特表 2025-503765 ハロプジノンを有効成分として含有する神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-04

(54)【発明の名称】ハロプジノンを有効成分として含有する神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/517 20060101AFI20250128BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20250128BHJP

【ＦＩ】

A61K31/517 ZNA

A61P25/28

A61P25/14

A61P25/16

A61P21/00

A61P43/00 111

C12N15/09 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024543121

(86)(22)【出願日】2022-12-12

(85)【翻訳文提出日】2024-09-13

(86)【国際出願番号】 KR2022020102

(87)【国際公開番号】W WO2023140505

(87)【国際公開日】2023-07-27

(31)【優先権主張番号】10-2022-0007094

(32)【優先日】2022-01-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521001526

【氏名又は名称】キュラミス インク

【住所又は居所原語表記】２Ｆ， ２１， Ｄａｅｈａｋ－ｒｏ １２－ｇｉｌ， Ｊｏｎｇｎｏ－ｇｕ Ｓｅｏｕｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(71)【出願人】

【識別番号】516011833

【氏名又は名称】ソウル ナショナル ユニバーシティ ホスピタル

【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＨＯＳＰＩＴＡＬ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ソン、ジョンジュン

(72)【発明者】

【氏名】クォン、ヨンナム

(72)【発明者】

【氏名】イ、ドヨン

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC46

4C086GA07

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA94

4C086ZC41

(57)【要約】

本発明はハロプジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）を有効成分として含有する神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用組成物に関するものであって、具体的に筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）細胞モデル及び動物モデルでハロプジノンが線維症を抑制し、骨格筋の生成を向上させ関節の構築を改善し、中枢神経系の炎症反応や神経細胞死滅を抑制する二重効果を示し、ＡＬＳの症状進行を遅延させ、遂行能力及び生存期間を向上させることができることを確認したので、前記ハロプジノンは、ＡＬＳを含む神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用組成物の有効成分として有用に利用されることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ハロフジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項2】

前記ハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩はＴＧＦ－β抑制剤である、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項3】

前記ハロプジノンは、下記［化学式１］で記載される化合物である、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用薬学組成物：
［化学式１］

.

【請求項4】

前記ハロプジノンは関節滑膜腔の線維症を緩和し、骨格筋生成を向上するものである、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項5】

前記ハロプジノンは中枢神経系の炎症反応および神経細胞死滅を抑制するものである、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項6】

前記ハロプジノンは神経退行性又は運動神経疾患の症状悪化を遅延させ、遂行能力および生存期間を向上させるものである、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項7】

前記神経退行性又は運動神経疾患は筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋肉緊張異常症、脊髄性筋萎縮症又は炎症性神経病症である、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項8】

ハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、神経退行性又は運動神経疾患予防又は改善用保健機能食品組成物。

【請求項9】

ハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を個体に投与する段階を含む、神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療方法。

【請求項10】

神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用薬剤として製造するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩の用途。

【請求項11】

神経退行性又は運動神経疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物として製造するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩の用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はハロプジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）を有効成分として含有する神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用組成物に関するものである。

【背景技術】

【0002】

筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）などは代表される退行性神経疾患又は運動神経疾患で、現在臨床的に使用されている治療剤が極めて制限的である。

【0003】

ＡＬＳは筋萎縮、関節拘縮及び痛みの進行によって生の質と死の質を低下させる。また、遺伝的突然変異、蛋白質恒常性障害、ミトコンドリア機能障害、神経機能障害及び神経炎症を含む様々な病態生理学的メカニズムにより、臨床経過及び予後が異質である。

【0004】

ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）は、細胞成長、分化および細胞死滅のような細胞調節に関与する多機能サイトカインで、ＴＧＦ－βとＡＬＳの間の関連性が現れた後、ＡＬＳ進行におけるＴＧＦ－βの役割が明らかになり始めた。骨格筋でＴＧＦ－βは損傷した筋肉を回復する役割をし、一般的に筋形成、成長および分化を調節する。しかし、ＴＧＦ－βが持続的に増加すると、筋形成が減少し、筋肉線維化及び萎縮が促進される。ＡＬＳのミューリンモデルを使用した以前の研究は、症状段階で向上したＴＧＦ－β信号伝達経路を示し、繊維／脂肪生成前駆体の増加により、豊富な細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）生成が現れた。同様に、正常な神経系では興奮毒性（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ）及び酸化的損傷からニューロンを保護し、神経発生に重要な役割をすると知られている。しかし、持続的に上昇したＴＧＦ－βは、ＡＬＳ疾患の進行促進と関連があると報告された。

【0005】

また、ＴＧＦ－β信号伝達経路はＡＬＳだけでなく、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症とも関連性があると報告された。

【0006】

そこで、持続的なＴＧＦ－βによるＡＬＳを含む神経退行性又は運動神経疾患の加速化を防ぎ、治療効果を示すことができる治療剤の開発に努力した結果、ＡＬＳ細胞モデルおよび動物モデルでハロプジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）がＴＧＦ－β上昇による線維症を抑制し、骨格筋の生成を向上させて関節構築を改善し、中枢神経系の炎症反応および神経細胞死滅を抑制する二重効果を示し、ＡＬＳの症状進行を遅延させ、遂行能力および生存期間を向上させることができることを確認し、前記ハロプジノンをＡＬＳを含む神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用組成物の有効成分として有用に利用できることを明らかにすることによって、本出願に至ることになった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｋａｔｓｕｎｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ。Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－βｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ。Ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１，４８－５６，２０１１。

【非特許文献2】Ｋａｓｈｉｍａ，Ｒ．＆Ｈａｔａ，Ａ。Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＧＦ－βｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ。Ａｃｔａ ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ５０，１０６－１２０，２０１８。

【非特許文献3】Ｐｅｔｅｒｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ。Ｔｈｅ ＴＧＦ－βＳｙｓｔｅｍ Ａｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｌａｙｅｒ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ。Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８，６６９，２０１７。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的はハロプジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の目的を達成するために、本発明はハロプジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用の薬学組成物を提供する。

【0010】

また、本発明はハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、神経退行性又は運動神経疾患予防又は改善用健康機能食品組成物を提供する。

【0011】

また、本発明はハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を個体に投与する段階を含む、神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療方法を提供する。

【0012】

また、本発明は神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療に使用するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を含有する薬学組成物を提供する。

【0013】

また、本発明は神経退行性又は運動神経疾患の予防又は改善に使用するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を含有する健康機能食品組成物を提供する。

【0014】

また、本発明は神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用薬剤として製造するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する。

【0015】

併せて、本発明は神経退行性又は運動神経疾患予防又は改善用健康機能食品組成物で製造するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する。

【0016】

【発明の効果】

【0017】

本発明者らは筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）細胞モデル及び動物モデルにおいて、ハロフジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）が線維症を抑制し、骨格筋の生成を向上させて関節構築を改善し、中枢神経系の炎症反応及び神経細胞の死滅を抑制する二重効果を示し、ＡＬＳの症状進行を遅延させ、遂行能力及び生存期間を向上させることができることを確認したので、前記ハロプジノンは、ＡＬＳを含む神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用組成物の有効成分として有用に利用されることができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明の一実施例によって筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）動物モデルにハロプジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）を投与する方法を模式化した図である。

【図2a】筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）にＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）刺激後、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ ｍＲＮＡ発現（図２ａ）及びＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ蛋白質発現（図２ｂ）を確認した図である。

【図2b】筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）にＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）刺激後、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ ｍＲＮＡ発現（図２ａ）及びＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ蛋白質発現（図２ｂ）を確認した図である。

【図3a】筋芽細胞に様々な濃度のハロプジノン処理（図３ａ）、又はＴＧＦ－β１及び様々な濃度のハロプジノン処理（図３ｂ）後の細胞生存率を確認し、ｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓａｍｄ２比率、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図３ｃ）を確認した図である。

【図3b】筋芽細胞に様々な濃度のハロプジノン処理（図３ａ）、又はＴＧＦ－β１及び様々な濃度のハロプジノン処理（図３ｂ）後の細胞生存率を確認し、ｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓａｍｄ２比率、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図３ｃ）を確認した図である。

【図3c】筋芽細胞に様々な濃度のハロプジノン処理（図３ａ）、又はＴＧＦ－β１及び様々な濃度のハロプジノン処理（図３ｂ）後の細胞生存率を確認し、ｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓａｍｄ２比率、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図３ｃ）を確認した図である。

【図4a】筋芽細胞にＴＧＦ－β１及びハロプジノン処理後、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ（ｃｏｌｌａｇｅｎＩ）ｍＲＮＡ発現（図４ａ）及びＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図４ｂ）を確認し，免疫細胞化学分析によりα－ＳＭＡ，ＭｙｏＤ発現（図４ｃ）を確認した図である。

【図4b】筋芽細胞にＴＧＦ－β１及びハロプジノン処理後、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ（ｃｏｌｌａｇｅｎＩ）ｍＲＮＡ発現（図４ａ）及びＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図４ｂ）を確認し，免疫細胞化学分析によりα－ＳＭＡ，ＭｙｏＤ発現（図４ｃ）を確認した図である。

【図4c】筋芽細胞にＴＧＦ－β１及びハロプジノン処理後、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ（ｃｏｌｌａｇｅｎＩ）ｍＲＮＡ発現（図４ａ）及びＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図４ｂ）を確認し，免疫細胞化学分析によりα－ＳＭＡ，ＭｙｏＤ発現（図４ｃ）を確認した図である。

【図5a】ＡＬＳ動物モデルから分離した線維芽細胞にハロプジノン処理後、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、コラーゲンＩｍＲＮＡ発現（図５ａ）及びｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓａｍｄ２の比率、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図５ｂ）を確認した図である。

【図5b】ＡＬＳ動物モデルから分離した線維芽細胞にハロプジノン処理後、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、コラーゲンＩｍＲＮＡ発現（図５ａ）及びｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓａｍｄ２の比率、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図５ｂ）を確認した図である。

【図6a】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノン投与後の運動機能及び体重変化（図６ａ）及び症状発病変化（図６ｂ及び図６ｃ）を確認した図である。

【図6b】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノン投与後の運動機能及び体重変化（図６ａ）及び症状発病変化（図６ｂ及び図６ｃ）を確認した図である。

【図6c】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノン投与後の運動機能及び体重変化（図６ａ）及び症状発病変化（図６ｂ及び図６ｃ）を確認した図である。

【図7a】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、９０日齢の雌（図７ａ）及び雄（図７ｂ）、１２０日齢の雌（図７ｃ）及び雄（図７ｄ）にＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩの発現を免疫組織化学分析により確認した図である。

【図7b】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、９０日齢の雌（図７ａ）及び雄（図７ｂ）、１２０日齢の雌（図７ｃ）及び雄（図７ｄ）にＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩの発現を免疫組織化学分析により確認した図である。

【図7c】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、９０日齢の雌（図７ａ）及び雄（図７ｂ）、１２０日齢の雌（図７ｃ）及び雄（図７ｄ）にＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩの発現を免疫組織化学分析により確認した図である。

【図7d】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、９０日齢の雌（図７ａ）及び雄（図７ｂ）、１２０日齢の雌（図７ｃ）及び雄（図７ｄ）にＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩの発現を免疫組織化学分析により確認した図である。

【図8a】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に膝関節滑膜腔において関節可動範囲（ＲＯＭ）を確認し（図８ａ）、ｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓａｍｄ２の割合、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図８ｂ）を確認した図である。

【図8b】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に膝関節滑膜腔において関節可動範囲（ＲＯＭ）を確認し（図８ａ）、ｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓａｍｄ２の割合、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ蛋白質発現（図８ｂ）を確認した図である。

【図9a】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に腰椎脊髄における微細阿膠細胞活性（図９ａ）、星状膠細胞活性（図９ｂ）、ＩＬ－１β発現（図９ｃ）、ＣｈＡＴ陽性運動ニューロン数（図９ｄ）、ＣｈＡＴｍＲＮＡ発現（図９ｅ）、ＣｈＡＴ蛋白質発現（図９ｆ）を確認した図である。

【図9b】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に腰椎脊髄における微細阿膠細胞活性（図９ａ）、星状膠細胞活性（図９ｂ）、ＩＬ－１β発現（図９ｃ）、ＣｈＡＴ陽性運動ニューロン数（図９ｄ）、ＣｈＡＴｍＲＮＡ発現（図９ｅ）、ＣｈＡＴ蛋白質発現（図９ｆ）を確認した図である。

【図9b】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に腰椎脊髄における微細阿膠細胞活性（図９ａ）、星状膠細胞活性（図９ｂ）、ＩＬ－１β発現（図９ｃ）、ＣｈＡＴ陽性運動ニューロン数（図９ｄ）、ＣｈＡＴｍＲＮＡ発現（図９ｅ）、ＣｈＡＴ蛋白質発現（図９ｆ）を確認した図である。

【図9c】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に腰椎脊髄における微細阿膠細胞活性（図９ａ）、星状膠細胞活性（図９ｂ）、ＩＬ－１β発現（図９ｃ）、ＣｈＡＴ陽性運動ニューロン数（図９ｄ）、ＣｈＡＴｍＲＮＡ発現（図９ｅ）、ＣｈＡＴ蛋白質発現（図９ｆ）を確認した図である。

【図9d】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に腰椎脊髄における微細阿膠細胞活性（図９ａ）、星状膠細胞活性（図９ｂ）、ＩＬ－１β発現（図９ｃ）、ＣｈＡＴ陽性運動ニューロン数（図９ｄ）、ＣｈＡＴｍＲＮＡ発現（図９ｅ）、ＣｈＡＴ蛋白質発現（図９ｆ）を確認した図である。

【図9e】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に腰椎脊髄における微細阿膠細胞活性（図９ａ）、星状膠細胞活性（図９ｂ）、ＩＬ－１β発現（図９ｃ）、ＣｈＡＴ陽性運動ニューロン数（図９ｄ）、ＣｈＡＴｍＲＮＡ発現（図９ｅ）、ＣｈＡＴ蛋白質発現（図９ｆ）を確認した図である。

【図9f】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に腰椎脊髄における微細阿膠細胞活性（図９ａ）、星状膠細胞活性（図９ｂ）、ＩＬ－１β発現（図９ｃ）、ＣｈＡＴ陽性運動ニューロン数（図９ｄ）、ＣｈＡＴｍＲＮＡ発現（図９ｅ）、ＣｈＡＴ蛋白質発現（図９ｆ）を確認した図である。

【図10a】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後９０日に腰椎脊髄から微細阿膠細胞活性（図１０ａ）及びＣｈＡＴ陽性運動ニューロン数（図１０ｂ）を確認した図である。

【図10b】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後９０日に腰椎脊髄から微細阿膠細胞活性（図１０ａ）及びＣｈＡＴ陽性運動ニューロン数（図１０ｂ）を確認した図である。

【図11a】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に腰椎脊髄においてＴＧＦ－β、ｉＮＯＳ、ＣＤ８６、アルギナーゼ１（ａｒｇｉｎａｓｅ１）、ＩＦＮ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β，ＴＮＦ－α，カスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ－３），ｂｃｌ２，ｂａｘ ｍＲＮＡ発現（図１１ａ）及び切断されたカスパーゼ３，ｂｃｌ２，ｂａｘ蛋白質発現（図１１ａ）を確認した図である。

【図11b】ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、生後１２０日に腰椎脊髄においてＴＧＦ－β、ｉＮＯＳ、ＣＤ８６、アルギナーゼ１（ａｒｇｉｎａｓｅ１）、ＩＦＮ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β，ＴＮＦ－α，カスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ－３），ｂｃｌ２，ｂａｘ ｍＲＮＡ発現（図１１ａ）及び切断されたカスパーゼ３，ｂｃｌ２，ｂａｘ蛋白質発現（図１１ａ）を確認した図である。

【発明の実施のための最良の形態】

【0019】

以下、本発明をより詳しく説明する。

【0020】

本発明において用語"予防"とは、本発明の組成物投与で疾患の発生及び加速化、症状の拡散及び再発を抑制させたり遅延させるすべての行為を意味し、用語"治療"とは、本発明の組成物投与で前記疾患の症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味する。

【0021】

本発明において用語"投与"は任意の適切な方法で患者に所定の物質を提供することを意味し、本発明の組成物の投与経路は目的組織に到達できる限り一般的なすべての経路を通じて経口又は非経口投与されることができる。また、組成物は活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されることができる。

【0022】

本発明はハロプジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用の薬学組成物を提供する。

【0023】

また、本発明はハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を個体に投与する段階を含む、神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療方法を提供する。

【0024】

また、本発明は神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療に使用するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を含有する薬学組成物を提供する。

【0025】

また、本発明は神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用薬剤として製造するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する。

【0026】

本発明で、前記ハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩はＴＧＦ－β抑制剤で、下記［化学式１］で記載される化学構造を有する：
［化学式１］

.

【0027】

また、前記ハロプジノンは市販のもの、合成したものにすべて無頓着に使用できる。

【0028】

本発明で、前記の神経退行性又は運動神経疾患は筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋肉緊張異常症、脊髄性筋萎縮症又は炎症性神経病症であり得るが、これに制限されるわけではない。

【0029】

具体的に、前記の神経退行性又は運動神経疾患において、ハロプジノンはＴＧＦ－β刺激による関節滑膜腔の線維症を緩和し、骨格筋生成を向上させ、疾患を予防又は治療することができる。

【0030】

また、前記の神経退行性又は運動神経疾患において、ハロプジノンはＴＧＦ－β刺激による中枢神経系の炎症反応および神経細胞死滅を抑制し、疾患を予防又は治療することができる。より具体的に、前記ハロプジノンは中枢神経系で抗炎症因子、例えばアルギナーゼ１（ａｒｇｉｎａｓｅ１）の発現を増加させ、伝炎因子、例えばｉＮＯＳ、ＣＤ８６、ＩＦＮ－α、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β又はＩＬ－６の発現を減少させて疾患を予防又は治療することができる。また、前記ハロプジノンは中枢神経系で抗神経細胞死滅因子、例えばｂｃｌ－２の発現を増加させ、神経細胞死滅因子、例えばカスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ－３）及びｂａｘの発現を減少させて疾患を予防又は治療することができる。

【0031】

また、前記の神経退行性又は運動神経疾患において、ハロプジノンは症状悪化を遅延させ、遂行能力および生存期間を向上させることができる。

【0032】

本発明の具体的な実施例で、本発明者たちは筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）でＴＧＦ－β１刺激により線維症が誘導され、筋形成が低下する反面、ハロプジノンを処理する場合、ＴＧＦ－β１刺激による線維症誘導及び筋形成低下が抑制されることを確認した。

【0033】

また、本発明者たちは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）動物モデルから線維芽細胞を分離した後、ハロプジノンを処理した結果、線維芽細胞で線維症および筋肉転写因子の低下が抑制されることを確認した。

【0034】

また、本発明者らはＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した結果、ＡＬＳ発病が遅延し、遂行能力及び生存期間が向上することを確認した。また、ハロプジノンを投与したＡＬＳ動物モデルで関節滑膜腔の線維症が減少し、骨格筋の生成が向上して関節構築が改善されることを確認した。併せて、ハロプジノンを投与したＡＬＳ動物モデルの中枢神経系（ＣＮＳ）で抗炎症及び神経細胞死滅抑制効果が現れることを確認した。

【0035】

したがって、本発明者たちはＡＬＳ細胞モデル及び動物モデルでハロプジノンが線維症を抑制し、骨格筋生成を向上して関節構築を改善し、中枢神経系の炎症反応及び神経細胞死滅を抑制する二重効果を示し、ＡＬＳの症状進行を遅延させて遂行能力及び生存期間を向上させることができることを確認したので、前記ハロプジノンはＡＬＳを含む神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用薬学組成物の有効成分として有用に利用されることができる。

【0036】

本発明のハロプジノンは、薬学的に許容可能な塩、これから製造できる可能な溶媒和物、水和物、ラセミ体、又は立体異性体をすべて含む。

【0037】

発明のハロプジノンは薬学的に許容可能な塩の形態で使用でき、塩としては薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨード化水素酸、亜硝酸又は亜リン酸のような無機酸類と脂肪族モノおよびジカルボンレート、フェニル置換アルカノエイト、ヒドロキシアルカノエイトおよびアルカンジオエイト、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類のような無毒性有機産から得られる。このような薬学的に無毒な塩類としては、ソルフェイト、ピロソルフェイト、バイソルフェイト、サルファイト、バイサルファイト、ニットレート、ホスフェート、モノハイドロゲンホスフェート、ジヒドロゲンホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェイトクロライド、ブロマイド、アイオダイド、フルオロド、アセテート、プロピオネート、デカノエイト、カプリレート、アクリレート、ポメート、イソブチレート、カフレート、ヘプタノエイト、プロピオレート、オキサレート、マロネート、ソクシネート、スベレート、セバケート、プーマレート、マリエイト、ブチン－１、４－ジオエイト、ヘキサン－１、６－ジオエイト、ベンゾエイト、クロロベンゾエイト、メチルベンゾエイト、ジニトロベンゾエイト、ヒドロキシベンゾエイト、メトキシベンゾエイト、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホネート、トルエンスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、キシレンスルホネート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、ラクテート、ヒドロキシ酪酸塩、グリコレート、マレート、タートレート、メタンスルホネート，プロパンスルホネート，ナフタレン－１－スルホネート、ナフタレン－２－スルホネート又はマンデレートを含む。

【0038】

本発明による酸付加塩は、通常の方法、例えば、本発明の化合物を過量の酸水溶液中に溶解させ、この塩を水混化性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン又はアセトニトリルを使用して沈殿させて製造することができる。また、この混合物で溶媒や過量の酸を蒸発させて乾燥したり、又は析出された塩を吸入濾過させて製造することもできる。

【0039】

また、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩は、例えば化合物を過量のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解して化合物塩をろ過し、余液を蒸発、乾燥させて得る。この時、金属塩としてはソジウム、カリウム又はカルシウム塩を製造することが制約上適している。また、これに対応する銀塩はアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例、硝酸銀）と反応させて得る。

【0040】

本発明のハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩は、治療的に有効な量で、および薬学的に許容可能な担体を含むことができる。

【0041】

本明細書で使用された"有効な量又は有効量"は、神経退行性および／又は運動神経疾患を遅らせたり、又は最小化したり；又は神経退行性および／又は運動神経疾患の治療又は管理において治療上の利点を提供するのに十分な本発明の化合物の量をいう。

【0042】

前記薬学的に許容可能な担体としては、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体が使用されることがある。経口投与用担体は、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸などを含むことができる。また、非経口投与用担体は水、適合するオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコール等を含むことができ、安定化剤および保存剤を追加で含むことができる。適した安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としてはベンズアルコニウムクロライド、メチル－又はプロピル－パラベンおよびクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されていることを参考にすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。

【0043】

本発明の薬学組成物は、人間をはじめとする哺乳動物にいかなる投与経路でも投与できる。経口又は非経口的に投与できる。

【0044】

非経口的な投与方法としては，例えば，静脈内，筋肉内，動脈内，骨髄内，硬膜内，心臓内，経皮，皮下，腹腔内，鼻腔内，腸管，局所，舌下又は直腸内投与であることがあるが，これに限定されるものではない。例えば、本発明の薬学組成物を注射型剤形で製造し、これを３０ゲージの細い注射針で皮膚を軽く端子（ｐｒｉｃｋ）する方法、又は皮膚に直接的に塗布又は付着する方法で投与されることもできる。

【0045】

本発明の薬学組成物は、上述したような投与経路によって経口投与用又は非経口投与用製剤として剤形化することができる。

【0046】

経口投与用製剤の場合に本発明の組成物は、粉末、顆粒、精製、環剤、糖衣精製、カプセル剤、液剤、ゲル剤，シロップ剤，スラリー剤，懸濁液などで当業界に公示された方法を利用して剤形化することができる。例えば、経口用製剤は活性成分を固体賦形剤と配合した後、これを粉砕して適合した補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することによって精製を収得ることができる。適合する賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロス、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール及びマルチトール等を含む糖類とトウモロコシのでんぷん、小麦でんぷん、米でんぷん及びジャガイモでんぷんン等を含むデンプン類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチル－セルロース等を含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどの充電剤が含まれることがある。また、場合により架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はナトリウムアルギネートなどを崩壊剤として添加することができる。さらに、本発明の薬学組成物は、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などを追加で含むことができる。

【0047】

非経口投与用製剤の場合は、注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、パッチ剤、エアロゾルおよび鼻腔吸入剤の形で当業界に公示された方法で剤形化することができる。これらの剤形はすべての製薬化学に一般的に知られている処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。

【0048】

本発明の薬学組成物の総投与量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与することができ、より具体的には、単一投与量で長期間多重投与することができ、又は多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与することができる。本発明の薬学組成物は、疾患の症状によって有効成分の含量を異にすることができる。具体的には、本発明の組成物の全体容量は、１日当たりの患者の体重１kg当たり約０．０１μｇないし１，０００ｍｇ、より具体的には０．１μｇないし１００ｍｇであることができる。しかし、前記本発明の薬学組成物の用量は投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、排泄率など多様な要因を考慮して当分野の通常的な知識を持つ者が適切な有効投与量を決定することができるだろう。本発明による薬学組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。

【0049】

また、本発明の薬学組成物は、個別治療剤として投与されるか、他の治療剤と併用して投与されることができる。他の治療剤と併用して投与される場合、本発明の組成物と他の治療剤は同時に、個別に又は順次投与することができる。この時、他の治療剤というのは神経退行性および／又は運動神経疾患の治療又は改善効果を持つことがすでに知られている物質である可能性がある。本発明の薬学組成物が他の治療剤と併用して投与される場合、本発明の組成物と他の治療剤はそれぞれ別途の容器に分離させて剤形化されたり、同じ剤形で共に複合剤形化されることができる。

【0050】

また、本発明はハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、神経退行性又は運動神経疾患予防又は改善用健康機能食品組成物を提供する。

【0051】

また、本発明は神経退行性又は運動神経疾患予防又は改善用健康機能食品組成物として使用するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する。

【0052】

併せて、本発明は神経退行性又は運動神経疾患予防又は改善用健康機能食品組成物で製造するためのハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する。

【0053】

本発明で、前記ハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩、神経退行性又は運動神経疾患に対する内容は前述した通りであるので、具体的な説明は前記内容を援用し、以下では健康機能食品組成物の特有な構成についてのみ説明するようにする。

【0054】

一方、本発明者たちはＡＬＳ細胞モデル及び動物モデルでハロフジノンが線維症を抑制し、骨格筋生成を向上して関節構築を改善し、中枢神経系の炎症反応及び神経細胞死滅を抑制する二重効果を示し、ＡＬＳの症状進行を遅延させ、遂行能力及び生存期間を向上させることができることを確認したので、前記ハロフジノンはＡＬＳを含む神経退行性又は運動神経疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物の有効成分として有用に利用されることができる。

【0055】

本発明の健康機能食品組成物は、粉末、顆粒、環、精製、カプセル、キャンディ、シロップおよび飲料の中から選択されたいずれかの剤形で製造されることができるが、これに制限されない。

【0056】

前記健康機能食品組成物は、神経退行性又は運動神経疾患を予防又は改善するために摂取できるものであれば、特に制限されない。本発明の健康機能食品組成物を食品添加物として使用する場合、前記の健康機能食品組成物をそのまま添加したり、他の食品又は食品成分と共に使用することができ、通常の方法によって適切に使用することができる。有効成分は，その使用目的（予防又は改善）に応じて適切に使用することができる。一般的に、食品又は飲料の製造時に本発明の健康機能食品組成物に対して１５重量部以下、好ましくは１０重量部以下の量で添加される。しかし、健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記の量は前記の範囲以下であり、安全性の面で何の問題もないため、有効成分は前記の範囲以上の量で使用できる。前記食品の種類には特別な制限はない。前記健康機能食品組成物を添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康食品をすべて含む。また、本発明の健康機能食品組成物は、食品、特に機能性食品として製造されることができる。

【0057】

本発明の機能性食品は、食品製造時に通常添加される成分を含み、例えば、蛋白質、炭水化物、脂肪、栄養素および調味剤を含む。例えば、ドリンク剤で製造される場合には、有効成分以外に天然炭水化物又は香味剤を追加成分として含むことができる。前記天然炭水化物はモノサカライド（例えば、グルコース、フラクトースなど）、ジサカライド（例えば、マルトス、スクロースなど）、オリゴ糖、ポリサカライド（例えば、デキストリン，シクロデキストリンなど）又は糖アルコール（例えばキシリトール，ソルビトール，エリスリトールなど）であることが望ましい。前記香味剤は、天然香味剤（例えば、タウマーティン、ステビア抽出物など）と合成香味剤（例えば、サッカリン、アスパルタムなど）を利用することができる。前記の健康機能食品の組成物の他に、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクト酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸，保護性コロイド増粘剤，ｐＨ調節剤，安定化剤，防腐剤，グリセリン，アルコール，炭酸飲料に使われる炭酸化剤などをさらに含有することができる。

【0058】

以下、本発明を実施例および実験例によって詳しく説明する。

【0059】

ただし、下記の実施例および実験例は本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。

【0060】

＜実施例１＞筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）培養、及びＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）及びハロフジノン（ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）処理

【0061】

ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）が筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）に及ぼす影響及びハロプジノン（ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）による効果を調べるために、マウス筋芽細胞を培養し、前記細胞にＴＧＦ－β１及びハロプジノンを処理した。

【0062】

具体的には、マウス筋芽細胞としてＣ２Ｃ１２細胞（ＣＲＬ－１７７２）をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）で購入し、１０％（ｖ／ｖ）小胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；Ｇｉｂｃｏ）が含まれたＤＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）で３７℃、５％ＣＯ_２条件下に維持した。Ｃ２Ｃ１２細胞を６ウェル－プレート（３×１０^５細胞／ウェル）に移し、２４時間分注した後、２４時間後に無血清培地に交換し、５ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦ－β１（組換えヒトＴＧＦ－β１；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に刺激した。刺激後、細胞を２４時間無血清培地で多様な濃度（０［ｃｏｎｔｒｏｌ］又は１，２．５、５（低濃度）、１０（高濃度）、２０、５０、１００ｎｇ／ｍｌ）のハロプジノン（ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ；Ｓｉｇｍａ）を処理した。

【0063】

＜実施例２＞細胞生存力分析

【0064】

細胞計数キット－８（ＣＣＫ－８キット）分析（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＡＬＸ－８５０－０３９）を使用して、Ｃ２Ｃ１２細胞に対して無血清条件でｒｈＴＧＦ－β１又はハロプジノン処理後の細胞生存力を測定した。

【0065】

具体的に、前記＜実施例１＞のＣ２Ｃ１２細胞を９６ウェル－プレート（１０^４細胞／ウェル）に２４時間培養し、２４時間で５ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦ－β１に刺激した。刺激後、ハロプジノンを様々な濃度（０［ｃｏｎｔｒｏｌ］又は１，２．５，５，１０，２０，５０，１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。２４時間後、各ウェルに１０μｌのＣＣＫ－８溶液を添加し、３７℃で１時間培養した。その後、ＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレート読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。細胞生存率は対照群（未処理）細胞の生存率で表現した。ハロプジノンの各濃度について，六つのウェルから得られた平均吸光度の平均値を計算した。

【0066】

＜実施例３＞免疫細胞化学分析

【0067】

前記＜実施例１＞のように、Ｃ２Ｃ１２細胞に対して無血清条件でｒｈＴＧＦ－β１又はハロプジノン処理後、免疫細胞化学分析を行った。

【0068】

具体的に、Ｃ２Ｃ１２細胞をカバースリップのある６ウェルプレートにプレーティングし、無血清培地でｒｈＴＧＦ－β１に刺激した。刺激２４時間後、細胞を２４時間無血清培地で低濃度又は高濃度のハロプジノンを処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温で１５分間４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で５分間処理した後、室温で１時間０．３％ＰＢＳ－Ｔで５％消血清アルブミンでブロッキングした。細胞を４℃のブロッキング緩衝液において、抗－α－ＳＭＡ抗体（１：２００；ａｂｃａｍ ｃａｔ＃ａｂ７８１７）、抗－ＭｙｏＤ抗体（１：２００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ｃａｔ＃ｓｃ３７７４６０）それぞれと２４時間インキュベーションし、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ２次抗体と室温で１時間インキュベーションした。核ＤＮＡをＤＡＰＩ（４，６－ｄｉａｍｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、１：１，０００；Ｓｉｇｍａ）で染色しＰＢＳで２回洗浄した後、カバースリップをＤａｋｏ蛍光マウンティング培地（Ｄａｋｏ）を使用してガラススライドにマウンティングした。４０×対物レンズを使ってＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像を観察した。また、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｘ ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してブラインド方式で定量化した。

【0069】

＜実施例４＞筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）動物モデル遺伝子検査

【0070】

筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）におけるハロプジノンの効能を調べるために、ＡＬＳ動物モデルを使用した。

【0071】

具体的に、すべての動物実験はソウル大学動物病院動物管理委員会の指針（ＩＡＣＵＣ、承認番号ＳＮＵ－２００２２０－１－２）に従って行われた。ＡＬＳ動物モデルで、人間Ｇ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１遺伝子（Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ）を発現する形質転換マウスは、ジャクソン研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）で購入した。ｍｔＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）Ｈ１高発現者菌株（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）の雄形質転換ＡＬＳマウスを雌マウス（Ｂ６／ＳＪＬＦ１）と交配させた。マウスは一定の温度（２２±１℃）、相対湿度（４０％）及び１２時間明暗周期の標準条件下で飼育し、食べ物と水に自由に接近できるようにした。遺伝子型は下記［表１］のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で確認し、移植遺伝子のコピー数を確認した。その後、Ｇ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１形質転換マウスを時点によって６０日齢（無症状）、９０日齢（初期症状）及び１２０日齢（後期症状）の３段階に分けた。計９６匹のマウスを実験に使用した。比較群として非－形質転換マウスを用いた。

【0072】

【表1】

＜実施例５＞ＡＬＳ動物モデル由来の線維芽細胞培養及びハロプジノン処理

【0073】

ＡＬＳにおけるハロプジノンの効能を調べるために、前記＜実施例４＞でＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１遺伝子を確認したＡＬＳ動物モデルから線維芽細胞を分離し、前記細胞にハロプジノンを処理した。

【0074】

具体的に、前記＜実施例４＞の１２０日齢の非－形質転換又はＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１形質転換マウスの骨格筋から１次線維芽細胞を分離した。切除された組織をカルシウム及びマグネシウムのないＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ'Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１４１７５０９５）とペニシリン－ストレプトマイシン（Ｃａｔ＃１５０７０－０６３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれた１００ｍｍ培養皿に置いた。筋肉組織を氷ブロックから切断した。その後、組織を１ｍｍ彫刻に切り、３７℃で１時間０．２％ＩＶ型コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＶ；Ｓｉｇｍａ）で酵素反応させた。１０ｍｌのＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加して酵素反応を中断した。組織混合物を５分間、４℃から１，８００ｒｐｍに遠心分離し、１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）で再現した。細胞を７０μｍ細胞ろ過器（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通じてろ過し、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培地で０．２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）コーティングされたプレートで培養した。その後、前記＜実施例１＞に記載された方法と同じ方法でハロフジノンを処理した。

【0075】

＜実施例６＞ＡＬＳ動物モデルにハロプジノン投与

【0076】

ＡＬＳにおけるハロプジノンの効能を調べるために、前記＜実施例４＞でＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１遺伝子を確認したＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した。

【0077】

具体的に、図１の模式図のように、前記＜実施例４＞の性別及び年齢が一致するマウスを無作為に３つのグループに分け、下記表２に示すように、ＤＭＳＯＴＧ群及びＨａｌＴＧ群は、Ｇ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１形質転換マウスにビヒクル（ＤＭＳＯ、Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、Ｄ１３７０）及びハロプジノン（Ｓｉｇｍａ、Ｓ８１４４）それぞれ１０週齢（初期段階）に１０週以上の注射を行った。比較群としてＤＭＳＯＮｏｎ－ＴＧ群は、非－形質転換マウスに同じ期間同じ方法でビヒクル（ＤＭＳＯ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。

【0078】

【表2】

一方、生化学分析に使用されるＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１形質転換マウス又は非形質転換マウスを生後９０日および１２０日に犠牲にし、すべての実験は三重で行った。

【0079】

＜実施例７＞ ＡＬＳ動物モデルの疾病進行、生存及び運動機能分析

【0080】

ＡＬＳにおけるハロプジノンの効能を調べるために、前記＜実施例６＞のようにＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した後、行動実験を単一盲検方式で行った。

【0081】

具体的に、前記＜実施例６＞のマウスの臨床状態と体重を出生後８３日目から週３回評価した。病気の発病は、尻尾を空中にぶら下がった時にマウスの手足が震えると定義し、これは上部運動ニューロンシステムの臨床的関連によるものと報告されている［Ｓ．Ｎａｇａｎｏ，Ｙ。Ｆｕｊｉｉ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ＴａｎｉｙａｍａＫ． Ｆｕｋａｄａ，Ｔ．Ｙａｎａｇｉｈａｒａ，ｅｔ ａｌ。Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｒｉｅｎｔｉｎｅ ｏｒ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ａｌｏｎｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｍｏｄｅｌ ｍｉｃｅ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，１７９（２００３），ｐｐ．１７６－１８０］。終結年齢は、動物が平らな表面に横に倒された後、３０秒以内に自らを正すことができないものと決定した。この時点でマウスが死んだと見た［Ｃ．Ｚｈｅｎｇ，Ｉ．Ｎｅｎｎｅｓｍｏ，Ｂ．Ｆａｄｅｅｌ，Ｊ．Ｉ．Ｈｅｎｔｅｒ Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＡＬＳ Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，５６（２００４），ｐｐ．５６４－５６７］。マウスの運動機能は、ロタロード装置（ＪＤ－Ａ－０７Ｍ、ＪＥＵＮＧ ＤＯ ＢＩＯ ＆ＰＬＡＮＴ ＣＯ．，ＬＴＤ．）を用いて検証した。マウスは記録を始める前に１週間訓練された。約８．３秒ごとに１ｒｐｍずつ増加させながら、３００秒にわたって４ｒｐｍの速度で始まり、４０ｒｐｍまで加速するロードにマウスを乗せた。ロタロードテストは生後８３日から１週間に３回ずつ平均３回測定し、連続３回ロタロードに１０秒以上留まることができない時点まで測定した。

【0082】

＜実施例８＞ 免疫組織化学分析

【0083】

ＡＬＳにおけるハロプジノンの効能を調べるために、前記＜実施例６＞のようにＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した後、腰椎脊髄（ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄｓ）と膝関節組織を利用して免疫組織化学分析を行った。

【0084】

具体的に、前記＜実施例６＞のマウスを生後９０日及び１２０日に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を貫流し、腰椎脊髄と膝関節を分離した。２４時間ＰＦＡに固定した後、膝関節を流れる水道の水で２４時間すすぎ、脱灰溶液（ｄｅｃａｌｃｉｆｙｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｃａｌｃｉ－Ｃｌｅａｒ、ＨＳ－１０４、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と共に４℃で持続的に振りながらインキュベーションした。針で骨が簡単に貫通する脱灰（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程が完了するまで、脱灰溶液を毎日新しい溶液に交換した。その後、脱灰された膝関節を流れる水道の水で２４時間すすぎ、脊髄と膝関節をサンプルが沈むまで３０％子糖に処理した後、凍結保護した後、連続的に切断した（１４μｍ）。腰椎脊髄及び膝関節組織切片をＰＢＳで３回洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で５分間透過した後、室温で１時間０．３％ＰＢＳ－Ｔの５％消血清アルブミンでブロックした。膝関節組織の切片は、 抗－ＴＧＦ－β１抗体（１：２００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ｃａｔ＃ｓｃ１３０３４８）、抗－α－ＳＭＡ抗体（１：２００；ａｂｃａｍ ｃａｔ＃ａｂ７８１７）、抗－ＭｙｏＤ抗体（１：２００；ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ｃａｔ＃ｓｃ３７７４６０）、抗－コラーゲンI抗体（１：２００；ａｂｃａｍ ｃａｔ＃ａｂ２１２８６）それぞれと、腰椎脊髄切片は，抗－ＧＦＡＰ抗体（１：２００；Ｄａｋｏｃａｔ＃Ｚ０３３４）、抗－Ｉｂａ１抗体（１：２００；Ｗａｋｏｃａｔ＃０１６）－２０００１）、抗－ＴＧＦ－β１抗体（１：２００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｃａｔ＃ｓｃ１３０３４８）、抗－ＴＧＦ－β１抗体（１：２００；ａｂｃａｍ，ｃａｔ＃ａｂ９２４８６）、抗 －ＩＬ－１β抗体（１：２００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ＡＦ－４０１－ＮＡ）それぞれと４℃で２４時間追加でインキュベーションした。切片をＰＢＳで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ２次抗体と暗室で１時間室温にインキュベーションした。染色および洗浄された脊髄切片を室温で１０分間ＤＡＰＩ（ＤＡＰＩ；１：１，０００；ｓｉｇｍａ）で染色した後、ＰＢＳで２回すすぎ、カバースリップをＤａｋｏ蛍光マウンティング培地（Ｄａｋｏ）でマウンティングし、膝関節は７．５倍対物レンズを利用し、脊髄は９．７５倍対物レンズを利用してＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。また、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｘ ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。

【0085】

＜実施例９＞腰椎脊髄の運動神経細胞係数

【0086】

ＡＬＳにおけるハロプジノンの効能を調べるために、前記＜実施例６＞のようにＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した後、腰椎脊髄を分離して運動神経細胞を計数した。

【0087】

具体的には、前記「実施例６」のマウスの臨床状態に応じて、様々な視点（９０日及び１２０日）にマウスを犠牲にした。各マウスに冷たいＰＢＳに続き、冷たい４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心貫流し、腰椎脊髄を分離した。サンプルを４％パラホルムアルデヒドに後－固定し、冷たい３０％自糖溶液に処理した後、凍結保護した後、１４μｍ厚さの横断面セクションを連続的に収得した。組織切片をＰＢＳで洗浄し、０．３％過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を含むＰＢＳに１５分間浸漬して耐因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。切片をＰＢＳで洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で５分間透過し、室温で１時間０．３％ＰＢＳ－Ｔの５％消血清アルブミンでブロックした。各セットの組織セクションを１次抗体として抗ＣｈＡＴ抗体（１：４００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｃａｔ＃ＡＢ１４４Ｐ）と共に２４時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、切片をビオチン化された末抗－塩素ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１：２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ＃ＢＡ－９５００）と共に１時間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合アビジン－ビオチン複合体（ＡＢＣキット；１：２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ＃ＰＫ４０００）と共に室温で１時間の間 インキュベーションした。徹底した洗浄の後、ジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＤＡＢ，ＩｍｍＰＡＣＴ（登録商標）
ＤＡＢ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ＃ＳＫ－４１０５）でセクションをインキュベーションしてペルオキシダーゼ染色を視覚化した。セクションを脱水及び空気乾燥し、トルエン可溶性Ｐｅｒｍｏｕｎｔマウンティング培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ＳＰ１５－５００）でマウンティングした。４×倍率でコンピュータ補助顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３）及びソフトウェア（ｃｅｌｌＳｅｎｓソフトウェア）を使用してＣｈＡＴ染色セクションで運動神経を計算した。係数はグループ当たり計３匹のマウスで脊髄前角（ｐｅｒ ｖｅｎｔｒａｌ ｈｏｒｎ）を行った。分析されたフィールドは、各半球の灰白質に明確に表示された免疫染色セクションの背側半分に位置したすべてのＣｈＡＴ＋プロファイルだった。

【0088】

＜実施例 １０＞ 関節可動範囲（ＲＯＭ）測定

【0089】

ＡＬＳにおけるハロプジノンの効能を調べるために、前記＜実施例６＞のようにＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した後、膝関節の関節可動範囲（ＲＯＭ）を測定した。

【0090】

具体的に、膝の伸展（ｋｎｅｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）角度を決定するために解剖学的指標を使用した。疾病年齢末期（１２０日）に２Ｄ角度分析システムであるＲａｎｄｏｍ Ｔｗｏ－ｌｉｎｅを使用して手動膝関節ＲＯＭを測定した。前記＜実施例６＞のマウスに１％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を吸入して麻酔させた後、アクリルプレートに置いて後ろ足の皮膚を剃った。大腿骨をプレートに固定し、マウス当たりの膝関節に一定の力の伸展モーメントを加えた。その後、大転子、膝の外側上と、外側のくるぶしにマーカーを付着して撮影映像のマーカーを得た。大腿骨の軸（膝の外側関節空間に対する大転子）と腓骨（膝の外側関節空間から外側のくるぶしまで）の間の角度を膝の伸展ＲＯＭで測定した。各群で１６匹のマウスを分析し、対照群として１２０日目に群でＤＭＳＯを注射した非－形質転換マウスの膝を使用した。

【0091】

＜実施例１１＞ リアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ分析

【0092】

前記＜実施例１＞でＴＧＦ－β１に刺激した後、ハロプジノンを処理した筋芽細胞、前記＜実施例５＞でＡＬＳ動物モデルから分離してハロプジノンを処理した線維芽細胞、又は前記＜実施例６＞のようにＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した後、分離した腰椎脊髄を利用してリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。

【0093】

具体的に、総ＲＮＡをＦａｖｏｒＰｒｅｐ^TMＴｒｉ－ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｆａｖｏｒｇｅｎ）を用いて、前記＜実施例１＞のＣ２Ｃ１２細胞、＜実施例５＞の線維芽細胞及び＜実施例６＞のマウスの腰椎脊髄から分離した。前記腰椎脊髄は＜実施例６＞のマウスから分離した後、実験前まで－８０℃で凍結保管した。総ＲＮＡの濃度は２６０ｎｍ吸光度で分光光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＮＤ－２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。ｃＤＮＡ はメーカーのプロトコルに従ってＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ－α－^TM（Ｔｏｙｏｂｏ）を使って１μｇの総ＲＮＡを用いて合成した。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｅｘｃｅｌ Ｔａｑ^TM２Ｘ Ｆａｓｔ Ｑ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＱ１２００、Ｓｍｏｂｉｏ）を使用して、サーモサイクラーＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）で下表３のプライマーを使用して定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。蛍光データはＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１ソフトウェアで分析し、２^{（－ΔΔＣＴ）}方法で対照群対相対的ｍＲＮＡ発現を計算した。すべてのサンプルに対して４回実験を行った。すべてのプライマーはＰｒｉｍｅｒ３オンラインソフトウェアを使用して設計し、対照群としてＧＡＰＤＨを使用した。

【0094】

【表3】

【0095】

＜実施例１２＞蛋白質抽出及びウエスタンブロット分析

【0096】

前記＜実施例１＞でＴＧＦ－β１に刺激した後、ハロプジノンを処理した筋芽細胞、前記＜実施例５＞でＡＬＳ動物モデルから分離してハロプジノンを処理した線維芽細胞又は前記＜実施例６＞のようにＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した後、分離した腰椎脊髄又は膝関節を利用してウエスタンブロット分析を行った。

【0097】

具体的に、前記＜実施例６＞のマウスの腰椎脊髄又は膝関節を分離し、直ちに－８０℃に凍結した。その後、各腰椎脊髄又は膝関節を均質化して化学処理して細胞を獲得した。前記化学処理された細胞、前記＜実施例１＞のＣ２Ｃ１２細胞又は＜実施例５＞の線維芽細胞をＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＡ、ＵＳＡ）からプロテアーゼ抑制剤およびホスファターゼ抑制剤（Ｒｏｃｈｅ、ＩＮ、ＵＳＡ）に溶解させ、氷の上で３０分間インキュベーションした。溶解物を４℃から１３，０００ｒｐｍに２０分間遠心分離した後、不溶性物質を除去した。ＢＣＡ分析（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によりタンパク質濃度を測定した。同量の細胞溶解物を電気泳動のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングし、ニトロセルロースメンブレン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｒｏｔｒａｎ ０．２ｕｍ ＮＣ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）に移した。その次、メンブレンを室温で１時間、１Ｘ ＴＢＳＴの５％（ｗ／ｖ）スキームミルクでブロックした。ブロッキング後、メンブレンに１次抗体として抗－β－アクチン抗体（１：５０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ｃａｔ＃ｓｃ４７７７８）、抗－Ｓｍａｄ２抗体（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｃａｔ＃５３３９）、抗－ｐ－Ｓｍａｄ２抗体（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｃａｔ＃３１０８）、抗－ＴＧＦ－β１抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｃａｔ＃ｓｃ１３０３４８）、抗－α－ＳＭＡ抗体（１：１００００；ａｂｃａｍ ｃａｔ＃ａｂ７８１７）、抗－ＭｙｏＤ抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｃａｔ＃ｓｃ３７７４６０）、抗－コラーゲンI抗体（１：１０００；ａｂｃａｍ ｃａｔ＃ａｂ２１２８６）、抗－切断されたカスパーゼ３抗体（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｃａｔ＃９６６１）、抗－ｂａｘ抗体（１：５００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｃａｔ＃ｓｃ４９３）、抗－ｂｃｌ２抗体（１：１０００；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ｃａｔ＃ＮＢ１００－５６０９８）、抗－ＣｈＡＴ抗体（１：１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｃａｔ＃ＡＢ１４４Ｐ）それぞれを処理し、４℃で一晩中インキュベーションした。その後、１Ｘ ＴＢＳＴで数回洗浄した後、メンブレンを室温（ＲＴ）で１時間ブロッキング緩衝液でホースラディッシュペルオキシダーゼ－接合二次抗体（抗－マウス、ウサギ又はヤギ、１：５０００；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベーションした。その後、メンブレンを洗浄し、メーカーの手順に従ってＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｐｌｕｓ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に簡単にインキュベーションし、イメージ分析器（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）に定量化した。内部対照群としてβ－アクチンを使用した。タンパク質強度の濃度測定はＩｍａｇｅ Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて定量化した。

【0098】

＜実施例１３＞ 統計分析

【0099】

すべてのデータは少なくとも３回の独立した実験に基づく平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表示し、対照群値の割合で表示した。グループ間の違いの有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ－ｔｅｓｔ又はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙ'ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎで分析した。ｐ－値＜０．０５は統計的に有意なものとみなした。ＫａｐｌａｎＭｅｉｅｒ ｃｕｒｖｅを使用して症状発病、ロタロード不全及び疾病終末点の累積確率を分析した。すべての分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使って行った。

【0100】

＜実験例１＞ 筋芽細胞におけるＴＧＦ－β１刺激による線維症の増進及び筋形成抑制の確認

【0101】

ＴＧＦ－β１が筋芽細胞に及ぼす影響を調べるために、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞株にＴＧＦ－β１刺激後、リアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ分析及びウェスタンブロット分析を行った。

【0102】

具体的には、前記＜実施例１＞のようにＣ２Ｃ１２細胞にＴＧＦ－β１を２４時間処理した後、前記＜実施例１１＞に記載された方法と同じ方法でリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ＴＧＦ－β１、２及び３、α－ＳＭＡ及びＭｙｏＤｍＲＮＡの発現を確認し（図２ａ）、前記＜実施例１２＞に記載された方法と同じ方法でウエスタンブロット分析を行い、ＴＧＦ－β１及びＭｙｏ蛋白質及びα－ＳＭＡの自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）発現を確認した（図２ｂ）。

【0103】

その結果、図２ａに示すように、Ｃ２Ｃ１２細胞株にＴＧＦ－β１刺激２４時間後、ＴＧＦ－β１、２及び３のｍＲＮＡレベルが対照群に比べて有意に増加した。また、ＴＧＦ－β刺激による筋線維芽細胞への筋芽細胞の活性化をα－ＳＭＡのｍＲＮＡ発現の有意な増加と確認した。対照的に、ＭｙｏＤのｍＲＮＡレベルはＴＧＦ－β刺激後に有意に減少した（図２ａ）。

【0104】

また、図２ｂに示すように、Ｃ２Ｃ１２細胞株にＴＧＦ－β１刺激２４時間後、ＴＧＦ－β１及びα－ＳＭＡ蛋白質の発現が有意に増加した。対照的に、ＭｙｏＤの蛋白質発現はＴＧＦ－β刺激後に有意に減少した（図２ｂ）。

【0105】

前記の結果を通じて、筋芽細胞でＴＧＦ－β１刺激による線維症増進及び筋形成抑制が誘発されることが分かる。

【0106】

＜実験例２＞ ハロプジノン（ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）の細胞毒性確認

【0107】

筋芽細胞におけるハロプジノン（ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）の細胞毒性を調べるために、細胞生存力分析及びウエスタンブロット分析を行った。

【0108】

具体的には、前記＜実施例２＞に記載された方法と同じ方法で、Ｃ２Ｃ１２細胞にＴＧＦ－β１刺激又は無刺激後ハロプジノンを処理し、ＣＣＫ－８分析を通じて細胞生存力分析を行い（図３ａ及び図３ｂ）、＜実施例１２＞に記載された方法と同じ方法でウエスタンブロット分析を行い、ｐ－Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２、ＴＧＦ－β１、ＭｙｏＤ、コラーゲンＩ蛋白質及びα－ＳＭＡの発現も確認した（図３ｃ）。

【0109】

その結果、図３ａ及び図３ｂに示したように、１ｎｇ／ｍｌないし１０ｎｇ／ｍｌのハロプジノン濃度において細胞生存率が大きく変わらないことを確認した（図３ａ及び図３ｂ）。

【0110】

また、図３ｃに示すように、５ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌのハロプジノン濃度において、ＴＧＦ－β１刺激によるｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ２の割合、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ及びコラーゲンＩ蛋白質レベルの上昇が有意に減少し、ＴＧＦ－β１刺激によるＭｙｏＤ蛋白質レベルの減少が有意に回復した（図３ｃ）。

【0111】

これにより、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるハロプジノンの最適濃度により、低濃度は５ｎｇ／ｍｌ、高濃度は１０ｎｇ／ｍｌ処理を決定した。

【0112】

＜実験例３＞ ＴＧＦ－β１刺激筋芽細胞におけるハロプジノンによる線維症の増進及び筋形成抑制の緩和を確認

【0113】

筋芽細胞におけるＴＧＦ－β１による変化がＴＧＦ－β抑制剤としてハロプジノンによって抑制されるかどうかを調査するために、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞細胞株にＴＧＦ－β１刺激後ハロプジノンを処理し、リアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ分析、ウエスタンブロット分析及び免疫細胞化学分析を行った。

【0114】

具体的には、前記＜実施例１＞のように、Ｃ２Ｃ１２細胞をＴＧＦ－β１で２４時間刺激した後、ハロプジノンを２４時間処理し、前記＜実施例１１＞に記載された方法と同じ方法でリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ及びコラーゲンＩ（Ｃｏｌ－Ｉ）ｍＲＮＡの発現を確認した（図４ａ）。また、前記＜実施例１２＞に記載された方法と同じ方法でウエスタンブロット分析を行い、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ及びコラーゲンＩ蛋白質の発現を確認した（図４ｂ）。併せて、前記＜実施例３＞に記載された方法と同じ方法で免疫細胞化学分析を行い、α－ＳＭＡ及びＭｙｏＤの発現を確認した（図４ｃ）。

【0115】

その結果、図４ａ及び図４ｂに示すように、低濃度又は高濃度のハロフジノンを処理した群において、ＴＧＦ－β１刺激によるＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ及びコラーゲンＩｍＲＮＡレベルの上昇が有意に減少し、ＴＧＦ－β１刺激によるＭｙｏＤｍＲＮＡレベルの減少は有意に回復した（図４ａ）。蛋白質の発現も同様の様相を呈した（図４ｂ）。

【0116】

また、図４ｃに示すように、免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡を用いてハロプジノン低濃度又は高濃度処理によりα－ＳＭＡが減少した強度とＭｙｏＤが回復した強度を確認した（図４ｃ）。

【0117】

前記の結果を通じて、筋芽細胞でＴＧＦ－β１刺激による線維症の増進及び筋形成抑制をＴＧＦ－β抑制剤としてハロプジノンを使用して予防できることが分かる。

【0118】

＜実験例４＞ ＡＬＳ動物モデル由来の線維芽細胞からハロフジノンによる線維症抑制を確認

【0119】

ＡＬＳ動物モデル由来の線維芽細胞におけるＴＧＦ－β１の変化及びハロプジノンの効果を調べるために、ＡＬＳ動物モデル由来の線維芽細胞にハロプジノンを処理した後、リアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ分析及びウエスタンブロット分析を行った。

【0120】

具体的には、前記＜実施例５＞に記載された方法と同じ方法でＡＬＳ動物モデルから線維芽細胞を分離し、ハロプジノンを処理した後、前記＜実施例１１＞に記載された方法と同じ方法でリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ及びコラーゲンＩ（Ｃｏｌ－Ｉ）ｍＲＮＡの発現を確認した（図５ａ）。また、前記＜実施例１２＞に記載された方法と同じ方法でウエスタンブロット分析を行い、ｐ－Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ及びコラーゲンＩ蛋白質の発現を確認した（図５ｂ）。対照群として非－形質転換マウスから分離した線維芽細胞を利用した。

【0121】

その結果、図５ａ及び図５ｂに示したように、ｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ２の割合、及びＴＧＦ－β、α－ＳＭＡ及びＣｏｌ－Ｉの蛋白質発現だけでなく、ｍＲＮＡのレベルは非形質転換マウス由来の線維芽細胞（Ｎｏｎ－ＴＧ）に比べてＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１マウス由来の線維芽細胞において有意に上昇した。このような変化は、２４時間の間、低濃度又は高濃度ハロプジノン処理により弱まることを確認した（図５ａ及び図５ｂ）。

【0122】

前記の結果を通じて、ＡＬＳマウスモデルの線維芽細胞で線維症が増進され、ハロフジノン処理によって線維症が抑制されることができることが分かる。

【0123】

＜実験例５＞ ＡＬＳ動物モデルでハロプジノン投与によるＡＬＳ発病遅延及び遂行能力向上確認

【0124】

生体内でハロプジノンの効果を評価するために、ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与して疾病進行、生存及び運動機能分析を行った。

【0125】

具体的に、前記＜実施例６＞に記載された方法と同じ方法でＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、前記＜実施例７＞に記載された方法と同じ方法で疾病進行、生存及び運動機能分析を行った。

【0126】

その結果、図６ａに示すように、症状段階の各ＴＧ群はｎｏｎ－ＴＧ群に比べてロタロッドで有意に時間が短縮される様相を呈した。一方、ＴＧ群の中で、ＤＭＳＯを投与したＴＧ群（ＤＭＳＯ ＴＧ群）と比較してハロプジノンを投与したＴＧ群（Ｈａｌ ＴＧ群）はロタロードで有意に長い時間を示した。体重はｎｏｎ－ＴＧ群と比較してＴＧ群で有意に減少し、ＤＭＳＯ ＴＧ群とＨａｌ ＴＧ群の間には有意な差がみられなかった（図６ａ）。

【0127】

また、図６ｂ及び図６ｃに示すように、ＤＭＳＯ ＴＧ群とＨａｌ ＴＧ群との間に症状発症の差があり、Ｈａｌ ＴＧ群の症状発症はＤＭＳＯ ＴＧ群に比べて有意に遅延した（平均±標準偏差［ＳＤ］、１１３±３．６ ｖｓ９４．２±５．７、ｐ＜それぞれ０．５）。また、ロタロッド不全に到達する年齢は、ＤＭＳＯ ＴＧ群よりＨａｌ ＴＧ群で遅れ（それぞれ１２４．３±３．５ｖｓ１１６．５±３．１、ｐ＜０．００１）、終結年齢も有意に増加した（１４１．８±それぞれ９．８ｖｓ１２９．３±７．６、図６ｂおよび図６ｃ）。

【0128】

＜実験例６＞ ＡＬＳ動物モデルの疾病初期段階でハロプジノン投与による滑膜腔の線維症減少及び骨格筋生成向上確認

【0129】

ＡＬＳ発病におけるハロプジノン効果を評価するために、ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与し、疾病初期と後期に膝関節滑膜腔の変化を免疫組織化学分析（ＩＨＣ）で確認した。

【0130】

具体的に、前記＜実施例６＞に記載された方法と同じ方法でＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１マウスにＡＬＳ発病初期（７３日）からハロプジノンを投与し、前記＜実施例８＞に記載された方法と同じ方法で疾病初期雌及び雄（９０日齢、図７ａ及び図７ｂ）と後期雌及び雄（１２０日齢、図７ｃ及び図７ｄ）膝関節を利用して免疫組織化学分析を行った。

【0131】

その結果、図７ａ及び図７ｂに示すように、ＤＭＳＯ Ｎｏｎ－ＴＧ群と比較して、ＤＭＳＯ ＴＧ群は性別に関係なく疾病の初期段階で膝関節滑膜腔におけるＴＧＦ－β１の有意な増加を確認した。また、ＤＭＳＯＮｏｎ－ＴＧ群に比べ、ＤＭＳＯ ＴＧ群の滑膜腔におけるＴＧＦ－β１の増加とともに、α－ＳＭＡ及びＣｏｌ－Ｉが増加し、ＭｙｏＤは減少することを確認した。一方、ＨａｌＴＧ群においては、疾病の初期段階においてＴＧＦ－βの増加が抑制され、これによりα－ＳＭＡ及びＣｏｌ－Ｉの発現もＤＭＳＯＴＧ群に比べて著しく低いことが確認された（図７ａ及び図７ｂ）。

【0132】

また、図７ｃ及び図７ｄに示すように、Ｈａｌ ＴＧ群ではＤＭＳＯ ＴＧ群と比較して滑膜腔において有意に低いＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、Ｃｏｌ－Ｉ及びより高いＭｙｏＤが疾病後期段階で持続的に維持されることを確認した。また、雌ハルＴＧ群においてＴＧＦ－β１、ＭｙｏＤ及びＣｏｌ－１の強度はＤＭＳＯ ｎｏｎ－ＴＧ群の強度と差がなく、雄Ｈａｌ ＴＧ群のＭｙｏＤ強度はＤＭＳＯ ｎｏｎ－ＴＧ群に比べて多少増加することを確認した（図７ｃ及び図７ｄ）。

【0133】

前記の結果から、ＴＧＦ－βの増加によるＡＬＳマウスの滑膜腔での筋線維芽細胞の活性化及び強化された線維化がハロプジノン投与によって改善できることがわかる。また、ＡＬＳマウスの滑膜腔で減少する骨格筋の筋形成もハロプジノン投与で予防できることがわかる。さらに、ＡＬＳマウスの疾病初期段階でハロプジノンの投与が性別に関係なく滑膜腔の線維症を有意に減少させ、筋肉形成を向上させることが分かる。

【0134】

＜実験例７＞ハロプジノン投与によるＡＬＳ動物モデルの関節構築改善確認

【0135】

ＡＬＳにおいて、線維症による機能抵抗及びこれに対するハロプジノンの効果を調べるために、ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した後、膝関節の関節可動範囲（ＲＯＭ）を測定し、ウエスタンブロット分析を行った。

【0136】

具体的に、前記＜実施例６＞に記載された方法と同じ方法でＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１マウスにハロプジノンを投与し、前記＜実施例１０＞に記載された方法と同じ方法で膝関節のＲＯＭ測定を行った（図８ａ）。また、膝関節組織を利用して、前記＜実施例１２＞に記載された方法と同じ方法でウエスタンブロット分析を行い、ｐ－Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２、ＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ、ＭｙｏＤ及びコラーゲンＩ蛋白質の発現を確認した（図８ｂ）。

【0137】

その結果、図８ａに示すように、１２０日のＤＭＳＯＮｏｎ－ＴＧ群に比べてＤＭＳ ＯＴＧ群でＲＯＭが有意に減少し、Ｈａｌ ＴＧ群ではＲＯＭが変化しないことが確認した（図８ａ）。

【0138】

また、図８ｂに示すように、ＤＭＳＯ Ｎｏｎ－ＴＧ群と比較して、ＤＭＳＯ ＴＧ群におけるｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ２の割合、ＴＧＦ－β、α－ＳＭＡ、Ｃｏｌ－Ｉの有意な増加とＭｙｏＤの減少を確認した。また、ＨａｌＴＧ群のｐ－Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ２の割合、及びＴＧＦ－β１、α－ＳＭＡ及びＭｙｏＤの発現レベルはＤＭＳＯ ｎｏｎ－ＴＧマウスと同様に保存され、Ｃｏｌ－１の発現レベルはむしろ減少した（図８ｂ）。

【0139】

前記の結果を通じて、ＡＬＳマウスでＴＧＦ－βの増加が膝関節内の線維症を強化して関節収縮を誘導する反面、ハロプジノン投与でこれを改善できることが分かる。

【0140】

＜実験例８＞ＡＬＳ動物モデルの中枢神経系（ＣＮＳ）組織におけるハロプジノン投与による抗炎症及び神経細胞死滅抑制効果の確認

【0141】

ＡＬＳにおけるハロプジノン投与による中枢神経系（ＣＮＳ）内の効果を調査するために、ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した後、腰椎脊髄を利用して免疫組織化学分析、腰椎脊髄の運動神経細胞係数及びウエスタンブロット分析を行った。

【0142】

具体的に、前記＜実施例６＞に記載された方法と同じ方法でＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１マウスにハロプジノンを投与し、生後１２０日マウスを犠牲にした後、前記＜実施例８＞に記載された方法と同じ方法で免疫組織化学分析を行い、腰椎脊髄でＴＧＦ－β１及び神経膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）を確認した。星?膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）から派生したＴＧＦ－βがＡＬＳマウスで病気を加速化すると報告されたことを勘案して、免疫組織化学分析時に各グループの脊髄をＴＧＦ－βとＧＦＡＰに共同染色した。また、微細阿膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）の活性を確認するためにＩＢＡ１染色を行った（図９ａ及び図９ｂ）。

【0143】

また、ＴＧＦ－βとＣＮＳの神経膠細胞変化が炎症に及ぼす影響を調べるために、免疫組織化学分析時に代表的な伝染性サイトカインであるＩＬ－１βをＧＦＡＰで同時染色した（図９ｃ）。

【0144】

また、脊髄の運動神経源を調べるために、前記＜実施例９＞に記載された方法と同じ方法で腰椎脊髄の運動神経細胞を観察及び計数し（図９ｄ）、前記＜実施例１１＞及び＜実施例１２＞に記載された方法と同じ方法でリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ及びウェスタンブロット分析を行い、ＣｈＡＴ ｍＲＮＡ（図９ｅ）及びＣｈＡＴ蛋白質（図９ｆ）発現を定量的に分析した。

【0145】

併せて、前記＜実施例６＞に記載された方法と同じ方法でＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１マウスにハロプジノンを投与し、生後９０日マウスを犠牲した後、前記と同じ方法で微細阿膠細胞の活性を確認するためにＩｂａ１染色を行い（図１０ａ）、運動神経細胞を観察および計数した（図１０ｂ）。

【0146】

その結果、図９ａ及び図９ｂに示すように、１２０日齢マウスのＤＭＳＯ ＴＧ群では、ＤＭＳＯ Ｎｏｎ－ＴＧ群に比べてＧＦＡＰ強度が有意に増加し、同一部位においてＴＧＦ－β１も増加した。星?膠細胞活性及びＴＧＦ－β１のこの増加は、ＨａｌＴＧ群において顕著に減少することを確認した（図９ｂ）。一方、微細阿膠細胞はＤＭＳＯ ＴＧ群で有意な増加を示し、Ｈａｌ ＴＧ群でも微細阿膠細胞が持続的に増加することを確認した（図９ａ）。

【0147】

また、図９ｃに示すように、１２０日齢マウスのＤＭＳＯ Ｎｏｎ－ＴＧ群と比較して、ＤＭＳＯ ＴＧ群ではＧＦＡＰ活性とともにＩＬ－１βが増加して活性化した炎症を示し、この活性化された炎症はＨａｌ ＴＧ群で抑制された（図９ｃ）。

【0148】

また、図９ｄないし図９ｆに示すように、１２０日齢マウスのＤＭＳＯ ＴＧ群において、ＣｈＡＴのすべてのｍＲＮＡ水準、ＣｈＡＴ陽性運動神経細胞の数及びＣｈＡＴ発現がＤＭＳＯ Ｎｏｎ－ＴＧ群より有意に低く現れるのに対し、Ｈａｌ ＴＧ群ではＤＭＳＯ Ｎｏｎ－ＴＧ群と同様に保存されることを確認した（図９ｄないし図９ｆ）。

【0149】

併せて、図１０ａおよび図１０ｂに示したように、前記のような変化は９０日齢マウスでも類似している（図１０ａおよび図１０ｂ）。

【0150】

前記の結果から、ＡＬＳマウスのＣＮＳにおけるＴＧＦ－βの増加が炎症反応の増加及びそれに伴う運動神経細胞の減少と関連があり、この過程はハロプジノン投与によって抑制されることがわかる。

【0151】

＜実験例９＞ＡＬＳ動物モデルにおけるハロプジノン投与によるＣＮＳの慢性炎症及び神経細胞死滅抑制を確認

【0152】

ＡＬＳにおけるハロプジノン投与がＣＮＳの炎症反応に及ぼす影響を調べるために、ＡＬＳ動物モデルにハロプジノンを投与した後、腰椎脊髄を利用してリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ分析及びウェスタンブロット分析を行った。

【0153】

具体的に、前記＜実施例６＞に記載された方法と同じ方法でＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１マウスにハロプジノンを投与し、生後１２０日マウスを犠牲にした後、腰椎脊髄を分離した。その次に、ＣＮＳの炎症関連因子および神経細胞死滅関連因子のｍＲＮＡ発現を前記＜実施例１１＞に記載された方法と同じ方法でリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＴ分析を行って確認し（図１１ａ）、神経細胞死滅関連因子の蛋白質発現を前記＜実施例１２＞に記載された方法と同じ方法でウエスタンブロット分析を行って確認した（図１１ｂ）。微細阿膠細胞のＭ１又はＭ２亜型によって役割（伝染症又は抗炎症効果）が異なるため、ＣＮＳの炎症関連因子としてはＭ１マーカー（ｉＮＯＳ、ＣＤ８６）、Ｍ２マーカー（ａｒｇｉｎａｓｅ１）と伝染症因子（ＩＦＮ－ａ、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６）の発現を確認した。また、神経細胞死滅関連因子としてｃａｓｐａｓｅ－３、ｂａｘ、ｂｃｌ－２の発現を確認した。

【0154】

その結果、図１１ａに示すように、ＤＭＳＯＴＧ群においてＴＧＦ－βのｍＲＮＡレベルに応じてＭ１マーカー及び伝染性因子のｍＲＮＡレベルが有意に増加し、これはハロプジノンによって抑制されることを確認した。また、抗神経細胞死滅因子であるｂｃｌ－２のｍＲＮＡ水準はＤＭＳＯＮｏｎ－ＴＧ群に比べてＤＭＳＯ ＴＧ群で減少し、Ｈａｌ ＴＧ群で保存されることを確認した（図１１ａ）。

【0155】

また、図１１ｂに示すように、ＤＭＳＯ Ｎｏｎ－ＴＧ群と比較してＤＭＳＯＴＧ群で神経細胞死滅因子である切断されたカスパーゼ３（ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３）及びｂａｘの蛋白質発現は増加し、抗神経細胞死滅因子であるｂｃｌ－２は減少し、このような変化はＨａｌ ＴＧ群で改善されることが確認された（図１１ｂ）。

【0156】

前記の結果から、ハロプジノンがＡＬＳマウスで持続的に増加したＴＧＦ－βを遮断し、ＣＮＳで抗炎症効果を示し、神経細胞死滅を抑制できることがわかる。

【0157】

前記＜実験例１＞ないし＜実験例９＞の結果を通じてハロプジノンがＡＬＳにおいてＴＧＦ－β増加による関節構築改善及びＣＮＳの慢性炎症及び神経細胞死滅抑制という二重治療効果を示すことを確認した。したがって、前記ハロプジノンはＡＬＳを含むＴＧＦ－β増加による神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療に利用されることができる。

【産業上の利用可能性】

【0158】

本発明では筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）細胞モデルおよび動物モデルでハロフジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）が繊維症を抑制し骨格筋の生成を向上させ、関節の構築を改善し中枢神経系の炎症反応及び神経細胞死滅を抑制する二重効果を示し、ＡＬＳの症状進行を遅延させ、遂行能力及び生存期間を向上させることができることを確認しましたので、前記ハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩は、ＡＬＳを含む神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用組成物の有効成分として有用に利用されることができる。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図5a】

【図5b】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図7d】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図9d】

【図9e】

【図9f】

【図10a】

【図10b】

【図11a】

【図11b】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-09-13

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ハロフジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項2】

前記ハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩はＴＧＦ－β抑制剤である、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項3】

前記ハロプジノンは、下記［化学式１］で記載される化合物である、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患の予防又は治療用薬学組成物：
［化学式１］

.

【請求項4】

前記ハロプジノンは関節滑膜腔の線維症を緩和し、骨格筋生成を向上するものである、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項5】

前記ハロプジノンは中枢神経系の炎症反応および神経細胞死滅を抑制するものである、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項6】

前記ハロプジノンは神経退行性又は運動神経疾患の症状悪化を遅延させ、遂行能力および生存期間を向上させるものである、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項7】

前記神経退行性又は運動神経疾患は筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋肉緊張異常症、脊髄性筋萎縮症又は炎症性神経病症である、請求項１に記載の神経退行性又は運動神経疾患予防又は治療用薬学組成物。

【請求項8】

ハロプジノン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、神経退行性又は運動神経疾患予防又は改善用保健機能食品組成物。

【国際調査報告】