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特表2025-503750低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-04
(54)【発明の名称】低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20250128BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20250128BHJP
A61P 9/06 20060101ALI20250128BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20250128BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20250128BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250128BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20250128BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20250128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
A61P9/00
A61P9/06
A61P9/04
A61K38/16
A61K48/00
A61K31/711
C12N15/63 Z
C07K14/47
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024542416
(86)(22)【出願日】2022-05-31
(85)【翻訳文提出日】2024-07-17
(86)【国際出願番号】 CN2022096227
(87)【国際公開番号】W WO2023201851
(87)【国際公開日】2023-10-26
(31)【優先権主張番号】202210425547.0
(32)【優先日】2022-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512007144
【氏名又は名称】華中科技大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000291
【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲チン▼
(72)【発明者】
【氏名】熊 洪波
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084NA14
4C084ZA36
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA36
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体及びその使用に関し、生物医薬技術の分野に属する。本発明は、低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体及び低分子シャペロンＭＯＧ１の突然変異体を、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、不整脈、拡張型心筋症又は心不全などの疾患を治療する薬物の調製に使用し、本発明における突然変異体は、野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流を効果的に向上させる。
【選択図】図９
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
塩基配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される、ことを特徴とする低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体。
【請求項2】
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される、ことを特徴とする低分子シャペロンＭＯＧ１の突然変異体。
【請求項3】
Ｂｒｕｇａｄａ症候群、不整脈、拡張型心筋症又は心不全を治療する薬物の調製における請求項１に記載の低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体の使用。
【請求項4】
前記不整脈は、心室頻拍、心室細動、洞不全症候群又は心房細動である、ことを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項5】
前記低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体は、心筋細胞のナトリウム電流密度を向上させることに用いられる、ことを特徴とする請求項３又は４に記載の使用。
【請求項6】
Ｂｒｕｇａｄａ症候群、不整脈、拡張型心筋症又は心不全を治療する薬物の調製における請求項２に記載の低分子シャペロンＭＯＧ１の突然変異体の使用。
【請求項7】
前記不整脈は、心室頻拍、心室細動、洞不全症候群又は心房細動である、ことを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記低分子シャペロンＭＯＧ１の突然変異体は、心筋細胞のナトリウム電流密度を向上させることに用いられる、ことを特徴とする請求項６又は７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医薬技術の分野に属し、より具体的には、低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
不整脈は毎年世界中で何百万人もの突然死を引き起こしている。ほとんどの抗不整脈薬は不整脈を予防できるものではなく、逆に、不整脈を引き起こす可能性がある。Ｂｒｕｇａｄａ症候群（ＢｒＳ）は、心電図（ＥＣＧ）の前胸部誘導におけるＳＴ上昇、心室頻拍（ＶＴ）又は心室細動（ＶＦ）を特徴とする致命的な心室不整脈症候群で、失神、てんかんや突然死を引き起こす。Ｂｒｕｇａｄａ症候群は、３０～４０歳の比較的若くて健康な人において多数の心臓突然死を引き起こしており、特に東南アジアの人口において４％の突然死を引き起こしている。しかし、この症候群に利用できる治療法は限られている。植込み型除細動器（ＩＣＤ）はよく使用されているが、不整脈を予防できるものではない。さらに、ＩＣＤはアレルギー反応、感染症、不適切な放電などを含む副作用を引き起こすことがよくある。したがって、Ｂｒｕｇａｄａ症候群とそれに関連する不整脈に対する効果的な治療法を見つけることは、極めて重要である。
【0003】
１９９８年に、Ｂｒｕｇａｄａ症候群を引き起こす最初の遺伝子ＳＣＮ５Ａが報告され、この遺伝子は、心臓ナトリウムチャネルＮａｖ１．５をコードしている。心臓ナトリウムチャネルＮａｖ１．５は、ヒト心筋細胞における活動電位の開始と伝導を担っている。Ｂｒｕｇａｄａ症候群のような不整脈を引き起こすＳＣＮ５Ａ突然変異は、機能喪失型突然変異である。現在までのところ、ＳＣＮ５Ａ突然変異はＢｒｕｇａｄａ症候群を引き起こす最も一般的な突然変異であり、ＢｒＳ症例の２５％～３０％を引き起こす。２００８年、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、Ｎａｖ１．５と相互作用できるわずか２０ｋＤａの低分子シャペロンであるＭＯＧ１を同定した。さらなる研究により、ＭＯＧ１は小胞体から細胞表面へのＮａｖ１．５の輸送を促進するが、ナトリウムチャネルの動態や個々のナトリウムチャネルのコンダクタンスには影響を及ぼさないことが示された。２００３年、ＨＥＫ２９３細胞において、Ｂｒｕｇａｄａ症候群の突然変異ｐ．Ｇ１７４３Ｒにより心臓ナトリウムチャネルＮａｖ１．５が細胞膜に正しく輸送されることができなくなり、心臓ナトリウム電流が大幅に減少する一方、ＭＯＧ１の高発現によりこのような欠陥を回復させ得ることを発見した。また、ＳＣＮ５Ａ突然変異ｐ．Ｄ１２７５Ｎは、洞不全症候群、心房細動などの不整脈や拡張型心筋症、心不全を引き起こす。ＳＣＮ５Ａ突然変異ｐ．Ｄ１２７５Ｎによっても、心臓ナトリウムチャネルＮａｖ１．５が細胞膜に正しく輸送されることができなくなり、心臓ナトリウム電流が大幅に減少する一方、ＭＯＧ１の高発現によりこのような欠陥を回復させ得る。最近、ＳＣＮ５Ａ突然変異体ｐ．Ｇ１７４３Ｒノックイン（ＫＩ）マウス（Ｓｃｎ５ａＧ１７４６Ｒ／＋）が樹立された。ホモ接合型ＫＩマウスは胎生期Ｅ１２より前に死亡する。一方、ヘテロ接合型Ｓｃｎ５ａＧ１７４６Ｒ／＋ ＫＩマウスは、心電図のＳＴ異常（顕著なＪ波）や自発性心室頻脈性不整脈（ＶＴ）、てんかん発作や突然死などを含むＢｒｕｇａｄａ症候群の臨床的特徴を再現する。心室頻拍の根本的なメカニズムは、心臓活動電位持続時間の短縮、第３相後期早期後脱分極（ＥＡＤ）やナトリウム電流密度の低下である。さらに、アデノ随伴ウイルスＡＡＶをベクターとして使用するＡＡＶ－ＭＯＧ１遺伝子治療が、外因性ＭＯＧ１遺伝子の発現を向上させ、細胞表面の心臓ナトリウムチャネルＮａｖ１．５の発現量を増加させ、心臓ナトリウム電流を増加させ、心臓の活動電位異常を正常化し、Ｊ波を除去し、Ｓｃｎ５ａＧ１７４６Ｒ／＋マウスの不整脈の病症を解消することを発見した。ＳＣＮ５Ａ突然変異ｐ．Ｄ１２７５Ｎを持つヒト化ＫＩマウスは以前に報告されている。ｐ．Ｄ１２７５Ｎヒト化ＫＩヘテロ接合マウスが不整脈、拡張型心筋症、心不全の特徴を持っていることを発見した。細胞表面の心臓ナトリウムチャネルＮａｖ１．５の発現量の低下と心臓ナトリウム電流密度の低下がこの疾患の主な原因である。ＡＡＶ－ＭＯＧ１遺伝子治療はまた、細胞表面でのＮａｖ１．５発現を向上させ、心臓ナトリウム電流密度を向上させ、ヒト化ＫＩヘテロ接合マウスの拡張型心筋症と不整脈の表現型を回復させた。これらの研究は、ＡＡＶ－ＭＯＧ１遺伝子治療の使用により、ＳＣＮ５Ａ突然変異による不整脈、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室頻拍、心室細動、洞不全症候群、心房細動、拡張型心筋症、心不全などを治療できることを示した。
【0004】
しかし、高用量のＭＯＧ１のみが心臓ナトリウム電流を約１．６倍向上させ得ることが判明し、これが原因で将来の臨床遺伝子治療がより困難になる。その主な理由としては、超高用量のウイルスを患者に注射するために、超高力価のＡＡＶ－ＭＯＧ１ウイルス製剤を調製する必要があるためである。この問題を解決するために、ＭＯＧ１タンパク質の突然変異を試みたところ、超強力なＭＯＧ１突然変異体が見つかった。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体がＨＥＫ２９３／Ｎａｖ１．５細胞の細胞表面でのＮａｖ１．５発現を効果的に向上させ、心臓ナトリウム電流密度を３．７倍向上させることを発見した。また、ラット心筋細胞では、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体も心臓ナトリウム電流密度を大幅に向上させた。その主な分子メカニズムは以下のとおりである。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、低分子ＧＴＰａｓｅＲａｎへの結合強度を低下させ、核内のＭＯＧ１の量を減らしてＭＯＧ１を細胞質に富化し、心臓ナトリウムチャネルＮａｖ１．５の細胞膜への輸送により深く関与するようにし、また、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体のタンパク質の安定性も向上する。さらに、野生型ＭＯＧ１と比較して、低用量Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体では、ＳＣＮ５Ａ突然変異によって引き起こされる心臓ナトリウム電流密度の減少を完全に回復できる。したがって、Ｒａｎとの相互作用に影響を与え、ＭＯＧ１タンパク質の安定性を高めるＭＯＧ１突然変異体は、ＡＡＶ－ＭＯＧ１ベースの遺伝子治療においてより効果的に使用できると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、心臓ナトリウム電流を向上させるための用量が高く、効果が不十分であるという従来技術における野生型ＭＯＧ１の技術的課題を解決する。本発明は、低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体及び低分子シャペロンＭＯＧ１の突然変異体を、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、不整脈、拡張型心筋症又は心不全などの疾患を治療する薬物の調製に使用し、本発明における突然変異体は、野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流を効果的に向上させる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の第１態様によれば、塩基配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される、低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体を提供する。
【0007】
本発明の第１態様によれば、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される低分子シャペロンＭＯＧ１の突然変異体を提供する。
【0008】
本発明の第１態様によれば、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、不整脈、拡張型心筋症又は心不全を治療する薬物の調製における、前記低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体の使用を提供する。
【0009】
好ましくは、前記不整脈は、心室頻拍、心室細動、洞不全症候群又は心房細動である。
【0010】
好ましくは、前記低分子シャペロンＭＯＧ１遺伝子をコードする突然変異体は、心筋細胞のナトリウム電流密度を向上させることに用いられる。
【0011】
本発明の第１態様によれば、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、不整脈、拡張型心筋症又は心不全を治療する薬物の調製における前記低分子シャペロンＭＯＧ１の突然変異体の使用を提供する。
【0012】
好ましくは、前記不整脈は、心室頻拍、心室細動、洞不全症候群又は心房細動である。
【0013】
好ましくは、前記低分子シャペロンＭＯＧ１の突然変異体は、心筋細胞のナトリウム電流密度を向上させることに用いられる。
【発明の効果】
【0014】
総じて言えば、従来技術と比較して、本発明で考案された上記の技術的解決手段は主に以下の技術的利点を有する。
【0015】
（１）遺伝子治療に使用されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、サイズが４．３ｋｂ未満の遺伝子しかパッケージングできず、ＳＣＮ５Ａ遺伝子のコード領域のサイズは６０４８ｂｐで、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのパッケージング能力を超えている。この限界を克服するために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介してわずか５６１ｂｐのＭＯＧ１遺伝子をパッケージングすることにより、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室頻拍、心室細動、洞不全症候群、心房細動、拡張型心筋症、心不全などの疾患を治療する遺伝子治療技術を開発した。本発明の遺伝子治療技術は、遺伝子が大きすぎるために遺伝子治療に使用できない他の遺伝子や疾患に対しても参照的意義を有する。
【0016】
（２）野生型ＭＯＧ１をパッケージングするＡＡＶ－ＭＯＧ１ベクターは関連遺伝子治療に使用することができるが、本発明によって開発されたＭＯＧ１に基づく超機能性突然変異体（ＭＯＧ１－Ｒａｎ結合を破壊した突然変異体、ＭＯＧ１の安定性を向上させた突然変異体を含む）は、効果がより高く、患者に注入されるウイルスの量を減少させ、臨床治療での使用がより容易になる。
【0017】
（３）本発明において、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体が野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流を効果的に向上させる分子メカニズムは以下の通りである。ＨＥＫ２９３／Ｎａｖ１．５細胞において、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流を効果的に向上させる。ＭＯＧ１は、約２２ｋＤの小さなタンパク質であり、核内のＲａｎ－ＧＴＰレベルを調節し、タンパク質の核輸送に関与するＲａｎ－ＧＴＰ放出因子であることが最初に発見された。ＭＯＧ１は主に核に局在しており、Ｒａｎとの相互作用は進化的に高度に保存されている。マウスＭＯＧ１突然変異体Ｒ３０Ａは、Ｒａｎ－ＧＴＰへの結合を強化することにより、ＧＴＰ放出に対して過剰に活性化する。最近、核磁気共鳴（ＮＭＲ）に基づく構造解析と生化学的特性評価を組み合わせた結果、ＲａｎとＭＯＧ１の相互作用には、いくつかの塩橋（ＲａｎＲ９５－ＭＯＧ１５０、ＲａｎＲ１０６－ＭＯＧ１Ｄ２７、ＲａｎＫ１３０－ＭＯＧ１Ｄ７０、ＲａｎＫ１３２－ＭＯＧ１５３、及びＲａｎＫ１３４－ＭＯＧ１５３）が関与していることが明らかになった。ヒトＭＯＧ１突然変異体Ｅ５０Ｋ及びＤ７０Ｋは、Ｒａｎへの結合を大幅に減少させる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ＨＥＫ２９３／Ｎａｖ１．５細胞におけるＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体及び野生型ＭＯＧ１による心筋ナトリウム電流の向上の結果を示す図である。
【図2】ラット初代心筋細胞におけるＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体及び野生型ＭＯＧ１による心筋ナトリウム電流密度の結果を示す図である。
【図3】半用量のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１スーパー突然変異体と全用量の野生型ＭＯＧ１がｐ．Ｄ１２７５Ｎ Ｎａｖ１．５突然変異体のナトリウム電流密度を回復した結果を示す図である。
【図4】半用量のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１スーパー突然変異体と全用量の野生型ＭＯＧ１がｐ．Ｇ１７４３Ｒ Ｎａｖ１．５突然変異体のナトリウム電流密度を回復した結果を示す図である。
【図5】半用量のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１スーパー突然変異体と全用量の野生型ＭＯＧ１がｐ．Ｔ３５３Ｉ Ｎａｖ１．５突然変異体のナトリウム電流密度を回復した結果を示す図である。
【図6】ＨＥＫ２９３／Ｎａｖ１．５細胞におけるＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体及び野生型ＭＯＧ１によるＮａｖ１．５の細胞表面発現の向上の結果を示す図である。
【図7】Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体のＲａｎへの結合能の結果を示す図である。
【図8】Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体が核内での発現量を低下させ、細胞質内での発現量を向上させた結果を示す図である。
【図9】本発明のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体がＳＣＮ５Ａ機能喪失型突然変異によって引き起こされる不整脈及び心不全を治療するときの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の目的、技術的解決手段及び利点をより明確にするために、以下、図面及び実施例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。本明細書に記載される具体的な実施例は、本発明を説明するためにのみ使用されるものであり、本発明を限定するために使用されるものではないことが理解されるべきである。さらに、以下に説明する本発明の各実施形態に係る技術的特徴は、互いに矛盾しない限り、互いに組み合わせてもよい。
【0020】
本発明における突然変異体は、グルタミン酸（Ｅ）をコードする５０位のコドンＧＡＡが、リジン（Ｋ）をコードするコドンＡＡＡに突然変異したＥ５０Ｋ突然変異体である。ＭＯＧ１遺伝子は４つの転写物を有し、本発明は、合計１８６個のアミノ酸を持つ最も長いＭＯＧ１タンパク質をコードするＡ型転写物ＡＦ２６５２０６である。Ｂ型転写物ＡＦ２６５２０５によってコードされるＭＯＧ１は合計１４６個のアミノ酸を持ち、３番目の転写物ＮＭ＿００１１７７８０２によってコードされるＭＯＧ１は合計１６５個のアミノ酸を持ち、４番目の転写物ＮＭ＿００１３３０１２７によってコードされるＭＯＧ１は合計１１８個のアミノ酸を持つ。すべての転写物の５０位はグルタミン酸である。
【0021】
実施例１
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流密度を効果的に向上させる。ＭＯＧ１は、約２２ｋＤの小さなタンパク質であり、核内のＲａｎ－ＧＴＰレベルを調節し、タンパク質の核輸送に関与するＲａｎ－ＧＴＰ放出因子であることが最初に発見された。ＭＯＧ１は主に核に局在しており、Ｒａｎとの相互作用は進化的に高度に保存されている。マウスＭＯＧ１突然変異体Ｒ３０Ａは、Ｒａｎ－ＧＴＰへの結合を強化することにより、ＧＴＰ放出に対して過剰に活性化する。最近、核磁気共鳴（ＮＭＲ）に基づく構造解析と生化学的特性評価を組み合わせた結果、ＲａｎとＭＯＧ１の相互作用には、いくつかの塩橋（ＲａｎＲ９５－ＭＯＧ１５０、ＲａｎＲ１０６－ＭＯＧ１Ｄ２７、ＲａｎＫ１３０－ＭＯＧ１Ｄ７０、ＲａｎＫ１３２－ＭＯＧ１５３、及びＲａｎＫ１３４－ＭＯＧ１５３）が関与していることが明らかになった。２０１８年、Ｂａｏらは、ヒトＭＯＧ１変異体Ｅ５０Ｋ及びＤ７０ＫがＲａｎへの結合を大幅に減少させることを発見した。
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流密度を効果的に向上させる。ＭＯＧ１は、約２２ｋＤの小さなタンパク質であり、核内のＲａｎ－ＧＴＰレベルを調節し、タンパク質の核輸送に関与するＲａｎ－ＧＴＰ放出因子であることが最初に発見された。ＭＯＧ１は主に核に局在しており、Ｒａｎとの相互作用は進化的に高度に保存されている。マウスＭＯＧ１突然変異体Ｒ３０Ａは、Ｒａｎ－ＧＴＰへの結合を強化することにより、ＧＴＰ放出に対して過剰に活性化する。最近、核磁気共鳴（ＮＭＲ）に基づく構造解析と生化学的特性評価を組み合わせた結果、ＲａｎとＭＯＧ１の相互作用には、いくつかの塩橋（ＲａｎＲ９５－ＭＯＧ１５０、ＲａｎＲ１０６－ＭＯＧ１Ｄ２７、ＲａｎＫ１３０－ＭＯＧ１Ｄ７０、ＲａｎＫ１３２－ＭＯＧ１５３、及びＲａｎＫ１３４－ＭＯＧ１５３）が関与していることが明らかになった。２０１８年、Ｂａｏらは、ヒトＭＯＧ１変異体Ｅ５０Ｋ及びＤ７０ＫがＲａｎへの結合を大幅に減少させることを発見した。
【0022】
次に、本発明は、ヒトＭＯＧ１について３つの突然変異体、すなわちＲ２９Ａ、Ｅ５０Ｋ及びＤ７０Ｋを確立し、心臓ナトリウムイオンチャネル機能及び心臓ナトリウム電流（ＩＮａ）密度に対する、ＭＯＧ１－Ｒａｎ相互作用に影響を及ぼす可能性のあるこれらの突然変異体の影響を検出した。本発明は、３つの突然変異体、野生型ＭＯＧ１陽性対照及び空のプラスミド陰性対照をそれぞれＨＥＫ２９３－Ｎａｖ１．５細胞にトランスフェクトし、全細胞パッチクランプを使用してナトリウム電流の変化を記録及び分析する。対照プラスミドと比較して、本発明のすべての突然変異体は、心臓ナトリウム電流ＩＮａのピーク密度を有意に向上させた（図１のＡ、図１のＢ）。さらに、野生型（ＷＴ）ＭＯＧ１と比較して、Ｅ５０Ｋ－ＭＯＧ１突然変異体は約２．１４倍向上した（－５９３．９±７５．６１ ｐＡ／ｐＦ ＶＳ－２７６．４±３４．０５、Ｐ＜０．０１、Ｅ５０Ｋ－ＭＯＧ１ ＶＳ野生型ＭＯＧ１）。このような結果は、Ｅ５０Ｋ－ＭＯＧ１突然変異体が野生型よりも心臓ナトリウム電流ＩＮａのピーク密度を大幅に向上できることを示している。図１からわかるように、ＨＥＫ２９３／Ｎａｖ１．５細胞では、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流を効果的に向上させた。（Ａ）ナトリウム電流の模式図、（Ｂ）ナトリウムのピーク電流密度、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ （ｎ＝１５～３４ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。したがって、Ｅ５０Ｋ－ＭＯＧ１突然変異体は野生型ＭＯＧ１よりも機能が高い。同じ結果がラット初代心筋細胞でも検証された（図２のＡ、図２のＢ、及び図２のＣ）。図２からわかるように、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、ラット初代心筋細胞において野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流密度を効果的に向上させることが分かった。Ａ：全細胞パッチクランプによって記録されたナトリウム電流の元の模式図、Ｂ：ナトリウム電流Ｉ－Ｖ曲線（ｃｕｒｒｅｎｔ ｖｓ ｖｏｌｔａｇｅ；－１２０ｍＶ～１００ｍＶで活性化）、Ｃ：ピークナトリウム電流密度（ｐＡ／ｐＦ）。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ （ｎ＝１３～１９ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。
【0023】
実施例２
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、ＳＣＮ５Ａ突然変異ｐ．Ｄ１２７５Ｎによって引き起こされるナトリウム電流異常を過剰に機能的に回復する。野生型Ｎａｖ１．５及びｐ．Ｄ１２７５Ｎ Ｎａｖ１．５突然変異体、並びにさまざまな量の野生型ＭＯＧ１ ｐ３ＸＦＬＡＧ－ＣＭＶ１０－ＷＴ－ＭＯＧ１又は突然変異体ＭＯＧ１ ｐ３ＸＦＬＡＧ－ＣＭＶ１０－Ｅ５０Ｋ－ＭＯＧ１をｔｓＡ－２０１細胞株にトランスミッションし、次に、ナトリウム電流をパッチクランプによって記録した。ｐ．Ｄ１２７５Ｎ ＳＣＮ５Ａ突然変異体は、ナトリウム電流ピーク密度を約３２．４８％低下させた（－１３２．８±１９．７６ ｖｓ－１９６．７±２４．３３、Ｄ１２７５Ｎ－Ｎａｖ１．５ ｖｓ野生型Ｎａｖ１．５）。０．６μｇの野生型ＭＯＧ１はＤ１２７５Ｎ－Ｎａｖ１．５のナトリウム電流密度を回復できるが、０．３μｇの野生型ＭＯＧ１はｐ．Ｄ１２７５Ｎ突然変異体のナトリウム電流密度を向上させることができない。逆には、０．３μｇのＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、Ｄ１２７５Ｎ－Ｎａｖ１．５のナトリウム電流密度を正常に回復でき、０．６μｇの野生型ＭＯＧ１と同じ有効性であった（図３のＡ、図３のＢ、及び図３のＣ）。図３からわかるように、半用量のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１スーパー突然変異体は、ｐ．Ｄ１２７５Ｎ Ｎａｖ１．５突然変異体のナトリウム電流密度の回復において全用量の野生型ＭＯＧ１と同等である。＊：Ｐ＜０．０５， ＊＊：Ｐ＜０．０１， ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ （ｎ＝２５～３１ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、ＳＣＮ５Ａ突然変異ｐ．Ｄ１２７５Ｎによって引き起こされるナトリウム電流異常を過剰に機能的に回復する。野生型Ｎａｖ１．５及びｐ．Ｄ１２７５Ｎ Ｎａｖ１．５突然変異体、並びにさまざまな量の野生型ＭＯＧ１ ｐ３ＸＦＬＡＧ－ＣＭＶ１０－ＷＴ－ＭＯＧ１又は突然変異体ＭＯＧ１ ｐ３ＸＦＬＡＧ－ＣＭＶ１０－Ｅ５０Ｋ－ＭＯＧ１をｔｓＡ－２０１細胞株にトランスミッションし、次に、ナトリウム電流をパッチクランプによって記録した。ｐ．Ｄ１２７５Ｎ ＳＣＮ５Ａ突然変異体は、ナトリウム電流ピーク密度を約３２．４８％低下させた（－１３２．８±１９．７６ ｖｓ－１９６．７±２４．３３、Ｄ１２７５Ｎ－Ｎａｖ１．５ ｖｓ野生型Ｎａｖ１．５）。０．６μｇの野生型ＭＯＧ１はＤ１２７５Ｎ－Ｎａｖ１．５のナトリウム電流密度を回復できるが、０．３μｇの野生型ＭＯＧ１はｐ．Ｄ１２７５Ｎ突然変異体のナトリウム電流密度を向上させることができない。逆には、０．３μｇのＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、Ｄ１２７５Ｎ－Ｎａｖ１．５のナトリウム電流密度を正常に回復でき、０．６μｇの野生型ＭＯＧ１と同じ有効性であった（図３のＡ、図３のＢ、及び図３のＣ）。図３からわかるように、半用量のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１スーパー突然変異体は、ｐ．Ｄ１２７５Ｎ Ｎａｖ１．５突然変異体のナトリウム電流密度の回復において全用量の野生型ＭＯＧ１と同等である。＊：Ｐ＜０．０５， ＊＊：Ｐ＜０．０１， ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ （ｎ＝２５～３１ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。
【0024】
実施例３
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、ＳＣＮ５Ａ突然変異ｐ．Ｇ１７４３Ｒによって引き起こされるナトリウム電流異常を過剰に機能的に回復する。上記のｐ．Ｄ１２７５Ｎ Ｎａｖ１．５突然変異体と同じ実験により、０．３μｇのＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体が、Ｇ１７４３Ｒ－Ｎａｖ１．５のナトリウム電流密度を正常に回復でき、０．６μｇの野生型ＭＯＧ１と同じ有効性であることが実証された（図４のＡ、図４のＢ、図４のＣ）。図４からわかるように、半用量のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１スーパー突然変異体は、ｐ．Ｇ１７４３Ｒ Ｎａｖ１．５突然変異体のナトリウム電流密度の回復において全用量の野生型ＭＯＧ１と同等である。＊：Ｐ＜０．０５， ＊＊：Ｐ＜０．０１， ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ （ｎ＝１４～２２ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、ＳＣＮ５Ａ突然変異ｐ．Ｇ１７４３Ｒによって引き起こされるナトリウム電流異常を過剰に機能的に回復する。上記のｐ．Ｄ１２７５Ｎ Ｎａｖ１．５突然変異体と同じ実験により、０．３μｇのＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体が、Ｇ１７４３Ｒ－Ｎａｖ１．５のナトリウム電流密度を正常に回復でき、０．６μｇの野生型ＭＯＧ１と同じ有効性であることが実証された（図４のＡ、図４のＢ、図４のＣ）。図４からわかるように、半用量のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１スーパー突然変異体は、ｐ．Ｇ１７４３Ｒ Ｎａｖ１．５突然変異体のナトリウム電流密度の回復において全用量の野生型ＭＯＧ１と同等である。＊：Ｐ＜０．０５， ＊＊：Ｐ＜０．０１， ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ （ｎ＝１４～２２ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。
【0025】
実施例４
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、ＳＣＮ５Ａ突然変異ｐ．Ｔ３５３Ｉによって引き起こされるナトリウム電流異常を過剰に機能的に回復する。Ｎａｖ１．５突然変異ｐ．Ｔ３５３ＩはＢｒｕｇａｄａ症候群を引き起こす。ナトリウム電流は、野生型チャネルと比較して約７４％減少した。上記ｐ．Ｄ１２７５Ｎ及びｐ．Ｇ１７４３Ｒ Ｎａｖ１．５突然変異体と同じ実験により、０．３μｇのＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体が、Ｔ３５３Ｉ－Ｎａｖ１．５のナトリウム電流密度を正常に回復でき、０．６μｇの野生型ＭＯＧ１と同じ有効性であることが実証された（図５のＡ、図５のＢ、及び図５のＣ）。図５からわかるように、半用量のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１スーパー突然変異体は、ｐ．Ｔ３５３Ｉ Ｎａｖ１．５突然変異体のナトリウム電流密度の回復において全用量の野生型ＭＯＧ１と同等である。＊：Ｐ＜０．０５， ＊＊：Ｐ＜０．０１， ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ （ｎ＝１４～２２ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、ＳＣＮ５Ａ突然変異ｐ．Ｔ３５３Ｉによって引き起こされるナトリウム電流異常を過剰に機能的に回復する。Ｎａｖ１．５突然変異ｐ．Ｔ３５３ＩはＢｒｕｇａｄａ症候群を引き起こす。ナトリウム電流は、野生型チャネルと比較して約７４％減少した。上記ｐ．Ｄ１２７５Ｎ及びｐ．Ｇ１７４３Ｒ Ｎａｖ１．５突然変異体と同じ実験により、０．３μｇのＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体が、Ｔ３５３Ｉ－Ｎａｖ１．５のナトリウム電流密度を正常に回復でき、０．６μｇの野生型ＭＯＧ１と同じ有効性であることが実証された（図５のＡ、図５のＢ、及び図５のＣ）。図５からわかるように、半用量のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１スーパー突然変異体は、ｐ．Ｔ３５３Ｉ Ｎａｖ１．５突然変異体のナトリウム電流密度の回復において全用量の野生型ＭＯＧ１と同等である。＊：Ｐ＜０．０５， ＊＊：Ｐ＜０．０１， ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ （ｎ＝１４～２２ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。
【0026】
実施例５
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、野生型ＭＯＧ１よりもＮａｖ１．５の細胞表面発現を効果的に向上させる。ＨＥＫ２９３／Ｎａｖ１．５細胞では、野生型ＭＯＧ１と同様に、Ｅ５０Ｋ又はＤ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体はいずれも細胞内の総Ｎａｖ１．５タンパク質の発現に影響を与えなかった（図６のＡ、図６のＢ）。しかし、細胞膜表面上のＮａｖ１．５については、野生型ＭＯＧ１は対照ベクターと比較して細胞表面上のＮａｖ１．５の発現量を有意に増加させた（図６のＣ、図６のＤ）。野生型ＭＯＧ１と比較して、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、細胞表面でのＮａｖ１．５の発現量をより強く有意に増加させたが、Ｄ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体にはこの効果はなかった（図６のＣ、図６のＤ）。図６からわかるように、ＨＥＫ２９３／Ｎａｖ１．５細胞では、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は野生型ＭＯＧ１よりもＮａｖ１．５の細胞表面発現を効果的に向上させた。Ａ：細胞内の総Ｎａｖ．１５発現量のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＷＢ）の模式図。Ｂ：（Ａ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｃ：細胞膜表面上のＮａｖ．１５発現量のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの模式図。Ｄ：（Ｃ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。＊：Ｐ＜０．０５， ＊＊：Ｐ＜０．０１， ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ。したがって、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体が野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流を効果的に向上させる分子メカニズムは以下のとおりである。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は野生型ＭＯＧ１よりもＮａｖ１．５を細胞表面に効果的に輸送する。
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、野生型ＭＯＧ１よりもＮａｖ１．５の細胞表面発現を効果的に向上させる。ＨＥＫ２９３／Ｎａｖ１．５細胞では、野生型ＭＯＧ１と同様に、Ｅ５０Ｋ又はＤ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体はいずれも細胞内の総Ｎａｖ１．５タンパク質の発現に影響を与えなかった（図６のＡ、図６のＢ）。しかし、細胞膜表面上のＮａｖ１．５については、野生型ＭＯＧ１は対照ベクターと比較して細胞表面上のＮａｖ１．５の発現量を有意に増加させた（図６のＣ、図６のＤ）。野生型ＭＯＧ１と比較して、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、細胞表面でのＮａｖ１．５の発現量をより強く有意に増加させたが、Ｄ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体にはこの効果はなかった（図６のＣ、図６のＤ）。図６からわかるように、ＨＥＫ２９３／Ｎａｖ１．５細胞では、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は野生型ＭＯＧ１よりもＮａｖ１．５の細胞表面発現を効果的に向上させた。Ａ：細胞内の総Ｎａｖ．１５発現量のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＷＢ）の模式図。Ｂ：（Ａ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｃ：細胞膜表面上のＮａｖ．１５発現量のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの模式図。Ｄ：（Ｃ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。＊：Ｐ＜０．０５， ＊＊：Ｐ＜０．０１， ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ。したがって、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体が野生型ＭＯＧ１よりも心筋ナトリウム電流を効果的に向上させる分子メカニズムは以下のとおりである。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は野生型ＭＯＧ１よりもＮａｖ１．５を細胞表面に効果的に輸送する。
【0027】
実施例６
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、Ｒａｎへの結合をほとんど失った。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体がナトリウム電流を向上させる分子メカニズムをさらに明らかにするために、本発明は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン実験（ＧＳＴプルダウン）により、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体のＲａｎへの結合能を検出した。ＧＳＴ－Ｒａｎを餌として、ＭＯＧ１をプルダウンする能力を検出した。野生型ＭＯＧ１と比較して、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、Ｒａｎへの結合を約９５％低下させたが、Ｄ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体はこの結合を約２６％だけ低下させた（図７のＡ、図７のＢ）。さらに、本発明は、免疫共沈降法によりＧＳＴプルダウンの実験結果をさらに検証した。ｔｓＡ－２０１細胞では、ＭＯＧ１とＲａｎとの間に相互作用がある（図７のＣ）。野生型ＭＯＧ１と比較して、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体はＲａｎへの結合を約９２％低下させたが、Ｄ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は約４７％低下させた（図７のＤ、図７のＥ）。Ａ：ＧＳＴプルダウン実験。ＧＳＴ－Ｒａｎ又は対照ＧＳＴタンパク質を、餌としてグルタチオンセファロースによって大腸菌から精製し、その結果はカーミン染色で示されている（下）。ＦＬＡＧ標識野生型ＭＯＧ１、Ｅ５０Ｋ又はＤ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体を、発現のためにヒトｔｓＡ２０１細胞にトランスミッションした。細胞溶解物は獲物とした。餌と獲物を混合してＧＳＴプルダウン分析を行った。次に、相互作用を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用してウェスタンブロットによって検出した。Ｂ：（Ａ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｃ：共免疫沈降実験。ＦＬＡＧ標識ＭＯＧ１とＨＡ標識ＲａｎをＴＳＡ－２０１細胞で共発現させた後、溶解し、ＨＡ抗体又は対照マウスＩｇＧとインキュベートして沈殿させ、次に、野生型ＭＯＧ１と野生型Ｒａｎの相互作用を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用してウェスタンブロットによって検出した。Ｄ：Ｒａｎとの相互作用に対するＭＯＧ１突然変異体の影響を検出するための免疫共沈降実験。Ｅ：（Ｄ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。＊＊：Ｐ＜０．０１ （ｎ＝３ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、Ｒａｎへの結合をほとんど失った。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体がナトリウム電流を向上させる分子メカニズムをさらに明らかにするために、本発明は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン実験（ＧＳＴプルダウン）により、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体のＲａｎへの結合能を検出した。ＧＳＴ－Ｒａｎを餌として、ＭＯＧ１をプルダウンする能力を検出した。野生型ＭＯＧ１と比較して、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、Ｒａｎへの結合を約９５％低下させたが、Ｄ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体はこの結合を約２６％だけ低下させた（図７のＡ、図７のＢ）。さらに、本発明は、免疫共沈降法によりＧＳＴプルダウンの実験結果をさらに検証した。ｔｓＡ－２０１細胞では、ＭＯＧ１とＲａｎとの間に相互作用がある（図７のＣ）。野生型ＭＯＧ１と比較して、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体はＲａｎへの結合を約９２％低下させたが、Ｄ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は約４７％低下させた（図７のＤ、図７のＥ）。Ａ：ＧＳＴプルダウン実験。ＧＳＴ－Ｒａｎ又は対照ＧＳＴタンパク質を、餌としてグルタチオンセファロースによって大腸菌から精製し、その結果はカーミン染色で示されている（下）。ＦＬＡＧ標識野生型ＭＯＧ１、Ｅ５０Ｋ又はＤ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体を、発現のためにヒトｔｓＡ２０１細胞にトランスミッションした。細胞溶解物は獲物とした。餌と獲物を混合してＧＳＴプルダウン分析を行った。次に、相互作用を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用してウェスタンブロットによって検出した。Ｂ：（Ａ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｃ：共免疫沈降実験。ＦＬＡＧ標識ＭＯＧ１とＨＡ標識ＲａｎをＴＳＡ－２０１細胞で共発現させた後、溶解し、ＨＡ抗体又は対照マウスＩｇＧとインキュベートして沈殿させ、次に、野生型ＭＯＧ１と野生型Ｒａｎの相互作用を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用してウェスタンブロットによって検出した。Ｄ：Ｒａｎとの相互作用に対するＭＯＧ１突然変異体の影響を検出するための免疫共沈降実験。Ｅ：（Ｄ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。＊＊：Ｐ＜０．０１ （ｎ＝３ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。
【0028】
実施例７
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は核内での発現を低下させ、細胞質での発現の向上を引き起こす。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体はＲａｎへの結合能をほぼ完全に失っているため、このＭＯＧ１突然変異体は核内での発現を低下させることができ、それにより細胞質での発現量を大幅に増加させると考えられる。ＦＬＡＧタグを保持する野生型及び突然変異体ＭＯＧ１をｔｓＡ－２０１細胞で発現させたところ、野生型と突然変異体ＭＯＧ１の総タンパク質発現量が同等であることがわかった（図８のＡ、図８のＢ）。しかし、核成分と細胞質成分を分離したところ、核内のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体とＥ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体の発現はそれぞれ約９５．７２％及び約６３．３２％低下することが判明した（図８のＣ、図８のＤ）。また、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１及びＥ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、細胞質における発現をそれぞれ約４２．６７％及び約１９．１４％向上させた（図８のＥ、図８のＦ）。一方、Ｒ２９Ａ、Ｄ３３Ａ、又はＤ４４Ａ ＭＯＧ１突然変異体は、核又は細胞質におけるこれらの発現に影響を与えなかった。また、免疫蛍光法により、ＨＥＫ２９３細胞におけるＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体の発現も検出した。図８のＧに示すように、野生型ＭＯＧ１は核と細胞質に均一に分布しており、Ｄ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は核での発現が低下し、細胞質での発現が向上しているが、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は核ではほとんど発現せず、細胞質で多量に発現する。図８からわかるように、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は核内での発現量を低下させ、その結果、細胞質での発現量が向上する。Ａ：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの模式図。ＦＬＡＧ標識野生型及びＭＯＧ１突然変異体をｔｓＡ－２０１細胞にトランスミッションし、総ＭＯＧ１タンパク質発現を抗ＦＬＡＧ抗体によって検出した。Ｂ：（Ａ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｃ：核タンパク質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの模式図。Ｄ：（Ｃ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｅ：細胞質タンパク質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ模式図。Ｆ：（Ｅ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｇ：免疫蛍光染色は、ｔｓＡ－２０１細胞内のＭＯＧ１タンパク質の特定の位置を示す。ＦＬＡＧ標識ＭＯＧ１プラスミドをｔｓＡ－２０１細胞にトランスミッションし、ＭＯＧ１タンパク質を抗ＦＬＡＧ抗体、次に二次抗体でインキュベートすると、青色ＤＡＰＩ染色により細胞核が示された。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：２０ ｕｍ。
Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は核内での発現を低下させ、細胞質での発現の向上を引き起こす。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体はＲａｎへの結合能をほぼ完全に失っているため、このＭＯＧ１突然変異体は核内での発現を低下させることができ、それにより細胞質での発現量を大幅に増加させると考えられる。ＦＬＡＧタグを保持する野生型及び突然変異体ＭＯＧ１をｔｓＡ－２０１細胞で発現させたところ、野生型と突然変異体ＭＯＧ１の総タンパク質発現量が同等であることがわかった（図８のＡ、図８のＢ）。しかし、核成分と細胞質成分を分離したところ、核内のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体とＥ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体の発現はそれぞれ約９５．７２％及び約６３．３２％低下することが判明した（図８のＣ、図８のＤ）。また、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１及びＥ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、細胞質における発現をそれぞれ約４２．６７％及び約１９．１４％向上させた（図８のＥ、図８のＦ）。一方、Ｒ２９Ａ、Ｄ３３Ａ、又はＤ４４Ａ ＭＯＧ１突然変異体は、核又は細胞質におけるこれらの発現に影響を与えなかった。また、免疫蛍光法により、ＨＥＫ２９３細胞におけるＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体の発現も検出した。図８のＧに示すように、野生型ＭＯＧ１は核と細胞質に均一に分布しており、Ｄ７０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は核での発現が低下し、細胞質での発現が向上しているが、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は核ではほとんど発現せず、細胞質で多量に発現する。図８からわかるように、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は核内での発現量を低下させ、その結果、細胞質での発現量が向上する。Ａ：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの模式図。ＦＬＡＧ標識野生型及びＭＯＧ１突然変異体をｔｓＡ－２０１細胞にトランスミッションし、総ＭＯＧ１タンパク質発現を抗ＦＬＡＧ抗体によって検出した。Ｂ：（Ａ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｃ：核タンパク質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの模式図。Ｄ：（Ｃ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｅ：細胞質タンパク質のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ模式図。Ｆ：（Ｅ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ図と同様の定量的統計分析。Ｇ：免疫蛍光染色は、ｔｓＡ－２０１細胞内のＭＯＧ１タンパク質の特定の位置を示す。ＦＬＡＧ標識ＭＯＧ１プラスミドをｔｓＡ－２０１細胞にトランスミッションし、ＭＯＧ１タンパク質を抗ＦＬＡＧ抗体、次に二次抗体でインキュベートすると、青色ＤＡＰＩ染色により細胞核が示された。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：２０ ｕｍ。
【0029】
図９は、本発明のＥ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体がＳＣＮ５Ａ機能喪失型突然変異によって引き起こされる不整脈及び心不全を治療するときの模式図である。ｐ．Ｇ１７４３Ｒ、ｐ．Ｄ１２７５Ｎ、ｐ．Ｔ３５３Ｉなどの機能喪失型突然変異は、心臓ナトリウムイオンチャネルＮａｖ１．５によって生成されるナトリウム電流密度を低下させるため、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、拡張型心筋症、心不全、心房細動、洞不全症候群などの疾患を引き起こす。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、心臓ナトリウムチャネル機能及び心臓ナトリウム電流密度に対するこれらのＮａｖ１．５突然変異体の影響を正常に回復することができ、その回復強度は野生型よりも高かった。その分子メカニズムは以下のとおりである。Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、ＭＯＧ１と核タンパク質Ｒａｎの相互作用を阻害し、それによって核に入るＭＯＧ１の数を減らし、このように、細胞質内のＭＯＧ１の数を大幅に増加させる。したがって、Ｅ５０Ｋ ＭＯＧ１突然変異体は、Ｎａｖ１．５とより効果的に相互作用し、Ｎａｖ１．５の上膜輸送を促進し、最終的にナトリウム電流を正常レベルに回復して、疾患を治療する目的を達成することができる。
【0030】
当業者であれば、上記の説明は本発明の好ましい実施例態に過ぎず、本発明を限定するためのものではなく、本発明の精神及び原則の範囲内で行われるいかなる修正、等価な置換及び改良等は、すべて本発明の保護範囲に含まれるべきであることが容易に理解される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】