特表 2025-503989 治療用サイトカイン及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-06

(54)【発明の名称】治療用サイトカイン及び方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/52 20060101AFI20250130BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20250130BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250130BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250130BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250130BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250130BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250130BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250130BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20250130BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20250130BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20250130BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20250130BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250130BHJP

【ＦＩ】

C07K14/52 ZNA

C07K19/00

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/19

A61K38/20

A61K38/21

A61P29/00

A61P43/00 105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024544664

(86)(22)【出願日】2023-01-30

(85)【翻訳文提出日】2024-09-25

(86)【国際出願番号】 EP2023052202

(87)【国際公開番号】W WO2023144393

(87)【国際公開日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】22382073.9

(32)【優先日】2022-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521364982

【氏名又は名称】フンダシオ セントレ デ レグラシオ ヘノミカ

(71)【出願人】

【識別番号】512171032

【氏名又は名称】インスティトゥシオ カタラナ デ レセルカ イ エストゥディス アヴァンカッツ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】フランシスコ ハビエル デルガド ブランコ

(72)【発明者】

【氏名】ルイス セラーノ プブル

(72)【発明者】

【氏名】アリアドナ テレサ モンテロ ブライ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084BA02

4C084BA41

4C084CA53

4C084DA01

4C084DA12

4C084DA24

4C084NA05

4C084ZB11

4C084ZB21

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA01

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書に開示されるのは、野生型サイトカイン単量体に比べて生理活性が向上した一本鎖二量体サイトカインである。本開示の一本鎖二量体サイトカインは、炎症状態又は増殖状態に関連する様々な疾患又は障害の治療において有用でありうる。一本鎖二量体サイトカインを対象に送達するための送達ベクター又は薬剤も開示される。そのような送達ベクター又は薬剤としては、細胞、細菌及びバクテリオファージが挙げられる。
【選択図】 図２６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、前記サイトカイン単量体ドメイン又は機能部分の一方の配列が連続せず、他方のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列によって中断されている一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項2】

（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、前記第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列が一続きに連続しており、一方で、前記第１のサイトカイン単量体ドメインの配列は、前記第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分が前記第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＮ末端に配置され、前記第１のサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分が前記第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＣ末端に配置されている、請求項１に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項3】

前記第１のサイトカイン単量体ドメインの前記第１の配列部分が、天然のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に対応し、前記第１のサイトカイン単量体ドメインの前記第２の配列部分が、前記天然のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に対応する、請求項２に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項4】

請求項２又は３に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
ｉ）前記一本鎖二量体サイトカインポリペプチドのフリーなＮ末端及びＣ末端、並びに前記第１のサイトカイン単量体ドメインの前記第１及び第２の配列部分を、それらの天然の配列順序で含む分割ドメイン、並びに
ｉｉ）前記第２のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分及び第２の配列部分として構築された、前記第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、前記第１及び第２の配列部分が、それらの天然の配列順序と比較して逆向きの順序である連続ドメイン
を含み、
前記分割ドメインにおいて、前記第１のサイトカイン単量体ドメインの前記第１及び第２の配列部分の配列が、前記連続ドメインの配列によって分離されている
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項5】

ｉ）第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ及びＢを含む、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢと、第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ及びＤを含む前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤと、前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｖ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ及びＢを含む前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｖｉ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢと、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣを架橋するリンカーペプチド、並びにｖｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ及びＤを含む前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、を含む一本鎖二量体クラスＩポリペプチドである、請求項３又は４に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項6】

ｉ）第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｃを含む、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣと、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤ～Ｆを含む前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦと、前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｖ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｃを含む前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｖｉ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣと、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤを架橋するリンカーペプチド、及びｖｉｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤ～Ｆを含む前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、を含む一本鎖二量体クラスＩＩポリペプチドである、請求項３又は４に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項7】

請求項３～４及び６のいずれか一項に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
ｉ）配列番号３２５－（Ｘｎ１）－配列番号３２６－（ＮｔＣｔ）－配列番号３２７－（Ｘｎ２）－配列番号３２８の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＬ－２２、
ｉｉ）配列番号１９５－（Ｘｎ１）－配列番号１９６－（ＮｔＣｔ）－配列番号１９７－（Ｘｎ２）－配列番号１９８の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＬ－１９、
ｉｉｉ）配列番号２００－（Ｘｎ１）－配列番号２０１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２０２－（Ｘｎ２）－配列番号２０３の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＬ－２０、
ｉｖ）配列番号２１０－（Ｘｎ１）－配列番号２１１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２１２－（Ｘｎ２）－配列番号２１３の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＬ－２６、
ｖ）配列番号２１５－（Ｘｎ１）－配列番号２１６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２１７－（Ｘｎ２）－配列番号２１８の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＦＮλ２、
ｖｉ）配列番号２２０－（Ｘｎ１）－配列番号２２１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２２２－（Ｘｎ２）－配列番号２２３の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＦＮλ３、
ｖｉｉ）配列番号２２５－（Ｘｎ１）－配列番号２２６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２２７－（Ｘｎ２）－配列番号２２８の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＦＮλ１、
ｖｉｉｉ）配列番号２３０－（Ｘｎ１）－配列番号２３１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２３２－（Ｘｎ２）－配列番号２３３の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＦＮα１／１３、
ｉｘ）配列番号２３５－（Ｘｎ１）－配列番号２３６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２３７－（Ｘｎ２）－配列番号２３８の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＦＮα２、
ｘ）配列番号２４０－（Ｘｎ１）－配列番号２４１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２４２－（Ｘｎ２）－配列番号２４３の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＦＮβ、
ｘｉ）配列番号２４５－（Ｘｎ１）－配列番号２４６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２４７－（Ｘｎ２）－配列番号２４８の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＦＮΩ１、
ｘｉｉ）配列番号２５０－（Ｘｎ１）－配列番号２５１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２５２－（Ｘｎ２）－配列番号２５３の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＦＮε、
又は
ｘｉｉｉ）配列番号２５５－（Ｘｎ１）－配列番号２５６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２５７－（Ｘｎ２）－配列番号２５８の配列若しくはそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＦＮκ、
であり、
（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）がペプチドリンカーである、
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項8】

配列番号６５、配列番号６６、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、若しくは配列番号２８８の配列、又はそれに対して少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性並びに／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－２２受容体１及び／若しくはＩＬ－２２受容体２との相互作用を保持する一本鎖二量体ＩＬ－２２ポリペプチドである、請求項３～４及び６～７のいずれか一項に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項9】

配列番号７６の配列又はそれと少なくとも８０％同一な配列を含む、又はそれからなり、少なくとも同じ安定性並びに／若しくは少なくとも同じレベルのＩＬ－１０受容体及びＩＬ－２２受容体との相互作用を保持する一本鎖キメラＩＬ－１０－ＩＬ－２２ポリペプチドが提供される、請求項３～４及び６のいずれか一項に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項10】

前記第１のサイトカイン単量体ドメインの前記第１の配列部分が、天然のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に対応し、前記第１のサイトカイン単量体ドメインの前記第２の配列部分が、天然のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に対応する、請求項２に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項11】

請求項２又は１０に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
ｉ）前記一本鎖二量体サイトカインポリペプチドのフリーなＮ末端及びＣ末端、並びに前記第１のサイトカイン単量体ドメインの前記第１及び第２の配列部分を、それらの天然の配列順序と比較して逆向きに含む分割ドメイン、並びに
ｉｉ）前記第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分をその天然の配列順序で含む連続ドメイン
を含み、
前記分割ドメインにおいて、前記第１のサイトカイン単量体ドメインの前記第１及び第２の配列部分の配列が、前記連続ドメインの配列によって分離されている
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項12】

請求項１０又は１１に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
ａ）リンカーペプチドが、第１のクラスＩサイトカイン単量体の第４のαヘリックスと、第２のクラスＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックスを架橋し、
ｂ）リンカーペプチドが、第２のクラスＩサイトカイン単量体の第４のαヘリックスと、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックスを架橋し、
前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ及びＢは架橋されていない、又は前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢ及びＣは架橋されていない、又は前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ及びＤは架橋されていない、一本鎖二量体クラスＩポリペプチドである、
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項13】

短鎖クラスＩサイトカインをベースとし、
ｉ）配列番号８９－（Ｘｎ１）－配列番号９０－（Ｘｎ２）－配列番号９１を含む二量体ＩＬ－２、
ｉｉ）配列番号９３－（Ｘｎ１）－配列番号９４－（Ｘｎ２）－配列番号９５を含む二量体ＩＬ－４、
ｉｉｉ）配列番号９７－（Ｘｎ１）－配列番号９８－（Ｘｎ２）－配列番号９９を含む二量体ＩＬ－３、
ｉｖ）配列番号１０３－（Ｘｎ１）－配列番号１０４－（Ｘｎ２）－配列番号１０５を含む二量体ＩＬ－７、
ｖ）配列番号１０７－（Ｘｎ１）－配列番号１０８－（Ｘｎ２）－配列番号１０９を含む二量体ＩＬ－９、
ｖｉ）配列番号１１０－（Ｘｎ１）－配列番号１１１－（Ｘｎ２２）－配列番号１１２を含む二量体ＩＬ－１５、
ｖｉｉ）配列番号１１３－（Ｘｎ１）－配列番号１１４－（Ｘｎ）－配列番号１１５を含む二量体ＩＬ－２１、
ｖｉｉｉ）配列番号１１６－（Ｘｎ１）－配列番号１１７－（Ｘｎ２）－配列番号１１８を含む二量体ＴＳＬＰ、及び
ｉｘ）二量体ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号１２０－（Ｘｎ１）－配列番号１２１－（Ｘｎ２）－配列番号１２配列番号１０１を含みうる、又はそれからなりうる）
であるか、
それらと少なくとも８０％同一な、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体短鎖クラスＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する配列
であり、
（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）がペプチドリンカーである、
請求項１０～１２のいずれか一項に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項14】

長鎖クラスＩサイトカインをベースとし、
ｉ）配列番号１３５－（Ｘｎ１）－配列番号１３６－（Ｘｎ２）－配列番号１３７を含む二量体ＩＬ－６、
ｉｉ）配列番号１３９－（Ｘｎ１）－配列番号１４０－（Ｘｎ２）－配列番号１４１を含む二量体ＩＬ－１１、
ｉｉｉ）配列番号１４３－（Ｘｎ１）－配列番号１４４－（Ｘｎ２）－配列番号１４５を含む二量体ＩＬ－１２α、
ｉｖ）配列番号１４７－（Ｘｎ１）－配列番号１４８－（Ｘｎ２）－配列番号１４９を含む二量体ＩＬ－２３α、
ｖ）配列番号１５１－（Ｘｎ１）－配列番号１５２－（Ｘｎ２）－配列番号１５３を含む二量体ＩＬ－２７α、
ｖｉ）配列番号１５４－（Ｘｎ１）－配列番号１５５－（Ｘｎ２）－配列番号１５６を含む二量体ＩＬ－３１、
ｖｉｉ）配列番号１５８－（Ｘｎ１）－配列番号１５９－（Ｘｎ２）－配列番号１６０を含む二量体ＣＬＣＦ１、
ｖｉｉｉ）配列番号１６１－（Ｘｎ１）－配列番号１６２－（Ｘｎ２）－配列番号１６３を含む二量体ＯＮＣＭ、
ｉｘ）配列番号１６５－（Ｘｎ１）－配列番号１６６－（Ｘｎ２）－配列番号１６７を含む二量体ＣＴＦ１、
ｘ）配列番号１６９－（Ｘｎ１）－配列番号１７０－（Ｘｎ２）－配列番号１７１を含む二量体ＣＮＴＦ、
ｘｉ）配列番号１７３－（Ｘｎ１）－配列番号１７４－（Ｘｎ２）－配列番号１７５を含む二量体ＬＩＦ、及び
ｘｉｉ）配列番号１７７－（Ｘｎ１）－配列番号１７８－（Ｘｎ２）－配列番号１７９を含む二量体ＣＳＦ３
であるか、
それらと少なくとも８０％同一な、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体長鎖クラスＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する配列
であり、
（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）がペプチドリンカーである、
請求項１０～１２のいずれか一項に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項15】

二量体ＩＬ－２であり、配列番号８９－（Ｘｎ１）－配列番号９０－（Ｘｎ２）－配列番号９１を含み、前記ペプチドリンカーＸｎ１及びＸｎ２が同一であり、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、又は配列番号２７５を含む、又はそれからなる、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項16】

請求項１０又は１１に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
ａ）リンカー配列が、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックスと、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の第６のαヘリックスを架橋し、
ｂ）リンカー配列が、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の第６のαヘリックスと、前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックスを架橋し、
ｃ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の第１及び第２のαヘリックス、第２及び第３のαヘリックス、第３及び第４のαヘリックス、第４及び第５のαヘリックス、又は第５及び第６のαヘリックスは架橋されていない、
一本鎖二量体クラスＩＩポリペプチドである、
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項17】

（ａ）第１のクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列が一続きに連続しており、一方で、前記第２のサイトカイン単量体ドメインの配列は、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置された前記第２のクラスＩサイトカイン単量体の前記第１の配列部分が、天然のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分に対応し、前記第２のクラスＩサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置された前記第２のクラスＩサイトカイン単量体の前記第２の配列部分が、前記天然のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分に対応する、請求項１に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項18】

請求項１又は１７に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
ｉ）前記一本鎖二量体クラスＩサイトカインポリペプチドのフリーなＮ末端及びＣ末端、並びに前記第２のクラスＩサイトカイン単量体ドメインの第１及び第２の配列部分を含む分割ドメイン、並びに
ｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む連続ドメイン
を含み、
前記分割ドメインにおいて、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体ドメインの前記第１及び第２の配列部分の配列が、前記連続ドメインの配列によって分離されている、
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項19】

請求項１７又は１８に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
ａ）リンカーペプチドが、第１のクラスＩサイトカイン単量体の第４のαヘリックスと、前記第２のクラスＩサイトカイン単量体の第３のαヘリックスを架橋し、
ｂ）リンカーペプチドが、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックスと、前記第２のクラスＩサイトカイン単量体の第２のαヘリックスを架橋し、
ｃ）リンカーペプチドが、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックス（αヘリックスＡ）と、前記第２のクラスＩサイトカイン単量体の第２のαヘリックスを架橋し、
ｄ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢ及びＣが架橋されされていない、
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項20】

配列番号２９６の配列又はそれと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルのＩＬ－２受容体との相互作用を保持する一本鎖二量体ＩＬ－２ポリペプチドである、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項21】

（ａ）第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列が一続きに連続しており、その天然の配列順序と比較して逆の順序であり、一方で、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの配列は、前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＮ末端に配置された前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分が天然のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に対応し、前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＣ末端に配置された前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの前記第２の配列部分が前記天然のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に対応する、請求項１に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項22】

請求項２又は２１に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
ｉ）前記一本鎖二量体クラスＩＩサイトカインポリペプチドの前記フリーなＮ末端及びＣ末端、並びに前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの前記第１及び第２の配列部分を、それらの天然の配列順序で含む分割ドメイン、並びに
ｉｉ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む連続ドメイン
を含む一本鎖二量体クラスＩＩサイトカインポリペプチドであり、
前記分割ドメインにおいて、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの前記第１及び第２の配列部分の配列が、前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの前記連続ドメインの配列によって分離されている
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項23】

前記リンカーペプチドが、約３～約２０個のアミノ酸、約３～約１６個のアミノ酸、約４～約１２個のアミノ酸、約４～約８個のアミノ酸、約３～約８個のアミノ酸又は約３～約６個のアミノ酸の配列を有し、前記リンカーペプチド配列が、５個以下の、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含み、任意選択で、前記リンカーペプチドが構造化リンカーである、請求項５～７、１２～１６及び１９のいずれか一項に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項24】

クラスＩサイトカインであるスワップドドメイン二量体を形成する第１及び第２のサイトカイン単量体ドメインを含み、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第２のサイトカイン単量体のヘリックスＡ～Ｃ及び前記第１のサイトカイン単量体のヘリックスＤを含む第１のサイトカイン単量体ドメイン、並びに前記第２のサイトカイン単量体のヘリックスＤ及び前記第１のサイトカイン単量体のヘリックスＡ～Ｃを含む第２のサイトカイン単量体ドメインを含み、リンカーペプチドが、前記第２のサイトカイン単量体のヘリックスＤと、前記第１のサイトカイン単量体のヘリックスＡを架橋する、請求項１に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項25】

配列番号１０１－（ＮｔＣｔ）－配列番号１０２の配列（（ＮｔＣｔ）はペプチドリンカー）又はそれと少なくとも８０％同一な配列を含む二量体ＩＬ－５ポリペプチドであり、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－５受容体との相互作用を保持する、請求項２４に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項26】

スワップドドメイン二量体を形成し、クラスＩＩサイトカインである第１及び第２のサイトカイン単量体を含み、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第２のサイトカイン単量体のヘリックスＡ～Ｃ、及び前記第１のサイトカイン単量体のヘリックスＤ～Ｆを含む第１のサイトカイン単量体ドメイン、並びに前記第２のサイトカイン単量体のヘリックスＤ～Ｆ及び前記第１のサイトカイン単量体のヘリックスＡ～Ｃを含む第２のサイトカイン単量体ドメインを含み、リンカーペプチドが、前記第２のサイトカイン単量体のヘリックスＦと、前記第１のサイトカイン単量体のヘリックスＡを架橋する、請求項１に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項27】

一本鎖二量体ＩＬ－１０であり、配列番号１１－（ＮｔＣｔ）－配列番号１２の配列（（ＮｔＣｔ）はペプチドリンカー）又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－１０受容体との相互作用を保持する、請求項２６に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項28】

配列番号９若しくは配列番号１０又はそれらと少なくとも８０％同一な配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－１０受容体との相互作用を保持する、請求項２７に記載の一本鎖二量体ＩＬ－１０ポリペプチド。

【請求項29】

一本鎖二量体ＩＦＮγであり、配列番号１４－（ＮｔＣｔ）－配列番号１５の配列（（ＮｔＣｔ）はペプチドリンカー）又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＦＮγ受容体との相互作用を保持する、請求項２６に記載の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【請求項30】

配列番号１８又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＦＮγ受容体との相互作用を保持する、請求項２９に記載の一本鎖二量体ポリペプチド。

【請求項31】

請求項１～３０のいずれか一項に記載の前記一本鎖二量体ポリペプチドを含むポリペプチド。

【請求項32】

請求項１～３１のいずれか一項に画定されたポリペプチドをコードする核酸。

【請求項33】

請求項３２に画定された核酸を含む発現ベクター。

【請求項34】

請求項３２に画定された核酸又は請求項３３に画定された発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項35】

請求項１～３１のいずれか一項に画定されたポリペプチドを含む医薬組成物。

【請求項36】

疾患を治療する方法であって、請求項１～３１のいずれか一項に画定されたポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含み、任意選択で、対象は炎症反応又は細胞増殖の速度の減少又は増加から利益が得られる対象である、方法。

【請求項37】

疾患の治療に使用するための、請求項１～３１のいずれか一項に画定されたポリペプチドであって、任意選択で、疾患は炎症反応又は細胞増殖の速度の減少又は増加から利益が得られる疾患である、ポリペプチド。

【請求項38】

疾患の治療用医薬品の製造のための、請求項１～３１のいずれか一項に画定されたポリペプチドであって、任意選択で、疾患は炎症反応又は細胞増殖の速度の減少又は増加から利益が得られる疾患である、ポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規治療用サイトカイン及び治療におけるそれらの使用方法に関する。具体的には、本発明は、新規二量体サイトカインに関し、より詳細には、強制的な立体構造の／構造的に制限された、二量体サイトカイン、及び治療におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

サイトカインは、ヒトの治療において可能性を秘めた大変興味深い生体分子である。それらは免疫系を調節し、とりわけ、がん、炎症、免疫応答、組織再生において重要な役割を果たす。その大きな可能性にもかかわらず、治療目的で承認されているサイトカインはほんの一握りである。これは、それらの多くが、短い血清中半減期、高い製造コスト、多面的効果、高い毒性などにくわえて、通常、種々の細胞型を標的とするため、有害な副作用を有する可能性があるからである（図２を参照）。

【0003】

選択されたサイトカインの薬力学及び薬物動態を向上させるために、様々な方法が提案されてきた（例えば、ＩＬ－７のＩｇＧ－Ｆｃ領域への融合^２や、多くのサイトカインに対するアジュバントポリエチレングリコールの使用など^３）。改良が必要な他の特性としては、親和性やタンパク質分解に対する耐性及び／又は毒性が挙げられ、これは、１つ又は複数の受容体との相互作用を標的とする表面変異を設計して、投与量を減らしながらも治療効果を最大化することによって部分的に解決できる可能性がある^４）。

【0004】

サイトカインの毒性を減少させる可能性のある１つの方法は、治療用細菌を使用することによってそれらを局所的に送達することである。目的の治療用分子をｉｎ ｓｉｔｕで産生及び送達する組換え細菌の使用が詳しく論文に報告されている^５。そのような取り組みの多くは、動物モデルでも高い有効性を示しているが、疾患部位で治療用分子を充分に有効な濃度に到達させ、維持することが困難であることもあり、臨床的な成功には至っていない。それでもなお、安価に製造でき、経口又は局所的に送達でき（例えば、ざ瘡のアクネ菌（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）；ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／３１９８１５７８／）、全身的な副作用を最小限に抑える、効果的な治療に対する期待から、治療薬としての微生物の利用に対する関心は高まり続けている。いくつかの企業が、ヒト治療用の細菌を開発中であり（例えば、Ｐｕｌｍｏｂｉｏｔｉｃｓ、Ｅｌｉｇｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｙｎｌｏｇｉｃ、Ａｚｉｔｒａ、Ｉｎｔｒｅｘｏｎ、Ｒｅｂｉｏｔｉｘ）、又は標的細菌で発現させるための目的の遺伝子を含む、バクテリオファージを用いている（例えば、Ａｒｍａｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｌｉｇｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。

【0005】

毒性を減少させ、有効性を向上させる別の方法は、所望の作用部位にサイトカインを向かわせる分子（例えば抗体）にサイトカインを融合させること；細胞が異なれば受容体成分の発現レベルが異なることを最終的に考慮して、受容体アセンブリの様々な成分のうち１つに対する親和性を相対的に変化させる変異を導入すること（例えば、ＩＬ２とその受容体α（ＩＬ－２ＲＡ））；又は、サイトカインを、受容体認識を妨げ、かつ正しい位置でサイトカインから切り離される、他のタンパク質ドメインに融合させること；でありうる。

【0006】

上記の背景に対して、新規の、及び／若しくは改善された治療用サイトカイン、治療法、並びに／又は方法を得て、それらにより、従来の方法又は生物学的送達ベクターを使用して投与を行った場合に、サイトカインの半減期、安全性、有効性、特異性、及び／又は局所ターゲティングが改善されることが望ましい。

【0007】

本発明は、先行技術における欠陥の１つ又は複数を克服、又は少なくとも軽減しようとするものである。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、サイトカイン単量体ドメイン又は機能部分の一方の配列が連続しておらず、他方のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列によって中断されている一本鎖二量体サイトカインポリペプチドに関する。

【0009】

一実施形態では、第１のサイトカイン単量体ドメインの配列又は機能部分は連続しておらず、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列によって中断されている。

【0010】

この実施形態のいくつかの側面では（Ｉｎ ｓｏｍｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）、第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分は、天然のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に相当し、第１のサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分は、天然のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に相当する。

【0011】

この実施形態の他の側面では（Ｉｎ ｏｔｈｅｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）、第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分は、天然のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に相当し、第１のサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分は、天然のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に相当する。

【0012】

別の実施形態では、第２のサイトカイン単量体ドメインの配列又は機能部分は連続しておらず、第１のサイトカイン単量体ドメインの配列又はその機能部分によって中断されている。

【0013】

この実施形態のいくつかの側面では、第１のクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列は一続きに連続し（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、一方で、第２のサイトカイン単量体ドメインの配列は、第１のクラスＩサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置された前記第２のクラスＩサイトカイン単量体の第１の配列部分が、天然のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分に対応し、第２のクラスＩサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置された第２のクラスＩサイトカイン単量体の第２の配列部分が、天然のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分に対応する。

【0014】

この実施形態の他の側面では、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列は一続きに連続し、その天然の配列順序と比較して逆の順序であり、一方で、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの配列は、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＮ末端に配置された第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分が、天然のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に対応し、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＣ末端に配置された第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分が、天然のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に対応する。

【0015】

別の実施形態では、本発明は、スワップドドメイン二量体を形成する第１のサイトカイン単量体及び第２のサイトカイン単量体を含み、リンカーペプチドが、第１のサイトカイン単量体のＮ末端と、第２のサイトカイン単量体のＣ末端を架橋する一本鎖二量体サイトカインポリペプチドに関する。

【0016】

本発明はさらに、本発明の一本鎖二量体ポリペプチドを含むポリペプチドに関する。

【0017】

本発明はさらに、本発明の一本鎖二量体ポリペプチド又はそれを含むポリペプチドをコードする核酸に関する。

【0018】

本発明はまた、本発明の核酸を含む発現ベクターに関する。

【0019】

さらに提供されるのは、本発明の核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞である。

【0020】

本発明はまた、本発明の一本鎖二量体ポリペプチド又はそれを含むポリペプチドを含む医薬組成物に関する。

【0021】

さらに提供されるのは、疾患を治療する方法であって、本発明の一本鎖二量体ポリペプチド又はそれを含むポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含み、任意選択で、対象は炎症反応又は細胞増殖の速度の減少又は増加から利益が得られる対象である、方法である。

【0022】

本発明はさらに、疾患の治療に使用するための、本発明の一本鎖二量体ポリペプチド又はそれを含むポリペプチドであって、任意選択で、疾患は炎症反応又は細胞増殖の速度の減少又は増加から利益が得られる疾患である、ポリペプチドに関する。

【0023】

本発明はさらに、疾患の治療用医薬品の製造のための、本発明の一本鎖二量体ポリペプチド又はそれを含むポリペプチドであって、任意選択で、疾患は炎症反応又は細胞増殖の速度の減少又は増加から利益が得られる疾患である、ポリペプチドに関する。

【0024】

広義には、本開示は、有益な治療効果をもたらすことができる新しいサイトカインポリペプチドバリアントの構造設計に関する。そのような治療用ポリペプチドは、例えば、経口で、噴霧、注射、又はウイルス、バクテリオファージ及び／若しくは細菌のような生物学的ベクターを使用することによって、当業者に利用可能な任意の方法によって、標的対象に送達することができる。

【0025】

本開示の新規サイトカインポリペプチドバリアントは、共有結合的に連結して一本鎖ポリペプチドを形成するサイトカイン単量体配列の対を含む。サイトカイン単量体配列は、同じ又は異なる野生型サイトカインタンパク質配列に由来しうる。有利には、本開示の一本鎖ポリペプチドは折り畳まれて、２つの構造ドメイン（例えば、左及び右３Ｄドメイン）を含む三次構造を形成し、各３Ｄドメインは、それが基になる／由来する自然のサイトカイン単量体の機能及び／若しくは活性を有することができる、又は異なる機能若しくは活性を有することができる。

【0026】

１つの態様において、開示されるのは、（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分が、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分に、ペプチドリンカーによって融合され、ペプチドリンカー配列が、５個以下の（好ましくは３個以下の）隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドである。好適には、人工ペプチドリンカーは約３～約２０個のアミノ酸の配列を有する。実施形態では、人工ペプチドリンカーは、約３～約１６個のアミノ酸、約３～約１２個のアミノ酸、約３～約８個のアミノ酸、約４～約８個のアミノ酸、又は約４～約６個のアミノ酸を有する。

【0027】

第２の態様において、開示されるのは、（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第２のサイトカイン単量体ドメインの配列又はその機能部分が、第１のサイトカイン単量体の第１の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置され、第１のサイトカイン単量体の第２の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置されるように、第１のサイトカイン単量体ドメインの配列内に挿入されている一本鎖二量体サイトカインポリペプチドである。有利には、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、左３Ｄサイトカインドメイン及び右３Ｄサイトカインドメインを含む三次構造を有し、左３Ｄサイトカインドメインは、右３Ｄサイトカインドメインに２つの架橋リンカーペプチドによって接続されている。実施形態では、左３Ｄサイトカインドメインは、好適には第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の第１及び第２の配列部分から形成された分割ドメインサイトカインであり、右３Ｄサイトカインドメインは、好適には第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分から形成された連続ドメインサイトカインである。

【0028】

第３の態様において、開示されるのは、（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第２のサイトカイン単量体ドメインの配列又はその機能部分が、第１のサイトカイン単量体の第１の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置され、第１のサイトカイン単量体の第２の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置されるように、前記第１のサイトカイン単量体ドメインの配列内に挿入されている一本鎖二量体サイトカインポリペプチドである。さまざまな実施形態では、第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分は、自然のサイトカイン単量体のＣ末端部分に対応し、第１のサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分は、自然のサイトカイン単量体のＮ末端部分に対応する。

【0029】

第４の態様において、開示されるのは、（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第１のサイトカイン単量体ドメイン配列が、第２のサイトカイン単量体ドメイン配列と異なる種類のサイトカインに由来し、左サイトカインドメインが、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の第１及び第２の配列部分から形成された分割ドメインサイトカインであり、右３Ｄサイトカインドメインが、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分から形成された連続ドメインサイトカインである一本鎖二量体サイトカインポリペプチドである。好適には、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分で形成される左３Ｄサイトカインドメイン、及び第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分で形成される右３Ｄサイトカインドメインを含む三次構造を有する。有利には、第１のサイトカイン単量体ドメインは、第２のサイトカイン単量体ドメインに、２つの架橋リンカーペプチドによって接続されている。実施形態では、第１のサイトカイン単量体ドメインはクラスＩＩサイトカインに由来し、第２のサイトカイン単量体はクラスＩサイトカインに由来する、又は第１のサイトカイン単量体ドメインはクラスＩサイトカインに由来し、第２のサイトカイン単量体はクラスＩＩサイトカインに由来する。

【0030】

第５の態様において、開示されるのは、（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第１のサイトカイン単量体ドメイン配列が、第２のサイトカイン単量体ドメイン配列と異なる種類のサイトカインに由来し、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドが、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分で形成される左３Ｄサイトカインドメイン、及び第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分で形成される右３Ｄサイトカインドメインを含む三次構造を有する一本鎖二量体サイトカインポリペプチドである。さまざまな実施形態では、（ｉ）第１のサイトカイン単量体ドメイン配列は、ＩＬ－１０若しくはＩＦＮγサイトカイン配列に由来し、第２のサイトカイン単量体ドメイン配列は、クラスＩ若しくはクラスＩＩサイトカイン配列に由来する、又は（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体ドメイン配列は、クラスＩ若しくはクラスＩＩサイトカイン配列に由来し、第２のサイトカイン単量体ドメイン配列は、ＩＬ－１０若しくはＩＦＮγサイトカイン配列に由来する。

【0031】

本開示はまた、本開示のポリペプチドのいずれかを包含する単離されたポリヌクレオチドを包含する。そのようなポリヌクレオチドを含む、バクテリオファージ又はウイルスベクターなどのベクターもまた、包含される。

【0032】

さらに、本開示は、本開示のポリヌクレオチド及び／又は本開示のポリペプチドを発現する細胞を含む細胞を包含する。

【0033】

本開示はまた、本開示のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及び／又は細胞を含む医薬組成物に関する。

【0034】

さらに、本開示は、本開示のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び／又は（医薬／治療）組成物を必要とする治療的使用及び医学的治療の方法に関する。

【0035】

本開示の様々な態様及び実施形態は、節（Ｃｌａｕｓｅｓ）及び添付の特許請求の範囲において画定される。本発明の概念のさらなる態様及び実施形態は、本明細書の他の箇所に記載される。

【0036】

本発明の１つの態様又は実施形態の任意の特徴は、別段の記載がない限り、本発明の他の態様又は実施形態の特徴の任意の組み合わせと組み合わせることができ、そのような組み合わせは、特許請求される発明の範囲内にあることが理解されるであろう。したがって、本発明は、本開示の節及び請求項のすべてをあらゆる組み合わせで包含する（但しそのような組み合わせが相容れない場合を除く）。

【図面の簡単な説明】

【0037】

本発明は、添付の図面により更に説明される。

【0038】

【図1】図１は、フォールディカインの一般的概念の概略図。基本的なフォールディカイン概念は、配列及び３Ｄ空間において連続的なフォールディングしたサイトカインドメイン（透明リボン；右手側）が、そのＮ及びＣ末端（灰色のＸｎリンカー；これは、天然Ｎ及びＣ末端であり得るか、又は、これもまた灰色で図示されているＮｔＣｔリンカーで天然Ｎ及びＣ末端を閉じることと組み合わせて新規Ｎ及びＣ末端を形成するために天然配列中のループを開くことの結果としてもたらされ得る）を介して、サイトカインに基づく別のドメインに連結されることから構成される単鎖分子であり、サイトカインに基づく別のドメインは、等しい又は異なるサイズの２つの部分（黒及びミディアムグレー、左手側）に分割され、結果的なフォールディカイン分子のＮ及びＣ末端は、第２（左手側）のサイトカインドメインの天然Ｎ及びＣ末端、又は第２のサイトカインドメインの分割の結果としてもたらされる新規Ｎ及びＣ末端であってもよい。この特有の例において、連続的な３Ｄドメインを形成するサイトカイン単量体の天然Ｎ及びＣ末端が、操作されたリンカー配列（ＮｔＣｔ）と連結されているＩＩ型サイトカインに基づいて作出されたｆｏｌｄｋｉｎｅが図示されている。融合した二量体構造を作出するために、２つの単量体中のαヘリックス３及び４を天然にブリッジするループは開かれており、両方のドメインの新たに作出されたＮ及びＣ末端は、２つのＸｎ設計リンカー（灰色）を介して連結されている。このようにして、連続的な３Ｄドメイン（ライトグレーで標識されたヘリックス１Ｂ～６Ｂ）は、非連続的な３Ｄドメインのそれぞれ２つの半分（黒で標識されたヘリックス１Ａ～３Ａ、及び灰色で標識されたヘリックス４Ａ～６Ａ）と接続される。ヘリックスは、天然単量体フォールディカインの各々のドメイン（ヘリックス１Ａ～６Ａ）について配列中に出現する順序で番号付けされる。フォールディカインの連続的な３Ｄドメインにおいて、この実施形態によれば、Ｎ末端からＣ末端への方向におけるヘリックスの順序は、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、１Ｂ、２Ｂ、３Ｂである。ヘリックスの数は、フォールディカインが由来するサイトカインに依存して変動する。例えば、Ｉ型サイトカインは、４つの保存されたαヘリックスを典型的には含む一方、ＩＩ型サイトカインは、６つの保存されたαヘリックスを典型的には含む。設計されたリンカーをリボンとして示しており、タンパク質骨格（Ｎ、ＣＡ、ＣＯ原子）を示している。

【図2】図２は、サイトカインの問題及びフォールディカインを使用した解決手段を図示するフローダイアグラム。

【図3】図３は、二量体スワップドドメイン二量体サイトカインＩＩ型に基づいてフォールディカインを形成するためのプロセスの概略図。Ｎ－ｔｅｒ Ａ及びＣ－ｔｅｒ Ａは第１のサイトカイン単量体のＮ及びＣ末端を指し示し、Ｎ－ｔｅｒ Ｂ及びＣ－ｔｅｒ Ｂはスワップドドメイン二量体の第２のサイトカイン単量体のＮ及びＣ末端を指し示す。ＩＬ－１０のようなスワップドドメインフォールディカインは、各々の分子のＮ及びＣ領域から構成される２つのサイトカインドメインを形成する２つの鎖（暗色及び灰色ヘリックス）から構成される。黒のループは、サイトカイン単量体のうちの１つ（この例においてＢ単量体）のＮ末端を他のサイトカイン単量体（この例においてＡ単量体）のＣ末端に接合して、２つのリンカーにより分割ドメイン（左３Ｄドメイン）に接続された「連続的フォールディカインドメイン」（図２５も参照）を作製するために設計された新規リンカー（Ｎ－Ｃリンカー）を表す。

【図4】図４は、２つの単量体クラスＩ短又は長鎖サイトカインに基づいて方法Ｂに従ってフォールディカインを設計するためのプロセスの概略図。Ｎ－ｔｅｒ Ａ及びＣ－ｔｅｒ Ａは元々の又は野生型サイトカイン単量体のうちの１つ（Ａ）のＮ及びＣ末端を指し示し、Ｎ－ｔｅｒ Ｂ及びＣ－ｔｅｒ Ｂは、二量体サイトカインを形成する他の元々のサイトカイン単量体（Ｂ）のＮ及びＣ末端を指し示す。Ａサイトカインドメイン中の黒のループは例示的であり、単鎖フォールディカインを作出するために（黒リンカー；中央と共に図示される）単量体Ａ及びＢの元々のＮ－ｔｅｒ Ａ及びＣ－ｔｅｒ Ｂ並びに元々のＮ－ｔｅｒ Ｂ及びＣ－ｔｅｒ Ａを接合することと組み合わせてフォールディカインを作出するためにこの例において開かれるループを表す。この図において、Ａドメイン中のペプチドループは、フォールディカインのＮ及びＣ末端を形成するために開かれる（図６及び図２７も参照）。他の実施形態において、ヘリックスの間の異なるループは、新規Ｎ及びＣ末端を形成するためにＡドメイン中で開かれてもよい。他の実施形態において、Ｂサイトカイン中のループは、新規Ｎ及びＣ末端を形成するために開かれてもよい。

【図5】図５は、２つの単量体クラスＩＩサイトカインに基づいて方法Ａに従ってフォールディカインを設計するためのプロセスの概略図。Ｎ－ｔｅｒ Ａ及びＣ－ｔｅｒ Ａは元々の又は野生型サイトカイン単量体のうちの１つ（Ａ）のＮ及びＣ末端を指し示し、Ｎ－ｔｅｒ Ｂ及びＣ－ｔｅｒ Ｂは他の元々のサイトカイン単量体（Ｂ）のＮ及びＣ末端を指し示す。黒のループ（左上パネル）は例示的であり、新規Ｎ及びＣ末端（Ｎ－Ｎ－ｔｅｒ Ａ及びＢ並びにＮ－Ｃ－ｔｅｒ Ａ及びＢ；右上パネル）を作出するために開かれる２つのループを表す。これらの新規Ｎ及びＣ末端は、新規ペプチドリンカー（小さい黒矢印により指し示される；右下パネル）と接続され得る。２つの元々の／野生型サイトカイン単量体のうちの１つ（この例においてサイトカインＢ）の元々のＮ－ｔｅｒ及びＣ－ｔｅｒは次に、新規ペプチドリンカー（小さい黒矢印；左下パネル）と接合されて、分割ドメインの２つの部分（左）の間にサンドイッチされた２つのフォールディカインドメイン：連続ドメイン（右）を有する単一のポリペプチドを形成する（図２７も参照）。

【図6】図６は、単量体クラスＩ及び単量体クラスＩＩサイトカインに基づいてキメラフォールディカインを設計するためのプロセスの概略図。方法Ｂに従って、Ｎ－ｔｅｒ Ａ及びＣ－ｔｅｒ Ａは元々の／野生型クラスＩＩサイトカイン単量体のＮ及びＣ末端を指し示し（ｉ）、方法Ｃに従って、Ｎ－ｔｅｒ Ｂ及びＣ－ｔｅｒ Ｂは元々の／野生型クラスＩサイトカイン単量体のＮ及びＣ末端を指し示す（ｉｉ）（パネルＡ及びＢ中の左上を参照）。Ｉ型及びＩＩ型単量体から構成されるフォールディカインを作出するための２つの可能な戦略が図示される。（ｉ）１つの単量体のＮ末端は他の単量体のＣ末端に共有結合的に連結され、逆もまた行われて、単一のポリペプチドが作出される（黒線、右上パネルを参照）。追加的に、元々の単量体ドメインのうちの１つにおける隣接するアルファヘリックスの間のリンカー領域（黒線；右下パネルを参照）は開かれて、フォールディカイン中の新規Ｎ及びＣ末端（Ｎ－Ｎ－ｔｅｒ及びＮ－Ｃ－ｔｅｒ；左下パネル）が作出される。描写される実施形態において、新規末端はドメインＢの元々のサイトカインＩ型配列中に作出される（図４及び図２７も参照）。（ｉｉ）リンカー領域／ループはＩＩ型サイトカイン（サイトカインＡ）中で開かれて、新規Ｎ及びＣ末端（Ｎ－Ｎ－ｔｅｒ及びＮ－Ｃ－ｔｅｒ；パネル右上）が作出される。次に、単量体Ａの新規Ｎ末端（Ｎ－Ｎ－ｔｅｒ）は単量体Ｂの天然Ｃ末端（Ｃ－ｔｅｒ Ｂ）に共有結合的に連結され、単量体Ａの新規Ｃ末端（Ｎ－Ｃ－ｔｅｒ）は単量体Ｂの天然Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒ Ｂ）に共有結合的に連結されて、２つの分子が接合されて（黒Ｘｎ標識線；右下パネルを参照）、フォールディカイン ＩＩ－Ｉが作出される。代替的に、単量体Ａの天然Ｎ及びＣ末端は接続されて（ＮｔＣｔ）、単量体Ａの循環置換体（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）連続ドメインが形成され、リンカー領域／ループはＩ型サイトカイン（単量体Ｂ）中で開かれて、フォールディカイン Ｉ－ＩＩを作出する新規Ｎ及びＣ末端（左下パネル）が作出される。

【図7】図７は、２つのＩＩ型サイトカイン単量体、Ａ及びＢの重ね合わせのための参照としてスワップドドメインＩＩ型サイトカイン（ＳＣ－ＩＬ１０）の構造がどのように使用され得るのかを示す概略図。第１のステップにおいて、単量体Ａ及びＢは、スワップドドメイン鋳型のそれぞれのフォールディングした３Ｄドメイン上に重ね合わせられて、Ａ及びＢ単量体の所望される相対的な配置及び方向性が作出される。第２のステップにおいて、各々の単量体ドメインのヘリックスの間の対向するループは開かれて、（図３～６に図示されるように）単量体を接合するブリッジ形成性リンカーのペアを形成するために対向する単量体の適合性の新規末端と接合される各々の単量体上の新規Ｎ及びＣ末端が作出される。ブリッジ形成性リンカー配列の長さ及び組成は、２つのフォールディカインドメインの間の最適な又は所望される構造的コンホメーション及び幾何学的構成を維持する２ドメインフォールディカインを形成するために各々の単量体の配列及び構造コンホメーションを考慮に入れて最適なリンカー配列をモデル化することにより決定されてもよい。別のステップにおいて、単量体のうちの１つ（Ａ又はＢ）の天然Ｎ及びＣ末端は、単量体のうちの１つを閉じるため及び単鎖フォールディカインポリペプチドを作出するために連結される。その天然Ｎ及びＣ末端を連結することにより閉じられる単量体、Ａ又はＢは、配列及び３Ｄ空間において「連続的」なドメインとなる。

【図8】図８は、それぞれの受容体に結合した場合の３つの異なる野生型スワップドドメインサイトカイン二量体の構造確認の概略表現であり、二量体サイトカインの２つの半分の間の角度及び細胞膜に対するそれらのおおよその方向性を示す：（Ａ）指し示される受容体Ｒ１及びＲ２を伴い、左及び右手側ドメインの間のＶ角度を呈するＩＦＮγサイトカイン；（Ｂ）指し示される受容体Ｒ１及びＲ２を伴い、左及び右手側ドメインの間のＶ角度を呈するＩＬ－１０サイトカイン；（Ｃ）結合した１つの受容体を伴い、２つの構造３Ｄドメインの間の平坦な１８０度の角度を呈するＩＬ－５サイトカイン。本開示によるフォールディカインは、スワップ済み野生型サイトカイン二量体の四次構造を模倣する三次構造を制約／促進するために共有結合性ペプチドリンカーと共に好適には設計及び構成される。

【図9】図９は、単球初代細胞に対する組換えＩＬ－１０又は細菌により分泌されるＩＬ－１０の効果。（Ａ）、（Ｂ）単球培地（対照）若しくはｈＩＬ－１０組換え（ｈＩＬ－１０ｒ）を加えた後（Ａ）又は野生型（ＷＴ）Ｍ．ニューモニエ（Ｍ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（対照）若しくはＩＬ－１０ ＯＲＦ（ＷＴ＿ＩＬ１０）を発現するＭ．ニューモニエからの上清を加えた後（Ｂ）の抗炎症マーカー（ＣＤ１６３、ＣＤ１６、ＭｅｒＴＫ、ＣＣＲ４及びＰＤＬ１）並びに炎症促進マーカー（ＭＨＣ２及びＣＤ８６）についてのヒトドナー（ｎ＝４）からの細胞のフローサイトメトリーデータの平均蛍光強度（ＭＦＩ）。ライトグレーのバーは対照条件についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表し；ダークグレーのバーは試験条件のＭＦＩを表す。＊ｐ＜０．０１（２元配置ＡＮＯＶＡ及び事後ボンフェローニ多重比較検定）。（Ｃ）、２人の独立したドナーから単離された単球のウエスタンブロット結果であり、刺激されていない細胞（対照）、又は組換えヒトＩＬ－１０（ｈＩＬ－１０ｒ）、ＷＴ Ｍ．ニューモニエの上清（ＷＴ対照）若しくはＩＬ－１０を発現するＭ．ニューモニエの上清（ＷＴ－ＩＬ－１０）で刺激された細胞を示す。

【図10】図１０は、ＩＬ－１０ Ｒ１及びＲ２受容体結合親和性を増加させるためにこの研究において生成されたＩＬ－１０突然変異の概略図。Ｒ１又はＲ２との相互作用を向上させるために突然変異させた位置の各々についての詳細を個々のパネルに示している。

【図11】図１１は、Ｍ．ニューモニエにおいて又はよって発現された選択されたＩＬ－１０バリアントの発現レベル及び見かけの解離定数。（Ａ）ＩＬ－１０ ＯＲＦ、ＭｕｔＭ、ｈＩＬ－１０ｒ、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３、ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２についての見かけのＫＤ（モル濃度）。見かけのＫＤ（ピコモル濃度）の平均を各々の突然変異体の上に灰色で示している。ｎ＞３の生物学的複製物。＊、ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後ボンフェローニ多重比較検定、参照ＩＬ－１０ ＯＲＦ条件としての選択）。（Ｂ）接種後４８時間（４８ｈｐｉ）での細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数により正規化された培地に分泌されたＩＬ－１０のフェムトグラム（ｆｇ）での発現レベル。＊、ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ＋チューキー事後検定）。（Ｃ）ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ１＿対照Ｇｌｙについてのタンパク質機能性に対するリンカー組成の影響力。ｘ軸は、分析されたＩＬ－１０濃度の範囲を示し、ｙ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞において測定された６３０ｎｍでの吸光度を示す（Ｎ＝３、ｎ＝２）。（Ｄ）２つの異なる細胞株：ＴＨＰ－１及びＨＡＦＴＬにおける固定されたＩＬ－１０濃度（２０ｎｇ／ｍＬ）での誘導後のｐ－ＳＴＡＴ３活性化のウエスタンブロット。比ｐ－ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３を２０分の誘導後に測定し、グラフの下に示している。（Ｅ及びＦ）ＢｌａＥＲ１（Ｅ）及びＨＡＦＴＬ細胞（Ｆ）において決定されたＩＬ－１０ ＯＲＦと単鎖突然変異体ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２の各々との間のフローサイトメトリーにより決定された見かけのＫｄにおける平均倍数変化。

【図12】図１２は、単鎖（ＳＣ）ＩＬ－１０ フォールディカインの設計を描写する概略図。（Ａ）２つの異なる融合パターンを生成するためのステップ：（１）縁部（ｆｒｉｎｇｅ）残基の欠失；（２）リワイアリングスキーム；（３）対応する領域をリワイアリングした後の構造再編成；（４）リンカーサーチ又はブリッジ形成の間の異なる長さ（最大２０）を有するペプチドブリッジを宿すために充分に長い数値的ギャップを含む、ＳＣにおける最終番号付け。単量体２の残基番号を左手パネルにおいて’により記している。（Ｂ）ＩＬ－１０融合パターン１からのＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２の構築。リンカー配列を灰色標識として示しており；リワイアリング後の突然変異を、単量体ＩＬ－１０番号付けを使用してＭｕｔＳＣ２について含めている。

【図13】図１３は、ｉｎ ｖｉｖｏでのマイコプラズマ・ニューモニエＣＶ８シャーシの特徴付け。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１０７ＣＦＵのＷＴ又はＣＶ８株を感染させ、感染の２又は４日後（２又は４ｄｐｉ）に屠殺した（ｎ≧３／群）。（Ａ）分析された時点においてＷＴ（丸）及びＣＶ８（四角）株について類似した細菌負荷（Ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／肺ホモジネート）が見出された。（Ｂ）ＷＴ（中央バー）、ＣＶ８（右バー）又はＰＢＳ（左バー）を接種させた肺の炎症プロファイル。内因性対照としてｇａｐｄｈを使用してＲＴ－ｑＰＣＲにより遺伝子発現を分析した（方法）。データをｍＲＮＡ発現における倍数変化（ＦＣ）の平均±ＳＤとして示している（一元配置ＡＮＯＶＡ＋チューキー事後検定）（＊、ｐ＜０．０５）。（Ｃ）肺試料の組織学的所見。左、プロットは肺胞（上パネル）及び気管支周囲／細気管支周囲浸潤物（下パネル）の定量評価（スコア：０～５）を表す。ＰＢＳ群の平均を使用してパラメーターを正規化した（ＦＣ＝試料値／平均ＰＢＳ；ＦＣ対照群、約１）。データをＦＣの平均±ＳＥＭとして示している（一元配置ＡＮＯＶＡ＋チューキー事後検定）（＊、ｐ＜０．０５）。右、ヘマトキシリン－エオシンで染色された肺の代表的な画像を示している（線は２５０μｍを表す）。（Ｄ）ＷＴ及びＣＶ８発現細胞の特徴付け。分析されたＷＴ及びＣＶ８株によるＩＬ－１０ ＯＲＦ産生をＥＬＩＳＡにより測定し、タンパク質含有量（バイオマス）により正規化した。ＷＴ又はＣＶ８株により生成されたＩＬ－１０バリアントの機能性を、陰性対照としてＷＴ又はＣＶ８株の上清を使用して、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞において検証した（一元配置ＡＮＯＶＡ＋チューキー事後検定）（＊、ｐ＜０．０５）。

【図14】図１４は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ－１０バリアントの免疫調節能力。（Ａ）マウスモデルの概略表現。（Ｂ）肺試料から回収されたＰＡＯ１（左）又はマイコプラズマ株（右）のＣＦＵ。データをＬｏｇ１０ ＣＦＵ／肺ホモジネートの平均±ＳＥＭとして示している。（Ｃ）炎症マーカーのｍＲＮＡ遺伝子発現の倍数変化（ＦＣ）。２－ΔΔＣｔ法を使用して、内因性対照としてｇａｐｄｈを使用して値を正規化した。データをＦＣの平均±ＳＥＭとして示している。対応のないｔ検定を使用して統計分析を行った。（Ｄ）非感染動物、又はＰＡＯ１＋ＣＶ８、ＩＬ－１０ ＷＴ（ＣＶ８－ＩＬ－１０ ＯＲＦ）、ＭｕｔＳＣ１（ＣＶ８＿ＭｕｔＳＣ１）、ＭｕｔＳＣ２（ＣＶ８＿ＭｕｔＳＣ２）若しくはヒトＩＬ－１０組換えタンパク質（ｈＩＬ－１０ｒ）をコードするＣＶ８での処置群と比べたＰＡＯ１＋ＰＢＳ群の統計的比較のＰ値。ダークグレー＝遺伝子発現の有意な増加；ライトグレー＝有意な低減。（Ｅ）肺試料の免疫化学（ＩＨＣ）により示される、好中球エラスターゼ（ＮＥ）の定量的分析。以下：％＝１００×（陽性細胞／陽性細胞＋陰性細胞）のように算出される、陽性細胞のパーセンテージの平均±ＳＥＭとしてデータを表している。（Ｆ）ＮＥに対するＩＨＣの代表的な画像を示している。行はＮＥ陽性細胞を指し示す。

【図15】図１５は、ＣｌｕｓｔａｌＸアルゴリズムを用いて行った異なる脊椎動物種からのＩＬ－１０ポリペプチドの複数配列アライメント。ＩＬ－１０ヒト（配列番号３４９）；ＩＬ－１０マウス（配列番号３５０）；ＩＬ－１０マカク（配列番号３５１）；ＩＬ－１０ニワトリ（配列番号３５２）；ＩＬ－１０モルモット（配列番号３５３）及びＩＬ－１０ゼブラフィッシュ（配列番号３５４）。

【図16】図１６は、受容体Ｒ１に結合したＩＬ－１０（１ｙｌ６ｋ）、並びに受容体Ｒ１及びＲ２の両方に結合したＩＬ－１０（６×９３）の結晶構造の重ね合わせ。Ｒ２と相互作用する場合に異なるコンホメーション構造を採用する相対的に構造化されていない領域を右下に示している。

【図17】図１７は、マウス肺のＰ．エルギノーサ（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１感染の分析。（Ａ）感染の２４又は４８時間後（２４又は４８ｈｐｉ）のマウス肺ホモジネートから得られた細菌負荷（ＣＦＵ）。（Ｂ）１０５及び１０４ＣＦＵ／マウスの用量でＰＡＯ１を用いた２４ｈｐｉにおける異なる炎症マーカーのｍＲＮＡ発現における倍数変化。

【図18】図１８は、フォールディカイン－１０におけるタンパク質設計ループを検証するための対照の生成。（Ａ）マイコプラズマ・ニューモニエ細菌細胞培養物の上清を使用したＨＥＫ－ｂｌｕｅ細胞－１０の活性化。（Ｂ）設計されたリンカーの重要性を実証するためのフォールディカイン－１０（ＭｕｔＳＣ１）及び２つの対照についてのＫｄａｐｐの測定。

【図19】図１９は、フォールディカイン－２２を上回るリンカー組成の影響力を示すグラフ。フォールディカイン２２＿３は、本明細書において使用されているフォールディカイン－２２＿３（ＳＣＩＬ２２＿３）であり、フォールディカイン２２＿ｃｏｎｔｒｏｌｃｅｎｔｒｅは、本明細書において使用されているフォールディカイン－２２＿３＿ｃｅｎｔｒａｌｌｉｎｋｅｒｓであり、フォールディカイン２２＿Ｎ－Ｃ ｌｏｏｐ ｐｏｌｙＧは、本明細書において使用されているフォールディカイン－２２＿３＿ｌｉｎｋｅｒＮＣｐｏｌｙｇｌｙである。１つのフォールディカインドメインのＮ及びＣ末端の間の設計されたループの、又はフォールディカインドメインの間のブリッジにおけるｐｏｌｙＧでの置き換えは、活性の有意な喪失を引き起こすことを実証している。

【図20】図２０は、ＩＬ２２ ｗｔと比較したＩＬ－２２疎水性突然変異の影響力の分析。

【図21】図２１は、ＩＬ－２２の疎水性コア中の個々の突然変異の影響力の分析。ＩＬ－２２はＩＬ－２２ ＷＴであり、末端におけるＣ＞Ａは７位におけるＣのＡへの突然変異であり；５６は単量体ＩＬ２２におけるＴ５６Ｍ点突然変異であり；６６は単量体ＩＬ２２におけるＡ６６Ｍ点突然変異であり；９５は単量体ＩＬ２２におけるＶ９５Ｉ点突然変異であり；９９は単量体ＩＬ２２におけるＴ９９Ｆ点突然変異であり；１７３は単量体ＩＬ２２におけるＳ１７３Ｌ点突然変異である。下：ＷＴ及び突然変異体構築物について決定された見かけの平均Ｋｄ。

【図22】図２２は、ＩＬ－２２操作バージョンに対するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－２２細胞の応答を示すグラフ。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－２２細胞を、ＩＬ－２２、フォールディカイン－２２＿１、フォールディカイン－２２＿３又はＮからＣ末端においてポリＧｌｙリンカーを有する対照（フォールディカイン－２２＿３＿ｌｉｎｋｅｒＮＣｐｏｌｙｇｌｙ）のうちの１つのいずれかを発現する細菌の上清とインキュベートした。２４時間のインキュベーション後に、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）を使用して上清中のＳＥＡＰレベルを測定することにより内部シグナル伝達活性化を評価した。（Ａ）非希釈上清（濃度＞３０ｎｇ／ｍＬ）。（Ｂ）３０ｎｇ／Ｌにおいて開始したＩＬ－２２濃度の８つの段階希釈液（各々０．５倍での希釈）。ｘ軸中に濃度をモル濃度で示している。

【図23】図２３は、フォールディカイン－１０／２２（ＳＣＩＬ１０ＩＬ２２）に対するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－１０及びＩＬ－２２細胞の応答。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－１０細胞を、２つの異なるキメラ（キメラ３及びキメラ５）を発現する細菌の上清とインキュベートした。２４時間のインキュベーション後に、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）を使用して上清中のＳＥＡＰレベルを測定することにより内部シグナル伝達活性化を評価した。非希釈上清（＞３０ｎｇ／ｍＬの定量化されたキメラの濃度）をそれぞれＩＬ－１０及びＩＬ－２２活性について評価した。

【図24】図２４は、短いポリｇｌｙ－ｓｅｒリンカーにより融合されたヘテロ二量体に対するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－１０及びＩＬ－２２細胞の応答。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－１０細胞を、ＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ヘテロ二量体１０－２２（ヘテロ１０２２）又はヘテロ二量体２２１０（ヘテロ２２１０）を発現する細菌からの上清とインキュベートした。２４時間のインキュベーション後に、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）を使用して上清中のＳＥＡＰレベルを測定することにより内部シグナル伝達活性化を評価した。（Ａ）及び（Ｂ）パネルについて、非希釈上清（＞３０ｎｇ／ｍＬの定量化されたキメラの濃度）をそれぞれＩＬ－１０及びＩＬ－２２において評価した。

【図25】図２５は、スワップドドメイン二量体クラスＩサイトカイン：（ｉ）第１の単量体配列のαヘリックスＡ、Ｂ及びＣ並びに第２の単量体配列のαヘリックスＤを含む隣接する３Ｄドメインを形成するために、対向する単量体αヘリックスＡ、Ｂ及びＣとアライメントしている各々の単量体単位のαヘリックスＤを示す野生型ドメインスワップ済み二量体；（ｉｉ）ペプチドリンカー（破線）を使用して１つの単量体配列のＣ末端を第２の単量体配列のＮ末端に連結することにより単量体配列が接合されて単鎖ポリペプチドを作製している融合した野生型単量体に基づく単鎖フォールディカインに基づいてフォールディカインを形成するための突然変異スキームの概略図。野生型リンカーを実線で示している。ボックスは、左及び右３Ｄドメインの各々を形成するαヘリックスを指し示す。描写されるように、構造／コンホメーション安定性を提供するために第１（左）及び第２（右）の３Ｄ三次構造ドメインにかかる２つのペプチドリンカーがある。

【図26】図２６は、二量体クラスＩサイトカイン：（ｉ）それぞれ第１及び第２の単量体配列のαヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを各々が含むサイトカイン二量体の左及び右ドメインを示す野生型二量体；（ｉｉ）各々の単量体のＣ末端を各々の単量体のそれぞれのＮ末端に連結すること（破線）、並びに次に元々の単量体配列のうちの１つから内部野生型リンカーを除去して新規Ｎ及びＣ末端を作出することにより単量体配列が接合されて単鎖ポリペプチドを作製している融合した野生型単量体に基づく単鎖フォールディカインに基づいてフォールディカインを形成するための突然変異スキームの概略図。野生型リンカーを実線で示している。ボックスは、左及び右３Ｄドメインの各々を形成するαヘリックスを指し示す。描写されるように、構造／コンホメーション安定性を提供するために第１（左）及び第２（右）の３Ｄ三次構造ドメインにかかる２つのペプチドリンカーがある。

【図27】図２７は、二量体クラスＩＩサイトカイン：（ｉ）それぞれ第１及び第２の単量体配列のαヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを各々が含むサイトカイン二量体の左及び右ドメインを示す野生型二量体；（ｉｉ）１つの単量体のＣ末端を同じ単量体のＮ末端に連結すること、並びに元々の単量体配列の各々から内部野生型リンカーを除去して新規Ｎ及びＣ末端を作出し、それを次に２つの新規ドメイン間ペプチドリンカー（破線）により接合して単鎖ポリペプチドを形成することにより単量体配列が接合されて単鎖ポリペプチドを作製している融合した野生型単量体に基づく単鎖フォールディカインに基づいてフォールディカインを形成するための突然変異スキームの概略図。野生型リンカーを実線で示している。ボックスは、左及び右３Ｄドメインの各々を形成するαヘリックスを指し示す。描写されるように、構造／コンホメーション安定性を提供するために第１（左）及び第２（右）の３Ｄ三次構造ドメインにかかる２つのペプチドリンカーがある。

【図28】図２８は、スワップドドメイン二量体クラスＩＩサイトカイン：（ｉ）第１の単量体配列のαヘリックスＡ、Ｂ及びＣ並びに第２の単量体配列のαヘリックスＤ、Ｅ及びＦを含む隣接する３Ｄドメインを形成するために、対向する単量体αヘリックスＡ、Ｂ及びＣとアライメントしている各々の単量体単位のαヘリックスＤ、Ｅ及びＦを示す野生型ドメインスワップ済み二量体；（ｉｉ）ペプチドリンカー（破線）を使用して１つの単量体配列のＣ末端を第２の単量体配列のＮ末端に連結することにより単量体配列が接合されて単鎖ポリペプチドを作製している融合した野生型単量体に基づく単鎖フォールディカインに基づいてフォールディカインを形成するための突然変異スキームの概略図。野生型リンカーを実線で示している。ボックスは、左及び右３Ｄドメインの各々を形成するαヘリックスを指し示す。描写されるように、構造／コンホメーション安定性を提供するために第１（左）及び第２（右）の３Ｄ三次構造ドメインにかかる２つのペプチドリンカーがある。

【図29】図２９は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞におけるＭｕｔＳＣ１ フォールディカインの発現を実証するグラフ。ペレット化された細胞（ｐｅｌｌ）及び上清（ｓｕｐ）の両方からＥＬＩＳＡにより野生型ＩＬ－１０中及びＭｕｔＳＣ１ フォールディカイン中のＩＬ－１０ポリペプチド配列を定量化した。各々の培養物において概算されたＩＬ－１０のｆｇに対してコロニー形成単位（ＣＦＵ）カウントを正規化した。ＭｕｔＳＣ１発現は、ペレット及び上清の両方において検出された。大腸菌により発現されるＭｕｔＳＣ１の機能性をＨＥＫ－ｂｌｕｅ細胞において評価した。ペレット及び上清中のＭｕｔＳＣ１の両方は、このレポーター細胞株においてｐ－ＳＴＡＴ３カスケードを活性化させた。ＭｕｔＳＣ１＿Ｈｉｓは、Ｈｉｓタグ付加されたフォールディカインについての結果を示す。

【図30】図３０は、Ｌ．ラクチス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）細胞におけるＭｕｔＳＣ１ フォールディカインの発現を実証するグラフ。ペレット化された細胞（ｐｅｌｌ）及び上清（ｓｐ）の両方からＥＬＩＳＡにより野生型ＩＬ－１０及びＭｕｔＳＣ１中のＩＬ－１０ポリペプチド配列を定量化した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ１０レポーター細胞を使用してＬ．ラクチスにより発現されるタンパク質の機能性を検証した。ｙ軸について、ｆｇをＥＬＩＳＡにより定量化し、２つの異なる培養物、ＩＬ－１０及びＭｕｔＳＣ１においてカウントされたＣＦＵに対して正規化した。

【図31】図３１は、クラスＩサイトカインに基づいて、方法Ａに従ってフォールディカインを形成するための突然変異スキームの概略図。（上部分）αヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを各々が含む野生型サイトカインＩ型単量体；（下部分）両方のサイトカイン単量体のαヘリックスＢ及びＣの間のループを開くこと、１つのサイトカイン単量体の新規Ｎ末端を他のサイトカイン単量体の新規Ｃ末端と連結すること、並びに反対に、サイトカイン単量体のうちの１つの天然Ｎ末端及びＣ末端を連結することにより単量体配列が接合されている融合した野生型単量体に基づく単鎖フォールディカイン。野生型リンカーを実線で示している。ボックスは、左及び右３Ｄドメインの各々を形成するαヘリックスを指し示す。描写されるように、構造／コンホメーション安定性を提供するために第１（左）及び第２（右）の３Ｄ三次構造ドメインにかかる２つのペプチドリンカーがある。

【図32】図３２は、黒の新規導入されたインターリンカー（２つのサイトカイン単量体の間のリンカー）の他に新規イントラリンカー（サイトカイン単量体のうちの１つの天然Ｎ末端及びＣ末端を接続する）を有する二量体クラスＩサイトカインに基づく、方法Ａにしたがったフォールディカイン フォールディカインの３Ｄ表現。Ｎｔ及びＣｔは、元々のサイトカイン単量体のＮ及びＣ末端を指し示す。

【図33】図３３は、２つのクラスＩＩサイトカイン：（上部分）それぞれ第１及び第２の単量体配列のαヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを各々が含む野生型サイトカインＩＩ型単量体；（下部分）１つの単量体のＣ末端を他の単量体のＮ末端に連結すること、並びに反対に、１つの元々の単量体配列からαヘリックスＣ及びＤの間の内部野生型リンカーを除去して新規Ｎ及びＣ末端（Ｎｔ及びＣｔ）を作出して、単鎖ポリペプチドを形成することにより単量体配列が接合されて単鎖ポリペプチドを作製している融合した野生型単量体に基づく単鎖フォールディカインに基づいて、方法Ｂに従ってフォールディカインを形成するための突然変異スキームの概略図。野生型リンカーを実線で示している。ボックスは、左及び右３Ｄドメインの各々を形成するαヘリックスを指し示す。描写されるように、構造／コンホメーション安定性を提供するために第１（左）及び第２（右）の３Ｄ三次構造ドメインにかかる２つのペプチドリンカーがある。

【図34】図３４は、二量体クラスＩＩサイトカインに基づく方法Ａにしたがったフォールディカインの３Ｄ表現：非連続的な黒線は新規導入されたインターリンカーであり、新規Ｎｔｅｒ及び新規Ｃｔｅｒは、１つの単量体中のループを開いた後に新規作出されたＮ及びＣ末端を指し示す。

【図35】図３５は、ＩＬ－２ ＷＴ及びＩＬ－２ フォールディカイン（プロリン（ＯＲＫ２＿６～８）又はグリシン／セリン（ＯＲＫ＿９～１１）から構成される異なるインターリンカーを有するＳＣＩＬ２）を一過的に発現するＣＨＯ細胞の上清を用いたＩＬ－２に応答するＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）細胞の滴定プロット。タンパク質は、発現システムとしてＣＨＯを使用して発現させた。Ｖｍａｘは０．９に設定した。

【図36】図３６は、ＩＬ－２２ ＷＴ又はＩＬ－２２ フォールディカイン（プロリン（ＯＲＫ１７～１９）又はグリシン／セリン（ＯＲＫ＿２４～２６）から構成される異なるインターリンカーを有するＯＲＫ２２）を一過的に発現するＭ．ニューモニエ細胞の上清を用いたＩＬ－２２に応答するＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）細胞の滴定プロット。

【図37】図３７は、ＩＬ－２２ ＷＴ（９，７６Ｅ－１１Ｍ）並びにＩＬ－２２ フォールディカイン（ポリプロインターリンカーを有するＯＲＩＫ２２－１２（４，３２Ｅ－１１Ｍ）及びポリＧｌｙインターリンカーを有するＯＲＩＫ２２＿１４（２，４１Ｅ－０９Ｍ））を一過的に発現するＣＨＯ細胞の上清を用いたＩＬ２２に応答するＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）細胞の滴定プロット。タンパク質は、発現システムとしてＣＨＯを使用して発現させた。

【図38】図３８は、ＩＬ－２ ＷＴ及びキメラフォールディカイン ＩＬ２／ＩＬ－４（ＩＬ２－ＩＬ４ポリＰｒｏリンカー）を一過的に発現するＣＨＯ細胞の上清を用いたＩＬ－２に応答するＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）細胞の滴定プロット。

【図39】図３９は、ＩＬ－２ ＷＴ及びキメラフォールディカイン ＩＬ２／ＩＬ－４（ＩＬ２－ＩＬ４ポリＰｒｏリンカー）を一過的に発現するＣＨＯ細胞の上清を用いたＩＬ－４に応答するＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）細胞の滴定プロット。比較目的のために、商業的に購入したＩＬ－４（６５０７－ＩＬ－０１０／ＣＦ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）の活性を示す。

【図40】図４０は、ＩＬ－２ ＷＴ及びフォールディカイン ＯＲＫ２＿０１３を一過的に発現するＣＨＯ細胞の上清を用いたＩＬ－２に応答するＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）細胞の滴定プロット。

【図41】図４１は、ＩＬ－２２に応答するＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）細胞の滴定プロット。Ｙ軸において、ｎＭでの算出されたＥＣ－５０を示す。Ｘ軸は、ＣＨＯ中で発現され、試験された異なるＩＬバリアントを指し示す。全ての場合において、ＩＬ－２２ ＷＴについての比較値を示す。異なるバリアントは、タンパク質設計（ＭｏｄｅｌＸ及びＦｏｌｄＸ）操作されたリンカー及び異なるループで開くことによりＮｔ及びＣｔを接合したＷＴサイトカインの異なる循環置換体バージョンを表す。ＬＦは、タンパク質が発現されるが、ＨＥＫレポーターにおいて活性を喪失したことを意味する。タンパク質は、発現システムとしてＣＨＯを使用して発現させた。各々のバーの上に、各々のバリアントについてのｎＭでの平均ＥＣ－５０を示している。

【図42】図４２は、ＩＦＮβに応答するＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）細胞の滴定プロット。Ｘ軸は、ＣＨＯ中で発現され、試験された異なるＩＬバリアントを指し示す。全ての場合において、ＷＴ ＩＦＮβについての比較値を示す。異なるバリアントは、タンパク質設計（ＭｏｄｅｌＸ及びＦｏｌｄＸ）操作されたリンカー及び異なるループで開くことによりＮｔ及びＣｔを接合したＷＴサイトカインの異なる循環置換体バージョンを表す。タンパク質は、発現システムとしてＣＨＯを使用して発現させた。各々のバーの上に、各々のバリアントについてのｎＭでの平均ＥＣ－５０を示している。

【図43】図４３は、ＩＬ－２に応答するＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）細胞の滴定プロット。Ｘ軸は、ＣＨＯ中で発現され、試験された異なるＩＬバリアントを指し示す。全ての場合において、ＷＴ ＩＬ－２値を比較のために示す。異なるバリアントは、タンパク質設計（ＭｏｄｅｌＸ及びＦｏｌｄＸ）操作されたリンカー及び異なるループで開くことによりＮｔ及びＣｔを接合したＷＴサイトカインの異なる循環置換体バージョンを表す。タンパク質は、発現システムとしてＣＨＯを使用して発現させた。各々のバーの上に、各々のバリアントについてのｎＭでの平均ＥＣ－５０を示している。

【図44】図４４は、ＩＦＮγ ＷＴ及びフォールディカイン ＯＲＫＩＦＮｇ－００２を一過的に発現するＣＨＯ細胞の上清を用いたＩＦＮγに応答するＨＥＫ Ｄｕａｌ細胞の滴定プロット。

【図45】図４５は、二量体クラスＩサイトカインに基づいて、方法Ｃに従ってフォールディカインを形成するための突然変異スキームの概略図。（上部分）αヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを各々が含む野生型単量体Ｉ型（サイトカイン１及びサイトカイン２）ｒ；（下部分）両方のサイトカイン単量体のαヘリックスＢ及びＣの間のループを開くことにより単量体配列が接合されている融合した野生型単量体に基づく単鎖フォールディカイン。単量体２のヘリックスＢ及びＣの間で開かれるループは開かれ、単量体２のヘリックスＢは単量体１の天然Ｎ末端に連結され、及びヘリックスＣは単量体１の天然Ｃ末端に連結される。ボックスは、左及び右３Ｄドメインの各々を形成するαヘリックスを指し示す。描写されるように、構造／コンホメーション安定性を提供するために第１（左）及び第２（右）の３Ｄ三次構造ドメインにかかる２つのペプチドリンカーがある。

【図46】図４６は、破線の新規導入されたインターリンカー（２つのサイトカイン単量体の間のリンカー）を有する二量体クラスＩサイトカインに基づく、方法Ｃにしたがったフォールディカイン フォールディカインの３Ｄ表現。Ｎ－ｔ及びＣ－ｔは、元々のサイトカイン単量体のＮ及びＣ末端を指し示す。

【図47】図４７は、クラスＩＩサイトカインに基づいて、方法Ｃに従ってフォールディカインを形成するための突然変異スキームの概略図。（上部分）αヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを各々が含む野生型ＩＩ型単量体（サイトカイン１及び２）；（下部分）１つのサイトカイン単量体（サイトカイン１）のαヘリックスＢ及びＣの間のループを開くこと、開かれたサイトカイン単量体の新規Ｃ末端（サイトカイン１、ヘリックスＢ）を他のサイトカイン単量体（サイトカイン２、ヘリックスＡ）の天然Ｎ末端と連結すること、及び開かれたサイトカイン単量体の新規Ｎ末端（サイトカイン１、ヘリックスＣ）を他のサイトカイン単量体（サイトカイン２；ヘリックスＦ）の天然Ｃ末端と連結することにより単量体配列が接合されている融合した野生型ＩＩ型サイトカイン単量体に基づく単鎖フォールディカイン。ボックスは、左及び右３Ｄドメインの各々を形成するαヘリックスを指し示す。描写されるように、構造／コンホメーション安定性を提供するために第１（左）及び第２（右）の３Ｄ三次構造ドメインにかかる２つのペプチドリンカーがある。

【図48】図４８は、太線の新規導入されたインターリンカー（２つのサイトカイン単量体の間のリンカー）を有する二量体クラスＩＩサイトカインに基づく、方法Ｃにしたがったフォールディカイン フォールディカインの３Ｄ表現。Ｎ－ｔ及びＣ－ｔは、元々のサイトカイン単量体のＮ及びＣ末端を指し示す。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本明細書で引用される文献はすべて、参照によりその全体が援用される。別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び生化学）の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0040】

別段の指示のない限り、本発明の実施には、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、化学的方法、医薬製剤、並びに動物の送達及び治療の従来技術を用い、それらは当業者の能力の範囲内である。そのような技術は文献、例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｏｏｋｓ １－３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｃｈ． ９， １３， ａｎｄ １６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．）；Ｂ． Ｒｏｅ， Ｊ． Ｃｒａｂｔｒｅｅ， ａｎｄ Ａ． Ｋａｈｎ， １９９６， ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ． Ｍ． Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ． ＭｃＧｅｅ， １９９０， Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ （Ｅｄｉｔｏｒ）， １９８４， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；及びＤ． Ｍ． Ｊ． Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ． Ｅ． Ｄａｈｌｂｅｒｇ， １９９２， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓでも説明されている。それらの本文全般（ｇｅｎｅｒａｌ ｔｅｘｔｓ）はそれぞれ、参照により本明細書に援用される。

【0041】

本発明の理解を助けるために、いくつかの用語が本明細書において定義される。

【0042】

本発明の文脈における「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、天然に存在するＬ－α－アミノ酸又は残基を含むことを意味する。天然に存在するアミノ酸に対して一般的に使用される１文字及び３文字の略語が本明細書で使用される：Ａ＝Ａｌａ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｅ＝Ｇｌｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇｌｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、Ｉ＝Ｉｌｅ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｌ＝Ｌｅｕ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｑ＝Ｇｌｎ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｓ＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａｌ、Ｗ＝Ｔｒｐ、及びＹ＝Ｔｙｒ（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ａ． Ｌ．， （１９７５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｄ ｅｄ．， ｐｐ． ７１－９２， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。「アミノ酸」という総称はさらに、Ｄ－アミノ酸、レトロインベルソアミノ酸、並びにアミノ酸類似体などの化学的に修飾されたアミノ酸、ノルロイシンなどの通常はタンパク質に組み込まれない天然に存在するアミノ酸、及びβ－アミノ酸などのアミノ酸の特徴として当該技術分野で公知の特性を有する化学的に合成された化合物を包含する。例えば、天然のＰｈｅやＰｒｏと同じようにペプチド化合物の立体構造を制限できる、フェニルアラニンやプロリンの類似体又は模倣体はアミノ酸の定義内に含まれる。そのような類似体及び模倣体は、本明細書ではそれぞれのアミノ酸の「機能的均等物」と呼ぶ。アミノ酸の他の例は、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ．， Ｖｏｌ． ５ ｐ． ３４１， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ． １９８３に列挙され、該文献は参照により本明細書に援用される。

【0043】

本明細書で（例えば、本明細書で開示のようなフォールディカイン（ｆｏｌｄｉｋｉｎｅ）タンパク質の文脈において）使用される「ペプチド」という用語は、直鎖又は環状鎖で一緒に結合した複数のアミノ酸を意味する。オリゴペプチドという用語は、典型的には、２～約５０個又はより多いアミノ酸を有するペプチドを表すのに使用される。約５０個のアミノ酸より大きいペプチドは、多くの場合、ポリペプチド又はタンパク質と呼ばれる。しかし、本発明において、「ペプチド」という用語は、任意の特定の数のアミノ酸に限定されず、他に示されない限り、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語と交換可能に使用される。本開示のペプチド／タンパク質の一次配列に対する小さい改変が、本発明によるポリペプチドの活性を実質的に変えることなく行われうることを考慮すると、本開示並びに本発明の様々な態様及び実施形態は、さらに、本明細書に開示の特定のアミノ酸配列と実質的に同じである任意のポリペプチド配列を包含すると考えられるべきである。例えば、特許請求された発明は、（本明細書に開示のポリペプチド配列の配列番号によって明らかにされうる）本明細書に開示のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性又は本明細書に明示的に開示された配列番号のポリペプチド配列と約１００％の同一性を有するポリペプチド配列を包含する。

【0044】

本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、細胞シグナル伝達に重要な小タンパク質の広範かつ大まかな（ｌｏｏｓｅ）カテゴリーからのいずれか１つを意味する。サイトカインは、細胞の脂質二重層を通過して細胞質に入ることができないペプチドである。サイトカインは、免疫調節物質としてオートクリン、パラクリン及び内分泌シグナル伝達に関与することが示されている。本明細書で使用する「フォールディカイン」という用語は、共有結合している２つの野生型サイトカイン単量体に由来し、二量体３Ｄドメイン構造を形成するように折り畳まれた一本鎖サイトカインを意味する。一般に、共有結合二量体の各３Ｄドメインのペプチド配列はまた、（ｉ）サイトカイン単量体を二量体化するために、且つ／又は（ｉｉ）新規３Ｄ二量体ユニットの立体配置を構造的に制限するために、１つ又は複数のアミノ酸変異、置換及び／又は欠失を含むので自然界には存在しない。

【0045】

「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、直鎖状又は環状立体構造の、及び一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）ポリマー、又は混合ポリマーを指す。本発明において、そのようなＤＮＡ又はＲＮＡポリマーは、天然ヌクレオチド、非天然又は合成ヌクレオチド、及びそれらの混合物を含むことができる。非天然ヌクレオチドとしては、天然ヌクレオチドの類似体、並びに塩基、糖及び／又はリン酸部分（例えば、ホスホロチオエートバックボーン）で修飾されたヌクレオチドが挙げられる。修飾核酸の例としては、ＰＮＡ及びモルフォリノ核酸がある。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対特異性を有する、すなわち、Ｇの類似体はＣと塩基対を形成することになる。本発明において、これらの用語はポリマーの長さに関して限定するものとはみなされるべきではない。ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’及び／又は３’末端は、分解を能動的に避けるために配列の安定性を向上させるように修飾することができる。この文脈における好適な修飾としては、ビオチン化ヌクレオチド及びホスホロチオエートヌクレオチドが挙げられるが、それらに限定されない。

【0046】

本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、ポリペプチド又はリボ核酸遺伝子産物の生成に関与する核酸（典型的にはＤＮＡ）のセグメントである。これには、コード領域の前後の領域（リーダー及びトレーラー）、並びに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる。好都合なことには、この用語にはまた、遺伝子産物をコードするコード領域及び／又は転写領域と同様に、関連するコード配列に隣接することもあり、又は離れていることもある、遺伝子発現に必要な制御配列（例えば、エンハンサー、サイレンサー、プロモーター、ターミネーターなど）も包含される。本発明による好ましい遺伝子は、サイトカインをコードするもの、特に、本開示による二量体サイトカイン又は「フォールディカイン」をコードするものである。コドンの冗長性を考慮すると、本開示及びクレームされた発明は、本明細書に開示の配列番号など本明細書に開示のポリヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性、本明細書に明示的に開示された配列番号をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性又は約１００％同一性を有するポリヌクレオチド配列を包含する。

【0047】

本開示の文脈において、「個体」、「対象」、又は「患者」という用語は交換可能に使用されて、医学的（病理学的）状態に罹患している可能性があり、本発明の治療分子又は医学的治療に反応する可能性がある動物を示す。治療される動物は、好適には、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、又はラットなどの哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。

【0048】

疾患状態又は病態の文脈において本明細書で使用される「治療する」、「治療する」、「治療」又は「治療法」という用語は、１つ又は複数の病原性症状の重症度及び／若しくは頻度の減少、症状の除去、並びに／又は症状及び／若しくはそのような疾患又は病態の根本原因又は複数の原因の予防を意味する。場合によっては、そのような治療は、疾患又は病態によって引き起こされる生理的損傷の軽減又は改善に関連しうる。

【0049】

フォールディカインという概念
サイトカインの効率を向上させ、治療効果に必要な濃度を減少させるには、サイトカインの折り畳み性（ｆｏｌｄａｂｉｌｉｔｙ）をより良くするか、分解の速度及び血清からのクリアランスを減少させる必要がある。そのためには、結合親和性を向上させる、凝集を減少させる、又はＦｃｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／３２９９４９９６／）のような他のタンパク質ドメインに融合させる、又は化学的修飾に供する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓ４１５５１－０２１－００７９７－８； ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｃｏｍ／２０７９－４９９１／９／８／１０７４； ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／１０．１００７／ｓ１１９１２－０１９－０７６０－ｚ）ことになる変異を遺伝子工学的に組み込む必要がある。

【0050】

毒性を減少させることに関しては、多くの場合、特定のサイトカインが生体内の様々な細胞に結合し、そのうちのあるものは所望の標的となり、他のものは望ましくない作用を及ぼすからである。大部分のサイトカインは２つ又は３つの異なる受容体と結合しており、中にはプロミスキャスで、複数のサイトカインを認識する受容体もある。特定のサイトカインに対する受容体は、すべての細胞で同じレベルに比例して発現するわけではなく、したがって、ある受容体に対する親和性を変化させて、特定の細胞群への結合を有利にし、したがって毒性を減少させることが可能なはずである（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ａｌｌ．１５１３２； ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／３３７３７４６１／）。

【0051】

場合によっては、２つの異なるサイトカインの組み合わせが、両方がアンタゴニスト若しくはアゴニストであることで、又は両方の混合物を有することで、特定の治療に有用であることもある（ｈｔｔｐｓ：／／ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ａｂｔ／ａｒｔｉｃｌｅ／４／２／１２３／６３０９３８５）。一方の分子のＮ末端と他方の分子のＣ末端の間にリンカー配列を挿入することによって２つのサイトカインを連結することは、上記の課題の一部又はすべてを解決する１つの方法でありうる。しかし、そのようなサイトカインが非共有結合二量体を形成することによって作用する場合であっても、受容体への結合様式が不適合であるために、Ｎ末端又はＣ末端を介して２つのサイトカインを連結することが常に可能であるとは限らない。さらに、柔軟なリンカーはタンパク質分解を受けやすいことになり、２つの単量体間の立体構造上の柔軟性のために結合親和性が増加しない場合がある。

【0052】

ここで、フォールディカインという概念は、野生型サイトカインと先行技術のいずれと比べても大きな利点をもたらす可能性がある。上述したように、フォールディカインは、２つの改変されたサイトカインドメインから構成される分子であり、そのそれぞれは、本明細書において「フォールディカインドメイン」と呼ばれ、この点に関して、２つの「フォールディカインドメイン」の少なくとも１つは、本明細書で記載されるように、フォールディカインドメインが基となるサイトカイン単量体ドメインと構造的に又は配列上同じではないことに留意されたい。本発明のフォールディカインの態様及び実施形態では、２つのフォールディカインドメインの１つは、一続きで連続しているとみなされうる。
フォールディカインドメインは、対応するサイトカイン単量体／ドメインと比較して非天然の配列順序を有する可能性があり、一方で、もう一つのフォールディカインドメインは、連続したフォールディカインドメインの天然又は新たに作り出されたＮ末端及びＣ末端に接続された、等しい又は異なるサイズの２つの断片に分割されている（図１を参照）。フォールディカインの連続ドメイン及び分割ドメインを、本明細書では３Ｄドメインとも呼ぶことがある。

【0053】

したがって、提供されるのは、（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、前記サイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の一方の配列が連続しておらず、もう一方のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列によって中断されている一本鎖二量体サイトカインポリペプチドである。

【0054】

配列が連続していない一本鎖二量体サイトカインポリペプチドのサイトカイン単量体ドメインは、人工一本鎖二量体サイトカインポリペプチドのフリーなＮ末端を含むサイトカイン単量体ドメインである。このサイトカイン単量体ドメインは、本出願全体を通じて、いわゆる「分割ドメイン」からなる又はその部分を構成する。

【0055】

他のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列は、その天然の配列順序を有する場合もあり、又は異なる配列順序を有する場合もある。第２のサイトカイン単量体ドメインは、本出願全体を通じて「連続ドメイン」とも呼ばれ、それは、２つのペプチドリンカー（「インターリンカー」）によって分割ドメインに接続されている。

【0056】

フォールディカインの利点
同一分子内に、配向が固定された２つの機能的に独立したドメインを有することにより、作製及び投与様式に依存しない、上述の問題のいくつかに答えるいくつかの興味深い可能性が提供される（図２を参照）。

【0057】

実施形態では、例えば、図３～図６、図２５～図２８、図３１～図３４、及び図４５～図４８に示されるように、フォールディカインは、隣接する（左右の）３Ｄドメイン（それら自体が「連続」及び「分割」であると考えることができる）間に２つのリンカーを有するという利点を有し、結合のエントロピーコストが主に第１の３Ｄドメインによって払われることになり、２つのリンカーの存在が第２の３Ｄドメインの移動度を制限するので、折り畳まれた二量体の構造／立体構造の安定性を高め、結果としてその標的受容体への結合の向上をもたらしうる。また、２つのリンカーで接続された２つの独立した３Ｄドメインを提供することによって、新しい特性をもつホモ又はヘテロ二量体サイトカインを作ることができ、例えば、標的受容体の発現のレベルに応じて特定の細胞型に対してより大きな選択性を許容しうる受容体と相互作用する３Ｄドメインの表面に導入できる変異により自由を与える（ｇｉｖｅｓ ｍｏｒｅ ｆｒｅｅｄｏｍ）。

【0058】

いくつかの有利な実施形態では、本発明によるヘテロ二量体フォールディカインは、その標的受容体に対する一方のドメインの結合の向上を示しうるが、その標的受容体に対する他方のドメインの結合の減少を示しうる。そのような実施形態では、第１のドメインは特定の細胞を標的とするのに有利に使用される可能性があり、一方で、第２のドメインは親和性が低下することになるので、第１のドメインに対するレセプターも発現している細胞のみに有利に／主に結合しうる。実施形態では、フォールディカインはまた、両ドメインの結合親和性を増加させ、したがって、特定の生理学的効果を達成するために必要とされうる有効な生理学的濃度を有意に減少させうる。例えば、フォールディカインが、対応する単量体生理的サイトカインと効果的に競合できるように、１つの受容体に対して高い親和性をもち、第２の受容体（対応する野生型サイトカインの受容体）に対しては全く親和性をもたない２つのドメインを有するアンタゴニスト分子を構築することが望まれる可能性がある。２つの３Ｄドメインを持つことにより、ホーミング、親和性及び特異性の多くの可能な組み合わせが可能になり、１分子中にアゴニストとアンタゴニストの機能を兼ね備えることができる。

【0059】

サイトカインファミリーに基づくフォールディカインの設計
本発明者ら（Ｗｅ）はインターロイキンの大部分を含むヘリックスバンドルサイトカインについてフォールディカインという概念を構築してきたが、ヘリックスバンドル構造から構成される他のタンパク質又は他の折り畳みをもつサイトカインについても同様のアプローチが可能であろうことが想定される。ヘリックスバンドルインターロイキンは以下ように分類される：
（Ａ）長鎖ヘリカル（ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ、及びＣＳＦ３）、若しくは単鎖ヘリカル（ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ１、及びＣＳＦ２）に細分類できるクラスＩヘリカルサイトカイン、又は
（Ｂ）（ＩＬ１０、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２４、ＩＬ２６、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、及びＩＬ２９）を含むＩＬ１０様タンパク質、並びにＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）及びＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１）などのＩ型インターフェロンであるクラスＩＩサイトカイン。

【0060】

ヘリックスバンドルサイトカインの大部分は、各クラスで類似した単量体構造を共有し、Ｉ型サイトカインが典型的には４つの保存されたαヘリックスをもつのに対し、ＩＩ型サイトカインは典型的には６つの保存されたαヘリックスをもつが、ＩＦＮγ、ＩＬ－５、ＩＬ－１０は「スワップドメイン（ｓｗａｐｐｅｄ－ｄｏｍａｉｎ）」二量体タンパク質である。ＩＬ－１０のようなスワップドメイン二量体タンパク質では、標準的なヘリックスバンドルサイトカインの単量体構造が開いて、もう一方のＩＬ－１０の開いた単量体を反平行に包み込み、２つの機能的なスプリットサイトカインドメインを一緒に生成し、２つの隣接する３Ｄドメインを画定する（例えば、図３及び２５を参照）。

【0061】

インターロイキンのクラス及びインターロイキンが単量体であるかスワップド二量体であるかに基づいて、本明細書に記載のように、フォールディカインを生成するための異なる戦略が採用されうる。

【0062】

本明細書で使用される場合、サイトカイン単量体のαヘリックスは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、アルファベット順Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ（クラスＩサイトカインの場合）、若しくはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ（クラスＩＩサイトカインの場合）で、又は序数（サイトカインのクラスに応じて第１～第４、若しくは第６）で番号付けされる。

【0063】

スワップドドメインサイトカインを含むフォールディカイン
この実施形態によれば、本発明による一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、スワップドドメイン二量体を形成する第１及び／又は第２のサイトカイン単量体（複数可）を含む。

【0064】

一実施形態によれば、本発明による一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、スワップドドメイン二量体を形成する第１及び第２のサイトカイン単量体を含む。具体的には、スワップドドメイン二量体を形成する第１及び第２のサイトカイン単量体は、同じサイトカインに由来してもよく、又は２つの異なるサイトカイン（２つの異なるクラスＩサイトカイン、若しくは２つの異なるクラスＩＩサイトカイン）に由来してもよい。

【0065】

スワップドドメインサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ－５、及びＩＬ－１０）の場合、本開示の一本鎖二量体サイトカイン（すなわち、フォールディカイン）を設計するためのスキームは、スワップドドメインサイトカインが、第２のスワップドドメインサイトカインに融合されるか、又はスワップドドメインを形成しないサイトカインに融合されるかに依存しうる。

【0066】

例えば、図３、２５及び２８を参照して記載されるように、フォールディカインが天然のスワップドドメイン二量体から作り出される両単量体の様々な実施形態では、その方法は、スワップドドメインフォールディカイン二量体において、「連続３Ｄ（フォールディカイン）ドメイン」（図３の右側ドメイン）が形成され、分割３Ｄ（フォールディカイン）ドメイン（図３の左側ドメイン）が形成されるように、第１のサイトカイン単量体のＮ末端を第２のサイトカイン単量体のＣ末端に連結するものでありうる。しかしその場合、最もＮ末端の単量体のＣ末端ヘリックスが、最もＣ末端の単量体のＮ末端ヘリックスに連結されるので、「連続」３Ｄドメインは、野生型サイトカインと比較して逆のヘリックス／配列を有することに留意されたい（図２５と２８）。さらに、３Ｄ空間における各ドメインは、２つの別々のポリペプチド単量体の部分から構成されることに留意すべきである。

【0067】

任意のそのような態様及び実施形態において、一方の単量体のＣ末端と他方の単量体のＮ末端の間を架橋するリンカー配列は、任意の好適な配列を有することができ、優先的に、立体構造的に拘束された（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ）構造を決める配列、すなわち「構造化（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）」リンカーを含む。このようにして、人工リンカーは、３Ｄドメイン構造を適切な／所望の構造配向に、立体構造的に拘束するのに役立つ。そのようなリンカーは、約３～約２０個のアミノ酸残基、約３～約１６個のアミノ酸残基、約４～約１２個のアミノ酸残基、約４～約８個のアミノ酸残基、約３～８個のアミノ酸残基又は約３～６個のアミノ酸残基を有することができる。有利には、そのようなリンカーは、互いに隣接する複数のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有せず、例えば、有利には、リンカーペプチドは、５個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基、２個以下のＧｌｙ及び／又はＳｅｒ残基、単離されたＧｌｙ及び／又はＳｅｒ残基のみを含有する、又はいくつかの実施形態では、Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有しない。

【0068】

したがって、スワップドドメイン二量体を形成する第１のサイトカイン単量体及び第２のサイトカイン単量体を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、リンカーペプチドは、第１のサイトカイン単量体のＮ末端と、第２のサイトカイン単量体のＣ末端を架橋する一本鎖二量体サイトカインポリペプチドが提供される。

【0069】

いくつかの実施形態では、スワップドドメイン二量体を形成するサイトカイン単量体はクラスＩサイトカインであり、前記（ｓａｉｄ）一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第２のサイトカイン単量体のヘリックスＡ～Ｃ及び第１のサイトカイン単量体のヘリックスＤを含む第１のサイトカイン単量体ドメイン（例えば、図２５の「分割ドメイン」を参照）、並びに第２のサイトカイン単量体のヘリックスＤ及び第１のサイトカイン単量体のヘリックスＡ～Ｃを含む第２のサイトカイン単量体ドメイン（例えば、図２５の「連続ドメイン」を参照）を含み、リンカーペプチドは、第２のサイトカイン単量体のヘリックスＤと、第１のサイトカイン単量体のヘリックスＡを架橋する。

【0070】

スワップドドメインクラスＩサイトカインに基づく例示的なホモマーのフォールディカインとしては、

TEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFK
hhhhhhhhhhhhh hhhh hhhhhhhhhh hhhhhh
HA HB
NLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES(NtCt)
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
TEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNL
hhhhhhhhhhhhh hhhh hhh hhhhhhhhhh hhhhhhhh
HA HB HC
SLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES
hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HD
を含む又はそれからなり、
（ＮｔＣｔ）が、ペプチドリンカー（配列番号１０１－（ＮｔＣｔ）－配列番号１０２の配列）、又は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一の配列であり、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－５受容体との相互作用を保持する二量体ＩＬ－５が挙げられる。ヘリックスの位置は、上記配列の一連の「ｈ」で表される。

【0071】

いくつかの実施形態では、スワップドドメイン二量体を形成するサイトカイン単量体はクラスＩＩサイトカインであり、前記一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第２のサイトカイン単量体のヘリックスＡ～Ｃ、及び第１のサイトカイン単量体のヘリックスＤ～Ｆを含む第１のサイトカイン単量体ドメイン（例えば、図２８の「分割ドメイン」を参照）、並びに第２のサイトカイン単量体のヘリックスＤ～Ｆ及び第１のサイトカイン単量体のヘリックスＡ～Ｃを含む第２のサイトカイン単量体ドメイン（例えば、図２８の「連続ドメイン」を参照）を含み、リンカーペプチドは、第２のサイトカイン単量体のヘリックスＦと第１のサイトカイン単量体のヘリックスＡを架橋する。

【0072】

スワップドドメインクラスＩＩサイトカインに基づく例示的なホモマーのフォールディカインとしては、二量体ＩＬ－１０が挙げられる。
一実施形態によれば、二量体ＩＬ－１０は、

CTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQ
hhh hhhhhhhhhhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
AENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINY
hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhh
HC HD HE
IEAYMTMKIRN(NtCt)PNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEV
hhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HF HA HB
MPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIF
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhh
HC HD HE
INYIEAYMTM_YY
hhhhhhhhhh
HF
（（ＮｔＣｔ）はペプチドリンカー）（配列番号１１－（ＮｔＣｔ）－配列番号１２の配列）の配列又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一な配列を含む又はそれからなり、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－１０受容体との相互作用を保持する。ヘリックスの位置は、上記配列の一連の「ｈ」で表される。

【0073】

一実施形態によれば、ＮｔＣｔリンカーはペプチドリンカーであり、配列ＮＧＧＬＤＹ（配列番号１３）を含む、又はそれからなる。

【0074】

具体的には、一本鎖二量体ＩＬ－１０は、配列番号９（いわゆる、実施例１のＭｕｔＳＣ１ポリペプチド）又は配列番号１０（いわゆる、実施例１のＭｕｔＳＣ２ポリペプチド）、又はそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一な配列を含む、又はそれからなり、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－１０受容体との相互作用を保持することができる。

【0075】

スワップドドメインクラスＩＩサイトカインに基づく別の例示的なホモマーのフォールディカインとしては、二量体ＩＦＮγが挙げられる。

【0076】

一実施形態によれば、二量体ＩＦＮγは、配列

QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQK
hhhhhhhhhhhh hh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hh
HA HB
SVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPMLF(NtCt)
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhh hhhhhh
HC HD HE HF
MQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDD
hhhhhhhhhhhhh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
QSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ
hhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhhhh
HC HD HE HF
MLFRGRRASQ_YY
（（ＮｔＣｔ）はペプチドリンカー）（配列番号１４－（ＮｔＣｔ）－配列番号１５の配列）、又は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一な配列を含む、又はそれからなり、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＦＮγ受容体との相互作用を保持する。ヘリックスの位置は、上記配列の一連の「ｈ」で表される。

【0077】

一実施形態によれば、ＮｔＣｔリンカーは、配列ＥＧＰＧ（配列番号１６）又はＡＳＫＰＨＰＧＱＬＷＹ（配列番号１７）を含む、又はそれからなる。

【0078】

具体的には、一本鎖二量体ＩＦＮγは、配列番号１８又は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは若しくは１００％同一な配列を含む、又はそれからなり、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＦＮγ受容体との相互作用を保持することができる。

【0079】

スワップドドメインサイトカインを形成しないサイトカイン（複数可）を含むフォールディカイン
本発明のこの態様によれば、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列は一続きに連続しており、一方で、第１のサイトカイン単量体ドメインの配列は、第１のサイトカイン単量体の第１の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置され、第１のサイトカイン単量体の第２の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置される。

【0080】

２つの同じ若しくは異なるクラスＩサイトカイン、２つの同じ若しくは異なるクラスＩＩサイトカイン、又は１つのクラスＩサイトカインと１つのクラスＩＩサイトカインを含むことができる、フォールディカインを作る３つの異なる方法が存在する。

【0081】

一実施形態によれば、第１及び第２のサイトカイン単量体は、スワップドドメイン二量体を形成しないクラスＩサイトカイン単量体であり、第１及び第２のサイトカイン単量体は同一又は異なる。

【0082】

別の実施形態によれば、第１及び第２のサイトカイン単量体は、スワップドドメイン二量体を形成しないクラスＩＩサイトカイン単量体であり、第１及び第２のサイトカイン単量体は同一、又は異なる。

【0083】

別の実施形態によれば、第１のサイトカイン単量体はクラスＩサイトカイン単量体であり、第２のサイトカイン単量体はクラスＩＩサイトカイン単量体である、又は第１のサイトカイン単量体はクラスＩＩサイトカイン単量体であり、第２のサイトカイン単量体はクラスＩサイトカイン単量体である。

【0084】

フォールディカインの形成方法Ａ
このフォールディカインの形成方法によれば、ループが各サイトカイン単量体で開けられ、サイトカイン単量体Ａの開いたループの新しいＮ末端がサイトカイン単量体Ｂの開いたループの新しいＣ末端と結合され、単量体Ａの開いたループの新しいＣ末端がサイトカイン単量体Ｂの開いたループの新しいＮ末端と結合される。サイトカイン単量体Ａの天然の（又は元の）Ｎ末端及び天然の（又は元の）Ｃ末端はさらに結合される（又は、代替えとして、サイトカイン単量体Ｂの天然／元のＮ末端及び天然／元のＣ末端が結合される）。

【0085】

フォールディカインを作るこの方法Ａによれば、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは：（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列は一続きに連続しており（特に第１のサイトカイン単量体ドメインの配列内に挿入され）、第１のサイトカイン単量体ドメインは、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＮ末端に配置された第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分が、天然のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に対応し、一方で、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＣ末端に配置された第１のサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分が、天然のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に相当する。

【0086】

構造的に、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、
ｉ）一本鎖二量体サイトカインポリペプチドのフリーなＮ末端及びＣ末端、並びに第１のサイトカイン単量体ドメインの第１及び第２の配列部分を、それらの天然の配列順序で含む分割ドメイン（すなわち、第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の部分は、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分であり、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドのＮ末端にあり、一方で、第１のサイトカイン単量体ドメインの第２の部分は、第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分であり、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドのＣ末端にある）、並びに
ｉｉ）第２のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分及び第２の配列部分として構築された第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、第１及び第２の配列部分が、それらの天然の配列順序と比較して逆向きの順序である連続ドメイン（すなわち、第２の部分は、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分であり、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分である第２のサイトカイン単量体ドメインの第１の部分のＮ側にある）
を含み、
分割ドメインにおいて、第１のサイトカイン単量体ドメインの第１及び第２の配列部分の配列は、連続ドメインの配列によって分離されている。

【0087】

スワップドドメイン二量体を形成しないクラスＩサイトカインの場合、フォールディカインの形成は、各単量体のループ（特にαヘリックスＢとＣの間）を開き、単量体の１つのＮ末端及びＣ末端を、リンカーを介して閉じた後に、２つのサイトカインを、２つのリンカーを介して連結させることを含みうる（例えば、図３１～３２を参照）。

【0088】

一実施形態によれば、αヘリックスＣとＤの間のループが各サイトカイン単量体で開けられ、２つのクラスＩサイトカイン単量体を含む一本鎖二量体クラスＩポリペプチドが提供され、前記一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、
ａ）第１のクラスＩサイトカイン単量体（図３１のサイトカイン２）の第２のαヘリックス（αヘリックスＢ）と、第２のクラスＩサイトカイン単量体（図３１のサイトカイン１）の第３のαヘリックス（αヘリックスＣ）を架橋する）リンカーペプチド、
ｂ）第２のクラスＩサイトカイン単量体の第４のαヘリックス（Ｃ末端αヘリックス、又はαヘリックスＤ）と、第２のクラスＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックス（Ｎ末端αヘリックス、又はαヘリックスＡ）を架橋するリンカーペプチド、及び
ｃ）第２のクラスＩサイトカイン単量体の第２のαヘリックス（αヘリックスＢ）と、第１のクラスＩサイトカイン単量体の第３のαヘリックス（αヘリックスＣ）を架橋するリンカーペプチド
を含む。

【0089】

前記一本鎖二量体サイトカインにおいて、第１のクラスＩサイトカイン単量体の天然のＮ末端及びＣ末端はフリーである。

【0090】

全体として、一本鎖二量体クラスＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ及びＢを含む第１のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢと、第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ及びＤを含む前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤと、前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｖ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ及びＢを含む前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｖｉ）第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢと、第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣを架橋するリンカーペプチド、並びにｖｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ及びＤを含む前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分を含む（図３１及び３２）。

【0091】

いくつかの実施形態では、一旦クラスＩフォールディカインが方法Ａに従って作られると、第２のクラスＩサイトカイン単量体の天然のＮｔ及びＣｔが結合され、ループが第１の第２のサイトカイン単量体で開いた循環置換（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）バリアントが作り出される。

【0092】

スワップドドメイン二量体を形成しないクラスＩＩサイトカインの場合、フォールディカインの形成は、２つのサイトカインを、各単量体のループ（特にαヘリックスＣとＤの間）を開き、単量体の１つのＮ末端及びＣ末端を、リンカーを介して閉じた後に、２つのリンカーを介して連結させることを含みうる（例えば、図５及び２７を参照）。

【0093】

一実施形態によれば、αヘリックスＣとＤの間のループが各サイトカイン単量体で開けられ、スワップドドメイン二量体を形成しないクラスＩＩサイトカイン（複数可）に由来する２つのサイトカイン単量体を含む一本鎖二量体ＩＩ型サイトカインポリペプチドが提供され、前記一本鎖二量体ＩＩ型サイトカインポリペプチドでは：
ａ）リンカー配列は、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体（図２７のサイトカイン１）の第３のαヘリックス（αヘリックスＣ）と、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体（図２７のサイトカイン２）の第４のαヘリックス（αヘリックスＤ）を架橋し、
ｂ）リンカー配列は、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の第４のαヘリックス（αヘリックスＤ）と、前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の第３のαヘリックス（αヘリックスＣ）を架橋し、
ｃ）リンカー配列は、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックス（Ｎ末端αヘリックス、又はαヘリックスＡ）と、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の第６のαヘリックス（Ｃ末端αヘリックス、又はαヘリックスＦ）を架橋し、
ｄ）前記第１及び第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のそれぞれの第３及び第４のαヘリックス（αヘリックスＣ及びＤ）は架橋されていない。

【0094】

全体として、一本鎖二量体クラスＩＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｃを含む第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣと、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤ～Ｆを含む第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦと、前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｖ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｃを含む第２のサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｖｉ）第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣと、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤを架橋するリンカーペプチド、及びｖｉｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤ～Ｆを含む前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＣ末端部分を含む。

【0095】

いずれのそのような実施形態においても、２つのクラスＩＩサイトカイン単量体は、スワップドドメイン二量体を形成しない１つのクラスＩＩサイトカインに由来する、又はスワップドドメイン二量体を形成しない２つの異なるクラスＩＩサイトカインに由来する。

【0096】

クラスＩＩサイトカインに基づく例示的なホモマーのフォールディカインとしては
ｉ）配列

RLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFT
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhh
HA HB
LEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLS(Xn1)HIQRNVQKLKDTVKKLGESGE
h---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhh
HC HD
IKAIGELDLLFMSLRNACI(NtCt)LDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKL
hhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hh
HE HF HA
FHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLS(Xn2)HIQR
h hhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HB HC
NVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
hhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF
（配列番号３２５－（Ｘｎ１）－配列番号３２６－（ＮｔＣｔ）－配列番号３２７－（Ｘｎ２）－配列番号３２８）又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカイン（ＩＬ－２２）のそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する二量体ＩＬ－２２、
ｉｉ）二量体ＩＬ－１９（配列番号１９５－（Ｘｎ１）－配列番号１９６－（ＮｔＣｔ）－配列番号１９７－（Ｘｎ２）－配列番号１９８の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｉｉｉ）二量体ＩＬ－２０（配列番号２００－（Ｘｎ１）－配列番号２０１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２０２－（Ｘｎ２）－配列番号２０３の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｉｖ）二量体ＩＬ－２６（配列番号２１０－（Ｘｎ１）－配列番号２１１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２１２－（Ｘｎ２）－配列番号２１３の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｖ）二量体ＩＦＮλ２（配列番号２１５－（Ｘｎ１）－配列番号２１６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２１７－（Ｘｎ２）－配列番号２１８の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｖｉ）二量体ＩＦＮλ３（配列番号２２０－（Ｘｎ１）－配列番号２２１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２２２－（Ｘｎ２）－配列番号２２３の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｖｉｉ）二量体ＩＦＮλ１（配列番号２２５－（Ｘｎ１）－配列番号２２６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２２７－（Ｘｎ２）－配列番号２２８の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｖｉｉｉ）二量体ＩＦＮα１／１３（配列番号２３０－（Ｘｎ１）－配列番号２３１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２３２－（Ｘｎ２）－配列番号２３３の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｉｘ）二量体ＩＦＮα２（配列番号２３５－（Ｘｎ１）－配列番号２３６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２３７－（Ｘｎ２）－配列番号２３８の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｘ）二量体ＩＦＮβ（配列番号２４０－（Ｘｎ１）－配列番号２４１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２４２－（Ｘｎ２）－配列番号２４３の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｘｉ）二量体ＩＦＮΩ１（配列番号２４５－（Ｘｎ１）－配列番号２４６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２４７－（Ｘｎ２）－配列番号２４８の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｘｉｉ）二量体ＩＦＮε（配列番号２５０－（Ｘｎ１）－配列番号２５１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２５２－（Ｘｎ２）－配列番号２５３の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
ｘｉｉｉ）二量体ＩＦＮκ（配列番号２５５－（Ｘｎ１）－配列番号２５６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２５７－（Ｘｎ２）－配列番号２５８の配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含むことができる、又はそれからなることができ、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルの前記単量体クラスＩＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する）、
が挙げられ、
ここで（ＮｔＣｔ）、（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）は、ペプチドリンカーである。

【0097】

任意のそのような態様及び実施形態において、１つの単量体のＮ末端とＣ末端を架橋するリンカー配列（ＮｔＣｔ）は、任意の好適な配列を有することができ、立体構造的に拘束された構造、すなわち「構造化」リンカーを画定する配列を優先的に含む。そのようなリンカーは、約３～約２０個のアミノ酸残基、約３～約１６個のアミノ酸残基、約４～約１２個のアミノ酸残基、約４～約８個のアミノ酸残基、約３～約８個のアミノ酸残基又は約３～約６個のアミノ酸残基を有することができる。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、互いに隣接する複数のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有せず、例えば、リンカーペプチドは、５個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、２個以下のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有し、単離されたＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基のみを含有する、又はいくつかの実施形態では、Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有しない。

【0098】

本発明者らは、設計されたリンカーが同じ長さのポリＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーよりも優れていることを見出したので、受容体と相互作用させるために、モデル化によってリンカーを設計することができる。

【0099】

例示的な構造化（ＮｔＣｔ）リンカーは、ＡＮＧＴ（配列番号３２９）、若しくはＡＮＧＶ（配列番号３３０）、若しくはＴＤＹＤＳＱＴＮ（配列番号３０３）の配列を含む、又はそれからなる。

【0100】

別の例示的な構造化（ＮｔＣｔ）リンカーは、特にフォールディカインが二量体ＩＦＮ－βである場合、配列ＥＧＰＧ（配列番号３０４）を含む、又はそれからなる。

【0101】

同様に、２つの単量体配列を架橋する人工リンカー（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）は、任意の好適な配列を有することができ、特に、立体構造的に拘束された構造、すなわち「構造化」リンカーを画定する配列を含む。そのようなリンカーは、約３～約２０個のアミノ酸残基、約３～約１６個のアミノ酸残基、約４～約１２個のアミノ酸残基、約４～約８個のアミノ酸残基、約３～約８個のアミノ酸残基又は約３～約６個のアミノ酸残基を有することができる。有利には、そのようなリンカーは、互いに隣接する複数のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有せず、例えば、リンカーペプチドは、５個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、２個以下のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有し、単離されたＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基のみを含有する、又はいくつかの実施形態では、Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有しない。２つの単量体配列を架橋する好適なリンカーの例示的な対は、
ｉ）リンカーがそれ自体又は２つのサイトカインドメインのいずれかと相互作用し、それにより、好ましい立体構造をとるように、タンパク質設計アルゴリズム（すなわちＦｏｌｄＸ、ＭｏｄｅｌＸ）を用いて設計された配列（例示的な配列としては、Ｘｎ１＝ＴＣＭＰＧＧＳＫＴ（配列番号３３７）且つＸｎ２＝ＲＬＥＬＬＰ（配列番号３３１）、又はＸｎ１＝ＮＲＬＫＫＬＭＡＳＳＤ（配列番号３３２）且つＸｎ２＝ＲＬＥＬＬＰ（配列番号３３１）が挙げられる）、
ｉｉ）リンカーの長さが短いままであり（好ましくは６、５、４又は３残基以下）、分割ドメインの一部が連続ドメインの一部に折り畳まれるのを防ぐことを条件として、さまざまな割合のＧｌｙ残基及びＳｅｒ残基から構成される柔軟な配列（例示的な配列としては、Ｘｎ１＝Ｘｎ２＝ＧＧＧ、若しくはＧＧＧＳＧＧ（配列番号２７３）、若しくはＧＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３３３）、若しくはＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３３４）が挙げられる）、又は
ｉｉｉ）任意の長さのＰｏｌｙＰｒｏヘリックスを作るＰｒｏ残基から構成される、柔軟性を欠く（Ｒｉｇｉｄ）配列（例示的な配列としては、Ｘｎ１＝Ｘｎ２＝ＧＰＧ、又はＧＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３３５）、又はＧＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３３６）が挙げられる）
を含む、又はそれからなる（特にフォールディカインが二量体ＩＬ－２２である場合）。

【0102】

いくつかの実施形態では、一旦クラスＩＩフォールディカインが方法Ａに従って作られると、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の天然のＮｔとＣｔが結合され、ループが第１の第２のクラスＩＩのサイトカイン単量体で開いた循環置換バリアントが作り出される。

【0103】

いくつかの実施形態によれば、配列番号６５、配列番号６６、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、若しくは配列番号２８８の配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一な配列を含む、又はそれからなり、ＩＬ－２２ポリペプチドと、少なくとも同じ安定性並びに／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－２２受容体１及び／若しくはＩＬ－２２受容体２との相互作用を保持する一本鎖二量体ＩＬ－２２ポリペプチドが提供される。

【0104】

いくつかの実施形態によれば、配列番号７６の配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一な配列を含む、又はそれからなり、少なくとも同じ安定性並びに／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－１０受容体及びＩＬ－２２受容体との相互作用を保持する一本鎖キメラＩＬ－１０－ＩＬ－２２ポリペプチドが提供される。

【0105】

クラスＩとクラスＩＩサイトカインの両方を含むフォールディカインは、クラスＩ又はクラスＩＩサイトカインに基づくフォールディカインについて記載されたのと同じ方法Ａで設計することができる。

【0106】

この実施形態によれば、本発明の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドでは、第１と第２のサイトカイン単量体の一方は、クラスＩサイトカイン単量体であり、第１と第２のサイトカイン単量体の他方は、クラスＩＩサイトカイン単量体である。

【0107】

第１のスキームでは、２つのサイトカインは、Ｉ型及びＩＩ型サイトカインの天然のループを開き、ＩＩ型サイトカイン又はＩ型サイトカインの天然のＮ末端及びＣ末端を、リンカーを介して閉じた後に、２つの人工ペプチドリンカーを介して連結される。

【0108】

フォールディカインの形成方法Ｂ
このフォールディカインの形成方法によれば、サイトカイン単量体Ａの天然のＮ末端は、サイトカイン単量体Ｂの天然のＣ末端と結合され、サイトカイン単量体Ｂの天然のＣ末端は、サイトカイン単量体Ａの天然のＮ末端と結合される。ループは、サイトカイン単量体Ａ又はサイトカイン単量体Ｂのいずれかで開けられる。

【0109】

天然のＮｔとＣｔを連結させ、異なるループでタンパク質を開け、単量体サイトカインの循環置換を作ることによって行われた実験（実施例４を参照）により、サイトカインの機能性を損なうことなくどのループを開くことができるかが示されている。

【0110】

フォールディカインを作るこの方法Ｂによれば、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列は、一続きに連続しており、一方で、第１のサイトカイン単量体ドメインの配列は、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＮ末端に配置された第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分が、天然のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に対応し、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＣ末端に配置された第１のサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分が、天然のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に対応する。

【0111】

構造的に、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、
ｉ）一本鎖二量体サイトカインポリペプチドのフリーなＮ末端及びＣ末端、並びに第１のサイトカイン単量体ドメインの第１及び第２の配列部分を、それらの天然の配列順序と比較して逆向きの順序で含む分割ドメイン（すなわち、第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分である第２の部分は、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分である、第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の部分のＮ側にある）、並びに
ｉｉ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を、その天然の配列順序で（すなわち、Ｎ末端からＣ末端の方向で）含む連続ドメインを含み、
分割ドメインにおいて、第１のサイトカイン単量体ドメインの第１及び第２の配列部分の配列は、連続ドメインの配列によって分離されている。

【0112】

スワップドドメイン二量体を形成しないクラスＩサイトカインの場合、方法Ｂに従ってフォールディカインの形成は、２つの単量体クラスＩサイトカインを２つのリンカーを介して連結して各サイトカイン単量体のＮ末端及びＣ末端にそれぞれ架橋し、続いて、単量体の１つでループを開いて一本鎖ポリペプチドに新しいＮ末端及びＣ末端を作り出すものである。１つのクラスＩサイトカイン単量体において開けられるループは、αヘリックスＡとＢの間のループ、αヘリックスＢとＣの間、又はαヘリックスＣとＤの間であることができる。

【0113】

いくつかの実施形態によれば、２つのクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体クラスＩポリペプチドが提供され、前記一本鎖二量体サイトカインポリペプチドでは：
ａ）リンカーペプチドは、第１のクラスＩサイトカイン単量体（例えば図２６のサイトカイン２）の第４のαヘリックス（αヘリックスＤ）と、第２のクラスＩサイトカイン単量体（例えば図２６のサイトカイン１）の第１のαヘリックス（αヘリックスＡ）を架橋し、
ｂ）リンカーペプチドは、第２のクラスＩサイトカイン単量体の第４のαヘリックス（Ｃ末端αヘリックス、又はαヘリックスＤ）と、第１のクラスＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックス（Ｎ末端αヘリックス、又はαヘリックスＡ）を架橋し、
ｃ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ及びＢは架橋されていない、又は前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢ及びＣは架橋されていない、又は前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ及びＤは架橋されていない。

【0114】

前記一本鎖二量体サイトカインでは、第１のクラスＩサイトカイン単量体のループを開くことによって作り出された新しいＮ末端及びＣ末端はフリーである。

【0115】

一実施形態によれば、αヘリックスＢとＣの間のループは、１つのサイトカイン単量体で開けられ、一本鎖二量体クラスＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ及びＤを含む第１のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤと、第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｄを含む前記第２のクラスＩサイトカイン単量体の部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤと、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、並びにｖ）αヘリックスＡ及びＢを含む前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分を含む。

【0116】

一実施形態によれば、αヘリックスＡとＢの間のループは、１つのサイトカイン単量体で開けられ、一本鎖二量体クラスＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢ～Ｄを含む第１のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤと、第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｄを含む前記第２のクラスＩサイトカイン単量体の部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤと、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、及びｖ）αヘリックスＡを含む前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分を含む。

【0117】

一実施形態によれば、αヘリックスＣとＤの間のループは、１つのサイトカイン単量体で開けられ、一本鎖二量体クラスＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤを含む第１のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤと、第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｄを含む前記第２のクラスＩサイトカイン単量体の部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤと、前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、及びｖ）αヘリックスＡ～Ｃを含む前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分を含む。

【0118】

ＩＬ－２サイトカイン単量体の文脈において、配列番号７９（シグナルペプチドを含まない）の配列を参照して、単量体は、αヘリックスＡとＢの間の位置４９～５４（特に位置５２～５３の残基間）若しくは６９～７６（特に位置６８～６９の残基間）のループ、αヘリックスＢとＣの間の位置９１～１０１（特に位置９６～９７の残基間）のループ、又はαヘリックスＣとＤの間の位置１１７～１２５（特に位置１２０～１２１の残基間）のループで開くことができることが具体的に示された（図４３を参照）。

【0119】

いくつかの実施形態では、一旦クラスＩフォールディカインが方法Ｂに従って作られると、第２のクラスＩサイトカイン単量体の天然のＮｔとＣｔが結合され、第１の第２のクラスＩサイトカイン単量体でループが開いた循環置換バリアントが作り出される。

【0120】

ＩＬ－２及びＩＬ－４サイトカイン単量体（ＩＬ－４は連続ドメインを含有）を含む一本鎖二量体クラスＩポリペプチドの例は、配列番号２９５の配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な、少なくとも同じ安定性並びに／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－２受容体及びＩＬ－４受容体との相互作用を保持する配列を含む、又はそれからなる。

【0121】

クラスＩサイトカインに基づく例示的なヘテロ二量体フォールディカインとしては、

MYRMQLLSCIALSLALVTNSLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
IL-2 HC IL-2 HD
STLTGPPPPPGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHH
H hhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
IL-4 HA IL-4 HB
EKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
IL-4 HC IL-4 HD
GPPPPPGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEV
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhh---hhhhhh
IL2-HA IL-2 HB
LNLAQS*
が挙げられる。

【0122】

短鎖クラスＩサイトカインに基づく例示的なホモマーのフォールディカインとしては、以下が挙げられる：
ｉ）二量体ＩＬ－２（配列番号８９－（Ｘｎ１）－配列番号９０－（Ｘｎ２）－配列番号９１を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｉｉ）二量体ＩＬ－４（配列番号９３－（Ｘｎ１）－配列番号９４－（Ｘｎ２）－配列番号９５を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｉｉｉ）二量体ＩＬ－３（配列番号９７－（Ｘｎ１）－配列番号９８－（Ｘｎ２）－配列番号９９を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｉｖ）二量体ＩＬ－７（配列番号１０３－（Ｘｎ１）－配列番号１０４－（Ｘｎ２）－配列番号１０５を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｖ）二量体ＩＬ－９（配列番号１０７－（Ｘｎ１）－配列番号１０８－（Ｘｎ２）－配列番号１０９を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｖｉ）二量体ＩＬ－１５（配列番号１１０－（Ｘｎ１）－配列番号１１１－（Ｘｎ２２）－配列番号１１２を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｖｉｉ）二量体ＩＬ－２１（配列番号１１３－（Ｘｎ１）－配列番号１１４－（Ｘｎ）－配列番号１１５を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｖｉｉｉ）二量体ＴＳＬＰ（配列番号１１６－（Ｘｎ１）－配列番号１１７－（Ｘｎ２）－配列番号１１８を含むことができる、又はそれからなることができる）、及び
ｉｘ）二量体ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号１２０－（Ｘｎ１）－配列番号１２１－（Ｘｎ２）－配列番号１２配列番号１０１を含むことができる、又はそれからなることができる）
であるか、
それらと少なくとも９５％、９８％若しくは９９％同一な、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体短鎖クラスＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する配列
であり、
ここで（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）はペプチドリンカーである。

【0123】

長鎖クラスＩサイトカインに基づく例示的なホモマーのフォールディカインとしては、以下が挙げられる：
ｉ）二量体ＩＬ－６（配列番号１３５－（Ｘｎ１）－配列番号１３６－（Ｘｎ２）－配列番号１３７を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｉｉ）二量体ＩＬ－１１（配列番号１３９－（Ｘｎ１）－配列番号１４０－（Ｘｎ２）－配列番号１４１を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｉｉｉ）二量体ＩＬ－１２α（配列番号１４３－（Ｘｎ１）－配列番号１４４－（Ｘｎ２）－配列番号１４５を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｉｖ）二量体ＩＬ－２３α（配列番号１４７－（Ｘｎ１）－配列番号１４８－（Ｘｎ２）－配列番号１４９を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｖ）二量体ＩＬ－２７α（配列番号１５１－（Ｘｎ１）－配列番号１５３－（Ｘｎ２）－配列番号１５３を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｖｉ）二量体ＩＬ－３１（配列番号１５４－（Ｘｎ１）－配列番号１５５－（Ｘｎ２）－配列番号１５６を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｖｉｉ）二量体ＣＬＣＦ１（配列番号１５８－（Ｘｎ１）－配列番号１５９－（Ｘｎ２）－配列番号１６０を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｖｉｉｉ）二量体ＯＮＣＭ（配列番号１６１－（Ｘｎ１）－配列番号１６２－（Ｘｎ２）－配列番号１６３を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｉｘ）二量体ＣＴＦ１（配列番号１６５－（Ｘｎ１）－配列番号１６６－（Ｘｎ２）－配列番号１６７を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｘ）二量体ＣＮＴＦ（配列番号１６９－（Ｘｎ１）－配列番号１７０－（Ｘｎ２）－配列番号１７１を含むことができる、又はそれからなることができる）、
ｘｉ）二量体ＬＩＦ（配列番号１７３－（Ｘｎ１）－配列番号１７４－（Ｘｎ２）－配列番号１７５を含むことができる、又はそれからなることができる）、及び
ｘｉｉ）二量体ＣＳＦ３（配列番号１７７－（Ｘｎ１）－配列番号１７８－（Ｘｎ２）－配列番号１７９を含むことができる、又はそれからなることができる）
であるか、
それらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な、少なくとも同じ安定性及び／若しくは少なくとも同じレベルの前記単量体長鎖クラスＩサイトカインのそれぞれの受容体（複数可）との相互作用を保持する配列
であり、
ここで（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）はペプチドリンカーである。

【0124】

任意のそのような態様及び実施形態において、αヘリックス、例えば、一方の単量体のＣ末端と他方の単量体のＮ末端の間を架橋するリンカーペプチド（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）は、任意の好適な配列を有することができ、立体構造的に拘束された構造、すなわち「構造化」リンカーを画定する配列を優先的に含む。そのようなリンカーは、約３～約２０個のアミノ酸残基、約３～約１６個のアミノ酸残基、約４～約１２個のアミノ酸残基、約４～約８個のアミノ酸残基、約３～約８個のアミノ酸残基又は約３～約６個のアミノ酸残基を有することができる。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、互いに隣接する複数のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有せず、例えば、リンカーペプチドは、５個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、２個以下のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有し、単離されたＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基のみを含有する、又はいくつかの実施形態では、Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有しない。優先的に、そのようなリンカーは、少なくとも２つの連続したＰｒｏ残基、好ましくは、３、４、５又は６個の連続したＰｒｏ残基を含有し、柔軟性を欠くＰｏｌｙＰｒｏヘリックスを形成する。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーＸｎ１及びＸｎ２は同一である。

【0125】

いくつかの実施形態では、二量体ＩＬ－２は、配列番号８９－（Ｘｎ１）－配列番号９０－（Ｘｎ２）－配列番号９１を含む、又はそれからなり、ペプチドリンカーＸｎ１及びＸｎ２は同一であり、ＧＰＰＰＰＧ（配列番号２７０）、ＧＰＰＰＰＰＧ（配列番号２７１）、ＧＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号２７２）、ＧＧＧＳＧＧ（配列番号２７３）、ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号２７４）、又はＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７５）の配列を含む、又はそれからなる。これらの実施形態では、二量体ＩＬ－２は、配列番号８９のＮ末端すぐにＬｙｓ残基を、配列番号９１のＣ末端すぐにＧｌｎ－Ｓｅｒジペプチドをさらに含むことができる（Ｋ－配列番号８９－（Ｘｎ１）－配列番号９０－（Ｘｎ２）－配列番号９１－ＱＳの配列）。

【0126】

スワップドドメイン二量体を形成しないクラスＩＩサイトカインの場合、方法Ｂに従ってフォールディカインの形成は、２つの単量体クラスＩＩサイトカインを、２つのリンカーを介して連結して各サイトカイン単量体のＮ末端及びＣ末端にそれぞれ架橋し、続いて、単量体の１つでループを開いて一本鎖ポリペプチドに新しいＮ末端及びＣ末端を作り出すことを含む。１つのクラスＩＩサイトカイン単量体において開けられるループは、αヘリックスＡとＢの間のループ、αヘリックスＢとＣの間、αヘリックスＣとＤの間、αヘリックスＤとＥの間、又はαヘリックスＥとＦの間であることができる。

【0127】

いくつかの実施形態によれば、スワップドドメイン二量体を形成しないクラスＩＩサイトカイン（複数可）の２つのサイトカイン単量体を含む一本鎖二量体ＩＩ型サイトカインポリペプチドが提供され、前記一本鎖二量体ＩＩ型サイトカインポリペプチドでは：
ａ）リンカー配列は、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体（例えば図３３のサイトカイン１）の第１のαヘリックス（Ｎ末端αヘリックス、又はαヘリックスＡ）と、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体（例えば図３３のサイトカイン２）の第６のαヘリックス（Ｃ末端αヘリックス、又はαヘリックスＦ）を架橋し、
ｂ）リンカー配列は、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の第６のαヘリックス（Ｃ末端αヘリックス、又はαヘリックスＦ）と、前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックス（Ｃ末端αヘリックス、又はαヘリックスＡ）を架橋し、
ｃ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の第１及び第２のαヘリックス（αヘリックスＡ及びＢ）、第２及び第３のαヘリックス（αヘリックスＢ及びＣ）、第３及び第４のαヘリックス（αヘリックスＣ及びＤ）、第４及び第５のαヘリックス（αヘリックスＤ及びＥ）、又は第５及び第６のαヘリックス（αヘリックスＥ及びＦ）は架橋されていない。

【0128】

前記一本鎖二量体サイトカインでは、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のループを開くことによって作り出された新しいＮ末端及びＣ末端はフリーである。

【0129】

一実施形態によれば、αヘリックスＢとＣの間のループは、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体で開けられ、一本鎖二量体クラスＩＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ～Ｆを含む第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦと、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｆを含む前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦと、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、並びにｖ）αヘリックスＡ及びＢを含む前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分を含む。

【0130】

一実施形態によれば、αヘリックスＣとＤの間のループは、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体で開けられ、一本鎖二量体クラスＩＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤ～Ｆを含む第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦと、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｆを含む前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦと、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、及びｖ）αヘリックスＡ～Ｃを含む前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＮ末端部分を含む。

【0131】

一実施形態によれば、αヘリックスＥとＦの間のループは、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体で開けられ、一本鎖二量体クラスＩＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦを含む第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＣ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦと、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｆを含む前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の部分、ｉｖ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦと、前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド、及びｖ）αヘリックスＡ～Ｅを含む前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＮ末端部分を含む。

【0132】

ＩＬ－２２サイトカイン単量体の文脈において、配列番号２９１（シグナルペプチドを含まない）の配列を参照して、単量体は、αヘリックスＢとＣの間の位置１０２～１１３（特に位置１０８～１０９の残基間）のループ、又はαヘリックスＣとＤの間の位置１２９～１４０（特に位置１３４～１３５の残基間）のループ、又はαヘリックスＥとＦの間の位置１６５～１６７（特に位置１６４～１６５の残基間）のループで開くことができることが具体的に示された（図４１を参照）。

【0133】

ＩＦＮβサイトカイン単量体の文脈において、配列番号２９１（シグナルペプチドを含まない）の配列を参照して、単量体は、αヘリックスＡとＢの間の位置３４～５１（特に位置４９～５０の残基間）のループ、又はαヘリックスＢとＣの間の位置７１～８１（特に位置７５～７６の残基間）のループ、又はαヘリックスＣとＤの間の位置１０８～１２１（特に位置１１７～１１８の残基間）のループで開くことができることが具体的に示された（図４２を参照）。

【0134】

任意のそのような態様及び実施形態において、αヘリックス、例えば、一方の単量体のＣ末端と他方の単量体のＮ末端の間を架橋するリンカーペプチド（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）は、任意の好適な配列を有することができ、立体構造的に拘束された構造、すなわち「構造化」リンカーを画定する配列を優先的に含む。そのようなリンカーは、約３～約２０個のアミノ酸残基、約３～約１６個のアミノ酸残基、約４～約１２個のアミノ酸残基、約４～約８個のアミノ酸残基、約３～約８個のアミノ酸残基又は約３～約６個のアミノ酸残基を有することができる。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、互いに隣接する複数のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有せず、例えば、リンカーペプチドは、５個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、２個以下のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有し、単離されたＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基のみを含有する、又はいくつかの実施形態では、Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有しない。優先的に、そのようなリンカーは、少なくとも２つの連続したＰｒｏ残基、好ましくは、３、４、５又は６個の連続したＰｒｏ残基を含有し、柔軟性を欠くＰｏｌｙＰｒｏヘリックスを形成する。

【0135】

いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーＸｎ１及びＸｎ２は同一である。

【0136】

Ｉ型とＩＩ型サイトカイン単量体の両方を含むフォールディカインは、クラスＩ及びクラスＩＩサイトカインに基づくフォールディカインについて記載されたのと同じ方法Ｂで設計することができる。

【0137】

このスキームでは、２つのサイトカインは、サイトカインＩ型の天然のＮ末端とサイトカインＩＩ型の天然のＣ末端を架橋し、サイトカインＩ型の天然のＣ末端とサイトカインＩＩ型の天然のＮ末端を架橋する２つの人工リンカーペプチドを介して連結され、サイトカインＩ型（例えば、図６ｉを参照）又はサイトカインＩＩ型（図示されていない）のループを開いている。

【0138】

いくつかの実施形態では、一旦クラスＩＩフォールディカインが方法Ｂに従って作られると、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の天然のＮｔとＣｔが結合され、ループが第１の第２のクラスＩＩサイトカイン単量体で開いた循環置換バリアントが作り出される。

【0139】

任意のそのような態様及び実施形態において、Ｉ型とＩＩ型サイトカインのＮ末端とＣ末端の間を架橋するリンカー配列は、任意の好適な配列を有することができ、立体構造的に拘束された構造、例えば「構造化」リンカーを画定する配列を優先的に含む。そのようなリンカーは、約３～約２０個のアミノ酸残基、約３～約１６個のアミノ酸残基、約４～約１２個のアミノ酸残基、約４～約８個のアミノ酸残基、約３～約８個のアミノ酸残基又は約３～約６個のアミノ酸残基を有することができる。有利には、そのようなリンカーは、互いに隣接する複数のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有せず、例えば、リンカーペプチドは、５個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、２個以下のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有し、単離されたＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基のみを含有する、又はいくつかの実施形態では、Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有しない。同様に、２つの単量体配列間を架橋する人工リンカーは、任意の好適な配列を有することができ、特に、立体構造的に拘束された構造、すなわち「構造化」リンカーを画定する配列を含む。そのようなリンカーは、約３～約２０個のアミノ酸残基、約３～約１６個のアミノ酸残基、約４～約１２個のアミノ酸残基、約４～約８個のアミノ酸残基、約３～約８個のアミノ酸残基又は約３～約６個のアミノ酸残基を有することができる。有利には、そのようなリンカーは、互いに隣接する複数のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有せず、例えば、リンカーペプチドは、５個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、２個以下のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有し、単離されたＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基のみを含有する、又はいくつかの実施形態では、Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有しない。

【0140】

任意のそのような態様及び実施形態において、任意のそのような人工リンカーペプチド配列（例えば、サイトカインＩ型のＮ末端及びＣ末端とＩＩ型サイトカインの開いたループの末端との間を架橋するリンカー、並びにＩＩ型サイトカインのＮ末端及びＣ末端を連結する（その選択肢が選ばれた場合）リンカー）は、任意の好適な配列を有することができ、立体構造的に拘束された構造、例えば「構造化」リンカーを画定する配列を優先的に含む。そのようなリンカーは、約３～約２０個のアミノ酸残基、約３～約１６個のアミノ酸残基、約４～約１２個のアミノ酸残基、約４～約８個のアミノ酸残基、約３～約８個のアミノ酸残基又は約３～約６個のアミノ酸残基を有することができる。有利には、そのようなリンカーは、互いに隣接する複数のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有せず、例えば、リンカーペプチドは、５個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、２個以下のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有し、単離されたＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基のみを含有する、又はいくつかの実施形態では、Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有しない。

【0141】

フォールディカインの形成方法Ｃ
クラスＩサイトカインの場合、フォールディカインの形成方法Ｃによれば、ループは１つのクラスＩサイトカイン単量体Ｂで開けられ、サイトカイン単量体Ｂの開いたループの新しいＮ末端は、サイトカイン単量体Ａの天然の（又は元の）Ｃ末端と結合され、単量体Ｂの開いたループの新しいＣ末端は、サイトカイン単量体Ａの天然の（又は元の）Ｎ末端と結合される。

【0142】

フォールディカインを作るこの方法Ｃによれば、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、（ａ）第１のクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、第１のクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列は一続きに連続しており、一方で、第２のサイトカイン単量体ドメインの配列は、第１のクラスＩサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置された第２のクラスＩサイトカイン単量体の第１の配列部分が、天然のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分に対応し、第１のクラスＩサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置された第２のクラスＩサイトカイン単量体の第２の配列部分が、天然のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分に対応する。

【0143】

一本鎖二量体クラスＩサイトカインポリペプチドは、
ｂ）一本鎖二量体クラスＩサイトカインポリペプチドのフリーなＮ末端及びＣ末端、並びに第２のクラスＩサイトカイン単量体ドメインの第１及び第２の配列部分を含む分割ドメイン、並びに
ｉｉ）第１のクラスＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む連続ドメイン
を含み、
第２のクラスＩサイトカイン単量体ドメインの第１及び第２の配列部分の配列は、分割ドメインにおいて、連続ドメインの配列によって分離されている。

【0144】

クラスＩサイトカインの場合、方法Ｃに従ってフォールディカインを形成することは、１つの単量体（例えばαヘリックスＢとＣの間）のループを開くことを含みうる。

【0145】

一実施形態によれば、αヘリックスＢとＣの間のループは、１つのサイトカイン単量体で開けられ、２つのクラスＩサイトカイン単量体を含む一本鎖二量体クラスＩポリペプチドが提供され、前記一本鎖二量体サイトカインポリペプチドにおいて：
ａ）リンカーペプチドは、第１のクラスＩサイトカイン単量体（例えば図４５のサイトカイン１）の第４のαヘリックス（αヘリックスＤ）と、第２のクラスＩサイトカイン単量体（例えば図４５のサイトカイン２）の第３のαヘリックス（αヘリックスＣ）を架橋し、
ｂ）リンカーペプチドは、第１のクラスＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックス（Ｎ末端αヘリックス、又はαヘリックスＡ）と、第２のクラスＩサイトカイン単量体の第２のαヘリックス（αヘリックスＢ）を架橋し、
ｃ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢ及びＣは架橋されていない。

【0146】

前記一本鎖二量体サイトカインでは、第２のクラスＩサイトカイン単量体の元のＮ末端及びＣ末端はフリーである。

【0147】

全体として、一本鎖二量体クラスＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ及びＢを含む第２のクラスＩサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｉｉ）前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢと、第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド（Ｘｎ１）、ｉｉｉ）αヘリックスＡ～Ｄを含む前記第１のクラスＩサイトカイン単量体の連続ドメイン、ｉｖ）第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＤと、第２のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣを架橋するリンカーペプチド（Ｘｎ２）、並びにｖｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ及びＤを含む前記第２のクラスＩサイトカイン単量体のＣ末端部分を含む。

【0148】

２つの単量体配列を架橋する人工リンカー（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）は、任意の好適な配列を有することができ、特に、立体構造的に拘束された構造、すなわち「構造化」リンカーを画定する配列を含む。そのようなリンカーは、約３～約２０個のアミノ酸残基、約３～約１６個のアミノ酸残基、約４～約１２個のアミノ酸残基、約４～約８個のアミノ酸残基、約３～約８個のアミノ酸残基又は約３～約６個のアミノ酸残基を有することができる。有利には、そのようなリンカーは、互いに隣接する複数のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有せず、例えば、リンカーペプチドは、５個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基、２個以下のＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有し、単離されたＧｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基のみを含有する、又はいくつかの実施形態では、Ｇｌｙ及び／若しくはＳｅｒ残基を含有しない。

【0149】

いくつかの実施形態によれば、配列番号Ｘ３３８の配列：

SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhhhhh
HA HB
QSKGGSGGSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPL
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhh
HA HB
EEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGSGG
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhs
HC HD
NFLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTG
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhs
HC HD
又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含む、又はそれからなり、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－２受容体との相互作用を保持する一本鎖循環置換二量体ＩＬ－２ポリペプチドが提供される。

【0150】

いくつかの実施形態では、一旦クラスＩＩフォールディカインが方法Ｃに従って作られると、第２のクラスＩサイトカイン単量体の天然のＮｔとＣｔが結合され、ループが第１の第２のクラスＩサイトカイン単量体で開いた循環置換バリアントが作り出される。

【0151】

いくつかの実施形態によれば、配列番号２９６の配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一な配列を含む、又はそれからなり、少なくとも同じ安定性及び／又は少なくとも同じレベルのＩＬ－２受容体との相互作用を保持する一本鎖循環置換二量体ＩＬ－２ポリペプチドが提供される。

【0152】

クラスＩＩサイトカインの場合、フォールディカインを作るこの方法Ｃによれば、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは、（ａ）第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含み、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列は一続きに連続しており、一方で、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの配列は、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＮ末端に配置された第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分が、天然のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に対応し、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分のＣ末端に配置された第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分が、天然のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に対応する。

【0153】

クラスＩＩサイトカインの場合、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の挿入された配列は、その天然の順序である。

【0154】

フォールディカインを作るこの方法Ｃによれば、一本鎖二量体クラスＩＩサイトカインポリペプチドは、
ｉ）一本鎖二量体クラスＩＩサイトカインポリペプチドのフリーなＮ末端及びＣ末端、並びに第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの第１及び第２の配列部分を、それらの天然の配列順序で含む分割ドメイン、並びに
ｉｉ）第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む連続ドメインを含み（図４７を参照）、
第１のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの第１及び第２の配列部分の配列は、分割ドメインにおいて、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体ドメインの連続ドメインの配列によって分離されている。

【0155】

クラスＩＩサイトカインの場合、方法Ｃに従ってフォールディカインを形成することは、１つの単量体（特に１つの単量体のαヘリックスＢとＣの間）でループを開き、新たに作り出されたＣ末端と他のサイトカイン単量体の天然のＣｔを結合させ、新たに作り出されたＮ末端と他のサイトカイン単量体の天然のＮ末端を結合させることを含みうる。

【0156】

一実施形態によれば、αヘリックスＢとＣの間のループは第１のサイトカイン単量体において開けられ、２つのクラスＩＩサイトカイン単量体を含む一本鎖二量体クラスＩＩポリペプチドが提供され、前記一本鎖二量体サイトカインポリペプチドにおいて：
ａ）リンカーペプチドは、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体（図４７のサイトカイン１）の第２のαヘリックス（αヘリックスＢ）と、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体（図４７のサイトカイン２）第１のαヘリックス（αヘリックスＡ）を架橋し、
ｂ）リンカーペプチドは、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の第３のαヘリックス（αヘリックスＣ）と、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の第１のαヘリックス（Ｎ末端αヘリックス、又はαヘリックスＡ）を架橋する。

【0157】

前記一本鎖二量体サイトカインでは、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体の天然のＮ末端及びＣ末端はフリーであり、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の挿入された配列は、その天然の配列順序に従う。

【0158】

全体として、一本鎖二量体クラスＩＩポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ及びＢを含む第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＮ末端部分、ｉｉ）前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＢと、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡを架橋するリンカーペプチド（Ｘｎ１）、ｉｉｉ）前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＡ～Ｆを含む前記第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の天然の配列、ｉｖ）第２のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＦと、第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣを架橋するリンカーペプチド（Ｘｎ２）、並びにｖｉｉ）前記第１のクラスＩサイトカイン単量体のαヘリックスＣ～Ｆを含む前記第１のクラスＩＩサイトカイン単量体のＮ末端部分を含む。

【0159】

同様に、２つの単量体配列を架橋する人工リンカー（Ｘｎ１）及び（Ｘｎ２）は、フォールディカインを作る方法Ａ及びＢで上記に開示のように、任意の好適な配列を有することができる。

【0160】

いくつかの実施形態では、クラスＩＩフォールディカインが方法Ｃに従って作られると、第２のクラスＩＩサイトカイン単量体の天然のＮｔとＣｔが結合され、第１の第２のクラスＩＩサイトカイン単量体でループが開いた循環置換バリアントが作り出される。

【0161】

さらに、Ｉ型とＩＩ型サイトカイン単量体ドメインの両方を含むフォールディカインは、クラスＩ又はクラスＩＩのサイトカインに基づくフォールディカインについて記載したのと同じ方法Ｃで設計することができる。

【0162】

スキームＣ－ａにおいて、２つのサイトカイン単量体は、ＩＩ型サイトカインの天然ループを開き、Ｉ型サイトカインの天然Ｎ末端及びＣ末端への２つの人工リンカーを介して、開いたループの新しいＮ末端及びＣ末端を閉じた後、２つのリンカーを介して連結される。さらに、Ｉ型サイトカインの天然のループを開くことができ、ＩＩ型サイトカインの天然のＮ末端及びＣ末端がリンカーを介して閉じられる（図６ｉｉ参照）、又はＩ型サイトカインの天然のループを開くことができ、新しいＮｔ及びＣｔがＩＩ型サイトカインの天然のＮ末端及びＣ末端に連結され、一方で、Ｉ型サイトカインの天然のＮ末端とＣ末端が結合され、ループがＩＩ型サイトカインで開けられて新しいＮｔとＣｔになる、その循環置換バージョン（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔ ｅｒｓｉｏｎ）を作ることができる。

【0163】

フォールディカイン２つの３Ｄドメイン間の角度を決めるために使用される構造鋳型
一対の単量体サイトカインからフォールディカインを設計する場合、スワップドドメインサイトカインに基づく鋳型／参照を使用することができる。有利には、そのような鋳型／参照はいずれも、所望の結果として得られるフォールディカインと類似の構造を有する。なぜなら、このようにして、４つの受容体を合成フォールディカインと結合させる際に重要でありうる２つの球状ドメイン間の任意の有益な角度を維持できるからである（図７及び８参照）。

【0164】

フォールディカインを含むポリペプチド
さらに提供されるのは、本発明による一本鎖二量体ポリペプチドを含むポリペプチドである。

【0165】

これらの態様では、一本鎖二量体ポリペプチドは、タンパク質タグ又は他のポリペプチドなど任意のペプチドに融合又は共有結合的に連結させることができる。

【0166】

組換えベクター、宿主細胞及び発現
制御配列／調節配列
「制御配列」又は「調節配列」という用語は、本明細書において交換可能に使用されて、特定の遺伝子の発現を増加又は減少させることができる任意のヌクレオチド配列を意味する。この調節は、転写速度や翻訳速度に影響を与えること、又は配列の安定性を変化させることのいずれかによって適用されうる。実施形態では、本開示のポリヌクレオチド配列は、以下に限定されないが、プロモーター、エンハンサー、選択マーカー、複製起点、リンカー配列、ポリＡ配列、ターミネーター配列、及び分解配列などの調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、本開示によるポリヌクレオチドは、１つ又は複数の好適な制御配列を含む。ある特定の実施形態では、制御配列は、本開示のすべてのポリヌクレオチドに対して同一である。代替的な実施形態では、異なる制御配列は、異なるポリヌクレオチドに対して、又は異なるポリヌクレオチド内で使用される。ある特定の実施形態では、制御配列は、標的原核生物又は真核生物細胞において天然に存在する制御配列である。他の実施形態では、制御配列は、標的細胞、例えば細菌において意図された機能を果たすように適合される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、精製又は局在化を改良するタグ配列をコードすることがある。他のオリゴヌクレオチド又はタンパク質に結合するオリゴヌクレオチドモチーフ及び配列と、アミノ酸モチーフ又は配列の両方が想定される。

【0167】

プロモーター
本開示のポリヌクレオチドは、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列、又はプロモーターを好適に含むことができる。本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、核酸配列の残りの部分の転写の開始及び速度が制御される核酸配列の制御領域を意味する。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼや他の転写因子など調節タンパク質及び分子が結合できるサブ領域（ｓｕｂ－ｒｅｇｉｏｎ）を含有することができる。プロモーター中の少なくとも１つのモジュール（ｍｏｄｕｌｅ）は、ＲＮＡ合成の開始部位を配置するように機能する。この最もよく知られた例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳類の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターやＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、ＴＡＴＡボックスを欠く一部のプロモーターでは、開始部位自体に重なる別のエレメントが開始点の決めるのを補助する。

【0168】

さらなるプロモーターエレメントは転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流に位置するが、多くのプロモーターは開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、結果として、エレメントが互いに反転又は移動してもプロモーター機能は維持される。プロモーターに応じて、個々のエレメントは協調的に又は独立して機能して、転写を活性化できるようである。

【0169】

プロモーターは、構成的、誘導的、活性化可能、抑制可能、組織特異的、又はそれらの任意の組み合わせであることができる。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を促進する、又は転写を促進する。本明細書において、プロモーターは、それが調節する核酸配列に関して正しい機能的位置及び配向にあり、その配列の転写開始及び／又は発現を制御する（「促進する」）ように調節する場合に、「作動可能に連結された」とみなされる。「作動可能に連結された」という用語は、本明細書において、「作動可能に配置されている」、「制御下にある」及び「転写制御下にある」という用語と交換可能に使用される。

【0170】

プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ（及び／又はσ因子）に対するその親和性に王維持て、強い又は弱いとして分類でき、これは、プロモーター配列がポリメラーゼに対する理想的なコンセンサス配列にどの程度密接に類似しているかに関連する。プロモーターの強度は、転写の開始が、そのプロモーターで高頻度に起こるか低頻度で起こるかに依存する。様々な強度をもつ様々なプロモーターを所望の通りに使用することができる。

【0171】

好適なプロモーター配列は、天然であっても、又は合成であってもよい。例えば、それらは、所与の遺伝子又は配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られる遺伝子又は配列と天然に結合している場合がある。そのようなプロモーターは「内在性」と呼ばれうる。同様に、アクチベーター／エンハンサーは、核酸配列の内部、下流又は上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に結合しているものであることができる。

【0172】

いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、組換え又は異種プロモーターの制御下に位置することができ、組換え又は異種プロモーターは、その天然環境においてコードされた核酸配列と通常は結合していないプロモーターを意味する。組換え又は異種エンハンサーは、その天然環境において核酸配列と通常結合していないエンハンサーを指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、任意の好適な真核生物又は原核生物細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、並びに例えば、異なる転写調節領域の異なるエレメント及び／若しくは遺伝子工学の方法を通して発現を変化させる変異を含有するものなど、「天然に存在しない」合成プロモーター又はエンハンサーを挙げることができる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することにくわえて、配列は、組換えクローニング及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む核酸増幅技術を使用して作製することができる。

【0173】

ある特定の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターであることができる。構成的プロモーターは、その発現が標準的な培養条件下で一定であるプロモーター、すなわち、実質的に一定の発現レベルで遺伝子産物を発現するプロモーターであると、当業者に理解される。

【0174】

代替的な実施形態では、プロモーターは、誘導性（条件付き）プロモーターであることができる。本明細書で使用される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導物質又は誘導剤の存在下、影響を受けたとき、又は接触したときに、転写活性を開始又は増強することを特徴とするものである。「誘導物質」又は「誘導剤（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」は、誘導性プロモーターから転写活性を誘導する際に活性であるような方法でプロモーター又は転写機構に接触する内因性又は通常は外因性の条件、化合物又はタンパク質でありうる。誘導性プロモーター、より具体的には細菌誘導性プロモーターの系は、当該技術分野において非常に詳細に記載されている（例えば、Ｂｒａｕｔａｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００９）。

【0175】

本開示に従って使用するための誘導性プロモーターは、細菌細胞などの微生物細胞において機能する。本明細書で使用するための誘導性プロモーターの例としては、バクテリオファージプロモーター（例えば、Ｐｌｓｌｃｏｎ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、ＰＬ）及び細菌プロモーター（例えば、Ｐｂａｄ、ＰｍｇｒＢ、Ｐｔｒｃ２、Ｐｌａｃ／ａｒａ、Ｐｔａｃ、Ｐｍ）、又はそれらのハイブリッド（例えば、ＰＬｌａｃＯ、ＰＬｔｅｔＯ）が挙げられるが、それらに限定されない。本開示に従って使用するための細菌プロモーターの例としては、正の調節型（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）σ７０プロモーター（例えば、誘導性ｐＢａｄ／ａｒａＣプロモーター、Ｌｕｘカセット右プロモーター、改変ラムダＰｒｍプロモーター、ｐｌａｃ Ｏｒ２－６２（正）、追加ＲＥＮ部位をもつｐＢａｄ／ＡｒａＣ、ｐＢａｄ、Ｐ（Ｌａｓ）ＴｅｔＯ、Ｐ（Ｌａｓ）ＣＩＯ、Ｐ（Ｒｈｌ）、Ｐｕ、ＦｅｃＡ、ｐＲＥ、ｃａｄＣ、ｈｎｓ、ｐＬａｓ、ｐＬｕｘ）や、ａｓプロモーター（例えばＰｄｐｓ）、σ３２プロモーター（例えば、ヒートショック）、σ５４プロモーター（例えば、ｇｌｎＡｐ２）など、正の調節型Ｅ．コリプロモーター；負の調節型（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）σ７０プロモーター（例えば、プロモーター（ＰＲＭ＋）や、改変ラムダＰｒｍプロモーター、ＴｅｔＲ－ＴｅｔＲ－４Ｃ Ｐ（Ｌａｓ）ＴｅｔＯ、Ｐ（Ｌａｓ）ＣＩＯ、Ｐ（Ｌａｃ）ＩＱ、ＲｅｃＡ＿ＤｌｅｘＯ＿ＤＬａｃ０１、ｄａｐＡｐ、ＦｅｃＡ、Ｐｓｐａｃ－ｈｙ、ｐｅｌ、ｐｌｕｘ－ｃｌ、ｐｌｕｘ－ｌａｃ、ＣｉｎＲ、ＣｉｎＬ、グルコース制御、改変Ｐｒ、改変Ｐｒｍ＋、ＦｅｃＡ、Ｐｃｙａ、ｒｅｃＡ（ＳＯＳ）、ＲｅｃＡ（ＳＯＳ）、ＥｍｒＲ＿調節、Ｂｅｔｌ＿調節、ｐＬａｃ＿ｌｕｘ、ｐＴｅｔ＿Ｌａｃ、ｐＬａｃ／Ｍｎｔ、ｐＴｅｔ／Ｍｎｔ、ＬｓｒＡ／ｃＩ、ｐＬｕｘ／ｃＩ、Ｌａｃｌ、ＬａｃＩＱ、ｐＬａｃＩＱｌ、ｐＬａｓ／ｃＩ、ｐＬａｓ／Ｌｕｘ、ｐＬｕｘ／Ｌａｓ、ＬｅｘＡ結合部位をもつｐＲｅｃＡ、リバースＢＢａ＿Ｒ００１１、ｐＬａｃＩ／ａｒａ－１、ｐＬａｃＩｑ、ｒｒｎＢ ＰＩ、ｃａｄＣ、ｈｎｓ、ＰｆｈｕＡ、ｐＢａｄ／ａｒａＣ、ｎｈａＡ、ＯｍｐＦ、ＲｃｎＲ）、σＳプロモーター（例えば、代替シグマ因子σ３８をもつＬｕｔｚ－Ｂｕｊａｒｄ ＬａｃＯ）、σ３２プロモーター（例えば、代替シグマ因子σ３２をもつＬｕｔｚ－Ｂｕｊａｒｄ ＬａｃＯ）、σ５４プロモーター（例えば、ｇｌｎＡｐ２）など、負の調節型Ｅ．コリプロモーター；抑制可能なＢ．サブティリスσΑプロモーター（例えば、グラム陽性ＩＰＴＧ－誘導性、Ｘｙｌ、ハイパースパンク（ｈｙｐｅｒ－ｓｐａｎｋ））やσプロモーターなど、負の調節型Ｂ．サブティリスプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。他の誘導性微生物プロモーター及び／又は細菌プロモーターを本開示に従って使用することができる。

【0176】

本開示に従って使用するための誘導性プロモーターは、ｐＨ、温度、放射線、浸透圧、生理食塩水勾配、細胞表面結合、及び１つ又は複数の外因性又は内因性誘導剤（複数可）の濃度の変化など、１つ又は複数の生理的条件（複数可）によって誘導（又は抑制）することができる。外因性誘導物質又は誘導剤は、アミノ酸及びアミノ酸類似体、糖類及び多糖類、核酸、タンパク質転写活性化因子及び抑制因子、サイトカイン、毒素、石油系化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質類似体、ホルモン、又はそれらの組み合わせを含むことができるが、それらに限定されない。

【0177】

本開示に従って使用するための誘導性プロモーターとしては、本明細書に記載の又は当業者に公知の任意の誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、アルコール調節プロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答プロモーター及びテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）や、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む他のテトラサイクリン応答プロモーター系）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジゾン受容体に基づくプロモーター、及びステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーに由来するプロモーター、金属調節プロモーター（例えば、酵母、マウス及びヒトのメタロチオネイン（金属イオンと結合し、それを隔離するタンパク質）遺伝子に由来するプロモーター）、病原体調節プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン又はベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）による誘導）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、並びに光調節プロモーター（例えば、植物細胞由来の光応答プロモーター）など、化学的／生化学的に調節されるプロモーター及び物理的に調節されるプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。ある特定の実施形態では、プロモーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－ｏｆｆ系の一部であるＴｅｔＲプロモーターである（Ｋｒｕｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ： ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｔｅｔ ｔｒａｎｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２００４及びＬｏｅｗ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｅｔ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＢｉｏＭｅｄＣｅｎｔｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１０）。

【0178】

マイコプラズマ属細菌での発現に適したプロモーター配列としては、限定されないが、Ｐ３プロモーター（４８）及び合成プロモーターｐＳｙｎＬが含まれる。ＳｙｎＭｙｃｏプロモーター（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｄｎａｒｅｓ／ｄｓｚ０１２）、又はＴｎ４００１トランスポゾン（１０．１００７／ＢＦ００３８２０９９）に由来する中間バージョンに使用されている他のプロモーターなど、他のプロモーターもマイコプラズマ属に関する分野で使用されて成功している。

【0179】

本開示に従って使用するための他のプロモーターとしては、細菌、ウイルス又は真核生物源に由来する任意の好適なプロモーターを挙げることができる（特に、ラクトコッカス・ラクチス又はＥ．コリでの発現に関して）。

【0180】

標的細胞が哺乳類細胞である様々な他の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及びラウス肉腫ウイルス長末端反復が、導入遺伝子の高レベル発現を得るために使用されうる。発現レベルが所与の目的に充分であることを条件として、当該技術分野で周知の他のウイルス又は哺乳類細胞又は細菌ファージプロモーターの使用も、導入遺伝子の発現を達成するために企図される。

【0181】

エンハンサー
本開示のいくつかの実施形態では、プロモーターは、転写活性化にも関与する「エンハンサー」とともに使用されることもあり、ともに使用されないこともある。エンハンサーは、タンパク質（すなわち、トランス作用因子）と結合して、遺伝子の転写レベルを高めることができるＤＮＡの１つ又は複数の領域である。エンハンサーは、プロモーターの上流又は下流の機能領域に位置しうる。典型的にはコード領域の５’末端にあるが、プロモーター配列から離れていてもよく、例えば、遺伝子のイントロン領域内又は遺伝子のコード領域の３’内にある場合もある。

【0182】

ターミネーター
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ターミネーター配列又はターミネーターを含有することができる。本明細書で使用される「ターミネーター」は、転写を停止させる核酸配列である。ターミネーターは、一方向又は双方向でありうる。ターミネーターは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列から構成される。ターミネーター配列は、上流プロモーターによる下流核酸配列の転写活性化を妨げる。したがって、ある特定の実施形態では、ＲＮＡ転写物の産生を終わらせるターミネーターが企図される。ターミネーターは、望ましい遺伝子／タンパク質発現レベルを達成するために生体内で必要な場合がある。

【0183】

最も一般的に使用されるタイプのターミネーターはフォワードターミネーターである。通常転写される核酸配列の下流に置かれたとき、フォワード転写ターミネーターは転写を中止させることになる。いくつかの実施形態では、双方向転写ターミネーターが提供され、通常、フォワード鎖とリバース鎖の両方で転写を終結させる。いくつかの実施形態では、リバース転写ターミネーターが包含され、通常、リバース鎖上の転写のみを終結させる。原核生物の系では、ターミネーターは通常、（ｉ）ｒｈｏ非依存性ターミネーターと（ｉｉ）ｒｈｏ依存性ターミネーターの２つのカテゴリーに分類される。Ｒｈｏ非依存性ターミネーターは一般に、Ｇ－Ｃ塩基対に富んだステムループ、それに続く一連のウラシル塩基を形成する回文配列から構成される。

【0184】

本開示に従って使用するためのターミネーターとしては、本明細書に記載の、又は当業者に公知の任意の転写ターミネーターが挙げられる。ターミネーターの例としては、例えばウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、及び例えば、ＴＯターミネーターなどのウイルス終結配列、ＴＥターミネーター、Ｌａｍｂｄａ Ｔｌ及び細菌系に見られるＴ１Ｔ２ターミネーターが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、終結シグナルは、配列切断から生じる配列など、転写又は翻訳できない配列でありうる。

【0185】

他の遺伝要素は、当該技術分野で公知であり、本開示に従って使用することができる。

【0186】

発現ベクター
本開示の任意の好適なポリヌクレオチドは、プラスミド、任意選択で、非複製プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、バクテリオファージ由来ベクター、人工染色体、ミニサークル、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス若しくはアデノ関連ウイルスベクター、ピギーバックベクター、又はｔｏｌ２ベクターなどの発現ベクターの一部でありうる。当業者は、これらの様々な種類のコンストラクトを認識しており、それらの生成及び操作は、多数の例において詳述されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ＩＳＢＮ ０８７９６９３０９６， １９８９及び対応最新第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０１２）。さらに、プラスミドＤＮＡ、又は（環状）組換えＤＮＡは、当業者には、コピーＤＮＡ、補体ＤＮＡ、又は略語「ｃＤＮＡ」と一般的に呼ばれ、それぞれ交換可能に使用できることが明らかである。

【0187】

「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は、核酸コード配列の一部又は全部が転写可能である、遺伝子産物をコードする核酸を含有する遺伝子コンストラクトを意味する。転写物は、タンパク質に翻訳されてもよいが、そうである必要はない。したがって、ある特定の実施形態では、発現には、遺伝子の転写とＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方が含まれる。

【0188】

特に有用なベクターは、全長タンパク質又はより小さなポリペプチドをコードしているかどうかにかかわらず、ＤＮＡセグメントのコード部分が、上記のようにプロモーターの転写制御下に配置されているベクターであることが企図される。

【0189】

当然のことながら、発現のために選択された細胞型又は生物において、本開示のポリペプチドの発現を効果的に誘導するプロモーターを使用することが重要であることになる。タンパク質発現のためのプロモーターと細胞型の組み合わせの使用は、一般に分子生物学の当業者に公知であり、例えば、参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９）を参照されたい。本開示のベクター又はプラスミドにおいて、コードされたポリペプチドの所望のレベルの発現を導く任意の好適なプロモーターを使用することができる。

【0190】

核酸の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、標的細胞又は生物において所望のポリペプチドを所望のレベルで発現できる限り、重要であるとは考えられていない。したがって、マイコプラズマが使用される場合、ポリヌクレオチドコード領域を、マイコプラズマで発現可能なプロモーターに隣接し、その制御下に置くことが好ましい可能性がある。同様に、ポリペプチドをＥ．コリ又はＬ．ラクチスで発現させたい場合には、Ｅ．コリ又はＬ．ラクチスでの発現に適した適切なプロモーターが使用されるべきである。

【0191】

組換え細菌又は他の細胞を作製する場合、１つ又は複数の「レポーター遺伝子」を含めることが有用でありうる。一般に、レポーター遺伝子は、宿主細胞によって他の方法では生成されないポリペプチド、又は宿主細胞によって生成されるが、はるかに低いレベルで生成されるタンパク質若しくは因子、又は宿主細胞によって他の方法では生成されないポリペプチドの変異形態をコードする。レポーター遺伝子は、ｉｎ ｓｉｔｕ分析で検出可能であり、転写活性化の定量的又は半定量的な関数である、宿主細胞における熱量測定的又は蛍光定量的な変化を生じる酵素をコードすることができる。例示的なレポーター遺伝子は、当業者に公知であろうように、発色団又はフルオロフォアを生成する活性によって検出されるエステラーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ及び他のタンパク質をコードする。そのようなレポーター遺伝子の周知の例は、Ｅ．コリβ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコール－アセチル転移酵素（ＣＡＴ）である。あるいは、レポーター遺伝子は、例えば、宿主細胞を選択剤に対する耐性を付与することによって、選択マーカーをコードしてもよい。例えば、遺伝子ｎｅｏは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を細胞に付与する。レポーター遺伝子カセットと適合する実質的にいずれの宿主細胞系も、調節ユニット（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｕｎｉｔ）を決定するために使用できることが企図される。したがって、哺乳動物細胞、又は他の真核細胞、昆虫、細菌、若しくは植物細胞を使用することができる。

【0192】

コード配列の効率的な翻訳には、特異的な開始シグナルも必要とされうる。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コード及び隣接配列が挙げられる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが与えられる必要があるかもしれない。当業者であれば、このことを容易に判断し、必要なシグナルを提供することができるだろう。挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンが所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは周知である。さらに、ある種特定の細菌は代替（非ＡＴＧ）開始部位を利用できることが周知であり、したがって、そのような代替部位を含む開始シグナルも企図される。外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然又は合成のいずれでもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって高めることができる。

【0193】

本明細書で使用される場合、「人工」及び「組換え」細胞という用語は、本開示のポリペプチド（フォールディカイン）をコードするポリヌクレオチドなど外来ＤＮＡセグメント又は遺伝子が導入された細胞を意味することを意図する。したがって、人工細胞は、組換え的に導入された外来ＤＮＡセグメント又は遺伝子を含有しない天然に存在する細胞と区別可能である。組換え細胞は、導入されたｃＤＮＡ又はゲノム遺伝子を有するものを含み、特定の導入された遺伝子と天然には結合しないプロモーターに隣接して位置する遺伝子も含む。

【0194】

本発明のフォールディカインポリペプチドを発現するために、１つ又は複数のプロモーターの制御下にあるフォールディカインをコードするポリ核酸を含む発現ベクターを調製することができる。コード配列をプロモーターの制御下にもってくるために、転写読み取り枠の転写開始部位の５’末端は一般に、選択されたプロモーターの約１～約５０ヌクレオチド下流（すなわち３’）に位置する。上流のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたポリペプチドの発現を促進する。１つ又は複数のエンハンサーエレメントを、発現コンストラクトと結合させることもできる。

【0195】

様々な宿主発現系においてタンパク質又はポリペプチドの発現を達成するために、適切な核酸及び転写／翻訳制御配列を含有する発現ベクターを構築するために、多くの標準的な技術が利用可能である。発現に利用可能な細胞型としては、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたＭ．ニューモニエ、Ｅ．コリや、Ｌ．ラクチス、Ｓ．アウレウス、Ｂ．サブティリスなどの細菌が挙げられるが、それらに限定されない。

【0196】

一般に、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主と関連させて使用される。ベクターは通常、複製部位、及び形質転換細胞の表現型選択を可能にする標識（ｍａｒｋｉｎｇ）配列を保有する。例えば、Ｅ．コリはＥ．コリ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を使用して形質転換されることが多い。ＰＢＲ３２２は、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、したがって、形質転換細胞を同定する容易な手段を提供する。ｐＢＲプラスミド又は他の微生物プラスミド若しくはファージはまた、微生物がそれ自体のタンパク質の発現のために使用できるプロモーターを含有しなければならない、又はそれを含有するように改変されなければならない。

【0197】

マイコプラズマは複製ベクターの維持が困難な傾向がある。しかし、（異なる耐性マーカーをもつ）Ｔｎ４００１ベクター由来のトランスポゾンを使用することができる。トランスポゾンはトランスポザーゼを含有し、一対の逆方向反復の外側に配置される。染色体に挿入される可能性のある外来ＤＮＡ配列は、逆方向反復内に配置される。ベクターが細胞に挿入されると、トランスポザーゼは逆方向反復の切除を触媒し、内部配列をランダムに染色体に導入する。したがって、異なる長さの外来ＤＮＡ断片をＭ．ニューモニエ染色体に導入することができる。

【0198】

さらに、宿主微生物に適合するレプリコン配列や制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、ファージｌａｍｂｄａ ＧＥＭ（商標）－１１は、Ｍ．ニューモニエやＥ．コリなどの宿主細胞を形質転換するのに使用できる組換えファージベクターを作製するのに利用することができる。

【0199】

さらなる有用なベクターとしては、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ， １９８５）、ｐＱＥ（Ｈｉｓタグ付き）ベクター（キアゲン）及び後の精製、分離又は切断のためのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質の生成に使用されるｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の好適な融合タンパク質は、β－ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどとのものである。

【0200】

本開示のポリペプチドは、サイトカインが通常発現されない細菌などの異種系で発現できること、又は、場合によっては、ヒト細胞などの真核生物細胞で発現できることが企図される。

【0201】

ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、バイシストロニック発現コンストラクトを含むことができる。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞ゲノム、好適には、Ｍ．ニューモニエ、Ｌ．ラクチス又はＥ．コリなどのバクテリアのゲノム配列に組み込まれる、すなわち挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞ゲノム、例えば、新たに設計された細胞ゲノム又は変異誘発若しくは合成された細菌ゲノムの一部であることができる。さらなる実施形態では、ヌクレオチド配置は、細菌人工染色体又は酵母人工染色体に含まれる。

【0202】

ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ｍｐｎ０５１遺伝子がマイコプラズマ・ペネトランス由来のｇｐｓＡ遺伝子で置換されたＣＶ２をベースとする弱毒化ＣＶ２株（Δｍｐｎ１３３、Δｍｐｎ３７２）（５８）又はＣＶ８などの遺伝子組み換えマイコプラズマ属株に組み込むことができる。これらのポリヌクレオチドは、他の対象となるマイコプラズマ属で評価することもできる。

【0203】

ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはバクテリオファージに含まれうる。本明細書に記載の「バクテリオファージ」という用語は、細菌及び古細菌に感染し、任意選択でその内で複製できるウイルスを示し、当該技術分野に記載（例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ２０１９）のように治療目的のために改変することができる。

【0204】

さらなる実施形態では、様々な配列要素（例えば、本開示のポリヌクレオチド）の連なり（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）は、「オペロン」とみなすことができる。本明細書で使用される「オペロン」は、すべての遺伝子が単一のプロモーターによって制御される遺伝子のクラスターを含有するＤＮＡの機能的単位を意味する。したがって、一般に、オペロンからの遺伝子は共転写（ｃｏ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）される。オペロンから転写された遺伝子は、単一のｍＲＮＡ鎖に転写されて、細胞質で一緒に翻訳されうる又はスプライシングを受けて別々に翻訳されうるモノシストロニックｍＲＮＡを生成することができる。

【0205】

本開示のベクター及びプラスミドは、典型的には、原核生物又は真核生物のいずれかにおいて複製が開始される配列を意味する「複製起点」又は「ＯＲＩ」も含む。ＤＮＡ複製は、この地点から双方向又は一方向に進行しうる。一般的に使用される原核生物の複製起点としては、ｐＭＢｌ、改変ｐＭＢｌ、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥｌ、ＣｏｌＥｌ誘導体、ＦＩ、Ｒ６Ｋ、ｐｌ５Ａ、ｐＳＣｌＯｌ、及びｐＵＣが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0206】

ポリヌクレオチドを挿入し、クローニングする、すなわち増殖させることができるようにするために、ベクターは、典型的には、１つ又は複数の固有の制限部位を含み、クローニングされた配列が再現可能（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ）であるように、決まった細胞又はビヒクル生物で自律複製することができる。上述のように、そのようなベクターは、上述のように、ベクターを含むレシピエント細胞の選択を可能にするために、例えば抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含むこともできる。

【0207】

発現されたポリペプチド
実施形態では、本開示のポリペプチド－本開示のポリヌクレオチドによってコードされる－「ディスプレイシグナル（ｄｉｓｐｌａｙ ｓｉｇｎａｌ）」若しくは「露出シグナル（ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｓｉｇｎａｌ）」及び／又は「分泌シグナル」を含むことができる。したがって、本開示のポリヌクレオチドは、１つ又は複数のそのような配列をコードする核酸配列を含むことができる。

【0208】

「ディスプレイシグナル」又は「露出シグナル」という用語は、融合／連結ペプチド（例えば、本開示のフォールディカイン）を細胞膜上に露出するよう方向づけるペプチド配列を意味する。細胞は、所望により、細菌細胞でも真核生物細胞でもよい。「露出された」又は「ディスプレイされた」とは、目的のポリペプチドが、それが産生された細胞、好ましくは細胞の外側の細胞表面に、ずっと物理的に付着していることを意味する。露出シグナル配列は当業者に公知である。実施形態では、露出シグナル配列は、Ｅ．コリ、Ｌ．ラクチス又はマイコプラズマ属（例えばＭ．ニューモニエ）などの細菌において天然に存在する配列である。いくつかの実施形態では、露出シグナル配列は、天然に存在しない細菌配列である。

【0209】

本明細書で使用される「分泌シグナル」という用語は、ポリペプチドが発現された細胞からの分泌を誘発又は媒介するペプチド配列を意味する。すなわち、ポリペプチドが露出又はディスプレイされる場合とは対照的に、分泌シグナルを含有する分泌ポリペプチドは、それが産生された細胞にもはや物理的に付着しておらず、細胞外空間に分泌されうる。

【0210】

実施形態では、分泌シグナル配列は、Ｅ．コリ、Ｌ．ラクチス又はマイコプラズマ属などの細菌において天然に存在する配列でありうる。代替的な実施形態では、分泌シグナル配列は、天然に存在しない細菌配列である。マイコプラズマ属の分泌シグナルは、例えば、国際特許出願国際公開第２０１６／１３５２８１号パンフレットに記載されている。実施形態では、連結された（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ）分泌シグナルが使用されて、ポリペプチドの分泌を増強することができる、例えば、異なる分泌シグナルを、本開示によるポリペプチドの異なる位置に組み込みことができる。

【0211】

さまざまな実施形態では、タンパク質が細胞表面上に露出された（すなわち、ディスプレイされた）後に、又はタンパク質が分泌された後に、シグナル配列は、連結しているタンパク質から、タンパク質分解切断によって除去されうる。ある特定の実施形態では、露出又は分泌シグナル配列は、ポリペプチドのＮ末端に位置する。

【0212】

疾患及び障害
本発明の薬剤、組成物、方法及び使用は、例えば、炎症反応又は細胞増殖の速度の減少又は増加から利益を得ことになるいずれかの疾患又は障害を含む、広範な疾患及び障害の治療に特に好適でありうる。具体的には、本発明に従って治療され得る疾患及び障害としては、がん及び／又は増殖性若しくは腫瘍性疾患（特に固形腫瘍）及び炎症性疾患又は障害が挙げられる。また、本発明は、感染症の治療又は組織損傷事象若しくは疾患後の組織再生の促進にも好適でありうる。

【0213】

当業者であれば、増殖性疾患は以下に関連しうることを理解するであろう：（１）通常静止している細胞若しくは通常増殖している細胞の病的な増殖、（２）通常の場所からの細胞の病的な移動（例えば、腫瘍細胞の転移）、（３）細胞マトリックスの望ましくないターンオーバーをもたらしうる、マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びエラスターゼ）などのタンパク質分解酵素の病的な発現、並びに／又は（４）増殖性網膜症及び腫瘍転移で起こるような病的血管新生。例示的な増殖性疾患としては、がん、良性新生物、及び疾患状態を伴い進行させる血管新生（病的血管新生として上記で定義）が挙げられる。

【0214】

本発明の組成物、薬剤、方法及び使用は、例えば、細胞増殖を防ぎ、特に病原性細胞の細胞死を促進することによって、広範な増殖性疾患及び障害の治療並びに／又はそれらの症状の軽減において有益な効果を有しうる。

【0215】

本発明は、複数のがんの種類で有用性を有し、且つ／又は生体内及び／若しくはインビトロにおいて腫瘍の進行に対して有益な効果（例えば、腫瘍の進行を逆転させるなど）を有しうる。具体的には、本発明は、肺がん（特に肺腺がん）、子宮頸がん、乳がん、心臓がん、結腸がん、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）がん、脳膠芽腫、膵臓がん、白血病（例えば急性単球性白血病）、リンパ腫、腎臓がん、大腸がん、膀胱がん、精巣がん、消化器がん、肝がん（例えば肝細胞がん）、及び／又は膠芽腫の治療に有用でありうる。本発明はまた、皮膚がん（例えばメラノーマ）、頭部及び／又は頸部がん、胆嚢がん、子宮がん、胃がん、甲状腺がん、咽頭（ｌａｒｙｎｇｅａｌ）がん、口唇及び／又は口腔がん、咽頭（ｔｈｒｏａｔ）がん、眼部のがん並びに骨がんのうちの１つ又は複数の治療にも有用でありうる。

【0216】

いくつかの特定の実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、副腎皮質がん、エイズ関連リンパ腫、ＣＮＳ原発リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、肝外がん、ユーイング肉腫ファミリー、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発リンパ腫、脊索腫、慢性骨髄増殖性新生物、結腸がん、肝外胆管がん、非浸潤性乳管がん（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、嗅神経芽細胞腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵管がん、骨線維性組織球腫、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、精巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、小児脳幹神経膠腫、有毛細胞白血病、肝細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、ウィルムス腫瘍及び他の小児腎腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、小細胞肺がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、眼内黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、正中線がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、鼻腔がん及び副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、上皮性卵巣がん、胚細胞卵巣がん、低悪性度卵巣がん、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔がん及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ）がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、カポジ肉腫、横紋筋肉腫、セザリー症候群、小腸がん、軟部肉腫、咽喉（ｔｈｒｏａｔ）がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮内膜子宮体がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、並びにワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群のいずれの１つ又は複数から選択されうる。

【0217】

さらに、本開示はまた、本発明の治療薬及び組成物の治療的使用、並びに任意のタイプの原発がんの局所浸潤若しくは転移、又はそれら両方を抑制又は予防する方法を包含する。例えば、原発がんは、メラノーマ、非小細胞肺、小細胞肺、肺、肝細胞がん、網膜芽細胞腫、星細胞腫、膠芽腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、頸部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、子宮頸、消化管、リンパ腫、脳、結腸、又は膀胱でありうる。ある特定の実施形態では、原発がんは肝がんでありうる。例えば、肝がんは、肝細胞癌（ＨＣＣ）及び／又は肝臓への転移でありうる。

【0218】

さらに、本開示は、がんを予防するため、又は化生、異形成及び過形成を含む前がん細胞又は前悪性細胞を治療するために使用することができる。また、扁平上皮化生、異形成、良性前立腺過形成細胞、過形成病変などの望ましくないが良性の細胞を抑制するために使用することもできる。いくつかの実施形態では、がんへの進行又はがんのより重症な形態への進行は、本明細書に開示の治療薬を含む本開示の使用及び方法によって、停止、中断、又は遅延させることができる。

【0219】

したがって、本発明は、医療に使用するための、特に、肺がん（特に、肺腺がん又は肺扁平上皮がん）、膀胱がん、子宮頸がん、乳がん、結腸がん、脳膠芽腫、膵臓がん、急性単球性白血病、腎臓がん、大腸がん、皮膚がん（例えばメラノーマ）、胃がん、甲状腺がん、骨がん及び肝がんから選択されるがんの治療に使用するための薬剤及び組成物を提供する。そのような疾患の治療のための方法も提供される。使用及び方法は、本発明による薬剤を、それを必要とする患者に投与することを含むことができる。

【0220】

本開示の組成物及び薬剤はまた、がん免疫療法及び／又は免疫腫瘍学的治療に有用でありうる。

【0221】

炎症
並行して、炎症反応は、物理的、化学的又は生物学的な様々な損傷に対する適応反応である。古典的炎症、恒常性炎症、低グレード炎症、パラ炎症として知られるストレスに対する適応反応、又は代謝誘発性炎症という様々な種類の炎症が存在する。本開示によるの「フォールディカイン」は、例えば、免疫系が誤って自身の体の細胞又は組織を攻撃するシナリオにおいて、炎症性疾患を治療するために使用することができる。そのような免疫学的疾患又は障害の関連する状態には、疼痛、発赤、腫脹、硬直、又は他の／隣接する健康な組織への損傷が多数含まれる。本発明は、医療における使用のための、特に、アレルギー、ぜんそく、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再灌流傷害、移植拒絶反応、糖尿病、アルツハイマー病、変形性関節症、線維筋痛症、筋性腰痛、関節炎、筋性頸部痛、心筋炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、線維症の治療における使用のための薬剤及び組成物を提供する。

【0222】

ウイルス、細菌及び真菌感染症
本開示の「フォールディカイン」は、ウイルス、細菌又は真菌感染症の治療に有用でありうる。そのような微生物はいずれも、炎症反応及び免疫系を変化させる生理作用物質の放出を誘発しうる。他の場合では、そのような感染体は、毒素を産生し、放出しうる。免疫系の反応を打ち消す（ｃｏｕｎｔｅｒｂａｌａｎｃｅ）ために、フォールディカインは、風疹、バラ疹、天然痘、チクングヤウイルス感染症、麻疹、ノロウイルス感染症、コロナウイルス感染症、帯状疱疹、肝炎、ヘルペス、デング熱、エボラ、ラッサ熱、マールブルグ出血熱、ポリオ、髄膜炎、脳炎又は狂犬病の状況においても適用される可能性がある。

【0223】

サイトカインはまた、免疫によって媒介される細胞修復及び再生反応の組織化調整において重要な役割を果たすので、本発明はまた、そのような感染症及び感染因子に関連する損傷後の組織修復を促進する際にさらなる利点をもたらしうる。

【0224】

組織再生
免疫系は、組織の修復及び再生において中心的な役割を果たす。組織損傷に対する免疫反応は、治癒過程及び器官の機能の回復の速度及び結果を決める上で極めて重要である。したがって、サイトカインを介した免疫成分を制御することは、再生医療において魅力的なアプローチである。したがって、本開示のフォールディカインは、例えば、正しい細胞の増殖及び分化を促進し、線維症を予防することによって、組織再生のための方法及び治療的使用においても有用でありうる。そのような使用の例は、大腸炎や、創傷治癒、発毛、肝臓再生、マトリックス合成などの状態の治療におけるものである。

【0225】

本発明の組成物、薬剤、方法及び使用は、そのような疾患及び障害のいずれか又はすべての治療において利益をもたらしうる。

【0226】

治療用組成物
本発明の一本鎖二量体サイトカイン、ポリヌクレオチド又は人工バクテリオファージ、組換え細菌若しくは細胞（例えば「治療薬」）は、動物、好ましくはヒトの治療に使用するための医薬組成物に組み込むことができる。本発明の治療薬（又はその誘導体）は、本発明の一本鎖二量体サイトカインの活性／性質に応じて、１つ又は複数の疾患又は感染症を治療するために使用することができる。さまざまな実施形態では、治療用ペプチドをコードする核酸は、発現コンストラクト／ベクター、特にバクテリオファージベクター、ウイルス又は細菌ゲノムに挿入され、同じ目的のために医薬製剤／医薬品に組み込むことができる。同様に、本開示のフォールディカインは、エアロゾル、気管内投与、注射、坐剤などの従来の送達方法を介して送達されうる、又は組換え手段を介して投与することができる。

【0227】

当業者なら理解するであろうように、本開示によるものなど、可能性のある治療薬は、ヒト対象での使用が承認されるうる前に、ウサギ又はマウスなどの動物モデルで試験することができる。したがって、本開示のポリペプチド、バクテリオファージ、バクテリア又は細胞は、ヒト／ヒト細胞においてと同様に、ウサギ若しくはマウスにおいて生体内で、又はウサギ若しくはマウス細胞において生体外で発現又は送達することができる。本発明において、適切な発現カセット及び発現コンストラクト／ベクターは、各動物系に対して特異的に設計することができる。

【0228】

本発明の治療用ペプチド及び核酸は、例えば、従来の方法によって投与される動物（細胞／組織）の所望の領域に細菌又はバクテリオファージを向けることによって、細胞内で標的となる（且つ治療する）ことができる疾患、病態及び／又は感染症の治療に特に好適でありうる。インビトロ及び細胞外用途にも適しうる。本明細書で使用される場合、「治療薬」及び「活性薬剤」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載のペプチド及び／又は核酸を含むベクター、バクテリオファージ、ウイルス、バクテリア及び他の細胞をも包含する。本発明の治療用核酸は、改変／人工バクテリオファージ、ウイルス又は細菌ゲノムを包含する。

【0229】

本発明の治療剤の治療的使用及び適用には、診療所で適用されるいずれかの送達方法論によって治療される対象において、本発明の一本鎖二量体サイトカインを発現させる又は送達することによって治療可能でありうる任意の疾患、障害又は他の医学的状態が含まれる。

【0230】

本発明の態様及び実施形態において、特に好ましい疾患としては、本明細書の他の箇所で開示のように、がん及び他の増殖性疾患又は障害、炎症性疾患又は障害、ウイルス、細菌及び真菌感染症並びに組織再生が挙げられる。

【0231】

１つ又は複数のさらなる薬学的に許容可能な「担体」（希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルなど）を、医薬組成物において本発明の治療薬（複数可）と組み合わせることができる。好適な医薬担体は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎに記載されている。本発明の医薬製剤及び組成物は、規制基準に適合するように製剤化され、経口、静脈内、局所、又は他の標準的な経路を介して投与することができる。本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、あらゆるすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。医薬活性物質のためのそのような溶媒及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。従来の溶媒又は薬剤が活性成分と不適合でない限りは、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」という句は、ヒトに投与されたときに、アレルギー又は類似の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を意味する。

【0232】

本発明において、治療薬（複数可）は、医薬品に製造することができ、又は医薬組成物に製剤化することができる。対象に投与される場合、治療薬は、薬学的に許容可能なビヒクルを含む組成物の成分として好適に投与される。本発明の分子、化合物及び組成物は、任意の簡便な経路によって、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、膣内、経皮、直腸、吸入によって、又は皮膚に局所的に投与することができる。投与は全身的である場合も、又は局所的である場合もある。公知の送達システムには、例えば、マイクロゲル、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへのカプセル化も含まれ、これらのいずれも、いくつかの実施形態において、本発明の薬剤を投与するために使用することができる。当該技術分野で公知の他の任意の好適な送達系も、本発明の使用において想定される。

【0233】

許容される医薬用ビヒクルは、水や、石油、動物、植物又は合成由来のもの、ピーナッツ油や、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油などの液体でありうる。医薬用ビヒクルは、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素などでありうる。さらに、助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤を使用することもできる。対象に投与される場合、薬学的に許容されるビヒクルは好ましくは無菌である。水は、特に本発明の化合物が静脈内投与される場合に好適なビヒクルである。生理食塩水溶液並びに、デキストロース及びグリセロールの水溶液も、特に注射液用の液体ビヒクルとして使用することができる。好適な医薬用ビヒクルとしては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も挙げられる。本発明の組成物が、所望により、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又は緩衝剤を含有することもできる。

【0234】

本発明の医薬品及び医薬組成物は、液体、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、錠剤、丸剤、ペレット剤、粉末、放出調節（ｍｏｄｉｆｉｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅ）製剤（液体又は粉末を含むカプセル剤）、坐剤、エマルション、エアロゾル、スプレー、カプセル剤、リポソーム、微粒子、又は当該技術分野で公知の任意の他の好適な製剤の形態をとることができる。好適な医薬用ビヒクルの他の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９ｔｈ ｅｄ．， １９９５， ｓｅｅ ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ ｐａｇｅｓ １４４７－１６７６に記載されている。

【0235】

いくつかの実施形態では、本発明の治療用組成物又は医薬品は、よく使われる手順に従って、経口投与向けに適合された（より好適にはヒト用）医薬組成物として製剤化される。経口送達用の組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、水性若しくは油性懸濁液、顆粒、粉末、エマルション、カプセル剤、シロップ、又はエリキシル剤の形態であることができる。したがって、様々な実施形態では、薬学的に許容可能なビヒクルは、カプセル剤、錠剤又は丸剤でありうる。

【0236】

経口投与される組成物は、１つ又は複数の薬剤、フルクトース、アスパルテーム又はサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、冬緑油又はチェリーのような香味剤、着色剤、及び保存剤を含んで、薬学的に口当たりのよい製剤をもたらすことができる。組成物が錠剤又は丸剤の形態である場合、組成物は、長期間にわたって活性剤の持続的放出をもたらすように、コーティングして消化管内での崩壊及び吸収を遅延させることができる。浸透圧活性駆動化合物（ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｄｒｉｖｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を取り囲む選択的透過性膜も、経口投与組成物に適する。これらの剤形では、カプセル剤を取り囲む環境からの流体が駆動化合物によって吸収され、それが膨潤して、開口部を介して薬剤又は薬剤組成物を移動させる。これらの剤形は、即時放出製剤のスパイクのあるプロファイルとは対照的に、本質的にゼロ次の送達プロファイルをもたらすことができる。モノステアリン酸グリセロール又はステアリン酸グリセロールなどの時間遅延物質も使用することができる。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的なビヒクルを含むことができる。そのようなビヒクルは、好ましくは医薬品グレードのものである。経口製剤の場合、放出場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、又は大腸でありうる。当業者は、胃では溶解せず、十二指腸や腸の他所で物質を放出することになる製剤を調製することができる。好適には、その放出は、ペプチド（又は誘導体）の保護によって、又は腸などの胃の環境を超えてペプチド（又は誘導体）を放出することによって、胃の環境の有害な影響を回避することになる。完全な胃耐性を確保するためには、少なくともｐＨ５．０に対して不透過性のコーティングが不可欠であろう。腸溶性コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、オイドラギットＬ３０Ｄ、アクアリック（Ａｑｕａｔｅｒｉｃ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、オイドラギットＬ、オイドラギットＳ、及びシェラックであり、それらは混合フィルムとして使用することができる。

【0237】

治療薬（複数可）の水性環境への溶解を補助するために、湿潤剤として界面活性剤が加えられる可能性がある。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムや、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ジオクチルスルホン酸ナトリウムアニオン性界面活性剤を挙げることができる。カチオン性界面活性剤が使用される可能性もあり、例えば塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトミウムが挙げられうる。界面活性剤として製剤に含まれうる非イオン性洗浄剤としては、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート２０、４０、６０、６５及び８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は、使用される場合、ペプチド、核酸又は誘導体の製剤に、単独でも、又は異なる比率の混合物としても存在することができる。

【0238】

典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張水性バッファーを含む。必要に応じて、組成物はまた、溶解補助剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）も含むことができる。

【0239】

本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、バクテリオファージ、細菌及び／又は他の細胞の混合物は、１つ又は複数の賦形剤、担体又は希釈剤と好適に混合した水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、並びに油中で調製することもできる。通常の保存及び使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する場合がある。注射に適した医薬形態としては、無菌水溶液又は分散液、及び無菌注射用溶液又は分散液を即座に調製するための無菌粉末が挙げられる。どのような場合でも、その形態は無菌であり、適切な注射器による注入を可能にする充分な流動性を有しうる。好適には、組成物は製造及び保存の条件下で安定であり、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、並びに／又は植物油を含有する溶媒又は分散媒でありうる。例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持されうる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいことになる。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物に使用することによってもたらされうる。

【0240】

例えば、水溶液中の非経口投与の場合、溶液は、必要に応じて好適に緩衝化し、液体希釈剤はまず、充分な生理食塩水又はグルコースで等張にすることができる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内及び腹腔内投与に特に適する。これに関連して、使用可能な無菌水性溶媒は、当業者に公知であろう。

【0241】

本発明の治療用組成物のための別の好適な投与の経路は、肺又は鼻送達を介するものである。

【0242】

本発明の治療薬の細胞取り込みを高めるために、脂肪酸や、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの添加物を含めることができる。

【0243】

本発明の治療薬はまた、いくつかの実施形態では、対象の皮膚への局所適用向けの組成物に製剤化することもできる。

【0244】

本発明の実施形態では、治療用組成物は、１つ本発明の治療薬のみを含みうる、又は２つ以上、例えば２つの本発明の補完的な治療薬を含みうる。例えば、標的動物の異なる炎症反応経路の阻害は、複数の本開示の一本鎖二量体サイトカインによって、又は２つ以上の異なる受容体を標的とする能力を有する一本鎖二量体サイトカインによって達成することができる。具体的には、本発明の一本鎖二量体サイトカイン／フォールディカインは、各ドメインが異なる受容体及び潜在的に異なる炎症経路を優先的に標的とするように、異なる型（例えばＩＬ－２２）のサイトカイン単量体が連結したある１つの型（例えばＩＬ－１０）のサイトカイン単量体を含むことができる。２つの（又はそれより多い）治療薬が企図される場合、バクテリオファージ、ウイルス又は細菌などの異なるペプチド又はコード核酸コンストラクトは、同じ医薬組成物に組み込まれてもよく、又は別々に作製されてもよい。２つの（又はそれより多い）医薬組成物が、同じ個体への投与のために製造される場合、それらの組成物は、指示／必要に応じて、同時に、順次に、又は別々に投与されうることが理解されるであろう。

【0245】

治療薬及び組成物の送達のための方法
本発明の治療薬／治療用組成物を投与するための任意の好適な送達方法が、本開示に従って使用されうる。好適な投与の経路は、熟練した医療従事者によって決められ、１つ又は複数の要因に依存しうる。

【0246】

本発明の治療薬又は組成物の送達は、全身的である場合も、又は局所的である場合もある。例えば、投与の経路は、疾患、例えば、治療されるがん又は炎症状態の位置及び／又は性質によって決定することができ、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号明細書、米国特許第５，６４１，５１５号明細書及び米国特許第５，３９９，３６３号明細書に記載のように、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、局所（例えば、腫瘍／標的組織の近傍）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入、灌流、洗浄、及び経口投与を挙げることができる。典型的には、全身投与の簡便な形態としては、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、経皮投与、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0247】

さまざまな実施形態では、治療薬／組成物は、標的組織、器官又は腫瘍に直接投与することができる。いくつかの特に有益な実施形態では、本開示の治療用組成物は、対象の血管系への注射によって送達することができる。

【0248】

いくつかの実施形態では、（連続）投与／長期間にわたる投与が好ましいことがあり、任意の好適な機構によって、例えば、腫瘍、血管系又は組織にカテーテルを埋め込むことによって達成することができる。好適には、連続的灌流による治療用組成物の投与量は、灌流が起こる期間にわたって調節された単回又は複数回の注射によって与えられる投与量と等しくすることができる。

【0249】

核酸コンストラクト、ベクター及び／又は細胞の注入は、発現コンストラクト（例えば細菌）が注入に必要な特定のゲージの針を通過できる限り、シリンジ又は溶液の注入に使用される任意の他の方法によって送達することができる。いくつかの実施形態では、例えば米国特許第５，８４６，２３３号明細書に記載のような、当業者に公知の無針注入システムを使用することができる。

【0250】

治療的治療レジーム及び投与
治療レジメンは様々であり、多くの場合、腫瘍などの疾患の種類及び／又は部位、疾患のステージ／進行、及び／又は患者の健康及び年齢に依存しうる。例えば、ある腫瘍は、本開示の治療用組成物の局所的及び／又は高濃度投与による治療によく反応しうるが、他の疾患（及び個人）は、治療薬のより拡散的及び／又は低投与量及び／又は長期投与から利益を得ることができる。熟練した臨床医であれば、それぞれの状況下で好適な治療的治療レジームを決めることができであろう。

【0251】

様々な態様及び実施形態では、本開示は、本明細書に開示の１つ又は複数の治療薬の投与によって対象を治療するための治療的使用及び方法を提供する。したがって、本開示は、標的腫瘍細胞の死を促進することによって腫瘍サイズ及び／又は増殖を減少させるための使用及び方法を提供する。その使用及び方法は、本発明の一本鎖サイトカインなどの本開示の治療用組成物若しくは薬剤、又は一本鎖サイトカインを発現させる薬剤の治療有効量を、個体又は個体のがん細胞若しくは標的細胞の第１の集団に投与することを含む。したがって、有利には、一本鎖サイトカインの複数のコピーを複製し、標的部位で発現及び／又は放出させることができるベクター又は送達剤（例えば、細菌、ウイルス、細胞又はバクテリオファージ）の使用によって、治療薬又はビヒクルの初回投与で対象のすべての標的細胞又は領域（腫瘍内など）に治療薬を直接投与する必要はない。むしろ、治療薬が本開示の一本鎖サイトカインの複数のコピーの増殖又は生成を可能にすることによって、治療効果の強化を達成することができる。

【0252】

本開示の一本鎖サイトカイン若しくは他の治療薬又はその医薬組成物の有効量は、標的がん細胞の腫瘍溶解／死滅、及び／又は標的がん細胞の溶解若しくは増殖の破壊、又は標的がん細胞若しくは腫瘍の増殖若しくはサイズの阻害若しくは減少を誘導するのに充分な量を含みうる。腫瘍又は標的がん細胞の増殖の減少は、例えば、細胞死、細胞を含む腫瘍の複製速度の遅延若しくは増殖速度の低下、又はがん細胞を含む対象の長期生存によって明らかにすることができる。代替的な態様及び実施形態では、本開示の一本鎖サイトカイン若しくは他の治療薬又はその医薬組成物の有効量は、肺などの標的個体、組織又は器官における炎症反応を軽減するのに充分な量を含みうる。

【0253】

したがって、いくつかの実施形態では、本開示の治療薬の有効量を対象に投与することを含む、がん又は腫瘍又は炎症性疾患若しくは障害（肺疾患、例えばぜんそくなど）を有する対象を治療する治療的使用及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、完全に又は実質的になくすことができる。いくつかの実施形態では、炎症反応は、完全に又は実質的になくすことができる。

【0254】

本開示の使用及び方法は、治療薬を対象又は個体に投与することを含むことができる。投与は、任意の好適な手段、例えば、注射又は摂取によることができる。投与は、全身又は局所、例えば、腫瘍部位へ直接であることができる。１つの実施形態では、全身送達が好ましい。

【0255】

治療用組成物及び／又は療法は、様々な「単位投与量」を含むことができ、単位投与量は、治療薬又は組成物の予め決められた量を含有するものとして定義することができる。投与すべき好適な量並びに特定の投与の経路及び製剤を明らかにすることは、臨床分野の当業者の技術の範囲内である。単位投与量は、例えば、単回注射又は錠剤として投与することができるが、設定された期間にわたる連続注入を介してなど、長期間にわたって投与することもできる。

【0256】

ある特定の実施形態では、治療薬は、一連の期間にわたって（例えば、１２時間又は２４時間にわたって）１回又は複数回の投与で施すことができ、これらを合わせて「単位投与量」とする。他の実施形態では、個々の投与はそれぞれ、「単位投与量」とみなすことができる。

【0257】

本開示の治療用組成物及び／又は薬剤は、適切とみなされる好適な治療期間内、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日、週、月又は年にわたって、適切とみなされる複数回の投与（例えば、２、３、４、５、６回以上の投与）で投与することができる。本明細書に記載の治療薬及び／又は医薬組成物の投与の頻度は、当業者によって決定されうるが、例えば、１日１回、１日２回、毎週１回、２週間に１回、月に１回、２か月に１回、３か月に１回、６か月に１回などであることができる。

【0258】

さらに、考案されうる治療的治療レジームに従って、単位投与量は、治療の段階又は種類に応じて、並びに対象の大きさ及び／若しくは年齢、又は治療が意図される疾患の種類を考慮して変動しうる。例えば、いくつかの実施形態では、対象に投与される本開示の治療薬又は医薬組成物の第１の投与量は、投与され得る任意の第２の投与量、第３の投与量、又はそれ以降の投与量よりも少ないこともあり、又は多いこともある。他の実施形態では、第１の投与期間中、投与量は、第２、第３又はそれ以降の投与期間中に投与される投与量よりも低いこともあり、又は高いこともある。当業者は、任意のそのような投与期間の期間、例えば、約１日、約１週間若しくは約１ヶ月、又は任意の中間の期間若しくはより長い期間を決定することができる。

【0259】

いくつかの例では、治療される対象は、１つ又は複数の追加の治療薬を投与される可能性がある、又は１つ又は複数の追加の従来療法（放射線治療若しくは化学療法など）若しくは補完療法を受ける可能性がある。

【0260】

併用療法
さまざまな実施形態では、本開示の使用及び方法は、本開示の治療薬（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター若しくは細胞（例えば本明細書に開示の組換え細菌細胞））、又は本開示の治療薬を含有する医薬組成物を、１つ又は複数の追加の療法又は治療薬と併用して投与することを含む。１つ又は複数の追加の療法又は治療薬は、本開示による治療薬と同時に、順次に、又は別々に（前若しくは後に）投与することができる。

【0261】

追加の治療薬は、本開示による別の治療薬であってもよく、その結果、本発明の２つの治療薬が併用して投与される。追加の療法又は治療薬の他の例としては、化学療法、放射線、追加のウイルスによる腫瘍溶解ウイルス療法、免疫調節タンパク質による治療、抗がん剤、抗炎症剤又はそれらの任意の組み合わせが挙げられうるが、それらに限定されない。

【0262】

特定の実施形態では、追加の治療薬は抗がん剤又はがん療法である。抗がん剤としては、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、抗がん抗体及び／又は抗サイクリン依存性キナーゼ剤が挙げられうるが、それらに限定されない。がん療法としては、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法及び／又は手術又はそれらの組み合わせが挙げられうる。

【0263】

さまざまな実施形態では、がんの治療には外科手術が含まれることがある。そのような手術には、がん様組織の全部又は一部が、対象から物理的に（例えば切除によって）取り除かれる、且つ／又は他の方法で破壊されｒｙ切除術が含まれうる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に取り除くことである。腫瘍切除にくわえて、手術による治療には、レーザー手術、凍結外科手術、電気外科手術、及び顕微鏡下手術（モース手術）がある。いくつかの実施形態では、腫瘍（又はその一部）は切除によって除去されるべきであると判断されることもあり、又は代替えとして、腫瘍は切除に適さないと判断されることもある。そのような状況において、本発明の実施形態は、切除の結果を向上させるために、又は腫瘍若しくはその一部を切除することを可能にするために、本開示の治療薬又は組成物で対象を治療することを含むことができる。したがって、本開示の治療的治療は、例えば腫瘍マージンの縮小に起因して、又は浸潤部分の除去によって、腫瘍の切除可能性を増加させることができる。切除に続く追加の治療は、腫瘍部位の微小残存病変を除去する役割を果たすことになる。

【0264】

キット
実施形態では、本開示は、本明細書に記載の一本鎖二量体サイトカイン、コードポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は他の薬剤（細菌若しくはバクテリオファージなど）を投与するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、本開示のキットは、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞（例えば細菌）若しくはバクテリオファージをコードする一本鎖二量体サイトカインなどの「治療薬」又は上記のようにそのような治療薬を含む（医薬）組成物を含むことができる。ある特定の実施形態では、本開示のキットはさらに、使用説明書や、デバイス、追加の試薬、並び本明細書に開示の方法及び療法を行うためのチューブや、容器、シリンジなどの構成要素などの１つ又は複数の構成要素を含むことができる。さまざまな実施形態では、本開示のキットはさらに、本開示の治療薬と組み合わせて（別々に、順次に、又は同時に）投与できる１つ又は複数の活性薬剤、例えば、抗がん剤、免疫調節剤、抗炎症剤、及び（ｏｒ）それらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つを含むことができる。

【0265】

いくつかの実施形態では、本開示によるキットは、治療薬、１つ又は複数の追加の活性薬剤及び／又は本明細書に記載のいずれかの試薬が入っている１つ又は複数の容器を含むことができる。

【0266】

いくつかの実施形態では、キットはさらに、本開示の治療薬（組換え細菌など）、及び／又は任意の追加の活性薬剤を対象に投与するための装置又はデバイスを含むことができる。好適な装置又はデバイスは、皮下注射針、静脈内注射針、カテーテル、無針注射器、吸入器及び／又は液体ディスペンサーのうちの１つ又は複数を含むことができる。

【0267】

キットの使用説明書には、キットに何が含まれるべきか、どのように適切に使用されるべきか、例えば、キットの様々な構成要素が、タイミング、濃度及び量を含め、どのように個人に投与されるべきか、適切な投与方法並びに使用中／治療中に個人をどのようにモニターすべきか／モニターすべきかどうかについての説明を好適に含めることができる。

【実施例】

【0268】

実施例１：ＩＬ－１０バリアント及び単鎖二量体ＩＬ－１０の生成
他に指し示されない場合、商業的に入手可能な試薬並びに分子生物学及び生化学における標準的な技術を使用した。
材料及び方法
本出願人により使用された以下の手順は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９８９： ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｎ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｓ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅに記載されている。一般的な目的の試薬、オリゴヌクレオチド、抗体、化学物質及び溶媒は、Ｍｅｒｃｋから購入した。酵素及びポリメラーゼは、他に指し示されない場合、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から入手した。

【0269】

方法
細菌株及び培養条件
使用される場合、この研究において生成されたＷＴマイコプラズマ・ニューモニエＭ１２９－Ｂ７株（ＡＴＴＣ ２９３４２）及び全てのＭ．ニューモニエ株は、表１に記載されている。Ｈａｙｆｌｉｃｋ液体培地を含む組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中５％ ＣＯ_２下３７℃でマイコプラズマ株を増殖させた。Ｈａｙｆｌｉｃｋは、８００ｍｌの不完全培地Ａ（２０ｇ ＰＰＬＯブロス［Ｄｉｆｃｏ、＃２５５４２０］、３０ｇ ＨＥＰＥＳ［最終１００ｍＭ］、２５ｍｌ ０．５％フェノールレッド溶液［Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ３５３２］）、２００ｍｌ熱不活化ウマ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃２６０５００８８）、２０ｍｌ無菌濾過済み５０％グルコース及びアンピシリンの１００ｍｇ ｍｌ^－１ストック１ｍｌ（最終濃度１００μｇ ｍｌ^－１、アンピシリンナトリウム塩［Ｓｉｇｍａ、＃Ａ９５１８］）を混合することにより調製した。プレート上での増殖が要求される場合、Ｈａｙｆｌｉｃｋブロスに０．８％ ｂａｃｔｏ－ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）を補充した。必要な場合、Ｈａｙｆｌｉｃｋブロスに細胞選択のためのテトラサイクリン又はクロラムフェニコール（Ｔｃ；２０μｇ ｍｌ^－１Ｃｍ；２０μｇ ｍｌ^－１）を補充した。シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１をＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｔ８９０７）寒天プレート中３７℃で増殖させた。クローニングのために、大腸菌ＮＥＢ（登録商標） ５－ａｌｐｈａ Ｈｉｇｈ－Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し；それを３７℃でＬＢブロス中又はアンピシリン（１００μｇ ｍｌ^－１）を補充したＬＢ寒天プレート上で増殖させた。

【0270】

細胞株
ＨＡＦＴＬ細胞は、胎児肝臓由来の、Ｈａ－ｒａｓがん遺伝子形質転換マウスプレＢ細胞株である（４７）。ＢＬａＥＲ１はヒトＢ細胞前駆白血病細胞株（４８）であり；両方の細胞株はＴｈｏｍａｓ Ｇｒａｆ教授の厚意により提供された。ＴＨＰ－１細胞株は、ＡＴＣＣから購入した末梢血に由来する単球細胞株である。細胞は、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（２５０３００８１、ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００ｎｇ／ｍＬストレプトマイシン（１５１４０１２２、ＧＩＢＣＯ）、及び２０％ ＦＢＳ（１０２７０－１０６、ＧＩＢＣＯ）を補充したＲＰＭＩ（１２６３３０１２、ＧＩＢＣＯ）中で増殖させた。

【0271】

プラスミド生成
この研究において生成した全てのプラスミドをＧｉｂｓｏｎ法^４７に従ってアセンブルした。必要な場合、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが遺伝子合成（ｇＢｌｏｃｋ二本鎖断片）及びオリゴヌクレオチド合成を行った。遺伝子増幅は、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実行した。一部の実施例において、ＩＬ－１０及びフォールディカイン＿１０バリアントのためのプロモーター配列はＰ３合成プロモーター^４８であり、Ｓ１４２（米国特許出願第１５／５５３，５５２号明細書、Ｇａｒｒｉｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２０２１）と称される分泌シグナルを使用した。ＩＬ－２２バリアント及びＩＦＮ－ラムダのために使用されたプロモーターはｐＳｙｎＬ（ＧＴＴＡＡＣＧＡＴＴＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴ；配列番号３３９）であった。プラスミド、株及びそれらの遺伝子部分の詳細なリストは表１にも与えている。全てのプラスミドは、ＰＣＲ及びサンガーシークエンシング（ＧＡＴＣ ｂｉｏｔｅｃｈ）により検証した。

【0272】

Ｍ．ニューモニエＣＶ８株の生成
ＣＶ８は、ｍｐｎ０５１がマイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）からのｇｐｓＡ遺伝子により置き換えられている弱毒化ＣＶ２株（Δｍｐｎ１３３、Δｍｐｎ３７２）の派生株である^５８。これらの２つの遺伝子によりコードされる酵素はグリセロール３リン酸の酸化に関与し、ＧｐｓＡ酵素の場合にＮＡＤＨの代謝副生成物、又はｍｐｎ０５１によりコードされるＧｌｐＤ酵素の場合にＨ_２Ｏ_２を生成し；このＨ_２Ｏ_２産生はＭ．ニューモニエの細胞毒性効果のために決定的である。ＣＶ８株はまた、ピューロマイシン耐性遺伝子（ＧＰ３５コーディング遺伝子の挿入を選択するために導入される）がゲノム中のその位置（ｍｐｎ５６０）から除去された第２の遺伝子欠失を持つ。ｓｓＤＮＡリコンビナーゼＧＰ３５に基づいてマイコプラズマに適合されたゲノム編集ツール^４９を使用して突然変異体を生成した。組換え用の基質として、以前に記載されたように製造されたｓｓＤＮＡの長いストレッチを使用した^５０。

【0273】

ｓｓＤＮＡの長いストレッチを生成するために用いたプライマー及びプラスミドの配列を表４に示している。

【0274】

株
細菌、例えばＭ．ニューモニエ中での異なるバージョンのヒトサイトカイン、例えばＩＬ－１０（ｈＩＬ－１０）、及び様々なフォールディカイン構築物の発現及び分泌のために、適切なシグナルペプチドを含有するサイトカイン及びフォールディカイン構築物に適切なプロモーター配列を融合することによりトランスポゾンベクターを生成した。ＩＬ－１０バリアント及びＮ末端ＩＬ１０配列を有するフォールディカインの発現及び分泌のために、合成プロモーターＰ３を分泌用のＮ末端のシグナルペプチド１４２（ｓ１４２）と共に使用した（各々の構築物の遺伝子情報について表１を参照）。ＩＬ－２２及びＩＦＮ－ラムダバリアント並びに対応するフォールディカイン構築物の発現及び分泌のために、合成プロモーターｐＳｙｎＬを使用し、シグナルペプチド（ｓ１４２）に融合させた。テトラサイクリン耐性マーカーもまた使用した（本明細書における方法を参照）。

【0275】

Ｍ．ニューモニエ発現細胞を生成するために、異なるプラスミドをＷＴ又はＣＶ８ Ｍ．ニューモニエのいずれか中に形質転換した。２０ｍｌの新鮮なＨａｙｆｌｉｃｋを含有する７５ｃｍ^２組織フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で細胞を増殖させ、後期対数増殖期まで５％ ＣＯ_２下３７℃でインキュベートした。予備冷却されたエレクトロポレーション緩衝液（２７２ｍＭスクロース、８ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４）で細胞を２回洗浄し、再懸濁し、剥がし取り、２５ゲージ（Ｇ２５）注射針に１０回通過させた。２μｇの所望されるプラスミドを含む０．１ｃｍキュベット中の５０μｌの細胞アリコートを氷上で２０分間保った。エレクトロポレーションの設定は、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ装置において１２５０Ｖ／２５μＦ／１００Ωに設定した。パルス後に、４２０μｌの新鮮なＨａｙｆｌｉｃｋを細胞に加えた。この培養から、８０μｌを、選択抗生物質（即ち、２０μｇ ｍｌ^－１クロラムフェニコール又はテトラサイクリン）を含む５ｍｌの新鮮なＨａｙｆｌｉｃｋを含む２５ｃｍ^２組織フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に接種した。異なるＭ．ニューモニエ発現細胞から、５０μｌのストック接種物を、５ｍｌの新鮮なＨａｙｆｌｉｃｋを含有する２５ｃｍ^２組織フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、４８時間増殖させた。培養培地を次に収集し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を－８０℃で１ｍｌアリコート中で貯蔵した。

【0276】

質量分析によるジスルフィド同定
最初に調製され、－８０℃で貯蔵されたアリコートから、２５μＬのｈＩＬ－１０、ＭｕｔＳＣ１、又はＭｕｔＳＣ２の初期接種物を、Ｃｍを補充した５ｍＬ Ｈａｙｆｌｉｃｋ培地を含むＴ２５ｃｍ^２フラスコに２連続で接種した。２４時間後に、培地を重複物のうちの１つから廃棄し、バージョン１３の限定培地で置き換えた（例えば欧州特許第２０３８２２６１号明細書を参照）。３６時間後に、両方の複製物の上清を収集し、プロテオーム分析のために処理した。いずれかのセットの条件下でタンパク質存在量において差異は観察されなかった。更なる特徴付けのために、試料をバージョン１３の限定培地中で生育した。

【0277】

上清を収集し、ＭＷＣＯ ３Ｋで濃縮し、７００μＬの上清を用いて１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次に、２００μＬの上清を同じＭＷＣＯカラムに加え、混合物を４℃、１２，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。約１００μＬの最終濃縮体積をＢＣＡ定量化用のもの及びＭＳ分析用の他のものの２つに分割した。新たに濃縮したアリコートの各々をＳＤＳ ４％、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ １００μＬ中に再懸濁した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標） ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２５）を使用してＢＣＡにより上清溶解液を定量化し、分析のためにＵＰＦ ＭＳ Ｆａｃｉｌｉｔｙに送った。試料調製のために、Ｎ－エチルマレイミド（３０ｎｍｏｌ、３７℃、６０分）でアルキル化することによりシステインを標識し、試料を次に６体積の冷アセトンで沈殿させた。ペレットを６Ｍ尿素／２００ｍＭ重炭酸アンモニウム中に溶解させ、試料をジチオトレイトール（３０ｎｍｏｌ、３７℃、６０分）で還元させ、暗所中ヨードアセトアミド（６０ｎｍｏｌ、２５℃、３０分）でアルキル化させた。

【0278】

全ての希釈液のために２００ｍＭ重炭酸アンモニウムを使用して、以下の方式で試料を次に消化した。ｈＩＬ－１０及びＭｕｔＳＣ２のために、得られたタンパク質抽出物を最初に２Ｍ尿素に希釈し、次にエンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ（ｅｎｄｏ－ＬｙｓＣ）（１：１００ｗ：ｗ、３７℃、６時間、Ｗａｋｏ、ｃａｔ＃１２９－０２５４１）とインキュベートし；試料を次に２倍（１：１００ｗ：ｗ）に希釈し、ｉ）トリプシン（３７℃、終夜；Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃ Ｖ５１１３）；ｉｉ）キモトリプシン（２５℃、終夜；Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｃａｔ＃ １１４１８４６７００１）；又はｉｉｉ）ＧｌｕＣ（２５℃、終夜；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ＃ Ｐ６１８１）で消化した。試料を最初に６Ｍ尿素にトリプシン消化（１：１００ｗ：ｗ、３７℃、終夜、Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃ Ｖ５１１３）、続いてＧｌｕＣ消化（１：１００ｗ：ｗ、２５℃、終夜、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ＃ Ｐ６１８１）のために希釈した。ＭｕｔＳＣ１のために、コンビナトリアル消化ミックスは以下であった：ｉ）ｅｎｄｏ－ＬｙｓＣ ＋ トリプシン：２Ｍ尿素にｅｎｄｏ－ＬｙｓＣのために希釈し（１：１００ｗ：ｗ、３７℃、６時間、Ｗａｋｏ、ｃａｔ＃ １２９－０２５４１）、次にトリプシンのために２倍に希釈した（１：１００ｗ：ｗ、３７℃、終夜、Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃ Ｖ５１１３）；ｉｉ）ｅｎｄｏ－ＬｙｓＣ ＋ キモトリプシン：２Ｍ尿素にｅｎｄｏ－ＬｙｓＣのために希釈し（１：１００ｗ：ｗ、３７℃、６時間、Ｗａｋｏ、ｃａｔ＃ １２９－０２５４１）、次にトリプシン消化のために２倍に希釈した（１：１００ｗ：ｗ、２５℃、終夜、Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｃａｔ＃ １１４１８４６７００１）；ｉｉｉ）ＬｙｓＣ ＋ ＧｌｕＣ：２Ｍ尿素にｅｎｄｏ－ＬｙｓＣのために希釈し（１：１００ｗ：ｗ、３７℃、６時間、Ｗａｋｏ、ｃａｔ＃ １２９－０２５４１）、次にＧｌｕＣのために２倍に希釈した（１：１００ｗ：ｗ、２５℃、終夜、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ＃ Ｐ６１８１）；及びｉｖ）トリプシン ＋ ＧｌｕＣ：６Ｍ尿素にトリプシン消化のために希釈し（１：１００ｗ：ｗ、３７℃、終夜、Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃ Ｖ５１１３）、次にＧｌｕＣで消化した（１：１００ｗ：ｗ、２５℃、終夜、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ＃ Ｐ６１８１）。全ての場合において、消化後のペプチド試料をギ酸で酸性化させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に先立ってＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃ１８カラム（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ）上で脱塩した。

【0279】

クロマトグラフィー及びＭＳ分析のために、以下のプロトコールを使用した。ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｒｏｘｅｏｎ）、Ｏｄｅｎｓｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に連結されたＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。５μｍの粒子サイズのＣ^１８粒子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を充填した１００μｍの内径の２ｃｍ Ｎａｎｏ Ｔｒａｐカラムにペプチドをロードし、１．９μｍ Ｃ１８粒子（Ｎｉｋｋｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． Ｊａｐａｎ）を充填した７５μｍの内径の２５ｃｍカラムを使用して逆相クロマトグラフィーにより分離を行った。クロマトグラフィー勾配は、２５０ｎｌ 分^－１の流速で５分間の９３％の緩衝液Ａ及び７％の緩衝液Ｂで開始し、１２０分時の６５％の緩衝液Ａ及び３５％の緩衝液Ｂまで徐々に増加させた。各々の分析後に、カラムを１５分間１０％の緩衝液Ａ及び９０％の緩衝液Ｂで洗浄した。緩衝液Ａ、水中の０．１％ギ酸；緩衝液Ｂ、アセトニトリル中の０．１％ギ酸。質量分析計は、２．１ｋＶに設定したナノスプレー電圧及び３００℃の供給源温度でのポジティブイオン化モードにおいて稼働させた。分析に先立つＦＴ質量分析装置の外的な軟正のためにＵｌｔｒａｍａｒｋ １６２１を使用し、内的な軟正は、ｍ／ｚ ４４５．１２００でバックグラウンドポリシロキサンイオンシグナルを使用して行った。測定値は、データ依存的取得（ｄａｔａ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ；ＤＤＡ）モードで取得し、６０，０００の分解能での１マイクロスキャンを伴うフルＭＳスキャンをＯｒｂｉｔｒａｐにおける検出と共にｍ／ｚ ３５０～２０００の質量範囲にかけて使用した。オートゲインコントロール（Ａｕｔｏ ｇａｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ；ＡＧＣ）を１Ｅ６、ダイナミックエクスクルージョン（６０秒）に設定し、単一荷電ペプチドを失格とする荷電状態フィルタリングを稼働させた。ＤＤＡ分析の各々のサイクルにおいて、及び各々のサーベイスキャン後に、５，０００の閾値イオンカウントを上回る複数の荷電イオンを伴う上位２０の最も強いイオンをフラグメンテーションのために選択した。３５％の正規化された衝突エネルギーでの衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）を介してフラグメントイオンスペクトルを生成し、イオントラップ質量分析装置において取得した。ＡＧＣを１Ｅ４、２．０ｍ／ｚの単離ウィンドウ、１０ｍｓのアクティベーション時間に設定し、１００ｍｓの最大注入時間を使用した。全てのデータはＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアｖ２．２で取得した。試料のキャリーオーバーを回避するため及び機器の安定性を保証するために各々の試料の間に、消化されたウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔ＃ Ｐ８１０８Ｓ）を分析し；ＱＣｌｏｕｄ（５３）を使用して、プロジェクトの間の機器の長手方向性能を制御した。

【0280】

Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェアスイート（ｖ２．０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＭａｓｃｏｔサーチエンジン（ｖ２．６、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ（５４））を使用してデータを分析した。Ｍ．ニューモニエ（８７０７１エントリー）に加えてｈＩＬ－１０、ＭｕｔＳＣ１、ＭｕｔＳＣ２並びに一般的な夾雑物のリスト（５５）及び対応するデコイエントリーの全てに対してデータをサーチした。ペプチド同定のために、７ｐｐｍの前駆体イオン質量許容性をＭＳ１レベルのために使用し、トリプシンを切断酵素として選択し、最大３回の切断の失敗を許した。フラグメントイオン質量許容性をＭＳ２スペクトルのために０．５Ｄａに設定した。メチオニンの酸化、Ｎ末端タンパク質アセチル化、システインのカルバミドメチル化及びＮ－エチルマレイミドを可変的な修飾として使用した。ペプチド同定における偽発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ；ＦＤＲ）は最大５％に設定した。ペプチド抽出イオン電流（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ；ＸＩＣ）のために２ｐｐｍの質量許容差を使用してＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ｖ２．０）からの「Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ ａｒｅａ ｄｅｔｅｃｔｏｒ」ノードからペプチド定量化データを取得した。得られた値を使用して、未分類のタンパク質のために独特のペプチドを伴うタンパク質の上位３区画を算出した。

【0281】

ＭｕｔＳＣ１のために、ＰＲＭ（並列反応モニタリング；ｐａｒａｌｌｅｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）－クロマトグラフィー及びＭＳ分析を行った。第１のシステインがカルバミドメチル化されていることを確認するために、試料をｅｎｄｏ－ＬｙｓＣ ＋ トリプシンで消化し、Ｅａｓｙ－ｎａｎｏＬＣ １２００ ＵＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＲＭ方法で分析した。ペプチドを直接的に分析カラムにロードし、２μｍ Ｃ^１８粒子を充填した７５μｍの内径の５０ｃｍカラムの分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して逆相クロマトグラフィーにより分離を行った。

【0282】

クロマトグラフィー勾配は、３００ｎＬ／分の流速で５分間の９５％の緩衝液Ａ及び５％の緩衝液Ｂで開始し、７９分にかけて２５％の緩衝液Ｂ及び７５％のＡ、並びに次に１１分にかけて４０％の緩衝液Ｂ及び６０％のＡまで徐々に増加させた。各々の分析後に、カラムを１０分間１０％の緩衝液Ａ（水中の０．１％ギ酸）及び９０％の緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル中の０．１％ギ酸）で洗浄した。

【0283】

質量分析計は、２．４ｋＶのＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙナノソースを伴うポジティブイオン化モードにおいて３０５℃の供給源温度で稼働させた。３０，０００の分解能での１マイクロスキャンを伴うフルＭＳスキャンをｍ／ｚ ３５０～１４００の質量範囲にかけて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析装置における検出と共に使用した。ＰＲＭ方法を、１．４ｍ／ｚに設定された四重極単離ウィンドウ及びｍ／ｚ ３００～２，０００の質量範囲にかけてのＭＳＭＳと共に、６０，０００の分解能でのＯｒｂｉｔｒａｐにおける検出と共にデータ取得のために使用した。３０ＮＣＥでのＨＣＤを使用してＭＳＭＳフラグメンテーションを行い、オートゲインコントロール（ＡＧＣ）を１×１０^５、及び５０２ｍｓの最大注入時間に設定した。ペプチド質量（ｍ／ｚ）は質量リストにおいて定義し、表Ｓ２に示される。ＰＲＭデータ分析のために、Ｓｋｙｌｉｎｅ－Ｄａｉｌｙソフトウェア（４）（ｖ２１．１．９．３５３）を使用してライブラリーを生成し、それをＭａｘＱｕａｎｔ（１．６．１０）サーチの出力として観察し、Ｐｒｏｓｉｔ（５）を用いて予測し、及び各々のペプチドのフラグメント区画を抽出した。

【0284】

細菌株におけるインターロイキン発現の定量化
突然変異体候補の各々の発現能力を試験するために、細胞を１ｍｌの新鮮なＨａｙｆｌｉｃｋ培地中に収集した（例えば、細胞をフラスコに接着させて増殖させ、培地を吸引し、１ｍｌの新鮮な培地を加えた）。細胞を固体Ｈａｙｆｌｉｃｋプレート中１０μｌのドット中にプレーティングし、１０日間３７℃、５％ ＣＯ_２で増殖させた。非希釈から１×１０^－８の希釈までの異なる希釈範囲にわたりコロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントした。分析した各々の条件について、異なる発現されたＩＬ－１０バリアントの濃度をＥＬＩＳＡにより定量化した。

【0285】

ＩＬ－１０定量化のために、生産者の指示書に従ってＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；＃４３０６０４）を行った。検出範囲に入るようにこのアッセイのために最大１００，０００倍に上清を希釈した。各々のアッセイのための陽性対照として、商用の組換えＩＬ－１０（＃２００－１０、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）（ｈＩＬ－１０ｒ）、又は組換えＩＬ－２２（＃２００－２２、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）をＰＢＳ中１０μｇ ｍｌ^－１で再構成し、－８０℃で２０μｌアリコート中で貯蔵した。突然変異体の濃度を推測するために使用された商用のＩＬ－１０のパトロン曲線を多項式のグレード２にフィッティングした。ＥＬＩＳＡによるＩＬ－２２定量化（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標） Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２２、４３４５０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）又はインターフェロンラムダ（ＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸ（商標） Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２９（ＩＦＮ－λ１）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のために同じ手順に従った。ＩＬ－２２ ＥＬＩＳＡキットを使用して（以下に記載される）フォールディカイン－２２分子のＳＣＩＬ１０ＩＬ２２キメラを定量化した。

【0286】

血液単球の単離
４人の健常ドナーからの血液試料は、Ｓｐａｎｉｓｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより承認された契約番号１６０００２の下で、Ｂａｎｃ ｄｅ Ｓａｎｇ ｉ Ｔｅｉｘｉｔｓ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）により提供された。書面によるインフォームドコンセントが試料収集前にドナーから得られた。

【0287】

生産者の指示書に従って、Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（登録商標）チューブを使用してバフィコートから末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を単離した。簡潔に述べれば、１０ｍＬの血液試料を１：５の比でリン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）を用いて希釈し、Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（登録商標）チューブに注ぎ、１５分間８００ｇで室温で遠心分離した。パスツールピペットを使用してＰＭＢＣを収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして３ｍｌ ＰＢＳで再懸濁した。単球をＣＤ１４^＋磁気的標識化により単離し、以前に記載されたようにマクロファージに分化させた^５４。簡潔に述べれば、生産者の指示書に従って、ＣＤ１４マイクロビーズ陽性選択及びＭＡＣＳ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して細胞を精製した。

【0288】

単球由来マクロファージを分化させるために、単球を６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のガラスカバースリップ（ＶＷＲ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に、温ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中３７℃で１時間１．５×１０^６細胞／ウェルで接着させた。培地を次に、２０ｎｇ ｍｌ^－１の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びヒト組換えマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の最終濃度まで補充を行った。細胞を６～８日間分化させた。

【0289】

ＨＥＫ－ｂｌｕｅ（商標）細胞の培養
ＳＥＡＰレポーター構築物を有するＨＥＫ－ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ＩＦＮ－ラムダ細胞株はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ１２－６０４Ｆ）中で細胞を増殖させた。ＨＥＫ－ＩＬ－１０細胞に１００μｇ ｍｌ－１ ｎｏｒｍｏｃｉｎ及び選択抗生物質を補充した。ＨＥＫ－ｂｌｕｅ ＩＬ－２２及びＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ＩＦＮ－ラムダ細胞にブラストサイジン、ピューロマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）を補充した。生産者の推奨に従って、７０％のコンフルエンスに達したときに細胞を継代した。

【0290】

ＨＥＫ－ｂｌｕｅ（商標）細胞における操作された候補の活性の試験
ＥＬＩＳＡによる上清定量化（方法を参照）後に、異なる上清の２００μｌのアリコートを－８０℃で貯蔵した。試料を希釈するために新鮮なＨａｙｆｌｉｃｋ培地を使用して、以下の濃度（３０、１５、７．５、３．７５、１．８８、０．９４、０．４７、及び０．２３ｎｇ ｍｌ^－１）の異なる５００μｌの「候補アリコート」を各々の突然変異体候補のため及びまた組換えタンパク質のために調製した。必要とされる上清の体積はＥＬＩＳＡ定量化により決定し、２０μｌ補充液中で上記される濃度に達するための新鮮なＨａｙｆｌｉｃｋ培地に従って体積を調整した。

【0291】

並行して、ＨＥＫ－ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－１０、ＩＬ－２２又はＩＦＮ－ラムダ細胞懸濁液を、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充した予め温めたＤＭＥＭ（抗生物質なし）中で２８０，０００細胞 ｍｌ^－１で調製した。その後、ウェル当たり１８０μｌを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１６７００８）中に播種した。ここから、Ｈａｙｆｌｉｃｋ培地中で調製された固定された濃度の２０μｌの各々の「候補アリコート」又は組換えタンパク質を加え、細胞を２４時間３７℃及び５％ ＣＯ_２で保った（誘導されたＨＥＫ細胞）。２４時間後に、１８０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ、＃ｒｅｐｑｂｓ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を２０μｌの誘導されたＨＥＫ細胞と新規の９６ウェルプレート中で混合した。細胞を次に６０分３７℃でインキュベートし、吸光度（６３０ｎｍ）を分光光度計Ｔｅｃａｎ ｉ－ｃｏｎｔｒｏｌ、２．０．１０．０において測定した。

【0292】

ＭｏｄｅｌＸソフトウェアを使用した単鎖（ＳＣ）分子の生成
Ｘ線ＩＬ－１０二量体構造（ＰＤＢ：１ｙ６ｋ、２ｉｌｋ）をリワイアリングすることにより、提案されるＳＣ－ＩＬ１０バリアントを生成した。新規の接続性は、ＭｏｄｅｌＸツールスイートの補助と共に知的に設計した。ＭｏｄｅｌＸ Ｂｒｉｄｇｉｎｇコマンド（Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇモード）を使用し；それは、特製のタンパク質断片ライブラリー（ＰｅｐＸＤＢ＿５ｋ）からの全ての幾何学的に適合性の断片と、アンカーとして選択された残基のペアを接続する。Ｂｒｉｄｇｉｎｇコマンドは、ユーザーが異なるペプチド長さを選択することを可能とし；出力は、ラマチャンドランプロットにおける禁じられたファイ及びプサイ二面角を有するリンカー／接続が廃棄されるブリッジ化モデル（ｂｒｉｄｇｅｄ ｍｏｄｅｌｓ）のアンサンブルである。

【0293】

ペプチドがアンカー間の数値的位置よりも長い場合、Ｂｒｉｄｇｉｎｇは、更なるモデリングステップにおいてＦｏｌｄＸによって認識されない残基（ｒｅｓ）コードで余剰残基を再番号付けする。この理由のため、ＳＣ－ＩＬ１０設計は、二量体中の単量体タンパク質残基の数値的再編成を要求して、接続されるべき領域間の数値的１８アミノ酸長ギャップを可能とした。これは、アンカリング残基が数値的ギャップに隣接する極端な場合のために非常に重要である。その状況をカバーするために、再番号付けを行って、接続されるべき領域周辺に１８の数値的位置のギャップを作出し、これは、残基コードを使用することなく６～２０残基の範囲に及ぶ長さ断片を許容するために充分であった。１８～２０の差異は、アンカリング点が、アルゴリズムがブリッジを位置付けるために要求されるということであるが、それらは、見出されるペプチドの末端残基で置換される。Ｂｒｉｄｇｉｎｇはまた、アンカー間の全ての縁部残基をペプチドからの残基で置き換える。明確性のために、Ｂｒｉｄｇｉｎｇを使用する前に生成される鋳型を「ソーイングパターン」（ｓｅｗｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ）又は「融合」パターンと称する（例えば図３～７、図１２及び図２５～２８）。数値的ギャップは空間的ギャップではないので、Ｂｒｉｄｇｉｎｇはまた、より小さいペプチド断片を許容して、非連続的な番号付けを作出することができる。

【0294】

ソーイング／融合パターンが一旦作出されたら、接合されるべき領域の側部周辺のオーバーラップするスライドするウィンドウにおけるアンカリング点の網羅的な組合せを用いてＢｒｉｄｇｉｎｇアルゴリズムを通じてモデルを実行することにより大規模リンカースクリーニングを行った。あらゆるウィンドウを異なるペプチド長さ（６～２０ａａ）のために照会した。ブリッジ化モデルは、ＦｏｌｄＸ^３０のＲｅｐａｉｒＰＤＢコマンドを使用して修復された側鎖であり、結果的なモデルをグローバルエネルギーによりランク付けした（ＦｏｌｄＸ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙコマンド）。

【0295】

ＭｕｔＳＣ１の生成はいくつかのステップにおいて達成された：残基１２’～１７’（単量体２の残基及び原子は’により描写されることが留意される）を欠失させたが、これは、それらはＣ’末端から離れるように向いており、ｘ線結晶構造において受容体Ｒ１と接触していないためであり；及び残基１８’～１５６’を１６９～３０７として再番号付けし、単鎖分子を作出するために第１の単量体配列と接合して、ソーイング／融合パターン１を作出した。最良のアンカリング点として、本発明者らは残基１４７（Ｉｌｅ）及び１６９（Ａｓｎ）を選択し、これらを本発明者らは次に、ＰＤＢ ２ｗｙｕからの１７アミノ酸断片（残基７３～８９）を使用して接続した。選択されたブリッジセグメントの２ｗｙｕにおける元々の配列はＬＤＡＬＦＡＧＶＫＥＡ－ＦＧＧＬＤ－Ｙ（配列番号３４０）であった。残基ＬＤＡＬＦＡＧＶＫＥＡ（配列番号３４１）及び最後のＹは、野生型ＩＬ－１０構造と構造的に重なり合った。したがって、本発明者らは、新規の残基がタンパク質安定性を向上させることが予想された場合を除いて、これらの突然変異の全てを元々のＩＬ－１０配列に戻すことに決めた。この場合、安定性はＡｓｎ１６９からＴｙｒへの突然変異により向上されることが予想されたので、この突然変異を維持した。

【0296】

動態データの値の推測
細菌細胞培養上清をＨａｙｆｌｉｃｋ培地中で希釈してＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ＩＦＮ－ラムダ又はＳＣＩＬ１０ＩＬ２２濃度を調整し、ＨＥＫ－ｂｌｕｅ（商標）について記載したダイナミックレンジ（方法を参照）を包含する０．０２４３ｎｇ ｍｌ^－１～３０ｎｇ ｍｌ^－１の範囲をカバーするようにした。各々のＩＬ－１０バリアントについてのモル濃度を算出するために、（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１）において記載される合成単量体であり、そのため１８ＫＤａの分子量を有するＭｕｔＭの例外と共に、全てのＩＬ－１０バリアント（ＩＬ－１０ ＯＲＦを含む）は３６ＫＤａの分子量を有することを想定した。

【0297】

フォールディカイン－２２バリアントについても分子量は３６ＫＤａであるが、２つの活性ドメインが考慮される。ＳＣＩＬ１０ＩＬ２２について、分子量は３６ＫＤａであるが、各々のインターロイキンについて１つの活性部位が考慮される。異なるインターロイキン試験濃度に起因する６３０ｎｍでの吸光度における変化を、以下の等式を使用して飽和結合モデルにフィッティングした：
Ｙ＝Ｂ Ｍａｘ×Ｘｈ／（Ｋ_Ｄｈ＋Ｘｈ）；

【0298】

この等式において、Ｋ_Ｄは見かけの解離定数であり（細胞当たりの活性受容体の数は未知であるため）、ｈはヒル勾配であり、Ｂ Ｍａｘは飽和シグナルである。この等式は特異的結合のみを想定し；全ての非特異的シグナルをサブトラクションした。飽和シグナルに達しない場合、Ｂ Ｍａｘは各々の実験のために然るべく設定された。

【0299】

各々の条件のための２つの技術的複製物を伴う、少なくとも３つの生物学的複製物（及び最大６つの生物学的複製物）を使用した。飽和に達しない条件において、Ｋ_Ｄパラメーターを概算するためにＢｍａｘを固定した。異なる実験を独立的に分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア、Ｅｘｃｅｌ又はＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈを使用してフィッティングした。

【0300】

ＩＬ－１０発現ＣＶ８及びＷＴ Ｍ．ニューモニエ細胞の特徴付け
ＩＬ－１０発現ＷＴ及びＣＶ８細胞のために、５０μｌのストック接種物を、５ｍｌの新鮮なＨａｙｆｌｉｃｋを含有する２５ｃｍ^２組織フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、４８時間増殖させた。培養培地を次に収集し、１０，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清を更なる定量化のために－８０℃で貯蔵した。１ｍｌ ＰＢＳ中で剥がし取ることにより細胞を収集し、５分間１０，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し；ペレットを１ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁し、５分間１０，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し、上清を廃棄した。そして、ペレットを２００μｌの溶解緩衝液（４％ ＳＤＳ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ）中で脱凝集させた。生産者のプロトコールに従ってＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してタンパク質溶解液を定量化した。並行して、以前に記載したようにＥＬＩＳＡにより上清中のＩＬ－１０バリアントのレベルを定量化した。分泌能を株の各々についてバイオマス（全培養物のタンパク質含有量）に対して正規化した。２つの生物学的複製物及び２つの技術的複製物を各々のアッセイのために実行した。

【0301】

マウス実験／Ｉｎ ｖｉｖｏ実験
６～８週齢のＣ５７Ｂｌ／６雌又は雄マウス（１８～２０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、ＰＲＢＢ動物施設において病原体フリー条件下で飼育した（登録番号Ｂ９９０００７３）。動物の取扱い及び手順は、現行の欧州（Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ８６／６０９／ＥＥＣ）及び国家（Ｒｅａｌ Ｄｅｃｒｅｔｏ ５３／２０１３）の法律の他に、ＦＥＬＡＳＡ及びＡＲＲＩＶＥガイドラインに従い、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ（ＰＲＢＢ）のＡｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｃｏｍｉｔｅ ｄｅ Ｅｔｉｃａ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｃｉｏｎ Ａｎｉｍａｌ ｙ Ｂｉｏｓｅｇｕｒｉｄａｄ）の承認及び当地政府の認可を得た。

【0302】

マウスにおけるＭ．ニューモニエ肺感染症
２５ｍｌ Ｈａｙｆｌｉｃｋ液体培地を含むＴ７５ｃｍ^２フラスコ中３７℃、５％ ＣＯ_２でＭ．ニューモニエＷＴ及びＣＶ８株を培養した。３～４日のインキュベーション後（培地の色が変化した時）に、上清を除去し、細菌培養物を３回洗浄し、剥がし取り、１０ｍｌ無菌ＰＢＳ中に収集した。約０．５～１×１０^８ＣＦＵ ｍｌ^－１（約０．５～１×１０^７ＣＦＵ／マウス）を含有する１００μｌ（のＷＴ又はＣＶ８）の細菌懸濁液を、イソフルラン２％（ＩＳＯＦＬＯ、Ｃｏｖｅｇａｎ）で以前に麻酔したマウスにおける気管内（ＩＴ）感染症のために使用した。接種の２又は４日後（２又は４ｄｐｉ）に、動物を頸部脱臼により屠殺し、肺を除去し、処理した。左肺を計量し、以前^５５に記載されたように細菌負荷定量化のために無菌の個々のバッグ（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ８０、Ｓｅｗａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ）中のＰＢＳ中で１：１０（ｗｔ／ｖｏｌ）でホモジナイズした（検出限界＝０．７～０．９Ｌｏｇ_１０ＣＦＵ／肺）。（ｉ）組織病理学的分析のために右肺に５０μｌの１０％メタノール安定化ホルマリン（Ｐａｎｒｅａｃ）を吹き込み（下大動脈葉）；及び（ｉｉ）ＲＮＡ抽出のために右肺をＮ_２中で凍結し、使用まで－８０℃で貯蔵した（下葉）。対照動物に１００μｌの媒体溶液を接種し、並行して処理した。感染は株当たり少なくとも５匹のマウス（ｎ≧５）の群において行った。

【0303】

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスモデルにおけるＰ．エルギノーサＰＡＯ１の急性肺感染症
Ｐ．エルギノーサＰＡＯ１株を３７℃、５％ ＣＯ_２で１４～１６時間、ＴＳＢ寒天プレート中３７℃で増殖させた（＃ＢＤ２１１８２５、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。細菌をＰＢＳ中に収集し、懸濁液を６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）＝０．５に対して正規化した。用量－応答アッセイのために、約１×１０^５又は１×１０^６ＣＦＵ ｍｌ^－１（それぞれ約１×１０^４又は約１×１０^５ＣＦＵ／マウス）を含有する１００μｌをＩＴ感染のために使用した。接種の２４又は４８時間後（２４又は４８ｈｐｉ）に、上記される方法に従って肺を処理した。対照動物に１００μｌの媒体溶液（ＰＢＳ）を接種し、並行して処理した。感染は株当たり少なくとも５匹のマウス（ｎ≧５）の群において行った。この研究において本発明者らはシュードモナス・エルギノーサ肺感染症モデルを準備した。最適な条件を決定するために、本発明者らは用量－応答実験を行い、該実験において肺細菌負担及び炎症マーカーの遺伝子発現を感染の２４及び４８時間後（２４及び４８ｈｐｉ）に評価した（図１７）。回収された細菌負荷は４８ｈｐｉ時よりも２４ｈｐｉ時に高く、経時的な細菌クリアランスを立証した（図１７Ａ）。追加的に、１０^５ＣＦＵで感染させた肺は、分析された両方の時点において、１０^４ＣＦＵで感染させた肺よりも高い細菌負担を示した（図１７Ａ）。炎症反応は２４ｈｐｉ時に主に局在化していた（図１７Ｂ）。１０^５ＣＦＵで感染させた肺は、非感染（ＰＢＳ）又は１０^４ＣＦＵ感染群と比較して、ｔｎｆ－ａ、ｋｃ、ｍｉｐ－１ａ、ｍｃｐ－１及びｉｌ－１ｂの発現において有意な増加を示した（全てｐ＜０．０５）。

【0304】

ｉｎ ｖｉｖｏでのｈＩＬ－１０を発現するＣＶ８の免疫調節効果
ｈＩＬ－１０をコードするマイコプラズマ株の免疫調節効果を評価するために、約２×１０^６ＣＦＵ ｍｌ^－１（約１×１０^５ＣＦＵ／マウス）を含有する５０μｌのＰ．エルギノーサＰＡＯ１細菌溶液をＣ５７Ｂｌ／６マウスに気管内（ＩＴ）感染させ；２時間後に、上記される手順に従って、約２×１０^８ＣＦＵ ｍｌ^－１（約１×１０^７ＣＦＵ／マウス）を含有する５０μｌのマイコプラズマ株をマウスにＩＴ感染させた（図１９Ａ）。対照動物を並行して処理し、（ｉ）２μｇのヒトＩＬ－１０組換えタンパク質（ｈＩＬ－１０ｒ）（＃２００－１０、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、又は（ｉｉ）無菌ＰＢＳ（媒体溶液）で処理した。２４時間のＰＡＯ１感染後に、動物を屠殺し、上記される実験のために肺を無菌的に除去した。

【0305】

全肺ＲＮＡ抽出及びリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）分析
－８０℃で貯蔵していた右肺をＵｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ（ＩＫＡ）を使用してホモジナイズし、生産者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標） Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ濃度を分光光度的に測定し、試料ＲＮＡ完全性を１％アガロースゲル電気泳動により確認した。１．８～２．１の２６０ｎｍ／２８０ｎｍでの吸光度測定値の比を有するＲＮＡ試料を使用した。

【0306】

ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡ（１μｇ）から全肺細胞からの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｔａｋａｒａ）を使用することによりＰＣＲ増幅を行い、ＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で蛍光を分析した。ｇａｐｄＨ、ｔｎｆ－ａ、ｋｃ、ｍｉｐ－１ａ、ｍｃｐ－１、ｉｎｆ－ｙ、ｉｌ－１ｂ及びｎｆ－ｋｂ２検出のためのプライマーペアを示している（表４）。２^{－ΔΔＣｔ}法を使用して、内因性対照としてｇａｐｄＨを使用して各々の実験条件におけるｍＲＮＡの相対的な存在量を決定し、以下のようにＰＢＳ群において得られた値に対して正規化した：ΔＣｔ＝分析された遺伝子の平均Ｃｔ － ｇａｐｄＨの平均Ｃｔ；ΔΔＣｔ＝処置群のΔＣｔ － ＰＢＳ群のΔＣｔ；ｍＲＮＡ発現における倍数変化＝２^{－ΔΔＣｔ}。

【0307】

肺試料の組織学的及び免疫組織化学（ＩＨＣ）分析
検死後に、下大動脈葉をホルマリン（Ｐａｎｒｅａｃ）中に固定し、トリミングし、エタノール系列及びキシレン中で自動的に処理した（Ｌｅｉｃａ ＴＰ１０２０ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）。その後、組織をパラフィン中に包埋し（Ｔｅｃ２９００ Ｈｉｓｔｏ－Ｌｉｎｅ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）、４μｍに切片化し（Ｌｅｉｃａ ＲＭ２２３５ Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）、標準的な手順に従ってヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色した（Ｌｅｉｃａ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ＸＬ）。

【0308】

調製物をガラススライド上に手動でマウントし、光顕微鏡法により調べた。訓練された獣医学病理医により組織を評価した（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ Ｍａｎａｇｅｒ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ－ＩＲＢ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）。肺胞細胞浸潤物及び血管周囲－気管支周囲／細気管支周囲浸潤物を組織病理学的パラメーターとして使用し、定量的なスコアを確立し（０～５：０、なし；１、最小；２、軽度；３、中等度；４、重度；５、非常に重度）；各々の試料の最終スコアを両方のパラメーターの和により得た。ＩＨＣのために、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸを使用してマクロファージのマーカーとしてのウサギモノクローナル抗Ｆ４／８０（Ｄ２Ｓ９Ｒ）ＸＰ（＃７００７６Ｓ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）^５６、又は好中球のマーカーとしてのウサギポリクローナル抗好中球エラスターゼ（＃Ａｂ６８６７２、Ａｂｃａｍ）^５７でパラフィン包埋組織切片を染色した。染色の特異性をウサギＩｇＧアイソタイプ対照（＃Ａｂ２７４７８、Ａｂｃａｍ）での染色により確認した。２０倍対物レンズを備えたＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ－２．０ ＨＴ Ｃ９６００デジタルスキャナー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）で明視野画像を取得した。画像制御パネルにおいて１．８に設定されたガンマ補正を使用して、ＮＤＰ．ｖｉｅｗ ２ Ｕ１２３８８８－０１ソフトウェア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ， Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて全ての画像を可視化した。画像分析から得られた出力結果を陽性細胞％［％＝１００×（陽性細胞／陽性細胞＋陰性細胞）］として表した。

【0309】

統計分析
全ての場合において、統計的有意性はｐ＜０．０５に設定した。分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）統計パッケージを使用して行い、各々の図の説明文中に詳述される。

【0310】

材料
以下のセクションにおいて試験及び記載されるＩＬ－１０バリアントのリスト：
・ｈＩＬ－１０ｒ（商用のＩＬ－１０タンパク質、天然のスワップドドメイン二量体である）
・ＷＴ－ＩＬ１０／ＩＬ－１０ ＯＲＦ（細菌、例えばマイコプラズマにより発現及び分泌されるｗｔスワップドドメイン二量体ＩＬ－１０）
・ｗｔスワップドドメイン二量体ＩＬ－１０上のＭｕｔ１からＭｕｔ３への点突然変異
・操作されたペプチドリンカーがスワップ済み二量体の２つの分子のＮ及びＣ末端を２つの３Ｄドメインのうちの１つにおいて共有結合的に接合している単鎖二量体ＩＬ－１０である、ＭｕｔＳＣ１ フォールディカイン＿１０
・ＭｕｔＳＣ１と同じであるが、フォールディカイン配列の各々の半分においてＭｕｔ３の点突然変異を有する、ＭｕｔＳＣ２（ポリペプチドの第２の半分における残基１８での突然変異の例外を伴う）
・別のグループにより以前（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９）に報告されたＩＬ１０の単量体バージョンである、ＭｕｔＭ
・ＭｕｔＳＣ１＿ｌｉｎｋｅｒｃｏｎｔｒｏｌ１９は、操作された分子の機能的活性におけるリンカー組成の影響力を評価するためにＭｕｔＳＣ１の操作されたペプチドリンカーが同じ長さ（５ａａ）のポリＧｌｙリンカーにより置き換えられているフォールディカインである。
・ＭｕｔＳＣ１＿ｃｏｎｔｒｏｌｃｅｎｔｅｒ２１は、新規Ｎ及びＣ末端が２つのフォールディカインドメインをブリッジするリンカーのうちの１つにおける切断（位置Ａｓｎ１６６）により生成されたＭｕｔＳＣ１に基づく対照構築物である。単鎖を保つために、ＭｕｔＳＣ１のフォールディカインドメインのうちの１つにおいて元々のＮ及びＣ末端をブリッジするために使用されるリンカー配列を使用して元々のスワップドドメイン構造中に存在する２つの元々のＮ及びＣ末端をブリッジした。この構築物は、３Ｄドメインのペアが２つではなく１つのリンカー配列のみによりブリッジされるようにＭｕｔＳＣ１ フォールディカインの２つの中央リンカーのうちの１つのみを有することの影響力を評価するために使用される。
・ＭｕｔＩＬ１０＿ｐｏｌｙｇｌｙは、報告されたように、１つのＩＬ－１０単量体配列のＮ末端が１３残基ポリＧｌｙリンカーで他のＩＬ－１０単量体配列のＣ末端に連結されている二量体ＩＬ－１０の単鎖バージョンを表す（Ｍｉｎｓｈａｗｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２０；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．０１７９４）。

【0311】

Ｍ．ニューモニエはジスルフィドブリッジを有する機能的なＩＬ－１０二量体を分泌する
本発明者らは最初に、Ｍ．ニューモニエが複雑な分子、例えば２つのジスルフィドブリッジを有するヒトＩＬ－１０スワップ済み二量体を活発に発現できるかどうかを試験した。このために、本発明者らは、Ｍ．ニューモニエについて以前^５８に記載されたｍｐｎ１４２分泌シグナルに融合されたヒトＩＬ－１０をクローニングした。

【0312】

本発明者らはＥＬＩＳＡにより、Ｍ．ニューモニエＷＴ株は、４８時間の培養後に、約２ｆｇ／細胞の濃度で、上清中にＩＬ－１０を発現したことを示した（１×１０^９細胞の培養物からの２μｇと同等；表５）。本発明者らは質量分析（ＭＳ）により、両方のジスルフィドブリッジが、発現されたｈＩＬ－１０中に生成されたことを確認し（表２）、二量体が正確にフォールディングしたことが指し示された。本発明者らは次に、一次血液、４人の独立した健常な血液ドナーから単離されたＣＤ１４^＋単球を使用して、（ｉ）ヒト一次マクロファージ抗炎症反応活性化プログラムをモジュレートし、及び（ｉｉ）ＳＴＡＴ３のＴｙｒ７０５のリン酸化により活性化される^３５能力について、産生されたＩＬ－１０の機能性を試験した（方法）。

【0313】

野生型（ＷＴ）ＩＬ－１０を発現するＭ．ニューモニエを２日間増殖させ、上清を約１００万個の循環性単球を含有する細胞培養物に加えた（１：５の比）。陽性対照として、ヒトＩＬ－１０組換えタンパク質（ｈＩＬ－１０ｒ）を２０ｎｇ ｍｌ^－１の濃度で加えた。予想されたように、単球の商用ｈＩＬ－１０ｒ処理は、処理されていない細胞と比較して、抗炎症マーカー（即ち、ＣＤ１６、ＣＤ１６３及びＭｅｒＴＫ）の発現を増強し、並びに不可欠な炎症促進性受容体（即ち、ＣＤ８６及びＭＨＣ２）（図９Ａ）^{３６，３７}の発現を減少させた。顕著なことに、Ｍ．ニューモニエにより産生されたＩＬ－１０（ＷＴ＿ＩＬ－１０ ＯＲＦ）を使用した結果は、ｈＩＬ－１０ｒを使用した場合と同等であった（図９Ｂ）。ウエスタンブロットにより、本発明者らは、ＩＬ－１０又はｈＩＬ－１０ｒを発現するＭ．ニューモニエの上清への新たに単離された単球の２４時間の曝露後にＳＴＡＴ３中のＴｙｒ７０５のリン酸化を観察した（図９Ｃ）。合わせると、これらの結果は、Ｍ．ニューモニエは機能的なヒトＩＬ－１０を発現できることを実証した。

【0314】

真核細胞におけるＭｕｔＳＣ２の発現及び真核細胞からのＭｕｔＳＣ２の分泌
真核細胞におけるＭｕｔＳＣ２の発現のために、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を選択した。

【0315】

Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞は、２９３Ｆ細胞株に由来するヒト細胞である。それらは、懸濁培養において維持され、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地中で高密度まで増殖される。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞は、高度にトランスフェクション可能であり、一過性のタンパク質発現において標準的な２９３細胞株と比較して優れたタンパク質収率を生成する。

【0316】

発現のために、精製されたＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆヒト細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へのトランスフェクションを行った。

【0317】

分泌されたＭｕｔＳＣ２タンパク質を同定するために、細胞をトランスフェクションの３日後に採取し、ＭｕｔＳＣ２含有上清を１３，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。ＭｕｔＳＣ２タンパク質を自動化された高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ；Ａｋｔａ ａｖａｎｔ）においてＨｉｔｒａｐ－Ｎｉカラム中で精製し、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルターユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じて濃縮し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、－８０℃で貯蔵した。

【0318】

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるＭｕｔＳＣ１の発現及び大腸菌からのＭｕｔＳＣ１の分泌
それぞれＩＬ－１０ ＷＴ、ＭｕｔＳＣ１、又はＭｕｔＳＣ１－ｈｉｓタグをコードする３つのｐＣｏｏｆｙベクターバリアント（ＫａｎＲ）を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。各々のベクターバリアントで形質転換された１つのコロニーを摘み取り、カナマイシンを補充したＬＢ中３７℃で終夜増殖させた。培養密度が約０．５ＯＤに達したら、培養物を室温まで冷却した。

【0319】

培養物から、１ｍｌをＬＢプレート中でのＣＦＵカウンティングのために使用し；４ｍｌの培養物を０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、終夜２０℃でインキュベートした。培養物を次に３，５００ｇで２０分間遠心分離し、上清をＥＬＩＳＡ定量化のために収集した。細胞ペレットを３００μｌのＭ－ＰＥＲタンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で再懸濁した。ｈｕｍａｎ ｄｅｌｕｘｅ ＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＩＬ－１０定量化を行い、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ１０レポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用してＩＬ－１０バリアントの機能性をチェックした。

【0320】

ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）におけるＭｕｔＳＣ１の発現及びラクトコッカス・ラクチスからのＭｕｔＳＣ１の分泌
ラクトコッカス・ラクチスの株（ＮＺ９０００ － ｐｅｐＮ：：ｎｉｓＲＫ；）及び形質転換ベクター（ｐＮＺ８１２４）はＭｏｂｉＴｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。生産者により指し示されるように細胞を増殖させた。

【0321】

エレクトロポレーションのために、ＩＬ－１０ ＷＴ又はＭｕｔＳＣ１をコードするＰＮＺ８１２４ベクター２００ｎｇで４０μｌの細胞を形質転換した。エレクトロポレーションの設定は、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒにおいて２，０００Ｖ、２５μＦ、２００Ωに設定した。次に、１ｍｌのＧ／Ｌ－Ｍ１７Ｂ ＋ ２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ＋ ２ｍＭ ＣａＣｌ_２を加えた。キュベットを５分間氷上に保ち、１～１．５時間３０℃でインキュベートし、１００μｌの培養物を２日間、グルコース及び１０ｎｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＭ１７寒天上にプレーティングした。

【0322】

異なるタンパク質の発現のために、５ｍｌの培養物を終夜３０℃で増殖させ、培養物のＯＤを０．４に調整した。１ｎｇ／ｍｌナイシン（ストック：０．０５％酢酸中の１ｍｇ／ｍｌナイシン、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で９ｍｌの培養物の誘導を行い、３時間インキュベートした。細胞を遠心分離により収集し、上清中の発現されたサイトカイン／フォールディカインをＥＬＩＳＡにより直接的に定量化した。細胞ペレットを３００μｌのＭ－ＰＥＲ抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解させた。細胞の段階希釈液を細菌増殖培地プレート上にＣＦＵカウントのためにプレーティングした。

【0323】

受容体親和性の増加のためのＩＬ－１０の操作
他の細菌と比較したＭ．ニューモニエにおけるより低いタンパク質製造能力という潜在的な問題^２２の制限を克服するために、及び患者に投与されるＭ．ニューモニエの数を有益に減少できるようにするために、本発明者らは、それぞれ高及び低親和性受容体Ｒ１及びＲ２に対する増加した結合親和性を有するＩＬ－１０における突然変異を設計することを提案した。Ｒ１に対する増加した親和性を有するＩＬ－１０バージョンを生成するために、本発明者らは、良好な結晶分解能を有するＲ１との複合体中で結晶化されたｈＩＬ－１０のｘ線結晶構造（ＰＤＢ １ｙ６ｋ；２．５Å）を研究した。

【0324】

本発明者らは次に、全てのＲ１接触ＩＬ－１０アミノ酸を他の１９個の天然アミノ酸の各々に個々に突然変異させるＰｏｓｉｔｉｏｎＳｃａｎ ＦｏｌｄＸコマンドを使用して複合体インターフェース残基のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発スキャニングを行った^３１。異なる種にわたる配列保存に関するこの分析に基づいて（図１５）、本発明者らは、突然変異され、及びＦｏｌｄＸソフトウェアプログラムを使用してモデル化された場合に、タンパク質安定性を劣化させることなくＲ１に対する結合を向上させた（表６）保存されていない残基のセット（例えば表１を参照）を同定した。選択された突然変異を使用して、本発明者らは、ＩＬ－１０の３１位がＳｅｒからそれぞれＬｙｓ又はＡｒｇに変化された２つの複数の突然変異体（Ｍｕｔ１（配列番号６）及びＭｕｔ２（配列番号７）をモデル化した（図１０）。本発明者らは、ＩＬ－１０アポ形態（ＰＤＢ ２ｉｌｋ；１．６Å）又はより低い分解能でのＲ１とのＩＬ－１０ホロ形態（ＰＤＢ １ｊ７ｖ、２．９Å）の他の構造においてそれらをモデル化することにより突然変異が使用された構造から独立していることを更にチェックした（表６）。

【0325】

この研究の開始時に、Ｒ２に結合したＩＬ－１０について利用可能な構造はなかった。したがって、本発明者らは、ＩＬ－１０とＲ２との間の相互作用の親和性を潜在的に増強することが以前に報告されているＩＬ－１０の追加の突然変異（例えば、Ｎ１８Ｉ、Ｎ９２Ｉ及びＫ９９Ｎ）^９とＭｕｔ２突然変異を組み合わせて、Ｍｕｔ３（配列番号８）を得た。ここで使用された全てのＩＬ－１０構造においてこれらの３つの突然変異をモデル化した場合、本発明者らは、それらはＩＬ－１０の安定性を減少させることを見出した（表６）。かなり最近になって、ＩＬ－１０とＲ１／Ｒ２との間の複合体の低分解能構造（６×９３；３．５Å）が利用可能となった^１０。これらの突然変異をモデル化するためにこの構造を使用して、本発明者らは、ＩＬ－１０の安定性における増加及びＲ２に対する予測される結合エネルギーにおける増加を実際に観察した（表６）。この増加は、Ｒ２と相互作用するＩＬ－１０領域における局所的なコンホメーション変化により説明され得る（図１６）。

【0326】

そして、本発明者らは、突然変異体Ｍｕｔ１～３及びＭｕｔＭ（ＩＬ－１０の以前に記載された単量体形態^２５）（表１）を生成し；これらをＭ．ニューモニエにクローニングした（突然変異位置及び構造における相互作用の概要について図１０を参照）。

【0327】

設計された複数の突然変異体についての見かけのＫ_Ｄ値の測定
異なるＩＬ－１０バリアントの相対的な親和性を評価するために、本発明者らは、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターを含有するレポーター細胞株（ＨＥＫ－ｂｌｕｅ（商標））を使用し、ＳＥＡＰレポーターは、ＩＬ－１０がＲ１及びＲ２に結合した場合に、ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３媒介性応答をトリガーして、６３０ｎｍでの吸光度により測定され得るＳＥＡＰ発現を結果としてもたらす。飽和前のシグナルの強度はＳＴＡＴ３の活性化に比例しており、動態モデル^３８は、見かけのＫ_Ｄ値を得るためにデータにフィッティングされ得る（方法を参照）。

【0328】

突然変異体Ｍｕｔ１及びＭｕｔ２（Ｒ１により良好に結合するように設計されている）は、類似した見かけのＫ_Ｄ値（それぞれ１．４５ｅ－^１０Ｍ及び６．４５ｅ－^１１Ｍ）を有したが、ＩＬ－１０ ＯＲＦ（１．９８ｅ－^１０Ｍ）よりも良好であり、それぞれ１．４倍及び３．０倍の増強を呈した。Ｍｕｔ２に基づき、及びＲ２結合を助長する突然変異を組み込んだＭｕｔ３は、８倍のＩＬ－１０－ＯＲＦと比較したＫ_Ｄ（２．６１ｅ－^１１Ｍ）における見かけの増加を結果としてもたらした（図１１Ａ）。本発明者らは、以前に記載されたように^２５、単量体ＩＬ－１０（ＭｕｔＭ）の見かけのＫ_ＤはＩＬ－１０ ＯＲＦの場合よりも低いことを確認した（図１１Ａ及び表７）。最良の突然変異体（Ｍｕｔ３）及びＩＬ－１０ ＯＲＦの発現レベルは類似していた（図１１Ｂ）。

【0329】

単鎖ＩＬ－１０の合理的な設計
最も高い可能な量／割合のＩＬ－１０活性形態を得るために、本発明者らは、分解、ミスフォールディング、及び／又は大規模な多量体化に起因する発現されたタンパク質の潜在的な隔離を最小化する必要があった（２７）。これを達成するために、１つの単量体のＮ末端領域をスワップ済み二量体（ＭｕｔＳＣ１）中の他の単量体のＣ末端領域に連結した（図１２Ａ）。アンカリング点としてＡｓｎ１８及びＬｙｓ１５７を使用したＭｏｄｅｌＸ Ｂｒｉｄｇｉｎｇサーチ（方法）後に、本発明者らは、側鎖修復された５４１個のモデルを得；ＦｏｌｄＸｖ５（３０）を使用してエネルギーによりこれらをランク付けした。最良のリンカー配列はＮ１５７－ＦＧＧＬＤ－Ｙ１８（配列番号３１６）であることが次に決定され、これは、Ａｓｎ１８がＴｙｒにより、及びＬｙｓ１５７がＡｓｎにより置き換えられており、並びにＦＧＧＬＤ配列（配列番号３４２）が挿入されたものであった。このリンカーを導入することにより、本発明者らは、結晶構造中の２つの単量体のうちの１つにおいてＮ末端残基（残基１２～１７；ＣＴＨＦＰＧ）を欠失させた。その後、本発明者らは、Ｒ１に対する結合を向上させるためにＮ１５７の後のＰｈｅ残基をＡｓｎに突然変異させ（これは、挿入される配列としてのＮＧＧＬＤを結果としてもたらす；図１２Ａ）（配列番号３１８）；これは、ＳＣ分子の全体的な安定性の他に、Ｒ１に対するその結合を向上させた（表６）。本発明者らは次に、配列を再番号付けした。Ｃｙｓ１２を含有する単量体のうちの１つのＮ末端配列が欠失された（それは、元々のＩＬ－１０ ＯＲＦ配列（新規の残基２５９が欠失されている）においてＣｙｓ１０８とジスルフィドブリッジを形成する）ので、本発明者らは、Ｃｙｓ１０８をＡｓｎに突然変異させて、潜在的な偽性ジスルフィドブリッジの形成を予防した。Ｃｙｓ１２及びＣｙｓ１０８は、スワップ済み二量体の他の単量体と構造的に同等のままであった。Ｍｕｔ３突然変異をＭｕｔＳＣ１にグラフトすることによりＭｕｔＳＣ２を設計した（図１２Ｂ）。

【0330】

結果的なポリペプチドは、単鎖分子の全体的な安定性の他に、Ｒ１に対するその結合の向上を呈した（表６）。これはＭｕｔＳＣ１を結果としてもたらした（表１）。Ｍｕｔ３突然変異をＭｕｔＳＣ１にグラフトすることによりＭｕｔＳＣ２を設計した（図１２Ｂ）。

【0331】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの操作されたＩＬ－１０突然変異体の特徴付け
かなり重要なことに、ＭｕｔＳＣ２は、スワップ済み二量体中の最良の複数の突然変異体（Ｍｕｔ３）よりも良好な見かけのＫ_Ｄを有した。ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２の活性におけるリンカー配列の重要性を決定するために、本発明者らは、リンカー配列Ｎ－ＮＧＧＬＤ－ＹをポリＧｌｙリンカー配列Ｎ－ＧＧＧＧＧ－Ｙで置き換えた（ＭｕｔＳＣ１＿ｃｏｎｔｒｏｌＧｌｙ）。新規の対照突然変異体ＭｕｔＳＣ１＿ｃｏｎｔｒｏｌＧｌｙは、活性における非常に顕著な減少を有し、短いリンカーが、特定の配列（図１１Ｃ）、及び潜在的に、特に有益な構造的コンホメーションを作出する配列、例えば、フォールディングした二量体構造にコンホメーション安定性を付与し得る配列を有することが重要であることを指し示した。

【0332】

ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２の見かけのＫ_Ｄにおけるこの向上が、アッセイにおいて使用された細胞タイプに特異的であったかどうかに取り組むために、本発明者らは、２つの異なる免疫細胞株：ヒト単球細胞株、ＴＨＰ１、及びマウスＢ細胞株、ＨＡＦＴＬにおいてその活性化を介するＩＬ－１０シグナル伝達（ウエスタンブロットにより示される）を評価した。両方の場合において、ＩＬ－１０ ＯＲＦ、ＭｕｔＳＣ１、及びＭｕｔＳＣ２の類似したモル濃度を使用した場合、ＷＴ ＩＬ－１０ ＯＲＦと比較して２つのＳＣ突然変異体について有意により高い活性化が観察された（図１１Ｄ）。

【0333】

見かけのＫ_Ｄの定量的な概算を得るために、本発明者らは、マウスＨＡＦＴＬ及びヒトＢＬａＥＲ１（Ｂ細胞前駆体白血病細胞株）を使用して、２つの異なる細胞株におけるＦＡＣＳによりリガンド刺激でのＳＴＡＴ３リン酸化を評価した。ＩＬ－１０ ＯＲＦと比較して、ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２突然変異体の両方は、ｐ－ＳＴＡＴ３の活性化において有意に優れていた（図１１Ｅ及びＦ）。以上を合わせると、操作された突然変異体ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２は、ヒト及びマウス起源の異なる細胞タイプにおいて親和性及び最大活性の増強を結果としてもたらした。ＨＥＫｂｌｕｅ細胞の場合と同様に、ＭｕｔＳＣ２はＭｕｔＳＣ１よりも約２倍良好であった。

【0334】

全体として、これらの結果は、マイコプラズマにより産生されるＩＬ－１０スワップ済みホモ二量体はアンフォールディングした単量体及び活性二量体形態の混合物であるという概念をサポートした。そのため、スワップ済み二量体を単鎖分子に変換すること（例えば図３）は、分泌されるタンパク質だけでなく、（より重要なことに）分泌される活性タンパク質の細菌中の量を増加させるための有効な戦略である。

【0335】

ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＶ８シャーシ株の特徴付け
Ｍ．ニューモニエは、マウスの肺において炎症反応を誘導することが示されている^{１７，３９}。この応答を調べるために、本発明者らは、ヌクレアーゼＭＰＮ１３３（ｍｐｎ１３３^４０）及びＣＡＲＤＳ毒素（ｍｐｎ３７２）^４１が欠失されており、並びにグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼＧｌｐＤ（ｍｐｎ０５１）^４２が、類似した代謝活性を有するがＨ_２０_２ではなくＨ_２０を産生する酵素であるＧｐｓＡにより置き換えられている（方法を参照）、本明細書においてシャーシＣＶ８（欧州特許出願公開第２０３８２２０７．７号明細書）として参照される、Ｍ．ニューモニエの弱毒化株を操作した。

【0336】

ＣＶ８の病原性を気管内肺感染症のマウスモデルにおいて試験した（図１３）。類似した細菌負荷が、分析した両方の時点においてＷＴ及びＣＶ８株について観察され（図１３Ａ）、病原性因子の欠失はマイコプラズマ株の定着能を低下させないことを示唆した。肺炎症プロファイルをＲＴ－ｑＰＣＲ（図１３Ｂ）により接種の２日後（２ｄｐｉ）に分析し；顕著なことに、この時点において、本発明者らは、細菌負荷は依然として有意であるが、炎症反応のために充分な時間があることを以前に示した^５８。感染されていない対照群（ＰＢＳを使用した）と比較して、ＷＴ株は、ｔｎｆ－ａ、ｋｃ、ｍｉｐ－１ａ、ｍｃｐ－１及びｉｌ－１ｂの発現を増加させた（全てｐ＜０．０５）（図１３Ｂ及び表８）。ＣＶ８の場合、ｍｉｐ－１ａの発現のみがＰＢＳ対照と比較して有意に変化したが（ｐ＜０．０５）、依然としてＷＴ株におけるよりも低いレベルのままであった。

【0337】

シャーシの弱毒化を確認するために、本発明者らは肺における組織学的所見を分析した（図１３Ｃ）。ＷＴ株は、ＰＢＳ対照と比較して、２及び４ｄｐｉの両方において、肺胞及び気管支周囲／細気管支周囲浸潤物の存在を促進した（両方についてｐ＜０．０５）。ＣＶ８感染肺においても、本発明者らは気管支周囲／細気管支周囲浸潤物を観察したが、分析した両方の時点においてＷＴ株について観察されたよりも低いレベルであった（両方ともｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＣＶ８の弱毒化された表現型と合致した。本発明者らはしたがって、ＣＶ８＿ＩＬ－１０ ＯＲＦ、ＣＶ８＿ＭｕｔＳＣ１及びＣＶ８＿ＭｕｔＳＣ２を生成してｉｎ ｖｉｖｏでそれらの免疫調節効果を試験した。決定的なことに、本発明者らは、ＷＴ若しくはＣＶ８株による機能的なＩＬ－１０ ＯＲＦの産生（図１３Ｃ）においても、ＷＴ株と比較した分泌される突然変異体のいずれかの活性（図１３Ｄ）においても、有意差を観察しなかった。

【0338】

操作されたＩＬ－１０バリアントはｉｎ ｖｉｖｏで強力な免疫調節効果を呈する
本発明者らは、この研究において生成されたＩＬ－１０バリアントの下方調節特性を研究するためのｉｎ ｖｉｖｏツールとしてシュードモナス・エルギノーサＰＡＯ１感染モデルを開発及び使用した（方法を参照）（図１７）。

【0339】

ＣＶ８シャーシにより発現される操作されたＩＬ－１０突然変異体の抗炎症特性を試験するために、本発明者らは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１×１０^５ＣＦＵのＰＡＯ１株を感染させ、２時間後に、１×１０^７ＣＦＵのマイコプラズマ株（ＣＶ８、ＣＶ８＿ＩＬ－１０ ＯＲＦ、ＣＶ８＿ＭｕｔＳＣ１又はＣＶ８＿ＭｕｔＳＣ２）を感染させた。対照マウスにはＰＢＳ（陰性対照として）又は２μｇのｈＩＬ－１０ｒ（陽性対照として）を与えた（図１４Ａ）。

【0340】

最初に、本発明者らは、ＰＡＯ１及びマイコプラズマの肺細菌カウントを分析した（図１４Ｂ）。有意差は、分析した群の間で２４ｈｐｉにおいて観察されず、炎症性遺伝子の発現における差異が肺において存在する細菌負荷によりバイアスされたことは除外された。

【0341】

本発明者らは次に炎症プロファイルを分析した（図１４Ｃ、図１４Ｄ）。実際に、ＰＡＯ１による感染は、炎症マーカーの発現における有意な増加を結果としてもたらした。ＣＶ８株に関して、本発明者らは、単独で使用された場合の軽微な炎症反応を見ることができ（図１４Ｃ）、これはＰＡＯ１＋ＣＶ８のジョイント投与を行った場合に付加的であった（図１４Ｃ、図１４Ｄ）。ＰＡＯ１により感染されたマウスへの２μｇのｈＩＬ１０ｒタンパク質の投与（ＰＡＯ１＋ｈＩＬ－１０ｒ）は、ｔｎｆ－ａ及びｍｉｐ－１ａの発現を有意に低減させ（両方ともｐ＜０．０１）、ｍｃｐ－１（ｐ＝０．１）、ｉｎｆ－ｙ（ｐ＝０．０８）及びｉｌ－１β（ｐ＝０．０６）について類似した傾向を有した（図１４Ｃ、図１４Ｄ）。ｈＩＬ－１０ｒ処置群について観察された結果とは対照的に、ＩＬ－１０ ＷＴをコードするＣＶ８（ＣＶ８＿ＩＬ－１０ ＯＲＦ）は、分析された炎症マーカーの発現を有意にモジュレートしなかった（図１４Ｃ、図１４Ｄ）。ＣＶ８＿ＭｕｔＳＣ１又はＣＶ８＿ＭｕｔＳＣ２の接種は炎症マーカーの発現を低減させた（図１４Ｃ）。本発明者らがｉｎ ｖｉｔｒｏで観察したものとは対照的に、ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２の特性はｉｎ ｖｉｖｏで異なり、ＭｕｔＳＣ１はより有効な候補であることが証明された（図１４Ｃ、図１４Ｄ）。ＣＶ８株により発現されるＭｕｔＳＣ１の効果は、２μｇのｈＩＬ－１０ｒの投与と同等であるか、又はより良好でもあった。

【0342】

顕著なことに、感染した肺の組織病理学的分析において、本発明者らは、分析された組織パラメーターにおける大きな差異を観察しなかった（表９）。本発明者らは、以前に記載されたように^４３、ＰＡＯ１に感染した全ての群において好中球優位（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ；ＰＭＮ）と共に重要な細胞浸潤物を観察した（図１４Ｅ、図１４Ｆ）。本発明者らは、ＰＡＯ１＋ＰＢＳ群と比較して、ＭｕｔＳＣ１で処置された動物の細胞浸潤物におけるＰＭＮの数における有意な減少、及びＭｕｔＳＣ２を用いた場合の減少（但し有意でなかった）を見出した（図１４Ｅ、図１４Ｆ）。

【0343】

要約すると、設計されたＩＬ－１０バリアントとのＭ．ニューモニエＣＶ８シャーシの組合せは、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫調節潜在能力を示し、ＭｕｔＳＣ１は最も有望な候補であった。

【0344】

考察
異なる病理、例えば炎症性腸疾患、アレルギー性喘息、及び固形腫瘍の処置のためのヒトにおけるＩＬ－１０の全身投与は、異なる臨床試験において試験されているが、異なる問題に起因してこれらの患者の臨床アウトカムにおいて失敗している^４。制限は、標的化された組織におけるＩＬ－１０の低い濃度、又はＩＬ－１０が所望される抗炎症効果を有するが全身毒性を回避するために要求される精密な組織位置を含む。

【0345】

ＩＬ－１０をコードする生きたバイオ医薬品製造物を使用することは、標的化された組織においてＩＬ－１０の局所的な濃度を増加させるための有効な戦略であり得るが、これは、該使用は、その作用が完了した時に抗生物質を用いて除去することが容易な薬物工場としての極小の、自己複製性最小マシンを本質的に提供するからである。ｉｎ ｓｉｔｕでのＩＬ－１０の局所送達に依拠する戦略は、臨床試験におけるある程度の予備的な有望な結果と共に、一部の細菌、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）におけるＬ．ラクチス又はビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）について探索されている^{４４，４５}。しかしながら、細菌によるヒトタンパク質の送達はまた、分泌された分子のフォールディング可能性、ジスルフィドブリッジを作る必要性及び／又は機能的なタンパク質となるために二量体（若しくはより高次のオリゴマー）を形成する必要性により妨害され得る。これは、２つのジスルフィドブリッジを有するスワップ済みホモ二量体タンパク質であるＩＬ－１０の場合に該当する。

【0346】

この研究において、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏで細菌により発現された場合にその発現及び有効性を最適化するためにヒトＩＬ－１０を操作した。最終目的は、ＩＬ－１０の抗炎症特性を保持しながら患者に投与される細菌用量を低減させることにより、起こり得る細菌病原性を減少させることであった。本発明者らの操作されたＩＬ－１０分子（「フォールディカイン」）の向上された特性を示すために、本発明者らは標的臓器として肺を選択した。この選択は、ＩＬ－１０の外因性送達は異なる肺疾患を寛解させることを示す報告^{１４，１５，４６}に基づいて、及び、肺は、その低減されたマイクロバイオームサイズに起因して、腸よりも難しい臓器であること^２８を理由として、為された。

【0347】

本研究で、本発明者らは、ヒト肺細菌Ｍ．ニューモニエは、ヒトＩＬ－１０組換えタンパク質（ｈＩＬ－１０ｒ）の場合と同等の活性を示す、ジスルフィドブリッジを有する機能的なＩＬ－１０を分泌できることを実証した。

【0348】

非病原性細菌によるものであったとしても肺の感染症は炎症反応をトリガーし得るため、使用される細菌は少なければ少ないほど良い。Ｍ．ニューモニエは限定されたタンパク質合成能を有するので、療法のために肺に適用される用量を減少させる１つの方法は、分泌される分子の活性を増加させることである。これは、ＩＬ－１０のその受容体に対する親和性を増加させること、並びに／又はその安定性及びフォールディング可能性を向上させることにより行われ得る^９，２９。

【0349】

本研究で本発明者らは、知的設計、ソフトウェアアルゴリズム（ＭｏｄｅｌＸ、ＦｏｌｄＸ）及び（例えばＭｕｔ３中に存在する設計された突然変異についての）文献からのデータの組合せの他に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有意により良好な見かけのＫ_Ｄを呈し、突然変異の別々に有益なセットの組合せを含めた場合（例えばフォールディカイン ＭｕｔＳＣ２）によりいっそう良好な見かけのＫ_Ｄを呈した、Ｎ及びＣ末端を連結した単鎖突然変異体（フォールディカイン ＭｕｔＳＣ１）を使用して、複数の突然変異体サイトカイン、例えば（本明細書に記載されるような）ＩＬ－１０及びＩＬ－２２バリアントを操作した。更に、ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２ フォールディカインは、ＩＬ－１０ ＯＲＦ又はＭｕｔ３よりも約４倍高いレベルで発現された。より高い発現及びより良好な見かけのＫ_Ｄを組み合わせて、ＭｕｔＳＣ２を発現するＷＴマイコプラズマ株は、ＩＬ－１０ ＯＲＦ株よりもｉｎ ｖｉｔｒｏで相対的に約６０倍高い活性を有する。

【0350】

これと合致して、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－１０ ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２を発現するＣＶ８株は、ＩＬ－１０ ＯＲＦを発現するＣＶ８又は２μｇのｈＩＬ－１０ｒタンパク質の投与と比較して、Ｐ．エルギノーサ感染症での炎症に対して有意な下方調節効果を示した。しかしながら、本発明者らは、ＭｕｔＳＣ２はｉｎ ｖｉｔｒｏで一部のアッセイにおいてＭｕｔＳＣ１よりも良好な成績であることを観察したが、ｉｎ ｖｉｖｏで反対の傾向が見られる。これは、２つの突然変異体の間の見かけのＫ_Ｄにおける小さい差異（約２倍）、又はより高い可能性として、本研究で操作された突然変異は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが行われたマウスＲ１受容体と比較して一部のＩＬ－１０相互作用位置において異なるヒトＲ１受容体を使用して設計されたという事実に起因し得る。

【0351】

二量体３Ｄ構造を有する単鎖分子は、細菌により分泌された場合に機能的タンパク質における増加を結果としてもたらすだけでなく、それらは、非対称分子が特異的細胞タイプ標的化のために設計されることを可能にする。これは、単一の分子の２つの相互作用表面の各々を別々に構造的に設計することにより新規の単鎖バリアントを設計する場合に考慮に入れられ得る。

【0352】

合わせると、本発明者らは、感染症の文脈において炎症反応を下方調節する肺組織における最適化されたサイトカイン（例えばＩＬ－１０）の細菌によるカーゴ送達のための生きたバイオ医薬品シャーシを生成し、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの有効なサイトカイン送達に関する以前の制約を除去し、及び臨床試験成功のための道を開いた。

【0353】

適切な配列及び構造修飾により、ＩＬ－１０及びＩＬ－２２ フォールディカインについて上記で実証されたフォールディカイン概念は、本明細書の他の箇所に記載されるような多くの他のサイトカイン、例えば（Ａ）長鎖ヘリックス型（ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ、及びＣＳＦ３）又は短鎖ヘリックス型（ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１３、ＩＬ１５及びＩＬ２１、ＴＳＬＰ、ＣＳＦ１及びＣＳＦ２）にサブクラス分けされ得るクラスＩヘリックス型サイトカイン；並びに（Ｂ）ＩＬ１０様サイトカイン（ＩＬ１０、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２４、ＩＬ２６、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、及びＩＬ２９）、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）及びＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１）を含む、クラスＩＩサイトカインに応用可能であることが想定される。

【0354】

【表1】

【0355】

【表2】

【0356】

表１．この表は、本開示において生成された様々な構築物の他に、異なる構築物が実行された株を記載する。遺伝子構築物の各々について、本発明者らはアミノ酸又はヌクレオチド配列を含めた。ＩＬ－１０バリアントのリストをこの研究において分析した。参照分子は、出発バックグラウンドスキャフォールドとしての操作されていないＷＴ ＩＬ－１０である。突然変異体１ （Ｍｕｔ１）、２ （Ｍｕｔ２）、及び３ （Ｍｕｔ３）について、列記される突然変異された残基の位置及び鎖はＰＤＢ番号付けに対応する。Ｌ鎖はＩＬ－１０を保持する。バリアントＭｕｔＳＣ１、ＭｕｔＳＣ２は、この研究において生成された単鎖分子（「フォールディカイン」）である。ＭｕｔＳＣ２は、ＭｕｔＳＣ１に基づき、Ｍｕｔ３に示される点突然変異を組み込んでいる。その位置の突然変異が、単一の分子を作製するために操作されたループと適合性でなかった１８位を除いて、２つの同一のドメインがマージされているため、ＭｕｔＳＣ２中の突然変異は重複している。

【0357】

【表3】

【0358】

【表4】

【0359】

表２Ａ及び２Ｂ．選択されたマイコプラズマ株（ジスルフィドブリッジの同定のためのＭ．ニューモニエＷＴにより発現されるＷＴ ＩＬ－１０及びＭｕｔＳＣ２）の上清のプロテオミクス分析。３つの異なる消化手順を使用したプロテオミクス施設において従われたプロトコールの詳細は方法セクションに記載されている： 表２Ａ － スルフィドＷＴ ＩＬ－１０、及び表２Ｂ － スルフィドＭｕｔＳＣ２。それらの各々において、本発明者らは、消化後に見出された異なるペプチド及び見出された場合にそれらの可能な化学修飾を示した。カルバミドメチルの存在は、ペプチドシステインがジスルフィドブリッジの部分であることを含意する。表２Ａ中のペプチド配列は上から下へそれぞれ配列番号１９～２８であり；表２Ｂ中のペプチド配列は上から下へ配列番号２７、２７、２８、２８、２０、２１、２９～３２、及び２２である。角括弧中に指し示されるアミノ酸残基はペプチド配列の部分を形成する。ＬｙｓＣプロテアーゼで消化されたＬｙｓＣ。キモトリプシンで消化されたＣｈｙｍ。ＧｌｕＣプロテアーゼで消化されたＧｌｕＣ。トリプシンで消化されたＴｒｙｐ。２つの名称が一緒に現れる場合、それは両方のプロテアーゼが使用されたことを意味する。同等のプロテオミクス分析をスルフィドＭｕｔＳＣ１のために行ったところ、潜在的なジスルフィドブリッジシステイン残基が位置Ｃｙｓ１２及びＣｙｓ６２において同定された（データ示さず）。

【0360】

【表5】

【0361】

表３．この研究において使用された抗体のリスト。それらの各々について、本発明者らはクローンの説明及び供給業者を含めている。

【0362】

【表6】

【0363】

表４．この研究において使用されたプライマーのリスト。それらの各々について、本発明者らは、方向性、配列、ソース参考文献を含めており、及び存在する任意の化学修飾を示している（＊：ホスホロチオエート化された塩基、ＢｔｎＴｇ：ビオチン化された５’末端）。

【0364】

【表7】

【0365】

表５．異なる生物学的複製物（Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４）にわたるＷＴ及びバリアント（ＩＬ－１０ ＯＲＦ、Ｍｕｔ３、及びＭｕｔＳＣ１）の細胞（Ｍ．ニューモニエＷＴ）当たりのＩＬ－１０タンパク質分泌能。それらの各々について、本発明者らは、各々のフラスコについてカウントされたコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、ＥＬＩＳＡにより上清の各々について概算されたＩＬ－１０濃度を統合した（方法を参照）。本発明者らは、Ｒ２における細胞当たりのＭｕｔＳＣ１発現（ｆｇ／ＣＦＵ）を参照として選択して発現値を補正した。

【0366】

【表8】

【0367】

表６． ＦｏｌｄＸｖ５を使用したエネルギー算出（方法を参照）。値はＫｃａｌ／ｍｏｌにおいて提供している。突然変異体（Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、及びＭｕｔ３）の各々について、独立的にＲ１及びＲ２との相互作用エネルギー並びにアポ形態及び複合体における安定性エネルギーを算出した（要約分析シート）。エネルギーは、３つの独立したＰＤＢモデル（２ｉｌｋ、１ｙ６ｋ、及び６×９３）において算出した。

【0368】

【表9】

【0369】

表７． Ｍ．ニューモニエにより発現及び分泌されたこの研究において生成されたＩＬ－１０バリアントの動態パラメーターのｅｘ ｖｉｖｏ特徴付け。上に本発明者らはいくつかの生物学的複製物からの異なる動態パラメーターの平均及び標準偏差を示している（下）。

【0370】

【表10】

【0371】

表８． Ｍ．ニューモニエＷＴ又はＣＶ８に感染した肺における炎症マーカーの遺伝子発現。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにマウス当たり１０７ＣＦＵを含有する１００μｌを感染させ、感染の２又は４日後（２又は４ｄｐｉ）に屠殺した。対照群（ＰＢＳ）を１００μｌの媒体溶液で処置した。これらのレポーター細胞のリードアウトは、６３０ｎｍでの吸光度として測定され（方法を参照）、ＩＬ－１０受容体（Ｒ１及びＲ２）を活性化させるＩＬ－１０バリアントの各々の能力に比例している。ＥＬＩＳＡ定量化及びＨＥＫ－ｂｌｕｅ由来吸光度値を各々の複製物について異なるシートに表示している。これらの結果に由来する得られた全ての動態（Ｂｍａｘ、ヒル定数（ｈ）、及びＫＤ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して動態モデルを用いて算出された（方法を参照）。算出されたパラメーターの各々を「統合された表」のシートに示している。飽和に達しなかった実験において、Ｂｍａｘは、同じ生物学的複製物における最大Ｂｍａｘに設定されており、アステリスクで表示している。

【0372】

【表11】

【0373】

表９．組織学的所見は、ＰＡＯ１を感染させ、及びＩＬ－１０バリアントをコードするＣＶ８で処置された肺において観察した。対照マウスにＰＢＳ又はｈＩＬ－１０ｒタンパク質を接種した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を細胞浸潤（スコア：０～５）、浸潤された血管周囲／気管支周囲（スコア：０～５）及び気管支／細気管支内腔中のＰＭＮ（スコア：０～５）の評価のために使用した。合計スコア（スコア：０～１５）を全てのパラメーターの和により算出した。免疫組織化学を好中球（好中球エラスターゼ）又はマクロファージ（ＦＡ）の定量的な決定のために使用した。より低いスコアは、より低い炎症性又は病原性の表現型を意味する。

【0374】

フォールディカイン－１０中の操作されたリンカーの影響力の評価
構築物及び設計
上記に、本発明者らは、以下のアミノ酸配列を有するＭｕｔＳＣ１と称される新規の分子を記載した：
ＭｕｔＳＣ１（配列番号９）
MTQENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQ
hhh hhhhhhhhhhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
AENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINY
hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhh
HC HD HE
IEAYMTMNGGLDYLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEV
hhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HF HA HB
MPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRNHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIF
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhh
HC HD HE
INYIEAYMTMKIRN
Hhhhhhhhhh
HF

【0375】

太字で強調した配列は、２つの単量体ドメインのＣ及びＮ末端を接続するために設計されたペプチドリンカーに対応する。太字の斜体において、本発明者らは、３Ｄドメインの間の２つの野生型構造化リンカーの部分（ＣＥＮＫＳＫＡ；配列番号１６８）である配列を示す。天然の「スワップ済み二量体」であるＩＬ－１０の場合、これらのリンカー配列は、天然の、構造化されたリンカーであり、フォールディカインの２つのドメインの間（又は野生型ＩＬ－１０二量体の左及び右ドメインの間）の特徴的な折り曲げ角度（Ｖ形態）を付与する。本発明者らは、操作された分子の機能的活性におけるリンカー組成の影響力を評価するためにＮＧＧＬＤ配列（配列番号３１８）が同じ長さ（５ａａ）のポリＧｌｙリンカーにより置き換えられている対照を生成した（下線）。これは、ＭｕｔＳＣ１＿ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｎｔｒｏｌ＿１９と称される分子を結果としてもたらす。

＞ ＭｕｔＳＣ１＿ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｎｔｒｏｌ＿１９（配列番号６３）
MTQENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQ
hhh hhhhhhhhhhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
AENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINY
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HC HD HE
IEAYMTMGGGGGYLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEV
hhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HF HA HB
MPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRNHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIF
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhh
HC HD HE
INYIEAYMTMKIRN
Hhhhhhhhhh
HF

【0376】

単一のリンカーと比較して各々の３Ｄドメインの間に２つのリンカーを有することの重要性及び分子の中心におけるＶ形態の剛性の重要性を評価するために以下の対照ポリペプチドを合成し、アッセイした：Ａ）本発明者らは、１つの３ＤドメインのＮ－Ｃ末端リンカーを他のフォールディカインドメイン中に複製して、各々のドメインが連続的な一次配列から形成されるようにし、並びにポリペプチドのための新規Ｎ及びＣ末端を作出するために、本発明者らは、３Ｄドメインの間の２つのリンカーのうちの１つにおける位置Ａｓｎ１６６において切断した（新規の末端を示すＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ１＿ｃｏｎｔｒｏｌ＿ｃｅｎｔｅｒ２１中の下線を引いた配列並びに太字の斜体並びに２つの非天然Ｎ→Ｃ末端リンカー（太字）を参照）。そのため、（本明細書の他の箇所において記載されるような）本発明のフォールディカインとは対照的に、フォールディカイン「ＭｕｔＳＣ１＿ｃｏｎｔｒｏｌ＿ｃｅｎｔｅｒ２１」は、フォールディングしたタンパク質中の左及び右３Ｄドメインの間にかかる１つの構造リンカーのみを有する。

＞ＭｕｔＳＣ１＿ｃｏｎｔｒｏｌｃｅｎｔｅｒ＿２１（配列番号６４）
KSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMNFGGLDYLPNMLRDLRDAFSR
hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhh
HD HE HF HA
VKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNS
hhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhh
HB HC
LGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYM
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF
TMNFGGLDYLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQ
hhh hhhhhhhhhh hhhhh hhhhhhhhhh
HA HB
FYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHFLPCEN
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC

【0377】

結果
合成プロモーター（ｐ３）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１７－００２３９－７及び分泌シグナル（ｓ１４２＿ＯＰＴ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５２５２／ｍｓｂ．２０２０１０１４５）の制御下のトランスポゾン（Ｔｎ４００１、ＣｍＲ）を介してマイコプラズマ・ニューモニエゲノム中に３つの異なる構築物を挿入した。Ｍ．ニューモニエをＨａｙｆｌｉｃｋ培地中で４８時間増殖させ、この後に、上清を収集し、異なる操作された分子の濃度をＥＬＩＳＡにより算出した。３つ全ての場合において、上清の濃度は、ＨＥＫ－ＢＬＵＥ－ＩＬ１０細胞のダイナミックレンジに入る最大濃度である３０ｎｇ／ｍｌよりも高かった。

【0378】

レポーターＨＥＫ－ｂｌｕｅ細胞において希釈されていない上清の活性を評価することにより分子の機能性の第１の概算を行った。３つ全ての構築物はＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を活性化させた（図１８を参照）。

【0379】

次に、本発明者らは、３０ｎｇ／ｍＬから開始（及び各々０．５倍に希釈）して８段階希釈を行い、ＨＥＫ ｂｌｕｅ細胞の活性化を評価した（図１８Ｂを参照）。本発明者らは、ミカエリス－メンテンモデルを実験データにフィッティングし（飽和結合、ヒル勾配を伴う特異的結合、２．３にＢｍａｘを固定）、見かけのＫＤを得た。操作されたループを同じサイズのポリＧｌｙリンカーにより置換した場合、この突然変異体は活性における非常に顕著な低下を有した（ＭｕｔＳＣ１＿ｌｉｎｋｅｒｃｏｎｔｒｏｌ１９／ＭｕｔＳＣ１＿ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｎｔｒｏｌ＿１９）。Ｎ及びＣ末端リンカーを両方の３Ｄドメイン中に導入した（新規Ｎ及びＣ末端がフォールディカインドメインの間に形成された）場合、約２．５分の１への活性における低下があった（ＭｕｔＳＣ１＿ｌｉｎｋｅｒｃｏｎｔｒｏｌ ２１／ＭｕｔＳＣ１＿ｃｏｎｔｒｏｌｃｅｎｔｅｒ＿２１）。

【0380】

上記の結果は、導入されたＮ及びＣ末端リンカーの正確なアミノ酸組成並びに隣接する３Ｄドメインの間でブリッジする２つのリンカーペプチドの存在の両方はフォールディカインの最適な機能性のために非常に重要であることを示唆する。

【0381】

実施例２：３つの操作されたリンカーを有するクラスＩＩ型の単量体サイトカインからのフォールディカインの生成
以下のセクションにおいて試験及び記載されるＩＬ－２２バリアントのリスト。ＩＬ－２２ フォールディカインスキャフォールドは、図５及び図２７に描写されるスキームに基づく。
・細菌、例えばＭ．ニューモニエ中で発現されるＩｌ２２ ｘｔａｌに基づく単量体ＩＬ２２である、ＩＬ２２ ＷＴ（ＰＤＢ＝３ｄｌｑ）
・突然変異Ｔ５６Ｌ、Ａ６６Ｍ、Ｖ９５Ｉ、Ｔ９９Ｆ、Ｓ１７３Ｌを有する単量体ＩＬ２２である、Ｈｙｄｒｏｐｈ＿ｃｏｒｅ－１
・突然変異Ｔ５６Ｍ、Ａ６６Ｍ、Ｖ９５Ｉ、Ｔ９９Ｆ、Ｓ１７３Ｌ、Ｎ６８Ｑを有する単量体ＩＬ２２である、Ｈｙｄｒｏｐｈ＿ｃｏｒｅ－2
・７位のＣｙｓがＡｌａにより置き換えられたＩＬ２２ ＷＴである、ＣｔｏＡ
・単量体ＩＬ２２中のＴ５６Ｍ点突然変異
・単量体ＩＬ２２中のＡ６６Ｍ点突然変異
・単量体ＩＬ２２中のＶ９５Ｉ点突然変異
・単量体ＩＬ２２中のＴ９９Ｆ点突然変異
・単量体ＩＬ２２中のＳ１７３Ｌ点突然変異
・フォールディカイン－２２＿１（ＳＣＩＬ２２＿１）（配列番号６５）：下記に更に説明されるように、ＩＬ－２２単量体配列のうちの１つのＮ及びＣ末端を接続するためにリンカーが操作されており、並びに二量体単位が次に、各々の単量体配列中のループ配列を壊すことによりその単量体を別のＩＬ－２２単量体配列に融合すること並びにそれぞれの新規Ｎ及びＣ末端を接続してドメイン間ブリッジングリンカーを形成させることにより作出（例えば、図５及び図２７に図示される）された単鎖ＩＬ－２２二量体。
・フォールディカイン－２２＿３（ＳＣＩＬ２２＿３）（配列番号６６）：フォールディカイン－２２＿１に類似しているが、新規Ｎ及びＣ末端のうちの１つの間の異なる操作されたリンカー配列を有し、並びに配列番号６５の２位におけるＣｙｓ残基がＶａｌ残基で置き換えられている、単鎖フォールディカイン。
・フォールディカイン－２２＿３＿ｌｉｎｋｅｒＮＣｐｏｌｙｇｌｙ／フォールディカイン－２２＿３＿ＮＣｐｏｌｙｇｌｙは、左及び右３Ｄドメインの間でブリッジする２つの操作されたリンカーを含むが、設計／操作されたＮ－Ｃ末端リンカーをポリＧｌｙ－Ｓｅｒで置き換えている。操作されたリンカーの正確な長さを新規のポリＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーにおいて維持した。
・フォールディカイン－２２＿３＿ｃｅｎｔｒａｌｌｉｎｋｅｒは、フォールディカイン－２２＿３（ＳＣＩＬ２２＿３）のＮ－Ｃ末端リンカーを保つが、左及び右３Ｄドメインをブリッジする２つの中央リンカーをポリＧｌｙ－Ｓｅｒに変更している。本発明者らは、操作されたリンカーをポリＧｌｙ－Ｓｅｒに変更した時にその正確な長さを維持した。

【0382】

構築物及び設計: 単鎖ＩＬ－２２の生成
ヒトＩＬ－２２は、天然に単量体のインターロイキンである。本発明者らは、ＩＬ－１０に基づくフォールディカイン（本明細書において「フォールディカイン－１０」と称される）を設計する場合に記載されたように知的設計並びにＭｏｄｅｌＸ及びＦｏｌｄＸソフトウェアの組合せを使用してＩＬ－２２をフォールディカイン（「フォールディカイン－２２」と称される）に変換した。ＩＬ－２２は天然にはスワップ済み二量体ではないので、フォールディカイン－２２を生成するために、別々の単量体の間に２つの非天然ブリッジを作出すること、及びまた単量体のうちの１つのＮ及びＣ末端を連結することが必要であった。別々の単量体の間の２つのブリッジは、図５及び図２７に関して記載及び図示されるように、各々の単量体中のループを開くこと、並びに（それぞれの新規Ｎ及びＣ末端の間の）開いた配列の各々において単量体を架橋することにより作出される。単量体の間の２つの新規のブリッジは、下記の配列において下線及び二重下線により指し示される。これらのブリッジは同一の位置に位置せず、及び同一の配列を融合しないので、下記の実施形態において説明されるように、各々のリンカー配列は好適には異なってもよい。リンカー配列のうちの１つ（一重下線）において異なるものの他に、１つの場合（太字、下線）においてＣｙｓ２がＶａｌに突然変異された２つの異なる突然変異体設計が生成された。太字において、本発明者らは、３Ｄドメインのうちの１つのＮ及びＣ末端を連結する設計された配列ＡＮＧＴ（配列番号３２９）を標識している。左及び右フォールディカインドメインの間のブリッジングリンカーは、フォールディカイン－２２＿１におけるＴＣＭＰＧＧＳＫＴ（配列番号３３７）及びＲＬＥＬＬＰ（配列番号３３１）並びにフォールディカイン－２２＿３におけるＮＲＬＫＫＬＭＡＳＳＤ（配列番号３３２）及びＲＬＥＬＬＰ（配列番号３３１）である。参照の容易性のために、フォールディカイン ２２中の構造的に保存されたヘリックスは、それらが元々のＩＬ－２２ ＷＴ配列中で見出される連続的な順序（即ちＨＡ、ＨＢ．．．．）により標識され、並びにヘリックス状セグメントはｈにより標識される。ヘリックス状セグメントがわずかに歪んだヘリックスであり、したがって一部の残基がｓｗｉｓｓｐｄｂにおいてｈとして割り当てられないが定型的ヘリックス状セグメントにより取り囲まれている場合、これはｈ－Ｎｒｅｓ－ｈ（ここで、Ｎｒｅｓは、－として示される任意の数の残基であり得る）として指し示される。ヘリックス状セグメントは、ｓｗｉｓｓｐｄｂソフトウェアを使用して定義され、それらを定義するために使用されるソフトウェアに依存して長さにおいて、及び結晶構造がわずかに異なり得る。

＞ＳＣＩＬ２２＿１（フォールディカイン－２２＿１）（配列番号６５）
GCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFT
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhh
HA HB
LEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCMPGGSKTHIQRNVQKLKDTVKKLGESGE
h---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhh
HC HD
IKAIGELDLLFMSLRNACIANGTLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKL
hhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hh
HE HF HA
FHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSRLELLPHIQR
h hhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HB HC
NVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
hhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF

＞ＳＣＩＬ２２＿３（フォールディカイン－２２＿３）（配列番号６６）
GVRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFT
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhh
HA HB
LEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLKKLMASSDHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIK
h---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhh
HC HD
AIGELDLLFMSLRNACIANGTLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFH
hhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hh
HE HF HA
GVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSRLELLPHIQRNV
h hhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HB HC
QKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
hhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF

【0383】

操作されたリンカー配列の重要性を更に調べるために、本発明者らは、フォールディカイン－２２＿３フレームワークに基づく多数の追加の突然変異体フォールディカイン構築物を生成した：第１の構築物、フォールディカイン－２２＿３＿ｌｉｎｋｅｒＮＣｐｏｌｙｇｌｙは、フォールディカイン－２２＿３の２つの操作されたリンカーブリッジの配列を保持しているが、Ｎ－Ｃ末端リンカーをポリＧｌｙに変更している。他の構築物（フォールディカイン－２２＿３＿ｃｅｎｔｒａｌｌｉｎｋｅｒｓ）は、Ｎ－Ｃ末端リンカー（太字）を保っているが、３Ｄドメインの間の２つの中央リンカーブリッジをポリＧｌｙ－Ｓｅｒ（灰色）に変更している。両方の場合において、本発明者らは、操作されたリンカーをそれぞれポリＧｌｙ又はポリＧｌｙ－Ｓｅｒに変更した時にその正確な長さを維持した。

【0384】

＞ フォールディカイン－２２＿３＿ｌｉｎｋｅｒＮＣｐｏｌｙｇｌｙ（配列番号６７）
GVRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLKKLMASSDHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIGGGGLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSRLELLPHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

【0385】

＞ フォールディカイン－２２＿３＿ｃｅｎｔｒａｌｌｉｎｋｅｒｓ（配列番号６８）
GVRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSGGSGGSGGSGGHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI-ANGTLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSGGSGGSHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

【0386】

結合した状態におけるＩＬ－２２の疎水性コアの安定化
並行して、本発明者らは、疎水性コアのモデリングに基づいて、結合したコンホメーションにおいて疎水性コアを安定化させることが予測される一部の突然変異をＩＬ－２２フレームワーク上に操作した。安定性増強を提供することが予想され、及び異なる種にわたり進化により１００％保存されていないアミノ酸置き換えが特に望ましかった。各々の潜在的な突然変異を個々に及び組合せで評価した。

【0387】

疎水性コアを突然変異させた場合の安定性変化の算出のための参照として選択された結晶学的構造及び配列は３ｄｌｑ．ＰＤＢであった。本発明者らは、突然変異でＩＬ２２タンパク質を潜在的に安定化させ得る残基として残基Ｔ５６、Ａ６６、Ｖ９５、Ｔ９９及びＳ１９３を同定した。これらの残基は、ＷＴ Ｐｄｂ配列（配列番号６９）上で灰色で記される。

３ｄｌｑ． Ｐｄｂ配列（配列番号６９）
ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTL
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEI
---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HC HD HE
KAIGELDLLFMSLRNACI
hhh hhhhhhhhhhhh
HF

【0388】

下記の表１０において、本発明者らは、ＩＬ２２の疎水性コアを安定化させることがＦｏｌｄＸで予測された５つの突然変異体を列記している。

【0389】

【表12】

【0390】

次に本発明者らは、上記されるフォールディカイン－２２構築物中に個々に及び集合的に疎水性突然変異を導入した。
３ｄｌｑ． Ｐｄｂ配列 － 疎水性コア安定化タンパク質（５６）（配列番号３４３）
ARLDKSNFQQPYITNRMFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTL
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEI
---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HC HD HE
KAIGELDLLFMSLRNACI
hhh hhhhhhhhhhhh
HF

３ｄｌｑ． Ｐｄｂ配列 － 疎水性コア安定化タンパク質（６６）（配列番号３４４）
ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEMSLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTL
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEI
---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HC HD HE
KAIGELDLLFMSLRNACI
hhh hhhhhhhhhhhh
HF

３ｄｌｑ． Ｐｄｂ配列 － 疎水性コア安定化タンパク質（９５）（配列番号３４５）
ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQILNFTL
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEI
---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HC HD HE
KAIGELDLLFMSLRNACI
hhh hhhhhhhhhhhh
HF

３ｄｌｑ． Ｐｄｂ配列 － 疎水性コア安定化タンパク質（９９）（配列番号３４６）
ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFML
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEI
---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HC HD HE
KAIGELDLLFMSLRNACI
hhh hhhhhhhhhhhh
HF

３ｄｌｑ． Ｐｄｂ配列 － 疎水性コア安定化タンパク質（１７３）（配列番号３４７）
ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTL
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGEMGEI
---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HC HD HE
KAIGELDLLFMSLRNACI
hhh hhhhhhhhhhhh
HF

３ｄｌｑ． Ｐｄｂ配列 － 疎水性コア安定化タンパク質（ＩＬ－２２ｈｙｄＣ）（配列番号７０）
ARLDKSNFQQPYITNRMFMLAKEMSLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQILNFML
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGELGEI
---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HC HD HE
KAIGELDLLFMSLRNACI
hhh hhhhhhhhhhhh
HF

【0391】

ＩＬ－２２インターフェース突然変異の操作
受容体Ｒ１及びＲ２に結合したマウスＩＬ－２２の結晶学的構造が利用可能である（６ｗｅ０．ｐｄｂ）。本発明者らは、マウスとヒトとの間で異なる残基を突然変異させるためにＦｏｌｄＸソフトウェア、及び、必要な場合に、アミノ酸差異をより良好に順応させるために小さい骨格移動をモデル化するためにＭｏｄｅｌＸソフトウェアを使用して、この結晶学的構造のヒト化されたモデルを生成した。Ｒ１及びＲ２受容体を伴うヒト及びマウスＩＬ－２２構造を得た後に、本発明者らは、受容体との接触状態での位置の各々についてのＦｏｌｄＸでの位置スキャン分析を行った。次に本発明者らは、両方の受容体との相互作用エネルギー及び複合体の安定性を分析した。本発明者らは、ヒト受容体及びマウス受容体の両方への結合を助長し得る位置を選択した。

【0392】

下記の表１１において、本発明者らは、ヒト構造において分析された異なる位置、複合体の安定性におけるＤＤＧ、並びにそれぞれＲ１及びＲ２との相互作用のＤＤＧを列記している。提供される値はｋｃａｌ／ｍｏｌにおけるものである。

【0393】

【表13】

【0394】

下記の表１２において、本発明者らは、マウス構造において分析された異なる位置、複合体の安定性におけるＤＤＧ、並びにそれぞれＲ１及びＲ２との相互作用のＤＤＧを列記している。提供される値はｋｃａｌ／ｍｏｌにおけるものである。

【0395】

【表14】

【0396】

これらの要素と共に、本発明者らは、最初にＩＬ－２２ ＷＴにおいて探索されるべき突然変異の組合せのシリーズを選択した。下記において、本発明者らは、インターフェース操作型突然変異体の配列を見出すことができる。

【0397】

表１３（下記）は、ＩＬ－２２の安定性及びその受容体との相互作用の両方を増加させる、野生型ＩＬ－２２配列に対して為された突然変異を指し示す。突然変異をＩＬ－２２ ＷＴ上で実行し、更にフォールディカイン－２２スキャフォールド中に含めた（野生型及び突然変異体Ｃ～Ｅの部分配列アライメントを下記に示している）。

【0398】

【表15】

【0399】

ＷＴ２２（配列番号３１７）
APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

突然変異体Ｃ＿ＩＬ２２（配列番号７１）
APISSHCRLEKRNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNIDVRLIGYKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLYRLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

突然変異体Ｄ＿ＩＬ２２（配列番号７２）
APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAWEAMLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

突然変異体Ｅ＿ＩＬ２２（配列番号７３）
APISSHCREDRSNFQQPYITNRTFMLAWEAMLADNNIDVRLIGYKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLYRLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

【0400】

・実験結果
ＩＬ－２２タンパク質機能性におけるリンカータンパク質組成の影響力の分析
ポリｇｌｙリンカー（フォールディカイン－２２＿３＿ｌｉｎｋｅｒＮＣｐｏｌｙｇｌｙ）又は中央リンカー（フォールディカイン－２２＿３＿ｃｅｎｔｒａｌｌｉｎｋｅｒｓ）でのＩＬ－２２ フォールディカインのＮ－Ｃ末端リンカーの置換は、タンパク質における機能の完全な喪失を結果としてもたらし、操作されたリンカー組成はタンパク質親和性に大きく影響するという概念をサポートした（図１９を参照）。

【0401】

ＩＬ－２２の疎水性コアを安定化させる突然変異の分析
ＩＬ－２２スキャフォールド上に導入された突然変異（Ｋｄ＝１．７ｅ－１１）について、本発明者らは、測定されたＫＤにおける増強を観察したが、これは、コア安定化突然変異が疎水性スキャフォールドに導入された場合の結合状態におけるこのタンパク質の安定化に起因することが想定される（Ｋｄ＝５．４ｅ－１２）（図２０）。

【0402】

本発明者らはまた、別々に突然変異体の各々の影響力を分析し、ＩＬ－２２ ＷＴと比較した。フォールディカイン－２２配列のＮ末端におけるＣｙｓ２アミノ酸を突然変異させてジスルフィドブリッジの形成を予防した場合、本発明者らは機能の完全な喪失を観察した。それにもかかわらず、疎水性コア中の異なる単一の突然変異を評価した場合、本発明者らは、６６、９５及び９９位における５つの突然変異のうちの３つについてタンパク質の親和性における増強を観察した（図２１）。本発明者らは、１７３位における突然変異は有害であり、及び５６位における突然変異は中立的であるらしいことを観察した。これは、親和性におけるわずか２倍の増加が複数の疎水性突然変異体において達成された理由を説明し得る。したがって、ＩＬ－２２及びフォールディカイン－２２の将来的なバージョンは、６６、９５及び９９における３つの突然変異を有益に含み得る。本発明者らの結果は、結合状態におけるフォールディカイン（又は単量体）タンパク質の疎水性コアの安定化は、タンパク質親和性を増強するための成功裡の戦略であることができることを示す（図２１）。

【0403】

Ｒ１及びＲ２受容体との相互作用を向上させる突然変異の分析
ＩＬ－２２とＲ１（突然変異体Ｃ＿ＩＬ２２、配列番号７１）、Ｒ２（突然変異体Ｄ＿ＩＬ２２、配列番号７２）及び両方（突然変異体Ｅ＿ＩＬ２２、配列番号７３）との間の相互作用を向上させるために設計された突然変異の影響力を分析した。ｗｔに対する突然変異体Ｅ＿ＩＬ２２についての親和性における１０倍の増加（見かけのＫＤ ３．３７Ｅ－１１ ｖｓ １．２８Ｅ－１０）、及び突然変異体Ｄ＿ＩＬ２２についての親和性における２倍の増加が観察された。

【0404】

フォールディカイン－２２バリアントの分析
本発明者らは、方法に記載されるようにトランスポゾン（Ｔｎ４００１、ＴｃＲ）を介して細菌ゲノムに異なる構築物を挿入した。細菌細胞（例えばＭ．ニューモニエ、Ｌ．ラクチス又は大腸菌）をＨａｙｆｌｉｃｋ培地中で４８時間増殖させ、この後に、上清を収集し、異なるＩＬ－２２操作分子の濃度をＥＬＩＳＡにより算出した。３つ全ての場合において、上清の濃度は、ＨＥＫ－ＢＬＵＥ－２２細胞のダイナミックレンジに入る最大濃度である３０ｎｇ／ｍｌよりも高かった。

【0405】

レポーターＨＥＫ－ｂｌｕｅ細胞において希釈されていない上清の活性を評価することにより分子の機能性の第１の概算を行った（図２２Ａを参照）。これらの分子から、ＩＬ－２２、フォールディカイン－２２－１及びフォールディカイン－２２＿３は、ＳＴＡＴ３を介するＩＬ－２２媒介性シグナル伝達経路を活性化させる能力を示した。フォールディカイン２２＿リンカーＮ－Ｃ末端がポリＧｌｙリンカーにより置換された構築物（フォールディカイン－２２＿３＿ｌｉｎｋｅｒＮＣｐｏｌｙｇｌｙ）はシグナル伝達経路を活性化させず、それは活性ではないことを示唆した（図１９及び図２２Ｂ）。

【0406】

次に、本発明者らは、３０ｎｇ／ｍＬから開始（及び各々０．５倍に希釈）して８段階希釈を行い、ＨＥＫ ｂｌｕｅ細胞の活性化を評価した（図２２Ｂを参照）。本発明者らは、ミカエリス－メンテンモデルを実験データにフィッティングし（飽和結合、ヒル勾配を伴う特異的結合、２．２にＢｍａｘを固定）、見かけのＫｄを得た。見かけのＫｄをパネルＢに示している。両方のフォールディカインは、ＩＬ２２ ＷＴと比較して約４倍のＫｄの増加を示し、野生型ＩＬ－２２と比べたフォールディカイン－２２の活性における向上が検証された。

【0407】

キメラＩＬ－１０／ＩＬ－２２
以下のセクションにおいて試験及び記載されるキメラＩＬ－１０／ＩＬ－２２キメラフォールディカインバリアントのリスト。
・フォールディカイン１０－２２。ＩＬ－１０が閉じた／連続的フォールディカイン ３Ｄドメインに対応し、ＩＬ－２２が開いた／分割ドメインに対応する、ＩＬ－１０及びＩＬ－２２を接合するキメラフォールディカイン。（配列番号７４）。
・キメラ３／フォールディカイン１０－２２＿３は、１位のＣｙｓ残基がＡｌａ残基で置き換えられたフォールディカイン１０－２２に基づく。（配列番号75）
・キメラ５／フォールディカイン１０－２２＿５は、タンパク質のＩＬ－２２活性を向上させるためにＩＬ－２２分割３Ｄドメインの安定性を増加させる試みにおいて５つの追加のアミノ酸置換の群が為されたフォールディカイン１０－２２＿３に基づく（配列番号７６）。
・Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ１０－２２。（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）に記載された操作された単量体ＩＬ－１０が、ＩＬ－１０のＣ末端をＩＬ－２２のＮ末端に接合する６アミノ酸の短いｇｌｙ－ｓｅｒリンカーによりＩＬ－２２に融合されている対照。
・Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ２２－１０。操作された単量体ＩＬ－２２が、ＩＬ－２２のＣ末端をＩＬ－１０のＮ末端に接合する６アミノ酸の短いｇｌｙ－ｓｅｒリンカーにより（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）に記載される単量体ＩＬ－１０に融合されている対照。

【0408】

構築物及び設計
本発明者らは、ＩＬ－１０スワップドドメイン構造（１ｙ６ｋ．ｐｄｂ）上にＩＬ－２２二量体構造（３ｄｌｑ．ｐｄｂ）をモデル化することにより開始した。「Ｓｅｗｉｎｇ１０２２」構築物（配列番号７４）を形成するために、本発明者らは、天然ＩＬ－２２配列のヘリックスＣ及びＤの間のＩＬ－２２ループを除去し（残基Ｌｅｕ１２９の後及びＡｒｇ１４２の前の切断）、並びにＩＬ－１０のＬｙｓ８８及びＣｙｓ１１４の間のループ（ヘリックスＣ及びＤ）を除去し、並びに操作されたＤＰＫＡＡＦＫＳリンカー（配列番号３１４）を用いてＩＬ－２２のＬｅｕ１２９をＩＬ－１０のＬｙｓ８８と、及びＤＳＫＶＮＲリンカー（配列番号３１５）を介してＩＬ－１０のＣｙｓ１１４をＩＬ－２２のＡｒｇ１４３と接続した。同時に、操作されたペプチドリンカーＮＦＧＧＬＤＹ（配列番号３１６）によりＩＬ－１０のＮ及びＣ末端を閉じた。斜体で本発明者らはＩＬ－２２に対応する残基を示し、下線でＩＬ－１０の残基を示している。太字の斜体は、ＩＬ－２２の２つの半分をＩＬ－１０に接合するために導入された２つの中央リンカーを指し示す。太字の非斜体は、ＩＬ－１０のＮ及びＣ末端を連結するリンカーペプチドである。
＞ｓｅｗｉｎｇ１０２２／フォールディカイン１０－２２（配列番号７４）
CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTL
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA-IL22 HB-IL22
EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLDPKAAFKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSE
hhhhhhhhhhhhhhhhh Xn hhhhhhhhhhhh hhhhhhh
HC HD-IL10 HE-IL10
FDIFINYIEAYMTMNFGGLDYLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKG
hhhhhhhhhhh NtCt hhhhhhhhhh hhhhhh
HF-IL10 HA-IL10
YLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCDSKVN
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh Xn
HB-IL10 HC-IL10
RRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
Hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD-IL22 HE_IL22 HF-IL22

【0409】

フォールディカイン－１０／２２分子のこの初期ソーイングパターンは、アッセイにおいてＩＬ－１０活性を実証したが、有意なＩＬ－２２活性を実証しなかった。同じことが、第１のＣｙｓ残基がＡｌａに突然変異されたフォールディカイン１０－２２＿３／キメラ３（配列番号７５）で観察された。この結果は、ＩＬ－２２分割ドメインの安定性の欠如、又は設計されたリンカーに伴う問題に起因し得る。この課題を研究及び解決するために、本発明者らは、機能性をレスキューすることを試みて分割ドメインＩＬ－２２の疎水性コアの安定性を増加させるための突然変異のセットを生成した（フォールディカイン１０２２＿５／キメラ５；配列番号７６）。下記の表において、本発明者らは、行われた突然変異のセットを列記している。下記の配列番号７５及び７６において突然変異を太字で示し、下線を引いている。

【0410】

＞ フォールディカイン１０－２２＿３（配列番号７５）
ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMLQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLDPKAAFKCKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMNFGGLDYLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCLCLSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCISKVLRRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI*

【0411】

＞フォールディカイン１０－２２＿５（配列番号７６）
ARLDKSNFQQPYITNRLFMLAKEASLMDNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMLQILNFFLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLDPKAAFKCKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMNFGGLDYLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCLCLSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCISKVLRRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMLLRNACI

この分子の突然変異は以下の通りである。

【0412】

【表16】

【0413】

対照として、本発明者らは２つの異なるタンパク質融合物を生成した。６アミノ酸の短いｇｌｙ－ｓｅｒリンカーによりＩＬ－２２（斜体）に融合された（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）に記載される操作された単量体ＩＬ－１０（下記で下線を引いている）（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ１０－２２）（配列番号７７）。並行して、本発明者らは、ＩＬ－２２（斜体）Ｃ末端が６アミノ酸の短いｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを介してＩＬ－１０（下線）Ｎ末端に融合された逆構築物（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ２２－１０）を生成した（配列番号７８）。下記の配列番号７８においてリンカーを太字の下線で指し示している。

【0414】

＞ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ１０－２２（配列番号７７）
MSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGNGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

【0415】

＞ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ２２－１０（配列番号７８）
APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIGGSGGSMSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGNGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN*

【0416】

結果
操作された分子の機能性を評価するために、本発明者らは最初に、細菌（例えばＭ．ニューモニエ、Ｌ．ラクチス又は大腸菌）による発現及び分泌での異なるバージョンの細胞培養物の上清中の濃度をＥＬＩＳＡにより定量化することにより開始した。異なるキメラの定量化のために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡによりＩＬ－２２を認識する抗体を使用したが、その理由は、ヒトＩＬ－１０を認識するために本発明者らが使用した商用の抗体（Ｄｅｌｕｘｅ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）はＩＬ－１０／ＩＬ－２２キメラ中のヒトＩＬ－１０を認識しないことを本発明者らは見出したからである。

【0417】

次に、本発明者らは、並行して２つのレポーター細胞株を使用して分子の機能性を評価した。第１の、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－２２細胞は、生物活性ヒト及びマウスＩＬ－２２を検出するために胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞株に由来する。第２のレポーター細胞株、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標） ＩＬ－１０もまた生物活性ヒト及びマウスインターロイキン１０（ＩＬ－１０）を検出する。図２３に本発明者らは実験結果を示している。

【0418】

ＩＬ－１０活性について、本発明者らは、キメラ３及びキメラ５はＩＬ－１０機能性について活性であることを実証した。加えて、本発明者らは、キメラ５はＩＬ－２２機能性も有することを実証した。したがって、フォールディカイン１０２２＿５（キメラ５）は、二重機能性を有する単分子サイトカインを生成できることを実証している。更に、ＩＬ－２２の第１の半分の分割ドメイン中の突然変異、即ちＴ６０Ｆ、Ｖ５６Ｉ、Ａ２７Ｍ、Ｔ１７Ｌ、及び／又は第２の半分の分割ドメイン中の突然変異、即ちＳ３１４Ｌの１つ以上が、ＩＬ－２２の活性のレスキューに関与することが明らかである。

【0419】

対照試験、即ち、柔軟性リンカーを介して連結された単量体ＩＬ－１０のＩＬ－２２への融合タンパク質及び逆融合物、即ちＩＬ－２２のＩＬ－１０への融合タンパク質に基づく対照試験に関して、融合物２２－１０（「ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ２２－１０」）においてＩＬ－１０機能のほぼ完全な喪失が結果としてもたらされ、部分的に過ぎないＩＬ－２２活性が観察された（図２４を参照）。この結果は、フォールディカイン概念、並びに、フォールディングした単鎖タンパク質の左及び右３Ｄドメインをブリッジする、分割ＩＬ－２２ ３Ｄ／フォールディカインドメインにＩＬ－１０ ３Ｄ／フォールディカインドメインを接合する２つの構造化されたリンカーの重要性をサポートする。

【0420】

実施例３：サイトカインヘリカルバンドルファミリーに基づくフォールディカインの構築
構造レベルで、フォールディカインを作製するために２つの主なサイトカインヘリカルバンドルファミリーが使用され得る。
上記されるように、本発明者らは、これらのサイトカインを、本明細書に記載されるように、フォールディカインリンカー及びブリッジが然るべく挿入されるクラスＩ又はクラスＩＩのいずれかにクラス分けすることができる。

【0421】

下記において、本発明者らは、ホモマーヒトフォールディカインクラスＩヘリックス型サイトカインを提案する。当業者に明らかなように、フォールディカインの概念は、構造的適合性を示す任意の他の非ヒトインターロイキンに拡張され得る。

【0422】

クラスＩヘリックス型サイトカイン
Ａ）短鎖ヘリックス状の、配列及び対応するホモマーフォールディカイン
ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＴＳＬＰ及びＧＭＣＳ－Ｆのヒト配列
本発明者らは、下記の配列においてシグナルペプチドを除去したが、当業者は、シグナルペプチドを含有する類似した構築物もまた本発明の範囲内に入ることを理解する。

＞ｓｐ｜Ｐ６０５６８｜ＩＬ２＿ヒトインターロイキン－２（配列番号７９）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

＞ｓｐ｜Ｐ０８７００｜ＩＬ３＿ヒトインターロイキン－３（配列番号８０）
RPGLQAPMTQTTPLKTSWVNCSNMIDEIITHLKQPPLPLLDFNNLNGEDQDILMENNLRRPNLEAFNRAVKSLQNASAIESILKNLLPCLPLATAAPTRHPIHIKDGDWNEFRRKLTFYLKTLENAQAQQTTLSLAIF

＞ｓｐ｜Ｐ０５１１２｜ＩＬ４＿ヒトインターロイキン－４（配列番号８１）
GNFVHGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS

＞ｓｐ｜Ｐ０５１１３｜ＩＬ５＿ヒトインターロイキン－５（配列番号８２）
TEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES

＞ｓｐ｜Ｐ１３２３２｜ＩＬ７＿ヒトインターロイキン－７（配列番号８３）
PVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLEC-50NSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

＞ｓｐ｜Ｐ１５２４８｜ＩＬ９＿ヒトインターロイキン－９（配列番号８４）
QGCPTLAGILDINFLINEC-50QEDPASKCHCSANVTSCLCLGIPSDNCTRPCFSERLSQMTNTTMQTRYPLIFSRVKKSVEVLKNNKCPYFSCEQPCNQTTAGNALTFLKSLLEIFQKEEC-50RGMRGKI

＞ｓｐ｜Ｐ４０９３３｜ＩＬ１５＿ヒトインターロイキン－１５（配列番号８５）
NSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

＞ｓｐ｜Ｑ９ＨＢＥ４｜ＩＬ２１＿ヒトインターロイキン－２１（配列番号８６）
HKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQEC-50IHQHLSSRTHGSED

＞ｓｐ｜Ｑ９６９Ｄ９｜ＴＳＬＰ＿ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（配列番号８７）
YDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ

＞ｓｐ｜Ｐ０４１４１｜ＣＳＦ２＿ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（配列番号８８）
QPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE

【0423】

上記のインターロイキンの各々について、本発明者らは、下記に説明されるように、図２６に指し示されるスキームに一般に従ってホモマーフォールディカインを生成するための方法論を提案する。「ドメインスワップ済み」二量体のために、例えば図２５により指し示されるように、フォールディカイン戦略は異なる。

【0424】

提案されるホモマーフォールディカインクラスＩ：ショートヘリックスバンドルサブクラス。
太字の二重下線において、本発明者らは、分割ドメインを形成するためにサイトカイン単量体の他方において開かれたループ配列を強調している。インタクトな単量体のＮ及びＣ末端に融合した分割分子／ドメインを斜体としている。（Ｘｎ）は、１つのフォールディカインドメインを他のフォールディカインドメインに連結するために操作された接続リンカーである。リンカー配列は、所望される構造的コンホメーションを提供するように設計されるか、又は異なる長さのＧｌｙ及びＳｅｒの単純に組合せである。有益には、しかしながら、操作されたリンカー配列は、特有の３Ｄコンホメーションを選好する「構造化された」リンカーであり、したがって、本開示の有利な実施形態において、操作されたリンカーは、Ｇｌｙ残基もＳｅｒ残基も含有しないか、又は有益には３個以下、２個以下、若しくは１個以下のＧｌｙ若しくはＳｅｒ残基を含有する。ＸＸ＿及び＿ＹＹは、追加の残基が、除去される、部分的に除去される又は単純に開かれるループ配列の位置において分割ドメインのＮ及びＣ末端に加えられ得ることを指し示す。更には、新規Ｎ及びＣ末端のそれぞれ右又は左の最大１０個の残基は、設計及び構造的要求に依存して、活性に影響することなく欠失されてもよい。そのため、ＸＸ及びＹＹは、開かれるループ配列の部分の全体を含んでもよい任意選択的な配列エレメントであり、下記の対応する配列番号により同定される配列の部分を形成しない。

【0425】

これらのリンカーの示される位置は本開示の一実施形態を表すが；これらのリンカーの位置を変更することが可能であり得、特に、リンカーブリッジの位置は、機能的なフォールディカインの形成を妨げることなくＮ末端方向又はＣ末端方向のいずれかにおいて１～１０又は１～５個のアミノ酸、例えば１、２、３、４又は５個のアミノ酸により変更されてもよいことが理解されるべきである。そのため、これらのリンカーの指し示される位置は近似的であると考えられるべきであり、各々の場合において、周囲の残基の一部を組み込む（又は除去する）ために拡張され得る。例えば、最大１０個のアミノ酸が、（Ｘｎ）位置の各々の側において欠失され得る。

【0426】

参照の容易性のために、各々のファミリー中の構造的に保存されたヘリックスは、それらが元々のＷＴ配列中で見出される連続的な順序（即ちＨＡ、ＨＢ．．．．）により標識され、並びにヘリックス状セグメントはｈにより標識される。ヘリックス状セグメントがわずかに歪んだヘリックスであり、したがって一部の残基がｓｗｉｓｓｐｄｂにおいてｈとして割り当てられないが定型的ヘリックス状セグメントにより取り囲まれている場合、本発明者らはそれを、ｈ－Ｎｒｅｓ－ｈ（ここで、Ｎｒｅｓは、－として示される任意の数の残基であり得る）として指し示す。ヘリックス状セグメントは、ｓｗｉｓｓｐｄｂソフトウェアを使用して定義され、それらを定義するために使用されるソフトウェアに依存して長さにおいて、及び結晶構造がわずかに異なり得る。

フォールディカイン－２（インターロイキン－２）（ＸＸ＿配列番号８９－（Ｘｎ）－配列番号９０－（Ｘｎ）－配列番号９１＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列ＱＳＫＮＦＨＬＲ、配列番号９２
XX_PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(Xn)TSSSTKKTQLQLEH
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh
HC HD HA
LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLI
hhhhhhhhhhhh hhhhhh hhh hhhhhhh---hhhhhh hhhh
HB
SNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(Xn)TSSSTKKTQLQLEHLLLDLQM
hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD HA
ILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA_YY
hhhhh hhhhhh hhhhhhh---hhhhhhh
HB

フォールディカイン－４（インターロイキン－４）（ＸＸ＿配列番号９３－（Ｘｎ）－配列番号９４－（Ｘｎ）－配列番号９５＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＧＡＴＡ、配列番号９６
XX_QQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS(Xn)GNFVHGH
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
KCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQ
hhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hh
HA HB
QFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS(Xn)GNFVHGHKCD
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
ITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCL_YY
hhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhh
HA HB

フォールディカイン－３（インターロイキン－３）（ＸＸ＿配列番号９７－（Ｘｎ）－配列番号９８－（Ｘｎ）－配列番号９９＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＫＳＬＱＮＡ、配列番号１００
XX_SAIESILKNLLPCLPLATAAPTRHPIHIKDGDWNEFRRKLTFYLKTLENAQA(Xn)
hhhhhhh hh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
SWVNCSNMIDEIITHLKQPPLPLLDFNNLNGEDQDILMENNLRRPNLEAFNRAV
hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HA HB
KSLQNASAIESILKNLLPCLPLATAAPTRHPIHIKDGDWNEFRRKLTFYLKTLENAQAQ(Xn)
hhhhhhh hh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
SWVNCSNMIDEIITHLKQPPLPLLDFNNLNGEDQDILMENNLRRPNLEAFNRAV-YY
hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HA HB

フォールディカイン－５（インターロイキン－５；スワップ済み二量体）（ＸＸ＿配列番号１０１－（ＮｔＣｔ）－配列番号１０２＿ＹＹ）
XX_TEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFK
hhhhhhhhhhhhh hhhh hhhhhhhhhh hhhhhh
HA HB
NLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES(NtCt)
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
TEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNL
hhhhhhhhhhhhh hhhh hhh hhhhhhhhhh hhhhhhhh
HA HB HC
SLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES_YY
hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HD

フォールディカイン－７（インターロイキン－７）（ＸＸ＿配列番号１０３－（Ｘｎ）－配列番号１０４－（Ｘｎ）－配列番号１０５＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＫＭＮＳＴＧ、配列番号１０６
XX_DFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTC
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HC HD
WNKILMGTKEH(Xn)PVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKE
hhhhh hhh---hhhhhhhhh hhhh
HA
GMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQ
hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HB HC
KKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH(Xn)PVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSN
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhh---hhhhhhhhh
HD HA
CLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFL_YY
hhhh hhhhhhhhh
HB

フォールディカイン－９（インターロイキン－９）（ＸＸ＿配列番号１０７－（Ｘｎ）－配列番号１０８－（Ｘｎ）－配列番号１０９＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＲＹＰ
XX_LIFSRVKKSVEVLKNNKCPYFSCEQPCNQTTAGNALTFLKSLLEIFQKEKMRGMRGKI(Xn)QGCPTLAG
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhh
HC HD
ILDINFLINKMQEDPASKCHCSANVTSCLCLGIPSDNCTRPCFSERLSQMTNTTMQTRYPLIFSRVKKSV
hhhhhhhhhhhh hhhhhh hhhh hhhhhhhhhh
HA HB HC
EVLKNNKCPYFSCEQPCNQTTAGNALTFLKSLLEIFQKEKMRGMRGKI(Xn)QGCPTLAGILDINFLINKMQ
hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HD HA
EDPASKCHCSANVTSCLCLGIPSDNCTRPCFSERLSQMTNTTMQT_YY
hhhhhh hhhh
HB

フォールディカイン－１５（インターロイキン－１５）（ＸＸ＿配列番号１１０－（Ｘｎ）－配列番号１１１－（Ｘｎ）－配列番号１１２＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＳＧＤ
XX_ASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(Xn)
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
TEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVIS
hhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
LESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(Xn)NSHFL
hh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
TEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLE_YY
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB

フォールディカイン－２１（インターロイキン－２１）（ＸＸ＿配列番号１１３－（Ｘｎ）－配列番号１１４－（Ｘｎ）－配列番号１１５＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＮＴＧ
XX_NERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGS
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
ED(Xn)HKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTG
hhhhhhhhhh---hhhhh hhhhhhhhhh
HA HB

NNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSE
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
D(Xn)HKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSA_YY
hhhhhhhhhh---hhhhh hhhhhhhhhh
HC HD

フォールディカイン－ＴＳＬ（胸腺間質性リンパ球新生因子）（ＸＸ＿配列番号１１６－（Ｘｎ）－配列番号１１７－（Ｘｎ）－配列番号１１８＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＳＬＡＫ、配列番号１１９)
XX_EMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ(Xn)
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
NCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAM
Hhhhhhhhh---hhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhh
HA HB
KTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNR(Xn)NCDFE
hhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hh
HC HD
KIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCA_YY
hhhhhhh---hhhhhhhh hhhhhhhhhhhh
HA HB

フォールディカイン－ＧＭＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）（ＸＸ＿配列番号１２０－（Ｘｎ）－配列番号１２１－（Ｘｎ）－配列番号１２２＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＲＧＳ
XX_LTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCW(Xn)QPWEHVNA
hh hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HA HB
IQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHC
hhhhhhhhhh hhhh hhhhhhhhhhh hh hhhhhhhhhhhhh
HA HB HC
PPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCW(Xn)QPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNET
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhh
HD HA
VEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGL_YY
hhhhhhhhhhh
HB

【0427】

Ｂ）長鎖ヘリックス状の、配列及び対応するホモマーフォールディカイン
ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３のヒト配列

【0428】

再び、本発明者らは、各々の構築物においてシグナルペプチドを除去したが、シグナルペプチドは当然ながら実施形態において保持され得る。

＞ｓｐ｜Ｐ０５２３１｜ＩＬ６＿ヒトインターロイキン－６ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ６ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１２３）
PVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM

＞ｔｒ｜Ａ８Ｋ３Ｆ７｜Ａ８Ｋ３Ｆ７＿ヒトインターロイキン１１ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ１１ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１（配列番号１２４）
PGPPPGPPRVSPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHNLDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRRAGGSSLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTLDWAVRGLLLLKTRL

＞ｓｐ｜Ｐ２９４５９｜ＩＬ１２Ａ＿ヒトインターロイキン－１２サブユニットアルファ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ１２Ａ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２（配列番号１２５）
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS

＞ｓｐ｜Ｑ９ＮＰＦ７｜ＩＬ２３Ａ＿ヒトインターロイキン－２３サブユニットアルファ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ２３Ａ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１２６）
RAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP

＞ｓｐ｜Ｑ８ＮＥＶ９｜ＩＬ２７Ａ＿ヒトインターロイキン－２７サブユニットアルファ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ２７ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２（配列番号１２７）
FPRPPGRPQLSLQELRREFTVSLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHALLGGLGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNLPEEEEEEEEEEEEERKGLLPGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQP

＞ｓｐ｜Ｑ６ＥＢＣ２｜ＩＬ３１＿ヒトインターロイキン－３１ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ３１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１２８）
SHTLPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKMLLKDVEEEKGVLVSQNYTLPCLSPDAQPPNNIHSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTISQQFSECMDLALKSLTSGAQQATT

＞ｓｐ｜Ｑ９ＵＢＤ９｜ＣＬＣＦ１＿ヒトカルジオトロフィン様サイトカイン因子１ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＣＬＣＦ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１２９）
LNRTGDPGPGPSIQKTYDLTRYLEHQLRSLAGTYLNYLGPPFNEPDFNPPRLGAETLPRATVDLEVWRSLNDKLRLTQNYEAYSHLLCYLRGLNRQAATAELRRSLAHFCTSLQGLLGSIAGVMAALGYPLPQPLPGTEPTWTPGPAHSDFLQKMDDFWLLKELQTWLWRSAKDFNRLKKKMQPPAAAVTLHLGAHGF

＞ｓｐ｜Ｐ１３７２５｜ＯＮＣＭ＿ヒトオンコスタチン－Ｍ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＯＳＭ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２（配列番号１３０）
MAAIGSCSKEYRVLLGQLQKQTDLMQDTSRLLDPYIRIQGLDVPKLREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNATLGCVLHRLADLEQRLPKAQDLERSGLNIEDLEKLQMARPNILGLRNNIYCMAQLLDNSDTAEPTKAGRGASQPPTPTPASDAFQRKLEGCRFLHGYHRFMHSVGRVFSKWGESPNRSRRHSPHQALRKGVRRTRPSRKGKRLMTRGQLPR

＞ｓｐ｜Ｑ１６６１９｜ＣＴＦ１＿ヒトカルジオトロフィン－１ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＣＴＦ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１３１）
MSRREGSLEDPQTDSSVSLLPHLEAKIRQTHSLAHLLTKYAEQLLQEYVQLQGDPFGLPSFSPPRLPVAGLSAPAPSHAGLPVHERLRLDAAALAALPPLLDAVCRRQAELNPRAPRLLRRLEDAARQARALGAAVEALLAALGAANRGPRAEPPAATASAASATGVFPAKVLGLRVCGLYREWLSRTEGDLGQLLPGGSA

＞ｓｐ｜Ｐ２６４４１｜ＣＮＴＦ＿ヒト毛様体神経栄養因子 ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＣＮＴＦ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１３２）
MAFTEHSPLTPHRRDLCSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDQWSELTEAERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGIPARGSHYIANNKKM

＞ｓｐ｜Ｐ１５０１８｜ＬＩＦ＿ヒト白血病阻害因子 ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＬＩＦ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１３３）
SPLPITPVNATCAIRHPCHNNLMNQIRSQLAQLNGSANALFIL_YYTAQGEPFPNNLDKLCGPNVTDFPPFHANGTEKAKLVELYRIVVYLGTSLGNITRDQKILNPSALSLHSKLNATADILRGLLSNVLCRLCSKYHVGHVDVTYGPDTSGKDVFQKKKLGCQLLGKYKQIIAVLAQAF

＞ｓｐ｜Ｐ０９９１９｜ＣＳＦ３＿ヒト顆粒球コロニー刺激因子 ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＣＳＦ３ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１３４）
TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP

【0429】

提案されるホモマーフォールディカインクラスＩ：ロングヘリックスバンドルサブクラス。
本開示のこれらの実施形態によるフォールディカインは、図２６に描写されるスキームに従って合成される。

【0430】

太字の二重下線において、本発明者らは、分割ドメインを形成するためにサイトカイン単量体の他方において開かれたループ配列を強調している。インタクトな単量体のＮ及びＣ末端に融合した分割ドメイン分子を斜体としている。（Ｘｎ）は、１つのフォールディカインドメインを他のフォールディカインドメインに連結するために操作された接続リンカーである。リンカー配列は、所望される構造的コンホメーションを提供するように設計されるか、又は異なる長さのＧｌｙ及びＳｅｒの単純に組合せである。有益には、しかしながら、操作されたリンカー配列は、特有の３Ｄコンホメーションを選好する「構造化された」リンカーであり、したがって、本開示の有利な実施形態において、操作されたリンカーは、Ｇｌｙ残基もＳｅｒ残基も含有しないか、又は有益には３個以下、２個以下、若しくは１個以下のＧｌｙ若しくはＳｅｒ残基を含有する。ＸＸ＿及び＿ＹＹは、追加の残基が、除去される、部分的に除去される又は単純に開かれるループ配列の位置において分割ドメインのＮ及びＣ末端に加えられ得ることを指し示す。更には、Ｎ及びＣ末端のそれぞれ右又は左の最大１０個の残基は、設計及び構造的要求に依存して、活性に影響することなく除去されてもよい。そのため、ＸＸ及びＹＹは、開かれるループ配列の部分の全体を含んでもよい任意選択的な配列エレメントであり、下記の対応する配列番号により同定される配列の部分を形成しない。

【0431】

これらのリンカーの示される位置は本開示の一実施形態を表すが；これらのリンカーの位置を変更することが可能であり得、特に、リンカーブリッジの位置は、機能的なフォールディカインの形成を妨げることなくＮ末端方向又はＣ末端方向のいずれかにおいて１～１０又は１～５個のアミノ酸、例えば１、２、３、４又は５個のアミノ酸により変更されてもよいことが理解されるべきである。そのため、これらのリンカーの指し示される位置は近似的であると考えられるべきであり、各々の場合において、周囲の残基の一部を組み込む（又は除去する）ために拡張され得る。例えば、最大１０個のアミノ酸が、（Ｘｎ）位置の各々の側において欠失され得る。

【0432】

参照の容易性のために、ファミリー中の構造的に保存されたヘリックスは、それらが元々のＷＴ配列中で見出される連続的な順序（即ちＨＡ、ＨＢ．．．．）により標識され、並びにヘリックス状セグメントはｈにより標識される。ヘリックス状セグメントがわずかに歪んだヘリックスであり、したがって一部の残基がｓｗｉｓｓｐｄｂにおいてｈとして割り当てられないが定型的ヘリックス状セグメントにより取り囲まれている場合、本発明者らはそれを、ｈ－Ｎｒｅｓ－ｈ（ここで、Ｎｒｅｓは、－として示される任意の数の残基であり得る）として指し示す。ヘリックス状セグメントは、ｓｗｉｓｓｐｄｂソフトウェアを使用して定義され、それらを定義するために使用されるソフトウェアに依存して長さにおいて、及び結晶構造がわずかに異なり得る。

フォールディカイン－６（ＩＬ６＿ヒトインターロイキン－６）（ＸＸ＿配列番号１３５－（Ｘｎ）－配列番号１３６－（Ｘｎ）－配列番号１３７＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＥＳＳＥ、配列番号１３８
XX_SEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQ
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
SSLRALRQM(Xn)LTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAE
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
NNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKK
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HB HC
AKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM(Xn)
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD
LTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETC
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh
HA
LVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFES_YY
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB

フォールディカイン－１１（ヒトインターロイキン１１）（ＸＸ＿配列番号１３９－（Ｘｎ）－配列番号１４０－（Ｘｎ）－配列番号１４１＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＧＳＳＬ、配列番号１４２
XX_SLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTL
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
DWAVRGLLLLKTRL(Xn)SPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHNLDSL
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
PTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRRAGGSSLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMS
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC
RLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTLDWAVRGLLLLKTRL(Xn)SPD
h hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD
PRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHNLDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYL
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
RHVQWLRRAG_YY
hhhhhhhh

フォールディカイン－１２ａ（ヒトインターロイキン－１２サブユニットアルファ）（ＸＸ＿配列番号１４３－（Ｘｎ）－配列番号１４４－（Ｘｎ）－配列番号１４５＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＭＤＰＫ、配列番号１４６
XX_RQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNA
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
S(Xn)RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLE
hhhhhhhhhhhhh hhhh
HA
LTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKIFLDQNM
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhh
HB
LAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(Xn)RNLPVATP
hhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
DPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSR
hhhhhhhhhhhhh hhhh
HA
ETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLL_YY
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB

フォールディカイン－２３ａ（ヒトインターロイキン－２３サブユニットアルファ）（ＸＸ＿配列番号１４７－（Ｘｎ）－配列番号１４８－（Ｘｎ）－配列番号１４９＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＴＧＥＰＳＬＬ、配列番号１５０
XX_LPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHG
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh

AATLSP(Xn)SPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQG
hh hhhhhhhhhhhhhhhh hhh
HA
LRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLS
hh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC
PSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLS(Xn)SPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHP
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HD HA
LVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFT_YY
hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB

フォールディカイン－２７ａ（ヒトインターロイキン－２７サブユニットアルファ）（ＸＸ＿配列番号１５１－（Ｘｎ）－配列番号１５２－（Ｘｎ）－配列番号１５３＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列ＱＧＲ
XX_WTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNLPEEEEEEEEEEEEERKGLLPGALGSALQGPAQVS
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh

WPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGH(Xn)LRREFTV
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhh
HD
SLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHAL
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
LGGLGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNLPEEEEEEEEEEEEERKGLLPGALGSAL
hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC
QGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGH(Xn)
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD
LRREFTVSLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTT
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhh hhhhhhhhhhh
HA HB
LQPFHALLGGLGT_YY
hhhhhhhhhhhh

フォールディカイン－３１（ヒトインターロイキン－３１）（ＸＸ＿配列番号１５４－（Ｘｎ）－配列番号１５５－（Ｘｎ）－配列番号１５６＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＤＮＫＳ、配列番号１５７
XX_VIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTISQQFSECMDLALKSLTSGAQQATT(Xn)SHTL
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
PVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKMLLKDVEEEKGVLVSQNYTLPCLSPDAQPPNNIHSPAIRAYLKTIRQ
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
LDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTISQQFSECMDLALKSLTSGAQQATT(Xn)S
h hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
HTLPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKMLLKDVEEEKGVLVSQNYTLPCLSPDAQPPNNIHSPAIRAYLKT
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhh
HA HB
IRQL_YY
Hhhh

フォールディカイン－ＣＬＣＦ１（ヒトカルジオトロフィン様サイトカイン因子１）（ＸＸ＿配列番号１５８－（Ｘｎ）－配列番号１５９－（Ｘｎ）－配列番号１６０＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＡＡＴ
XX_AELRRSLAHFCTSLQGLLGSIAGVMAALGYPLPQPLPGTEPTWTPGPAHSDFLQKMDDFWLLKELQTW
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
LWRSAKDFNRLKKKMQPP(Xn)PGPGPSIQKTYDLTRYLEHQLRSLAGTYLNY
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
LGPPFNEPDFNPPRLGAETLPRATVDLEVWRSLNDKLRLTQNYEAYSHLLCYLRGLNRQAATAELRRSLA
hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhh
HB
HFCTSLQGLLGSIAGVMAALGYPLPQPLPGTEPTWTPGPAHSDFLQKMDDFWLLKELQTWLWRSAKDFNR
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
LKKKMQPP(Xn)PGPGPSIQKTYDLTRYLEHQLRSLAGTYLNYLGPPFNEPDF
hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
NPPRLGAETLPRATVDLEVWRSLNDKLRLTQNYEAYSHLLCYLRGLNR_YY
hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB

フォールディカイン－ＯＮＣＭ（ヒトオンコスタチン－Ｍ）（ＸＸ＿配列番号１６１－（Ｘｎ）－配列番号１６２－（Ｘｎ）－配列番号１６３＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＫＡＱＤＬＥＲＳＧＬＮ、配列番号１６４
XX_NIEDLEKLQMARPNILGLRNNIYCMAQLLDNSDTAEPTKAGRGASQPPTPTPASDAFQRKLEGCRFLH
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh
HC HD
GYHRFMHSVGRVFSKWGE(Xn)SCSKEYR
hhhhhhhhhhhhhhh hh

VLLGQLQKQTDLMQDTSRLLDPYIRIQGLDVPKLREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNATLGCV
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HA HB
LHRLADLEQRLPKAQDLERSGLNIEDLEKLQMARPNILGLRNNIYCMAQLLDNSDTAEPTKAGRGASQPP
hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC
TPTPASDAFQRKLEGCRFLHGYHRFMHSVGRVFSKWGE(Xn)SCSKEYRVLLGQLQKQTDLMQDTSRLLDPYIRIQGLD
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh
HD HA
VPKLREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNATLGCVLHRLADLEQRLPK_YY
hhhhhhhhh hhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HB

フォールディカイン－ＣＴＦ１（ヒトカルジオトロフィン－１）（ＸＸ＿配列番号１６５－（Ｘｎ）－配列番号１６６－（Ｘｎ）－配列番号１６７＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＮＰＲＡ、配列番号１６８
XX_PRLLRRLEDAARQARALGAAVEALLAALGAANRGPRAEPPAATASAASATGVFPAKVLGLRVCGLYRE
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HC
WLSRTEGDLGQLLP(Xn)HLEAKIRQTHSLAHLLTKYAEQLLQEYVQL
hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
QGDPFGLPSFSPPRLPVAGLSAPAPSHAGLPVHERLRLDAAALAALPPLLDAVCRRQAELNPRAPRLLRR
Hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhh
HB
LEDAARQARALGAAVEALLAALGAANRGPRAEPPAATASAASATGVFPAKVLGLRVCGLYREWLSRTEGD
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
LGQLLP(Xn)HLEAKIRQTHSLAHLLTKYAEQLLQEYVQLQGDPFGL
hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
PSFSPPRLPVAGLSAPAPSHAGLPVHERLRLDAAALAALPPLLDAVCRRQAEL_YY
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB

フォールディカイン－ＣＮＴＦ（ヒト毛様体神経栄養因子）（ＸＸ＿配列番号１６９－（Ｘｎ）－配列番号１７０－（Ｘｎ）－配列番号１７１＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＴＰＴＥＧＤ、配列番号１７２
XX_FHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRS
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
IHDLRFISSHQTGIPARGSHYIANNKKM(Xn)PHRRDLCSRSIWLARKIRSDLTALTESYVK
hhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
HQGLNKNINLDSADGMPVASTDQWSELTEAERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIH
hh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh
HB
TLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFIS
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
SHQ(Xn)PHRRDLCSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNI
h hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
NLDSADGMPVASTDQWSELTEAERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHF_YY
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB

フォールディカイン－ＬＩＦ（ヒト白血病阻害因子）（ＸＸ＿配列番号１７３－（Ｘｎ）－配列番号１７４－（Ｘｎ）－配列番号１７５＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＮＰＳＡ、配列番号１７６
XX_LSLHSKLNATADILRGLLSNVLCRLCSKYHVGHVDVTYGPDTSGKDVFQKKKLGCQLLGKYKQIIAVL
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
AQAF(Xn)HPCHNNLMNQIRSQLAQLNGSANALFILYYTAQGEPFPNNLDKLCGPNV
hhhhhhhhhhhh---hhhhhhhhhhhh
HA
TDFPPFHANGTEKAKLVELYRIVVYLGTSLGNITRDQKILNPSALSLHSKLNATADILRGLLSNVLCRLC
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC
SKYHVGHVDVTYGPDTSGKDVFQKKKLGCQLLGKYKQIIAVLAQAF(Xn)HPCHNNL
hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh h
HD
MNQIRSQLAQLNGSANALFILYYTAQGEPFPNNLDKLCGPNVTDFPPFHANGTEKAKLVELYRIVVYLGT
hhhhhhhhhhh---hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
SLGNITRDQKIL_YY
hhhhhhhhhhhh

フォールディカイン－ＣＳＦ３（ヒト顆粒球コロニー刺激因子）（ＸＸ＿配列番号１７７－（Ｘｎ）－配列番号１７８－（Ｘｎ）－配列番号１７９＿ＹＹ）
サイトカイン単量体のうちの１つにおいて開かれる配列、ＥＧＩＳ、配列番号１８０
XX_ELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSY
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh

RVLRHLAQP(Xn)SSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEELVLLGHSLGI
hhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
PWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGM
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC
APALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(Xn)SSLPQSFLLKCLEQ
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD
VRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQG
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
LLQAL_YY
Hhhhh

【0433】

クラスＩＩヘリックス型サイトカイン
タンパク質のＩＬ１０様クラスは、ＩＬ１０、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２４、及びＩＬ２６を含む。ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ及びＩＬ２９（ＩＦＮλ）、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）及びＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１））、ＩＦＮγ。

【0434】

下記に本発明者らは、この構造ファミリーに含まれるインターロイキンの各々を列記する。

＞ｓｐ｜Ｐ２２３０１｜ＩＬ１０＿ヒトインターロイキン－１０ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ１０ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１８１）
QSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN

＞ｓｐ｜Ｑ９ＵＨＤ０｜ＩＬ１９＿ヒトインターロイキン－１９ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ１９ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２（配列番号１８２）
VDNHGLRRCLISTDMHHIEESFQEIKRAIQAKDTFPNVTILSTLETLQIIKPLDVCCVTKNLLAFYVDRVFKDHQEPNPKILRKISSIANSFLYMQKTLRQCQEQRQCHCRQEATNATRVIHDNYDQLEVHAAAIKSLGELDVFLAWINKNHEVMFSA

＞ｓｐ｜Ｑ９Ｎ＿ＹＹ１｜ＩＬ２０＿ヒトインターロイキン－２０ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ２０ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２（配列番号１８３）
KTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNIDIRILRRTESLQDTKPANRCCLLRHLLRLYLDRVFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKKDLRLCHAHMTCHCGEEAMKKYSQILSHFEKLEPQAAVVKALGELDILLQWMEETE

＞ｓｐ｜Ｑ９ＧＺＸ６｜ＩＬ２２＿ヒトインターロイキン－２２ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ２２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１８４）
APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

＞ｓｐ｜Ｑ９ＮＰＨ９｜ＩＬ２６＿ヒトインターロイキン－２６ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＬ２６ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１８５）
HKQSSFTKSCYPRGTLSQAVDALYIKAAWLKATIPEDRIKNIRLLKKKTKKQFMKNCQFQEQLLSFFMEDVFGQLQLQGCKKIRFVEDFHSLRQKLSHCISCASSAREMKSITRMKRIFYRIGNKGIYKAISELDILLSWIKKLLESSQ

＞ｓｐ｜Ｑ８ＩＺＪ０｜ＩＦＮＬ２＿ヒトインターフェロンラムダ－２ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＬ２ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１（配列番号１８６）
RGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCRCHSRLFPRTWDLRQLQVRERPMALEAELALTLKVLEATADTDPALVDVLDQPLHTLHHILSQFRACIQPQPTAGPRTRGRLHHWLYRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV

＞ｓｐ｜Ｑ８ＩＺＩ９｜ＩＦＮＬ３＿ヒトインターフェロンラムダ－３ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＬ３ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２（配列番号１８７）
VPVARLRGALPDARGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCKCRSRLFPRTWDLRQLQVRERPVALEAELALTLKVLEATADTDPALGDVLDQPLHTLHHILSQLRACIQPQPTAGPRTRGRLHHWLHRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV

＞ｓｐ｜Ｑ８ＩＵ５４｜ＩＦＮＬ１＿ヒトインターフェロンラムダ－１ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＬ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１８８）
GPVPTSKPTTTGKGCHIGRFKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRERPVALEAELALTLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQACIQPQPTAGPRPRGRLHHWLHRLQEAPKKESAGCLEASVTFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTHPEST

＞ｓｐ｜Ｐ０１５６２｜ＩＦＮＡ１＿ヒトインターフェロンアルファ－１／１３ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＡ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１８９）
DLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE

＞ｓｐ｜Ｐ０１５７４｜ＩＦＮＢ＿ヒトインターフェロンベータ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＢ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１９０）
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR_YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN

＞ｓｐ｜Ｐ０５０００｜ＩＦＮＷ１＿ヒトインターフェロンオメガ－１ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＷ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２（配列番号１９１）
LGCDLPQNHGLLSRNTLVLLHQMRRISPFLCLKDRRDFRFPQEMVKGSQLQKAHVMSVLHEMLQQIFSLFHTERSSAAWNMTLLDQLHTGLHQQLQHLETCLLQVVGEGESAGAISSPALTLRRYFQGIRVYLKEKKYSDCAWEVVRMEIMKSLFLSTNMQERLRSKDRDLGSS

＞ｓｐ｜Ｑ８６ＷＮ２｜ＩＦＮＥ＿ヒトインターフェロンイプシロン ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＥ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１（配列番号１９２）
LDLKLIIFQQRQVNQESLKLLNKLQTLSIQQCLPHRKNFLLPQKSLSPQQYQKGHTLAILHEMLQQIFSLFRANISLDGWEENHTEKFLIQLHQQLEYLEALMGLEAEKLSGTLGSDNLRLQVKMYFRRIHDYLENQDYSTCAWAIVQVEISRCLFFVFSLTEKLSKQGRPLNDMKQELTTEFRSPR

＞ｓｐ｜Ｑ９Ｐ０Ｗ０｜ＩＦＮＫ＿ヒトインターフェロンカッパ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＫ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２（配列番号１９３）
LDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAFNIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCLEEDKNENEDMKEMKENEMKPSEARVPQLSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRCL_YYFYKFTALFRRK

＞ｓｐ｜Ｐ０１５７９｜ＩＦＮＧ＿ヒトインターフェロンガンマ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＧ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（配列番号１９４）
QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ

【0435】

提案されるホモマーフォールディカインクラスＩＩ
クラスＩＩサイトカインのホモ二量体フォールディカインは、好適には図２７のスキームに従ってアセンブルされる。インタクトな単量体のＮ及びＣ末端に融合した分割ドメイン／分子を斜体としている。（Ｘｎ）は接続リンカーである。

【0436】

スワップドドメインタンパク質、例えばＩＬ－１０及びＩＦＮγにおいて、Ｘｎは、単量体サイトカイン中に導入される設計されたＳｎループと同等の天然配列である、太字の、二重下線を引いた残基に対応する。クラスＩＩサイトカインのスワップドドメインフォールディカインは、好適には図２８のスキームに従ってアセンブルされる。

【0437】

非スワップドドメインサイトカインにおいて、（Ｘｎ）は、１つのフォールディカインドメインを他のフォールディカインドメインに連結するために操作された接続リンカーである。リンカー配列は、所望される構造的コンホメーションを提供するように設計されるか、又は異なる長さのＧｌｙ及びＳｅｒの単純に組合せである。有益には、しかしながら、操作されたリンカー配列は、特有の３Ｄコンホメーションを選好する「構造化された」リンカーであり、したがって、本開示の有利な実施形態において、操作されたリンカーは、Ｇｌｙ残基もＳｅｒ残基も含有しないか、又は５個以下、有益には３個以下、２個以下、若しくは１個以下のＧｌｙ若しくはＳｅｒ残基を含有する。ＸＸ＿及び＿ＹＹは、追加の残基がＮ及びＣ末端に付加され得ること、又は代替的に新規Ｎ及びＣ末端においてＸＸ＿及びＹＹ＿の位置のそれぞれ右若しくは左の最大１０個の残基が、設計及び構造的要求に依存して、活性に影響することなく欠失され得ることを指し示す。そのため、ＸＸ及びＹＹは、任意選択的な配列エレメントであり、下記の対応する配列番号により同定される配列の部分を形成しない。

【0438】

これらのリンカーの示される位置は本開示の一実施形態を表すが；これらのリンカーの位置を変更することが可能であり得、特に、リンカーブリッジの位置は、機能的なフォールディカインの形成を妨げることなくＮ末端方向、Ｃ末端方向、又は両方において１～１０又は１～５個のアミノ酸、例えば１、２、３、４又は５個のアミノ酸により変更されてもよいことが理解されるべきである。そのため、これらのリンカーの指し示される位置は近似的であると考えられるべきであり、各々の場合において、周囲の残基の一部を組み込む（又は除去する）ために拡張され得る。例えば、最大１０個のアミノ酸が、（Ｘｎ）位置の各々の側において欠失され得る。

【0439】

参照の容易性のために、ファミリー中の構造的に保存されたヘリックスは、それらが元々のＷＴ配列中で見出される連続的な順序（即ちＨＡ、ＨＢ．．．．）により標識され、並びにヘリックス状セグメントはｈにより標識される。ヘリックス状セグメントがわずかに歪んだヘリックスであり、したがって一部の残基がｓｗｉｓｓｐｄｂにおいてｈとして割り当てられないが定型的ヘリックス状セグメントにより取り囲まれている場合、本発明者らはそれを、ｈ－Ｎｒｅｓ－ｈ（ここで、Ｎｒｅｓは、－として示される任意の数の残基であり得る）として指し示す。ヘリックス状セグメントは、ｓｗｉｓｓｐｄｂソフトウェアを使用して定義され、それらを定義するために使用されるソフトウェアに依存して長さにおいて、及び結晶構造がわずかに異なり得る。（ＮｔＣｔ）は、１つの単量体のＮ及びＣ末端を他方に接合するために設計されたリンカーである。

【0440】

フォールディカイン－１０（ＩＬ１０＿ヒトインターロイキン－１０）（ＸＸ＿配列番号１１－（ＮｔＣｔ）－配列番号１２－ＹＹ）
それは天然のスワップドドメインサイトカインであるのでループは除去されない。太字の、二重下線を引いたボックスは、フォールディカインを作製するために（下記に指し示されるように）単量体サイトカインのヘリックス間リンカーとスワップされてもよいリンカー配列に対応する。そのため、下記の配列中の（Ｘｎ）は、下記に指し示される天然配列であってもよいか、又は別の設計されたブリッジング配列であってもよい。
XX_CTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQ
hhh hhhhhhhhhhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
AENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINY
hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhh
HC HD HE
IEAYMTMKIRN(NtCt)PNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEV
hhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HF HA HB
MPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIF
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhh
HC HD HE
INYIEAYMTM_YY
Hhhhhhhhhh
HF

フォールディカイン－１９（ヒトインターロイキン－１９）（ＸＸ＿配列番号１９５－（Ｘｎ）－配列番号１９６－（ＮｔＣｔ）－配列番号１９７－（Ｘｎ）－配列番号１９８＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＣＱＱＣＲ；配列番号１９９）
XX_VDNHGLRRCLISTDMHHIEESFQEIKRAIQAKDTFPNVTILSTLETLQIIKPLDVCCVTKNLLAFYVD
hhhhhhhh----hhhh hh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
RVFKDHQEPNPKILRKISSIANSFLYMQKTLRQ(Xn)QEATNATRVIHDNYDQLEVHAAAIKSLGELDVFLA
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhh hhhhh
HC HD HE HF
WINKNHEVMFSA(NtCt)VDNHGLRRCLISTDMHHIEESFQEIKRAIQAKDTFPNVTILSTLETLQIIKP
hhhhh hhhhhhh----hhhh hh h
HA
LDVCCVTKNLLAFYVDRVFKDHQEPNPKILRKISSIANSFLYMQKTLRQ(Xn)QEATNATRVIHDNYDQLEV
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh h
HB HC HD
HAAAIKSLGELDVFLAWINKNHEVMFSA_YY
hhhhhhh hhhhhhhhhh
HE HF

フォールディカイン－２０（ヒトインターロイキン－２０）（ＸＸ＿配列番号２００－（Ｘｎ）－配列番号２０１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２０２－（Ｘｎ）－配列番号２０３＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＭＴＣＨＣ；配列番号２０４）
XX_KTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNIDIRILRRTESLQDTKPANRCCLLRHLLRLYLDR
hhhhhhhh---hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
VFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKKDLRLCHAH(Xn)GEEAMKKYSQILSHFEKLEPQAAVVKALGELD
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hh
HC HD HE
ILLQWMEETE(NtCT)KTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNIDIRILRRTESLQDTKPANR
hhhhhhh hhhhhhhh---hhhhh hhhh
HF HA
CCLLRHLLRLYLDRVFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKKDLRLCHAH(Xn)GEEAMKKYSQILSHFEKL
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
EPQAAVVKALGELDILLQWMEETE_YY
hhhhhhh hhhhhhhhh
HE HF

フォールディカイン－２２（ヒトインターロイキン－２２）（ＸＸ＿配列番号２０５－（Ｘｎ）－配列番号２０６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２０７－（Ｘｎ）－配列番号２０８＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＳＴＣＨＩＥＧＤＤＬ；配列番号２０９）
XX_CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQ
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh---hhhh
HA HB
SDRFQPYMQEVVPFLARLSNRL(Xn)HIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI(NtCt)
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HC HD HE HF
APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEE
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
VLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRL(Xn)HIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI-YY
hhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HC HD HE HF

フォールディカイン－２６（ヒトインターロイキン－２６）（ＸＸ＿配列番号２１０－（Ｘｎ）－配列番号２１１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２１２－（Ｘｎ）－配列番号２１３＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＳＣＡＳＳＡＲＥ；配列番号２１４）
XX_HKQSSFTKSCYPRGTLSQAVDALYIKAAWLKATIPEDRIKNIRLLKKKTKKQFMKNCQFQEQLLSFFM
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhhh
HA HB
EDVFGQLQLQGCKKIRFVEDFHSLRQKLSHCI(Xn)MKSITRMKRIFYRIGNKGIYKAISELDILLSWIKKL
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhh
HC HD HE HF
LESSQ(NtCt)HKQSSFTKSCYPRGTLSQAVDALYIKAAWLKATIPEDRIKNIRLLKKKTKKQFMKNCQF
hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhh
HA
QEQLLSFFMEDVFGQLQLQGCKKIRFVEDFHSLRQKLSHCI(Xn)MKSITRMKRIFYRIGNKGIYKAISELD
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhh h
HB HC HD HE
ILLSWIKKLLESSQ_YY
hhhhhhhhhhhh
HF

フォールディカイン－Ｌ２（ヒトインターフェロンラムダ－２）（ＸＸ＿配列番号２１５－（Ｘｎ）－配列番号２１６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２１７－（Ｘｎ）－配列番号２１８＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＴＲＧ；配列番号２１９）
XX_RGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCRCHSRLFPRTWDLRQLQVRERPMALEAELALTL
hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
KVLEATADTDPALVDVLDQPLHTLHHILSQFRAC(Xn)RLHHWLYRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTR
hhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD HE HF
DLNCVASGDLCV(NtCt)RGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCRCHSRLFPRTWDLRQLQ
hhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
VRERPMALEAELALTLKVLEATADTDPALVDVLDQPLHTLHHILSQFRAC(Xn)RLHHWLYRLQEAPKKESPG
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hh
HB HC HD
CLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV_YY
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HE HF

フォールディカイン－Ｌ３（ヒトインターフェロンラムダ－３）（ＸＸ＿配列番号２２０－（Ｘｎ）－配列番号２２１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２２２－（Ｘｎ）－配列番号２２３＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＴＲＧＲ；配列番号２２４）
XX_RGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCKCRSRLFPRTWDLRQLQVRERPVALEAELALTL
hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
KVLEATADTDPALGDVLDQPLHTLHHILSQLRAC(Xn)RLHHWLHRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTR
hhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD HE-HF
DLNCVASGDLCV(NtCt)RGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCKCRSRLFPRTWDLRQLQ
hhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
VRERPVALEAELALTLKVLEATADTDPALGDVLDQPLHTLHHILSQLRAC(Xn)RLHHWLHRLQEAPKKESPG
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hh
HB HC HD
CLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV_YY
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HE-HF

フォールディカイン－Ｌ１（ヒトインターフェロンラムダ－１）（ＸＸ＿配列番号２２５－（Ｘｎ）－配列番号２２６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２２７－（Ｘｎ）－配列番号２２８＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＴＲＧＲ；配列番号２２９）
XX_TGKGCHIGRFKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRER
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
PVALEAELALTLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQAC(Xn)LHHWLHRLQEAPKKESAGCLEASV
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhh
HB HC HD HE
TFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTHPEST(NtCt) TGKGCHIGRFKSLSPQELASFKK
h hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhh
HF
ARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRERPVALEAELALTLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLH
hhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HA HB HC
HILSQLQAC(Xn)LHHWLHRLQEAPKKESAGCLEASVTFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTHPEST_YY
hhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh
HD HE HF

フォールディカイン－Ａ１（ヒトインターフェロンアルファ－１／１３）（ＸＸ＿配列番号２３０－（Ｘｎ）－配列番号２３１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２３２－（Ｘｎ）－配列番号２３３＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＭＱＥＥＲＶＧＥＴＰＬＭＮ；配列番号２３４）
XX_SLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFT
hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
TKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACV(Xn)ADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMR
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh
HC HD HE-HF
SLSLSTNLQERLRRKE(NtCt)SLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQ
hhhhh hhhhhhhhhhh
HA
KAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACV(Xn)ADSILAVKKYFRRITLY
hhhhhhhhhhhh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
LTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE_YY
hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HE-HF

フォールディカイン－Ａ２（ヒトインターフェロンアルファ－２ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＩＦＮＡ２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１（ＸＸ＿配列番号２３５－（Ｘｎ）－配列番号２３６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２３７－（Ｘｎ）－配列番号２３８＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫ；配列番号２３９）
XX_SLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAA
hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh hhhhhh
HA HB
WDETLLDKFYTELYQQLNDLEACV(Xn)EDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTN
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD HE-HF
LQESLRSKE(NtCt)SLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQ
hhhhhhhhhhh hhhhhhhhh
HA HB
IFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACV(Xn)EDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVV
hhh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh
HC HD HE-HF
RAEIMRSFSLSTN _YY
hhhhhhhhh

フォールディカイン－ＩＦＮＢ（ヒトインターフェロンベータ）（ＸＸ＿配列番号２４０－（Ｘｎ）－配列番号２４１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２４２－（Ｘｎ）－配列番号２４３＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＫＥＤＦＴＲＧＫ；配列番号２４４）
XX_MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFA
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
IFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLE(Xn)LMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVE
hh hh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhh
HC HD
ILRNFYFINRLTGYLRN(NtCt)MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQL
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh hhhh
HE-HF HA
QQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLE(Xn)LMSSLHLKRYYG
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh
HB HC
RILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN_YY
hhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE-HF

フォールディカイン－ＩＦＮＷ１（ヒトインターフェロンオメガ－１）（ＸＸ＿配列番号２４５－（Ｘｎ）－配列番号２４６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２４７－（Ｘｎ）－配列番号２４８＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＬＬＱＶＶＧＥＧＥＳＡＧＡＩＳ；配列番号２４９）
XX_LGCDLPQNHGLLSRNTLVLLHQMRRISPFLCLKDRRDFRFPQEMVKGSQLQKAHVMSVLHEMLQQIFS
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
LFHTERSSAAWNMTLLDQLHTGLHQQLQHLETC(Xn)SPALTLRRYFQGIRVYLKEKKYSDCAWEVVRMEIM
hhhhh hhhhhhh---hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh
HC HD HE-HF
KSLFLSTNMQ(NtCt)CDLPQNHGLLSRNTLVLLHQMRRISPFLCLKDRRDFRFP
hhhhhhh hhhhhhhhhhhhh
HA
QEMVKGSQLQKAHVMSVLHEMLQQIFSLFHTERSSAAWNMTLLDQLHTGLHQQLQHLETC(Xn)SPALTLRR
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhh hhhhhhh---hhhh hhhhh
HB HC
YFQGIRVYLKEKKYSDCAWEVVRMEIMKSLFLSTNMQ_YY
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE-HF

フォールディカイン－ＩＦＮＥ（ヒトインターフェロンイプシロン）（ＸＸ＿配列番号２５０－（Ｘｎ）－配列番号２５１－（ＮｔＣｔ）－配列番号２５２－（Ｘｎ）－配列番号２５３＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＧＬＥＡＥＫＬＳＧＴＬＧ；配列番号２５４）
XX_LDLKLIIFQQRQVNQESLKLLNKLQTLSIQQCLPHRKNFLLPQKSLSPQQYQKGHTLAILHEMLQQIF
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh

SLFRANISLDGWEENHTEKFLIQLHQQLEYLEALM(Xn)SDNLRLQVKMYFRRIHDYLENQDYSTCAWAIVQ
hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhh

VEISRCLFFVFSLTEKLSKQGRPLNDMKQELTTEFRSPR(NtCt)LDLKLIIFQQRQVNQESLKLLNKLQ
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh

TLSIQQCLPHRKNFLLPQKSLSPQQYQKGHTLAILHEMLQQIFSLFRANISLDGWEENHTEKFLIQLHQQ
Hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh

LEYLEALM(Xn)SDNLRLQVKMYFRRIHDYLENQDYSTCAWAIVQVEISRCLFFVFSLTEKLSKQGRPLNDM
hhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhh
KQELTTEFRSPR_YY
hhhhhhh

フォールディカイン－ＩＦＮＫ（ヒトインターフェロンカッパ）（ＸＸ＿配列番号２５５－（Ｘｎ）－配列番号２５６－（ＮｔＣｔ）－配列番号２５７－（Ｘｎ）－配列番号２５８＿ＹＹ）
（ループは除去されている ＥＥＤＫＮＥＮＥＤＭＫＥＭＫＥＮＥＭＫＰＳＥＡＲ；配列番号２５９）
XX_LDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAF
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
NIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCL(Xn)VPQLSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVR
hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhh
HC HD
VEIRRCL_YYFYKFTALFRRK(NtCt)LDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQE
hhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh
HE-HF HA
FLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAFNIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCL(Xn)VPQLSSLELR
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhh
HB HC
RYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRCL_YYFYKFTALFRRK_YY
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE-HF

フォールディカイン－ＩＦＮＧ（ヒトインターフェロンガンマ）（ＸＸ－配列番号１４－（ＮｔＣｔ）－配列番号１５－ＹＹ）
それは天然のスワップ済みＩＬであるのでループは除去されないXX_QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQK
hhhhhhhhhhhh hh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hh
HA HB
SVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPMLF(NtCt)
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhh hhhhhh
HC HD HE HF
MQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDD
hhhhhhhhhhhhh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
QSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ
hhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhhhh
HC HD HE HF
MLFRGRRASQ_YY

フォールディカイン－ＩＦＮＧ（ヒトインターフェロンガンマ）（ＯＲＫＩＦＮｇ－００２）（配列番号１８）
GSQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQK
hhhhhhhhhhhh hh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hh
HA HB
SVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMASKPHPGQLWA
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhh hhhhhh
HC HD HE HF
YVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETI
hhhhhhhhhhhh hh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh
HA HB HC
KEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAA
hhhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhh hhhhhh
HC HD HE HF

【0441】

クラスＩ及びクラスＩＩヘテロ二量体フォールディカイン
単一分子ヘテロ二量体フォールディカインは、図６Ａ及び図６Ｂに指し示されるスキームに従ってクラスＩサイトカインとクラスＩＩサイトカインとの間で形成されてもよい。

【0442】

Ａ）図６Ａの構築スキームの様々な実施形態に従ってヘテロ二量体フォールディカインを形成するためにクラスＩＩサイトカインと組み合わせられてもよいクラスＩサイトカインは、ショートヘリックスバンドルサイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＴＳＬＰ、ＧＭＣＳ－Ｆ、ＣＳＦ１、及びＣＳＦ２；並びにロングヘリックスバンドルサイトカイン、例えばＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３を含む。

【0443】

図６Ａの構築スキームの様々な実施形態に従ってヘテロ二量体フォールディカインを形成するためにクラスＩサイトカインと組み合わせられてもよいクラスＩＩサイトカインは、ＩＬ１０様クラスのタンパク質ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２４、及びＩＬ２６；ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ及びＩＬ２９（ＩＦＮλ）；Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）；ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）；ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）；ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）；ＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１））及びＩＦＮγを含む。

【0444】

クラスＩ／クラスＩＩ フォールディカインヘテロ二量体
この態様及び本開示の様々な実施形態にしたがったフォールディカインは、１つの単量体のＮ末端を共有結合的に他の単量体のＣ末端に及びその逆に連結して単一のポリペプチドを作出することにより形成される（黒線、右上パネル；図６Ａを参照）。追加的に、元々の単量体ドメインのうちの１つにおける隣接するαヘリックスの間のリンカー領域（黒線；右下パネル；図６Ａを参照）は開かれて、フォールディカイン中の新規Ｎ及びＣ末端（Ｎ＿Ｎ－ｔｅｒ及びＮ－Ｃ－ｔｅｒ；左下パネル；図６Ａ）が作出される。新規Ｎ及びＣ末端が元々のサイトカインＩ型配列において作出される。

【0445】

例として、この態様の１つの実施形態にしたがったヘテロ二量体ＩＬ－２／ＩＬ－２２ポリペプチドが下記に示される（配列番号１９７）。この配列において、下線で本発明者らは分割ＩＬ－２ポリペプチド配列を、及び斜体で「連続的な」ＩＬ－２２配列を示している。太字は、新規フォールディカインタンパク質のために新規Ｎ及びＣ末端を作出するために開かれるＩＬ－２のループである。開かれる正確な位置及び保たれるべき残基は変動することができ、以前に記載されたように、任意の数の太字残基を含み得る。

ＩＬ－２／ＩＬ－２２（フォールディカイン２－２２＿６Ａ；ＸＸ＿配列番号２６０－（Ｘｎ）－配列番号２６１－（Ｘｎ）－配列番号２６２＿ＹＹ）

XX-FHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(Xn)
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQ
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh---hhhh
HA HB
SDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
Hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HC HD HE HF
(Xn)TSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKN-YY
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh hhh hhhhhhh---hhhhhh
HA HB

【0446】

Ｂ）図６Ｂの構築スキームの様々な実施形態に従ってヘテロ二量体フォールディカインを形成するためにクラスＩＩサイトカインと組み合わせられてもよいクラスＩサイトカインは、ショートヘリックスバンドルサイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１及びＧＭＣＳ－Ｆ；並びにロングヘリックスバンドルサイトカイン、例えばＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３を含む。

【0447】

図６Ｂの構築スキームの様々な実施形態に従ってヘテロ二量体フォールディカインを形成するためにクラスＩサイトカインと組み合わせられてもよいクラスＩＩサイトカインは、ＩＬ１０様クラスのタンパク質ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２４、及びＩＬ２６；ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ及びＩＬ２９（ＩＦＮλ）；Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）；ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）；ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）；ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）；ＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１））及びＩＦＮγを含む。

【0448】

分割ドメインサイトカイン単量体がクラスＩサイトカイン又はクラスＩＩサイトカインのいずれにより提供されるのかに従って２つの異なるスキームが用いられてもよい。

【0449】

クラスＩ／クラスＩＩ フォールディカインヘテロ二量体
第１の例において、クラスＩ フォールディカインは分割され、並びに連続的なクラスＩＩサイトカインがクラスＩサイトカインの分割Ｎ及びＣ末端部分の間に挿入される。これらの実施形態に従って、クラスＩ及びクラスＩＩサイトカインは、それぞれ野生型クラスＩ及びクラスＩＩサイトカインの構造と比較して逆転しており、野生型サイトカインのＣ末端部分は対応するフォールディカイン部分／ドメインのＮ末端部分を形成しており、及び野生型サイトカインのＮ末端部分は対応するフォールディカイン部分／ドメインのＣ末端部分を形成している。

【0450】

この態様及び本開示の様々な実施形態にしたがったフォールディカインは、例えば、第２及び第３のαヘリックスの間で、クラスＩサイトカイン中のリンカー領域／ループを開いて新規Ｎ及びＣ末端を作出することにより形成される。同様に、クラスＩＩサイトカイン中のリンカー領域／ループは、クラスＩサイトカインの元々のＮ及びＣ末端に融合するための新規Ｎ及びＣ末端を作出するために開かれる。次に、リンカー（Ｘｎ）が使用されて、クラスＩサイトカインの元々のＣ末端がクラスＩＩサイトカインの新規Ｎ末端に、及びクラスＩサイトカインの元々のＮ末端がクラスＩＩサイトカインの新規Ｃ末端に接続される。クラスＩサイトカイン中の開かれるループは、下記の配列において太字で示される。

【0451】

例として、この実施形態にしたがったヘテロ二量体ＩＬ－２／ＩＬ－２２ポリペプチドが下記に示される（配列番号１９８）。この配列において、斜体で本発明者らは分割ＩＬ－２ポリペプチド配列を、及び下線で「連続的な」（逆転した）ＩＬ－２２配列を示している。太字は、新規フォールディカインタンパク質のために新規Ｎ及びＣ末端を作出するために開かれるＩＬ－２のループである。開かれる正確な位置及び保たれるべき残基は変動することができ、以前に記載されたように、任意の数の太字残基を含み得る。

ＩＬ－２／ＩＬ－２２（フォールディカイン２－２２＿６Ｂ；ＸＸ＿配列番号２６３－（Ｘｎ）－配列番号２６４－（ＮｔＣｔ）－配列番号２６５－（Ｘｎ）－配列番号２６６＿ＹＹ）

XX-FHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(Xn)LHIQRNVQKLKDTVKK
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD HD
LGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI(NtCt)CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSE
hhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh
HE HF HA
RCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRL(Xn)TSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNP
hhhhhhhhhhhhh hhhh hhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HA
KLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKN-YY
hhhhhh hhh hhhhhhh---hhhhhh
HB

【0452】

第２の例において、クラスＩＩ フォールディカインは分割され、並びに連続的なクラスＩサイトカインがクラスＩＩサイトカインの分割Ｎ及びＣ末端部分の間に挿入される。これらの実施形態に従って、クラスＩ又はクラスＩＩサイトカインのいずれも逆転されず、その結果、αヘリックスの順序は、（分割単量体ドメインの例外と共に）対応する野生型サイトカインの順序にしたがったものである。

【0453】

この態様及び本開示の様々な実施形態にしたがったフォールディカインは、例えば、第３及び第４のαヘリックスの間で、クラスＩＩサイトカイン中のリンカー領域／ループを開いて新規Ｎ及びＣ末端を作出することにより形成される。次に、リンカー（Ｘｎ）が使用されて、分割クラスＩＩサイトカイン配列の新規Ｃ及びＮ末端が、連続的なクラスＩサイトカインドメインのそれぞれ元々のＮ及びＣ末端に接続される。

【0454】

例として、この実施形態にしたがったヘテロ二量体ＩＬ－２２／ＩＬ－２ポリペプチドが下記に示される（配列番号１９９）。この配列において、斜体で本発明者らは分割ＩＬ－２２ポリペプチド配列を、及び下線で「連続的な」ＩＬ－２配列を示している。

ＩＬ－２２／ＩＬ－２（フォールディカイン ２２－２＿６Ｂ；ＸＸ＿配列番号２６７－（Ｘｎ）－配列番号２６８－（Ｘｎ）－配列番号２６９＿ＹＹ）
ＩＬ－２２は分割され、及び斜体の残基として示される。IL-2は連続的であり、及び下線を引いた残基として示される。

XX_CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQ
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh---hhhh
HA HB
SDRFQPYMQEVVPFLARLSNRL(Xn)TSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATEL
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh hhh
HC HA
KHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(Xn)
hhhhhhh---hhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
LHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI-YY
hhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF

【0455】

実施例４：異なるフォールディカインスキャフォールド中のリンカーの設計及び開かれるべきループの同定
方法
循環置換体の生成
インターロイキンのための循環置換体を生成するための一般的なプロトコールは、（ＭｏｄｅｌＸのＢｒｉｄｇｉｎｇコマンドを使用して）天然ＮＣ末端を閉じる、対応する構造上の第１のイントラリンカー設計により行う。この第１のステップは、各々の異なるインターロイキンのために共通であり、及び連続的な配列により表される構造モデルを作出する。循環置換体は次に、連続的な配列上のペプチド結合を破壊すること及び新規Ｎ末端（破壊残基、ｂｒｅａｋｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅ）から開始してそれを再番号付けすることにより作出される。異なる破壊残基の選択は異なる置換体（ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）を結果としてもたらす。選択される破壊残基は、各々の結晶学的構造においてより小さい安定化特性を有する残基である。

【0456】

使用されたＰＤＢ構造：
ＩＬ－２のために本発明者らは、タンパク質モデリング用の構造ＰＤＢ ５ｌｑｂ、ＩＬ－２２のために６ｗｅｏ、ＩＦＮｂのために１ａｕ１及びＧＭＣＳＦのために２ｇｍｆを使用した。

【0457】

ＭｏｄｅｌＸ及びＦｏｌｄＸソフトウェアを使用したイントラリンカーの設計：
標的ＩＬの天然Ｎｔ及びＣｔを連結する新規の接続（イントラリンカー）をＭｏｄｅｌＸツールスイートの補助と共に設計した。ＭｏｄｅｌＸ Ｂｒｉｄｇｉｎｇコマンド（Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇモード）を使用し；それは、特製のタンパク質断片ライブラリー（ＰｅｐＸＤＢ＿５ｋ）からの全ての幾何学的に適合性の断片と、アンカーとして選択された残基のペアを接続する。Ｂｒｉｄｇｉｎｇコマンドは、ユーザーが異なるペプチド長さを選択することを可能とし；出力は、ラマチャンドランプロットにおける禁じられたファイ及びプサイ二面角を有するか又は骨格クラッシュを有するリンカー／接続が廃棄されるブリッジ化モデルのアンサンブルである。

【0458】

ペプチドがアンカー間の数値的位置よりも長い場合、Ｂｒｉｄｇｉｎｇは、更なるモデリングステップにおいてＦｏｌｄＸによって認識されない残基コードで余剰残基を再番号付けする。この理由のため、循環置換体の設計は、指し示される位置で開き並びに天然Ｎｔ及びＣｔを連結した後の単量体タンパク質残基の数値的再編成を要求した。Ｂｒｉｄｇｉｎｇはまた、アンカー間の全ての縁部残基をペプチドからの残基で置き換える。

【0459】

所与の構造のＮＣ末端を閉じるために、接合されるべき領域の側部周辺のオーバーラップするスライドするウィンドウにおけるアンカリング点の網羅的な組合せを用いてＢｒｉｄｇｉｎｇアルゴリズムを通じてモデルを実行することにより大規模リンカースクリーニングを行った。あらゆるウィンドウを異なるペプチド長さ（６～２０ａａ）のために照会した。ブリッジ化モデルは、ＦｏｌｄＸ（Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ， ２０１９）のＲｅｐａｉｒＰＤＢコマンドを使用して修復された側鎖であり、結果的なモデルをグローバルエネルギーによりランク付けした（ＦｏｌｄＸ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙコマンド）。次にＦｏｌｄＸのｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｃａｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＰＳＳＭ）をリンカー及び隣接する残基に対して実行して、ＩＬ及び対応する受容体とのパッキングを最適化する突然変異を同定した。

【0460】

プラスミド生成
この研究において生成された全てのプラスミドをＧｉｂｓｏｎ法（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６， ３４３－３４５ （２００９）に従ってアセンブルさせた。必要な場合、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが遺伝子合成（ｇＢｌｏｃｋ二本鎖断片）及びオリゴヌクレオチド合成を行った。遺伝子増幅は、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実行し、大腸菌ＤＨ５－アルファコンピテント細胞（ＮＥＢ）において形質転換を行った。

【0461】

ＥｘｐｉＣＨＯ細胞中での哺乳動物タンパク質発現のために、使用されたベクターはｐｃＤＮＡ３．１（Ｖ７９０－２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。マイコプラズマ・ニューモニエＭ１２９細胞を使用した細菌タンパク質発現のために、Ｔｎ４００１に由来するトランスポゾン（Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９８４；１９３（３）：５５４－６）を使用した。マイコプラズマ・ニューモニエの場合、本発明者らは、Ｐ３合成プロモーター（Ｙｕｓ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１７ Ａｕｇ ２８；８（１）：３６８）を使用し、Ｍ．ニューモニエ用の分泌シグナル（ｓ１４２）（米国特許第１０，７４５，４５０号明細書）を全てのバリアントのために使用した。

【0462】

全てのプラスミドをサンガーシークエンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により検証した。

【0463】

ＥｘｐｉＣＨＯシステムを使用したタンパク質発現
ＥｘｐｉＣＨＯタンパク質発現キット細胞はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（Ａ２９１３３）から購入した。小スケール製造（２．５ｍＬ）のために、２４深底ウェルプレートを使用し（ＡＸＹＰＤＷ１０ＭＬ２４ＣＳ、Ｍｅｒｃｋ）、気体透過性フィルム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により覆った。製造の－１日目に、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を１ｍＬ当たり３×１０^６個の生存細胞の最終密度に分割した。３７℃、８％ ＣＯ_２及び１１０ｒｐｍでの振盪で増殖させた。製造の０日目に、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を試料毎に１ｍＬ当たり３×１０^６個の生存細胞の最終密度に分割し、２．５ｍＬの細胞懸濁液のアリコートをプレートウェル毎にプレーティングした。試料毎に、本発明者らは、９．０μＬ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬（錯化混合物）を含む２００μｌの冷ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ中の２μｇのＤＮＡを調製し、各々のプレートウェルに加えた。プレートを気体透過性シールで覆い、３７℃、８％ ＣＯ_２及び２２５ｒｐｍでインキュベートした。トランスフェクションの１８～２２時間後の１日目に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ及びＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄを各々のウェルに加えた。２４ウェルのプレート全体について、コニカルチューブ中で４００μＬ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ及び１６ｍＬ ＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄを混合した。この混合物から、６００μＬをプレートの各々のウェルに加えた。次にプレートを３７℃、８％ ＣＯ_２及び２２５ｒｐｍで４日間インキュベートし、次に採取を行った。

【0464】

ＥＬＩＳＡによるタンパク質定量化
マイコプラズマ・ニューモニエＭ１２９発現又はＥｘｐｉＣＨＯ発現について関心対象のタンパク質のタンパク質製造をＥＬＩＳＡにより定量化した。異なる実験の各々を生産者の指示書に従ってＩＦＮ－ベータ（Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－ｂｅｔａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）、ＩＬ－１０（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標） Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－２２（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標） Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びＩＬ－２（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標） Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）について行った。

【0465】

質量分析によるタンパク質定量化
ＩＦＮ－βバリアント及びＩＬ－２２バリアントについて、タンパク質定量化についてのＥＬＩＳＡの結果を質量分析により検証した。試料調製のために、溶液の消化試料をジチオトレイトール（３０ｎｍｏｌ、１時間、３７℃）で還元させ、暗所中ヨードアセトアミド（６０ｎｍｏｌ、３０分、２５℃）でアルキル化した。得られたタンパク質抽出物を最初に２００ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３で１／３に希釈し、１μｇ ＬｙｓＣ（Ｗａｋｏ、ｃａｔ＃ １２９－０２５４１）で終夜３７℃で消化し、次に１／２に希釈し、１μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃ Ｖ５１１３）で８時間３７℃で消化した。消化後に、ペプチドミックスをギ酸で酸性化させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に先立ってＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃ１８カラム（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ）で脱塩した。クロマトグラフィー及び質量分析のために、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １２００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｒｏｘｅｏｎ）、Ｏｄｅｎｓｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に連結されたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｃｌｉｐｓｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して試料を分析した。ペプチドを直接的に分析カラムにロードし、２μｍ Ｃ１８粒子を充填した７５μｍの内径の５０ｃｍカラムの分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して逆相クロマトグラフィーにより分離を行った。

【0466】

クロマトグラフィー勾配は、３００ｎｌ／分の流速で９５％の緩衝液Ａ及び５％の緩衝液Ｂで開始し、７９分の２５％の緩衝液Ｂ及び７５％のＡ、並びに次に１１分の４０％の緩衝液Ｂ及び６０％のＡまで徐々に増加させた。各々の分析後に、カラムを１０分間１００％の緩衝液Ｂで洗浄した。緩衝液Ａ：水中の０．１％のギ酸。緩衝液Ｂ：８０％のアセトニトリル中の０．１％のギ酸（２０１９年１月）。

【0467】

質量分析計は、２．４ｋＶに設定されたナノスプレー電圧及び３０５℃の供給源温度と共に陽イオン化モードにおいて稼働した。取得は、データ依存的取得（ＤＤＡ）モードで行い、１２０，０００の分解能での１マイクロスキャンを伴うフルＭＳスキャンをＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析装置における検出と共にｍ／ｚ ３５０～１４００の質量範囲にかけて使用した。オートゲインコントロール（ＡＧＣ）は「ｓｔａｎｄａｒｄ」に、及び注入時間は「ａｕｔｏ」に設定した。データ依存的取得分析の各々のサイクルにおいて、各々のサーベイスキャン後に、１００００の閾値イオンカウントを上回る最も強いイオンをフラグメンテーションのために選択した。フラグメンテーションのために選択される前駆体イオンの数は、「Ｔｏｐ Ｓｐｅｅｄ」取得アルゴリズム及び６０秒のダイナミックエクスクルージョンにより決定した。２８％の正規化された衝突エネルギーでの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を介してフラグメントイオンスペクトルを生成し、それらをイオントラップ質量分析装置において取得した。ＡＧＣを２Ｅ４に設定し、０．７ｍ／ｚの単離ウィンドウ及び１２ｍｓの最大注入時間を使用した。試料のキャリーオーバーを回避するため及び機器の安定性を保証するために各々の試料の間に、消化されたウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔ＃ Ｐ８１０８Ｓ）を分析し；ＱＣｌｏｕｄ（Ｃｈｉｖａ ｅｔ ａｌ． （２０１８） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． Ｊａｎ １１；１３（１））を使用して、プロジェクトの間の機器の長手方向性能を制御した。データ分析のために、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェアスイート（ｖ２．０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＭａｓｃｏｔサーチエンジン（ｖ２．６、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｐｅｒｋｉｎｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｄｅｃ；２０（１８）：３５５１－６７）を使用して、取得されたスペクトルを分析した。Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔチャイニーズハムスター参照データベース（２０２２年１１月時点で、２３８８５エントリー）に加えて一般的な夾雑物のリスト（Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ （２０１７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １６１９：３３９－３５２）及び全ての対応するデコイエントリーに対してデータをサーチした。ペプチド同定のために、７ｐｐｍの前駆体イオン質量許容性をＭＳ１レベルのために使用し、トリプシンを酵素として選択し、最大３回の切断の失敗を許した。フラグメントイオン質量許容性をＭＳ２スペクトルのために０．５Ｄａに設定した。メチオニンの酸化及びＮ末端タンパク質アセチル化を変動的な修飾として使用した一方、システイン上のカルバミドメチル化を固定された修飾として設定した。ペプチド同定における偽発見率（ＦＤＲ）は最大５％に設定した。

【0468】

ペプチド抽出イオン電流（ＸＩＣ）のために２ｐｐｍの質量許容差を使用してＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ｖ２．５）からの「Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｉｏｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ」ノードからペプチド定量化データを取得した。

【0469】

ＨＥＫ ｂｌｕｅ ＩＬレポーター細胞の培養
ＳＥＡＰレポーター構築物を有するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞株はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。この研究において本発明者らは、ＩＦＮ－α／βレポーターＨＥＫ ２９３細胞（ｈｋｂ－ｉｆｎａｂ）、ヒトＩＬ－２ ＆ ＩＬ－１５レポーター細胞（ｈｋｂ－ｉｌ２ｂｇ）、ヒト＆マウスＩＬ－２２レポーター細胞（ｈｋｂ－ｉｌ２２）及びヒトＩＬ－１０レポーター細胞（ｈｋｂ－ｉｌ１０）を使用した。本発明者らは、ＩＦＮ－ガンマ検出のためにＨＥＫ二重細胞（２つのレポーター：ＳＥＡＰ及びＬｕｃｉａ）（ヒトＩＦＮ－γ ＳＥＡＰ／ルシフェラーゼレポーター細胞、ｈｋｄ－ｉｆｎｇ）を使用した。

【0470】

１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び異なるレポーター細胞の各々において生産者により指定された選択抗生物質を補充したＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ１２－６０４Ｆ）中で細胞を増殖させた。生産者の推奨に従って、７０％のコンフルエンスに達したときに細胞を継代した。

【0471】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞における比色分析
ＥＬＩＳＡによる上清定量化後に、異なる希釈を行うためにＤＭＥＭ培地を使用してＨＥＫレポーター細胞のダイナミックレンジにフィットするように試料を調整した。最上濃度の各々は、各々のレポーター細胞について飽和にマッチするように設定し、８段階希釈を各々の試料について行った（各々０．５倍）。次に、ＨＥＫレポーター細胞を生産者の指示書に従って調製した。簡潔に述べれば、ウェル当たり１８０μｌの細胞を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１６７００８）中に播種した。ここから、調整された濃度を有する各々の上清２０μＬを加え、細胞を２０～２４時間３７℃及び５％ ＣＯ_２で保った（誘導されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標））。その後に、１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ、＃ｒｅｐｑｂｓ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を２０μＬの誘導されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞と新規の９６ウェルプレート中で混合した。細胞を次に６０分３７℃でインキュベートし、吸光度（６３０ｎｍ）を分光光度計Ｔｅｃａｎ ｉ－ｃｏｎｔｒｏｌ、２．０．１０．０において測定した。

【0472】

ＥＣ－５０データの推測
条件の各々について、分子量を考慮に入れてモル濃度を算出した。「フォールディカイン」について、タンパク質の両方のサブユニットは活性であると考えられ、したがって本発明者らは、それがホモフォールディカイン（２つのドメインが同じ）である場合に単量体の分子量を使用した。フォールディカインがヘテロフォールディカインである場合、本発明者らは、フォールディカインのうちの１つに対する抗体を使用して存在量を決定し、モル濃度を決定するために各々のＩＬの分子量を考慮した。バックグラウンドをサブトラクションした異なる吸光度測定値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してミカエリス・メンテン式にフィッティングした。

【0473】

結果
ｆｏｄｉｋｉｎｅを作製する方法Ｂ － クラスＩサイトカイン（例えばＩＬ－２）
試験したバリアントのリストは以下の通りであった：
・ＩＬ２ ＷＴ（真核細胞、即ちＣＨＯ細胞により発現及び分泌される野生型ＩＬ－２）
・ＯＲＫ２－００６：ａａ配列ＧＰＰＰＰＧ（配列番号２７０）を有する２つの６ａａインターリンカーを介して接続されたフォールディカイン－２。
・ＯＲＫ２－００７：ａａ配列ＧＰＰＰＰＰＧ（配列番号２７１）を有する２つの７ａａインターリンカーを介して接続されたフォールディカイン－２。
・ＯＲＫ２－００８：ａａ配列ＧＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号２７２）を有する２つの８ａａインターリンカーを介して接続されたフォールディカイン－２。
・ＯＲＫ２－００９：ａａ配列ＧＧＧＳＧＧ（配列番号２７３）を有する２つの６ａａインターリンカーを介して接続されたフォールディカイン－２。
・ＯＲＫ２－０１０：ａａ配列ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号２７４）を有する２つの７ａａインターリンカーを介して接続されたフォールディカイン－２。
・ＯＲＫ２－０１１：ａａ配列ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７５）を有する２つの８ａａインターリンカーを介して接続されたフォールディカイン－２。

【0474】

使用されたアミノ酸配列は以下であった（カノニカルなαヘリックスのみを標識しており；下線を引いた配列はＭ．ニューモニエ用の分泌シグナルである）：

＞ＩＬ２ ＷＴ（配列番号７９）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh
HA
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR
hhhhhhh---hhhhhhhh hhhhh-hhhhhhhhh hhhhhhh
HB HC HD
WITFCQSIISTLT*
hhhhhhhhhhh
HD

＞ＯＲＫ２－００６ ポリＰｒｏ ６ａａリンカー（配列番号３１３）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
STLTGPPPPGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKP
h hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhh
HA HB
LEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGP
hhhh hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
PPPGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN
Hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhh---hhhh
HA HB
LAQS*

＞ＯＲＫ２－００７ ポリＰｒｏ ７ａａリンカー（配列番号２７６）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
STLTGPPPPPGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKP
h hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhh
HA HB
LEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGP
hhhh hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
PPPPGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN
Hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhh---hhhh
HA HB
LAQS*

＞ＯＲＫ２－００８ ポリＰｒｏ ８ａａリンカー（配列番号２７７）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
STLTGPPPPPPGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK
h hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hh
HA HB
PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTG
hhhhh hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
PPPPPPGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEV
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhhhhh
HA HB
LNLAQS*

＞ＯＲＫ２－００９ ポリＧｌｙ ６ａａリンカー（配列番号２７８）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
STLTGGGSGGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPL
h hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhh
HA HB
EEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGG
hhh hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
SGGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhhhhh
HA HB
QS*

＞ＯＲＫ２－０１０ ポリＧｌｙ ７ａａリンカー（配列番号２７９）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
STLTGGGSGGGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKP
h hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hh
HA HB
LEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGG
hhhh hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
GSGGGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhhhhh
HA HB
LAQS*

＞ＯＲＫ２－０１１ ポリＧｌｙ ８ａａリンカー（配列番号２８０）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD
STLTGGGSGGGGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK
h hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---h
HA HB
PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTG
hhhhh hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
GGSGGGGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEV
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhhhhh
HA HB
LNLAQS*

【0475】

結果
方法に記載されるように、異なる構築物でＥｘｐｉＣＨＯ細胞を一過的に形質転換した。方法に記載されるようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞を増殖させ、４日後に上清を収集し、異なる操作された分子の濃度をＥＬＩＳＡにより算出した。次に、本発明者らは、２０ｎｇ／ｍＬから開始（及び各々０．５倍に希釈）して段階希釈を行い、ＩＬ－２レポーターＨＥＫ ｂｌｕｅ細胞の活性化を評価した（図３５を参照）。本発明者らは、ミカエリス・メンテン数学モデルを実験データにフィッティングし（方法を参照）、ＥＣ－５０を得た（表１４）。

【0476】

【表17】

【0477】

表１４： 突然変異体の各々のためのフィッティングパラメーター。タンパク質は、発現システムとしてＣＨＯを使用して発現させた。Ｖｍａｘは０．９に設定した。

【0478】

上記の結果は、ＩＬ－２の場合、設計されていない柔軟性（ポリＧｌｙ）又は剛性リンカー（ポリＰｒｏ）は重要でないと思われることを示唆する。

【0479】

ｆｏｄｉｋｉｎｅを作製する方法Ａ － クラスＩＩサイトカイン（例えばＩＬ－２２）
使用されたアミノ酸配列は以下であった（カノニカルなαヘリックスのみを標識しており；ＩＬ－２２シグナルペプチドをＭ．ニューモニエシグナルペプチドにより置き換えている － 方法を参照）：

＞ＯＲＫ２２－０１６ ショート１ａａ Ｇｌｙリンカー、Ｎｔ－Ｃｔリンカーを太字の斜体としている（配列番号２８１）

ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSGHIQRNVQKLKDTVKKLGES
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh h
HB HC HD
GEIKAIGELDLLFMSLRNACIANGVLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMS
hhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HE HF HA
ERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSGHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAI
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh
HB HC HD HE
GELDLLFMSLRNACI*
hhhhhhhhhhhh
HF

＞ＯＲＫ２２－０１７ ショート３ａａ Ｇｌｙリンカー、Ｎｔ－Ｃｔリンカーを下線を引いた太字の斜体としている（配列番号２８２）

ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSGGGHIQRNVQKLKDTVKKLG
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
ESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIANGVLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVS
hhhhhhh hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HE HF HA
MSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSGGGHIQRNVQKLKDTVKKLGESGE
Hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhh
HB HC HD HE
IKAIGELDLLFMSLRNACI*
hhhh hhhhhhhhhhh
HE HF

＞ＯＲＫ２２－０１８ ロング６ａａポリＧｌｙリンカー、Ｎｔ－Ｃｔリンカーを下線を引いた太字の斜体としている（配列番号２８３）

ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSGGGSGGHIQRNVQKLKDTVK
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
KLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIANGVLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFH
h hhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HE HF HA
GVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSGGGSGGHIQRNVQKLKDTVKK
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
LGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI*
hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HE HF

＞ＯＲＫ２２－０１９ ロング９ａａポリＧｌｙリンカー、Ｎｔ－Ｃｔリンカーを下線を引いた太字の斜体としている（配列番号２８４）

ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSGGGSGGSGGHIQRNVQKLKD
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhh
HB HC HD
TVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIANGVLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEK
hhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE HF HA
LFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSGGGSGGSGGHIQRNVQKL
Hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhh
HB HC HD
KDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI*
hhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF

＞ＯＲＫ２２－０２０ ロング１２ａａポリＧｌｙリンカー、Ｎｔ－Ｃｔリンカーを下線を引いた太字の斜体としている（配列番号２８５）

ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSGGGSGGSGGSGGHIQRNVQK
Hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhh
HB HC HD
LKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIANGVLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLI
hhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE HF HA
GEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSGGGSGGSGGSGGHIQ
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh
HB HC HD
RNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI*
hhhhhhhhhhhhs hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF

＞ＯＲＫ２２－０２４ ポリＰｒｏ ３ａａリンカー。Ｎｔ－Ｃｔリンカーを太字の斜体とし、下線を引いている（配列番号２８６）

ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSGPGHIQRNVQKLKDTVK
Hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
KLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIANGVLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFH
h hhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HE HF HA
GVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSGPGHIQRNVQKLKDTVKK
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
LGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI*
hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HE HF

＞ＯＲＫ２２－０２５ ポリＰｒｏ ９ａａリンカー、Ｎｔ－Ｃｔリンカーを太字の斜体とし、下線を引いている（配列番号２８７）

ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSGPPPPPPPGHIQRNVQKLKD
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhh
HB HC HD
TVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIANGVLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEK
hhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE HF HA
LFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSGPPPPPPPGHIQRNVQKL
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhh
HB HC HD
KDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI*
dhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF

＞ＯＲＫ２２－０２６ ポリＰｒｏ １１ａａリンカー、Ｎｔ－Ｃｔリンカーを太字の斜体とし、下線を引いている（配列番号２８８）

ARLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSGPPPPPPPPPGHIQRNVQKL
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhh
HB HC HD

KDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIANGVLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG
hhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE HF HA
EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSGPPPPPPPPPGHIQRN
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhh
HB HC HD
VQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI*
hhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF

【0480】

結果
異なる長さ及び／又は異なる組成（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ若しくはプロリンベース）のリンカーを有するクラスＡ フォールディカイン ２２で得られ結果を図３６に示している（ＯＲＫ２２－１７～ＯＲＫ２２－１９、及びＯＲＫ２２－２４～ＯＲＫ２２－２６）。異なる長さのポリＧｌｙ又はポリＰｒｏリンカーを有するこれらのフォールディカインのいずれも、Ｍ．ニューモニエにおいて発現された場合に活性であるとは見出されなかった。設計（ＭｕｔＳＣ１及びＭｕｔＳＣ２）により操作されたリンカーを有するフォールディカイン ２２クラスＡのみが、機能の増強を結果としてもたらした。

【0481】

ｆｏｄｉｋｉｎｅを作製する方法Ｂ － クラスＩＩサイトカイン（例えばＩＬ－２２）
試験したバリアントのリストは以下の通りである：
・ＯＲＫ２２－０１２：２つのＩＬ－２２分子の天然Ｎｔ及びＣｔを接続するａａ配列ＧＧＰＰＰＰＰＰＧＧ（配列番号２８９）を有する１０ａａの２つのインターリンカーで連結されたフォールディカイン－２２。
・ＯＲＫ２２－０１４：２つのＩＬ－２２分子の天然Ｎｔ及びＣｔを接続するａａ配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡ（配列番号２９０）を有する１０ａａの２つのインターリンカーで連結されたフォールディカイン－２２。

【0482】

使用されたアミノ酸配列は以下であった（カノニカルなαヘリックスのみを標識しており；ＩＬ－２２シグナルペプチドをＭ．ニューモニエシグナルペプチドにより置き換えている － 方法を参照）：

＞ＩＬ２２＿ＷＴ（配列番号２９１）

MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNT
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
DVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLH
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC
IQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF

＞ＯＲＫ２２－０１２ ポリＰｒｏリンカー １０ａａ（配列番号２９２）

MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIGGPPPPPPGG
hhhhhhh hhhhhhhhhhhh
HE HF
APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEV
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
LFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMS
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhh
HC HD HE HF
LRNACIGGPPPPPPGGAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSE
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhh
HF HA
RCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLG
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD

＞ＯＲＫ２２－０１４ ポリＧｌｙリンカー １０ａａ（配列番号２９３）

MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIGGGGGGGGGG
hhhhhhh hhhhhhhhhhhh
HE HF
APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEV
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh
HA HB
LFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMS
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhh
HC HD HE HF
LRNACIGGGGGGGGGGAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSE
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HF HA
RCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLG
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD

【0483】

結果
方法に記載されるように、異なる構築物でＥｘｐｉＣＨＯ細胞を一過的に形質転換した。方法に記載されるようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞を増殖させ、４日後に上清を収集し、異なる操作された分子の濃度をＥＬＩＳＡにより算出した。次に、本発明者らは、２０ｎｇ／ｍＬから開始（及び各々０．５倍に希釈）して段階希釈を行い、ＩＬ－２２レポーターＨＥＫ ｂｌｕｅ細胞の活性化を評価した（図３７を参照）。

【0484】

本発明者らは、ミカエリス・メンテン数学モデルを実験データにフィッティングし（方法を参照）、見かけのＥＣ－５０を得た（表１５）。

【0485】

【表18】

【0486】

ポリＰｒｏインターリンカーを有するフォールディカイン ＯＲＩＫ－１２は、ＩＬ－２２ ＷＴと比較してＩＬ－２２ ＨＥＫ ｂｌｕｅ細胞の活性化を増加させるが、柔軟なポリＧｌｙリンカーを有するフォールディカイン ＯＲＩＫ－１２は活性化を強く低減させることを本発明者らは見出した。

【0487】

これらの結果は、クラスＢ フォールディカインを作製するＩＬ－２２について、インターリンカーの剛性が重要であることを指し示す。

【0488】

ｆｏｄｉｋｉｎｅを作製する方法Ｂ － クラスＩＩサイトカイン（キメラＩＬ－４－ＩＬ－２）
試験したバリアントは、ＩＬ－２及びＩＬ－４を含む、ＩＬ２－ＩＬ４ポリＰｒｏリンカー、ヘテロフォールディカイン Ｉ型であり、ＩＬ－４は連続ドメインを含有する。２つのＩＬを、以下のａａ組成：ＧＰＰＰＰＰＧ（配列番号２７１）を有する７ａａの２つのインターリンカーにより連結する。
使用した配列は以下の通りである（カノニカルなαヘリックスのみを標識しており；シグナルペプチドをＭ．ニューモニエシグナルペプチドにより置き換えている － 方法を参照）：

＞ＩＬ２ ＷＴ（配列番号７９）

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh
HA
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR
hhhhhhh---hhhhhhhh hhhhh-hhhhhhhhh hhhhhhh
HB HC HD
WITFCQSIISTLT*
hhhhhhhhhhh
HD

＞ＩＬ－４（配列番号２９４）

MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAA
hhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhh
HA HB
TVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMRE
hhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC HD
KYSKCSS*
hhhhh
HD

＞ＩＬ２－ＩＬ４ポリＰｒｏリンカー（配列番号２９５）

MYRMQLLSCIALSLALVTNSLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
IL-2 HC IL-2 HD
STLTGPPPPPGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHH
H hhhhhhhhhhhh hhh hhhhhhhhhhhhhhhhhh
IL-4 HA IL-4 HB
EKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
IL-4 HC IL-4 HD
GPPPPPGTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEV
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhh---hhhhhh
IL2-HA IL-2 HB
LNLAQS*

【0489】

結果
方法に記載されるように、異なる構築物でＥｘｐｉＣＨＯ細胞を一過的に形質転換した。方法に記載されるようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞を増殖させ、４日後に上清を収集し、異なる操作された分子の濃度をＥＬＩＳＡにより算出した。次に、本発明者らは、２０ｎｇ／ｍＬから開始（及び各々０．５倍に希釈）して段階希釈を行い、ＩＬ－２及びＩＬ－４レポーターＨＥＫ ｂｌｕｅ細胞の活性化を評価した（図３８～３９を参照）。

【0490】

本発明者らは、ミカエリス・メンテン数学モデルを実験データにフィッティングし（方法を参照）、見かけのＥＣ－５０を得た（表１６）。

【0491】

【表19】

【0492】

表１６： フィッティングパラメーター。Ｖｍａｘは、ＨＥＫ ＩＬ－２データフィッティングのために１．０及びＨＥＫ ＩＬ－４データのために２．４に設定した。

【0493】

キメラフォールディカインは、ＩＬ－２ ＷＴサイトカインよりも優れた活性及び市販のＩＬ－４（この場合、１つの場合においてフォールディカインはＣＨＯ細胞中で発現されてＥＬＩＳＡにより定量化されたが、他方はＢｉｏｔｅｃｈｎｅ（６５０７－ＩＬ－０１０／ＣＦ）から購入されたので、差異は有意ではない）よりもわずかに低い活性を有することを本発明者らは見出した。

【0494】

ｆｏｄｉｋｉｎｅを作製する方法Ｃ － クラスＩサイトカイン（例えばＩＬ－２）
使用されバリアント及びそれらの配列は以下の通りであった：
＞ＩＬ２ ＷＴ（配列番号７９）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh sss
HA
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR
hhhhhhh---hhhhhhhh hhhhh-hhhhhhhhh sss hhhhhhh
HB HC HD
WITFCQSIISTLT*
hhhhhhhhhhh
HD

【0495】

ＯＲＫ＿０１３：１つの単量体が、配列ＧＴＳを有する長さ３の２つのインターリンカーを介して他のＩｌ－２単量体の天然Ｎｔ及びＣｔとそれを連結させるために開かれたループを有するＩＬ－２ フォールディカインの方法Ｃ循環置換体。

＞ＯＲＫ２＿０１３（配列番号２９６）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSNFLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQS
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HC HD
IISTLTGGSGGNFLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGT
hhh hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhs
HD HC HD
SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhhhhhh
HA HB
QSKGGSGGTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hh
HA HB
PLEEVLNLAQSK
hhhhh

【0496】

結果
方法に記載されるように、異なる構築物でＥｘｐｉＣＨＯ細胞を一過的に形質転換した。方法に記載されるようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞を増殖させ、４日後に上清を収集し、異なる操作された分子の濃度をＥＬＩＳＡにより算出した。次に、本発明者らは、２０ｎｇ／ｍＬから開始（及び各々０．５倍に希釈）して段階希釈を行い、ＩＬ－２レポーターＨＥＫ ｂｌｕｅ細胞の活性化を評価した（図４０を参照）。

【0497】

本発明者らは、ミカエリス・メンテン数学モデルを実験データにフィッティングし（方法を参照）、見かけのＥＣ－５０を得た（表１７）。

【0498】

【表20】

【0499】

表１７： フィッティングパラメーター。突然変異体の各々についての曲線フィッティング後のヒル勾配＆ボトムパラメーター。タンパク質は、発現システムとしてＣＨＯを使用して発現させた。Ｖｍａｘは０．７に固定した。

【0500】

キメラ方法Ｃ フォールディカインは、わずかにより低いＥＣ－５０を有するが活性であることを本発明者らは見出した。

【0501】

ＩＦＮガンマ（スワップドドメインを形成するクラスＩＩサイトカイン）
バリアントのリスト
ＯＲＫＩＦＮｇ－００２
配列のリスト
Ｎｔ－Ｃｔリンカーを太字の斜体としている ＡＳＫＰＨＰＧＱＬＷＹ（配列番号１７）
突然変異を太字として下線を引いている
ＩＦＮｇ ＷＴとして本発明者らはＰＤＢ ６ｅ３ｋの結晶化されたバージョンのＩＦＮｇを使用した。

＞ＩＦＮｇ ＷＴ（配列番号３１２）
SQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVET
hhhhhhhhhhhh hh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh
HA HB HC
IKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAA*
hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhh hhhhhh
HC HD HE HF

＞ＯＲＫＩＦＮｇ－００２（配列番号１８）
GSQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQK
hhhhhhhhhhhh hh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hh
HA HB
SVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMASKPHPGQLWA
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhh hhhhhh
HC HD HE HF
YVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETI
hhhhhhhhhhhh hh hhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh
HA HB HC
KEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAA
hhhhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhh hhhhhh
HC HD HE HF

【0502】

結果
方法に記載されるように、異なる構築物でＥｘｐｉＣＨＯ細胞を一過的に形質転換した。方法に記載されるようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞を増殖させ、４日後に上清を収集し、異なる操作された分子の濃度をＥＬＩＳＡにより算出した（図４３）。

【0503】

本発明者らは、ミカエリス－メンテンモデルを実験データにフィッティングし（方法を参照）、見かけのＥＣ－５０を得た（表１８）。

【0504】

【表21】

【0505】

表１８： フィッティングパラメーター。突然変異体の各々についての曲線フィッティング後のヒル勾配＆ボトムパラメーター。タンパク質は、発現ベクターとしてマイコプラズマ・ニューモニエを使用して発現させた。

【0506】

フォールディカイン ＩＦＮＧはＷＴ ＩＦＮｇよりも低いＥＣ－５０を有することを本発明者らは見出した。

【0507】

開くための好適なループの決定：循環置換体
これらは、本発明者らが２つの分子の天然Ｎｔ及びＣｔを連結しており、並びにループで開く必要があるクラスＢ フォールディカインのために、いずれのループを開くべきかを決定するために非常に重要である。

【0508】

クラスＡ、及びクラスＣ フォールディカインのために、それらはより低い重要性であり、その理由は、循環置換において開かれた場合にタンパク質を不安定化させ得るループは、開かれたループの結果としてもたらされる新規Ｎｔ及びＣｔを別のＩＬにその天然Ｎｔ及びＣｔを介して（クラスＣ）又は開かれた別のループを介して（クラスＡ）連結することによりレスキューされ得るからである。

【0509】

これにもかかわらず、幾何学的に実現可能であり及び受容体結合と適合性の場合、タンパク質を不安定化させないループを開くことは常により良い。

【0510】

ＩＬ－２２
（構造３ｄｌｑ．ｐｄｂ及び二次構造の定義のためにＳｗｉｓｓＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒを使用）。結晶及び複合体に依存して、カノニカルなヘリックスの長さは変動し得る。
＃ＩＬ－２２特異的Ｎｔ－ＣｔリンカーはＴＤＹＤＳＱＴＮ（配列番号３０３）である
＃ＩＬ－２２シグナルペプチド ＭＡＡＬＱＫＳＶＳＳＦＬＭＧＴＬＡＴＳＣＬＬＬＬＡＬＬＶＱＧＧＡＡ（配列番号３４８）
ループは灰色ボックス中
ｈ アルファヘリックス
ｓ 鎖
本発明者らは、ＷＴ配列（ＩＬ２２＿ＷＴ）についてのカノニカルなＨＡ、ＨＢ、ＨＣ、ＨＤ、ＨＥ及びＨＦアルファヘリックスは別としてループ及び全ての二次構造エレメントのみを示している。

ＩＬ２２＿ｃｕｔａｓｎ６８ ６７～６８の間で開かれたループ（ループ６７－８８、ｌＡＢ）
ＩＬ２２＿ｃｕｔ７７ ７６～７７の間で開かれたループ（ループ６６－８８、ｌａＢ）
ＩＬ２２＿ｃｕｔ８６ ８５～８６の間で開かれたループ（ループ６６－８８、ｌＡＢ）
ＩＬ２２＿ｃｕｔ１０９ １０８～１０９の間で開かれたループ（ループ１０２－１１３、ｌＢＣ）
ＩＬ２２＿ｃｕｔ１３５ １３４～１３５の間で開かれたループ（ループ１２９－１４０、ｌＣＤ）
ＩＬ２２＿ｃｕｔ１５６ １６４～１６５の間で開かれたループ（ループ１６５－１６７、ｌＥＦ）

【0511】

ループ１５５－１５７（ｌＤＥ）は、別のサイトカインへの接合を不可能にする非常に不都合な方向性を有し、試験しなかった。

＞ＩＬ２２＿ＷＴ（配列番号２９１）
lAB
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNT
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA
lAB lBC lCD
DVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLH
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC
lDE lEF
IQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HD HE HF

＞ＩＬ２２＿ｃｕｔａｓｎ６８（残基６７～６８の間でのループオープン）（配列番号２９７）
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAANNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVL
hhhhhhhhhhhhh
hB
FPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSL
H hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhh
HC HD HE HF
RNACTDYDSQTNCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLAD
hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HF HA

＞ＩＬ２２＿ｃｕｔ７７（残基７６～７７の間でのループオープン）（配列番号２９８）
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQP
hhhhhhhhhhhhh
HB
YMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACTDYDS
Hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HC HD HE HF
QTNCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG*
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA

＞ＩＬ２２＿ｃｕｔ８６（残基８５～８６の間でのループオープン）（配列番号２９９）
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAASERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFL
hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhh
HB HC
ARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACTDYDSQTNCRLDKS
hhhhhh hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HC HD HE HF
NFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSM*
hhhhhhhhhhhhhhhhh
HA

＞ＩＬ２２＿ｃｕｔ１０９（残基１０８～１０９の間でのループオープン）（配列番号３００）
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAADRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNV
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhh
HC HD
QKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACTDYDSQTNCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADN
hhhhhhhhh hhhhhhh hhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE HF HA
NTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQS*
hhhhhhhhhhhhh
HB

＞ＩＬ２２＿ｃｕｔ１３５（残基１３４～１３５の間でのループオープン）（配列番号３０１）
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLF
hhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh hhhh
HD HE HF
MSLRNACTDYDSQTNCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ
hhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh
HF HA HB
VLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHI*
Hhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh
HB HC

＞ＩＬ２２＿ｃｕｔ１５６（残基１６４～１６５の間でのループオープン）（配列番号３０２）
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACTDYDSQTNCRLDKS
hhhhhhh hhhhhhhhhhh
HE HF
NFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYM
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh hh
HA HB HC
QEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL*
Hhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HC HD

【0512】

ＩＦＮベータ
（構造１ａｕ１．ｐｄｂ及び二次構造の定義のためにＳｗｉｓｓＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒを使用）。結晶及び複合体に依存して、カノニカルなヘリックスの長さは変動し得る。
＃ＩＦＮｂ特異的リンカーはＥＧＰＧ（配列番号３０４）である
＃ＩＦＮｂシグナルペプチド ＭＴＮＫＣＬＬＱＩＡＬＬＬＣＦＳＴＴＡＬＳ（配列番号３０５）
ループは灰色ボックス中
ｈ アルファヘリックス
ｓ 鎖
本発明者らは、ＷＴ配列（ＩＬ２２＿ＷＴ ＋ｓｐ）についてのカノニカルなＨＡ、ＨＢ、ＨＣ、ＨＤ、ＨＥ及びＨＦアルファヘリックスは別としてループ及び全ての二次構造エレメントのみを示している。

【0513】

バリアントのリスト
ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ２６ ２５～２６の間で開かれたループ（ループ２２－２９、ｌＡＢ１）
ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ５０ ４９～５０の間で開かれたループ（ループ３４－５１、ｌＡＢ２）
ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ７６ ７５～７６の間で開かれたループ（ループ７１－８１、ｌＢＣ）
ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ１１２ １１７～１１８の間で開かれたループ（ループ１０８－１２１、ｌＣＤ）
ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ１６５ ＷＴのＮｔ及びＣｔへのＮｔ－Ｃｔリンカーの追加
＞ＩＦＮｂＷＴ（配列番号３０６）
lAB1 lAB2 lAB3
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQ
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh hhhh
HA
lBC1 lBC2 lCD
KEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLH
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC
lEF
LKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYL*
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE-HF
＞ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ１６５（ＷＴのＮｔ及びＣｔへの分割Ｎｔ－Ｃｔイントラリンカー（太字）の追加）（配列番号３０７）
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSGPGYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQ
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh hhhh
HA
QFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMS
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC
SLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLE*
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE-HF
＞ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ２６（２５～２６の間で開かれたループ）（配列番号３０８）
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDS
hhhh hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB
SSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWT
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhh
HC HD HE-HF
IVRVEILRNFYFINRLTGYLEGPGYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLN*
hhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HE-HF HA
＞ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ５０（４９～５０の間で開かれたループ）（配列番号３０９）
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHL
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh
HB HC
KTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLEGPG
Hhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC HD HE-HF
YNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQ*
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh hhhh
HA
＞ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ７６（７５～７６の間で開かれたループ）（配列番号３１０）
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhh
HC HD
YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLEGPGYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRL
hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE-HF HA
EYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSS*
hhhh hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HB
＞ＩＦＮｂ＿ｃｕｔ１１２（１１７～１１８の間で開かれたループ）（配列番号３１１）
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLEG
hhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HE-HF
PGYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIF
hhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhh hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HA HB
RQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLM*
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HC

【0514】

ＩＬ－２
（構造２ｂ５ｉ．ｐｄｂ及び二次構造の定義のためにＳｗｉｓｓＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒを使用）。結晶及び複合体に依存して、カノニカルなヘリックスの長さは変動し得る。
＃ＩＬ－２特異的Ｎｔ－ＣｔリンカーはＬＰＫＬＧＭ（配列番号３１９）である
＃ＩＬ－２シグナルペプチド ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３２０）
ループは灰色ボックス中
ｈ アルファヘリックス
ｓ 鎖
本発明者らは、ＷＴ配列（ＩＬ２２＿ＷＴ ＋ｓｐ）についてのカノニカルなＨＡ、ＨＢ、ＨＣ、ＨＤ、ＨＥ及びＨＦアルファヘリックスは別としてループ及び全ての二次構造エレメントのみを示している。

【0515】

バリアントのリスト
ＩＬ２＿ｃｕｔ５３ ３２～３３の間で開かれたループ（ループ２９－３４；ｌＡＢ１）
ＩＬ２＿ｃｕｔ６９ ４８～４９の間で開かれたループ（ループ６９－７６；ｌＡＢ３）
ＩＬ２＿ｃｕｔ９６ ７６～７７の間で開かれたループ（ループ９１－１０１；ｌＢＣ）
ＩＬ２＿ｃｕｔ１２１ １００～１０１の間で開かれたループ（ループ９７－１０５；ｌＣＤ１）
＞ＩＬ２ ＷＴ（配列番号７９）
lAB1 lAB2
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA
hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhh sss
HA
lAB3 lBC lCD1 lCD2
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR
hhhhhhh---hhhhhhhh hhhhh-hhhhhhhhh sss hhhhhhh
HB HC HD
WITFCQSIISTLT*
hhhhhhhhhhh
HD
＞ＩＬ２＿ｃｕｔ５３（残基３２～３３の間でのループオープン）（配列番号３２１）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRP
hhhhhhh---hhhhhh hh
HB HC
RDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISLLPKLGMNKKTQLQLEHLLLDL
Hhh-hhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhh
HC HD HA
QMILNGINNYK*
hhhhhhh
HA
＞ＩＬ２＿ｃｕｔ６９（残基４８～４９の間でのループオープン）（配列番号３２２）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKG
hhhhhhh---hhhhhh hhhhh-hhhhhhhhhh
HB HC
SETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISLLPKLGMNKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLT
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
HD HA
RMLTFKFYMPK*
＞ＩＬ２＿ｃｕｔ９６（残基７６～７７の間でのループオープン）（配列番号３２３）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQ
hhhhh-hhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhh
HC HD
SIISLLPKLGMNKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKP
hhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhh---hhh
HD HA HB
LEEVLNLAQSK*
hhh
HB
＞ＩＬ２＿ｃｕｔ１２１（残基１００～１０１の間でのループオープン）（配列番号３２４）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSTTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISLLPKLGMNKKTQLQLEHLLL
hhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhh
HD HA
DLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNI
hhhhhhhhh hhhhhhh---hhhhhh hhhhh-hhh
HA HB HC
NVIVLELKGSE*
hhhhhhhhh
HC

【0516】

結果
方法に記載されるように、異なる構築物でＥｘｐｉＣＨＯ細胞を一過的に形質転換した。方法に記載されるようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞を増殖させ、４日後に上清を収集し、異なる操作された分子の濃度をＥＬＩＳＡにより算出した。次に、本発明者らは、２０ｎｇ／ｍＬから開始（及び各々０．５倍に希釈）して段階希釈を行い、ＩＬ－２２、ＩＦＮｂ、ＩＬ－２及びＩＬ－４レポーターＨＥＫ ｂｌｕｅ細胞の活性化を評価した（図４１～４３を参照）。

【0517】

本発明者らは、ミカエリス－メンテンモデルを実験データにフィッティングし（方法を参照）、見かけのＥＣ－５０を得た。ＩＬに依存して、一部のループはそれらを開くことについてかなり許容的であるが、他のものはＥＣ－５０における有意な減少を結果としてもたらすことを本発明者らは見出した。興味深いことにＩＬ－２２及びＩＬ－２の場合、一部の循環置換体は対応するＩＬ ＷＴよりも良好なＥＣ－５０を有することを本発明者らは見出した。天然Ｎｔ及びＣｔを接合するために導入されるインターリンカーは、親和性を増加させる受容体との好都合な相互作用を有し得ることをこれは示唆し得る。

【0518】

参考文献
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５． ｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒ， Ｓ． Ｊ．， Ｅｌｓｏｎ， Ｃ． Ｏ． ＆ Ｆｅｄｏｒａｋ， Ｒ． Ｎ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｉｎ ｓｔｅｒｏｉｄ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １１３ ３８３－３８９ （１９９７）．
６． Ｓａｘｅｎａ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｐａｒａｄｏｘ： Ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈａｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｈａｒｎｅｓｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７４， ２７－３４ （２０１５）．
７． Ｔｅｒａｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １／ＩｇＧ１－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１０ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５８， １３０７－１３１７ （２００９）．
８． Ｄｕｎｃａｎ， Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ＰＬＡ－ＰＥＧ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ （Ｂａｓｅｌ） ９， （２０１９）．
９． Ｇｏｒｂｙ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＩＬ－１０ ｖａｒｉａｎｔｓ ｅｌｉｃｉｔ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｔ ｌｏｗ ｌｉｇａｎｄ ｄｏｓｅｓ． Ｓｃｉ． Ｓｉｇｎａｌ． １３， （２０２０）．
１０． Ｓａｘｔｏｎ， Ｒ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏ－ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７１， （２０２１）．
１１． Ｓｔｅｉｄｌｅｒ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｃｏｌｉｔｉｓ ｂｙ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９， １３５２－１３５５ （２０００）．
１２． Ｃａｒｄｏｓｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０－Ａｆｆｏｒｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｓｏｄｉｕｍ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｌｉｔｉｓ． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９， ４００ （２０１８）．
１３． Ｂｒａａｔ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ａ Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｔｒｉａｌ Ｗｉｔｈ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ４ ７５４－７５９ （２００６）．
１４． Ｃｙｐｅｌ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｏｎｏｒ ｌｕｎｇｓ ｂｙ ＩＬ－１０ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． １， ４ｒａ９ （２００９）．
１５． Ｓｈａｍｓｋｈｏｕ， Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｈｙｄｒｏｇｅｌ－ｂａｓｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｉｌ－１０ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０３， ５２－６２ （２０１９）．
１６． Ｗａｎｇ， Ｘ．， Ｗｏｎｇ， Ｋ．， Ｏｕｙａｎｇ， Ｗ． ＆ Ｒｕｔｚ， Ｓ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＩＬ－１０ Ｆａｍｉｌｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １１ ａ０２８５４８ （２０１９）．
１７． Ｗａｉｔｅｓ， Ｋ． Ｂ． ＆ Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎ， Ｄ． Ｆ． Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ａｓ ａ Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｖｏｌ． １７ ６９７－７２８ （２００４）．
１８． Ｗｏｄｋｅ， Ｊ． Ａ． Ｈ． Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ． Ｍｏｌ． Ｓｙｓｔ． Ｂｉｏｌ． ９， ６５３ （２０１３）．
１９． Ｉｎａｍｉｎｅ， Ｊ． Ｍ．， Ｈｏ， Ｋ． Ｃ．， Ｌｏｅｃｈｅｌ， Ｓ． ＆ Ｈｕ， Ｐ． Ｃ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ＵＧＡ ｉｓ ｒｅａｄ ａｓ ａ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｃｏｄｏｎ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ａｓ ａ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ｂｙ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ， Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ， ａｎｄ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２， ５０４－５０６ （１９９０）．
２０． Ｓｌｕｉｊｔｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ ＭＧ３５２－ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａ Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｖａｓｅ ｔｈａｔ ｈａｓ ａ ｎｏｎ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ ｉｎ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ７７ １２６１－１２７７ （２０１０）．
２１． Ｍａｉｅｒ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｉｎ ａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ７ ５１１ （２０１１）．
２２． Ｋｕｈｎｅｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ． ３２６ １２３５－１２４０ （２００９）．
２３． Ｓｃｏｔｔ， Ｍ．， Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ， Ｃ． Ｗ．， Ｍａｔｅｅｓｃｕ， Ｅ． Ｍ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ． ＆ Ｈｗａ， Ｔ． Ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０， １０９９－１１０２ （２０１０）．
２４． Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｍ． Ｊ．， Ｃｈｏｅ， Ｓ． ＆ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ｄ． Ｄｏｍａｉｎ ｓｗａｐｐｉｎｇ： ｅｎｔａｎｇｌｉｎｇ ａｌｌｉａｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｖｏｌ． ９１ ３１２７－３１３１ （１９９４）．
２５． Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｍｏｎｏｍｅｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， １３５５２－１３５５７ （２０００）．
２６． Ｓｙｔｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７， １６９４３－１６９５１ （１９９８）．
２７． Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ， Ｌ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． ３Ｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｗａｐｐｉｎｇ Ｃａｕｓｅｓ Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ Ｗｈｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｉｎ Ｐｌａｎｔａ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ｖｏｌ． ７ ｅ４６４６０ （２０１２）．
２８． Ｈｕｆｆｎａｇｌｅ， Ｇ． Ｂ．， Ｄｉｃｋｓｏｎ， Ｒ． Ｐ． ＆ Ｌｕｋａｃｓ， Ｎ． Ｗ． Ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ： ａ ｔｗｏ－ｗａｙ ｓｔｒｅｅｔ． Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０， ２９９－３０６ （２０１７）．
２９． Ｍｉｎｓｈａｗｉ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１， １７９４ （２０２０）．
３０． Ｄｅｌｇａｄｏ， Ｊ．， Ｒａｄｕｓｋｙ， Ｌ． Ｇ．， Ｃｉａｎｆｅｒｏｎｉ， Ｄ． ＆ Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｌ． ＦｏｌｄＸ ５．０： ｗｏｒｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ＲＮＡ， ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３５， ４１６８－４１６９ （２０１９）．
３１． Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＦｏｌｄＸ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ： ａｎ ｏｎｌｉｎｅ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３， Ｗ３８２－８ （２００５）．
３２． Ｄｅｌｇａｄｏ Ｂｌａｎｃｏ， Ｊ．， Ｒａｄｕｓｋｙ， Ｌ． Ｇ．， Ｃｉａｎｆｅｒｏｎｉ， Ｄ． ＆ Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ＲＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｏｃｋｉｎｇ （ＲｎａＸ） ｆｏｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＭｏｄｅｌＸ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １１６， ２４５６８－２４５７３ （２０１９）．
３３． Ｃｉａｎｆｅｒｏｎｉ， Ｄ．， Ｒａｄｕｓｋｙ， Ｌ． Ｇ．， Ｈｅａｄ， Ｓ． Ａ．， Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｌ． ＆ Ｄｅｌｇａｄｏ， Ｊ． ＰｒｏｔｅｉｎＦｉｓｈｉｎｇ： ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ＭｏｄｅｌＸ ｔｏｏｌｓｕｉｔｅ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３６， ４２０８－４２１０ （２０２０）．
３４． Ｂｌａｎｃｏ， Ｊ． Ｄ．， Ｒａｄｕｓｋｙ， Ｌ．， Ｃｌｉｍｅｎｔｅ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｈ． ＆ Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｌ． ＦｏｌｄＸ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ－ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＰＡＤＡ１ （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓｉｓｔｅｄ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ １）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ． ４６ ３８５２－３８６３ （２０１８）．
３５． Ｙｕ， Ｈ．， Ｐａｒｄｏｌｌ， Ｄ． ＆ Ｊｏｖｅ， Ｒ． ＳＴＡＴｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ： ａ ｌｅａｄｉｎｇ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＳＴＡＴ３． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ９， ７９８－８０９ （２００９）．
３６． Ｌａｓｔｒｕｃｃｉ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｔｉｌｅ， ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ＣＤ１６（＋） ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ＩＬ－１０／ＳＴＡＴ３ ａｘｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２５， １３３３－１３５１ （２０１５）．
３７． Ｚｉｚｚｏ， Ｇ．， Ｈｉｌｌｉａｒｄ， Ｂ． Ａ．， Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒ， Ｍ． ＆ Ｃｏｈｅｎ， Ｐ． Ｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍ２ｃ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ＭｅｒＴＫ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８９， ３５０８－３５２０ （２０１２）．
３８． Ｈｅｃｋ， Ｈ． Ｄ． Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｈｉｌｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｖｏｌ． ９３ ２３－２９ （１９７１）．
３９． Ｔａｍｉｙａ， Ｓ．， Ｙｏｓｈｉｋａｗａ， Ｅ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｋ． ＆ Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｙ． Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｓｔｒａｉｎｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｒｏｂｕｓｔ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ａｆｔｅｒ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ＤＢＡ／２ Ｍｉｃｅ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １０ （２０２１）．
４０． Ｓｏｍａｒａｊａｎ， Ｓ． Ｒ．， Ｋａｎｎａｎ， Ｔ． Ｒ． ＆ Ｂａｓｅｍａｎ， Ｊ． Ｂ． Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｍｐｎ１３３ ｉｓ ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ－， ｌｙｓｉｎｅ－ ａｎｄ ｓｅｒｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｃｅｌｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １２， １８２１－１８３１ （２０１０）．
４１． Ｓｅｇｏｖｉａ， Ｊ． Ａ． Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｃａｒｄｓ Ｔｏｘｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＮＬＲＰ３ Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １３５ ＡＢ１５３ （２０１５）．
４２． Ｈａｍｅｓ， Ｃ．， Ｈａｌｂｅｄｅｌ， Ｓ．， Ｈｏｐｐｅｒｔ， Ｍ．， Ｆｒｅｙ， Ｊ． ＆ Ｓｔｕｌｋｅ， Ｊ． Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９１， ７４７－７５３ （２００９）．
４３． Ｓｕｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＩＬ－１０ ｏｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｆｔｅｒ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４１， ７６－８４ （２００９）．
４４． Ｍａｕｒａｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａ Ｎｅｗ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＳｙｓＴｅｍ （ＢＥＳＴ） ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｉｎ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ９ （２０１８）．
４５． Ｓｔｅｉｄｌｅｒ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｃｏｌｉｔｉｓ ｂｙ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９， １３５２－１３５５ （２０００）．
４６． Ｌｉｎｄｎｅｒ， Ｈ． Ａ．， Ｖｅｌａｓｑｕｅｚ， Ｓ． Ｙ．， Ｔｈｉｅｌ， Ｍ． ＆ Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇ， Ｔ． Ｌｕｎｇ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｖｓ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ： Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ Ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｏｆ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｄｅａｌｉｎｇ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２， ６０２１３０ （２０２１）．
４７． Ｇｉｂｓｏｎ， Ｄ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６， ３４３－３４５ （２００９）．
４８． Ｙｕｓ， Ｅ．， Ｙａｎｇ， Ｊ．－Ｓ．， Ｓｏｇｕｅｓ， Ａ． ＆ Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｌ． Ａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｎｖｅｉｌｓ ｋｅｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８， ３６８ （２０１７）．
４９． Ｐｉｎｅｒｏ－Ｌａｍｂｅａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｏｌｉｇｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｓ９－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ． ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ． Ｂｉｏｌ． ９， １６９３－１７０４ （２０２０）．
５０． Ｂｕｒｇｏｓ， Ｒ．， Ｗｅｂｅｒ， Ｍ．， Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｓ．， Ｌｌｕｃｈ－Ｓｅｎａｒ， Ｍ． ＆ Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｒｅｄｕｃｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ． Ｍｏｌ． Ｓｙｓｔ． Ｂｉｏｌ． １６， ｅ９５３０ （２０２０）．
５１． Ｃｈｉｖａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． ＱＣｌｏｕｄ： Ａ ｃｌｏｕｄ－ｂａｓｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３， ｅ０１８９２０９ （２０１８）．
５２． Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｄ． Ｎ．， Ｐａｐｐｉｎ， Ｄ． Ｊ．， Ｃｒｅａｓｙ， Ｄ． Ｍ． ＆ Ｃｏｔｔｒｅｌｌ， Ｊ． Ｓ． Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０， ３５５１－３５６７ （１９９９）．
５３． Ｂｅｅｒ， Ｌ． Ａ．， Ｌｉｕ， Ｐ．， Ｋｙ， Ｂ．， Ｂａｒｎｈａｒｔ， Ｋ． Ｔ． ＆ Ｓｐｅｉｃｈｅｒ， Ｄ． Ｗ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｌａｂｅｌ－Ｆｒｅｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ＭａｘＱｕａｎｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６１９， ３３９－３５２ （２０１７）．
５４． Ｔｒｏｅｇｅｌｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ， ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９２， ６９９－７０８ （２０１４）．
５５． Ｇｒｉｌｌｏ， Ｍ．－Ｊ．， Ｂｌａｓｃｏ， Ｊ． Ｍ．， Ｇｏｒｖｅｌ， Ｊ． Ｐ．， Ｍｏｒｉｙｏｎ， Ｉ． ＆ Ｍｏｒｅｎｏ， Ｅ． Ｗｈａｔ ｈａｖｅ ｗｅ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ？ Ｖｅｔ． Ｒｅｓ． ４３， ２９ （２０１２）．
５６． Ｋａｍｅｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｌｕｎｇ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １１３， Ｅ６１５３－Ｅ６１６１ （２０１６）．
５７． Ｈｉｒｃｈｅ， Ｔ． Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎｎａｔｅ ｈｏｓｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８１， ４９４５－４９５４ （２００８）．
５８． Ｖｉｃｔｏｒｉａ Ｇａｒｒｉｄｏ ＆ Ｃａｒｌｏｓ Ｐｉｎｅｒｏ－Ｌａｍｂｅａ， Ｉｒｅｎｅ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｒｃｅ， Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｐａｅｔｚｏｌｄ， Ｔｏｎｙ Ｆｅｒｒａｒ， Ｍａｒｃ Ｗｅｂｅｒ， Ｅｖａ Ｇａｒｃｉａ－Ｒａｍａｌｌｏ， Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｇａｌｌｏ， Ｍａｒｉａ Ｃｏｌｌａｎｔｅｓ， Ｉｖａｎ Ｐｅｎｕｅｌａｓ， Ｌｕｉｓ Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｍａｒｉａ－Ｊｅｓｕｓ Ｇｒｉｌｌｏ， Ｍａｒｉａ Ｌｌｕｃｈ－Ｓｅｎａｒ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｒｅｄｕｃｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｂｉｏｆｉｌｍｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｉｎ ｐｒｅｓｓ．

【0519】

節（ＣＬＡＵＳＥＳ）：
以下の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドは本発明の一部を成す：
Ａ１．（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分が、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分に、５個以下、３個以下、又は２個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含む人工ペプチドリンカー配列によって融合されている一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0520】

Ａ１Ａ．ペプチドリンカーが
（ｉ）約３～約２０個のアミノ酸、
（ｉｉ）約３～約１６個のアミノ酸、
（ｉｉｉ）約３～約１２個のアミノ酸、
（ｉｖ）約３～約８個のアミノ酸、
（ｖ）約４～約８個のアミノ酸、又は
（ｖｉ）約４～約６個のアミノ酸
の配列を有する、節Ａ１の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0521】

Ａ２．左３Ｄサイトカインドメイン及び右３Ｄサイトカインドメインを含む三次構造を有し、左３Ｄサイトカインドメインが右３Ｄサイトカインドメインに２つの架橋リンカーペプチドによって接続されている、節Ａ１又は節Ａ１Ａの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0522】

Ａ３．左３Ｄサイトカインドメインが、第１のサイトカイン単量体の部分及び第２のサイトカイン単量体の部分から形成され、右３Ｄサイトカインドメインが、第１のサイトカイン単量体の部分及び第２のサイトカイン単量体の部分から形成される、節Ａ２の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0523】

Ａ４．２つの架橋リンカーペプチドが、３～２０個のアミノ酸を有する構造化リンカーであり、架橋ペプチドリンカー配列が、５個以下の、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含む、節Ａ２又は節Ａ３の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0524】

Ａ５．（ａ）第１及び第２のサイトカイン単量体が構造的に同じ種類である、又は（ｂ）第１及び第２のサイトカイン単量体が異なる種類である、節Ａ１又～Ａ４のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0525】

Ａ６．第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０、ＩＬ－５及びＩＦＮγからなる群のサイトカインから選択される、又はそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０、ＩＬ－５及びＩＦＮγからなる群のサイトカインから選択される、又はそれに由来する、節Ａ１又～Ａ５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0526】

Ａ７．第１のサイトカイン単量体及び第２のサイトカイン単量体がＩＬ－１０単量体であり、任意選択でＩＬ－１０が、ヒト又はマウス配列に由来する、節Ａ１又～Ａ６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0527】

Ａ８．第１及び第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０ ＯＲＦ（配列番号４）、配列番号１８１、配列番号３４９若しくは配列番号３５０の配列若しくはそれらの機能断片、又は配列番号４、配列番号１８１、配列番号３４９若しくは配列番号３５０若しくはそれらの機能断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ａ１又～Ａ７のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0528】

Ａ９．第１及び／又は第２のサイトカイン単量体配列が、Ｎ１８Ｉ、Ｄ２８Ｅ、Ｓ３１Ｋ、Ｎ４５Ｓ、Ｎ９２Ｉ、Ｋ９９Ｎ及びＴ１５５Ｍからなる群より選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、変異位置の番号付けが配列番号１８１に基づき、配列番号１８１の第１の位置のＱが配列位置Ｑ７である、節Ａ８の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0529】

Ａ１０．第１及び／又は第２のサイトカイン単量体配列が、少なくともアミノ酸置換：Ｄ２８Ｅ、Ｓ３１Ｋ、Ｎ４５Ｓ及びＴ１５５Ｍを含む、節Ａ９の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0530】

Ａ１１．第１のサイトカイン単量体配列が、アミノ酸置換：Ｎ１８Ｉ、Ｄ２８Ｅ、Ｓ３１Ｋ、Ｎ４５Ｓ、Ｎ９２Ｉ、Ｋ９９Ｎ及びＴ１５５Ｍのすべてを含み、第２のサイトカイン単量体配列が、アミノ酸置換：Ｄ２８Ｅ、Ｓ３１Ｋ、Ｎ４５Ｓ、Ｎ９２Ｉ、Ｋ９９Ｎ及びＴ１５５Ｍのすべてを含む、節Ａ９又は節Ａ１０の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0531】

Ａ１２．節Ａ１又～Ａ８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号９（ＭｕｔＳＣ１）の配列若しくはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
（ｉｉ）配列番号１１－（ＮｔＣｔ）－配列番号１２（フォールディカイン－１０）の配列若しくはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列
を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0532】

Ａ１３．配列番号１０（ＭｕｔＳＣ２）の配列又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ａ１又～Ａ１１のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0533】

Ａ１４．リンカーペプチドＮｔＣｔが、約４～約８個のアミノ酸又は約３～約６個のアミノ酸の配列を有する、節Ａ１２（ｉｉ）の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0534】

Ａ１５．リンカーペプチドＮｔＣｔが、ＦＧＧＬＤ（配列番号３４２）及びＮＧＧＬＤ（配列番号３１８）から選択される配列を含み、任意選択でリンカーペプチドＮｔＣｔ隣接残基の１つ又は複数のアミノ酸変異をさらに含み、特にその配列が配列番号６５である、節Ａ１４の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0535】

Ａ１６．第１のサイトカイン単量体及び第２のサイトカイン単量体がＩＬ－５単量体であり、任意選択でＩＬ－５がヒト又はマウス配列である、節Ａ１又～Ａ６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0536】

Ａ１７．第１及び第２のサイトカイン単量体が、ヒトＩＬ－５（配列番号８２）若しくはその機能断片の配列、又は配列番号８２若しくはその機能断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ａ１～Ａ６又はＡ１６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0537】

Ａ１８．配列番号１０１－（ＮｔＣｔ）－配列番号１０２（フォールディカイン－５）の配列又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ａ１６又は節Ａ１７の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0538】

Ａ１９．リンカーペプチドＮｔＣｔが、約３～約２０個のアミノ酸、約３～１６個のアミノ酸、約４～１２個のアミノ酸、約４～８個のアミノ酸、約３～８個のアミノ酸又は約３～６個のアミノ酸の配列を有する、節Ａ１８の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0539】

Ａ２０．リンカーペプチドＮｔＣｔが、ＦＧＧＬＤ（配列番号３４２）及びＮＧＧＬＤ（配列番号３１８）から選択される配列を含む、節Ａ１９の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0540】

Ａ２１．第１のサイトカイン単量体及び第２のサイトカイン単量体がＩＦＮγ単量体であり、任意選択でＩＦＮγがヒト又はマウス配列である、節Ａ１又～Ａ６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0541】

Ａ２２．第１及び第２のサイトカイン単量体が、ヒトＩＦＮγ（配列番号１９４）若しくはその機能断片の配列、又は配列番号１９４若しくはその機能断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ａ１～Ａ６又はＡ２１のいずれか一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0542】

Ａ２３．配列番号１４－（ＮｔＣｔ）－配列番号１５（フォールディカイン－ＩＦＮＧ）の配列又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ａ２１又は節Ａ２２の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0543】

Ａ２４．リンカーペプチドＮｔＣｔが、約３～約２０個のアミノ酸、約３～１６個のアミノ酸、約４～１２個のアミノ酸、約４～８個のアミノ酸、約３～８個のアミノ酸又は約３～６個のアミノ酸の配列を有する、節Ａ２３の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0544】

Ａ２５．リンカーペプチドＮｔＣｔが、ＦＧＧＬＤ（配列番号３４２）及びＮＧＧＬＤ（配列番号３１８）から選択される配列を含む、節Ａ２４の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0545】

Ａ２６．節Ａ１～Ａ２５のいずれかのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【0546】

Ａ２７．節Ａ２６の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【0547】

Ａ２８．バクテリオファージベクター又はウイルスベクターである、節Ａ２７のベクター。

【0548】

Ａ２９．節Ａ１～Ａ２５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドを発現する細胞。

【0549】

Ａ３０．真核生物細胞、特にヒト細胞である、節Ａ２９の細胞。

【0550】

Ａ３１．組換え細菌細胞であり、任意選択で細菌細胞が、マイコプラズマ属（例えばＭ．ニューモニエ）、Ｅ．コリ、Ｌ．ラクチス、Ｓ．アウレウス、及びＢ．サブティリス細菌株から選択される、節Ａ２９の細胞。

【0551】

Ａ３２．マイコプラズマ・ニューモニエ株であり、任意選択で、Ｍ１２９－Ｂ７株（ＡＴＴＣ２９３４２）、エスケリキア・コリＢＬ２１、又はラクトコッカス・ラクチス株ＮＺ９０００－ｐｅｐＮ：：ｎｉｓＲＫに由来する、節Ａ２１の細胞。

【0552】

Ａ３３．節Ａ２６～Ａ２８のいずれかのポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞。

【0553】

Ａ３４．節Ａ１～Ａ２５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ａ２９～Ａ３３のいずれかの細胞、又は節Ａ２６～Ａ２８のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクターを含む医薬組成物。

【0554】

Ａ３５．医療における使用のための、節Ａ１又～Ａ２５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ａ２９～Ａ３３のいずれかの細胞、節Ａ２６～Ａ２８のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、又は節Ａ３２の医薬組成物。

【0555】

Ａ３６．使用が、炎症性疾患及び障害；肺疾患；がん及び増殖性疾患及び病態；感染症；アレルギー、免疫及び自己免疫疾患及び障害；組織の傷害、変性及び損傷状態；並びにそれらに関連する病態から選択される疾患又は障害の治療のための方法におけるものである、節Ａ３５による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0556】

Ａ３７．がん又は増殖性疾患若しくは障害が、例えば、肺がん（特に、肺腺がん又は肺扁平上皮がん）、膀胱がん、子宮頸がん、乳がん、結腸がん、脳膠芽腫、膵臓がん、急性単球性白血病、腎臓がん、大腸がん、皮膚がん（例えばメラノーマ）、胃がん、甲状腺がん、骨がん及び肝がんからなる群より選択される固形腫瘍である、節Ａ３６による使用のための一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0557】

Ａ３８．炎症性疾患又は障害が、アレルギー、ぜんそく、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再灌流傷害、移植拒絶反応、糖尿病、アルツハイマー病、変形性関節症、線維筋痛症、筋性腰痛、関節炎、筋性頸部痛、心筋炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、線維症からなる群より選択される、節Ａ３６による使用のための一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0558】

Ａ３９．組織の傷害、変性又は損傷状態が、大腸炎、創傷治癒、発毛、肝臓再生及びマトリックス合成からなる群より選択される、節Ａ３６による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0559】

Ａ４０．使用が、がん免疫療法及び／又は免疫腫瘍学におけるものである、節Ａ３６による使用のための一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0560】

Ｂ１．（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第２のサイトカイン単量体ドメインの配列又はその機能部分が、第１のサイトカイン単量体の第１の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置され、第１のサイトカイン単量体の第２の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置されるように、第１のサイトカイン単量体ドメインの配列内に挿入されている一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0561】

Ｂ２．一本鎖二量体サイトカインポリペプチドが、左３Ｄサイトカインドメイン及び右３Ｄサイトカインドメインを含む三次構造を有し、左３Ｄサイトカインドメインが、右３Ｄサイトカインドメインに２つの架橋リンカーペプチドによって接続されている、節Ｂ１の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0562】

Ｂ３．左３Ｄサイトカインドメインが、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の第１及び第２の配列部分から形成された分割ドメインサイトカインであり、右３Ｄサイトカインドメインが、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分から形成された連続ドメインサイトカインである、節Ｂ２の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0563】

Ｂ４．２つの架橋リンカーペプチドが約３～約２０個のアミノ酸の配列を有し、架橋リンカーペプチド配列が、５個以下の、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含み、任意選択で２つの架橋リンカーペプチドが構造化リンカーを形成する、節Ｂ２又は節Ｂ３の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0564】

Ｂ５．２つの架橋リンカーペプチドが同じ配列である、又は異なる配列である、節Ｂ４の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0565】

Ｂ６．２つの架橋リンカーペプチドの第１のペプチドが、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分を第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に接続し、２つの架橋リンカーペプチドの第２のペプチドが、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分を第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端に接続する、節Ｂ２又は節Ｂ２に従属する場合は節Ｂ３～Ｂ５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0566】

Ｂ７．第１のサイトカイン単量体ドメインが、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分割され、２つの架橋リンカーペプチドが、第２のサイトカイン単量体ドメインを、第１のサイトカイン単量体ドメインの隣接αヘリックス間で接続し、任意選択で、第１のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割されている、節Ｂ２又は節Ｂ２に従属する場合は節Ｂ３～Ｂ６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0567】

Ｂ８．第２のサイトカイン単量体ドメインがＮ末端部分及びＣ末端部分を含み、Ｎ末端部分が、Ｃ末端部分に人工ペプチドリンカーによって接続され、任意選択で、人工ペプチドリンカーが、約３～約２０個のアミノ酸、約３～１６個のアミノ酸、約４～１２個のアミノ酸、約４～８個のアミノ酸、約３～８個のアミノ酸又は約３～６個のアミノ酸の配列を有する、節Ｂ６又は節Ｂ７の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0568】

Ｂ９．人工ペプチドリンカーが、５個以下の、３個以下の、又は２個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含む、節Ｂ８の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0569】

Ｂ１０．節Ｂ８又は節Ｂ９の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。
（ｉ）第２のサイトカイン単量体ドメインが、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＣ末端部分に対応し、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＮ末端部分に対応するように、それが基になる対応する野生型サイトカイン単量体と比較して逆向きであり、任意選択で、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、２、３若しくは４つのαヘリックスを含み、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、２、３若しくは４つのαヘリックスを含み、特に、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分及びＣ末端部分が、同数のαヘリックスを有する、且つ／又は
（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＮ末端部分に対応し、第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＣ末端部分に対応し、任意選択で、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、２、３若しくは４つのαヘリックスを含み、第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、２、３若しくは４つのαヘリックスを含み、特に、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分及びＣ末端部分が、同数のαヘリックスを有する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0570】

Ｂ１１．２つの架橋リンカーペプチドが、第２のサイトカイン単量体ドメインに、一対の隣接αヘリックス間で接続する、節Ｂ８又～Ｂ１０のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0571】

Ｂ１２．（ａ）第１及び第２のサイトカイン単量体が同じ種類である、又は（ｂ）第１及び第２のサイトカイン単量体が異なる種類である、節Ｂ１又～Ｂ１１のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0572】

Ｂ１３．第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＦＮλ２、３及び１（それぞれ、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ及びＩＬ－２９）、Ｉ型インターフェロンＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）、並びにＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１）からなる群のクラスＩＩサイトカインから選択される、又はそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＳＦ３、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ１、及びＣＳＦ２からなる群のクラスＩサイトカインから選択される、又はそれに由来し、任意選択で、第１及び第２のサイトカイン単量体配列が、ヒト又はマウス配列に由来する、節Ｂ１又～Ｂ１２のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0573】

Ｂ１４．第１のサイトカイン単量体及び／又は第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－２２単量体であり、任意選択で、ＩＬ－２２が、ヒト又はマウス配列である、節Ｂ１又～Ｂ１３のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0574】

Ｂ１５．第１及び第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－２２（配列番号１８４）若しくはその機能断片の配列、又は配列番号１８４若しくはその機能断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ｂ１又～Ｂ１４のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0575】

Ｂ１６．第１及び／又は第２のサイトカイン単量体配列が、ＩＬ－２２単量体ドメインの疎水性コアの安定性を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、任意選択で、１つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｔ５６Ｌ又はＴ５６Ｍ、Ａ６６Ｍ、Ｎ６８Ｑ、Ｖ９５Ｉ、Ｔ９９Ｆ及びＳ１７３Ｌからなる群より選択され、変異位置の番号付けが配列番号１８４のＩＬ－２２配列に基づき、配列番号１８４の第１の位置のＡが配列位置Ａ３４である、節Ｂ１４又は節Ｂ１５の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0576】

Ｂ１７．第１及び／又は第２のサイトカイン単量体配列が、
（ｉ）Ａ６６Ｍ、Ｖ９５Ｉ及びＴ９９Ｆ、
（ｉｉ）Ｔ５６Ｌ、Ａ６６Ｍ、Ｖ９５Ｉ及びＴ９９Ｆ、
（ｉｉｉ）Ｔ５６Ｍ、Ａ６６Ｍ、Ｎ６８Ｑ、Ｖ９５Ｉ及びＴ９９Ｆ、
（ｉｉｉ）Ｔ５６Ｌ、Ａ６６Ｍ、Ｖ９５Ｉ、Ｔ９９Ｆ及びＳ１７３Ｌ、並びに
（ｉｉ）Ｔ５６Ｍ、Ａ６６Ｍ、Ｎ６８Ｑ、Ｖ９５Ｉ、Ｔ９９Ｆ及びＳ１７３Ｌ
から選択されるアミノ酸置換のセットを含む、節Ｂ１６の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0577】

Ｂ１８．第１及び／又は第２のサイトカイン単量体配列が、安定性及び／又はその受容体Ｒ１及び／又はＲ２に対するＩＬ－２２単量体ドメインの結合親和性を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、任意選択で、１つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｄ４３Ｅ、Ｓ４５Ｒ、Ｋ６１Ｗ、Ｓ６４Ｍ、Ｔ７０Ｉ、Ｅ７７Ｙ及びＡ１３２Ｙからなる群より選択され、変異位置の番号付けが配列番号１８４に基づき、配列番号１８４の第１の位置のＡが配列位置Ａ３４である、節Ｂ１５又～Ｂ１７のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0578】

Ｂ１９．第１及び／又は第２のサイトカイン単量体配列が、
（ｉ）Ａ１３２Ｙ、Ｄ４３Ｅ、Ｓ４５Ｒ、Ｅ７７Ｙ、Ｔ７０Ｉ、
（ｉｉ）Ｋ６１Ｗ、Ｓ６４Ｍ、及び
（ｉｉｉ）Ａ１３２Ｙ、Ｄ４３Ｅ、Ｓ４５Ｒ、Ｅ７７Ｙ、Ｔ７０Ｉ、Ｋ６１Ｗ、Ｓ６４Ｍ
から選択されるアミノ酸置換のセットを含む、節Ｂ１８の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0579】

Ｂ２０．２つの架橋リンカーペプチドの第１のペプチドが、配列ＴＣＭＰＧＧＳＫＴ（配列番号３３７）を含む若しくは有し、２つの架橋リンカーペプチドの第２のペプチドが、配列ＲＬＥＬＬＰ（配列番号３３１）を含む若しくは有する、又は２つの架橋リンカーペプチドの第１のペプチドが配列ＮＲＬＫＫＬＭＡＳＳＤ（配列番号３３２）を含み、２つの架橋リンカーペプチドの第２のペプチドが配列ＲＬＥＬＬＰ（配列番号３３１）を含む、節Ｂ６又は節Ｂ６に従属する場合は節Ｂ７～Ｂ１９のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0580】

Ｂ２１．第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に、配列ＡＮＧＴ（配列番号３２９）を含む又は有する人工ペプチドリンカーによって接続されている、節Ｂ８又は節Ｂ８に従属する場合は節Ｂ９～Ｂ２０のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0581】

Ｂ２２．配列番号６５（フォールディカイン－２２＿１）、６６（フォールディカイン－２２＿３）、７２（３ｄｌｑ．Ｐｄｂ単量体配列）、７３（ＩＬ－２２ｈｙｄＣ単量体）、７４（ＭｕｔａｎｔＣ＿ＩＬ２２単量体）、７５（ＭｕｔａｎｔＤ＿ＩＬ２２単量体）、７６（ＭｕｔａｎｔＥ＿ＩＬ２２単量体）及び１４３（フォールディカイン－２２）、並びにそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％及び１００％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含む、節Ｂ１又～Ｂ２１のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0582】

Ｂ２３．配列番号６５（フォールディカイン－２２＿１）、６６（フォールディカイン－２２＿３）及び１４３（フォールディカイン－２２）、並びにそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％及び１００％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含む、節Ｂ１又～Ｂ２１のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0583】

Ｂ２４．配列番号１４１、１４２、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２及び１５３、並びにそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％及び１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含む、節Ｂ１又～Ｂ１３のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0584】

Ｂ２５．リンカーペプチドＮｔＣｔが、約３～約２０個のアミノ酸、約３～１６個のアミノ酸、約４～１２個のアミノ酸、約４～８個のアミノ酸、約３～８個のアミノ酸又は約３～６個のアミノ酸の配列を有する、節Ｂ２２又～Ｂ２４のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0585】

Ｂ２６．リンカーペプチドＮｔＣｔが、ＦＧＧＬＤ（配列番号３４２）、ＮＧＧＬＤ（配列番号３１８）、ＮＦＧＧＬＤＹ（配列番号３１６）及びＡＮＧＴ（配列番号３２９）から選択される配列、特に、配列番号１９０の配列を含む、節Ｂ２５の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0586】

Ｂ２７．架橋リンカーペプチド（Ｘｎ）がそれぞれ、約３～約２０個のアミノ酸、約３～１６個のアミノ酸、約４～１２個のアミノ酸、約４～８個のアミノ酸、約３～８個のアミノ酸又は約３～６個のアミノ酸の配列を有する、節Ｂ６に従属する場合は節Ｂ２２～Ｂ２６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0587】

Ｂ２８．架橋リンカーペプチド（Ｘｎ）が、ＴＣＭＰＧＧＳＫＴ（配列番号３３７）、ＲＬＥＬＬＰ（配列番号３３１）、及びＮＲＬＫＫＬＭＡＳＳＤ（配列番号３３２）から選択される配列を有する、節Ｂ２７の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0588】

Ｂ２９．節Ｂ１～Ｂ２８のいずれかのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【0589】

Ｂ３０．節Ｂ２９の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【0590】

Ｂ３１．バクテリオファージベクター又はウイルスベクターである、節Ｂ３０のベクター。

【0591】

Ｂ３２．節Ｂ１～Ｂ２８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドを発現する細胞。

【0592】

Ｂ３３．真核生物細胞、特にヒト細胞である、節Ｂ３２の細胞。

【0593】

Ｂ３４．組換え細菌細胞であり、任意選択で細菌細胞が、マイコプラズマ属（例えばＭ．ニューモニエ）、Ｅ．コリ、Ｌ．ラクチス、Ｓ．アウレウス、及びＢ．サブティリス細菌株から選択される、節Ｂ３２の細胞。

【0594】

Ｂ３５．マイコプラズマ・ニューモニエ株であり、任意選択で、Ｍ１２９－Ｂ７株（ＡＴＴＣ２９３４２）、エスケリキア・コリＢＬ２１、又はラクトコッカス・ラクチス株ＮＺ９０００－ｐｅｐＮ：：ｎｉｓＲＫに由来する、節Ｂ３４の細胞。

【0595】

Ｂ３６．節Ｂ２９～Ｂ３１のいずれかのポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞。

【0596】

Ｂ３７．節Ｂ１～Ｂ２８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ｂ３２～Ｂ３６のいずれかの細胞、又は節Ｂ２９～Ｂ３１のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクターを含む医薬組成物。

【0597】

Ｂ３８．医療における使用のための、節Ｂ１又～Ｂ２８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ｂ３２～Ｂ３６のいずれかの細胞、節Ｂ２９～Ｂ３１のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、又は節Ｂ３５の医薬組成物。

【0598】

Ｂ３９．使用が、炎症性疾患及び障害；肺疾患；がん及び増殖性疾患及び病態；感染症；アレルギー、免疫及び自己免疫疾患及び障害；組織の傷害、変性及び損傷状態；並びにそれらに関連する病態から選択される疾患又は障害の治療のための方法におけるものである、節Ｂ３８による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0599】

Ｂ４０．がん又は増殖性疾患若しくは障害が、例えば、肺がん（特に、肺腺がん又は肺扁平上皮がん）、膀胱がん、子宮頸がん、乳がん、結腸がん、脳膠芽腫、膵臓がん、急性単球性白血病、腎臓がん、大腸がん、皮膚がん（例えばメラノーマ）、胃がん、甲状腺がん、骨がん及び肝がんからなる群より選択される固形腫瘍である、節Ｂ３９による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0600】

Ｂ４１．炎症性疾患又は障害が、アレルギー、ぜんそく、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再灌流傷害、移植拒絶反応、糖尿病、アルツハイマー病、変形性関節症、線維筋痛症、筋性腰痛、関節炎、筋性頸部痛、心筋炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、線維症からなる群より選択される、節Ｂ３９による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0601】

Ｂ４２．組織の傷害、変性又は損傷状態が、大腸炎、創傷治癒、発毛、肝臓再生及びマトリックス合成からなる群より選択される、節Ｂ３９による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0602】

Ｂ４３．使用が、がん免疫療法及び／又は免疫腫瘍学におけるものである、節Ｂ３９による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0603】

Ｃ１．（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の配列が、第１のサイトカイン単量体の第１の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置され、第１のサイトカイン単量体の第２の配列部分が、第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置されるように、第１のサイトカイン単量体ドメインの配列内に挿入されている一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0604】

Ｃ１Ａ．第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分が、天然のサイトカイン単量体のＣ末端部分に相当し、第１のサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分が、天然のサイトカイン単量体のＮ末端部分に相当する、節Ｃ１の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0605】

Ｃ２．一本鎖二量体サイトカインポリペプチドが、左３Ｄサイトカインドメイン及び右３Ｄサイトカインドメインを含む三次構造を有し、左３Ｄサイトカインドメインが、右３Ｄサイトカインドメインに２つの架橋リンカーペプチドによって接続されている、節Ｃ１又は節Ｃ１Ａの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0606】

Ｃ３．左３Ｄサイトカインドメインが、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の第１及び第２の配列部分から形成された分割ドメインサイトカインであり、右３Ｄサイトカインドメインが、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分から形成された連続ドメインサイトカインである、節Ｃ２の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0607】

Ｃ４．２つの架橋リンカーペプチドが、約３～２０個のアミノ酸、約３～１６個のアミノ酸、約４～１２個のアミノ酸、約４～８個のアミノ酸、約３～８個のアミノ酸又は約３～６個のアミノ酸の配列を有し、架橋リンカーペプチド配列が、５個以下の、好適には３個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含み、任意選択で２つの架橋リンカーペプチドが構造化リンカーである、節Ｃ２又は節Ｃ３の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0608】

Ｃ５．２つの架橋リンカーペプチドが同じ配列である、又は異なる配列である、節Ｃ４の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0609】

Ｃ６．２つの架橋リンカーペプチドが、構造化リンカーである、又は短い柔軟なリンカーである、節Ｃ４又は節Ｃ５の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0610】

Ｃ７．２つの架橋リンカーペプチドの第１のペプチドが、第１のサイトカイン単量体ドメインの第１の配列部分を、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端に接続し、２つの架橋リンカーペプチドの第２のペプチドが、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端を、第１のサイトカイン単量体ドメインの第２の配列部分に接続する、節Ｃ２又は節Ｃ２に従属する場合は節Ｃ３～Ｃ６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0611】

Ｃ８．第１のサイトカイン単量体ドメインが、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分割されて、一本鎖二量体サイトカインポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を形成する、節Ｃ１又～Ｃ７のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0612】

Ｃ９．第１のサイトカイン単量体ドメインが、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＣ末端部分に対応し、第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＮ末端部分に対応するように、それが基になる対応する野生型サイトカイン単量体と比較して逆向きである、節Ｃ１又～Ｃ８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0613】

Ｃ１０．第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、特に、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分及びＣ末端部分が、同数のαヘリックスを有し、任意選択で、第１のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割される、節Ｃ８又は節Ｃ９の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0614】

Ｃ１１．第２のサイトカイン単量体ドメインの２つの隣接αヘリックス間のペプチドリンカー／ループが、約３～約２０個のアミノ酸、約３～約１６個のアミノ酸、約４～約１２個のアミノ酸、約４～約８個のアミノ酸、約３～約８個のアミノ酸又は約３～約６個のアミノ酸の人工リンカーペプチドで置換されている、節Ｃ１又～Ｃ１０のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0615】

Ｃ１１Ａ．人工ペプチドリンカー配列が、５個以下の、好ましくは３個以下の、又は２個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含み、任意選択で、人工ペプチドリンカーが構造化リンカーである、節Ｃ１又～Ｃ１１のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0616】

Ｃ１２．節Ｃ１又～Ｃ１１のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）第１及び第２のサイトカイン単量体が同じ種類である、又は
（ｉｉ）第１及び第２のサイトカイン単量体が異なる種類である
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0617】

Ｃ１３．節Ｃ１又～Ｃ１２のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＧＭＣＳ－Ｆ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３からなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＧＭＣＳ－Ｆ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３からなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する、
（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３からなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３からなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する、又は
（ｉｉｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＴＳＬ及びＧＭＣＳ－Ｆからなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＴＳＬ及びＧＭＣＳ－Ｆからなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、任意選択で第１及び第２のサイトカイン単量体配列が、ヒト若しくはマウス配列に由来する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0618】

Ｃ１４．配列番号９２、９３、９４、９６、９７、９８、９９、１００及び１０１、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４及び１２５、並びにそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含む、節Ｃ１又～Ｃ１３のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0619】

Ｃ１５．架橋リンカーペプチド（Ｘｎ）のそれぞれが、約３～２０個のアミノ酸、約３～１６個のアミノ酸、約４～１２個のアミノ酸、約４～８個のアミノ酸、約３～８個のアミノ酸又は約３～６個のアミノ酸の配列を有する、節Ｃ１３又は節Ｃ１４の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0620】

Ｃ１６．節Ｃ１～Ｃ１５のいずれかのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【0621】

Ｃ１７．節Ｃ１６の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【0622】

Ｃ１８．バクテリオファージベクター又はウイルスベクターである、節Ｃ１７のベクター。

【0623】

Ｃ１９．節Ｃ１～Ｃ１５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドを発現する細胞。

【0624】

Ｃ２０．真核生物細胞、特にヒト細胞である、節Ｃ１９の細胞。

【0625】

Ｃ２１．組換え細菌細胞であり、任意選択で細菌細胞が、マイコプラズマ属（例えばＭ．ニューモニエ）、Ｅ．コリ、Ｌ．ラクチス、Ｓ．アウレウス、及びＢ．サブティリス細菌株から選択される、節Ｃ１９の細胞。

【0626】

Ｃ２２．マイコプラズマ・ニューモニエ株であり、任意選択で、Ｍ１２９－Ｂ７株（ＡＴＴＣ２９３４２）、エスケリキア・コリＢＬ２１、又はラクトコッカス・ラクチス株ＮＺ９０００－ｐｅｐＮ：：ｎｉｓＲＫに由来する、節Ｃ２１の細胞。

【0627】

Ｃ２３．節Ｃ１６～Ｃ１８のいずれかのポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞。

【0628】

Ｃ２４．節Ｃ１～Ｃ１５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ｃ１９～Ｃ２３のいずれかの細胞、又は節Ｃ１６～Ｃ１８のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクターを含む医薬組成物。

【0629】

Ｃ２５．医療における使用のための、節Ｃ１又～Ｃ１５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ｃ１９～Ｃ２３のいずれかの細胞、節Ｃ１６～Ｃ１８のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、又は節Ｃ２４の医薬組成物。

【0630】

Ｃ２６．使用が、炎症性疾患及び障害；肺疾患；がん及び増殖性疾患及び病態；感染症；アレルギー、免疫及び自己免疫疾患及び障害；組織の傷害、変性及び損傷状態；並びにそれらに関連する病態から選択される疾患又は障害の治療のための方法におけるものである、節Ｃ２５による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0631】

Ｃ２７．がん又は増殖性疾患若しくは障害が、例えば、肺がん（特に、肺腺がん又は肺扁平上皮がん）、膀胱がん、子宮頸がん、乳がん、結腸がん、脳膠芽腫、膵臓がん、急性単球性白血病、腎臓がん、大腸がん、皮膚がん（例えばメラノーマ）、胃がん、甲状腺がん、骨がん及び肝がんからなる群より選択される固形腫瘍である、節Ｃ２６による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0632】

Ｃ２８．炎症性疾患又は障害が、アレルギー、ぜんそく、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再灌流傷害、移植拒絶反応、糖尿病、アルツハイマー病、変形性関節症、線維筋痛症、筋性腰痛、関節炎、筋性頸部痛、心筋炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、線維症からなる群より選択される、節Ｃ２６による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0633】

Ｃ２９．組織の傷害、変性又は損傷状態が、大腸炎、創傷治癒、発毛、肝臓再生及びマトリックス合成からなる群より選択される、節Ｃ２６による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0634】

Ｃ３０．使用が、がん免疫療法及び／又は免疫腫瘍学におけるものである、節Ｃ２６による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0635】

Ｄ１．（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第１のサイトカイン単量体ドメイン配列が、第２のサイトカイン単量体ドメイン配列に対して異なる種類のサイトカインに由来し、左サイトカインドメインが、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の第１及び第２の配列部分から形成された分割ドメインサイトカインであり、右３Ｄサイトカインドメインが、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分から形成された連続ドメインサイトカインである一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0636】

Ｄ２．一本鎖二量体サイトカインポリペプチドが、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分で形成される左３Ｄサイトカインドメイン及び第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分で形成される右３Ｄサイトカインドメインを含む三次構造を有する、節Ｄ１の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0637】

Ｄ３．第１のサイトカイン単量体ドメインが、第２のサイトカイン単量体ドメインに、２つの架橋リンカーペプチドによって接続されている、節Ｄ１又は節Ｄ２の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0638】

Ｄ４．２つの架橋リンカーペプチドがそれぞれ、約３～約２０個のアミノ酸の配列、約３～約１６個のアミノ酸、約４～約１２個のアミノ酸、約４～約８個のアミノ酸、約３～約８個のアミノ酸又は約３～約６個のアミノ酸を有し、好ましくは、架橋ペプチドリンカー配列が、５個以下の、３個以下の、又は２個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含む、節Ｄ３の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0639】

Ｄ５．第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分が、第１のサイトカイン単量体の第１の配列部分が第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置され、第１のサイトカイン単量体の第２の配列部分が第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置されるように、第１のサイトカイン単量体ドメインの配列内に挿入される、節Ｄ１又～Ｄ４のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0640】

Ｄ６．２つの架橋リンカーペプチドが同じ配列である、又は異なる配列である、節Ｄ２又は節Ｄ２に従属する場合は節Ｄ３～Ｄ５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0641】

Ｄ７．２つの架橋リンカーペプチドの第１のペプチドが、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分を、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端に接続し、２つの架橋リンカーペプチドの第２のペプチドが、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端を、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に接続する、節Ｄ２又は節Ｄ２に従属する場合は節Ｄ３～Ｄ６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0642】

Ｄ８．節Ｄ１又～Ｄ７のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）第１のサイトカイン単量体ドメインがクラスＩＩサイトカインに由来し、第２のサイトカイン単量体がクラスＩサイトカインに由来する、又は
（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体ドメインがクラスＩサイトカインに由来し、第２のサイトカイン単量体がクラスＩＩサイトカインに由来する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0643】

Ｄ９．第１のサイトカイン単量体が、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分割され、２つの架橋リンカーペプチドが、第２のサイトカイン単量体ドメインを、第１のサイトカイン単量体ドメインの隣接αヘリックス間で接続し、任意選択で、第１のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割される、節Ｄ８（ｉ）の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0644】

Ｄ１０．第１のサイトカイン単量体が、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分割され、一本鎖二量体サイトカインのＮ末端及びＣ末端をもたらし、２つの架橋リンカーペプチドが、第１のサイトカイン単量体の元のＣ末端及びＮ末端を、それぞれ、第２のサイトカイン単量体ドメインの元のＮ末端及びＣ末端に接続して、一本鎖二量体サイトカインを形成する、節Ｄ８（ｉｉ）の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0645】

Ｄ１１．第１のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割される、節Ｄ１０の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0646】

Ｄ１２．分割部分又は第１のサイトカイン単量体ドメインが、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＣ末端部分に対応し、第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＮ末端部分に対応するように、それが基になる対応する野生型サイトカイン単量体と比較して逆向きであり、任意選択で、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、特に、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分及びＣ末端部分が、同数のαヘリックスを有する、節Ｄ８（ｉｉ）、Ｄ１０又はＤ１１のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0647】

Ｄ１３．第２のサイトカイン単量体ドメインがＮ末端部分及びＣ末端部分を含み、Ｎ末端部分が、Ｃ末端部分に人工ペプチドリンカーによって接続され、任意選択で、人工リンカーが、約３～約２０個のアミノ酸、約３～１６個のアミノ酸、約４～１２個のアミノ酸、約４～８個のアミノ酸、約３～８個のアミノ酸又は約３～６個のアミノ酸の配列を有する、節Ｄ８（ｉｉ）の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0648】

Ｄ１４．第２のサイトカイン単量体ドメインが、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＣ末端部分に対応し、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＮ末端部分に対応するような、それが基になる対応する野生型サイトカイン単量体と比較して逆向きである、任意選択で、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、特に、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分及びＣ末端部分が、同数のαヘリックスを有する、節Ｄ１３の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0649】

Ｄ１５．第１のサイトカイン単量体が、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分割され、一本鎖二量体サイトカインのＮ末端及びＣ末端をもたらし、任意選択で、第１のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割される、節Ｄ８（ｉｉ）、Ｄ１３又はＤ１４のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0650】

Ｄ１６．第２のサイトカイン単量体が、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分割され、２つの架橋リンカーペプチドが、それぞれ、第１のサイトカイン単量体の元のＣ末端及びＮ末端に、第２のサイトカイン単量体ドメインの隣接αヘリックス間で接続され、任意選択で、第２のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割される、節Ｄ８（ｉｉ）、又はＤ１３～Ｄ１５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0651】

Ｄ１７．節Ｄ１又～Ｄ１６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＦＮλ２、３及び１（それぞれ、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ及びＩＬ－２９）、Ｉ型インターフェロンＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）及びＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１）からなる群のクラスＩＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＧＭＣＳ－Ｆ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３からなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する、又は
（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＧＭＣＳ－Ｆ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３からなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＦＮλ２、３及び１（それぞれ、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ及びＩＬ－２９）、Ｉ型インターフェロンＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）及びＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１）からなる群のクラスＩＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0652】

Ｄ１８．列番号２６７－（Ｘｎ）－配列番号２６８－（Ｘｎ）－配列番号２６９（フォールディカイン２２－２＿６Ｂ）の配列又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ｄ９の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0653】

Ｄ１９．配列番号２６３－（Ｘｎ）－配列番号２６４－（ＮｔＣｔ）－配列番号２６５－（Ｘｎ）－配列番号２６６（フォールディカイン２－２２＿６Ｂ）の配列又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ｄ１３又～Ｄ１６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0654】

Ｄ２０．配列番号２６０－（Ｘｎ）－配列番号２６１－（Ｘｎ）－配列番号２６２（フォールディカイン２－２２＿６Ａ）の配列又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ｄ１０又～Ｄ１２のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0655】

Ｄ２１．節Ｄ１～Ｄ２０のいずれかのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【0656】

Ｄ２２．節Ｄ２１の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【0657】

Ｄ２３．バクテリオファージベクター又はウイルスベクターである、節Ｄ２２のベクター。

【0658】

Ｄ２４．節Ｄ１～Ｄ２０のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドを発現する細胞。

【0659】

Ｄ２５．組換え真核生物細胞、特にヒト細胞である、節Ｄ２４の細胞。

【0660】

Ｄ２６．組換え細菌細胞であり、任意選択で、細菌細胞が、マイコプラズマ属（例えばＭ．ニューモニエ）、Ｅ．コリ、Ｌ．ラクチス、Ｓ．アウレウス、及びＢ．サブティリス細菌株から選択される、節Ｄ２４の細胞。

【0661】

Ｄ２７．マイコプラズマ・ニューモニエ株であり、任意選択で、Ｍ１２９－Ｂ７株（ＡＴＴＣ２９３４２）、エスケリキア・コリＢＬ２１、又はラクトコッカス・ラクチス株ＮＺ９０００－ｐｅｐＮ：：ｎｉｓＲＫに由来する、節Ｄ２６の細胞。

【0662】

Ｄ２８．節Ｄ２１～Ｄ２３のいずれかのポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞。

【0663】

Ｄ２９．節Ｄ１～Ｄ２０のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ｄ２４～Ｄ２８のいずれかの細胞、又は節Ｄ２１～Ｄ２３のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクターを含む医薬組成物。

【0664】

Ｄ３０．医療における使用のための、節Ｄ１又～Ｄ２０のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ｄ２４～Ｄ２８のいずれかの細胞、節Ｄ２１～Ｄ２３のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、又は節Ｄ２９の医薬組成物。

【0665】

Ｄ３１．使用が、炎症性疾患及び障害；肺疾患；がん及び増殖性疾患及び病態；感染症；アレルギー、免疫及び自己免疫疾患及び障害；組織の傷害、変性及び損傷状態；並びにそれらに関連する病態から選択される疾患又は障害の治療のための方法におけるものである、節Ｄ３０による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0666】

Ｄ３２．がん又は増殖性疾患若しくは障害が、例えば、肺がん（特に、肺腺がん又は肺扁平上皮がん）、膀胱がん、子宮頸がん、乳がん、結腸がん、脳膠芽腫、膵臓がん、急性単球性白血病、腎臓がん、大腸がん、皮膚がん（例えばメラノーマ）、胃がん、甲状腺がん、骨がん及び肝がんからなる群より選択される固形腫瘍である、節Ｄ３１による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0667】

Ｄ３３．炎症性疾患又は障害が、アレルギー、ぜんそく、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再灌流傷害、移植拒絶反応、糖尿病、アルツハイマー、変形性関節症、線維筋痛症、筋性腰痛、関節炎、筋性頸部痛、心筋炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、線維症からなる群より選択される、節Ｄ３１による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0668】

Ｄ３４．組織の傷害、変性又は損傷状態が、大腸炎、創傷治癒、発毛、肝臓再生及びマトリックス合成からなる群より選択される、節Ｄ３１による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0669】

Ｄ３５．使用が、がん免疫療法及び／又は免疫腫瘍学におけるものである、節Ｄ３１による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0670】

Ｅ１．（ａ）第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分及び（ｂ）第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分を含む一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、第１のサイトカイン単量体ドメイン配列が、第２のサイトカイン単量体ドメイン配列に対して異なる種類のサイトカインに由来し、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分で形成される左３Ｄサイトカインドメイン及び第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分で形成される右３Ｄサイトカインドメインを含む三次構造を有する一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0671】

Ｅ２．節Ｅ１の一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）第１のサイトカイン単量体ドメイン配列が、ＩＬ－１０若しくはＩＦＮγサイトカイン配列に由来し、第２のサイトカイン単量体ドメイン配列が、クラスＩ若しくはクラスＩＩサイトカイン配列に由来する、又は
（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体ドメイン配列が、クラスＩ若しくはクラスＩＩサイトカイン配列に由来し、第２のサイトカイン単量体ドメイン配列が、ＩＬ－１０若しくはＩＦＮγサイトカイン配列に由来する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0672】

Ｅ３．左３Ｄサイトカインドメインが、右３Ｄサイトカインドメインに２つの架橋リンカーペプチドによって接続されている、節Ｅ１又は節Ｅ２の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0673】

Ｅ４．２つの架橋リンカーペプチドがそれぞれ、約３～約２０個のアミノ酸の配列、約３～約１６個のアミノ酸、約４～約１２個のアミノ酸、約４～約８個のアミノ酸、約３～約８個のアミノ酸又は約３～約６個のアミノ酸を有し、好ましくは、架橋ペプチドリンカー配列が、５個以下の、３個以下の、又は２個以下の隣接Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含む、節Ｅ３の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0674】

Ｅ５．第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分が、第１のサイトカイン単量体の第１の配列部分が第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＮ末端に配置され、第１のサイトカイン単量体の第２の配列部分が第２のサイトカイン単量体又はその機能部分のＣ末端に配置されるように、第１のサイトカイン単量体ドメインの配列内に挿入される、節Ｅ１又～Ｅ４のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0675】

Ｅ６．左３Ｄサイトカインドメインが、第１のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分の第１及び第２の配列部分から形成された分割ドメインサイトカインであり、右３Ｄサイトカインドメインが、第２のサイトカイン単量体ドメイン又はその機能部分から形成された連続ドメインサイトカインである、節Ｅ１又～Ｅ５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0676】

Ｅ７．２つの架橋リンカーペプチドが同じ配列である、又は異なる配列である、節Ｅ３又は節Ｅ３に従属する場合は節Ｅ４～Ｅ６のいずれか一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0677】

Ｅ８．２つの架橋リンカーペプチドの第１のペプチドが、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分を第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分に接続し、２つの架橋リンカーペプチドの第２のペプチドが、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端を第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分に接続する、節Ｅ３又は節Ｅ３に従属する場合は節Ｅ４～Ｅ７のいずれか一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0678】

Ｅ８Ａ．第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、自然のサイトカイン単量体のＣ末端部分に対応し、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、自然のサイトカイン単量体のＮ末端部分に対応する、節Ｅ８の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0679】

Ｅ９．節Ｅ１又～Ｅ８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）第１のサイトカイン単量体ドメインがＩＬ－１０サイトカインに由来し、第２のサイトカイン単量体がクラスＩサイトカインに由来する、
（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体ドメインがＩＬ－１０サイトカインに由来し、第２のサイトカイン単量体がクラスＩＩサイトカインに由来する、
（ｉｉｉ）第１のサイトカイン単量体ドメインがＩＦＮγサイトカインに由来し、第２のサイトカイン単量体がクラスＩサイトカインに由来する、又は
（ｉｖ）第１のサイトカイン単量体ドメインがＩＦＮγサイトカインに由来し、第２のサイトカイン単量体がクラスＩＩサイトカインに由来する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0680】

Ｅ１０．第１のサイトカイン単量体が、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分割され、２つの架橋リンカーペプチドが、第２のサイトカイン単量体ドメインを、第１のサイトカイン単量体ドメインの隣接αヘリックス間で接続し、任意選択で、第１のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割される、節Ｅ６又は節Ｅ６に従属する場合は節Ｅ７～Ｅ９のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0681】

Ｅ１１．第１のサイトカイン単量体が、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分割されて一本鎖二量体サイトカインのＮ末端及びＣ末端をもたらし、２つの架橋リンカーペプチドが、第１のサイトカイン単量体の元のＣ末端及びＮ末端を、それぞれ、第２のサイトカイン単量体ドメインの元のＮ末端及びＣ末端に接続して一本鎖二量体サイトカインを形成する、節Ｅ６又は節Ｅ６に従属する場合は節Ｅ７～Ｅ９のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0682】

Ｅ１２．第１のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割される、節Ｅ１１の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0683】

Ｅ１３．分割部分又は第１のサイトカイン単量体ドメインが、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＣ末端部分に対応し、第１のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＮ末端部分に相当するように、それが基になる対応する野生型サイトカイン単量体と比較して逆向きであり、任意選択で、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、特に、第１のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分及びＣ末端部分が、同数のαヘリックスを有する、節Ｅ６又は節Ｅ６に従属する場合は節Ｅ７～Ｅ１２のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0684】

Ｅ１４．第２のサイトカイン単量体ドメインがＮ末端部分及びＣ末端部分を含み、Ｎ末端部分が、Ｃ末端部分に人工ペプチドリンカーによって接続され、任意選択で、人工リンカーが、約３～約２０個のアミノ酸、約３～１６個のアミノ酸、約４～１２個のアミノ酸、約４～８個のアミノ酸、約３～８個のアミノ酸又は約３～６個のアミノ酸の配列を有する、節Ｅ６又は節Ｅ６に従属する場合は節Ｅ７～Ｅ１３のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0685】

Ｅ１５．第２のサイトカイン単量体ドメインが、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＣ末端部分に対応し、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、対応する野生型サイトカイン単量体ドメイン配列のＮ末端部分に対応するようにそれが基になる対応する野生型サイトカイン単量体と比較して逆向きである、任意選択で、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、第２のサイトカイン単量体ドメインのＣ末端部分が、２、３又は４つのαヘリックスを含み、特に、第２のサイトカイン単量体ドメインのＮ末端部分及びＣ末端部分が、同数のαヘリックスを有する、節Ｅ１４の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0686】

Ｅ１６．第１のサイトカイン単量体が、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分離され、一本鎖二量体サイトカインのＮ末端及びＣ末端をもたらし、任意選択で、第１のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割される、節Ｅ６又は節Ｅ６に従属する場合は節Ｅ７～Ｅ１５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0687】

Ｅ１７．第２のサイトカイン単量体が、一対の隣接αヘリックス間のループ領域で分離され、２つの架橋リンカーペプチドが、それぞれ、第１のサイトカイン単量体の元のＣ末端及びＮ末端に、第２のサイトカイン単量体ドメインの隣接αヘリックス間で接続され、任意選択で、第２のサイトカイン単量体が、サイトカイン単量体ドメインの第２と第３のαヘリックスの間又は第３と第４のαヘリックスの間のループ領域で分割される、節Ｅ１４又～Ｅ１６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0688】

Ｅ１８．節Ｅ１又～Ｅ１７のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）クラスＩサイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＧＭＣＳ－Ｆ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３からなる群のサイトカインから選択される、且つ／若しくはそれに由来する、又は
（ｉｉ）クラスＩＩサイトカインが、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＦＮλ２、３及び１（それぞれ、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ及びＩＬ－２９）、Ｉ型インターフェロンＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）及びＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１）からなる群のサイトカインから選択される、且つ／若しくはそれに由来する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0689】

Ｅ１９．節Ｅ１又～Ｅ１８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＦＮλ２、３及び１（それぞれ、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ及びＩＬ－２９）、Ｉ型インターフェロンＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）及びＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１）からなる群のクラスＩＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０及びＩＦＮγからなる群のスワップドドメインサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する、又は
（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０及びＩＦＮγからなる群のスワップドドメインサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＦＮλ２、３及び１（それぞれ、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ及びＩＬ－２９）、Ｉ型インターフェロンＩＦＮα（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７及びＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮω（ＩＦＮＷ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮк（ＩＦＮＫ）及びＩＦＮβ（ＩＦＮＢ１）からなる群のクラスＩＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0690】

Ｅ２０．節Ｅ１又～Ｅ１８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３からなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０及びＩＦＮγからなる群のスワップドドメインサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する、又は
（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０及びＩＦＮγからなる群のスワップドドメインサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ、ＩＬ３１、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＴＦ１、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＳＦ３からなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0691】

Ｅ２１．節Ｅ１又～Ｅ１８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドであって、
（ｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１及びＧＭＣＳ－Ｆからなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０及びＩＦＮγからなる群のスワップドドメインサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する、又は
（ｉｉ）第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０及びＩＦＮγからなる群のスワップドドメインサイトカインから選択される、又はそれに由来し、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１及びＧＭＣＳ－Ｆからなる群のクラスＩサイトカインから選択される、若しくはそれに由来する
一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0692】

Ｅ２２．第１のサイトカイン単量体がＩＬ－２２であり、第２のサイトカイン単量体がＩＬ－１０であり、任意選択で、ＩＬ－２２及びＩＬ－１０が、ヒト又はマウス配列に由来する、節Ｅ１又～Ｅ１９のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0693】

Ｅ２３．第１のサイトカイン単量体がＩＬ－１０であり、第２のサイトカイン単量体がＩＬ－２２であり、任意選択で、ＩＬ－２２及びＩＬ－１０が、ヒト又はマウス配列に由来する、節Ｅ１又～Ｅ１９のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0694】

Ｅ２４．第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０ ＯＲＦ（配列番号４）、配列番号１８１、配列番号３４９若しくは配列番号３５０若しくはそれらの機能断片の配列、又は配列番号４若しくは配列番号１８１、配列番号３４９若しくは配列番号３５０若しくはそれらの機能断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含み、第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－２２（配列番号１８４）若しくはその機能断片の配列、又は配列配列番号１８４若しくはその機能断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ｅ１～Ｅ１９又はＥ２３のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0695】

Ｅ２５．ＩＬ－２２サイトカイン単量体配列が、ＩＬ－２２単量体ドメインの疎水性コアの安定性を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、任意選択で、１つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｔ５６Ｌ及びＴ５６Ｍ、Ａ６６Ｍ、Ｎ６８Ｑ、Ｖ９５Ｉ、Ｔ９９Ｆ及びＳ３１７Ｌからなる群より選択され、変異位置の番号付けが配列番号１８４のＩＬ－２２配列に基づき、配列番号１８４の第１の位置のＡが配列位置Ａ３４である、節Ｅ２４の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0696】

Ｅ２６．ＩＬ－２２サイトカイン単量体配列が、
（ｉ）Ｔ５６Ｌ、Ａ６６Ｍ、Ｖ９５Ｉ、Ｔ９９Ｆ及びＳ１７３Ｌ、並びに
（ｉｉ）Ｔ５６Ｍ、Ａ６６Ｍ、Ｎ６８Ｑ、Ｖ９５Ｉ、Ｔ９９Ｆ及びＳ１７３Ｌ
から選択されるアミノ酸置換のセットを含む、節Ｅ２５の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0697】

Ｅ２７．ＩＬ－２２サイトカイン単量体配列が、安定性及び／又はその受容体Ｒ１及び／又はＲ２に対するＩＬ－２２単量体ドメインの結合親和性を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、任意選択で、１つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｄ４３Ｅ、Ｓ４５Ｒ、Ｋ６１Ｗ、Ｓ６４Ｍ、Ｔ７０Ｉ、Ｅ７７Ｙ及びＡ１３２Ｙからなる群より選択され、変異位置の番号付けが配列番号１２９に基づき、配列番号１８４の第１の位置のＡが配列位置Ａ３４である、節Ｅ２４又～Ｅ２６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0698】

Ｅ２８．ＩＬ－２２サイトカイン単量体配列が、
（ｉ）Ａ１３２Ｙ、Ｄ４３Ｅ、Ｓ４５Ｒ、Ｅ７７Ｙ、Ｔ７０Ｉ、
（ｉｉ）Ｋ６１Ｗ、Ｓ６４Ｍ、及び
（ｉｉｉ）Ａ１３２Ｙ、Ｄ４３Ｅ、Ｓ４５Ｒ、Ｅ７７Ｙ、Ｔ７０Ｉ、Ｋ６１Ｗ、Ｓ６４Ｍ
から選択されるアミノ酸置換のセットを含む
節Ｅ２７の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0699】

Ｅ２９．第２のサイトカイン単量体が、ＩＬ－１０ ＯＲＦ（配列番号４）、配列番号１８１、配列番号３４９若しくは配列番号３５０の配列若しくはそれらの機能断片、又は配列番号４若しくは配列番号１８１、配列番号３４９若しくは配列番号３５０若しくはそれらの機能断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含み、第１のサイトカイン単量体が、ＩＬ－２２（配列番号１８４）若しくはその機能断片の配列、又は配列番号１８４若しくはその機能断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ｅ１～Ｅ１９又はＥ２２のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0700】

Ｅ３０．ＩＬ－２２サイトカイン単量体配列が、ＩＬ－２２単量体分割３Ｄドメインの安定性を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、任意選択で、１つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｔ１７Ｌ、Ａ２７Ｍ、Ｖ５６Ｉ、Ｔ６０Ｆ及びＳ３１４Ｌからなる群より選択され、変異位置の番号付けが、配列番号７５のフォールディカイン１０２２＿３配列に基づく、節Ｅ２９の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0701】

Ｅ３１．ＩＬ－２２サイトカイン単量体配列が、アミノ酸置換：Ｔ１７Ｌ、Ａ２７Ｍ、Ｖ５６Ｉ、Ｔ６０Ｆ及びＳ３１４Ｌのすべてを含む、節Ｅ３０の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0702】

Ｅ３２．ＩＬ－１０サイトカイン単量体配列が、Ｎ１８Ｉ、Ｄ２８Ｅ、Ｓ３１Ｋ、Ｎ４５Ｓ、Ｎ９２Ｉ、Ｋ９９Ｎ及びＴ１５５Ｍからなる群より選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、変異位置の番号付けが配列番号１８１に基づき、配列番号１８１の第１の位置のＱが配列位置Ｑ７である、節Ｅ２４若しくは節Ｅ２４に従属する場合は節Ｅ２５～Ｅ２８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、又は節Ｅ２９若しくは節Ｅ２９に従属する場合は節Ｅ３０若しくは節Ｅ３１の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0703】

Ｅ３３．ＩＬ－１０サイトカイン単量体配列が、少なくともアミノ酸置換：Ｄ２８Ｅ、Ｓ３１Ｋ、Ｎ４５Ｓ及びＴ１５５Ｍを含む、節Ｅ３２の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0704】

Ｅ３４．ＩＬ－１０サイトカイン単量体配列が、アミノ酸置換：Ｄ２８Ｅ、Ｓ３１Ｋ、Ｎ４５Ｓ、Ｎ９２Ｉ、Ｋ９９Ｎ及びＴ１５５Ｍのすべてを含む、節Ｅ３２又は節Ｅ３３の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0705】

Ｅ３５．ＩＬ－２２単量体分割３ＤドメインのＮ末端部分が、ＩＬ－１０単量体連続３ＤドメインのＮ末端に、配列ＤＰＫＡＡＦＫＳ（配列番号３１４）を含む、又は有する架橋リンカーペプチドによって接続され、ＩＬ－１０単量体連続３ＤドメインのＣ末端が、ＩＬ－２２単量体分割３ＤドメインのＣ末端部分に、配列ＤＳＫＶＮＲ（配列番号３１５）を含む、又は有する架橋リンカーペプチドによって接続されている、節Ｅ２９又は節Ｅ２９に従属する場合は節Ｅ３０～Ｅ３４のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0706】

Ｅ３６．ＩＬ－１０単量体連続３ＤドメインのＮ末端部分が、ＩＬ－１０単量体連続３ＤドメインのＣ末端部分に、配列ＮＦＧＧＬＤＹ（配列番号３１６）を含む、又は有する人工ペプチドリンカーによって接続されている、節Ｅ２９又は節Ｅ２９に従属する場合は節Ｅ３０～Ｅ３５のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0707】

Ｅ３７．配列番号７７（フォールディカイン１０２２）、７５（フォールディカイン１０２２＿３）及び７６（フォールディカイン１０２２＿５）からなる群より選択される配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ｅ１又～Ｅ３６のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0708】

Ｅ３８．配列番号７６（フォールディカイン１０２２＿５）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、節Ｅ３７の一本鎖二量体サイトカインポリペプチド。

【0709】

Ｅ３９．節Ｅ１～Ｅ３８のいずれかのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【0710】

Ｅ４０．節Ｅ３９の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【0711】

Ｅ４１．バクテリオファージベクター又はウイルスベクターである、節Ｅ４０のベクター。

【0712】

Ｅ４２．節Ｅ１～Ｅ３８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチドを発現する細胞。

【0713】

Ｅ４３．組換え真核生物細胞、特にヒト細胞である、節Ｅ４２の細胞。

【0714】

Ｅ４４．組換え細菌細胞であり、任意選択で、細菌細胞が、マイコプラズマ属（例えばＭ．ニューモニエ）、Ｅ．コリ、Ｌ．ラクチス、Ｓ．アウレウス、及びＢ．サブティリス細菌株から選択される、節Ｅ４２の細胞。

【0715】

Ｅ４５．マイコプラズマ・ニューモニエ株であり、任意選択で、Ｍ１２９－Ｂ７株（ＡＴＴＣ２９３４２）、エスケリキア・コリＢＬ２１、又はラクトコッカス・ラクチス株ＮＺ９０００－ｐｅｐＮ：：ｎｉｓＲＫに由来する、節Ｅ４４の細胞。

【0716】

Ｅ４６．節Ｅ３９～Ｅ４１のいずれかのポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞。

【0717】

Ｅ４７．節Ｅ１～Ｅ３８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ｅ４２～Ｅ４６のいずれかの細胞、又は節Ｅ３９～Ｅ４１のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクターを含む医薬組成物。

【0718】

Ｅ４８．医療における使用のための、節Ｅ１又～Ｅ３８のいずれかの一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、節Ｅ４２～Ｅ４６のいずれかの細胞、節Ｅ３９～Ｅ４１のいずれかの単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、又は節Ｅ４７の医薬組成物。

【0719】

Ｅ４９．使用が、炎症性疾患及び障害；肺疾患；がん及び増殖性疾患及び病態；感染症；アレルギー、免疫及び自己免疫疾患及び障害；組織の傷害、変性及び損傷状態；並びにそれらに関連する病態から選択される疾患又は障害の治療のための方法におけるものである、節Ｅ４８による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0720】

Ｅ５０．がん又は増殖性疾患若しくは障害が、例えば、肺がん（特に、肺腺がん又は肺扁平上皮がん）、膀胱がん、子宮頸がん、乳がん、結腸がん、脳膠芽腫、膵臓がん、急性単球性白血病、腎臓がん、大腸がん、皮膚がん（例えばメラノーマ）、胃がん、甲状腺がん、骨がん及び肝がんからなる群より選択される固形腫瘍である、節Ｅ４９による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0721】

Ｅ５１．炎症性疾患又は障害が、アレルギー、ぜんそく、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再灌流傷害、移植拒絶反応、糖尿病、アルツハイマー、変形性関節症、線維筋痛症、筋性腰痛、関節炎、筋性頸部痛、心筋炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、線維症からなる群より選択される、節Ｅ４９による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0722】

Ｅ５２．組織の傷害、変性又は損傷状態が、大腸炎、創傷治癒、発毛、肝臓再生及びマトリックス合成からなる群より選択される、節Ｅ５１による使用のための、一本鎖二量体サイトカインポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド若しくはベクター、細胞又は医薬組成物。

【0723】

特定の実施形態を本明細書において図示及び説明してきたが、特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正を行うことができることが理解されるべきである。さらに、特許請求された主題の様々な態様を本明細書に記載されているが、そのような態様は組み合わせて利用する必要はない。したがって、添付の特許請求の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる、特許請求される主題の範囲内にある、そのような変更及び修正をすべてカバーすることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【配列表】

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【国際調査報告】