114】

いくつかの実施形態では、タンパク質またはペプチドバリアントのライブラリーからの最適なタンパク質またはペプチド機能の選択を可能にする、細胞によって発現される選択マーカーが使用され得る。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質機能の選択マーカーは、細胞株で通常発現されない蛍光タンパク質であり得、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）などを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、選択マーカーは、親和性に基づく選択のために表面タンパク質の発現を誘導し得、いくつかの例には、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ３４および他の表面タンパク質が含まれ得る。他の実施形態では、選択マーカーは、細胞生存を可能にする酵素を含み得、これらに限定されないが、アポトーシス経路遺伝子、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、抗生物質耐性マーカー、ブレオマイシン、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、または^（１）その他を含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、染色体変化をもたらすＣｒｅ－ｌｏｘまたはＣＲＩＳＰＲ遺伝子活性化の結果として読み取られ得る。いくつかの実施形態では、インテグラーゼを使用して、ライブラリーをクローニングするために遺伝子を細胞に挿入することができる。他の実施形態では、安定な細胞プールを使用して、トランスフェクトされたプラスミドからライブラリーを生成することができる。他の実施形態では、分泌タンパク質ライブラリーは、インテグラーゼを使用して生成され得る。他の実施形態では、分泌タンパク質ライブラリーは、トランスポザーゼを使用して生成され得る。いくつかの実施形態では、アッセイの読み出しは、スクリーニング後の細胞集団の配列決定に基づいてもよい。いくつかの実施形態では、そのアッセイ読み出しは、抗体またはウイルス感染バリアントそれぞれの固有の識別子として、抗体および／またはウイルスまたはウイルス感染モデルによってコードされるＤＮＡバーコードの同定を含み得る。他の実施形態では、アッセイの読み出しは、蛍光マーカー、およびフローサイトメトリーによる選別に基づいてもよい。

【0115】

いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチドは抗体バリアントであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の形式：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ２’のうちの１つ以上のものであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性抗体であり得る。他の実施形態では、抗体は三重特異性抗体であり得る。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、抗体天然重：軽^{（２，３，４）}対を含み得る。

【0116】

いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチドは、ランダムに対になった重鎖および軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体の重：軽の発現は、同じｍＲＮＡ転写物上にあり得る。他の実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖は、別々のｍＲＮＡ上で発現され得る。いくつかの実施形態では、重鎖ｍＲＮＡと軽鎖ｍＲＮＡ^（３）との間に双方向プロモーターを使用することができる。

【0117】

いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチドは、天然ヒト免疫ライブラリーのスクリーニングによって開発されたヒト患者由来の抗体遺伝子ライブラリーに見られる抗体を含む。他の実施形態では、抗体遺伝子ライブラリーは、マウス、トランスジェニックマウス、ラクダ（ｃａｍｅｌｌｉｄ）、サメ、非ヒト霊長類、モルモット、または他の動物を含む動物源に由来し得る。いくつかの実施形態では、抗体遺伝子ライブラリーを合成的に生成することができる。特定の実施形態では、ライブラリーは、（例えば、標的変異誘発、部位飽和変異誘発、ＤＮＡシャッフリング、エラープローンＰＣＲ、体細胞超変異、または他の多様性導入機構によって）多様性が導入された、合成的に生成されたライブラリーを含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質ライブラリーは、既知の活性を有する抗体遺伝子に基づいてもよい。いくつかの実施形態では、開示されるスクリーニング方法を使用して、既知のベースライン活性を有する抗体に由来する多様化ライブラリーの改善された効力、選択性、または幅を選択することができる。いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチドは、マウス、非ヒト霊長類、モルモット、フェレット、ブタおよびヒトを含むがこれらに限定されない任意の種によって発現される細胞受容体にアゴナイズするか、または拮抗する能力について選択され得る。

【0118】

いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチドまたは異種試験ポリペプチドライブラリーバリアントは、いくらかのベースライン活性を有し得、記載される機能的スクリーニングは、その効力、選択性または活性の幅を改善するために使用される。いくつかの実施形態では、出発タンパク質またはペプチドライブラリーは、特徴付けられていない活性を有し得、本明細書に記載の機能アッセイを使用して、タンパク質またはペプチドライブラリー中のバリアントの機能活性を特徴付け、所望の機能的バリアントを選択する。

【0119】

いくつかの実施形態では、細胞は、選択ラウンドの間に分泌ポリペプチド（異種試験ポリペプチド）に遺伝的多様性を導入するように操作され得る。遺伝的多様性を導入するためのいくつかの機構が当業者に公知であり、活性化誘導シチジンデアミダーゼ（ＡＩＤ）の発現、エラープローンポリメラーゼの発現、または直交性プラスミド複製システムの使用が含まれる。

【0120】

いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチド発現プロモーターを変更して分泌タンパク質濃度を調節することができ、その場合、より強いプロモーターが分泌濃度に影響を及ぼす。より弱いプロモーターを使用して、より強力な分泌タンパク質選択を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、タンパク質分泌の時間量を変化させて、同様に分泌タンパク質濃度を調整することができる。いくつかの実施形態では、例として、ウイルスの添加前のインキュベーション時間を短くすると、上清中の可溶性ポリペプチド濃度を低下させ、それにより、より強力に活性または保護性な分泌分子を選択することができる。

【0121】

いくつかの実施形態では、レポーター（例えば、ＧＦＰ発現）をもたらす機能アッセイは、ウイルス感染に由来してもよく、アッセイは、細胞によって発現および分泌される異種ポリペプチドが抗体または抗原結合断片である、ウイルス中和アッセイを含む。

【0122】

いくつかの実施形態において、機能アッセイは、細胞受容体（例えば、Ｇタンパク質共役受容体、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、アポトーシスマーカー、免疫調節剤、例えばＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ、４－１ＢＢ、またはその他）を介した結合および活性化またはシグナル伝達を含み得る。そのような実施形態では、機能アッセイは、細胞受容体を活性化し、シグナル伝達を誘導することができる分泌タンパク質のスクリーニングを含み得る。シグナル伝達事象は、所望の細胞受容体活性化に対する分泌タンパク質の機能的効果の読み出しを可能にする任意のレポーター（例えば、蛍光タンパク質発現、アポトーシスマーカー、細胞表面マーカー発現、Ｃｒｅ－ＬｏｘもしくはＣＲＩＳＰＲ発現、またはｍＲＮＡベースのマーカー）に連結され得る。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、活性化部分（例えば、細胞によって天然に産生されるか、細胞によって産生されるように操作されるか、または細胞と接触するように添加されるリガンド）の存在下で表面受容体を遮断し、その活性化を防止し、結果として機能的読み出し、例えばレポーターが生じる。他の実施形態では、分泌タンパク質は、表面受容体を直接活性化し得る。

【0123】

いくつかの実施形態では、分泌されたタンパク質の機能的スクリーニングのために、単一細胞を区画に単離する。いくつかの実施形態では、区画は９６または３８４ウェルプレートであり得る。いくつかの実施形態では、区画は、印刷された^{（４，５）}マイクロウェル、オープンマイクロチャンバ、またはＮａｎｏｐｅｎ（商標）であってもよい。Ｎａｎｏｐｅｎは、アレイ状に配置されたナノライタースケールのウェルを含む細胞含有デバイスであり、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔ社から購入可能である。他の実施形態では、区画は、エマルジョン^（６）液滴であり得る（例えば、図１５、図１６、図１８、図２８、および図２９を参照されたい）。いくつかの実施形態では、一定の時間が経過して所望の分泌試験ポリペプチドが液滴内に蓄積した後に、追加の試薬を区画に添加することができる。ウェルプレートでは、流体添加によって試薬添加が起こり得る。印刷された^{（４，５）}マイクロウェル、オープンマイクロチャンバ、またはＮａｎｏｐｅｎ（商標）では、試薬添加は、非封止区画の近くでの洗浄または流体フローによって達成され得る。エマルジョン液滴では、液滴の混同によって試薬の添加が起こり得る。いくつかの実施形態では、液滴混同は、電気融合（実施例２６、図２９を参照されたい）、印刷されたピラー抵抗、または誘導された液滴融合の他の手段によって達成され得る。特定の実施形態では、分泌タンパク質バリアントを含むライブラリー細胞の最初の封入後の試薬の添加は必要ない場合がある。

【0124】

いくつかの実施形態では、区画に添加される試薬は、ウイルスまたは偽ウイルスを含有し得、その場合、アッセイはウイルス中和アッセイであり得る。いくつかの実施形態では、単一のウイルスまたは偽ウイルスのみが添加され得る。他の実施形態では、複数のウイルスまたはウイルスバリアントを加えてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスまたは偽ウイルスは、感染ウイルスを同定するために異なる選択マーカーでバーコード化され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスまたは偽ウイルスは、１つまたは複数の異なる蛍光マーカー、ＤＮＡバーコード、または細胞表面タンパク質でバーコード化、タグ付け、または標識され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスまたは偽ウイルス感染は細胞死を引き起こし得、ウイルスまたは偽ウイルスを中和する保護的分泌タンパク質をコードする細胞のみがアッセイ後に生存することができる。

【0125】

抗体工学および発見における長年の課題は、膜タンパク質に対するアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体を同定する必要性である。膜タンパク質相互作用を使用して細胞挙動を操作することは、癌生物学および自己免疫疾患治療を含む現代医学における重要な目標である。重要な膜タンパク質標的のいくつかの例としては、表面マーカー４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、およびイオンチャネルが挙げられる。膜タンパク質を標的とする抗体の発見に対する最大の課題のうちの２つには、１）膜タンパク質は、可溶性形式で発現されると天然ではないので、膜結合タンパク質の可溶性バージョンを発現および精製する能力、および２）単に結合についてスクリーニングするのではなく、^（７）タンパク質の天然の膜結合バージョンに結合する抗体の機能についてスクリーニングすることは技術的に複雑であること、が含まれる。同じ細胞における分泌試験タンパク質発現を標的タンパク質の膜表面発現として関連付けるための本記載のアプローチは、スクリーニングのために非天然可溶化形式で膜タンパク質を発現および精製する必要がなく、また、細胞ベースの活性化マーカー（蛍光マーカー発現またはルシフェラーゼ発現など）の使用が、単一細胞によって分泌される試験タンパク質の機能活性の直接的な読み出しを提供することができるので、これらの２つの従来の課題に見事に対処する。したがって、分泌タンパク質分析のための本明細書に記載のアプローチは、表面タンパク質、ならびに４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、およびイオンチャネルなどの受容体を含む、重要な膜標的に使用することができる。

【0126】

いくつかの実施形態では、分泌タンパク質活性は、受容体活性のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。特定の実施形態では、試薬は、区画に添加されてもよく、例えば受容体アゴニスト、例えばＰＤ－１受容体に対するＰＤ－Ｌ１であってもよい。他の実施形態では、区画に添加される試薬は、結合時に受容体活性化を防止する受容体アンタゴニストであり得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、受容体活性化をレポーター発現、例えば蛍光部分発現と関連させて、タンパク質受容体活性を調節する抗体を分泌する能力について細胞をスクリーニングする。蛍光シグナル、ルシフェラーゼシグナル、または受容体活性を示す他のシグナルを含む受容体活性化レポーターを有する特定の細胞株が生成され、それらは分析および選択のために分泌タンパク質のライブラリーで適切に形質転換されると、この目的のために使用され得る。

【0127】

以下は、本出願の態様を利用し得る、または本出願の態様によって利用され得るアッセイのセットである。アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ社などの様々な会社から購入可能であり得る。膜結合タンパク質および／または分泌タンパク質の検出および／または特徴付けに使用されるアッセイの例は、４－１ＢＢアッセイである。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである４－１ＢＢ（ＣＤ１３７／ＴＮＦＲＳＦ９）は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および自然免疫細胞集団上に発現される誘導性共刺激受容体である。細胞表面上に存在する場合、４－１ＢＢは４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）と相互作用し、特にＴ細胞およびＮＫ細胞において、その後の細胞増殖ならびにインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）の産生を誘導する。膜結合タンパク質および／または分泌タンパク質の検出および／または特徴付けに使用されるアッセイの別の例は、ＯＸ４０アッセイである。ＯＸ４０バイオアッセイは、ＯＸ４０を結合して活性化することができるリガンドまたはアゴニスト抗体の効力および安定性を測定する、生物発光細胞に基づくアッセイである。ＯＸ４０（ＣＤ１３４／ＴＮＦＲＳＦ４）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーであり、主に活性化Ｔ細胞上、より少ない程度で好中球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現される共刺激受容体である。細胞表面に存在する場合、ＯＸ４０は、特にＴ細胞において、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）と相互作用し、その後の細胞増殖、生存およびサイトカインの産生を誘導する。

【0128】

膜結合タンパク質および／または分泌タンパク質の検出および／または特徴付けに使用されるアッセイの別の例は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アッセイである。ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞上に発現される免疫阻害性受容体であり、腫瘍抗原および自己抗原に対する免疫応答を調節するのに重要な役割を果たす。ＰＤ－１の、隣接細胞上のそのリガンド、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２のいずれかによる係合は、ＴＣＲシグナル伝達およびＴＣＲ媒介増殖、転写活性化およびサイトカイン産生を阻害する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するように設計された治療用抗体およびＦｃ融合タンパク質は、様々な癌の治療のための臨床試験において有望な結果を示す。膜結合タンパク質および／または分泌タンパク質の検出および／または特徴付けに使用されるアッセイの別の例は、ＣＴＬＡ－４アッセイである。ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、構成的に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上に発現され、活性化Ｔ細胞において上方制御される免疫阻害性受容体である。ＣＴＬＡ－４は、腫瘍抗原および自己抗原に対する免疫応答の調節において重要な役割を果たす。ＣＴＬＡ－４発現がＴ細胞の表面上で上方制御されると、Ｔ細胞はより高いアビディティーでＢ７に結合し、したがってＣＤ２８からの正の共刺激シグナルを打ち負かす。さらに、ＣＴＬＡ－４の、隣接する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のそのリガンド、ＣＤ８０（Ｂ７－１）またはＣＤ８６（Ｂ７－２）のいずれかによる係合は、Ｔ細胞活性化、細胞増殖およびサイトカイン産生のＣＤ２８共刺激を阻害する。

【0129】

膜結合タンパク質および／または分泌タンパク質の検出および／または特徴付けに使用されるアッセイの別の例は、ＬＡＧ－３／ＭＨＣＩＩ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙアッセイである。ＬＡＧ－３／ＭＨＣＩＩ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙは、ＬＡＧ－３とその最良に特徴付けられたリガンドである主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）との相互作用を遮断するように設計された抗体および他の生物製剤の効力および安定性を測定する生物発光細胞に基づくアッセイである。ＣＤ２２３としても知られるＬＡＧ－３は、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現される免疫チェックポイント受容体である。ＬＡＧ－３は、腫瘍抗原および自己抗原に対する免疫応答の調節において重要な役割を果たす。ＭＨＣＩＩによるＬＡＧ－３の係合は、ＴＣＲシグナル伝達、サイトカイン産生および活性化Ｔ細胞の増殖を阻害する。ＬＡＧ－３／ＭＨＣＩＩ相互作用を遮断するように設計された治療用抗体は、様々な癌の治療のための臨床試験において有望な結果を示す。

【0130】

［組成物］

【0131】

本開示の一態様では、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、単離され、遺伝子操作された単一の細胞を含み、細胞は、細胞表面タンパク質を提示し、細胞は、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化する場合にレポーター分子を発現するように操作される。

【0132】

いくつかの実施形態では、組成物は、単離され、遺伝子操作された単一の細胞を含み、細胞は、細胞表面タンパク質を提示し、細胞は、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しない場合にレポーター分子を発現するように操作される。

【0133】

いくつかの実施形態では、組成物は、単離され、遺伝子操作された単一の細胞、および場合により試験試薬を含み、細胞は、細胞表面タンパク質を提示し、細胞は、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドまたは試験試薬のうちの１つが細胞表面タンパク質を活性化する場合にレポーター分子を発現するように操作される。

【0134】

いくつかの実施形態では、組成物は、単離され、遺伝子操作された単一の細胞、および場合によりレポーター分子を含む試験試薬を含み、細胞は細胞表面タンパク質を提示し、試験試薬は、細胞によって提示される細胞表面タンパク質に結合し、試薬－受容体複合体を形成することができ、試薬－受容体複合体が形成されると、試験試薬が細胞への侵入を獲得し、細胞は、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌するように操作される。

【0135】

いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、植物細胞または細菌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞を含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、内因性受容体を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞表面タンパク質を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、異種タンパク質を含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、試験ポリペプチドの分泌は構成的である。いくつかの実施形態では、試験ポリペプチドの分泌は誘導性である。

【0138】

いくつかの実施形態では、単離され、遺伝子操作された単一の細胞は、マルチウェルプレートのウェル内にある。いくつかの実施形態では、単離され、遺伝子操作された単一の細胞は、マイクロチップのチャンバ内にある。いくつかの実施形態では、単離され、遺伝子操作された単一の細胞は、エマルジョン液滴などのマイクロ流体液滴中にある。いくつかの実施形態では、単離され、遺伝子操作された単一の細胞は、Ｎａｎｏｐｅｎ（商標）内にある。

【0139】

いくつかの実施形態では、レポーター分子は、蛍光マーカー、酵素、タグ付きタンパク質、または核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、レポーター分子は核酸配列、場合によりバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、レポーター分子は蛍光部分を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、異種試験ペプチドは、受容体リガンドのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、リガンドバリアントのライブラリーに由来する。いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチドは、潜在的な受容体アゴニストまたはアンタゴニストを含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、試験試薬は、受容体活性化のアゴニストまたはアンタゴニストを含む。いくつかの実施形態では、試験試薬は細胞表面タンパク質リガンドを含み、異種試験ポリペプチドは、受容体活性化の潜在的アゴニストまたはアンタゴニストのライブラリーに由来する。

【0142】

いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチドは、抗体、ＶＨＨ（例えば、ノノボディ（ｎｏｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれる重鎖のみの抗体の抗原結合断片）またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片のライブラリーに由来する。

【0143】

いくつかの実施形態において、試験試薬はウイルスを含み、細胞表面タンパク質は細胞へのウイルス侵入の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、インフルエンザＡ、Ｂ、またはＣから選択される１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および黄熱ウイルスから選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含み、細胞表面タンパク質はヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、膜貫通セリンプロテアーゼ２（ＴＭＰＲＳＳ２）を発現するように操作される。

【0144】

いくつかの実施形態では、細胞はまた、選択ラウンドの間に異種試験ポリペプチドに新たな遺伝子多様性を導入するように操作される。遺伝的多様性を導入するためのいくつかの機構が当業者に公知であり、活性化誘導シチジンデアミダーゼ（ＡＩＤ）の発現、エラープローンポリメラーゼの発現、または直交性プラスミド複製システムの使用が含まれる。

【0145】

［キット］

【0146】

本開示の別の態様では、キットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、（ａ）細胞内の異種試験ポリペプチドの発現のためのベクター；（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞上に提示される細胞表面タンパク質を活性化すると活性化されるベクターを含み、ベクターの１つ以上は発現ベクターであるか、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。

【0147】

いくつかの実施形態では、キットは、（ａ）細胞中の異種試験ポリペプチドの発現のためのベクター；（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しないと活性化されるベクターを含み、ベクターの１つ以上は発現ベクターであるか、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。

【0148】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）試験試薬；および（２）（ａ）細胞中の異種試験ポリペプチドの発現のためのベクター；（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、異種試験ポリペプチドまたは試験試薬のいずれかが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化されるベクターを含み、ベクターの１つ以上は発現ベクターであるか、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。

【0149】

いくつかの実施形態において、キットは、（１）レポーター分子を含む試験試薬、および（２）（ａ）細胞において試験ポリペプチドを発現させるためのベクターであって、発現ベクターであってもよく、またはインテグレーションベクターであってもよいベクターを含む。

【0150】

いくつかの実施形態では、キットは、追加的または代替的に、（ｃ）細胞表面タンパク質の発現のための１つまたは複数のベクターを含む。いくつかの実施形態では、異種試験ポリペプチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、レポーター分子は蛍光マーカーおよびバーコードのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、レポーター分子は誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、試験試薬はウイルスまたは偽ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、およびインフルエンザＡ、Ｂ、またはＣの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および黄熱ウイルスから選択される。いくつかの実施形態では、偽ウイルスは、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣもしくはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、またはインフルエンザＡ、ＢもしくはＣの１つ以上に由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、偽ウイルスは、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、または黄熱ウイルスに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、異種試験ペプチドは、抗体またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、異種試験ペプチドは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）またはナノボディである。

【0151】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化される核酸を含む遺伝子操作された細胞を含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しない場合に活性化される核酸を含む遺伝子操作された細胞を含む。

【0153】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化される核酸を含む、遺伝子操作された細胞、および場合により（３）試験試薬を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、キットは、（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）遺伝子操作された細胞、（３）レポーター分子を含む試験試薬であって、細胞によって提示される細胞表面タンパク質に結合し、試薬－受容体複合体を形成することができ、試薬－受容体複合体が形成されると、細胞へ侵入することができる、試験試薬を含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、（ｃ）異種細胞表面タンパク質をコードする核酸をさらに含む。

【0156】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、ベクター上にコードされた目的の核酸配列を発現するために使用されるベクターを指す。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、核酸をＲＮＡ産物として発現する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ発現産物はポリペプチドまたはタンパク質へと翻訳される。

【0157】

本明細書で使用される場合、「インテグレーションベクター」は、目的のヌクレオチド配列を標的細胞のゲノムに組み込むために使用されるベクターを指す。核酸を細胞のゲノムに組み込む例示的な方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ベースの相同組換え、レトロウイルスまたはレンチウイルス形質導入である。

【0158】

［例示的な実施形態］

【0159】

分泌タンパク質のライブラリーの機能的スクリーニングに有用なシステム、キット、方法および組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、システム、キット、方法および／または組成物は、１つ以上の試験ポリペプチドを発現し、１つ以上のレポーター分子を条件付きで発現することができる１つ以上の操作された細胞を含む。以下に説明する実施形態は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
１．タンパク質またはペプチド発見のためのアッセイであって、
ａ．各々が分泌タンパク質またはペプチドバリアントをコードする、細胞のライブラリーが生成され、
ｂ．各細胞が区画に隔離され、
ｃ．ライブラリー中のコードされたバリアントペプチドまたはタンパク質各々の機能活性が、タンパク質またはペプチドバリアントを分泌する細胞の分析に基づいて分析される、アッセイ。
２．１，０００個超の細胞が同時にスクリーニングされる、上記。
３．１０，０００個超の細胞が同時にスクリーニングされる、上記。
４．タンパク質またはペプチド分泌細胞の分析が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、および他の蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない蛍光タンパク質発現の検出を含む、上記のいずれか。
５．タンパク質またはペプチド分泌細胞の分析が、ルシフェラーゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼを含むがこれらに限定されない酵素発現の検出を含む、上記のいずれか。
６．タンパク質またはペプチド分泌細胞の分析が、そのタンパク質をコードする核酸の検出を含む、上記のいずれか。
７．タンパク質またはペプチド分泌細胞の分析が、タンパク質またはペプチド分泌細胞に関連する核酸配列の検出を含む、上記のいずれか。
８．核酸配列またはバーコードが分泌タンパク質またはペプチドバリアントを示す、上記のいずれか。
９．核酸配列またはバーコードがウイルスまたは偽ウイルス感染事象を示す、上記のいずれか。
１０．検出されるタンパク質機能がウイルス中和である、上記のいずれか。
１１．区画がエマルジョン液滴、印刷マイクロウェル、ｎａｎｏｐｅｎ、９６ウェルプレート、または３８４ウェルプレートを含む、上記のいずれか。
１２．機能活性がウイルス感染を遮断する能力である、上記のいずれか。
１３．機能活性が、タンパク質を分泌する同じ細胞における受容体活性化に基づく、上記のいずれか。
１４．機能活性が、タンパク質を分泌する同じ細胞における受容体不活性化に基づく、上記のいずれか。
１５．タンパク質分泌、およびウイルス感染の機能アッセイの両方が可能な細胞ライブラリーの生成。
１６．タンパク質分泌、および操作された受容体活性の機能分析の両方が可能な細胞ライブラリーの生成。
１７．分泌タンパク質が抗体、Ｆａｂ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’２、Ｆａｂ２’、ＶＨＨ、または他の抗体または免疫グロブリン発現形式である、上記のいずれか。
１８．ＤＮＡバーコードを使用して分泌タンパク質の配列を追跡することができる、上記のいずれか。
１９．ＤＮＡバーコードを使用してウイルスまたは偽ウイルス感染事象を追跡することができる、上記のいずれか。
２０．ウイルス中和アッセイの読み出しが、ウイルス、偽ウイルス、ウイルス様粒子または組換えウイルス粒子による細胞へのＤＮＡの挿入である、上記のいずれか。
２１．挿入されたＤＮＡがＤＮＡバーコードを含む、上記のいずれか。
２２．ウイルス中和アッセイの読み出しが、ウイルス、偽ウイルス、ウイルス様粒子または組換えウイルス粒子による蛍光マーカーの発現である、上記のいずれか。
２３．ウイルス中和アッセイの読み出しが、ウイルス、偽ウイルス、ウイルス様粒子または組換えウイルス粒子による表面タンパク質レポーターの発現である、上記のいずれか。
２４．ウイルス中和アッセイの読み出しが、ウイルス、偽ウイルス、ウイルス様粒子または組換えウイルス粒子による成長選択マーカーの発現である、上記のいずれか。
２５．操作された受容体アゴニズムまたはアンタゴニズムの読み出しが、ウイルス、偽ウイルス、ウイルス様粒子または組換えウイルス粒子による蛍光マーカーの発現である、上記のいずれか。
２６．操作された受容体アゴニズムまたはアンタゴニズムの読み出しが、ウイルス、偽ウイルス、ウイルス様粒子または組換えウイルス粒子による表面タンパク質レポーターの発現である、上記のいずれか。
２７．操作された受容体アゴニズムまたはアンタゴニズムの読み出しが、ウイルス、偽ウイルス、ウイルス様粒子または組換えウイルス粒子による成長選択マーカーの発現である、上記のいずれか。
２８．細胞が哺乳動物細胞である、上記のいずれか。
２９．細胞が昆虫細胞である、上記のいずれか。
３０．細胞が植物細胞である、上記のいずれか。
３１．細胞が細菌細胞である、上記のいずれか。
３２．（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することを含むスクリーニング方法であって、細胞が細胞表面タンパク質を提示し、細胞が、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化する場合にレポーター分子を発現するように操作される。
３３．（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することを含むスクリーニング方法であって、細胞が細胞表面タンパク質を提示し、細胞が、（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しない場合にレポーター分子を発現するように操作される。
３４．（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞を試験試薬と接触させる工程であって、細胞が細胞表面タンパク質を提示し、細胞が（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌し、（ｉｉ）試験ポリペプチドまたは試験試薬のうちの１つが細胞表面タンパク質を活性化するとレポーター分子を発現するように操作されている工程、（ｂ）レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出する工程を含む、スクリーニング方法。
３５．（ａ）単離され、遺伝子操作された単一の細胞をレポーター分子を含む試験試薬と接触させる工程であって、細胞が細胞表面タンパク質を提示し、試験試薬が、細胞によって提示される細胞表面タンパク質に結合し、試薬－タンパク質複合体を形成することができ、試薬－受容体複合体が形成されると、試験試薬が細胞への侵入を獲得し、細胞が（ｉ）異種試験ポリペプチドを分泌するように操作されている工程；（ｂ）細胞におけるレポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出する工程を含む、スクリーニング方法。
３６．細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、植物細胞または細菌細胞を含む、実施形態３２～３５のいずれかに記載の方法。
３７．細胞表面タンパク質が内因性受容体を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法。
３８．細胞が、細胞表面タンパク質を発現するように操作される、前述の実施形態のいずれかに記載の方法。
３９．細胞表面タンパク質が異種受容体を含む、実施形態３８記載の方法。
４０．試験ポリペプチドの分泌が構成的である、前述の実施形態のいずれかに記載の方法。
４１．試験ポリペプチドの分泌が誘導性である、実施形態３２～３９のいずれかに記載の方法。
４２．単離され、遺伝子操作された単一の細胞が、マルチウェルプレートのウェル内にある、前述の実施形態のいずれかに記載の方法。
４３．単離され、遺伝子操作された単一の細胞が、マイクロチップのチャンバ内にある、実施形態３２～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．単離され、遺伝子操作された単一の細胞が、エマルジョン液滴などのマイクロ流体液滴中にある、実施形態３２～４２のいずれか１つに記載の方法。
４５．単離され、遺伝子操作された単一の細胞が、Ｎａｎｏｐｅｎ（商標）内にある、実施形態３２～４２のいずれか１つに記載の方法。
４６．レポーター分子が、蛍光マーカー、酵素、タグ付きタンパク質、または核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４７．細胞がヒト細胞を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４８．レポーター分子が、核酸配列、場合によりバーコード配列を含み、レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することが、増幅反応および配列決定反応、場合により単一細胞配列決定反応の１つまたは複数を含む、前述の実施形態のいずれかに１つ記載の方法。
４９．レポーター分子が蛍光部分を含み、レポーター分子の発現の存在および／またはレベルを検出することが蛍光活性化細胞を選別することを含む、実施形態３２～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．異種試験ポリペプチドをコードする核酸を配列決定することをさらに含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５１．異種試験ペプチドが受容体リガンドのバリアントを含む、実施形態１～３または５～１９のいずれか１つに記載の方法。
５２．バリアントがリガンドバリアントのライブラリーに由来する、実施形態５１に記載の方法。
５３．試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質リガンドのバリアントを含み、試験試薬が野生型リガンドによる受容体活性化のアゴニストまたはアンタゴニストを含む、実施形態３、または５～１９のいずれか１つに記載の方法。
５４．試験試薬が細胞表面タンパク質リガンドを含み、試験ポリペプチドが、リガンドによる受容体活性化の潜在的アゴニストまたはアンタゴニストのライブラリーに由来する、実施形態３、または５～１９のいずれか１つに記載の方法。
５５．試験ポリペプチドが、抗体、抗体由来形式、ナノボディ、ＶＨＨ、またはその抗原結合断片を含む、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
５６．抗体または抗体由来形式、ナノボディ、ＶＨＨ、抗原結合断片が、抗体または抗原結合断片のライブラリーに由来する、実施形態２４に記載の方法。
５７．試験試薬が、ウイルス、ウイルス様粒子、偽ウイルスおよび組換えウイルス粒子のうちの１つまたは複数を含み、細胞表面タンパク質が、細胞へのウイルス侵入の構成要素を含む、実施形態４、５～１９または２４～２５のいずれかに記載の方法。
５８．ウイルスが、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣまたはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、インフルエンザＡ、ＢまたはＣから選択される、実施形態２６記載の方法。
５９．ウイルスが、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エスプタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、および黄熱ウイルスから選択される、実施形態２６に記載の方法。
６０．ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含み、細胞表面タンパク質がヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）を含む、実施形態２６に記載の方法。
６１．細胞が、膜貫通セリンプロテアーゼ２（ＴＭＰＲＳＳ２）を発現するように操作される、実施形態２９に記載の方法。
６２．前述の実施形態のいずれかの遺伝子操作された細胞を含む組成物、キットまたはシステム。
６３．（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクター；（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化されるベクターを含むキットであって、ベクターの１つ以上は発現ベクターであってもよく、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。
６４．（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクター；（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しないと活性化されるベクターを含むキットであって、ベクターの１つ以上は発現ベクターであってもよく、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。
６５．（１）試験試薬、および（２）（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクター；（ｂ）レポーター分子をコードするベクターであって、その発現が、異種試験ポリペプチドまたは試験試薬のいずれかが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化されるベクターを含むキットであって、ベクターの１つ以上は発現ベクターであってもよく、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。
６６．（１）レポーター分子を含む試験試薬、および（２）（ａ）異種試験ポリペプチドをコードするベクターを含むキットであって、ベクターの１つ以上は発現ベクターであってもよく、またはベクターの１つ以上はインテグレーションベクターであってもよい。
６７．１つ以上の核酸が、（ｃ）細胞表面タンパク質をさらにコードする、実施形態３６～３５のいずれか１つに記載のキット。
６８．異種試験ポリペプチドがプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態６３～６６のいずれか１つに記載のキット。
６９．プロモーターが構成的プロモーターである、実施形態６８に記載のキット。
７０．プロモーターが誘導性プロモーターである、実施形態６８に記載のキット。
７１．レポーター分子が、蛍光マーカー、酵素、タグ付きタンパク質、または核酸配列を含む、実施形態６３～７０のいずれかに記載のキット。
７２．試験試薬が、ウイルス、ウイルス様粒子、偽ウイルス、および組換えウイルス粒子の１つまたは複数を含む、実施形態６６～７１のいずれかに記載のキット。
７３．ウイルスが、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣまたはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、およびインフルエンザＡ、ＢまたはＣから選択される、実施形態７２記載のキット。
７４．ウイルスが、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エスプタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、および黄熱ウイルスから選択される、実施形態７２に記載のキット。
７５．偽ウイルスが、コロナウイルスＡ、Ｂ、ＣもしくはＤ、フラビウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスまたはインフルエンザＡ、ＢもしくはＣに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、実施形態７２に記載のキット。
７６．偽ウイルスが、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エスプタイン－バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デングウイルス、または黄熱ウイルスに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、実施形態７２に記載のキット。
７７．異種試験ペプチドが、抗体またはその一部を含む、実施形態６３～６５または６８～７１のいずれかに記載のキット。
７８．異種試験ペプチドが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）またはナノボディである、実施形態７７に記載のキット。
７９．（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化される核酸を含む遺伝子操作された細胞を含む、キット。
８０．（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化しないと活性化される核酸を含む遺伝子操作された細胞を含む、キット。
８１．（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）（ａ）レポーターをコードする核酸であって、その発現が、異種試験ポリペプチドが細胞表面タンパク質を活性化すると活性化される核酸を含む、遺伝子操作された細胞、および場合により（３）試験試薬を含む、キット。
８２．（１）異種試験ポリペプチドを発現させるためのベクター、（２）遺伝子操作された細胞、（３）レポーター分子を含む試験試薬であって、細胞によって提示される細胞表面タンパク質に結合し、試薬－表面タンパク質複合体を形成することができ、試薬－タンパク質複合体が形成されると細胞への侵入を獲得する、試験試薬を含む、キット。
８３．遺伝子操作された細胞が、（ｃ）異種細胞表面タンパク質をコードする核酸をさらに含む、実施形態７９～８２のいずれかに記載のキット。

【実施例】

【0160】

以下の実施例は例示であり、特許請求される主題の範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【0161】

［実施例１： 同時のｍＡｂ分泌およびウイルス感染のための細胞株の確立］

【0162】

この実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体／補助受容体および抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を、同じ細胞株を用いてタンパク質分泌およびウイルス感染の両方について同時に実施される中和アッセイの適用例として使用した。抗ウイルス抗体およびそれらのそれぞれのウイルス侵入受容体または補助受容体を発現して、抗体分泌と同時にウイルス感染を可能にする、Ａａ哺乳動物細胞株を開発した。一例として、ウイルス適用、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体ならびにその受容体ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）および／または膜貫通セリンプロテアーゼ２（ＴＭＰＲＳＳ２）を哺乳動物細胞株において発現させた（図１）。ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のＡＣＥ２表面受容体、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびＴＭＰＲＳＳ２遺伝子を含有するバイシストロニックベクターを構築し、哺乳動物発現ベクターにおいてｈＡＣＥ２およびＴＭＰＲＳＳ２を共発現させた。（ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子は任意であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に必要ではないが、ウイルスの（８）いくつかの細胞に感染する能力を高めることができる）。この発現カセットを、プラスミドトランスフェクションのための選択マーカーを有するベクターにクローニングし、選択マーカーを使用した形質転換細胞選択を可能にした。本発明者らは、このプラスミドＨＥＫ２９３細胞を、プラスミドをリポフェクタミントランスフェクション試薬と混合することによってトランスフェクトした。２日後、細胞培養培地を補充し、選択プロセスを開始するために、選択マーカーに対応する選択試薬を培養培地に添加した。７～１４日後、本発明者らは、選択試薬に耐性のある安定な細胞プールを得た。次いで、この細胞プールを、蛍光コンジュゲート抗ＡＣＥ２および蛍光コンジュゲート抗ＴＭＰＲＳＳ２の両方で染色した（図２）。細胞をＡＣＥ２およびＴＭＰＲＳＳ２発現について選別し、細胞を回復のために静置した。通常の成長による細胞回復後、限界希釈クローニングを実施して単一クローンを単離した。１０～１５日後、単一クローンが細胞コロニーを形成し、これを２４ウェルプレートに移して細胞を増殖させた。細胞増殖後、クローンを抗ＡＣＥ２および抗ＴＭＰＲＳＳ２で染色し、ＡＣＥ２およびＴＭＰＲＳＳ２の発現が最も高いクローンを選択した（ＨＥＫＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２と名付けた）。

【0163】

次いで、これらの細胞を形質転換して、既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和能を有する抗体の完全なＩｇＧを発現させた。あるいは、他のＩｇＧフラグメント、例えば単鎖可変領域フラグメント（Ｓｃｆｖ）、抗原結合断片（Ｆａｂ）または二重特異性抗体を発現することができた。所望の抗体または抗体フラグメントを、選択マーカーと共に哺乳動物ベクターにクローニングした。トランスフェクション、および選択マーカー試薬による選択に続いて、ＩｇＧ発現ＨＥＫＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２の安定プールを限界希釈クローニングに供して、この場合は抗体ＩｇＧである、クローンを発現する個々の分泌タンパク質を単離した。１０～１５日の細胞増殖後、５０ｕＬの細胞培養培地を移して、ＩｇＧ発現を直接ＥＬＩＳＡによって評価した。ＥＬＩＳＡを、ＩｇＧを９６ウェルプレートに一晩コーティングすることによって行った。プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＰＢＳＴ中５％ ＢＳＡで２時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ヒトＦｃ抗体をウェルに添加し、２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン液体基質をＨＲＰ反応のために添加し、検出のために２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。プレートリーダを使用して４５０ｎｍの吸光度波長でプレートを分析した。次いで、ＨＥＫＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２安定クローンによって発現されたＩｇＧの吸光度をＩｇＧ標準と比較して、相対ＩｇＧ発現収量を推定した。ＩｇＧ発現が最も高いクローンを本発明者らの候補クローンとして選択した。単一細胞で中和アッセイを行うことを可能にする、ＡＣＥ２、ＴＭＰＲＳＳ２およびＩｇＧを含む細胞株を生成した（図３）。細胞株開発のためのいくつかの戦略を使用することができる（図４）。

【0164】

［実施例２： 可溶性タンパク質を分泌できる修飾哺乳動物細胞株におけるウイルスまたは偽ウイルスに対する感染の定量化］

【0165】

ＨＥＫ２９３細胞株は、ラボ実験におけるタンパク質発現または分泌のために使用することができる。この実施例では、偽ウイルス中和アッセイのために、ＡＣＥ２を発現するがＴＭＰＲＳＳ２を発現しないＨＥＫ２９３細胞株を使用した（ＨＥＫＡＣＥ２と命名）。ウイルス発現ベクター中の、ＧＦＰレポーター遺伝子を含むウイルス表面上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＣｏＶ２スパイクタンパク質をコードするレンチウイルスベースの偽ウイルスの株にＨＥＫＡＣＥ２を感染させた。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス感染細胞はＧＦＰを発現するだろう。０．０５％トリプシンでＨＥＫＡＣＥ２細胞を剥離し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地でのトリプシン反応を停止させた。次いで、細胞密度をカウントし、細胞を３×１０^５細胞／ｍＬの密度に再懸濁し、１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。凍結偽ウイルスのアリコートを回収し、様々な量のウイルス（１５μＬ、３０μＬ、６０μＬおよび９０μＬ）を９６ウェルに添加した。９６ウェルプレートを３７℃で４８～７２時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰシグナルを取得することによって中和を定量した。図５に示すように、偽ウイルス感染ＨＥＫＡＣＥ２細胞の割合は、ＧＦＰ陽性細胞の割合によって反映され、添加されたウイルスの量と相関した（図５）。

【0166】

［実施例３： コードされたタンパク質バリアントのライブラリーを用いて、単一細胞におけるタンパク質分泌を可能にする。］

【0167】

この実施例では、後のタンパク質分泌およびアッセイベースの選択のための単一細胞におけるタンパク質分泌を可能にする方法を示す。この実施例では、分泌タンパク質は抗体ＩｇＧである。自然に対になった抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域（ＶＨ：ＶＬ）のライブラリーは、ＭｃＤａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌのプロトコルに記載されているように、患者のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から得ることができる^（３）。対になったＶＨ：ＶＬ配列を、以前に記載された形式と同様に、１つのＣＭＶプロモーターおよび１つのＥＦ１ａｌｐａプロモーターを有するプラスミドベクター（ｐＣＭＶ－ＥＦ１ａ、図６）または双方向プロモーターを有するベクター（図６、ｐＢＩ）にクローニングした^{（１０，１１，１２，１３，１４）}。ｐＣＭＶ－ＥＦ１ａおよびｐＢＩへのＶＨ：ＶＬライブラリーのクローニングは、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ切断部位を利用してアンプリコンをプロモーター無しのバックボーンベクターにクローニングし、次いで、重鎖および軽鎖のリーダーペプチド領域上のＮｈｅＩおよびＮｃｏＩ部位をそれぞれ使用して、二重プロモーター（ＣＭＶおよびＥＦ１ａ）または双方向ベクター（Ｂｉ－ＣＭＶ）にクローニングする。以前の研究では、タンパク質のリーダーペプチドを変化させると、タンパク質発現のレベルを調節できることが示されている^{１０、１１、１２、１３、１４）}。種々のリーダーペプチドを設計して、様々なレベルのタンパク質分泌を達成した。重鎖のためのＮｈｅＩ切断部位を含む３つのリーダーペプチド（Ｌｅ１１、Ａｌｂ２およびＬ２Ｂ）および軽鎖のためのＮｃｏＩ切断部位を含む２つのリーダーペプチド（Ｌｅ１２およびＡｌｂ１）を設計した（表１）。６つの異なる重鎖および軽鎖リーダーペプチドの組み合わせ（表２）を有する２つの抗体（抗ＨＩＶ抗体ＶＲＣ０１および抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗体、ＣＲ３０２２）を２つの異なるベクター（ｐＢＩまたはｐＣＭＶ－ＥＦ１ａ）で発現させた。リポフェクタミンを使用して、これらの２４個のＩｇＧ構築物をＨＥＫＡＣＥ２細胞（ＴＭＰＲＳＳ２発現無し）にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、実施例１に記載されるＥＬＩＳＡによってＩｇＧ発現を検出した。図６に示すように、ＶＲＣ０１およびＣＲ３０２２抗体の両方について、すべてのリーダーペプチドの組み合わせがＩｇＧ発現を可能にすること、および所望の分泌抗体の濃度を調節するために、種々のリーダーペプチドの組み合わせが選択され得ることが観察された。ＬＰ４およびＬＰ５を用いて、最も高い２つのＩｇＧ発現がｐＣＭＶ－ＥＦ１ａベクターにおいて観察された（図７）。５μｇ／ｍＬの最終濃度までブラストサイジンを添加することによって、安定なＩｇＧ発現プールを生成した。

【0168】

【表1】

【0169】

【表2】

【0170】

あるいは、自然に対になったＶＨ：ＶＬを、ＦＲＴ部位でのＦｌｐリコンビナーゼ媒介インテグレーションを介して、Ｆｌｉｐ－Ｉｎ ＨＥＫ２９３キットから誘導されたＨＥＫＡＣＥ２に発現させることができた（図８）。そのためには、まずＩｇＧ発現遺伝子カセットをｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターにクローニングする。次いで、操作されたｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターをＦｌｐリコンビナーゼベクターｐＯＧ４４と共に、ＡＣＥ２発現を有するＨＥＫ－Ｆｌｐ－Ｉｎ ２９３に同時トランスフェクトする。ハイグロマイシン選択によって、ＩｇＧ発現細胞のライブラリーを生成する。Ｆｌｐ媒介クローニングは、単一のタンパク質バリアントのみが各細胞によってコードされるという利点を有し、これは、アッセイの実施に厳密には必要でないが、本発明者らのアッセイの選択性に有益である。

【0171】

別の実施例では、インテグラーゼベースの遺伝子インテグレーションシステムを使用して、ＴＡＲＧＡＴＴ（商標）－ＨＥＫ２９３マスター細胞株に由来するＨＥＫ２９３ＡＣＥ細胞からＩｇＧを発現させた。ＩｇＧ発現遺伝子カセットを、インテグラーゼ認識部位、ａｔｔＢ、ブラストサイジン耐性マーカーおよびｍＣｈｅｒｒｙを含むドナーベクターにクローニングした（図９）。次いでドナープラスミドおよびインテグラーゼ発現プラスミドを、ＡＣＥ２を安定に発現する操作されたＨＥＫ細胞株に同時トランスフェクトした。ａｔｔＰランディングパッドは、ｈＨ１１遺伝子座にあった。

【0172】

別の実施例では、ＣＲＩＳＰＲ相同組換え修復プラットフォームシステムを使用して、ＨＥＫ－ＡＣＥ２細胞にＩｇＧを発現させた。ドナーＩｇＧ発現カセット（二重プロモーターまたは双方向プロモーターを有するＶＨ：ＶＬ配列）を相同アームと共に同時トランスフェクトした（図１０）。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９発現ベクターは、自然に対になったＶＨ：ＶＬ配列のセーフハーバー遺伝子座へのインテグレーションをもたらした。標的セーフハーバー遺伝子座には、ＣＣＲ５、ＡＡＶＳ１およびＨｉｐｐ１１が含まれる（図１０）。

【0173】

クローニングおよび形質転換の方法は、目的の細胞株および細胞ベースの機能活性モデルに適切に適合させることができる。分泌タンパク質のライブラリーを哺乳動物または他の細胞中に生成するために、いくつかの異なるクローニングおよび形質転換方法を適切に使用することができる（図１１）。他の種類のクローニングを使用して、タンパク質分泌のための核酸を宿主細胞に挿入することができ、これには限定されないが、レンチウイルス遺伝子導入、感染性分子クローン、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、化学的ＤＮＡトランスフェクション、化学的ＲＮＡトランスフェクション、ナノ粒子によってカプセル封入されたｍＲＮＡ、ナノ粒子によってカプセル封入されたＤＮＡ、または所望のタンパク質およびプラスミドベクターの細胞発現を誘導するための当技術分野で公知の他の方法が含まれ得る。

【0174】

［実施例４： ＶＨ：ＶＬ双方向形式でのクローニングおよび可溶性抗体機能分析のための抗体タンパク質ライブラリーの生成］

【0175】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、ランダムに対になったＶＨ：ＶＬライブラリーまたは変異ＶＨ：ＶＬライブラリーを、抗体のＶＨおよびＶＬ遺伝子がＤＮＡリンカーによって連結される、遺伝子合成サービスを介して合成することができる。あるいは、ＶＨ：ＶＬ遺伝子ライブラリーは、以前に報告されたように、ヒト、マウス、または非ヒト霊長類試料から直接増幅することができる^（１５）。いくつかの実施形態では、エラープローンＰＣＲ、部位飽和変異誘発、および／またはＤＮＡシャッフリングを使用して、ライブラリーに多様性を導入することができる。ＮｏｔＩとＮｃｏＩとの組み合わせを使用してＶＨライブラリーをクローニングし、二重プロモーターでＮｈｅＩとＡｓｃＩとの組み合わせを使用してＶＬライブラリーをクローニングすることができ（連続形式）、または、以前の報告と同様に、第１のＮｏｔＩおよびＡｓｃＩを使用して完全な構築物をクローニングし、次いでＮｃｏＩおよびＮｈｅＩを使用して双方向プロモーター内でクローニングすることによって、図６に示すような双方向プロモーター形式を維持することができる^{（１６、１７）}。このプラスミドを、ＩｇＧ発現のためにＨＥＫＡＣＥ２細胞にトランスフェクトすることができる。あるいは、遺伝子カセット（重鎖および軽鎖を有する二重プロモーターまたは双方向プロモーター）を、ＦＬＰ／ＦＲＴベースの遺伝子インテグレーションドナープラスミド（図８）、インテグラーゼベースのドナープラスミド（図９）、またはセーフハーバー遺伝子座への安定なＩｇＧインテグレーションのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ドナープラスミド（図１０）にクローニングすることができる。いくつかの可能なクローニング戦略を双方向抗体発現に使用することができる（図１１）。

【0176】

［実施例５： 標準的な一方向形式で合成的に生成された抗体発現を可能にする方法］

【0177】

遺伝子合成サービスを介して、ランダムに対になったＶＨ：ＶＬライブラリーまたは変異ＶＨ：ＶＬライブラリーを合成することができる。次に、図１２ａに示すように、ＶＨおよびＶＬを哺乳動物発現ベクターに別々にクローニングし、ＩｇＧを一方のオープンリーディングフレームで発現させることができる。

【0178】

ＩｇＧは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にＧＳリンカーを用いて単鎖可変領域フラグメント形式で発現させることができる。

【0179】

あるいは、完全ＩｇＧを、ＩｇＧ重鎖と軽鎖との間にｐ２Ａ切断ペプチドを有するバイシストロニック形式で発現させることができる（図１２Ｂ）（以下の黄熱の実施例を参照されたい）。プラスミドをトランスフェクトし、ＩｇＧを発現させた。

【0180】

ＩｇＧの一方向形式をセーフハーバー遺伝子座発現部位にインテグレーションすることができる。インテグレーションのための選択肢としては、ＦＬＰ／ＦＲＴベースの遺伝子インテグレーション（図８）、インテグラーゼベースのドナープラスミド（図９）、トランスポゾンベースのインテグレーション、または安定なＩｇＧインテグレーションのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ドナープラスミドの使用（図１０）が挙げられる。分泌タンパク質に使用される細胞株および機能モデルに応じて、いくつかのクローニングおよび形質転換方法が好適である（例えば、図１１）。

【0181】

［実施例６： 区画としてのウェルプレートにおける、ウイルス中和特性を有する抗体を選択するための分泌タンパク質アッセイの適用］

【0182】

この実施例では、分泌タンパク質を同じ細胞株における分泌タンパク質活性の読み出しと共に使用する機能アッセイを示す。この例では、分泌タンパク質は抗体であり、アッセイされる活性はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの中和であり、選択マーカーはＧＦＰである。

【0183】

２×１０^４個のＨＥＫＡＣＥ２細胞を、トランスフェクション時に７０％の細胞密集度に達するように９６ウェルプレートに播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれるプロトコルに従って、哺乳動物発現ベクターｐＢＩ中のｍＡｂ １００ｎｇ／ウェルを５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に希釈し、０．２μＬのＰ３０００（商標）Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。別に、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００ Ｒｅａｇｅｎｔも５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）に希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００ Ｒｅａｇｅｎｔに添加し、室温で１２分間インキュベートした。次いで、このＤＮＡ－脂質複合体をＨＥＫＡＣＥ２細胞に添加し、３７℃で３日間インキュベートした。ｐＢＩベクターはｍＡｂの軽鎖上にｍＣｈｅｒｒｙを含むので、トランスフェクション後に蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーを用いて細胞を可視化して、遺伝子発現を確認することができた。トランスフェクションの３日後、抗体の中和活性を以下のように測定した。

【0184】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１ ＧＦＰレポーターウイルス粒子（Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を解凍し、氷上に置き、６０μＬのレポーターウイルス粒子を細胞培地に直接添加した。９６ウェルプレートを３７℃で４８～７２時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰシグナルを取得することによって中和を定量した。ＩｇＧ発現のＥＬＩＳＡ分析は、ＶＣＲ０１が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である抗体９１０－３０^（１７）よりも高いＩｇＧ発現レベルを有することを示した。中和アッセイは、ＶＣＲ０１を発現するＨＥＫＡＣＥ２が、９１０－３０を発現するＨＥＫＡＣＥ２細胞よりも高いＧＦＰ集団を示すことを示した（図１３）。実験を繰り返すと、同様の結果が得られた（図１４）。

【0185】

［実施例７： 抗体分泌および偽ウイルス感染の両方が可能な細胞によってコードされる抗体のライブラリーからの中和抗体の選択］

【0186】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、実施例６に記載されているように、分泌ＶＲＣ０１および９１０－３０を発現する安定な細胞株の混合物を生成する。限界希釈単離を実施して、９６ウェルプレート中に単一細胞を、ウェルあたり平均０．２５個の細胞で生成する。細胞を限界希釈クローニング後４０日間増殖させ、次いで直接中和アッセイのために３０μＬの偽ウイルスを添加する。細胞を回収し、それらが分泌する抗体によって感染から保護されなかった（すなわち、非中和抗体を発現していた）細胞について濃縮されたＧＦＰ＋集団を選別する。ＧＦＰ－集団も選別して、感染から保護された（すなわち、中和抗体を発現している）細胞を濃縮する。ＲＮＡを抽出し、抗体遺伝子についてＲＴ－ＰＣＲを行うことによって^（２２）、ＧＦＰ－集団およびＧＦＰ＋集団から対になった抗体ＤＮＡ遺伝子配列を回収する。ハイスループットシーケンシングを行って、ＧＦＰ－集団およびＧＦＰ＋集団におけるＶＨ：ＶＬ情報を得る。各集団における抗体バリアントの頻度を比較し、集団^（２１）プール中の各抗体の中和能を決定する。ＧＦＰ＋ウイルス感染群でＶＲＣ０１配列が比較的濃縮されたのに対して、ＧＦＰ－群では９１０－３０配列が比較的濃縮されたことを見出し、これらの選択の定量的シグナルは、本発明者らの分泌タンパク質アッセイの、細胞によって分泌されるコードされた抗体のウイルス中和能を試験する能力を実証する。

【0187】

自然に対になったＶＨ：ＶＬ抗体をＢ細胞から直接発見するために、実施例３、実施例４および実施例５に記載されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヒト患者試料からの天然ＶＨ：ＶＬライブラリーをＩｇＧ発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫＡＣＥ２細胞に発現させる。単一細胞を、ウェルあたり１つの細胞で９６ウェルに限界希釈クローニング単離する。限界希釈クローニングの４０日間後、直接中和アッセイのために３０μＬの偽ウイルスを添加する。非中和抗体が濃縮されたＧＦＰ＋集団を選別する。ＧＦＰ－集団を選別して、集団を中和抗体について濃縮する。ＲＮＡを抽出し、抗体遺伝子についてＲＴ－ＰＣＲを行うことによって^（２２）、ＧＦＰ－集団およびＧＦＰ＋集団から対になった抗体ＤＮＡ遺伝子配列を回収する。ハイスループットシーケンシング分析を行って、ＶＨ：ＶＬ情報を得る。各集団における抗体バリアントの頻度を比較して、集団^（２１）における中和抗体の同定を決定する。

【0188】

［実施例８： 区画としての印刷されたマイクロチャンバにおける分泌タンパク質機能アッセイの適用］

【0189】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、最初に、実施例３、実施例４、および実施例５に記載される方法の１つによって、対になったＶＨ：ＶＬを発現するＨＥＫＡＣＥ２細胞を生成する。細胞の集団を、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スライド^（２）で成形された１２５ｐｌウェルに加える。各スライドは１．７×１０^５ウェルを含む。４つのスライドを、６８，０００個のＩｇＧ発現ＨＥＫＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を約１：１０の細胞対ウェル比占有率で含むように同時に処理し、ポアソン統計学による９５％超の確率での単一細胞／ウェルを可能にする。スライドを３７℃、５％ ＣＯ_２のインキュベーターで一晩インキュベートし、ＩｇＧを分泌させる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスをマイクロウェル上に沈着させて内部に拡散させ、ＰＤＭＳスライドを透析膜で密封する。スライドを１６時間インキュベートし、ウイルスを細胞へ侵入させる。スライドを洗浄し、高濃度（１ｍｇ／ｍＬ）の可溶性９１０－３０中和ＩｇＧの存在下でスライドから生細胞を回収して、細胞が一緒にプールされた後のウイルス感染を防ぐ。細胞を２４ウェルプレートに播種して、３７℃の５％ ＣＯ_２インキュベーターで２日間回復および増殖させる。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。ＧＦＰ－集団およびＧＦＰ＋集団を回収し、ＲＮＡを抽出し、抗体遺伝子についてＲＴ－ＰＣＲを行う^（２２）。ハイスループットシーケンシング分析を行って、ＶＨ：ＶＬ情報を得る。実施例６に記載されているように、各集団における抗体バリアントの頻度を比較して、集団^{（３、２１）}における中和抗体の同定を決定する。

【0190】

あるいは、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍによって抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体をスクリーニングする。ＩｇＧ発現ＨＥＫＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を、ＮａｎｏＰｅｎ（商標）チャンバを備えたＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップにロードして、チャンバ毎に１つの細胞ベースで単離し、細胞を一晩インキュベートして、抗体を分泌させる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスをチャンバに添加し、３日間インキュベートする。高濃度（１ｍｇ／ｍＬ）の可溶性９１０－３０中和ＩｇＧの存在下でＮａｎｏｐｅｎ（商標）から生細胞を回収して、細胞が一緒に回収されると、その後のウイルス感染を防ぐ。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用してＧＦＰ－集団およびＧＦＰ＋集団を単離し、ＲＮＡを抽出し、抗体遺伝子についてＲＴ－ＰＣＲを行う^（２２）。ハイスループットシーケンシング分析を行って、ＶＨ：ＶＬ情報を得る。実施例６に記載されているように、各集団における抗体バリアントの頻度を比較して、集団^{（３、２１）}における中和抗体の同定を決定する。

【0191】

［実施例９： エマルジョン液滴システムにおけるアッセイの適用］

【0192】

この実施例では、マイクロ流体デバイスを使用して、ＩｇＧ発現ＨＥＫＡＣＥ２細胞を細胞分泌培地にカプセル封入して、液滴あたり１つの細胞を含む液滴を形成した^{（６、２５、２６）}。抗体分泌のために一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を使用した、細胞単離および抗体分泌の例を図１５に示す。

【0193】

ＨＥＫＡＣＥ２細胞を使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分泌タンパク質中和アッセイのためにこのシステムを実行した。エマルジョン液滴内でタンパク質を分泌する細胞を使用する中和アッセイのワークフローを図１６に示す。より広域の時間尺度を使用することもできるが、本発明者らは液滴を４～９６時間インキュベートし、液滴内で分泌タンパク質（この例では、ＩｇＧ）を分泌させた。続いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを含有する第２の液滴を、ＩｇＧ発現ＨＥＫＡＣＥ２細胞を含む液滴に混同した。本発明者らは、電気融合を使用して液滴を混同したが^（２４）、別の液滴混同方法も当業者に知られており、マイクロピラー抵抗アレイを含む。混同された液滴をさらに４～９６時間インキュベートして、偽ウイルスの感染または中和の発生を可能にしたが、より広域な時間尺度を使用することもできる。液滴を破壊し、細胞を回収した。

【0194】

液滴は、１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ－パーフルオロ－１－オクタノールを含む化学試薬、または当業者に公知の他の方法を使用して破壊することができる。場合により、強力に中和する化合物（例えば、高濃度の中和抗体）をシステムに添加して、液滴が一緒に混同された後の新たな偽ウイルス感染を防ぐことができる。顕著な一例として、液滴を破壊し、高濃度（１ｍｇ／ｍＬ）の可溶性９１０－３０中和ＩｇＧの存在下で液滴から生細胞を回収して、細胞が一緒に回収された後のウイルス感染を防ぐ。場合により、回収された細胞は、スクリーニングの前にさらに数時間、数日間、数週間または数ヶ月間培養することができる。次に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用してＧＦＰ－細胞およびＧＦＰ＋細胞を単離し、ＲＮＡを抽出し、抗体遺伝子についてＲＴ－ＰＣＲを行った^（２２）。ハイスループットシーケンシング分析を行って、ＧＦＰ－細胞およびＧＦＰ＋細胞におけるＶＨ：ＶＬ情報を得る。実施例６に記載されているように、各集団における抗体バリアントの頻度を比較して、集団^{（３，２１）}における中和抗体の同定を決定し、ここでＧＦＰ－細胞は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２偽ウイルス感染に対する防御を提供するコード抗体について濃縮されているのに対して、ＧＦＰ＋細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して防御しない、または使用されるアッセイ条件下で液滴内に防御を提供するのに十分な量で発現しないコード抗体について濃縮されている。

【0195】

［実施例１０： 天然抗体ライブラリー^{（９、１６、１７、１９）}からの中和抗体発見］

【0196】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、自然に対になったＶＨ：ＶＬ配列決定プラットフォームを使用して、自然に対になったＶＨ：ＶＬライブラリーを得る。ＶＨ：ＶＬアンプリコンは、実施例３に記載されているように、プラスミドトランスフェクションおよび耐性遺伝子マーカー選択を使用したランダム遺伝子インテグレーション、ならびに部位特異的インテグレーションを介して、ＩｇＧまたはＩｇＧフラグメントとして送達することができる。ウェルプレート（実施例７）、印刷チャンバ（実施例８）またはマイクロ流体液滴（実施例９）への単一細胞単離を含む、単一細胞単離のための複数の方法を使用して強力なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体をスクリーニングする。次いで、ＧＰＦ－ＨＥＫＡＣＥ２細胞およびＧＦＰ＋ＨＥＫＡＣＥ２細胞を選別し、ＲＴ－ＰＣＲを実施して、各細胞集団から対のＶＨ：ＶＬアンプリコンを得る。以前に説明されているように^{（１６、１７、１９）}、ＰＣＲを実行して、抗体集団の次世代配列分析のためのプライマーバーコードを付加する。ＧＦＰ陰性集団において濃縮された、遺伝子合成のための最も一般的なＶＨ：ＶＬクローンのうちの１０個を選択する。次いで、プラスミドの一過性トランスフェクションを行って、Ｅｘｐｉ２９３細胞の懸濁液中でＩｇＧを発現させた。トランスフェクションの７日後、培養物を遠心分離し、上清を５０ｍＬ遠心管に移す。０．５ｍＬのプロテインＧレジンを添加し、反応をベンチローテーターで２時間進行させる。次いで、反応混合物をポリプロピレンカラムに注ぎ、プロテインＧレジンを保持する。次いで、０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）でＩｇＧを溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でｐＨを中和する。次いで、精製されたＩｇＧを濃縮し、個々のＩｇＧの中和アッセイ分析に供する。ＢＣＡタンパク質アッセイによってＩｇＧタンパク質濃度を定量した。次いで、２μｇの精製ＩｇＧをＳＤＳ－ｐａｇｅ試料緩衝液と混合し、ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅプレキャストゲルに通すことによってＩｇＧの純度を分析する。１０μｇ／ｍＬから０．００１μｇ／ｍＬの最終濃度まで抗体の段階希釈を行う。連続希釈した抗体を３０μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスと合わせ、反応物を３７℃で一時間インキュベートする。次いで、ウイルス－抗体混合物を、２×１０^５のＡＣＥ発現ＨＥＫ２９３細胞を含む９６ウェルに添加する。３７℃の５％ ＣＯ_２で３日間インキュベートする。ＧＦＰシグナルのフローサイトメトリー分析によって抗体の中和活性を分析して、ＧＦＰ－細胞集団において濃縮されている中和抗体の回収を実証する。

【0197】

［実施例１１： 強力な中和抗体のための抗体ライブラリーバリアント発現および指向性進化選択］

【0198】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を、ＤＮＡシャッフリング、エラープローンＰＣＲ、単一部位特異的変異誘発からの方法の１つによって変異させて、抗体バリアントライブラリーを生成する。変異のランドスケープを増やすために、組み合わせ変異および／または逐次変異をさらに行うことができる。合成抗体変異体ライブラリーを実施例３に記載のＨＥＫＡＣＥ２細胞にクローニングする。実施例７、実施例８および実施例９に叙述されたアプローチの１つによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２中和抗体をスクリーニングする。ＧＦＰ－細胞およびＧＦＰ＋細胞を選別し、続いてＧＦＰ陰性ＩｇＧ発現ＨＥＫＡＣＥ２細胞（中和抗体の分泌に富む）からＲＴ－ＰＣＲによってＶＨ：ＶＬ配列情報を回収した後、スクリーニングされたＶＨ：ＶＬ遺伝子を、その後のスクリーニングラウンドのために、実施例３に詳述されているＩｇＧ発現ベクター内に再送達する（濃縮ＩｇＧライブラリーと命名）。スクリーニングラウンド間の多様性を高めるために、ＤＮＡシャッフリング、エラープローンＰＣＲ、単一部位特異的変異誘発を使用して逐次変異を行うこともできる。他のＤＮＡ配列決定およびライブラリー多様性生成戦略も使用することができ、当業者に公知である。実施例３に示すように、ＩｇＧ発現プラットフォーム上で濃縮ライブラリーおよび濃縮＋変異ＩｇＧライブラリーの両方を発現する。実施例７、実施例８または実施例９に記載される方法を使用して中和抗体ＶＨ：ＶＬ配列を再スクリーニングし、得る。その後のラウンドのための濃縮されたライブラリーの再送達およびスクリーニングを繰り返して、所望の中和効力を有する分子が得られるまで中和効力についてさらに濃縮する。再スクリーニング、変異および再送達のこのプロセスは、抗体を強力に中和するための指向性進化選択を可能にする。

【0199】

［実施例１２： 多数のウイルス株を逐次的に中和する抗体バリアント］

【0200】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１株を中和分析のための偽ウイルスとして使用して、実施例１０および１１に記載される方法から中和抗体を単離する。ＧＦＰ－細胞の回収を介して、中和ＩｇＧライブラリー発現ＨＥＫＡＣＥ２細胞を回収することができる。Ｓ－Ｄ６１４Ｇバリアントなど、別のウイルス変異バリアントを使用して、実施例７、実施例８または実施例９に記載の細胞単離プラットフォームを介して逐次中和スクリーニング（第２ラウンドとして定義される）を実施する。スクリーニングの第２ラウンド後、集団を、Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１およびＤ６１４Ｇの両方に対する中和能を示す抗体について濃縮する。

【0201】

あるいは、ＧＦＰ陰性細胞の選別後のＦＡＣＳ後に、これらの細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲを実施してＶＨ：ＶＬ配列を得る。次いで、ＶＨ：ＶＬ対を実施例３に記載のＨＥＫＡＣＥ２細胞に再送達して、単一ライブラリー選別後に分泌タンパク質ライブラリーを生成する。次いで、Ｄ６１４変異を含有する偽ウイルスバリアントを使用して、スクリーニングの第２ラウンドを実施する。これらの方法は、目的の複数のウイルス株を標的とする中和抗体の選択を可能にする。

【0202】

［実施例１３： 多数のウイルス株を同時に用いる抗体バリアントの中和］

【0203】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、同時に複数のウイルス株を使用して偽ウイルス中和を実施する。まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２－Ｄ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶを含む広範なコロナウイルス株由来の等量のウイルスを混合し、各偽ウイルスは、それぞれＹＦＰ、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰを含有する。あるいは、すべて異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント（例えば、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７、およびＢ．１．４２９）に由来する異なるウイルス株を使用することができる。いくつかの実施形態では、すべてのウイルスが同じレポーター（例えば、ＧＦＰ）をコードする。いくつかの実施形態では、各ウイルスは、感染後に標的細胞が発現する異なるＤＮＡまたはＲＮＡバーコードをコードする。いくつかの実施形態では、真正ウイルスが使用される。別の実施形態では、偽ウイルスが使用される。実施例７（マルチプルウェルプレートベース）、実施例８（マイクロチャンバベース）または実施例９（マイクロ流体液滴ベース）に記載のアプローチに基づいて、ウイルス株の混合物を含む抗体ライブラリーの中和アッセイを行う。実施例７のマルチプルウェルプレートアッセイのために、広範な中和を有する抗体を発現する候補細胞として、ＹＦＰ、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰを示さなかった細胞を含有するウェルを選択した。他の蛍光マーカーを使用することができ、当業者に公知である。マイクロチャンバベースの方法（実施例８）およびマイクロ流体液滴ベースの方法（実施例９）の両方で、マイクロチャンバ（実施例８）または液滴（実施例９）のいずれかから細胞を回収した後、さらに４８時間静置して細胞を増殖させる（細胞は、実験の優先度に応じて０時間～複数ヶ月の間の任意の期間静置することができる）。ＹＦＰ、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰを発現しない細胞、ならびにフルオロフォア発現を示す細胞（すなわち、感染した）を選別する。ＲＴ－ＰＣＲ遺伝子回収およびハイスループットシーケンシングによって各集団のＶＨ：ＶＬ対合情報を得る。両方のスクリーニング集団の配列を比較し、次いで、ＨＥＫ２９３Ｅｘｐｉ細胞からのＹＦＰ、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰが無い集団で濃縮された候補抗体を発現させ、定量化のために抗体を精製する。実施例１０に記載される方法に従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２－Ｄ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、およびＭＥＲＳ－ＣｏＶに対する個々の抗体の中和能を評価する。

【0204】

［実施例１４： 多数の異なるウイルスを同時に用いる抗体バリアントの中和］

【0205】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、同時に複数の異なるウイルス型を使用して偽ウイルス中和を実施する。まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２－Ｄ６１４Ｇ、ＹＦＶ、およびＤＥＮＶ－１を含む異なる株由来の等量のウイルスを混合し、各偽ウイルスは、それぞれＹＦＰ、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰを含有する。いくつかの実施形態では、すべてのウイルスが同じレポーター（例えば、ＧＦＰ）をコードする。いくつかの実施形態では、各ウイルスは、感染後に標的細胞が発現する異なるＤＮＡまたはＲＮＡバーコードをコードする。いくつかの実施形態では、真正ウイルスが使用される。別の実施形態では、偽ウイルスが使用される。使用されるウイルスのいずれかに感染され得る細胞株が生成される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２－Ｄ６１４Ｇ、ＹＦＶ、およびＤＥＮＶ－１に感染され得る細胞は、Ｒａｊｉ－ＤＣ－ＳＩＧＮ細胞で開始することによって生成することができ、それは、ＹＦＶおよびＤＥＮＶ－１組換えウイルス粒子（ＲＶＰ）によるインビトロ感染に使用され、Ｒａｊｉ－ＤＣ－ＳＩＧＮを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染も可能にするＡＣＥ２タンパク質を発現するように修飾する。次に、修飾Ｒａｊｉ－ＤＣ－ＳＩＧＮ－ＡＣＥ２細胞から抗体を発現および分泌するために抗体のライブラリーをクローニングし、実施例７（マルチプルウェルプレートベース）、実施例８（マイクロチャンバベース）または実施例９（マイクロ流体液滴ベース）に記載のアプローチに基づいて、ウイルスの混合物を含む抗体ライブラリーの中和アッセイを行う。実施例７のマルチプルウェルプレートアッセイのために、広範な中和を有する抗体を発現する候補細胞として、ＹＦＰ、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰを示さなかった細胞を含有するウェルを選択した。マイクロチャンバベースの方法（実施例８）およびマイクロ流体液滴ベースの方法（実施例９）の両方で、マイクロチャンバ（実施例８）または液滴（実施例９）のいずれかから細胞を回収した後、さらに４８時間静置して細胞を増殖させる（が、細胞は、実験の優先度に応じて、０時間～複数ヶ月の間のどこからでも静置することができる）。ＹＦＰ、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰを発現しない細胞、ならびにフルオロフォア発現を示す細胞（すなわち、感染した）を選別する。ＲＴ－ＰＣＲ遺伝子回収およびハイスループットシーケンシングによって各集団のＶＨ：ＶＬ対合情報を得る。両方のスクリーニング集団の配列を比較し、次いで、ＨＥＫ２９３Ｅｘｐｉ細胞からのＹＦＰ、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＣＦＰが無い集団で濃縮された候補抗体を発現させて、ハイスループットアッセイを使用して中和抗体の配列を決定する。いくつかの実施形態では、各ウイルスは、ウイルス型をコードする細胞特異的バーコードをコードし、感染または非感染抗体集団の抗体遺伝子配列のハイスループット分析に加えて、バルクまたは単一細胞のライブラリー内に感染するウイルスのハイスループットＤＮＡベースの読み出しを可能にする。いくつかの実施形態では、単一細胞の配列決定を使用して、感染ウイルスのバーコードを抗体のＤＮＡ配列に直接連結する。

【0206】

［実施例１５： ４－１ＢＢを活性化する分泌タンパク質の迅速なハイスループット発見］

【0207】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、細胞株は、４－１ＢＢが活性化されると蛍光マーカーの発現を引き起こすレポーターまたは他のレポーター（例えば、ＧＦＰまたは当技術分野で公知の他の細胞選択マーカー）と共に、４－１ＢＢ発現のために使用される。４－１ＢＢ細胞外ドメインの融合タンパク質は、４－１ＢＢが活性化されるとＧＦＰ発現を引き起こす内部活性化シグナルと共に生成される。タンパク質ライブラリーは、各細胞にタンパク質バリアントを分泌させる細胞株（細胞毎に１つのタンパク質バリアント）にコードされる。細胞を単一細胞として区画内に単離し、４時間インキュベートさせて分泌タンパク質を蓄積する（しかし、時間は、実験の条件および目標に応じて、数秒から数ヶ月の範囲に及ぶことができる）。いくつかの実施形態では、区画はエマルジョン液滴で構成される。４－１ＢＢを活性化するタンパク質を分泌する細胞は、蛍光マーカー発現を活性化する（例えば、ＧＦＰ）。細胞回収後、マーカー＋細胞およびマーカー－細胞をフローサイトメトリーによって単離し、それらの同一性をＤＮＡ配列決定によって特徴付けて、４－１ＢＢを機能的に活性化することができるライブラリー内のタンパク質バリアントを決定する。代替アプローチとして、蛍光細胞選別の代わりにルシフェラーゼ検出システムを使用して、目的の機能活性を有する分泌タンパク質を検出することができる。目的の機能活性を有する適切な分泌タンパク質の同定後、発見されたタンパク質は、癌または他の疾患の治療のために４－１ＢＢを活性化する免疫療法としての可能性を有する。

【0208】

［実施例１６： プログラム死受容体１（ＰＤ－１）活性化を遮断する分泌タンパク質の迅速なハイスループット発見］

【0209】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、細胞株は、ＰＤ－１が活性化されると蛍光レポーターまたは他のレポーター（例えば、ＧＦＰまたは当技術分野で公知の他の細胞選択マーカー）の発現を引き起こす選択マーカーと共に、ＰＤ－１発現のために生成される。ＰＤ－１細胞外ドメインの融合タンパク質は、ＰＤ－１が活性化されるとＧＦＰ発現を引き起こす内部活性化シグナルと共に生成される。タンパク質ライブラリーは、各細胞にタンパク質バリアントを分泌させる細胞株（細胞毎に１つのタンパク質バリアント）にコードされる。細胞を単一細胞として区画内に単離し、４時間インキュベートさせて分泌タンパク質を蓄積する（しかし、時間は、実験の条件および目標に応じて、数秒から数ヶ月の範囲に及ぶことができる）。いくつかの実施形態では、区画はエマルジョン液滴で構成される。次いで、ＰＤ－Ｌ１を区画に添加して、ＰＤ－１のライゲーションおよび活性化を誘導する。ＰＤ－Ｌ１結合を遮断し、かつ／またはＰＤ－１活性化を妨げるタンパク質を分泌する細胞は、蛍光マーカーの発現を妨げる。細胞回収後、ＧＦＰ－細胞をフローサイトメトリーによって単離し、それらの同一性をＤＮＡ配列決定によって特徴付けて、ＰＤ－Ｌ１を介してＰＤ－１の活性化を遮断することができるライブラリー内のタンパク質バリアントを決定する。代替アプローチとして、蛍光細胞選別の代わりにルシフェラーゼ検出システムを使用して、目的の機能活性を有する分泌タンパク質を検出することができる。目的の機能活性を有する適切な分泌タンパク質の同定後、発見されたタンパク質は、癌治療のための免疫療法チェックポイント阻害剤となる潜在的能力を有する。

【0210】

［実施例１７： ＧＰＣＲ活性化を遮断する分泌タンパク質の迅速なハイスループット発見］

【0211】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、細胞株は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）発現のために、ＧＰＣＲが活性化されると蛍光マーカーの発現を引き起こすレポーターまたは他のレポーター（例えば、ＧＦＰまたは当技術分野で公知の他の細胞選択マーカー）と共に生成される。ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲが活性化されると内部活性化シグナルを活性化する細胞株において発現される。例示的な細胞株は、例えば、ＧＰＣＲ細胞株を販売するＥｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社から購入可能であり、または同様に構築することができる。分泌タンパク質ライブラリーはまた、各細胞にタンパク質バリアントを分泌させる細胞株（細胞毎に１つのタンパク質バリアント）にコードされる。細胞を単一細胞として区画内に単離し、４時間インキュベートさせて分泌タンパク質を蓄積する（しかし、時間は、実験の条件および目標に応じて、数秒から数ヶ月の範囲に及ぶことができる）。いくつかの実施形態では、区画はエマルジョン液滴で構成される。次いで、ＧＰＣＲアゴニストを区画に添加して、ＧＰＣＲのライゲーションおよび活性化を誘導する。ＧＰＣＲアゴニスト結合を遮断し、かつ／またはＧＰＣＲ活性化を妨げるタンパク質を分泌する細胞は、蛍光マーカーの発現を妨げる。細胞回収後、活性化細胞および非活性化細胞をフローサイトメトリーによって単離し、それらの同一性をＤＮＡ配列決定によって特徴付けて、ＧＰＣＲの活性化を遮断することができるライブラリー内のタンパク質バリアントを決定する。代替アプローチとして、蛍光細胞選別の代わりにルシフェラーゼ検出システムを使用して、目的の機能活性を有する分泌タンパク質を検出することができる。目的の機能活性を有する適切な分泌タンパク質の同定後、発見されたタンパク質は、ＧＰＣＲ活性化を遮断する薬物として有望な候補であろう。

【0212】

［実施例１８： ＧＰＣＲ活性化を誘導する分泌タンパク質の迅速なハイスループット発見］

【0213】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、細胞株は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）発現のために、ＧＰＣＲが活性化されると蛍光レポーターの発現を引き起こすレポーターまたは他のレポーター（例えば、ＧＦＰまたは当技術分野で公知の他の細胞レポーター）と共に生成される。ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲが活性化されると内部活性化シグナルを生成する細胞株において発現される。例示的な細胞株は、例えば、ＧＰＣＲ細胞株を販売するＥｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社から購入可能であり、または同様に構築することができる。分泌タンパク質ライブラリーは、各細胞にタンパク質バリアントを分泌させる細胞株（細胞毎に１つのタンパク質バリアント）にコードされる。細胞を単一細胞として区画内に単離し、４時間インキュベートさせて分泌タンパク質を蓄積する（しかし、時間は、実験の条件および目標に応じて、数秒から数ヶ月の範囲に及ぶことができる）。ＧＰＣＲを活性化するタンパク質を分泌する細胞は、それらの同じ細胞において蛍光マーカーを発現させる。細胞回収後、活性化細胞および非活性化細胞をフローサイトメトリーによって単離し、それらの同一性をＤＮＡ配列決定によって特徴付けて、ＧＰＣＲを活性化するライブラリー内のタンパク質バリアントを決定する。代替アプローチとして、蛍光細胞選別の代わりにルシフェラーゼ検出システムを使用して、目的の機能活性を有する分泌タンパク質を検出することができる。目的の機能活性を有する適切な分泌タンパク質の同定後、発見されたタンパク質は、ＧＰＣＲを活性化する薬物として有望な候補であろう。

【0214】

［実施例１９： 黄熱ウイルスの中和のための分泌タンパク質分析］

【0215】

この実施例では、Ｒａｊｉ－ＤＣＳＩＧＮＲ細胞を使用して、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）を中和する分泌タンパク質の能力を試験した。この実施例では、レンチウイルス形質導入を使用して遺伝子を分泌のための細胞に挿入して、実施例５に記載のｐ２ａモチーフを使用してバイシストロニック形式で抗体を発現させた。Ｒａｊｉ－ＤＣＳＩＧＮＲ細胞のレンチウイルス形質導入を利用して、ハイスループット単一細胞中和アッセイでのそれらの能力を評価した。Ｒａｊｉ－ＤＣＳＩＧＮＲ細胞^（１６）に、抗体分泌のための黄熱ウイルス中和抗体ｍＡｂ－１７、または抗体発現を誘導しない空のプラスミドを形質導入した。９６ウェルプレートで４日間の抗体分泌後の細胞株を試験し、その後ＹＦＶ組換えウイルス粒子（ＲＶＰ）を添加して、分泌抗体がＹＦＶ ＲＶＰからの保護を提供することを検証する（図１７）。ｍＡｂ １７を発現する細胞はＹＦＶ ＲＶＰ感染から保護されたが、ｍＡｂ １７を発現しない細胞は感染から保護されなかった。これらのデータは、抗体分泌タンパク質の機能的中和特性を、迅速かつハイスループット方法での抗ＹＦＶ抗体中和の直接スクリーニングのための細胞株プラットフォームとして、ＧＦＰベースのレポーター（ＲＶＰ感染事象の後に発現される）に結び付けることができることを立証した。

【0216】

［実施例２０： 異なるリーダーペプチドおよびプロモーターの組み合わせによる抗体発現］

【0217】

この実施例では、ＡＣＥ２を発現するＨＥＫ２９３細胞の、抗体分泌のために異なるリーダーペプチド組み合わせ（ＬＰ１、ＬＰ４、ＬＰ５およびＬＰ６）で発現された９１０－３０を含有するプラスミドで一過性にトランスフェクトされる能力を試験した。リポフェクタミン３０００を、９６ウェルプレート中で逆トランスフェクションプロトコルに従ってトランスフェクション試薬として使用し、３７℃で２日間インキュベートした。トランスフェクションの２日後、ＧＦＰレポーター遺伝子を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス４０μＬを細胞に添加し、３７℃でさらに３日間インキュベートした。偽ウイルスを添加した３日後、分泌されたＩｇＧを含有する上清を、ＥＬＩＳＡ抗体定量化に使用するために細胞から除去する。ＥＬＩＳＡの読み出しを図１８に示す。多数のペプチドの組み合わせによって発現される抗体ＶＲＣ０１およびＣＲ３０２２は、抗体発現の成功を示し、異なるリーダーペプチドおよびプロモーター配列を使用した抗体の分泌の成功を示した。

【0218】

［実施例２１： 可溶性タンパク質細胞分泌プラットフォームに抗体をクローニングするためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の使用］

【0219】

この実施例では、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のドナーベクターＡＡＶＳ１ Ｓａｆｅ Ｈａｒｂｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ＨＲ Ｄｏｎｏｒ ２ベクターＧＥ６２２Ａ－１に抗ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２モノクローナル抗体、２－１５をクローニングした。２－１５モノクローナル抗体を含むドナープラスミドをｐＧＥ６２２Ａ２－１５と命名した。次いで、２－１５ドナープラスミド（ｐＧＥ６２２Ａ２－１５）およびＡｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ Ｃａｓ９ Ｓｍａｒｔ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ＡＡＶＳ１ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃ＣＡＳ６０１Ａ－１）をＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後のＣａｓ９ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡの発現は、Ｅｘｐｉ２９３細胞ＡＡＶＳ１ゲノム部位で二重株破壊を起こした。ドナープラスミドからの２－１５遺伝子配列を、相同組換え事象に起因してＡＡＶＳ１遺伝子座にインテグレーションした（以下の２－１５遺伝子インテグレーションの説明を参照）。トランスフェクションの１週間後にピューロマイシン選択（５μｇ／ｍＬの濃度）を開始して、ランダムインテグレーションＥｘｐｉ２９３細胞を減らした。２～１５個の遺伝子インテグレーションを有する安定な細胞プールをＥｘｐｉ２－１５と命名した。

【0220】

Ｅｘｐｉ２－１５およびＥｘｐｉ２９３細胞を、ウェルあたり３．２×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。次いで細胞を、これらの細胞（Ｅｘｐｉ２－１５およびＥｘｐｉ２９３の両方）を播種した直後に、ＡＣＥ２／ＴＭＲＰＳＳ２発現プラスミドでトランスフェクトした。中和アッセイの陽性対照のために、精製した９１０３０抗体（最終濃度５μｇ／ｍＬ）をＡＣＥ２／ＴＭＲＰＳＳ２発現Ｅｘｐｉ２９３細胞に添加した。さらなるＩｇＧ定量化分析のために、各ウェルから２０μＬの培養培地を分注した。スパイクタンパク質Ｄ６１４Ｇ変異およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する８０μＬのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２レポーターウイルス粒子を、ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２発現Ｅｘｐｉ２－１５細胞（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２＋Ｅｘｐｉ２－１５）、ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２発現野生型Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋Ｅｘｐｉ２９３）、および５μｇ／ｍＬの９１０３０を含むＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２発現野生型Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋Ｅｘｐｉ２９３＋９１０３０）に添加した。

【0221】

レポーターウイルスを添加した３日後、培養培地を取り出し、３０μＬのＰＢＳおよび３０μＬの希釈Ｒｅｎｉｌｌａ－Ｇｌｏアッセイ基質（アッセイ緩衝液中に１：１００で希釈したＲｅｎｉｌｌａ－Ｇｌｏアッセイ基質）を添加した。次いで、室温で１０分間インキュベートした後、ルミノメーターで発光を検出した。各群のルミノメーター読み取りの平均相対発光量（ＲＬＵ）を計算した。以下の図に示すように、ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２＋Ｅｘｐｉ２－１５群およびＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋Ｅｘｐｉ２９３＋９１０３０（陽性対照）群の両方が、ＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋Ｅｘｐｉ２９３群と比較して相対発光量の有意な減少を示し、Ｅｘｐｉ２－１５細胞から分泌された２－１５がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２偽ウイルスを中和することができることを示している（図２０）。

【0222】

ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２＋Ｅｘｐｉ２－１５群の抗体発現レベルをＥＬＩＳＡによって検証した。平均抗体発現レベルは、ＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ ２＋Ｅｘｐｉ２－１５からの０．２３μｇ／ｍＬ（ｎ＝６）抗体発現であり、Ｅｘｐｉ２－１５細胞が機能的に活性な２－１５を分泌できることを示唆している（図２１）。５ｕｇ／ｍＬの精製９１０３０モノクローナル抗体（精製９１０３０のナノドロップに基づいて計算）を含有する群、ＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋Ｅｘｐｉ２９３＋９１０３０を、本発明者らのＥＬＩＳＡアッセイのインターナルコントロールとして３．９μｇ／ｍＬの濃度でＥＬＩＳＡによって測定した。

【0223】

ゲノムＰＣＲをさらに実行して、Ｅｘｐｉ２－１５細胞株への２－１５ ｍａｂ遺伝子配列決定のインテグレーションを検証した。最初に、野生型Ｅｘｐｉ２９３およびＥｘｐｉ２－１５細胞株からゲノムＤＮＡを単離した。次いで、ＧｏＴａｑ２ホットスタートポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｍ７４０５）、およびＳｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって検証され、提供されるプライマー（上流プライマーセット、フォワード５’ ＴＣＣＴＧＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴ ３’（配列番号２５）およびリバース５’ ＣＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＡＣＴＴＣＣ ３’（配列番号２６））を使用してＰＣＲ増幅を行って、上流遺伝子インテグレーション領域を増幅した。Ｅｘｐｉ２－１５細胞からの１０００ｂ．ｐ．アンプリコンは、野生型Ｅｘｐｉ２９３細胞からのＰＣＲ増幅無しと比較して遺伝子インテグレーションの成功を示した（図２２ａを参照のこと）。

【0224】

インターナルＰＣＲコントロールのためのヒトコントロールプライマーセット（フォワード５’－ＡＣＣＴＣＣＡＧＴＴＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＴ－３’（配列番号２７）リバース５’－ＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡ－３’（配列番号２８））を使用する別個のＰＣＲ反応（図２２ｂ）。

【0225】

［実施例２２： 可溶性タンパク質細胞分泌プラットフォームに抗体をクローニングするためのＴＡＲＧＡＴＴ特異的インテグレーションの使用］

【0226】

この実施例では、ＴＡＲＧＡＴＴ（商標）ＨＥＫマスター細胞株ノックインキットの取扱説明書に従い、抗ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２モノクローナル抗体、２－１５をＴＡＲＧＡＴＴ ２４ ＣＭＶ－ＭＣＳ－ａｔｔＢにクローニングしてドナープラスミドを作製した（ｐＴＡＲＧＡＴＴ２－１５と命名）。次いで、２－１５ドナープラスミド（ｐＴＡＲＧＡＴＴ２－１５）およびインテグラーゼプラスミドをＴＡＲＧＡＴＴ ＨＥＫマスター細胞に同時トランスフェクトした。インテグラーゼは、２－１５モノクローナル抗体、ｍＣｈｅｒｒｙおよびブラストサイジン選択マーカーのゲノムへのインテグレーションを可能にする、遺伝子組換え事象を触媒する（図２３参照）。

【0227】

トランスフェクションの３日後、トランスフェクト細胞を１：２０の分割比で継代培養した。継代培養の２４時間後、１０μｇ／ｍＬの濃度のブラストサイジンを添加し、ブラストサイジン選択圧を２週間維持した。次いで細胞選別を実施して、２－１５組み込み細胞が濃縮したｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を単離した（ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５と命名）。ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５細胞の回収後、ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５および野生型ＴＡＲＧＡＴＴ細胞を、ウェルあたり３．２×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。次いで細胞を播種した直後に、（実施例１および図２に記載されるように）ＡＣＥ２／ＴＭＲＰＳＳ２発現プラスミドで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、偽ウイルス中和アッセイに先立って、精製９１０３０抗体（最終濃度５μｇ／ｍＬ）を陽性対照として未修飾ＴＡＲＧＡＴＴ細胞に添加した。さらなるＩｇＧ定量化分析のために、各ウェルから２０μＬの培養培地を分注した。

【0228】

スパイクタンパク質Ｄ６１４Ｇ変異およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する８０μＬのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２レポーターウイルス粒子を、ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２発現ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５細胞（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２＋ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５）、ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２発現野生型ＴＡＲＧＡＴＴ細胞（ＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋ＴＡＲＧＡＴＴＷＴ）、および５μｇ／ｍＬの精製９１０３０を含むＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２発現野生型ＴＡＲＧＡＴＴ細胞（ＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋９１０３０）に添加した。レポーターウイルスを添加した３日後、培養培地を取り出し、３０μＬのＰＢＳおよび３０μＬの希釈Ｒｅｎｉｌｌａ－Ｇｌｏアッセイ基質（アッセイ緩衝液中に１：１００で希釈したＲｅｎｉｌｌａ－Ｇｌｏアッセイ基質）を添加した。次いで、室温で１０分間インキュベートした後、ルミノメーターで発光を検出した。各群のルミノメーター読み取りの平均相対発光量（ＲＬＵ）を計算した。以下の図に示すように、ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２＋２－１５群およびＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋９１０３０群の両方が、ＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋ＷＴ群と比較して相対発光量の有意な減少を示し、ＴＡＲＧＡＴＴＨＥＫ２－１５細胞から分泌された２－１５がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２偽ウイルスを中和することができることを示している（図２４）。

【0229】

ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２＋ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５群の抗体発現レベルをＥＬＩＳＡによって検証した。平均抗体発現レベルは、ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５からの０．４４μｇ／ｍＬ（ｎ＝６）抗体発現であり、ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５細胞が機能的に活性な２－１５を分泌できることを示唆している（図２５）。５μｇ／ｍＬの精製９１０３０モノクローナル抗体（精製９１０３０のナノドロップに基づいて計算）を含有する群、ＡＣＥ／ＴＭＰＲＳＳ２＋９１０３０を、本発明者らのＥＬＩＳＡアッセイのインターナルコントロールとして２．７４μｇ／ｍＬの濃度でＥＬＩＳＡによって測定した。

【0230】

ゲノムＰＣＲをさらに実行して、ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５細胞株への２－１５ ｍａｂ遺伝子配列決定のインテグレーションを検証した。最初に、野生型ＴＡＲＧＡＴＴおよびＴＡＲＧＡＴＴ２－１５細胞株からゲノムＤＮＡを単離した。次いでＰＣＲ増幅を実行して、ＧｏＴａｑ２ホットスタートポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｍ７４０５）、およびＡｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ，Ｉｎｃ．によって検証され、提供されたプライマー配列（下流プライマーセット、フォワード５’ ＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＧＣＣＧＴ ３’（配列番号２９）およびリバース５’ ＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＴＴＣＧＡＡＧＧＧ ３’（配列番号３０））を使用して下流遺伝子インテグレーション領域を増幅した。ＴＡＲＧＡＴＴ２－１５群からの５００ｂ．ｐ．アンプリコンは、野生型ＴＡＲＧＡＴＴ細胞からのＰＣＲ増幅無しと比較して、遺伝子インテグレーションの成功を示した（図２６）。

【0231】

［実施例２３： 次世代シーケンシングを使用して中和抗体を同定するための迅速液滴ベースアッセイの使用］

【0232】

この予言的例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）では、抗体をＲａｊｉ－ＤＣＳＩＧＮＲ細胞にクローニングし、合成ライブラリー混合物を生成して、液滴ベースのスクリーニングの、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）を標的とする中和抗体を同定する能力を試験する。Ｒａｊｉ－ＤＣＳＩＧＮＲ細胞のレンチウイルス形質導入を利用して、ハイスループット単一細胞中和アッセイに使用されるそれらの能力を評価した。Ｒａｊｉ－ＤＣＳＩＧＮＲ細胞に、抗体分泌のための黄熱ウイルス中和抗体ｍＡｂ－１７、またはＹＦＶを中和しない他の抗体（９１０－３０、ＶＲＣ０１、および２－１５）を形質導入する。細胞をマイクロ流体液滴にカプセル封入し、それらを２４時間インキュベートして（ただし、インキュベーション時間は実験の目的に応じて数分から数週間に及んでもよい）、液滴内での抗体の分泌および蓄積を促進する。次に、電気融合技術を使用して液滴を混同し（液滴混同のための他の技術も使用することができ、当業者に公知である）、３７℃で一晩インキュベートして、分泌抗体によって保護されていない任意の細胞を偽ウイルスに感染させる（インキュベーション時間およびインキュベーション温度は、実験の目的に応じて変更してもよい）。液滴を破壊し、細胞を回収する。短時間のインキュベーション時間（実験の目的に応じて、０分～数週間の範囲であり得る）の後、フローサイトメーターでＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ－細胞を選別して、中和細胞と非中和細胞とを分離する。細胞を回収し、ＰＣＲベースの増幅のためにゲノムＤＮＡを抽出する。

【0233】

データセット内の各抗体クローンの有病率を定量する次世代シーケンシングのためにＤＮＡが送られる。中和抗体はＧＦＰ－細胞のセットで濃縮され、ＧＦＰ＋細胞で枯渇し、これらの濃縮特徴に基づいて中和抗体を同定することができた。これらのデータは、抗体分泌タンパク質の機能的中和特性を、迅速かつハイスループット方法での抗ＹＦＶ抗体中和の直接スクリーニングのための細胞株プラットフォームとして、レポーター（組換えウイルス粒子、ＲＶＰ感染事象の後に発現される）に結び付けることができること、さらに、中和抗体の配列を次世代シーケンシング分析を使用して検出できることを立証するであろう。

【0234】

［実施例２４： ＨＩＶ－１の中和のための分泌タンパク質分析］

【0235】

この実施例では、ＴＺＭ－ＧＦＰ細胞を使用して、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）を中和する分泌タンパク質の能力を試験した。レンチウイルス形質導入ＴＺＭ－ＧＦＰ細胞を利用して、ハイスループット単一細胞中和アッセイでのそれらの能力を評価した。ＴＺＭ－ＧＦＰ細胞^（２３）に、抗体分泌のためのＨＩＶ－１中和抗体ＶＲＣ３４、またはＨＩＶ－１を中和しない対照抗体（７２Ａ１）を形質導入した。ＨＩＶ－１偽ウイルス粒子（株Ｗ６Ｍ．ＥｎＶ．Ｃ２）を添加する前に、９６ウェルプレートで２日間抗体を分泌させた後に細胞株を試験して、分泌抗体がＨＩＶ－１偽ウイルスからの保護を提供することを確認した（図２７）。ＶＲＣ３４を発現する細胞はＨＩＶ－１偽ウイルス感染から保護されたが、ＶＲＣ３４を発現しない細胞は感染から保護されなかった。これらのデータは、抗体分泌タンパク質の機能的中和特性を、迅速かつハイスループット方法での抗ＨＩＶ－１抗体中和の直接スクリーニングのための細胞株プラットフォームとして、ＧＦＰベースのレポーター（偽ウイルス感染事象の後に発現される）に結び付けることができることを立証した。

【0236】

［実施例２５： 分泌タンパク質細胞ライブラリーを用いて液滴内の可溶性分泌アッセイを可能にする液滴混同技術］

【0237】

この実施例では、液滴混同技術を適用して、カプセル封入および液滴混同、ならびに分泌細胞アッセイを可能にする、細胞ライブラリーからのＤＮＡの回収を実証する。最初に合成細胞ライブラリーを生成し、そこで各細胞は、別個の抗体クローンを分泌し、分泌タンパク質機能をスクリーニングするために使用され得るＡＣＥ２も発現する。抗体クローンを発現する４つの異なる細胞群を単一のライブラリーに混合した（表３）。

【0238】

表３．既知の抗体クローンを発現する細胞を混合し、人工細胞ライブラリーとして使用した。ＡＣＥ２を発現するＨＥＫ２９３－Ｔクローンおよび異なるモノクローナル抗体クローンを、５％ウシ胎児血清および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充した高グルコースＤＭＥＭにおいて１×１０^６細胞／ｍＬで示されるように混合した。

【0239】

【表3】

【0240】

直径約８０μｍの液滴を生成する液滴ジェネレーター（Ｆ０２－ＨＰＢ－８ｘ、ｕＦｌｕｉｄｉｘ、カナダ）を使用して、細胞を単一細胞エマルジョンに捕捉した。次に、電場を適用して液滴の混同を誘導する、液滴混同デバイスに液滴をロードした。このデバイスはまた、細胞液滴と混同するためのローダミン１１０（直径：約４０μｍ、＃８３６９５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を含有する液滴を生成する（図２８）。

【0241】

［実施例２６： 可溶性タンパク質分泌アッセイ後に異なる選択マーカーで選別された細胞集団中の分泌タンパク質を同定するためのＤＮＡの回収］

【0242】

この実施例では、液滴混同技術を適用して、カプセル封入および液滴混同、ならびに分泌細胞アッセイを可能にする、細胞ライブラリーからのＤＮＡの回収を実証する。４つの異なる抗体クローンを含む合成細胞ライブラリー（表３）を生成し、選別したが、その一部のみがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を強力に中和することができる。

【0243】

感染細胞においてＧＦＰ発現を誘導するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスとの液滴混同後、細胞をエマルジョンから回収し、ライブラリー中の分泌抗体間の機能的性能差を示すＧＦＰマーカーの発現について選別した。この場合、機能的スクリーニングにより、ＧＦＰ－細胞集団において比較的濃縮された中和抗体が同定され、非中和抗体がＧＦＰ＋細胞集団に含まれていた。

【0244】

ゲノムＤＮＡを、Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を使用してＨＥＫ細胞から単離した。次に、サイトメガロウイルスプロモーターの３’領域および重定常鎖の５’領域を固定するプライマーを使用する、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して重鎖可変領域を増幅した。使用したプライマー配列は、フォワード：５’－ＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡ－３’（配列番号３１）、リバース：５’－ＣＣＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＡＧ－３’（配列番号３２）であった。ポリメラーゼ連鎖反応を、アニーリング温度として５１℃を使用して４０サイクル中に行った。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル中で、１ Ｋｂ ＤＮＡラダー（＃Ｎ０５５０Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、米国）を用いて分解し、サイズを調節した。得られたＤＮＡゲルを図２９に示す。これらのデータは、ハイスループット液滴ベースの細胞分泌タンパク質機能アッセイにおいて利用される細胞からＤＮＡ配列を回収する、本発明者らの能力を実証する。

【0245】

［実施例２７： エマルジョン液滴システム内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する既知の中和特性を有する抗体の合成ライブラリーを使用する単一細胞アッセイの適用］

【0246】

この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの中和のための抗体分子を分泌する合成細胞ライブラリーのスクリーニングの成功に関する。最初に、異なるモノクローナル抗体を発現するＨＥＫ－ＡＣＥ２を混合して、４つの抗体産生細胞（以前に報告された抗体ＶＲＣ０１、ＣＲ３０２２、９１０－３０およびｍＡｂ１－２０）からなる合成ライブラリーを生成した。ＶＲＣ０１はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和せず、陰性対照の役割を果たす。マイクロ流体デバイスを使用して合成ライブラリーをＤＭＥＭ培地でカプセル封入し、液滴あたり１つの細胞を含む液滴を形成した。液滴を２４時間インキュベートし、抗体蓄積のために液滴内でＩｇＧを分泌させた。続いて、Ｄ６１４Ｇ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを含有する第２の液滴を、ＩｇＧ発現ＨＥＫ－ＡＣＥ２細胞を含む液滴に混同した。電気融合を使用して液滴を混同したが、マイクロピラー抵抗アレイの使用を含む、液滴を混同する代替方法が報告されている。混同された液滴をさらに２４時間インキュベートして、偽ウイルスの感染または中和を発生させた。次いで液滴を破壊し、細胞を回収する。細胞を４８時間回復させた。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用してＧＦＰ－集団およびＧＦＰ＋集団を単離し、細胞アリコートからｇＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを実行してＮＧＳ分析用の抗体遺伝子ライブラリーを回収した。ＧＦＰ－細胞も回収し、中和クローンについてさらに濃縮するためのその後のスクリーニングラウンドの入力として使用した。

【0247】

ＧＦＰ－細胞およびＧＦＰ＋細胞の選別された各ライブラリーに対してハイスループット配列決定分析を実施して、重鎖配列情報を得た。各集団における重鎖抗体バリアントの頻度を比較して、集団における中和抗体および非中和抗体に対する液滴中和アッセイの効果を決定した（図３０、表４）。

【0248】

【表4】

【0249】

［実施例２８： エマルジョン液滴システム内のＨＩＶ偽ウイルスに対する既知の中和特性を有する抗体の合成ライブラリーを使用する単一細胞アッセイの適用］

【0250】

この実施例は、ＨＩＶ偽ウイルスの中和のための抗体分子を分泌する合成細胞ライブラリーのスクリーニングの成功に関する。最初に、異なるモノクローナル抗体を発現するＴＺＭ－ＧＦＰ細胞を混合して、３つの抗体産生細胞（以前に報告された抗体７２Ａ１、ＶＲＣ０１およびＶＲＣ３４）からなる合成ライブラリーを生成した。７２Ａ１はＨＩＶ－１を中和せず、陰性対照の役割を果たす。マイクロ流体デバイスを使用して合成ライブラリーを培地でカプセル封入し、液滴あたり１つの細胞を含む液滴を形成した。液滴を２４時間インキュベートし、抗体蓄積のために液滴内でＩｇＧを分泌させた。続いて、ＨＩＶ－１ ＢＧ５０５．Ｗ６Ｍ．Ｅｎｖ．Ｃ２偽ウイルスを含有する第２の液滴を、ＩｇＧ発現ＴＺＭ－ＧＦＰ細胞を含む液滴に混同した。電気融合を使用して液滴を混同したが、マイクロピラー抵抗アレイの使用を含む、液滴を混同する代替方法が報告されている。混同された液滴をさらに２４時間インキュベートして、偽ウイルスの感染または中和を発生させた。次いで液滴を破壊し、細胞を回収する。細胞を４８時間回復させた。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用してＧＦＰ－集団およびＧＦＰ＋集団を単離し、細胞アリコートからｇＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを実行してＮＧＳ分析用の抗体遺伝子ライブラリーを回収した。ＧＦＰ－細胞も回収し、中和クローンについてさらに濃縮するためのその後のスクリーニングラウンドの入力として使用した。

【0251】

ＧＦＰ－細胞およびＧＦＰ＋細胞の選別された各ライブラリーに対してハイスループット配列決定分析を実施して、重鎖配列情報を得た。各集団における重鎖抗体バリアントの頻度を比較して、集団における中和抗体および非中和抗体に対する液滴中和アッセイの効果を決定した（図３１、表５）。

【0252】

【表5】

【0253】

［引用文献］
以下に列挙されるものを含む、本開示で提供されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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８．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍ．，Ｋｌｅｉｎｅ－Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｓ．，Ｋｒｕｇｅｒ，Ｎ．，Ｈｅｒｒｌｅｒ，Ｔ．，Ｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｓ．，Ｓｃｈｉｅｒｇｅｎｓ，Ｔ．Ｓ．，Ｈｅｒｒｌｅｒ，Ｇ．，Ｗｕ，Ｎ．－Ｈ．，Ｎｉｔｓｃｈｅ，Ａ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｄｒｏｓｔｅｎ，Ｃ．＆Ｐｏｈｌｍａｎｎ，Ｓ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＡＣＥ２ ａｎｄ ＴＭＰＲＳＳ２ ａｎｄ Ｉｓ Ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｖｅｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｃｅｌｌ １８１，２７１－２８０．ｅ８（２０２０）．
９．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６ Ｍａｒ；１１（３）：４２９－４２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．０２４．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｆｅｂ ４．
１０．Ｋｕｌｍａｌａ Ａ，Ｈｕｏｖｉｎｅｎ Ｔ，Ｌａｍｍｉｎｍａｋｉ Ｕ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｆａｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２０１９ Ｓｅｐ １６；１８（１）：１５７．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９３４－０１９－１２１０－１．ＰＭＩＤ：３１５２６３９５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６７４５８０２．
１１．Ｚａｌｕｃｋｉ ＹＭ，Ｂｅａｃｈａｍ ＩＲ，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＭＰ．Ｂｉａｓｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｏｒｔ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００９ Ａｐｒ；１７（４）：１４６－５０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｍ．２００９．０１．００５．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｍａｒ ２１．ＰＭＩＤ：１９３０７１２２．
１２．Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｃｏｌｌｉｎｓ Ａ，Ｃｈｅｎ Ｍ，Ｋｎｙａｚｅｖ Ｉ，Ｇｅｎｔｚ Ｒ．Ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｂｉｏｓｅｐ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｆｉｌｔｅｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１９９８ Ａｕｇ ５；５９（３）：３５１－９．ｄｏｉ：１０．１００２／（ｓｉｃｉ）１０９７－０２９０（１９９８０８０５）５９：３＜３５１：：ａｉｄ－ｂｉｔ１１＞３．０．ｃｏ；２－ｈ．ＰＭＩＤ：１００９９３４６．
１３．Ａｒｎｏｌｄ ＣＥ，Ｐａｒｅｋｈ ＲＮ，Ｙａｎｇ Ｗ，Ｗｉｔｔｒｕｐ ＫＤ．Ｌｅａｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１９９８ Ａｕｇ ５；５９（３）：２８６－９３．ＰＭＩＤ：１００９９３３９．
１４．Ｋｈｏｒｓｈｉｄｉ Ｓ，Ｚｏｍｏｒｏｄｉｐｏｕｒ Ａ，Ｂｅｈｍａｎｅｓｈ Ｍ，Ｖａｔａｎｄｏｏｓｔ Ｊ，Ｂｏｓ ＭＨ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｕｓｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１５ Ｓｅｐ；３７（９）：１７７３－８１．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０５２９－０１５－１８６８－３．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｊｕｎ ２４．Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１５ Ｏｃｔ；３７（１０）：２０９７．ＰＭＩＤ：２６１０５５５９．
１５．Ｍｕｋｈａｍｅｄｏｖａ Ｍ，Ｗｒａｐｐ Ｄ，Ｓｈｅｎ ＣＨ，Ｇｉｌｍａｎ ＭＳＡ，Ｒｕｃｋｗａｒｄｔ ＴＪ，Ｓｃｈｒａｍｍ ＣＡ，Ａｕｌｔ Ｌ，Ｃｈａｎｇ Ｌ，Ｄｅｒｒｉｅｎ－Ｃｏｌｅｍｙｎ Ａ，Ｌｕｃａｓ ＳＡＭ，Ｒａｎｓｉｅｒ Ａ，Ｄａｒｋｏ Ｓ，Ｐｈｕｎｇ Ｅ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｒｕｓｈ ＳＡ，Ｍａｄａｎ Ｂ，Ｓｔｅｗａｒｔ－Ｊｏｎｅｓ ＧＢＥ，Ｃｏｓｔｎｅｒ ＰＪ，Ｈｏｌｍａｎ ＬＡ，Ｈｉｃｋｍａｎ ＳＰ，Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ ＮＭ，Ｄｏｒｉａ－Ｒｏｓｅ ＮＡ，Ｍｏｒａｂｉｔｏ ＫＭ，ＤｅＫｏｓｋｙ ＢＪ，Ｇａｕｄｉｎｓｋｉ ＭＲ，Ｃｈｅｎ ＧＬ，Ｃｒａｎｋ ＭＣ，Ｍｉｓａｓｉ Ｊ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＮＪ，Ｄｏｕｅｋ ＤＣ，Ｋｗｏｎｇ ＰＤ，Ｇｒａｈａｍ ＢＳ，ＭｃＬｅｌｌａｎ ＪＳ，Ｍａｓｃｏｌａ ＪＲ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０２１ Ａｐｒ １３；５４（４）：７６９－７８０．ｅ６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０２１．０３．００４．Ｅｐｕｂ ２０２１ Ａｐｒ ５．ＰＭＩＤ：３３８２３１２９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ８０９９４２２．
１６．Ｆａｈａｄ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｉｎ Ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ Ｚｉｋａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，（２０２１）．
１７．Ｂａｎａｃｈ，Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｐａｉｒｅｄ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｐｏｔｅｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｕｂｌｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．１２．３１．４２４９８７（２０２１）ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１２．３１．４２４９８７．
１８．ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｉｒｅｄ ｈｅａｖｙ－ａｎｄ ｌｉｇｈｔ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１，８６－９１（２０１５）．
１９．Ｗａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｎｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｉｖｅｌｙ ｐａｉｒｅｄ ｈｕｍａｎ ＶＨ：ＶＬ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６，１５２－１５５（２０１８）．
２０．Ｔｉａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｎｅａｇｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．Ｃｅｌｌ １６６，１４７１－１４８４．ｅ１８（２０１６）．
２１．Ｊｉｎ，Ｗ．，Ｍａｄａｎ，Ｂ．，Ｍｕｓｓｍａｎ，Ｂ．Ｋ．，Ｈａｉｌｅｍａｒｉａｍ，Ａ．Ｔ．，Ｆａｈａｄ，Ａ．Ｓ．，Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｌ．，Ｋｗｏｎｇ，Ｐ．Ｄ．＆ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．Ｔｈｅ Ｃｏｖａｌｅｎｔ ＳＮＡＰ Ｔａｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗ－ｐＨ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０２０）．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０２０．０６．０１１
２２．Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．，Ｉｐｐｏｌｉｔｏ，Ｇ．Ｃ．，Ｂｅａｕｓａｎｇ，Ｊ．，Ｂｕｓｓｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｗａｒｄｅｍａｎｎ，Ｈ．＆Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，１５８－１６８（２０１４）．
２３．Ｇｌｕｄｉｓｈ ＤＷ，Ｂｏｌｉａｒ Ｓ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ Ｓ，Ｔｅｍｂｏ ＤＬ，Ｃｈｉｍｂａｙｏ ＥＴ，Ｊａｍｂｏ ＫＣ，Ｍｗａｎｄｕｍｂａ ＨＣ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＧ．ＴＺＭ－ｇｆｐ ｃｅｌｌｓ：ａ ｔｒａｃｔａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｒｅ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０ Ｎｏｖ １６；１０（１）：１９９００．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－７６４２２－６．ＰＭＩＤ：３３１９９７２２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ７６７０４２８．
２４．Ａｂａｔｅ ＡＲ，Ｈｕｎｇ Ｔ，Ｍａｒｙ Ｐ，Ａｇｒｅｓｔｉ ＪＪ，Ｗｅｉｔｚ ＤＡ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｐｉｃｏｉｎｊｅｃｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ Ｎｏｖ ９；１０７（４５）：１９１６３－６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１００６８８８１０７．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｏｃｔ ２０．ＰＭＩＤ：２０９６２２７１；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２９８４１６１．
２５．Ｓｅａｈ，Ｙ．Ｆ．Ｓ．，Ｈｕ，Ｈ．＆Ｍｅｒｔｅｎ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５９，４７－６１（２０１８）．
２６．Ｄｅｂｓ，Ｂ．Ｅ．，Ｕｔｈａｒａｌａ，Ｒ．，Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ，Ｉ．Ｖ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．＆Ｍｅｒｔｅｎ，Ｃ．Ａ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔ－ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９，１１５７０－１１５７５（２０１２）．

【0254】

本発明の範囲および意図から逸脱することなく、本明細書に開示された発明に対して様々な置換および修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定がない状態で適切に実施され得る。使用されている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示され説明された特徴またはその一部の均等物を除外する意図はないが、本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明は特定の実施形態および任意選択の特徴によって例示されているが、本明細書に開示された概念の修正および／または変形が当業者によって行われてもよく、そのような修正および変形は本発明の範囲内にあるとみなされることを理解されたい。

【0255】

本明細書では、多数の特許および非特許文献を引用することができる。引用された文献はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。引用された文献における用語の定義と比較して、本明細書における用語の定義に不一致がある場合、その用語は、本明細書における定義に基づいて解釈されるべきである。

【図1a-b】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図5】

【図6a-b】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12a-b】

【図13】

【図14a-b】

【図15a-b】

【図16a-b】

【図16c】

【図17】

【図18a-b】

【図18c-d】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26a-b】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

2025503698000001.xml

【国際調査報告】