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特表2025-503731ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１を標的とするタンパク質複合体及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-04
(54)【発明の名称】ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１を標的とするタンパク質複合体及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20250128BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250128BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20250128BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250128BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250128BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250128BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 D
A61K39/395 E
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61P35/00
A61K47/68
A61K39/395 L
A61K39/395 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024542281
(86)(22)【出願日】2022-12-16
(85)【翻訳文提出日】2024-07-17
(86)【国際出願番号】 US2022053125
(87)【国際公開番号】W WO2023140950
(87)【国際公開日】2023-07-27
(31)【優先権主張番号】63/300,440
(32)【優先日】2022-01-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523440260
【氏名又は名称】エフビーデー バイオロジクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ワン ジインタン
(72)【発明者】
【氏名】ツェン チーリン
(72)【発明者】
【氏名】チュオ ゾン シェン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB31
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＴＧＦβを標的とする、タンパク質複合体に、並びにその使用方法に関する。一態様では、該タンパク質複合体は、各々がＳＩＲＰα細胞外領域の全部又は一部分を含む１つ以上のＣＤ４７結合ドメイン、各々がＰＤ－１細胞外領域の全部又は一部分を含む１つ以上のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、及び任意選択で、各々がＴＧＦＢＲ２細胞外領域の全部又は一部分を含む１つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）Ｆｃと、（ｂ）ＣＤ４７結合ドメインと、
（ｃ）ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）結合ドメインと
を含む、タンパク質複合体。
【請求項2】
ＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子ベータ）結合ドメインを更に含む、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項3】
前記ＣＤ４７結合ドメインが、ＣＤ４７を発現する細胞（例えば、がん細胞）に結合することができ、かつ／又はＣＤ４７とシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）との間の相互作用を遮断することができる、請求項１又は２に記載のタンパク質複合体。
【請求項4】
前記ＣＤ４７結合ドメインが、ＳＩＲＰα細胞外ドメイン（例えば、ヒトＳＩＲＰα細胞外ドメイン）であるか、又はそれを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項5】
前記ＣＤ４７結合ドメインが、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ若しくはＶＨＨ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項6】
前記ＣＤ４７結合ドメインが、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項7】
前記ＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞（例えば、がん細胞）に結合することができ、かつ／又はＰＤ－Ｌ１とプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）との間の相互作用を遮断することができる、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項8】
前記ＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、ＰＤ－１細胞外ドメイン（例えば、ヒトＰＤ－１細胞外ドメイン）であるか、又はそれを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項9】
前記ＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ若しくはＶＨＨ）である、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項10】
前記ＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項11】
前記ＴＧＦβ結合ドメインが、ＴＧＦβを捕捉することができ、それによって、免疫応答を増加させかつ／又は腫瘍微小環境を改善することができる、請求項２～１０のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項12】
前記ＴＧＦβ結合ドメインが、ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン（例えば、ヒトＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン）であるか、又はそれを含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項13】
前記ＴＧＦβ結合ドメインが、抗ＴＧＦβ抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ若しくはＶＨＨ）である、請求項２～１１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項14】
前記ＴＧＦβ結合ドメインが、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２～１３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項15】
前記Ｆｃが、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項16】
前記ＣＤ４７結合ドメインが、任意選択でヒンジ領域を介して、前記ＦｃにおけるＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている、請求項１～１５のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項17】
前記ＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、任意選択でリンカーペプチドを介して、前記ＣＤ４７結合ドメインのＮ末端に連結されている、請求項１６に記載のタンパク質複合体。
【請求項18】
前記ＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、任意選択でヒンジ領域を介して、前記ＦｃにおけるＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている、請求項１～１５のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項19】
前記ＣＤ４７結合ドメインが、任意選択でリンカーペプチドを介して、前記ＰＤ－Ｌ１結合ドメインのＮ末端に連結されている、請求項１８に記載のタンパク質複合体。
【請求項20】
前記ヒンジ領域が、ＥＵ付番によるＳ２２８Ｐ変異を任意選択で有するヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項21】
前記ＴＧＦβ結合ドメインが、任意選択でリンカーペプチドを介して、前記ＦｃにおけるＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、請求項２～２０のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項22】
２つ以上のＣＤ４７結合ドメインを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項23】
２つ以上のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項24】
２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項25】
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のリンカーペプチド、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択の第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む、第２のポリペプチドと
を含む、タンパク質複合体。
【請求項26】
前記第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び／又は前記第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、配列番号５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項２５に記載のタンパク質複合体。
【請求項27】
前記第１のＣＤ４７結合ドメイン及び／又は前記第２のＣＤ４７結合ドメインが、配列番号６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項２５又は２６に記載のタンパク質複合体。
【請求項28】
前記第１のＴＧＦβ結合ドメイン及び／又は前記第２のＴＧＦβ結合ドメインが、配列番号７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項29】
前記第１のヒンジ領域及び／又は前記第２のヒンジ領域が、配列番号１６に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項30】
前記第１のＦｃ領域及び／又は前記第２のＦｃ領域が、配列番号１７に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項２５～２９のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項31】
前記第１のリンカーペプチド及び／又は前記第３のリンカーペプチドが、配列番号８に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項32】
前記第２のリンカーペプチド及び／又は前記第４のリンカーペプチドが、配列番号９に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項２５～３１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項33】
前記第１のポリペプチド及び／又は前記第２のポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項34】
前記第１のポリペプチドが、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含み、前記第２のポリペプチドが、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含む、請求項２５～３３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項35】
前記第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び／又は前記第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、配列番号５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項３４に記載のタンパク質複合体。
【請求項36】
前記第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、任意選択で第５のリンカーペプチドを介して、前記第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメインのＮ末端に連結されており、前記第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、任意選択で第６のリンカーペプチドを介して、前記第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインのＮ末端に連結されている、請求項３４又は３５に記載のタンパク質複合体。
【請求項37】
前記第５のリンカーペプチド及び／又は前記第６のリンカーペプチドが、配列番号１０に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項３６に記載のタンパク質複合体。
【請求項38】
前記第１のポリペプチド及び／又は前記第２のポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項39】
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のリンカーペプチド、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択の第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む、第２のポリペプチドと
を含む、タンパク質複合体。
【請求項40】
前記第１のＣＤ４７結合ドメイン及び／又は前記第２のＣＤ４７結合ドメインが、配列番号６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項３９に記載のタンパク質複合体。
【請求項41】
前記第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び／又は前記第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、配列番号５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項３９又は４０に記載のタンパク質複合体。
【請求項42】
前記第１のＴＧＦβ結合ドメイン及び／又は前記第２のＴＧＦβ結合ドメインが、配列番号７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項43】
前記第１のヒンジ領域及び／又は前記第２のヒンジ領域が、配列番号１６に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項44】
前記第１のＦｃ領域及び／又は前記第２のＦｃ領域が、配列番号１７に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項45】
前記第１のリンカーペプチド及び／又は前記第３のリンカーペプチドが、配列番号８に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項３９～４４のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項46】
前記第２のリンカーペプチド及び／又は前記第４のリンカーペプチドが、配列番号９に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項３９～４５のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項47】
前記第１のポリペプチド及び／又は前記第２のポリペプチドが、配列番号２に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項48】
前記第１のポリペプチドが、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含み、前記第２のポリペプチドが、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含む、請求項３９～４７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項49】
前記第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び／又は前記第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、配列番号５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項４８に記載のタンパク質複合体。
【請求項50】
任意選択で、前記第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメインと前記第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインとの間の第５のリンカーペプチドを介して、該第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、該第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメインと前記第１のヒンジ領域との間で融合されており、任意選択で、前記第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインと前記第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインとの間の第６のリンカーペプチドを介して、該第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインが、該第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインと前記第２のヒンジ領域との間で融合されている、請求項４８又は４９に記載のタンパク質複合体。
【請求項51】
前記第５のリンカーペプチド及び／又は前記第６のリンカーペプチドが、配列番号１０に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項５０に記載のタンパク質複合体。
【請求項52】
前記第１のポリペプチド及び／又は前記第２のポリペプチドが、配列番号４に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項53】
請求項１～５２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
【請求項54】
ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である、請求項５３に記載の核酸。
【請求項55】
請求項５３又は５４に記載の核酸のうちの１つ以上を含む、ベクター。
【請求項56】
請求項５５に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項57】
ＣＨＯ細胞である、請求項５６に記載の細胞。
【請求項58】
請求項５３又は５４に記載の核酸のうちの１つ以上を含む、細胞。
【請求項59】
タンパク質複合体を産生する方法であって、（ａ）請求項５６～５８のいずれか一項に記載の細胞が該タンパク質複合体を産生するのに十分な条件下で、該細胞を培養することと、
（ｂ）該細胞によって産生された該タンパク質複合体を収集することと
を含む、該方法。
【請求項60】
治療用物質に共有結合している請求項１～５２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体を含む、タンパク質コンジュゲート。
【請求項61】
前記治療用物質が、細胞毒性物質又は細胞増殖抑制物質である、請求項６０に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項62】
がんを有する対象を治療する方法であって、請求項１～５２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体又は請求項６０若しくは６１に記載のタンパク質コンジュゲートを含む組成物の治療有効量を、該対象に投与することを含む、該方法。
【請求項63】
前記対象が、ＣＤ４７及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現するがん細胞を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記がんが、乳がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、中皮腫、肺がん、卵巣がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺がん、子宮内膜がん腫、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胆管がん、頭頸部がん、血液がん、又はそれらの組み合わせである、請求項６２又は６３に記載の方法。
【請求項65】
腫瘍増殖速度を減少させる方法であって、腫瘍細胞を、請求項１～５２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体又は請求項６０若しくは６１に記載のタンパク質コンジュゲートを含む組成物の有効量と接触させることを含む、該方法。
【請求項66】
腫瘍細胞を殺滅する方法であって、腫瘍細胞を、請求項１～５２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体又は請求項６０若しくは６１に記載のタンパク質コンジュゲートを含む組成物の有効量と接触させることを含む、該方法。
【請求項67】
請求項１～５２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本開示は、２０２２年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／３００，４４０号の優先権及び利益を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、２０２２年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／３００，４４０号の優先権及び利益を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
この出願には、５２２４６－０００２ＷＯ１＿ＳＬ＿ＳＴ２６．ｘｍｌという名称のＸＭＬファイルとして電子的に提出された配列表が含まれる。ＸＭＬファイルは、２０２２年１２月１５日に作成され、２４，２９７バイトのサイズである。ＸＭＬファイル内のデータは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
この出願には、５２２４６－０００２ＷＯ１＿ＳＬ＿ＳＴ２６．ｘｍｌという名称のＸＭＬファイルとして電子的に提出された配列表が含まれる。ＸＭＬファイルは、２０２２年１２月１５日に作成され、２４，２９７バイトのサイズである。ＸＭＬファイル内のデータは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
技術分野
本開示は、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を標的とする、タンパク質複合体に、並びにその使用方法に関する。
本開示は、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を標的とする、タンパク質複合体に、並びにその使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）は、ＳＩＲＰファミリー由来の調節性膜糖タンパク質である。これは、主に骨髄細胞によって発現され、幹細胞又はニューロンによっても発現される。ＳＩＲＰαは、阻害性受容体として作用し、広く発現された膜貫通タンパク質ＣＤ４７と相互作用する。この相互作用は、宿主細胞の食作用などの自然免疫細胞のエフェクター機能を負に制御する。ＳＩＲＰαは、マクロファージ膜上で横方向に拡散し、食作用シナプスに蓄積してＣＤ４７に結合し、これは、マクロファージによる食作用の細胞骨格集約的プロセスを阻害する。ＣＤ４７は、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）のＮ末端に結合することによって、「食べないで（ｄｏ ｎｏｔ ｅａｔ）」シグナルを提供する。ＣＤ４７は、多くの異なる腫瘍細胞において過剰発現されていることが見出されている。ＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰαを標的とすることは、がん免疫療法に有用である可能性がある。しかしながら、ＣＤ４７は、赤血球（ＲＢＣ）及び血小板上でも発現されるため、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を阻害することは、ＲＢＣ及び血小板の食作用を引き起こす場合がある。プログラム死－１（ＰＤ－１）は、免疫チェックポイントであり、調節性Ｔ細胞におけるアポトーシスを低減させながら、リンパ節における抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスを促進するという二重の機構を介して自己免疫から保護する。ＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路及び／又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を標的とする治療法を開発する必要がある。
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）は、ＳＩＲＰファミリー由来の調節性膜糖タンパク質である。これは、主に骨髄細胞によって発現され、幹細胞又はニューロンによっても発現される。ＳＩＲＰαは、阻害性受容体として作用し、広く発現された膜貫通タンパク質ＣＤ４７と相互作用する。この相互作用は、宿主細胞の食作用などの自然免疫細胞のエフェクター機能を負に制御する。ＳＩＲＰαは、マクロファージ膜上で横方向に拡散し、食作用シナプスに蓄積してＣＤ４７に結合し、これは、マクロファージによる食作用の細胞骨格集約的プロセスを阻害する。ＣＤ４７は、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）のＮ末端に結合することによって、「食べないで（ｄｏ ｎｏｔ ｅａｔ）」シグナルを提供する。ＣＤ４７は、多くの異なる腫瘍細胞において過剰発現されていることが見出されている。ＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰαを標的とすることは、がん免疫療法に有用である可能性がある。しかしながら、ＣＤ４７は、赤血球（ＲＢＣ）及び血小板上でも発現されるため、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を阻害することは、ＲＢＣ及び血小板の食作用を引き起こす場合がある。プログラム死－１（ＰＤ－１）は、免疫チェックポイントであり、調節性Ｔ細胞におけるアポトーシスを低減させながら、リンパ節における抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスを促進するという二重の機構を介して自己免疫から保護する。ＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路及び／又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を標的とする治療法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【0005】
概要
本開示は、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を標的とする、タンパク質複合体に、並びにその使用方法に関する。いくつかの場合、タンパク質複合体はまた、ＴＧＦβを標的とし得る。
本開示は、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を標的とする、タンパク質複合体に、並びにその使用方法に関する。いくつかの場合、タンパク質複合体はまた、ＴＧＦβを標的とし得る。
【0006】
一態様では、本開示は、（ａ）Ｆｃと、（ｂ）ＣＤ４７結合ドメインと、（ｃ）ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）結合ドメインとを含む、タンパク質複合体に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子ベータ）結合ドメインを更に含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、ＣＤ４７を発現する細胞（例えば、がん細胞）に結合し得、かつ／又はＣＤ４７とシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）との間の相互作用を遮断し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、ＳＩＲＰα細胞外ドメイン（例えば、ヒトＳＩＲＰα細胞外ドメイン）であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ若しくはＶＨＨ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞（例えば、がん細胞）に結合し得、かつ／又はＰＤ－Ｌ１とプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）との間の相互作用を遮断し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＰＤ－１細胞外ドメイン（例えば、ヒトＰＤ－１細胞外ドメイン）であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ若しくはＶＨＨ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβを捕捉し得、それによって、免疫応答を増加させかつ／又は腫瘍微小環境を改善し得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン（例えば、ヒトＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン）であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＴＧＦβ抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ若しくはＶＨＨ）である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、任意選択でヒンジ領域を介して、ＦｃにおけるＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、任意選択でリンカーペプチドを介して、ＣＤ４７結合ドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、任意選択でヒンジ領域を介して、ＦｃにおけるＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、任意選択でリンカーペプチドを介して、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＥＵ付番によるＳ２２８Ｐ変異を任意選択で有するヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、任意選択でリンカーペプチドを介して、ＦｃにおけるＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。
【0011】
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、２つ以上のＣＤ４７結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、２つ以上のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。
【0012】
一態様では、本開示は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のリンカーペプチド、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択の第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む、第２のポリペプチドとを含む、タンパク質複合体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＤ４７結合ドメイン及び／又は第２のＣＤ４７結合ドメインは、配列番号６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＴＧＦβ結合ドメイン及び／又は第２のＴＧＦβ結合ドメインは、配列番号７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のヒンジ領域及び／又は第２のヒンジ領域は、配列番号１６に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃ領域及び／又は第２のＦｃ領域は、Ｃ末端に付加されたリジン又はアラニン残基を任意選択で有する、配列番号１７に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーペプチド及び／又は第３のリンカーペプチドは、配列番号８に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーペプチド及び／又は第４のリンカーペプチドは、配列番号９に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び／又は第２のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含み、第２のポリペプチドは、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、任意選択で第５のリンカーペプチドを介して、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメインのＮ末端に連結されており、いくつかの実施形態では、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、任意選択で第６のリンカーペプチドを介して、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、第５のリンカーペプチド及び／又は第６のリンカーペプチドは、配列番号１０に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び／又は第２のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。
【0014】
一態様では、本開示は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のリンカーペプチド、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択の第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む、第２のポリペプチドとを含む、タンパク質複合体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＣＤ４７結合ドメイン及び／又は第２のＣＤ４７結合ドメインは、配列番号６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＴＧＦβ結合ドメイン及び／又は第２のＴＧＦβ結合ドメインは、配列番号７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のヒンジ領域及び／又は第２のヒンジ領域は、配列番号１６に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃ領域及び／又は第２のＦｃ領域は、Ｃ末端に付加されたリジン又はアラニン残基を任意選択で有する、配列番号１７に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーペプチド及び／又は第３のリンカーペプチドは、配列番号８に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーペプチド及び／又は第４のリンカーペプチドは、配列番号９に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び／又は第２のポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含み、第２のポリペプチドは、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、任意選択で、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメインと第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインとの間の第５のリンカーペプチドを介して、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメインと第１のヒンジ領域との間で融合されており、いくつかの実施形態では、任意選択で、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインと第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインとの間の第６のリンカーペプチドを介して、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインと第２のヒンジ領域との間で融合されている。いくつかの実施形態では、第５のリンカーペプチド及び／又は第６のリンカーペプチドは、配列番号１０に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び／又は第２のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。
【0016】
一態様では、本開示は、本明細書に記載のタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸に関する。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。
【0017】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸のうちの１つ以上を含むベクターに関する。
【0018】
一態様では、本開示は、本明細書に記載のベクターを含む細胞に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【0019】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸のうちの１つ以上を含む細胞に関する。
【0020】
一態様では、本開示は、タンパク質複合体を産生する方法に関し、本方法は、（ａ）細胞がタンパク質複合体を産生するのに十分な条件下で、本明細書に記載の細胞を培養することと、（ｂ）細胞によって産生されたタンパク質複合体を収集することとを含む。
【0021】
一態様では、本開示は、治療用物質に共有結合している本明細書に記載のタンパク質複合体を含む、タンパク質コンジュゲートに関する。いくつかの実施形態では、治療用物質は、細胞毒性物質又は細胞増殖抑制物質である。
【0022】
一態様では、本開示は、がんを有する対象を治療する方法に関し、本方法は、明細書に記載のタンパク質複合体又は請明細書に記載のタンパク質コンジュゲートを含む組成物の治療有効量を、対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＣＤ４７及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現するがん細胞を有する。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、中皮腫、肺がん、卵巣がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺がん、子宮内膜がん腫、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胆管がん、頭頸部がん、血液がん、又はそれらの組み合わせである。
【0023】
一態様では、本開示は、腫瘍増殖速度を減少させる方法に関し、本方法は、腫瘍細胞を、本明細書に記載のタンパク質複合体又は本明細書に記載のタンパク質コンジュゲートを含む組成物の有効量と接触させることを含む。
【0024】
一態様では、本開示は、腫瘍細胞を殺滅する方法に関し、本方法は、腫瘍細胞を、本明細書に記載のタンパク質複合体又は本明細書に記載のタンパク質コンジュゲートを含む組成物の有効量と接触させることを含む。
【0025】
一態様では、本開示は、本明細書に記載のタンパク質複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。
【0026】
本明細書で使用される場合、「タンパク質複合体」又は「タンパク質構築物」という用語は、１つ以上のポリペプチドを有する複合体を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、２つ以上のポリペプチドを有し、ポリペプチドは、互いに会合して、二量体又は多量体を形成し得る。
【0027】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ４７結合ドメイン」という用語は、ＣＤ４７に結合し得るタンパク質ドメインを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、抗ＣＤ４７抗体、その抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ若しくはＶＨＨ）、又はＣＤ４７結合タンパク質若しくはその一部分であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、１つ以上の自己安定化ドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、ＳＩＲＰα細胞外ドメインを含むか、又はそれからなる。ＳＩＲＰαは、野生型ＳＩＲＰα、ヒトＳＩＲＰα、野生型ＳＩＲＰαに由来するポリペプチド（例えば、変異を有する）、又はその一部分（例えば、ＳＩＲＰαの細胞外領域、又はＳＩＲＰαのＩｇＶドメイン）であり得る。いくつかの実施形態では、野生型ＳＩＲＰαに由来するポリペプチドは、１つ以上の変異を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、ＳＩＲＰαの実質的に細胞外領域全体又はそのバリアントを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、ＳＩＲＰαのＩｇＶドメイン又はそのバリアントを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＩｇＶドメインは、１つ以上の変異を有する。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、１つ以上の変異を有する。
【0028】
本明細書で使用される場合、「ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン」という用語は、ＰＤ－Ｌ１に結合し得るタンパク質ドメインを指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ若しくはＶＨＨ）、又はＰＤ－Ｌ１結合タンパク質若しくはその一部分であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、１つ以上の自己安定化ドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＰＤ－１細胞外ドメインを含むか、又はそれからなる。ＰＤ－１は、野生型ＰＤ－１、ヒトＰＤ－１、野生型ＰＤ－１に由来するポリペプチド（例えば、変異を有する）、又はその一部分（例えば、ＰＤ－１の細胞外領域）であり得る。いくつかの実施形態では、野生型ＰＤ－１に由来するポリペプチドは、１つ以上の変異を有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１細胞外ドメインは、ＰＤ－１の実質的に細胞外領域全体又はそのバリアントを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１細胞外ドメインは、ＰＤ－１の細胞外領域の一部分又はそのバリアントを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１細胞外ドメインは、１つ以上の変異を有する。
【0029】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、自律増殖の能力を有する細胞を指す。そのような細胞の例としては、急速に増殖する細胞増殖によって特徴付けられる異常な状態（ｓｔａｔｅ）又は状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を有する細胞が挙げられる。この用語は、組織病理学的なタイプ又は侵襲性の段階にかかわらず、がん性増殖、例えば、腫瘍、発がんプロセス、転移性組織、及び悪性に形質転換された細胞、組織、又は臓器を含むことを意味する。また、呼吸器系、心臓血管系、腎臓系、生殖器系、血液系、神経系、肝臓系、胃腸系、及び内分泌系などの様々な器官系の悪性腫瘍、並びにほとんどの結腸がん、腎細胞がん腫、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞がん腫、ならびに小腸のがんなどの悪性腫瘍を含む腺がんも含まれる。「自然発生する」がんは、がん細胞の対象への移植によって実験的に誘導されていない任意のがんを含み、例えば、自発的に発生するがん、患者の発がん物質への曝露によって引き起こされるがん、トランスジェニックがん遺伝子の挿入又は腫瘍抑制遺伝子のノックアウトによって引き起こされるがん、及び感染、例えば、ウイルス感染によって引き起こされるがんを含む。「がん腫」という用語は、当該技術分野で認識され、上皮又は内分泌組織の悪性腫瘍を指す。この用語はまた、がん性組織及び肉腫組織からなる悪性腫瘍を含むがん肉腫も含む。「腺がん」とは、腺組織に由来するか、又は腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成するがんを指す。「肉腫」という用語は、当該技術分野で認識され、間葉系由来の悪性腫瘍を指す。「造血腫瘍性障害」という用語は、造血起源の過形成／腫瘍細胞が関与する疾患を含む。造血腫瘍性障害は、骨髄系統、リンパ系統、若しくは赤血球系統、又はその前駆細胞から生じる可能性がある。血液がんは、骨髄などの造血組織、又は免疫系の細胞において発生するがんである。血液がんの例としては、例えば、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫などが挙げられる。
【0030】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書全体にわたって互換的に使用され、本発明の方法による治療が提供される動物、ヒト、又は非ヒトを説明する。獣医学的用途及び非獣医学的用途が、本開示において企図される。ヒト患者は、成人のヒト又は若年のヒト（例えば、１８歳未満のヒト）であり得る。ヒトに加えて、患者には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌ、及び霊長類が含まれるが、これらに限定されない。例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ目、ブタ（例えば、ブタ、ミニチュアブタ）、ウマ科、イヌ科、ネコ科、ウシ属、及び他の家庭用動物、家畜、動物園動物が含まれる。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸の任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。
【0032】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、及び「核酸配列」という用語は、少なくとも２つのヌクレオチドの任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指すために本明細書で互換的に使用され、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びそれらの改変を含むが、これらに限定されない。
【0033】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。方法及び材料は、本発明における使用のために本明細書に記載されており、当該技術分野で既知の他の好適な方法及び材料も使用され得る。材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定することを意図したものではない。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先される。
【0034】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図2】ＣＤ４７を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｓ細胞に対するＨＣＢ３０１タンパク質の全体的な細胞結合の結果を示す。
【図3】ＰＤ－Ｌ１を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｓ細胞に対するＨＣＢ３０１タンパク質の全体的な細胞結合の結果を示す。
【図4】ＣＤ４７発現ＦａＤｕ細胞に対するＨＣＢ３０１タンパク質の全体的な細胞結合の結果を示す。
【図7A】ＨＣＢ３０１タンパク質のヒトＴＧＦβ１結合の結果及びＥＣ５０値を示す。ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップを陽性対照として使用した。
【図7B】ＨＣＢ３０１タンパク質のヒトＴＧＦβ２結合の結果及びＥＣ５０値を示す。ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップを陽性対照として使用した。
【図7C】ＨＣＢ３０１タンパク質のヒトＴＧＦβ３結合の結果及びＥＣ５０値を示す。ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップを陽性対照として使用した。
【図8A】トランスフェクションされていないＯＥ１９細胞及びＰＤ－Ｌ１を発現するトランスフェクションされたＯＥ１９細胞に対する３２ｐＭ濃度のＨＣＢ３０１タンパク質の結合パーセンテージを示す。
【図8B】図８Ｂ～８Ｇは、トランスフェクションされていないＯＥ１９細胞及びＰＤ－Ｌ１を発現するトランスフェクションされたＯＥ１９細胞に対するＳＩＲＰα＿Ｇ４、ＰＤ１＿Ｇ４、ＨＣＢ３０１－３、ＨＣＢ３０１－４、ＨＣＢ３０１－１、及びＨＣＢ３０１－２の結合曲線を示す。
【図9】ＨＣＢ３０１タンパク質のＲＢＣ血球凝集の結果を示す。
【図10】ＣＤ４７を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｓ細胞に対するＨＣＢ３０１タンパク質のＳＩＲＰα／ＣＤ４７遮断の結果を示す。
【図11】ＰＤ－Ｌ１を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｓ細胞に対するＨＣＢ３０１タンパク質のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断の結果を示す。ビオチン－ＰＤ１－ＥＣＤ－Ｆｃは、ビオチン化ＰＤ１＿Ｇ４を表す。
【図12A】ＨＣＢ３０１タンパク質によって阻害されたＴＧＦβ－１媒介ｓｍａｄ２レポーター活性を示す。
【図12B】ＨＣＢ３０１タンパク質によって阻害されたＴＧＦβ－２媒介ｓｍａｄ２レポーター活性を示す。
【図12C】ＨＣＢ３０１タンパク質によって阻害されたＴＧＦβ－３媒介ｓｍａｄ２レポーター活性を示す。
【図13】ＣＤ４７発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＲａｗ２６４．７マウスマクロファージによるＨＣＢ３０１タンパク質の誘導食作用活性を示す。
【図14A】ＴＧＦβ１の存在下でのＭＬＲアッセイにおけるＨＣＢ３０１タンパク質誘導細胞増殖を示す。
【図14B】ＥＬＩＳＡによって測定されたＴＧＦβ１の存在下でのＭＬＲアッセイにおけるＨＣＢ３０１タンパク質誘導ＩＬ－２分泌を示す。
【図14C】ＥＬＩＳＡによって測定されたＴＧＦβ１の存在下でのＭＬＲアッセイにおけるＨＣＢ３０１タンパク質誘導ＩＦＮ－γ分泌を示す。
【発明を実施するための形態】
【0036】
詳細な説明
本開示は、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１に結合するタンパク質複合体を提供する。これらのタンパク質複合体を使用して、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を同時に標的とし得る。その結果は、タンパク質複合体が、ＣＤ４７発現がん細胞に効果的に結合し、内因性のＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用を遮断し、それによって自然免疫応答（例えば、マクロファージによるがん細胞の食作用）を誘導し得ることを示す。一方、タンパク質複合体は、ＲＢＣ細胞又は血小板への最小限の結合を示し、それによって、抗ＣＤ４７抗体マグロリマブ（ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ）によって観察されるように、宿主細胞のクリアランスを阻害した。加えて、結果は、タンパク質複合体が、ＰＤ－Ｌ１発現がん細胞に選択的に結合し、内因性のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し得ることを示す。更に、タンパク質複合体はまた、ＴＧＦβトラップを含み得、それによって、ＴＧＦβ誘導免疫抑制応答を阻害し、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌を増加させる。
本開示は、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１に結合するタンパク質複合体を提供する。これらのタンパク質複合体を使用して、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を同時に標的とし得る。その結果は、タンパク質複合体が、ＣＤ４７発現がん細胞に効果的に結合し、内因性のＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用を遮断し、それによって自然免疫応答（例えば、マクロファージによるがん細胞の食作用）を誘導し得ることを示す。一方、タンパク質複合体は、ＲＢＣ細胞又は血小板への最小限の結合を示し、それによって、抗ＣＤ４７抗体マグロリマブ（ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ）によって観察されるように、宿主細胞のクリアランスを阻害した。加えて、結果は、タンパク質複合体が、ＰＤ－Ｌ１発現がん細胞に選択的に結合し、内因性のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し得ることを示す。更に、タンパク質複合体はまた、ＴＧＦβトラップを含み得、それによって、ＴＧＦβ誘導免疫抑制応答を阻害し、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌を増加させる。
【0037】
したがって、本明細書に記載のタンパク質複合体は、マクロファージによる食作用の増加（例えば、食作用のＣＤ４７媒介阻害の不活性化による）を介した腫瘍免疫原性及び抗原提示の増強、並びにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及びＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害を介したＴ細胞活性化の増強を伴うがん治療のために使用され得る。
【0038】
ＳＩＲＰα細胞外ドメイン
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰａ、Ｓｉｒｐａ、又はＣＤ１７２Ａ）は、膜貫通タンパク質である。３つのＩｇ様ドメインを含む細胞外領域、並びにタンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ１及びＳＨＰ２の結合を媒介する免疫受容体チロシンベース阻害モチーフを含有する細胞質領域を有する。ＳＩＲＰαのチロシンリン酸化は、様々な増殖因子及びサイトカインによって、並びに細胞外マトリックスタンパク質へのインテグリン媒介細胞接着によって調節される。ＳＩＲＰαは、マクロファージ及び樹状細胞などの骨髄細胞において特に豊富であるが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞においては低レベルでのみ発現される。
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰａ、Ｓｉｒｐａ、又はＣＤ１７２Ａ）は、膜貫通タンパク質である。３つのＩｇ様ドメインを含む細胞外領域、並びにタンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ１及びＳＨＰ２の結合を媒介する免疫受容体チロシンベース阻害モチーフを含有する細胞質領域を有する。ＳＩＲＰαのチロシンリン酸化は、様々な増殖因子及びサイトカインによって、並びに細胞外マトリックスタンパク質へのインテグリン媒介細胞接着によって調節される。ＳＩＲＰαは、マクロファージ及び樹状細胞などの骨髄細胞において特に豊富であるが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞においては低レベルでのみ発現される。
【0039】
ＳＩＲＰαの細胞外領域は、そのリガンドＣＤ４７と相互作用することができる。マクロファージ上のＳＩＲＰαと赤血球上のＣＤ４７との相互作用は、インビトロ及びインビボでのマクロファージによるＩｇオプソニン化赤血球の食作用を防止する。隣接細胞上で発現されたＣＤ４７による食細胞上のＳＩＲＰαのライゲーションは、ＳＩＲＰα細胞質免疫受容体チロシンベース阻害モチーフのリン酸化をもたらし、ＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２ホスファターゼの動員をもたらす。１つの生じる下流効果は、食作用シナプスでのミオシン－ＩＩＡの蓄積の防止、及び結果としての食作用の阻害である。したがって、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用は、健康な自己細胞が不適切に食作用されないことを確実にするために、「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」シグナルを送るための負の免疫チェックポイントとして機能する。しかしながら、ＣＤ４７の過剰発現はまた、ほぼ全てのタイプの腫瘍においても見出されており、そのうちのいくつかは、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、膀胱がん、及び乳がんを含む。マクロファージのそのような負の調節は、ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を遮断することによって最小限に抑えられ得る。したがって、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を遮断する作用物質は、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の両方を促進し得、いくつかの場合では、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を引き起こし得、したがって、様々ながんを治療するために使用され得る。
【0040】
ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を遮断することは、細胞食作用を促進し得、したがって、様々ながんを治療するために使用され得る。それは、先天性免疫によって、がん細胞の認識及び排除を引き起こす。ＣＤ４７又はＳＩＲＰαを標的とする作用物質を使用して、様々な腫瘍及びがん、例えば、固形腫瘍、血液悪性腫瘍（例えば、再発又は難治性の血液悪性腫瘍）、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、乳がん、膀胱がん、卵巣がん、及び小細胞肺がん腫瘍を治療し得る。
【0041】
加えて、ＳＩＲＰαは、マクロファージによる、赤血球及び血小板を含む、ＣＤ４７発現宿主細胞のインビボクリアランスを阻害するように作用する。ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用はまた、造血幹細胞への生着に不可欠であるようである。ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を遮断することは、正常な赤血球の偶発的な死滅を引き起こし、貧血をもたらし、炎症を引き起こす場合がある。したがって、例えば、赤血球に対する効果を限定又は制御して、ＳＩＲＰαを標的とする作用物質とＣＤ４７との相互作用を調節することが重要である。
【0042】
ＳＩＲＰα及びその機能の詳細な説明は、例えば、Ｙａｎａｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉ－ＳＩＲＰα ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．”ＪＣＩ ｉｎｓｉｇｈｔ ２．１（２０１７）、Ｓｅｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．“Ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α（ＳＩＲＰα）ｂｕｔ ｎｏｔ ＳＩＲＰβ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｂｉｎｄｓ ｔｏ ＣＤ４７ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｉｍｍａｔｕｒｅ ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｌｏｏｄ９７．９（２００１）：２７４１－２７４９において見出され得、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0043】
ヒトＳＩＲＰαは、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）のメンバーである。シグナル調節タンパク質は、必須の細胞表面タンパク質相互作用及びシグナル伝達を媒介する細胞表面Ｉｇスーパーファミリータンパク質である。ＳＩＲＰは全て、Ｎ末端の細胞外領域、単一膜貫通ドメイン、及びＣ末端の細胞内領域を含有する。
【0044】
ヒトＳＩＲＰαの細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｐ７８３２４）は、ＩｇＶドメイン、Ｉｇ様Ｃ１－１型ドメイン、及びＩｇ様Ｃ１－２型ドメインを有する。これらは、ヒトＳＩＲＰαタンパク質（配列番号２３、ＮＰ＿５４２９７０．１）のアミノ酸３２～１３７、アミノ酸１４８～２４７、及びアミノ酸２５４～３４８に対応する。アミノ酸１～３０は、シグナルペプチドである。ヒトＳＩＲＰαはまた、２つの推定上の免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む長い細胞内ドメインを有する。ＳＩＲＰα ＩＴＩＭの活性化は、細胞の応答を負に調節する阻害シグナルを送達する。
【0045】
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、１つ以上のＣＤ４７結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、ＳＩＲＰα細胞外ドメインを含むか、又はそれからなる。本明細書で使用される場合、「ＳＩＲＰα細胞外ドメイン」は、ＳＩＲＰαの細胞外領域の全部若しくは一部分又はそのバリアントを指し、細胞外領域の一部分は、ＣＤ４７に結合し得る。ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、独立して折り畳み得、自己安定化構造を形成し得る、１つ以上のタンパク質ドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、ＩｇＶドメイン、Ｉｇ様Ｃ１－１型ドメイン、及びＩｇ様Ｃ１－２型ドメインから選択される１つ以上のドメインを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、ＩｇＶドメインを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、ＩｇＶドメイン及びＩｇ様Ｃ１－１型ドメインを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、ＩｇＶドメイン、Ｉｇ様Ｃ１－１型ドメイン、及びＩｇ様Ｃ１－２型ドメインを含むか、又はそれらからなる。
【0046】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＩＲＰα細胞外ドメインは、ヒトＳＩＲＰαタンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＨ２６６９２．１、配列番号１２）のアミノ酸３１～１４８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４７結合ドメイン又はＳＩＲＰαドメインは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４７結合ドメイン又はＳＩＲＰα細胞外ドメインは、ヒトＳＩＲＰαタンパク質のＩｇＶドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４７結合ドメイン又はＳＩＲＰα細胞外ドメインは、マウスＳＩＲＰαタンパク質のＩｇＶドメインを含む。
【0047】
ＰＤ－１細胞外ドメイン
ＰＤ－１（プログラム死－１）は、免疫チェックポイントであり、調節性Ｔ細胞（抗炎症性、抑制性Ｔ細胞）におけるアポトーシスを低減させながら、リンパ節における抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進するという二重の機構を介して自己免疫から保護する。
ＰＤ－１（プログラム死－１）は、免疫チェックポイントであり、調節性Ｔ細胞（抗炎症性、抑制性Ｔ細胞）におけるアポトーシスを低減させながら、リンパ節における抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進するという二重の機構を介して自己免疫から保護する。
【0048】
ＰＤ－１は、主にＴ細胞及び初代Ｂ細胞の表面上で発現され、ＰＤ－１の２つのリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）において広く発現される。ＰＤ－１とそのリガンドとの相互作用は、免疫応答の負の調節において重要な役割を果たす。ＰＤ－１とそのリガンドとの間の結合の阻害は、腫瘍細胞を免疫系の殺滅効果に曝すことができ、したがって、腫瘍組織を殺滅し、がんを治療する効果に到達することができる。
【0049】
ＰＤ－Ｌ１は、多くの異なるがんの腫瘍細胞上に発現される。Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合してその阻害をもたらすことにより、ＰＤ－Ｌ１発現は、腫瘍細胞が免疫攻撃を回避することができる主要な機構である。ＰＤ－Ｌ１の過剰発現は、概念的には、内因性及び適応性の２つの機構に起因し得る。がん細胞上でのＰＤ－Ｌ１の固有の発現は、これらの腫瘍細胞における細胞／遺伝子異常に関連する。ＡＫＴ及びＳＴＡＴ経路を含む細胞シグナル伝達の活性化は、ＰＤ－Ｌ１発現の増加をもたらす。原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫では、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）とＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２との遺伝子融合が生じ、これらのタンパク質の過剰発現をもたらす。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２が位置する染色体９ｐ２３－２４の増幅は、古典的ホジキンリンパ腫における両方のタンパク質の発現の増加をもたらす。適応機構は、腫瘍微小環境におけるＰＤ－Ｌ１発現の誘導に関連する。ＰＤ－Ｌ１は、インターフェロンγに応答して、腫瘍細胞上で誘導され得る。マイクロサテライト不安定性結腸がんでは、ＰＤ－Ｌ１は、主に腫瘍内の骨髄細胞上で発現され、したがって、細胞毒性Ｔ細胞機能を抑制する。
【0050】
抗腫瘍免疫を増強するためのＰＤ－１遮断の使用は、ＰＤ－１相互作用を防止することがＴ細胞の枯渇を逆転させた慢性感染症モデルでの観察に由来する。同様に、ＰＤ－１の遮断は、Ｔ細胞ＰＤ－１／腫瘍細胞ＰＤ－Ｌ１又はＴ細胞ＰＤ－１／腫瘍細胞ＰＤ－Ｌ２の相互作用を防止し、Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫の回復をもたらす。
【0051】
ＰＤ－１の詳細な説明、及びがんを治療するための抗ＰＤ－１抗体の使用は、例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓｕｚａｎｎｅ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓａｆｅｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．”Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６６．２６（２０１２）：２４４３－２４５４、Ｈｉｒａｎｏ，Ｆｕｍｉｙａ，ｅｔ ａｌ．“Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ Ｂ７－Ｈ１ ａｎｄ ＰＤ－１ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．”Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５．３（２００５）：１０８９－１０９６、Ｒａｅｄｌｅｒ，Ｌｉｓａ Ａ．“Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）：ｆｉｒｓｔ ＰＤ－１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ ｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．”Ａｍｅｒｉｃａｎ ｈｅａｌｔｈ＆ｄｒｕｇ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ８．Ｓｐｅｃ Ｆｅａｔｕｒｅ（２０１５）：９６、Ｋｗｏｋ，Ｇｅｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）．”（２０１６）：２７７７－２７８９、ＵＳ２０１７／０２４７４５４、ＵＳ９，８３４，６０６（Ｂ）、及びＵＳ８，７２８，４７４において記載されており、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【0052】
ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｑ１５１１６によれば、ヒトＰＤ－１の細胞外領域は、配列番号１１のアミノ酸２４～１７０に対応し、ヒトＰＤ－１の膜貫通領域は、配列番号１１のアミノ酸１７１～１９１に対応し、ヒトＰＤ－１の細胞質領域は、配列番号１１のアミノ酸１９２～２８８に対応する。ＰＤ－１細胞外領域はまた、ヒトＰＤ－１タンパク質（配列番号１１、ＮＰ＿００５００９．２）のアミノ酸３５～１４５に対応するＩｇＶドメインを有する。シグナルペプチドは、配列番号１１のアミノ酸１～２３に対応する。ヒトＳＩＲＰαの細胞質領域はまた、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ、配列番号１１のアミノ酸２２１～２２６に対応）及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ、配列番号１１のアミノ酸２４１～２５１に対応）を有する。
【0053】
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、１つ以上のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＰＤ－１細胞外ドメインを含むか、又はそれからなる。本明細書で使用される場合、「ＰＤ－１細胞外ドメイン」は、ＰＤ－１の細胞外領域の全部若しくは一部分又はそのバリアントを指し、細胞外領域の一部分は、ＰＤ－Ｌ１に結合し得る。ＰＤ－１細胞外ドメインは、独立して折り畳み得、自己安定化構造を形成し得る、１つ以上のタンパク質ドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１細胞外ドメインは、ＩｇＶドメインを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１細胞外ドメインは、シグナルペプチドを含まない。
【0054】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤ－１細胞外ドメインは、ヒトＰＤ－１タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２、配列番号１１）のアミノ酸２６～１７０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン又はＰＤ－１細胞外ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン又はＳＩＲＰα細胞外ドメインは、ヒトＰＤ－１タンパク質のＩｇＶドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン又はＳＩＲＰα細胞外ドメインは、マウスＰＤ－Ｌ１タンパク質の細胞外ドメインの全部又は一部分を含む。
【0055】
ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン
ＴＧＦ－β受容体２型（ＴＧＦＢＲ２）は、ＴＧＦ－βファミリーの全てのメンバーのリガンド結合受容体であり、線維芽細胞を含む実質的に全ての細胞型において発現される。リガンド誘導細胞応答は、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、Ａｋｔ、Ｓｒｃ、細胞外シグナル調節キナーゼ、及びｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路などの標準的なＳｍａｄ依存性又は非標準的なＳｍａｄ非依存性シグナル伝達経路のいずれかを介して媒介される。ＴＧＦＢＲ２へのリガンド結合は、受容体の二量体化及び自己リン酸化をもたらし、その後、ＴＧＦ－ベータ受容体１型（ＴＧＦＢＲ１）又は３型（ＴＧＦＢＲ３）に結合する。新しく形成されたヘテロ四量体複合体は、次いで、調節性ＳＭＡＤ（ＳＭＡＤ２又はＳＭＡＤ３）をリン酸化し、そのリン酸化状態では、ｃｏ－ＳＭＡＤ分子ＳＭＡＤ４に結合する。調節性ＳＭＡＤ／ｃｏ－ＳＭＡＤ複合体は、核に位置を変え、標的遺伝子発現を調節する転写因子として作用する。
ＴＧＦ－β受容体２型（ＴＧＦＢＲ２）は、ＴＧＦ－βファミリーの全てのメンバーのリガンド結合受容体であり、線維芽細胞を含む実質的に全ての細胞型において発現される。リガンド誘導細胞応答は、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、Ａｋｔ、Ｓｒｃ、細胞外シグナル調節キナーゼ、及びｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路などの標準的なＳｍａｄ依存性又は非標準的なＳｍａｄ非依存性シグナル伝達経路のいずれかを介して媒介される。ＴＧＦＢＲ２へのリガンド結合は、受容体の二量体化及び自己リン酸化をもたらし、その後、ＴＧＦ－ベータ受容体１型（ＴＧＦＢＲ１）又は３型（ＴＧＦＢＲ３）に結合する。新しく形成されたヘテロ四量体複合体は、次いで、調節性ＳＭＡＤ（ＳＭＡＤ２又はＳＭＡＤ３）をリン酸化し、そのリン酸化状態では、ｃｏ－ＳＭＡＤ分子ＳＭＡＤ４に結合する。調節性ＳＭＡＤ／ｃｏ－ＳＭＡＤ複合体は、核に位置を変え、標的遺伝子発現を調節する転写因子として作用する。
【0056】
ＴＧＦβ、ＴＧＦＢＲ２の詳細な説明、及びがんを治療するためのＴＧＦβトラップの使用は、例えば、Ｂｉｅｒｉｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．“ＴＧＦβ：ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｅｋｙｌｌ ａｎｄ Ｈｙｄｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ６．７（２００６）：５０６－５２０、Ｋｉｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ ＴＧＦ－β ｐａｔｈｗａｙ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４．１（２０２１）：１－２０、及びＬｉｎｄ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．“Ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＴＧＦ－β ａｎｄ ＰＤ－Ｌ１ ｖｉａ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βＲＩＩ ａｇｅｎｔ：ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｄｖａｎｃｅｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ８．１（２０２０）において記載されており、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【0057】
ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ３７１７３によれば、ヒトＴＧＦＢＲ２の細胞外領域は、配列番号１３のアミノ酸２３～１６６に対応し、ヒトＴＧＦＢＲ２の膜貫通領域は、配列番号１３のアミノ酸１６７～１８７に対応し、ヒトＴＧＦＢＲ２の細胞質領域は、配列番号１３のアミノ酸１８８～５６７に対応する。シグナルペプチドは、配列番号１３のアミノ酸１～２２に対応する。
【0058】
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、１つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインを含むか、又はそれからなる。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン」は、ＴＧＦＢＲ２の細胞外領域の全部若しくは一部分又はそのバリアントを指し、細胞外領域の一部分は、ＴＧＦβに結合し得る。ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、独立して折り畳み得、自己安定化構造を形成し得る、１つ以上のタンパク質ドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、シグナルペプチドを含まない。
【0059】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、ヒトＴＧＦＢＲ２タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００３２３３．４、配列番号１３）のアミノ酸２４～１５９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴＧＦβ結合ドメイン又はＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴＧＦβ結合ドメイン又はＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、ヒトＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインの全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴＧＦβ結合ドメイン又はＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、マウスＰＤ－Ｌ１タンパク質の細胞外ドメインの全部又は一部分を含む。
【0060】
ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＴＧＦβを標的とする、タンパク質複合体
本開示は、ＣＤ４７に特異的に結合し得るタンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質複合体は、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαシグナル伝達経路を遮断し、したがって、免疫応答を増加させ得る。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質複合体は、食作用を開始し得る。
本開示は、ＣＤ４７に特異的に結合し得るタンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質複合体は、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαシグナル伝達経路を遮断し、したがって、免疫応答を増加させ得る。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質複合体は、食作用を開始し得る。
【0061】
本開示はまた、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し得るタンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質複合体は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路を遮断し、したがって、免疫応答を増加させ得る。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質複合体は、Ｔ細胞の活性化、増殖、及び／又はサイトカイン放出を誘導し得る。
【0062】
一態様では、本開示は、Ｆｃ、１つ以上のＣＤ４７結合ドメイン、１つ以上のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、及び任意選択で１つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含むか、又はそれらからなる、タンパク質複合体又はタンパク質構築物を提供する。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ」という用語は、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＤ）の断片結晶化可能領域を指す。「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃ領域配列」という用語は、Ｆｃ領域を形成する重鎖ペプチドにおける重鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ２及びＣＨ３）を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体又はタンパク質構築物は、１、２、３、４、５、又は６個のＣＤ４７結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体又はタンパク質構築物は、１、２、３、４、５、又は６個のＰＤ－Ｌ１結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体又はタンパク質構築物は、１、２、３、４、５、又は６個のＴＧＦβ結合ドメインを含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体又はタンパク質構築物は、Ｆｃ、分化クラスター４７（ＣＤ４７）に特異的に結合する第１のドメイン、及びプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する第２のドメインを含むか、又はそれらからなる。
【0064】
いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＣＤ４７を発現する細胞（例えば、がん細胞）に結合し得、かつ／又はＣＤ４７とシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）との間の相互作用を遮断し得る。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＳＩＲＰαの細胞外領域の全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαは、ヒトＳＩＲＰαである。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0065】
いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞（例えば、がん細胞）に結合し得、かつ／又はＴ細胞の活性化及び増殖を刺激し得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）の細胞外領域の全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１は、ヒトＰＤ－１である。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃである。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、任意選択でヒンジ領域を介して、ＦｃにおけるＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、任意選択でヒンジ領域を介して、ＦｃにおけるＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＥＵ付番によるＳ２２８Ｐ変異を任意選択で有するヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である。
【0067】
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体又はタンパク質構築物は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）に特異的に結合する第３のドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、第３のドメインは、任意選択でリンカーペプチドを介して、ＦｃにおけるＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。
【0068】
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、２つ以上の第１のドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、２つ以上の第２のドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、２つ以上の第３のドメインを含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメイン、ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、及びＴＧＦβ結合ドメインは、本明細書に記載のリンカーペプチド又はヒンジ領域配列のうちのいずれかを介してＦｃ領域に連結されている。
【0070】
タンパク質複合体のいくつかの実施形態を、図１Ａ～１Ｄに示す。それらは、以下に詳細に記載される。
【0071】
ＨＣＢ３０１－４
一態様では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。第１のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のリンカーペプチド、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択で第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む。第２のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ＨＣＢ３０１－４形式を有する例示的なタンパク質複合体の概略構造を図１Ａに示す。
一態様では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。第１のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のリンカーペプチド、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択で第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む。第２のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ＨＣＢ３０１－４形式を有する例示的なタンパク質複合体の概略構造を図１Ａに示す。
【0072】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＰＤ－１の細胞外ドメイン、例えば、ヒトＰＤ－１タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２、配列番号１１）のアミノ酸２６～１７０又は配列番号５の全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、同一である。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、異なる。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１、第２、第３、及び／又は第４のリンカーペプチドは、配列番号８～１０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１、第２、第３、及び／又は第４のリンカーペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１８）又はＧＳＧＧＳＧ（配列番号１９）の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個）の反復に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0075】
ＨＣＢ３０１－２
一態様では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。第１のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第５のリンカーペプチド、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択で第１のリンカーペプチド、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択で第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む。第２のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択で第６のリンカーペプチド、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ＨＣＢ３０１－２形式を有する例示的なタンパク質複合体の概略構造を図１Ｃに示す。
一態様では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。第１のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第５のリンカーペプチド、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択で第１のリンカーペプチド、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択で第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む。第２のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択で第６のリンカーペプチド、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ＨＣＢ３０１－２形式を有する例示的なタンパク質複合体の概略構造を図１Ｃに示す。
【0076】
いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＰＤ－１の細胞外ドメイン、例えば、ヒトＰＤ－１タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２、配列番号１１）のアミノ酸２６～１７０又は配列番号５の全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、同一である。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、異なる。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１、第２、第３、第４、第５、及び／又は第６のリンカーペプチドは、配列番号８～１０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１、第２、第３、第４、第５、及び／又は第６のリンカーペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１８）又はＧＳＧＧＳＧ（配列番号１９）の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個）の反復に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0078】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0079】
ＨＣＢ３０１－３
一態様では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。第１のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のリンカーペプチド、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択で第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む。第２のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ＨＣＢ３０１－４形式を有する例示的なタンパク質複合体の概略構造を図１Ｂに示す。
一態様では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。第１のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第１のリンカーペプチド、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択で第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む。第２のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ＨＣＢ３０１－４形式を有する例示的なタンパク質複合体の概略構造を図１Ｂに示す。
【0080】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＰＤ－１の細胞外ドメイン、例えば、ヒトＰＤ－１タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２、配列番号１１）のアミノ酸２６～１７０又は配列番号５の全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、同一である。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、異なる。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１、第２、第３、及び／又は第４のリンカーペプチドは、配列番号８～１０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１、第２、第３、及び／又は第４のリンカーペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１８）又はＧＳＧＧＳＧ（配列番号１９）の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個）の反復に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0083】
ＨＣＢ３０１－１
一態様では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。第１のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択で第１のリンカーペプチド、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第５のリンカーペプチド、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択で第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む。第２のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択で第６のリンカーペプチド、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ＨＣＢ３０１－２形式を有する例示的なタンパク質複合体の概略構造を図１Ｄに示す。
一態様では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。第１のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第１のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択で第１のリンカーペプチド、第１のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第５のリンカーペプチド、第３のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第１のヒンジ領域、第１のＦｃ領域、任意選択で第２のリンカーペプチド、及び任意選択の第１のＴＧＦβ結合ドメインを含む。第２のポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端に向かって、第２のＣＤ４７結合ドメイン、任意選択の第３のリンカーペプチド、第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択で第６のリンカーペプチド、第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、任意選択の第２のヒンジ領域、第２のＦｃ領域、任意選択の第４のリンカーペプチド、及び任意選択の第２のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ＨＣＢ３０１－２形式を有する例示的なタンパク質複合体の概略構造を図１Ｄに示す。
【0084】
いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＰＤ－１の細胞外ドメイン、例えば、ヒトＰＤ－１タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２、配列番号１１）のアミノ酸２６～１７０又は配列番号５の全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、同一である。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、異なる。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び／又は第４のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１、第２、第３、第４、第５、及び／又は第６のリンカーペプチドは、配列番号８～１０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１、第２、第３、第４、第５、及び／又は第６のリンカーペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１８）又はＧＳＧＧＳＧ（配列番号１９）の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個）の反復に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0087】
本明細書に記載のタンパク質複合体のうちのいずれかでは、第１及び／又は第２のＣＤ４７結合ドメインは、ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン、例えば、ヒトＳＩＲＰαタンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＨ２６６９２．１、配列番号１２）のアミノ酸３１～１４８又は配列番号６の全部又は一部分を含み得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＤ４７結合ドメインは、同一である。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＣＤ４７結合ドメインは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＣＤ４７結合ドメインは、ＳＩＲＰα（例えば、ヒトＳＩＲＰα）のＩｇＶドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣＤ４７結合ドメインは、異なる。
【0088】
本明細書に記載のタンパク質複合体のうちのいずれかでは、第１及び／又は第２のＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦＢＲ２の細胞外ドメイン、例えば、ヒトＴＧＦＢＲ２タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００３２３３．４、配列番号１３）のアミノ酸２４～１５９又は配列番号７の全部又は一部分を含み得る。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＴＧＦβ結合ドメインは、同一である。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＴＧＦβ結合ドメインは、異なる。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＴＧＦβ結合ドメインは、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0089】
本明細書に記載のタンパク質複合体のうちのいずれかでは、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、免疫グロブリンのヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１６）の全部又は一部分を含み得る。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヒンジ領域は、同一である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヒンジ領域は、異なる。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、ＥＵ付番による２２８位にプロリンを含む。
【0090】
本明細書に記載のタンパク質複合体のうちのいずれかでは、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、同一であり得、Ｆｃホモ二量体を形成し得る。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンのＦｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域（配列番号１７）の全部又は一部分を含む。本明細書に記載のタンパク質複合体のうちのいずれかでは、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、異なり得る。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、１つ以上の変異を導入することによって、Ｆｃヘテロ二量体を形成し得る。例えば、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、１つ以上のノブイントゥホール（ＫＩＨ）変異を含み得る。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、当該技術分野で既知の他の技術を使用して、Ｆｃヘテロ二量体を形成し得る。詳細なヘテロ二量体Ｆｃ技術は、例えば、Ｈａ，ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｆｒｏｍ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７（２０１６）：３９４において見出され得、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0091】
一態様では、本開示は、ＣＤ４７結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ４７結合ドメインのうちのいずれか）及びＰＤ－Ｌ１結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合ドメインのうちのいずれか）を含むタンパク質複合体に関する。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、ＴＧＦβ結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のＴＧＦβ結合ドメインのうちのいずれか）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、ＳＩＲＰα細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載のＳＩＲＰα細胞外ドメインのうちのいずれか）であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＰＤ－１細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載のＰＤ－１細胞外ドメインのうちのいずれか）であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載のＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインのうちのいずれか）であるか、又はそれを含む。
【0092】
タンパク質複合体の特性
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、本明細書に記載の任意のＣＤ４７結合ドメイン、ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、及び／又はＴＧＦβ結合ドメインを含み得る。本開示はまた、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸も提供する。
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、本明細書に記載の任意のＣＤ４７結合ドメイン、ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、及び／又はＴＧＦβ結合ドメインを含み得る。本開示はまた、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸も提供する。
【0093】
２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列が最適な比較目的のためにアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップが導入され得、非相同配列が比較目的のために無視され得る）。比較目的でアラインメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９５％、又は１００％である。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されている場合、したがって、その分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有された同一の位置の数の関数である。例えば、２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡張ペナルティ、及び５のフレームシフトギャップペナルティを有するＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスを使用して達成され得る。
【0094】
本明細書に記載のタンパク質複合体は、抗体のＦｃを含み得る。これらの抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス、又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２）のものであり得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）に由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域）である。
【0095】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、抗体ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥヒンジ領域）を介してＦｃ領域に連結されている。加えて、Ｆｃ領域は、所望のエフェクター機能又は血清半減期を提供するように改変され得る。
【0096】
本明細書に記載のタンパク質複合体は、免疫細胞上に発現されるＣＤ４７と内因性ＳＩＲＰαとの間の結合を遮断し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合することによって、本明細書に記載のタンパク質複合体は、免疫細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、及び樹状細胞）上で発現される内因性ＳＩＲＰαへのＣＤ４７（例えば、腫瘍細胞上で発現される）の結合を阻害し得、それによって、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路を遮断し、免疫応答を上方制御し、食作用を促進する。
【0097】
本明細書に記載のタンパク質複合体は、免疫細胞上に発現されるＰＤ－Ｌ１と内因性ＰＤ－１との間の結合を遮断し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合することによって、本明細書に記載のタンパク質複合体は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）上で発現される内因性ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１（例えば、腫瘍細胞上で発現される）の結合を阻害し得、それによって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断し、免疫応答を上方制御し、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン放出を活性化する。
【0098】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、免疫応答、免疫細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、樹状細胞、抗原提示細胞）の活性又は数を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、又は２０倍増加させ得る。
【0099】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、０．１ｓ－１未満、０．０１ｓ－１未満、０．００１ｓ－１未満、０．０００１ｓ－１未満、又は０．００００１ｓ－１未満の解離速度（ｋｏｆｆ）で、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７、サルＣＤ４７、又はマウスＣＤ４７）、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１、サルＰＤ－Ｌ１、又はマウスＰＤ－Ｌ１）、又はＴＧＦβ（例えば、ヒトＴＧＦβ、サルＴＧＦβ、又はマウスＴＧＦβ）に結合し得る。いくつかの実施形態では、解離速度（ｋｏｆｆ）は、０．０１ｓ－１超、０．００１ｓ－１超、０．０００１ｓ－１超、０．００００１ｓ－１超、又は０．０００００１ｓ－１である。いくつかの実施形態では、動的会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０２／Ｍｓ超、１×１０３／Ｍｓ超、１×１０４／Ｍｓ超、１×１０５／Ｍｓ超、又は１×１０６／Ｍｓ超である。いくつかの実施形態では、動的会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０５／Ｍｓ未満、１×１０６／Ｍｓ未満、又は１×１０７／Ｍｓ未満である。親和性は、動的速度定数（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）の商から推定され得る。いくつかの実施形態では、ＫＤは、１×１０－６Ｍ未満、１×１０－７Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満、又は１×１０－１０Ｍ未満である。いくつかの実施形態では、ＫＤは、３００ｎＭ未満、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ，３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、又は１０ｐＭである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、１×１０－７Ｍ超、１×１０－８Ｍ超、１×１０－９Ｍ超、１×１０－１０Ｍ超、１×１０－１１Ｍ超、又は１×１０－１２Ｍ超である。
【0100】
親和性を測定するための一般的な技術としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、サルＣＤ４７、及び／又はマウスＣＤ４７に結合し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、サルＣＤ４７、及び／又はマウスＣＤ４７に結合することができない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、サルＰＤ－Ｌ１、及び／又はマウスＰＤ－Ｌ１に結合し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、サルＰＤ－Ｌ１、及び／又はマウスＰＤ－Ｌ１に結合することができない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、サルＴＧＦβ、及び／又はマウスＴＧＦβに結合し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、サルＴＧＦβ、及び／又はマウスＴＧＦβに結合することができない。
【0101】
いくつかの実施形態では、熱安定性が決定される。本明細書に記載のタンパク質複合体は、６０超、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５℃のＴｍを有し得る。いくつかの実施形態では、Ｔｍは、６０未満、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５℃である。
【0102】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、１０％超、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％の腫瘍増殖阻害パーセンテージ（ＴＧＩ％）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、６０％未満、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％の腫瘍増殖阻害パーセンテージを有する。ＴＧＩ％は例えば、治療開始の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日後、又は治療開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２か月後に決定され得る。本明細書で使用される場合、腫瘍増殖阻害パーセンテージ（ＴＧＩ％）は、以下の式：
ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００
を使用して計算される。Ｔｉは、ｉ日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｔ０は、ゼロ日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群における平均腫瘍体積である。Ｖ０は、ゼロ日目の対照群における平均腫瘍体積である。
ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００
を使用して計算される。Ｔｉは、ｉ日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｔ０は、ゼロ日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群における平均腫瘍体積である。Ｖ０は、ゼロ日目の対照群における平均腫瘍体積である。
【0103】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の腫瘍阻害効果は、抗ＣＤ４７参照抗体、例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４、又は抗ＳＩＲＰα抗体、例えば、ＣＣ－９５２５１と同等である。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４は、例えば、Ｓｉｋｉｃ ｅｔ ａｌ．“Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｈｕｍａｎ，ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｃｌａｓｓ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ４７ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃａｎｃｅｒｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３７．１２（２０１９）：９４６に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の腫瘍阻害効果は、抗ＣＤ４７参照抗体、例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４、又は抗ＳＩＲＰα抗体、例えば、ＣＣ－９５２５１よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、又は５倍多い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の腫瘍阻害効果は、ＳＩＲＰα＿Ｇ４よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、又は５倍多い。ＳＩＲＰα＿Ｇ４（又はｈＳＩＲＰα－Ｇ４Ｆｃ－ｗｔ（Ｔｒｉｌｌｉｕｍ）、ＴＴＩ－６２２）の詳細は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３２９６１６（Ａ１）号に見出され得、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＳＩＲＰα＿Ｇ４のアミノ酸配列を、配列番号１４に示す。
【0104】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の腫瘍阻害効果は、抗ＰＤ－Ｌ１参照抗体、例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、又は抗ＰＤ－１抗体、例えば、ペムブロリズマブと同等である。ＭＰＤＬ３２８０Ａは、例えば、Ｐｏｗｌｅｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．“ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１）ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．”Ｎａｔｕｒｅ ５１５．７５２８（２０１４）：５５８－５６２に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の腫瘍阻害効果は、抗ＰＤ－Ｌ１参照抗体、例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、又は抗ＰＤ－１抗体、例えば、ペムブロリズマブよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、又は５倍多い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の腫瘍阻害効果は、ＰＤ１＿Ｇ４よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、又は５倍多い。ＰＤ１＿Ｇ４は、ＨＣＢ３０１融合タンパク質（ＨＣＢ３０１タンパク質）の対照タンパク質として使用される。ＰＤ１＿Ｇ４のアミノ酸配列を、配列番号１５に示す。
【0105】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の腫瘍阻害効果は、ＴＧＦβトラップタンパク質、例えば、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体×ＴＧＦβトラップＭ７８２４と同等である。Ｍ７８２４は、例えば、Ｇａｔｔｉ－Ｍａｙｓ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．“Ｍ７８２４：ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｃｏｍｂａｔ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ．”Ｏｎｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ５．１１－１２（２０１８）：２６９に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の腫瘍阻害効果は、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ又はＭ７８２４よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、又は５倍多い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の腫瘍阻害効果は、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、又は５倍多い。ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップは、ＨＣＢ３０１融合タンパク質（ＨＣＢ３０１タンパク質）の対照タンパク質として使用される。ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップのアミノ酸配列を、配列番号２０に示す。
【0106】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、機能性Ｆｃを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４由来である。いくつかの実施形態では、機能性Ｆｃのエフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）である。いくつかの実施形態では、機能性Ｆｃのエフェクター機能は、食作用である。いくつかの実施形態では、機能性Ｆｃのエフェクター機能は、ＡＤＣＣ及び食作用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質構築物は、エフェクター機能のないＦｃ領域を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、機能性Ｆｃ領域を有しない。例えば、Ｆｃ領域は、ＬＡＬＡ変異（ＥＵ付番におけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異）、又はＬＡＬＡ－ＰＧ変異（ＥＵ付番におけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ変異）を有する。
【0107】
Ｆｃ領域に対するいくつかの他の改変を行うことができる。例えば、システイン残基を、Ｆｃ領域に導入することができ、それによってこの領域での鎖間ジスルフィド結合形成が可能になる。このように生成されたホモ二量体融合タンパク質は、インビトロ及び／又はインビボでの任意の増加した半減期を有し得る。
【0108】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４は、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵ付番）を有する。Ｓ２２８Ｐ変異は、インビボ及びインビトロのＩｇＧ４ Ｆａｂ－アーム交換を防止する。
【0109】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合されたフコースを欠く炭水化物構造を有する。例えば、そのようなＦｃ領域組成物におけるフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、又は２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されるように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合する全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番、又はＫａｂａｔ付番における３１４位）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ｆｃ領域配列のわずかな配列変動により、Ａｓｎ２９７はまた、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち、２９４位～３００位に位置し得る。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。いくつかの実施形態では、グリカンの不均一性を低減するために、Ｆｃ領域を、２９７位のアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）に置き換えるように更に操作することができる。
【0110】
いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣ－ＳＥＣの主要なピークは、プロテインＡベースの親和性クロマトグラフィー及び／又はサイズ排他的クロマトグラフィーによる精製後の本明細書に記載のタンパク質複合体の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％を占める。
【0111】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、抗ＣＤ４７参照抗体（例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）又はＳＩＲＰα＿Ｇ４と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、又は少なくとも１２０％である親和性で、ヒトＣＤ４７発現腫瘍細胞（例えば、ヒトＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞、又はＦａＤｕ細胞）に結合し得る。
【0112】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ＰＤ１＿Ｇ４と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、又は少なくとも１２０％である親和性で、ヒトＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｓ細胞）に結合し得る。
【0113】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、又は少なくとも１２０％である親和性で、ヒトＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３）に結合し得る。いくつかの実施形態では、ヒトＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３）に結合するタンパク質複合体のＥＣ５０値は、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップのＥＣ５０値と比較して、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、１倍未満、２倍未満、３倍未満、４倍未満、５倍未満、又は１０倍未満である。
【0114】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、抗ＣＤ４７参照抗体（例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）と比較して、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、又は１％未満の親和性でＲＢＣ細胞又は血小板（例えば、ヒトドナー由来）に結合し得る。
【0115】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、血球凝集を誘導しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、抗ＣＤ４７参照抗体（例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）と比較して、５００倍、２０００倍、５０００倍、２００００倍、又は５００００倍超の最小濃度で血球凝集を誘導し得る。
【0116】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７又はその断片）とＳＩＲＰα（例えば、ヒトＳＩＲＰα又はその断片）との間の相互作用を遮断し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ヒトＣＤ４７発現細胞（例えば、ＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞又はＦａＤｕ細胞）とヒトＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の遮断能力は、抗ＣＤ４７参照抗体（例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）又はＳＩＲＰａ＿Ｇ４と比較して、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、又は少なくとも１５０％である。
【0117】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１又はその断片）とＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１又はその断片）との間の相互作用を遮断し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ヒトＰＤ－Ｌ１発現細胞（例えば、ＰＤ－Ｌ１ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞）とヒトＰＤ－１との間の相互作用を遮断し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体の遮断能力は、抗ＰＤ－Ｌ１参照抗体（例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）又はＰＤ１＿Ｇ４と比較して、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、又は少なくとも１５０％である。
【0118】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、マウスマクロファージ（例えば、Ｒａｗ２６４．７細胞）によるＣＤ４７発現腫瘍細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）の食作用を誘導し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７発現腫瘍細胞の食作用を誘導するための本明細書に記載のタンパク質複合体のＥＣ５０値は、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７発現腫瘍細胞の食作用を誘導するための本明細書に記載のタンパク質複合体のＥＣ５０値は、抗ＣＤ４７参照抗体（例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）又はＳＩＲＰα＿Ｇ４のＥＣ５０値と同等である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体が、マウスマイクロファージによるＣＤ４７発現腫瘍細胞の食作用を誘導する能力は、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４又はＳＩＲＰα＿Ｇ４の能力と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、抗ＣＤ４７参照抗体（例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）よりも、マウスマクロファージ（例えば、Ｒａｗ２６４．７細胞）によるＲＢＣ細胞又は血小板の食作用を誘導する能力が弱い（例えば、８０％未満、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％）。
【0119】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ヒトマクロファージ（例えば、ＭＤＭ細胞）によるＣＤ４７発現腫瘍細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）の食作用を誘導し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体が、ヒトマクロファージによるＣＤ４７発現腫瘍細胞の食作用を誘導する能力は、抗ＣＤ４７参照抗体（例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）又はＳＩＲＰα＿Ｇ４の能力と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、抗ＣＤ４７参照抗体（例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）よりも、ヒトマクロファージ（例えば、ＭＤＭ細胞）によるＲＢＣ細胞又は血小板の食作用を誘導する能力が弱い（８０％未満、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％）。
【0120】
赤血球を含む様々な細胞型上でのＣＤ４７の内因性発現は、ＣＤ４７標的療法の有効性を制限する可能性がある恐ろしい「抗原シンク」を作り出す。したがって、本明細書に記載のタンパク質複合体のＲＢＣ細胞及び／又は血小板の食作用を誘導する弱い能力は、タンパク質複合体のインビボ有効性を増加させ得る。加えて、タンパク質複合体は、抗ＣＤ４７参照抗体（例えば、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）と同様の有効性を有して、低用量レベル及び／又は低頻度の投薬スケジュールで投与され得る。
【0121】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ＴＧＦβ誘導下流経路、例えば、ｓｍａｄ２レポーター経路を阻害し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、抗ＴＧＦβ、又はＭ７８２４と比較して、ＴＧＦβ１媒介ｓｍａｄ２レポーター活性を、１５０％未満、１４０％未満、１３０％未満、１２０％未満、１１０％未満、１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、又は５０％未満に阻害し得る。
【0122】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、（例えば、ＭＬＲアッセイにおいて）Ｔ細胞応答を増強し得る。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の原理は、１つのドナー由来のＴ細胞が、異なるドナー由来のＡＰＣの存在下で増殖することである。これは、２つの無関係のドナー間のＨＬＡミスマッチの認識によって引き起こされ、Ｔ細胞からの免疫応答を誘発する。ＭＬＲは、多くの場合、培養物中でＴ細胞の全般的な刺激／活性化を誘導する手段として使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、本明細書で使用される対照分子又はそれらの組み合わせよりも、Ｔ細胞増殖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％増加させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、本明細書で使用される対照分子又はそれらの組み合わせよりも、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－２）産生を少なくとも１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、又は１００００倍増加させ得る。
【0123】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ヒトにおいてサイトカインストームを誘導しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、スーパーアゴニストではない。サイトカインストーム及びスーパーアゴニストの詳細は、例えば、Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ－Ｖｏｒｎｈａｇｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．“Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ６．１（２０１８）：１－１４に見出され得、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0124】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、腫瘍増殖を阻害し得る。
【0125】
タンパク質複合体を作製する方法
本明細書に記載のタンパク質複合体のバリアントは、ポリペプチド又はその一部をコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。そのようなバリアントは、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換を含む。
本明細書に記載のタンパク質複合体のバリアントは、ポリペプチド又はその一部をコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。そのようなバリアントは、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換を含む。
【0126】
スクリーニングを実施して、ＣＤ４７結合ドメイン及びＰＤ－Ｌ１結合ドメインの結合親和性を増加させ得る。欠失、挿入、及び／又は組み合わせの任意の組み合わせを行って、標的に対する結合親和性が増加したバリアントに到達し得る。バリアントに導入されたアミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数の変更（例えば、増加又は減少）、グリコシル化部位のタイプの変更（例えば、細胞に存在する酵素によって異なる糖が結合されるようにアミノ酸配列を変更）、又は新しいグリコシル化部位の導入など、ポリペプチドに新しい翻訳後修飾を変更又は導入し得る。
【0127】
ＣＤ４７結合ドメイン及び／又はＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、哺乳動物を含む任意の種の動物に由来し得る。結合ドメインバリアントの非限定的な例としては、ヒト、霊長類、例えば、サル及び類人猿、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラクダ科動物（例えば、ラクダ及びラマ）、ニワトリ、ヤギ、及びげっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、及びウサギ）に由来する配列が挙げられる。
【0128】
本開示はまた、本明細書に開示の単離されたポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む組換えベクター（例えば、発現ベクター）、組換えベクターが導入される宿主細胞（すなわち、宿主細胞がポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドを含むベクターを含有するように）、及び組換え技術による組換えポリペプチド又はその断片の産生を提供する。
【0129】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ベクターが宿主細胞に導入される場合に、目的の１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる任意の構築物である。「発現ベクター」は、目的の１つ以上のポリヌクレオチドを、発現ベクターが導入された宿主細胞においてコードされたポリペプチドとして送達及び発現することができる。したがって、発現ベクターにおいて、目的のポリヌクレオチドは、目的のポリヌクレオチドが、発現ベクターが導入された宿主細胞において翻訳されるような、目的のポリヌクレオチドの組み込み部位で、又はその近傍で、又は隣接して、ベクター内又は宿主細胞のゲノムにおけるずれかで、プロモーター、エンハンサー、及び／又はポリＡテールなどの調節エレメントと作動可能に連結されていることによって、目的のポリヌクレオチドがベクターにおいて発現するように配置される。
【0130】
ベクターは、当該技術分野で既知の方法、例えば、エレクトロポレーション、化学トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン）、形質転換、トランスフェクション、並びに（例えば、組換えウイルスでの）感染及び／又は形質導入によって宿主細胞に導入され得る。したがって、ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター（組換えウイルスを生成するために使用され得る）、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ファージベクター、及びカチオン性縮合剤と結びついたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクターが挙げられる。
【0131】
いくつかの実施態様では、本明細書に開示のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）は、ウイルス発現系（例えば、ワクシニア又は他のポックスウイルス、レトロウイルス、又はアデノウイルス）を使用して導入され、これは、非病原性（欠陥）の複製能のあるウイルスの使用を伴い得るか、又は複製欠陥ウイルスを使用し得る。ＤＮＡをそのような発現系に組み込むための技術は、当業者に周知である。ＤＮＡはまた、「裸」であってもよい。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞内に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【0132】
発現のために、本明細書に開示のポリペプチドコードポリヌクレオチドを含むＤＮＡ挿入物は、いくつかを挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ｌａｃ、ｔｒｐ、及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの適切なプロモーター（例えば、異種プロモーター）に作動可能に連結され得る。他の好適なプロモーターは、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。発現構築物は、転写開始、終止のための部位、及び転写領域において翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含有し得る。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、最初に開始する翻訳、翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）を含み得る。
【0133】
示されるように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含み得る。そのようなマーカーには、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、並びに大腸菌及び他の細菌において培養するためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細胞などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ） Ｓ２及びスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ） Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｂｏｗｅｓ黒色腫、及びＨＫ２９３細胞などの動物細胞、並びに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は、当該技術分野で既知である。
【0134】
細菌における使用のための非限定的なベクターとしては、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、及びｐＱＥ－９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、並びにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。非限定的な真核生物ベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、及びｐＳＧ、並びにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが挙げられる。当業者には、他の好適なベクターが容易に明らかになるであろう。
【0135】
使用に好適な非限定的な細菌プロモーターとしては、大腸菌 ｌａｃＩ及びｌａｃＺ プロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ及びＰＬプロモーター、並びにｔｒｐプロモーターが挙げられる。好適な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のものなどのレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、並びにマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
【0136】
酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、α因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成的又は誘導性プロモーターを含有する多数のベクターが使用され得る。
【0137】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、又は他の方法によって影響を受ける可能性がある。そのような方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載され、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0138】
高等真核生物による本開示のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加され得る。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常、約１０～３００ｂｐであり、所与の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増加させるように作用する。エンハンサーの例としては、塩基対１００～２７０の複製起点の後側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【0139】
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔、周辺質空間、又は細胞外環境に分泌するために、適切な分泌シグナルが、発現されたポリペプチドに組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るか、又は異種シグナルであり得る。
【0140】
ポリペプチドは、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合物）などの改変された形態で、又はヒスチジンタグを有して、発現され得、かつ、分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能領域も含み得る。例えば、追加のアミノ酸、特に電荷アミノ酸の領域を、ポリペプチドのＮ末端に付加して、宿主細胞内、精製中、又はその後の取り扱い及び保管中の安定性及び持続性を改善し得る。また、精製を容易にするために、ペプチド部分をポリペプチドに付加することもできる。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製前に除去され得る。とりわけ、分泌又は排出を引き起こし、安定性を改善し、精製を容易にするために、ペプチド部分をポリペプチドに付加することは、当該技術分野でよく知られた日常的な技術である。
【0141】
治療の方法
本開示のタンパク質構築物又はポリペプチドは、様々な治療目的で使用され得る。
本開示のタンパク質構築物又はポリペプチドは、様々な治療目的で使用され得る。
【0142】
一態様では、本開示は、対象におけるがんを治療するための方法、対象における腫瘍の体積増加速度を経時的に低減する方法、転移を発症するリスクを低減する方法、又は対象における追加の転移を発症するリスクを低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療は、がんの進行を停止、減速、遅延、又は阻害し得る。いくつかの実施形態では、治療は、対象におけるがんの１つ以上の症状の数、重症度、及び／又は期間の低減をもたらし得る。
【0143】
一態様では、本開示は、本明細書に開示のタンパク質構築物又はポリペプチドの治療有効量を、それを必要とする対象（例えば、がんを有するか、又は有すると特定若しくは診断された対象）、例えば、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、カルチノイドがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、神経膠腫、頭頸がん、肝臓がん、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、尿道がん、又は血液悪性腫瘍に投与することを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、がんは、切除不能な黒色腫若しくは転移性黒色腫、非小細胞肺がん腫（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膀胱がん、又は転移性ホルモン不応性前立腺がんである。いくつかの実施形態では、対象は、固形腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、がんは、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、又は結腸直腸がん腫である。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、膵臓がん腫、中皮腫、血液学的悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、慢性リンパ性白血病、又は進行性固形腫瘍である。
【0144】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物及び方法は、がんのリスクがある患者の治療に使用され得る。がん患者は、当該技術分野で既知の様々な方法で特定され得る。
【0145】
本明細書で使用される場合、「有効量」とは、疾患、例えば、がんの進行を停止、減速、遅延、又は阻害することを含む、有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な量又は投薬量を意味する。有効量は、例えば、タンパク質構築物若しくはポリペプチド、該タンパク質構築物若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及び／又はそれらの組成物が投与される対象の年齢及び体重、症状の重症度、及び投与経路に応じて変化し、したがって、投与は、個々に基づいて決定され得る。
【0146】
有効量は、１回以上の投与で投与され得る。例として、タンパク質構築物又はポリペプチドの有効量は、患者におけるがんの進行を改善、停止、安定化、逆転、阻害、減速、及び／又は遅延させるのに十分な量であるか、又はインビトロでの細胞（例えば、生検細胞、本明細書に記載のがん細胞のうちのいずれか、又は細胞株（例えば、がん細胞株））の増殖を改善、停止、安定化、逆転、減速、及び／又は遅延させるのに十分な量である。当該技術分野で理解されるように、有効量は、とりわけ、患者の病歴、並びに使用されるタンパク質構築物又はポリペプチドのタイプ（及び／又は投薬量）などの他の要因に応じて変化し得る。
【0147】
タンパク質構築物若しくはポリペプチド、該タンパク質構築物若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／又は本明細書に開示の組成物を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に決定され得、そのような決定を行うことは、当該技術分野の技術の範囲内である。当業者は、投与される必要がある投薬量が、例えば、本明細書に開示のタンパク質構築物若しくはポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び／又は組成物を受ける哺乳動物、投与経路、使用される本明細書に開示の特定のタイプのポリヌクレオチド及び／又は組成物、並びに哺乳動物に投与される他の薬物に応じて変化することを理解するであろう。
【0148】
有効量のタンパク質構築物及び／又はポリペプチドの典型的な１日投薬量は、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ（患者体重ｋｇ当たりのｍｇ）である。いくつかの実施形態では、投薬量は、１００ｍｇ／ｋｇ未満、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態では、投薬量は、１０ｍｇ／ｋｇ超、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態では、投薬量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、投薬量は、約１～１０ｍｇ／ｋｇ、約１～５ｍｇ／ｋｇ、又は約２～５ｍｇ／ｋｇである。
【0149】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかでは、タンパク質構築物又はポリペプチドは、少なくとも週に１回（例えば、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、１日に１回、１日に２回、又は１日に３回）、対象に投与され得る。
【0150】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療用物質は、タンパク質構築物又はポリペプチドを投与する前に、又は投与した後に、対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療用物質は、対象において１つ以上の追加の治療用物質及びタンパク質構築物又はポリペプチドの生理活性期間に重複があるように、対象に投与される。
【0151】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療用物質が対象に投与され得る。追加の治療用物質は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、ＥＲＫの阻害剤、Ｋ－Ｒａｓの阻害剤、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤、Ａｋｔの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤、並びにイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）及び／又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）の阻害剤からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１）（ＩＤＯ１）の阻害剤（例えば、エパカドスタット）である。
【0152】
いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、ＨＥＲ３の阻害剤、ＬＳＤ１の阻害剤、ＭＤＭ２の阻害剤、ＢＣＬ２の阻害剤、ＣＨＫ１の阻害剤、活性化されたヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤、及びエストロゲン受容体を選択的に分解する作用物質からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を含み得る。
【0153】
いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、トラベクテジン、ｎａｂ－パクリタキセル、トレバナニブ、パゾパニブ、セディラニブ、パルボシクリブ、エベロリムス、フルオロピリミジン、ＩＦＬ、レゴラフェニブ、レオリジン（Ｒｅｏｌｙｓｉｎ）、アリムタ、ジカディア、スーテント、テムシロリムス、アキシチニブ、エベロリムス、ソラフェニブ、ヴォトリエント、パゾパニブ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ－００３、カボザンチニブ、ビンフルニン、Ｈｓｐ９０阻害剤、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ、テマゾロミド、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンブラスチン、サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）、ダカルバジン、シクロホスファミド、レナリドミド、アザシチジン、レナリドミド、ボルテゾミド（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｄ）、アムルビシン、カルフィルゾミブ、プララトレキサート、及びエンザスタウリンからなる群から選択される１つ以上の治療用物質を含み得る。
【0154】
いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ、ＩＬ－１、ＨＭＧＢ１、ＩＬ－１０アンタゴニスト、ＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－１３アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＨＶＥＭアンタゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＣＸ３ＣＬ１を標的とする治療、ＣＸＣＬ９を標的とする治療、ＣＸＣＬ１０を標的とする治療、ＣＣＬ５を標的とする治療、ＬＦＡ－１アゴニスト、ＩＣＡＭ１アゴニスト、及びセレクチンアゴニストからなる群から選択される１つ以上の治療用物質を含み得る。
【0155】
いくつかの実施形態では、カルボプラチン、ｎａｂ－パクリタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、ペメトレキセド、ゲムシタビン、ＦＯＬＦＯＸ、又はＦＯＬＦＩＲＩが、対象に投与される。
【0156】
いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、又は抗ＧＩＴＲ抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）又は抗ＥＧＦ受容体抗体（例えば、セツキシマブ）である。
【0157】
医薬組成物及び投与経路
本明細書に記載のタンパク質構築物又はポリペプチドを含有する医薬組成物もまた本明細書に提供される。医薬組成物は、当該技術分野で既知の任意の方法で製剤化され得る。
本明細書に記載のタンパク質構築物又はポリペプチドを含有する医薬組成物もまた本明細書に提供される。医薬組成物は、当該技術分野で既知の任意の方法で製剤化され得る。
【0158】
医薬組成物は、それらの意図される投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）と適合性であるように製剤化される。組成物は、無菌希釈剤（例えば、無菌水若しくは生理食塩水）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、若しくは他の合成溶媒、ベンジルアルコール若しくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの抗菌剤若しくは抗真菌剤、アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、若しくはリン酸塩などの緩衝剤、及び糖（例えば、デキストロース）、ポリアルコール（例えば、マンニトール若しくはソルビトール）、若しくは塩（例えば、塩化ナトリウム）などの等張剤、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。リポソーム懸濁液は、薬学的に許容される担体としても使用され得る。これらの組成物の調製物は、製剤化され、アンプル、使い捨てシリンジ、又は複数用量バイアル内に封入され得る。必要に応じて（例えば、注射可能な製剤など）、例えば、レシチン又は界面活性剤などのコーティング剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。該剤の吸収は、吸収を遅延させる作用物質（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることによって延長され得る。あるいは、制御放出は、生分解性、生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸）を含み得るインプラント及びマイクロカプセル化送達システムによって達成され得る。
【0159】
本明細書に記載のタンパク質構築物又はポリペプチドを含有する組成物は、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）投与のために、投薬単位形態（すなわち、投与の簡便性及び投薬量の均一性のために所定量の活性化合物を含有する物理的に別個の単位）で製剤化され得る。
【0160】
非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは滅菌で、実質的に等張であり、適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち単回投与のための投薬量）で提供され得る。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は補助剤を使用して製剤化され得る。製剤は、選択した投与経路に依存する。注射のために、該剤は、注射部位での不快感を低減するために、水溶液中、好ましくは生理学的に適合する緩衝液中に製剤化され得る。溶液は、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有し得る。あるいは、タンパク質構築物又はポリペプチドは、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌されたパイロゲンフリー水での構成用に凍結乾燥された形態であり得る。
【0161】
組成物の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物（例えば、サル）における標準の薬学的手順によって判定され得る。例えば、１つは、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定し得、治療指数は、ＬＤ５０：ＥＤ５０の比率である。高い治療指数を呈する作用物質が好ましい。作用物質が望ましくない副作用を呈する場合、潜在的な損傷を最小限に抑える（すなわち、望ましくない副作用を低減させる）ように注意を払う必要がある。毒性及び治療有効性は、他の標準的な薬学的手順によって判定され得る。
【0162】
例示的な用量としては、対象の体重のキログラム当たりの本明細書に記載のタンパク質構築物又はポリペプチドのうちのいずれかのミリグラム又はマイクログラム量（例えば、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ～約５０μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ）が含まれる。これらの用量は広範囲をカバーするが、当業者は、治療用物質がその効力を変化させることができ、有効量が当該技術分野で既知の方法によって決定され得ることを理解するであろう。典型的には、比較的低い用量が最初に投与され、主治医の医療専門家又は獣医学の専門家（治療用途の場合）又は研究者（開発段階でまだ作業している場合）は、その後、適切な応答が得られるまで、用量を徐々に増加させ得る。加えて、任意の特定の対象の特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事、投与時間、投与経路、排泄速度、及びインビボでの半減期を含む様々な因子に依存することが理解される。
【0163】
医薬組成物は、投与の指示とともに、容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。本開示はまた、本明細書に記載の様々な使用のためのタンパク質構築物又はポリペプチドを製造する方法を提供する。
【実施例】
【0164】
本発明を以下の実施例で更に説明するが、それらは特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【0165】
実施例１．ＰＤ１×ＳＩＲＰα×ＴＧＦβトラップ形式を有するＦｃベースのデザイナー生物製剤（ＦＢＤＢ（商標））の設計
ＦＢＤＢ（商標）の異なる三重標的形式は、（１）治療剤をＰＤ－Ｌ１＋腫瘍細胞に指向し、（２）自然免疫（例えば、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７経路を標的とする）及び適応免疫（例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を標的とする）の力を組み合わせ、（３）ＴＧＦβ誘導免疫抑制を逆転させるように設計及び開発された。
ＦＢＤＢ（商標）の異なる三重標的形式は、（１）治療剤をＰＤ－Ｌ１＋腫瘍細胞に指向し、（２）自然免疫（例えば、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７経路を標的とする）及び適応免疫（例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を標的とする）の力を組み合わせ、（３）ＴＧＦβ誘導免疫抑制を逆転させるように設計及び開発された。
【0166】
各形式は、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ４）のＦｃ領域に直接的又は間接的に接続されている少なくとも３つの異なるタイプの免疫モジュールを含む。３つの免疫モジュールは、（１）食作用を誘導することによって抗原提示を刺激し得る、１つ以上のＳＩＲＰα細胞外ドメイン、（２）ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断してＴ細胞機能を増強し、ＳＩＲＰα×ＰＤ－１×ＴＧＦβトラップ分子をＰＤ－Ｌ１発現腫瘍に誘導し得る、１つ以上のＰＤ－１細胞外ドメイン、及び（３）免疫抑制性ＴＧＦβを捕捉しかつ腫瘍微小環境を改善して免疫応答を増強し得る、１つ以上のＴＧＦβトラップ分子（例えば、ＴＧＦ－ベータ受容体２型（ＴＧＦＢＲ２）の細胞外ドメイン）である。例えば、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、腫瘍細胞上のＣＤ４７とマクロファージ上のＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断することによって、マクロファージに対して「私を食べないで」ブレーキを放出し得、ＰＤ－１細胞外ドメインは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断することによって、エフェクターＴ細胞に対する阻害ブレーキを放出し得、ＴＧＦβトラップ分子は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＴＧＦβ機能を阻害し得る。
【0167】
図１Ａ～図１Ｄに示されるように、ＦＢＤＢ（商標）の４つの三重標的形式を設計した。ＨＣＢ３０１－４（又はＰＳＴ＿ｖ２、図１Ａに示される概略構造）は、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。具体的には、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＰＤ－１細胞外ドメイン（配列番号５、ヒトＰＤ－１タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２、配列番号１１）のアミノ酸２６～１７０と同一の配列を有する）、ＳＩＲＰα細胞外ドメイン（配列番号６、ヒトＳＩＲＰαタンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＨ２６６９２．１、配列番号１２）のアミノ酸３１～１４８と同一の配列を有する）、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域（ＥＵ付番によるＳ２２８Ｐ変異を有する）、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、及びＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン（配列番号７、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００３２３３．４、配列番号１３）のアミノ酸２４～１５９と同一の配列を有する）を含む。ＰＤ－１細胞外ドメイン及びＳＩＲＰα細胞外ドメインは、（ＧＳＧ）６リンカーペプチド（配列番号８）を介して接続されている。ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、（Ｇ４Ｓ）４Ｇリンカーペプチド（配列番号９）を介してヒトＩｇＧ４ ＦｃのＣ末端に接続されている。
【0168】
ＨＣＢ３０１－３（又はＳＰＴ＿ｖ２、図１Ｂに示される概略構造）は、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。具体的には、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＩＲＰα細胞外ドメイン（配列番号６）、ＰＤ－１細胞外ドメイン（配列番号５）、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域（ＥＵ付番によるＳ２２８Ｐ変異を有する）、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、及びＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン（配列番号７）を含む。ＳＩＲＰα細胞外ドメイン及びＰＤ－１細胞外ドメインは、（ＧＳＧ）６リンカーペプチド（配列番号８）を介して接続されている。ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、（Ｇ４Ｓ）４Ｇリンカーペプチド（配列番号９）を介してヒトＩｇＧ４ ＦｃのＣ末端に接続されている。
【0169】
ＨＣＢ３０１－２（又はＰ２ＳＴ＿ｖ２、図１Ｃに示される概略構造）は、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。具体的には、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号１０）を介して連結されている２つの同一のＰＤ－１細胞外ドメイン（配列番号５）、ＳＩＲＰα細胞外ドメイン（配列番号６）、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域（ＥＵ付番によるＳ２２８Ｐ変異を有する）、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、及びＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン（配列番号７）を含む。２つのＰＤ－１細胞外ドメインは、（ＧＳＧ）６リンカーペプチド（配列番号８）を介してＳＩＲＰα細胞外ドメインのＮ末端に接続されている。ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、（Ｇ４Ｓ）４Ｇリンカーペプチド（配列番号９）を介してヒトＩｇＧ４ ＦｃのＣ末端に接続されている。
【0170】
ＨＣＢ３０１－１（又はＳＰ２Ｔ＿ｖ２、図１Ｄに示される概略構造）は、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。具体的には、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＩＲＰα細胞外ドメイン（配列番号６）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号１０）を介して連結されている２つの同一のＰＤ－１細胞外ドメイン（配列番号５）、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域（ＥＵ付番によるＳ２２８Ｐ変異を有する）、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、及びＴＧＦＢＲ２細胞外ドメイン（配列番号７）を含む。ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、（ＧＳＧ）６リンカーペプチド（配列番号８）を介して、２つのＰＤ－１細胞外ドメインのうちの１つに接続されている。ＴＧＦＢＲ２細胞外ドメインは、（Ｇ４Ｓ）４Ｇリンカーペプチド（配列番号９）を介してヒトＩｇＧ４ ＦｃのＣ末端に接続されている。
【0171】
発現されたタンパク質をタンパク質Ａカラムによって精製し、続いてＨＰＬＣ－ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィーとカップリングした高速液体クロマトグラフィー、Ａｇｉｌｅｎｔ）を行い、高分子量ピークのパーセンテージ（ＨＭＷ％）、主要なピークのパーセンテージ（主要％）、及び低分子量ピークのパーセンテージ（ＬＭＷ％）を測定した。
【0172】
具体的には、ＨＣＢ３０１タンパク質をＣＨＯ－Ｓ細胞において発現させた。培養物の上清を収集し、プロテインＡ精製に供した。濃縮平衡緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を添加することによって、培養物の上清のｐＨを８．０に調整した。次に、タンパク質Ａカラムを１０×カラム体積の平衡化緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化し、次いで培養物の上清を平衡化したタンパク質Ａカラムに充填した。次いで、カラムを６×カラム体積の洗浄緩衝液（１００ｍＭのクエン酸、５００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。タンパク質試料を、６×カラム体積の溶出緩衝液（１００ｍＭの酢酸塩、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）によって溶出し、１ＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液によってｐＨを６．５～７に調整した。以下の表に示されるように、ＨＣＢ３０１－３及びＨＣＢ３０１－４の発現レベル（力価）は同等であり、ＨＣＢ３０１－１又はＨＣＢ３０２－２よりも高かった。プロテインＡ精製後、ＨＣＢ３０１タンパク質の主要なピークのパーセンテージ（主要％）は８７．８８％～９４．３８％の範囲であり、ＨＣＢ３０１タンパク質の高分子量ピークのパーセンテージ（ＨＭＷ％）は１．３５％～５．４３％の範囲であり、ＨＣＢ３０１タンパク質の低分子量ピークのパーセンテージ（ＬＭＷ％）は１．２７％～１０．７８％の範囲であった。結果は、４つ全てのＨＣＢ３０１タンパク質（ＨＣＢ３０１－１、ＨＣＢ３０１－２、ＨＣＢ３０１－３、及びＨＣＢ３０１－４）が高純度で発現及び採取され得ることを示す。
【0173】
【表1】
【0174】
加えて、ＨＣＢ３０１－１、ＨＣＢ３０１－２、ＨＣＢ３０１－３、及びＨＣＢ３０１－４のアミノ酸配列を、免疫除去ツール（免疫エピトープのデータベース及び分析リソース、Ｄｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ＨＬＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３．１（２０１８）：１１８－１３２）を使用して分析し、免疫原性領域を特定した。免疫原性は、特定されなかった。
【0175】
実施例２．ＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞に対する全体的な細胞結合能力の判定
細胞表面上に発現されたＣＤ４７に対するＨＣＢ３０１タンパク質の全体的な細胞結合能力を判定するために、ヒトＣＤ４７を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ）を標的細胞として使用した。５×１０４個の細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４を、陽性対照として使用した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４は、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する。ＰＤ１＿Ｇ４を陰性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４は、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する。
細胞表面上に発現されたＣＤ４７に対するＨＣＢ３０１タンパク質の全体的な細胞結合能力を判定するために、ヒトＣＤ４７を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ）を標的細胞として使用した。５×１０４個の細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４を、陽性対照として使用した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４は、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する。ＰＤ１＿Ｇ４を陰性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４は、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する。
【0176】
図２に示されるように、４つ全てのＨＣＢ３０１タンパク質は、ＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞に結合することができる。具体的には、陽性対照ＳＩＲＰα＿Ｇ４が最も高いＣＤ４７結合能力を呈し、ＨＣＢ３０１－３及びＨＣＢ３０１－１が続いた。ＨＣＢ３０１－４及びＨＣＢ３０１－２も、ＣＤ４７発現細胞に結合することができる。対照的に、陰性対照ＰＤ１＿Ｇ４については結合シグナルは検出されなかった。
【0177】
実施例３．ＰＤＬ１ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞に対する全体的な細胞結合能力の判定
ＰＤ－Ｌ１に対するＨＣＢ３０１タンパク質の結合能力を判定するために、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｓ細胞（ＰＤＬ１ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ）を標的細胞として使用した。３×１０４個の細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、及び１００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。ＰＤ１＿Ｇ４を、陽性対照として使用した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４（抗ＣＤ４７参照抗体）及びＳＩＲＰα＿Ｇ４を、陰性対照として使用した。
ＰＤ－Ｌ１に対するＨＣＢ３０１タンパク質の結合能力を判定するために、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｓ細胞（ＰＤＬ１ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ）を標的細胞として使用した。３×１０４個の細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、及び１００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。ＰＤ１＿Ｇ４を、陽性対照として使用した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４（抗ＣＤ４７参照抗体）及びＳＩＲＰα＿Ｇ４を、陰性対照として使用した。
【0178】
図３に示されるように、４つ全てのＨＣＢ３０１タンパク質は、ＰＤＬ１ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞に結合することができる。具体的には、ＨＣＢ３０１－１及びＨＣＢ３０１－２は、陽性対照ＰＤ１＿Ｇ４よりも高い結合能力を呈し、ＰＤ１＿Ｇ４は、ＨＣＢ３０１－４及びＨＣＢ３０１－３よりも高い結合能力を呈した。対照的に、陰性対照Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びＳＩＲＰα＿Ｇ４については結合シグナルは検出されなかった。
【0179】
実施例４．ＣＤ４７発現腫瘍細胞に対する全体的な細胞結合能力の判定
腫瘍細胞表面上に発現されたＣＤ４７に対するＨＣＢ３０１タンパク質の全体的な細胞結合能力を判定するために、内因性ＣＤ４７を発現する下咽頭がん腫ＦａＤｕ細胞を標的細胞として使用した。３×１０４個のＦａＤｕ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、及び１００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びＳＩＲＰα＿Ｇ４を陽性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４を陰性対照として使用した。
腫瘍細胞表面上に発現されたＣＤ４７に対するＨＣＢ３０１タンパク質の全体的な細胞結合能力を判定するために、内因性ＣＤ４７を発現する下咽頭がん腫ＦａＤｕ細胞を標的細胞として使用した。３×１０４個のＦａＤｕ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、及び１００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びＳＩＲＰα＿Ｇ４を陽性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４を陰性対照として使用した。
【0180】
図４に示されるように、４つ全てのＨＣＢ３０１タンパク質は、ＦａＤｕ細胞に結合することができる。具体的には、ＨＣＢ３０１－１が最も高い結合能力を示し、ＨＣＢ３０１－３、ＨＣＢ３０１－４、及びＨＣＢ３０１－２が続いた。対照的に、陰性対照ＰＤ１＿Ｇ４については結合シグナルは検出されなかった。
【0181】
実施例５．ＲＢＣに対する全体的な細胞結合能力の判定
赤血球（ＲＢＣ）に対するＨＣＢ３０１タンパク質の結合能力を判定するために、１×１０５個のヒトＲＢＣを、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、ＲＢＣをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４を陽性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４を陰性対照として使用した。
赤血球（ＲＢＣ）に対するＨＣＢ３０１タンパク質の結合能力を判定するために、１×１０５個のヒトＲＢＣを、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、ＲＢＣをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４を陽性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４を陰性対照として使用した。
【0182】
図５Ａ～５Ｂに示されるように、陽性対照Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４は、ＲＢＣに対する強い結合能力を呈した。対照的に、４つ全てのＨＣＢ３０１タンパク質は、ＲＢＣへの弱い結合を示した。具体的には、ＨＣＢ３０１－３は、ＨＣＢ３０１－１よりも高いＲＢＣ結合能力を示し、ＨＣＢ３０１－３及びＨＣＢ３０１－１の両方の結合能力は、ＳＩＲＰα＿Ｇ４よりも高かった。ＨＣＢ３０１－４及びＨＣＢ３０１－２は、より低いＲＢＣ結合能力を示し、これは、ＰＤ１＿Ｇ４と同等であった。
【0183】
実施例６．血小板に対する全体的な細胞結合能力の判定
血小板に対するＨＣＢ３０１タンパク質の結合能力を判定するために、５×１０５個のヒト血小板を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、血小板をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４を陽性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４及びＳＩＲＰα＿Ｇ４を陰性対照として使用した。
血小板に対するＨＣＢ３０１タンパク質の結合能力を判定するために、５×１０５個のヒト血小板を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、血小板をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４を陽性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４及びＳＩＲＰα＿Ｇ４を陰性対照として使用した。
【0184】
図６Ａ～６Ｂに示されるように、陽性対照Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４は、血小板に対する強い結合能力を呈した。対照的に、全てのＨＣＢ３０１タンパク質は、血小板への弱い結合を示した。具体的には、ＨＣＢ３０１－３は、ＨＣＢ３０１－２及びＨＣＢ３０１－１よりも高い血小板結合能力を示した。ＨＣＢ３０１－４は、ＳＩＲＰα＿Ｇ４と同等である、より低いＲＢＣ結合能力を示した。
【0185】
実施例７．ｈＴＧＦβ１、ｈＴＧＦβ２、及びｈＴＧＦβ３への結合能力の判定
ヒトＴＧＦβに対するＨＣＢ３０１タンパク質の結合能力を判定するために、示された濃度（２５．４ｐＭ、７６．２ｐＭ、２２８．６ｐＭ、６８５．８ｐＭ、２．１ｎＭ、６．２ｎＭ、１８．５ｎＭ、５５．６ｎＭ、１６６．７ｎＭ、又は５００ｎＭ）でＨＣＢ３０１タンパク質を使用して、結合滴定ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップを陽性対照として使用した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４を陰性対照として使用した。９６ウェルＥＩＡマイクロプレートを、１μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３）で４℃で一晩コーティングした。５％のスキムミルクを含有する１×ＰＢＳでブロッキングした後、希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質を添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした。１×ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳ）でウェルを３回洗浄することによって非結合タンパク質を除去した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：５０００）を、室温で１時間ウェルに添加した。インキュベーション後、ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄することによって、過剰な二次抗体を除去した。最後に、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色現像に添加した。反応を停止し、４５０ｎｍの分光光度計を使用してＨＲＰ活性を測定した。
ヒトＴＧＦβに対するＨＣＢ３０１タンパク質の結合能力を判定するために、示された濃度（２５．４ｐＭ、７６．２ｐＭ、２２８．６ｐＭ、６８５．８ｐＭ、２．１ｎＭ、６．２ｎＭ、１８．５ｎＭ、５５．６ｎＭ、１６６．７ｎＭ、又は５００ｎＭ）でＨＣＢ３０１タンパク質を使用して、結合滴定ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップを陽性対照として使用した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４を陰性対照として使用した。９６ウェルＥＩＡマイクロプレートを、１μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３）で４℃で一晩コーティングした。５％のスキムミルクを含有する１×ＰＢＳでブロッキングした後、希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質を添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした。１×ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳ）でウェルを３回洗浄することによって非結合タンパク質を除去した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：５０００）を、室温で１時間ウェルに添加した。インキュベーション後、ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄することによって、過剰な二次抗体を除去した。最後に、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色現像に添加した。反応を停止し、４５０ｎｍの分光光度計を使用してＨＲＰ活性を測定した。
【0186】
図７Ａ～７Ｃに示されるように、ＥＣ５０値もまた結合曲線に従って決定された。結果は、ＨＣＢ３０１タンパク質は、ｈＴＧＦβ１及びｈＴＧＦβ３に結合することができるが、ｈＴＧＦβ２に対しては弱い結合能力を示したことを示す。具体的には、ｈＴＧＦβ３に結合するＨＣＢ３０１－１、ＨＣＢ３０１－３、及びＨＣＢ３０１－４のＥＣ５０値は、ｈＴＧＦβ１に結合するそれらのそれぞれのＥＣ５０値よりも低かった。
【0187】
実施例８．ＰＤ－Ｌ１発現細胞への選択的結合
ＰＤ－Ｌ１発現細胞に対するＨＣＢ３０１タンパク質の選択的結合能力を以下のように判定した。製造業者によって提供された指示に従って、ＯＥ１９細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｃ３４５５４）で標識し、ＰＤ－Ｌ１を発現するトランスフェクションされたＯＥ１９細胞（ＰＤ－Ｌ１ ｔｆ ＯＥ１９）を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）バイオレット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｃ３４５５７）で標識した。２×１０４個の細胞／ウェルのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ標識ＯＥ１９細胞（ＯＥ１９－ＣＦＳＥ）及び２×１０４個の細胞／ウェルのＰＤ－Ｌ１ ｔｆ ＯＥ１９細胞を発現するＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット標識のトランスフェクションされたＯＥ１９細胞（ＯＥ１９－バイオレット）を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。その後、細胞をＰＥシグナルに従ってゲートし、Ｋａｌｕｚａ分析ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）によって異なる細胞型のパーセンテージを計算した。ＰＤ１＿Ｇ４を陽性対照として使用し、ＳＩＲＰα＿Ｇ４を陰性対照として使用した。
ＰＤ－Ｌ１発現細胞に対するＨＣＢ３０１タンパク質の選択的結合能力を以下のように判定した。製造業者によって提供された指示に従って、ＯＥ１９細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｃ３４５５４）で標識し、ＰＤ－Ｌ１を発現するトランスフェクションされたＯＥ１９細胞（ＰＤ－Ｌ１ ｔｆ ＯＥ１９）を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）バイオレット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｃ３４５５７）で標識した。２×１０４個の細胞／ウェルのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ標識ＯＥ１９細胞（ＯＥ１９－ＣＦＳＥ）及び２×１０４個の細胞／ウェルのＰＤ－Ｌ１ ｔｆ ＯＥ１９細胞を発現するＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット標識のトランスフェクションされたＯＥ１９細胞（ＯＥ１９－バイオレット）を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。その後、細胞をＰＥシグナルに従ってゲートし、Ｋａｌｕｚａ分析ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）によって異なる細胞型のパーセンテージを計算した。ＰＤ１＿Ｇ４を陽性対照として使用し、ＳＩＲＰα＿Ｇ４を陰性対照として使用した。
【0188】
図８Ａに示されるように、３２ｐＭで、全てのＨＣＢ３０１タンパク質は、ＯＥ１９－ＣＦＳＥ細胞に対して、ＰＤ－Ｌ１を発現するＯＥ１９－バイオレット細胞への選択的結合を示した。図８Ｂ～８Ｇは、それぞれ、ＳＩＲＰα＿Ｇ４、ＰＤ１＿Ｇ４、及び４つのＨＣＢ３０１タンパク質（ＨＣＢ３０１－１、ＨＣＢ３０１－２、ＨＣＢ３０１－３、及びＨＣＢ３０１－４）の、２つの細胞型への結合曲線を示す。
【0189】
実施例９．血球凝集（ＨＡ）活性
ＨＣＢ３０１タンパク質によって誘導されるＨＡ活性を決定するために、１０％のＲＢＣ溶液を健常なドナーの全血から調製した。ＲＢＣを０．９％のＮａＣｌ緩衝液で２回洗浄し、次いで、０．９％のＮａＣｌ緩衝液中で１０体積％に希釈した。ＨＣＢ３０１タンパク質を、８．４ｐＭ、２５．４ｐＭ、７６．２ｐＭ、２２８．６ｐＭ、６８５．８ｐＭ、２．１ｎＭ、６．２ｎＭ、１８．５ｎＭ、５５．６ｎＭ、１６６．７ｎＭ、又は５００ｎＭの最終濃度に連続希釈した（３倍）。希釈されたタンパク質を、丸底の９６ウェルプレート内で、１２μｌの１０％のＲＢＣ溶液とともに、室温で一晩インキュベーションした。凝集されたＲＢＣは、ウェルを均等にコーティングしたが、非凝集細胞は、ウェルの底に明確な赤い点を形成した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４は陽性対照ＰＣを使用した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４、ＰＤ１＿Ｇ４、及びＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップを、陰性対照として使用した。
ＨＣＢ３０１タンパク質によって誘導されるＨＡ活性を決定するために、１０％のＲＢＣ溶液を健常なドナーの全血から調製した。ＲＢＣを０．９％のＮａＣｌ緩衝液で２回洗浄し、次いで、０．９％のＮａＣｌ緩衝液中で１０体積％に希釈した。ＨＣＢ３０１タンパク質を、８．４ｐＭ、２５．４ｐＭ、７６．２ｐＭ、２２８．６ｐＭ、６８５．８ｐＭ、２．１ｎＭ、６．２ｎＭ、１８．５ｎＭ、５５．６ｎＭ、１６６．７ｎＭ、又は５００ｎＭの最終濃度に連続希釈した（３倍）。希釈されたタンパク質を、丸底の９６ウェルプレート内で、１２μｌの１０％のＲＢＣ溶液とともに、室温で一晩インキュベーションした。凝集されたＲＢＣは、ウェルを均等にコーティングしたが、非凝集細胞は、ウェルの底に明確な赤い点を形成した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４は陽性対照ＰＣを使用した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４、ＰＤ１＿Ｇ４、及びＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップを、陰性対照として使用した。
【0190】
翌日、図９に示されるように、プレートの画像を取得した。画像は、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４のみが高濃度でＨＡ活性を誘導したことを示すが、４つのＨＣＢ３０１タンパク質を含む他の試験された分子のいずれも、上で示された濃度範囲内でＨＡ活性を誘導しなかった。
【0191】
実施例１０．ＳＩＲＰα／ＣＤ４７相互作用に対する遮断効果の判定
ＨＣＢ３０１タンパク質のＳＩＲＰαリガンド遮断能力を判定するために、標的細胞としてＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞を使用して、フローサイトメトリーベースのアッセイを実施した。具体的には、３×１０４個の細胞／ウェルのＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（０．２ｐＭ、１．９ｐＭ、１５．２ｐＭ、１２２．１ｐＭ、８７６．６ｐＭ、７．８ｎＭ、６２．５ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、固定濃度のビオチン化ＳＩＲＰα＿Ｇ４とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。洗浄後、ストレプトアビジン－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：ＥＢＳ１２－４３１７－８７）をウェル当たり０．３μｇで添加し、細胞からのＰＥシグナルを、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。Ｈｕ５Ｆ９及びＳＩＲＰａ＿Ｇ４を陽性対照として使用した。（ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する）抗ＰＤ－１抗体をアイソタイプ対照として使用した。
ＨＣＢ３０１タンパク質のＳＩＲＰαリガンド遮断能力を判定するために、標的細胞としてＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞を使用して、フローサイトメトリーベースのアッセイを実施した。具体的には、３×１０４個の細胞／ウェルのＣＤ４７ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（０．２ｐＭ、１．９ｐＭ、１５．２ｐＭ、１２２．１ｐＭ、８７６．６ｐＭ、７．８ｎＭ、６２．５ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、固定濃度のビオチン化ＳＩＲＰα＿Ｇ４とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。洗浄後、ストレプトアビジン－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：ＥＢＳ１２－４３１７－８７）をウェル当たり０．３μｇで添加し、細胞からのＰＥシグナルを、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。Ｈｕ５Ｆ９及びＳＩＲＰａ＿Ｇ４を陽性対照として使用した。（ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する）抗ＰＤ－１抗体をアイソタイプ対照として使用した。
【0192】
図１０に示されるように、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４は、最も強い遮断効果を呈し、ＳＩＲＰα＿Ｇ４、及び４つのＨＣＢ３０１タンパク質が続いた。より具体的には、４つのＨＣＢ３０１タンパク質の遮断効果は、以下のように強いものから弱いものにランク付けすることができる：ＨＣＢ３０１－３、ＨＣＢ３０１－１、ＨＣＢ３０１－４、及びＨＣＢ３０１－２。
【0193】
実施例１１．ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に対する遮断効果の判定
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞との間の相互作用に対するＨＣＢ３０１タンパク質の遮断効果を以下のとおりに判定した。３×１０４個の細胞／ウェルのＰＤ－Ｌ１ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（０．２ｐＭ、１．９ｐＭ、１５．２ｐＭ、１２２．１ｐＭ、８７６．６ｐＭ、７．８ｎＭ、６２．５ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、固定濃度のビオチン化ＰＤ１＿Ｇ４とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。洗浄後、ストレプトアビジン－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：ＥＢＳ１２－４３１７－８７）をウェル当たり０．３μｇで添加し、細胞からのＰＥシグナルを、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）及びＰＤ１＿Ｇ４を陽性対照として使用した。
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞との間の相互作用に対するＨＣＢ３０１タンパク質の遮断効果を以下のとおりに判定した。３×１０４個の細胞／ウェルのＰＤ－Ｌ１ ｔｆ ＣＨＯ－Ｓ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（４％のＦＢＳを補充したＰＢＳ）中で、示された濃度（０．２ｐＭ、１．９ｐＭ、１５．２ｐＭ、１２２．１ｐＭ、８７６．６ｐＭ、７．８ｎＭ、６２．５ｎＭ、及び５００ｎＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、固定濃度のビオチン化ＰＤ１＿Ｇ４とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。洗浄後、ストレプトアビジン－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：ＥＢＳ１２－４３１７－８７）をウェル当たり０．３μｇで添加し、細胞からのＰＥシグナルを、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）及びＰＤ１＿Ｇ４を陽性対照として使用した。
【0194】
図１１に示されるように、ＭＰＤＬ３２８０Ａは、最も強い遮断効果を呈した。ＨＣＢ３０１－１及びＨＣＢ３０１－２は、ＰＤ１＿Ｇ４の遮断効果よりも強い遮断効果を示した。ＨＣＢ３０１－４は、ＰＤ１＿Ｇ４よりも弱い遮断効果を示したが、ＨＣＢ３０１－３よりも強い遮断効果を示した。結果は、各ポリペプチド鎖に２つのＰＤ－１細胞外ドメインを有するＨＣＢ３０１タンパク質が、各ポリペプチド鎖に１つのＰＤ－１細胞外ドメインを有するものよりも効率的にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断できることを示す。
【0195】
実施例１２．ＴＧＦβ誘導ｓｍａｄ２レポーター活性の阻害
ＴＧＦβ１誘導ｓｍａｄ２レポーター活性を阻害するＨＣＢ３０１タンパク質の能力は、以下のように判定した。ＨＣＢ３０１タンパク質を、６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭの最終濃度に連続希釈した（５倍）。Ｍ７８２４（抗ＰＤ－Ｌ１×ＴＧＦβトラップ）、抗ＴＧＦβ（抗ＴＧＦβ抗体、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号：ＢＥ００５７）、及びＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップを陽性対照として使用した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４を陰性対照として使用した。４×１０３個のｓｍａｄ２レポーターを発現するトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３とともに、希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともにインキュベーションした。５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間のインキュベーション後、発光シグナルをＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ）によって検出した。
ＴＧＦβ１誘導ｓｍａｄ２レポーター活性を阻害するＨＣＢ３０１タンパク質の能力は、以下のように判定した。ＨＣＢ３０１タンパク質を、６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭの最終濃度に連続希釈した（５倍）。Ｍ７８２４（抗ＰＤ－Ｌ１×ＴＧＦβトラップ）、抗ＴＧＦβ（抗ＴＧＦβ抗体、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号：ＢＥ００５７）、及びＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップを陽性対照として使用した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４を陰性対照として使用した。４×１０３個のｓｍａｄ２レポーターを発現するトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３とともに、希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともにインキュベーションした。５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間のインキュベーション後、発光シグナルをＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ）によって検出した。
【0196】
図１２Ａに示されるように、４つ全てのＨＣＢ３０１タンパク質は、ＴＧＦβ１媒介ｓｍａｄ２レポーター活性を阻害することができる。各ＨＣＢ３０１タンパク質は、Ｍ７８２４及びＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップよりも強い阻害能力を示した。具体的には、ＨＣＢ３０１－３、ＨＣＢ３０１－４、及びＨＣＢ３０１－１は、ＨＣＢ３０１－２よりも強い阻害能力を示した。図１２Ｂ～１２Ｃに示されるように、ＨＣＢ３０１－３、ＨＣＢ３０１－４、及びＨＣＢ３０１－１は、ＴＧＦβ３媒介レポーター活性を阻害することができるが、ＴＧＦβ２媒介ｓｍａｄ２レポーター活性を阻害することはできない。特に、ＨＣＢ３０１－３、ＨＣＢ３０１－４、及びＨＣＢ３０１－１は、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ又はＭ７８２４と比較して、同等のＴＧＦβ３阻害能力を呈した。
【0197】
実施例１３．ＣＤ４７発現腫瘍細胞を食作用するための、マクロファージの誘導
がん細胞に対するＨＣＢ３０１タンパク質によって誘導されるマクロファージ媒介食作用を判定するために、食作用アッセイを以下のように行った。ＣＤ４７発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を５ｎＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｃ３４５５４）で、３７℃で１０分間標識し、それらを完全ＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した。１×１０５個の細胞／ウェルのＣＦＳＥ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞（標的細胞）を、低結合９６ウェルＵ字型底プレート中で、示された濃度（１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び１μＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、５×１０４個のＲａｗ２６４．７マウスマイクロファージを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベーションした。Ｒａｗ２６４．７細胞を、ＰＥ－シアニン７コンジュゲートＦ４／８０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：２５－４８０１－８２）で染色した。ＨＣＢ３０１タンパク質の食作用能力は、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）によって、マクロファージからの総Ｆ４／８０シグナルに対するマクロファージからのＣＦＳＥ＋Ｆ４／８０＋（マクロファージ食作用されたＣＦＳＥ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す）のパーセンテージを計算することによって評価された。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びＳＩＲＰα＿Ｇ４を陽性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４を陰性対照として使用した。（ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する）抗ＰＤ－１抗体をアイソタイプ対照として使用した。
がん細胞に対するＨＣＢ３０１タンパク質によって誘導されるマクロファージ媒介食作用を判定するために、食作用アッセイを以下のように行った。ＣＤ４７発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を５ｎＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｃ３４５５４）で、３７℃で１０分間標識し、それらを完全ＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した。１×１０５個の細胞／ウェルのＣＦＳＥ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞（標的細胞）を、低結合９６ウェルＵ字型底プレート中で、示された濃度（１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び１μＭ）で連続希釈されたＨＣＢ３０１タンパク質とともに、３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、５×１０４個のＲａｗ２６４．７マウスマイクロファージを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベーションした。Ｒａｗ２６４．７細胞を、ＰＥ－シアニン７コンジュゲートＦ４／８０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：２５－４８０１－８２）で染色した。ＨＣＢ３０１タンパク質の食作用能力は、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）によって、マクロファージからの総Ｆ４／８０シグナルに対するマクロファージからのＣＦＳＥ＋Ｆ４／８０＋（マクロファージ食作用されたＣＦＳＥ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す）のパーセンテージを計算することによって評価された。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びＳＩＲＰα＿Ｇ４を陽性対照として使用した。ＰＤ１＿Ｇ４を陰性対照として使用した。（ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する）抗ＰＤ－１抗体をアイソタイプ対照として使用した。
【0198】
図１３に示されるように、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４は、ＣＤ４７発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＲａｗ２６４．７媒介食作用を誘導する最も強い能力を呈し、ＳＩＲＰα＿Ｇ４が続いた。ＨＣＢ３０１－３、ＨＣＢ３０１－１、及びＨＣＢ３０１－４もまた、マイクロファージを誘導して、Ｊｕｒｋａｔ細胞を食作用させた。対照的に、ＰＤ１＿Ｇ４及びアイソタイプ対照は、試験された濃度で食作用を誘導しなかった。
【0199】
実施例１４．ＴＧＦβ１の存在下でのＭＬＲアッセイにおけるＴ細胞応答の増強
ＴＧＦβ１の存在下での混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを実施して、ＨＣＢ３０１タンパク質によるＴ細胞応答の増強を判定した。Ｔ細胞を５ｎＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｃ３４５５７）で３７℃で１０分間標識し、次いで完全ＲＰＭＩ－１６４０培地で２回洗浄した。１×１０５個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット標識ＣＤ４＋Ｔ細胞及び１×１０４の樹状細胞（ＤＣ）を、２ｎＭ、２０ｎＭ、又は２００ｎＭのＨＣＢ３０１タンパク質とともにインキュベーションした。対照分子又はそれらの組み合わせ、例えば、ＰＤＧＦＲ－Ｆｃ、ＳＩＲＰα＿Ｇ４、ＰＤ１＿Ｇ４、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、Ｍ７８２４、ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＰＤ１＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＰＤ１＿Ｇ４、ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、及びＰＤ１＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップもまたインキュベーションに使用した。ＰＤＧＦＲ－Ｆｃは、陰性対照として機能した。ＰＤＧＦＲ－Ｆｃは、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、Ｆｃに融合されたＰＤＧＦＲ細胞外ドメインを有する。次いで、ＮＣｌ－Ｈ６５０細胞からのＴＧＦβ１含有条件培地を添加し、５日間共インキュベーションした。共インキュベーション後、細胞を採取し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ－Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）によって細胞増殖を分析した。培養物の上清も収集し、ＩＬ－２分泌及びＩＦＮ－γ分泌を、それぞれ、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４３１８０５）及びＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４３０１０５）を使用して測定した。
ＴＧＦβ１の存在下での混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを実施して、ＨＣＢ３０１タンパク質によるＴ細胞応答の増強を判定した。Ｔ細胞を５ｎＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｃ３４５５７）で３７℃で１０分間標識し、次いで完全ＲＰＭＩ－１６４０培地で２回洗浄した。１×１０５個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット標識ＣＤ４＋Ｔ細胞及び１×１０４の樹状細胞（ＤＣ）を、２ｎＭ、２０ｎＭ、又は２００ｎＭのＨＣＢ３０１タンパク質とともにインキュベーションした。対照分子又はそれらの組み合わせ、例えば、ＰＤＧＦＲ－Ｆｃ、ＳＩＲＰα＿Ｇ４、ＰＤ１＿Ｇ４、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、Ｍ７８２４、ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＰＤ１＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＰＤ１＿Ｇ４、ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、及びＰＤ１＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップもまたインキュベーションに使用した。ＰＤＧＦＲ－Ｆｃは、陰性対照として機能した。ＰＤＧＦＲ－Ｆｃは、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、Ｆｃに融合されたＰＤＧＦＲ細胞外ドメインを有する。次いで、ＮＣｌ－Ｈ６５０細胞からのＴＧＦβ１含有条件培地を添加し、５日間共インキュベーションした。共インキュベーション後、細胞を採取し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ－Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）によって細胞増殖を分析した。培養物の上清も収集し、ＩＬ－２分泌及びＩＦＮ－γ分泌を、それぞれ、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４３１８０５）及びＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４３０１０５）を使用して測定した。
【0200】
図１４Ａに示されるように、ＭＬＲアッセイにおける細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット細胞増殖キット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｃ３４５５７）を使用して測定された。具体的には、ＣＤ３＋／７－ＡＤＤ－細胞（総Ｔ細胞を示す）に対する、より弱くＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット標識された細胞（増殖細胞を示す）のパーセンテージを計算した。結果は、ＨＣＢ３０１－３、ＨＣＢ３０１－４、及びＨＣＢ３０１－１で処理された細胞は、対照分子又はそれらの組み合わせのものと比較して、細胞増殖を有意に変化させなかったことを示す。
【0201】
図１４Ｂに示されるように、ＭＬＲアッセイにおけるＩＬ－２分泌は、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅキットを使用して測定された。結果は、Ｍ７８２４が最も高いＩＬ－２分泌レベルを呈し、ＨＣＢ３０１－１、ＨＣＢ３０１－３、及びＨＣＢ３０１－４が続いたことを示した。特に、ＨＣＢ３０１－４で処理された細胞は、ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ及びＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＰＤ１＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップのものと比較して、類似のＩＬ－２分泌レベルを有した。ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ又はＰＤ１＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップで処理された細胞は、ＩＬ－２分泌レベルが低かった。
【0202】
図１４Ｃに示されるように、ＭＬＲアッセイにおけるＩＦＮ－γ分泌は、ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅキットを使用して測定された。結果は、ＨＣＢ３０１－１が最も高いＩＦＮ－γ分泌レベルを呈し、Ｍ７８２４、ＰＤ１＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、ＨＣＢ３０１－３、及びＨＣＢ３０１－４が続いたことを示した。ＰＤ１＿Ｇ４、ＳＩＲＰα＿Ｇ４、ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＰＤ１＿Ｇ４、ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＰＤ１＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップ、ＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＰＤ１＿Ｇ４、及びＳＩＲＰα＿Ｇ４＋ＩｇＧ４－ＴＧＦβトラップで処理された細胞は、同様かつ低いＩＦＮ－γ分泌レベルを有した。
【0203】
要約として、図１５Ａ～１５Ｂは、上で論じられたインビトロアッセイの結果を示す。ＨＣＢ３０１－３は、ＨＣＢ３０１－１及びＨＣＢ３０１－２に対して比較的単純な構造、並びにインビトロアッセイで示されるようなその強力な機能を部分的に理由として、後続の実験のために選択された。
【0204】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示することを意図するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、添付の特許請求の範囲内である。
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示することを意図するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、添付の特許請求の範囲内である。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図16-4】
【配列表】
【国際調査報告】