特表 2025-503728 抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）改良抗体を含む融合タンパク質及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-04

(54)【発明の名称】抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）改良抗体を含む融合タンパク質及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20250128BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250128BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20250128BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20250128BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12P21/02 C

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/02

A61K45/00

A61K38/16

A61K39/395 N

A61K39/395 L

A61P9/00

A61P35/00

A61K47/68

A61K47/65

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024542268

(86)(22)【出願日】2023-01-13

(85)【翻訳文提出日】2024-08-05

(86)【国際出願番号】 KR2023000631

(87)【国際公開番号】W WO2023136648

(87)【国際公開日】2023-07-20

(31)【優先権主張番号】10-2022-0005625

(32)【優先日】2022-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520364897

【氏名又は名称】ファームアブシン・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＨＡＲＭＡＢＣＩＮＥ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】２Ｆ， ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＢＵＩＬＤＩＮＧ ２， ＹＵＳＥＯＮＧ‐ＤＡＥＲＯ １６８９ＢＥＯＮ‐ＧＩＬ ７０， ＹＵＳＥＯＮＧ‐ＧＵ， ＤＡＥＪＥＯＮ ３４０４７， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100194973

【弁理士】

【氏名又は名称】尾崎 祐朗

(72)【発明者】

【氏名】ナム ジュリョン

(72)【発明者】

【氏名】イ ヨンエ

(72)【発明者】

【氏名】イ ウォンソプ

(72)【発明者】

【氏名】ユ ジンサン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076CC11

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF34

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA41

4C084CA53

4C084DC50

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA361

4C084ZB212

4C084ZB261

4C084ZC412

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA25

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、向上した特性を示す抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）改良抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質及びその用途に関する。具体的には、本発明は、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに特異的に結合するヒト抗体の重鎖ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＨ１からＶＨ３に置換、及び軽鎖ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＬ１からＶＫ１に置換し、突然変異を誘導させて抗原に対する親和度を増加させた抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）抗体の末端にＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ４）結合タンパク質ドメインを結合した融合タンパク質、前記融合タンパク質を含む新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）関連疾患の診断又は治療用の組成物、腫瘍又は癌の予防又は治療用の組成物、及び前記融合タンパク質以外の治療剤と併用投与するための組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片；及びＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ４）結合タンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、
前記ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、融合タンパク質。

【請求項2】

前記ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体は、配列番号８の重鎖可変領域及び配列番号１０の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＤＬＬ４結合タンパク質は、配列番号１８の配列を含むＮｏｔｃｈ１である、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記ＤＬＬ４結合タンパク質ドメインは、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体の軽鎖Ｎ末端に結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片、及びＤＬＬ４結合タンパク質ドメインは、リンカーを介して連結されていることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記リンカーは、（Ｇ_ｎＳ）_ｍ（ｎ、ｍはそれぞれ、１～１０）を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項9】

請求項８に記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。

【請求項10】

次の段階を含む融合タンパク質の製造方法：
（ａ）請求項９に記載の細胞を培養して融合タンパク質を生成する段階；及び
（ｂ）前記生成された融合タンパク質を回収する段階。

【請求項11】

請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む血管新生疾患の予防又は治療用の組成物。

【請求項12】

請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む血管新生疾患診断用の組成物。

【請求項13】

請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む腫瘍又は癌の予防又は治療用の組成物。

【請求項14】

請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む他の治療剤との併用投与用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、向上した特性を示す抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）改良抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質及びその用途に関する。具体的には、本発明は、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに特異的に結合するヒト抗体の重鎖ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＨ１からＶＨ３に置換、及び軽鎖ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＬ１からＶＫ１に置換し、突然変異を誘導させて抗原に対する親和度を増加させた抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）抗体の末端にＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ４）結合タンパク質ドメインを結合させた融合タンパク質、前記融合タンパク質を含む新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関連した疾患の診断又は治療用の組成物、腫瘍又は癌の予防又は治療用の組成物、及び前記融合タンパク質以外の治療剤と併用投与するための組成物に関する。

【0002】

【背景技術】

【0003】

ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲは一次的な血管新生受容体で、ＶＥＧＦイソ型であるＡ、Ｃ、Ｄ及びＥと結合し、内皮細胞分化だけでなくＶＥＧＦのマイトジェン性、血管新生性及び浸透性－強化効果に重要である。抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、公知された全てのＶＥＧＦイソ型がＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合してシグナリングを始めることを防止できる。また、腫瘍はより多い数のＶＥＧＦを分泌するのに対し、受容体の数は相対的に一定に維持されるため、受容体を標的することは、非常に高いレベルのＶＥＧＦイソ型の存在下でさえも完全にシグナリングを抑制する確率を増加させる。

【0004】

新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、内皮細胞の成長、分裂、移動などによって既存の血管から新しい血管が生成されることを意味し、成人では、傷の治療、女性の生殖サイクルなどの特別な場合を除いては発生しない。しかし、腫瘍の成長と転移、加齢性黄斑変性（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性網膜病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）及び慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）などのような疾病において過度な新生血管の形成が報告されており（Ｃａｍｅｌｉｅｔ ａｎｄ Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９，２０００）、このような理由で、新生血管抑制剤を用いて疾病治療、特に腫瘍の治療をしようとする努力が多く行われている。

【0005】

１９７１年にＤｒ．Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎによって、腫瘍の成長と転移は新生血管形成依存的であり、したがって、抗新生血管形成にフォーカスした治療法は固形癌に対する新しい治療剤になり得るとの仮設が提起されて以来、過度な新生血管形成機序の抑制と関連した研究は多数の研究者の関心を集めてきた（Ｆｅｒｒａｒａ ａｎｄ Ｋｅｒｂｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：９６７，２００５）。新生血管形成過程の進行様相は、新生血管形成誘発因子と新生血管形成阻害因子の総合的なバランスによって決定され、諸段階の複雑かつ順次的な過程によって進行される。その過程について説明すると、まず、腫瘍や傷ついた組織から分泌される血管内皮成長因子（Ｖａｓｉｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）をはじめとする様々な新生血管形成誘発因子が周辺の既存血管内皮細胞の該当の受容体に結合することにより、血管内皮細胞を活性化させ、血管内皮細胞の透過性を増加させ、基底膜タンパク分解酵素（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＭＭＰ）のようなタンパク質分解酵素を分泌することにより、血管内皮細胞周辺の基底膜と細胞外基質を分解させ、血管内皮細胞が既存の毛細血管から離れて、新生血管形成誘発因子を分泌する組織に向かって移動・増殖することになる。移動・増殖した血管内皮細胞は、血管内チューブ構造をなし、最後に、血管内皮細胞の構造的支持台である血管周囲細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）が流入しながら、安定で成熟した血管形成がなされる。

【0006】

上の血管形成過程において正常血管チューブ形成をなす主要因子の一つがＤＬＬ４である。ＤＬＬ４はＶＥＧＦによって特異的に誘導され、Ｎｏｔｃｈ受容体に作用して血管新生性発芽を適切に調節する役割を担当する。ＤＬＬ４を遮断すると血管新生部位末端の細胞において外側抑制（ｌａｔｅｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）の欠失が現れ、過度な発芽がなされる。その結果として、過度に多いであるのに生産性は低下する血管新生反応が高くなり、酸素を供給する灌流が悪くなって癌の周辺に低酸素状態を誘導するとされている。癌実験モデルにおいてもＤＬＬ４信号伝達の活性化は血管新生を向上させたが、抑制すると癌の成長が阻害されることが見られた（Ｌｏｂｏｖ ＩＢ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ Ｆｅｂ ２７；１０４（９）：３２１９－２４）。

【0007】

前記ＤＬＬ４は、Ｎｏｔｃｈ受容体に対するリガンドの一つであり、哺乳動物には現在まで４種類のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ １～４）と５種類のＮｏｔｃｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ－１、Ｊａｇｇｅｄ－２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４）が存在することが知られており、Ｎｏｔｃｈ信号伝達体系の場合、一つの細胞のＮｏｔｃｈリガンドが他の細胞のＮｏｔｃｈ受容体に結合することによって始まるが、必ず互いに異なる細胞間の直接的な相互作用によってのみ活性化される（Ｂｒａｙ ＳＪ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．，７（９）：６７８，２００６）。

【0008】

ＮｏｔｃｈリガンドがＮｏｔｃｈ受容体に結合すると、まず、ＡＤＡＭメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）が活性化されることにより、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞膜外側の近接部位が切断され、続いてガンマ－セクレターゼ（ｇａｍｍａ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）複合体が活性化されることにより、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞膜内側の近接部位を切断してＮＩＣＤ（Ｎｏｔｃｈ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ）が遊離し、ＮＩＣＤは核に移動してＲＢＰＪ／ＣＳＬ転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）と結合し、Ｈｅｓ、Ｈｅｙのような塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ－ｌｏｏｐ－ｈｅｌｉｘ）タンパク質などのＮｏｔｃｈターゲット遺伝子の発現を誘導する。このように、Ｎｏｔｃｈ信号伝達体系は、当該細胞が処している状況によって増殖／分化／自滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）などの運命を決定し、正常幹細胞及び癌幹細胞の維持にも重要な働きをする。

【0009】

基本的に、全てのＮｏｔｃｈ受容体が全てのＮｏｔｃｈリガンドと結合し得るが、このような様々な結合の組合せは、当該細胞が処している微細環境で選択的に調節される。例えば、ＤＬＬ４は、胎児発達過程で血管新生時に内皮細胞に強く発現し、周辺内皮細胞に発現するＮｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４と結合するが、このうち、ＤＬＬ４－Ｎｏｔｃｈ１結合が排他的に最も重要であり（Ｙａｎ Ｍ，Ｖａｓｃ Ｃｅｌｌ，２０１１）、この結合によって血管新生が進行される。このような事実は、遺伝子欠乏実験などからよく究明されている（Ｄｕａｒｔｅ ｅｔ ａｌ ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ，２００４；Ｇａｌｅ ｅｔ ａｌ ．，ＰＮＡＳ，２００４；Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００４）。

【0010】

したがって、ＤＬＬ４－Ｎｏｔｃｈ１結合を阻害させると血管新生が抑制され、これにより、腫瘍などの様々な疾患が治療できる。既に、癌治療においてアバスチン（ベバシズマブ）などを用いてＶＥＧＦを抑制すると血管形成が抑制され、腫瘍の灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）が減少するにつれて腫瘍サイズが減る一方、ＤＬＬ４を標的にして周辺細胞において発現するＮｏｔｃｈ１との結合を抑制すると、血管が異常に多く生成（ｈｙｐｅｒｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）されるものの正常に機能できず（ｎｏｎ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）、腫瘍の灌流が減少し、結果的に腫瘍サイズが減る（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ ，，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ，７（５）：３２７，２００７）点が立証されている。

【0011】

したがって、本研究者らは、Ｎｏｔｃｈ１、特に、本発明ではＮｏｔｃｈ１のＤＬＬ４結合部位を既存抗体に融合させた二重標的抗体を作製することによって、新生血管形成を効果的に抑制しようとした。

【0012】

新生血管形成に関与する因子には血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、転換成長因子（ＴＧＦｂ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などがあり、中でも内皮細胞成長因子は内皮細胞の成長、分化移動に直接に関与する内皮細胞特異的因子で、４種の互いに異なるイソ型（ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６）が存在し、胎盤以外の全てのヒト組織でＶＥＧＦ１６５が最も豊富なイソ型である（Ｔｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６６：１１９４７，１９９１）。

【0013】

内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は、ｉｎ ｓｉｔｕで内皮前駆体（血管母細胞）の分化からの新しい血管形成を調節し、胚芽組織（Ｂｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｃａｍｂ）、１１４：５２１，１９９２）、大食細胞、傷治癒期間における増殖上皮角質細胞（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１３７５，１９９２）で発現し、炎症と結びついた組織浮腫の原因であり得る（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１３：１８，１９９２）。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究によれば、多形成膠芽細胞腫、血管芽細胞腫、中枢神経系新生物及びエイズ－結付カポシ肉腫（Ｐｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．，ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４５，１９９２；Ｐｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：５８２２，１９９３；Ｂｅｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１５３，１９９３；Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ Ｗｅｅｋｌｙ．１３（１）、１９９２）を含めて多数のヒト腫瘍株でＶＥＧＦが高度に発現するということが証明された。高レベルのＶＥＧＦは低酸素症誘導血管新生からも観察された（Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４３，１９９２）。

【0014】

ＶＥＧＦの生物学的機能は、ＶＥＧＦに対して高親和性を有するＶＥＧＦ受容体によって媒介されるが、前記受容体は、胚芽形成（ｅｍｂｒｙｏ遺伝子ｓｉｓ）中（Ｍｉｌｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７２：８３５，１９９３）及び腫瘍形成中に内皮細胞で選択的に発現する。一般に、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）は、それのアミノ末端細胞外受容体リガンド－結合ドメインに複数個、一般に５個又は７個の免疫グロブリン様ループを有することを特徴とするクラスＩＩＩ受容体型チロシンキナーゼである（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：２０２７，１９９３）。他の２部位は、キナーゼインサートドメインと呼ばれる可変性長の親水性インターキナーゼ配列の挿入によって中断されるカルボキシ末端細胞内触媒ドメイン及び膜通過部位を含む（Ｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６：１６７７，１９９１）。ＶＥＧＦＲは、ニューロピリン－１及びニューロピリン－２のような他の受容体もＶＥＧＦに結合することはできるが、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体（ｆｌｔ－１）、又はＶＥＧＦＲ－１（Ｓｈｉｂｕｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏ遺伝子，５：５１９，１９９０；ＷＯ９２／１４２４８；Ｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏ遺伝子，６：１６７７，１９９１）及び 含キナーゼインサートドメイン受容体／胎児間キナーゼ（ＫＤＲ／ｆｌｋ－１）、又はＶＥＧＦＲ－２（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９０２６，１９９１）を含む。他のチロシンキナーゼ受容体であるＶＥＧＦＲ－３（ｆｌｔ－４）は、ＶＥＧＦホモログであるＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄに結合し、リンパ管の発達において重要な役割を担う。

【0015】

高レベルのＦｌｋ－１は、神経膠芽腫を浸潤する内皮細胞によって発現する（Ｐｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４５，１９９２）。Ｆｌｋ－１レベルは、ヒト膠芽細胞腫によって生成されるＶＥＧＦによって特異的に上方調節される（Ｐｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：５８２２，１９９３）。膠芽細胞終結部内皮細胞（ＧＡＥＣ）においてＦｌｋ－１が高レベルで発現するという事実は、Ｆｌｋ－１転写体が正常脳内皮細胞からはほとんど検出されず、受容体活性が恐らく腫瘍形成中に誘導されるということを示す。このような上方調節は、腫瘍に非常に近接した血管内皮細胞でのみ発生する。中和抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体（ｍＡｂ）でＶＥＧＦ活性を遮断すると、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍移植片の成長が抑制されるが（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１，１９９３）、これは、腫瘍関連血管新生におけるＶＥＧＦが直接的な役割を担うということを示す。

【0016】

ＶＥＧＦリガンドが腫瘍細胞において上方調節され、それの受容体が腫瘍浸潤血管内皮細胞において上方調節されるが、血管新生と結び付いていない正常細胞ではＶＥＧＦリガンド及びその受容体の発現は低い。したがって、このような正常細胞は、ＶＥＧＦとそれの受容体間の相互作用を遮断して血管新生を抑制させ、よって、腫瘍成長が起こらない。

【0017】

高レベルのＶＥＧＦＲ－２は、神経膠腫に浸潤する内皮細胞によって発現し、ヒト膠芽細胞腫によって生成されたＶＥＧＦによって特異的に上方調節される（Ｐｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５９：８４５，１９９２；Ｐｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：５８２２，１９９３）。ＶＥＧＦＲ－２転写体は正常脳内皮細胞ではほとんど検出されないため、膠芽細胞腫関連内皮細胞（ＧＡＥＣ）で高レベルのＶＥＧＦＲ－２が発現することは、腫瘍形成中に受容体活性が誘導されるということを示すす。

【0018】

ＶＥＧＦは種々の腫瘍で高いレベルで発現し（Ｐｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５９：８４３５，１９９２；Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：１２７５，１９９１）、新生の毛細血管はＶＥＧＦ－生産性腫瘍胞周囲に集まる（Ｐｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５９：８４３５，１９９２）。ＶＥＧＦ発現は、速く成長する腫瘍と関連付いているもののように、低酸素症条件下で強く上方調節される（Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５９：８４３，１９９２）。アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）のような抗体によるＶＥＧＦ中和（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，３（５）：３９１，２００４；Ａｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１１３（３）：３６３，２００６）は、癌又はＡＭＤのような他の血管新生疾患を抑制するために臨床的に承認された療法である。しかし、ＶＥＧＦ遮断に対する耐性が、化学療法と併用され場合ですら発見された。この耐性は、リモデルリングされた脈管構造及び他の血管新生因子の増加した発現と関連があり得る。したがって、当該技術の分野には癌及び血管新生と関連した他の疾患を抑制するための改善された組成物及び方法への必要性が依然として存在する。

【0019】

チロシンキナーゼ抑制剤（ＴＫＩ）及び抗ＫＤＲＰ抗体の両方ともＫＤＲ媒介の血管新生を抑制できるとしても、抗体接近はＴＫＩに比べて長所を有する。ＴＫＩとは対照的に、抗ＫＤＲ抗体はより特異的なＫＤＲ標的剤である（すなわち、抗ＫＤＲ抗体は他のＶＥＧＦ受容体を抑制しない）。このような高い特異性により、抗ＫＤＲ抗体は、標的離脱効果（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）及びより特異的でないＴＫＩによって引起こされた毒性を制限及び／又は回避できる（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．，Ｊｕｎ；１７（２）：１５５，１９９８）。

【0020】

ただ１つのリガンド（ＶＥＧＦ－Ａ）のみと結合するアバスチンとは違い、抗ＫＤＲ抗体は、全ての公知のＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合することを防止するものと予想される。抗ＫＤＲ抗体は、単純にＶＥＧＦ－Ａを遮断することよりは腫瘍血管新生に対してより強力な抑制効果を有し得る。抗ＫＤＲ抗体を用いた療法がアバスチン耐性においては効果的である可能性がある。

【0021】

このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、既存ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに特異的に結合する抗体を改良するために、重鎖可変領域のＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＨ１からＶＨ３に置換、及び軽鎖ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＬ１からＶＫ１に置換し、重鎖と軽鎖のＣＤＲ３領域に突然変異を誘導させることで抗原に対する親和度を増加させた新規な抗体を製造したし、抗体末端にＮｏｔｃｈ１のＤＬＬ４結合部位を融合させて融合タンパク質を作製し、本発明を完成するに至った。

【0022】

【0023】

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0024】

本発明の目的は、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに対する向上した結合力を有する抗体末端にＤＬＬ４結合タンパク質ドメインが融合された形態の融合タンパク質を提供することにある。

【0025】

本発明の他の目的は、前記融合タンパク質をコードする核酸を提供することにある。

【0026】

本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、前記ベクターを含む形質転換細胞及びその製造方法を提供することにある。

【0027】

本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質を含む血管新生疾患の予防又は治療用の組成物を提供することにある。前記融合タンパク質を個体に投与する段階を含む血管新生疾患の予防又は治療方法を提供することにある。前記融合タンパク質を血管新生疾患の予防又は治療用の組成物の製造に使用するための用途を提供することにある。

【0028】

本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質を含む血管新生疾患診断用の組成物を提供することにある。前記融合タンパク質を個体に投与する段階又はサンプルに融合タンパク質を処理する段階を含む血管新生疾患の診断方法を提供することにある。前記融合タンパク質を血管新生疾患診断用の組成物の製造に使用するための用途を提供することにある。

【0029】

本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質を含む腫瘍又は癌の予防又は治療用の組成物を提供することにある。前記融合タンパク質を個体に投与する段階を含む腫瘍又は癌の予防又は治療方法を提供することにある。前記融合タンパク質を腫瘍又は癌の予防又は治療用の組成物の製造に使用するための用途を提供することにある。

【0030】

本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質を含む他の治療剤と併用投与するための組成物を提供することにある。前記融合タンパク質を個体に投与する段階を含む他の治療剤と併用投与するするための方法を提供することにある。前記融合タンパク質を他の治療剤と併用投与するするための組成物の製造に使用するための用途を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0031】

上記の目的を達成するために、本発明は、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片；及び、ＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ４）結合タンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、

【0032】

前記ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む融合タンパク質を提供する。

【0033】

本発明は、また、前記融合タンパク質をコードする核酸を提供する。

【0034】

本発明は、また、前記核酸を含むベクターを提供する。

【0035】

本発明は、また、前記ベクターを含む形質転換細胞を提供する。

【0036】

本発明は、また、次の段階を含む前記融合タンパク質の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養して融合タンパク質を生成する段階；及び、（ｂ）前記生成された融合タンパク質を回収する段階。

【0037】

本発明は、また、前記融合タンパク質を含む血管新生疾患の予防又は治療用の組成物を提供する。

【0038】

本発明は、また、前記融合タンパク質を含む血管新生疾患診断用の組成物を提供する。

【0039】

本発明は、また、前記融合タンパク質を含む腫瘍又は癌の予防又は治療用の組成物を提供する。

【0040】

本発明は、また、前記融合タンパク質を含む他の治療剤と併用投与するための組成物を提供する。

【0041】

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】６Ａ６の重鎖ＣＤＲ配列を移植した配列である。

【0043】

【図2】６Ａ６の軽鎖ＣＤＲ配列を移植した配列である。

【0044】

【図3A-3B】作製された融合タンパク質の結合力をＳＰＲによって確認した結果である。

【0045】

【図4】２種の抗原への同時結合能力をＳＰＲによって確認した結果である。

【0046】

【図5】成長調節因子によるＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制可能であることを確認した結果である。

【0047】

【図6】血管内皮細胞で抗体のＶＥＧＦＲ－２リン酸化抑制効果を確認した結果である。

【0048】

【図7】ＦＡＣＳを用いて血管内皮細胞における融合タンパク質の結合能を確認した結果である。

【0049】

【図8】細胞表面に発現させたｈＤＬＬ４に対する融合タンパク質の結合能をＦＡＣＳを用いて確認した結果である。

【0050】

【0051】

【発明を実施するための形態】

【0052】

特に定義されない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使われるものである。

【0053】

本発明は、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片；及び、ＤＬＬ４結合タンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む融合タンパク質に関する。

【0054】

本発明に係る融合タンパク質において、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片は、血管内皮成長因子受容体を中和する完全ヒト化抗体の改良抗体である。特に、血管内皮成長因子受容体を中和するヒト単クローン抗体（韓国登録特許１０－０８８３４３０号）の改良抗体である。

【0055】

本出願の発明者らは、完全ヒト抗体ライブラリーから発明されたし、ＶＥＧＦＲ－２／ＫＤＲを標的としながら同時にマウス又はラット由来のｆｌｋ－１（ＶＥＧＦＲ－２相同体）に対しても反応性を有する唯一の抗体を改良した。当該抗体は臨床試験からその優秀性が立証されたが、抗体タンパク質の抗原に対する結合力が多少低く、生体内半減期が短い。これを改良し、免疫抗癌剤としての効能増大、血管新生関連疾患における効能増大が予想される。

【0056】

既存ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに特異的に結合する抗体を改良するために、重鎖可変領域のＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＨ１からＶＨ３に置換、及び軽鎖ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＬ１からＶＫ１に置換し、重鎖と軽鎖のＣＤＲ３領域に突然変異を誘導させることで、抗原に対する親和度を増加させた新規な抗体を製造した。その結果、本発明者らは、既存ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに特異的に結合する抗体に比べて高い結合力を有し、より細胞内効能に優れた抗体を開発し、抗体が目的とする免疫抗癌剤又は血管新生関連疾病の治療剤として働き得ることを確認した。

【0057】

前記改良抗体は次のような方法でスクリーニングした。まず、６Ａ６のＣＤＲ領域配列とフレームワーク（ｆｒａｍｅ ｗｏｒｋ：ＦＲ）配列を確認し、ＣＤＲグラフト（ｇｒａｆｔｉｎｇ）手法を用いて、重鎖ＣＤＲ配列をヒト生殖細胞系（ｈｕｍａｎ ｇｅｒｍｌｉｎｅ）ＶＨ３配列に移植し、軽鎖ＣＤＲ配列を生殖細胞系ＶＫ１に移植した。

【0058】

ＣＤＲグラフト（移植）とは、一般に、マウス単クローン抗体の可変部位配列を暗号化するＤＮＡを分離し、遺伝子クローニングによってＣＤＲ配列を確保した後、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ上で適切なヒト抗体配列中にＣＤＲ配列を移植して作る方法である（Ｈｏｕ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ３４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００８；１４４（１）：１１５－２０；及び、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ＳＶ，Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓ Ｒ，Ｇｏｎｚａｌｅｓ ＮＲ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ．ＳＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ－－ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５；３６（１）：２５－３４）。上の方法を用いて、生殖細胞系ＶＨ１／ＶＬ１を有する６Ａ６のフレームワークを生殖細胞系ＶＨ３／ＶＫ１で置換した。

【0059】

前記置換された抗体の親和度を向上させるために、軽鎖と重鎖のＣＤＲ３塩基配列に突然変異を誘導するライブラリーを構築し、組換えＫＤＲ Ｄ１～Ｄ３－Ｆｃ融合タンパク質を用いて、抗体をスクリーニングした。抗体スクリーニングはファージディスプレイを用いてスクリーニングした。

【0060】

これに基づいて、本発明は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。

【0061】

本発明の融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ及びＤＬＬ４のそれぞれに特異的に結合してよい。「二特異的」又は「二重特異的」とは、２個の異なるターゲットに特異的に結合してターゲットの活性を調節できる結合タンパク質の特性であり、例えば、各ターゲットに特異的に結合する抗体又はタンパク質、又はその断片によって製造されてよく、２個の区分された抗原結合アーム（ａｒｍ：２個ターゲットに対する特異性）を保有し、これに結合するそれぞれの抗原に対して１価である。

【0062】

本明細書で使われる用語、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに特異的に結合する抗ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ抗体を意味する。本発明の範囲には、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに特異的に結合する完全な抗体形態の他、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。

【0063】

完全な抗体は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、各軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）のタイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のタイプを有する。

【0064】

抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうちＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の定常領域及び重鎖の一番目の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体断片である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ，ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されたり又はＣ末端で直ちに連結されており、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなし得る。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる）、遺伝子組換え技術によって作製することもできる。

【0065】

一実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はエプシロン（ε）のいずれか一イソタイプから選ばれてよい。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）、又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ型であってよい。

【0066】

本明細書で使われる用語、「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む、全長重鎖及びその断片のいずれをも意味する。また、本明細書で使われる用語、「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む、全長軽鎖及びその断片のいずれをも意味する。

【0067】

本発明の抗体は、単クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、又はこれら抗体のエピトープ結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。

【0068】

前記単クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から得た抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が、微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異を除いては同一であるものを指す。単クローン抗体は高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に互いに異なる決定因子（エピトープ）に対して指示された互いに異なる抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一決定因子に対して指示される。

【0069】

「エピトープ」は、抗体が特異的に結合し得るタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、通常、化学的に活性である表面分子群、例えばアミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴の他に特定の電荷特性も有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失するが、後者に対しては消失しないという点で区別される。

【0070】

前記「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、ネズミ科）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を、目的とする特異性、親和性及び能力を保有している非ヒト種（供与者抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域からの残基で代替させたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。

【0071】

前記「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンに由来する分子であって、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されているものを意味する。

【0072】

重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種に由来するか、特別な抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか又はこれと相同性である一方、残りの鎖は、さらに他の種に由来するか、さらに他の抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか又はこれと相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）の他にも、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片も含まれる。

【0073】

本願に使われているような「抗体可変領域」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分のことを指す。ＶＨは重鎖の可変領域のことを指す。ＶＬは軽鎖の可変領域のことを指す。

【0074】

「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）」は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変領域のアミノ酸残基のことを指す。各可変領域は典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。本発明は、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0075】

本発明にいて、前記ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ及びＤＬＬ４に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含んでよい。

【0076】

「骨格領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。各可変領域は典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。

【0077】

「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含む抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変領域と１個の軽鎖可変領域が、例えばｓｃＦｖで堅固に事実上共有的に連合した二量体からなる。

【0078】

「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は一般に、それらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端近くに共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。

【0079】

「単一鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含んでよい。

【0080】

ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ抗体は、単鎖又は二重鎖を含んでよい。機能的に、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ抗体の結合親和性は、１０^－５Ｍ～１０^－１２Ｍの範囲内にある。例えば、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ抗体の結合親和性は、１０^－６Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－１０Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－７Ｍ、又は１０^－５Ｍ～１０^－６Ｍである。

【0081】

本発明は、配列番号８の配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。

【0082】

本発明は、また、配列番号１０の配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。

【0083】

本発明は、また、配列番号８の配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０の配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。

【0084】

前記相同性は、請求された配列番号の配列全体と比較して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有してよい。

【0085】

本発明は、明細書に記載された融合タンパク質の配列だけでなく、その生物学的均等物も含んでよい。例えば、融合タンパク質の結合親和度及び／又はその他生物学的特性をより改善させるためにアミノ酸配列に追加的な修飾を与えることができる。このような修飾は、例えば、アミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析によって、アルギニン、リジン及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びている残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の形状を有する、ということが分かる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リジン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、生物学的に機能均等物であるといえる。

【0086】

上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の融合タンパク質又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。上記の実質的な同一性は、上述した本発明の配列と任意の他の配列を極力対応するようにアラインし、当業界に一般に使用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知されている。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）はＮＣＢＩなどから接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用することができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いて配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌから確認できる。

【0087】

これに基づいて、本発明の融合タンパク質は、明細書に記載の明示された配列又は全体と比較して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有してよい。このような相同性は、当業界に公知された方法による配列比較及び／又は整列によって決定されてよい。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。

【0088】

前記ＤＬＬ４結合タンパク質ドメインは、ＤＬＬ４に結合するタンパク質ドメインで、Ｎｏｔｃｈ１のＤＬＬ４結合部位を含む。例えば、ヒトＮｏｔｃｈ１のＥＧＦ様ドメインを含んでよく、配列番号１８の配列を含んでよい。

【0089】

前記ＤＬＬ４結合タンパク質ドメインは、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体の末端、例えば軽鎖末端、具体的には軽鎖Ｎ末端に結合してよい。

【0090】

韓国登録特許第１０－１５６９０８３号にＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ及びＤＬＬ４結合タンパク質ドメインを含むＤＩＧ－ＫＮ物質が記載されているが、本発明は、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに特異的に結合するヒト抗体の重鎖ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＨ１からＶＨ３に置換、及び軽鎖ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｏｉｎ）をＶＬ１からＶＫ１に置換し、突然変異を誘導させて抗原に対する親和度を増加させた抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）抗体を含み、抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）抗体の軽鎖Ｎ末端にＤＬＬ４結合タンパク質ドメイン（Ｎｏｔｃｈ１ＥＧＦ様ドメイン）が結合するので、差異がある。

【0091】

前記ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片及びＤＬＬ４結合タンパク質ドメインは、リンカーを介して連結されてよい。前記リンカーは、ペプチドリンカーであってよく、約１０^－２５ａａ長を有してよい。例えば、グリシン及び／又はセリンのような親水性アミノ酸が含まれてよいが、これに限定されるものではない。

【0092】

具体的には、前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ又は（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍはそれぞれ、１～１０）を含んでよいが、前記リンカーは、例えば（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍはそれぞれ、１～１０）であってよい。

【0093】

本発明は、他の観点で、前記融合タンパク質をコードする核酸に関する。

【0094】

前記核酸は、重鎖可変領域をコードする配列番号７の配列を含んでよい。前記核酸は、軽鎖可変領域をコードする配列番号９の配列を含んでよい。前記核酸は、ＤＬＬ４結合タンパク質ドメインをコードする配列番号１７の配列を含んでよい。

【0095】

本発明の融合タンパク質をコードする核酸を分離して組替え的に生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入してさらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又はさらに発現させる。これに基づいて、本発明は、さらに他の観点において前記核酸を含むベクターに関する。

【0096】

「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他、糖又は塩基部位が修飾された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の融合タンパク質をコードする核酸の配列は修飾されてよい。前記修飾は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

【0097】

ＤＮＡは通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に、次のいずれか１つ以上が含まれるが、それに限定されない：信号配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。

【0098】

本明細書で使われる用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクター；などを含む。前記ベクターにおいて融合タンパク質をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。

【0099】

「作動的に連結」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節する。

【0100】

原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリポソーム結合部位及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）、又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられてよく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

【0101】

場合によって、ベクターは、そのベクターから発現する融合タンパク質の精製を容易にするために他の配列と融合されてよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）、及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。

【0102】

前記ベクターは、選択標識として当業界で通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。

【0103】

本発明は、さらに他の観点で、前記言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の融合タンパク質を生成させるために使われた細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物の細胞であってよく、これに限定されるものではない。

【0104】

エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、及びスタフィロコカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を利用できる。

【0105】

ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であってよいが、これに限定されるものではない。

【0106】

本発明は、さらに他の観点で、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から融合タンパク質を回収する段階を含む、前記融合タンパク質の製造方法に関する。

【0107】

前記細胞は、各種培地で培養できる。市販のいかなる培地も培養培地として使用可能である。当業者に公知されているその他全ての必須補充物が適当な濃度で含まれてよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に用いられており、これは当業者に明らかであろう。

【0108】

前記融合タンパク質の回収は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって不純物を除去し、その結果物を、例えば親和クロマトグラフィーなどを用いて精製できる。追加のその他精製技術、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどが用いられてよい。

【0109】

前記融合タンパク質中に含まれた抗体は、ＩｇＧ又は可変領域を含む断片、すなわちＳｃＦｖ、Ｆａｂであってよい。また、重鎖の可変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４であってよい。

【0110】

本発明は、さらに他の観点で、前記融合タンパク質を有効成分として含む血管新生疾患の予防又は治療用の組成物に関する。

【0111】

前記血管新生は、以前に存在する血管から新しい血管の形成又は成長を意味し、「血管新生関連疾患（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）」は、血管新生の発生又は進行と関連した疾患を意味する。前記融合タンパク質で治療可能であれば、その疾病は制限なく血管新生関連疾患の範囲に含まれ得る。血管新生関連疾患の例には、癌、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、糖尿網膜病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜病症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、角膜移植拒否（ｃｏｒｎｅａｌ ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、血管新生性緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ）、全身紅色症（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｓ）、増殖性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、血友病性股関節炎（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、動脈硬化性プラーク（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）の毛細血管形成、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、傷顆粒化（ｗｏｕｎｄ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、血管癒着（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、リウマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、退行性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レステノシス（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、粥状動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、腸狭窄（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、猫ひっかき病（ｃａｔ ｓｃｒａｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、肝硬変症（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、腎臓炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性腎臓疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性足部潰瘍（ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｆｏｏｔ Ｕｌｃｅｒｓ）、慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、炎症疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、急性呼吸困難症候群（Ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、及び神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含むが、これに限定されるものではない。

【0112】

また、前記癌は、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）、及び多発性骨髄血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）からなる群から選ばれるが、これに限定されるものではない。

【0113】

ここで使われる用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｒ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、本発明の融合タンパク質を投与し、関心疾患の開始を抑制又は遅延させる全ての措置を指す。用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ）」は、本発明の融合タンパク質を投与し、関心疾患の症状を改善又は好転させる全ての措置を指す。

【0114】

本発明は、例えば、（ａ）本発明に係る融合タンパク質の薬剤学的有効量；及び、（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む、腫瘍又は癌の予防又は治療用の薬剤学的組成物であってよい。本発明は、また、前記融合タンパク質を腫瘍又は癌患者に投与する段階を含む、腫瘍又は癌の予防又は治療方法であってよい。本発明は、さらに、前記融合タンパク質の機序妨害用途及びこれによる腫瘍又は癌の予防又は治療用途であってよい。

【0115】

治療用として適切な腫瘍又は癌の非制限的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、透明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応前立腺癌腫）、膵腺癌腫、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平細胞癌腫、肝癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽細胞腫、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、及びその他新生物癌腫を含む。さらに、本発明は、融合タンパク質を使用して治療できる不応又は再発の癌を含む。

【0116】

本発明は、例えば、前記融合タンパク質の治療的有効量を、血管新生阻害を必要とする患者に投与する段階を含む、血管新生疾患の治療方法が提供される。前記血管新生疾患の治療は、前記投与段階以前に、血管新生阻害を必要とする患者を確認する段階をさらに含んでよい。さらに他の例において、前記融合タンパク質の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、血管新生疾患の予防及び／又は治療方法が提供される。前記予防及び／又は治療方法は、前記投与段階以前に、血管新生疾患の予防及び／又は治療を必要とする患者を確認する段階をさらに含んでよい。

【0117】

前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでよく、前記担体は、薬物の製剤化に一般に使用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。前記薬学組成物は、また、薬学組成物の製造に一般に使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤からなる群から選ばれる１種以上をさらに含んでよい。

【0118】

前記薬学組成物、又は前記血管新生疾患の有効量は、経口又は非経口で投与できる。非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、皮内投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。経口投与時に、タンパク質又はペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングするなどして胃での分解から保護されるように剤形化してよい。また、前記組成物は、活性物質を標的細胞に移動させ得る任意の装置によって投与されてよい。

【0119】

本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与される。ここで使われる用語「薬学的に有効な量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、全ての医学的治療に適用可能な合理的な利益と危険の比率（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ ｒａｔｉｏ）として十分な疾患治療用薬学的組成物の量を指す。有効量は、治療すべき疾患の重症度、患者の年齢及び性別、疾患の種類、薬剤の活性度、薬剤に対する敏感度、投与時間、投与経路、分泌速度、治療期間、薬剤の共投与及び本分野に周知の他のパラメータを含む様々な要因によって異なる。本発明の組成物は、単独で又は他の治療法との組合で投与されてよい。このような場合に、従来の治療法と一緒に順に又は同時に投与されてよい。また、前記組成物は、１回用量で又は多回用量に分けて投与されてよい。これらの要因を完全に考慮するとき、副作用無しで最大の効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要であり、この服量は、分野の専門家によって容易に決定され得る。本発明の薬学的組成物の服量は特に限定されないが、患者の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬の種類、投与経路及び投与時間を含む様々な要因によって変更される。組成物は１日に１回用量で又は多回用量でラット、ネズミ、家畜、ヒトなどを含む哺乳類に、典型的に許容された経路、例えば、経口で、直腸で、静脈で（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、皮下で（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、子宮内に（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｌｙ）又は脳血管内に（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ）投与されてよい。

【0120】

前記薬学組成物中の融合タンパク質の含有量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々に処方されてよい。例えば、前記融合タンパク質の１日投与量は０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、具体的には０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、さらに具体的には０．１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよいが、これに限定されるものではない。前記１日投与量は単位用量の形態で一つの製剤として製剤化されたり、適切に分量して製剤化されたり、又は多用量容器内に内入させて製造されてよい。

【0121】

前記薬学組成物は、他の血管新生阻害関連疾病の治療剤のような他の薬物と併用投与が可能であり、その投与量、投与方法及び他の薬物の種類は、患者の状態によって適切に処方されてよい。

【0122】

前記薬学的組成物は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤などの形態で剤形化でき、剤形化のために分散剤又は安定化剤をさらに含んでよい。

【0123】

特に、前記融合タンパク質を含む薬学組成物は、融合タンパク質を含むので、免疫リポソームとして剤形化できる。融合タンパク質を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法によって製造されてよい。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びポリエチレングリコール－誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であり、逆相蒸発法によって製造されてよい（韓国公開特許１０－２０１５－００８９３２９号）。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交替反応によってリポソームに接合されてよい。

【0124】

また、本発明の融合タンパク質は、他の製剤、抗体又は生物学的活性剤、又は様々な目的のための物質と組み合わせて使用されてよい。本発明は、このような観点で、前記融合タンパク質を含む、他の血管新生疾患治療剤との併用投与用組成物に関する。

【0125】

前記他の血管新生疾患治療剤は、抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物を挙げることができる。これにより、互いの抵抗性を克服させ、効能を増進させることができる。

【0126】

本発明に係る組成物において、他の血管新生疾患治療剤と併用投与される場合に、融合タンパク質と他の血管新生疾患治療剤は順次又は同時に投与されてよい。例えば、抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物を対象体に投与した後、活性成分として融合タンパク質を含む組成物を前記対象体に投与するか、又は前記組成物を対象体に投与した後、抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物を前記対象体に投与する。場合によって、前記組成物を抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物と同時に対象体に投与してよい。

【0127】

【0128】

実施例

【0129】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

【0130】

【0131】

実施例１．ＣＤＲグラフト（移植）

【0132】

６Ａ６のＣＤＲ配列をＫａｂａｔナンバリング、ＩＭＧＴプログラムを用いて確認し、これをヒト生殖器系ＶＨ３／ＶＫ１に移植するクローニングを行った。図１に重鎖ＣＤＲ移植配列を表記し、図２に軽鎖ＣＤＲ移植配列を表記した。

【0133】

【0134】

実施例２．親和度増進のための変異体作製及び選別

【0135】

ＣＤＲグラフトされた抗体の親和度増進のための最適化を行った。軽鎖と重鎖のＣＤＲ３の元来ＤＮＡ配列を７０％保存しつつランダム化（ｒａｎｄｏｍｉｚｅ）させるソフトランダム化（ｓｏｆｔ－ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）法を活用して、軽鎖ＣＤＲ３と重鎖ＣＤＲ３に無作為変異を導入したプライマーを作製した。これを使用したＰＣＲを用いて変異が導入された軽鎖可変領域、重鎖可変領域コーディングＤＮＡ断片を確保した。このＤＮＡ断片をそれぞれｓｃＦｖファージ、ファージミドの軽鎖可変領域及びｓｃＦｖファージ、ファージミドの重鎖可変領域と置換し、軽鎖ＣＤＲ３変異体ｓｃＦｖファージライブラリーと重鎖ＣＤＲ３変異体ｓｃＦｖファージＤＮＡライブラリーをそれぞれ作製した。

【0136】

変異体ｓｃＦｖファージＤＮＡライブラリーをフェノール－クロロホルム精製後に、電気穿孔法を用いて大腸菌株ＸＬ－１ Ｂｌｕｅに形質転換した。形質転換効率分析及びＤＮＡ配列分析によって多様性が確保されたことを確認した後、５００ｍｌ規模で培養してファージ発現を誘導し、ＰＥＧ－沈殿法を用いて軽鎖と重鎖のＣＤＲ３変異体ｓｃＦｖファージライブラリー作製した。

【0137】

各変異体ｓｃＦｖファージライブラリーを用いてバイオパンニングを行った。９６ウェル免疫プレートに抗原（ＫＤＲ１～３ ｄｏｍｉａｎ－Ｆｃ）を２μｇ／ｍｌで１００μｌずつウェルに入れ、４℃で一晩置いた（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）。翌日、抗原コーティングプレート（ｃｏａｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ）はＰＢＳＴ（０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、２％ ＢＳＡ遮断バッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）２００μｌを入れ、室温で２時間反応させた。２ｘ ＹＴ－ＴＥＴ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ１０μｇ／ｍｌ）成長培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）２ｍｌにＸＬ１－Ｂｌｕｅストック（ｓｔｏｃｋ）５０μｌを入れ、３７℃、２００ｒｐｍで２時間程度育てた後、１３ｍｌをさらに添加し、ＯＤ_６００が０．５になるまで育てた。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）２時間後に１Ｘ ＰＢＳＴ（０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。洗浄した各ウェルに変異体ライブラリーを４％ ＢＳＡと同じ量で混ぜた後、２００μｌずつ添加して室温で３０分間ロッキング（ｒｏｃｋｉｎｇ）した後、２時間を反応させた。ファージライブラリー反応が終わると、上澄液は捨て、０．１％ ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＰＢＳで５回洗浄した。各ウェルに１００ｍＭ ＴＥＡ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１００μｌを入れた後、室温で１０分間振盪した。１０分経過すると各ウェルに１Ｍトリス（ｐＨ ７．５）５０μｌを入れて混ぜた。上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）はＯＤ_６００が０．５になったＸＬ１－ｂｌｕｅ １０ｍｌに入れ、３７℃で３０分間感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた。感染が終わると、１００μｌはアウトプット力価（ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）として使用し、残りは６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液は捨て、沈殿物はラージスクエアプレート（ｌａｒｇｅ ｓｑｕａｒｅ ｐｌａｔｅ：ＣＭ ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）にスプレッド（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）し、３７℃で一晩培養（ｏｖｅｒｎｉｎｇｔ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。アウトプット力価として残した１００μｌは、１／１０、１／１００、１／１０００に希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）してＣＭプレートにスプレッドし、３７℃で一晩おいた。翌日、スクエアプレートに育ったコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）は２ｘ ＹＴ培地５０ｍｌを入れた後、ループ（ｌｏｏｐ）を使ってかき集めた後、６０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上澄液は捨て、沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）に対して１次パンニングストック（ｐａｎｎｉｎｇ ｓｔｏｃｋ）を作り、２ｘ ＹＴ培養培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ：ＣＭ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れた後、ＯＤ_６００が０．２となるように細胞を入れ、２００ｒｐｍ、３７℃でＯＤ_６００が０．５になるまで育てた。ＯＤ_６００値が０．５になるまで細胞を培養した後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ：Ｍ１３ＫＯ７変異体）を細胞の２０倍になるように入れた。ヘルパーファージを入れて３７℃、３０分感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。上澄液を捨て、細胞は２ｘＹＴ培地（ＣＭ３４μｇ／ｍｌ＋Ｋａｎ．７０μｇ／ｍｌ＋１ｍＭ ＩＰＴＧ＋５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）１００ｍｌに交替して入れた後、２００ｒｐｍ、３０℃で一晩置いた。翌日、育った細胞は、７０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、同じ方法でもう１回遠心分離した。集められた上澄液は、上澄液の１／５（ｖ／ｖ）２０％ ＰＥＧ／２．５ｍ ＮａＣｌを入れ、アイス（ｉｃｅ）で１時間沈殿させた。沈殿させた後、９０００ｒｐｍ、１時間遠心分離した。上澄液は捨て、ＰＢＳ ５ｍｌで沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）を解いた後、０．４５μｍフィルター（ｆｉｌｔｅｒ）に濾過した後に４℃に保管し、これを次回のパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）過程で使用した。この過程を３～４回反復し、抗原に結合する抗体をＥＬＩＳＡで確認した。

【0138】

その後、選別過程では、結合を保持する能力の定量的評価指標としてｓｃＦｖの解離速度定数Ｋｄｉｓを測定した。

【0139】

【0140】

実施例３．抗原に対する高親和力を有する抗体選別（Ｏｆｆ－ｒａｔｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）

【0141】

選別された抗体の抗原に対する結合力をＯｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて測定した。そのために、ＫＤＲ １～３ドメインをバイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）に固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）した後、ｓｃＦｖ形態で発現した候補抗体を入れて結合させた後、解離速度定数を測定した。選別された最適化クローン５種に対する解離速度定数測定結果［表１］とアミノ酸配列［表２及び表３］を示した。

【0142】

［表１］抗原に特異的に結合する抗体の解離速度定数

【0143】

【0144】

実施例４．融合タンパク質作製

【0145】

融合タンパク質の作製のために選別したｓｃＦｖファージ抗体のうち、最も解離定数の低いＤ４をＩｇＧ形態に転換した。ＩｇＧ形態転換は、分子生物学的技法を用いて行った。選別したＥ．Ｃｏｌｉクローンからファージミド（Ｐｈａｇｅｍｉｄ）を抽出し、ＰＣＲ技法を用いて可変領域を増幅した。増幅した重鎖可変領域を、重鎖定常領域を含む発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ｐｆｕｓｅｓｓ－ｈｃｈｇ１）に挿入し、増幅した軽鎖可変領域は軽鎖定常領域を含む発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ｐｆｕｓｅ２ｓｓ－ｈｃｌｋ）に挿入し、ＩｇＧ形態のＤＮＡクローニングを完了し、ＩｇＧ１形態に転換した。上の転換された軽鎖定常領域のＮ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ配列）を含むＤＬＬ４結合ドメイン（Ｎｏｔｃｈ１ ＥＧＦ様ドメイン）を遺伝子合成して融合した。作製された抗体の塩基配列は表２及び表３に示した。

【0146】

［表２］選別された抗体のＣＤＲ配列

【0147】

［表３］選別された抗体の配列

【0148】

【0149】

【0150】

【0151】

【0152】

【0153】

【0154】

【0155】

実施例５．融合タンパク質発現

【0156】

ＩｇＧ形態の一時発現は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現システムキット（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）を使用した。キットに含まれたＥｘｐｉ２９３細胞を専用培地を使用して３７℃、５％ＣＯ_２環境下で１２５ｒｐｍオビタルシェーカー上で浮遊培養した。３日ごとに３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように継代培養したし、発現ベクター導入時には３×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞数を調整して使用した。遺伝子導入は、専用試薬であるＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用したし、細胞懸濁液１ｍｌ当たりに発現ベクターＤＮＡ １μｇとＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２．７μｌを含有するＬｉｐｉｄ－ＤＮＡ複合体を作製し、細胞懸濁液に添加したし、導入１６～１８時間後にエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）１／２を添加して発現を誘導した。その後、同一条件で３～４日間培養後に遠心分離してＩｇＧ含有上澄液を取った。

【0157】

【0158】

実施例６．融合タンパク質の精製

【0159】

得られた上澄液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入し、親和力クロマトグラフィーによってＩｇＧを精製した。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ７．０）で平衡化させた後、上澄液を注入し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ポリソルベート２０（ｐＨ ７．０）溶液で洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ ３．５）で溶出した後、１Ｍ Ｔｒｉｓで中和した。溶出されたタンパク質は、ＭＷＣＯ １０，０００ ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ，ＵＳ）を使用した透析過程によってＰＢＳで溶媒を交換した。その後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｔｏｒｉｕｓ，ＤＥ）を用いて必要濃度に濃縮し、分周後に－８０℃で保管した。

【0160】

【0161】

実施例７．融合タンパク質の結合特異性分析

【0162】

選別された融合タンパク質の抗原に対する結合力をＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００，Ｃｙｔｉｖａ）を用いて測定した。融合タンパク質をキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）し、抗原タンパク質を分析物（ａｎａｌｙｔｅ）として使用して分析した。タンパク質Ａチップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｃｈｉｐ）を用いて、メーカーの指示（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）にしたがって表面に融合タンパク質を固定した。前記センサーチップ（ｓｅｎｓｅｒ ｃｈｉｐ）に融合タンパク質を５ｕｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ－Ｔランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に希釈し、１０ｕｌ／ｍｉｎの流速で注入し、約２００ＲＵに到達するようにする。抗原を濃度別にＰＢＳ－Ｔランニングバッファーに希釈し、３０ｕｌ／ｍｉｎの流速で４分間注入し、解離時間は１０分として）分析した。毎サイクルごとに結合している融合タンパク質を除去するために 再生溶液（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ １．５）を３０ｕｌ／ｍｉｎの流速で１分間注入した。実験結果はＢＩＡ評価ソフトウェアバージョン１．０の１：１結合モデル（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を用いて算出した。表４に結合力を示し、図３Ａ及び図３ＢにＳＰＲセンサグラム示した。

【0163】

［表４］抗原に特異的に結合する融合タンパク質の結合力

【0164】

【0165】

実施例８．抗原に対する融合タンパク質の同時結合能力確認

【0166】

選別された融合タンパク質が２種の抗原に対して同時結合可能であることを、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００，Ｃｙｔｉｖａ）を用いて確認した。タンパク質Ａチップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｃｈｉｐ）を用いて、メーカーの指示（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）にしたがって表面に融合タンパク質を固定した。上のセンサーチップ（ｓｅｎｓｅｒ ｃｈｉｐ）に融合タンパク質を５ｕｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ－Ｔランニングバッファーに希釈し、約２００ＲＵに到達するようにする。まず、ＰＢＳ－Ｔランニングバッファーに希釈された１００ｎＭ ｈＫＤＲ－ＥＣＤを３０ｕｌ／ｍｉｎの流速で注入して１２０秒間結合させた後、ＰＢＳ－Ｔランニングバッファーを使って６０秒、３０ｕｌ／ｍｉｎの流速で流す。再生（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）無しでＰＢＳ－Ｔランニングバッファーに希釈された２００ｎＭ ｈＤＬＬ４を３０ｕｌ／ｍｉｎの流速で注入して１２０秒間結合させた後、ＰＢＳ－Ｔランニングバッファーを用いて６０秒、３０ｕｌ／ｍｉｎの流速で流す。両抗原の同時結合の結果は図４に示した。

【0167】

【0168】

実施例９．融合タンパク質のＨＵＶＥＣｓの増殖能確認

【0169】

作製された融合タンパク質の血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ，ＨＵＶＥＣ）の増殖能変化を比較するために、融合タンパク質及び比較対照群抗体（６Ａ６、６Ａ６ｘＤＬＬ４、Ｄ４、Ｍｉｎｏｄ－Ｆｃ）を血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ，ＨＵＶＥＣ）に処理した。６Ａ６ｘＤＬＬ４は、表５に記載された通りである。Ｍｉｎｏｄ－Ｆｃは、配列番号１８のＮｏｔｃｈ１とＦｃを融合させたタンパク質である。

【0170】

［表５］

【0171】

簡略に要約すれば、ＨＵＶＥＣ（ＬＯＮＺＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ２５１９Ａ）細胞は、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ Ｎｏ．＃ＬＣＴ－ＬＬ－０００５）培地を使用して２％ゼラチンがコートされたプレートで培養した。培地は、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。分析（ａｓｓａｙ）に使用したＨＵＶＥＣｓは、継代（ｐａｓｓａｇｅ）１０以内の細胞を使用したし、０．５％熱不活性された（ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＦＢＳが含まれたＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．＃１１０４３－０２３）で９６ウェルプレートに１Ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを接種した。各抗体を２５０ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、２ｎＭに希釈し、分析プレート（ａｓｓａｙ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ）の当該ウェルに処理した後、３０分間培養した。その後、ＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ Ｎｏ．２９３－ＶＥ）をウェルごとに１００ｎｇ／ｍＬの濃度で処理した。ＶＥＧＦと薬物を処理していない陰性対照群（ＶＥＧＦ－／Ａｂ－，）と、ＶＥＧＦのみを処理した陽性対照群（ＶＥＧＦ＋／Ａｂ－）を含めて３日間３７℃ ＣＯ_２培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で培養した。生存度（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）測定は、ＣｅｌｌＴｉｅｒ Ｇｌｏ－Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｇ７５７１）を用いて生きている細胞内のＡＴＰを検出して測定した。

【0172】

試験の結果、６Ａ６比較群及び６Ａ６バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を有する６Ａ６ｘＤＬＬ４比較群に比べて、最適化抗体であるＤ４比較群、及びＤ４バックボーンを有するＤ４ｘＤＬＬ４試験群において、ＶＥＧＦ１６５に媒介されるＨＵＶＥＣ増殖能をより大きく阻害したし、これらはいずれも濃度依存的な様相を示した。この結果を図５に示した。

【0173】

【0174】

実施例１０．融合タンパク質のＶＥＧＦＲ－２リン酸化抑制変化

【0175】

融合タンパク質のＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ－２）脱リン酸化能力を確認するために、融合タンパク質及び対照群抗体（６Ａ６、６Ａ６ｘＤＬＬ４、Ｄ４、Ｍｉｎｏｄ－Ｆｃ）をウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって比較した。

【0176】

要するに、ＨＵＶＥＣ（ＬＯＮＺＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ２５１９Ａ）細胞培養は、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ Ｎｏ．＃ＬＣＴ－ＬＬ－０００５）培地を用いて、６ウェルプレートに８Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で接種したし、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で一日培養した。ＨＵＶＥＣ細胞に各抗体を１２５ｎＭ、２５ｎＭで３０分間処理した後、ＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．２９３－ＶＥ）を各ウェルごとに５０ｎｇ／ｍＬの濃度で１０分間処理した。ＶＥＧＦと薬物を処理していない陰性対照群（ＶＥＧＦ－／Ａｂ－）とＶＥＧＦのみを処理した陽性対照群（ＶＥＧＦ＋／Ａｂ－）を含めた。薬物を処理したＨＵＶＥＣは、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄後に、溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＲＩＰＡバッファー及びホスファターゼ抑制剤）を入れ、氷上で１０分間細胞溶解（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）させた。溶解した（ｌｙｓｅｄ）細胞は、細胞スクレイパー（ｃｅｌｌ ｓｃｒａｐｅｒ）を用いてかき集めた後、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液のみを得た。得られた上澄液は、ＢＣＡタンパク質定量法を用いて総タンパク質（ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を定量した後、４～１５％ ｇｒａｄｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌに２０μｇずつローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）して電気泳動した。電気泳動が終わった後、ウェスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－ｒａｄ，Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）にトランスファーした。ニトロセルロース膜ブロットに遮断バッファー［５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅｄ ｓａｌｉｎｅ）］を加え、常温で１時間の間ブロッキングした。ＴＢＳ－Ｔバッファーで洗浄した後、１次抗体（ｐ－ＶＥＲＦＲ２（Ｙ１１７５）、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１：１０００に希釈し、常温で１時間反応させ、洗浄した。２次抗体（ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ－ＨＲＰ）は１：５０００に希釈し、常温で１時間反応させた。ＴＢＳ－Ｔバッファーで洗浄した後、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ Ｎｏ．３４０９６）を処理して反応させた後、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６８０）を用いてイメージを得た。

【0177】

試験の結果、６Ａ６比較群及び６Ａ６ｘＤＬＬ４比較群においてＶＥＧＦ１６５に媒介されるＶＥＧＦＲ２リン酸化が濃度依存的な様相で部分的に阻害（ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）することを示したのに対し、最適化抗体であるＤ４比較群とＤ４ｘＤＬＬ４を同量処理した試験群では、ＶＥＧＦＲ２がほぼ完全に（ａｌｍｏｓｔ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）脱リン酸化されることを示した。この結果は図６に示した。

【0178】

【0179】

実施例１１．ＦＡＣＳを用いたＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ－２）結合能確認

【0180】

融合タンパク質のＨＵＶＥＣに対する結合活性を調べるために、融合タンパク質及び対照群抗体（６Ａ６、６Ａ６ｘＤＬＬ４、Ｄ４、Ｍｉｎｏｄ－Ｆｃ）を用いてＦＡＣＳ分席を行った。

【0181】

要するに、ＨＵＶＥＣ（ＬＯＮＺＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ２５１９Ａ）細胞は、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ Ｎｏ．＃ＬＣＴ－ＬＬ－０００５）培地と２％ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）がコート（ｃｏａｔｉｎｇ）されたプレート（ｐｌａｔｅ）を用いて、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養した。細胞をＦＡＣＳバッファー（０．５％ ＦＢＳ， ＰＢＳ中０．０５％アジ化ナトリウム）に２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で調製し、ＦＡＣＳチューブに５０ｕＬずつ分注した。５ｎＭ濃度の各抗体を１００ｕｌずつＦＡＣＳチューブに混ぜた後、４℃で３０分反応させた。反応が終わった後、各チューブにＦＡＣＳバッファーを２ｍＬずつ添加し、１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離した。上澄液は除去し、細胞を懸濁した（ｒｅ－ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）後、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ抗体（１：２００，Ｂｅｔｈｙｌ，＃Ａ８０－２４８ＰＥ）を１００ｕｌずつ入れ、４℃で２０分間反応させた。各ＦＡＣＳチューブにＦＡＣＳバッファーを２ｍＬずつ添加した後、１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離した。分離された上澄液を除去し、ＦＡＣＳバッファーを２００ｕｌずつ入れて懸濁した後、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｙｒｉｃ）を用いて結合活性を分析した。

【0182】

試験の結果、Ｍｉｎｏｄ－Ｆｃ以外は、ＶＥＧＦＲ２をターゲットとする６Ａ６と６Ａ６ｘＤＬＬ４、Ｄ４、Ｄ４ｘＤＬＬ４がいずれもＨＵＶＥＣに結合することを確認した。また、Ｄ４とＤ４ｘＤＬＬ４が６Ａ６と６Ａ６ｘＤＬＬ４比べて結合活性が改善されていることが見られた。この結果は図７に示した。

【0183】

【0184】

実施例１２．細胞表面に発現するｈＤＬＬ４と抗体の結合能確認

【0185】

細胞表面にＤＬＬ４が発現する細胞を作製するために、ＨＥＫ２９３細胞にｐｃＤＮＡ－ｈＤＬＬ４を形質転換させた。

【0186】

要するに、ＧｅｎｅＡｒｔにおいて合成されたｐｃＤＮＡ－ｈＤＬＬ４ベクターをＨＥＫ２９３細胞にリポフェクタミン^ＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１１６８－０１９，ＵＳＡ）を用いて形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）したし、ネオマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＃１０１３１、５０ｍｇ／ｍＬ）を添加して選別した後、育っている全ての細胞を集めてプール状態で培養した。その後、限外希釈（Ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）方法を用いて培養し、単一コロニー２３種を得たし、単一コロニーのうち、ｈＤＬＬ４をよく発現させる（ｈｉｇｈｌｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）細胞株を１種選択して実験を行った。選別された細胞をＦＡＣＳバッファー（０．５％ ＦＢＳ、 ＰＢＳ中０．０５％アジ化ナトリウム）に２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で調製し、ＦＡＣＳチューブに５０ｕＬずつ分注した。５ｎＭ濃度の融合タンパク質及び対照群抗体（６Ａ６、６Ａ６ｘＤＬＬ４、Ｄ４、Ｄ４ｘＤＬＬ４、Ｍｉｎｏｄ－Ｆｃ）を、細胞が入っているＦＡＣＳチューブに１００ｕＬずつ入れ、４℃で３０分反応させた。反応が終わった後、各チューブにＦＡＣＳバッファーを２ｍＬずつ添加した後、１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離する。上澄液を除去し、細胞をよく懸濁した後、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ抗体（１：２００，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃Ａ８０－２４８ＰＥ）を１００ｕｌずつ入れ、４℃で２０分反応させた。反応が終わった後、各ＦＡＣＳチューブにＦＡＣＳバッファーを２ｍＬずつ添加した後、１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離した。分離された上澄液を除去し、ＦＡＣＳバッファーを２００ｕｌずつ入れて懸濁した後、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｙｒｉｃ）を用いて結合活性を分析した。

【0187】

試験の結果、ＤＬＬ４をターゲットとするＭｉｎｏｄドメインを含んでいるＭｉｎｏｄ－Ｆｃ、６Ａ６ｘＤＬＬ４及びＤ４ｘＤＬＬ４のみが、ＤＬＬ－４が発現しているＨＥＫ２９３（ＤＬＬ４－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＨＥＫ２９３）細胞に結合したし、Ｍｉｎｏｄ－Ｆｃ単独よりは、融合タンパク質６Ａ６ｘＤＬＬ４、Ｄ４ｘＤＬＬ４でよく結合することが見られた。６Ａ６とＤ４は、ＤＬＬ－４が発現しているＨＥＫ２９３に結合しなかった。この結果は図８に示した。

【0188】

【産業上の利用可能性】

【0189】

本発明は、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＤＬＬ４を同時に標的な融合タンパク質であって、既存のＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲを標的とする抗体に比べて親和度がより向上した抗体を含むことにより、腫瘍の治療において既存の治療剤に比べてより効能のよい併用治療及び単独治療法を提供することができる。ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲへの向上した結合力を示し、目的とする癌／腫瘍又は血管新生阻害に関連した疾病の予防又は治療に有用に使用可能であり、Ｎｏｔｃｈ１によるＤＬＬ４の活性を同時に阻害することによって、単独処理に比べて優れた新生血管阻害能力を有する。

【0190】

【0191】

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述してきたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定される点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

【0192】

配列目録フリーテキスト

【0193】

電子ファイルとして添付

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】