特表 2025-503959 腫瘍浸潤リンパ球の富化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-06

(54)【発明の名称】腫瘍浸潤リンパ球の富化方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20250130BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250130BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20250130BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250130BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

A61P35/00

A61P37/04

A61K35/17

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024544415

(86)(22)【出願日】2023-01-27

(85)【翻訳文提出日】2024-09-24

(86)【国際出願番号】 US2023061497

(87)【国際公開番号】W WO2023147505

(87)【国際公開日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】63/304,288

(32)【優先日】2022-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/411,317

(32)【優先日】2022-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/423,676

(32)【優先日】2022-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522043220

【氏名又は名称】アベルゼータ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100216839

【弁理士】

【氏名又は名称】大石 敏幸

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】ルオ，シャンビン

(72)【発明者】

【氏名】タン，フェイ

(72)【発明者】

【氏名】パトリック，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】トリン，トゥ・レ

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ジアチ

(72)【発明者】

【氏名】ヤオ，シン

(72)【発明者】

【氏名】ジュ，シグイ

(72)【発明者】

【氏名】ヤオ，イホン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AC12

4B065AC20

4B065BA30

4B065BB19

4B065BC12

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB64

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

(57)【要約】

本開示は、伝統的な方法より短い時間で、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖させるための、およびＴＩＬの治療用集団を製造するための改良方法を提供する。所望のＴ細胞表現型を維持しながら目標細胞用量を容易に満たすＴＩＬ細胞療法製品が製造されうる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）第１の細胞培養培地内で第１の細胞集団を培養して第２の細胞集団を生成させること（ここで、第１の細胞集団は患者からの腫瘍サンプルから得られる）、および
（ｂ）第２の細胞培養培地内で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスと、第２の細胞集団を接触させて、第３の細胞集団を生成させること（ここで、第２の細胞培養培地は約１００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む）、を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖させる方法。

【請求項2】

第１の細胞培養培地が、約２，０００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む、請求項１記載の方法。

【請求項3】

工程（ａ）において、第１の細胞集団を約１０日間～約４０日間培養する、請求項１記載の方法。

【請求項4】

工程（ａ）において、第１の細胞集団を約１０日間～約１４日間培養する、請求項３記載の方法。

【請求項5】

第２の細胞培養培地が、約５００ ＩＵ／ｍＬ～約４，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む、請求項１記載の方法。

【請求項6】

第２の細胞培養培地が、約３，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む、請求項５記載の方法。

【請求項7】

工程（ａ）の後に第２の細胞集団を凍結保存することを更に含む、請求項１記載の方法。

【請求項8】

工程（ｂ）において、接触が約３日間～約１７日間である、請求項１記載の方法。

【請求項9】

第３の細胞集団が、数において第２の細胞集団より少なくとも１００倍多い、請求項１記載の方法。

【請求項10】

第３の細胞集団が、数において第２の細胞集団より約１００倍～約２０００倍多い、請求項９記載の方法。

【請求項11】

腫瘍サンプルが固形腫瘍からのものである、請求項１記載の方法。

【請求項12】

固形腫瘍が、肉腫、肝細胞癌、神経膠腫、頭頸部癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、肛門管癌、肛門直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、中耳癌、口腔癌、外陰部癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸癌、下咽頭癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、腹膜癌、大網癌、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、膀胱癌またはそれらの組合せを含む、請求項１１記載の方法。

【請求項13】

請求項１記載の方法によって得られる腫瘍浸潤リンパ球。

【請求項14】

（ｉ）ＣＤ３^＋細胞約３％～約８８％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉ）ＣＤ３^＋細胞約１０％～約９６％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉｉ）ＣＤ４^＋細胞約５０％～約８８％の範囲の割合のＣＤ４^＋ Ｔ_ＣＭ Ｔ細胞、
（ｉｖ）ＣＤ８^＋細胞約２８％～約８２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ Ｔ_ＣＭ Ｔ細胞、
（ｖ）ＣＤ４^＋細胞約１１％～約４９％の範囲の割合のＣＤ４^＋ Ｔ_ＥＭ Ｔ細胞、および
（ｖｉ）ＣＤ８^＋細胞約１１％～約６１％の範囲の割合のＣＤ８^＋ Ｔ_ＥＭ Ｔ細胞
のうちの１以上を含む、腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された、または腫瘍浸潤リンパ球から増殖した細胞集団であって、ここで、該細胞集団が７０％以上の生細胞を含み、該細胞集団が患者からの腫瘍サンプルから生成される、前記細胞集団。

【請求項15】

生細胞における８０％以上のＣＤ３^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項16】

ＣＤ４^＋細胞約１０％～約５１％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ２７^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項17】

ＣＤ８^＋細胞約１２％～約７２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項18】

ＣＤ８^＋細胞約３４％～約９５％の範囲の割合のＣＤ８^＋ＣＤ２８^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項19】

ＣＤ４^＋細胞約８２％～約１００％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ２８^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項20】

ＣＤ４^＋細胞約０．２％～約５．８％の範囲の割合のＣＤ４^＋ ４－１ＢＢ^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項21】

ＣＤ８^＋細胞約０．２％～約１１．６％の範囲の割合のＣＤ８^＋ ４－１ＢＢ^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項22】

ＣＤ４^＋細胞約０．２％～約１９．５％の範囲の割合のＣＤ４^＋ ＬＡＧ３^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項23】

ＣＤ８^＋細胞約６％～約５１．２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ ＬＡＧ３^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項24】

ＣＤ４^＋細胞約０．９％～約３１％の範囲の割合のＣＤ４^＋ ＰＤ１^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項25】

ＣＤ８^＋細胞約１％～約１８％の範囲の割合のＣＤ８^＋ ＰＤ１^＋ Ｔ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項26】

１０％以下のＣＤ５６^＋ ＮＫ細胞を含む、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項27】

（ａ）第１の細胞培養培地内で第１の細胞集団を培養して第２の細胞集団を生成させること（ここで、第１の細胞集団は患者からの腫瘍サンプルから得られる）、および
（ｂ）第２の細胞培養培地内で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスと、第２の細胞集団を接触させること（ここで、第２の細胞培養培地は約１００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む）、を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖させる方法によって生成される、請求項１４記載の細胞集団。

【請求項28】

（ａ）患者からの腫瘍サンプルから得られた細胞を培養すること、
（ｂ）該培養細胞を処理して、腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された細胞集団を生成させること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された細胞集団を増殖させる方法であって、該細胞集団が、
（ｉ）ＣＤ３^＋細胞約３％～約８８％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉ）ＣＤ３^＋細胞約１０％～約９６％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉｉ）ＣＤ４^＋細胞約５０％～約８８％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^＋セントラルメモリーＴ細胞、
（ｉｖ）ＣＤ８^＋細胞約２８％～約８２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^＋セントラルメモリーＴ細胞、
（ｖ）ＣＤ４^＋細胞約１１％～約４９％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^－エフェクターメモリーＴ細胞、および
（ｖｉ）ＣＤ８^＋細胞約１１％～約６１％の範囲の割合のＣＤ８^＋ Ｔ ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^－エフェクターメモリーＴ細胞
のうちの１以上を含む、前記方法。

【請求項29】

請求項２８記載の方法によって得られる腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された細胞集団。

【請求項30】

請求項１３記載の腫瘍浸潤リンパ球を患者に投与することを含む、癌を有する患者の治療方法。

【請求項31】

約１×１０^９～約１×１０^１１個の細胞を患者に投与する、請求項３０記載の方法。

【請求項32】

約５×１０^９～約９×１０^１０個の細胞を患者に投与する、請求項３０記載の方法。

【請求項33】

癌が、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌または頭頸部癌である、請求項３０記載の方法。

【請求項34】

請求項１４記載の細胞集団を患者に投与することを含む、癌を有する患者の治療方法。

【請求項35】

請求項２９記載の細胞集団を患者に投与することを含む、癌を有する患者の治療方法。

【請求項36】

癌が、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌または頭頸部癌である、請求項３４記載の方法。

【請求項37】

癌が、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌または頭頸部癌である、請求項３５記載の方法。

【請求項38】

癌が、肉腫、肝細胞癌、神経膠腫、頭頸部癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、肛門管癌、肛門直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、中耳癌、口腔癌、外陰部癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸癌、下咽頭癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、腹膜癌、大網癌、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、膀胱癌またはそれらの組合せを含む、請求項３０記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍浸潤リンパ球を富化する（ｅｎｒｉｃｈ；濃縮する）ための方法に関する。

【0002】

関連出願に対する相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６３／３０４，２８８号（２０２２年１月２８日付出願）、第６３／４１１，３１７号（２０２２年９月２９日付出願）および第６３／４２３，６７６号（２０２２年１１月８日付出願）（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に基づく優先権を主張するものである。

【背景技術】

【0003】

背景
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いる養子細胞療法はがん（以下、癌と表記される）に対する潜在的な治療選択肢を提供する。ＴＩＬは、多様な抗原特異性を有するポリクローナルＴ細胞に富む。腫瘍の断片の抽出およびそれに続くエクスビボ増殖は不適な腫瘍微小環境からＴＩＬを取り出し、腫瘍内制御性Ｔ細胞の免疫抑制効果を低減する。ＴＩＬのエクスビボでの増殖は細胞を若返らせて、患者に再注入されるべき数十億個のそのような細胞を生成する。広範な性質の腫瘍ネオ抗原および各患者からの特有のアレイに対処しうる細胞療法製品は、個別の目的に合わせた応答の可能性につながるであろう。Ｓａｒｎａｉｋら，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０２１，３９：２６５６－２６６６。

【0004】

ＴＩＬを使用する癌の有効な治療は数十億個のＴＩＬのエクスビボでの製造を要する。ＴＩＬの製造のためには、患者の切除された腫瘍を最初に断片化し、腫瘍組織からのＴＩＬの移動を維持する条件下でインビトロで培養する。通常のプロトコルにおいては、次いで、放射線照射された同種ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用して、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）でＴＩＬ数を増加させる。ＲＥＰは、注入のための十分なＴＩＬを生成させるために用いられる。ドナーＰＢＭＣの利用可能性および検証を含む幾つかの要因が、通常のＲＥＰプロトコルを、長時間を要し、多大な労力を要し、高い費用を要するものにする。これらのマイナス要因に加えて、標準的なプロトコルで増殖したＴＩＬは、主に、より不良な臨床応答に関連する終末分化表現型（Ｔ_ＥＭ、Ｔ_ＥＭＲＡ）を示す。ＴＩＬ注入製品における若いメモリー表現型（Ｔ_ＳＣＭ、Ｔ_ＣＭ）は患者における抗腫瘍応答の改善に関連付けられている。したがって、容易に入手可能な市販試薬を使用して、好ましい表現型を有するＴＩＬを生成しうる、より簡便であるがＧＭＰに準拠したプロセスを、通常のＲＥＰプロトコルの代わりに用いることが必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

概括
本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖させる方法を提供し、該方法は、（ａ）第１の細胞培養培地内で第１の細胞集団を培養して第２の細胞集団を生成させること、ならびに（ｂ）第２の細胞培養培地内で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスと、第２の細胞集団を接触させて、第３の細胞集団を生成させることを含む。特定の実施形態においては、第１の細胞集団は患者からの腫瘍サンプルから得られる。

【0006】

第３の細胞集団は、本発明の医薬組成物に含まれるべきＴＩＬまたは細胞でありうる。第３の細胞集団は、癌を有する対象（例えば、患者）を治療するために本発明の方法において使用されるべきＴＩＬまたは細胞でありうる。

【0007】

特定の実施形態においては、第２の細胞培養培地は約１００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）、約５００ ＩＵ／ｍＬ～約４，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約１，０００ ＩＵ／ｍＬ、約２，０００ ＩＵ／ｍＬ、約３，０００ ＩＵ／ｍＬ、約４，０００ ＩＵ／ｍＬ、または約５，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。

【0008】

特定の実施形態においては、第１の細胞培養培地は約２，０００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約５，０００ ＩＵ／ｍＬ、約６，０００ ＩＵ／ｍＬ、約７，０００ ＩＵ／ｍＬ、または約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。

【0009】

特定の実施形態においては、工程（ａ）において、第１の細胞集団を、約１０日間～約４０日間、約１０日間～約１４日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間または約１７日間培養する。

【0010】

該方法は、工程（ａ）の後に第２の細胞集団を凍結保存することを更に含みうる。

【0011】

特定の実施形態においては、工程（ｂ）において、接触を、約３日間～約１７日間、約５日間～約１５日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間または約１７日間行う。

【0012】

特定の実施形態においては、第３の細胞集団は、数において、第２の細胞集団より少なくとも１００倍多く、または第２の細胞集団より約１００倍～約２０００倍多い。

【0013】

腫瘍サンプルは固形腫瘍からのものでありうる。固形腫瘍には、肉腫、肝細胞癌、神経膠腫、頭頸部癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、肛門管癌、肛門直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、中耳癌、口腔癌、外陰部癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸癌、下咽頭癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、腹膜癌、大網癌、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、膀胱癌およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0014】

本開示は、本発明の方法によって得られる腫瘍浸潤リンパ球を提供する。

【0015】

また、本開示は、以下のもの、すなわち、
（ｉ）ＣＤ３^＋細胞約３％～約８８％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉ）ＣＤ３^＋細胞約１０％～約９６％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉｉ）ＣＤ４^＋細胞約５０％～約８８％の範囲の割合のＣＤ４^＋ Ｔ_ＣＭ Ｔ細胞、
（ｉｖ）ＣＤ８^＋細胞約２８％～約８２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ Ｔ_ＣＭ Ｔ細胞、
（ｖ）ＣＤ４^＋細胞約１１％～約４９％の範囲の割合のＣＤ４^＋ Ｔ_ＥＭ Ｔ細胞、
（ｖｉ）ＣＤ８^＋細胞約１１％～約６１％の範囲の割合のＣＤ８^＋ Ｔ_ＥＭ Ｔ細胞
のうちの１以上を含む、腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された、または腫瘍浸潤リンパ球から増殖した細胞集団をも含み、ここで、細胞集団は７０％以上の生細胞を含み、細胞集団は患者からの腫瘍サンプルから生成される。

【0016】

細胞集団は、生細胞における８０％以上のＣＤ３^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0017】

細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約１０％～約５１％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ２７^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0018】

細胞集団は、ＣＤ８^＋細胞約１２％～約７２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0019】

細胞集団は、ＣＤ８^＋細胞約３４％～約９５％の範囲の割合のＣＤ８^＋ＣＤ２８^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0020】

細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約８２％～約１００％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ２８^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0021】

細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約０．２％～約５．８％の範囲の割合のＣＤ４^＋ ４－１ＢＢ^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0022】

細胞集団は、ＣＤ８^＋細胞約０．２％～約１１．６％の範囲の割合のＣＤ８^＋ ４－１ＢＢ^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0023】

細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約０．２％～約１９．５％の範囲の割合のＣＤ４^＋ ＬＡＧ３^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0024】

細胞集団は、ＣＤ８^＋細胞約６％～約５１．２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ ＬＡＧ３^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0025】

細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約０．９％～約３１％の範囲の割合のＣＤ４^＋ ＰＤ１^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0026】

細胞集団は、ＣＤ８^＋細胞約１％～約１８％の範囲の割合のＣＤ８^＋ ＰＤ１^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0027】

細胞集団は、１０％以下のＣＤ５６^＋ ＮＫ細胞を含みうる。

【0028】

本開示は、本発明の方法によって得られる細胞集団を提供する。

【0029】

該方法は、（ａ）第１の細胞培養培地内で第１の細胞集団を培養して第２の細胞集団を生成させること、および、（ｂ）第２の細胞培養培地内で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスと、第２の細胞集団を接触させて、第３の細胞集団を生成させることを含む。特定の実施形態においては、第１の細胞集団は患者からの腫瘍サンプルから得られる。第３の細胞集団は、本方法によって生成される細胞集団でありうる。

【0030】

本開示は、腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された細胞集団を増殖させる方法を提供する。該方法は、（ａ）患者からの腫瘍サンプルから得られた細胞を培養すること、（ｂ）該培養細胞を処理して、腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された細胞集団を生成させることを含み、ここで、細胞集団は、以下のもの、すなわち、
（ｉ）ＣＤ３^＋細胞約３％～約８８％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉ）ＣＤ３^＋細胞約１０％～約９６％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉｉ）ＣＤ４^＋細胞約５０％～約８８％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^＋セントラルメモリーＴ細胞、
（ｉｖ）ＣＤ８^＋細胞約２８％～約８２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^＋セントラルメモリーＴ細胞、
（ｖ）ＣＤ４^＋細胞約１１％～約４９％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^－エフェクターメモリーＴ細胞、
（ｖｉ）ＣＤ８^＋細胞約１１％～約６１％の範囲の割合のＣＤ８^＋ Ｔ ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^－エフェクターメモリーＴ細胞
のうちの１以上を含む。

【0031】

また、本開示は、本発明の腫瘍浸潤リンパ球、本発明の細胞集団、本発明の細胞（例えば、第３の細胞集団）または本発明の組成物を患者に投与することを含む、癌を有する患者の治療方法をも含む。

【0032】

本開示は、本発明の腫瘍浸潤リンパ球、本発明の細胞集団または本発明の細胞（例えば、第３の細胞集団）を含む医薬組成物を提供する。

【0033】

特定の実施形態においては、約１×１０^９～約１×１０^１１個の細胞、または約５×１０^９～約９×１０^１０個の細胞を患者に投与する。

【0034】

癌は、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌または頭頸部癌でありうる。癌には、肉腫、肝細胞癌、神経膠腫、頭頸部癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、肛門管癌、肛門直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、中耳癌、口腔癌、外陰部癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸癌、下咽頭癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、腹膜癌、大網癌、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、膀胱癌またはそれらの組合せが含まれうる。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】標準化プロトコルに従うプレ（ｐｒｅ－）ＲＥＰ ＴＩＬ培養におけるＴＩＬ増殖およびグルコース／乳酸レベル。標準化プレＲＥＰプロトコルにおいては、腫瘍断片を、２５０ｍＬのプレＲＥＰ完全培地を含有するＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置内に配置し、第１０日に１体積の培地を供給し、第１４日にそれを回収した。第０日、第６日、第１０日および第１４日に上清を採取した。

【図2】標準化プロトコルによるプレＲＥＰ ＴＩＬの系統の特徴づけ。ＮＫ，ＣＤ４５^＋ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋（ＣＤ４５^＋細胞内）；Ｂ，ＣＤ４５^＋ＣＤ３^－ＣＤ１９^＋（ＣＤ４５^＋細胞内）；骨髄，ＣＤ４５^＋ＣＤ３^－ＣＤ１４^＋（ＣＤ４５^＋細胞内）；上皮，ＣＤ４５^－ ＥＰＣＡＭ^＋（生細胞内）；ＣＤ３^＋ Ｔ細胞（ＣＤ４５^＋細胞内）；ＣＤ４^＋ ＴおよびＣＤ８^＋ Ｔ（ＣＤ３^＋ Ｔ細胞内）。

【図3】標準化プロトコルに従い生成されたＣＤ４^＋プレＲＥＰ ＴＩＬの活性化／阻害性表面マーカーおよびサブセットの発現。

【図4】標準化プロトコルに従い生成されたＣＤ８^＋プレＲＥＰ ＴＩＬの活性化／阻害性表面マーカーおよびサブセットの発現。

【図5】伝統的なＲＥＰまたはＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰによって増殖されたＴＩＬにおけるＣＤ３^＋ Ｔ細胞ならびにＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞サブセットの割合。統計的有意性は対応ｔ検定によって決定した：^＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ，有意ではない（ｎ＝１２）。

【図6】ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ ＴＩＬのメモリー表現型。上図：ＣＤ４、下図：ＣＤ８。各ドットは１名のドナーを表す。水平バーは平均および標準偏差を表す。Ｔ_Ｎ，ナイーブＴ細胞；Ｔ_ＳＣＭ，幹細胞メモリー；Ｔ_ＣＭ，セントラルメモリー；Ｔ_ＥＭ，エフェクターメモリー；Ｔ_ＥＦＦ，エフェクターＴ細胞。Ｐ値はスチューデント対応ｔ検定によって得た。Ｎｓ，有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｎ＝１２）。

【図7】ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ ＴＩＬサブセットにおける阻害性マーカーおよび活性化マーカーの分析。上図：ＣＤ４、下図：ＣＤ８。各ドットは１名のドナーを表す。水平バーは平均および標準偏差を表す。Ｐ値はスチューデント対応ｔ検定によって得た。ｎｓ，有意ではない；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｎ＝１２）。

【図8】αＣＤ３刺激に応答したＩＦＮ－γおよびグランザイムＢの産生。刺激は全てのドナーに関して３回重複して行い、各ドットはそれらの平均値を表す。水平バーは各条件における異なるドナーの総平均を表す。Ｐ値は対応ｔ検定によって得た。ｎｓ，有意ではない；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図9】自己腫瘍細胞の存在下のインキュベーション中のＣ－ＴＩＬ０５１（ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬ）および伝統的なＲＥＰ ＴＩＬの腫瘍殺傷効果。ドナーＴ５１０１０１６からのＴＩＬをサイトライト・ラピッド・レッド（Ｃｙｔｏｌｉｇｈｔ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｄ）で標識し、次いで、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）３／７グリーン（Ｇｒｅｅｎ）を含有する培養培地内で２：１、３：１、および４：１のＥ：Ｔ比で癌ＭＯＳと共に６８時間共培養した。ＭＯＳの単独体を陰性対照として使用した。カスパーゼ３／７のシグナルが高いほど、殺傷効果が高いことを示す。

【図10】ＴｒａｎｓＡｃｔおよびＧ－Ｒｅｘ（登録商標）装置を使用したＣ－ＴＩＬ０５１ ＲＥＰ ＰＤ実施培養におけるＩＬ－２タンパク質濃度の動的変化。ＲＥＰ ＣＭ（第０日）または種々の時点で採集された培養上清サンプルのＩＬ－２タンパク質濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（左）。７回のＲＥＰ実施からのサンプルを分析したところ、異なるドナーのＴＩＬは種々のレベルの増殖を示した［右；第１４日のデータは、第９日のそれぞれの分割係数（ｓｐｌｉｔ ｆａｃｔｏｒ）を考慮した後の予測数を表す］。

【図11】ＴｒａｎｓＡｃｔおよびＧ－Ｒｅｘ（登録商標）装置を使用したＣ－ＴＩＬ０５１ ＲＥＰ ＰＤ実施培養におけるグルコースおよび乳酸レベルの動的変化。ＲＥＰ ＣＭ（第０日）または種々の時点で採集された培養上清サンプルにおけるグルコース濃度および乳酸濃度を、それぞれ、グルコース－Ｇｌｏアッセイおよび乳酸－Ｇｌｏアッセイによって測定した。７回のＲＥＰ実施からのサンプルを分析したところ、異なるドナーのＴＩＬは種々のレベルの増殖を示した。

【図12】Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置を使用したＴｒａｎｓＡｃｔによるＲＥＰの後のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ ＴＩＬの表面マーカー発現およびメモリー表現型のＦＡＣＳ分析。データは、９５％ ＣＩを有する平均として示されている。Ｔ_Ｎ（Ｔｎａｉｖｅ），ナイーブＴ細胞；Ｔ_ＳＣＭ（Ｔｓｃｍ），幹メモリーＴ細胞；Ｔ_ＣＭ（Ｔｃｍ），セントラルメモリーＴ細胞；Ｔ_ＥＭ（Ｔｅｍ），エフェクターメモリーＴ細胞；Ｔ_ＥＦＦ，エフェクターＴ細胞。

【図13】Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＣ－ＴＩＬ０５１ ＲＥＰ ＰＤ実施培養におけるＩＬ－２タンパク質濃度の動的変化。第７日にＧ－Ｒｅｘ（登録商標）培養からの上清をサンプリングした後、同日に培養物をＸｕｒｉ（商標）Ｃｅｌｌｂａｇに接種し、次いで第８日から回収まで毎日サンプリングした。

【図14】Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＣ－ＴＩＬ０５１ ＲＥＰ ＰＤ実施培養におけるグルコース濃度および乳酸濃度の動的変化。第７日にＧ－Ｒｅｘ（登録商標）培養からの上清をサンプリングした後、同日に培養物をＸｕｒｉ（商標）Ｃｅｌｌｂａｇに接種し、次いで第８日から回収まで毎日サンプリングした。

【図15】Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＣ－ＴＩＬ０５１ ＰＤ実施からのＲＥＰ ＴＩＬの細胞増殖、生存率および累積増殖倍数。最初に５つのプレＲＥＰサンプルをＴｒａｎｓＡｃｔで活性化し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置において増殖させ、次いで第７日にＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターに移した。細胞をＸｕｒｉ（商標）において更に８～１２日間増殖させ、ここで、細胞増殖および生存率を調べるために毎日サンプリングした。

【図16】Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＲＥＰの後のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ ＴＩＬの表面マーカー発現およびメモリー表現型のＦＡＣＳ分析。データは、９５％ ＣＩを有する平均として示されている。Ｔ_Ｎ，ナイーブＴ細胞；Ｔ_ＳＣＭ，幹メモリーＴ細胞；Ｔ_ＣＭ，セントラルメモリーＴ細胞；Ｔ_ＥＭ，エフェクターメモリーＴ細胞；Ｔ_ＥＦＦ，エフェクターＴ細胞。

【図17】αＣＤ３／ＣＤ２８刺激に応答した模擬実施からのＣ－ＴＩＬ０５１によるＩＦＮ－γ産生。

【図18】αＣＤ３刺激に応答したＣ－ＴＩＬ０５１エンジニア実施（Ｅｎｇｉｎｅｅｒ Ｒｕｎ）によるＴ細胞活性化マーカー（４－１ＢＢおよびＯＸ４０）のアップレギュレーション。水平線は総平均を示す。

【図19】Ｔ細胞効力アッセイを使用したＣ－ＴＩＬ０５１媒介性ＭＯＳ殺傷の評価。１：１、５：１、および１０：１のＥ：Ｔ比で観察された、相対的なＴ５１０１０３４（左）およびＴ５１０１０３５（右）自己ＴＩＬ誘導性ＭＯＳ殺傷の定量。共培養をＭＯＳ確立後の第３日に開始し、９６時間までイメージを取得した。ＮＩＲチャネルの平均積分蛍光強度（ＮＩＲＣＵ×μｍ^２）は、ＮＩＲ６８０色素で標識された生存腫瘍細胞からのものであった。ＭＯＳのみの群に対してデータを正規化した。

【図20】ＨＬＡ篏合（Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）の必要性はＣ－ＴＩＬ０５１媒介性ＭＯＳ殺傷の特異性を示した。Ｃ－ＴＩＬ０５１ ＲＥＰ ＴＩＬと自己ＭＯＳとの共培養を、示されているＨＬＡ遮断抗体の存在下または非存在下、５：１のエフェクター：標的比で行い、９６時間まで分析した。ＮＩＲチャネルの平均積分蛍光強度（ＮＩＲＣＵ×μｍ^２）は、ＮＩＲ６８０色素で標識された生存腫瘍細胞からのものであった。示されているデータは、ＭＯＳのみの群に対して正規化されている。

【図21-1】ＨＬＡクラスＩおよびＩＩの遮断はＣ－ＴＩＬ０５１と自己ＭＯＳとの共培養におけるサイトカインの産生を減少させた。Ｃ－ＴＩＬ０５１：本発明方法の実施形態によって生成されたＴＩＬ。

【図21-2】ＨＬＡクラスＩおよびＩＩの遮断はＣ－ＴＩＬ０５１と自己ＭＯＳとの共培養におけるサイトカインの産生を減少させた。Ｃ－ＴＩＬ０５１：本発明方法の実施形態によって生成されたＴＩＬ。

【0036】

詳細な説明
本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖させる方法を提供する。本発明の方法は、フィーダー細胞、例えばＰＢＭＣを使用する必要がない。照射ＰＢＭＣを使用して生成／増殖されたＴＩＬと比較して、本発明方法を使用して生成／増殖されたＴＩＬは、ＣＤ８ ＴＩＬの優先的増殖を伴い、ＴＩＬ上のＰＤ－１のような疲弊マーカーの、低い表面レベルを維持する。特に、本発明方法を使用して生成／増殖されたＴＩＬは、（１）比較的高いＣＤ８／ＣＤ４比を維持し、（２）ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞における、Ｔｎａｉｖｅ／ｓｃｍおよびＴｃｍの、より高い割合を有し、（３）ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上のＰＤ－１の、低減した陽性率を示す。本発明の方法は、高いＣＤ８／ＣＤ４比を有するＴＩＬを迅速に増殖させることが可能であり、より高いＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞割合、低減した疲弊および増強したメモリーを有するＴＩＬを生成させることが可能である。したがって、本発明の方法によって生成されるＴＩＬは、癌免疫療法に対して、より有効である。

【0037】

また、本開示は、集中化（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ）製造プロセスを用いて、Ｔ細胞の異種レパートリーを維持しながらエクスビボで増殖可能であり腫瘍抗原を認識しうる腫瘍－組織Ｔ細胞を使用する自己ＴＩＬ療法をも含む。

【0038】

特定の実施形態においては、本発明の細胞は、患者の腫瘍サンプルから採取された自己ＴＩＬを含有する。腫瘍を最初に断片化し、高用量ＩＬ－２において培養して、ＴＩＬの放出および増殖を促進させる。腫瘍組織からのＴＩＬを増殖させるこの初期段階は、プレ急速増殖プロトコル（プレＲＥＰ）と称される。この初期エクスビボ培養の後、ＴＩＬを、治療用量に達するまで急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）で更に増殖させることが可能である。

【0039】

本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖させる方法を提供する。該方法は、（ａ）第１の細胞培養培地内で第１の細胞集団を培養して第２の細胞集団を生成させること（ここで、第１の細胞集団は患者からの腫瘍サンプルから得られる）、および、（ｂ）第２の細胞培養培地内で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスと、第２の細胞集団を接触させて、第３の細胞集団を生成させること（ここで、第２の細胞培養培地は約１００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む）を含みうる。

【0040】

該方法は、第１の増殖［プレＲＥＰ、または本方法の工程（ａ）］の後に第２の細胞集団を凍結保存することを更に含みうる。次いで、凍結保存された第２の細胞集団を解凍し、第２の増殖［ＲＥＰ、または本方法の工程（ｂ）、例えば、第２の細胞培養培地内で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスと接触させること］に付すことが可能である。第２の細胞集団は、解凍後直ちに第２の増殖［ＲＥＰ、または本方法の工程（ｂ）］に付されうる。第２の細胞集団は、２日間未満、４８時間未満、４０時間未満、３６時間未満、３０時間未満、２４時間未満、２０時間未満、１５時間未満、１２時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満または１時間未満回収された後、第２の増殖［ＲＥＰ、または本方法の工程（ｂ）］に付されうる。

【0041】

第２の細胞集団（これはプレＲＥＰ ＴＩＬを含む）は、患者の疾患の進行の間、凍結保存されうる。患者の疾患の進行の後、プレＲＥＰ ＴＩＬを解凍し、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）に従い増殖させる。

【0042】

凍結され解凍された細胞製品の場合、解凍細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスと接触させることが可能であり、あるいは一晩放置後に活性化させることが可能である。あるいは、解凍細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスと接触させることが可能であり、あるいは、一晩放置することなく直ちに活性化させることが可能である。１つの実施形態においては、凍結細胞を水浴内で３７℃で急速解凍する。

【0043】

ＴｒａｎｓＡｃｔと第２の細胞培養培地（または第２の増殖のための細胞培養培地、またはＲＥＰ細胞培養培地）との体積比は、約１：２００～約１：２、約１：１８０～約１：２、約１：１５０～約１：５、約１：１２０～約１：５、約１：１００～約１：８、約１：８０～約１：８、約１：５０～約１：１０、約１：４０～約１：１０、約１：３０～約１：１０、約１：２０～約１：１０、約１：２０～約１：１５、または約１：１７．５の範囲でありうる。特定の実施形態においては、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）は、ヒト化組換えＣＤ３およびＣＤ２８アゴニスト（例えば、抗体）に共有結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスであるＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を使用する。１つの実施形態においては、１７．５ｍＬの最終体積のＲＥＰ細胞培養培地に対して１ｍＬのＴｒａｎｓＡｃｔが使用されうる。次いで、ＲＥＰ ＴＩＬを洗浄し、配合し、および／または凍結保存する。

【0044】

「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」は、対象の血流を離れて腫瘍内に移動した白血球として元々得られた細胞集団を意味しうる。ＴＩＬには、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔｈ１およびＴｈ１７ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞およびマクロファージが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＴＩＬは腫瘍浸潤Ｔ細胞を含みうる（または腫瘍浸潤Ｔ細胞でありうる）。ＴＩＬには、一次ＴＩＬおよび二次ＴＩＬの両方が含まれる。一次ＴＩＬは、本明細書に記載されている患者組織サンプルから得られるものである。二次ＴＩＬは、本明細書に記載されているとおりに増加または増殖した任意のＴＩＬ細胞集団であり、バルクＴＩＬおよび増殖ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」または「ＲＥＰ後ＴＩＬ」）を包含するが、これらに限定されるものではない。ＴＩＬ細胞集団には、遺伝的に修飾されたＴＩＬが含まれうる。ＴＩＬは一般に、細胞表面マーカーを用いて生化学的に定義可能であり、あるいは、腫瘍に浸潤し治療をもたらすそれらの能力によって機能的に定義可能である。ＴＩＬは一般に、以下のバイオマーカーの１以上の発現によって分類されうる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲα／β、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、４－１ＢＢおよびＣＤ２５。追加的または代替的に、ＴＩＬは、患者内への再導入に際して固形腫瘍に浸潤するそれらの能力によって機能的に定義されうる。Ｆｉｓｈｅｒら，Ｔｕｍｏｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｄｉｕｍ－１１１ ｌａｂｅｌｅｄ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９８９，７（２）：２５０－６１。

【0045】

「ＩＬ－２」（または「ＩＬ２」）なる語は、インターロイキン－２として公知のＴ細胞増殖因子を意味し、ヒトおよび哺乳類の形態、保存的アミノ酸置換、糖形態（グリコフォーム）、バイオシミラーおよびそれらの変異体を含むＩＬ－２の全形態を含む。ＩＬ－２は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，３９８３－８８およびＭａｌｅｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，４５３－７９（これらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。ＩＬ－２はアルデスロイキン（プロロイキン（登録商標））のようなヒト組換え形態のＩＬ－２、および組換えＩＬ－２の形態を包含しうる。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は非グリコシル化ヒト組換え形態のＩＬ－２である。ＩＬ－２は、ペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４を含むペグ化形態のＩＬ－２をも包含しうる。本発明における使用に適したコンジュゲート化ＩＬ－２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、第５，２０６，３４４号、第５，０８９，２６１号および第４，９０２，５０２号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。本発明における使用に適したＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

【0046】

第１の増殖（プレＲＥＰ）は、第１のガス透過性表面領域を有する密閉容器内で行われうる。第２の増殖（ＲＥＰ）は、第２のガス透過性表面領域を有する密閉容器内で行われうる。幾つかの実施形態においては、密閉容器は、単一のバイオリアクターを含む（または単一のバイオリアクターである）。幾つかの実施形態においては、密閉容器は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）容器および／またはＸｕｒｉ（商標）細胞バッグを含みうる（またはそれらである）。幾つかの実施形態においては、密閉容器は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置および／またはＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターである。幾つかの実施形態においては、密閉容器は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍおよび／またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍを含む（またはそれらである）。幾つかの実施形態においては、密閉容器は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍおよび／またはＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターを含む（またはそれらである）。特定の実施形態においては、本方法（例えば、プレＲＥＰおよび／またはＲＥＰ ＴＩＬ培養プロセスにおけるもの）は、ＴＩＬ培養容器としてのガス透過性急速増殖（Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標））装置の使用を含む。１つの実施形態においては、ＴＩＬをガス透過性バッグ内で増殖させる。１つの実施形態においては、ガス透過性バッグ、例えばＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクター内でＴＩＬを増殖させる細胞増殖系を使用して、ＴＩＬを増殖させる。１つの実施形態においては、ガス透過性バッグ、例えば、Ｘｕｒｉ（商標）細胞増殖系Ｗ５としても公知のＷＡＶＥバイオリアクター系内でＴＩＬを増殖させる細胞増殖系を使用して、ＴＩＬを増殖させる。１つの実施形態においては、細胞増殖系は、ガス透過性細胞バッグを含む。１つの実施形態においては、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）フラスコ内でＴＩＬを増殖させることが可能である。

【0047】

幾つかの実施形態においては、腫瘍断片が得られた時点から、患者への投与または凍結保存のためにＴＩＬの準備が整うまで、閉鎖系は１つの容器を使用する。２つの容器を使用する幾つかの実施形態においては、第１の容器は、閉鎖されたＧ－Ｒｅｘ（登録商標）容器であり、第１の閉鎖Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）容器を開けることなくＴＩＬの集団を遠心分離し、輸液バッグに移す。

【0048】

本開示はまた、本発明方法によって得られる腫瘍浸潤リンパ球をも提供する。

【0049】

また、本開示は、以下のもの、すなわち、
（ｉ）ＣＤ３^＋細胞約３％～約８８％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉ）ＣＤ３^＋細胞約１０％～約９６％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉｉ）ＣＤ４^＋細胞約５０％～約８８％の範囲の割合のＣＤ４^＋ Ｔ_ＣＭ Ｔ細胞、
（ｉｖ）ＣＤ８^＋細胞約２８％～約８２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ Ｔ_ＣＭ Ｔ細胞、
（ｖ）ＣＤ４^＋細胞約１１％～約４９％の範囲の割合のＣＤ４^＋ Ｔ_ＥＭ Ｔ細胞、
（ｖｉ）ＣＤ８^＋細胞約１１％～約６１％の範囲の割合のＣＤ８^＋ Ｔ_ＥＭ Ｔ細胞
のうちの１以上を含む、腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された、または腫瘍浸潤リンパ球から増殖した細胞集団をも含み、ここで、細胞集団は７０％以上の生細胞を含み、細胞集団は患者からの腫瘍サンプルから生成される。

【0050】

特定の実施形態においては、細胞集団は生細胞における８０％以上のＣＤ３^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0051】

特定の実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約１０％～約５１％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ２７^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0052】

特定の実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ８^＋細胞約１２％～約７２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0053】

特定の実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ８^＋細胞約３４％～約９５％の範囲の割合のＣＤ８^＋ＣＤ２８^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0054】

特定の実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約８２％～約１００％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ２８^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0055】

特定の実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約０．２％～約５．８％の範囲の割合のＣＤ４^＋ ４－１ＢＢ^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0056】

特定の実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ８^＋細胞約０．２％～約１１．６％の範囲の割合のＣＤ８^＋ ４－１ＢＢ^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0057】

特定の実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約０．２％～約１９．５％の範囲の割合のＣＤ４^＋ ＬＡＧ３^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0058】

特定の実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ８^＋細胞約６％～約５１．２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ ＬＡＧ３^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0059】

特定の実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ４^＋細胞約０．９％～約３１％の範囲の割合のＣＤ４^＋ ＰＤ１^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0060】

特定の実施形態においては、細胞集団はＣＤ８^＋細胞約１％～約１８％の範囲の割合のＣＤ８^＋ ＰＤ１^＋ Ｔ細胞を含みうる。

【0061】

特定の実施形態においては、細胞集団は、１０％以下のＣＤ５６^＋ ＮＫ細胞を含みうる。

【0062】

本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖させる方法によって生成される細胞集団を提供する。該方法は、（ａ）第１の細胞培養培地内で第１の細胞集団を培養して第２の細胞集団を生成させること（ここで、第１の細胞集団は患者からの腫瘍サンプルから得られる）、および、（ｂ）第２の細胞培養培地内で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスと、第２の細胞集団を接触させること（ここで、第２の細胞培養培地は約１００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む）を含みうる。

【0063】

本開示は、腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された細胞集団を増殖させる方法を提供する。該方法は、（ａ）患者からの腫瘍サンプルから得られた細胞を培養すること、（ｂ）該培養細胞を処理して、腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された細胞集団を生成させることを含み、ここで、細胞集団は、以下のもの、すなわち、
（ｉ）ＣＤ３^＋細胞約３％～約８８％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉ）ＣＤ３^＋細胞約１０％～約９６％の範囲の割合のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、
（ｉｉｉ）ＣＤ４^＋細胞約５０％～約８８％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^＋セントラルメモリーＴ細胞、
（ｉｖ）ＣＤ８^＋細胞約２８％～約８２％の範囲の割合のＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^＋セントラルメモリーＴ細胞、
（ｖ）ＣＤ４^＋細胞約１１％～約４９％の範囲の割合のＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^－エフェクターメモリーＴ細胞、および
（ｖｉ）ＣＤ８^＋細胞約１１％～約６１％の範囲の割合のＣＤ８^＋ Ｔ ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^－エフェクターメモリーＴ細胞
のうちの１以上を含む。

【0064】

本開示はまた、本発明方法によって得られる腫瘍浸潤リンパ球に関して富化された細胞集団を提供する。

【0065】

本方法は、任意の適切な細胞培養培地を使用しうる。特定の実施形態においては、本方法は１以上のタイプの細胞培養培地を使用する。使用されうる細胞培養培地には、ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｌ－グルタミン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩および１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン硫酸塩）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＲＰＭＩ １６４０培地が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0066】

ＩＬ－２の濃度（第１の培養培地または第２の培養培地におけるもの）は、約１０００ ＩＵ／ｍＬ～約１００００ ＩＵ／ｍＬ、約２０００ ＩＵ／ｍＬ～約１００００ ＩＵ／ｍＬ、約３０００ ＩＵ／ｍＬ～約１００００ ＩＵ／ｍＬ、約４０００ ＩＵ／ｍＬ～約１００００ ＩＵ／ｍＬ、約５０００ ＩＵ／ｍＬ～約１００００ ＩＵ／ｍＬ、約２０００ ＩＵ／ｍＬ～約８０００ ＩＵ／ｍＬ、約３０００ ＩＵ／ｍＬ～約７０００ ＩＵ／ｍＬ、または約４０００ ＩＵ／ｍＬ～約６０００ ＩＵ／ｍＬでありうる。ＩＬ－２の濃度（第１の培養培地または第２の培養培地におけるもの）は、約６０００ ＩＵ／ｍＬでありうる。ＩＬ－２の濃度（第１の培養培地または第２の培養培地におけるもの）はまた、約２０００ ＩＵ／ｍＬ、３０００ ＩＵ／ｍＬ、４０００ ＩＵ／ｍＬ、５０００ ＩＵ／ｍＬ、６０００ ＩＵ／ｍＬ、７０００ ＩＵ／ｍＬ、８０００ ＩＵ／ｍＬ、９０００ ＩＵ／ｍＬまたは最大約１００００ ＩＵ／ｍＬでありうる。

【0067】

ＴＩＬを増殖させたら、それらの特性および／または機能、例えば腫瘍反応性を決定するために、それらをインビトロアッセイに付すことが可能である。例えば、ＴＩＬは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５８の発現に関するＦＡＣＳによって評価されうる。ＴＩＬはまた、共培養、細胞傷害、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにも付されうる。

【0068】

腫瘍サンプルは、任意の哺乳動物から採取されうる。本発明の細胞または医薬組成物は、任意の哺乳動物を治療するために使用されうる。哺乳動物はヒトまたは非ヒト霊長類でありうる。哺乳動物にはまた、ウサギのようなウサギ目、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目、ウシ属（ウシ）およびブタ（豚）を含む偶蹄目、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物も含まれるが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、非ヒト霊長類、例えば、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄ）もしくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄ）（サル）の非ヒト霊長類、または類人猿目（ヒトおよび類人猿）の非ヒト霊長類であることが好ましい。幾つかの実施形態においては、哺乳動物は齧歯目の哺乳動物、例えばマウスおよびハムスターでありうる。

【0069】

腫瘍サンプルの入手
一般に、まず、患者の腫瘍サンプルからＴＩＬ（第１の細胞集団）を得、次いで、本明細書に記載されている更なる操作のための、より大きな集団へと増殖させ、所望により、凍結保存する。

【0070】

ＴＩＬは、腫瘍サンプル、または癌に罹患した組織もしくは器官から増殖されうる。幾つかの実施形態においては、腫瘍断片からＴＩＬを得る。幾つかの実施形態においては、腫瘍（サンプル）は、非癌組織または壊死領域から切り取られうる。患者の腫瘍サンプルは、当技術分野で公知の方法、例えば外科的切除、針生検、または腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含有するサンプルを得るための他の手段を用いて得られうる。腫瘍サンプルが得られたら、それは、（例えば、鋭利な切開を用いて）小さな断片へと断片化されうる。第１の細胞集団は、患者（または複数の患者）からの１つまたは複数の腫瘍断片でありうる。第１の細胞集団は、患者から切除された腫瘍からの１つまたは複数の腫瘍断片から得られうる。腫瘍を破壊するための方法は、機械的断片化方法、例えば、腫瘍組織の粉砕、薄片化、分割および細分化、ならびに腫瘍組織の物理的構造を破壊するための任意の他の方法を含みうる。

【0071】

幾つかの実施形態においては、腫瘍断片は、約１ｍｍ^３～５０ｍｍ^３、約１ｍｍ^３～４５ｍｍ^３、約１ｍｍ^３～４０ｍｍ^３、約１ｍｍ^３～３５ｍｍ^３、約１ｍｍ^３～３０ｍｍ^３、約１ｍｍ^３～２５ｍｍ^３、約１ｍｍ^３～２０ｍｍ^３、約１ｍｍ^３～１５ｍｍ^３、約１ｍｍ^３～１０ｍｍ^３、約１ｍｍ^３～８ｍｍ^３、約２ｍｍ^３～３ｍｍ^３、約１ｍｍ^３、約２ｍｍ^３、約３ｍｍ^３、約４ｍｍ^３、約５ｍｍ^３、約６ｍｍ^３、約７ｍｍ^３、約８ｍｍ^３、約９ｍｍ^３、約１０ｍｍ^３、約１２ｍｍ^３、約１５ｍｍ^３、約１８ｍｍ^３、約２０ｍｍ^３、約２５ｍｍ^３、または約３０ｍｍ^３である。幾つかの実施形態においては、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片の体積は約８ｍｍ^３～約２７ｍｍ^３の体積を有する。幾つかの実施形態においては、複数の断片は、約１３００ｍｍ^３～約１５００ｍｍ^３の総体積を有する約３０～約６０個の断片を含む。幾つかの実施形態においては、複数の断片は、約１３５０ｍｍ^３の総体積を有する約５０個の断片を含む。幾つかの実施形態においては、複数の断片は、約１グラム～約１．５グラムの総質量を有する約５０個の断片を含む。

【0072】

幾つかの実施形態においては、腫瘍は、各次元において約２～３ｍｍへと断片化されうる。幾つかの場合には、腫瘍は、各次元において約０．５ｍｍ～約５ｍｍ、約１ｍｍ～約２ｍｍ、約２ｍｍ～約３ｍｍ、約３ｍｍ～約４ｍｍ、または約４ｍｍ～約５ｍｍへと断片化されうる。

【0073】

ＴＩＬは、酵素による腫瘍消化物を用いて、これらの腫瘍断片から培養されうる。そのような腫瘍消化物は、酵素（例えば、ＤＮａｓｅおよびコラーゲナーゼ）含有培地内でのインキュベーションおよびそれに続く機械的分離（例えば、組織分離装置を使用するもの）によって生成されうる。幾つかの実施形態においては、断片化は物理的断片化（例えば、解剖）および／または消化を含む。

【0074】

該方法は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法によって腫瘍サンプルからＴ細胞のバルク集団を得ることを含みうる。例えば、腫瘍サンプルを細胞懸濁液に分離し、そこから特定の細胞集団を選択することによって、腫瘍サンプルからＴ細胞のバルク集団が得られうる。Ｔ細胞のバルク集団を得るための適切な方法は、腫瘍を機械的に分離する（例えば、細かく刻む）こと、腫瘍を酵素によって分離する（例えば、消化する）こと、および吸引する（例えば、針を使用する）ことのいずれか１以上を含みうるが、これらに限定されるものではない。

【0075】

特定の実施形態においては、腫瘍サンプルは、原発性腫瘍、浸潤性腫瘍または転移性腫瘍を含む固形腫瘍からのものである。固形腫瘍は良性または悪性でありうる。「固形腫瘍癌」なる語は、悪性、腫瘍性または癌性の固形腫瘍を意味する。固形腫瘍には、肉腫、肝細胞癌、神経膠腫、頭頸部癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、肛門管癌、肛門直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、中耳癌、口腔癌、外陰部癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸癌、下咽頭癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、腹膜癌、大網癌、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、膀胱癌またはそれらの組合せが含まれうる。幾つかの実施形態においては、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵臓癌、膀胱癌、乳癌および非小細胞肺癌から選択される。

【0076】

腫瘍サンプルはまた、血液悪性疾患から得られた腫瘍のような液性腫瘍でありうる。

【0077】

ＴＩＬは、胎児、新生児、若年者および成体（これらに限定されるものではない）を含む任意の発達段階のドナーからの腫瘍サンプルから増殖されうる。

【0078】

次いで、腫瘍断片は、培地および細胞刺激物質、例えばサイトカインを使用して、インビトロで培養されうる。幾つかの場合には、腫瘍断片からＴＩＬを増殖させるために、ＩＬ－２が使用されうる。

【0079】

第１の増殖（プレＲＥＰ）
本方法により増殖されたプレＲＥＰ ＴＩＬは、顕著に低下したＣＤ８／ＣＤ４比を伴うことなくＲＥＰ ＴＩＬを生成しうる。このプレＲＥＰ ＴＩＬは、ＲＥＰ ＴＩＬにおける疲弊マーカーＰＤ－１の発現レベルを低く維持しながら増殖されうる。

【0080】

第１の増殖（プレＲＥＰ、該方法の工程（ａ））においては、第１の細胞培養培地は、約１，０００ ＩＵ／ｍＬ～約１０，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約１，０００ ＩＵ／ｍＬ～約９，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約１，０００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約２，０００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約２，０００ ＩＵ／ｍＬ～約７，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約２，０００ ＩＵ／ｍＬ～約６，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約２，０００ ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約２，０００ ＩＵ／ｍＬ～約４，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約２，０００ ＩＵ／ｍＬ～約３，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約３，０００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約３，０００ ＩＵ／ｍＬ～約７，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約３，０００ ＩＵ／ｍＬ～約６，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約３，０００ ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約４，０００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約２，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約３，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約４，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約５，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２または約１０，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含みうる。特定の実施形態においては、第１の細胞培養培地は、約３，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含みうる。特定の実施形態においては、第１の細胞培養培地は、約５，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含みうる。特定の実施形態においては、第１の細胞培養培地は、約６，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含みうる。特定の実施形態においては、第１の細胞培養培地は、約７，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含みうる。特定の実施形態においては、第１の細胞培養培地は、約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含みうる。

【0081】

第１の増殖（プレＲＥＰ、該方法の工程（ａ））においては、第１の細胞集団は、約３日間～約６０日間、約５日間～約５０日間、約７日間～約４０日間、約１０日間～約４０日間、約１０日間～約３０日間、約１０日間～約２０日間、約１０日間～約１８日間、約１０日間～約１７日間、約１０日間～約１６日間、約１２日間～約１５日間、約１２日間～約１４日間、約１３日間～約１４日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間または約２０日間培養されうる（第１の増殖はそれらの期間にわたって継続されうる）。特定の実施形態においては、第１の細胞集団は、約１４日間培養される。特定の実施形態においては、第１の増殖は約１４日間継続される。

【0082】

第１の増殖（プレＲＥＰ、該方法の工程（ａ））においては、第１の細胞集団が約２または３日間（第０日が第１の細胞集団の培養を開始する日である場合には、第３日またはその前後）、約３または４日間（第４日またはその前後）、約４または５日間（第５日またはその前後）、約５または６日間（第６日またはその前後）、約６または７日間（第７日またはその前後）、約７または８日間（第８日またはその前後）、約８または９日間（第９日またはその前後）、約９または１０日間（第１０日またはその前後）、約１０または１１日間（第１１日またはその前後）、約１１または１２日間（第１２日またはその前後）、約１２または１３日間（第１３日またはその前後）、あるいは約１３または１４日間（第１４日またはその前後）培養されたら、細胞培養培地が１回、２回、３回または４回添加（または交換）されうる。特定の実施形態においては、第１の増殖（プレＲＥＰ、該方法の工程（ａ））においては、細胞培養培地は、第９日またはその前後（第１の細胞集団が約８日間または９日間培養された際）に１回添加される。特定の実施形態においては、第１の増殖（プレＲＥＰ、該方法の工程（ａ））においては、細胞培養培地は、第１０日またはその前後（第１の細胞集団が約９日間または１０日間培養された際）に１回添加される。特定の実施形態においては、第１の増殖（プレＲＥＰ、該方法の工程（ａ））においては、細胞培養培地は第１１日またはその前後（第１の細胞集団が約１０日間または１１日間培養された際）に１回添加される。

【0083】

特定の実施形態においては、第１の増殖（プレＲＥＰ、該方法の工程（ａ））においては、添加される細胞培養培地の体積は、細胞培養容器内の細胞培養（培地）の体積の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．２倍、約２．５倍、約２．７倍または約３倍である。

【0084】

第１の増殖（プレＲＥＰ、該方法の工程（ａ））の初期培養体積は、細胞培養容器／系の容積の約５％～約１００％、約１０％～約８０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約２０％～約８０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約２０％～約３０％、約２５％～約８０％、約２５％～約６０％、約２５％～約５０％、約２５％～約４０％、約２５％～約３０％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％または約６０％である。特定の実施形態においては、第１の増殖（プレＲＥＰ、該方法の工程（ａ））の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％または約４０％である。特定の実施形態においては、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ装置（底表面積１０ｃｍ^２、容積１００ｍＬ）の場合、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、３５ｍＬまたは４０ｍＬの初期培養体積が用いられる。特定の実施形態においては、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置（底表面積１００ｃｍ^２、容積１０００ｍＬ）の場合、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬまたは４００ｍＬの初期培養体積が用いられる。

【0085】

第１の増殖（プレＲＥＰ）は、ＴＩＬまたは細胞約１×１０^７～約１×１０^９個、ＴＩＬまたは細胞約２×１０^７～約９×１０^８個、ＴＩＬまたは細胞約３×１０^７～約８×１０^８個、ＴＩＬまたは細胞約４×１０^７～約６×１０^８個、ＴＩＬまたは細胞約５×１０^７～約５×１０^８個、ＴＩＬまたは細胞約６×１０^７～約４×１０^８個、ＴＩＬまたは細胞約８×１０^７～約３×１０^８個、ＴＩＬまたは細胞約９×１０^７～約２×１０^８個、ＴＩＬまたは細胞約９×１０^７～約１×１０^８個、あるいはＴＩＬまたは細胞約１×１０^８個の範囲の細胞またはＴＩＬの集団を生成しうる。

【0086】

第２の増殖（ＲＥＰ）
第２の増殖は一般に急速増殖プロセス（ＲＥＰ）と称される。本方法の第２の増殖はフィーダー細胞を使用しても使用しなくてもよい。１つの実施形態においては、本方法、または本方法の第２の増殖は、フィーダー細胞を使用しないプロセスである。

【0087】

第２の増殖（ＲＥＰ、該方法の工程（ｂ））においては、第２の細胞培養培地は、約５０ ＩＵ／ｍＬ～約１０，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約１００ ＩＵ／ｍＬ～約８，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約２００ ＩＵ／ｍＬ～約６，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約５００ ＩＵ／ｍＬ～約６，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約５００ ＩＵ／ｍＬ～約４，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約５００ ＩＵ／ｍＬ～約３，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８００ ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８００ ＩＵ／ｍＬ～約４，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約１，０００ ＩＵ／ｍＬ～約６，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、または約１，０００ ＩＵ／ｍＬ～約４，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含みうる。１つの実施形態においては、第２の細胞培養培地は約３，０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。

【0088】

第２の増殖（ＲＥＰ、該方法の工程（ｂ））においては、接触は、約３日間～約１７日間、約３日間～約６０日間、約５日間～約５０日間、約７日間～約４０日間、約１０日間～約４０日間、約１０日間～約３０日間、約１０日間～約２０日間、約１０日間～約１４日間でありうる。

【0089】

幾つかの実施形態においては、第２の増殖（ＲＥＰ、該方法の工程（ｂ））は、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間継続しうる。幾つかの実施形態においては、第２のＴＩＬ増殖は約７日間～約１４日間継続しうる。幾つかの実施形態においては、第２のＴＩＬ増殖は約８日間～約１４日間継続しうる。幾つかの実施形態においては、第２のＴＩＬ増殖は約９日間～約１４日間継続しうる。幾つかの実施形態においては、第２のＴＩＬ増殖は約１０日間～約１４日間継続しうる。幾つかの実施形態においては、第２のＴＩＬ増殖は約１１日間～約１４日間継続しうる。幾つかの実施形態においては、第２のＴＩＬ増殖は約１２日間～約１４日間継続しうる。幾つかの実施形態においては、第２のＴＩＬ増殖は約１３日間～約１４日間継続しうる。幾つかの実施形態においては、第２のＴＩＬ増殖は約１４日間継続しうる。

【0090】

第２の増殖（ＲＥＰ、該方法の工程（ｂ））においては、接触は、例えば、細胞を収容しうる任意の容器内で、好ましくは無菌環境中で、インビトロで行われうる。そのような容器は、例えば培養フラスコ、培養バッグ、バイオリアクター、または細胞を成長させるために使用されうる任意の装置（閉鎖細胞培養系または閉鎖容器におけるものを含む）でありうる。閉鎖系または容器はガス透過性表面領域を提供しうる。１つの実施形態においては、第２の増殖（ＲＥＰ、該方法の工程（ｂ））は、Ｔ－１７５フラスコ、ガス透過性バッグおよび／またはガス透過性培養系（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標））を使用して行われうる。幾つかの実施形態においては、第２の増殖（ＲＥＰ、該方法の工程（ｂ））は、閉鎖系または閉鎖系バイオリアクターにおいて行われる。幾つかの実施形態においては、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。１つの実施形態においては、第２の増殖は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍおよび／またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍにおいて行われうる。

【0091】

特定の実施形態においては、第３の細胞集団は、数において、第２の細胞集団より少なくとも１００倍多く、例えば、数において約１００倍～約２０００倍多く、数において約１００倍～約１８００倍多く、数において約１００倍～約１５００倍多く、数において約１００倍～約１２００倍多く、数において約１００倍～約１０００倍多く、数において約１００倍～約８００倍多く、数において約１００倍～約６００倍多く、または数において約１００倍～約５００倍多い。

【0092】

第３の細胞集団はＴＩＬの治療用集団でありうる。幾つかの実施形態においては、ＴＩＬの治療用集団は、ＴＩＬの治療有効投与量に十分なＴＩＬを含む。

【0093】

幾つかの実施形態においては、第３の細胞集団は、第２のＴＩＬ集団と比較して増加した、エフェクターＴ細胞および／またはセントラルメモリーＴ細胞の亜集団を含む。幾つかの実施形態においては、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団のＴＣＲレパートリーを、より高い度合で保存している。

【0094】

抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックス
特定の実施形態においては、本方法は、ＴＩＬを生成させ、増殖させ、活性化させ、および／または富化するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントを含むポリマーマトリックスを使用する。

【0095】

可撓性マトリックスは、コラーゲン、タンパク質、ペプチド、多糖、グリコサミノグリカンおよび／または細胞外マトリックス組成物を含む（または本質的にそれらからなる、またはそれらからなる）ことが可能である。多糖には、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸またはアルギナートが含まれる。他のポリマーには、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリビニルアセタート、ブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）またはポリウレタンが含まれうる。ポリマーは乳酸またはコポリマーでありうる。コポリマーは乳酸および／またはグリコール酸（ＰＬＧＡ）を含みうる。ポリマーマトリックスはポリマーデキストラン材料（またはデキストランのポリマー）を含む（または本質的にそれからなる、またはそれからなる）ことが可能である。

【0096】

ポリマーマトリックスは、４０，０００ダルトンの平均分子量を有しうる。

【0097】

ポリマーマトリックスは、磁性、常磁性、超常磁性ナノ結晶または蛍光染料（例えば、ポリマーマトリックス内に包埋されているもの）を含んでいても含んでいなくてもよい。

【0098】

ポリマーマトリックスは、１μｍ未満、５００ｎｍ未満または２００ｎｍ未満のサイズを有しうる。ポリマーマトリックスは約１ｎｍ～約５００ｎｍ、または約１０ｎｍ～約２００ｎｍのサイズを有しうる。

【0099】

抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントと、抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとは、同じポリマーマトリックスに結合されることが可能であり、または別々のポリマーマトリックスに結合されることが可能である。抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントと、抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとは、当技術分野で公知の種々の方法によって、ポリマーマトリックスに結合またはカップリングされうる。結合は共有もしくは非共有結合、静電的結合または疎水性結合でありうる。結合は、化学的、機械的、酵素的または他の適切な手段を含む種々の結合手段によって達成されうる。抗体またはそのフラグメントは最初に直接的または間接的にマトリックスに結合されうる。例えば、抗体またはそのフラグメントは、最初に、アビジン（またはストレプトアビジン）およびビオチン系を介してマトリックスに結合されうる。抗体またはそのフラグメントは、例えば抗アイソタイプ抗体を介して、間接的にマトリックスに結合されうる。もう１つの例は、抗体またはそのフラグメントに結合させるために、マトリックスに結合するタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇまたは他の非特異的抗体結合性分子を使用することを含む。あるいは、抗体またはそのフラグメントはマトリックスへの架橋のような化学的手段によってマトリックスに結合されうる。

【0100】

抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、キメラ抗体、ハプテンならびに抗体フラグメント、ならびに抗原上のエピトープに特異的に結合するという点での抗体等価体である分子でありうる。「抗体」なる語は、任意のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合性部分、例えば、Ｆ（ａｂ）およびＦｖフラグメント、例えばｓｃＦｖ、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびＦａｂ発現ライブラリー（これらに限定されるものではない）を含む。特定の実施形態においては、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体は、モノクローナル抗体でありうる。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても公知のＯＫＴ－３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、ＣＤ３εおよびＴ３としても公知のＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブおよびビシリズマブが含まれる。

【0101】

抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントと抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメント（同じポリマーマトリックスに結合しているもの、または別々のポリマーマトリックスに結合しているもの）との比は、約１００：１～約１：１００、約１０：１～約１：１０、または約２：１～約１：２の範囲でありうる。抗ＣＤ３抗体もしくはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体もしくはそのフラグメントは、マトリックス１ｍｇ当たり２５μｇを超える、またはマトリックス１ｍｇ当たり５０μｇを超える高密度で、同じまたは別々のマトリックスに結合されうる。

【0102】

１つの実施形態においては、ポリマーマトリックスはＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）である。米国特許第１０，５１３，６８７号。

【0103】

特定の実施形態においては、ポリマーマトリックスと細胞との比は、１００：１より大きい、５００：１より大きい、または１０００：１より大きいことが可能である。

【0104】

医薬組成物
本開示は、本発明の細胞／ＴＩＬまたは細胞集団を含む医薬組成物を提供する。本医薬組成物は、本発明の細胞または細胞集団と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含みうる。薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤には、適切な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤ならびに不活性成分が含まれうる。追加的な活性医薬成分、例えば他の薬物も、記載されている組成物および方法に組み入れられうる。注射用の細胞のための適切な薬学的に許容される担体には、例えば、任意の等張性担体、例えば生理食塩水（水中の約０．９％ ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中の約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、または水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、または水中の約５％のデキストロースが含まれうる。１つの実施形態においては、薬学的に許容される担体はヒト血清アルブミンで補足される。本開示の組成物は、静脈内投与用に製剤化（処方）されうる。１つの実施形態においては、医薬組成物は無菌バッファー中のＴＩＬまたは細胞の懸濁液である。

【0105】

本発明の細胞または医薬組成物は、例えば過剰増殖性障害のような疾患の治療方法において使用されうる。また、それらは他の障害の治療においても使用されうる。幾つかの実施形態においては、過剰増殖性障害は癌である。

【0106】

本発明の細胞または細胞集団は、癌の治療または予防方法において使用されうる。この点に関して、本開示は、哺乳動物において癌を治療または予防するのに有効な量の本発明の医薬組成物、細胞または細胞集団を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌の治療または予防方法を提供する。本発明のもう１つの実施形態は、哺乳動物において癌を治療または予防するのに有効な量の本発明の細胞または細胞集団を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌の治療または予防方法を提供する。

【0107】

また、本開示は、癌を有する対象（例えば、哺乳動物）または患者の治療方法をも含む。該方法は、本発明のＴＩＬおよび／または本発明の細胞集団を対象または患者に投与することを含みうる。細胞／ＴＩＬは医薬組成物として患者に投与されうる。

【0108】

本発明の細胞または医薬組成物は、鼻腔内および経皮経路、動脈内経路、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植または吸入を含む任意の適切な経路によって投与されうる。本発明の細胞または医薬組成物は、注射または注入によって投与されうる。幾つかの実施形態においては、本発明の細胞または医薬組成物は、動脈内または静脈内投与（例えば、注入）によって投与される。他の適切な投与経路には、腹腔内、髄腔内およびリンパ内が含まれる。

【0109】

任意の適切な用量のＴＩＬが投与されうる。幾つかの実施形態においては、約２×１０^１０～約１５×１０^１０個のＴＩＬまたは細胞、約１×１０^１０～約５×１０^１０個のＴＩＬまたは細胞、約３×１０^１０～約１２×１０^１０個のＴＩＬまたは細胞、約４×１０^１０～約１０×１０^１０個のＴＩＬまたは細胞、約５×１０^１０～約８×１０^１０個のＴＩＬまたは細胞、約６×１０^１０～約８×１０^１０個のＴＩＬまたは細胞、約７×１０^１０～約８×１０^１０個のＴＩＬまたは細胞、約８×１０^１０個のＴＩＬまたは細胞、または約７×１０^１０個のＴＩＬまたは細胞が投与される。幾つかの実施形態においては、治療的有効投与量は、ＴＩＬまたは細胞約２×１０^１０～約１５×１０^１０個である。幾つかの実施形態においては、治療的有効投与量は、ＴＩＬまたは細胞約１×１０^１０～約５×１０^１０個である。幾つかの実施形態においては、治療的有効投与量は、ＴＩＬまたは細胞約３×１０^１０～約１２×１０^１０個である。幾つかの実施形態においては、治療的有効投与量は、ＴＩＬまたは細胞約４×１０^１０～約１０×１０^１０個である。幾つかの実施形態においては、治療的有効投与量は、ＴＩＬまたは細胞約５×１０^１０～約８×１０^１０個である。幾つかの実施形態においては、治療的有効投与量は、ＴＩＬまたは細胞約６×１０^１０～約８×１０^１０個である。幾つかの実施形態においては、治療的有効投与量は、ＴＩＬまたは細胞約７×１０^１０～約８×１０^１０個である。幾つかの実施形態においては、ＴＩＬの有効投与量は、約１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３および９×１０^１３個の細胞／ＴＩＬである。幾つかの実施形態においては、ＴＩＬの有効投与量は、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７、１×１０^７～５×１０^７、５×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～５×１０^８、１×１０^９～５×１０^９、５×１０^９～１×１０^１０、１×１０^１０～５×１０^１０、５×１０^１０～１×１０^１１、５×１０^１１～１×１０^１２、１×１０^１２～５×１０^１２、および５×１０^１２～１×１０^１３個の細胞／ＴＩＬの範囲である。特定の実施形態においては、約１×１０^９～約１×１０^１１個の細胞、または約５×１０^９～約９×１０^１０個の細胞が患者に投与される。細胞／ＴＩＬの数は、投与（例えば、注入）当たり細胞約１０×１０^６～約１０×１０^１１個、投与（例えば、注入）当たり細胞約１０×１０^９～約１０×１０^１１個、または投与（例えば、注入）当たり細胞１０×１０^７～約１０×１０^９個でありうる。ＴＩＬを含む医薬組成物は、１０^４～１０^１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０^５～１０^６、１０^５～１０^１０、１０^５～１０^１１、１０^６～１０^１０、１０^６～１０^１１、１０^７～１０^１１、１０^７～１０^１０、１０^８～１０^１１、１０^８～１０^１０、１０^９～１０^１０、または１０^９～１０^１０細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の投与量で投与されうる。

【0110】

本発明の医薬組成物において提供されるＴＩＬは、広範な投与量範囲にわたって有効でありうる。厳密な投与量は、投与経路、投与速度、障害または状態の重症度、治療すべき対象の性別および年齢、ならびに治療すべき対象の体重によって左右されうる。適切な場合には、ＴＩＬの臨床的に確立された投与量が用いられうる。

【0111】

本発明の細胞または医薬組成物は、単一用量（単回投与）または複数用量（複数回投与）で投与されうる。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によって行われうる。幾つかの実施形態においては、本発明の細胞または医薬組成物は、単回の動脈内または静脈内注入として投与される。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回または６回超でありうる。投与は、１か月に１回、２週間に１回、１週間に１回、または２日に１回でありうる。ＴＩＬの投与は、必要な限り継続されうる。

【0112】

本発明の方法の目的においては、細胞集団が投与される場合、細胞は、哺乳動物にとって同種または自己のものである細胞でありうる。１つの実施形態においては、細胞は哺乳動物にとって自己のものである。

【0113】

本発明の細胞または医薬組成物によって治療される癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌［頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む］、腎臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌または他のタイプの癌でありうる。本発明の細胞または医薬組成物は、再発性または難治性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療するために使用されうる。癌は、肉腫（例えば、滑膜肉腫、骨肉腫、子宮平滑筋肉腫および胞状横紋筋肉腫）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、肝細胞癌、神経膠腫、頭頸部癌、急性リンパ性癌、急性骨髄性白血病、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、肛門管癌、肛門直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、中耳癌、口腔癌、外陰癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌（例えば、結腸癌腫）、食道癌、子宮頸癌、胃腸癌（例えば、胃腸カルチノイド腫瘍）、下咽頭癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、腹膜，大網および腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌および膀胱癌のいずれかを含む任意の癌でありうる。

【0114】

幾つかの実施形態においては、過剰増殖性障害は、固形腫瘍癌である。幾つかの実施形態においては、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌［頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む］、腎臓癌および腎細胞癌からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、過剰増殖性障害は、血液悪性疾患である。幾つかの実施形態においては、固形腫瘍癌は、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫である。

【0115】

１つの実施形態においては、患者における癌の治療方法は、本発明の細胞または医薬組成物の投与の前に、非骨髄破壊的化学療法で患者を前治療することを更に含む。１つの実施形態においては、非骨髄破壊的化学療法は、ＴＩＬ注入前にシクロホスファミドおよび／またはフルダラビンを投与することを含む。１つの実施形態においては、非骨髄破壊的化学療法およびＴＩＬ注入の後、患者はＩＬ－２の静脈内注入を受ける。

【0116】

数値に関する「約」なる語は、示されている数値の±１０％を指す。換言すれば、数値は、示されている値の９０％から、示されている値の１１０％までの範囲でありうる。

【0117】

これ以上詳細に説明しなくても、当業者は、前記の説明に基づいて、本開示を最大限に利用しうると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は単なる例示として解釈されるべきであり、本開示の残りの部分を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。本明細書中に引用されている全ての刊行物を、本明細書中で参照されている目的または主題に関して、参照により本明細書に組み入れることとする。

【0118】

実施例１：ＴＩＬプレＲＥＰプロセスの開発およびプレＲＥＰ ＴＩＬの特徴づけ
プレ急速増殖プロトコル（プレＲＥＰ）において、患者のＮＳＣＬＣ腫瘍サンプルから自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を採取した。腫瘍を最初に断片化し、高用量ＩＬ－２において培養して、ＴＩＬの放出および増殖を促進させた。この初期エクスビボ培養の後、ＴＩＬを、治療用量に達するまで急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）で更に増殖させることが可能である。本発明者らは、ＧＭＰ生産へと移行可能なプレＲＥＰ ＴＩＬ培養プセスを最適化した。

【0119】

標準治療後に患者の疾患の進行を待つ間、初期Ｔ細胞材料（プレＲＥＰ ＴＩＬ）は凍結保存されうる。患者の疾患の進行の後、プレＲＥＰ ＴＩＬは解凍され、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）によって増殖されうる。

【0120】

本発明者らの最適化プレＲＥＰ ＴＩＬ培養プロセスは、ＴＩＬ培養容器としてのガス透過性急速増殖（Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標））装置の使用を伴う。該プロセスは、更なる製造に適した高い細胞収量および好ましいＴ細胞表現型を有するプレＲＥＰ ＴＩＬを生成する堅牢なＧＭＰ製造プロセスを維持するために、より短い培養時間および培地交換頻度で行われる。培地は、第８日、第９日、第１０日および／もしくは第１１日［第０日は、細胞培養（第１の増殖またはプレＲＥＰ）が開始される日である］またはその前後に添加可能であり、プレＲＥＰ ＴＩＬは、第１２日、第１３日、第１４日、第１５日、第１６日もしくは第１７日またはその前後に回収されうる。最適化プロトコルを用いた場合、ＩＬ－２およびグルコースのレベルは十分なままであり、一方、成長阻害性代謝物である乳酸は、ＴＩＬ増殖に悪影響を及ぼさない低レベルである。本発明者らは、最適化後、腫瘍断片当たりに生成されたＴＩＬの平均数が、最適化前に生成されたＴＩＬ数より４倍以上高いことを実証し（それぞれ、１６．２９×１０^６±１０．５８×１０^６対３．１０×１０^６±３．５２×１０^６）、これは、全体的に優れているプレＲＥＰ ＴＩＬ収量を示した。プレＲＥＰ ＴＩＬはより早期の分化状態を示し、より高い割合のＣＤ２７^＋細胞、大部分を占めるＴセントラルメモリー（ＣＤ４^＋区画では６６．２８％±１２．８７％、ＣＤ８^＋区画では５９．０４％±１３．４７％；ｎ＝８）、および非常に低い割合のエフェクター細胞（ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞では、それぞれ、０．２６％±０．１９％および４．２７％±３．８５％；ｎ＝８）を含有する。また、回収された産物においては、Ｔ_Ｎ／Ｔ_ＳＣＭサブセットの割合も高く、このことは、より好ましいＴＩＬ特性を示している^１。

【0121】

１つの実施形態においては、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）は、ヒト化組換えＣＤ３およびＣＤ２８アゴニスト（例えば、抗体）に共有結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスであるＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を使用する。次いでＲＥＰ ＴＩＬを洗浄し、製剤化し、および／または凍結保存する。

【0122】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置内で増殖された断片化黒色腫腫瘍は、プレＲＥＰ中に、平均１４～１８日間の培養で、腫瘍断片当たり平均７．５１×１０^６個のＴＩＬを生成することが以前に示されていた^２。本発明者らのプレＲＥＰ製造目標細胞数は、以前の公開に基づく最小１×１０^９個のＴＩＬ目標用量および４００倍の推定ＲＥＰ増殖に基づいて、６×１０^７個のＣＤ３^＋ Ｔ細胞に設定された^３。プレＲＥＰ ＴＩＬの早期分化表現型の増殖および保存に有利な適切な条件は高品質の中間体を生成し、これは、高い治療可能性を有する最終的なＲＥＰ ＴＩＬ産物の製造を促進すると予想される^４，５。本研究は、早期分化表現型と短縮した培養時間とを伴うプレＲＥＰ ＴＩＬの高収量産物を生成させるために、主要培養条件を最適化することを目指した。

【0123】

方法
腫瘍採取
非小細胞肺癌腫瘍試料を採取した。ＮＳＣＬＣ試料を匿名化し、各ドナーに１つの識別番号を割り当てた。簡単に説明すると、切除腫瘍試料を４℃の組織保存溶液に浸し、手術後２４時間以内に発送した。腫瘍試料を、受領直後に、ＴＩＬの調製に移した。

【0124】

腫瘍の断片化および播種
一度に１つのみの腫瘍を処理し、腫瘍ごとに新たな組の材料および装置を使用した。

【0125】

腫瘍洗浄培地を洗浄用６ウェルプレートのウェルに加えた。腫瘍洗浄培地を腫瘍断片化用ペトリ皿に加えた。ピンセットを使用して、腫瘍をペトリ皿に移した。腫瘍を各次元で約２～３ｍｍの断片に切断した。断片化中に、壊死、出血および脂肪組織の領域を除去した。各腫瘍断片を洗浄して赤血球を除去した。腫瘍切片全体が切り分けられるまで、このプロセスを繰り返した。腫瘍断片の数を記録し、同じドナーからの断片を、同じ培養装置における培養のために組合せた。

【0126】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ装置の使用の場合、同一ドナーの１、２、３、４、５、６、７または８個の腫瘍断片を１つのＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ装置内に播種した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置の使用の場合、同一ドナーの最大１００個の腫瘍断片を１つのＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置内に播種した。

【0127】

プレＲＥＰ ＴＩＬの増殖
プレＲＥＰ ＴＩＬを、３００ ＩＵ／ｍＬ、１０００ ＩＵ／ｍＬ、３０００ ＩＵ／ｍＬまたは６０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で補足されたプレＲＥＰ基礎培地内で培養した。基礎培地はＲＰＭＩ－１６４０、ヒトＡＢ血清、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、β－ＭＥ（２－メルカプトエタノール）、ＧｌｕｔａＭａｘおよびゲンタマイシンを含む。

【0128】

腫瘍断片化後の第０日に、腫瘍断片をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ培養装置内に播種した。小規模のプレＲＥＰの場合、１０ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、５０ｍＬまたは１００ｍＬの初期培地体積で１～８個の断片をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ装置内に加えた。

【0129】

細胞数
細胞濃度、生存率およびサイズを、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ－２００（商標）系を使用して測定した。

【0130】

ＴＩＬ培養培地サンプルの採取
使用済み培地を細胞計数前に除去した場合には、後の分析のために、５００μＬの使用済み培地を－２０℃の冷凍庫に保存した。あるいは、細胞計数を行わなかった場合には、少量（毎回約５００μＬ）のプレＲＥＰ培養培地を培地表面付近から採取した。プレＲＥＰ段階中の示されている時点（例えば、第０日、第３日、第６日、第７日、第１０日および第１４日）にＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ装置またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置から培地を採取した。

【0131】

培養内のグルコースおよび乳酸の濃度の定量
培養上清におけるグルコースおよび乳酸の濃度をグルコース－Ｇｌｏアッセイおよび乳酸－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。

【0132】

ＥＬＩＳＡによるＩＬ－２濃度の定量
ＩＬ－２タンパク質濃度を定量するために、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．のＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットを使用した。サンプルを２通りまたは３通りのウェルにおいて測定した。データは平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として示されている。タンパク質濃度（ｐｇ／ｍＬ）をＩＵ／ｍＬに変換した（ＩＬ－２の場合、１ｎｇ／ｍＬ＝１６．３６ ＩＵ／ｍＬ）。

【0133】

フローサイトメトリー
細胞を、まず、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で染色し、次いで種々の表面マーカーに対する抗体で染色した。次いでＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸフローサイトメーターによってサンプルを得た。全てのデータをＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアで分析した。

【0134】

結果および分析
未熟なＴＩＬプロセスのフラスコおよびバッグの代替手段として、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）（ガス透過性急速増殖）は、免疫細胞を産生させるために特別に作製された製造プラットフォームであり、これは規模拡大（スケールアップ）、スケールアウトが容易であり、臨床試験に要求されるｃＧＭＰ条件に適合している。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０装置と２４ウェルプレートとにおいて培養された転移性黒色腫腫瘍を使用して、初期ＴＩＬ増殖（プレＲＥＰ）を比較した^２。本発明者らの研究においては、プレＲＥＰ ＴＩＬ培養容器としてＧ－Ｒｅｘ（登録商標）装置を使用した。

【0135】

本発明者らは、まず、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍを使用するプレＲＥＰのために、４つの釣り合った腫瘍サンプルセット（Ｔ５１０１００１、Ｔ５１０１００２、Ｔ５１０１００４およびＴ５１０１００５）を使用した。最終的なプレＲＥＰ細胞収量は４名のドナーに関して細胞（１５．６０±２５．０９）×１０^６個から（２７．５４±２２．６０）×１０^６個の範囲であった。

【0136】

プレＲＥＰ ＴＩＬの表現型決定は、ＴＩＬにおけるＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞の大部分が、エフェクター表現型Ｔ_ＥＭ（エフェクターメモリーＴ細胞）ではなく、セントラルメモリー表現型Ｔ_ＣＭ（セントラルメモリーＴ細胞）であることを示した。

【0137】

供給を最適化するために、プレＲＥＰ培養におけるグルコースおよび乳酸のレベルならびにＩＬ－２消費量を測定した。次に、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置（底表面積１００ｃｍ^２、容積１０００ｍＬ）を使用するために、プロセスをスケールアップした。３名のドナー（Ｔ５１０１００９、Ｔ５１０１０１０およびＴ５１０１０１３）のプレＲＥＰ培養を開始するために、腫瘍断片を使用した。Ｔ５１０１００９およびＴ５１０１０１０のプレＲＥＰ実施は、培養時間の決定の前に行い、培地の添加も交換も行うことなく、それぞれ第１７日および第２０日に停止させた。Ｔ５１０１０１３に関しては、細胞計数を行い、第８日、第９日、第１０日間もしくは第１日またはその前後に新鮮培地を添加した。Ｔ５１０１０１０およびＴ５１０１０１３においては、第６日の後、グルコースレベルが低下し始め、その場合、Ｔ５１０１００９と比較して著しい細胞増殖が認められた。Ｔ５１０１０１０による、より大きな乳酸産生が、第３日までに検出され、培養中の全体にわたって増加し続けた。Ｔ５１０１０１３に関しては、新鮮培地の添加が乳酸レベルの更なる増加を防いだようであった。そのような培地添加は、Ｔ細胞によって許容される低レベルに乳酸を維持するために、急速に増殖するＴＩＬを有するドナーにとって特に重要である。

【0138】

更に、プレＲＥＰ培養におけるＩＬ－２消費を評価した。ＩＬ－２タンパク質濃度をＥＬＩＳＡキットで測定し、濃度（ｐｇ／ｍＬ）をＩＵ／ｍＬに変換した（ＩＬ－２：１ｎｇ／ｍＬ＝１６．３６ ＩＵ／ｍＬ）。分析した２回のプレＲＥＰ実施の最初の６日間は、培養培地を変更したり添加したりしなかった。なぜなら、初期段階ではＴ細胞の総数が少なかったからである。しかし、第６日にＴ５１０１００１およびＴ５１０１００２の両方のプレＲＥＰ ＴＩＬの収量は２×１０^６未満であったが、ＩＬ－２レベルの約５０％の減少が尚も観察された。

【0139】

２４ウェルプレートにおける単一の腫瘍断片に由来するＴＩＬをＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ装置内に播種し、最初の６日間は培地の交換／添加を行わずに更に８日間培養した。Ｔ５１０１００１とＴ５１０１００２との両方の培養培地サンプルにおいて、６日後、ＩＬ－２レベルにおける、一貫した約５０％の減少を見出したが、それらの増殖は顕著に異なっていた（Ｔ５１０１００１ － ５×１０^６およびＴ５１０１００１ － １０×１０^６に関しては、それぞれ、５３．８倍および２０．３倍；Ｔ５１０１００２ － ５×１０^６およびＴ５１０１００２ － １０×１０^６に関しては、それぞれ、３．１８倍および３．５７倍）。したがって、Ｔ細胞増殖は、プレＲＥＰ ＴＩＬ培養におけるＩＬ－２濃度低下の決定要因ではないようであった。

【0140】

更に、プレＲＥＰ段階中のＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置におけるＩＬ－２消費を調べた（グルコースおよび乳酸測定に使用したのと同じサンプルセット）。この分析において、ドナーＴ５１０１００９とドナーＴ５１０１０１０とは、顕著に異なるプレＲＥＰ ＴＩＬ収量（２．２×１０^６対９３×１０^６）を示したが、プレＲＥＰ実施は同等のＩＬ－２減少曲線を示した。これら２つのドナーに関しては、プレＲＥＰ段階全体を通じて培地の交換／添加が行われなかったことは注目に値する。結果として、Ｔ細胞がどれだけ強力に増殖したとしても、第１４日に、元のＩＬ－２濃度の約２０％が残存した。

【0141】

プレＲＥＰの手順
第０日 － 腫瘍断片化および一次ＴＩＬ培養。簡潔に説明すると、腫瘍を各次元で約２～３ｍｍの断片へと切断し、壊死、出血および脂肪沈着を除去する。１０ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、５０ｍＬまたは１００ｍＬの初期培養体積中で、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ培養装置当たり１、２、３、４または５個の断片を培養する。１００個までの断片総数の場合、１００ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬまたは１０００ｍＬの初期培養体積で１～２個のＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ培養装置が使用されうる。３００ ＩＵ／ｍＬ、１０００ ＩＵ／ｍＬ、３０００ ＩＵ／ｍＬまたは６０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で補足された５００または１０００ｍＬのプレＲＥＰ基礎培地を使用して、プロセス全体の全プレＲＥＰ培養培地が第０日に調製されうる。１つの実施形態においては、ＩＬ－２濃度は３００ ＩＵ／ｍＬである。もう１つの実施形態においては、ＩＬ－２濃度は１０００ ＩＵ／ｍＬである。更にもう１つの実施形態においては、ＩＬ－２濃度は３０００ ＩＵ／ｍＬである。更にもう１つの実施形態においては、ＩＬ－２濃度は６０００ ＩＵ／ｍＬである。

【0142】

第８日、第９日、第１０日または第１１日 － 培地の添加または交換。第０日に調製されたプレＲＥＰ ＣＭ（培養培地）を使用前に室温または３７℃で温める。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０ＭまたはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置を使用する場合、初期プレＲＥＰ ＣＭの体積の１倍、２倍または３倍の総体積を各培養装置内に添加または交換する。ＴＩＬ培養の継続のために培養装置をインキュベーターに戻す。

【0143】

第１３日、第１４日、第１５日、第１６日または第１７日 － プレＲＥＰ ＴＩＬの回収。０．５％、０．７％、１％、１．５％、２％または５％のＨＳＡ溶液の最終濃度が得られるように、Ｐｌａｓｍａ－ＬｙｔｅＡ（注射用多価電解質）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を使用して、１００または２００ｍＬの回収溶液を調製する。ＴＩＬを手動で回収する。細胞懸濁液を集め、細胞ストレーナーで濾過する。全てのＴＩＬが回収されることが保証されるように、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置を２回洗浄する。

【0144】

細胞を２００、３００または４００ｇで４℃で１５分または３０分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁させ、Ｐｌａｓｍａ－ＬｙｔｅＡ中にＨＳＡを含有する回収溶液を使用して、一緒にする。ＮＣ２００自動細胞カウンターを使用して細胞計数を行い、細胞を凍結保存する。

【0145】

以下の培養条件を用いる。

【0146】

培養条件（Ａｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0147】

培養条件（Ａ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0148】

培養条件（Ａ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0149】

培養条件（Ａ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0150】

培養条件（Ａ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0151】

培養条件（Ａ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ（Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ）である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0152】

培養条件（Ａ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0153】

培養条件（Ａ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0154】

培養条件（Ａ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0155】

培養条件（Ａ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0156】

培養条件（Ａ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0157】

培養条件（Ａ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0158】

培養条件（Ａ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0159】

培養条件（Ａ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0160】

培養条件（Ａ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の量の細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0161】

培養条件（Ｂ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0162】

培養条件（Ｂ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0163】

培養条件（Ｂ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0164】

培養条件（Ｂ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0165】

培養条件（Ｂ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0166】

培養条件（Ｂ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ（Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ）である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0167】

培養条件（Ｂ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0168】

培養条件（Ｂ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0169】

培養条件（Ｂ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0170】

培養条件（Ｂ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0171】

培養条件（Ｂ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の量の細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0172】

培養条件（Ｂ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0173】

培養条件（Ｂ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0174】

培養条件（Ｂ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の量の細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0175】

培養条件（Ｂ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の量の細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0176】

培養条件（Ｃ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0177】

培養条件（Ｃ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0178】

培養条件（Ｃ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0179】

培養条件（Ｃ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0180】

培養条件（Ｃ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0181】

培養条件（Ｃ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0182】

培養条件（Ｃ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0183】

培養条件（Ｃ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0184】

培養条件（Ｃ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0185】

培養条件（Ｃ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0186】

培養条件（Ｃ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0187】

培養条件（Ｃ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0188】

培養条件（Ｃ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0189】

培養条件（Ｃ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0190】

培養条件（Ｃ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0191】

培養条件（Ｄ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖における初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0192】

培養条件（Ｄ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0193】

培養条件（Ｄ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0194】

培養条件（Ｄ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0195】

培養条件（Ｄ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0196】

培養条件（Ｄ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0197】

培養条件（Ｄ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0198】

培養条件（Ｄ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0199】

培養条件（Ｄ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0200】

培養条件（Ｄ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0201】

培養条件（Ｄ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0202】

培養条件（Ｄ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0203】

培養条件（Ｄ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0204】

培養条件（Ｄ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0205】

培養条件（Ｄ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１３日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0206】

培養条件（Ｅ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0207】

培養条件（Ｅ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0208】

培養条件（Ｅ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0209】

培養条件（Ｅ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0210】

培養条件（Ｅ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0211】

培養条件（Ｅ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0212】

培養条件（Ｅ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0213】

培養条件（Ｅ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0214】

培養条件（Ｅ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0215】

培養条件（Ｅ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0216】

培養条件（Ｅ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0217】

培養条件（Ｅ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0218】

培養条件（Ｅ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0219】

培養条件（Ｅ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0220】

培養条件（Ｅ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0221】

培養条件（Ｆ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0222】

培養条件（Ｆ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0223】

培養条件（Ｆ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0224】

培養条件（Ｆ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0225】

培養条件（Ｆ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0226】

培養条件（Ｆ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0227】

培養条件（Ｆ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0228】

培養条件（Ｆ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0229】

培養条件（Ｆ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0230】

培養条件（Ｆ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0231】

培養条件（Ｆ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0232】

培養条件（Ｆ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0233】

培養条件（Ｆ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0234】

培養条件（Ｆ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0235】

培養条件（Ｆ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0236】

培養条件（Ｇ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0237】

培養条件（Ｇ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0238】

培養条件（Ｇ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0239】

培養条件（Ｇ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0240】

培養条件（Ｇ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0241】

培養条件（Ｇ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0242】

培養条件（Ｇ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0243】

培養条件（Ｇ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0244】

培養条件（Ｇ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0245】

培養条件（Ｇ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0246】

培養条件（Ｇ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0247】

培養条件（Ｇ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0248】

培養条件（Ｇ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0249】

培養条件（Ｇ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0250】

培養条件（Ｇ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0251】

培養条件（Ｈ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0252】

培養条件（Ｈ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0253】

培養条件（Ｈ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0254】

培養条件（Ｈ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0255】

培養条件（Ｈ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0256】

培養条件（Ｈ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0257】

培養条件（Ｈ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0258】

培養条件（Ｈ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0259】

培養条件（Ｈ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0260】

培養条件（Ｈ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0261】

培養条件（Ｈ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0262】

培養条件（Ｈ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0263】

培養条件（Ｈ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0264】

培養条件（Ｈ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0265】

培養条件（Ｈ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１４日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0266】

培養条件（Ｉ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0267】

培養条件（Ｉ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0268】

培養条件（Ｉ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0269】

培養条件（Ｉ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0270】

培養条件（Ｉ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0271】

培養条件（Ｉ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第８日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0272】

培養条件（Ｉ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0273】

培養条件（Ｉ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0274】

培養条件（Ｉ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日－プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0275】

培養条件（Ｉ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0276】

培養条件（Ｉ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第８日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0277】

培養条件（Ｉ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0278】

培養条件（Ｉ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0279】

培養条件（Ｉ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0280】

培養条件（Ｉ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第８日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0281】

培養条件（Ｊ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0282】

培養条件（Ｊ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0283】

培養条件（Ｊ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0284】

培養条件（Ｊ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0285】

培養条件（Ｊ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0286】

培養条件（Ｊ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第９日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0287】

培養条件（Ｊ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0288】

培養条件（Ｊ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0289】

培養条件（Ｊ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0290】

培養条件（Ｊ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0291】

培養条件（Ｊ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第９日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0292】

培養条件（Ｊ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0293】

培養条件（Ｊ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0294】

培養条件（Ｊ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0295】

培養条件（Ｊ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第９日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0296】

培養条件（Ｋ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0297】

培養条件（Ｋ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0298】

培養条件（Ｋ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0299】

培養条件（Ｋ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0300】

培養条件（Ｋ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0301】

培養条件（Ｋ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第１０日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0302】

培養条件（Ｋ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0303】

培養条件（Ｋ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0304】

培養条件（Ｋ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0305】

培養条件（Ｋ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0306】

培養条件（Ｋ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１０日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0307】

培養条件（Ｋ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0308】

培養条件（Ｋ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0309】

培養条件（Ｋ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0310】

培養条件（Ｋ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１０日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0311】

培養条件（Ｌ－ｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0312】

培養条件（Ｌ－ｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0313】

培養条件（Ｌ－ｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0314】

培養条件（Ｌ－ｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0315】

培養条件（Ｌ－ｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0316】

培養条件（Ｌ－ｖｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１００ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１０００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１００％である。
第１１日 － 初期培養体積の１倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0317】

培養条件（Ｌ－ｖｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0318】

培養条件（Ｌ－ｖｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0319】

培養条件（Ｌ－ｉｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0320】

培養条件（Ｌ－ｘ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0321】

培養条件（Ｌ－ｘｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は５０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は５００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の５０％である。
第１１日 － 初期培養体積の２倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0322】

培養条件（Ｌ－ｘｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は１０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は１００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の１０％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0323】

培養条件（Ｌ－ｘｉｉｉ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２０％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0324】

培養条件（Ｌ－ｘｉｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は２５ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は２５０ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の２５％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を添加または交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0325】

培養条件（Ｌ－ｘｖ）：
第０日 － 初期培養体積は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍの場合は３０ｍＬ［またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの場合は３００ｍＬ］である。換言すれば、第１の増殖の初期培養体積は細胞培養容器／系の容積の３０％である。
第１１日 － 初期培養体積の３倍の体積を有する細胞培養培地を交換する。
第１５日 － プレＲＥＰ ＴＩＬ回収。

【0326】

他の適切な培養条件も使用されうる。

【0327】

最適化の前および後の成功率
最適化前は、プレＲＥＰ ＴＩＬ産生の成功率は低く、平均収量は３．１０×１０^６細胞／断片であった（表１）。プレＲＥＰ手順を最適化した後、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置においてフルスケール培養を行い、これは１６．２９×１０^６細胞／断片の平均収量をもたらした（表２）。したがって、本発明者らの最適化された手順は、最適化前よりも有意に高い、回収プレＲＥＰ ＴＩＬの収量をもたらした（Ｐ＝０．００１２５；最適化前の実施ではｎ＝１２、最適化後の実施ではｎ＝８）（表２）。

【0328】

【表1】

【0329】

標準化プレＲＥＰプロトコルにおけるグルコースおよび乳酸濃度の評価
標準化プレＲＥＰプロトコルにおける培地添加が該プロセスに十分であることを検証するために、７回の実施（Ｔ５１０１０１４～Ｔ５１０１０１８、Ｔ５１０１０２１およびＴ５１０１０２２）から第０日、第６日、第１０日および第１４日に上清を収集し、最終的なＴＩＬ収量、グルコースおよび乳酸濃度を評価した。第６日までおよびその後、グルコースおよび乳酸レベルはＴＩＬ増殖の度合に比例して変化した（図１）。しかし、回収時のグルコースレベルは、Ｔ細胞増殖を維持するのに十分に高いままであった（７．６９±２．８６ｍＭ；９５％ＣＩ、５．０５～１０．３３ｍＭ；ｎ＝７）（表３）。重要なことに、乳酸レベル（６．３０±３．９２ｍＭ；９５％ＣＩ、２．６７～９．９３ｍＭ；ｎ＝７）は２０ｍＭを十分に下回っていた。このレベルを超えると、ＣＤ８^＋キラーＴ細胞は、低減した増殖、生存率および機能を示すことが示されている^１４。総合すると、本発明者らの結果は、最適化されたプレＲＥＰプロセスが、グルコースおよび乳酸のレベルを、ＴＩＬの移動および増殖を支持する範囲内に維持しうることを示した。

【0330】

【表2】

【0331】

プレＲＥＰ ＴＩＬの特徴づけ
予想通り、最適化条件下で増殖したプレＲＥＰ ＴＩＬは高い生存率および高いＣＤ３^＋細胞割合を示した。プレＲＥＰ ＴＩＬの平均生存率は９３．６８％±２．４８％（ｎ＝８）であった。ＣＤ３^＋細胞の平均割合は８９．４３％±５．３１％（ｎ＝８）であった。

【0332】

プレＲＥＰ ＴＩＬ産物におけるＣＤ８^＋細胞の割合はドナー間で異なり、平均割合（３７．３５％）は他のＮＳＣＬＣプレＲＥＰ ＴＩＬ産物に類似していた^３。プレＲＥＰ材料はＮＫ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞および上皮細胞を低い割合で含有しているに過ぎなかった。ＮＫ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞、および皮細胞の割合は、それぞれ、７．７４％±４．８７％、０．１１８％±０．１１７％、０．０３４％±０．０３２％、および０．０７４％±０．１３７％であった（ｎ＝８；図２および表４）。

【0333】

【表3】

【0334】

また、本発明者らは、種々の活性化／阻害性マーカーの発現およびＴ細胞サブセットの分布を調べることによって、本発明者らのプレＲＥＰ ＴＩＬの表現型を広範に分析した。データは、これらのプレＲＥＰ ＴＩＬが、ＣＤ２７およびＣＤ２８の高い発現［ここで、ＣＤ４^＋プレＲＥＰ ＴＩＬにおける陽性頻度は、それぞれ、３７．９４％±７．１７％および９４．５１％±４．７２％であり、（ｎ＝８；図３、表５）、ＣＤ８^＋プレＲＥＰ ＴＩＬにおける陽性頻度は、それぞれ、３４．４５％±９．６２％および５７．６６％±１９．１９％である（ｎ＝８；図４、表７）］を伴って活性化されることを示した。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋プレＲＥＰ Ｔ細胞上には種々の阻害性マーカーが発現しており、ＣＤ４^＋プレＲＥＰ Ｔ細胞上ではＬＡＧ－３の発現が最も低く、陽性頻度は１０．０７％±３．２３％（ｎ＝８；図３、表５）であった。ＰＤ－１はＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋の両方のプレＲＥＰ Ｔ細胞上で中程度に発現していた。ＰＤ－１の陽性頻度は、ＣＤ４^＋プレＲＥＰ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋プレＲＥＰ Ｔ細胞において、それぞれ、５７．４３％±１９．５８％および３４．３１％±２１．６７％であった。ＴＩＭ－３はほとんどのＣＤ８^＋プレＲＥＰ ＴＩＬ上で高度に発現していた。ＴＩＭ－３の陽性頻度はＣＤ４^＋プレＲＥＰ Ｔ細胞においては５３．５０％±１６．１２％（ｎ＝８；図３、表５）であり、ＣＤ８^＋プレＲＥＰ Ｔ細胞においては７１．９３％±１７．８５％（ｎ＝８；図４、表７）であった。

【0335】

本発明者らのプレＲＥＰ ＴＩＬの、１つの好ましい特徴は、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋の両方のプレＲＥＰ ＴＩＬにおける、Ｔ_ＣＭの高い割合、およびＴ_ＥＭの低い割合であった。Ｔ_ＣＭの割合はＣＤ４^＋プレＲＥＰ ＴＩＬにおいては６６．２８％±１２．８７％であり、ＣＤ８^＋プレＲＥＰ ＴＩＬにおいては５９．０４％±１３．４７％であった。Ｔ_ＥＭの割合はＣＤ４^＋プレＲＥＰ ＴＩＬにおいては３０．９８％±１３．２５％であり（ｎ＝８；図３、表６）、ＣＤ８^＋プレＲＥＰ ＴＩＬにおいては２７．６６％±１１．５９％であった（ｎ＝８；図４、表８）であった。更に、Ｔ_ＥＦＦサブセットの最小割合（ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞において、それぞれ、０．２６％±０．１９％および４．２７％±３．８５％；ｎ＝８）が確認された。また、回収された産物において、Ｔ_Ｎ／Ｔ_ＳＣＭサブセットの割合も高かった［ＣＤ４^＋プレＲＥＰ ＴＩＬにおいては２．４９％±２．２８％（ｎ＝８）であり、ＣＤ８^＋プレＲＥＰ ＴＩＬにおいては９．０４％±８．６５％（ｎ＝８）であった（図３、表６；および図４、表８）］。このことは顕著な早期メモリーＴＩＬ表現型を示している。これは非常に重要である。なぜなら、ＴＩＬ療法の臨床上の利益は、プレＲＥＰ ＴＩＬから生成されるＴＩＬ産物の具体的な品質に大きく左右されるからである。全体として、本発明者らは、ここにおいて、プレＲＥＰ ＴＩＬを有効かつ適時な様態で生成する方法を示した。該方法は高い収量および好ましいＴＩＬ表現型をもたらし、このことは、臨床的有効性に関連したＲＥＰの成功を示唆している。

【0336】

【表4】

【0337】

【0338】

結論
本発明者らはプレＲＥＰ ＴＩＬ培養プロセスを最適化して、高い割合のＴ_ＣＭおよび健常なＴＩＬ表現型を得た。全体として、これらの研究は、プレＲＥＰ臨床製造および後続のＴＩＬ実験を支持するために利用されうる。

【0339】

参考文献
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１０．Ｗｕ，Ｒ．ら，Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｕｔｌｏｏｋ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ １８，１６０－１７５（２０１２）．
１１．Ｚｈｏｕ，Ｊ．，Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．＆ Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｆ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２８，５３－６２（２００５）．
１２．Ｔｒａｎ，Ｋ．Ｑ．ら，Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３１，７４２－７５１（２００８）．
１３．Ｐｉｌｌｉｎｇ，Ｄ．ら，Ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ ｒｅｓｔｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（Ｎｏｉｓｙ－ｌｅ－ｇｒａｎｄ） ４６，１６３－１７４（２０００）．
１４．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｋ．ら，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ １０９，３８１２－３８１９（２００７）．
１５．Ｇｈａｆｆａｒｉ，Ｓ．ら，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｓｅｅｄｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｂｅａｄ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｒａｔｉｏ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２，４３（２０２１）．

【0340】

実施例２：伝統的なＲＥＰまたはフィーダー細胞非含有ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰプロトコルから小規模で生成されたＴＩＬの比較
伝統的には、ＴＩＬは、高用量のＩＬ－２の存在下、２４ウェルプレートのウェルにおいて単一の腫瘍断片から増殖され、腫瘍反応性に関して選択され、次いで急速に増殖された^６。この方法からの産物がたとえ臨床的に有効だとしても、ＴＩＬの産生は難題である。なぜなら、ＴＩＬ産生の伝統的な方法は特異的腫瘍認識に関してアッセイされ、通常６～８週間を要し、これはインビトロでのＴ細胞疲弊およびインビボでの短い存続を引き起こすからである^７，８。また、腫瘍応答反応性の選択は、ＴＩＬ産生の、より低い成功率をもたらして、ＴＩＬ療法にまわされた患者の５０％を超える脱落率につながり^９、その臨床応用を大きく制限する^１０。組織培養フラスコおよびガス透過性バッグにおいて腫瘍組織全体を使用する代替的な「未熟な」ＴＩＬプロセスが開発され、これは、長いテロメアならびにＣＤ２７およびＣＤ２８の発現の増強のような、インビボでの存続性の改善に関連する特性を有するＴＩＬの生成に好ましい^{１１，１２}。

【0341】

ここで用いたＲＥＰプロトコルは、照射されたＰＢＭＣおよび抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体が増殖のために使用される伝統的なＴＩＬ ＲＥＰプロトコルとは異なる、フィーダー細胞を使用しないプロセスであった。フィーダー細胞を使用しないＲＥＰプロセスは産物の効力および安全性を高め、製造コストを削減しうる。本発明者らは、伝統的なＲＥＰプロトコルを用いる小規模ＴＩＬと、フィーダー細胞を使用しないＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰプロセスからのものとの比較を行った。

【0342】

ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰと伝統的なＲＥＰとにおけるＴＩＬ増殖の比較
１２名のドナーからのプレＲＥＰ ＴＩＬを使用して、本発明者らは、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰプロトコルを使用して増殖させたＴＩＬの平均増殖倍率が、伝統的なＲＥＰプロトコルと同等である３８９．３±１３８．８（表９）であることを見出した。これは、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰプロトコルが、臨床目標用量要件を満たすのに十分なＴＩＬを生成しうることを示唆した。

【0343】

【表5】

【0344】

ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰと伝統的なＲＥＰとの生存率およびＴ細胞亜型の比較
ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬは、全てのドナー間で一貫した、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の割合における顕著な増加を示した（図５および表１０）。

【0345】

ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰまたは伝統的なＲＥＰからのＴ細胞表現型および阻害性／活性化細胞表面マーカーの比較
ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬに関しては、ＣＤ４^＋集団およびＣＤ８^＋集団は共に、早期メモリー表現型を有する細胞の割合における有意な増加を示し（図６、図７および表１０）、一方、より分化したエフェクターＴ細胞（Ｔ_ＥＭ、Ｔ_ＥＦＦ）の割合は減少した（図６および表１０）。これらのＴＩＬ特性は、ＴＩＬ養子細胞療法における好ましい結果に関連していることが示されている^４。

【0346】

ＲＥＰ ＴＩＬを免疫チェックポイント（阻害性）および活性化細胞表面マーカーの発現に関しても分析した（図７および表１０）。伝統的なＲＥＰ ＴＩＬと比較して、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬは、ＣＤ４^＋区画およびＣＤ８^＋区画の両方における増加した割合のＣＤ２７^＋細胞、ならびに疲弊マーカーＰＤ－１を発現する、減少した割合のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を有し、このことはＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬの早期メモリー表現型を更に支持するものであった。

【0347】

【表6】

【0348】

表１１は別の実験からのＴ細胞サブセットを示す。

【表7】

【0349】

照射ＰＢＭＣ（ｉｒＰＢＭＣ） ＋ ＯＫＴ３ ｍＡｂまたは本方法［例えば、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を使用するもの］で増殖させた９名のドナーからのＦＡＣＳ分析によって決定されたＲＥＰ ＴＩＬ Ｔ細胞亜型の割合。括弧内の範囲と共に各集団の平均割合が示されている。Ｐ値は、Ｅｘｃｅｌにおける対応ｔ検定を用いて決定した（ｎ＝９）。

【0350】

ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰと伝統的なＲＥＰとのαＣＤ３刺激に対する応答におけるＴ細胞活性化の比較
２つのＲＥＰ法で増殖させたＴＩＬの機能性を比較するために、αＣＤ３刺激に応答したＲＥＰ ＴＩＬからの回収細胞の細胞表面活性化マーカーおよびサイトカイン分泌の変化を調べた。ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬは、外因性ＩＬ－２の存在下または非存在下、αＣＤ３刺激に際して、遥かに高いレベルのＩＦＮ－γおよびグランザイムＢを生成した（図８、表１２）。外因性ＩＬ－２の存在下または非存在下、表面４－１ＢＢを発現するＴＩＬの平均割合は、ＣＤ４^＋集団とＣＤ８^＋集団との両方において、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬにおいて、より大きかった（表１２）。これらのデータは、伝統的なＲＥＰと比較して、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰが、Ｔ細胞活性化に応答して、増殖ＴＩＬの機能性の、より良好な機能性を支持することを示している。

【0351】

【表8】

【0352】

ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰまたは伝統的ＲＥＰからのＴＩＬのインビトロＭＯＳ腫瘍殺傷
伝統的なＲＥＰおよびＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰのＴＩＬの腫瘍細胞殺傷効果を比較するため、ＴＩＬと自己腫瘍由来ミクロオルガノスフェア（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｏｓｐｈｅｒｅ）（ＭＯＳ）との共培養を行った。ドナーＴ５１０１０１６からのＲＥＰ ＴＩＬを、自家肺癌ＭＯＳと、２：１、３：１または４：１（ＴＩＬ２０，０００～４０，０００個：ＭＯＳ内の癌細胞１０，０００個）の種々のＥ：Ｔ比で、共培養した。共培養を２時間ごとに６８時間までイメージングし、ＴＩＬ群におけるカスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）３／７シグナルの増加を観察した（図９）。

【0353】

該アッセイは自己ＮＳＣＬＣ ＭＯＳに対するＴＩＬの細胞傷害性を証明した。ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬ（Ｃ－ＴＩＬ０５１）は、伝統的なＴＩＬと比較して、試験された全てのＥ：Ｔ比において、カスパーゼ３／７シグナルによって示される有意に増強した腫瘍殺傷活性を示した（図９）。これらのデータは、伝統的なＲＥＰ ＴＩＬと比較して、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬが、自己腫瘍細胞に応答した、より良好な機能性を有することを示している。

【0354】

ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰ ＴＩＬと伝統的なＲＥＰ ＴＩＬとのＴＣＲレパートリーの比較
６名のドナーからのＴＩＬのＴＣＲベータ鎖配列決定データを、伝統的なＲＥＰまたはＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰのいずれかを用いて、ＲＥＰ増殖の前（プレＲＥＰ）および後のレパートリーの多様性に関して比較した。モリシタ指数（Ｍｏｒｉｓｉｔａ Ｉｎｄｅｘ）（これは、２つのサンプル間の共有クローンの数と相対的存在量との両方を考慮した相関分析である）がプレＲＥＰとＲＥＰとの各サンプルペアに関して示されている。値は０から１までの範囲であり、高い値はそれらの２つのサンプルの全体的なレパートリーの間の高い類似性を示す。ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰのモリシタ指数は伝統的なＲＥＰのものより高く、このことは、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰが、より高い度合でプレＲＥＰレパートリーを全体的に保存している可能性があることを示唆している（表１３）。

【0355】

【表9】

【0356】

また、複数の側面（シンプソンクローン性、プレＲＥＰ ＴＩＬとＴＩＬとの間のＴＣＲ重複、ＲＥＰ後の上位１００個のプレＲＥＰクローンの保存を含む）からの種々のマトリックスでの複合分析は、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰプロセスが、プレＲＥＰ ＴＣＲレパートリーの保存において、伝統的なＲＥＰプロセスよりも良好であった、または少なくとも劣っていなかったようであることを示しており、このことはＲＥＰプロセスにおけるＴｒａｎｓＡｃｔの使用を更に支持するものである。

【0357】

実施例３：ＴＩＬ ＲＥＰプロセスの開発およびＴＩＬの特徴づけ
１１名のＮＳＣＬＣ患者の腫瘍に由来するプレＲＥＰ ＴＩＬを使用した本発明者らの小規模実験は、商業的に入手可能なαＣＤ３／αＣＤ２８アゴニストであるＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（本明細書においてはＴｒａｎｓＡｃｔと略記される）が、臨床的用量要件を満たしうるとともに、ＴＩＬの急速増殖を維持するために、照射フィーダー細胞およびαＣＤ３抗体の代わりに使用可能であることを示した。この研究の目的は、製造規模でプレＲＥＰ ＴＩＬを増殖させるためにＴｒａｎｓＡｃｔを使用するＲＥＰプロセスを開発することであった。本発明者らはまた、ＧＭＰ施設からプロセス開発（ＰＤ）実施およびモック実施において生成されたＴＩＬをＴ細胞表現型、レパートリー多様性および／または腫瘍殺傷機能に関して特徴づけることも目的とした。

【0358】

本発明者らの実験データは、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）での活性化の後、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）細胞培養装置において、またはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続的使用において、ＴＩＬのＲＥＰの成功が製造規模で達成されうることを示している。プロセス開発実施からのＴＩＬの特徴づけは、増殖細胞が、好ましい表現型と、同族プレＲＥＰ ＴＩＬを代表する良く保存されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーとを示すことを示した。ＴＩＬはまた、表面Ｔ細胞活性化マーカーの発現をアップレギュレーションする、およびＴ細胞活性化シグナルに応答して種々のサイトカインを生成する能力を保持していた。更に、本発明者らのＧＭＰ施設からの模擬実施からのＴＩＬ産物の特徴づけは、本発明者らが開発した自己細胞療法産物が早期分化表現型を有し、強力な腫瘍殺傷能力を有することを実証した。

【0359】

材料
１１名のドナーに由来するプレＲＥＰ ＴＩＬをＰＤのために使用した。５名のドナー（Ｔ５１０１００１、Ｔ５１０１００２、Ｔ５１０１００５、Ｔ５１０１００８、Ｔ５１０１０１０）からのプレＲＥＰ細胞をプレＲＥＰプロセスの最適化の前に回収し、それらのＣＤ３^＋ Ｔ細胞の割合は３８．７％～９８．０％の範囲であった。その他の６名のドナー（Ｔ５１０１０１４、Ｔ５１０１０１５、Ｔ５１０１０１６、Ｔ５１０１０１７、Ｔ５１０１０１８、Ｔ５１０１０２４）からのプレＲＥＰ細胞をプレＲＥＰプロセスの最適化の後に回収し、それらのＣＤ３^＋ Ｔ細胞の割合は８１．８％～９７．０％の範囲であった。

【0360】

方法
Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０ＭとＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置との連続的使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＲＥＰ
第０日に、プレＲＥＰ細胞を水浴内で解凍し、ＲＥＰ完全培地（ＣＭ；３００または１０００、３０００または６０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で補足されたＲＥＰ基礎培地）で２回洗浄した。１つの実施形態においては、ＩＬ－２濃度は３００ ＩＵ／ｍＬである。もう１つの実施形態においては、ＩＬ－２濃度は１０００ ＩＵ／ｍＬである。更にもう１つの実施形態においては、ＩＬ－２濃度は３０００ ＩＵ／ｍＬである。更にもう１つの実施形態においては、ＩＬ－２濃度は６０００ ＩＵ／ｍＬである。次いで細胞をＲＥＰ ＣＭに再懸濁させ、自動細胞カウンター（ＮＣ－２００）で計数した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ装置において培養を開始させるために、約１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１０×１０^６または２０×１０^６個の生細胞とＴｒａｎｓＡｃｔとを含有する細胞懸濁液のアリコートを約１：１５０、１：５、１：１０、または１：１７．５のＴｒａｎｓＡｃｔ：培地の体積比で該装置内に加え、最終的な培養体積をＲＥＰ ＣＭで１０ｍＬ、１５ｍＬまたは２０ｍＬに調整した。次いでＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍを３７℃、５％ ＣＯ_２のインキュベーター内に配置した。

【0361】

第３日、第４日または第５日に、予熱ＲＥＰ ＣＭをＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍに加えることによって、初期培養を１０倍、２０倍または３０倍希釈した。該装置をＣＯ_２インキュベータに戻した。

【0362】

第６日、第７日、第８日、第９日または第１０日に、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍにおいて細胞を再懸濁させ、計数した後、培養を新たなＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置に移し、予熱ＲＥＰ ＣＭを加えることによって１０倍、２０倍、３０倍希釈した。次いでＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００ＭをＣＯ_２インキュベーター内に配置した。

【0363】

第１２日、第１３日、第１４日、第１５日、第１６日、第１７日、第１８日、第１９日または第２０日に、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍから細胞を回収した。残りの細胞のアリコートをペレット化し、凍結保存した。

【0364】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５との連続的使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＲＥＰ
第０日に、プレＲＥＰ細胞を水浴内で解凍し、ＲＥＰ ＣＭで２回洗浄した。次いで細胞をＲＥＰ ＣＭに再懸濁させ、ＮＣ－２００で計数した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置における培養を開始させるために、約２０×１０^６、５０×１０^６、１０００×１０^６または２００×１０^６個の生細胞とＴｒａｎｓＡｃｔとを含有する細胞懸濁液のアリコートを約１：１５０、１：５、１：１０、または１：１７．５のＴｒａｎｓＡｃｔ：培地の体積比で該装置内に加え、最終的な培養体積をＲＥＰ ＣＭで５０～１００ｍＬに調整した。あるいは、閉鎖系のＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ－ＣＳ装置を使用する場合には、５０ｍｌ シリンジのバレルを培地添加チューブのＬｕｅｒポートに接続し、次いで細胞懸濁液およびＴｒａｎｓＡｃｔをシリンジバレルを介してＧ－Ｒｅｘ（登録商標）に加えた。その後、培地添加チューブを熱シールし、シリンジバレルを取り外した。次いでＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００ＭまたはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ－ＣＳをＣＯ_２インキュベーター内に配置した。

【0365】

第３日、第４日または第５日に、予熱ＲＥＰ ＣＭをＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍに加えることによって、初期培養を１０倍、１５倍または２０倍希釈した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ－ＣＳを使用する場合には、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ－ＣＳ上の培地添加チューブに結合したＲＥＰ ＣＭを含有する培地移送バッグを介して培地を加えた。培地の添加の後、チューブを熱シールし、培地移送バッグを取り外した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置をＣＯ_２インキュベーターに戻した。

【0366】

第６日頃～第１０日頃に、使用済み培地の約２５％または５０％をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍの上部から取り出し、新たな培地ボトル内に保存した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ－ＣＳを使用する場合には、使用済み培地を培地添加／除去チューブから取り出し、培地転送バッグ内に保存した。次いで細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）装置内に再懸濁させ、サンプルを採取してＮＣ－２００で計数した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置を、回収まで、ＣＯ_２インキュベーターに戻した。

【0367】

Ｘｕｒｉ（商標）ＲＥＰを開始させるために、２Ｌまたは１０ＬのＸｕｒｉ（商標）ＣｅｌｌｂａｇをＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５細胞増殖系のロッキングトレイに取り付けた。次いで新鮮なＣＭをＣｅｌｌｂａｇに添加し、系を２時間平衡化した。

【0368】

総細胞数に応じて、細胞数がＸｕｒｉ（商標）Ｃｅｌｌｂａｇ接種の要件を満たすように、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置内の細胞懸濁液のアリコートを移送バッグ内に回収した［Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ－ＣＳの場合には、ＧａｔｈｅＲｅｘ細胞回収ポンプを使用した］。次いで移送バッグをＸｕｒｉ（商標）Ｃｅｌｌｂａｇのフィードラインに接続して、細胞を移した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）からの追加的な使用済み培地（細胞計数前に保存されたもの）をＸｕｒｉ（商標）Ｃｅｌｌｂａｇに加えて、Ｃｅｌｌｂａｇ内の新鮮なＣＭの体積が最終総培養体積の半分になり、最終細胞濃度が約０．５×１０^６／ｍＬまたは１×１０^６／ｍＬまたは２×１０^６／ｍＬとなるようにした。その後、低速および低角度で揺動させながら、Ｘｕｒｉ（商標）の増殖を開始させた。

【0369】

第６日、第７日間または第８日およびそれ以降に、サンプルをＸｕｒｉ（商標）Ｃｅｌｌｂａｇから毎日採取して、細胞増殖および生存率を計数し、モニターした。総培養体積が１リットルまたは５リットルに達するまで、培養を所望の細胞濃度に調整するために、各細胞計数後に新鮮なＲＥＰ ＣＭを添加した。次いで、翌日から、０．５リットル／日、１リットル／日または２リットル／日で灌流を開始させた。細胞濃度に応じて、灌流速度を揺動の速度および角度と共に、毎日、徐々に増加させた。

【0370】

Ｘｕｒｉ（商標）培養の最終日に、細胞計数およびＦＡＣＳ分析のためにサンプルを採取した後、ＲＥＰ細胞を回収し、洗浄し、凍結保存した。

【0371】

αＣＤ３刺激
３名のドナー（Ｔ５１０１０１５、Ｔ５１０１０１８およびＴ５１０１０２４）のＲＥＰ産物を解凍し、ＲＥＰ ＣＭ中で１～２日間静置した。次いで細胞を洗浄し、ＩＬ－２の非存在下または３００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（最終濃度）の存在下、ＲＥＰ基礎培地に再懸濁させ、９６ウェルプレートの、１つのウェルにおいて、２×１０^５個の細胞を播種した。ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ ＣＤ３純粋物（αＣＤ３抗体、ＯＫＴ３）を同じ培養培地内で希釈し、１μｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに加えた。細胞を一晩刺激し、次いで、サイトカインアッセイのために上清を採取し、ＦＡＣＳ分析のために細胞を染色した。実験は各条件に関して３回重複して行った。

【0372】

サイトカインアッセイ
細胞培養上清中のサイトカイン濃度の分析のために、製造業者のプロトコルに従い、複数の可溶性分析物の同時定量のために、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ヒトＣＤ８／ＮＫパネルキットを使用した。アッセイをＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸ ＦＡＣＳ装置で読み取り、データをＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ソフトウェアで分析した。

【0373】

ＦＡＣＳ
細胞を、まず、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）固定可能アクア（Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ）染料で染色し、次いで種々の表面マーカーに対する抗体で染色した。試薬。次いでＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸ ＦＡＣＳ装置でサンプルを得た。全てのデータをＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアで分析した。

【0374】

ＴＩＬ培養培地サンプルの収集
細胞が底部に存在するＧ－Ｒｅｘ（登録商標）装置によるＲＥＰの場合には、示されている時点で約５００μＬの上清をサンプル採取した。Ｘｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターによるＲＥＰの場合には、培養サンプルをＸｕｒｉ（商標）Ｃｅｌｌｂａｇのサンプリングポートから採取し、４００ｇ／分で５分間遠心分離した。上清を新たな１．５ｍＬ滅菌チューブに移すことによって、ＲＥＰ培養培地サンプル（２００μＬ～５００μＬ）を得た。該培養培地サンプルを直ちに－２０℃の冷凍庫内で保存し、アッセイ時に氷上で解凍した。

【0375】

ＩＬ－２酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
サンプルを、ＩＬ－２タンパク質濃度に応じて、ＲＥＰ基礎培地で１５～３００倍希釈した。サンプルを２通りまたは３通りのウェルにおいて測定した。データは平均±標準偏差（ＳＤ）として示されている。新鮮ＲＥＰ ＣＭサンプルの、３つのバッチにおける、ＩＬ－２濃度の平均値を、第０日の濃度と表示した。１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２が１６．３６ ＩＵ／ｍＬに相当するという前提で、質量濃度を単位濃度に変換した。

【0376】

培養上清中のグルコースおよび乳酸濃度の定量
サンプルをアリコート化し、グルコース－Ｇｌｏおよび乳酸－Ｇｌｏアッセイキットを製造業者の推奨プロトコルに従い使用して、分析した。培養上清をＰＢＳ中で１：２００～１：３００に希釈した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３における発光に関して、プレートを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで標準曲線を作成し、Ｅｘｃｅｌにおいてサンプルの値を計算した。

【0377】

ＴＣＲレパートリー分析
Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続的使用によるＰＤ実施のフルスケールＲＥＰ増殖の前（プレＲＥＰ）および後のＴＣＲレパートリー多様性を比較するために、２名のドナー（Ｔ５１０１０１５－３およびＴ５１０１０２４ａ）からのＴＩＬのＴＣＲベータ鎖配列決定を行った。

【0378】

ＧＭＰ施設からのＴＩＬの模擬実施
２名のドナー（Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５）からのプレＲＥＰ ＴＩＬをＧＭＰ施設において増殖させ、凍結保存した。プレＲＥＰ ＴＩＬのＣＤ３^＋ Ｔ細胞の割合は、Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５に関して、それぞれ、８５．７２％および９０．８２％であった。プレＲＥＰ ＴＩＬを、同じＧＭＰ施設におけるＲＥＰ製造を開始する前に、それぞれ１０日間および２５日間、凍結保存した。ＲＥＰの標準操作手順を、ＰＤ実施に基づいて開発し、エンジニアリングラン（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｒｕｎ）および模擬実施（ｍｏｃｋ ｒｕｎ）に適用した。

【0379】

ＴＩＬ模擬実施産物の特徴づけ
ＴＩＬ模擬実施製造の収量をＮＣ－２００細胞カウンターでの自動細胞計数によって測定した。産物のＴ細胞表現型をＢＤ ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（商標）臨床フローサイトメトリー系において表面マーカー染色およびＦＡＣＳによって分析した。非特異的活性化を測定するために、凍結保存産物を解凍し、一晩回復させ、次いで１×１０^５個の細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒト（Ｈｕｍａｎ）Ｔ－アクチベーター（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で、１：１の割合で、２００μＬの最終体積において、２４時間刺激した。次いで、市販キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡを行うために、細胞上清を回収した。あるいは、一晩の回復の後、２×１０^５個の細胞を、１μｇ／ｍＬの最終濃度のαＣＤ３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で、２００μＬの最終体積において２４時間刺激した。次いで、４－１ＢＢおよびＯＸ４０を含むＴ細胞活性化マーカーのＦＡＣＳ分析のために、細胞を回収した。

【0380】

また、２名のドナー（Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５）のＴＩＬ模擬実施産物を、ＴＩＬ産物と自己腫瘍由来ミクロオルガノスフェア（ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｏｓｐｈｅｒｅ）（ＭＯＳ）との共培養を含む直接機能アッセイによって特徴づけした（Ｄｉｎｇら，Ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０２２，２９，９０５－９１７，ｅ９０６）。

【0381】

結果および分析
Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０ＭとＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置との連続的使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＣ－ＴＩＬ０５１ ＰＤ実施
本発明者らは、まず、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０ＭとＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置との連続的使用およびＴｒａｎｓＡｃｔを用いて、１０名のドナーからの１０×１０^６個のプレＲＥＰ ＴＩＬを使用して、ＲＥＰを行った。

【0382】

ＲＥＰプロセスの条件
ＴＩＬのＲＥＰは十分な栄養素および高いＩＬ－２濃度を要し、一方、乳酸のような代謝産物の蓄積はＴ細胞増殖を低下させうる。培地の交換／添加の前および回収時に採取した培養上清からのグルコース、乳酸およびＩＬ－２のレベルを測定した。ＩＬ－２濃度は、細胞増殖速度に無関係に、試験した全てのサンプルに関して、全ての時点で、高レベル（＞２０００ ＩＵ／ｍＬ）であることが判明した（図１０、左）。培養の最初の６日間は、ＴＩＬが増殖し始めるため、グルコースレベルが低下した。その後、培地を添加または交換し、これにより、培養終了時まで、ほとんどのサンプルで、グルコースレベルが約１０ｍＭに維持され（図１１）、第６日から、指数関数的な増殖が認められた（図１０、右）。グルコースの消費と一致して、乳酸が最初の６日間に培養内で蓄積し始め、その後、それは、培地の添加／交換によって、希釈され、または同様の低レベルで維持された。全体的に、培養プロセス全体を通じて、試験した全てのサンプルに関して、乳酸レベルは２０ｍＭを大きく下回っていた（図１１）。これは、以前の研究^１４によると、Ｔ細胞によって十分に許容されうる。これらのデータは、本発明者らが開発したフィードスケジュールがＧ－Ｒｅｘ（登録商標）装置におけるＴＩＬ増殖の要件を満たしていることを実証した。

【0383】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０ＭとＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置との連続的使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＰＤ実施からのＴＩＬの増殖倍率、生存率およびＴ細胞組成
培養後、８名のドナーからのＴＩＬは少なくとも２００倍増殖した（表１４）。このことはＲＥＰの成功を実証している。これらのサンプルに関して、本発明者らは７１２．４±２９２．２［９５％ 信頼区間（ＣＩ）：４６８．１～９５６．７］の平均増殖倍率、ならびに高い細胞生存率（９７．９５％±１．５１％）およびＴ細胞純度（９７．４３％±１．５０％；表１４）（全生細胞のなかのＣＤ３^＋の割合によって決定されたもの）を達成した。これらのサンプルのプレＲＥＰ収量は広い範囲（３０×１０^６～７８３×１０^６個のＴＩＬ）を示した。したがって、プレＲＥＰ ＴＩＬの収量はＲＥＰ収量と関連していないようであり、５０００万細胞未満のプレＲＥＰ収量を有する２つのサンプル（Ｔ５１０１００２およびＴ５１０１００８）は本発明者らのプロトコルで堅牢な増殖を示した（表１４）。高い平均倍率の増殖を考慮すると、ここで開発されたＲＥＰプロセスはプレＲＥＰ ＴＩＬの中間産物の僅か１０×１０^６個を増幅して、最終ＲＥＰ産物の目標用量、すなわち、１×１０^９～１００×１０^９細胞を達成すると予想される。注目すべきことに、これらの８つのサンプルはプレＲＥＰ ＴＩＬの出発材料中に８０％を超えるＣＤ３^＋ Ｔ細胞を含有していた（表１４）。対照的に、低い割合のＣＤ３^＋ Ｔ細胞を含有するその他の２つのプレＲＥＰサンプル（Ｔ５１０１００５およびＴ５１０１０１０、ＣＤ３^＋ Ｔ細胞％：それぞれ、６４．０％および３８．７％）は、ＲＥＰ段階において、不十分な増殖を示した（それぞれ、１７倍および１６７倍）。したがって、プレＲＥＰ ＴＩＬにおけるＣＤ３^＋ Ｔ細胞の割合はＴｒａｎｓＡｃｔ媒介性ＲＥＰに重要でありうる。全体として、これらのデータは、ＴｒａｎｓＡｃｔが、製造規模でＧ－Ｒｅｘ（登録商標）装置を使用した場合に、ＮＳＣＬＣ ＴＩＬのＲＥＰを高い成功率で実際に支持しうることを実証した。それらの８つのサンプルの増殖の成功はまた、ＴｒａｎｓＡｃｔによるＲＥＰプロセスが、照射フィーダー細胞を使用する伝統的なＲＥＰに一般に要求される２日以上の回復期間を要することなく、プレＲＥＰ細胞の解凍の直後に開始されうることも実証した。

【0384】

【表10】

【0385】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０ＭとＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置との連続的使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＰＤ実施からのＴＩＬのＴ細胞表現型
ＦＡＣＳ分析は、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０ＭとＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置との連続的使用によるＰＤ実施からのＲＥＰ ＴＩＬが、比較的高い割合のＣＤ８^＋細胞（平均４７．１９％±２８．５６％；表１４）を維持することを示した。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ ＴＩＬは共に、主要共刺激分子であるＣＤ２８を高レベルで発現し（それぞれ、平均８３．１０％±３０．０７％および６６．０３％±１６．８１％；図１２および表１５）、それより低い度合でＣＤ２７を発現した（それぞれ、平均２６．４６％±２０．６８％および４０．１２％±２１．１５％；図１２および表１５）。阻害性マーカーに関しては、両方の集団はＰＤ－１（それぞれ、平均１０．９８％±１２．６０％および９．２６％±１４．０３％；図１２および表１５）およびＬＡＧ－３（それぞれ、平均７．４６％±６．９９％および２８．４１％±１９．４０％；図１２および表１５）の低い発現を示したが、ＴＩＭ－３（それぞれ、平均４８．９６％±２０．７０％および６１．０４％±１８．９７％；図１２および表１５）の高い発現を示した。最後に、ＲＥＰ ＴＩＬは主に、保持された増殖能力を有する細胞に特徴的である、セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）細胞およびエフェクターメモリー（Ｔ_ＥＭ）細胞から構成されていた（図１２）。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ ＴＩＬにおけるＴ_ＣＭの平均割合は、それぞれ、５１．８８％±２６．１９％および５４．９６％±１３．８２％であり、Ｔ_ＥＭの平均割合は、それぞれ、３７．８１％±２３．１１％および２９．３１％±１５．４４％であった（表１６）。

【0386】

【表11】

【0387】

総合すると、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０ＭとＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置との連続的使用を用いて本発明者らが開発したＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰプロセスはＴＩＬ細胞療法製品の製造に適用可能であり、これは、好ましいＴ細胞表現型を維持する一方で細胞用量要件を満たしている。

【0388】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続的使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＣ－ＴＩＬ０５１ ＰＤ実施
Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０ＭとＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ装置との連続的使用によるＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰプロセスは、低いプレＲＥＰ収量を示すドナーに良好に機能する。本発明者らはまた、高収量のプレＲＥＰ ＴＩＬのための、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００ＭとＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続的使用によるＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰプロセスも開発した。

【0389】

本発明者らは、３名のドナーからのプレＲＥＰ ＴＩＬを使用して５回のＲＥＰ実施を行った。プレＲＥＰ ＴＩＬを１つのＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍまたはその閉鎖系等価体であるＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ－ＣＳに播種した後（播種細胞数の範囲：８７×１０^６～２００×１０^６）、細胞をＴｒａｎｓＡｃｔで活性化させ、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置において７日間増殖させ、これは平均１２倍の細胞増殖をもたらした。次いで、Ｔ５１０１０２４を除き、培養を１０ＬのＸｕｒｉ（商標）Ｃｅｌｌｂａｇに移し、Ｘｕｒｉ（商標）Ｗ２５系で更に増殖させた。Ｔ５１０１０２４に関しては、異なるフィードスケジュールを比較するために、培養を２つの１０ＬのＸｕｒｉ（商標）Ｃｅｌｌｂａｇに均等に分配した。

【0390】

培養条件
Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置におけるＴＩＬ増殖およびそれに続くＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターにおけるＴＩＬ増殖は、異なるフィードスケジュールを要する。本発明者らが開発したフィードスケジュールの正当性を示すために、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）（第７日）およびＸｕｒｉ（商標）（毎日）の培養の採取した上清からのグルコース、乳酸およびＩＬ－２のレベルを測定した。ＩＬ－２濃度は、細胞増殖速度に無関係に、試験した全てのサンプルに関して、全ての時点で高レベル（＞１０００ ＩＵ／ｍＬ）であることが判明した（図１３）。

【0391】

グルコースレベルも高かったが（図１４）、乳酸は、Ｔ５１０１０２４ａ ＲＥＰを除き、Ｔ細胞によってほぼ許容される低レベルであった。Ｔ５１０１０２４ａ ＲＥＰはＧ－Ｒｅｘ（登録商標）培養終了時の第７日に一時的な高レベルの乳酸を示した（図１４）。このＲＥＰにおいては、新鮮なＲＥＰ ＣＭの添加の結果として、乳酸レベルは低下し、Ｘｕｒｉ（商標）培養中に低レベルのままであり（図１４）、堅牢な細胞増殖が認められた（図１５）。これらのデータは、本発明者らが開発したフィードスケジュールがＧ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）バイオリアクターとの両方におけるＴＩＬ増殖の要件を満たしていることを実証した。

【0392】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続的使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＰＤ実施からのＴＩＬ収量、生存率およびＴ細胞組成
８～１２日間のＸｕｒｉ（商標）増殖の後、ＰＤ実施を終了した。その最小ＲＥＰ収量は３２．４×１０^９細胞であり、これは１×１０^９～１００×１０^９の目標用量範囲に達した（平均収量５５．３８±２１．９１×１０^９；図１５および表１７）。最終的なＲＥＰ産物は高い生存率（平均９８．４２％±０．０８％）およびＣＤ３^＋の割合（平均９７．６４％±０．９５％）をも維持しており、このＲＥＰプロセスの平均細胞増殖倍率は５１４．６±２０６．２である（表１７）。注目すべきことに、プロセスを終了した際に増殖プラトーに到達していなかったため、これらの細胞は更に増殖する可能性を保持しており（図１５）、Ｘｕｒｉ（商標）バイオリアクターにおける培養時間を延長することによって、平均細胞増殖倍率は更に増加しうる。同様に、急速に増殖し、早期に目標細胞数に達したサンプルに関しては、それに応じて、回収のためにＲＥＰプロセスが停止されうる。したがって、ＲＥＰプロセスはＴＩＬの将来の製造時間における柔軟性をもたらす。

【0393】

【表12】

【0394】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクターとの連続的使用およびＴｒａｎｓＡｃｔによるＴＩＬ ＰＤ実施のＴ細胞表現型
ＦＡＣＳによってＴ細胞表現型を分析した。それは、該新規プロセスからのＲＥＰ産物が比較的高いＣＤ８^＋細胞割合を維持していることを示した（平均５１．７０％±２５．４０％；表１７）。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ＴＩＬは共に、高レベルのＣＤ２８（それぞれ、平均７７．１４％±１９．７７％および４９．２６％±２６．１８％）、および中等度レベルのＴＩＭ－３（それぞれ、平均３１．７２％±１８．７０％および３４．６８％±３１．４０％）を発現したが、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３の発現は低レベルであった（これらのマーカーに関する平均陽性率は約１０％以下；図１６および表１８）。また、ＲＥＰ産物は主にＴ_ＣＭおよびＴ_ＥＭ細胞から構成されており（図１６）、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置のみのプロセスから生成されたＴＩＬに類似した有利な表現型を有する。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ ＴＩＬにおけるＴ_ＣＭの平均割合は、それぞれ、４０．１６％±１９．３２％および３１．３４％±１９．８８％であり、Ｔ_ＥＭの平均割合は、それぞれ、５３．５０％±２１．６６％および４８．８６％±２３．９８％であった（表１９）。

【0395】

【表13】

【0396】

総合すると、本発明者らはＸｕｒｉ（商標）ＲＥＰの最適な性能のための培養パラメータを決定した。Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）装置とＸｕｒｉ（商標）バイオリアクターとの連続的使用による本発明者らが開発したＴｒａｎｓＡｃｔ ＲＥＰプロセスは、所望のＴ細胞表現型を維持しながら目標細胞用量を容易に満たしうるＴＩＬ細胞療法製品の製造に適用されうる。

【0397】

ＴＣＲ配列決定によるＰＤ実施からのＴＩＬの特徴づけ
製造規模のＲＥＰ ＰＤ実施の前（プレＲＥＰ）および後のレパートリー多様性を比較するために、２名のドナーからのＴＩＬのＴＣＲベータ鎖の配列決定を行った。ＲＥＰ ＴＩＬはその同族プレＲＥＰ ＴＩＬとの大きなＴＣＲ重複を示した（それぞれ、Ｔ５１０１０１５－３に関しては９２％、Ｔ５１０１０２４ａに関しては７７％）。このことは、プレＲＥＰ ＴＩＬによって提示されたＴＣＲクローンがＲＥＰプロセス後にほとんど残存していたことを示唆している。また、プレＲＥＰとＲＥＰとの各サンプルペアに関して、モリシタ指数（Ｍｏｒｉｓｉｔａ Ｉｎｄｅｘ）を計算した。これは、それらの２つのサンプル間の共有クローンの数と相対的存在量との両方を考慮した相関分析である。値は０から１までの範囲であり、高い値はそれらの２つのサンプルの全体的なレパートリーの間の高い類似性を示す。また、モリシタ指数は比較的高かったが（それぞれ、Ｔ５１０１０１５に関しては０．８０、Ｔ５１０１０２４に関しては０．５４）、このことは再び、ＰＤ実施からのＲＥＰ ＴＩＬがプレＲＥＰ ＴＩＬのレパートリー多様性を十分に保存している可能性があることを示唆している。これはＲＥＰ後の上位１００個のプレＲＥＰクローンの保存およびシンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ）クローン性の追加解析によって更に支持されている。

【0398】

ＰＤ実施からのＴＩＬの機能特徴づけ
ＴＩＬ ＰＤ実施からのＲＥＰ ＴＩＬの機能性に関する証拠を得るために、αＣＤ３刺激に応答した、Ｘｕｒｉ（商標）ＲＥＰ後の３名のドナーからのＴＩＬの細胞活性化およびサイトカイン分泌を調べた。３つのＰＤ産物の全ては多機能性であり、αＣＤ３刺激のみで大量のＩＦＮ－γ、グランザイムＢおよびＴＮＦ－αを産生したが、絶対的なレベルはドナーによって様々であった。一部のドナーに関しては、ＩＬ－２の添加によって、サイトカイン産生が潜在的に増強可能であった。一貫して、ＣＤ４^＋集団およびＣＤ８^＋集団の両方において、４－１ＢＢおよびＯＸ４０の表面発現はαＣＤ３刺激のみによってアップレギュレーションされ、後者の発現はＩＬ－２の添加によって相当に増強された。これらのデータは、Ｃ－ＴＩＬ０５１ ＰＤ実施のＲＥＰ ＴＩＬが、Ｔ細胞活性化シグナルに応答する機能性を保持していることを実証している。

【0399】

模擬実施からのＴＩＬの特徴づけ
前記のＰＤ実施に基づいて、標準的な操作手順を確立した。Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５のフルスケールの模擬実施をＧＭＰ施設において行った。ＲＥＰ産物を試験した。ＴＩＬ最終産物の特徴づけは後記に示されている。

【0400】

模擬実施からのＴＩＬの収量、生存率およびＴ細胞組成
回収時に、両方の模擬実施からのＲＥＰ収量は、高い生存率（Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５に関して、それぞれ、９６．５％および９６．８％）で、本発明者らの目標用量である１×１０^９～１００×１０^９細胞に達した（Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５に関して、それぞれ、１．７２×１０^９および５．９５×１０^９；表２０）。ＲＥＰ ＴＩＬのＣＤ３^＋割合は、Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５に関して、それぞれ、８６．９８％および９７．４２％であり、そのうちの、それぞれ、３０．９６％および９．８１％がＣＤ８^＋Ｔ細胞であった（表２０）。

【0401】

【表14】

【0402】

模擬実施からのＣ－ＴＩＬ０５１のＴ細胞表現型
模擬実施からのＲＥＰ ＴＩＬ産物のＴ細胞活性化マーカーおよび疲弊マーカーならびにメモリー表現型を調べた。ＣＤ４^＋サブセットにおいては、４－１ＢＢの表面発現は両方のサンプルに関して最小であり（Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５に関して、それぞれ、０．２０％および０．８７％）、一方、ＰＤ－１の表面発現は繰り返し検出された（Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５に関して、それぞれ、１４．５６％および２６．９０％）（表２１）。ＣＤ８^＋サブセットにおいては、ＣＤ４^＋サブセットと比較して、４－１ＢＢの表面発現は僅かに高く（Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５に関して、それぞれ、２．３６％および６．１３％）、一方、ＰＤ－１の表面発現は両方のサンプルにおいて低かった（約５％）（表２１）。また、表現型解析は、ＴＩＬ産物の両方が主にメモリー細胞から構成されており、Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５に関して、ナイーブまたは幹細胞メモリー（Ｔ_Ｎ／Ｔ_ＳＣＭ）段階では、それぞれ１９．９３％および２２．３５％であり、セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）段階では、それぞれ２９．１５％および１９．７２％であり、エフェクターメモリー（Ｔ_ＥＭ）段階では、それぞれ３７．５６％および３４．３７％であった（表２２）。エフェクター細胞（Ｔ_ＥＦＦ）の割合は、２つの産物に関して、それぞれ１３．３６％および２３．５６％であった（表２２）。

【0403】

【表15】

【0404】

模擬実施からのＴＩＬの機能特徴づけ
まず、ＲＥＰ ＴＩＬ産物の機能特徴づけのために、ＩＦＮ－γ放出アッセイを行った。抗ＣＤ３／ＣＤ２８結合ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）での一晩の刺激の後、両方の産物は大量のＩＦＮ－γを放出した（Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５に関して、それぞれ、１０．４６ｆｇ／細胞および１６．１５ｆｇ／細胞；図１７）。

【0405】

また、αＣＤ３抗体での一晩の刺激の後、ＲＥＰ ＴＩＬ産物によるＴ細胞活性化マーカーの表面発現も調べた。活性化シグナルは、２つの産物のＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋サブセットのいずれにおいても、４－１ＢＢとＯＸ４０との両方の表面発現を強く誘導した（図１８）。

【0406】

更に、同族腫瘍試料から生成されたＭＯＳに対する、２回のフルスケール模擬実施からのＲＥＰ ＴＩＬのインビトロ腫瘍殺傷効果を評価した。形態学的特徴による特徴づけ、ＥｐＣＡＭの免疫組織化学染色およびＥｐＣＡＭとｐａｎ－サイトケラチンとの免疫蛍光染色は、Ｔ５１０１０３４およびＴ５１０１０３５ ＭＯＳが共に腫瘍由来であることを証明した。後続の効力アッセイにおいて、両方の産物は、より高いエフェクター対標的比（５：１および１０：１；図１９）で共培養された場合にＭＯＳを根絶することが可能であった。これは、残存するＮＩＲ６８０色素陽性生腫瘍細胞からの蛍光強度を測定することによって定量された。どちらの場合も、効果は僅か８時間の共培養で検出可能であり、時間の経過と共に次第に顕著になった（図１９）。重要なことに、共培養におけるＨＬＡクラスＩ遮断抗体の添加はＴ５１０１０３４ ＴＩＬ産物の殺傷効果を完全に無効にしたが、ＨＬＡクラスＩＩ遮断は効果を全く示さなかった（図２０、左）。このことは、殺傷機能が主にＣＤ８^＋Ｔ細胞によって媒介されることを示唆している。Ｔ５１０１０３５の場合には、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ遮断抗体のどちらの添加も殺傷効果を無効にすることが可能であった（図２０、右）。このことは、該殺傷機能がＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋の両方のＴ細胞を要したことを示唆している。ドナーの違いにかかわらず、どちらの場合にもＨＬＡ認識に依存していることは、Ｔ５１０１０３４ ＴＩＬおよびＴ５１０１０３５ ＴＩＬの腫瘍殺傷機能が腫瘍細胞に特異的であることを実証した。

【0407】

また、第３日にＴＩＬおよびＭＯＳの共培養（Ｅ：Ｔ＝５：１）の培養上清を採取し、サイトカインアッセイを行った。ＴＩＬのみの対照と比較して、ＴＩＬとＭＯＳとの共培養群は培養上清中のＩＦＮ－γおよびグランザイムＡのレベルの有意な増加を示した（図２１）。Ｔ５１０１０３４ ＴＩＬおよびＭＯＳ共培養上清中のグランザイムＢのレベルも増加し、Ｔ５１０１０３５ ＴＩＬおよびＭＯＳ共培養上清中のＴＮＦ－αのレベルも増加した（図２１）。この結果は、既に記載されているＴＩＬ腫瘍殺傷効力の結果と一致した。更に、ＨＬＡクラスＩ遮断抗体の添加は両方のドナーからのＴＩＬおよびＭＯＳの共培養上清中のサイトカインレベルを劇的に減少させたが、ＨＬＡクラスＩＩ遮断抗体の添加はＴ５１０１０３５ ＴＩＬおよびＭＯＳの共培養上清中のサイトカインレベルを主に減少させた（図２１）。ドナーの違いにかかわらず、どちらの場合にもＨＬＡ認識に依存していることは、ＴＩＬの腫瘍殺傷効果がＴＣＲを媒介していることを実証した。総合すると、これらのデータは、模擬実施からのＴＩＬが自己腫瘍細胞の殺傷において非常に有効であることを実証した。

【0408】

結論
本発明者らは、αＣＤ３／αＣＤ２８ナノ粒子を使用する、フィーダーを使用しないＴＩＬ ＲＥＰプロセスの開発に成功した。該ＴＩＬ ＲＥＰプロセスはプレＲＥＰ細胞の解凍の直後に開始可能である。プレＲＥＰ ＴＩＬの生細胞数に応じて、異なる細胞増殖装置または系［すなわち、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ－ＣＳおよびＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５バイオリアクター］がＲＥＰプロセスに使用可能であり、目標治療用量が達成されうる。ＴＩＬにおいてはＴ細胞レパートリー多様性が保存される。ＴＩＬは、所望のＴ細胞表現型、Ｔ細胞活性化マーカーのアップレギュレーション能力、およびＴ細胞活性化シグナルに応答した種々のサイトカインの産生能力をも示す。更に、模擬実施からのＴＩＬの機能特徴づけは、該産物が自己腫瘍細胞の殺傷において有効であることを実証した。

【0409】

本発明の範囲は、前記に具体的に示され記載されているものによって限定されるものではない。材料、構成、構造および寸法の記載されている例に代わる適切な代替物が存在することを、当業者は認識するであろう。本発明の記載においては、特許および種々の刊行物を含む多数の参考文献が引用され、考察されている。そのような参考文献の引用および考察は、もっぱら本発明の記載を明確にするためになされているに過ぎず、いずれの参考文献も、本明細書に記載されている本発明の先行技術であると認めるものではない。本明細書中で引用され記載されている全ての参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書に記載されているものの変形、修飾および他の実施が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者に見出されるであろう。本発明の特定の実施形態が示されており、記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変更および修飾が行われうることが、当業者に明らかであろう。前記説明に記載されている事柄は、もっぱら例示として記載されており、限定的なものとして記載されているのではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【国際調査報告】