特表 2025-504002 細胞組成物を製造する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-06

(54)【発明の名称】細胞組成物を製造する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20250130BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250130BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250130BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20250130BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20250130BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20250130BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250130BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20250130BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20250130BHJP

   C12N 15/19 20060101ALN20250130BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20250130BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250130BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20250130BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20250130BHJP

   C07K 14/55 20060101ALN20250130BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20250130BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20250130BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

A61K35/17

A61P35/00

A61P37/06

A61P31/00

A61P37/04

A61K39/395 N

C12N7/01

C12N15/12

C12N15/19

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/867 Z

C12N5/0783

C07K14/55

C07K14/54

C07K16/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024544751

(86)(22)【出願日】2023-01-27

(85)【翻訳文提出日】2024-09-19

(86)【国際出願番号】 US2023061510

(87)【国際公開番号】W WO2023147515

(87)【国際公開日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】63/304,502

(32)【優先日】2022-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/438,764

(32)【優先日】2023-01-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516316897

【氏名又は名称】ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】チャン，カルビン

(72)【発明者】

【氏名】リム，チン－ウェイ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AA97X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BB19

4B065BD15

4B065BD39

4B065CA24

4B065CA44

4C085AA14

4C085CC03

4C085DD62

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB65

4C087NA20

4C087ZB08

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB31

4H045AA30

4H045BA60

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA04

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの組換え受容体を発現する細胞を含むＴ細胞治療薬の生産のためのものを含む、細胞組成物を製造するための連続向流遠心分離方法が、提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子操作されたＴ細胞の組成物を生産するための方法であって、
（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産すること；
（ｂ）ウイルスベクター粒子を前記円錐形の流体エンクロージャーに投入することによって、前記細胞組成物と前記ウイルスベクター粒子とを含むインプット組成物を生成すること；ならびに
（ｃ）第２の遠心力および第２の流量を前記インプット組成物に適用し、前記第２の遠心力および第２の流量が前記遠心分離機システムの流路で前記ウイルスベクター粒子を再循環させ、それによって、遺伝子操作されたＴ細胞を生成すること
を含む、方法。

【請求項2】

前記ウイルスベクター粒子の前記投入が、（ａ）における前記適用の少なくとも一部分の間に実行される、および／または（ｃ）における前記適用の少なくとも一部分の間に実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

遺伝子操作されたＴ細胞の組成物を生産するための方法であって、
（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、（ｉ）ウイルスベクター粒子と（ｉｉ）Ｔ細胞を含む細胞組成物とを含むインプット組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産すること；ならびに
（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を前記インプット組成物に前記円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用し、前記第２の遠心力および第２の流量が前記遠心分離機システムの流路で前記ウイルスベクター粒子を再循環させ、それによって、遺伝子操作されたＴ細胞を生成すること
を含む、方法。

【請求項4】

前記細胞組成物および前記ウイルスベクター粒子を前記円錐形の流体エンクロージャーに投入することによって前記インプット組成物を生成することをさらに含み、前記細胞組成物の投入が、前記ウイルスベクター粒子の投入前、投入中、および／または投入後である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記細胞組成物の投入および／または前記ウイルスベクター粒子の投入が、（ａ）における前記適用の前および／または間に実施される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記遠心分離機システムが、連続向流遠心分離機システムである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

第３の遠心力および第３の流量を、前記遺伝子操作されたＴ細胞に、前記遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、前記遺伝子操作されたＴ細胞を含むアウトプット組成物を生産することをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、前記インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きく、適宜、少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、または少なくとも約２５％大きい、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記アウトプット組成物中のＴ細胞の少なくとももしくは少なくとも約５％、少なくとももしくは少なくとも約１０％、少なくとももしくは少なくとも約１５％、少なくとももしくは少なくとも約２０％、少なくとももしくは少なくとも約２５％、または少なくとももしくは少なくとも約３０％が、前記ウイルスベクター粒子で形質導入されている、請求項７または請求項８に記載の方法。

【請求項10】

（ｉ）前記第１の遠心力が、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第１の流量が、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間であり、適宜、前記第１の遠心力および前記第１の流量が、前記細胞組成物または前記インプット組成物に、約１５秒間、約３０秒間、約４５秒間、または約６０秒間適用される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

（ｉ）前記第２の遠心力が、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第２の流量が、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

（Ｇでの）前記第１の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第１の流量に対する比率が、約２００から約４００の間である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

（Ｇでの）前記第１の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第１の流量に対する比率が、約３００である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記第１の遠心力が、約３，０００Ｇであり、前記第１の流量が、約１０ｍＬ／分である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約２０から約１００の間、約２５から約８５の間、または約３０から約６５の間である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約３５である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記第２の遠心力が、約１，０００Ｇであり、前記第２の流量が、約２８．５ｍＬ／分である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

（ｉ）前記第２の遠心力が、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第２の流量が、約１０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である、請求項１から１０および１２から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約６２．５である、請求項１から１５および１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記第２の遠心力が、約６２５Ｇであり、前記第２の流量が、約１０ｍＬ／分である、請求項１から１０、１２から１５、１８、および１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

（ｉ）前記第２の遠心力が、約１００Ｇから約２，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第２の流量が、約１０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である、請求項１から１０、１２から１６、および１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約３０である、請求項１から１５、１８、および２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記第２の遠心力が、約３００Ｇであり、前記第２の流量が、約１０ｍＬ／分である、請求項１から１０、１２から１５、２１、および２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記第２の遠心力および前記第２の流量が、前記インプット組成物に、少なくとも約１５分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約６０分間、少なくとも約７５分間、または少なくとも約９０分間適用される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

（ｉ）前記第３の遠心力が、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第３の流量が、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間である、請求項７から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

（Ｇでの）前記第３の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第３の流量に対する比率が、約１００から約１５０の間であり、適宜、（Ｇでの）前記第３の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第３の流量に対する比率が、約１２５である、請求項７から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記第３の遠心力が、約２，５００Ｇであり、前記第３の流量が、約２０ｍＬ／分である、請求項７から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記第３の遠心力および前記第３の流量を適用する前に、前記遺伝子操作されたＴ細胞を１つまたは複数の洗浄工程に付すことを含み、適宜、前記１つまたは複数の洗浄工程が、培地交換を含む、請求項７から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記方法が、前記細胞組成物の前記Ｔ細胞を（ａ）における前記適用の前に刺激条件下でインキュベートすることを含む、および／または前記細胞組成物の前記Ｔ細胞が、（ａ）における前記適用の前に刺激条件下でインキュベートされる、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記刺激条件が、ＴＣＲ複合体の１つまたは複数の構成要素の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化可能である刺激試薬の存在を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記刺激試薬が、（ｉ）ＴＣＲ複合体のメンバーに特異的に結合する、適宜、ＣＤ３に特異的に結合する、一次薬剤；および（ｉｉ）Ｔ細胞共刺激分子に特異的に結合する二次薬剤を含み、適宜、前記共刺激分子が、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０、およびＩＣＯＳから選択される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記一次および二次薬剤の少なくとも一方が、抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記一次薬剤が、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、前記二次薬剤が、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片である、請求項３１または請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記一次薬剤および前記二次薬剤が、各々、固体支持体の表面に存在し、適宜、前記一次薬剤および前記二次薬剤が、各々、ビーズ、さらに適宜、常磁性ビーズの表面に存在する、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記一次薬剤および前記二次薬剤が、複数のストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン突然変異タンパク質分子を含むオリゴマー粒子試薬の表面に可逆的に結合している、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ストレプトアビジン分子または前記ストレプトアビジン突然変異タンパク質分子が、ビオチンもしくはビオチンアナログに結合するか、またはそれに結合可能である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記一次薬剤が、抗ＣＤ３ Ｆａｂを含み、前記二次薬剤が、抗ＣＤ２８ Ｆａｂを含む、請求項３１から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記刺激条件が、１つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記刺激条件が、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５のうちの１つまたは複数の存在を含む、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記方法が、前記アウトプット組成物を収集することを含む、および／または前記アウトプット組成物が、収集される、請求項７から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記方法が、収集されたアウトプット組成物の前記遺伝子操作されたＴ細胞をインキュベートすることを含む、および／または収集されたアウトプット組成物の前記遺伝子操作されたＴ細胞が、インキュベートされる、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記収集されたアウトプット組成物の前記遺伝子操作されたＴ細胞が、前記収集の直後に少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、または少なくとも約２０日間インキュベートされる、請求項４０または請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

収集の約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、または約１０日後の前記収集されたアウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、前記インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

収集の約１日後の前記収集されたアウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、前記インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

収集の約５日後の前記収集されたアウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、前記インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記方法が、前記収集されたアウトプット組成物を凍結保存することを含む、および／または前記収集されたアウトプット組成物が、凍結保存されることによって、凍結保存組成物が生成される、請求項４０から４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記凍結保存組成物が解凍されて解凍組成物が生産され、前記解凍組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、前記インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きく、適宜、少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、少なくとも約２５％大きいか、または少なくとも約３０％大きい、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記インプット組成物が、６マイクロメートルより大きいもしくは約６マイクロメートルより大きい、６マイクロメートルより大きいもしくは約６マイクロメートルより大きい、７マイクロメートルより大きいもしくは約７マイクロメートルより大きい、８マイクロメートルより大きいもしくは約８マイクロメートルより大きい、９マイクロメートルより大きいもしくは約９マイクロメートルより大きい、１０マイクロメートルより大きいもしくは約１０マイクロメートルより大きい、または１１マイクロメートルより大きいもしくは約１１マイクロメートルより大きい平均直径を有するＴ細胞を含む、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記インプット組成物が、総数約１×１０^６のＴ細胞から総数約２×１０^９のＴ細胞の間のＴ細胞を含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記インプット組成物が、総数少なくとも約１×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約２×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約３×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約４×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約５×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約６×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約７×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約８×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約７×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約８×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約９×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約１×１０^９のＴ細胞、総数少なくとも約１．２５×１０^９のＴ細胞、総数少なくとも約１．５０×１０^９のＴ細胞、または総数少なくとも約１．７５×１０^９のＴ細胞を含む、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記インプット組成物の体積が、約５ｍｌから約２０，０００ｍｌの間、約１０ｍＬから約２，０００ｍＬの間、約１５ｍＬから約１，０００ｍＬの間、約２０ｍＬから約５００ｍＬの間、約２５ｍＬから約１００ｍＬの間、または約３０ｍＬから約６０ｍＬの間である、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記インプット組成物の前記体積が、約３０ｍＬから約６０ｍＬの間である、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記アウトプット組成物の体積が、約２．５ｍＬから約６０ｍＬの間、約５ｍＬから約４０ｍＬの間、または約１０ｍＬから約２０ｍＬの間である、請求項７から５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記アウトプット組成物の前記体積が、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬ、約４０ｍＬ、約４５ｍＬ、約５０ｍＬ、約５５ｍＬ、または約６０ｍＬである、請求項７から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

細胞組成物を生細胞について濃縮するための方法であって、
（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、前記細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含む、生産すること；ならびに
（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を前記細胞組成物に適用し、前記第２の遠心力および第２の流量が前記遠心分離機システムの流路で前記細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、前記細胞組成物中の生存不能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存不能なＴ細胞のパーセンテージを有する前記細胞組成物の廃棄物画分を水簸して前記円錐形の流体エンクロージャーから出し、前記円錐形の流体エンクロージャー内で前記細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生産すること
を含む、方法。

【請求項56】

（ｉ）前記第１の遠心力が、約１，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第１の流量が、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

（Ｇでの）前記第１の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第１の流量に対する比率が、約２００から約５００の間である、請求項５５または請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

（Ｇでの）前記第１の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第１の流量に対する比率が、約２００から約４００の間である、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記第１の遠心力および前記第１の流量が、前記細胞組成物に少なくとも３０秒間、適用される、請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

（ｉ）前記第２の遠心力が、約３５０Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第２の流量が、約５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である、請求項５５から５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記第２の遠心力が、約３５０Ｇから３，０００Ｇの間である、請求項５５から６０のいずれかに記載の方法。

【請求項62】

前記第２の遠心力が、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間である、請求項５５から６１のいずれかに記載の方法。

【請求項63】

前記第２の遠心力が、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間である、請求項５５から６１のいずれかに記載の方法。

【請求項64】

前記第２の流量が、約６５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である、請求項５５から６３のいずれかに記載の方法。

【請求項65】

前記第２の流量が、約１０ｍＬ／分から約６５ｍＬ／分の間である、請求項５５から６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記第２の流量が、約１０ｍＬ／分から約３５ｍＬ／分の間である、請求項５５から６３および６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記第２の流量が、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である、請求項５５から６３、６５、および６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約３０から約７０の間である、請求項５５から６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約３０から約４０の間である、請求項５５から６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記Ｔ細胞が、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有する、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記Ｔ細胞が、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有し、（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約３０から約７０の間である、請求項５５から６８および７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記Ｔ細胞が、約９μｍ未満の平均直径を有する、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記Ｔ細胞が、９μｍ未満の平均直径を有し、（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約３０から約４０の間である、請求項５５から６９および７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

細胞組成物を生細胞について濃縮する方法であって、
（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、前記細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含み、（ｉ）前記第１の遠心力が、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第１の流量が、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である、生産すること；ならびに
（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を前記細胞組成物に適用し、前記第２の遠心力および第２の流量が前記遠心分離機システムの流路で前記細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、前記細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成することであって、（ｉ）前記第２の遠心力が、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第２の流量が、約６５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間であり、（ｉｉｉ）（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約３０から約４０の間である、生成すること
を含み、
前記Ｔ細胞が、９μｍ未満の平均直径を有する、方法。

【請求項75】

前記Ｔ細胞が、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する、請求項１から６９および７２から７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

水簸された廃棄物画分を収集することを含む、請求項５５から７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記水簸された廃棄物画分が、前記円錐形の流体エンクロージャーの広端と流体連通している容器に収集される、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

細胞組成物を生細胞について濃縮するための方法であって、
（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、前記細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含む、生産すること；
（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を前記細胞組成物に適用し、前記第２の遠心力および第２の流量が前記遠心分離機システムの流路で前記細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、前記細胞組成物中の生存不能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存不能なＴ細胞のパーセンテージを有する前記細胞組成物の廃棄物画分を水簸して前記円錐形の流体エンクロージャーから出し、前記円錐形の流体エンクロージャー内で前記細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成すること；ならびに
（ｃ）前記濃縮組成物の細胞を工程（ａ）および（ｂ）の後に凍結保存して、凍結保存細胞組成物を作出すること
を含む、方法。

【請求項79】

（ｄ）前記凍結保存細胞組成物を工程（ｃ）の後に解凍することをさらに含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記第２の流量が、３０ｍＬ／分またはそれ未満である、請求項７８または請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記第２の流量が、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である、請求項７８から８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

細胞組成物を生細胞について濃縮する方法であって、
（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、前記細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含み、（ｉ）前記第１の遠心力が、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第１の流量が、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である、生産すること；ならびに
（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を前記細胞組成物に適用し、前記第２の遠心力および第２の流量が前記遠心分離機システムの流路で前記細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、前記細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成することであって、（ｉ）前記第２の遠心力が、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第２の流量が、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である、生成すること
を含む、方法。

【請求項83】

前記Ｔ細胞が、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有する、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記濃縮組成物の細胞を、工程（ａ）および（ｂ）の適用後に凍結保存して、凍結保存細胞組成物を作出することを含む、請求項８２または請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記凍結保存することが、凍結保護剤を含む培地に前記細胞を懸濁させること、および前記細胞を凍結することを含み、適宜、前記凍結することが、速度制御フリーザーにおいてである、請求項７８から８１および８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記凍結保存細胞組成物を解凍することをさらに含み、適宜、前記解凍することが、凍結保存細胞組成物が少なくとも３日間凍結された後に行われる、請求項７８から８１、８４、および８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記第２の遠心力が、約７００Ｇから約１，３００Ｇの間である、請求項７８から８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記第２の遠心力が、約８００Ｇから約１，２００Ｇの間である、請求項７８から８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記第２の遠心力が、約９００Ｇから約１，１００Ｇの間である、請求項７８から８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

第２の遠心力が、約１，０００Ｇである、請求項７８から８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

（Ｇでの）前記第２の遠心力の（ｍＬ／分での）前記第２の流量に対する比率が、約３０から約４０の間である、請求項７８から９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記細胞組成物を前記遠心分離機システムに投入することを含み、前記投入することが、（ａ）における前記適用の少なくとも一部分の前および／または間に行われる、請求項５５から９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記遠心分離機システムが、連続向流遠心分離機システムである、請求項５５から９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

（ａ）における前記適用の前に、前記方法が、前記細胞組成物の前記Ｔ細胞をウイルスベクター粒子と接触させることによって、遺伝子操作されたＴ細胞を生産することを含む、および／または前記細胞組成物の前記Ｔ細胞が、ウイルスベクター粒子と接触したことによって、遺伝子操作されたＴ細胞が生産済みである、請求項５５から９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、前記細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、少なくとも約３０％大きいか、少なくとも約４０％大きいか、少なくとも約５０％大きいか、または少なくとも約６０％大きい、請求項５５から９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

（ｃ）第３の遠心力および第３の流量を前記濃縮組成物に前記遠心分離機システムの前記円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、前記濃縮組成物を収集することを含み、（ｉ）前記第３の遠心力が、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）前記第３の流量が、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間である、請求項５５から９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記第３の遠心力および前記第３の流量を適用する前に、前記濃縮組成物を１つまたは複数の洗浄工程に付すことを含み、適宜、前記１つまたは複数の洗浄工程が、培地交換を含む、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記１つまたは複数の洗浄工程が、前記第２の遠心力および前記第２の流量で実行される、請求項２８から５４および９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記細胞組成物が、活性化Ｔ細胞を含む、請求項１から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記方法が、収集された濃縮組成物を凍結保存することを含む、および／または収集された濃縮組成物が、凍結保存されることによって、凍結保存濃縮組成物が生成される、請求項５５から９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記凍結保存濃縮組成物が解凍されて解凍された濃縮組成物が生産され、前記解凍された濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、前記細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きく、適宜、少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、少なくとも約２５％大きいか、または少なくとも約３０％大きい、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記方法の１つまたは複数の工程が自動化され、適宜、前記方法の１つまたは複数の工程が、遠心分離機システムまたはそのコンポーネントによって自動化される、請求項１から１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記ウイルスベクター粒子が、組換え分子をコードする異種核酸を含む、請求項１から５４および９４から１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記組換え分子が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、抗原受容体、またはそれらの組合せである、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

前記組換え分子が、抗原受容体である、請求項１０３または請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記抗原受容体が、トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記抗原受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１０５に記載の方法。

【請求項108】

前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインと、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記ＣＡＲが、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１０８または請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通部分を含む、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１０８から１１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項113】

前記Ｔ細胞共刺激分子が、ＣＤ２８および４－１ＢＢからなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記ウイルスベクター粒子が、レトロウイルスベクター粒子である、請求項１から５４および９４から１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記レトロウイルスベクター粒子が、γ－レトロウイルスベクターである、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記レトロウイルスベクター粒子が、レンチウイルスベクター粒子である、請求項１１４に記載のベクター。

【請求項117】

前記抗原受容体が、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する、請求項１０５から１１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記疾患または状態が、がん、自己免疫疾患もしくは障害、および／または感染症である、請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記疾患または状態が、がんである、請求項１１７または請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記Ｔ細胞が、適宜ヒト対象からの、初代Ｔ細胞である、請求項１から１１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

請求項１から１２０のいずれか一項に記載の方法によって生産される遺伝子操作されたＴ細胞を含む、組成物。

【請求項122】

約１．０×１０^６個のＣＡＲ発現Ｔ細胞から約２．０×１０^９個のＣＡＲ発現Ｔ細胞の間のＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む、請求項１２１に記載の組成物。

【請求項123】

薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１２１または請求項１２２に記載の組成物。

【請求項124】

凍結保護剤をさらに含む、請求項１２１または請求項１２２に記載の組成物。

【請求項125】

疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、請求項１２１から１２３のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項126】

前記遺伝子操作されたＴ細胞が、前記疾患または障害に関連する抗原に特異的に結合する抗原受容体を発現する、請求項１２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれの内容が、全ての目的のために参照により全体が組み込まれる、２０２２年１月２８日に出願した米国仮出願第６３／３０４，５０２号および２０２３年１月１２日に出願した米国仮出願第６３／４３８，７６４号の優先権を主張するものである。

【0002】

配列表の参照による組込み
本出願は、電子的フォーマットの配列表と共に提出される。配列表は、２０２３年１月２３日に作成された、７３５０４２０２１０４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｘｍｌと題されたファイルとして提供され、そのサイズは３５，１０２バイトである。配列表の電子的フォーマットの情報は、参照により全体が組み込まれている。

【0003】

本開示は、一部の態様では、操作された細胞組成物を含む細胞組成物の処理および製造における連続向流遠心分離方法に関する。一部の態様では、連続向流遠心分離方法は、細胞組成物を生細胞、例えば、生存可能なＴ細胞について濃縮する。得られる細胞組成物、例えば、抗原受容体を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞を含むものも、提供される。一部の態様では、細胞組成物、例えば、リンパ球の集団を含む組成物の形質導入は、連続向流遠心分離によって実行される。一部の態様では、本開示は、細胞集団の形質導入のための方法であって、リンパ球およびウイルスベクター粒子の連続向流遠心分離を含み、それによって、形質導入細胞を含有する組成物を生産する、方法を提供する。一部の実施形態では、提供される細胞および組成物は、養子細胞療法の方法において使用され得る。

【背景技術】

【0004】

インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのＴ細胞集団の濃縮および／または形質導入には、例えば、養子細胞免疫療法またはがん療法において使用するためのインビトロでの抗原特異的Ｔ細胞の濃縮および形質導入には、種々の戦略が利用可能である。大規模研究、診断、および治療を目的としたものを含む、インビトロでの細胞集団の濃縮および／または形質導入のための改善された戦略が、必要とされている。このような必要性に対処する方法および関連組成物が、提供される。

【発明の概要】

【0005】

遺伝子操作されたＴ細胞の組成物を生産するための方法であって、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産すること；（ｂ）ウイルスベクター粒子を円錐形の流体エンクロージャーに投入することによって、細胞組成物とウイルスベクター粒子とを含むインプット組成物を生成すること；ならびに（ｃ）第２の遠心力および第２の流量をインプット組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路でウイルスベクター粒子を再循環させ、それによって、遺伝子操作されたＴ細胞を生成することを含む、方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、遠心分離機システムは、連続向流遠心分離機システムである。

【0006】

一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の投入は、（ａ）における適用の少なくとも一部分の間に実行される。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の投入は、（ｃ）における適用の少なくとも一部分の間に実行される。

【0007】

遺伝子操作されたＴ細胞の組成物を生産するための方法であって、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、（ｉ）ウイルスベクター粒子と（ｉｉ）Ｔ細胞を含む細胞組成物とを含むインプット組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産すること；ならびに（ｂ）第２の遠心力および第２の流量をインプット組成物に円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路でウイルスベクター粒子を再循環させ、それによって、遺伝子操作されたＴ細胞を生成することを含む、方法も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、遠心分離機システムは、連続向流遠心分離機システムである。

【0008】

一部の実施形態では、方法は、細胞組成物およびウイルスベクター粒子を円錐形の流体エンクロージャーに投入することによってインプット組成物を生成することを含む。一部の実施形態では、細胞組成物の投入は、ウイルスベクター粒子の投入前、投入中、および／または投入後である。一部の実施形態では、細胞組成物の投入は、ウイルスベクター粒子の投入前である。一部の実施形態では、細胞組成物の投入は、ウイルスベクター粒子の投入中である。一部の実施形態では、細胞組成物の投入は、ウイルスベクター粒子を投入後である。一部の実施形態では、細胞組成物の投入および／またはウイルスベクター粒子の投入は、（ａ）における適用の前および／または間に実施される。一部の実施形態では、細胞組成物の投入は、（ａ）における適用の前および／または間に実施される。一部の実施形態では、細胞組成物の投入は、（ａ）における適用の前に実施される。一部の実施形態では、細胞組成物の投入は、（ａ）における適用の間に実施される。一部の実施形態では、細胞組成物の投入は、（ａ）における適用の前および間に実施される。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の投入は、（ａ）における適用の前に実施される。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の投入は、（ａ）における適用の間に実施される。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の投入は、（ａ）における適用の前および間に実施される。

【0009】

一部の実施形態では、方法は、第３の遠心力および第３の流量を、遺伝子操作されたＴ細胞に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、遺伝子操作されたＴ細胞を含むアウトプット組成物を生産することを含む。

【0010】

一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、または少なくとも約２５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約１０％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約１５％大きい。

【0011】

一部の実施形態では、アウトプット組成物中のＴ細胞の少なくともまたは少なくとも約５％、少なくともまたは少なくとも約１０％、少なくともまたは少なくとも約１５％、少なくともまたは少なくとも約２０％、少なくともまたは少なくとも約２５％、少なくともまたは少なくとも約３０％は、ウイルスベクター粒子で形質導入されている。一部の実施形態では、アウトプット組成物中のＴ細胞の少なくとも約２０％は、ウイルスベクター粒子で形質導入されている。一部の実施形態では、アウトプット組成物中のＴ細胞の少なくとも約２５％は、ウイルスベクター粒子で形質導入されている。一部の実施形態では、アウトプット組成物中のＴ細胞の少なくとも約３０％は、ウイルスベクター粒子で形質導入されている。一部の実施形態では、アウトプット組成物中のＴ細胞の少なくとも約３５％は、ウイルスベクター粒子で形質導入されている。一部の実施形態では、アウトプット組成物中のＴ細胞の少なくとも約４０％は、ウイルスベクター粒子で形質導入されている。

【0012】

一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第１の流量は、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物またはインプット組成物に約１５秒間、約３０秒間、約４５秒間、または約６０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物またはインプット組成物に約３０秒間適用される。

【0013】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に、少なくとも約１５分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約６０分間、少なくとも約７５分間、または少なくとも約９０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約３０分間適用される。

【0014】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に、少なくとも約１５分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約６０分間、少なくとも約７５分間、または少なくとも約９０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約３０分間適用される。

【0015】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１００Ｇから約２，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に、少なくとも約１５分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約６０分間、少なくとも約７５分間、または少なくとも約９０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約３０分間適用される。

【0016】

一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００から約４００の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約３００である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約３，０００Ｇであり、第１の流量は、約１０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２０から約１００の間、約２５から約８５の間、または約３０から約６５の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３５である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，０００Ｇであり、第２の流量は、約２８．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約６２．５である。

【0017】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約６２５Ｇであり、第２の流量は、約１０ｍＬ／分である。

【0018】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３００Ｇであり、第２の流量は、約１０ｍＬ／分である。

【0019】

一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１００から約１５０の間である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１２５である。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，５００Ｇであり、第３の流量は、約２０ｍＬ／分である。

【0020】

一部の実施形態では、第３の遠心力および第３の流量を適用する前に、方法は、遺伝子操作されたＴ細胞を１つまたは複数の洗浄工程に付すことを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、培地交換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、第２の遠心力および第２の流量で実行される。

【0021】

一部の実施形態では、方法は、細胞組成物のＴ細胞を（ａ）における適用の前に刺激条件下でインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、細胞組成物のＴ細胞は、（ａ）における適用の前に刺激条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞組成物は、活性化細胞を含む。一部の実施形態では、刺激条件は、ＴＣＲ複合体の１つまたは複数の構成要素の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化可能である刺激試薬の存在を含む。一部の実施形態では、刺激試薬は、（ｉ）ＴＣＲ複合体のメンバーに特異的に結合する、適宜、ＣＤ３に特異的に結合する、一次薬剤；および（ｉｉ）Ｔ細胞共刺激分子に特異的に結合する二次薬剤を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、ＣＤ３に特異的に結合する。一部の実施形態では、二次薬剤は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０、およびＩＣＯＳから選択される共刺激分子に特異的に結合する。一部の実施形態では、二次薬剤は、ＣＤ２８に特異的に結合する。

【0022】

一部の実施形態では、一次および二次薬剤の少なくとも一方は、抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、一次薬剤および二次薬剤は、各々、抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、二次薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、一次薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、二次薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、一次薬剤および二次薬剤は、各々、固体支持体の表面に存在するか、または付着している。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、表面に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体が付着している常磁性ビーズである。一部の実施形態では、一次薬剤および二次薬剤は、複数のストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン突然変異タンパク質分子を含むオリゴマー粒子試薬の表面に可逆的に結合している。一部の実施形態では、ストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン突然変異タンパク質分子は、ビオチン、アビジン、ビオチンアナログもしくはビオチン突然変異タンパク質、アビジンアナログもしくはアビジン突然変異タンパク質および／またはその生物活性断片に結合するか、またはそれに結合可能である。一部の実施形態では、一次薬剤は、抗ＣＤ３ Ｆａｂを含み、二次薬剤は、抗ＣＤ２８ Ｆａｂを含む。

【0023】

一部の実施形態では、刺激条件は、１つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む。一部の実施形態では、刺激条件は、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５のうちの１つまたは複数の存在を含む。

【0024】

一部の実施形態では、方法は、アウトプット組成物を収集することを含む。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、収集される。

【0025】

一部の実施形態では、方法は、収集されたアウトプット組成物の遺伝子操作されたＴ細胞をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、収集されたアウトプット組成物の遺伝子操作されたＴ細胞は、インキュベートされる。一部の実施形態では、収集されたアウトプット組成物の遺伝子操作されたＴ細胞は、収集の直後に少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、または少なくとも約２０日間インキュベートされる。

【0026】

一部の実施形態では、収集の約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、または約１０日後の、収集されたアウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい。一部の実施形態では、収集の約１日後の、収集されたアウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい。一部の実施形態では、収集の約５日後の、収集されたアウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい。

【0027】

一部の実施形態では、方法は、収集されたアウトプット組成物を凍結保存することを含む、および／または収集されたアウトプット組成物が凍結保存されることによって凍結保存組成物が生成される。一部の実施形態では、方法は、収集されたアウトプット組成物を凍結保存することによって凍結保存組成物を生成することを含む。一部の実施形態では、収集されたアウトプット組成物が凍結保存されることによって凍結保存組成物が生成される。一部の実施形態では、凍結保存組成物が解凍されて解凍組成物が生産され、解凍組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい。一部の実施形態では、解凍組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、少なくとも２５％大きいか、または少なくとも約３０％大きい。

【0028】

一部の実施形態では、インプット組成物は、６マイクロメートルより大きいもしくは約６マイクロメートルより大きい、６マイクロメートルより大きいもしくは約６マイクロメートルより大きい、７マイクロメートルより大きいもしくは約７マイクロメートルより大きい、８マイクロメートルより大きいもしくは約８マイクロメートルより大きい、９マイクロメートルより大きいもしくは約９マイクロメートルより大きい、１０マイクロメートルより大きいもしくは約１０マイクロメートルより大きい、または１１マイクロメートルより大きいもしくは約１１マイクロメートルより大きい平均直径を有するＴ細胞を含む。

【0029】

一部の実施形態では、インプット組成物は、総数約１×１０^６のＴ細胞から総数約２×１０^９のＴ細胞の間のＴ細胞を含む。一部の実施形態では、インプット組成物は、総数少なくとも約１×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約２×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約３×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約４×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約５×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約６×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも７×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約８×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約７×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約８×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約９×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約１×１０^９のＴ細胞、総数少なくとも約１．２５×１０^９のＴ細胞、総数少なくとも約１．５０×１０^９のＴ細胞、または総数少なくとも約１．７５×１０^９のＴ細胞を含む。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約５ｍｌから約２０，０００ｍｌの間、約１０ｍＬから約２，０００ｍＬの間、約１５ｍＬから約１，０００ｍＬの間、約２０ｍＬから約５００ｍＬの間、約２５ｍＬから約１００ｍＬの間、または約３０ｍＬから約６０ｍＬの間である。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約３０ｍＬから約６０ｍＬの間である。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約３０ｍＬである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約６０ｍＬである。

【0030】

一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約２．５ｍＬから約６０ｍＬの間、約５ｍＬから約４０ｍＬの間、または約１０ｍＬから約２０ｍＬの間である。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬ、約４０ｍＬ、約４５ｍＬ、約５０ｍＬ、約５５ｍＬ、または約６０ｍＬである。

【0031】

一部の実施形態では、方法の１つまたは複数の工程は、自動化される。一部の実施形態では、方法の１つまたは複数の工程は、遠心分離機システムまたはそのコンポーネントによって自動化される。

【0032】

一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、組換え分子をコードする異種核酸を含む。一部の実施形態では、組換え分子は、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、抗原受容体（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲ）、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、組換え分子は、抗体受容体である。一部の実施形態では、抗原受容体は、トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。一部の実施形態では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。

【0033】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインと、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８および４－１ＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、組換え発現される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ベクターから発現される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、γ－レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターからの発現である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、レンチウイルスベクターから発現される。

【0034】

一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスベクター粒子である。一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、γ－レトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子である。

【0035】

一部の実施形態では、抗原受容体は、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、自己免疫疾患もしくは障害、および／または感染症である。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、適宜ヒト対象からの、初代Ｔ細胞である。

【0036】

細胞組成物を生細胞について濃縮するための方法であって、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含む、生産すること；ならびに（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を細胞組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路で細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、細胞組成物中の生存不能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存不能なＴ細胞のパーセンテージを有する細胞組成物の廃棄物画分を水簸して円錐形の流体エンクロージャーから出し、円錐形の流体エンクロージャー内で細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生産することを含む、方法も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、遠心分離機システムは、連続向流遠心分離機システムである。

【0037】

一部の実施形態では、（ｉ）第１の遠心力は、約１，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第１の流量は、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である。

【0038】

一部の実施形態では、（Ｇでの）第１の遠心力の（ｍＬ／分での）第１の流量に対する比率は、約２００から約５００の間である。一部の実施形態では、（Ｇでの）第１の遠心力の（ｍＬ／分での）第１の流量に対する比率は、約２００から約４００の間である。

【0039】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約３０秒間適用される。

【0040】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３５０Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。

【0041】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３５０Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間である。

【0042】

一部の実施形態では、第２の流量は、約６５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。

【0043】

一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約６５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約３５ｍＬ／分の間である。

【0044】

一部の実施形態では、第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。

【0045】

一部の実施形態では、（Ｇでの）第２の遠心力の（ｍＬ／分での）第２の流量に対する比率は、約３０から約７０の間である。一部の実施形態では、（Ｇでの）第２の遠心力の（ｍＬ／分での）第２の流量に対する比率は、約３０から約４０の間である。

【0046】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、９μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する。

【0047】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有し、（Ｇでの）第２の遠心力の（ｍＬ／分での）第２の流量に対する比率は、約３０から約７０の間である。

【0048】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１０μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１２μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１４μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。

【0049】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ未満の平均直径を有し、（Ｇでの）第２の遠心力の（ｍＬ／分での）第２の流量に対する比率は、約３０から約４０の間である。

【0050】

細胞組成物を生細胞について濃縮する方法であって、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含み、（ｉ）第１の遠心力が、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第１の流量が、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である、生産すること；ならびに（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を細胞組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路で細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成することであって、（ｉ）第２の遠心力が、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量が、約６５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間であり、（ｉｉｉ）（Ｇでの）第２の遠心力の（ｍＬ／分での）第２の流量に対する比率が、約３０から約４０の間である、生成することを含み、Ｔ細胞が、９μｍ未満の平均直径を有する、方法も、本明細書で提供される。

【0051】

一部の実施形態では、方法は、水簸された廃棄物画分を収集することを含む。一部の実施形態では、水簸された廃棄物画分は、円錐形の流体エンクロージャーの広端と流体連通している容器に収集される。

【0052】

細胞組成物を生細胞について濃縮するための方法であって、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含む、生産すること；ならびに（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を細胞組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路で細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、細胞組成物中の生存不能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存不能なＴ細胞のパーセンテージを有する細胞組成物の廃棄物画分を水簸して円錐形の流体エンクロージャーから出し、円錐形の流体エンクロージャー内で細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成することを含み、細胞組成物が、方法の適用の前に凍結保存され解凍されたＴ細胞を含む、方法も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、遠心分離機システムは、連続向流遠心分離機システムである。

【0053】

細胞組成物を生細胞について濃縮するための方法であって、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含む、生産すること；（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を細胞組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路で細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、細胞組成物中の生存不能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存不能なＴ細胞のパーセンテージを有する細胞組成物の廃棄物画分を水簸して円錐形の流体エンクロージャーから出し、円錐形の流体エンクロージャー内で細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成すること；ならびに（ｃ）濃縮組成物の細胞を工程（ａ）および（ｂ）の後に凍結保存して、凍結保存細胞組成物を作出することを含む、方法も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、（ｄ）凍結保存細胞組成物を工程（ｃ）の後に解凍することを含む。一部の実施形態では、遠心分離機システムは、連続向流遠心分離機システムである。

【0054】

細胞組成物を生細胞について濃縮する方法であって、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含む、生産すること；ならびに（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を細胞組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路で細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成することを含む、方法も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、遠心分離機システムは、連続向流遠心分離機システムである。

【0055】

一部の実施形態では、方法は、水簸された廃棄物画分を収集することを含む。一部の実施形態では、水簸された廃棄物画分は、円錐形の流体エンクロージャーの広端と流体連通している容器に収集される。

【0056】

一部の実施形態では、第２の流量は、約３０ｍＬ／分またはそれ未満である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。

【0057】

細胞組成物を生細胞について濃縮する方法であって、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含み、（ｉ）第１の遠心力が、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第１の流量が、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である、生産すること；ならびに（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を細胞組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路で細胞組成物の細胞を再循環させ、それによって、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成することであって、（ｉ）第２の遠心力が、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量が、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である、生成することを含む、方法も、本明細書で提供される。

【0058】

一部の実施形態では、細胞組成物は、方法の適用前に凍結保存され解凍されたＴ細胞を含む。一部の実施形態では、方法は、凍結保存細胞組成物を解凍して、Ｔ細胞を含む細胞組成物を生産することをさらに含む。

【0059】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約７００Ｇから約１，３００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約８００Ｇから約１，２００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約９００Ｇから約１，１００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，０００Ｇである。

【0060】

一部の実施形態では、（Ｇでの）第２の遠心力の（ｍＬ／分での）第２の流量に対する比率は、約３０から約４０の間である。

【0061】

一部の実施形態では、（ｉ）第１の遠心力は、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第１の流量は、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物を遠心分離機システムに投入することを含む。一部の実施形態では、投入することは、（ａ）における適用の少なくとも一部分の前および／または間に実施される。一部の実施形態では、投入することは、（ａ）における適用の前に実施される。一部の実施形態では、投入することは、（ａ）における適用の少なくとも一部分の間に実施される。一部の実施形態では、投入することは、（ａ）における適用の少なくとも一部分の前および間に実施される。

【0062】

一部の実施形態では、（ａ）における適用の前に、方法は、細胞組成物のＴ細胞をウイルス粒子と接触させることによって遺伝子操作されたＴ細胞を生産することを含む。一部の実施形態では、細胞組成物のＴ細胞がウイルスベクター粒子と接触したことによって、遺伝子操作されたＴ細胞が生産済みである。一部の実施形態では、細胞組成物のＴ細胞は、遺伝子操作されたＴ細胞である。

【0063】

一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、少なくとも約３０％大きいか、少なくとも約４０％大きいか、少なくとも５０％大きいか、または少なくとも約６０％大きい。

【0064】

一部の実施形態では、方法は、（ｃ）第３の遠心力および第３の流量を濃縮組成物に遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、濃縮組成物を収集することを含む。一部の実施形態では、（ｉ）第３の遠心力は、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第３の流量は、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第３の遠心力および第３の流量を適用する前に、方法は、濃縮組成物を１つまたは複数の洗浄工程に付すことを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、培地交換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、第２の遠心力および第２の流量で実行される。

【0065】

一部の実施形態では、収集の約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、または約１０日後の、収集された濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい。一部の実施形態では、収集の約１日後の、収集された濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい。一部の実施形態では、収集の約５日後の、収集された濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい。

【0066】

一部の実施形態では、方法は、細胞組成物のＴ細胞を（ａ）における適用の前に刺激条件下でインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、細胞組成物のＴ細胞は、（ａ）における適用の前に刺激条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞組成物は、活性化細胞を含む。一部の実施形態では、刺激条件は、ＴＣＲ複合体の１つまたは複数の構成要素の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化可能である刺激試薬の存在を含む。一部の実施形態では、刺激試薬は、（ｉ）ＴＣＲ複合体のメンバーに特異的に結合する、適宜、ＣＤ３に特異的に結合する、一次薬剤；および（ｉｉ）Ｔ細胞共刺激分子に特異的に結合する二次薬剤を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、ＣＤ３に特異的に結合する。一部の実施形態では、二次薬剤は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０、およびＩＣＯＳから選択される共刺激分子に特異的に結合する。一部の実施形態では、二次薬剤は、ＣＤ２８に特異的に結合する。

【0067】

一部の実施形態では、一次および二次薬剤の少なくとも一方は、抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、一次薬剤および二次薬剤は、各々、抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、二次薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、一次薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、二次薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、一次薬剤および二次薬剤は、各々、固体支持体の表面に存在するか、または付着している。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、表面に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体が付着している常磁性ビーズである。一部の実施形態では、一次薬剤および二次薬剤は、複数のストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン突然変異タンパク質分子を含むオリゴマー粒子試薬の表面に可逆的に結合している。一部の実施形態では、ストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン突然変異タンパク質分子は、ビオチン、アビジン、ビオチンアナログもしくはビオチン突然変異タンパク質、アビジンアナログもしくはアビジン突然変異タンパク質および／またはその生物活性断片に結合するか、またはそれに結合可能である。一部の実施形態では、一次薬剤は、抗ＣＤ３ Ｆａｂを含み、二次薬剤は、抗ＣＤ２８ Ｆａｂを含む。

【0068】

一部の実施形態では、刺激条件は、１つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む。一部の実施形態では、刺激条件は、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５のうちの１つまたは複数の存在を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、活性化Ｔ細胞を含む。

【0069】

一部の実施形態では、方法は、収集された濃縮組成物を凍結保存することによって凍結保存濃縮組成物を生成することを含む。一部の実施形態では、収集された濃縮組成物が凍結保存されることによって凍結保存濃縮組成物が生成される。一部の実施形態では、凍結保存濃縮組成物が解凍されて解凍された濃縮組成物が生産され、解凍された濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい。一部の実施形態では、解凍された濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、少なくとも２５％大きいか、または少なくとも約３０％大きい。

【0070】

一部の実施形態では、方法は、濃縮組成物の細胞を工程（ａ）および（ｂ）の適用後に凍結保存して、凍結保存細胞組成物を作出することを含む。一部の実施形態では、凍結保存は、凍結保護剤を含む培地に細胞を懸濁させること、および細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、凍結することは、速度制御フリーザーにおいてである。

【0071】

一部の実施形態では、方法は、凍結保存細胞組成物を解凍することをさらに含む。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が少なくとも３日間凍結された後に行われる。

【0072】

一部の実施形態では、方法の１つまたは複数の工程は、自動化される。一部の実施形態では、方法の１つまたは複数の工程は、遠心分離機システムまたはそのコンポーネントによって自動化される。

【0073】

一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、組換え分子をコードする異種核酸を含む。一部の実施形態では、組換え分子は、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、抗原受容体（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲ）、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、組換え分子は、抗体受容体である。一部の実施形態では、抗原受容体は、トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。一部の実施形態では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。

【0074】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインと、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８および４－１ＢＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、組換え発現される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ベクターから発現される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、γ－レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターからの発現である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、レンチウイルスベクターから発現される。

【0075】

一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスベクター粒子である。一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、γ－レトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子である。

【0076】

一部の実施形態では、抗原受容体は、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、自己免疫疾患もしくは障害、および／または感染症である。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、適宜ヒト対象からの、初代Ｔ細胞である。

【0077】

本明細書で提供される方法のいずれかによって生産される遺伝子操作されたＴ細胞を含む組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、組成物は、約１．０×１０^６個のＣＡＲ発現Ｔ細胞から約２．０×１０^９個のＣＡＲ発現Ｔ細胞の間のＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、凍結保護剤を含む。

【0078】

疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、本明細書で提供される組成物のいずれかを対象に投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。対象における疾患または障害の処置のための、本明細書で提供される組成物のいずれかの使用が、本明細書で提供される。対象における疾患または障害の処置において使用するための、本明細書で提供される組成物のいずれかが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、疾患または障害に関連する抗原に特異的に結合する抗原受容体を発現するように操作されている。

【図面の簡単な説明】

【0079】

【図1】図１Ａおよび１Ｂは、連続向流遠心分離によってインプット細胞組成物を生細胞について濃縮する３つの異なる実験［ラン１～３］の結果を示す。図１Ａは、インプット組成物、ならびに連続向流遠心分離後の産物および廃棄物画分の、総生細胞数および総死細胞数を示す。図１Ｂは、連続向流遠心分離による濃縮後の生細胞のパーセンテージの増加を示す。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、連続向流遠心分離ベースの方法または規模縮小スピノキュレーション方法のどちらかによって実行した、形質導入産物画分における形質導入効率、ならびにインプット組成物およびウイルスベクターによる形質導入後の多様な産物画分中の生細胞のパーセンテージを、それぞれ示す。対照として、細胞を、規模を縮小した方法によってウイルスベクターと共にインキュベートしたが、いかなる遠心分離にも付さなかった（「無回転」）。

【図3】図３は、連続向流遠心分離ベースの方法または規模縮小スピノキュレーション方法のどちらかによって実行した、インプット組成物およびウイルスベクターによる形質導入後の多様な産物画分中の生細胞のパーセンテージを示す。形質導入の連続向流遠心分離ベースの方法に付したインプット組成物は、３０ｍＬまたは６０ｍＬのどちらかの総体積を有した。

【図4】図４Ａは、濃縮および緩衝液交換の連続向流水簸（ＣＣＥ）ベースの方法（「洗浄」）、またはデッドエンド遠心分離および緩衝液交換の代替方法のどちらかの後の、１１名の異なるヒトドナーから生成されたインプット組成物および洗浄済み産物画分中の生細胞のパーセンテージを示す。 図４Ｂは、ＣＣＥベースの方法または代替方法を使用する洗浄前産物（「回収産物」；ＨＰ）画分、洗浄済み産物（ＷＰ）画分、製剤化薬物製品（ＦＤＰ）画分および凍結保存薬物製品（ＣＤＰ）画分中の生細胞のパーセンテージを示す。 図４Ｃは、洗浄前産物（ＨＰ）画分の生存率に対する、洗浄済み産物（ＷＰ）画分、製剤化薬物製品（ＦＤＰ）画分および凍結保存薬物製品（ＣＤＰ画分）における細胞の生存率を示す。 図４Ｄは、洗浄前産物（ＨＰ）画分、洗浄済み産物（ＷＰ）画分および洗浄済み廃棄物画分における生細胞と生存不能な細胞の総数を示す。 図４Ｅは、多様な遠心力での解凍された凍結保存薬物製品（ＣＤＰ）画分の洗浄前産物（ＨＰ）画分に対する生存率比を示す。 図４Ｆは、改変されたＣＣＥベースの方法または代替方法のどちらかを使用する最終産物収率を示す。 図４Ｇは、改変されたＣＣＥベースの方法（Ｍｏｄ ＣＣＥ）または代替（Ａｌｔ）方法を低、中または高細胞投入量で使用する解凍された凍結保存薬物製品（ＣＤＰ）画分の平均生存率を示す。 図４Ｈ、４Ｉおよび４Ｊは、より低い生存率を示す洗浄前産物（ＨＰ）画分を有するドナー（図４Ｈ）および代替方法を使用する低い生存率を有するドナー（図４Ｊ）間のものを含む、代替方法と比較して改変されたＣＣＥベースの方法によって生産されるＣＤＰの細胞生存率についての予測された改善を示す。 図４Ｋは、改変されたＣＣＥベースの方法の洗浄体積の増加に伴う、流入培地中の不純物の理論および実測濃度、ならびに流出培地中の同じ不純物の理論濃度を示す。

【図5】図５Ａは、インプット組成物ならびに濃縮の連続向流遠心分離方法後の産物および廃棄物画分中の全および生存不能な細胞の数を示す。濃縮方法の洗浄工程を、６２．５または３３．３どちらかの遠心力の流量に対する比率（Ｇ／ＦＲ）で実行した。 図５Ｂは、インプット組成物および６２．５または３３．３どちらかの遠心力の流量に対する比率（Ｇ／ＦＲ）で実施した洗浄工程後の洗浄済み産物画分中の生細胞のパーセンテージを示す。 図５Ｃは、９６時間刺激した（上のパネル）または活性化の開始後１５日間培養下で拡大した（下のパネル）生存率向上についてのインプット組成物における生細胞（Ｖ）および生存不能な細胞（ＮＶ）のサイズを示す。

【図6】図６Ａは、異なる遠心力および流量のもとで実行した、ウイルスベクターでの形質導入の連続向流遠心分離ベースの方法の後のＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示す。比較のために、ＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを、形質導入の規模縮小スピノキュレーション方法の後に評価した（図６Ｂ）。 図６Ｃは、３０００Ｇの遠心力および３０ｍＬ／分の流量を用いる条件下で実行した、ウイルスベクターでの形質導入の連続向流遠心分離ベースの方法の後のＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示す。図６Ｄは、遠心力および流量条件をインキュベーション全体にわたって定期的に変える条件下で実行した、ウイルスベクターでの形質導入の連続向流遠心分離ベースの方法の後のＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示す。比較のために、規模縮小スピノキュレーション方法（６９３Ｇ）を使用してウイルスベクターで細胞に形質導入した。

【図7】図７Ａは、１００万細胞当たり１１．１μＬまたは３．３３μＬのどちらかのベクター粒子での細胞の連続向流遠心分離ベースの形質導入後の生存ＣＤ４５＋細胞間のＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示す。 図７Ｂは、１００万細胞当たり６μＬのベクター粒子での細胞の連続向流遠心分離ベースの形質導入後のＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示す。比較のために、規模縮小スピノキュレーション方法（６９３Ｇ）を使用してウイルスベクターで細胞に形質導入した。

【図8】図８Ａは、インプット組成物が３０ｍＬまたは６０ｍＬのどちらかの総体積を有する、形質導入の連続向流遠心分離ベースの方法の後のＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のフローサイトメトリー分析を示す。結果が図８Ｂにおいて定量化されている。

【図9】図９Ａは、インプット組成物が総数６００×１０^６の細胞または総数２００×１０^６の細胞のどちらかを含む、形質導入の連続向流遠心分離ベースの方法の後のＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のフローサイトメトリー分析を示す。対照として、総数１５×１０^６の細胞を形質導入の規模縮小スピノキュレーション方法に付した。結果が図９Ｂにおいて定量化されている。

【図10】図１０Ａは、初代Ｔ細胞の連続向流遠心分離ベースの形質導入中に逆遠心分離機システムから採取したウイルスベクター上清での形質導入後のＣＡＲ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞のパーセンテージを示す。 図１０Ｂは、逆遠心分離機システムにおける３０分または９０分の連続向流遠心分離ベースの形質導入後のＣＤ３＋ＣＡＲ＋初代Ｔ細胞のパーセンテージを示す。

【図11】図１１は、形質導入の連続向流遠心分離ベースの方法中の連続向流遠心分離機システムにおけるウイルスベクター濃度および分布を示す。

【発明を実施するための形態】

【0080】

細胞組成物に含まれているものなどの標的細胞、およびウイルスベクター粒子を遠心分離に付すことによって細胞に形質導入する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、遠心分離方法は、連続向流水簸（ＣＣＥ）に基づく。一部の実施形態では、方法は、標的細胞が遠心分離機のエンクロージャー（例えば、円錐形のエンクロージャー）においてウイルスベクター粒子による接触を繰り返し受けることによって、ウイルスベクターで形質導入された複数の標的細胞を含む組成物が生成される条件下での、ＣＣＥベースの遠心分離に関する。一部の実施形態では、形質導入の遠心分離ベースの方法はまた、生存可能な標的細胞を濃縮するか、不純物を除去するか、または両方である。提供される開示に従う方法によって生産されるものなどの、形質導入細胞集団を含有する関連組成物も、提供される。

【0081】

免疫細胞、例えばＴ細胞、などの細胞の遠心分離による形質導入を含む、細胞（例えば、Ｔ細胞）へのウイルスベクターの移入方法も提供される。一部の実施形態では、提供される方法は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）などの細胞とレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター粒子とを、遠心分離に付すことを含む。一部の実施形態では、遠心分離方法は、遠心分離の連続向流水簸（ＣＣＥ）方法であるか、またはそれに基づき、例えば、逆遠心分離機システム（例えば、向流遠心分離システム）において実行される。一部の実施形態では、遠心分離システムは、その全体が参照により本明細書に各々組み込まれるＷＯ２０１８／２０４９９２およびＷＯ２０１９／１４０４９１に記載されているもののいずれかである。一部の実施形態では、提供される方法は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）などの細胞とレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター粒子とを逆遠心分離システム（例えば、向流遠心分離システム）において遠心分離に付すこと含み、このシステムにおいて、ウイルスベクター粒子は、システムを通って循環されて細胞と繰り返し接触する。

【0082】

形質導入細胞組成物などの細胞組成物中の生細胞を遠心分離によって濃縮する方法も提供される。一部の実施形態では、細胞組成物は、Ｔ細胞組成物、例えば、形質導入Ｔ細胞組成物である。一部の実施形態では、遠心分離方法は、遠心分離のＣＣＥ法であるか、またはそれに基づき、例えば、逆遠心分離機システム（例えば、向流遠心分離システム）において実行される。提供される開示に従う方法によって生産されるものなどの、生細胞が濃縮された細胞集団を含有する関連組成物も、提供される。

【0083】

細胞組成物、例えばＴ細胞組成物、から遠心分離によってビーズを除去する（脱ビーズ化する（ｄｅｂｅａｄｉｎｇ））方法も提供される。一部の実施形態では、遠心分離方法は、遠心分離のＣＣＥ法であるか、またはそれに基づき、例えば、逆遠心分離機システム（例えば、向流遠心分離システム）において実行される。提供される開示に従う方法によって生産されるものなどの、脱ビーズ化細胞集団を含有する関連組成物も、提供される。

【0084】

逆流（「向流」としても公知）遠心分離は、遠心加速下で流体中の粒子の沈降速度を支持培地の流れによって相殺する技術である。粒子は、それによって、流動床として懸濁される。逆流遠心分離は、十分に穏やかであるので細胞を培養することができ、ひいては流動床状態で拡大することができる。細胞凝集も低減させることができる。さらに、この技術は、密度および形態特性の違いから死細胞の生細胞からの分離を可能にする。遠心加速下での細胞または粒子へ半径方向内向きの流体流のデリバリーは、向流状況を作り出す。各粒子が経験する遠心加速は、回転中心からのその粒子の半径方向距離に比例する。流動粒子床を作出するためには、相殺する流量を回転半径ごとに調整する必要がある。提供される実施形態のいずれかにおいて、流量は、蠕動ポンプによって提供される。これは、一般に、円錐の尖端が半径方向外側に向いている円錐として、チャンバーを成形することによって達成される。対向流体流は、円錐尖端を通ってインプットされる。流体流は、比較的高い速度で円錐の尖端に入り、流体流の速度は、それが半径方向内向きに進むにつれて、円錐の断面積が増加するため徐々に低下する。Ｒ．Ｊ．Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｋ．Ｅ．Ｂｉｒｄ、Ｎ．Ｆ．ＰａｌｍｅｒおよびＪ．Ｂｒｅｎｍａｎによって論文：“Design Principles for a Counter Flow Centrifugation Cell Separation Chamber” Analytical Biochemistry 71 , 615-622 (1976)に記録されているように、昔から、逆流遠心分離のためのチャンバー形状および具体的な円錐幾何形状についての研究は行われている。

【0085】

一部の実施形態では、提供される方法は、そのような細胞を、組換え抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、をコードする異種分子を用いて遺伝子操作するために、使用される。得られる遺伝子操作された細胞を養子免疫療法において使用することができる。一部のそのような実施形態では、提供される方法を使用して、形質導入のスピノキュレーションベースの方法を用いることなく養子療法のための免疫細胞、例えばＴ細胞、を調製することができる。一部の態様では、提供される方法は、細胞組成物、細胞およびウイルスベクター粒子組成物、ならびに／または形質導入細胞集団を生細胞について濃縮することができる。一部の態様では、生細胞の濃縮は、低い出発生存率を有する組成物においてより顕著である。一部の態様では、提供される方法は、代替方法（例えば、デッドエンド遠心分離方法）と比較して匹敵する最終細胞収率を維持しつつ生細胞を濃縮する。

【0086】

一般に、スピノキュレーションベースの方法を使用して、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）などの細胞にウイルスベクター粒子で形質導入することができる。しかし、そのような方法には、生細胞の数が少ないおよび／または生存可能な形質導入細胞の数が少ないという欠点がある。形質導入のスピノキュレーションベースの方法は、細胞組成物を生細胞について本質的に濃縮しないからである。したがって、既存のスピノキュレーションベースの方法を用いると、下流の使用のための、例えば細胞療法における使用のための、生存能が維持された多数の細胞に、必ずしも形質導入できるとは限らない可能性がある。

【0087】

さらに、連続指数関数的速度で不純物を希釈する連続向流遠心分離システムのおかげで、細胞組成物中の不純物のクリアランスが代替方法およびシステムと比較して改善される。一部の態様では、不純物は、タンパク質、ＤＮＡ、細胞残屑、製造に使用された試薬、またはそれらの任意の組合せを含み得る。

【0088】

加えて、遠心分離の代替方法およびシステムを自動化することおよび／または他のシステムに統合することができるとは限らない。対照的に、本明細書で提供される方法の異なる工程を、連続向流遠心分離システム（例えば、ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）を使用すると自動化することができる。さらに、このようなシステムは、他の機器およびシステムと互換性があり、それらと統合することができる。

【0089】

提供される方法は、遠心分離の連続向流水簸ベースの方法、例えば、逆遠心分離機システム（例えば、ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）において実行される該方法が、対象から得られた初代細胞の十分な形質導入を達成することができ、細胞組成物を生細胞について濃縮することができるという観察結果に基づく。

【0090】

一部の実施形態では、方法は、特定の生細胞数またはパーセンテージを獲得可能である。例えば、一部の実施形態では、方法によって生成される組成物中の細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％は、生存可能である。一部の実施形態では、方法は、生細胞のパーセンテージがインプット組成物より大きい、例えば、インプット組成物より５％、１０％、１５％、または２０％大きい、アウトプット組成物を生産する。

【0091】

一部のそのような実施形態では、生細胞の数およびパーセンテージは、細胞の生存率またはその欠如を示すマーカーの発現レベルを測定することによって、モニタリングおよび／または観察することができる。細胞生存率を評価するためのいくつかの周知の方法、例えば、細胞死マーカー、例えば、クロマチン凝縮、アネキシンＶ、カスパーゼ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、および／またはホスファチジルセリン（ＰＳ）の、例えば、細胞表面タンパク質に関して、フローサイトメトリーまたは細胞染色（例えば、免疫組織化学的検査）などによる検出を、使用することができる。一部の例では、発現は、細胞によって産生される分子、例えば、乳酸デヒドロナーゼ（ＬＤＨ）またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルの検出によって測定される。

【0092】

一部の実施形態では、方法を使用して、集団におけるＴ細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くが、生存可能なＴ細胞、例えば、細胞死マーカー、例えば、表面マーカーまたは分泌分子または他のマーカーを欠くＴ細胞である、Ｔ細胞の集団に形質導入することができる。

【0093】

一部の実施形態では、方法は、アウトプット組成物中の全細胞の（またはＴ細胞などの特定の標的細胞型の）少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％が生存可能であり、および／または細胞死マーカー、例えば、表面マーカーもしくは分泌マーカーもしくは他のマーカーを発現しない、アウトプット組成物を生産する。

【0094】

一部の実施形態では、提供される方法は、免疫細胞、例えばＴ細胞、の比較的高い生存率をもたらす。一部の実施形態では、細胞集団、例えばアウトプット組成物、中のＴ細胞などの細胞の少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、提供される方法に従って生存可能である。

【0095】

一部の実施形態では、アウトプット組成物中のＴ細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％以下は、生存不能な細胞であり、アネキシンＶ、カスパーゼ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および／もしくはホスファチジルセリン（ＰＳ）からなる群から選択される表面マーカーを発現し、ならびに／または比較的高レベルのＬＤＨおよび／もしくは比較的低レベルのＡＴＰを分泌する。例えば、一部の態様では、インプット組成物および／またはアウトプット組成物の細胞の集団は、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％がアネキシンＶ、カスパーゼ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および／またはホスファチジルセリン（ＰＳ）について表面陰性であるものである。

【0096】

細胞の生存率を評価するための方法および技術は、当該技術分野で公知である。そのようなマーカーの検出のための抗体および試薬は、当該技術分野で周知であり、容易に入手可能である。

【0097】

一部の実施形態では、方法は、ある特定の条件下で少なくとも特定の形質導入効率を達成可能である。例えば、インプット組成物が、ウイルスおよび細胞を、細胞１個当たり１または約１感染単位（ＩＵ）から細胞１個当たり１０ＩＵ、例えば、細胞１個当たり少なくとも１もしくは１もしくは約１感染単位（ＩＵ）、または細胞１個当たり少なくとも２もしくは２もしくは約２ＩＵ、細胞１個当たり少なくとも５もしくは５もしくは約５ＩＵ、または細胞１個当たり少なくとも１０もしくは１０もしくは約１０ＩＵの比率で含む、一部の実施形態では、方法は、方法によって生成される組成物における細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％がウイルスベクターを含む、例えば、ウイルスベクターで形質導入されている、アウトプット組成物を生産可能である。

【0098】

一部のそのような実施形態では、ウイルスベクター粒子（例えば、レトロウイルスベクター）での細胞の形質導入効率を、細胞、例えば、生存可能な宿主細胞、例えば生存可能なＴ細胞、またはその細胞の集団へのベクターの形質導入または他の形態の移入後に、ウイルスベクターのゲノムに含有される核酸によりコードされる組換え分子またはタンパク質、例えば異種抗原受容体、の発現のレベルを測定することによって、モニタリングおよび／または観察することができる。組換え分子の発現レベルを評価するためのいくつかの周知の方法、例えば、親和性ベースの方法、例えば免疫親和性ベースの方法による、例えば、細胞表面タンパク質に関して、フローサイトメトリーなどによる検出を、使用することができる。一部の例では、発現は、形質導入マーカーおよび／またはレポーターコンストラクトの検出によって測定される。一部の実施形態では、切断された表面タンパク質をコードする核酸がベクター内に含められ、発現および／またはその増強のマーカーとして使用される。

【0099】

一部の実施形態では、提供される方法は、細胞とウイルス粒子のインキュベーション、例えば、細胞のウイルス粒子での形質導入の前または後に、凍結保存工程を含み得る。一部の実施形態では、提供される方法は、細胞とウイルス粒子のインキュベーション、例えば、細胞のウイルス粒子での形質導入の前または後に、凍結保存工程を含む。一部の実施形態では、そのような工程は、材料の出荷、材料のサンプリング、または患者の状態を保留する治療の「一時停止」を可能にするためのプロセスの中断工程を含むこともあり得る。一部の実施形態では、提供される方法によって達成される細胞生存率の向上は、凍結保存薬物製品において、または以前に凍結保存された解凍薬物製品において維持される。一部の実施形態では、提供される方法によって達成される細胞生存率の向上は、凍結保存薬物製品において維持される。一部の実施形態では、提供される方法によって達成される細胞生存率の向上は、以前に凍結保存された解凍薬物製品において維持される。

【0100】

一部の実施形態では、提供される方法は、例えば養子細胞療法における、臨床使用のための細胞の調製における１つの、より多くの、または全ての工程が、非無菌条件に細胞を曝露することなく、および無菌室またはキャビネットを使用する必要なく実行されるように、実行される。そのようなプロセスの一部の実施形態では、全て閉鎖されたシステム内で、細胞は、生存率について向上され、および／または形質導入される。一部の実施形態では、閉鎖されたシステムは、逆遠心分離機システムの円錐形のエンクロージャーであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、方法、またはそのいずれかの部分は、自動化方式で実行される。一部の実施形態では、方法全体が自動化方式で実行される。

【0101】

一部の実施形態では、提供される方法は、細胞がスピノキュレーションの非存在下で形質導入されおよび／または細胞生存率について向上され、ひいては下流の処理および産物が改善される、最適化されたまたは改善されたプロセスを提供する。一部の態様では、提供される方法はまた、より良好なまたはより望ましい表現型、例えば、より多くの生細胞を有する、対象への投与のための形質導入細胞を生産することができる。

【0102】

一部の実施形態では、方法によって生産されるそのような細胞、またはそのような細胞を含む組成物は、疾患または状態を処置するために対象に投与される。

【0103】

一部の実施形態では、提供される方法は、細胞の準最適用量を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、細胞の用量は、疾患または状態を処置するための細胞の治療有効用量の１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１もしくは１０分の１未満、または約１．５分の１、約２分の１、３分の１、約４分の１、約５分の１もしくは約１０分の１未満である。そのような例では、細胞の治療有効量をもたらすための細胞の拡大が、対象への細胞の投与時にインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で起こり得る。

【0104】

一部の実施形態では、提供される方法は、細胞のインビボ拡大を含む。一部の態様では、細胞のインビボ拡大は、投与された細胞の導入遺伝子特異的活性化または刺激によってインビボで起こり得る。一部の実施形態では、抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）は、抗原の認識時に刺激される、例えば、活性化または拡大される。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤が、対象におけるインビボでの細胞の刺激、活性化または拡大をブーストする、増す、または増大させるために、対象に投与される。

【0105】

一部の実施形態では、提供される方法は、対象に投与されたときに持続性および／または拡大の増大を示す遺伝子操作されたＴ細胞を生産する。一部の実施形態では、持続性および／または拡大が増大された遺伝子操作された細胞は、それが投与される対象において、より良好な効力を示す。一部の実施形態では、提供されるウイルスベクターおよび方法は、例えば、対象への投与の前にＴ細胞のエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）マニピュレーションを最小にすることおよび／または低減させることによって、養子細胞療法の方法における処置成績のばらつきを低減させる。一部の実施形態では、形質導入の前にまたはそれと並行して生存可能なＴ細胞を濃縮することは、エクスビボマニピュレーションに必要とされる時間および試薬を低減させることによって、養子細胞療法のための遺伝子操作されたＴ細胞を生産または調製するプロセスを改善する。一部の実施形態では、形質導入細胞または操作された細胞の選択が遺伝子操作後に実行される。

【0106】

また、提供される実施形態の中には、本明細書で提供される方法のいずれかによって生産される遺伝子操作された細胞、例えば、組換え抗原受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現する細胞、ならびにそのような遺伝子操作された細胞の養子細胞療法のための方法および使用もある。

【0107】

本出願において参照される特許文書、科学論文およびデータベースを含む全ての出版物は、それぞれ個々の出版物が個々に参照により組み込まれた場合と同程度に、あらゆる目的のために参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開された出願および他の出版物に記載の定義に反するか、または別の状況で矛盾する場合、参照により本明細書に組み込まれる定義より本明細書に記載の定義が優先される。

【0108】

本明細書で使用される節の見出しは、単に系統化する目的のためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されないものとする。

【0109】

Ｉ．細胞に形質導入する方法
遺伝子操作されたＴ細胞の組成物を遠心分離機システムにおいて生産するための方法が、提供される。一部の実施形態では、方法は、遠心分離機システムにおいて細胞組成物を含むインプット組成物にウイルスベクター粒子で形質導入することを含む。一部の実施形態では、遠心分離機システムは、逆遠心分離機システムとしても公知の、連続向流水簸（「ＣＣＥ」）遠心分離機システムである。一部の実施形態では、生産される細胞は、例えば養子細胞療法において、自家または同種移植のために調製される初代細胞などの、細胞療法における使用のためのものである。方法は、追加の細胞処理工程、例えば、細胞洗浄、単離、分離、収集、製剤化、または細胞組成物の生産に関連する他の工程を含み得る。

【0110】

一部の実施形態では、提供される方法は、レトロウイルスベクター粒子などのウイルスベクター粒子をＴ細胞などの細胞に導入するために使用される。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの抗原受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含有する。したがって、一部の実施形態では、提供される方法は、トランスジェニックＴＣＲまたはＣＡＲなどの遺伝子操作された抗原受容体をＴ細胞などの細胞において発現させるために使用することができる。そのような粒子および方法によって形質導入された細胞、ならびにそのような細胞を含有する組成物、ならびにそれらを使用するための方法も、提供される。

【0111】

一部の実施形態では、方法は、養子細胞療法における使用に望ましい、形質導入細胞および／またはそれらのある特定の集団もしくは亜集団の生存率の増加をもたらす特徴を含む。一部の実施形態では、提供される方法は、生存可能な遺伝子操作された細胞をはじめとする生細胞を濃縮する。したがって、一部の実施形態では、提供される方法から得られる細胞の組成物は、形質導入の前と比較して、形質導入後に細胞生存率の増加を示す。一部の実施形態では、生存率の増加は、形質導入の直後に観察され、および／または形質導入後ある期間（例えば、数時間もしくは数日）にわって維持される。

【0112】

Ａ．インプット組成物
一部の実施形態では、提供される方法は、遠心分離機システムにおいて、Ｔ細胞を含細胞組成物と、抗原受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含有するウイルスベクター粒子（合わせて、「インプット組成物」）を接触させることによって、Ｔ細胞を遺伝子操作することを含む。一部の実施形態では、方法は、第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することを含む。一部の実施形態では、方法は、第１の遠心力および第１の流量の適用の前に円錐形の流体エンクロージャーに細胞組成物を投入することを含む。

【0113】

一部の実施形態では、遠心分離機システムは、円錐形の流体エンクロージャー内にカニューレを含む。一部の実施形態では、カニューレは、円錐形の流体エンクロージャーの長さに沿って伸びている。一部の実施形態では、カニューレの一方の末端は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近にある。一部の実施形態では、カニューレの他方の末端は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近、例えば、広端の中心またはその付近にある。

【0114】

一部の実施形態では、細胞組成物は、円錐形の流体エンクロージャーにカニューレ経由で投入される。一部の実施形態では、細胞組成物は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近において、円錐形の流体エンクロージャーに投入される。一部の実施形態では、細胞組成物は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端に入り、円錐形の流体エンクロージャーの尖端または付近におけるカニューレの末端から出ることによって、円錐形の流体エンクロージャーに投入される。

【0115】

一部の実施形態では、方法は、ウイルスベクター粒子を遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーに投入することを含み、細胞組成物とウイルス粒子とを含む得られる組成物がインプット組成物である。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の投入は、第１の遠心力および第１の流量の適用と同時にまたは適用の間に実行される。

【0116】

一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、円錐形の流体エンクロージャーにカニューレ経由で投入される。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近において、円錐形の流体エンクロージャーに投入される。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端に入り、円錐形の流体エンクロージャーの尖端または付近におけるカニューレの末端から出ることによって、円錐形の流体エンクロージャーに投入される。

【0117】

一部の実施形態では、方法は、第２の遠心力および第２の流量をインプット組成物に適用することを含む。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、遠心分離機システムの流路でウイルスベクター粒子を再循環させる。したがって、一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、遠心分離機システムを通って再循環している間に細胞の流動床と繰り返し接触する。一部の実施形態では、方法は、抗原受容体を発現する遺伝子操作されたＴ細胞を生産する。

【0118】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量を適用することによって、細胞組成物の廃棄物画分が水簸されて円錐形の流体エンクロージャーから出される。一部の実施形態では、水簸された廃棄物画分は、細胞組成物中の生存不能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存不能なＴ細胞のパーセンテージを有する。

【0119】

一部の実施形態では、水簸された細胞は、円錐形の流体エンクロージャーの広端における開口部経由で円錐形の流体エンクロージャーから出る。一部の実施形態では、開口部は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端を少なくとも部分的に包囲している。一部の実施形態では、開口部は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端を包囲している。

【0120】

一部の実施形態では、方法は、水簸された廃棄物画分を収集することを含む。一部の実施形態では、水簸された廃棄物画分は、容器に回収される。一部の実施形態では、容器は、円錐形の流体エンクロージャーの広端と流体連通している。

【0121】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量を適用することによって、円錐形の流体エンクロージャー内で細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物が生産される。

【0122】

一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の投入は、第２の遠心力および第２の流量の適用と同時にまたは適用の間に実行される。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、第２の遠心力および第２の流量の適用の少なくとも一部分の間、遠心分離機システムに存在する。

【0123】

一部の実施形態では、方法は、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産すること；（ｂ）抗原受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含有するウイルスベクター粒子を円錐形の流体エンクロージャーに投入することによって、細胞組成物とウイルスベクター粒子とを含むインプット組成物を生成すること；ならびに（ｃ）第２の遠心力および第２の流量をインプット組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路でウイルスベクター粒子を再循環させ、その結果、ウイルスベクター粒子が細胞の流動床と繰り返し接触し、それによって、遺伝子操作されたＴ細胞を生成することを含む。

【0124】

一部の実施形態では、方法は、第１の遠心力および第１の流量を、抗原受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含有するウイルスベクター粒子とＴ細胞を含む細胞組成物とを含むインプット組成物に適用することを含む。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子および細胞組成物は、両方とも、第１の遠心力および第１の流量が適用されるとき遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーに存在する。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量の適用は、細胞の流動床を生産する。一部の実施形態では、方法は、第１の遠心力および第１の流量の適用の前に円錐形の流体エンクロージャーに細胞組成物およびウイルスベクター粒子を投入することを含む。一部の実施形態では、細胞組成物の投入は、ウイルスベクター粒子の投入前、投入中、および／または投入後である。一部の実施形態では、方法は、第１の遠心力および第１の流量の適用の前に円錐形の流体エンクロージャーにインプット組成物を投入することを含む。一部の実施形態では、細胞組成物および／またはウイルスベクター粒子は、第１の遠心力および第１の流量の適用の前または間に円錐形の流体エンクロージャーに投入される。

【0125】

一部の実施形態では、第１の遠心力は、約６２５Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約６２５Ｇから約３，０００Ｇの間、約６２５Ｇから約２，５００Ｇの間、約６２５Ｇから約２，０００Ｇの間、約６２５Ｇから約１，５００Ｇの間、約６２５Ｇから約１，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約１，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約２，５００Ｇの間、または約２，５００Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間である。

【0126】

一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，０００Ｇから約５，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約４，５００Ｇの間、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，５００Ｇ、または約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，０００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，０００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約３，０００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約３，５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約４，０００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約４，５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約５，０００Ｇである。

【0127】

一部の実施形態では、第１の流量は、半径方向内向きである。一部の実施形態では、第１の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から離れる方向に向けられている。一部の実施形態では、第１の遠心力は、第１の流量によって相殺される。一部の実施形態では、第１の流量は、対向流量（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ ｒａｔｅ）である。

【0128】

一部の実施形態では、第１の流量は、カニューレを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、カニューレを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、カニューレから出て、円錐形の流体エンクロージャーにその尖端から入る。

【0129】

一部の実施形態では、第１の流量は、約１ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約３ｍＬ／分から約１８ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間、または約８ｍＬ／分から約１２ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約３ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約９ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１１ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１２ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約２０ｍＬ／分である。

【0130】

一部の実施形態では、第１の流量は、約１ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約１ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間、約１ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間、約１ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約１ｍＬ／分から約１０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間、または約４０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１０ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間である。

【0131】

一部の実施形態では、第１の流量は、約１０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、または約３５ｍＬ／分から約４５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第１の流量は、約４０ｍＬ／分である。

【0132】

一部の実施形態では、第１の流量は、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第１の遠心力は、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第１の流量は、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である。

【0133】

一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００から約４００の間である。本明細書での遠心力の流量に対する比率は、別段の指示がない限り、Ｇでの遠心力のｍＬ／分での流量に対する比率である。

【0134】

一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００から約４００の間、約２２５から約３７５の間、約２５０から約３５０の間、または約２７５から約３２５の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２２５である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２５０である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２７５である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約３００である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約３２５である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約３５０である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約３７５である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約４００である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約３，０００Ｇであり、第１の流量は、約１０ｍＬ／分である。

【0135】

一部の実施形態では、第の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２０から２００の間、約２０から１８０の間、約２０から１６０の間、約２０から１４０の間、約２０から１２０の間、約２０から１００の間、約２０から８０の間、約２０から６０の間、約２０から４０の間、約４０から２００の間、約４０から１８０の間、約４０から１６０の間、約４０から１４０の間、約４０から１２０の間、約４０から１００の間、約４０から８０の間、約４０から６０の間、約６０から２００の間、約６０から１８０の間、約６０から１６０の間、約６０から１４０の間、約６０から１２０の間、約６０から１００の間、約６０から８０の間、約８０から２００の間、約８０から１８０の間、約８０から１６０の間、約８０から１４０の間、約８０から１２０の間、約８０から１００の間、約１００から２００の間、約１００から１８０の間、約１００から１６０の間、約１００から１４０の間、約１００から１２０の間、約１２０から２００の間、約１２０から１８０の間、約１２０から１６０の間、約１２０から１４０の間、約１４０から２００の間、約１４０から１８０の間、約１４０から１６０の間、約１６０から２００の間、約１６０から１８０の間、または約１８０から２００の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約４０から２００の間、約４０から１８０の間、約４０から１６０の間、約４０から１４０の間、約４０から１２０の間、約４０から１００の間、約４０から８０の間、または約５０から６０の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約６２．５である。

【0136】

一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約６２．５から約３００の間、約６２．５から約２５０の間、約６２．５から約２００の間、約６２．５から約１５０の間、または約６２．５から約１００の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約６２．５である。

【0137】

一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約６２．５から約３００の間、約１００から約３００の間、約１５０から約３００の間、約２００から約３００の間、および約２５０から約３００の間である。

【0138】

一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，５００Ｇであり、第１の流量は、約４０ｍＬ／分である。

【0139】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１５秒間、約３０秒間、約４５秒間、約６０秒間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約１０分間、または約１５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約３０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約４５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約６０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に、約１分間から約１５分間の間、約３分間から約１２分間の間、または約５分間から約１０分間の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約２分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約３分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約４分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約６分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約７分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約８分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約９分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１０分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１１分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１２分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１３分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１４分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に、少なくとも流動床が確立されるまで、適用される。

【0140】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に、少なくとも約１５秒間、少なくとも約３０秒間、少なくとも約４５秒間、少なくとも約６０秒間、少なくとも約２分間、少なくとも約３分間、少なくとも約４分間、少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、または少なくとも約１５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約１５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約２０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約２５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約３０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約４５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約６０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約２分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約３分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約４分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約１０分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約１５分間適用される。

【0141】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に１５秒から６０秒の間または約１５秒から約６０秒の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に２５秒から６０秒の間または約２５秒から約６０秒の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に３０秒から６０秒の間または約３０秒から約６０秒の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に１５秒から２分の間または約１５秒から約２分の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に２５秒から２分の間または約２５秒から約２分の間適用される。

【0142】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に、所定の数の細胞が円錐形の流体エンクロージャーに投入されるまで適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に、所定の数の細胞が細胞の流動床の一部になるまで適用される。一部の実施形態では、所定の数の細胞は、所定の数のＴ細胞である。一部の実施形態では、所定の数の細胞、例えば、Ｔ細胞は、約１０００万から１億の間、約１０００万から９０００万の間、約１０００万から８０００万の間、約１０００万から７０００万の間、約１０００万から６０００万の間、約１０００万から５０００万の間、約１０００万から４０００万の間、約１０００万から３０００万の間、約１０００万から２０００万の間、約２０００万から１億の間、約２０００万から９０００万の間、約２０００万から８０００万の間、約２０００万から７０００万の間、約２０００万から６０００万の間、約２０００万から５０００万の間、約２０００万から４０００万の間、約２０００万から３０００万の間、約３０００万から１億の間、約３０００万から９０００万の間、約３０００万から８０００万の間、約３０００万から７０００万の間、約３０００万から６０００万の間、約３０００万から５０００万の間、約３０００万から４０００万の間、約４０００万から１億の間、約４０００万から９０００万の間、約４０００万から８０００万の間、約４０００万から７０００万の間、約４０００万から６０００万の間、約４０００万から５０００万の間、約５０００万から１億の間、約５０００万から９０００万の間、約５０００万から８０００万の間、約５０００万から７０００万の間、約５０００万から６０００万の間、約６０００万から１億の間、約６０００万から９０００万の間、約６０００万から８０００万の間、約６０００万から７０００万の間、約７０００万から１億の間、約７０００万から９０００万の間、約７０００万から８０００万の間、約８０００万から１億の間、約８０００万から９０００万の間、または約９０００万から１億の間の細胞、例えば、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、所定の数の細胞、例えば、Ｔ細胞は、約５０００万の細胞、例えば、Ｔ細胞である。

【0143】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約１５秒間、約３０秒間、約４５秒間、約６０秒間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約１０分間、または約１５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約１５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約３０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約４５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約６０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に、約１分間から約１５分間の間、約３分間から約１２分間の間、または約５分間から約１０分間の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約１分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約２分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約３分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約４分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約６分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約７分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約８分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約９分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約１０分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約１１分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約１２分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約１３分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約１４分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に約１５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に、少なくとも流動床が確立されるまで、適用される。

【0144】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に、少なくとも約１５秒間、少なくとも約３０秒間、少なくとも約４５秒間、少なくとも約６０秒間、少なくとも約２分間、少なくとも約３分間、少なくとも約４分間、少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、または少なくとも約１５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約１５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約２０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約２５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約３０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約４５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約６０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約２分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約３分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約４分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約１０分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に少なくとも約１５分間適用される。

【0145】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に１５秒から６０秒の間または約１５秒から約６０秒の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に２５秒から６０秒の間または約２５秒から約６０秒の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に３０秒から６０秒の間または約３０秒から約６０秒の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に１５秒から２分の間または約１５秒から約２分の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に２５秒から２分の間または約２５秒から約２分の間適用される。

【0146】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に、所定の数の細胞が円錐形の流体エンクロージャーに投入されるまで適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、インプット組成物に、所定の数の細胞が細胞の流動床の一部になるまで適用される。一部の実施形態では、所定の数の細胞は、所定の数のＴ細胞である。一部の実施形態では、所定の数の細胞、例えば、Ｔ細胞は、約１０００万から１億の間、約１０００万から９０００万の間、約１０００万から８０００万の間、約１０００万から７０００万の間、約１０００万から６０００万の間、約１０００万から５０００万の間、約１０００万から４０００万の間、約１０００万から３０００万の間、約１０００万から２０００万の間、約２０００万から１億の間、約２０００万から９０００万の間、約２０００万から８０００万の間、約２０００万から７０００万の間、約２０００万から６０００万の間、約２０００万から５０００万の間、約２０００万から４０００万の間、約２０００万から３０００万の間、約３０００万から１億の間、約３０００万から９０００万の間、約３０００万から８０００万の間、約３０００万から７０００万の間、約３０００万から６０００万の間、約３０００万から５０００万の間、約３０００万から４０００万の間、約４０００万から１億の間、約４０００万から９０００万の間、約４０００万から８０００万の間、約４０００万から７０００万の間、約４０００万から６０００万の間、約４０００万から５０００万の間、約５０００万から１億の間、約５０００万から９０００万の間、約５０００万から８０００万の間、約５０００万から７０００万の間、約５０００万から６０００万の間、約６０００万から１億の間、約６０００万から９０００万の間、約６０００万から８０００万の間、約６０００万から７０００万の間、約７０００万から１億の間、約７０００万から９０００万の間、約７０００万から８０００万の間、約８０００万から１億の間、約８０００万から９０００万の間、または約９０００万から１億の間の細胞、例えば、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、所定の数の細胞、例えば、Ｔ細胞は、約５０００万の細胞、例えば、Ｔ細胞である。

【0147】

一部の実施形態では、第２の流量は、半径方向内向きである。一部の実施形態では、第２の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から離れる方向に向けられている。一部の実施形態では、第２の遠心力は、第２の流量によって相殺される。一部の実施形態では、第２の流量は、対向流量である。

【0148】

一部の実施形態では、第２の流量は、カニューレを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、カニューレを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、カニューレから出て、円錐形の流体エンクロージャーにその尖端から入る。

【0149】

他の実施形態では、第２の流量は、半径方向外向きである。一部の実施形態では、第２の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端に向けられている。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、同じまたは実質的に同じ方向である。

【0150】

一部の実施形態では、第２の流量は、円錐形の流体エンクロージャーを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、円錐形の流体エンクロージャーを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から出てカニューレに入る。

【0151】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１００Ｇから約２，０００Ｇの間、約２００Ｇから約１８００Ｇの間、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間、または約７５０Ｇから約１，２５０Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約２５０Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約６００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約７００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約８００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約９００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，０００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，１００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，２００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，３００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，４００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，５００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，３００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，７５０Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約２，０００Ｇである。

【0152】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１００Ｇから約３，７５０Ｇの間、約１００Ｇから約３，５００Ｇの間、約１００Ｇから約３，２５０Ｇの間、約１００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１００Ｇから約２，７５０Ｇの間、約１００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１００Ｇから約２，２５０Ｇの間、約１００Ｇから約２，０００Ｇの間、約１００Ｇから約１，７５０Ｇの間、約１００Ｇから約１，５００Ｇの間、約１００Ｇから約１，２５０Ｇの間、約１００Ｇから約１，０００Ｇの間、約１００Ｇから約７５０Ｇの間、約１００Ｇから約５００Ｇの間、約１００Ｇから約２５０Ｇの間、約２５０Ｇから約４，０００Ｇの間、約２５０Ｇから約３，７５０Ｇの間、約２５０Ｇから約３，５００Ｇの間、約２５０Ｇから約３，２５０Ｇの間、約２５０Ｇから約３，０００Ｇの間、約２５０Ｇから約２，７５０Ｇの間、約２５０Ｇから約２，５００Ｇの間、約２５０Ｇから約２，２５０Ｇの間、約２５０Ｇから約２，０００Ｇの間、約２５０Ｇから約１，７５０Ｇの間、約２５０Ｇから約１，５００Ｇの間、約２５０Ｇから約１，２５０Ｇの間、約２５０Ｇから約１，０００Ｇの間、約２５０Ｇから約７５０Ｇの間、約２５０Ｇから約５００Ｇの間、約５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約５００Ｇから約３，７５０Ｇの間、約５００Ｇから約３，５００Ｇの間、約５００Ｇから約３，２５０Ｇの間、約５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約５００Ｇから約２，７５０Ｇの間、約５００Ｇから約２，５００Ｇの間、約５００Ｇから約２，２５０Ｇの間、約５００Ｇから約２，０００Ｇの間、約５００Ｇから約１，７５０Ｇの間、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間、約５００Ｇから約１，２５０Ｇの間、約５００Ｇから約１，０００Ｇの間、約５００Ｇから約７５０Ｇの間、約７５０Ｇから約４，０００Ｇの間、約７５０Ｇから約３，７５０Ｇの間、約７５０Ｇから約３，５００Ｇの間、約７５０Ｇから約３，２５０Ｇの間、約７５０Ｇから約３，０００Ｇの間、約７５０Ｇから約２，７５０Ｇの間、約７５０Ｇから約２，５００Ｇの間、約７５０Ｇから約２，２５０Ｇの間、約７５０Ｇから約２，０００Ｇの間、約７５０Ｇから約１，７５０Ｇの間、約７５０Ｇから約１，５００Ｇの間、約７５０Ｇから約１，２５０Ｇの間、約７５０Ｇから約１，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約３，７５０Ｇの間、約１，０００Ｇから約３，５００Ｇの間、約１，０００Ｇから約３，２５０Ｇの間、約１，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，７５０Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，２５０Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約１，７５０Ｇの間、約１，０００Ｇから約１，５００Ｇの間、約１，０００Ｇから約１，２５０Ｇの間、約１，２５０Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，２５０Ｇから約３，７５０Ｇの間、約１，２５０Ｇから約３，５００Ｇの間、約１，２５０Ｇから約３，２５０Ｇの間、約１，２５０Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，２５０Ｇから約２，７５０Ｇの間、約１，２５０Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，２５０Ｇから約２，２５０Ｇの間、約１，２５０Ｇから約２，０００Ｇの間、約１，２５０Ｇから約１，７５０Ｇの間、約１，２５０Ｇから約１，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，７５０Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，２５０Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，７５０Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，２５０Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約１，７５０Ｇの間、約１，７５０Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，７５０Ｇから約３，７５０Ｇの間、約１，７５０Ｇから約３，５００Ｇの間、約１，７５０Ｇから約３，２５０Ｇの間、約１，７５０Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，７５０Ｇから約２，７５０Ｇの間、約１，７５０Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，７５０Ｇから約２，２５０Ｇの間、約１，７５０Ｇから約２，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約３，７５０Ｇの間、約２，０００Ｇから約３，５００Ｇの間、約２，０００Ｇから約３，２５０Ｇの間、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約２，７５０Ｇの間、約２，０００Ｇから約２，５００Ｇの間、約２，０００Ｇから約２，２５０Ｇの間、約２，２５０Ｇから約４，０００Ｇの間、約２，２５０Ｇから約３，７５０Ｇの間、約２，２５０Ｇから約３，５００Ｇの間、約２，２５０Ｇから約３，２５０Ｇの間、約２，２５０Ｇから約３，０００Ｇの間、約２，２５０Ｇから約２，７５０Ｇの間、約２，２５０Ｇから約２，５００Ｇの間、約２，５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約２，５００Ｇから約３，７５０Ｇの間、約２，５００Ｇから約３，５００Ｇの間、約２，５００Ｇから約３，２５０Ｇの間、約２，５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約２，５００Ｇから約２，７５０Ｇの間、約２，７５０Ｇから約４，０００Ｇの間、約２，７５０Ｇから約３，７５０Ｇの間、約２，７５０Ｇから約３，５００Ｇの間、約２，７５０Ｇから約３，２５０Ｇの間、約２，７５０Ｇから約３，０００Ｇの間、約３，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約３，０００Ｇから約３，７５０Ｇの間、約３，０００Ｇから約３，５００Ｇの間、約３，０００Ｇから約３，２５０Ｇの間、約３，２５０Ｇから約４，０００Ｇの間、約３，２５０Ｇから約３，７５０Ｇの間、約３，２５０Ｇから約３，５００Ｇの間、約３，５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約３，５００Ｇから約３，７５０Ｇの間、または約３，７５０Ｇから約４，０００Ｇの間である。

【0153】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間、約５００Ｇから約１，４００Ｇの間、約５００Ｇから約１，３００Ｇの間、約５００Ｇから約１，２００Ｇの間、約５００Ｇから約１，１００Ｇの間、約５００Ｇから約１，０００Ｇの間、約５００Ｇから約９００Ｇの間、約５００Ｇから約８００Ｇの間、または約５００Ｇから約７００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約６２５Ｇである。

【0154】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１００Ｇから約２，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１００Ｇから約２，０００Ｇの間、約１００Ｇから約１，９００Ｇの間、約１００Ｇから約１，８００Ｇの間、約１００Ｇから約１，７００Ｇの間、約１００Ｇから約１，６００Ｇの間、約１００Ｇから約１，５００Ｇの間、約１００Ｇから約１，４００Ｇの間、約１００Ｇから約１，３００Ｇの間、約１００Ｇから約１，２００Ｇの間、約１００Ｇから約１，１００Ｇの間、約１００Ｇから約１，０００Ｇの間、約１００Ｇから約９００Ｇの間、約１００Ｇから約８００Ｇの間、約１００Ｇから約７００Ｇの間、約１００Ｇから約６００Ｇの間、約１００Ｇから約５００Ｇの間、または約１００Ｇから約４００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３００Ｇである。

【0155】

一部の実施形態では、第２の流量は、約１０から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第２の遠心力は、約１００Ｇから約２，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。

【0156】

一部の実施形態では、第２の流量は、約１０から約１００ｍＬ／分の間、約１５から約９０ｍＬ／分の間、約２０から約８０ｍＬ／分の間、約２５から約７０ｍＬ／分の間、約３０から約６０ｍＬ／分の間、または約３５から約５０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２０ｍＬ／分、約２１ｍＬ／分、約２２ｍＬ／分、約２３ｍＬ／分、約２４ｍＬ／分、約２５ｍＬ／分、約２５．５ｍＬ／分、約２６ｍＬ／分、約２６．５ｍＬ／分、約２７ｍＬ／分、約２７．５ｍＬ／分、約２８ｍＬ／分、約２８．５ｍＬ／分、約２９ｍＬ／分、約２９．５ｍＬ／分、約３０ｍＬ／分、約３１ｍＬ／分、約３２ｍＬ／分、約３３ｍＬ／分、約３４ｍＬ／分、または約３５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２５．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２６ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２６．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２７ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２７．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２８．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２９ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２９．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約３０ｍＬ／分である。

【0157】

一部の実施形態では、第２の流量は、約５から約１００ｍＬ／分の間、約５から約９０ｍＬ／分の間、約５から約８０ｍＬ／分の間、約５から約７０ｍＬ／分の間、約５から約６０ｍＬ／分の間、約５から約５０ｍＬ／分の間、約５から約４０ｍＬ／分の間、約５から約３０ｍＬ／分の間、約５から約２５ｍＬ／分の間、約５から約２０ｍＬ／分の間、約５から約１５ｍＬ／分の間、約５から約１０ｍＬ／分の間、約１０から約１００ｍＬ／分の間、約１０から約９０ｍＬ／分の間、約１０から約８０ｍＬ／分の間、約１０から約７０ｍＬ／分の間、約１０から約６０ｍＬ／分の間、約１０から約５０ｍＬ／分の間、約１０から約４０ｍＬ／分の間、約１０から約３０ｍＬ／分の間、約１０から約２５ｍＬ／分の間、約１０から約２０ｍＬ／分の間、約１０から約１５ｍＬ／分の間、約１５から約１００ｍＬ／分の間、約１５から約９０ｍＬ／分の間、約１５から約８０ｍＬ／分の間、約１５から約７０ｍＬ／分の間、約１５から約６０ｍＬ／分の間、約１５から約５０ｍＬ／分の間、約１５から約４０ｍＬ／分の間、約１５から約３０ｍＬ／分の間、約１５から約２５ｍＬ／分の間、約１５から約２０ｍＬ／分の間、約２０から約１００ｍＬ／分の間、約２０から約９０ｍＬ／分の間、約２０から約８０ｍＬ／分の間、約２０から約７０ｍＬ／分の間、約２０から約６０ｍＬ／分の間、約２０から約５０ｍＬ／分の間、約２０から約４０ｍＬ／分の間、約２０から約３０ｍＬ／分の間、約２０から約２５ｍＬ／分の間、約２５から約１００ｍＬ／分の間、約２５から約９０ｍＬ／分の間、約２５から約８０ｍＬ／分の間、約２５から約７０ｍＬ／分の間、約２５から約６０ｍＬ／分の間、約２５から約５０ｍＬ／分の間、約２５から約４０ｍＬ／分の間、約２５から約３０ｍＬ／分の間、約３０から約１００ｍＬ／分の間、約３０から約９０ｍＬ／分の間、約３０から約８０ｍＬ／分の間、約３０から約７０ｍＬ／分の間、約３０から約６０ｍＬ／分の間、約３０から約５０ｍＬ／分の間、約３０から約４０ｍＬ／分の間、約４０から約１００ｍＬ／分の間、約４０から約９０ｍＬ／分の間、約４０から約８０ｍＬ／分の間、約４０から約７０ｍＬ／分の間、約４０から約６０ｍＬ／分の間、約４０から約５０ｍＬ／分の間、約５０から約１００ｍＬ／分の間、約５０から約９０ｍＬ／分の間、約５０から約８０ｍＬ／分の間、約５０から約７０ｍＬ／分の間、約５０から約６０ｍＬ／分の間、約６０から約１００ｍＬ／分の間、約６０から約９０ｍＬ／分の間、約６０から約８０ｍＬ／分の間、約６０から約７０ｍＬ／分の間、約７０から約１００ｍＬ／分の間、約７０から約９０ｍＬ／分の間、約７０から約８０ｍＬ／分の間、約８０から約１００ｍＬ／分の間、約８０から約９０ｍＬ／分の間、または約９０から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。

【0158】

一部の実施形態では、（ｉ）第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。

【0159】

一部の実施形態では、第２の流量は、約５から約４０ｍＬ／分の間、約５から約３５ｍＬ／分の間、約５から約３０ｍＬ／分の間、約５から約２５ｍＬ／分の間、約５から約２０ｍＬ／分の間、または約５から約１５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分である。

【0160】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２０から約１００の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２５から約８５の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０から約６５の間である。

【0161】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２０から約１００の間、約２５から約８０の間、または約３０から約６０の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約４０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約４５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約５０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約５５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約６０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約６５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約７０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約７５である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，０００Ｇであり、第２の流量は、約２８．５ｍＬ／分である。

【0162】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２０から２００の間、約２０から１８０の間、約２０から１６０の間、約２０から１４０の間、約２０から１２０の間、約２０から１００の間、約２０から８０の間、約２０から６０の間、約２０から４０の間、約４０から２００の間、約４０から１８０の間、約４０から１６０の間、約４０から１４０の間、約４０から１２０の間、約４０から１００の間、約４０から８０の間、約４０から６０の間、約６０から２００の間、約６０から１８０の間、約６０から１６０の間、約６０から１４０の間、約６０から１２０の間、約６０から１００の間、約６０から８０の間、約８０から２００の間、約８０から１８０の間、約８０から１６０の間、約８０から１４０の間、約８０から１２０の間、約８０から１００の間、約１００から２００の間、約１００から１８０の間、約１００から１６０の間、約１００から１４０の間、約１００から１２０の間、約１２０から２００の間、約１２０から１８０の間、約１２０から１６０の間、約１２０から１４０の間、約１４０から２００の間、約１４０から１８０の間、約１４０から１６０の間、約１６０から２００の間、約１６０から１８０の間、または約１８０から２００の間である。

【0163】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２０から約１００の間、約２０から約８０の間、約２０から約６０の間、または約２０から約４０の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３００Ｇであり、第２の流量は、約１０ｍＬ／分である。

【0164】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約４０から２００の間、約４０から１８０の間、約４０から１６０の間、約４０から１４０の間、約４０から１２０の間、約４０から１００の間、約４０から８０の間、または約５０から６０の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約６２．５である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約６２５Ｇであり、第２の流量は、約１０ｍＬ／分である。

【0165】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約５分間から約１００分間の間、約１０分間から約９０分間の間、約１５分間から約８０分間の間、約２０分間から約７０分間の間、約２５分間から約６０分間の間、約３０分間から約５０分間の間、または約３５分間から約４０分間の間、適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約１０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約１５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約２０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約２５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約３０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約４５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約６０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約７５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に約９０分間適用される。

【0166】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に少なくとも約１５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に少なくとも約３０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に少なくとも約４５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に少なくとも約６０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に少なくとも約７５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に少なくとも約９０分間適用される。

【0167】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に連続的に適用される。

【0168】

他の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に非連続的に適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に断続的に適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に規則的に生じる間隔で適用される。

【0169】

前述の実施形態のいずれかでは、第２の遠心力および第２の流量がインプット組成物に適用される時間の量は、第２の遠心力および第２の流量が非連続的に適用される時間の総量であり得る。例えば、一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に、３０分の期間中に合計で約５分間から約２５分間の間、非連続的に適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に、３０分の期間中に合計で約１５分間適用される。

【0170】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、インプット組成物に第１の期間に適用され、この期間に第２の期間が続き、第２の期間では、第２の遠心力および第２の流量がインプット組成物に適用されない。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量とはそれぞれ異なる遠心力および流量が、インプット組成物に適用される。一部の実施形態では、第２の期間中に適用される遠心力および流量は、本明細書に記載される遠心力および流量のいずれか、例えば、記載される第２の遠心力および第２の流量のいずれか、例えば、本明細書に記載される第２の遠心力の第２の流量に対する比率のいずれかでの遠心力および流量である。

【0171】

一部の実施形態では、第１の期間および第２の期間は、長さがほぼ等しい。

【0172】

一部の実施形態では、第１の期間および第２の期間は、長さが異なる。

【0173】

一部の実施形態では、第１および第２の期間は、所定の回数、繰り返される。一部の実施形態では、第１および第２の期間は、所定の時間量が経過し終えるまで繰り返される。一部の実施形態では、所定の時間量は、約５分から約１００分の間、約１０分から約９０分の間、約１５分から約８０分の間、約２０分から約７０分の間、約２５分から約６０分の間、約３０分から約５０分の間、または約３５分から約４０分の間である。

【0174】

一部の実施形態では、第１の期間は、約１分から約１０分の間、約１分から約９分の間、約１分から約８分の間、約１分から約７分の間、約１分から約６分の間、約１分から約５分の間、約１分から約４分の間、約１分から約３分の間、約１分から約２分の間、約２分から約１０分の間、約２分から約９分の間、約２分から約８分の間、約２分から約７分の間、約２分から約６分の間、約２分から約５分の間、約２分から約４分の間、約２分から約３分の間、約３分から約１０分の間、約３分から約９分の間、約３分から約８分の間、約３分から約７分の間、約３分から約６分の間、約３分から約５分の間、約３分から約４分の間、約４分から約１０分の間、約４分から約９分の間、約４分から約８分の間、約４分から約７分の間、約４分から約６分の間、約４分から約５分の間、約５分から約１０分の間、約５分から約９分の間、約５分から約８分の間、約５分から約７分の間、約５分から約６分の間、約６分から約１０分の間、約６分から約９分の間、約６分から約８分の間、約６分から約７分の間、約７分から約１０分の間、約７分から約９分の間、約７分から約８分の間、約８分から約１０分の間、約８分から約９分の間、または約９分から約１０分の間である。一部の実施形態では、第１の期間は、約１分から約１０分の間、約１分から約９分の間、約１分から約８分の間、約１分から約７分の間、約１分から約６分の間、約１分から約５分の間、約１分から約４分の間、約１分から約３分の間、または約１分から約２分の間である。一部の実施形態では、第１の期間は、約１分である。

【0175】

一部の実施形態では、第２の期間は、約１分から約１０分の間、約１分から約９分の間、約１分から約８分の間、約１分から約７分の間、約１分から約６分の間、約１分から約５分の間、約１分から約４分の間、約１分から約３分の間、約１分から約２分の間、約２分から約１０分の間、約２分から約９分の間、約２分から約８分の間、約２分から約７分の間、約２分から約６分の間、約２分から約５分の間、約２分から約４分の間、約２分から約３分の間、約３分から約１０分の間、約３分から約９分の間、約３分から約８分の間、約３分から約７分の間、約３分から約６分の間、約３分から約５分の間、約３分から約４分の間、約４分から約１０分の間、約４分から約９分の間、約４分から約８分の間、約４分から約７分の間、約４分から約６分の間、約４分から約５分の間、約５分から約１０分の間、約５分から約９分の間、約５分から約８分の間、約５分から約７分の間、約５分から約６分の間、約６分から約１０分の間、約６分から約９分の間、約６分から約８分の間、約６分から約７分の間、約７分から約１０分の間、約７分から約９分の間、約７分から約８分の間、約８分から約１０分の間、約８分から約９分の間、または約９分から約１０分の間である。一部の実施形態では、第２の期間は、約１分から約１０分の間、約１分から約９分の間、約１分から約８分の間、約１分から約７分の間、約１分から約６分の間、約１分から約５分の間、約１分から約４分の間、約１分から約３分の間、または約１分から約２分の間である。一部の実施形態では、第２の期間は、約１分である。

【0176】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，５００Ｇであり、第２の流量は、約１０ｍＬ／分であり、第２の遠心力および第２の流量は、約１分の第１の期間、インプット組成物に適用され、その後、約３００Ｇの遠心力および約１０ｍＬ／分の流量が、約１分の第２の期間、インプット組成物に適用される。一部の実施形態では、第１および第２の期間は、約３０分が経過し終えるまで繰り返される。

【0177】

一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約５ｍｌから約２０，０００ｍｌの間、約１０ｍＬから約２，０００ｍＬの間、約１５ｍＬから約１，０００ｍＬの間、約２０ｍＬから約５００ｍＬの間、約２５ｍＬから約１００ｍＬの間、または約３０ｍＬから約６０ｍＬの間の体積を含む。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約３０ｍＬから約６０ｍＬの間である。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約５ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約１０ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約１５ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約２０ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約２５ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約３０ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約３５ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約４０ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約４５ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約５０ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約５５ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約６０ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約６５ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約７０ｍｌである。一部の実施形態では、インプット組成物の体積は、約７５ｍｌである。

【0178】

用語「Ｇ」または「相対遠心力」（ＲＣＦ）は、一般に、回転軸に照らして空間内の特定の位置における、地球の重力に対する、物体または物質（例えば、回転しているチャンバーまたは他の容器内の細胞、試料またはペレットおよび／または箇所）に付与される有効力であると理解される。値は、重力、回転速度および回転の半径（回転の軸と、ＲＣＦが測定されている物体、物質または粒子からの距離）を考慮して周知の式を使用して決定され得る。

【0179】

一部の実施形態では、提供される方法から生産される細胞（本明細書では以降、「遺伝子操作されたＴ細胞」または「アウトプット組成物」とも呼ばれる）は、組換え受容体、例えばＣＡＲ、などの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターなどの、ウイルスベクターで形質導入された細胞を含む。この文脈での異種とは、ウイルスから通常は発現されない、および／またはウイルスゲノムによってコードされない、タンパク質を指す。一部の実施形態では、ウイルスベクターの宿主ゲノムへの統合は、インキュベーション後に、ウイルスベクター粒子のゲノムに含有されている核酸によってコードされる組換えタンパク質、例えば異種タンパク質、の発現レベルを測定することによって、評価することができる。組換え分子の発現レベルを評価するためのいくつかの周知の方法、例えば、親和性ベースの方法、例えば免疫親和性ベースの方法による、例えば、細胞表面タンパク質に関して、フローサイトメトリーなどによる検出を、使用することができる。一部の例では、発現は、形質導入マーカーおよび／またはレポーターコンストラクトの検出によって測定される。一部の実施形態では、切断された表面タンパク質をコードする核酸がベクター内に含められ、発現および／またはその増強のマーカーとして使用される。

【0180】

ｉ．細胞組成物
一部の実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞組成物は、ウイルスベクター粒子で、例えば、記載される方法に従って、形質導入される。一部の実施形態では、インプット組成物の細胞の濃度は、１．０×１０^５細胞／ｍＬ～１．０×１０^８細胞／ｍＬまたは約１．０×１０^５細胞／ｍＬ～約１．０×１０^８細胞／ｍＬ、例えば、少なくともまたは約少なくともまたは約１．０×１０^５細胞／ｍＬ、５×１０^５細胞／ｍＬ、１×１０^６細胞／ｍＬ、５×１０^６細胞／ｍＬ、１×１０^７細胞／ｍＬ、５×１０^７細胞／ｍＬまたは１×１０^８細胞／ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物は、約１×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約１．２５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約１．５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約１．７５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約２×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約２．２５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約２．５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約２．７５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約３×１０^６細胞／ｍＬを含む。

【0181】

一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約２０ｍＬから約３００ｍＬの間、約２５ｍＬから約２５０ｍＬの間、約３０ｍＬから約２００ｍＬの間、約３５ｍＬの間、および約１５０ｍＬの間、または約４０ｍＬから約１００ｍＬ間からなる。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約２０ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約２５ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約３０ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約３５ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約４０ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約４５ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約５０ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約５５ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約６０ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約７０ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約８０ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約１００ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約１２５ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約１５０ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約１７５ｍＬである。一部の実施形態では、細胞組成物の体積は、約２００ｍＬである。

【0182】

一部の実施形態では、細胞組成物は、総数約１×１０^８の細胞、総数約２×１０^８の細胞、総数約３×１０^８の細胞、総数約４×１０^８の細胞、総数約５×１０^８の細胞、総数約６×１０^８の細胞、総数約７×１０^８の細胞、総数約８×１０^８の細胞、総数約９×１０^８の細胞、または総数約１×１０^９の細胞を含む。

【0183】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約５μｍ～約２５μｍ、約５μｍ～約２０μｍ、約５μｍ～約１５μｍ、約５μｍ～約１０μｍ、約１０μｍ～約２５μｍ、約１０μｍ～約２０μｍ、約１０μｍ～約１５μｍ、約１５μｍ～約２５μｍ、約１５μｍ～約２０μｍ、または約２０μｍ～約２５μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。

【0184】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１０μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１２μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１４μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。

【0185】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、９μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約３μｍ～約９μｍ、約４μｍ～約９μｍ、約５μｍ～約９μｍ、約６μｍ～約９μｍ、約７μｍ～約９μｍ、または約８μｍ～約９μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する。

【0186】

一部の実施形態では、細胞組成物は、方法の適用前に凍結保存され解凍されたＴ細胞を含有する。一部の実施形態では、方法は、凍結保存細胞組成物を解凍して、Ｔ細胞を含む細胞組成物を生産することをさらに含む。

【0187】

一部の実施形態では、細胞組成物は、方法の適用前に凍結保存されても解凍されてもいないＴ細胞を含有する。

【0188】

一部の実施形態では、細胞は、提供される方法による形質導入の前にインキュベートおよび／または培養される。インキュベーション工程は、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、刺激、活性化、および／または増殖を含み得る。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物のＴ細胞を第１の遠心力および第１の流量の適用の前に刺激条件下でインキュベートすることを含む。そのような条件は、集団内の細胞の増殖、拡大、活性化および／もしくは生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するように、ならびに／または遺伝子操作のために、例えば組換え抗原受容体の導入のために、細胞を刺激するように、設計されたものを含む。条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体および細胞を活性化するように設計された任意の他の薬剤のうち１つまたは複数を含み得る。

【0189】

一部の実施形態では、細胞組成物のＴ細胞は、第１の遠心力および第１の流量の適用の前に刺激条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物のＴ細胞を、細胞組成物を遠心分離機システムに投入する前に刺激条件下でインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、細胞組成物のＴ細胞は、遠心分離機システムへの細胞組成物の投入の前に刺激条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞組成物は、活性化Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢまたはこれらの任意の組合せを発現するＴ細胞を含む。

【0190】

一部の実施形態では、刺激条件は、刺激試薬の存在を含む。一部の実施形態では、刺激試薬は、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化できる。一部の態様では、薬剤は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードを活性化または開始する。そのような薬剤としては、抗体、例えば、例えばビーズなどの固体支持体に結合した、ＴＣＲ構成要素および／もしくは共刺激受容体に対して特異的な抗体、例えば抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ならびに／または１つもしくは複数のサイトカインを挙げることができる。一部の実施形態では、刺激試薬は、ＴＣＲ複合体の１つまたは複数の構成要素の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化可能である。一部の実施形態では、刺激試薬は、（ｉ）ＴＣＲ複合体のメンバーに特異的に結合する一次薬剤；および（ｉｉ）Ｔ細胞共刺激分子に特異的に結合する二次薬剤を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、ＣＤ３に特異的に結合する。一部の実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０またはＩＣＯＳから選択される。一部の実施形態では、一次および二次薬剤の少なくとも一方は、抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、二次薬剤は、抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、またはそれを含む。適宜、拡大方法は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を培養培地に（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）添加する工程をさらに含み得る。

【0191】

一部の実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５、例えば、少なくとも約１０単位／ｍＬのＩＬ－２濃度を含む。一部の態様では、インキュベーションは、Ｒｉｄｄｅｌｌらの米国特許第６，０４０，１７７号、Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および／またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されているものなどの、技術に従って実行される。

【0192】

一部の実施形態では、刺激条件は、ヒトＴリンパ球の成長に適した温度、例えば、少なくとも摂氏約２５度、一般に少なくとも約３０度、および一般に摂氏３７度または摂氏約３７度を含む。適宜、インキュベーションは、非分裂ＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）をフィーダー細胞として添加することをさらに含み得る。ＬＣＬには約６０００～１０，０００ラドの範囲のガンマ線が照射され得る。ＬＣＬフィーダー細胞は、一部の態様では、任意の適した量で、例えば、少なくとも約１０：１のＬＣＬフィーダー細胞の最初のＴリンパ球に対する比率で提供される。

【0193】

実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞、例えば、抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブまたは抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することによって得られる。例えば、感染対象からＴ細胞を単離することおよび同じ抗原を用いてインビトロで細胞を刺激することによって、サイトメガロウイルス抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞株またはクローンを生成できる。

【0194】

一部の場合には、細胞、例えばＴ細胞、が活性化されることを必要としないウイルスベクター粒子が、使用され得る。一部のそのような例では、細胞は、活性化の前におよびまたは活性化の非存在下で、選択および／または形質導入され得る。

【0195】

一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞、例えばＴ細胞、の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くは活性化され、例えば、一部の場合には、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ４０Ｌおよび／または４－１ＢＢのうちの１つまたは複数について表面陽性である。一部の実施形態では、細胞は、第１の遠心力および第１の流量の適用の開始前に、例えば、流動床の確立前および／または形質導入の開始前に、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の存在下で、活性化剤を用いて活性化される。Ｔ細胞集団をインビトロで、外因性増殖因子の非存在下でまたは少量の外因性増殖因子で拡大する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，３５２，６９４Ｂ１号および欧州特許ＥＰ ０ ７００ ４３０ Ｂ１を参照されたい）。一般に、そのような方法は、多様な結合剤（例えば、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体）が固定化されている、１μＭを超える固相表面を利用する。例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、Ｔ細胞拡大のための市販の試薬であり、これは、ヒトＴ細胞上のＣＤ３およびＣＤ２８細胞表面分子に対する親和性精製モノクローナル抗体の混合物でコーティングされた均一な、４．５μｍ超常磁性、滅菌、非発熱性ポリスチレンビーズである。一部の実施形態では、活性化剤、例えば、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８は、磁性ビーズなどのビーズに固定化され得る。

【0196】

一部の実施形態では、細胞活性化も、ＩＬ－２（例えば、５０ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬまたは約５０ＩＵ／ｍＬ～約２００ＩＵ／ｍＬ、例えば、１００ＩＵ／ｍＬまたは約１００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で行われる。一部の実施形態では、活性化は、１時間から９６時間、１時間から７２時間、１時間から４８時間、４時間から３６時間、８時間から３０時間もしくは１２時間から２４時間の間、または約１時間から約９６時間、約１時間から約７２時間、約１時間から約４８時間、約４時間から約３６時間、約８時間から約３０時間もしくは約１２時間から約２４時間の間、例えば、少なくともまたは約少なくとも６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間または７２時間、実行される。一部の実施形態では、活性化は、２５℃より高いまたは約２５℃より高い、例えば、一般に、３２℃、３５℃もしくは３７℃より高いまたは約３２℃、約３５℃もしくは約３７℃より高い、例えば、３７℃±２℃または約３７℃±２℃の温度で、例えば、３７℃または約３７℃の温度で実行される。

【0197】

一部の実施形態では、細胞は、接触の開始前に、例えば、形質導入の開始前に、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の存在下で、活性化剤を用いて活性化されない。一部の実施形態では、細胞組成物は、複数の休止細胞を含む。一部の実施形態では、集団内のＴ細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くは、休止Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞活性化マーカー、例えば、表面マーカーもしくは細胞内サイトカインもしくは他のマーカー、を欠いているＴ細胞、および／または細胞周期のＧ０もしくはＧ１期にあるＴ細胞である。

【0198】

特定の態様では、提供される方法は、接触および／またはインキュベーションの前に活性化する必要なく、Ｔ細胞への形質導入を起こさせる。一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞を最初に、例えば形質導入の前に、活性化および／または刺激することなく、休止またはナイーブＴ細胞を含有するＴ細胞の集団にウイルスベクターで形質導入することを含む。一部のそのような実施形態では、提供される方法は、養子療法のための細胞、例えばＴ細胞、を調製するために使用することができ、Ｔ細胞を活性化および／または刺激する工程を含まない。

【0199】

一部の実施形態では、細胞は、一般に、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、典型的にはヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、血液、骨髄、リンパ、もしくはリンパ器官に由来するか、または免疫系の細胞、例えば、自然もしくは適応免疫の細胞、例えば、リンパ球、典型的にはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を含む、骨髄性もしくはリンパ系細胞である。他の例示的な細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、複能性および多能性幹細胞などの、幹細胞が挙げられる。細胞は、典型的には初代細胞、例えば、対象から直接単離されたもの、および／または対象から単離され、凍結されたものである。一部の実施形態では、細胞は、初代Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト対象からの初代Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞または他の細胞型の１つまたは複数のサブセット、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、およびその亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、拡大、再循環、局在化、および／もしくは持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器もしくは区画における存在、マーカーもしくはサイトカイン分泌プロファイル、ならびに／または分化の程度によって定義されるものを含む。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含むか、またはＣＤ３＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むか、またはＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むか、またはＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。処置されるべき対象を基準にして、細胞は、同種異系および／または自家であり得る。方法には、既成の方法も含まれる。既成の技術についてのものなどの、一部の態様では、細胞は、多能性および／または複能性、例えば、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、方法は、対象から細胞を単離すること、本明細書に記載されるように、それらを調製すること、処理すること、培養することおよび／または操作すること、ならびに凍結乾燥の前または後に、それらを同じ患者に再導入することを含む。

【0200】

Ｔ細胞のおよび／またはＣＤ４＋Ｔ細胞のおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプおよび亜集団の中には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、記憶Ｔ細胞およびそのサブタイプ、例えば、幹細胞記憶Ｔ（ＴＳＣＭ）、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）、エフェクター記憶Ｔ（ＴＥＭ）、または最終分化型エフェクター記憶Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然に存在するおよび適応制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、アルファ／ベータＴ細胞、ならびにデルタ／ガンマＴ細胞もある。

【0201】

一部の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、および／または好塩基球である。

【0202】

一部の実施形態では、細胞の調製は、１つまたは複数の培養および／または調製工程を含む。細胞は、試料、例えば、生物学的試料、例えば、対象から得られたものまたは対象に由来するものから単離され得る。一部の実施形態では、細胞が単離される対象は、疾患もしくは状態を有する者、または細胞療法を必要とする者、または細胞療法が投与されることになる者である。対象は、一部の実施形態では、細胞が単離、処理および／または操作されることになる養子細胞療法などの、特定の治療介入を必要とするヒトである。

【0203】

したがって、細胞は、一部の実施形態では、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。試料は、対象から直接採取された組織、流体および他の試料、ならびに１つまたは複数の処理工程、例えば、分離、遠心分離、遺伝子操作（例えば、ウイルスベクターでの形質導入）、洗浄および／またはインキュベーション、から得られる試料を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られる試料、または処理される試料であり得る。生物学的試料としては、これらに限定されないが、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織ならびに臓器試料が、それらに由来する処理された試料を含めて、挙げられる。

【0204】

一部の態様では、細胞が由来するかまたは単離される試料は、血液もしくは血液由来試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物に由来する。例示的試料としては、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、脾臓、他のリンパ系組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺もしくは他の臓器および／またはそれらに由来する細胞が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、ＰＢＭＣである。試料は、細胞療法、例えば、養子細胞療法の文脈では、自家および同種異系供給源からの試料を含む。

【0205】

一部の実施形態では、細胞は、細胞株、例えば、Ｔ細胞株に由来する。細胞は、一部の実施形態では、異種供給源から、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはブタから得られる。

【0206】

一部の実施形態では、細胞の単離は、１つまたは複数の調製および／または非親和性ベースの細胞分離工程を含む。一部の例では、細胞は、例えば、望ましくない構成要素を除去するために、所望の構成要素を濃縮するために、特定の試薬に対して感受性の細胞を溶解または除去するために、１つまたは複数の試薬の存在下で洗浄、遠心分離、および／またはインキュベートされる。一部の例では、細胞は、１つまたは複数の特性、例えば、密度、接着特性、サイズ、特定の構成要素に対する感受性および／または耐性に基づいて分離される。

【0207】

一部の例では、細胞は、対象の循環血液から、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、一部の態様では、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および／または血小板を含有し、一部の態様では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。

【0208】

一部の実施形態では、対象から収集された血液細胞は、例えば、血漿画分を除去するために、および細胞をその後の処理工程のための適切な緩衝液または培地に入れるために、洗浄される。一部の実施形態では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。一部の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムおよび／またはマグネシウムおよび／または多くのもしくは全ての二価カチオンを欠く。一部の態様では、洗浄工程は、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１セルプロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ）によって製造元の説明書に従って達成される。一部の態様では、洗浄工程は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製造元の説明書に従って達成される。一部の実施形態では、細胞は、洗浄後、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有のＰＢＳなどに再懸濁される。ある特定の実施形態では、血液細胞試料の構成要素は除去され、細胞は培養培地に直接再懸濁される。

【0209】

一部の実施形態では、方法は、密度ベースの細胞分離方法、例えば、赤血球の溶解およびパーコールまたはフィコール勾配による遠心分離による末梢血液からの白血球の調製を含む。

【0210】

一部の実施形態では、提供される方法を実施する前に細胞を濃縮または選択する必要がない。

【0211】

一部の実施形態では、単離方法は、細胞における１つまたは複数の特定の分子、例えば、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカーまたは核酸の発現または存在に基づく、異なる細胞型の分離を含む。一部の実施形態では、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の公知の方法が使用され得る。分離方法は、可逆的試薬系、例えば、本明細書に記載されるような薬剤（例えば、受容体結合剤または選択剤）および試薬を使用する方法を含む、本明細書に開示されるもののいずれかを含み得る。

【0212】

一部の実施形態では、分離は、親和性ベースのまたは免疫親和性ベース分離である。例えば、単離は、一部の態様では、１つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカー、の細胞の発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団の分離であって、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーション、続いて、一般に、洗浄工程および抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの抗体または結合パートナーに結合している細胞の分離による、分離を含む。

【0213】

そのような分離工程は、試薬に結合している細胞がさらなる使用のために保持されるポジティブ選択、および／または抗体もしくは結合パートナーに結合していない細胞が保持されるネガティブ選択に基づき得る。一部の例では、両方の画分がさらなる使用のために保持される。一部の態様では、不均一な集団において細胞型を特異的に識別する抗体が利用可能でない場合、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて分離が最良に実行されるようなネガティブ選択は、特に有用であり得る。

【0214】

分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の１００％濃縮または除去をもたらす必要がない。例えば、マーカーを発現するものなどの特定の型の細胞のポジティブ選択または濃縮は、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な非存在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現するものなどの特定の型の細胞のネガティブ選択、除去または枯渇は、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、全てのそのような細胞の完全な除去をもたらす必要はない。

【0215】

一部の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ３＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0216】

一部の例では、ある工程からポジティブまたはネガティブ選択された画分がその後のポジティブまたはネガティブ選択などの別の分離工程に付される、複数ラウンドの分離工程が、実行される。一部の例では、単一分離工程は、例えば、細胞を、ネガティブ選択の標的となるマーカーに対して各々特異的な複数の抗体または結合パートナーと共にインキュベートすることによって、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、種々の細胞型上に発現される複数の抗体または結合パートナーと共に細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞型を同時にポジティブに選択することができる。

【0217】

例えば、一部の態様では、１つもしくは複数の表面マーカーについて陽性の細胞または高レベルの１つもしくは複数の表面マーカー発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特定の亜集団が、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって単離される。

【0218】

例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８がコンジュゲートしている磁性ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を使用してポジティブ選択することができる。

【0219】

一部の実施形態では、単離は、ポジティブ選択による特定の細胞集団についての濃縮、またはネガティブ選択による特定の細胞集団の枯渇によって実行される。一部の実施形態では、ポジティブまたはネガティブ選択は、それぞれ、ポジティブまたはネガティブ選択された細胞上に発現されるまたは相対的に高いレベルで（マーカーｈｉｇｈ）発現される（マーカー＋）１つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する１つまたは複数の抗体または他の結合剤と共に細胞をインキュベートすることによって、達成される。

【0220】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ試料から、非Ｔ細胞、例えば、Ｂ細胞、単球、または他の白血球上に発現されるマーカー、例えばＣＤ１４、のネガティブ選択によって分離される。一部の態様では、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択工程は、ＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離するために使用される。そのようなＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団は、１つまたは複数のナイーブ、記憶および／またはエフェクターＴ細胞亜集団上に発現されるまたは相対的により高度に発現されるマーカーについてのポジティブまたはネガティブ選択によって、亜集団にさらに選別され得る。

【0221】

一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、ナイーブ、中枢記憶、エフェクター記憶および／または中枢記憶幹細胞について、例えば、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づくポジティブまたはネガティブ選択によって、さらに濃縮または枯渇される。一部の実施形態では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞についての濃縮は、有効性を増大させるために、例えば、投与後の長期間生存、拡大および／または生着を改善するために実行され、これは、一部の態様では、このような亜集団において特に頑強である。Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82；Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。一部の実施形態では、ＴＣＭが濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を組み合わせることによって、有効性がさらに増強される。

【0222】

一部の実施形態では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋サブセットとＣＤ６２Ｌ－サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣを、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋および／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分について、例えば、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体を使用して、濃縮または枯渇することができる。

【0223】

一部の実施形態では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３および／またはＣＤ１２７の陽性または高い表面発現に基づき、一部の態様では、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはグランザイムＢを発現するまたは高度に発現する細胞についてのネガティブ選択に基づく。一部の態様では、ＴＣＭ細胞について濃縮されたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、およびＣＤ６２Ｌを発現する細胞についてのポジティブ選択または濃縮によって実行される。一態様では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４発現に基づいて選択された細胞のネガティブ画分を用いて出発して実行され、この画分が、ＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡの発現に基づくネガティブ選択ならびにＣＤ６２Ｌに基づくポジティブ選択に付される。このような選択は、一部の態様では、同時に実行され、他の態様では、いずれかの順序で逐次的に実行される。一部の態様では、ＣＤ８＋細胞集団または亜集団の調製において使用される同じＣＤ４発現ベースの選択工程が、ＣＤ４＋細胞集団または亜集団を生成するためにも使用され、したがって、ＣＤ４ベースの分離から得られたポジティブ画分とネガティブ画分の両方が保持され、方法のその後の工程において、適宜、１つまたは複数のさらなるポジティブまたはネガティブ選択工程後に、使用される。

【0224】

特定の例では、ＰＢＭＣの試料または他の白血球試料がＣＤ４＋細胞の選択に付され、ネガティブ画分とポジティブ画分の両方が保持される。次いで、ネガティブ画分は、ＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ１９の発現に基づくネガティブ選択、ならびに中枢記憶Ｔ細胞に特有のマーカー、例えばＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ７、に基づくポジティブ選択に付され、ポジティブおよびネガティブ選択は、いずれかの順序で実行される。

【0225】

ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによってナイーブ、中枢記憶およびエフェクター細胞に選別される。ＣＤ４＋リンパ球は、標準方法によって得ることができる。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、中枢記憶ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋である。一部の実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ－およびＣＤ４５ＲＯ－である。

【0226】

一例では、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞について濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。一部の実施形態では、抗体または結合パートナーは、ポジティブおよび／またはネガティブ選択のための細胞の分離を可能にするために固体支持体またはマトリックス、例えば、磁性ビーズまたは常磁性ビーズに結合される。例えば、一部の実施形態では、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気）分離技術を使用して分離または単離される（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher (c) Humana Press Inc., Totowa, NJにおいて概説されている）。

【0227】

一部の態様では、分離しようとする細胞の試料または組成物は、小さい、磁化できる、または磁気的に応答性の材料、例えば、磁気的に応答性の粒子または微粒子、例えば常磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｌｂｅａｄｓまたはＭＡＣＳビーズなど）と共にインキュベートされる。磁気的に応答性の材料、例えば粒子、は一般に、分離することが所望される、例えばネガティブまたはポジティブ選択することが所望される、細胞、複数の細胞、または細胞の集団上に存在する分子、例えば表面マーカー、に特異的に結合する結合パートナー、例えば抗体に、直接的または間接的に付着される。

【0228】

一部の実施形態では、磁性粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的な結合メンバーに結合した磁気的に応答性の材料を含む。磁気分離方法において使用される多くの周知の磁気的に応答性の材料がある。適する磁性粒子としては、これにより参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄａｙの米国特許第４，４５２，７７３号におよび欧州特許明細書ＥＰ ４５２３４２ Ｂに記載されているものが挙げられる。コロイドサイズの粒子、例えば、Ｏｗｅｎの米国特許第４，７９５，６９８号およびＬｉｂｅｒｔｉらの米国特許第５，２００，０８４号に記載されるものが、他の例である。

【0229】

インキュベーションは一般に、磁性粒子もしくはビーズに付着している抗体もしくは結合パートナーまたはそのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する分子、例えば、二次抗体もしくは他の試薬が、細胞表面分子が試料内の細胞上に存在する場合、それに特異的に結合する条件下で実行される。

【0230】

一部の態様では、試料は、磁場に置かれ、磁気的に応答性のまたは磁化できる粒子が付着している細胞は、磁石に引き付けられ、非標識細胞から分離されることになる。ポジティブ選択については、磁石に引き付けられる細胞が保持され、ネガティブ選択については、引き付けられない細胞（非標識細胞）が保持される。一部の態様では、ポジティブ選択とネガティブ選択の組合せが同じ選択工程の間に実施され、ポジティブおよびネガティブ画分が保持され、さらに処理されるか、またはさらなる分離工程に付される。

【0231】

磁化できる粒子を細胞から除去するための方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、磁化できる粒子、または切断可能なリンカーにコンジュゲートした抗体などの使用を含む。一部の実施形態では、磁化できる粒子は、生分解性である。

【0232】

一部の実施形態では、親和性ベースの選択は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によるものである。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）システムは、磁化された粒子が付着している細胞の高純度選択が可能である。ある特定の実施形態では、ＭＡＣＳは、外部の磁場の適用後に非標的および標的種が逐次的に溶出される様式で作動する。つまり、磁化された粒子に付着している細胞はその場に保持されるが、付着していない種は溶出される。次いで、この第１の溶出工程が完了した後、磁場にトラップされ、溶出が妨げられた種は、それらを溶出および回収することができるような何らかのやり方で解放される。ある特定の実施形態では、非標的細胞が標識され、細胞の不均一集団から枯渇される。

【0233】

ある特定の実施形態では、単離または分離は、方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養および／または製剤化工程のうちの１つまたは複数を実行するシステム、デバイスまたは装置を使用して、実行される。一部の態様では、システムは、例えば、エラー、ユーザーによる取扱い、および／または汚染を最小にするために、閉鎖または無菌環境でこれらの工程の各々を実行するために使用される。一例では、システムは、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０７２００３、または米国特許出願公開第２０１１０００３３８０Ａ１号に記載されているようなシステムである。

【0234】

一部の実施形態では、システムまたは装置は、単離、処理、および／または製剤化工程の１つまたは複数、例えば全てを、統合もしくは内蔵システムにおいて、および／または自動化もしくはプログラム可能な方式で実行する。一部の態様では、システムまたは装置は、システムまたは装置と通信しているコンピューターおよび／またはコンピュータープログラムを含み、このコンピューターおよび／またはコンピュータープログラムによって、ユーザーが処理、単離、操作および製剤化工程をプログラムすること、制御すること、前記工程の結果を評価すること、および／または前記工程の多様な態様を調整することが可能になる。

【0235】

一部の態様では、分離および／または他の工程は、例えば、閉鎖および無菌システムにおける臨床規模レベルでの細胞の自動分離のために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｉｃ）を使用して実行される。ある特定の実施形態では、分離および／または他の工程は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実行される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムには、一部の態様では、遠心分離による細胞の自動洗浄および分画を可能にする細胞処理ユニットが装備されている。

【0236】

一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体流で運ばれるフローサイトメトリーによって収集および濃縮（または枯渇）される。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、分取スケール（ＦＡＣＳ）選別によって収集および濃縮（または枯渇）される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、ＦＡＣＳベースの検出システムと組み合わせて微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップを使用することによって収集および濃縮（または枯渇）される［例えば、ＷＯ２０１０／０３３１４０、Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573；およびGodin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376を参照されたい］。どちらの場合も、細胞は、明確に定義されたＴ細胞サブセットの高純度での単離を可能にする複数のマーカーで標識され得る。

【0237】

一部の実施形態では、調製方法は、単離、インキュベーションおよび／または遺伝子操作の前または後のいずれかに、細胞を凍結するための、例えば、凍結保存するための工程を含む。一部の実施形態では、凍結し、その後に解凍する工程によって、細胞集団中の顆粒球およびある程度まで単球が除去される。一部の実施形態では、細胞は、例えば、血漿および血小板を除去するための洗浄工程後に、凍結溶液に懸濁される。様々な公知の凍結溶液およびパラメーターのいずれかが一部の態様では使用され得る。一例は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ、または他の適する細胞凍結培地の使用を含む。次いで、これは、培地を用いてＤＭＳＯおよびＨＳＡの最終濃度がそれぞれ１０％および４％になるように１：１希釈される。次いで、細胞は、毎分１°の速度で－８０℃に凍結され、液体窒素保管タンクの蒸気相内で保管される。

【0238】

ｉｉ．ウイルスベクター粒子
一部の実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞組成物は、本明細書で提供される方法のいずれかによって、ウイルスベクター、例えば、節ＩＶに記載されるもののいずれかで、形質導入される。

【0239】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターが遠心分離機の中の組成物に投入される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子を含む組成物の体積は、約１ｍＬ、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約３ｍＬ、約４ｍＬ、約５ｍＬ、約６ｍＬ、約７ｍＬ、約８ｍＬ、約９ｍＬ、約１０ｍＬ、約１１ｍＬ、約１２ｍＬ、約１３ｍＬ、約１４ｍＬ、約１５ｍＬ、約１６ｍＬ、約１７ｍＬ、約１８ｍＬ、約１９ｍＬ、または約２０ｍＬである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターを含む組成物の体積は、約５ｍＬである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターを含む組成物の体積は、約１０ｍＬである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターを含む組成物の体積は、約１５ｍＬである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターを含む組成物の体積は、約２０ｍＬである。

【0240】

一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、ウイルスベクター粒子のコピー数またはその感染単位（ＩＵ）の、インプット組成物中の細胞の総数または形質導入される細胞の総数当たりの、ある特定の比率（ＩＵ／細胞）で提供される。例えば、一部の実施形態では、ウイルス粒子は、接触中に細胞１個当たり０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、もしくは６０ＩＵ、または約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、もしくは約６０ＩＵ、または少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、もしくは少なくとも６０ＩＵ、または少なくとも約０．５、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約もしくは少なくとも約６０ＩＵのウイルスベクター粒子で存在する。

【0241】

一部の実施形態では、形質導入は、１００未満の、例えば一般に６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、５未満のまたはそれより低い感染多重度（ＭＯＩ）で達成することができる。

【0242】

Ｂ．アウトプット組成物
一部の実施形態では、方法は、第３の遠心力および第３の流量を、遺伝子操作されたＴ細胞に適用して、遺伝子操作されたＴ細胞を含むアウトプット組成物を生産することを含む。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、細胞療法における下流の使用などのために収集または回収される。一部の実施形態では、第３の遠心力および第３の流量は、遺伝子操作されたＴ細胞に遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞への第３の遠心力および第３の流量の適用は、アウトプット組成物の収集または回収を可能にする。

【0243】

一部の実施形態では、アウトプット組成物は、カニューレ経由で収集される。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近におけるカニューレの末端に入り、円錐形の流体エンクロージャーの広端または付近におけるカニューレの末端から出る。

【0244】

一部の実施形態では、方法は、アウトプット組成物を凍結保存することを含む。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生細胞のレベルは、凍結保存されたアウトプット組成物において維持される。一部の実施形態では、方法は、凍結保存されたアウトプット組成物を解凍することを含む。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生細胞のレベルは、解凍されたアウトプット組成物において維持される。

【0245】

一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間である。

【0246】

一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約２２００Ｇから約２，８００Ｇの間、または約２，４００Ｇから約２，６００Ｇの間である。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，０００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，１００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，２００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，３００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，４００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，５００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，６００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，７００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，８００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，９００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約３，０００Ｇである。

【0247】

一部の実施形態では、第３の流量は、半径方向外向きである。一部の実施形態では、第３の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端に向けられている。一部の実施形態では、第３の遠心力および第３の流量は、同じまたは実質的に同じ方向である。

【0248】

一部の実施形態では、第３の流量は、円錐形の流体エンクロージャーを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、円錐形の流体エンクロージャーを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から出てカニューレに入る。

【0249】

一部の実施形態では、第３の流量は、約１０ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間、約１２ｍＬ／分から約２８ｍＬ／分の間、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間、または約１８ｍＬ／分から約２２ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１６ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１７ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１９ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２１ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２２ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２３ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２４ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２５ｍＬ／分である。

【0250】

一部の実施形態では、第３の流量は、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第３の遠心力は、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第３の流量は、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間である。

【0251】

一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１００から約１５０の間、約１１０から１４０の間、または約１２０から１３０の間である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１００である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１０５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１１０である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１１５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１２０である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１２５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１３０である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１３５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１４０である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１４５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１５０である。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，５００Ｇであり、第３の流量は、約２０ｍＬ／分である。

【0252】

一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１００から約１５０の間である。

【0253】

一部の実施形態では、方法は、アウトプット組成物の細胞を凍結保存して、凍結保存組成物を作出することを含む。一部の実施形態では、凍結保存は、凍結保護剤を含む培地に細胞を懸濁させること、および細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、凍結することは、速度制御フリーザーにおいてである。一部の実施形態では、方法は、凍結保存細胞組成物を解凍することを含む。一部の実施形態では、方法は、解凍された細胞を製剤化して薬物製品としての投与のための細胞組成物を作製することを含む。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が少なくとも１日間凍結された後に行われる。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が少なくとも２日間凍結された後に行われる。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が少なくとも３日間凍結された後に行われる。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が少なくとも１週間、１０日間、２週間、または１カ月間凍結された後に行われる。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が最大１０日間、２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、または６カ月間凍結された後に行われる。

【0254】

Ｃ．他の処理工程
一部の実施形態では、細胞操作に関連してなどの、形質導入のための処理工程は、細胞の洗浄、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、刺激、活性化、増殖および／または製剤化をさらに含み得る。一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、アウトプット組成物として収集される前に１つまたは複数の洗浄工程に付される。一部の実施形態では、収集されたアウトプット組成物は、刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。このような条件は、集団中の細胞の増殖、拡大、活性化および／もしくは生存を誘導するように、ならびに／または抗原曝露を模倣するように、設計されたものを含む。刺激は、対象への投与後にエクスビボまたはインビボで実行され得る。

【0255】

ｉ．洗浄
一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞への第３の遠心力および第３の流量の適用の前に、方法は、遺伝子操作された細胞を１つまたは複数の洗浄工程に付すことを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、生存不能な細胞を除去する。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、不純物（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、細胞残屑、試薬）を除去する。

【0256】

一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、約５００Ｇから約３，０００Ｇの間の遠心力を適用することを含む。一部の実施形態では、遠心力は、約５００Ｇである。一部の実施形態では、遠心力は、約１，０００Ｇである。一部の実施形態では、遠心力は、約１，５００Ｇである。一部の実施形態では、遠心力は、約２，０００Ｇである。一部の実施形態では、遠心力は、約２，５００Ｇである。一部の実施形態では、遠心力は、約３，０００Ｇである。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、約２０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の流量を適用することを含む。一部の実施形態では、流量は、約２０ｍＬ／分、約３０ｍＬ／分、約４０ｍＬ／分、約５０ｍＬ／分、約６０ｍＬ／分、約７０ｍＬ／分、約８０ｍＬ／分、約９０ｍＬ／分、または約１００ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約３０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約３５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約４０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約４５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約５０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約５５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約６０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約６５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約７０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約７５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約８０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約８５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、流量は、約９０ｍＬ／分である。

【0257】

一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、遠心力（Ｇ）および流量（ＦＲ）を約２０Ｇ／ＦＲから約８０Ｇ／ＦＲの間の比率で適用することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、または約７５のＧ／Ｆ比率を適用することを含む。一部の実施形態では。一部の実施形態では、Ｇ／ＦＲ比率は、約６２．５Ｇ／ＦＲである。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、約２，５００Ｇの遠心力および約４０ｍＬ／分の流量を適用することを含む。一部の実施形態では、Ｇ／ＦＲ比率は、約３３．３Ｇ／ＦＲである。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、約２，５００Ｇの遠心力および約７５ｍＬ／分の流量を適用することを含む。一部の実施形態では、Ｇ／ＦＲ比率は、約３５Ｇ／ＦＲである。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、約１，０００Ｇの遠心力および約２８．５ｍＬ／分の流量を適用することを含む。

【0258】

一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、１つまたは複数の洗浄工程の前に遠心分離機内の培地に懸濁される。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、培地交換を含む。したがって、一部の態様では、培地は、１つまたは複数の洗浄工程中に異なる溶液に交換される。一部の態様では、生存不能な細胞は、１つまたは複数の洗浄工程中に水簸される。一部の態様では、生存不能な細胞は、１つまたは複数の洗浄工程中に廃棄物画分として収集される。一部の態様では、細胞組成物の細胞は、１つまたは複数の洗浄工程中に形質導入される。したがって、一部の実施形態では、細胞組成物の細胞は、同時に、形質導入されかつ洗浄される。

【0259】

ｉｉ．細胞の形質導入後の活性化および／または拡大
一部の実施形態では、細胞、例えば、収集されたアウトプット組成物は、遺伝子操作に関連して、さらにインキュベートおよび／またはさらに培養される。インキュベーション工程は、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、刺激、活性化、および／または増殖を含み得る。一部のそのような実施形態では、さらなるインキュベーションは、１つまたは複数の細胞の宿主ゲノムへのウイルスベクターの組込みをもたらす条件下で行われる。インキュベーションおよび／または操作は、培養または細胞培養のためのユニット、チャンバー、ウェル、カラム、管、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、または他の容器などの培養容器で実施され得る。一部の実施形態では、組成物または細胞は、刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。そのような条件には、集団での細胞の増殖、拡大、活性化、および／もしくは生存を誘導する、抗原曝露を模倣する、ならびに／または組換え抗原受容体の導入などの遺伝子操作のためにプライムするように設計された条件が挙げられる。

【0260】

一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、室温を超える、例えば２５℃を超えるまたは約２５℃を超える、例えば一般に約３２℃、３５℃もしくは３７℃を超えるまたは約３２℃、約３５℃もしくは約３７℃を超える温度で実施される。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、３７℃±２℃または約３７℃±２℃の温度、例えば３７℃または約３７℃の温度で行われる。

【0261】

一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、細胞の刺激および／または活性化のための条件下で行われ、該条件には、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、剤、例えば、栄養分、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の薬剤のうちの１つまたは複数を挙げることができる。

【0262】

一部の実施形態では、刺激条件または刺激剤には、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる１つまたは複数の剤（例えば、刺激剤および／または補助剤）、例えばリガンドが挙げられる。一部の態様では、一次シグナルをデリバリーする、例えば、ＩＴＡＭ誘導シグナルの活性化を開始するのに適した剤、例えばＴＣＲ成分に特異的なもの、および／または共刺激シグナルを促進する剤、例えばＴ細胞共刺激受容体に特異的なもの、例えば、例えばビーズなどの固体支持体に適宜結合された抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、もしくは抗４１－ＢＢ、および／または１つもしくは複数のサイトカインなどの剤は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードを活性化または開始する。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ［例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ、および／またはＥｘｐＡＣＴ（登録商標）ビーズ］は、刺激剤の中の１つである。適宜、拡大方法は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を培養培地に添加する工程をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５、例えば、少なくとも約１０単位／ｍＬのＩＬ－２濃度を含む。

【0263】

一部の実施形態では、刺激条件または刺激剤には、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる１つまたは複数の剤、例えばリガンドが挙げられる。一部の態様では、剤は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードを活性化または開始する。そのような剤には、抗体、例えば、例えばビーズなどの固体支持体に結合した、ＴＣＲ成分および／もしくは共刺激受容体に特異的な抗体、例えば抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ならびに／または１つもしくは複数のサイトカインを挙げることができる。適宜拡大方法は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を培養培地に添加する工程（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５、例えば、少なくとも約１０単位／ｍＬ、少なくとも約５０単位／ｍＬ、少なくとも約１００単位／ｍＬまたは少なくとも約２００単位／ｍＬのＩＬ－２濃度を含む。

【0264】

条件には、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、剤、例えば、栄養分、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の剤のうちの１つまたは複数を挙げることができる。

【0265】

一部の態様では、インキュベーションは、Ｒｉｄｄｅｌｌらの米国特許第６，０４０，１ ７７号、Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および／またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9): 689-701に記載されているものなどの手法に従って実施される。

【0266】

一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、遠心分離機において実行される。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、回転も遠心分離も伴わずに実行され、一般に、アウトプット組成物の収集の後に行われる。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、クロマトグラフィーマトリックスの外側などの固定相の外側で、例えば、溶液中で実行される。

【0267】

一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、遠心分離後の異なる容器または装置への細胞、例えば収集されたアウトプット組成物、の移送、例えば自動移送などによって、接触が行われたものとは異なる容器または装置において実行される。

【0268】

一部の実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、培養開始組成物にフィーダー細胞、例えば、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を添加すること（例えば、得られる細胞の集団が、拡大されることになる最初の集団中の各Ｔリンパ球について少なくとも約５、１０、２０または４０もしくはそれより多いＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）；および培養物をインキュベートすること（例えば、Ｔ細胞の数を拡大するのに十分な時間）によって拡大される。一部の態様では、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ線照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を含み得る。一部の実施形態では、細胞分裂を防ぐために約３０００～３６００ラドの範囲のガンマ線がＰＢＭＣに照射される。一部の態様では、フィーダー細胞は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の添加の前に培養培地に添加される。

【0269】

一部の実施形態では、刺激条件は、ヒトＴリンパ球の成長に適した温度、例えば、少なくとも摂氏約２５度、一般に少なくとも約３０度、および一般に摂氏３７度または摂氏約３７度を含む。適宜、インキュベーションは、フィーダー細胞として非分裂ウイルス形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を添加することをさらに含むことがあり、例えば、ウイルスは、ＥＢＶ、ＣＭＶ、またはインフルエンザであり得、形質転換ＬＣＬは、それらの表面にウイルス由来の抗原を、適宜、ＭＨＣに関連して、提示する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ウイルス抗原を認識するＴＣＲを発現する。一部の実施形態では、ウイルス抗原は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、またはインフルエンザからのものであり得る。ＬＣＬは、約６０００～１０，０００ラドの範囲のガンマ線を照射され得る。ＬＣＬフィーダー細胞は、一部の態様では、任意の適した量で、例えば、約１０：１のＬＣＬフィーダー細胞の最初のＴリンパ球に対する比率で提供される。

【0270】

一部の実施形態では、例えばエクスビボ拡大を促進するためのさらなる培養またはインキュベーションは、２４時間超、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、８日超、９日超、１０日超、１１日超、１２日超、１３日超、１４日超もしくは１５日超、または約２４時間超、約２日超、約３日超、約４日超、約５日超、約６日超、約７日超、約８日超、約９日超、約１０日超、約１１日超、約１２日超、約１３日超、約１４日超もしくは約１５日超にわたって実施される。一部の実施形態では、さらなる培養またはインキュベーションは、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下、２日以下または２４時間以下にわたって実施される。

【0271】

一部の実施形態では、例えば刺激剤とのインキュベーションの合計持続時間は、１時間～９６時間、１時間～７２時間、１時間～４８時間、４時間～３６時間、８時間～３０時間もしくは１２時間～２４時間、または約１時間～約９６時間、約１時間～約７２時間、約１時間～約４８時間、約４時間～約３６時間、約８時間～約３０時間もしくは約１２時間～約２４時間、例えば少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間もしくは少なくとも７２時間、または約少なくとも６時間、約少なくとも１２時間、約少なくとも１８時間、約少なくとも２４時間、約少なくとも３６時間もしくは約少なくとも７２時間である。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、１時間以上４８時間以下、４時間以上３６時間以下、８時間以上３０時間以下もしくは１２時間以上２４時間以下、または約１時間以上約４８時間以下、約４時間以上約３６時間以下、約８時間以上約３０時間以下もしくは約１２時間以上約２４時間以下の時間にわたる。

【0272】

一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、さらなる培養またはインキュベーションを含まない、例えば、エクスビボ拡大工程を含まないか、または実質的により短いエクスビボ拡大工程を含む。

【0273】

一部の実施形態では、細胞を操作する全プロセス、例えば、選択および／または濃縮、形質導入に関連したインキュベーション、および／またはさらなる培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）もしくは培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）は、対照から細胞を得た後、９日より長い、８日以下、７日以下、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下、２日以下または１日以下の期間内に実行される。そのようなタイミングは、細胞が凍結保存に付されるいずれの期間も含まないことは理解される。

【0274】

本明細書で提供される方法の一部の実施形態では、操作された細胞、例えば、アウトプット組成物または製剤化された組成物は、有意なエクスビボ拡大を行わずに、形質導入の直後にまたは形質導入後間もなく対象に投与される。一部の実施形態では、操作された細胞は、形質導入工程の直後に投与され得る。一部の実施形態では、操作された細胞は、例えば、有意なエクスビボ拡大を行わずに、または有意なインビトロ活性化、拡大および／もしくは濃縮を必要とし得る従来の方法におけるエクスビボ拡大より実質的に短いエクスビボ拡大を行って、形質導入工程後間もなく投与され得る。例えば、本明細書で提供される方法の一部の実施形態では、操作された細胞は、形質導入から３、２または１日以内に投与され得る。一部の実施形態では、操作された細胞は、形質導入工程から４８、３６、２４、２０、１６、１２、８、４、２、１またはそれより短い時間以内に投与され得る。一部の実施形態では、操作された細胞は、従来の方法より実質的に短いインビトロ拡大、例えば、４８、３６、２４、２０、１６、１２、８、４、２、１またはそれより短い時間のインビトロ拡大に付される。

【0275】

そのような実施形態のいずれかでは、細胞の拡大および／または活性化、例えば、細胞の投与後の対象の体内での操作された細胞の拡大が、抗原への曝露後にインビボで生じ得る。一部の実施形態では、インビボ拡大の程度、度合いまたは大きさを、投与される細胞、例えば組換え受容体発現細胞、の拡大、増殖、生存および／または有効性をモジュレートすることができる、例えば増大させることができる、様々な方法によって、さらに増すことができるか、ブーストすることができるか、または増強することができる。

【0276】

一部の実施形態では、そのような方法は、分子の発現または活性を変更する（例えば、増加または減少させる）ための薬剤、例えば、核酸を用いてさらに改変される操作された細胞の投与を含む方法であって、そのような変更された発現または活性が、投与される細胞の拡大、増殖、生存および／または有効性を増す、ブーストするまたは増強する、方法を含む。一部の実施形態では、薬剤、例えば核酸、の発現は、誘導物質または他のモジュレ－ティング分子の投与などによって誘導可能である、抑制可能である、調節可能である、および／またはユーザーによって制御される。

【0277】

一部の実施形態では、そのような方法は、投与される細胞、例えば組換え受容体発現細胞、の拡大、増殖、生存および／または有効性を増すことができるかブーストすることができるかまたは増強することができる薬物または薬剤との併用投与、例えば同時または逐次投与、を含む方法を含む。

【0278】

ｉｉｉ．製剤化
一部の実施形態では、さらなるインキュベーションの後、細胞を調製するためのプロセスは、細胞を製剤化することをさらに含み得る。したがって、処理工程には、上記の組成物を製剤化することも含まれ得る。

【0279】

上記の方法における使用のための医薬組成物または医薬品製剤であって、一部の実施形態では、提供される処理方法に関連して、例えば、他の処理工程が実行される閉鎖されたシステムにおいて、例えば、自動化されたまたは部分的に自動化された方式で製剤化される、医薬組成物または医薬品製剤も、提供される。

【0280】

一部の実施形態では、細胞および組成物は、細胞または細胞集団と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む組成物などの、医薬組成物または医薬品製剤の形態で、対象に投与される。

【0281】

用語「医薬品製剤」とは、その中に含有される有効成分の生物活性を有効にさせるような形態にあり、製剤が投与される対象にとって容認しがたい毒性となる追加の成分を含有しない調製物を指す。

【0282】

医薬組成物は、一部の実施形態では、他の薬学的に活性な薬剤または薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどをさらに含む。一部の実施形態では、薬剤は、塩、例えば薬学的に許容される塩、の形態で投与される。適する薬学的に許容される酸付加塩としては、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、および硫酸、ならびに有機酸、例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホ難、例えばｐ－トルエンスルホン酸、から誘導されるものが挙げられる。

【0283】

「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性の、有効成分以外の医薬品製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存料が挙げられるが、これらに限定されない。

【0284】

一部の態様では、担体の選択は、一部には特定の細胞および／または投与の方法によって決定される。したがって、様々な適切な製剤がある。例えば、医薬組成物は保存料を含んでもよい。適切な保存料には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが挙げられ得る。一部の態様では、２つまたはそれより多い保存料の混合物が使用される。保存料またはその混合物は、典型的には、組成物全体の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。担体は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量および濃度ではレシピエントにとって非毒性であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。

【0285】

一部の態様では緩衝剤が組成物に含まれる。適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、および様々な他の酸および塩が挙げられる。一部の態様では、２つまたはそれより多い緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には組成物全体の約０．００１％～約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製する方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21^st ed. (May 1, 2005)により詳細に記載されている。

【0286】

製剤は、水溶液を含み得る。製剤または組成物は、細胞で処置される特定の適応症、疾患または状態に有用な１つより多くの有効成分、好ましくは、細胞を補完する活性を有する有効成分であって、それぞれの活性が互いに悪影響を及ぼさない、有効成分も含有し得る。そのような有効成分は、意図された目的に有効である量で組み合わせて適切に存在する。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は、他の薬学的に活性な薬剤または薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および／またはビンクリスチンをさらに含む。

【0287】

医薬組成物は一部の実施形態では、疾患または状態を処置または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で細胞を含有する。治療的有効性または予防的有効性は一部の実施形態では、処置された対象の定期的な評価によってモニタリングされる。所望の投与量を、細胞の単回ボーラス投与によって、細胞の複数回ボーラス投与によって、または細胞の連続注入投与によってデリバリーすることができる。

【0288】

製剤は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺内、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、または坐薬投与用のものを含む。一部の実施形態では、細胞集団は非経口投与される。用語「非経口」は本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内、および腹腔内投与を含む。一部の実施形態では、細胞は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身デリバリーを使用して対象に投与される。

【0289】

一部の実施形態における組成物は、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供され、該調製物は、一部の態様では選択されたｐＨに緩衝され得る。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製するのが容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに幾分より便利である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらす適切な粘度範囲内で製剤化され得る。液体組成物または粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。

【0290】

滅菌注射用溶液は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等などの適切な担体、希釈液、または賦形剤との混合物などの溶媒に、細胞を組み込むことによって調製することができる。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘性増強添加物、保存料、香味剤、および／または着色料などの補助物質を含有することができる。一部の態様では、適切な調製物を調製するのに標準的なテキストが調べられてもよい。

【0291】

抗菌保存料、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加物が添加され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって確保することができる。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。

【0292】

インビボ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過によって容易に達成され得る。

【0293】

Ｄ．アウトプット組成物の例示的な特徴
一部の実施形態では、アウトプット組成物（例えば、収集されるアウトプット組成物）の体積は、約１ｍｌから約２０，０００ｍｌの間、約５ｍＬから約２，０００ｍＬの間、約１０ｍＬから約１，０００ｍＬの間、約１５ｍＬから約５００ｍＬの間、または約２０ｍＬから約１００ｍＬの間からなる。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約１ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬ、約４０ｍＬ、約４５ｍＬ、約５０ｍＬ、約５５ｍＬ、約６０ｍＬ、約６５ｍＬ、約７０ｍＬ、約７５ｍＬ、約８０ｍＬ、約８５ｍＬ、約９０ｍＬ、約９５ｍＬ、または約１００ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約１ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約５ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約１０ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約１５ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約２０ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約２５ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約３０ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約３５ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約４０ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約４５ｍＬである。一部の実施形態では、アウトプット組成物の体積は、約５０ｍＬである。

【0294】

一部の実施形態では、アウトプット組成物は、細胞組成物またはインプット組成物より大きいパーセンテージの生存可能なＴ細胞を含む。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、細胞組成物より大きいパーセンテージの生存可能なＴ細胞を含む。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、または少なくとも約２５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約１０％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約１５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約２０％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約２５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約３０％大きい。

【0295】

一部の実施形態では、アウトプット組成物は、インプット組成物より大きいパーセンテージの生存可能なＴ細胞を含む。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、または少なくとも約２５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約１０％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約１５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約２０％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約２５％大きい。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、インプット組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約３０％大きい。

【0296】

特定の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％の生細胞を含有する。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも７５％または少なくとも約７５％の生細胞を含有する。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％の生細胞を含有する。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％の生存可能なＣＤ３＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも７５％または少なくとも約７５％の生存可能なＣＤ３＋Ｔ細胞を含有する。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％の生存可能なＣＤ３＋Ｔ細胞を含有する。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％の生存可能なＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも７５％または少なくとも約７５％の生存可能なＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％の生存可能なＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％の生存可能なＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも７５％または少なくとも約７５％の生存可能なＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物は、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％の生存可能なＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。

【0297】

特定の実施形態では、アウトプット細胞は、アポトーシスを遂げることになる細胞ならびに／または調製され、刺激され、および／もしくはアポトーシスに入ることになる細胞の割合および／または頻度が低い。特定の実施形態では、アウトプット細胞は、アポトーシスマーカーについて陽性である細胞の割合および／または頻度が低い。一部の実施形態では、アウトプット組成物の細胞の４０％もしくは約４０％未満、３５％もしくは約３５％未満、３０％もしくは約３０％未満、２５％もしくは約２５％未満、２０％もしくは約２０％未満、１５％もしくは約１５％未満、１０％もしくは約１０％未満、５％もしくは約５％未満、または１％もしくは約１％未満は、アポトーシスマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスマーカーについて陽性である。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の細胞の２５％または約２５％未満は、アポトーシスのマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスのマーカーについて陽性である。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の１０％未満または約１０％未満の細胞は、アポトーシスマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスマーカーについて陽性である。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の５％未満または約５％未満の細胞は、アポトーシスマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスマーカーについて陽性である。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の１％未満または約１％未満の細胞は、アポトーシスマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスマーカーについて陽性である。

【0298】

特定の実施形態では、アウトプット組成物は、ＣＤ３＋Ｔ細胞について濃縮された細胞の組成物である。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の全細胞の少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９８．５％、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９９．５％、少なくとももしくは約９９．９％、１００％、または約１００％は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の全細胞の少なくとももしくは約８６％、少なくとももしくは約８６．５％、少なくとももしくは約８７％、少なくとももしくは約８７．５％、少なくとももしくは約８８％、少なくとももしくは約８８．５％、少なくとももしくは約８９％、少なくとももしくは約８９．５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９０．５％、少なくとももしくは約９１％、少なくとももしくは約９１．５％、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９２．５％、少なくとももしくは約９３％、少なくとももしくは約９３．５％、少なくとももしくは約９４％、少なくとももしくは約９４．５％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９５．５％、少なくとももしくは約９６％、少なくとももしくは約９６．５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９７．５％、少なくとももしくは約９８％、または少なくとももしくは約９８．５％は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の全細胞の約８０％から約１００％の間、約８５％から約９８％の間、約８８％から約９６％の間、または約９０％から約９４％の間は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、ＣＤ３＋Ｔ細胞から本質的になる。一部の実施形態では、アウトプット組成物中の全細胞の少なくともまたは約９０％は、ＣＤ３＋Ｔ細胞であり、アウトプット組成物中の全細胞の少なくともまたは約４０％は、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する。

【0299】

ある特定の実施形態では、アウトプット組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮された細胞の組成物である。特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、アウトプット組成物中の全細胞の少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９８．５％、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９９．５％、少なくとももしくは約９９．９％、１００％、または約１００％を占める。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、アウトプット組成物中の全細胞の少なくとももしくは約８６％、少なくとももしくは約８６．５％、少なくとももしくは約８７％、少なくとももしくは約８７．５％、少なくとももしくは約８８％、少なくとももしくは約８８．５％、少なくとももしくは約８９％、少なくとももしくは約８９．５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９０．５％、少なくとももしくは約９１％、少なくとももしくは約９１．５％、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９２．５％、少なくとももしくは約９３％、少なくとももしくは約９３．５％、少なくとももしくは約９４％、少なくとももしくは約９４．５％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９５．５％、少なくとももしくは約９６％、少なくとももしくは約９６．５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９７．５％、少なくとももしくは約９８％、または少なくとももしくは約９８．５％を占める。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、アウトプット組成物中の全細胞の約８０％から約１００％の間、約８５％から約９８％の間、約８８％から約９６％の間、または約９０％から約９４％の間を占める。一部の実施形態では、アウトプット組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞から本質的になる。

【0300】

特定の実施形態では、アウトプット組成物は、１０％から９０％もしくは約１０％から約９０％の間、２０％から８０％もしくは約２０％から約８０％の間、２５％から７５％もしくは約２５％から約７５％の間、３０％から７０％もしくは約３０％から約７０％の間、３５％から６５％もしくは約３５％から約６５％の間、４０％から６０％もしくは約４０％から約６０％の間、５５％から４５％もしくは約５５％から約４５％の間、または約５０％もしくは５０％のＣＤ４＋Ｔ細胞、および１０％から９０％もしくは約１０％から約９０％の間、２０％から８０％もしくは約２０％から約８０％の間、２５％から７５％もしくは約２５％から約７５％の間、３０％から７０％もしくは約３０％から約７０％の間、３５％から６５％もしくは約３５％から約６５％の間、４０％から６０％もしくは約４０％から約６０％の間、５５％から４５％もしくは約５５％から約４５％の間、または約５０％もしくは５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物は、３５％から６５％もしくは約３５％から約６５％の間、４０％から６０％もしくは約４０％から約６０％の間、５５％から４５％もしくは約５５％から約４５％の間、または約５０％もしくは５０％のＣＤ４＋Ｔ細胞、および３５％から６５％もしくは約３５％から約６５％の間、４０％から６０％もしくは約４０％から約６０％の間、５５％から４５％もしくは約５５％から約４５％の間、または約５０％もしくは５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、アウトプットは、３５％から６５％または約３５％から約６５％の間のＣＤ４＋Ｔ細胞、および３５％から６５％または約３５％から約６５％の間のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、アウトプット組成物は、３：１から１：３の間、２．５：１から１：２．５の間、２：１から１：２の間、１．５：１から１：１．５の間、１．４：１から１：１．４の間、１．３：１から１：１．３の間、１．２：１から１：１．２の間、または１．１：１から１：１．１の間の、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比率を含有する。一部の実施形態では、細胞の組成物は、３：１のもしくは約３：１の、２．８：１のもしくは約２．８：１の、２．５：１のもしくは約２．５：１の、２．２５：１のもしくは約２．２５：１の、２：１のもしくは約２：１の、１．８：１のもしくは約１．８：１の、１．７：１のもしくは約１．７：１の、１．６：１のもしくは約１．６：１の、１．５：１のもしくは約１．５：１の、１．４：１のもしくは約１．４：１の、１．３：１のもしくは約１．３：１の、１．２：１のもしくは約１．２：１の、１．１：１のもしくは約１．１：１の、１：１のもしくは約１：１の、１：１．１のもしくは約１：１．１の、１：１．２のもしくは約１：１．２の、１：１．３のもしくは約１：１．３の、１：１．４のもしくは約１：１．４の、１：１．５のもしくは約１：１．５の、１：１．６のもしくは約１：１．６の、１：１．７のもしくは約１：１．７の、１：１．８のもしくは約１：１．８の、１：２のもしくは約１：２の、１：２．２５のもしくは約１：２．２５の、１：２．５のもしくは約１：２．５の、１：２．８のもしくは約１：２．８の、または１：３のもしくは約１：３の、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比率を有する。

【0301】

一部の実施形態では、アウトプット組成物は、３：１から１：３の間、２．５：１から１：２．５の間、２：１から１：２の間、１．５：１から１：１．５の間、１．４：１から１：１．４の間、１．３：１から１：１．３の間、１．２：１から１：１．２の間、または１．１：１から１：１．１の間の、組換え受容体、例えばＣＡＲ、を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の、組換え受容体、例えばＣＡＲ、を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比率を含有する。一部の実施形態では、アウトプット組成物における、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の、組換え受容体（例えばＣＡＲ）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比率は、３：１のもしくは約３：１の、２．８：１のもしくは約２．８：１の、２．５：１のもしくは約２．５：１の、２．２５：１のもしくは約２．２５：１の、２：１のもしくは約２：１の、１．８：１のもしくは約１．８：１の、１．７：１のもしくは約１．７：１の、１．６：１のもしくは約１．６：１の、１．５：１のもしくは約１．５：１の、１．４：１のもしくは約１．４：１の、１．３：１のもしくは約１．３：１の、１．２：１のもしくは約１．２：１の、１．１：１のもしくは約１．１：１の、１：１のもしくは約１：１の、１：１．１のもしくは約１：１．１の、１：１．２のもしくは約１：１．２の、１：１．３のもしくは約１：１．３の、１：１．４のもしくは約１：１．４の、１：１．５のもしくは約１：１．５の、１：１．６のもしくは約１：１．６の、１：１．７のもしくは約１：１．７の、１：１．８のもしくは約１：１．８の、１：２のもしくは約１：２の、１：２．２５のもしくは約１：２．２５の、１：２．５のもしくは約１：２．５の、１：２．８のもしくは約１：２．８の、または１：３のもしくは約１：３の比率である。

【0302】

一部の実施形態では、提供される方法に関連して生成または生産されるアウトプット組成物は、組換え受容体、例えばＴＣＲまたはＣＡＲ、を発現する細胞を含有する。一部の実施形態では、組換え受容体を発現することは、細胞膜および／もしくは細胞表面に局在する１つもしくは複数の組換え受容体タンパク質を有すること、検出可能な量の組換え受容体タンパク質を有すること、組換え受容体をコードする検出可能な量のｍＲＮＡを有すること、組換え受容体をコードする組換えポリヌクレオチドを有することもしくは含有すること、ならびに／または組換え受容体発現についてのサロゲートマーカーであるｍＲＮＡもしくはタンパク質を有することもしくは含有することを含み得るが、これらに限定されない。

【0303】

一部の実施形態では、アウトプット組成物の細胞の少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または約９９％より多くは、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または約９９％より多くは、組換え受容体を発現する。一部の実施形態では、アウトプット組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の細胞の少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または約９９％より多くは、組換え受容体を発現するＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、アウトプット組成物の細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現するＣＤ３＋Ｔ細胞である。

【0304】

特定の実施形態では、アウトプット組成物のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または約９９％より多くは、組換え受容体を発現する。特定の実施形態では、アウトプット組成物のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現する。一部の実施形態では、アウトプット組成物のＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または約９９％より多くは、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物のＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現する。

【0305】

特定の実施形態では、アウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、アウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、アウトプット組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。特定の実施形態では、アウトプット組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、アウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。特定の実施形態では、アウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。

【0306】

特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の、平均で、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の、平均で、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の、平均で、少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の、平均で、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の、平均で、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の平均で少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の、平均で、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の、平均で、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の、平均で、少なくとも９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。

【0307】

前記実施形態のいずれかでは、本明細書で開示される方法によって生産される複数のアウトプット組成物は、同じまたは異なるドナーに由来し得る。一部の態様では、複数のアウトプット組成物のうちの少なくとも２つは、異なるドナーに由来する。一部の態様では、複数のアウトプット組成物の各々は、いくつかの異なるドナーのうちの１つに由来し、例えば、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、または約６０より多くの異なるドナー、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法などの細胞療法を必要とする患者に由来する。

【0308】

特定の実施形態では、アウトプット組成物の細胞の大部分は、ナイーブもしくはナイーブ様細胞、中枢記憶細胞、および／またはエフェクター記憶細胞である。特定の実施形態では、アウトプット組成物の細胞の大部分は、ナイーブ様細胞または中枢記憶細胞である。一部の実施形態では、アウトプット組成物の細胞の大部分は、中枢記憶細胞である。一部の態様では、より分化度の低い細胞、例えば、中枢記憶細胞は、より長寿命であり、あまり急速に疲弊せず、そのため持続性および耐久性が増大される。一部の態様では、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法などの細胞療法の奏効者は、中枢記憶遺伝子の発現増加を有する。例えば、Fraietta et al. (2018) Nat Med. 24(5):563-571を参照されたい。

【0309】

ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の細胞は、ナイーブ様Ｔ細胞、またはナイーブ様Ｔ細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるＴ細胞の、割合および／または頻度が高い。ある特定の実施形態では、アウトプット組成物の細胞は、代替プロセス、例えば、拡大を含むプロセス（例えば、拡大ユニット作動を含む、および／または細胞の拡大を引き起こすことを目的とする工程を含む、プロセス）から生成されるアウトプット組成物よりナイーブ様細胞の割合および／または頻度が大きい。ある特定の実施形態では、ナイーブ様Ｔ細胞は、種々の分化状態の細胞を含み得、ある特定の細胞マーカーの陽性もしくは高発現（例えば、表面発現もしくは細胞内発現）および／または他の細胞マーカーの陰性もしくは低発現（例えば、表面発現もしくは細胞内発現）を特徴とし得る。一部の態様では、ナイーブ様Ｔ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、および／またはＣＤ２７の陽性または高発現を特徴とする。一部の態様では、ナイーブ様Ｔ細胞は、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、および／またはＫＬＲＧ１の陰性発現を特徴とする。一部の態様では、ナイーブ様Ｔ細胞は、ＣＤ９５の低発現を特徴とする。ある特定の実施形態では、ナイーブ様Ｔ細胞、またはナイーブ様Ｔ細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるＴ細胞は、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋であり、これらの細胞は、ＣＤ２７＋またはＣＤ２７－である。ある特定の実施形態では、ナイーブ様Ｔ細胞、またはナイーブ様Ｔ細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるＴ細胞は、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋であり、これらの細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋またはＣＤ４５ＲＡ－である。ある特定の実施形態では、ナイーブ様Ｔ細胞、またはナイーブ様Ｔ細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ－ＣＣＲ７＋である。

【0310】

ＩＩ．生細胞を濃縮する方法
遠心分離機システムにおいて細胞組成物（例えば、操作された細胞組成物）を生細胞について濃縮するための方法が提供される。一部の実施形態では、遠心分離機システムは、逆遠心分離機システムとしても公知の、連続向流水簸（「ＣＣＥ」）遠心分離機システムである。一部の実施形態では、生産される細胞は、例えば養子細胞療法における、自家または同種移植のために調製される初代細胞などの、細胞療法における使用のための細胞である。方法は、追加の細胞処理工程、例えば、細胞洗浄、単離、分離、収集、製剤化、または細胞組成物の生産に関連する他の工程を含み得る。

【0311】

細胞組成物を生細胞について濃縮する方法であって、（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含む、生産すること；ならびに（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を細胞組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路でインプット組成物の細胞を再循環させ、それによって、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成することを含む、方法も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物（例えば、操作された細胞組成物）を遠心分離機システムに投入することを含み、投入することは、（ａ）における適用の少なくとも一部分の前および／または間に実施される。

【0312】

一部の実施形態では、遠心分離機システムは、円錐形の流体エンクロージャー内にカニューレを含む。一部の実施形態では、カニューレは、円錐形の流体エンクロージャーの長さに沿って伸びている。一部の実施形態では、カニューレの一方の末端は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近にある。一部の実施形態では、カニューレの他方の末端は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近、例えば、広端の中心またはその付近にある。

【0313】

一部の実施形態では、細胞組成物は、円錐形の流体エンクロージャーにカニューレ経由で投入される。一部の実施形態では、細胞組成物は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近において、円錐形の流体エンクロージャーに投入される。一部の実施形態では、細胞組成物は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端に入り、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近におけるカニューレの末端から出ることによって、円錐形の流体エンクロージャーに投入される。

【0314】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量を適用することによって、細胞組成物の廃棄物画分が水簸されて円錐形の流体エンクロージャーから出される。一部の実施形態では、水簸された廃棄物画分は、細胞組成物中の生存不能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存不能なＴ細胞のパーセンテージを有する。

【0315】

一部の実施形態では、水簸された細胞は、円錐形の流体エンクロージャーの広端における開口部経由で円錐形の流体エンクロージャーから出る。一部の実施形態では、開口部は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端を少なくとも部分的に包囲している。一部の実施形態では、開口部は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端を包囲している。

【0316】

一部の実施形態では、方法は、水簸された廃棄物画分を収集することを含む。一部の実施形態では、水簸された廃棄物画分は、容器に回収される。一部の実施形態では、容器は、円錐形の流体エンクロージャーの広端と流体連通している。

【0317】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量を適用することによって、円錐形の流体エンクロージャー内で細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物が生産される。

【0318】

一部の実施形態では、提供される方法は、生細胞、例えばＴ細胞（例えば、操作されたＴ細胞）を濃縮するために使用される。一部の実施形態では、細胞にはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの抗原受容体をコードする異種ポリヌクレオチドが事前に導入されている。一部の実施形態では、細胞にはウイルスベクター粒子によって異種核酸が事前に導入されていた。一部の実施形態では、細胞には、抗原受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターで事前に形質導入されている。一部の実施形態では、遺伝子操作することは、細胞組成物のＴ細胞を、抗原受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含有するウイルスベクター粒子と接触させることを含む。一部の実施形態では、細胞は、抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、（ａ）における適用の前に、方法は、抗原受容体を発現するように細胞組成物のＴ細胞を遺伝子操作することを含み、および／または細胞組成物のＴ細胞は、抗原受容体を発現するように遺伝子操作されている。したがって、一部の実施形態では、提供される方法は、トランスジェニックＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原受容体を発現するように事前に操作されている生存可能なＴ細胞の濃縮に使用することができる。

【0319】

一部の実施形態では、細胞組成物は、方法の適用前に凍結保存され解凍されたＴ細胞を含有する。一部の実施形態では、方法は、凍結保存細胞組成物を解凍して、Ｔ細胞を含む細胞組成物を生産することを含む。

【0320】

一部の実施形態では、方法は、濃縮組成物の細胞を凍結保存して、凍結保存組成物を作出することを含む。一部の実施形態では、凍結保存は、凍結保護剤を含む培地に細胞を懸濁させること、および細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、凍結することは、速度制御フリーザーにおいてである。一部の実施形態では、方法は、凍結保存細胞組成物を解凍することを含む。一部の実施形態では、方法は、解凍された細胞を製剤化して薬物製品としての投与のための細胞組成物を作製することを含む。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が少なくとも１日間凍結された後に行われる。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が少なくとも２日間凍結された後に行われる。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が少なくとも３日間凍結された後に行われる。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が少なくとも１週間、１０日間、２週間、または１カ月間凍結された後に行われる。一部の実施形態では、解凍することは、凍結保存細胞組成物が最大１０日間、２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、または６カ月間凍結された後に行われる。

【0321】

一部の実施形態では、細胞組成物は、方法の適用前に凍結保存されても解凍されてもいないＴ細胞を含有する。

【0322】

そのような方法によって生産される細胞の集団、およびそれを使用するための方法も、提供される。

【0323】

したがって、一部の実施形態では、提供される方法から得られる細胞の組成物は、遠心分離の前と比較して、遠心分離後に生存率の増加を示す。一部の実施形態では、生存率の増加は、遠心分離の直後に観察され、および／または遠心分離後ある期間（例えば、数時間もしくは数日）にわたって維持される。

【0324】

一部の実施形態では、第１の遠心力は、約５００Ｇから約５，０００Ｇの間、約５００Ｇから約４，５００Ｇの間、約５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約５００Ｇから約３，５００Ｇの間、約５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約５００Ｇから約２，５００Ｇの間、約５００Ｇから約２，０００Ｇの間、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間、約５００Ｇから約１，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約５，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約４，５００Ｇの間、約１，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約３，５００Ｇの間、約１，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約１，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約５，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約４，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約５，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約４，５００Ｇの間、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約３，５００Ｇの間、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約２，５００Ｇの間、約２，５００Ｇから約５，０００Ｇの間、約２，５００Ｇから約４，５００Ｇの間、約２，５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約２，５００Ｇから約３，５００Ｇの間、約２，５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約３，０００Ｇから約５，０００Ｇの間、約３，０００Ｇから約４，５００Ｇの間、約３，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約３，０００Ｇから約３，５００Ｇの間、約３，５００Ｇから約５，０００Ｇの間、約３，５００Ｇから約４，５００Ｇの間、約３，５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約４，０００Ｇから約５，０００Ｇの間、約４，０００Ｇから約４，５００Ｇ、または４，５００Ｇから５，０００Ｇ間もしくは約４，５００Ｇから約５，０００Ｇ間である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，０００Ｇから約４，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間である。

【0325】

一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，０００Ｇから約５，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約４，５００Ｇの間、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，５００Ｇ、または約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，０００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，０００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約３，０００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約３，５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約４，０００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約４，５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約５，０００Ｇである。

【0326】

一部の実施形態では、第１の流量は、半径方向内向きである。一部の実施形態では、第１の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から離れる方向に向けられている。一部の実施形態では、第１の遠心力は、第１の流量によって相殺される。一部の実施形態では、第１の流量は、対向流量である。

【0327】

一部の実施形態では、第１の流量は、カニューレを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、カニューレを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、カニューレから出て、円錐形の流体エンクロージャーにその尖端から入る。

【0328】

一部の実施形態では、第１の流量は、約１ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約３ｍＬ／分から約１８ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間、または約８ｍＬ／分から約１２ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約３ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約９ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１１ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１２ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約１８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約２０ｍＬ／分である。

【0329】

一部の実施形態では、第１の流量は、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第１の遠心力は、約１，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第１の流量は、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第１の遠心力は、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第１の流量は、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である。

【0330】

一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約１００から約６００の間、約１００から約５００の間、約１００から約４００の間、約１００から約３００の間、約１００から約２００の間、約２００から約６００の間、約２００から約５００の間、約２００から約４００の間、約２００から約３００の間、約３００から約６００の間、約３００から約５００の間、約３００から約４００の間、約４００から約６００の間、約４００から約５００の間、または約５００から約６００の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００から約５００の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００から約４００の間である。本明細書での遠心力の流量に対する比率は、別段の指示がない限り、Ｇでの遠心力のｍＬ／分での流量に対する比率である。

【0331】

一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００から約４００の間、約２２５から約３７５の間、約２５０から約３５０の間、または約２７５から約３２５の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２００である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２２５である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２５０である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約２７５である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約３００である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約３２５である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約３５０である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約３７５である。一部の実施形態では、第１の遠心力の第１の流量に対する比率は、約４００である。

【0332】

一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、第１の流量は、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約３，０００Ｇであり、第１の流量は、約１０ｍｌ／分である。

【0333】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物（例えば、操作された細胞組成物）に約１５秒間、約３０秒間、約４５秒間、約６０秒間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約１０分間、または約１５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約１５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約３０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約４５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に約６０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に、少なくとも細胞の流動床が確立されるまで、適用される。

【0334】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に、少なくとも約１５秒間、少なくとも約３０秒間、少なくとも約４５秒間、少なくとも約６０秒間、少なくとも約２分間、少なくとも約３分間、少なくとも約４分間、少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、または少なくとも約１５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約１５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約２０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約２５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約３０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約４５秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約６０秒間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約２分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約３分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約４分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約５分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約１０分間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に少なくとも約１５分間適用される。

【0335】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に１５秒から６０秒の間または約１５秒から約６０秒の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に２５秒から６０秒の間または約２５秒から約６０秒の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に３０秒から６０秒の間または約３０秒から約６０秒の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に１５秒から２分の間または約１５秒から約２分の間適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に２５秒から２分の間または約２５秒から約２分の間適用される。

【0336】

一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に、所定の数の細胞が円錐形の流体エンクロージャーに投入されるまで適用される。一部の実施形態では、第１の遠心力および第１の流量は、細胞組成物に、所定の数の細胞が細胞の流動床の一部になるまで適用される。一部の実施形態では、所定の数の細胞は、所定の数のＴ細胞である。一部の実施形態では、所定の数の細胞、例えば、Ｔ細胞は、約１０００万から１億の間、約１０００万から９０００万の間、約１０００万から８０００万の間、約１０００万から７０００万の間、約１０００万から６０００万の間、約１０００万から５０００万の間、約１０００万から４０００万の間、約１０００万から３０００万の間、約１０００万から２０００万の間、約２０００万から１億の間、約２０００万から９０００万の間、約２０００万から８０００万の間、約２０００万から７０００万の間、約２０００万から６０００万の間、約２０００万から５０００万の間、約２０００万から４０００万の間、約２０００万から３０００万の間、約３０００万から１億の間、約３０００万から９０００万の間、約３０００万から８０００万の間、約３０００万から７０００万の間、約３０００万から６０００万の間、約３０００万から５０００万の間、約３０００万から４０００万の間、約４０００万から１億の間、約４０００万から９０００万の間、約４０００万から８０００万の間、約４０００万から７０００万の間、約４０００万から６０００万の間、約４０００万から５０００万の間、約５０００万から１億の間、約５０００万から９０００万の間、約５０００万から８０００万の間、約５０００万から７０００万の間、約５０００万から６０００万の間、約６０００万から１億の間、約６０００万から９０００万の間、約６０００万から８０００万の間、約６０００万から７０００万の間、約７０００万から１億の間、約７０００万から９０００万の間、約７０００万から８０００万の間、約８０００万から１億の間、約８０００万から９０００万、または約９０００万から１億の間の細胞、例えば、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、所定の数の細胞、例えば、Ｔ細胞は、約５０００万の細胞、例えば、Ｔ細胞である。

【0337】

一部の実施形態では、第２の流量は、半径方向内向きである。一部の実施形態では、第２の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から離れる方向に向けられている。一部の実施形態では、第２の遠心力は、第２の流量によって相殺される。一部の実施形態では、第２の流量は、対向流量である。

【0338】

一部の実施形態では、第２の流量は、カニューレを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、カニューレを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、カニューレから出て、円錐形の流体エンクロージャーにその尖端から入る。

【0339】

他の実施形態では、第２の流量は、半径方向外向きである。一部の実施形態では、第２の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端に向けられている。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、同じまたは実質的に同じ方向である。

【0340】

一部の実施形態では、第２の流量は、円錐形の流体エンクロージャーを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、円錐形の流体エンクロージャーを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から出てカニューレに入る。

【0341】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１００Ｇから約３，５００Ｇの間、約１００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１００Ｇから約２，０００Ｇの間、約１００Ｇから約１，５００Ｇの間、約１００Ｇから約１，０００Ｇの間、約１００Ｇから約５００Ｇの間、約１００Ｇから約３５０Ｇの間、約３５０Ｇから約４，０００Ｇの間、約３５０Ｇから約３，５００Ｇの間、約３５０Ｇから約３，０００Ｇの間、約３５０Ｇから約２，５００Ｇの間、約３５０Ｇから約２，０００Ｇの間、約３５０Ｇから約１，５００Ｇの間、約３５０Ｇから約１，０００Ｇの間、約３５０Ｇから約５００Ｇの間、約５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約５００Ｇから約３，５００Ｇの間、約５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約５００Ｇから約２，５００Ｇの間、約５００Ｇから約２，０００Ｇの間、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間、約５００Ｇから約１，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約３，５００Ｇの間、約１，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，０００Ｇから約２，０００Ｇの間、約１，０００Ｇから約１，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，５００Ｇの間、約１，５００Ｇから約２，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約３，５００Ｇの間、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約２，０００Ｇから約２，５００Ｇの間、約２，５００Ｇから約４，０００Ｇの間、約２，５００Ｇから約３，５００Ｇの間、約２，５００Ｇから約３，０００Ｇの間、約３，０００Ｇから約４，０００Ｇの間、約３，０００Ｇから約３，５００Ｇの間、または約３，５００Ｇから約４，０００Ｇの間である。

【0342】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３５０Ｇから約４，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３５０Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞、例えば、活性化Ｔ細胞は、約５μｍ～約２５μｍ、約５μｍ～約２０μｍ、約５μｍ～約１５μｍ、約５μｍ～約１０μｍ、約１０μｍ～約２５μｍ、約１０μｍ～約２０μｍ、約１０μｍ～約１５μｍ、約１５μｍ～約２５μｍ、約１５μｍ～約２０μｍ、または約２０μｍ～約２５μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。

【0343】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１０μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１２μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１４μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。

【0344】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３５０Ｇから約４，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３５０Ｇから約３，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約７００Ｇから約１，３００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約８００Ｇから約１，２００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約９００Ｇから約１，１００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，０００Ｇである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞またはあまり活性化されていないＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、方法の適用前に凍結保存され、解凍された。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、９μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約３μｍ～約９μｍ、約４μｍ～約９μｍ、約５μｍ～約９μｍ、約６μｍ～約９μｍ、約７μｍ～約９μｍ、または約８μｍ～約９μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する。

【0345】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１００Ｇから約２，０００Ｇの間、約２００Ｇから約１８００Ｇの間、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間、または約７５０Ｇから約１，２５０Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約２５０Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約６００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約７００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約８００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約９００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，０００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，１００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，２００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，３００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，４００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，５００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，３００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，７５０Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約２，０００Ｇである。

【0346】

一部の実施形態では、第２の流量は、約５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約７０ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約６０ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約５ｍＬ／分から約１０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約７０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約６０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間、約１０ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約７０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約６０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約７０ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約６０ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約３０ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間、約４０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約４０ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間、約４０ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間、約４０ｍＬ／分から約７０ｍＬ／分の間、約４０ｍＬ／分から約６０ｍＬ／分の間、約４０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約５０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約５０ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間、約５０ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間、約５０ｍＬ／分から約７０ｍＬ／分の間、約５０ｍＬ／分から約６０ｍＬ／分の間、約６０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約６０ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間、約６０ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間、約６０ｍＬ／分から約７０ｍＬ／分の間、約７０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約７０ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間、約７０ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間、約８０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約８０ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間、または約９０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。

【0347】

一部の実施形態では、第２の流量は、約５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第２の遠心力は、約３５０Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約６５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約３５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞、例えば、活性化Ｔ細胞は、約５μｍ～約２５μｍ、約５μｍ～約２０μｍ、約５μｍ～約１５μｍ、約５μｍ～約１０μｍ、約１０μｍ～約２５μｍ、約１０μｍ～約２０μｍ、約１０μｍ～約１５μｍ、約１５μｍ～約２５μｍ、約１５μｍ～約２０μｍ、または約２０μｍ～約２５μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。

【0348】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１０μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１２μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１４μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。

【0349】

一部の実施形態では、第２の流量は、３０ｍＬ／分またはそれ未満である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞またはあまり活性化されていないＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、方法の適用前に凍結保存され、解凍された。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、９μｍ未満の平均直径を有する。一部の場合には、Ｔ細胞は、約３μｍ～約９μｍ、約４μｍ～約９μｍ、約５μｍ～約９μｍ、約６μｍ～約９μｍ、約７μｍ～約９μｍ、または約８μｍ～約９μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する。

【0350】

一部の実施形態では、第２の流量は、３０ｍＬ／分またはそれ未満である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞またはあまり活性化されていないＴ細胞である。一部の実施形態では、方法は、第１の遠心力および第１の流量を細胞組成物に適用する前に細胞組成物の細胞を活性化することおよび培養すること（例えば、細胞を少なくとも２４、４８、７２または９６時間培養すること）を含む。一部の実施形態では、方法は、濃縮組成物のＴ細胞を凍結保存することおよび適宜、解凍することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、９μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約３μｍ～約９μｍ、約４μｍ～約９μｍ、約５μｍ～約９μｍ、約６μｍ～約９μｍ、約７μｍ～約９μｍ、または約８μｍ～約９μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する。

【0351】

一部の実施形態では、第２の流量は、約６５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第２の遠心力は、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約６５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約６５ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約６５ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞またはあまり活性化されていないＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、方法の適用前に凍結保存され、解凍された。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、９μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約３μｍ～約９μｍ、約４μｍ～約９μｍ、約５μｍ～約９μｍ、約６μｍ～約９μｍ、約７μｍ～約９μｍ、または約８μｍ～約９μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する。

【0352】

一部の実施形態では、第２の流量は、約６５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、（ｉ）第２の遠心力は、約１，５００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量は、約６５ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約６５ｍＬ／分から約９０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約６５ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞またはあまり活性化されていないＴ細胞である。一部の実施形態では、方法は、濃縮組成物の細胞を凍結保存することおよび適宜、解凍することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、９μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約３μｍ～約９μｍ、約４μｍ～約９μｍ、約５μｍ～約９μｍ、約６μｍ～約９μｍ、約７μｍ～約９μｍ、または約８μｍ～約９μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する。

【0353】

一部の実施形態では、第２の流量は、約１０から約１００ｍＬ／分の間、約１５から約９０ｍＬ／分の間、約２０から約８０ｍＬ／分の間、約２５から約７０ｍＬ／分の間、約３０から約６０ｍＬ／分の間、または約３５から約５０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２０ｍＬ／分、約２１ｍＬ／分、約２２ｍＬ／分、約２３ｍＬ／分、約２４ｍＬ／分、約２５ｍＬ／分、約２５．５ｍＬ／分、約２６ｍＬ／分、約２６．５ｍＬ／分、約２７ｍＬ／分、約２７．５ｍＬ／分、約２８ｍＬ／分、約２８．５ｍＬ／分、約２９ｍＬ／分、約２９．５ｍＬ／分、約３０ｍＬ／分、約３１ｍＬ／分、約３２ｍＬ／分、約３３ｍＬ／分、約３４ｍＬ／分、または約３５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２５．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２６ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２６．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２７ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２７．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２８．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２９ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２９．５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約３０ｍＬ／分である。

【0354】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２０から約１００の間、約２０から約９０の間、約２０から約８０の間、約２０から約７０の間、約２０から約６０の間、約２０から約５０の間、約２０から約４０の間、約２０から約３０の間、約３０から約１００の間、約３０から約９０の間、約３０から約８０の間、約３０から約７０の間、約３０から約６０の間、約３０から約５０の間、約３０から約４０の間、約４０から約１００の間、約４０から約９０の間、約４０から約８０の間、約４０から約７０の間、約４０から約６０の間、約４０から約５０の間、約５０から約１００の間、約５０から約９０の間、約５０から約８０の間、約５０から約７０の間、約５０から約６０の間、約６０から約１００の間、約６０から約９０の間、約６０から約８０の間、約６０から約７０の間、約７０から約１００の間、約７０から約９０の間、約７０から約８０の間、約８０から約１００の間、約８０から約９０の間、または約９０から約１００の間である。

【0355】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０から約７０の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０から約４０の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞、例えば、活性化Ｔ細胞は、約５μｍ～約２５μｍ、約５μｍ～約２０μｍ、約５μｍ～約１５μｍ、約５μｍ～約１０μｍ、約１０μｍ～約２５μｍ、約１０μｍ～約２０μｍ、約１０μｍ～約１５μｍ、約１５μｍ～約２５μｍ、約１５μｍ～約２０μｍ、または約２０μｍ～約２５μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。

【0356】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１０μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１２μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１４μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。

【0357】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有し、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０から約７０の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、１０μｍ～２０μＭ（例えば、１２μｍ～２０μｍまたは１４μｍ～２０μｍ）の平均直径を有し、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０から約７０の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、１２μｍ～２０μｍの平均直径を有し、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０から約７０の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、１４μｍ～２０μｍの平均直径を有し、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０から約７０の間である。

【0358】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ未満の平均直径を有し、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０から約４０の間である。

【0359】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０から約４０の間である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞またはあまり活性化されていないＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、方法の適用前に凍結保存され、解凍された。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、９μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約３μｍ～約９μｍ、約４μｍ～約９μｍ、約５μｍ～約９μｍ、約６μｍ～約９μｍ、約７μｍ～約９μｍ、または約８μｍ～約９μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する。

【0360】

一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２０から約１００の間、約２５から約８０の間、または約３０から約６０の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約２５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約３５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約４０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約４５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約５０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約５５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約６０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約６５である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約７０である。一部の実施形態では、第２の遠心力の第２の流量に対する比率は、約７５である。

【0361】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、第２の流量は、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１，０００Ｇであり、流量は、約２８．５ｍＬ／分である。

【0362】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約５分間から約１００分間の間、約１０分間から約９０分間の間、約１５分間から約８０分間の間、約２０分間から約７０分間の間、約２５分間から約６０分間の間、約３０分間から約５０分間の間、または約３５分間から約４０分間の間、適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約１０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約１５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約２０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約２５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約３０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約４５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約６０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約７５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に約９０分間適用される。

【0363】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に少なくとも約１５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に少なくとも約３０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に少なくとも約４５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に少なくとも約６０分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に少なくとも約７５分間適用される。一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量は、細胞組成物に少なくとも約９０分間適用される。

【0364】

Ａ．細胞組成物（例えば、操作された細胞組成物）
一部の実施形態では、Ｔ細胞（例えば、抗原受容体を発現するように事前に操作されたＴ細胞）を含む細胞組成物は、連続向流遠心分離機システムにおいて生細胞について濃縮される。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の細胞の濃度は、１．０×１０^５細胞／ｍＬ～１．０×１０^８細胞／ｍＬまたは約１．０×１０^５細胞／ｍＬ～約１．０×１０^８細胞／ｍＬ、例えば、少なくともまたは約少なくともまたは約１．０×１０^５細胞／ｍＬ、５×１０^５細胞／ｍＬ、１×１０^６細胞／ｍＬ、５×１０^６細胞／ｍＬ、１×１０^７細胞／ｍＬ、５×１０^７細胞／ｍＬまたは１×１０^８細胞／ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物は、約１×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、操作された細胞組成物は、約１．２５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約１．５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、操作された細胞組成物は、約１．７５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、操作された細胞組成物は、約２×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、操作された細胞組成物は、約２．２５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、操作された細胞組成物は、約２．５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、操作された細胞組成物は、約２．７５×１０^６細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、操作された細胞組成物は、約３×１０^６細胞／ｍＬを含む。

【0365】

一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約２０ｍＬから約３００ｍＬの間、約２５ｍＬから約２５０ｍＬの間、約３０ｍＬから約２００ｍＬの間、約３５ｍＬの間、および約１５０ｍＬの間、または約４０ｍＬから約１００ｍＬ間からなる。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約２０ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約２５ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約３０ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約３５ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約４０ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約４５ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約５０ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約５５ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約６０ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約７０ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約８０ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約１００ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約１２５ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約１５０ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約１７５ｍＬである。一部の実施形態では、操作された細胞組成物の体積は、約２００ｍＬである。

【0366】

一部の実施形態では、操作された細胞組成物は、総数約１×１０^８の細胞、総数約２×１０^８の細胞、総数約３×１０^８の細胞、総数約４×１０^８の細胞、総数約５×１０^８の細胞、総数約６×１０^８の細胞、総数約７×１０^８の細胞、総数約８×１０^８の細胞、総数約９×１０^８の細胞、または総数約１×１０^９の細胞を含む。

【0367】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約５μｍ～約２５μｍ、約５μｍ～約２０μｍ、約５μｍ～約１５μｍ、約５μｍ～約１０μｍ、約１０μｍ～約２５μｍ、約１０μｍ～約２０μｍ、約１０μｍ～約１５μｍ、約１５μｍ～約２５μｍ、約１５μｍ～約２０μｍ、または約２０μｍ～約２５μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約９μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。

【0368】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１０μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１２μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１４μｍ～約２０μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。

【0369】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、９μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約３μｍ～約９μｍ、約４μｍ～約９μｍ、約５μｍ～約９μｍ、約６μｍ～約９μｍ、約７μｍ～約９μｍ、または約８μｍ～約９μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約６μｍ～約９μｍの平均直径を有する。

【0370】

一部の実施形態では、細胞は、提供される方法による遺伝子操作の前にインキュベートおよび／または培養される。インキュベーション工程は、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、刺激、活性化、および／または増殖を含み得る。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物のＴ細胞を遺伝子操作の前に刺激条件下でインキュベートすることを含む。そのような条件は、集団内の細胞の増殖、拡大、活性化および／もしくは生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するように、ならびに／または遺伝子操作のために、例えば組換え抗原受容体の導入のために、細胞を刺激するように、設計されたものを含む。条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体および細胞を活性化するように設計された任意の他の薬剤のうち１つまたは複数を含み得る。

【0371】

一部の実施形態では、細胞組成物のＴ細胞は、第１の遠心力および第１の流量の適用の前に刺激条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物のＴ細胞を、細胞組成物を遠心分離機システムに投入する前に刺激条件下でインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、細胞組成物のＴ細胞は、遠心分離機システムへの細胞組成物の投入の前に刺激条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞組成物は、活性化Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢまたはこれらの組合せを発現するＴ細胞を含む。

【0372】

一部の実施形態では、刺激条件は、刺激試薬の存在を含む。一部の実施形態では、刺激試薬は、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化できる。一部の態様では、薬剤は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードを活性化または開始する。そのような薬剤としては、抗体、例えば、例えばビーズなどの固体支持体に結合した、ＴＣＲ構成要素および／もしくは共刺激受容体に対して特異的な抗体、例えば抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ならびに／または１つもしくは複数のサイトカインを挙げることができる。一部の実施形態では、刺激試薬は、ＴＣＲ複合体の１つまたは複数の構成要素の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化可能である。一部の実施形態では、刺激試薬は、（ｉ）ＴＣＲ複合体のメンバーに特異的に結合する一次薬剤；および（ｉｉ）Ｔ細胞共刺激分子に特異的に結合する二次薬剤を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、ＣＤ３に特異的に結合する。一部の実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０またはＩＣＯＳから選択される。一部の実施形態では、一次および二次薬剤の少なくとも一方は、抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、二次薬剤は、抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、またはそれを含む。適宜、拡大方法は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を培養培地に（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）添加する工程をさらに含み得る。

【0373】

一部の実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５、例えば、少なくとも約１０単位／ｍＬのＩＬ－２濃度を含む。一部の態様では、インキュベーションは、Ｒｉｄｄｅｌｌらの米国特許第６，０４０，１７７号、Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および／またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されているものなどの、技術に従って実行される。

【0374】

一部の実施形態では、刺激条件は、ヒトＴリンパ球の成長に適した温度、例えば、少なくとも摂氏約２５度、一般に少なくとも約３０度、および一般に摂氏３７度または摂氏約３７度を含む。適宜、インキュベーションは、非分裂ＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）をフィーダー細胞として添加することをさらに含み得る。ＬＣＬには約６０００～１０，０００ラドの範囲のガンマ線が照射され得る。ＬＣＬフィーダー細胞は、一部の態様では、任意の適した量で、例えば、少なくとも約１０：１のＬＣＬフィーダー細胞の最初のＴリンパ球に対する比率で提供される。

【0375】

実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞、例えば、抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブまたは抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することによって得られる。例えば、感染対象からＴ細胞を単離することおよび同じ抗原を用いてインビトロで細胞を刺激することによって、サイトメガロウイルス抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞株またはクローンを生成できる。

【0376】

一部の場合には、細胞、例えばＴ細胞、が活性化されることを必要としないウイルスベクター粒子が、使用され得る。一部のそのような例では、細胞は、活性化の前におよびまたは活性化の非存在下で、選択および／または形質導入され得る。

【0377】

一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞、例えばＴ細胞、の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くは活性化され、例えば、一部の場合には、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ４０Ｌおよび／または４－１ＢＢのうちの１つまたは複数について表面陽性である。一部の実施形態では、細胞は、第１の遠心力および第１の流量の適用の開始前に、例えば、流動床の確立前および／または形質導入の開始前に、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の存在下で、活性化剤を用いて活性化される。Ｔ細胞集団をインビトロで、外因性増殖因子の非存在下でまたは少量の外因性増殖因子で拡大する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，３５２，６９４Ｂ１号および欧州特許ＥＰ ０ ７００ ４３０ Ｂ１を参照されたい）。一般に、そのような方法は、多様な結合剤（例えば、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体）が固定化されている、１μＭを超える固相表面を利用する。例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、Ｔ細胞拡大のための市販の試薬であり、これは、ヒトＴ細胞上のＣＤ３およびＣＤ２８細胞表面分子に対する親和性精製モノクローナル抗体の混合物でコーティングされた均一な、４．５μｍ超常磁性、滅菌、非発熱性ポリスチレンビーズである。一部の実施形態では、活性化剤、例えば、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８は、磁性ビーズなどのビーズに固定化され得る。

【0378】

一部の実施形態では、細胞活性化も、ＩＬ－２（例えば、５０ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬまたは約５０ＩＵ／ｍＬ～約２００ＩＵ／ｍＬ、例えば、１００ＩＵ／ｍＬまたは約１００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で行われる。一部の実施形態では、活性化は、１時間から９６時間、１時間から７２時間、１時間から４８時間、４時間から３６時間、８時間から３０時間もしくは１２時間から２４時間の間、または約１時間から約９６時間、約１時間から約７２時間、約１時間から約４８時間、約４時間から約３６時間、約８時間から約３０時間もしくは約１２時間から約２４時間の間、例えば、少なくともまたは約少なくとも６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間または７２時間、実行される。一部の実施形態では、活性化は、２５℃より高いまたは約２５℃より高い、例えば、一般に、３２℃、３５℃もしくは３７℃より高いまたは約３２℃、約３５℃もしくは約３７℃より高い、例えば、３７℃±２℃または約３７℃±２℃の温度で、例えば、３７℃または約３７℃の温度で実行される。

【0379】

一部の実施形態では、細胞は、接触の開始前に、例えば、形質導入の開始前に、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の存在下で、活性化剤を用いて活性化されない。一部の実施形態では、細胞組成物は、複数の休止細胞を含む。一部の実施形態では、集団内のＴ細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くは、休止Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞活性化マーカー、例えば、表面マーカーもしくは細胞内サイトカインもしくは他のマーカー、を欠いているＴ細胞、および／または細胞周期のＧ０もしくはＧ０Ｇ１ａ期にあるＴ細胞である。

【0380】

特定の態様では、提供される方法は、オリゴマータンパク質試薬、例えば多量体化試薬、との接触および／またはインキュベーションの前に活性化する必要なく、Ｔ細胞への形質導入を起こさせる。一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞を最初に、例えば形質導入の前に、活性化および／または刺激することなく、休止またはナイーブＴ細胞を含有するＴ細胞の集団にウイルスベクターで形質導入することを含む。一部のそのような実施形態では、提供される方法は、養子療法のための細胞、例えばＴ細胞、を調製するために使用することができ、Ｔ細胞を活性化および／または刺激する工程を含まない。

【0381】

一部の実施形態では、細胞は、一般に、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、典型的にはヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、血液、骨髄、リンパ、もしくはリンパ器官に由来するか、または免疫系の細胞、例えば、自然もしくは適応免疫の細胞、例えば、リンパ球、典型的にはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を含む、骨髄性もしくはリンパ系細胞である。他の例示的な細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、複能性および多能性幹細胞などの、幹細胞が挙げられる。細胞は、典型的には初代細胞、例えば、対象から直接単離されたもの、および／または対象から単離され、凍結されたものである。一部の実施形態では、細胞は、初代Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト対象からの初代Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞または他の細胞型の１つまたは複数のサブセット、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、およびその亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、拡大、再循環、局在化、および／もしくは持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器もしくは区画における存在、マーカーもしくはサイトカイン分泌プロファイル、ならびに／または分化の程度によって定義されるものを含む。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含むか、またはＣＤ３＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むか、またはＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むか、またはＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。処置されるべき対象を基準にして、細胞は、同種異系および／または自家であり得る。方法には、既成の方法も含まれる。既成の技術についてのものなどの、一部の態様では、細胞は、多能性および／または複能性、例えば、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、方法は、対象から細胞を単離すること、本明細書に記載されるように、それらを調製すること、処理すること、培養することおよび／または操作すること、ならびに凍結乾燥の前または後に、それらを同じ患者に再導入することを含む。

【0382】

Ｔ細胞のおよび／またはＣＤ４＋Ｔ細胞のおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプおよび亜集団の中には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、記憶Ｔ細胞およびそのサブタイプ、例えば、幹細胞記憶Ｔ（ＴＳＣＭ）、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）、エフェクター記憶Ｔ（ＴＥＭ）、または最終分化型エフェクター記憶Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然に存在するおよび適応制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、アルファ／ベータＴ細胞、ならびにデルタ／ガンマＴ細胞もある。

【0383】

一部の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、および／または好塩基球である。

【0384】

一部の実施形態では、細胞の調製は、１つまたは複数の培養および／または調製工程を含む。細胞は、試料、例えば、生物学的試料、例えば、対象から得られたものまたは対象に由来するものから単離され得る。一部の実施形態では、細胞が単離される対象は、疾患もしくは状態を有する者、または細胞療法を必要とする者、または細胞療法が投与されることになる者である。対象は、一部の実施形態では、細胞が単離、処理および／または操作されることになる養子細胞療法などの、特定の治療介入を必要とするヒトである。

【0385】

したがって、細胞は、一部の実施形態では、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。試料は、対象から直接採取された組織、流体および他の試料、ならびに１つまたは複数の処理工程、例えば、分離、遠心分離、遺伝子操作（例えば、ウイルスベクターでの形質導入）、洗浄および／またはインキュベーション、から得られる試料を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られる試料、または処理される試料であり得る。生物学的試料としては、これらに限定されないが、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織ならびに臓器試料が、それらに由来する処理された試料を含めて、挙げられる。

【0386】

一部の態様では、細胞が由来するかまたは単離される試料は、血液もしくは血液由来試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物に由来する。例示的試料としては、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、脾臓、他のリンパ系組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺もしくは他の臓器および／またはそれらに由来する細胞が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、ＰＢＭＣである。試料は、細胞療法、例えば、養子細胞療法の文脈では、自家および同種異系供給源からの試料を含む。

【0387】

一部の実施形態では、細胞は、細胞株、例えば、Ｔ細胞株に由来する。細胞は、一部の実施形態では、異種供給源から、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはブタから得られる。

【0388】

一部の実施形態では、細胞の単離は、１つまたは複数の調製および／または非親和性ベースの細胞分離工程を含む。一部の例では、細胞は、例えば、望ましくない構成要素を除去するために、所望の構成要素を濃縮するために、特定の試薬に対して感受性の細胞を溶解または除去するために、１つまたは複数の試薬の存在下で洗浄、遠心分離、および／またはインキュベートされる。一部の例では、細胞は、１つまたは複数の特性、例えば、密度、接着特性、サイズ、特定の構成要素に対する感受性および／または耐性に基づいて分離される。

【0389】

一部の例では、細胞は、対象の循環血液から、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、一部の態様では、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および／または血小板を含有し、一部の態様では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。

【0390】

一部の実施形態では、対象から収集された血液細胞は、例えば、血漿画分を除去するために、および細胞をその後の処理工程のための適切な緩衝液または培地に入れるために、洗浄される。一部の実施形態では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。一部の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムおよび／またはマグネシウムおよび／または多くのもしくは全ての二価カチオンを欠く。一部の態様では、洗浄工程は、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１セルプロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ）によって製造元の説明書に従って達成される。一部の態様では、洗浄工程は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製造元の説明書に従って達成される。一部の実施形態では、細胞は、洗浄後、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有のＰＢＳなどに再懸濁される。ある特定の実施形態では、血液細胞試料の構成要素は除去され、細胞は培養培地に直接再懸濁される。

【0391】

一部の実施形態では、方法は、密度ベースの細胞分離方法、例えば、赤血球の溶解およびパーコールまたはフィコール勾配による遠心分離による末梢血液からの白血球の調製を含む。

【0392】

一部の実施形態では、提供される方法を実施する前に細胞を濃縮または選択する必要がない。

【0393】

一部の実施形態では、単離方法は、細胞における１つまたは複数の特定の分子、例えば、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカーまたは核酸の発現または存在に基づく、異なる細胞型の分離を含む。一部の実施形態では、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の公知の方法が使用され得る。分離方法は、可逆的試薬系、例えば、本明細書に記載されるような薬剤（例えば、受容体結合剤または選択剤）および試薬を使用する方法を含む、本明細書に開示されるもののいずれかを含み得る。

【0394】

一部の実施形態では、分離は、親和性ベースのまたは免疫親和性ベースの分離である。例えば、単離は、一部の態様では、１つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカー、の細胞の発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団の分離であって、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーション、続いて、一般に、洗浄工程および抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの抗体または結合パートナーに結合している細胞の分離による、分離を含む。

【0395】

そのような分離工程は、試薬に結合している細胞がさらなる使用のために保持されるポジティブ選択、および／または抗体もしくは結合パートナーに結合していない細胞が保持されるネガティブ選択に基づき得る。一部の例では、両方の画分がさらなる使用のために保持される。一部の態様では、不均一な集団において細胞型を特異的に識別する抗体が利用可能でない場合、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて分離が最良に実行されるようなネガティブ選択は、特に有用であり得る。

【0396】

分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の１００％濃縮または除去をもたらす必要がない。例えば、マーカーを発現するものなどの特定の型の細胞のポジティブ選択または濃縮は、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な非存在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現するものなどの特定の型の細胞のネガティブ選択、除去または枯渇は、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、全てのそのような細胞の完全な除去をもたらす必要はない。

【0397】

一部の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ３＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮される。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0398】

一部の例では、ある工程からポジティブまたはネガティブ選択された画分がその後のポジティブまたはネガティブ選択などの別の分離工程に付される、複数ラウンドの分離工程が、実行される。一部の例では、単一分離工程は、例えば、細胞を、ネガティブ選択の標的となるマーカーに対して各々特異的な複数の抗体または結合パートナーと共にインキュベートすることによって、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、種々の細胞型上に発現される複数の抗体または結合パートナーと共に細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞型を同時にポジティブに選択することができる。

【0399】

例えば、一部の態様では、１つもしくは複数の表面マーカーについて陽性の細胞または高レベルの１つもしくは複数の表面マーカー発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特定の亜集団が、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって単離される。

【0400】

例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８がコンジュゲートしている磁性ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を使用してポジティブ選択することができる。

【0401】

一部の実施形態では、単離は、ポジティブ選択による特定の細胞集団についての濃縮、またはネガティブ選択による特定の細胞集団の枯渇によって実行される。一部の実施形態では、ポジティブまたはネガティブ選択は、それぞれ、ポジティブまたはネガティブ選択された細胞上に発現されるまたは相対的に高いレベルで（マーカーｈｉｇｈ）発現される（マーカー＋）１つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する１つまたは複数の抗体または他の結合剤と共に細胞をインキュベートすることによって、達成される。

【0402】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ試料から、非Ｔ細胞、例えば、Ｂ細胞、単球、または他の白血球上に発現されるマーカー、例えばＣＤ１４、のネガティブ選択によって分離される。一部の態様では、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択工程は、ＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離するために使用される。そのようなＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団は、１つまたは複数のナイーブ、記憶および／またはエフェクターＴ細胞亜集団上に発現されるまたは相対的により高度に発現されるマーカーについてのポジティブまたはネガティブ選択によって、亜集団にさらに選別され得る。

【0403】

一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、ナイーブ、中枢記憶、エフェクター記憶および／または中枢記憶幹細胞について、例えば、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づくポジティブまたはネガティブ選択によって、さらに濃縮または枯渇される。一部の実施形態では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞についての濃縮は、有効性を増大させるために、例えば、投与後の長期間生存、拡大および／または生着を改善するために実行され、これは、一部の態様では、このような亜集団において特に頑強である。Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82；Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。一部の実施形態では、ＴＣＭが濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を組み合わせることによって、有効性がさらに増強される。

【0404】

一部の実施形態では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋サブセットとＣＤ６２Ｌ－サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣを、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋および／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分について、例えば、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体を使用して、濃縮または枯渇することができる。

【0405】

一部の実施形態では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３および／またはＣＤ１２７の陽性または高い表面発現に基づき、一部の態様では、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはグランザイムＢを発現するまたは高度に発現する細胞についてのネガティブ選択に基づく。一部の態様では、ＴＣＭ細胞について濃縮されたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、およびＣＤ６２Ｌを発現する細胞についてのポジティブ選択または濃縮によって実行される。一態様では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４発現に基づいて選択された細胞のネガティブ画分を用いて出発して実行され、この画分が、ＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡの発現に基づくネガティブ選択ならびにＣＤ６２Ｌに基づくポジティブ選択に付される。このような選択は、一部の態様では、同時に実行され、他の態様では、いずれかの順序で逐次的に実行される。一部の態様では、ＣＤ８＋細胞集団または亜集団の調製において使用される同じＣＤ４発現ベースの選択工程が、ＣＤ４＋細胞集団または亜集団を生成するためにも使用され、したがって、ＣＤ４ベースの分離から得られたポジティブ画分とネガティブ画分の両方が保持され、方法のその後の工程において、適宜、１つまたは複数のさらなるポジティブまたはネガティブ選択工程後に、使用される。

【0406】

特定の例では、ＰＢＭＣの試料または他の白血球試料がＣＤ４＋細胞の選択に付され、ネガティブ画分とポジティブ画分の両方が保持される。次いで、ネガティブ画分は、ＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ１９の発現に基づくネガティブ選択、ならびに中枢記憶Ｔ細胞に特有のマーカー、例えばＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ７、に基づくポジティブ選択に付され、ポジティブおよびネガティブ選択は、いずれかの順序で実行される。

【0407】

ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによってナイーブ、中枢記憶およびエフェクター細胞に選別される。ＣＤ４＋リンパ球は、標準方法によって得ることができる。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、中枢記憶ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋である。一部の実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ－およびＣＤ４５ＲＯ－である。

【0408】

一例では、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞について濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。一部の実施形態では、抗体または結合パートナーは、ポジティブおよび／またはネガティブ選択のための細胞の分離を可能にするために固体支持体またはマトリックス、例えば、磁性ビーズまたは常磁性ビーズに結合される。例えば、一部の実施形態では、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気）分離技術を使用して分離または単離される（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher (c) Humana Press Inc., Totowa, NJにおいて概説されている）。

【0409】

一部の態様では、分離しようとする細胞の試料または組成物は、小さい、磁化できる、または磁気的に応答性の材料、例えば、磁気的に応答性の粒子または微粒子、例えば常磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｌｂｅａｄｓまたはＭＡＣＳビーズなど）と共にインキュベートされる。磁気的に応答性の材料、例えば粒子、は一般に、分離することが所望される、例えばネガティブまたはポジティブ選択することが所望される、細胞、複数の細胞、または細胞の集団上に存在する分子、例えば表面マーカー、に特異的に結合する結合パートナー、例えば抗体に、直接的または間接的に付着される。

【0410】

一部の実施形態では、磁性粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的な結合メンバーに結合した磁気的に応答性の材料を含む。磁気分離方法において使用される多くの周知の磁気的に応答性の材料がある。適する磁性粒子としては、これにより参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄａｙの米国特許第４，４５２，７７３号におよび欧州特許明細書ＥＰ ４５２３４２ Ｂに記載されているものが挙げられる。コロイドサイズの粒子、例えば、Ｏｗｅｎの米国特許第４，７９５，６９８号およびＬｉｂｅｒｔｉらの米国特許第５，２００，０８４号に記載されるものが、他の例である。

【0411】

インキュベーションは一般に、磁性粒子もしくはビーズに付着している抗体もしくは結合パートナーまたはそのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する分子、例えば、二次抗体もしくは他の試薬が、細胞表面分子が試料内の細胞上に存在する場合、それに特異的に結合する条件下で実行される。

【0412】

一部の態様では、試料は、磁場に置かれ、磁気的に応答性のまたは磁化できる粒子が付着している細胞は、磁石に引き付けられ、非標識細胞から分離されることになる。ポジティブ選択については、磁石に引き付けられる細胞が保持され、ネガティブ選択については、引き付けられない細胞（非標識細胞）が保持される。一部の態様では、ポジティブ選択とネガティブ選択の組合せが同じ選択工程の間に実施され、ポジティブおよびネガティブ画分が保持され、さらに処理されるか、またはさらなる分離工程に付される。

【0413】

磁化できる粒子を細胞から除去するための方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、磁化できる粒子、または切断可能なリンカーにコンジュゲートした抗体などの使用を含む。一部の実施形態では、磁化できる粒子は、生分解性である。

【0414】

一部の実施形態では、親和性ベースの選択は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によるものである。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）システムは、磁化された粒子が付着している細胞の高純度選択が可能である。ある特定の実施形態では、ＭＡＣＳは、外部の磁場の適用後に非標的および標的種が逐次的に溶出される様式で作動する。つまり、磁化された粒子に付着している細胞はその場に保持されるが、付着していない種は溶出される。次いで、この第１の溶出工程が完了した後、磁場にトラップされ、溶出が妨げられた種は、それらを溶出および回収することができるような何らかのやり方で解放される。ある特定の実施形態では、非標的細胞が標識され、細胞の不均一集団から枯渇される。

【0415】

ある特定の実施形態では、単離または分離は、方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養および／または製剤化工程のうちの１つまたは複数を実行するシステム、デバイスまたは装置を使用して、実行される。一部の態様では、システムは、例えば、エラー、ユーザーによる取扱い、および／または汚染を最小にするために、閉鎖または無菌環境でこれらの工程の各々を実行するために使用される。一例では、システムは、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０７２００３、または米国特許出願公開第２０１１０００３３８０Ａ１号に記載されているようなシステムである。

【0416】

一部の実施形態では、システムまたは装置は、単離、処理、操作および製剤化工程の１つまたは複数、例えば全てを、統合もしくは内蔵システムにおいて、および／または自動化もしくはプログラム可能な方式で実行する。一部の態様では、システムまたは装置は、システムまたは装置と通信しているコンピューターおよび／またはコンピュータープログラムを含み、このコンピューターおよび／またはコンピュータープログラムによって、ユーザーが処理、単離、操作および製剤化工程をプログラムすること、制御すること、前記工程の結果を評価すること、および／または前記工程の多様な態様を調整することが可能になる。

【0417】

一部の態様では、分離および／または他の工程は、例えば、閉鎖および無菌システムにおける臨床規模レベルでの細胞の自動分離のために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｉｃ）を使用して実行される。ある特定の実施形態では、分離および／または他の工程は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実行される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムには、一部の態様では、遠心分離による細胞の自動洗浄および分画を可能にする細胞処理ユニティーが装備されている。

【0418】

一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体流で運ばれるフローサイトメトリーによって収集および濃縮（または枯渇）される。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、分取スケール（ＦＡＣＳ）選別によって収集および濃縮（または枯渇）される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、ＦＡＣＳベースの検出システムと組み合わせて微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップを使用することによって収集および濃縮（または枯渇）される［例えば、ＷＯ２０１０／０３３１４０、Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573；およびGodin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376を参照されたい］。どちらの場合も、細胞は、明確に定義されたＴ細胞サブセットの高純度での単離を可能にする複数のマーカーで標識され得る。

【0419】

一部の実施形態では、調製方法は、単離、インキュベーションおよび／または遺伝子操作の前または後のいずれかに、細胞を凍結するための、例えば、凍結保存するための工程を含む。一部の実施形態では、凍結し、その後に解凍する工程によって、細胞集団中の顆粒球およびある程度まで単球が除去される。一部の実施形態では、細胞は、例えば、血漿および血小板を除去するための洗浄工程後に、凍結溶液に懸濁される。様々な公知の凍結溶液およびパラメーターのいずれかが一部の態様では使用され得る。一例は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ、または他の適する細胞凍結培地の使用を含む。次いで、これは、培地を用いてＤＭＳＯおよびＨＳＡの最終濃度がそれぞれ１０％および４％になるように１：１希釈される。次いで、細胞は、毎分１°の速度で－８０℃に凍結され、液体窒素保管タンクの蒸気相内で保管される。

【0420】

Ｂ．濃縮組成物
一部の実施形態では、方法は、第３の遠心力および第３の流量を濃縮組成物に適用して、生存率が向上した細胞を含む（例えば、操作された細胞を含む）濃縮組成物を生産することを含む。一部の実施形態では、濃縮組成物は、細胞療法における下流の使用などのために収集または回収される。一部の実施形態では、第３の遠心力および第３の流量は、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて濃縮組成物の細胞に適用される。一部の実施形態では、濃縮細胞への第３の遠心力および第３の流量の適用は、濃縮組成物の収集または回収を可能にする。

【0421】

一部の実施形態では、濃縮組成物は、カニューレ経由で収集される。一部の実施形態では、濃縮組成物は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近におけるカニューレの末端に入り、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端から出る。

【0422】

一部の実施形態では、方法は、濃縮組成物を凍結保存することを含む。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生細胞のレベルは、凍結保存濃縮組成物において維持される。一部の実施形態では、方法は、凍結保存濃縮組成物を解凍することを含む。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生細胞のレベルは、解凍された濃縮組成物において維持される。

【0423】

一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間、約２，２００Ｇから約２，８００Ｇの間、または約２，４００Ｇから約２，６００Ｇの間である。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，０００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，１００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，２００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，３００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，４００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，５００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，６００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，７００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，８００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，９００Ｇである。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約３，０００Ｇである。

【0424】

一部の実施形態では、第３の流量は、半径方向外向きである。一部の実施形態では、第３の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端に向けられている。一部の実施形態では、第３の遠心力および第３の流量は、同じまたは実質的に同じ方向である。

【0425】

一部の実施形態では、第３の流量は、円錐形の流体エンクロージャーを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、円錐形の流体エンクロージャーを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から出てカニューレに入る。

【0426】

一部の実施形態では、第３の流量は、約１０ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間、約１２ｍＬ／分から約２８ｍＬ／分の間、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間、または約１８ｍＬ／分から約２２ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１６ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１７ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１９ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２１ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２２ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２３ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２４ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約１５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第３の流量は、約２５ｍＬ／分である。

【0427】

一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１００から約１５０の間、約１１０から１４０の間、または約１２０から１３０の間である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１００である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１０５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１１０である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１１５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１２０である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１２５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１３０である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１３５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１４０である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１４５である。一部の実施形態では、第３の遠心力の第３の流量に対する比率は、約１５０である。

【0428】

一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、第３の流量は、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第３の遠心力は、約２，５００Ｇであり、第３の流量は、約２０ｍＬ／分である。

【0429】

一部の実施形態では、処理工程は、細胞の洗浄、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、刺激、活性化、増殖および／または製剤化をさらに含み得る。一部の実施形態では、濃縮細胞は、アウトプット組成物として収集される前に１つまたは複数の洗浄工程に付される。一部の実施形態では、収集された濃縮組成物細胞は、刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。このような条件は、集団中の細胞の増殖、拡大、活性化および／もしくは生存を誘導するように、ならびに／または抗原曝露を模倣するように設計されたものを含む。刺激は、対象への投与後にエクスビボまたはインビボで実行され得る。一部の実施形態では、濃縮組成物は収集され、節Ｉ．Ｃに記載されるもののいずれかを含むさらなる処理工程に付される。

【0430】

Ｃ．濃縮組成物の例示的な特徴
一部の実施形態では、濃縮組成物（例えば、収集された濃縮組成物）の体積は、約１ｍｌから約２０，０００ｍｌの間、約５ｍＬから約２，０００ｍＬの間、約１０ｍＬから約１，０００ｍＬの間、約１５ｍＬから約５００ｍＬの間、または約２０ｍＬから約１００ｍＬの間である。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約１ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬ、約４０ｍＬ、約４５ｍＬ、約５０ｍＬ、約５５ｍＬ、約６０ｍＬ、約６５ｍＬ、約７０ｍＬ、約７５ｍＬ、約８０ｍＬ、約８５ｍＬ、約９０ｍＬ、約９５ｍＬ、または約１００ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約１ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約５ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約１０ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約１５ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約２０ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約２５ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約３０ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約３５ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約４０ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約４５ｍＬである。一部の実施形態では、濃縮組成物の体積は、約５０ｍＬである。

【0431】

一部の実施形態では、濃縮組成物は、細胞組成物または細胞組成物より大きいパーセンテージの生存可能なＴ細胞を含む。一部の実施形態では、濃縮組成物は、細胞組成物より大きいパーセンテージの生存可能なＴ細胞を含む。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、または少なくとも約２５％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約５％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約１０％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約１５％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約２０％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約２５％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより約３０％大きい。

【0432】

一部の実施形態では、濃縮組成物は、細胞組成物（例えば、操作された細胞組成物）より大きいパーセンテージの生存可能なＴ細胞を含む。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、または少なくとも約２５％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約５％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約１０％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約１５％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約２０％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約２５％大きい。一部の実施形態では、濃縮組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージは、細胞組成物中の生存可能なＴインプットのパーセンテージより約３０％大きい。

【0433】

特定の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％の生細胞を含有する。一部の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも７５％または少なくとも約７５％の生細胞を含有する。ある特定の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％の生細胞を含有する。一部の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％の生存可能なＣＤ３＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも７５％または少なくとも約７５％の生存可能なＣＤ３＋Ｔ細胞を含有する。ある特定の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％の生存可能なＣＤ３＋Ｔ細胞を含有する。一部の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％の生存可能なＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する。ある特定の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも７５％または少なくとも約７５％の生存可能なＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％の生存可能なＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％の生存可能なＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。一部の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも７５％または少なくとも約７５％の生存可能なＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。ある特定の実施形態では、濃縮組成物は、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％の生存可能なＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。

【0434】

特定の実施形態では、アウトプット細胞は、アポトーシスを遂げることになる細胞ならびに／または調製され、刺激され、および／もしくはアポトーシスに入ることになる細胞の割合および／または頻度が低い。特定の実施形態では、アウトプット細胞は、アポトーシスマーカーについて陽性である細胞の割合および／または頻度が低い。一部の実施形態では、濃縮組成物の細胞の４０％もしくは約４０％未満、３５％もしくは約３５％未満、３０％もしくは約３０％未満、２５％もしくは約２５％未満、２０％もしくは約２０％未満、１５％もしくは約１５％未満、１０％もしくは約１０％未満、５％もしくは約５％未満、または１％もしくは約１％未満は、アポトーシスマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスマーカーについて陽性である。ある特定の実施形態では、濃縮組成物の細胞の２５％または約２５％未満は、アポトーシスのマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスのマーカーについて陽性である。ある特定の実施形態では、濃縮組成物の１０％未満または約１０％未満の細胞は、アポトーシスマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスマーカーについて陽性である。ある特定の実施形態では、濃縮組成物の５％未満または約５％未満の細胞は、アポトーシスマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスマーカーについて陽性である。ある特定の実施形態では、濃縮組成物の１％未満または約１％未満の細胞は、アポトーシスマーカーを発現する、含有する、および／またはアポトーシスマーカーについて陽性である。

【0435】

特定の実施形態では、濃縮組成物は、ＣＤ３＋Ｔ細胞について濃縮された細胞の組成物である。一部の実施形態では、濃縮組成物中の全細胞の少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９８．５％、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９９．５％、少なくとももしくは約９９．９％、１００％、または約１００％は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、濃縮組成物中の全細胞の少なくとももしくは約８６％、少なくとももしくは約８６．５％、少なくとももしくは約８７％、少なくとももしくは約８７．５％、少なくとももしくは約８８％、少なくとももしくは約８８．５％、少なくとももしくは約８９％、少なくとももしくは約８９．５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９０．５％、少なくとももしくは約９１％、少なくとももしくは約９１．５％、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９２．５％、少なくとももしくは約９３％、少なくとももしくは約９３．５％、少なくとももしくは約９４％、少なくとももしくは約９４．５％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９５．５％、少なくとももしくは約９６％、少なくとももしくは約９６．５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９７．５％、少なくとももしくは約９８％、または少なくとももしくは約９８．５％は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、濃縮組成物中の全細胞の約８０％から約１００％の間、約８５％から約９８％の間、約８８％から約９６％の間、または約９０％から約９４％の間は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、濃縮組成物は、ＣＤ３＋Ｔ細胞から本質的になる。一部の実施形態では、濃縮組成物中の全細胞の少なくともまたは約９０％は、ＣＤ３＋Ｔ細胞であり、濃縮組成物中の全細胞の少なくともまたは約４０％は、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する。

【0436】

ある特定の実施形態では、濃縮組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮された細胞の組成物である。特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、濃縮組成物中の全細胞の少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９８．５％、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９９．５％、少なくとももしくは約９９．９％、１００％、または約１００％を占める。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、濃縮組成物中の全細胞の少なくとももしくは約８６％、少なくとももしくは約８６．５％、少なくとももしくは約８７％、少なくとももしくは約８７．５％、少なくとももしくは約８８％、少なくとももしくは約８８．５％、少なくとももしくは約８９％、少なくとももしくは約８９．５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９０．５％、少なくとももしくは約９１％、少なくとももしくは約９１．５％、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９２．５％、少なくとももしくは約９３％、少なくとももしくは約９３．５％、少なくとももしくは約９４％、少なくとももしくは約９４．５％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９５．５％、少なくとももしくは約９６％、少なくとももしくは約９６．５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９７．５％、少なくとももしくは約９８％、または少なくとももしくは約９８．５％を占める。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、濃縮組成物中の全細胞の約８０％から約１００％の間、約８５％から約９８％の間、約８８％から約９６％の間、または約９０％から約９４％の間を占める。一部の実施形態では、濃縮組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞から本質的になる。

【0437】

特定の実施形態では、濃縮組成物は、１０％から９０％もしくは約１０％から約９０％の間、２０％から８０％もしくは約２０％から約８０％の間、２５％から７５％もしくは約２５％から約７５％の間、３０％から７０％もしくは約３０％から約７０％の間、３５％から６５％もしくは約３５％から約６５％の間、４０％から６０％もしくは約４０％から約６０％の間、５５％から４５％もしくは約５５％から約４５％の間、または約５０％もしくは５０％のＣＤ４＋Ｔ細胞、および１０％から９０％もしくは約１０％から約９０％の間、２０％から８０％もしくは約２０％から約８０％の間、２５％から７５％もしくは約２５％から約７５％の間、３０％から７０％もしくは約３０％から約７０％の間、３５％から６５％もしくは約３５％から約６５％の間、４０％から６０％もしくは約４０％から約６０％の間、５５％から４５％もしくは約５５％から約４５％の間、または約５０％もしくは５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。ある特定の実施形態では、濃縮組成物は、３５％から６５％もしくは約３５％から約６５％の間、４０％から６０％もしくは約４０％から約６０％の間、５５％から４５％もしくは約５５％から約４５％の間、または約５０％もしくは５０％のＣＤ４＋Ｔ細胞、および３５％から６５％もしくは約３５％から約６５％の間、４０％から６０％もしくは約４０％から約６０％の間、５５％から４５％もしくは約５５％から約４５％の間、または約５０％もしくは５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、アウトプット組成物は、３５％から６５％または約３５％から約６５％の間のＣＤ４＋Ｔ細胞、および３５％から６５％または約３５％から約６５％の間のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。特定の実施形態では、濃縮組成物は、３：１から１：３の間、２．５：１から１：２．５の間、２：１から１：２の間、１．５：１から１：１．５の間、１．４：１から１：１．４の間、１．３：１から１：１．３の間、１．２：１から１：１．２の間、または１．１：１から１：１．１の間の、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比率を含有する。一部の実施形態では、細胞の組成物は、３：１のもしくは約３：１の、２．８：１のもしくは約２．８：１の、２．５：１のもしくは約２．５：１の、２．２５：１のもしくは約２．２５：１の、２：１のもしくは約２：１の、１．８：１のもしくは約１．８：１の、１．７：１のもしくは約１．７：１の、１．６：１のもしくは約１．６：１の、１．５：１のもしくは約１．５：１の、１．４：１のもしくは約１．４：１の、１．３：１のもしくは約１．３：１の、１．２：１のもしくは約１．２：１の、１．１：１のもしくは約１．１：１の、１：１のもしくは約１：１の、１：１．１のもしくは約１：１．１の、１：１．２のもしくは約１：１．２の、１：１．３のもしくは約１：１．３の、１：１．４のもしくは約１：１．４の、１：１．５のもしくは約１：１．５の、１：１．６のもしくは約１：１．６の、１：１．７のもしくは約１：１．７の、１：１．８のもしくは約１：１．８の、１：２のもしくは約１：２の、１：２．２５のもしくは約１：２．２５の、１：２．５のもしくは約１：２．５の、１：２．８のもしくは約１：２．８の、または１：３のもしくは約１：３の、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比率を有する。

【0438】

一部の実施形態では、濃縮組成物は、３：１から１：３の間、２．５：１から１：２．５の間、２：１から１：２の間、１．５：１から１：１．５の間、１．４：１から１：１．４の間、１．３：１から１：１．３の間、１．２：１から１：１．２の間、または１．１：１から１：１．１の間の、組換え受容体、例えばＣＡＲ、を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の、組換え受容体、例えばＣＡＲ、を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比率を含有する。一部の実施形態では、濃縮組成物における、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の、組換え受容体（例えばＣＡＲ）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比率は、３：１のもしくは約３：１の、２．８：１のもしくは約２．８：１の、２．５：１のもしくは約２．５：１の、２．２５：１のもしくは約２．２５：１の、２：１のもしくは約２：１の、１．８：１のもしくは約１．８：１の、１．７：１のもしくは約１．７：１の、１．６：１のもしくは約１．６：１の、１．５：１のもしくは約１．５：１の、１．４：１のもしくは約１．４：１の、１．３：１のもしくは約１．３：１の、１．２：１のもしくは約１．２：１の、１．１：１のもしくは約１．１：１の、１：１のもしくは約１：１の、１：１．１のもしくは約１：１．１の、１：１．２のもしくは約１：１．２の、１：１．３のもしくは約１：１．３の、１：１．４のもしくは約１：１．４の、１：１．５のもしくは約１：１．５の、１：１．６のもしくは約１：１．６の、１：１．７のもしくは約１：１．７の、１：１．８のもしくは約１：１．８の、１：２のもしくは約１：２の、１：２．２５のもしくは約１：２．２５の、１：２．５のもしくは約１：２．５の、１：２．８のもしくは約１：２．８の、または１：３のもしくは約１：３の比率である。

【0439】

一部の実施形態では、提供される方法に関連して生成または生産される濃縮組成物は、組換え受容体、例えばＴＣＲまたはＣＡＲ、を発現する細胞を含有する。一部の実施形態では、組換え受容体を発現することは、細胞膜および／もしくは細胞表面に局在する１つもしくは複数の組換え受容体タンパク質を有すること、検出可能な量の組換え受容体タンパク質を有すること、組換え受容体をコードする検出可能な量のｍＲＮＡを有すること、組換え受容体をコードする組換えポリヌクレオチドを有することもしくは含有すること、ならびに／または組換え受容体発現についてのサロゲートマーカーであるｍＲＮＡもしくはタンパク質を有することもしくは含有することを含み得るが、これらに限定されない。

【0440】

一部の実施形態では、濃縮組成物の細胞の少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または約９９％より多くは、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、濃縮組成物の細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、濃縮組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または約９９％より多くは、組換え受容体を発現する。一部の実施形態では、濃縮組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、濃縮組成物の細胞の少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または９９％より多くは、組換え受容体を発現するＣＤ３＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、濃縮組成物の細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現するＣＤ３＋Ｔ細胞である。

【0441】

特定の実施形態では、濃縮組成物のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または９９％より多くは、組換え受容体を発現する。特定の実施形態では、濃縮組成物のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現する。一部の実施形態では、濃縮組成物のＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９９％、または９９％より多くは、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、濃縮組成物のＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくともまたは約５０％は、組換え受容体を発現する。

【0442】

特定の実施形態では、濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、濃縮組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、濃縮組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。特定の実施形態では、濃縮組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。特定の実施形態では、濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。

【0443】

特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の、平均で、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の、平均で、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の平均で少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の、平均で、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の、平均で、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の平均で少なくとも９０％または少なくとも約９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の、平均で、少なくとも５０％もしくは少なくとも約５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも約６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも約７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも約７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも約８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも約９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも約９５％、少なくとも９９％もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９９．９％もしくは少なくとも約９９．９％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の、平均で、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物の組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の平均で少なくとも９０％は、生細胞、例えば、カスパーゼ（例えば、活性化カスパーゼ－３）などのアポトーシスマーカーについて陰性の細胞である。

【0444】

前記実施形態のいずれかでは、本明細書で開示される方法によって生産される複数の濃縮組成物は、同じまたは異なるドナーに由来し得る。一部の態様では、複数の濃縮組成物のうちの少なくとも２つは、異なるドナーに由来する。一部の態様では、複数の濃縮組成物の各々は、いくつかの異なるドナーのうちの１つに由来し、例えば、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、または約６０より多くの異なるドナー、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法などの細胞療法を必要とする患者に由来する。

【0445】

特定の実施形態では、濃縮組成物の細胞の大部分は、ナイーブもしくはナイーブ様細胞、中枢記憶細胞、および／またはエフェクター記憶細胞である。特定の実施形態では、濃縮組成物の細胞の大部分は、ナイーブ様細胞または中枢記憶細胞である。一部の実施形態では、濃縮組成物の細胞の大部分は、中枢記憶細胞である。一部の態様では、より分化度の低い細胞、例えば、中枢記憶細胞は、より長寿命であり、あまり急速に疲弊せず、そのため持続性および耐久性が増大される。一部の態様では、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法などの細胞療法の奏効者は、中枢記憶遺伝子の発現増加を有する。例えば、Fraietta et al. (2018) Nat Med. 24(5):563-571を参照されたい。

【0446】

ある特定の実施形態では、濃縮組成物の細胞は、ナイーブ様Ｔ細胞、またはナイーブ様Ｔ細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるＴ細胞の、割合および／または頻度が高い。ある特定の実施形態では、濃縮組成物の細胞は、代替プロセス、例えば、拡大を含むプロセス（例えば、拡大ユニット作動を含む、および／または細胞の拡大を引き起こすことを目的とする工程を含む、プロセス）から生成される濃縮組成物よりナイーブ様細胞の割合および／または頻度が大きい。ある特定の実施形態では、ナイーブ様Ｔ細胞は、種々の分化状態の細胞を含み得、ある特定の細胞マーカーの陽性もしくは高発現（例えば、表面発現もしくは細胞内発現）および／または他の細胞マーカーの陰性もしくは低発現（例えば、表面発現もしくは細胞内発現）を特徴とし得る。一部の態様では、ナイーブ様Ｔ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、および／またはＣＤ２７の陽性または高発現を特徴とする。一部の態様では、ナイーブ様Ｔ細胞は、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、および／またはＫＬＲＧ１の陰性発現を特徴とする。一部の態様では、ナイーブ様Ｔ細胞は、ＣＤ９５の低発現を特徴とする。ある特定の実施形態では、ナイーブ様Ｔ細胞、またはナイーブ様Ｔ細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるＴ細胞は、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋であり、これらの細胞は、ＣＤ２７＋またはＣＤ２７－である。ある特定の実施形態では、ナイーブ様Ｔ細胞、またはナイーブ様Ｔ細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるＴ細胞は、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋であり、これらの細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋またはＣＤ４５ＲＡ－である。ある特定の実施形態では、ナイーブ様Ｔ細胞、またはナイーブ様Ｔ細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ－ＣＣＲ７＋である。

【0447】

ＩＩＩ．細胞組成物を脱ビーズ化する方法
遠心分離機システム（例えば、「逆」または連続向流遠心分離機システム）を使用してビーズを除去するまたは細胞組成物を「脱ビーズ化」する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、細胞組成物は、節Ｉ．Ａ．ｉに記載のもののいずれか、例えば、事前にビーズ（例えば、常磁性ビーズ）とインキュベートされた細胞組成物を含む。したがって、一部の実施形態では、細胞組成物は、細胞（例えば、Ｔ細胞）およびビーズ（例えば、常磁性ビーズ）を含む。

【0448】

一部の実施形態では、ビーズは、常磁性ビーズ、例えば、常磁性ポリスチレンビーズである。一部の実施形態では、細胞は、例えば、細胞を活性化または刺激するために、ビーズとのインキュベーションに事前に付された。一部の実施形態では、ビーズは、刺激剤でコーティングされている。一部の実施形態では、刺激試薬は、ＴＣＲ複合体の１つまたは複数の構成要素の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化可能である。一部の実施形態では、刺激試薬は、（ｉ）ＴＣＲ複合体のメンバーに特異的に結合する一次薬剤；および（ｉｉ）Ｔ細胞共刺激分子に特異的に結合する二次薬剤を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、ＣＤ３に特異的に結合する。一部の実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０またはＩＣＯＳから選択される。一部の実施形態では、一次および二次薬剤の少なくとも一方は、抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、一次薬剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、二次薬剤は、抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、ビーズは、抗ＣＤ３抗体でコーティングされたビーズを含む。一部の実施形態では、ビーズは、抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズを含む。一部の実施形態では、ビーズは、抗ＣＤ３抗体でコーティングされたビーズ、および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズを含む。

【0449】

一部の実施形態では、細胞組成物は、少なくとも約１０×１０^６個のビーズ、少なくとも約２５×１０^６個のビーズ、少なくとも約５０×１０^６個のビーズ、少なくとも約７５×１０^６個のビーズ、少なくとも約１００×１０^６個のビーズ、少なくとも約１２５×１０^６個のビーズ、少なくとも約１５０×１０^６個のビーズ、少なくとも約１７５×１０^６個のビーズ、少なくとも約２００×１０^６個のビーズ、少なくとも約２２５×１０^６個のビーズ、少なくとも約２５０×１０^６個のビーズ、少なくとも約２７５×１０^６個のビーズ、または少なくとも約３００×１０^６個のビーズを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約１００×１０^６個のビーズを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約１５０×１０^６個のビーズを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約２００×１０^６個のビーズを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約２５０×１０^６個のビーズを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、約３００×１０^６個のビーズを含む。

【0450】

一部の実施形態では、方法は、（ｉ）第１の遠心力および第１の流量を適用して細胞の流動床を確立すること；および（ｉｉ）第２の遠心力および第２の流量を適用して細胞組成物からビーズを除去することによって、脱ビーズ化組成物を生成することを含む。

【0451】

一部の実施形態では、方法は、第１の遠心力および第１の流量を適用する前に円錐形の流体エンクロージャーに細胞組成物を投入することを含む。

【0452】

一部の実施形態では、遠心分離機システムは、円錐形の流体エンクロージャー内にカニューレを含む。一部の実施形態では、カニューレは、円錐形の流体エンクロージャーの長さに沿って伸びている。一部の実施形態では、カニューレの一方の末端は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近にある。一部の実施形態では、カニューレの他方の末端は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近、例えば、広端の中心またはその付近にある。

【0453】

一部の実施形態では、細胞組成物は、円錐形の流体エンクロージャーにカニューレ経由で投入される。一部の実施形態では、細胞組成物は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近において、円錐形の流体エンクロージャーに投入される。一部の実施形態では、細胞組成物は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端に入り、円錐形の流体エンクロージャーの尖端または付近におけるカニューレの末端から出ることによって、円錐形の流体エンクロージャーに投入される。

【0454】

一部の実施形態では、ビーズは、円錐形の流体エンクロージャーから細胞を水簸することによって細胞組成物から除去される。一部の実施形態では、水簸された細胞は、円錐形の流体エンクロージャーの広端における開口部経由で円錐形の流体エンクロージャーから出る。一部の実施形態では、開口部は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端を少なくとも部分的に包囲している。一部の実施形態では、開口部は、円錐形の流体エンクロージャーの広端またはその付近におけるカニューレの末端を包囲している。

【0455】

一部の実施形態では、ビーズは、円錐形の流体エンクロージャーの中に残存する。一部の実施形態では、ビーズは、細胞の水簸後に円錐形の流体エンクロージャーから除去される。一部の実施形態では、ビーズは、カニューレ経由で除去される。一部の実施形態では、ビーズは、円錐形の流体エンクロージャーの尖端またはその付近におけるカニューレの末端に入り、円錐形の流体エンクロージャーの広端または付近におけるカニューレの末端から出る。

【0456】

一部の実施形態では、第１の遠心力は、約５００Ｇから約２，０００Ｇの間、または約７５０Ｇから約１，５００Ｇの間、または約５００Ｇから約１，０００Ｇの間である。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，０００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，５００Ｇである。一部の実施形態では、第１の遠心力は、約２，０００Ｇである。

【0457】

一部の実施形態では、第１の流量は、半径方向内向きである。一部の実施形態では、第１の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から離れる方向に向けられている。一部の実施形態では、第１の遠心力は、第１の流量によって相殺される。一部の実施形態では、第１の流量は、対向流量である。

【0458】

一部の実施形態では、第１の流量は、カニューレを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、カニューレを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、カニューレから出て、円錐形の流体エンクロージャーにその尖端から入る。

【0459】

一部の実施形態では、第１の流量は、約１０ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間、約１５ｍＬ／分から約４５ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の間、または約２５ｍＬ／分から約３５ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第１の流量は、約２０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約２５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約３０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約３５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約４０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約４５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第１の流量は、約５０ｍＬ／分である。

【0460】

一部の実施形態では、第１の遠心力は、約１，０００Ｇであり、第１の流量は、約３０ｍＬ／分である。

【0461】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１００Ｇから約１，０００Ｇの間、約２００Ｇから約８００Ｇの間、または約４００Ｇから約６００Ｇの間である。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約１００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約２００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約３００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約４００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約５００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約６００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約７００Ｇである。一部の実施形態では、第２の遠心力は、約８００Ｇである。

【0462】

一部の実施形態では、第２の流量は、半径方向内向きである。一部の実施形態では、第２の流量は、円錐形の流体エンクロージャーの尖端から離れる方向に向けられている。一部の実施形態では、第２の遠心力は、第２の流量によって相殺される。一部の実施形態では、第２の流量は、対向流量である。

【0463】

一部の実施形態では、第２の流量は、カニューレを通る培地の流れによる影響を受ける。一部の実施形態では、カニューレを通る培地の流れは、円錐形の流体エンクロージャーの広端から尖端への流れである。一部の実施形態では、培地は、カニューレから出て、円錐形の流体エンクロージャーにその尖端から入る。

【0464】

一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の間、約２０ｍＬ／分から約８０ｍＬ／分の間、または約３０ｍＬ／分から約６０ｍＬ／分の間である。一部の実施形態では、第２の流量は、約１０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約２０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約３０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約４０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約５０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約６０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約７０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約８０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約９０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、第２の流量は、約１００ｍＬ／分である。

【0465】

一部の実施形態では、第２の遠心力は、約６００Ｇであり、第２の流量は、約５０ｍＬ／分である。

【0466】

一部の実施形態では、第２の遠心力および第２の流量の適用は、細胞組成物からビーズの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％を除去する。

【0467】

一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、細胞組成物に含有されるビーズの約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０２％未満、または約０．０１％未満を含有する。一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、細胞組成物に含有されるビーズの約１０％を含有する。一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、細胞組成物に含有されるビーズの約５％を含有する。一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、細胞組成物に含有されるビーズの約１％を含有する。一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、細胞組成物に含有されるビーズの約１％を含有する。一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、細胞組成物に含有されるビーズの約０．５％を含有する。一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、細胞組成物に含有されるビーズの約０．１％を含有する。一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、細胞組成物に含有されるビーズの約０．０５％を含有する。一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、細胞組成物に含有されるビーズの約０．０１％を含有する。一部の実施形態では、脱ビーズ化組成物は、脱ビーズ化アウトプット組成物として収集される。一部の実施形態では、方法は、脱ビーズ化アウトプット組成物を１つまたは複数の追加の処理工程、例えば、細胞の形質導入、洗浄、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、刺激、増殖、および／または製剤化に付すことを含む。一部の実施形態では、脱ビーズ化アウトプット組成物は、その後、細胞療法における使用などのために形質導入に付される。

【0468】

ＩＶ．ウイルスベクター粒子
一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルス粒子である。一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、ウイルスベクターのゲノムに、組換えおよび／または異種分子、例えば、組換えまたは異種タンパク質、例えば、組換えおよび／または異種受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または他の抗原受容体をコードする核酸を含有する。一部の実施形態では、組換え分子は、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、抗原受容体（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲ）、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、組換え分子は、ケモカインである。一部の実施形態では、組換え分子は、ケモカイン受容体である。一部の実施形態では、組換え分子は、サイトカインである。一部の実施形態では、組換え分子は、サイトカイン受容体である。一部の実施形態では、組換え分子は、抗体受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）である。一部の実施形態では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一部の実施形態では、抗原受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。ウイルスベクター粒子のゲノムは、典型的には、組換え分子をコードする核酸に加えて配列を含む。そのような配列には、ゲノムをウイルス粒子にパッケージングことを可能にする配列、および／またはＣＡＲなどの組換え受容体をコードする核酸の発現を促進する配列を挙げることができる。

【0469】

Ａ．ウイルスベクター
一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスゲノムベースのベクターに由来するゲノム、例えば、レンチウイルスゲノムベースのベクターに由来するゲノムを含有する。提供されるウイルスベクターの一部の態様では、組換え受容体、例えば、抗原受容体、例えばＣＡＲ、をコードする異種核酸は、ベクターゲノムの５’ＬＴＲと３’ＬＴＲ配列の間に含有される、および／またはその間に位置する。

【0470】

一部の実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、レンチウイルスゲノム、例えば、ＨＩＶ－１ゲノムまたはＳＩＶゲノムである。例えば、レンチウイルスベクターは、病原性遺伝子を多様に弱毒化するによって生成されており、例えば、治療目的のために遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させて、ベクターをより安全にすることができる。レンチウイルスベクターは周知である。Naldini et al.. (1996 and 1998);Zufferey et al., (1997)；Dull et al., 1998、米国特許第６，０１３，５１６号；および同５，９９４，１３６号を参照されたい。一部の実施形態では、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸を統合するための、選択のための、および宿主細胞への核酸の移動のための必須の配列を保持するように構成される。公知のレンチウイルスは、保管所またはコレクション、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０－２２０９）から容易に得ることができる、または商業的に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離できる。

【0471】

レンチウイルスベクターの限定されない例として、レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ－１）、ＨＴＬＶ－２またはウマ感染貧血ウイルス（Ｅ１ＡＶ）に由来するものが挙げられる。例えば、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多様に弱毒化することによって生成されており、例えば、治療目的のために遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させ、ベクターをより安全にする。レンチウイルスベクターは当該技術分野で公知であり、Naldini et al., (1996 and 1998);Zufferey et al., (1997)；Dull et al., 1998、米国特許第６，０１３，５１６号；および同５，９９４，１３６号を参照されたい。一部の実施形態では、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸を統合するための、選択のための、および宿主細胞への核酸の移動のための必須の配列を保持するように構成される。公知のレンチウイルスは、保管所またはコレクション、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０－２２０９）から容易に得ることができる、または商業的に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離できる。

【0472】

一部の実施形態では、ウイルスゲノムベクターは、レンチウイルスなどのレトロウイルスの５’および３’ＬＴＲの配列を含有し得る。一部の態様では、ウイルスゲノムコンストラクトは、レンチウイルスの５’および３’ＬＴＲ由来の配列を含有し得る、特に、レンチウイルスの５’ＬＴＲ由来のＲおよびＵ５配列ならびにレンチウイルス由来の不活性化された３’ＬＴＲまたは自己不活性化３’ＬＴＲを含有し得る。ＬＴＲ配列は、任意の種に由来する任意のレンチウイルスに由来するＬＴＲ配列であり得る。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＢＩＶ由来のＬＴＲ配列であり得る。通常、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ ＬＴＲ配列である。

【0473】

一部の実施形態では、ＨＩＶウイルスベクターなどのウイルスベクターの核酸は、追加の転写ユニットを欠く。ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含有することができる（Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998；Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998）。例えば、ウイルスベクターＲＮＡを生成するために使用される核酸の３’ＬＴＲのＵ３領域における欠失を使用して、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターを生成できる。次いで、この欠失を逆転写の際にプロウイルスのＤＮＡの５’ＬＴＲに移すことができる。自己不活性化ベクターは一般に、３’の長い末端反復配列（ＬＴＲ）からエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有し、これは、ベクター統合の際に５’ＬＴＲ中にコピーされる。一部の実施形態では、ＬＴＲの転写活性を消失させるために、ＴＡＴＡボックスの除去を含む十分な配列が排除され得る。これは、形質導入された細胞における全長ベクターＲＮＡの産生を妨げ得る。一部の態様では、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１およびＮＦ－カッパＢ部位の欠失を含有する。自己不活性化３’ＬＴＲの結果として、侵入および逆転写後に生成されるプロウイルスは、不活性化された５’ＬＴＲを含有する。これは、ベクターゲノムの動員および隣接する細胞性プロモーターに対するＬＴＲの影響のリスクを低減することによって安全性を改善し得る。自己不活性化３’ＬＴＲは、当該技術分野で公知の任意の方法によって構築できる。一部の実施形態では、これは、ベクターのベクター力価またはインビトロもしくはインビボ特性に影響しない。

【0474】

適宜、ウイルスコンストラクト、例えば、異種プロモーター配列において、レンチウイルス５’ＬＴＲ由来のＵ３配列をプロモーター配列と置き換えることができる。これは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を増大し得る。エンハンサー配列もまた、含まれ得る。 パッケージング細胞株においてウイルスＲＮＡゲノムの発現を増大する任意のエンハンサー／プロモーターの組合せが使用され得る。一例では、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（米国特許第５，３８５，８３９号および米国特許第５，１６８，０６２号）。

【0475】

ある特定の実施形態では、統合に欠陥のあるレトロウイルスベクターゲノム、例えば、レンチウイルスベクターゲノムを構築することによって、挿入変異誘発のリスクを最小にすることができる。非組込みベクターゲノムを生成するために様々なアプローチを追求できる。一部の実施形態では、不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、ｐｏｌ遺伝子のインテグラーゼ酵素構成要素中に突然変異（複数可）を操作することができる。一部の実施形態では、ベクターゲノム自体を改変して、例えば、一方または両方の付着部位を変異または欠失させることによって、または欠失もしくは改変によって３’ＬＴＲ近位ポリプリントラクト（ＰＰＴ）を非機能性にすることによって統合を妨げることができる。一部の実施形態では、非遺伝的アプローチが利用可能であり、これらには、インテグラーゼの１つまたは複数の機能を阻害する薬理学的薬剤が含まれる。アプローチは、相互に排他的ではなく、すなわち、それらのうち２つより多くを一度に使用できる。例えば、インテグラーゼおよび付着部位の両方が非機能的である場合があり、またはインテグラーゼおよびＰＰＴ部位が非機能的である場合があり、または結合部位およびＰＰＴ部位が非機能的である場合があり、またはそれらの全てが非機能的である場合がある。そのような方法およびウイルスベクターゲノムは公知であり、利用可能である［Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007；Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995；Brown et al J Virol 73:9011 (1999)；ＷＯ２００９／０７６５２４；McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003；Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996を参照されたい］。

【0476】

一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞、例えば、原核生物の宿主細胞における増殖のための配列を含有する。一部の実施形態では、ウイルスベクターの核酸は、原核細胞、例えば、細菌細胞における増殖のための１つまたは複数の複製の起源を含有する。一部の実施形態では、原核生物の複製起点を含むベクターはまた、その発現が検出可能なまたは薬物耐性などの選択マーカーを付与する遺伝子を含有し得る。

【0477】

一部の実施形態では、ウイルスベクターは、異種組換えタンパク質をコードする核酸を含有する。一部の実施形態では、異種組換え分子は、組換え受容体、例えば、抗原受容体、ＳＢ－トランスポゾン、例えば遺伝子サイレンシングのためＳＢ－トランスポゾン、カプシドに閉じ込められたトランスポゾン、相同二本鎖核酸、例えば、ゲノム組換えのための相同二本鎖核酸、もしくはレポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰもしくはルシフェラーゼ）であるか、またはそれを含む。

【0478】

一部の実施形態では、ウイルスベクターは、組換え受容体および／またはキメラ受容体、例えば異種受容体タンパク質、をコードする、核酸を含有する。組換え受容体、例えば、異種受容体は、抗原受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をはじめとする機能的非ＴＣＲ受容体、および他の抗原結合受容体、例えばトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み得る。受容体は、他の受容体、例えば、他のキメラ受容体、例えば、特定のリガンドに結合する受容体であって、ＣＡＲに存在するものに類似している膜貫通および／または細胞内シグナル伝達ドメインを有する受容体も含み得る。

【0479】

そのような例のいずれかでは、核酸は、ウイルスベクターの領域に、例えば、一般にウイルスゲノムの非必須領域に、挿入されるか、またはそこに位置する。一部の態様では、核酸は、複製欠損性であるウイルスを生産するために、ある特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入される。

【0480】

一部の実施形態では、コードされる組換え抗原受容体、例えば、ＣＡＲは、提供される方法および組成物による標的化のための本明細書に記載されるものを含む、がん、感染症、炎症性もしくは自己免疫疾患、または他の疾患もしくは状態などの標的化される疾患の細胞における１つまたは複数のリガンドに特異的に結合できるものである。

【0481】

ある特定の実施形態では、例示的な抗原は、αｖβ６インテグリン（ａｖｂ６インテグリン）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９、またＣＡＩＸもしくはＧ２５０としても公知）、がん精巣抗原、がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ、またＮＹ－ＥＳＯ－１およびＬＡＧＥ－２としても公知）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイクリン、サイクリンＡ２、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ－１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、上皮成長因子タンパク質（ＥＧＦＲ）、切断型上皮成長因子タンパク質（ｔＥＧＦＲ）、ＩＩＩ型上皮成長因子受容体突然変異（ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ－２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ－４０）、エフリンＢ２、エフリン受容体Ａ２（ＥＰＨａ２）、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５；またＦｃ受容体ホモログ５もしくはＦＣＲＨ５としても公知）、胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドＧＤ２、Ｏ－アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、Ｇタンパク質共役受容体５Ｄ（ＧＰＣＲ５Ｄ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原Ａ１（ＨＬＡ－Ａ１）、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２受容体アルファ（ＩＬ－２２Ｒａ）、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒａ２）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、カッパ軽鎖、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ロイシンリッチリピート含有８ファミリーメンバーＡ（ＬＲＲＣ８Ａ）、ルイスＹ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、マウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、メランＡ（ＭＡＲＴ－１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん胎児性抗原、黒色腫の優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４としても公知のＴＰＢＧ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、病原体特異的抗原、またはユニバーサルタグと会合した抗原、および／またはビオチン化分子、および／またはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶもしくは他の病原体によって発現される分子であるか、あるいはこれらを含む。一部の実施形態において受容体によって標的化される抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば多くの公知のＢ細胞マーカーのいずれかを含む。一部の実施形態では、受容体によって標的化される抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ３０である。

【0482】

一部の実施形態では、例示的な抗原は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌｌ－ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４、０ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３もしくは４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＩＬ－２２Ｒ－アルファ、ＩＬ－１３Ｒ－アルファ２、ｋｄｒ、カッパ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１－細胞接着分子、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ－１、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＤ－２、およびＭＡＧＥ Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、サイクリン、例えばサイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ならびに／あるいはビオチン化分子、ならびに／あるいはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶおよび／もしくは他の病原体および／もしくはこれらの発がん性バージョンによって発現されるおよび／またはそれらに特有のもしくは特異的な分子である。

【0483】

一部の実施形態では、抗原は、病原体特異的または病原体発現抗原であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原（ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ等由来のウイルス抗原など）、細菌抗原、および／または寄生虫抗原である。

【0484】

ＣＡＲおよび組換えＴＣＲをはじめとする例示的な組換え受容体、ならびにそれらの産生および導入は、一部の実施形態では、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開第２００２１３１９６０号、同第２０１３２８７７４８号、同第２０１３０１４９３３７号、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号および同第８，４７９，１１８号ならびに欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されているもの、ならびに／またはSadelain et al., Cancer Discov.2013 April; 3(4): 388-398；Davila et al. (2013) PloS ONE 8(4): e61338；Turtle et al., Curr.Opin. Immunol., 2012 October；24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75によって記載されているものを含む。

【0485】

ｉ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
一部の実施形態では、ウイルスベクターのゲノムに含有される核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。ＣＡＲは、一般に、１つまたは複数の細部内シグナル伝達構成要素に連結されている細胞外リガンド結合ドメイン、例えば抗体またはその断片を含有する細胞外部分、を有する遺伝子操作された受容体である。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する、膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを含む。そのような分子は、典型的には、天然の抗原受容体を通じたシグナル、および／または共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を通じたシグナルを模倣または近似する。

【0486】

一部の実施形態では、特定のマーカー、例えば、養子療法の標的とされる特定の細胞型に発現されるマーカー、例えば、がんマーカー、および／または記載される抗原のいずれかに対する特異性を有する、ＣＡＲが、構築される。したがって、ＣＡＲは、典型的に、抗体の１つもしくは複数の抗原結合性断片、ドメインもしくは一部分、または１つもしくは複数の抗体可変ドメイン、および／または抗体分子を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体分子の抗原結合部分（単数もしくは複数）、例えば、可変重鎖（ＶＨ）もしくはその抗原結合部分、またはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。

【0487】

一部の実施形態では、特定の細胞型の表面に発現される抗原などの特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）に対する特異性を有するＣＡＲを発現する操作された細胞、例えば、Ｔ細胞が、提供される。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、それは、炭水化物または他の分子である。一部の実施形態では、抗原は、正常な、または標的化されていない細胞または組織と比較して、疾患または状態を有する細胞で、例えば、腫瘍または病原性の細胞で、選択的に発現または過剰発現される。他の実施形態では、抗原は、正常細胞で発現され、および／または操作された細胞で発現される。

【0488】

特定の実施形態では、組換え受容体、例えば、キメラ受容体は、細胞内シグナル伝達領域であって、細胞質シグナル伝達ドメインもしくは領域（互換的に、細胞内シグナル伝達ドメインもしくは領域とも呼ばれる）、例えば、Ｔ細胞において一次活性化シグナルを誘導可能である細胞質（細胞内）領域、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）構成要素の細胞質シグナル伝達ドメインもしくは領域［例えば、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞質シグナル伝達ドメインもしくは領域、またはその機能性変異体もしくはシグナル伝達部分］を含む、および／または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、細胞内シグナル伝達領域を含有する。

【0489】

一部の実施形態では、キメラ受容体は、リガンド（例えば抗原）抗原に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインをさらに含有する。一部の実施形態では、キメラ受容体は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含有するＣＡＲである。一部の実施形態では、抗原などのリガンドは、細胞の表面に発現されるタンパク質である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原は、処理されたペプチド抗原、例えば、細胞内タンパク質のペプチド抗原であり、これは、ＴＣＲと同様に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子の文脈において細胞表面で認識される。

【0490】

ＣＡＲをはじめとする例示的な抗原受容体、ならびにそのような受容体を操作するためのおよび細胞に導入するための方法は、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開第２００２１３１９６０号、同第２０１３２８７７４８号、同第２０１３０１４９３３７号、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号および同第８，４７９，１１８号ならびに欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されているもの、ならびに／またはSadelain et al., Cancer Discov.2013 April; 3(4): 388-398；Davila et al. (2013) PloS ONE 8(4): e61338；Turtle et al., Curr.Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39；Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75によって記載されているものを含む。一部の態様では、抗原受容体には、米国特許第７，４４６，１９０号に記載のＣＡＲ、および国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４０５５６６８ Ａ１に記載されているものが挙げられる。ＣＡＲの例には、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ ８，３３９，６４５、ＵＳ ７，４４６，１７９、ＵＳ ２０１３／０１４９３３７、米国特許第７，４４６，１９０号、米国特許第８，３８９，２８２号、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， １０， ２６７－２７６ （２０１３）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３５（９）： ６８９－７０１；およびＢｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１３ ５（１７７）などの上述の刊行物のいずれかに開示のＣＡＲが挙げられる。ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ ８，３３９，６４５、ＵＳ ７，４４６，１７９、ＵＳ ２０１３／０１４９３３７、米国特許第７，４４６，１９０号、および米国特許第８，３８９，２８２号も参照のこと。

【0491】

一部の実施形態では、特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）、例えば、養子療法の標的とされる特定の細胞型に発現される抗原、例えば、がんマーカー、および／または弱める応答を誘導することを目的とする抗原、例えば、正常もしくは非罹病細胞型上に発現される抗原に対する特異性を有する、ＣＡＲが、構築される。したがって、ＣＡＲは、典型的には、その細胞外部分に１つまたは複数の抗原結合分子、例えば、１つもしくは複数の抗原結合性断片、ドメインもしくは部分、または１つもしくは複数の可変ドメイン、および／または抗体分子を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体分子の抗原結合部分（単数または複数）、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。

【0492】

ＣＡＲをはじめとする例示的な抗原受容体、ならびにそのような受容体を操作するためのおよび細胞に導入するための方法は、例えば、国際特許公開番号ＷＯ２０００／１４２５７、ＷＯ２０１３／１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４／０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、ＷＯ２０１６／００４６７２４、ＷＯ２０１６／０１４７８９、ＷＯ２０１６／０９０３２０、ＷＯ２０１６／０９４３０４、ＷＯ２０１７／０２５０３８およびＷＯ２０１７／１７３２５６、米国特許出願公開第２００２１３１９６０号、同第２０１３２８７７４８号および同第２０１３０１４９３３７号、ならびに米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号、同第８，４７９，１１８号および同第９，７６５，３４２号、ならびに欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されているもの、ならびに／またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39；およびWu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75によって記載されているものを含む。一部の態様では、抗原受容体は、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されているようなＣＡＲ、および国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４０５５６５８ Ａ１に記載されているものを含む。ＣＡＲの例としては、上述の刊行物のいずれか、例えば、ＷＯ２０１４０３１６８７、米国特許第８，３３９，６４５号、米国特許第７，４４６，１７９号、米国特許出願公開第２０１３／０１４９３３７号、米国特許第７，４４６，１９０号、米国特許第８，３８９，２８２号、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013)；Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)において開示されているようなＣＡＲが挙げられる。ＷＯ２０１４０３１６８７、米国特許第８，３３９，６４５号、米国特許第７，４４６，１７９号、米国特許出願公開第２０１３／０１４９３３７号、米国特許第７，４４６，１９０号、および米国特許第８，３８９，２８２号も参照されたい。

【0493】

例示的な抗原受容体、例えば、ＣＡＲはまた、Marofi et al., Stem Cell Res Ther 12: 81 (2021)；Townsend et al., J Exp Clin Cancer Res 37: 163 (2018)；Ma et al., Int J Biol Sci 15(12): 2548-2560 (2019)；Zhao and Cao, Front Immunol 10: 2250 (2019)；Han et al., J Cancer 12(2): 326-334 (2021)；Specht et al., Cancer Res 79: 4 Supplement, Abstract P2-09-13；Byers et al., Journal of Clinical Oncology 37, no. 15_suppl (2019)；Panowski et al., Cancer Res 79 (13 Supplement) 2326 (2019)；およびSauer et al., Blood 134 (Supplement_1): 1932 (2019)に記載されているいずれかを含むか、または米国特許第８，１５３，７６５号、同第８，６０３，４７７号および同第８，００８，４５０号、米国特許出願公開第２０１２０１８９６２２号および同第２０１００２６０７４８号、ならびに国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６０９９８７５、ＷＯ２００９０８０８２９、ＷＯ２０１２０９２６１２およびＷＯ２０１４２１００６４に記載されている抗体もしくは抗原結合性断片のいずれかを含有し得る。

【0494】

さらなる例示的な抗原受容体、例えば、ＣＡＲ、例えば抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、イデカブタゲンビクルユーセル、ＡＢＥＣＭＡ（著作権）、ＢＣＭＡ０２、ＪＣＡＲＨ１２５、ＪＮＪ－６８２８４５２８［ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ；シルタカブタジンオートルーセル；ＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）］（Ｊａｎｓｓｅｎ／Ｌｅｇｅｎｄ）、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１（Ｐｏｓｅｉｄａ）、ＰＢＣＡＲ２６９Ａ（Ｐｏｓｅｉｄａ）、Ｐ－ＢＣＭＡ－Ａｌｌｏ１（Ｐｏｓｅｉｄａ）、Ａｌｌｏ－７１５（Ｐｆｉｚｅｒ／Ａｌｌｏｇｅｎｅ）、ＣＴ０５３（Ｃａｒｓｇｅｎ）、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－０８（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）、ＰＨＥ８８５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＲＩ－００２（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、ＩＤＩＢＡＰＳ）、およびＣＴＸ１２０（ＣＲＩＳＰＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）のＣＡＲを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、イデカブタゲンビクルユーセル細胞のＣＡＲである。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）細胞（ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）免疫療法において使用される細胞）のＣＡＲである。特定の実施形態では、ＣＡＲは、シルタカブタジンオートルーセル細胞のＣＡＲである。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）細胞［ＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）免疫療法において使用される細胞］のＣＡＲである。

【0495】

例示的な抗原受容体、例えばＣＡＲはまた、ＦＤＡ承認製品ＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）（リソカブタゲンマラルユーセル）、ＴＥＣＡＲＴＵＳ（商標）（ブレクスカブタゲンオートルユーセル）、ＫＹＭＲＩＡＨ（商標）（チサゲンレクルユーセル）、およびＹＥＳＣＡＲＴＡ（商標）（アキシカブタゲンシロルユーセル）、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）（イデカブタゲンビクルユーセル）、およびＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）（シルタカブタジンオートルーセル）のＣＡＲも含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、ＣＡＲは、ＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）（リソカブタゲンマラルユーセル）、ＴＥＣＡＲＴＵＳ（商標）（ブレクスカブタゲンオートルユーセル）、ＫＹＭＲＩＡＨ（商標）（チサゲンレクルユーセル）、ＹＥＳＣＡＲＴＡ（商標）（アキシカブタゲンシロルユーセル）、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）（イデカブタゲンビクルユーセル）、またはＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）（シルタカブタジンオートルーセル）のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかの一部では、ＣＡＲは、ＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）［リソカブタゲンマラルユーセル、参照：Sehgal et al., 2020, Journal of Clinical Oncology 38:15_suppl, 8040；Teoh et al., 2019, Blood 134(Supplement_1):593；およびAbramson et al., 2020, The Lancet 396(10254): 839-852］のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかの一部では、ＣＡＲは、ＴＥＣＡＲＴＵＳ（商標）［ブレクスカブタゲンオートルユーセル、参照：Mian and Hill, 2021, Expert Opin Biol Ther; 21(4):435-441；および Wang et al., 2021, Blood 138(Supplement 1):744］のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかの一部では、ＣＡＲは、ＫＹＭＲＩＡＨ（商標）［チサゲンレクルユーセル、参照：Bishop et al., 2022, N Engl J Med 386:629:639；Schuster et al., 2019, N Engl J Med 380:45-56；Halford et al., 2021, Ann Pharmacother 55(4):466-479；Mueller et al., 2021, Blood Adv. 5(23):4980-4991；およびFowler et al., 2022, Nature Medicine 28:325-332］のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかの一部では、ＣＡＲは、ＹＥＳＣＡＲＴＡ（商標）［アキシカブタゲンシロルユーセル、参照：Neelapu et al., 2017, N Engl J Med 377(26):2531-2544；Jacobson et al., 2021, The Lancet 23(1):P91-103；およびLocke et al., 2022, N Engl J Med 386:640-654］のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかの一部では、ＣＡＲは、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）［イデカブタゲンビクルユーセル、参照：Raje et al., 2019, N Engl J Med 380:1726-1737；およびMunshi et al., 2021, N Engl J Med 384:705-716］のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかの一部では、ＣＡＲは、ＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）［シルタカブタジンオートルーセル、参照：Berdeja et al., Lancet. 2021 Jul 24;398(10297):314-324；およびMartin, Abstract #549 [Oral], presented at 2021 American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting & Exposition)］のＣＡＲである。

【0496】

一部の実施形態では、抗原は、ＢＣＭＡである。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体分子のＢＣＭＡ部分（単数または複数）、例えば、抗体、例えばｓｃＦｖ抗体断片、の重鎖可変（ＶＨ）領域および／または軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。キメラ受容体、例えば、ＣＡＲは、一般に、細胞外抗原結合ドメイン、例えば、抗体分子の一部分、一般に、抗体、例えばｓｃＦｖ抗体断片、の可変重鎖（ＶＨ）領域および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む。一部の実施形態では、提供されるＢＣＭＡ結合ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ抗体などの抗体またはその抗原結合性断片を含有し、これが、提供されるＣＡＲのＢＣＭＡ結合特性を付与する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合ドメインは、記載されるいずれかの抗ＢＣＭＡ抗体であり得るか、または記載されるいずれかの抗ＢＣＭＡ抗体に由来し得る。例えば、Carpenter et al., Clin. Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060；Feng et al., Scand. J. Immunol. (2020) 92:e12910；米国特許第９，０３４，３２４号、米国特許第９，７６５，３４２号、米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号、同第２０１７０１８３４１８号、および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１６０９０３２０、ＷＯ２０１６０９０３２７、ＷＯ２０１６０９４３０４、ＷＯ２０１６０１４５６５、ＷＯ２０１６０１４７８９、ＷＯ２０１０１０４９４９、ＷＯ２０１７０２５０３８、ＷＯ２０１７１７３２５６、ＷＯ２０１８０８５６９０、またはＷＯ２０２１０９１９７８を参照されたい。このような抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合性断片のいずれかを、提供されるＣＡＲにおいて使用することができる。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、１つまたは複数の単一ドメイン抗ＢＣＭＡ抗体を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の単一ドメイン抗ＢＣＭＡ抗体は、ＷＯ２０１７０２５０３８またはＷＯ２０１８０２８６４７に記載されている抗体に由来する。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、２つの単一ドメイン抗ＢＣＭＡ抗体を含有する。一部の実施形態では、２つの単一ドメイン抗ＢＣＭＡ抗体は、ＷＯ２０１７０２５０３８またはＷＯ２０１８０２８６４７に記載されている１つまたは複数の抗体に由来する。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ結合ドメインは、ＷＯ２０１７０２５０３８またはＷＯ２０１８０２８６４７に記載されており、例えば、ＷＯ２０１７０２５０３８またはＷＯ２０１８０２８６４７の配列番号３００、３０１および３０２（シグナルペプチドを伴うまたは伴わない）に提供されている、Ａ３７３５３－Ｇ４Ｓ－Ａ３７９１７（Ｇ４Ｓは、２つの結合ドメイン間のリンカーである）を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有するｓｃＦｖである抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有するｓｃＦｖは、ＷＯ２０１６０９０３２０またはＷＯ２０１６０９０３２７に記載されている抗体に由来する。一部の実施形態では、可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有するｓｃＦｖは、ＷＯ２０１９／０９０００３に記載されている抗体に由来する。一部の実施形態では、可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有するｓｃＦｖは、ＷＯ２０１６０９４３０４またはＷＯ２０２１０９１９７８に記載されている抗体に由来する。一部の実施形態では、可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有するｓｃＦｖは、ＷＯ２０１８１３３８７７に記載されている抗体に由来する。一部の実施形態では、可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有するｓｃＦｖは、ＷＯ２０１９１４９２６９に記載されている抗体に由来する。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＷＯ２０１９１７３６３６またはＷＯ２０２００５１３７４Ａに記載のいずれかである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＷＯ２０１８１０２７５２に記載のいずれかである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＷＯ２０２０１１２７９６またはＷＯ２０２１１７３６３０に記載のいずれかである。

【0497】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、例えばヒトＢＣＭＡ、に対して特異的である抗ＢＣＭＡ ＣＡＲである。マウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体およびヒト抗ヒトＢＣＭＡ抗体を含む、抗ＢＣＭＡ抗体を含有するキメラ抗原受容体、ならびにそのようなキメラ受容体を発現する細胞は、以前に記載されている。Carpenter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060、米国特許第９，７６５，３４２号、ＷＯ２０１６／０９０３２０、ＷＯ２０１６０９０３２７、ＷＯ２０１０１０４９４９Ａ２、ＷＯ２０１６／００４６７２４、ＷＯ２０１６／０１４７８９、ＷＯ２０１６／０９４３０４、ＷＯ２０１７／０２５０３８、およびＷＯ２０１７１７３２５６を参照されたい。

【0498】

一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＷＯ２０１６０９４３０４またはＷＯ２０２１０９１９７８に記載されている抗体に由来する可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有する、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖを含有する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有する抗体断片である。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＷＯ２０１６／０９０３２０またはＷＯ２０１６０９０３２７に記載されている抗体に由来する可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有する、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖを含有する。

【0499】

一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖもしくはＶ_Ｈドメイン）は、ＣＤ１９などの抗原を特異的に認識する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合性断片に由来するか、またはその変異体である。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ１９である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ１９に対して特異的な抗体または抗体断片に由来するＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含有する。一部の実施形態では、ＣＤ１９と結合する抗体または抗体断片は、マウス由来の抗体、例えばＦＭＣ６３およびＳＪ２５Ｃ１である。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、ヒト抗体であり、例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１６／０１５２７２３号に記載されるヒト抗体である。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一部の態様ではｓｃＦｖであり得る、ＦＭＣ６３に由来するＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌを含む。ＦＭＣ６３は、一般的に、ヒト起源のＣＤ１９を発現するＮａｌｍ－１および－１６細胞に対して生じたマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体を指す（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一部の態様ではｓｃＦｖであり得る、ＳＪ２５Ｃ１に由来するＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌを含む。ＳＪ２５Ｃ１は、ヒト起源のＣＤ１９を発現するＮａｌｍ－１および－１６細胞に対して生じたマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体である（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。

【0500】

一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ２０である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ２０に対して特異的な抗体または抗原断片に由来するＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含有する。一部の実施形態では、ＣＤ２０に結合する抗体または抗体断片は、リツキシマブである抗体、またはリツキシマブに由来する抗体、例えば、リツキシマブｓｃＦｖである。

【0501】

一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ２２である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ２２に対して特異的な抗体または抗原断片に由来するＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含有する。一部の実施形態では、ＣＤ２２に結合する抗体または抗体断片は、ｍ９７１である抗体、またはｍ９７１に由来する抗体、例えばｍ９７１ ｓｃＦｖである。

【0502】

一部の実施形態では、抗原または抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的な抗体または抗体断片由来のＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含有する。一部の実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄと結合する抗体または抗体断片は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０９０３２９およびＷＯ２０１６／０９０３１２に記載の抗体または抗体断片からのＶ_ＨおよびＶ_Ｌであるかまたはそれを含有する。

【0503】

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、抗原受容体などの組換え受容体の一部として細胞上に発現される。抗原受容体の中には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの機能性非ＴＣＲ抗原受容体が含まれる。一般に、ペプチド－ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲ様特異性を示す抗体または抗原結合性断片を含有するＣＡＲは、ＴＣＲ様ＣＡＲとも呼ばれ得る。一部の実施形態では、ＴＣＲ様ＣＡＲのＭＨＣ－ペプチド複合体に特異的な細胞外抗原結合性ドメインは、一部の態様ではリンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結される。一部の実施形態では、そのような分子は、典型的には、ＴＣＲなどの天然の抗原受容体を通じたシグナル、および適宜、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を通じたシグナルを模倣または近似することができる。

【0504】

一部の実施形態では、組換え受容体、例えば、キメラ受容体（例えば、ＣＡＲ）は、抗原（またはリガンド）に結合する、例えば特異的に結合する、リガンド結合ドメインを含む。キメラ受容体によって標的化される抗原の中には、養子細胞療法による標的にされる疾患、状態または細胞型に関連して発現されるものもある。疾患および状態の中には、血液がん、免疫系のがん、例えば、リンパ腫、白血病および／または骨髄腫、例えば、Ｂ、Ｔおよび骨髄性白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫を含む、がんおよび腫瘍を含む、増殖性、新生物性および悪性疾患および障害もある。

【0505】

一部の実施形態では、抗原（またはリガンド）は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、それは、炭水化物または他の分子である。一部の実施形態では、抗原（またはリガンド）は、正常なまたは標的化されていない細胞または組織と比較して、疾患または状態を有する細胞上に、例えば、腫瘍または病原性の細胞上に、選択的に発現または過剰発現される。他の実施形態では、抗原は、正常な細胞上に発現され、および／または操作された細胞上に発現される。

【0506】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞の表面に発現される無傷抗原などの抗原を特異的に認識する、抗体または抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含有する。

【0507】

一部の実施形態では、抗原（またはリガンド）は、腫瘍抗原またはがんマーカーである。一部の実施形態では、抗原（またはリガンド）、抗原は、αｖβ６インテグリン（αｖｂ６インテグリン）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９、またＣＡＩＸもしくはＧ２５０としても公知）、がん－精巣抗原、がん／精巣抗原_１Ｂ（ＣＴＡＧ、またＮＹ－ＥＳＯ－１およびＬＡＧＥ－２としても公知）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイクリン、サイクリンＡ２、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ－１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、上皮成長因子タンパク質（ＥＧＦＲ）、切断型上皮成長因子タンパク質（ｔＥＧＦＲ）、ＩＩＩ型上皮成長因子受容体突然変異（ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ－２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ－４０）、エフリンＢ２、エフリン受容体Ａ２（ＥＰＨａ２）、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５；またＦｃ受容体ホモログ５もしくはＦＣＲＨ５としても公知）、胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドＧＤ２、Ｏ－アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、Ｇタンパク質共役受容体５Ｄ（ＧＰＣＲ５Ｄ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原Ａ１（ＨＬＡ－Ａ１）、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２受容体アルファ（ＩＬ－２２Ｒａ）、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒａ２）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、カッパ軽鎖、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ロイシンリッチリピート含有８ファミリーメンバーＡ（ＬＲＲＣ８Ａ）、ルイスＹ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、マウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、メランＡ（ＭＡＲＴ－１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん胎児性抗原、黒色腫の優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４としても公知のＴＰＢＧ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、病原体特異的抗原、またはユニバーサルタグと会合した抗原、および／またはビオチン化分子、および／またはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶもしくは他の病原体によって発現される分子であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、受容体によって標的化された抗原としては、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば多数の公知のＢ細胞マーカーのいずれかが挙げられる。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂもしくはＣＤ３０であるか、またはこれらを含む。

【0508】

一部の実施形態では、抗原は、病原体特異的または病原体発現抗原であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原（ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ等由来のウイルス抗原など）、細菌抗原、および／または寄生虫抗原である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＭＨＣ－ペプチド複合体として細胞表面に提示される、腫瘍関連抗原などの細胞内抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）などのＴＣＲ様抗体を含有する。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、抗原受容体などの組換え受容体の一部として細胞で発現され得る。抗原受容体の中には、機能性非ＴＣＲ抗原、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もある。一般に、ペプチド－ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲ様特異性を示す抗体または抗原結合性断片を含有するＣＡＲは、ＴＣＲ様ＣＡＲとも呼ばれ得る。

【0509】

「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）への言及は、一部の場合には、細胞機構によって処理されたペプチド抗原を含むポリペプチドのペプチド抗原と複合体形成できる多型結合部位または結合溝を含有するタンパク質、一般に、糖タンパク質を指す。一部の場合において、ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞上の抗原受容体、例えばＴＣＲまたはＴＣＲ様抗体によって認識可能なコンフォメーションでの抗原提示のために、例えばペプチドとの複合体、すなわちＭＨＣ－ペプチド複合体などとして、細胞表面上に提示されてもよいし、または細胞表面上で発現されてもよい。一般的に、ＭＨＣクラスＩ分子は、膜貫通α鎖、一部の場合において３つのαドメインを有する膜貫通α鎖、および非共有結合で会合したβ２ミクログロブリンを有するヘテロ二量体である。一般的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβで構成され、これらは両方、典型的には膜貫通型である。ＭＨＣ分子は、抗原結合部位またはペプチド結合のための部位、および適切な抗原受容体による認識に必要な配列を含有するＭＨＣの有効な部分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、サイトゾルに由来するペプチドを細胞表面に送達する、この場合、ＭＨＣ－ペプチド複合体は、Ｔ細胞、例えば一般的にＣＤ８^＋Ｔ細胞によって認識されるが、一部の場合、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によって認識される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系に由来するペプチドを細胞表面に送達し、この場合、これらは、典型的には、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によって認識される。一般的に、ＭＨＣ分子は、連鎖した遺伝子座の群によってコードされており、これは集合的に、マウスではＨ－２、ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。したがって、典型的には、ヒトＭＨＣはまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称される場合もある。

【0510】

用語「ＭＨＣ－ペプチド複合体」または「ペプチド－ＭＨＣ複合体」またはそれらの派生語は、ペプチド抗原およびＭＨＣ分子の複合体または会合を指し、これは例えば、一般的に、ＭＨＣ分子の結合溝またはクレフトにおけるペプチドの非共有結合の相互作用による会合である。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体は、細胞の表面上に存在するかまたは提示される。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体は、抗原受容体、例えばＴＣＲ、ＴＣＲ様ＣＡＲまたはそれらの抗原結合部位によって特異的に認識され得る。

【0511】

一部の実施形態では、ポリペプチドのペプチド、例えばペプチド抗原またはエピトープは、例えば抗原受容体による認識のために、ＭＨＣ分子と会合することができる。一般的に、ペプチドは、それより長い生体分子、例えばポリペプチドまたはタンパク質の断片から誘導されるかまたはそれに基づく。一部の実施形態では、ペプチドは、典型的には、約８～約２４アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ複合体における認識のために、９～２２アミノ酸または約９～約２２アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ複合体における認識のために、８～１３アミノ酸または約８～約１３アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子、例えばＭＨＣ－ペプチド複合体の状態でのペプチドの認識のとき、抗原受容体、例えばＴＣＲまたはＴＣＲ様ＣＡＲは、Ｔ細胞応答、例えばＴ細胞増殖、サイトカイン生産、細胞傷害性Ｔ細胞応答または他の応答を誘導するＴ細胞への活性化シグナルを生産するかまたはそのきっかけとなる。

【0512】

一部の実施形態では、ＴＣＲ様抗体または抗原結合部分は公知であるか、または公知の方法によって作製することができる（例えば、米国公開出願番号ＵＳ ２００２／０１５０９１４；ＵＳ ２００３／０２２３９９４；ＵＳ ２００４／０１９１２６０；ＵＳ ２００６／００３４８５０；ＵＳ ２００７／００９９２５３０；ＵＳ２００９０２２６４７４；ＵＳ２００９０３０４６７９；および国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０３／０６８２０１を参照）。

【0513】

一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体を含有する有効量の免疫原で宿主をヒト化して作製されてもよい。一部の例では、ＭＨＣ－ペプチド複合体のペプチドは、ＭＨＣに結合することができる抗原、例えば腫瘍抗原、例えば、ユニバーサル腫瘍抗原、免疫原抗原または以下に記載の他の抗原のエピトープである。一部の実施形態では、有効量の免疫原が次いで、免疫応答を惹起するために宿主に投与され、この場合、免疫原は、ＭＨＣ分子の結合溝におけるペプチドの３次元提示に対して免疫応答を惹起するのに十分な期間にわたりその３次元形態を保持する。次いで宿主から収集された血清をアッセイして、ＭＨＣ分子の結合溝におけるペプチドの３次元提示を認識する望ましい抗体が生産されているかどうかを決定する。一部の実施形態では、抗体が、ＭＨＣ分子単独、目的のペプチド単独、およびＭＨＣと無関係のペプチドとの複合体からＭＨＣ－ペプチド複合体を区別できることを確認するために、生産された抗体を評価することができる。次いで望ましい抗体を単離することができる。

【0514】

一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部位は、抗体ライブラリーディスプレイ方法、例えばファージ抗体ライブラリーを採用することによって生産することができる。一部の実施形態では、突然変異体Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたは他の抗体形態のファージディスプレイライブラリーが生成されてもよく、例えば、ライブラリーのメンバーは、ＣＤＲまたはＣＤＲｓの１つまたは複数の残基で変異される。例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２０１５０９１４、ＵＳ２０１４／０２９４８４１；およびCohen CJ. Et al. (2003) J Mal. Recogn. 16:324-332を参照のこと。

【0515】

本明細書において用語「抗体」は最も広い意味で使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含み、これらは無傷抗体および機能性（抗原結合性）抗体断片を含み、該断片には、抗原結合性（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、抗原に特異的に結合可能である重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片が含まれる。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作された、および／またはそれ以外の方法で改変された形態、例えばイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性を有する、例えば二重特異性の抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、タンデムジｓｃＦｖ、タンデムトリｓｃＦｖを包含する。用語「抗体」は、別段の指定がない限り、それらの機能的な抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、あらゆるクラスまたはサブクラスの抗体を含む無傷または全長抗体、例えば、ＩｇＧおよびそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤなども包含する。

【0516】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質、抗体およびその抗原結合性断片は、全長抗体の抗原を特異的に認識する。一部の実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖は、全長であることがあり、または抗原結合部分［Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）］であることがある。他の実施形態では、抗体重鎖定常領域は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択され、特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択され、さらに特に、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）である。別の実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダから選択され、特にカッパである。

【0517】

提供される抗体の中には抗体断片もある。「抗体断片」は、無傷抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体の一部分を含む、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線形抗体；可変重鎖（Ｖ_Ｈ）領域、一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃＦｖおよび単一ドメインＶ_Ｈ単一抗体；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、抗体は、可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体断片、例えば、ｓｃＦｖである。

【0518】

用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶ_ＨおよびＶ_Ｌ）は、一般的に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照）。単一Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、該抗原に結合する抗体からのＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインを使用して相補的なＶ_ＬまたはＶ_Ｈドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。

【0519】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗原、例えば、がんマーカー、または腫瘍細胞もしくはがん細胞などの標的化される疾患の細胞の細胞表面抗原、例えば、本明細書に記載されるまたは公知の標的抗原のいずれか、に特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む。

【0520】

抗体断片は、無傷抗体のタンパク質分解による消化および組換え宿主細胞による産生を含むがこれらに限定されない様々な技法によって作製することができる。一部の実施形態では、抗体は、組換え生産された断片、例えば、天然に存在しない配置を含む断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカー、によって接合されている２つもしくはそれより多くの抗体領域もしくは鎖を有するもの、および／または天然に存在する無傷抗体の酵素消化によって生産され得ないものである。一部の実施形態では、抗体断片は、ｓｃＦｖである。

【0521】

「ヒト化」抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲに由来し、全てまたは実質的に全てのＦＲアミノ酸残基が非ヒトＦＲに由来する、抗体である。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、通常、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化を受けている非ヒト抗体の変異体を指す。一部の実施形態では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復させるまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基と置換される

【0522】

したがって、一部の実施形態では、ＴＣＲ様ＣＡＲをはじめとするキメラ抗原受容体は、抗体または抗体断片を含有する細胞外部分を含む。一部の実施形態では、抗体または断片は、ｓｃＦｖを含む。一部の態様では、キメラ抗原受容体は、抗体または断片を含有する細胞外部分と、細胞内シグナル伝達領域とを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞において一次活性化シグナルを誘導可能であるシグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）構成要素のシグナル伝達ドメイン、および／または免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含むシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。

【0523】

一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外部分、例えば、その抗体部分は、スペーサー、例えば、抗原認識構成要素、例えばＳｃＦｖ、と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域を、さらに含む。スペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはその変異型もしくは改変バージョンの少なくとも一部分、例えば、ヒンジ領域、例えばＩｇＧ４ヒンジ領域、ならびに／またはＣＨ１／ＣＬおよび／もしくはＦｃ領域であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、組換え受容体は、スペーサーおよび／またはヒンジ領域をさらに含む。一部の実施形態では、定常領域または位置は、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のものである。一部の態様では、定常領域の部分は、抗原認識構成要素、例えば、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインの間でスペーサー領域として働く。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号１に記載された配列を有し、配列番号２に記載された配列によってコードされる。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号３に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号４に記載された配列を有する。

【0524】

一部の実施形態では、定常領域または部分は、ＩｇＤの定常領域または部分である。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号５に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号１、３、４および５のいずれかに対して少なくともまたは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。

【0525】

一部の実施形態では、スペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはその変異型もしくは改変バージョンの少なくとも一部分、例えば、ヒンジ領域、例えばＩｇＧ４ヒンジ領域、ならびに／またはＣ_Ｈ１／Ｃ_Ｌおよび／もしくはＦｃ領域であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、組換え受容体は、スペーサーおよび／またはヒンジ領域をさらに含む。一部の実施形態では、定常領域または部分は、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１などの、ヒトＩｇＧの定常領域または部分である。一部の態様では、定常領域の部分は、抗原認識構成要素、例えばｓｃＦｖ、と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として働く。スペーサーは、スペーサーの非存在下と比較して、抗原結合後に細胞の応答性増大をもたらす長さのスペーサーであり得る。一部の例では、スペーサーは、長さ１２もしくは約１２アミノ酸であるか、または長さ１２アミノ酸以下である。例示的なスペーサーとしては、少なくとも約１０～２２９アミノ酸、約１０～２００アミノ酸、約１０～１７５アミノ酸、約１０～１５０アミノ酸、約１０～１２５アミノ酸、約１０～１００アミノ酸、約１０～７５アミノ酸、約１０～５０アミノ酸、約１０～４０アミノ酸、約１０～３０アミノ酸、約１０～２０アミノ酸、または約１０～１５アミノ酸を有する、およびこれらの列挙された範囲のいずれかの終点間の任意の整数を含む、スペーサーが挙げられる。一部の実施形態では、スペーサー領域は、約１２アミノ酸もしくはそれ未満、約１１９アミノ酸もしくはそれ未満、または約２２９アミノ酸もしくはそれ未満を有する。例示的なスペーサーとしては、ＩｇＧ４ヒンジ単独、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４、またはＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４ヒンジが挙げられる。例示的なスペーサーとしては、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153または国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／０３１６８７に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号１に記載された配列を有し、配列番号２に記載された配列によってコードされる。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号３に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号４に記載された配列を有する。

【0526】

一部の実施形態では、定常領域または部分は、ＩｇＤの定常領域または部分である。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号５に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号１、３、４および５のいずれかに対して少なくともまたは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。

【0527】

細胞外リガンド結合、例えば、抗原認識ドメインは、一般に、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成要素、例えば、ＣＡＲの場合にはＴＣＲ複合体などの抗原受容体複合体を通じての活性化を模倣する、および／または別の細胞表面受容体を介してシグナル伝達する、シグナル伝達構成要素に、連結される。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する。一部の実施形態では、抗原結合構成要素（例えば、抗体）は、１つまたは複数の膜貫通および細胞内シグナル伝達領域に結合される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメインと融合した膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、受容体、例えば、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の場合には、膜貫通ドメインは、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を避けて、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するためにアミノ酸置換によって選択または改変される。

【0528】

膜貫通ドメインは、一部の実施形態では、天然供給源に、または合成供給源に由来する。供給源が天然である場合には、ドメインは、一部の態様では、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来するものを含む（例えば、少なくともこれらの膜貫通領域を含む）。あるいは、一部の実施形態における膜貫通ドメインは合成である。一部の態様では、合成膜貫通ドメインは、主に疎水性の残基、例えば、ロイシンおよびバリンを含む。一部の態様では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。一部の実施形態では、連結は、リンカー、スペーサー、および／または膜貫通ドメインによる。

【0529】

一部の実施形態では、短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば、２から１０個のアミノ酸長のリンカー、例えば、グリシンおよびセリンを含有するもの、例えば、グリシン－セリンダブレットが存在し、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの間の連結を形成する。

【0530】

組換え受容体、例えば、ＣＡＲは、一般に、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達構成要素（単数または複数）を含む。一部の実施形態では、受容体は、ＴＣＲ複合体の細胞内構成要素、例えば、Ｔ細胞活性化および細胞毒性を媒介するＴＣＲ ＣＤ３鎖、例えば、ＣＤ３ゼータ鎖を含む。したがって、一部の態様では、抗原結合部分は、１つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。一部の実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または他のＣＤ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、受容体、例えばＣＡＲは、Ｆｃ受容体γ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、またはＣＤ１６などの１つまたは複数の追加の分子の一部をさらに含む。例えば、一部の態様では、ＣＡＲまたは他のキメラ受容体は、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３－ζ）またはＦｃ受容体γとＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５またはＣＤ１６の間のキメラ分子を含む。

【0531】

ＣＡＲまたは他のキメラ受容体のライゲーション時に、受容体の細胞質ドメインおよび／もしくは領域または細胞内シグナル伝達ドメインおよび／もしくは領域は、ＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞、例えばＴ細胞、の正常なエフェクター機能または応答の少なくとも１つを活性化する。例えば、一部の文脈では、ＣＡＲは、Ｔ細胞の機能、例えば、細胞溶解活性またはＴヘルパー活性、例えば、サイトカインまたは他の因子の分泌を誘導する。一部の実施形態では、無傷の免疫賦活性鎖の代わりに、抗原受容体構成要素または共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの末端切断型部分が、例えば、それがエフェクター機能シグナルを伝達する場合には使用される。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達領域、例えば、細胞内ドメイン（単数または複数）を含む細胞内シグナル伝達領域は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列を含み、一部の態様では、天然の状況で抗原受容体会合後にそのような受容体と協調作用してシグナル伝達を開始する共受容体の細胞質配列、および／またはそのような分子のいずれかの誘導体もしくは変異体、および／または同じ機能を有するいずれかの合成配列も含む。

【0532】

天然ＴＣＲの文脈において、完全活性化は、一般に、ＴＣＲを介したシグナル伝達だけでなく、共刺激シグナルも必要とする。したがって、一部の実施形態では、完全活性化を促進するために、二次または共刺激シグナルを生成するための構成要素もＣＡＲ中に含まれる。他の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナルを生成するための構成要素を含まない。一部の態様では、さらなるＣＡＲは、同一細胞において発現され、二次または共刺激シグナルを生成するための構成要素を提供する。

【0533】

Ｔ細胞活性化は、一部の態様では、次の２つのクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると記載される：ＴＣＲを通じて抗原依存的一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、および抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらすもの（二次細胞質シグナル伝達配列）。一部の態様では、ＣＡＲは、そのようなシグナル伝達構成要素の一方または両方を含む。

【0534】

一部の態様では、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激的方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有し得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲまたはＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。ある特定の実施形態では、一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭは、ＴＣＲまたはＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、もしくはＦｃＲベータに由来するものを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲにおける細胞質シグナル伝達分子（複数可）は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部分、またはＣＤ３ゼータに由来する配列を含有する。

【0535】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０およびＩＣＯＳなどの、共刺激受容体のシグナル伝達ドメインおよび／または膜貫通部分を含む。一部の態様では、同じＣＡＲが、活性化またはシグナル伝達領域と共刺激構成要素の両方を含む。

【0536】

一部の実施形態では、活性化ドメインは１つのＣＡＲの中に含まれるのに対し、共刺激成分は別の抗原を認識する別のＣＡＲによって提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、両方とも同じ細胞で発現される活性化ＣＡＲまたは刺激ＣＡＲ、および共刺激ＣＡＲを含む（ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照）。一部の態様では、ＣＡＲは、刺激または活性化ＣＡＲであり、他の態様では、それは、共刺激ＣＡＲである。一部の実施形態では、抑制性ＣＡＲ［ｉＣＡＲ、参照：Fedorov et al., Sci. Transl.Medicine, 5(215) (December, 2013)］、例えば、異なる抗原を認識するＣＡＲをさらに含み、それにより、抑制性ＣＡＲがそのリガンドに結合することによって、第１の抗原を認識するＣＡＲを通じてデリバリーされる活性化シグナルが減少または抑制されて、例えば、オフターゲット効果が低減される。

【0537】

ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３細胞内ドメインに連結されたＣＤ２８膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３細胞内ドメインに連結されたキメラＣＤ２８およびＣＤ１３７共刺激ドメインを含む。

【0538】

一部の実施形態では、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと同じである。一部の実施形態では、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインとは異なる。

【0539】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数の、例えば２つ以上の共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを細胞質部分に包含する。例示的なＣＡＲには、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、および４－１ＢＢの細胞内成分が挙げられる。

【0540】

一部の実施形態では、提供されるウイルスベクター内の核酸（複数可）によってコードされる組換え受容体（複数可）、例えば、ＣＡＲは、１つまたは複数のマーカーを、例えば、受容体を発現する細胞の形質導入もしくは操作、ならびに／またはポリヌクレオチドによってコードされる分子（複数可）を発現する細胞の選択および／もしくは標的化を目的として、さらに含む。一部の態様では、そのようなマーカーは、異なる核酸またはポリヌクレオチドによってコードされ得、該核酸またはポリヌクレオチドもまた、遺伝子操作プロセス中に、典型的には、同じ方法、例えば、本明細書で提供される方法のいずれかによる形質導入によって、例えば、同じベクターまたは同じタイプのベクターによって導入され得る。

【0541】

一部の態様では、マーカー、例えば、形質導入マーカーは、タンパク質であり、および／または細胞表面分子である。例示的なマーカーは、天然に存在する細胞表面分子などの、天然に存在する、例えば内因性の、マーカーの切断型変異体である。一部の態様では、変異体は、天然または内因性細胞表面分子と比較して免疫原性の低下、輸送機能の低下、および／またはシグナル伝達機能の低下を有する。一部の実施形態では、マーカーは、細胞表面受容体の切断バージョン、例えば、切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）である。一部の態様では、マーカーは、ＣＤ３４の全体もしくは部分（例えば、切断型）、ＮＧＦＲの全体もしくは部分（例えば、切断型）、または上皮成長因子受容体の全体もしくは部分（例えば、切断型）（例えば、ｔＥＧＦＲ）を含む。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸は、切断可能なリンカー配列、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａおよび／またはＦ２Ａなどの、リンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。例えば、ＷＯ２０１４／０３１６８７を参照されたい。

【0542】

一部の実施形態では、マーカーは、Ｔ細胞で天然に見出されない、またはＴ細胞の表面で天然に見出されない分子、例えば細胞表面タンパク質、またはその部分である。

【0543】

一部の実施形態では、分子は、非自己分子、例えば非自己タンパク質、例えば細胞が養子移入される宿主の免疫系によって「自己」として認識されない分子である。

【0544】

一部の実施形態では、マーカーは、治療機能を提供せず、かつ／または遺伝子操作についてのマーカーとして使用されること、例えば操作に成功した細胞を選択するため以外の効果を生産しない。他の実施形態では、マーカーは、治療用分子または別の方法で一部の所望の効果を発揮する分子、例えばインビボにおいて遭遇される細胞のリガンド、例えば養子移入およびリガンドとの遭遇に際して細胞の応答を向上および／または減弱する共刺激分子または免疫チェックポイント分子であってもよい。

【0545】

一部の例では、ＣＡＲは、第１、第２、および／または第３世代ＣＡＲと呼ばれる。一部の態様では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合時にＣＤ３鎖誘導シグナルだけをもたらすものであり；一部の態様では、第２世代ＣＡＲは、そのようなシグナルおよび共刺激シグナルをもたらすもの、例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７などの共刺激受容体からの細胞内シグナル伝達ドメインを含むものであり；一部の態様では、第３世代ＣＡＲは、一部の態様では、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。

【0546】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞外リガンド結合部分、例えば、抗原結合部分、例えば、抗体またはその抗原結合性断片と、細胞内ドメインとを含む。一部の実施形態では、抗体または断片は、ｓｃＦｖまたは単一ドメインＶＨ抗体を含み、細胞内ドメインは、ＩＴＡＭを含有する。一部の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖のゼータ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する、および／またはこれらのドメイン間に配置された、膜貫通ドメインを含む。

【0547】

一部の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通部分を含有する。細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、直接または間接的に連結され得る。一部の実施形態では、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、スペーサー、例えば、本明細書に記載されるいずれかによって連結される。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを、例えば、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの間に、含有する。一部の態様では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８または４－１ＢＢである。

【0548】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体、例えば、抗体断片、ＣＤ２８の膜貫通部分である膜貫通ドメインもしくはＣＤ２８の膜貫通部分を含有する膜貫通ドメインまたはその機能性変異体、およびＣＤ２８のシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体、およびＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分またはその機能性変異体を含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体、例えば、抗体断片、ＣＤ２８の膜貫通部分である膜貫通ドメインもしくはＣＤ２８の膜貫通部分を含有する膜貫通ドメインまたはその機能性変異体、および４－１ＢＢのシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体、およびＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分またはその機能性変異体を含有する。一部のそのような実施形態では、受容体は、ヒトＩｇ分子などのＩｇ分子の一部、例えばＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジを含有するスペーサー、例えばヒンジのみのスペーサーをさらに含む。

【0549】

一部の実施形態では、受容体、例えばＣＡＲ、の膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインもしくはその変異体、例えば、ヒトＣＤ２８（アクセッション番号Ｐ１０７４７．１）の２７アミノ酸膜貫通ドメインであるか、あるいは配列番号８に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号８に対して少なくとももしくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、膜貫通ドメインであり、一部の実施形態では、組換え受容体の膜貫通ドメイン含有部分は、配列番号９に記載されたアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。

【0550】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。一部の態様では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８または４－１ＢＢである。

【0551】

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ヒトＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体もしくは部分、例えば、その４１アミノ酸ドメイン、および／または天然のＣＤ２８タンパク質の１８６～１８７位にＬＬからＧＧへの置換を有するそのようなドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達領域および／またはドメインは、配列番号１０もしくは１１に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号１０もしくは１１に対して少なくとももしくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み得る。一部の実施形態では、細胞内領域および／またはドメインは、４－１ＢＢの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体、例えば、ヒト４－１ＢＢ（例えば、アクセッション番号Ｑ０７０１１．１）の４２アミノ酸細胞質ドメイン、またはその機能性変異体もしくは部分、例えば、配列番号１２に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号１２に対して少なくとももしくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

【0552】

一部の実施形態では、細胞内領域および／またはドメインは、ヒトＣＤ３鎖、適宜、ＣＤ３ゼータ刺激シグナル伝達ドメインもしくはその機能性変異体、例えば、ヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３（アクセッション番号Ｐ２０９６３．２）の１１２ ＡＡ細胞質ドメイン、または米国特許第７，４４６，１９０号もしくは米国特許第８，９１１，９９３号に記載されているようなＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達領域は、配列番号１３、１４もしくは１５に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号１３、１４もしくは１５に対して少なくとももしくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

【0553】

一部の態様では、スペーサーは、ＩｇＧのヒンジ領域のみ、例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のヒンジ領域のみ、例えば、配列番号１に記載されたヒンジのみのスペーサーを含有する。他の実施形態では、スペーサーは、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインに連結されたＩｇヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジである。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号３に記載されたような、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインに連結されたＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジである。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号４に記載されたような、Ｃ_Ｈ３ドメインのみに連結されたＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジである。一部の実施形態では、スペーサーは、グリシン－セリンリッチ配列または公知のフレキシブルリンカーなどの他のフレキシブルリンカーであるか、またはこれを含む。

【0554】

例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合部分、例えば、抗原、例えば本明細書に記載される抗原、に特異的に結合する抗原結合部分、例えば、ｓｄＡｂおよびｓｃＦｖを含む、抗体またはその断片と；スペーサー、例えば、Ｉｇ－ヒンジ含有スペーサーのいずれかと；ＣＤ２８の一部分である膜貫通ドメインまたはその変異体と；ＣＤ２８のシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体と；ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体のシグナル伝達部分とを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合部分、例えば、抗原、例えば本明細書に記載される抗原、に特異的に結合する抗原結合部分、例えば、ｓｄＡｂおよびｓｃＦｖを含む、抗体またはその断片と；スペーサー、例えば、Ｉｇ－ヒンジ含有スペーサーのいずれかと；ＣＤ２８の一部分である膜貫通ドメインまたはその変異体と；４－１ＢＢのシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体と；ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体のシグナル伝達部分とを含む。一部の実施形態では、そのようなＣＡＲコンストラクトは、Ｔ２Ａリボソームスキップエレメントおよび／またはｔＥＧＦＲ配列を、例えばＣＡＲの下流に、さらに含む。

【0555】

ｉｉ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
一部の実施形態では、核酸（複数可）によってコードされる組換え分子（複数可）は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、組換えＴＣＲは、抗原、一般に、標的細胞上に存在する抗原、例えば、腫瘍特異的抗原、自己免疫もしくは炎症性疾患に関連する特定の細胞型上に発現される抗原、またはウイルス性病原体もしくは細菌性病原体に由来する抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍タンパク質、ウイルスタンパク質または自己免疫タンパク質の抗原のペプチドエピトープまたはＴ細胞エピトープを認識するＴＣＲまたはその抗原結合部分を発現する、Ｔ細胞などの操作された細胞が提供される。

【0556】

一部の実施形態では、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、可変αおよびβ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）もしくは可変γおよびδ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）、またはそれらの抗原結合部分を含有し、ＭＨＣ分子に結合したペプチドに特異的に結合することができる分子である。一部の実施形態では、ＴＣＲはαβ型である。典型的には、αβ型およびγδ型で存在するＴＣＲはおおむね構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は異なる解剖学的位置または機能を有し得る。ＴＣＲは、細胞の表面でまたは可溶型で見出され得る。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面で見出され、一般に、そこで主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与している。

【0557】

特に明記しない限り、用語「ＴＣＲ」は、完全なＴＣＲおよびその抗原結合部分または抗原結合性断片を包含すると理解されるべきである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、αβ型またはγδ型のＴＣＲを含むインタクトなまたは完全長のＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、完全長ＴＣＲに満たないが、ＭＨＣ分子中の結合した特定のペプチドに結合する、例えばＭＨＣ－ペプチド複合体に結合する、抗原結合部分である。一部の例では、ＴＣＲの抗原結合部分または断片は、完全長またはインタクトなＴＣＲの構造ドメインの一部のみを含有し得るが、完全なＴＣＲが結合するＭＨＣ－ペプチド複合体などのペプチドエピトープに依然として結合することができる。一部の例では、抗原結合部分は、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン、例えば、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖を含有する。一般に、ＴＣＲの可変鎖は、ペプチド、ＭＨＣおよび／またはＭＨＣ－ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域を含有する。

【0558】

一部の実施形態では、ＴＣＲの可変ドメインは、一般に抗原認識および結合能および特異性に対する主要な寄与因子である、超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲまたはその組合せは、所与のＴＣＲ分子の抗原結合部位の全てまたは実質的に全てを形成する。ＴＣＲ鎖の可変領域内の様々なＣＤＲは、一般にフレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられ、ＣＤＲと比較してＦＲは、ＴＣＲ分子間でより少ない可変性を一般に示す（例えば、Jares et al., Proc. Nat’ l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990;Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988を参照；また、Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003も参照のこと）。一部の実施形態では、ＣＤＲ３は、抗原結合もしくは特異性に関与する主なＣＤＲであるか、または抗原認識、および／もしくはペプチド－ＭＨＣ複合体の処理されたペプチド部分との相互作用にとって、所与のＴＣＲ可変領域の３つのＣＤＲの中で最も重要である。一部の状況では、アルファ鎖のＣＤＲ１は、ある特定の抗原ペプチドのＮ末端部分と相互作用することができる。一部の状況では、ベータ鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用することができる。一部の状況では、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ－ペプチド複合体のＭＨＣ部分との相互作用もしくは該部分の認識に最も強く寄与するかまたは関与する主要なＣＤＲである。一部の実施形態では、β鎖の可変領域は、一般にスーパー抗原結合に関与し、抗原認識に関与しない、さらなる超可変領域（ＣＤＲ４またはＨＶＲ４）を含有することができる［Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426］。

【0559】

一部の実施形態では、ＴＣＲは、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または短い細胞質テイルも含有することができる（例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3^rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照）。一部の態様では、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端の短い細胞質テイルを有することができる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合する。

【0560】

一部の実施形態では、ＴＣＲ鎖は１つまたは複数の定常ドメインを含有する。例えば、所与のＴＣＲ鎖（例えば、α鎖またはβ鎖）の細胞外部分は、細胞膜に隣接する２つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば、可変ドメイン（例えば、ＶαまたはＶβ；典型的にはＫａｂａｔ番号付けに基づくアミノ酸１～１１６ Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5^th ed.）および定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣα、典型的にはＫａｂａｔ番号付けに基づくα鎖の１１７～２５９位、またはβ鎖定常ドメインまたはＣ_β、典型的にはＫａｂａｔに基づくβ鎖の１１７～２９５位）を含有する。例えば、一部の例では、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は２つの膜近位定常ドメイン、および２つの膜遠位可変ドメインを含有し、可変ドメインは各々ＣＤＲを含有する。ＴＣＲの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによってＴＣＲの２つの鎖を連結する短い連結配列を含有してもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲが定常ドメインに２つのジスルフィド結合を有するように、ＴＣＲはαおよびβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有してもよい。

【0561】

一部の実施形態では、ＴＣＲ鎖は膜貫通ドメインを含有する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは正に荷電される。一部の例では、ＴＣＲ鎖は細胞質テイルを含有する。一部の例では、構造がＴＣＲをＣＤ３およびそのサブユニットのような他の分子と会合させる。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含有するＴＣＲは、細胞膜にタンパク質を固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合し得る。ＣＤシグナル伝達サブユニット（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εおよびＣＤ３ζ鎖）の細胞内テイルは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する１つまたは複数の免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭを含有する。

【0562】

一部の実施形態では、ＴＣＲは、２つの鎖αおよびβ（または適宜γおよびδ）のヘテロ二量体であってもよく、または一本鎖ＴＣＲコンストラクトであってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ジスルフィド結合（複数可）などによって連結された２つの別々の鎖（αおよびβ鎖またはγおよびδ鎖）を含有するヘテロ二量体である。

【0563】

一部の実施形態では、ＴＣＲは、実質的に完全長のコード配列が容易に利用可能なＶα、β鎖の配列などの公知のＴＣＲ配列から生成することができる。細胞源からＶ鎖配列を含む完全長ＴＣＲ配列を得る方法は周知である。一部の実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸は、所与の細胞内のもしくは所与の細胞から単離されたＴＣＲコード核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、または市販のＴＣＲ ＤＮＡ配列の合成などによって様々な供給源から得ることができる。

【0564】

一部の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマなどの細胞などの生物学的供給源、または他の市販の供給源から得られる。一部の実施形態では、Ｔ細胞はインビボで単離された細胞から得ることができる。一部の実施形態では、ＴＣＲは胸腺で選択されたＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲはネオエピトープ拘束性ＴＣＲである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分もしくは抗原結合性断片は、ＴＣＲの配列の知識から合成で生成されてもよい。

【0565】

一部の実施形態では、ＴＣＲは、標的ポリペプチド抗原、またはその標的Ｔ細胞エピトープに対する候補ＴＣＲのライブラリーのスクリーニングから同定または選択されたＴＣＲから生成される。ＴＣＲライブラリーは、ＰＢＭＣ、脾臓または他のリンパ器官に存在する細胞を含む対象から単離されたＴ細胞由来のＶαおよびＶβのレパートリーの増幅によって生成することができる。一部の例では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から増幅され得る。一部の実施形態では、ＴＣＲライブラリーがＣＤ４＋またはＣＤ８＋ 細胞から生成され得る。一部の実施形態では、ＴＣＲは健康な対象の正常なＴ細胞源から増幅され得る（例えば、正常なＴＣＲライブラリー）。一部の実施形態では、ＴＣＲは疾患を有する対象のＴ細胞源から増幅され得る（例えば、疾患ＴＣＲライブラリー）。一部の実施形態では、ヒトから得られたＴ細胞などの試料でのＲＴ－ＰＣＲなどによってＶαおよびＶβの遺伝子レパートリーを増幅するのに縮重プライマーが使用されてもよい。一部の実施形態では、増幅産物がリンカーによって隔てられるようにクローニングされるかまたは組み立てられるナイーブＶαおよびＶβライブラリーから、ｓｃＴｖライブラリーが組み立てられてもよい。対象および細胞供給源に応じて、ライブラリーはＨＬＡ対立遺伝子特異的であり得る。あるいは、一部の実施形態では、ＴＣＲライブラリーは、親または足場ＴＣＲ分子の変異誘発または多様化によって生成することができる。一部の態様では、ＴＣＲは、例えばαまたはＶβ鎖の変異誘発などによって定向進化に供される。一部の態様では、ＴＣＲのＣＤＲ内の特定の残基が変更される。一部の実施形態では、選択されたＴＣＲが親和性成熟によって改変され得る。一部の実施形態では、ペプチドに対するＣＴＬ活性を評価するためにスクリーニングなどによって抗原特異的Ｔ細胞が選択され得る。一部の態様では、例えば抗原特異的Ｔ細胞に存在するＴＣＲが、結合活性、例えば、抗原に対する特定の親和性またはアビディティーなどによって選択され得る。

【0566】

一部の実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、および／または天然に存在するＴ細胞からクローニングされたＴＣＲを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲは、天然に存在するＴ細胞からクローニングされたＴＣＲである。一部の実施形態では、標的抗原（例えば、がん抗原）に対する高親和性Ｔ細胞クローンが同定され、患者から単離され、細胞に導入される。一部の実施形態では、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、またはＨＬＡ）を用いて操作されたトランスジェニックマウスにおいて生成された。例えば、腫瘍抗原を参照されたい［例えば、Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180およびCohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808を参照されたい］。一部の実施形態では、ファージディスプレイが、標的抗原に対するＴＣＲを単離するために使用される［例えば、Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395およびLi (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354を参照されたい］。一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、改変または操作されたものである。一部の実施形態では、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体に対する親和性がより高いなど、特性が変更されたＴＣＲを生成するのに定向進化方法が使用される。一部の実施形態では、定向進化は、酵母ディスプレイ［Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92］、ファージディスプレイ［Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54］、またはＴ細胞ディスプレイ［Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84］を含むがこれらに限定されないディスプレイ方法によって達成される。一部の実施形態では、ディスプレイアプローチは、既知の親または参照ＴＣＲの操作または改変を必要とする。例えば、一部の例では、ＣＤＲの１つまたは複数の残基が変異され、所望の変更された特性、例えば、所望の標的抗原に対するより高い親和性を有する変異体が選択される変異誘発ＴＣＲを作製するための鋳型として、野生型ＴＣＲが使用され得る。

【0567】

一部の実施形態では、目的のＴＣＲの生産または生成における使用のための標的ポリペプチドのペプチドは、当業者に既知であるか、または当業者によって容易に同定され得る。一部の実施形態では、ＴＣＲまたは抗原結合部分の生成における使用に適したペプチドは、以下に記載される標的ポリペプチドなどの目的の標的ポリペプチド中のＨＬＡ拘束性モチーフの存在に基づき決定することができる。一部の実施形態では、ペプチドは、利用可能なコンピューター予測モデルを使用して同定される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ結合部位の予測に関するそのようなモデルには、ＰｒｏＰｒｅｄ１［Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12): 1236- 1237］、およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ［Schuler et al. (2007) 226 Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007を参照］が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＭＨＣ拘束性エピトープは、全白人の約３９～４６％で発現され、それ故に、ＴＣＲまたは他のＭＨＣ－ペプチド結合分子の調製において使用するためのＭＨＣ抗原の適切な選択となるＨＬＡ－Ａ０２０１である。

【0568】

コンピューター予測モデルを使用したＨＬＡ－Ａ０２０１結合モチーフならびにプロテアソームおよび免疫プロテアソームの切断部位は公知である。ＭＨＣクラスＩ 結合部位の予測に関するそのようなモデルには、ＰｒｏＰｒｅｄ１［Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12): 1236-1237 2001により詳細に記載されている］、およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ［Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. In Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007を参照］挙げられるが、これらに限定されない。

【0569】

一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、結合特性などの１つまたは複数の特性が変更されている組換えにより作製された天然のタンパク質またはその変異型であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲは様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物の１つに由来してもよい。ＴＣＲは細胞結合型または可溶型であってもよい。一部の実施形態では、提供される方法の目的のために、ＴＣＲは細胞の表面で発現される細胞結合型である。

【0570】

一部の実施形態では、ＴＣＲは完全長ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは抗原結合部分である。一部の実施形態では、ＴＣＲは二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ＴＣＲは一本鎖ＴＣＲ（ｓｃ－ＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲは、ＷＯ ０３／０２０７６３、ＷＯ ０４／０３３６８５、ＷＯ２０１１／０４４１８６に記載の構造を有する。

【0571】

一部の実施形態では、ＴＣＲは膜貫通配列に対応する配列を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲは細胞質配列に対応する配列を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲはＣＤ３とＴＣＲ複合体を形成することができる。一部の実施形態では、ｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲを含むＴＣＲのいずれかが、Ｔ細胞の表面で活性ＴＣＲを生成するシグナル伝達ドメインに連結されてもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲは細胞の表面で発現される。

【0572】

一部の実施形態ではｄＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合される第１のポリペプチド、およびＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合される第２のポリペプチドを含有し、第１および第２のポリペプチドはジスルフィド結合によって連結される。一部の実施形態では、結合は、天然の二量体αβＴＣＲに存在する天然の鎖間ジスルフィド結合に対応し得る。一部の実施形態では、鎖間ジスルフィド結合は天然のＴＣＲに存在しない。例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のシステインがｄＴＣＲポリペプチド対の定常領域細胞外配列に組み込まれてもよい。一部の例では、天然および非天然ジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。一部の実施形態では、ＴＣＲは、膜に固定するための膜貫通配列を含有する。

【0573】

一部の実施形態では、ｄＴＣＲは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのＣ末端に結合した第１の二量体化モチーフを含有するＴＣＲα鎖、ならびに可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのＣ末端に結合した第１の二量体化モチーフを含むＴＣＲβ鎖を含有し、第１および第２の二量体化モチーフは容易に相互作用して、第１の二量体化モチーフ中のアミノ酸と第２の二量体化モチーフ中のアミノ酸の間に共有結合を形成し、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を連結する。

【0574】

一部の実施形態では、ＴＣＲはｓｃＴＣＲである。典型的には、ｓｃＴＣＲは、公知の方法を使用して生成することができ、例えば、Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992);Wuelfing, C. and Plueckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994);Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993)；国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９６／１３５９３号、ＷＯ９６／１８１０５号、ＷＯ９９／６０１２０号、ＷＯ９９／１８１２９号、ＷＯ０３／０２０７６３号、ＷＯ２０１１／０４４１８６号；およびSchlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)を参照のこと。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲ鎖の会合を容易にするための導入された非天然ジスルフィド鎖間結合を含有する（例えば、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ０３／０２０７６３を参照）。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、そのＣ末端に融合された異種ロイシンジッパーが鎖の会合を容易にする非ジスルフィド連結切断型ＴＣＲである（例えば、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９９／６０１２０号を参照）。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ペプチドリンカーを介してＴＣＲβ可変ドメインに共有結合されたＴＣＲα可変ドメインを含有する（例えば、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９９／１８１２９号を参照）。

【0575】

一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合した、ＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。

【0576】

一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメント、ならびに配列β鎖細胞外定常および膜貫通配列のＮ末端に融合したβ鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメント、ならびに適宜、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。

【0577】

一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合したＴＣＲβ鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメント、ならびに配列α鎖細胞外定常および膜貫通配列のＮ末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメント、ならびに適宜、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。

【0578】

一部の実施形態では、第１および第２のＴＣＲセグメントを連結するｓｃＴＣＲのリンカーは、ＴＣＲ結合特異性を保持しながら、単一ポリペプチド鎖を形成することができる任意のリンカーであってもよい。一部の実施形態では、リンカー配列は、例えば、式－Ｐ－ＡＡ－Ｐ－（式中、Ｐはプロリンであり、ＡＡはアミノ酸配列を表し、アミノ酸はグリシンおよびセリンである）を有し得る。一部の実施形態では、第１および第２のセグメントは対合され、その結果、それらの可変領域配列はそのような結合のために配向される。それ故に、一部の例では、リンカーは、第１のセグメントのＣ末端と第２のセグメントのＮ末端の間の距離に及ぶ十分な長さを有するか、またはその逆も同様であるが、標的リガンドへのｓｃＴＣＲの結合をブロックまたは低減するほど長くはない。一部の実施形態では、リンカーは、１０～４５個のアミノ酸または約１０～約４５個のアミノ酸、例えば１０～３０個のアミノ酸または２６～４１個のアミノ酸残基、例えば２９、３０、３１または３２個アミノ酸を含有することができる。一部の実施形態では、リンカーは、式－ＰＧＧＧ－（ＳＧＧＧＧ）_５－Ｐ－（式中、Ｐはプロリンであり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンである）（配列番号２２）を有する。一部の実施形態では、リンカーは、配列ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号２３）を有する。

【0579】

一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する共有ジスルフィド結合を含有する。一部の実施形態では、天然のＴＣＲの鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のシステインがｓｃＴＣＲポリペプチドの第１および第２のセグメントの定常領域細胞外配列に組み込まれ得る。一部の例では、天然および非天然ジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。

【0580】

導入された鎖間ジスルフィド結合を含有するｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲの一部の実施形態では、天然ジスルフィド結合は存在しない。一部の実施形態では、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成する１つまたは複数の天然システインは、別の残基、例えばセリンまたはアラニンに置換される。一部の実施形態では、導入されたジスルフィド結合は、第１および第２のセグメントの非システイン残基をシステインに変異させることによって形成されてもよい。ＴＣＲの例示的な非天然ジスルフィド結合は、公開国際ＰＣＴ番号ＷＯ２００６／０００８３０に記載されている。

【0581】

一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合性断片は、標的抗原に対する平衡結合定常が、１０－５～１０－１２Ｍまたは約１０－５～約１０－１２Ｍおよびその中の全ての個々の値および範囲の親和性を示す。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＨＣ－ペプチド複合体またはリガンドである。

【0582】

一部の実施形態では、αおよびβ鎖などのＴＣＲをコードする核酸は、ＰＣＲ、クローニングまたは他の適切な手段によって増幅され、適切な発現ベクターにクローニングされ得る。発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであってもよく、任意の適切な宿主を形質転換またはトランスフェクトするのに使用することができる。適切なベクターには、増殖および拡大、もしくは発現または両方のために設計されたベクター、例えばプラスミドおよびウイルスが挙げられる。

【0583】

一部の実施形態では、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、マジソン、ウィスコンシン）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）、またはｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）のベクターであってもよい。一部の例では、λＧ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用することができる。一部の実施形態では、植物発現ベクターが使用されてもよく、これはｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。一部の実施形態では、動物発現ベクターは、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが使用される。

【0584】

一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して調製され得る。一部の実施形態では、ベクターは、必要に応じて、およびベクターがＤＮＡベースかまたはＲＮＡベースかを考慮しながら、ベクターが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に固有の転写および翻訳の開始および終止コドンなどの調節配列を含有することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ＴＣＲまたは抗原結合部分（または他のＭＨＣ－ペプチド結合分子）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された非天然プロモーターを含有することができる。一部の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長末端反復で見出されるプロモーターであってもよい。他の既知のプロモーターも企図される。

【0585】

一部の実施形態では、Ｔ細胞クローンが得られた後、ＴＣＲアルファおよびベータ鎖が単離され、遺伝子発現ベクターにクローニングされる。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファおよびベータ遺伝子は、ピコルナウイルス２Ａリボソームスキップペプチドを介して連結され、その結果、両方の鎖が共発現される。一部の実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸は、受容体を発現させるための細胞の形質導入または操作を確認するためにマーカーを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲの遺伝子移入は、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターベクターを介して、またはトランスポゾンを介して達成される［例えば、Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063；Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757；およびHackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683を参照されたい］。

【0586】

一部の実施形態では、ＴＣＲをコードするベクターを生成するために、目的のＴＣＲを発現するＴ細胞クローンから単離された全ｃＤＮＡからαおよびβ鎖がＰＣＲ増幅され、発現ベクターにクローニングされる。一部の実施形態では、αおよびβ鎖は同じベクターにクローニングされる。一部の実施形態では、αおよびβ鎖は異なるベクタークローニングされる。一部の実施形態では、生成されたαおよびβ鎖は、レトロウイルス、例えばレンチウイルスのベクターに組み込まれる。

【0587】

ｉｉｉ．他の調節エレメント
本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えベクター、例えば、抗原受容体、例えばＣＡＲ、をコードするウイルスベクターゲノムに含有される核酸配列は、目的の配列の発現を特定の方法で調節するために、他の遺伝子エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサーをはじめとする転写調節配列と、機能的な関係で作動可能に連結される。ある特定の例では、そのような転写調節配列は、活性に関して時間的におよび／または空間的に調節されるものである。構成要素の発現を調節するために使用することができる発現制御エレメントは公知であり、これらに限定されないが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサーおよび他の調節エレメントを含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターゲノムに含有される核酸配列は、異なるコードされた構成要素、例えば、異なる受容体構成要素および／またはシグナル伝達構成要素、を制御する複数の発現制御エレメントを含有し、したがって、組換え受容体および／または操作された細胞、例えば、操作された受容体を発現する細胞、の発現、機能および／または活性を制御することができ、例えば、該発現、機能および／または活性は、誘導可能であり、抑制可能であり、調節可能であり、および／またはユーザーによって制御される。一部の実施形態では、１つまたは複数のベクターは、１つもしくは複数の発現制御エレメントおよび／または１つもしくは複数のコードされた構成要素を含有する、１つまたは複数の核酸配列を含有することができ、したがって、核酸配列は一緒に、コードされた構成要素、例えば組換え受容体、または操作された細胞、の発現、活性および／または機能を調節することができる。

【0588】

一部の実施形態では、組換え受容体、例えば、抗原受容体、例えばＣＡＲ、をコードする核酸配列は、内部プロモーター／エンハンサー調節配列と作動可能に連結される。利用されるプロモーターは、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指令するために適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導可能、および／または有用であり得る。プロモーターは、異種であることがあり、または内因性であることがある。一部の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、合成によって生産される。一部の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して生産される。

【0589】

一部の場合には、組換え受容体をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。一部の態様では、シグナル配列は、天然ポリペプチドに由来するシグナルペプチドをコードし得る。他の態様では、シグナル配列は、異種または非天然シグナルペプチド、例えば、配列番号２５に記載され、配列番号２４に記載されたヌクレオチド配列によってコードされる、ＧＭＣＳＦＲアルファ鎖の例示的なポリペプチドをコードし得る。一部の場合には、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。シグナルペプチドの限定されない例としては、例えば、配列番号２５に記載され、配列番号２４に記載されたヌクレオチド配列によってコードされる、ＧＭＣＳＦＲアルファ鎖シグナルペプチド；または配列番号２６に記載されたＣＤ８アルファシグナルペプチドが挙げられる。

【0590】

一部の実施形態では、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するように作動可能に連結されている少なくとも１つのプロモーターを含有する。一部の例では、ポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するように作動可能に連結された２つ、３つ、またはそれより多いプロモーターを含有する。

【0591】

核酸分子が、２つまたはそれより多くの異なるポリペプチド鎖、例えば、組換え受容体およびマーカーをコードする、ある特定の場合、ポリヌクレオチド鎖の各々が別々の核酸分子によってコードされ得る。例えば、２つの別々の核酸が提供され、各々が、細胞における発現のために細胞に個々に移入または導入され得る。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸、およびマーカーをコードする核酸は、同じプロモーターに作動可能に連結され、適宜、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられるか、または適宜Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａである、自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって隔てられる。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸、および組換え受容体をコードする核酸は、２つの異なるプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸、および組換え受容体をコードする核酸は、細胞のゲノム内の異なる位置に存在するか、または挿入される。一部の実施形態では、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドは、培養細胞を含有する組成物に、例えば、レトロウイルス形質導入、トランスフェクション、または形質転換によって、導入される。

【0592】

一部の実施形態、例えば、ポリヌクレオチドが第１および第２の核酸配列を含有する実施形態では、異なるポリペプチド鎖の各々をコードするコード配列は、同じであってもまたは異なっていてもよいプロモーターに作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、核酸分子は、２つまたはそれより多い異なるポリペプチド鎖の発現を駆動するプロモーターを含有することができる。一部の実施形態では、そのような核酸分子は、マルチシストロニック（バイシストロニックまたはトリシストロニック、例えば、米国特許第６，０６０，２７３号を参照）であり得る。一部の実施形態では、転写ユニットを、単一のプロモーターからのメッセージによる遺伝子産物（例えば、マーカーをコードする、または組換え受容体をコードする）の共発現を可能にするＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）を含有するバイシストロニックユニットとして操作することができる。あるいは、一部の例では、単一のプロモーターが、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に、自己切断ペプチド（例えば、２Ａ配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フューリン）をコードする配列によって互いに隔てられた２つまたは３つの遺伝子（例えば、マーカーをコードする、および組換え受容体をコードする）を含有するＲＮＡの発現を指示してもよい。ＯＲＦは故に、翻訳中（２Ａの場合）または翻訳後のどちらかに、個々のタンパク質にプロセシングされる単一ポリペプチドをコードする。一部の例では、Ｔ２Ａなどのペプチドは、２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をリボソームにスキップさせ（リボソームスキッピング）、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドの間に分離をもたらすことができる［例えば、de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)およびde Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照されたい］。様々な２Ａエレメントが公知である。本明細書で開示される方法およびシステムにおいて使用することができる２Ａ配列の例としては、米国特許出願公開第２００７０１１６６９０号に記載の口蹄疫ウイルスからの２Ａ配列（Ｆ２Ａ、例えば配列番号２１）、Ａ型ウマ鼻炎ウイルスからの２Ａ配列（Ｅ２Ａ、例えば配列番号２０）、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルスからの２Ａ配列（Ｔ２Ａ、例えば、配列番号６または１７）、およびブタテッショウウイルス－１からの２Ａ配列（Ｐ２Ａ、例えば、配列番号１８または１９）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0593】

本明細書に記載される組換え受容体のいずれかは、組換え受容体をコードする１つまたは複数の核酸を任意の組合せまたは配置で含有するポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、１つ、２つ、３つまたはそれより多くの異なるポリペプチド、例えば組換え受容体をコードし得る。一部の実施形態では、１つのベクターまたはコンストラクトは、マーカーをコードする核酸配列を含有し、別のベクターまたはコンストラクトは、組換え受容体、例えばＣＡＲ、をコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸、および組換え受容体をコードする核酸は、２つの異なるプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸は、マーカーをコードする核酸の下流に存在する。

【0594】

一部の実施形態では、ベクター骨格は、１つまたは複数のマーカーをコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のマーカーは、形質導入マーカー、サロゲートマーカーおよび／または選択マーカーである。

【0595】

一部の実施形態では、マーカーは、形質導入マーカーまたはサロゲートマーカーである。形質導入マーカーまたはサロゲートマーカーを使用して、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を検出することができる。一部の実施形態では、形質導入マーカーは、細胞の改変を示すことができるか、または確認することができる。一部の実施形態では、サロゲートマーカーは、細胞表面に組換え受容体、例えばＣＡＲ、と共発現されるように作製されるタンパク質である。特定の実施形態では、そのようなサロゲートマーカーは、活性をほとんどまたは全く有さないように改変された表面タンパク質である。ある特定の実施形態では、サロゲートマーカーは、組換え受容体をコードする同じポリヌクレオチドにコードされる。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸配列は、マーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結され、適宜、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）よって隔てられるか、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド、例えばＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡもしくはＦ２Ａ配列をコードする核酸によって隔てられる。外因性マーカー遺伝子は、一部の場合には、細胞の検出または選択を可能にするために、および一部の場合には細胞自殺を促進するためにも、操作された細胞に関連して利用され得る。

【0596】

例示的なサロゲートマーカーとしては、切断型ヒト上皮成長因子受容体２（ｔＨＥＲ２）、切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ、配列番号７もしくは１６に記載された例示的なｔＥＧＦＲ配列）、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）もしくはその改変型を挙げることができる。ＥＧＦＲｔは、抗体セツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）］または他の治療用抗ＥＧＦＲ抗体もしくは結合分子によって認識されるエピトープを含有し得、これらは、ＥＧＦＲｔコンストラクトおよび組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、を用いて操作された細胞を同定もしくは選択するために、ならびに／または受容体を発現する細胞を排除もしくは分離するために、使用され得る。米国特許第８，８０２，３７４号およびLiu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434を参照されたい。一部の態様では、マーカー、例えば、サロゲートマーカーは、ＣＤ３４の全体もしくは部分（例えば、切断型）、ＮＧＦＲの全体もしくは部分（例えば、切断型）、または上皮成長因子受容体の全体もしくは部分（例えば、切断型）（例えば、ｔＥＧＦＲ）を含む。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸は、切断可能なリンカー配列、例えばＴ２Ａなどのリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。例えば、マーカー、および適宜リンカー配列は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４０３１６８７に開示されているいずれかであってもよい。例えば、マーカーは、Ｔ２Ａ切断可能リンカー配列などのリンカー配列に適宜連結されている、切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）であり得る。切断型ＥＧＦＲ（例えば、ｔＥＧＦＲ）の例示的なポリペプチドは、配列番号７もしくは１６に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号７もしくは１６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

【0597】

一部の実施形態では、マーカーは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、例えばスーパーフォールドＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄまたはＤｓＲｅｄ２、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ならびにこれらの変異体であるか、またはそれらを含み、該変異体には、蛍光タンパク質の種変異体、単量体変異体、ならびにコドン最適化および／または増強変異体が含まれる。一部の実施形態では、マーカーは、酵素、例えば、ルシフェラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であるか、またはこれらを含む。例示的な発光レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはそれらの変異体が挙げられる。

【0598】

一部の実施形態では、マーカーは、選択マーカーである。一部の実施形態では、選択マーカーは、外因性薬剤または薬物に対する耐性を付与するポリペプチドであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、選択マーカーは、哺乳動物細胞に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、選択マーカーは、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、もしくはゼオシン耐性遺伝子、またはこれらの改変型であるか、あるいはそれらを含む。

【0599】

導入のための追加の核酸、例えば遺伝子の中には、移入された細胞の生存能および／または機能の促進することなどによって治療の有効性を改善するためのもの；細胞の選択および／または評価のための、例えばインビボ生存または局在化を評価するための、遺伝子マーカーを提供するための遺伝子；例えば、Lupton S. D. et al., Mol. And Cell Biol., 11:6 (1991)およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)によって記載されたようにインビボでネガティブ選択を受けやすくすること［優性選択マーカーとネガティブ選択マーカーの融合から得られる二機能性選択融合遺伝子の使用を記載しているＬｕｐｔｏｎらによるＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の公報も参照されたい］によって、安全性を改善するための遺伝子もある。Ｒｉｄｄｅｌｌらの米国特許６，０４０，１７７号、第１４～１７欄を参照されたい。

【0600】

一部の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができるような、核酸配列と自然に会合しているものであることがある。あるいは、一部の実施形態では、コード核酸配列セグメントは、自然環境でコード核酸配列と通常は会合していない、組換えおよび／または異種プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下に置かれていることがある。例えば、組換えＤＮＡ構築において使用される例示的なプロモーターとしては、β－ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、トリプトファン（ｔｒｐ）、ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）ＩＩＩプロモーター（ヒトおよびマウスＵ６ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターならびにヒトおよびマウスＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む）、ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）ＩＩプロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｐＣＭＶ）、伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）、およびラウス肉腫ウイルス長末端反復（ｐＲＳＶ）プロモーター系が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、得ることができる。プロモーターは、例えば、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または天然配列と通常は会合しているプロモーターであってもよいが、そのようなプロモーターが標的細胞と適合性であることを条件とする。一実施形態では、プロモーターは、ウイルス発現系に天然に存在するウイルスプロモーターである。

【0601】

一部の実施形態では、プロモーターは、構成的に活性であり得る。使用することができる構成的プロモーターの限定されない例としては、ユビキチンのためのプロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号；ＷＯ９８／３２８６９）、ＣＭＶのためのプロモーター（Thomsen et al., PNAS 81:659, 1984；米国特許第５，１６８，０６２号）、ベータ－アクチンのためのプロモーター（Gunning et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835）およびｐｇｋのためのプロモーター（例えば、Adra et al. 1987 Gene 60:65-74；Singer-Sam et al. 1984 Gene 32:409-417；およびDobson et al. 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637）が挙げられる。

【0602】

一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターおよび／または標的細胞特異的プロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、目的の配列の誘導性発現を可能にするように選択され得る。誘導性発現のためのいくつかの系が公知であり、それらには、テトラサイクリン応答系；ｌａｃオペレーター－リプレッサー系；ならびに熱ショック、金属イオン、例えばメタロチオネインプロモーター、インターフェロン、低酸素、ステロイド、例えばプロゲステロンまたはグルココルチコイドプロモーター、放射線、例えばＶＥＧＦプロモーターを含む、様々な環境または生理的変化に応答性のプロモーターが含まれる。一部の実施形態では、ｔｅｔオペレーター配列（ＴＥＣＯ）に対する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｔｅｔ抑制（ｔｅｔｒ）の抑制性作用に基づく、テトラサイクリン－（ｔｅｔ）－調節性の系を、哺乳動物系における使用のために改変することができ、発現カセットの調節性エレメントとして使用することができる。これらの系は、周知である。［Goshen and Badgered, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51 (1992)、Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6522-26 (1996)、Lindemann et al., Mol. Med. 3:466-76 (1997)を参照されたい］。

【0603】

プロモーターの組合せも、目的の遺伝子の所望の発現を達成するために使用することができる。当業者は、目的の生物または標的細胞における遺伝子の所望の発現パターンに基づいてプロモーターを選択することができるであろう。

【0604】

一部の実施形態では、エンハンサーも、目的の遺伝子の発現を増加させるためにウイルスコンストラクトに存在し得る。エンハンサーは典型的に、プロモーターに対してその転写を増加させるように作用する、通常は長さ約１０～３００ｂｙの、シス作用性核酸エレメントである。ＨＩＶまたはＣＭＶなどのウイルスゲノムにおける多くのエンハンサーが公知である。例えば、ＣＭＶエンハンサー（Boshart et al. Cell, 41:521, 1985）を使用することができる。他の例としては、例えば、複製起点の後期側（ｂｐ１００～２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマ－エンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一部の場合には、エンハンサーは、哺乳動物遺伝子からのもの、例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ－フェトプロテインまたはインスリンからのエンハンサーである。エンハンサーを異種プロモーターと組み合わせて使用することができる。エンハンサーをベクターにおける目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドの５’または３’側の位置にスプライシングすることができるが、エンハンサーは、一般に、プロモーターから５’側の部位に位置する。当業者は、所望の発現パターンに基づいて適切なエンハンサーを選択することができるであろう。

【0605】

ウイルスベクターゲノムは、追加の遺伝子エレメントも含有し得る。コンストラクトに含めることができるエレメントのタイプは、いかなる点においても限定されず、当業者によって選択され得る。

【0606】

例えば、標的細胞におけるウイルスゲノムの核侵入を容易にするシグナルを含めることができる。そのようなシグナルの一例は、ＨＩＶ－１フラップシグナル（一部の場合にはフラップ配列と呼ばれる）である。加えて、ベクターゲノムは、目的の遺伝子の発現を増強するように設計された１つまたは複数の遺伝子エレメントを含有し得る。一部の実施形態では、ゲノムは、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、または転写後活性を示すその改変型を含有する。例えば、一部の実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答エレメント（ＷＰＲＥ）をコンストラクトの中に配置することができる（Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-3681；Deglon et al. 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-190）。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、フラップ配列を欠き、および／またはＷＰＲＥを欠く。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、突然変異したまたは欠陥のあるフラップ配列および／またはＷＰＲＥを含有する。

【0607】

一部の例では、別々の異種タンパク質をコードする１つより多くのオープンリーディングフレームを含めることができる。例えば、一部の実施形態では、レポーターおよび／または検出可能なおよび／または選択遺伝子を発現コンストラクトに含めた場合、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含めることができる。典型的には、追加の遺伝子エレメントは、独立したプロモーター／エンハンサーと作動可能に連結され、それらによって制御される。追加の遺伝子エレメントは、レポーター遺伝子、選択マーカーまたは他の所望の遺伝子であり得る。

【0608】

一部の実施形態では、他の多様な調節エレメントが転写開始領域および／または終結領域を含み得る。発現ベクターは、転写の終結のためのおよびｍＲＮＡの安定化のための配列も含有し得る。そのような配列は公知であり、多くの場合、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’およびときには３’非翻訳領域において自然に見出される。転写終結領域の例としては、ポリアデニル化シグナル配列が挙げられるが、これに限定されない。ポリアデニル化シグナル配列の例としては、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリ（Ａ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリ（Ａ）配列、およびこれらの任意の変異体が挙げられるが、それらに限定されない。

【0609】

一部の実施形態では、調節エレメントは、組換え受容体、例えばＣＡＲ、の調節可能な発現および／または活性を可能にする調節エレメントおよび／または系を含み得る。一部の実施形態では、調節可能な発現および／または活性は、特定の調節エレメントおよび／または系を含有するようにまたはそれらによって制御されるように組換え受容体を構成することによって達成される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の受容体を発現調節系において使用することができる。一部の実施形態では、発現調節系は、組換え受容体の発現および／または活性を調節することができる特定のリガンドへの曝露または該リガンドの結合を必要とする系を含み得る。一部の実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲ、の調節された発現は、調節可能な転写因子放出系、例えば、改変されたノッチシグナル伝達系によって達成される［例えば、Roybal et al., Cell (2016) 164:770-779；Morsut et al., Cell (2016) 164:780-791を参照されたい］。一部の実施形態では、組換え受容体の活性の調節は、ポリペプチド、例えば組換え受容体、のコンフォメーション変化および／または多量体化を誘導することができる追加の薬剤の投与によって達成される。一部の実施形態では、追加の薬剤は、化学誘導物質である［例えば、米国特許出願公開第２０１６／００４６７００号、Clackson et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A. 95(18):10437-42；Spencer et al. (1993) Science 262(5136):1019-24；Farrar et al. (1996) Nature 383 (6596):178-81；Miyamoto et al. (2012) Nature Chemical Biology 8(5): 465-70；Erhart et al. (2013) Chemistry and Biology 20(4): 549-57を参照されたい］。

【0610】

Ｂ．ウイルスベクター粒子の調製
ウイルスベクターゲノムは、典型的に、パッケージングまたはプロデューサー細胞株にトランスフェクトすることができるプラスミド形態で構築される。そのゲノムがウイルスベクターゲノムのＲＮＡコピーを含有するレトロウイルス粒子を生成するために、様々な公知の方法のいずれも使用できる。一部の実施形態では、少なくとも２つの構成要素が、ウイルスベースの遺伝子デリバリーシステムの作製に関与する：第１に、構造タンパク質とウイルスベクター粒子を生成するのに必要な酵素とを包むパッケージングプラスミド、ならびに第２に、ウイルスベクター自体、例えば、移入すべき遺伝物質。バイオセイフティー保護は、これらの構成要素の一方または両方の設計に導入され得る。

【0611】

一部の実施形態では、パッケージングプラスミドは、全てのレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ－１、エンベロープタンパク質以外のタンパク質を含有し得る（Naldini et al., 1998）。他の実施形態では、ウイルスベクターは、追加のウイルス遺伝子、例えば病原性に関連するもの、例えば、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｎｅｆ、ならびに／またはＨＩＶの主要なトランス活性化因子であるＴａｔを欠いていてもよい。一部の実施形態では、レンチウイルスベクター、例えば、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクターは、組換えを介した野生型ウイルスの再構築の可能性を低減または排除する親ウイルスの３つの遺伝子のみ：ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖを含む。

【0612】

一部の実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されたウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージングするために必要な全ての構成要素を含有するパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、目的の１つまたは複数の配列、例えば組換え核酸に加えてウイルス成分をコードする１つまたは複数の遺伝子を含んでもよい。しかし、一部の態様では、標的細胞におけるゲノムの複製を防ぐために、複製に必要とされる内因性ウイルス遺伝子が除去され、パッケージング細胞株に別々に提供される。

【0613】

一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、粒子を生成するために必要な構成要素を含有する１つまたは複数のプラスミドベクターでトランスフェクトされる。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、ＬＴＲと、シス作用性パッケージング配列と、目的の配列、例えば、抗原受容体、例えばＣＡＲ、をコードする核酸とを含むウイルスベクターゲノムを含有するプラスミド；ならびにウイルスの酵素的および／または構造的構成要素、例えばＧａｇ、ｐｏｌおよび／またはｒｅｖ、をコードする１つまたは複数のヘルパープラスミドで、トランスフェクトされる。一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝子構成要素を分離するために複数のベクターが利用される。一部のこのような実施形態では、別個のベクターをパッケージング細胞に提供することによって、そうでなければ複製能力のあるウイルスを生成する可能性がある組換え事象の機会が低減される。一部の実施形態では、レトロウイルス構成要素の全てを有する単一プラスミドベクターが使用され得る。

【0614】

一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子は、宿主細胞の形質導入効率を増大するための偽型である。例えば、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子は、一部の実施形態では、ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質を有する偽型であり、これは、形質導入され得る細胞種に拡大する広い細胞宿主域を提供する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、異種指向性、多指向性または両種指向性エンベロープ、例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスエンベロープ、ＧＡＬＶまたはＶＳＶ－Ｇを含むようになど、非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドまたはポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。

【0615】

一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクター粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングにイントランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）必要とされるウイルス調節および構造タンパク質を含む構成要素を提供する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現可能であり、機能的レンチウイルスベクター粒子を生成可能である任意の細胞株であり得る。一部の態様では、適したパッケージング細胞株として、２９３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ Ｘ）、２９３Ｔ、ＨｅＬＡ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３０）細胞が挙げられる。

【0616】

一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、ウイルスタンパク質（複数可）を安定に発現する。例えば、一部の態様では、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖおよび／または他の構造遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング構成要素を有さないパッケージング細胞株を構築できる。一部の実施形態では、パッケージング細胞株を、異種タンパク質をコードする核酸分子および／またはエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含有するウイルスベクターゲノムと共に、１つまたは複数のウイルスタンパク質をコードする核酸分子を用いて一過性にトランスフェクトできる。

【0617】

一部の実施形態では、ウイルスベクターならびにパッケージングおよび／またはヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株中にトランスフェクションまたは感染を介して導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有するウイルスベクター粒子を産生する。トランスフェクションまたは感染の方法は周知である。限定されない例として、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランおよびリポフェクション法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが挙げられる。

【0618】

組換えプラスミドおよびレトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列が特別の細胞株中に導入される場合に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって、例えば）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子中にパッケージングされることを可能にでき、次いで、培養培地中に分泌され得る。組換えレトロウイルスを含有する培地は、一部の実施形態では、次いで、収集され、適宜、濃縮され、遺伝子導入のために使用される。例えば、一部の態様では、パッケージング細胞株へのパッケージングプラスミドおよびトランスファーベクターの同時トランスフェクション後に、当業者によって使用される標準方法によってウイルスベクター粒子が培養培地から回収され、力価測定される。

【0619】

一部の実施形態では、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス粒子の生成を可能にするプラスミドの導入によって、パッケージング細胞株、例えば、例示的なＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株において生産され得る。一部の実施形態では、パッケージング細胞は、トランスフェクトされ、ならびに／またはｇａｇおよびｐｏｌをコードするポリヌクレオチドおよび組換え受容体、例えば、抗原受容体、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、適宜および／もしくはさらにトランスフェクトされる、ならびに／またはｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、適宜および／もしくはさらにトランスフェクトされる、ならびに／または非天然エンベロープ糖タンパク質、例えば、ＶＳＶ－Ｇをコードするポリヌクレオチドを含有する。一部のこのような実施形態では、細胞、例えば、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションのおよそ２日後、細胞上清は、組換えレンチウイルスベクターを含有し、これは回収され、力価測定され得る。

【0620】

回収され、および／または生成されたレトロウイルスベクター粒子を使用して、記載されたような方法を使用して標的細胞に形質導入できる。ひとたび、標的細胞においてウイルスＲＮＡが逆転写されると、核中に移入され、宿主ゲノム中に安定に統合される。ウイルスＲＮＡの統合の１日後または２日後に、組換えタンパク質、例えば、抗原受容体、例えばＣＡＲ、の発現が検出され得る。

【0621】

Ｖ．組成物、製剤、および投与方法
医薬組成物および医薬品製剤を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの操作された受容体（例えば、操作された抗原受容体）を発現する細胞の形質導された集団を含有する組成物、および操作された細胞を含有する組成物も、提供される。組成物の、例えば、抗原が発現される疾患、状態および障害の処置における、または検出、診断および予後予測方法における、使用方法および使用も、提供される。

【0622】

生細胞について濃縮された細胞の形質導入された集団であり得る、生細胞について濃縮された細胞の集団を含有する組成物も、提供される。脱ビーズ化された細胞の形質導入された集団であり得る、脱ビーズ化された細胞の集団を含有する組成物も、提供される。一部の実施形態では、細胞の形質導入された集団は、抗原受容体（例えば、操作された抗原受容体）、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物および医薬品製剤を含む。組成物の、例えば、抗原が発現される疾患、状態および障害の処置における、または検出、診断および予後予測方法における、使用方法および使用も、提供される。

【0623】

Ａ．組成物および製剤
一部の実施形態では、組換え抗原受容体、例えばＣＡＲまたはＴＣＲ、を用いて操作された細胞を含む細胞の用量は、医薬組成物または医薬品製剤などの組成物または製剤として提供される。そのような組成物を、提供される方法に従って、および／または提供される製造品もしくは組成物と共に、例えば、疾患、状態および障害の予防または処置において、ならびに検出、診断および予後予測方法において、使用することができる。

【0624】

用語「医薬品製剤」とは、その中に含有される有効成分の生物活性を有効にさせるような形態である調製物であって、製剤が投与される対象にとって容認しがたいほど毒性である追加の構成要素を含有しない調製物を指す。

【0625】

「薬学的に許容される担体」とは、活性成分以外の医薬品製剤中の構成要素であって、対象にとって非毒性である構成要素を指す。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存料を含むが、これらに限定されない。

【0626】

一部の態様では、担体の選択は、一部には、特定の細胞もしくは薬剤によっておよび／または投与の方法によって決定される。したがって、様々な適切な製剤がある。例えば、医薬組成物は、保存料を含有し得る。適切な保存料としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムを挙げることができる。一部の態様では、２つまたはそれより多くの保存料の混合物が使用される。保存料またはその混合物は、典型的には、組成物全体の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。担体は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)によって記載されている。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、以下を含むが、これらに限定されない：リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。

【0627】

緩衝剤が、一部の態様では、組成物に含まれる。適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、および多様な他の酸および塩が挙げられる。一部の態様では、２つまたはそれより多くの緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には、組成物全体の約０．００１重量％～約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、より詳細に、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21^st ed. (May 1, 2005)に記載されている。

【0628】

製剤または組成物は、細胞または薬剤で予防または処置される特定の適応症、疾患または状態に有用な１つより多くの有効成分であって、それぞれの活性が互いに悪影響を及ぼさない、有効成分も含有し得る。そのような有効成分は、意図された目的に有効である量で組み合わせて適切に存在する。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は、他の薬学的に活性な薬剤または薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどをさらに含む。一部の実施形態では、薬剤または細胞は、塩、例えば薬学的に許容される塩、の形態で投与される。適する薬学的に許容される酸付加塩としては、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸、ならびに有機酸、例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホ難、例えばｐ－トルエンスルホン酸、から誘導されるものが挙げられる。

【0629】

医薬組成物は、一部の実施形態では、疾患または状態を処置または予防するために有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で、薬剤または細胞を含有する。治療的有効性または予防的有効性は、一部の実施形態では、処置された対象の定期的な評価によってモニタリングされる。状態に応じた数日間またはそれより長い反復投与については、疾患症状の所望の抑制が生じるまで処置が反復される。しかし、他の投与量レジメンが有用であることがあり、該レジメンを決定することができる。所望の投与量を、組成物の単回ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、または組成物の連続注入投与によってデリバリーすることができる。

【0630】

薬剤または細胞を、いずれかの適した手段によって、例えば、ボーラス注入によって、注射、例えば、静脈内もしくは皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または強膜近傍後側デリバリーによって投与することができる。一部の実施形態では、それらは、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与、ならびに局所的処置に望まれる場合は病巣内投与によって、投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与を含む。一部の実施形態では、所与の用量が細胞または薬剤の単回ボーラス投与によって投与される。一部の実施形態では、それは、細胞または薬剤の複数回ボーラス投与によって、例えば、３日以下の期間にわたって投与されるか、または細胞または薬剤の連続注入によって投与される。

【0631】

疾患の予防または処置のための、適切な投与量は、処置されるべき疾患のタイプ、薬剤（単数または複数）のタイプ、細胞型または組換え受容体のタイプ、疾患の重症度および経過、薬剤または細胞が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか、以前の療法、対象の臨床歴および薬剤または細胞に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存し得る。組成物は、一部の実施形態では、対象に一度に、または一連の処置にわたって、適切に投与される。

【0632】

細胞または薬剤を、標準的な投与法、製剤および／またはデバイスを使用して投与することができる。組成物の保管および投与ための製剤およびデバイス、例えば、シリンジおよびバイアルが、提供される。細胞に関して、投与は、自家または異種であってもよい。例えば、免疫応答性細胞または前駆体が１つの対象から得られ、同じ対象または異なる適合する対象に投与されてもよい。末梢血由来免疫応答性細胞またはそれらの子孫（例えば、インビボ、エクスビボまたはインビトロで得られた）が、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射または非経口投与をはじめとする局所注射によって投与されてもよい。治療用組成物（例えば、神経毒性の症状を処置または改善する、遺伝子改変された免疫応答性細胞または薬剤を含有する医薬組成物）を投与する場合、治療用組成物は、一般に、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化される。

【0633】

製剤は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺内、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下または坐薬投与用のものを含む。一部の実施形態では、薬剤または細胞集団は、非経口投与される。用語「非経口」は、本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内および腹腔内投与を含む。一部の実施形態では、薬剤または細胞集団は、静脈内、腹腔内または皮下注射による末梢全身デリバリーを使用して対象に投与される。

【0634】

組成物は、一部の実施形態では、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供され、これらは、一部の態様では、選択されたｐＨに緩衝され得る。液体調製物は、通常は、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物よりも調製するのが容易である。加えて、液体組成物のほうが、特に注射によって投与するのに幾分便利である。その一方で、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすために適切な粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘性組成物は、担体を含むことができ、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびこれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。

【0635】

滅菌注射用溶液は、溶媒に、例えば、適切な担体、希釈液または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなど、との混合物に、薬剤または細胞を組み入れることによって調製することができる。

【0636】

インビボ投与に使用されることになる製剤は、一般に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成され得る。

【0637】

Ｂ．投与量および投与
細胞または組成物は、疾患または状態を処置するためにインビボで組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）発現細胞の治療有効量をもたらすような用量で投与される。疾患の予防または処置のための、適切な投与量は、処置されるべき疾患のタイプ；細胞型または組換え受容体のタイプ；細胞拡大をブーストする、増すまたは増強するものなどの、組合せでの他の薬物または薬剤、の投与；疾患の重症度および経過；細胞が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか；以前の療法；対象の臨床歴および薬剤または細胞に対する応答；ならびに担当医の裁量に依存し得る。組成物および細胞は、一部の実施形態では、対象に一度に、または一連の処置にわたって、適切に投与される。

【0638】

投与の文脈における剤、例えば、医薬品製剤、細胞、または組成物の「有効量」とは、治療的または予防的結果などの所望の結果を達成するために必要な投与量／量および期間での有効な量を指す。

【0639】

剤、例えば、医薬品製剤または細胞の「治療有効量」とは、疾患、状態、もしくは障害の処置などに対する所望の治療的結果、および／または処置の薬物動体的もしくは薬力学的効果を達成するために必要な投与量および期間での有効な量を指す。治療有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに投与される細胞集団および組み合わせて、例えば並行して、投与される他の薬物または薬剤などの要因に従って異なり得る。

【0640】

「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間での有効な量を指す。典型的には、必ずしもではないが、予防的用量は、疾患の初期段階の前にまたは初期段階で対象において使用されるため、予防有効量は治療有効量より少なくなる。

【0641】

一部の実施形態では、細胞または組成物は、疾患または状態を処置または予防するために有効である量、例えば、治療有効量または予防有効量で投与される。したがって、一部の実施形態では、投与方法は、有効量での細胞および組成物の投与を含む。治療的有効性または予防的有効性は、一部の実施形態では、処置された対象の定期的な評価によってモニタリングされる。状態に応じた数日間またはそれより長い反復投与については、疾患症状の所望の抑制が生じるまで処置が反復される。しかし、他の投与量レジメンが有用であることがあり、該レジメンを決定することができる。

【0642】

一部の実施形態では、細胞の治療有効量が対象に投与される。一部の実施形態では、細胞のインビボ拡大のための条件下で細胞が投与される、ある特定の場合などは、細胞の準最適用量が投与される。

【0643】

ある特定の実施形態では、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、約１０万～約１０００億細胞の範囲で、および／または対象の体重１キログラム当たりのその細胞量で、例えば、１０万～約５００億細胞（例えば、５０万細胞未満、１００万細胞未満、約１０万細胞、約２０万細胞、約３０万細胞、約４０万細胞、約５０万細胞、約１００万細胞、約５００万細胞、約２５００万細胞、約５億細胞、約１０億細胞、約５０億細胞、約２００億細胞、約３００億細胞、約４００億細胞、もしくは前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）、１００万～約５００億細胞（例えば、約５００万細胞、約２５００万細胞、約５億細胞、約１０億細胞、約５０億細胞、約２００億細胞、約３００億細胞、約４００億細胞、もしくは前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）、例えば、約１０００万～約１０００億細胞（例えば、約２０００万細胞、約３０００万細胞、約４０００万細胞、約６０００万細胞、約７０００万細胞、約８０００万細胞、約９０００万細胞、約１００億細胞、約２５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、もしくは前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）、および一部の場合には、約１億細胞～約５００億細胞（例えば、約１億２０００万細胞、約２億５０００万細胞、約３億５０００万細胞、約４億５０００万細胞、約６億５０００万細胞、約８億細胞、約９億細胞、約３０億細胞、約３００億細胞、約４５０億細胞）、またはこれらの範囲の間のおよび／もしくは対象の体重１キログラム当たりの任意の値などで、対象に投与される。投与量は、特に疾患もしくは障害および／または患者および／または他の処置の特質に応じて異なり得る。一部の実施形態では、そのような値は、組換え受容体発現細胞の数を指し、他の実施形態では、それらは、投与されるＴ細胞またはＰＢＭＣまたは全細胞の数を指す。

【0644】

一部の実施形態では、細胞療法は、少なくとももしくは少なくとも約０．１×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）、少なくとももしくは少なくとも約０．２×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約０．３×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約０．４×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約０．５×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約１×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約２．０×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約３×１０^６細胞／ｋｇ、または少なくとももしくは少なくとも約５×１０^６細胞／ｋｇであるか、あるいは０．１×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）、０．２×１０^６細胞／ｋｇ、０．３×１０^６細胞／ｋｇ、０．４×１０^６細胞／ｋｇ、０．５×１０^６細胞／ｋｇ、１×１０^６細胞／ｋｇ、２．０×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇまたは５×１０^６細胞／ｋｇであるか、あるいは約０．１×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）、約０．２×１０^６細胞／ｋｇ、約０．３×１０^６細胞／ｋｇ、約０．４×１０^６細胞／ｋｇ、約０．５×１０^６細胞／ｋｇ、約１×１０^６細胞／ｋｇ、約２．０×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇまたは約５×１０^６細胞／ｋｇである、細胞数を含む用量の投与を含む。

【0645】

一部の実施形態では、細胞療法は、各境界を含めて、０．１×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）から１．０×１０^７細胞／ｋｇの間もしくは約０．１×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）から約１．０×１０^７細胞／ｋｇの間、０．５×１０^６細胞／ｋｇから５×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約０．５×１０^６細胞／ｋｇから約５×１０^６細胞／ｋｇの間、０．５×１０^６細胞／ｋｇから３×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約０．５×１０^６細胞／ｋｇから約３×１０^６細胞／ｋｇの間、０．５×１０^６細胞／ｋｇから２×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約０．５×１０^６細胞／ｋｇから約２×１０^６細胞／ｋｇの間、０．５×１０^６細胞／ｋｇから１×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約０．５×１０^６細胞／ｋｇから約１×１０^６細胞／ｋｇの間、１．０×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）から５×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約１．０×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）から約５×１０^６細胞／ｋｇの間、１．０×１０^６細胞／ｋｇから３×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約１．０×１０^６細胞／ｋｇから約３×１０^６細胞／ｋｇの間、１．０×１０^６細胞／ｋｇから２×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約１．０×１０^６細胞／ｋｇから約２×１０^６細胞／ｋｇの間、２．０×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）から５×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約２．０×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）から約５×１０^６細胞／ｋｇの間、２．０×１０^６細胞／ｋｇから３×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約２．０×１０^６細胞／ｋｇから約３×１０^６細胞／ｋｇの間、または３．０×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）から５×１０^６細胞／ｋｇの間もしくは約３．０×１０^６細胞／ｋｇ（対象の体重）から約５×１０^６細胞／ｋｇの間である細胞数を含む用量の投与を含む。

【0646】

一部の実施形態では、細胞の用量は、２×１０^５の細胞／ｋｇから２×１０^６の細胞／ｋｇもしくは約２×１０^５の細胞／ｋｇから約２×１０^６の細胞／ｋｇの間、例えば、４×１０^５の細胞／ｋｇから１×１０^６の細胞／ｋｇもしくは約４×１０^５の細胞／ｋｇから約１×１０^６の細胞／ｋｇの間、または６×１０^５の細胞／ｋｇから８×１０^５の細胞／ｋｇもしくは約６×１０^５の細胞／ｋｇから約８×１０^５の細胞／ｋｇの間の用量を含む。一部の実施形態では、細胞の用量は、対象の体重１キログラム当たり２×１０^５の細胞（例えば、抗原発現、例えばＣＡＲ発現、細胞）（細胞／ｋｇ）以下、例えば、３×１０^５細胞／ｋｇもしくは約３×１０^５細胞／ｋｇ以下、４×１０^５細胞／ｋｇもしくは約４×１０^５細胞／ｋｇ以下、５×１０^５細胞／ｋｇもしくは約５×１０^５細胞／ｋｇ以下、６×１０^５細胞／ｋｇもしくは約６×１０^５細胞／ｋｇ以下、７×１０^５細胞／ｋｇもしくは約７×１０^５細胞／ｋｇ以下、８×１０^５細胞／ｋｇもしくは約８×１０^５細胞／ｋｇ以下、９×１０^５細胞／ｋｇもしくは約９×１０^５細胞／ｋｇ以下、１×１０^６細胞／ｋｇもしくは約１×１０^６細胞／ｋｇ以下、または２×１０^６細胞／ｋｇもしくは約２×１０^６細胞／ｋｇ以下を含む。

【0647】

一部の実施形態では、細胞の用量は、対象の体重１キログラム当たり少なくとももしくは少なくとも約２×１０^５のまたは２×１０^５もしくは約２×１０^５の細胞（例えば、抗原発現、例えばＣＡＲ発現、細胞）（細胞／ｋｇ）、例えば、少なくとももしくは少なくとも約３×１０^５細胞／ｋｇまたは３×１０^５もしくは約３×１０^５細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約４×１０^５細胞／ｋｇまたは４×１０^５もしくは約４×１０^５細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約５×１０^５細胞／ｋｇまたは５×１０^５もしくは約５×１０^５細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約６×１０^５細胞／ｋｇまたは６×１０^５もしくは約６×１０^５細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約７×１０^５細胞／ｋｇまたは７×１０^５もしくは約７×１０^５細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約８×１０^５細胞／ｋｇまたは８×１０^５もしくは約８×１０^５細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約９×１０^５細胞／ｋｇまたは９×１０^５もしくは約９×１０^５細胞／ｋｇ、少なくとももしくは少なくとも約１×１０^６細胞／ｋｇまたは１×１０^６もしくは約１×１０^６細胞／ｋｇ、あるいは少なくとももしくは少なくとも約２×１０^６細胞／ｋｇまたは２×１０^６もしくは約２×１０^６細胞／ｋｇを含む。

【0648】

一部の実施形態では、細胞の用量は、細胞の一定用量または細胞の固定用量であり、したがって、細胞の用量は、対象の体表面積または体重に縛られも基づきもしない。

【0649】

ある特定の実施形態では、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、約１００万～約１０００億個の細胞の範囲で、および／または体重１キログラム当たりのその量の細胞で、例えば、１００万～約５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）、例えば約１０００万～約１０００億個の細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）、および一部の例では約１億個の細胞～約５００億個の細胞（例えば、約１億２０００万細胞、約２億５０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５０００万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞）、またはこれらの範囲の間のおよび／もしくは体重１キログラム当たりの任意の値で対象に投与される。投与量は、特に疾患もしくは障害および／または患者および／または他の処置の特質に応じて異なり得る。

【0650】

一部の実施形態では、例えば、対象がヒトである場合、用量は、総数約５×１０^８未満の組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）発現細胞、Ｔ細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、例えば、総数２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８もしくは５×１０^８のそのような細胞、または前述の値のいずれか２つの間の範囲などの、約１×１０^６～５×１０^６の範囲でそのような細胞を含む。

【0651】

一部の実施形態では、細胞療法は、各境界を含めて、組換え受容体発現細胞総数、Ｔ細胞総数もしくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）総数１×１０^５～５×１０^８もしくは約１×１０^５～約５×１０^８、または組換え受容体発現細胞総数、Ｔ細胞総数もしくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）総数５×１０^５～１×１０^７もしくは約５×１０^５～約１×１０^７、または組換え受容体発現細胞総数、Ｔ細胞総数もしくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）総数１×１０^６～１×１０^７もしくは約１×１０^６～約１×１０^７の細胞数を含む用量の投与を含む。一部の実施形態では、細胞療法は、組換え受容体発現細胞総数、Ｔ細胞総数または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）総数少なくともまたは少なくとも約１×１０^５、例えば、そのような細胞少なくとももしくは少なくとも１×１０^６、少なくとももしくは少なくとも約１×１０^７、少なくとももしくは少なくとも約１×１０^８の細胞数を含む細胞の用量の投与を含む。一部の実施形態では、数は、ＣＤ３＋またはＣＤ８＋の総数に準拠しており、一部の場合には、組換え受容体発現（例えば、ＣＡＲ＋）細胞も同様である。一部の実施形態では、細胞療法は、各境界を含めて、ＣＤ３＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞総数またはＣＤ３＋もしくはＣＤ８＋組換え受容体発現細胞１×１０^５～５×１０^８もしくは約１×１０^５～約５×１０^８、あるいはＣＤ３＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞総数またはＣＤ３＋もしくはＣＤ８＋組換え受容体発現細胞５×１０^５～１×１０^７もしくは約５×１０^５～約１×１０^７、あるいはＣＤ３＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞総数またはＣＤ３＋もしくはＣＤ８＋組換え受容体発現細胞１×１０^６～１×１０^７もしくは約１×１０^６～約１×１０^７の細胞数を含む用量の投与を含む。一部の実施形態では、細胞療法は、各境界を含めて、ＣＤ３＋／ＣＡＲ＋もしくはＣＤ８＋／ＣＡＲ＋細胞総数１×１０^５～５×１０^８もしくは約１×１０^５～約５×１０^８、またはＣＤ３＋／ＣＡＲ＋もしくはＣＤ８＋／ＣＡＲ＋細胞総数５×１０^５～１×１０^７もしくは約５×１０^５～約１×１０^７、またはＣＤ３＋／ＣＡＲ＋もしくはＣＤ８＋／ＣＡＲ＋細胞総数１×１０^６～１×１０^７もしくは約１×１０^６～約１×１０^７の細胞数を含む用量の投与を含む。

【0652】

一部の実施形態では、用量のＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。

【0653】

一部の実施形態では、例えば、対象がヒトである場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む用量におけるものを含む、用量のＣＤ８＋Ｔ細胞は、総数約１×１０^６から５×１０^８の間の組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）発現ＣＤ８＋細胞、例えば、そのような細胞総数１×１０^７、２．５×１０^７、５×１０^７、７．５×１０^７、１×１０^８もしくは５×１０^８のそのような細胞、または前述の値のうちいずれか２つの間の範囲などの、約５×１０^６～１×１０^８の範囲でそのような細胞を含む。一部の実施形態では、患者に複数用量が投与され、用量の各々または総用量は、前述の値のいずれかの中にあり得る。一部の実施形態では、細胞の用量は、各境界を含めて、総数１×１０^７～０．７５×１０^８または約１×１０^７～約０．７５×１０^８の組換え受容体発現ＣＤ８＋Ｔ細胞、総数１×１０^７～約２．５×１０^７の組換え受容体発現ＣＤ８＋Ｔ細胞、総数１×１０^７～０．７５×１０^８または約１×１０^７～約０．７５×１０^８の組換え受容体発現ＣＤ８＋Ｔ細胞の投与を含む。一部の実施形態では、細胞の用量は、総数１×１０^７、２．５×１０^７、５×１０^７、７．５×１０^７、１×１０^８、もしくは５×１０^８、または約１×１０^７、約２．５×１０^７、約５×１０^７、約７．５×１０^７、約１×１０^８、もしくは約５×１０^８の組換え受容体発現ＣＤ８＋Ｔ細胞の投与を含む。

【0654】

一部の実施形態では、細胞、例えば組換え受容体発現Ｔ細胞、の用量は、単一用量として対象に投与されるか、または２週間、１カ月、３カ月、６カ月、１年のもしくはそれより長い期間内に１回のみ投与される。

【0655】

養子細胞療法の状況において、細胞の所与の「用量」の投与は、所与の量または数の細胞の単一組成物としての投与、および／または例えば単回注射または連続注入としての、単一の中断されない投与を包含し、また、指定期間にわたって、例えば３日間以下にわたって、複数の個々の組成物または注入で提供される、分割用量としてのまたは複数の組成物としての所与の量または数の細胞の投与も包含する。したがって、一部の状況では、用量は、単一の時点で与えられるまたは開始される指定数の細胞の単回または連続投与である。しかし、一部の状況では、用量は、３日間以下の期間にわたって複数回の注射または注入で、例えば、３日間もしくは２日間、１日１回、または１日の期間にわたって複数回の注入によって、投与される。

【0656】

したがって、一部の態様では、用量の細胞は、単一の医薬組成物で投与される。一部の実施形態では、用量の細胞は、合計で用量の細胞を含有する、複数の組成物で投与される。

【0657】

用語「分割用量」とは、１日より長きにわたって投与されるように分割される用量を指す。このタイプの投薬は、本方法に包含され、単一用量であると見なされる。一部の実施形態では、分割用量の細胞は、合計で用量の細胞を含有する複数の組成物で３日以下の期間にわたって投与される。

【0658】

したがって、細胞の用量は、分割用量、例えば、経時的に投与される分割用量として、投与され得る。例えば、一部の実施形態では、用量は、２日間にわたってまたは３日間にわたって対象に投与され得る。分割投薬のための例示的な方法は、１日目に用量の２５％を投与し、２日目に用量の残りの７５％を投与することを含む。他の実施形態では、用量の３３％が１日目に投与され、残りの６７％を２日目に投与され得る。一部の態様では、用量の１０％が１日目に投与され、用量の３０％が２日目に投与され、用量の６０％が３日目に投与される。一部の実施形態では、分割用量は、３日間を超えて広げられない。

【0659】

一部の実施形態では、用量の細胞は、用量の一部の細胞を各々が含有する複数の組成物または溶液、例えば、第１および第２の、適宜それより多くの組成物または溶液の投与によって投与され得る。一部の態様では、細胞の異なる集団および／またはサブタイプを各々が含有する複数の組成物は、別々にまたは独立して、適宜、ある特定の期間内に、投与される。例えば、細胞の集団またはサブタイプは、それぞれ、ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞を、および／またはそれぞれ、ＣＤ８＋濃縮集団およびＣＤ４＋濃縮集団、例えば、組換え受容体を発現するように遺伝子操作された細胞を各々が個々に含むＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、含み得る。一部の実施形態では、用量の投与は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の用量またはＣＤ４＋Ｔ細胞の用量を含む第１の組成物の投与と、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のその他の用量を含有する第２の組成物の投与とを含む。

【0660】

一部の実施形態では、組成物または用量の投与、例えば、複数の細胞組成物の投与は、別々に細胞組成物の投与を含む。一部の態様では、別々の投与は、同時に、または逐次に、任意の順序で実行される。一部の実施形態では、用量は、第１の組成物および第２の組成物を含み、第１の組成物および第２の組成物は、０～１２時間離して、０～６時間離して、または０～２時間離して投与される。一部の実施形態では、第１の組成物の投与の開始、および第２の組成物の投与の開始は、２時間以下、１時間以下、または３０分以下離して、１５分以下、１０分以下、または５分以下離して実行される。一部の実施形態では、第１の組成物の投与の開始および／または完了、ならびに第２の組成物の投与の開始および／または完了は、２時間以下、１時間以下、または３０分以下離して、１５分以下、１０分以下、または５分以下離して実行される。

【0661】

一部の組成物では、第１の組成物、例えば、用量の第１の組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の組成物では、第１の組成物、例えば、用量の第１の組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、第１の組成物は、第２の組成物の前に投与される。

【0662】

一部の実施形態では、細胞の用量または組成物は、組換え受容体を発現するＣＤ４＋細胞の組換え受容体を発現するＣＤ８＋細胞に対する、および／またはＣＤ４＋細胞のＣＤ８＋細胞に対する、定義されたまたは標的比率を含み、この比率は、およそ１：１であってもよく、またはおよそ１：３からおよそ３：１の間、例えば、およそ１：１であってもよい。一部の態様では、異なる細胞集団の標的または所望の比率（例えば、ＣＤ４＋：ＣＤ８＋比率またはＣＡＲ＋ＣＤ４＋：ＣＡＲ＋ＣＤ８＋比率、例えば、１：１）を有する組成物または用量の投与は、集団のうちの１つを含有する細胞組成物の投与、次いで、集団のうちの他のものを含む別の細胞組成物の投与を含み、投与は、標的もしくは所望の比率でのまたはおよそ標的もしくは所望の比率での投与である。一部の態様では、定義された比率での細胞の用量または組成物の投与は、Ｔ細胞療法の改善された拡大、持続性および／または抗腫瘍活性をもたらす。

【0663】

一部の実施形態では、対象は、細胞の複数用量、例えば、２もしくはそれより多くの用量または複数の連続用量を受ける。一部の実施形態では、２用量が対象に投与される。一部の実施形態では、対象は連続用量を受け、例えば、第２の用量は、第１の用量のおよそ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日後に投与される。一部の実施形態では、複数の連続用量が第１の用量の後に投与され、したがって、追加の用量（単数または複数）が連続用量の投与後に投与される。一部の態様では、追加の用量で対象に投与される細胞の数は、第１の用量および／または連続用量と同じまたは同様である。一部の実施形態では、追加の用量（単数または複数）は、前の用量より多い。

【0664】

一部の態様では、第１の用量および／または連続用量のサイズは、以前の処置、例えば化学療法、への対象の応答、対象における疾患負荷、例えば、腫瘍量、容積、サイズもしくは度合い、転移の程度もしくはタイプ、ステージ、ならびに／または対象が毒性転帰、例えば、ＣＲＳ、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性、を生じる可能性もしくは発生率、ならびに／または投与される細胞および／もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答などの、１つまたは複数の基準に基づいて決定される。

【0665】

一部の態様では、第１の用量の投与と連続用量の投与の間の時間は、約９～約３５日、約１４～約２８日、または１５～２７日である。一部の態様では、連続用量の投与は、第１の用量の投与から１４日より後、かつ第１の用量の投与後約２８日未満の時点である。一部の態様では、第１の用量と連続用量の間の時間は、約２１日である。一部の実施形態では、追加の用量（単数または複数）、例えば、連続用量は、連続用量の投与後に投与される。一部の態様では、追加の連続用量（単数または複数）は、前の用量投与から少なくとも約１４日後、かつ前の用量の投与後約２８日未満に投与される。一部の実施形態では、追加の用量は、前の投与後約１４日未満、例えば、前の投与から４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３日後に投与される。一部の実施形態では、前の投与後約１４日未満に投与される用量はなく、および／または前の投与から約２８日より後に投与される用量はない。

【0666】

一部の実施形態では、細胞、例えば組換え受容体発現細胞、の用量は、Ｔ細胞の第１の用量とＴ細胞の連続用量とを含む２用量（例えば、２回用量）であり、第１の用量および第２の用量の一方または両方がＴ細胞の分割用量の投与を構成する。

【0667】

一部の実施形態では、細胞の用量は、一般に、疾患負荷を低下させる上で有効であるのに十分なほど多い。

【0668】

一部の実施形態では、細胞は、所望の投与量で投与され、所望の投与量は、一部の態様では、細胞もしくは細胞型の所望の用量もしくは数、および／または細胞型の所望の比率を含む。したがって、細胞の投与量は、一部の実施形態では、細胞の総数（または体重１ｋｇ当たりの数）、および個々の集団またはサブタイプの所望の比率、例えば、ＣＤ４＋のＣＤ８＋に対する比率に基づく。一部の実施形態では、細胞の投与量は、個々の集団内の細胞の、または個々の細胞型の、所望の総数（または体重１ｋｇ当たりの数）に基づく。一部の実施形態では、投与量は、全細胞の所望の数、所望の比率、および個々の集団内の細胞の所望の総数などの、そのような特徴の組合せに基づく。

【0669】

一部の実施形態では、細胞の集団またはサブタイプ、例えば、ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞の所望の用量などの全細胞の所望の用量でまたは所望の用量の許容差の範囲内で投与される。一部の態様では、所望の用量は、所望の細胞数、または細胞が投与される対象の体重の単位当たりの所望の細胞数、例えば、細胞／ｋｇである。一部の態様では、所望の用量は、最小細胞数または体重の単位当たりの最小細胞数であるか、またはそれより上である。一部の態様では、所望の用量で投与される全細胞の中に、個々の集団またはサブタイプが、所望のアウトプット比率（例えば、ＣＤ４^＋のＣＤ８^＋に対する比率）で、またはほぼその比率で、例えば、そのような比率のある特定の許容差もしくは誤差の範囲内で存在する。

【0670】

一部の実施形態では、細胞は、細胞の個々の集団もしくはサブタイプの１つもしくは複数についての所望の用量、例えば、ＣＤ４＋細胞の所望の用量および／もしくはＣＤ８＋細胞の所望の用量で、または所望の用量の許容差の範囲内で投与される。一部の態様では、所望の用量は、サブタイプもしくは集団の所望の細胞数、または細胞が投与される対象の体重の単位当たりのそのような細胞の所望の数、例えば、細胞／ｋｇである。一部の態様では、所望の用量は、集団もしくはサブタイプの細胞の最小数または体重の単位当たりの集団もしくはサブタイプの細胞の最小数であるか、またはそれより上である。

【0671】

したがって、一部の実施形態では、投与量は、全細胞の所望の固定用量、および所望の比率に基づき、ならびに／または個々のサブタイプもしくは亜集団の１つもしくは複数、例えば、各々についての所望の固定用量に基づく。したがって、一部の実施形態では、投与量は、Ｔ細胞の所望の固定もしくは最小用量およびＣＤ４^＋細胞のＣＤ８^＋細胞に対する所望の比率に基づき、ならびに／またはＣＤ４^＋および／もしくはＣＤ８^＋細胞の所望の固定もしくは最小用量に基づく。

【0672】

一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞もしくはサブタイプなどの、複数の細胞集団もしくはサブタイプの所望のアウトプット比率で、または所望のアウトプット比率の許容範囲内で投与される。一部の態様では、所望の比率は、特定の比率であり得るか、または比率の範囲であり得る。例えば、一部の実施形態では、所望の比率（例えば、ＣＤ４^＋細胞のＣＤ８^＋細胞に対する比率）は、５：１から５：１もしくは約５：１から約５：１の間（または例えば、約１：５より大きく、かつ約５：１未満）、または１：３から３：１もしくは約１：３から約３：１の間（または約１：３より大きく、かつ約３：１未満）、例えば、２：１から１：５または約２：１から約１：５の間（または約１：５より大きく、かつ約２；１未満、例えば、５：１、４．５：１、４：１、３．５：１、３：１、２．５：１、２：１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９：１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：４．５もしくは１：５、または約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．９：１、約１．８：１、約１．７：１、約１．６：１、約１．５：１、約１．４：１、約１．３：１、約１．２：１、約１．１：１、約１：１、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、約１：１．９：１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５もしくは約１：５）である。一部の態様では、許容差は、所望の比率の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％以内であり、これには、これらの範囲間の任意の値が含まれる。

【0673】

特定の実施形態では、細胞の数および／または濃度は、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）発現細胞の数を指す。他の実施形態では、細胞の数および／または濃度は、投与される全ての細胞、Ｔ細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の数または濃度を指す。

【0674】

一部の態様では、用量のサイズは、以前の処置、例えば化学療法、への対象の応答、対象における疾患負荷、例えば、腫瘍量、容積、サイズもしくは度合い、転移の程度もしくはタイプ、ステージ、ならびに／または対象が毒性転帰、例えば、ＣＲＳ、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性、を生じる可能性もしくは発生率、ならびに／または投与される細胞および／もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答などの、１つまたは複数の基準に基づいて決定される。

【0675】

一部の実施形態では、方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞および／もしくはリンパ球除去療法の１もしくは複数の追加の用量を投与することも含み、ならびに／または方法の１つもしくは複数の工程が繰り返される。一部の実施形態では、１または複数の追加の用量は、初回用量と同じである。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の用量は、初回用量と異なり、例えば、初回用量より高い、例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍もしくはそれより高いか、あるいは、初回用量より低い、例えば、高い、例えば、初回用量の２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１または１０分の１もしくはそれ未満である。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の用量の投与は、最初の処置もしくはいずれかの以前の処置への対象の応答、対象における疾患負荷、例えば、腫瘍量、容積、サイズもしくは度合い、転移の程度もしくはタイプ、ステージ、ならびに／または対象が毒性転帰、例えば、ＣＲＳ、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性、を生じる可能性もしくは発生率、ならびに／または投与される細胞および／もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答に基づいて、決定される。

【0676】

一部の実施形態では、細胞の比較的低い用量、例えば、細胞の準最適用量、または治療有効量より低い細胞の用量であって、インビボ刺激（例えば、内因性抗原または外因性薬剤による）時に対象体内に存在する操作された細胞の数のブースト、例えば増加または拡大、をもたらすことができる用量が、投与され得る。そのような実施形態のいずれかでは、細胞の拡大および／または活性化、例えば、細胞の投与後の対象の体内での操作された細胞の拡大が、抗原への曝露によってインビボで生じ得る。一部の実施形態では、インビボ拡大の程度、度合いまたは大きさを、投与される細胞、例えば組換え受容体発現細胞、の拡大、増殖、生存および／または有効性をモジュレートすることができる、例えば、増大させることができる様々な方法によって、さらに増すことができるか、ブーストすることができるか、または増強することができる。

【0677】

細胞が対象（例えば、ヒト）に投与されると、細胞集団の生物活性は、一部の態様では、いくつかの公知方法のいずれかによって測定される。評価するパラメーターは、インビボでの、例えばイメージングによる、またはエクスビボでの、例えばＥＬＩＳＡもしくはフローサイトメトリーによる、抗原への細胞の特異的結合を含む。ある特定の実施形態では、標的細胞を破壊する細胞の能力を、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)、およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載されている細胞傷害性アッセイなどの、当技術分野において公知のいずれか適する方法を使用して測定することができる。ある特定の実施形態では、細胞の生物活性を、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦなどのある特定のサイトカインの発現および／または分泌をアッセイすることによって測定することもできる。一部の態様では、生物活性は、腫瘍負荷または腫瘍量の低下などの臨床転帰を評価することによって測定される。一部の態様では、毒性転帰、細胞の持続性および／もしくは拡大、ならびに／または宿主免疫応答の存在もしくは非存在が評価される。

【0678】

ＶＩ．製造品およびキット
一部の実施形態では、提供される方法を実施する際に有用なシステム、装置およびキットも提供される。一部の実施形態では、ウイルス粒子および／または細胞と適宜、使用説明書とを含有する製造品、例えば、キットまたはデバイスが、提供される。一部の実施形態では、キットは、細胞に形質導入するための方法において、例えば、養子細胞療法のための遺伝子操作された細胞を調製することに合わせて、使用され得る。一部の実施形態では、キットは、生細胞、例えば、形質導入細胞中の生細胞を濃縮するための方法において使用され得る。一部の実施形態では、キットは、細胞を脱ビーズ化するために使用され得る。

【0679】

一部の実施形態では、製造品は、１つまたは複数の容器、典型的には複数の容器と、包装材料と、容器（単数もしくは複数）および／もしくは包装材上のまたはそれ（ら）に付随するラベルまたは添付文書とを含み、該ラベルまたは添付文書は、一般に、細胞の形質導入、例えば、対象からの細胞の形質導入についての説明書を含む。あるいは、説明書は、生細胞の濃縮または細胞の脱ビーズ化についての説明書であり得る。

【0680】

本明細書で提供される製造品は、包装材料を含有する。提供される材料の包装における使用のための包装材料は、当業者に周知である。例えば、米国特許第５，３２３，９０７号、同第５，０５２，５５８号および同第５，０３３，２５２号を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。包装材料の例としては、ブリスターパック、ビン、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、またはビンが挙げられるが、これらに限定されない。製造品は、材料の分注を容易にするための針または他の注射デバイスを含み得る。典型的に、包装材は、それに収容される組成物と非反応性である。

【0681】

一部の実施形態では、ウイルス粒子および細胞は、別々に包装される。一部の実施形態では、各容器は、単一の区画を有し得る。一部の実施形態では、ウイルス粒子を収容する容器は、例えば、開口部を通って区画内への、ユーザーによる細胞の添加、またはその逆に適応できる容器である。ウイルス粒子および／または細胞の封入のための定義空間を有することに適応でき、細胞と会合しているウイルス粒子を含有するインプット組成物を生産するための混合に必要な最終構成要素の添加を可能にする単純なマニピュレーションに適応できる、任意の容器または他の製造品が、企図される。一部の実施形態では、細胞は、細胞組成物およびウイルス粒子を遠心分離機に投入する前にウイルス粒子に添加される。

【0682】

一部の実施形態では、そのような材料は、同じ容器内に別々に包装され、したがって、例えば、構成要素を容器内で混合することまたは併せることができる。一部の態様では、そのような容器の例としては、容易に除去できる膜によって２つの空間が隔てられているような、ウイルス粒子を収容する定義された密閉空間と細胞を収容する別の定義された密閉空間とを有する容器であって、その膜が除去されると構成要素の混合が可能になる容器が挙げられる。構成要素を別々に保つことができる任意の容器または他の製造品が企図される。一部の実施形態では、製造品は、製造品が圧縮されると破裂し、ひいては隔てられた構成要素の混合が可能になる、膜などの区分け部材によって隔てられている隣接区画に、各構成要素を収容することができる。適する実施形態については、例えば、米国特許第３，５３９，７９４号および同第５，１７１，０８１号に記載されている容器を参照されたい。

【0683】

ＶＩＩ．定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される、本分野の全ての用語、表記法ならびに他の技術および科学用語または用語法は、特許請求の範囲の主題が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有することが意図される。一部の場合、通常理解される意味を有する用語は、明確にするためにおよび／または参照を容易にするために本明細書において定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当該技術分野において一般的に理解されている定義との実質的な相違を表すとは解釈すべきでない。

【0684】

本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別に明確に示されない限り、複数の言及を含む。例えば、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」とは、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」を含む。本明細書において説明される態様および変形は、態様および変形「からなること」および／または「から本質的になること」を含むことが理解される。

【0685】

本開示を通じて、特許請求される主題の様々な態様が範囲形式で提示される。範囲形式における説明は、単に便利および簡潔さのためであり、特許請求の範囲の主題の範囲に対する変更不能な限定として解釈すべきでないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、特に開示される全ての可能な下位範囲およびその範囲内の個々の数値を有すると考えるべきである。例えば、ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各間の値、およびその示される範囲内の任意の他の示される値または間の値は、特許請求の範囲の主題の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、特許請求の範囲の主題の範囲内に包含され、示される範囲内の任意の特に除外される限定を受ける。示される範囲が限定のうちの１つまたは両方を含む場合、また、それらの含まれる限定のいずれかまたは両方を除外する範囲は、特許請求の範囲の主題に含まれる。これは範囲の広さに関係なく適用される。

【0686】

用語「約」とは、本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書中の「約」を伴う値またはパラメーターについての言及は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とする実施形態を含み（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。

【0687】

用語「ベクター」とは、本明細書において、連結された別の核酸を増殖することが可能な核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、およびそれが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。ベクターの中には、レトロウイルス、例えば、ガンマレトロウイルスおよびレンチウイルスのベクターなどのウイルスベクター粒子が含まれる。

【0688】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これは、一次形質転換細胞および継代数にかかわらずそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含量において親細胞に対して完全に同一ではない場合もあり、突然変異を含有する場合もある。元の形質転換細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同一の機能または生物活性を有する突然変異体子孫も本明細書で含まれる。

【0689】

本明細書で使用される場合、組成物は、細胞を含む、２つまたはそれより多くの産物、物質または化合物の任意の混合物を指す。それは、溶液、分散液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組合せであり得る。

【0690】

本明細書で使用される場合、１つまたは複数の特定の細胞型または細胞集団に言及するときの「濃縮すること」は、細胞型または集団の数またはパーセンテージを、例えば、組成物中の細胞の総数もしくは組成物の体積と比較して、または他の細胞型と比べて、例えば、集団もしくは細胞によって発現されるマーカーに基づくポジティブ選択によって、または枯渇される細胞集団もしくは細胞上に存在しないマーカーに基づくネガティブ選択によって、増加させることを指す。この用語は、組成物からの他の細胞、細胞型、または集団の完全な除去を必要とせず、そのように濃縮された細胞が、濃縮組成物中１００％で存在することも、さらにはほぼ１００％で存在することも必要としない。

【0691】

本明細書で使用する場合、細胞または細胞の集団が、特定のマーカーについて「陽性」であるという記載は、特定のマーカー、通常、表面マーカーの細胞上または細胞中での検出可能な存在を指す。表面マーカーについて言及する場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えばマーカーに特異的に結合する抗体により染色し、前記抗体を検出することによって検出される表面発現の存在を指し、ここで、染色は、他は同一の条件下においてアイソタイプ適合対照について同じ手順を行って検出される染色を実質的に超えるレベルにおいて、かつ／またはそのマーカーについて陽性であることが公知の細胞についてのレベルと実質的に同様のレベルにおいて、かつ／またはそのマーカーについて陰性であることが公知の細胞についてのレベルよりも実質的に高いレベルにおいて、フローサイトメトリーによって検出可能である。

【0692】

本明細書で使用される場合、細胞または細胞集団が特定のマーカーに対して「陰性」であるという記述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの、細胞上または細胞内の実質的な検出可能な存在がないことを指す。表面マーカーに関して、該用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、前記抗体を検出することによって検出されるような表面発現がないことを指し、他は同一の条件下のアイソタイプ適合対照を用いて同じ手順を行って検出される染色を実質的に上回るレベル、および／またはマーカーに対して陽性であることが公知の細胞より実質的に低いレベル、および／またはマーカーに対して陰性であることが公知の細胞と比較して実質的に同様のレベルでは、染色はフローサイトメトリーによって検出されない。

【0693】

用語「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドが遺伝子などの核酸分子のコード配列に基づいて生産されるプロセスを指す。プロセスは、転写、転写後制御、転写後改変、翻訳、翻訳後制御、翻訳後改変、またはこれらの任意の組合せを含み得る。

【0694】

本明細書で使用される場合、「逆」または「向流」遠心分離は、遠心加速下で流体（例えば、支持培地）中の粒子の沈降速度を支持培地の流れによって相殺する技術である。

【0695】

本明細書で使用される場合、「連続」流遠心分離は、「デッドエンド」または「回分式」遠心分離とは対照的に、ローターの頻繁な停止および開始も、遠心分離管の頻繁な濾過およびデカントも必要とすることなく、大きな体積の材料を遠心分離することができる技術であって、高い遠心力を含む技術を指す。連続流システムは、連続流ベースで機能し得る。デッドエンド遠心分離の一例は、スイングバケットローター遠心分離である。

【0696】

本明細書で使用される場合、対照は、試験パラメーターで処理されないことを除いて試験試料と実質的に同一である試料を指し、または対照が血漿試料である場合、対照は、目的の状態に罹患していない正常なボランティアからのものであることがある。対照は、内部対照であることもある。

【0697】

ＶＩＩＩ．例示的な実施形態
本明細書で提供される実施形態の中には以下がある：

【0698】

１．遺伝子操作されたＴ細胞の組成物を生産するための方法であって、
（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産すること；
（ｂ）ウイルスベクター粒子を円錐形の流体エンクロージャーに投入することによって、細胞組成物とウイルスベクター粒子とを含むインプット組成物を生成すること；ならびに
（ｃ）第２の遠心力および第２の流量をインプット組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路でウイルスベクター粒子を再循環させ、それによって、遺伝子操作されたＴ細胞を生成すること
を含む、方法。

【0699】

２．ウイルスベクター粒子の投入が、（ａ）における適用の少なくとも一部分の間に実行される、および／または（ｃ）における適用の少なくとも一部分の間に実行される、実施形態１に記載の方法。

【0700】

３．遺伝子操作されたＴ細胞の組成物を生産するための方法であって、
（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、（ｉ）ウイルスベクター粒子と（ｉｉ）Ｔ細胞を含む細胞組成物とを含むインプット組成物に遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産すること；ならびに
（ｂ）第２の遠心力および第２の流量をインプット組成物に円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路でウイルスベクター粒子を再循環させ、それによって、遺伝子操作されたＴ細胞を生成すること
を含む、方法。

【0701】

４．細胞組成物およびウイルスベクター粒子を円錐形の流体エンクロージャーに投入することによってインプット組成物を生成することをさらに含み、細胞組成物の投入が、ウイルスベクター粒子の投入前、投入中、および／または投入後である、実施形態３に記載の方法。

【0702】

５．細胞組成物の投入および／またはウイルスベクター粒子の投入が、（ａ）における適用の前および／または間に実施される、実施形態４に記載の方法。

【0703】

６．遠心分離機システムが、連続向流遠心分離機システムである、実施形態１～５のいずれかに記載の方法。

【0704】

７．第３の遠心力および第３の流量を、遺伝子操作されたＴ細胞に、遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、遺伝子操作されたＴ細胞を含むアウトプット組成物を生産することをさらに含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。

【0705】

８．アウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きく、適宜、少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、または少なくとも約２５％大きい、実施形態７に記載の方法。

【0706】

９．アウトプット組成物中のＴ細胞の少なくとももしくは少なくとも約５％、少なくとももしくは少なくとも約１０％、少なくとももしくは少なくとも約１５％、少なくとももしくは少なくとも約２０％、少なくとももしくは少なくとも約２５％、または少なくとももしくは少なくとも約３０％が、ウイルスベクター粒子で形質導入されている、実施形態７または実施形態８に記載の方法。

【0707】

１０．（ｉ）第１の遠心力が、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第１の流量が、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間であり、適宜、第１の遠心力および第１の流量が、細胞組成物またはインプット組成物に、約１５秒間、約３０秒間、約４５秒間、または約６０秒間適用される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。

【0708】

１１．（ｉ）第２の遠心力が、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量が、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。

【0709】

１２．第１の遠心力の第１の流量に対する比率が、約２００から約４００の間である、実施形態１１のいずれか１つに記載の方法。

【0710】

１３．第１の遠心力の第１の流量に対する比率が、約３００である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。

【0711】

１４．第１の遠心力が、約３，０００Ｇであり、第１の流量が、約１０ｍＬ／分である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。

【0712】

１５．第２の遠心力の第２の流量に対する比率が、約２０から約１００の間、約２５から約８５の間、または約３０から約６５の間である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。

【0713】

１６．第２の遠心力の第２の流量に対する比率が、約３５である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0714】

１７．第２の遠心力が、約１，０００Ｇであり、第２の流量が、約２８．５ｍＬ／分である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0715】

１８．第２の遠心力の第２の流量に対する比率が、約６２．５である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0716】

１９．第２の遠心力および第２の流量が、インプット組成物に、少なくとも約１５分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約６０分間、少なくとも約７５分間、または少なくとも約９０分間適用される、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。

【0717】

２０．（ｉ）第３の遠心力が、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第３の流量が、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間である、実施形態７～１９のいずれか１つに記載の方法。

【0718】

２１．第３の遠心力の第３の流量に対する比率が、約１００から約１５０の間であり、適宜、第３の遠心力の第３の流量に対する比率が、約１２５である、実施形態７～２０のいずれか１つに記載の方法。

【0719】

２２．第３の遠心力が、約２，５００Ｇであり、第３の流量が、約２０ｍＬ／分である、実施形態７～２１のいずれか１つに記載の方法。

【0720】

２３．第３の遠心力および第３の流量を適用する前に、遺伝子操作されたＴ細胞を１つまたは複数の洗浄工程に付すことを含み、適宜、１つまたは複数の洗浄工程が、培地交換を含む、実施形態７～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0721】

２４．方法が、細胞組成物のＴ細胞を（ａ）における適用の前に刺激条件下でインキュベートすることを含む、および／または細胞組成物のＴ細胞が、（ａ）における適用の前に刺激条件下でインキュベートされる、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。

【0722】

２５．刺激条件が、ＴＣＲ複合体の１つまたは複数の構成要素の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化可能である刺激試薬の存在を含む、実施形態２４に記載の方法。

【0723】

２６．刺激試薬が、（ｉ）ＴＣＲ複合体のメンバーに特異的に結合する、適宜、ＣＤ３に特異的に結合する、一次薬剤；および（ｉｉ）Ｔ細胞共刺激分子に特異的に結合する二次薬剤を含み、適宜、共刺激分子が、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０またはＩＣＯＳから選択される、実施形態２５に記載の方法。

【0724】

２７．一次および二次薬剤の少なくとも一方が、抗体またはその抗原結合性断片を含む、実施形態２６に記載の方法。

【0725】

２８．一次薬剤が、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、二次薬剤が、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片である、実施形態２６または実施形態２７に記載の方法。

【0726】

２９．一次薬剤および二次薬剤が、各々、固体支持体の表面に存在するか、または付着しており、適宜、固体支持体が、ビーズであるか、またはそれを含み、さらに適宜、固体支持体が、表面に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体が付着している常磁性ビーズである、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載の方法。

【0727】

３０．一次薬剤および二次薬剤が、複数のストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン突然変異タンパク質分子を含むオリゴマー粒子試薬の表面に可逆的に結合している、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載の方法。

【0728】

３１．ストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン突然変異タンパク質分子が、ビオチン、アビジン、ビオチンアナログもしくはビオチン突然変異タンパク質、アビジンアナログもしくはアビジン突然変異タンパク質および／またはその生物活性断片に結合するか、またはそれに結合可能である、実施形態３０に記載の方法。

【0729】

３２．一次薬剤が、抗ＣＤ３ Ｆａｂを含み、二次薬剤が、抗ＣＤ２８ Ｆａｂを含む、実施形態２６～３０のいずれか１つに記載の方法。

【0730】

３３．刺激条件が、１つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む、実施形態２４～３２のいずれか１つに記載の方法。

【0731】

３４．刺激条件が、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５のうちの１または複数の存在を含む、実施形態２４～３３のいずれか１つに記載の方法。

【0732】

３５．方法が、アウトプット組成物を収集することを含む、および／またはアウトプット組成物が、収集される、実施形態７～３４のいずれか１つに記載の方法。

【0733】

３６．方法が、収集されたアウトプット組成物の遺伝子操作されたＴ細胞をインキュベートすることを含む、および／または収集されたアウトプット組成物の遺伝子操作されたＴ細胞が、インキュベートされる、実施形態３５に記載の方法。

【0734】

３７．収集されたアウトプット組成物の遺伝子操作されたＴ細胞が、収集の直後に少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、または少なくとも約２０日間インキュベートされる、実施形態３５または実施形態３６に記載の方法。

【0735】

３８．収集の約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、または約１０日後の収集されたアウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい、実施形態３５～３７のいずれか１つに記載の方法。

【0736】

３９．収集の約１日後の収集されたアウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい、実施形態３５～３８のいずれか１つに記載の方法。

【0737】

４０．収集の約５日後の収集されたアウトプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きい、実施形態３５～３９のいずれか１つに記載の方法。

【0738】

４１．方法が、収集されたアウトプット組成物を凍結保存することを含む、および／または収集されたアウトプット組成物が、凍結保存されることによって、凍結保存組成物が生成される、実施形態３５～４０のいずれか１つに記載の方法。

【0739】

４２．凍結保存組成物が解凍されて解凍組成物が生産され、解凍組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、インプット組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きく、適宜、少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、少なくとも約２５％大きいか、または少なくとも約３０％大きい、実施形態４１に記載の方法。

【0740】

４３．インプット組成物が、６マイクロメートルより大きいもしくは約６マイクロメートルより大きい、６マイクロメートルより大きいもしくは約６マイクロメートルより大きい、７マイクロメートルより大きいもしくは約７マイクロメートルより大きい、８マイクロメートルより大きいもしくは約８マイクロメートルより大きい、９マイクロメートルより大きいもしくは約９マイクロメートルより大きい、１０マイクロメートルより大きいもしくは約１０マイクロメートルより大きい、または１１マイクロメートルより大きいもしくは約１１マイクロメートルより大きい平均直径を有するＴ細胞を含む、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法。

【0741】

４４．インプット組成物が、総数約１×１０^６のＴ細胞から総数約２×１０^９のＴ細胞の間のＴ細胞を含む、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の方法。

【0742】

４５．インプット組成物が、総数少なくとも約１×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約２×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約３×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約４×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約５×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約６×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約７×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約８×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約７×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約８×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約９×１０^８のＴ細胞、総数少なくとも約１×１０^９のＴ細胞、総数少なくとも約１．２５×１０^９のＴ細胞、総数少なくとも約１．５０×１０^９のＴ細胞、または総数少なくとも約１．７５×１０^９のＴ細胞を含む、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の方法。

【0743】

４６．インプット組成物の体積が、約５ｍｌから約２０，０００ｍｌの間、約１０ｍＬから約２，０００ｍＬの間、約１５ｍＬから約１，０００ｍＬの間、約２０ｍＬから約５００ｍＬの間、約２５ｍＬから約１００ｍＬの間、または約３０ｍＬから約６０ｍＬの間である、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の方法。

【0744】

４７．インプット組成物の体積が、約３０ｍＬから約６０ｍＬの間である、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の方法。

【0745】

４８．アウトプット組成物の体積が、約２．５ｍＬから約６０ｍＬの間、約５ｍＬから約４０ｍＬの間、または約１０ｍＬから約２０ｍＬの間である、実施形態７～４７のいずれか１つに記載の方法。

【0746】

４９．アウトプット組成物の体積が、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬ、約４０ｍＬ、約４５ｍＬ、約５０ｍＬ、約５５ｍＬ、または約６０ｍＬである、実施形態７～４８のいずれか１つに記載の方法。

【0747】

５０．細胞組成物を生細胞について濃縮する方法であって、
（ａ）第１の遠心力および第１の流量を、Ｔ細胞を含む細胞組成物に遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、細胞の流動床を生産することであって、細胞組成物が、生存可能および生存不能なＴ細胞を含み、（ｉ）第１の遠心力が、約２，０００Ｇから約４，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第１の流量が、約５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間である、生産すること；ならびに
（ｂ）第２の遠心力および第２の流量を細胞組成物に適用し、第２の遠心力および第２の流量が遠心分離機システムの流路でインプット組成物の細胞を再循環させ、それによって、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより高い生存可能なＴ細胞のパーセンテージを有する濃縮組成物を生成することであって、（ｉ）第２の遠心力が、約５００Ｇから約１，５００Ｇの間であり、（ｉｉ）第２の流量が、約２５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間である、生成すること
を含む、方法。

【0748】

５１．細胞組成物を遠心分離機システムに投入することを含み、投入することが、（ａ）における適用の少なくとも一部分の前および／または間に行われる、実施形態５０に記載の方法。

【0749】

５２．遠心分離機システムが、連続向流遠心分離機システムである、実施形態５０または実施形態５１に記載の方法。

【0750】

５３．（ａ）における適用の前に、方法が、細胞組成物のＴ細胞をウイルスベクター粒子と接触させることによって、遺伝子操作されたＴ細胞を生産することを含む、および／または細胞組成物のＴ細胞が、ウイルスベクター粒子と接触したことによって、遺伝子操作されたＴ細胞が生産済みである、実施形態５０～５２のいずれか１つに記載の方法。

【0751】

５４．濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、少なくとも約３０％大きいか、少なくとも約４０％大きいか、少なくとも約５０％大きいか、または少なくとも約６０％大きい、実施形態５０～５３のいずれか１つに記載の方法。

【0752】

５５．（ｃ）第３の遠心力および第３の流量を濃縮組成物に遠心分離機システムの円錐形の流体エンクロージャーにおいて適用して、濃縮組成物を収集することを含み、（ｉ）第３の遠心力が、約２，０００Ｇから約３，０００Ｇの間であり、（ｉｉ）第３の流量が、約１５ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間である、実施形態５０～５４のいずれか１つに記載の方法。

【0753】

５６．第３の遠心力および第３の流量を適用する前に、濃縮組成物を１つまたは複数の洗浄工程に付すことを含み、適宜、１つまたは複数の洗浄工程が、培地交換を含む、実施形態５５に記載の方法。

【0754】

５７．１つまたは複数の洗浄工程が、第２の遠心力および第２の流量で実行される、実施形態２３～４９および５６のいずれか１つに記載の方法。

【0755】

５８．細胞組成物が、活性化Ｔ細胞を含む、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の方法。

【0756】

５９．方法が、収集された濃縮組成物を凍結保存することを含む、および／または収集された濃縮組成物が、凍結保存されることによって、凍結保存濃縮組成物が生成される、実施形態５０～５８のいずれか１つに記載の方法。

【0757】

６０．凍結保存濃縮組成物が解凍されて解凍された濃縮組成物が生産され、解凍された濃縮組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージが、細胞組成物中の生存可能なＴ細胞のパーセンテージより大きく、適宜、少なくとも約５％大きいか、少なくとも約１０％大きいか、少なくとも約１５％大きいか、少なくとも約２０％大きいか、少なくとも約２５％大きいか、または少なくとも約３０％大きい、請実施形態５９に記載の方法。

【0758】

６１．方法の１つまたは複数の工程が自動化され、適宜、方法の１つまたは複数の工程が、遠心分離機システムまたはそのコンポーネントによって自動化される、実施形態１～６０のいずれか１つに記載の方法。

【0759】

６２．ウイルスベクター粒子が、組換え分子をコードする異種核酸を含む、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の方法。

【0760】

６３．組換え分子が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、抗原受容体（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲ）、またはそれらの組合せである、実施形態６２に記載の方法。

【0761】

６４．組換え分子が、抗原受容体である、実施形態６２または実施形態６３に記載の方法。

【0762】

６５．抗原受容体が、トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、実施形態６４に記載の方法。

【0763】

６６．抗原受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態６５に記載の方法。

【0764】

６７．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインと、ＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、実施形態６６に記載の方法。

【0765】

６８．細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、実施形態６７に記載の方法。

【0766】

６９．ＣＡＲが、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインをさらに含む、実施形態６７または実施形態６８に記載の方法。

【0767】

７０．膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通部分を含む、実施形態６９に記載の方法。

【0768】

７１．細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態６７～７０のいずれか１つに記載の方法。

【0769】

７２．Ｔ細胞共刺激分子が、ＣＤ２８および４－１ＢＢからなる群から選択される、実施形態７１に記載の方法。

【0770】

７３．ＣＡＲが、組換え発現される、実施形態６６～７２のいずれか１つに記載の方法。

【0771】

７４．ＣＡＲが、ベクター、適宜、γ－レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターから発現される、実施形態６６～７３のいずれか１つに記載の方法。

【0772】

７５．ＣＡＲが、レンチウイルスベクターから発現される、実施形態６６～７４のいずれか１つに記載の方法。

【0773】

７６．抗原受容体が、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する、実施形態６４～７５のいずれか１つに記載の方法。

【0774】

７７．疾患または状態が、がん、自己免疫疾患もしくは障害、および／または感染症である、実施形態７６に記載の方法。

【0775】

７８．疾患または状態が、がんである、実施形態７６または実施形態７７に記載の方法。

【0776】

７９．Ｔ細胞が、適宜ヒト対象からの、初代Ｔ細胞である、実施形態１～７８のいずれか１つに記載の方法。

【0777】

８０．実施形態１～７９のいずれか１つに記載の方法によって生産される遺伝子操作されたＴ細胞を含む、組成物。

【0778】

８１．約１×１０^６個のＣＡＲ発現Ｔ細胞から約２．０×１０^９個のＣＡＲ発現Ｔ細胞の間のＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む、実施形態８０に記載の組成物。

【0779】

８２．薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態８０または８１に記載の組成物。

【0780】

８３．凍結保護剤をさらに含む、実施形態８０または実施形態８１に記載の組成物。

【0781】

８４．疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、実施形態８０～８２のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。

【0782】

８５．遺伝子操作されたＴ細胞が、疾患または障害に関連する抗原に特異的に結合する抗原受容体を発現する、実施形態８４に記載の方法。

【0783】

ＩＸ．実施例
以下の実施例は、説明的な目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。

【実施例】

【0784】

［実施例１］
連続向流遠心分離による形質導入中の生細胞の濃縮
Ａ．形質導入中の生細胞の濃縮
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の別々の組成物を、４名のヒトドナーからの白血球アフェレーシス試料から単離したＰＢＭＣから免疫親和性ベースの濃縮によって選択した。選択した細胞組成物を凍結保存し、その後、解凍し、生存可能なＣＤ４＋細胞の生存可能なＣＤ８＋細胞に対する比率１：１で培養した。次いで、複合ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞組成物を、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を含有する培地中で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｆａｂがコンジュゲートしているオリゴマーストレプトアビジン突然変異タンパク質試薬（例えば、ＷＯ２０１８１９７９４９およびPoltorak et al. (2020) Sci Rep 10, 17832を参照されたい）と共にインキュベートして、１８～３０時間、Ｔ細胞を活性化した。

【0785】

活性化後、Ｔ細胞組成物を、連続向流遠心分離システム（ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）において、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスベクター粒子の存在下で遠心分離の連続向流水簸（「ＣＣＥ」）ベースの方法に付して、ベクターでＴ細胞に形質導入した（「インプット組成物」）。ＣＡＲは、マウス抗体に由来する抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３に由来する可変領域、免疫グロブリン由来のスペーサー、ＣＤ２８に由来する膜貫通ドメイン、４－１ＢＢに由来する共刺激領域、およびＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン）を含有した。ウイルスベクターにおける発現コンストラクトは、切断型受容体をコードする配列をさらに含有しており、この配列は、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列によってＣＡＲ配列から分離されおり、ＣＡＲ発現のサロゲートマーカーとして機能した。

【0786】

初めに、Ｔ細胞組成物を、２００ｍＬの総培地体積中１～２００万細胞／ｍＬを含有するように生成し、システムの円錐形のエンクロージャー部分に、円錐形のエンクロージャー部分の長さに沿って伸びている狭いカニューレ経由で投入した。投入するための、Ｔ細胞組成物は、円錐形のエンクロージャー部分の広端においてカニューレに入り、円錐形のエンクロージャー部分の尖端においてカニューレから出た。Ｔ細胞組成物を、最初に、３，０００：１０の遠心力の流量に対する比（３００のＧ／ＦＲ）をもたらす３，０００×ｇの遠心力および１０ｍＬ／分の流量に付して、細胞の流動床を形成した。生存不能な細胞は、円錐形のエンクロージャー部分の尖端の外縁の方に凝集する傾向があった。流動細胞床の確立後、レンチウイルスベクター粒子を含有する１０ｍＬ溶液を、遠心力および流量を維持しながら円錐形のエンクロージャー部分に連続向流遠心分離機システムのカニューレ経由で投入して、細胞およびベクター粒子の流動床を確立した。

【0787】

細胞およびベクター粒子の流動床を確立した後、６２５×ｇの遠心力でだが流量を１０ｍＬ／分で維持し、その結果、６２．５のＧ／ＦＲをもたらした。これらの条件は、より大きい、粘着性の生存不能なＴ細胞凝集物を円錐形のエンクロージャー部分の円錐の尖端においてペレットとして凝集し続けさせ（「廃棄物」画分）、その一方で、流動Ｔ細胞（生存可能なまたは生存不能などちらかの）およびベクター粒子を強制的に円錐形のエンクロージャー部分の中心に向かわせ、円錐形のエンクロージャー部分の広端から出（水簸）させ、「アウトプット」画分として流路を通って収集チャンバーに流入させた。細胞組成物を方向転換し、最終形質導入細胞「産物」画分として収集するまで、合計３０分間、アウトプット画分を、連続向流遠心分離機システムの円錐形のエンクロージャー部分を通って再循環させた。

【0788】

再循環後、アウトプット画分を方向転換し、１２５のＧ／ＦＲをもたらす２，５００×ｇの遠心力および２０ｍＬ／分の流量で最終生細胞「産物」画分として収集した。形質導入「産物」画分をカニューレ経由で収集し、収集細胞は、円錐形のエンクロージャー部分の尖端においてカニューレに入り、円錐形のエンクロージャー部分の広端においてカニューレから出た。形質導入「産物」画分を培地に０．７５×１０^６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させ、２４時間、摂氏３７度でインキュベートしてウイルスベクターを統合させた。多様な画分中の生細胞および生存不能な細胞の数を蛍光顕微鏡法ベースの細胞計数機器によって決定した。

【0789】

３回の異なるランからの結果を図１Ａおよび１Ｂに示す。形質導入の例示的な遠心分離方法は、生存不能な細胞の平均およそ５０％を除去し（図１Ａ、下のパネル）、生細胞収率を平均およそ２０％増加させた（図１Ｂ）。これらの結果は、形質導入のＣＣＥベースの方法が試料中の生細胞を濃縮することができ、そのパーセンテージを増加させることができることを実証する。

【0790】

Ｂ．形質導入効率および形質導入後の細胞生存率
節Ａで説明したように、初代ヒトＴ細胞組成物をヒト成人ドナーからの白血球アフェレーシス試料から生成し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターの存在下で遠心分離のＣＣＥベースの方法に付してベクターでＴ細胞に形質導入した（「インプット」組成物）。遠心分離された細胞組成物の形質導入効率および細胞生存率を、形質導入の直後に、およびその後の複数の時点で評価した。

【0791】

対照として、スピノキュレーションを用いるかそれとも用いない、規模を縮小した方法によって、レンチウイルスベクターでＴ細胞に形質導入した。スピノキュレーション方法については、Ｔ細胞組成物を、２×１０^７生細胞／ｍＬを含有するように生成し、実質的に堅い円筒形の遠心分離チャンバーにおいて３０分間、６９３ｇで遠心分離した。「無回転」対照試料は、同じ条件下で、しかし遠心分離を用いずに、インキュベートした。ベクター力価は、全ての試料について１００万細胞当たり１．１１μＬであった。対照組成物は、ウイルスベクターを統合させるために形質導入後にもインキュベートした。

【0792】

インキュベーション後、形質導入産物画分を収集し、自動化されたデッドエンド遠心分離および緩衝液交換方法によって洗浄した。形質導入効率を、形質導入細胞組成物中のＣＡＲの表面発現を有するＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージに基づいて決定した。形質導入細胞組成物の生存率を、節Ａで説明したように評価した。

【0793】

２名のドナーからの細胞から生産した形質導入細胞組成物について図２Ａに示すように、ＣＣＥベースの方法は、無回転対照方法と比べて改善された形質導入効率をもたらした。ＣＣＥ方法の形質導入効率は、スピノキュレーション方法を用いて達成される形質導入効率より低かった。

【0794】

図２Ｂに示すように、Ｔ細胞の生存率は、６５パーセントから、ベクターを用いる連続向流遠心分離の直後に８１パーセントへ増加した（「インプット」対「０ｈ」）。形質導入後２４時間（「２４ｈ」）および５日（「５日目」）両方の時点で、形質導入Ｔ細胞は、それらの形質導入前生存率と比較して細胞生存率の増加を示し続けた。一方、細胞生存率は、対照試料では形質導入前生存率レベルから有意に変化しなかった。

【0795】

Ｃ．細胞生存率に対する形質導入体積の効果
関連実験では、連続向流遠心分離機システムにおいてＣＣＥ方法による同じ方法によって３０ｍＬまたは６０ｍＬのどちらかの総体積で１００万細胞当たり１．１１μＬのベクターを用いてＴ細胞に形質導入した。対照として、Ｔ細胞を規模縮小スピノキュレーション方法に付した。ＣＣＥ方法に付した３０ｍＬおよび６０ｍＬ両方の細胞およびベクター組成物の生存率は、同程度に増加した（図３）。これは、組成物の体積が、形質導入細胞の生存率に対して有意な影響を及ぼさなかったことを示す。

【0796】

結果は、連続向流遠心分離機システムを使用して、同時に、Ｔ細胞組成物にウイルスベクター粒子で形質導入しかつ組成物を生存可能なＴ細胞について濃縮することができるという観察結果と一致する。
［実施例２］

【0797】

代替自動化遠心分離に対する連続向流遠心分離による形質導入生細胞の濃縮
Ｔ細胞組成物を１１名のヒトドナーから実施例１で説明したように生成し、活性化した。活性化後、細胞を組換えＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を含有する培地に再懸濁させ、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いてスピノキュレーションによって６９３ｇで３０分間、形質導入した。ＣＡＲは、マウス抗体に由来する抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３に由来する可変領域、免疫グロブリン由来のスペーサー、ＣＤ２８に由来する膜貫通ドメイン、４－１ＢＢに由来する共刺激領域、およびＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン）を含有した。ウイルスベクターにおける発現コンストラクトは、ＣＡＲ発現のサロゲートマーカーとして機能する、切断型受容体をコードする配列をさらに含有しており、この配列は、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列によってＣＡＲ配列から分離されていた。

【0798】

スピノキュレートした細胞を洗浄し、培地に再懸濁させ、活性化の開始後９６時間まで、摂氏３７度で培養した。培養後、形質導入Ｔ細胞組成物（「インプット組成物」）を、連続向流遠心分離機システム（ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）の円錐形のエンクロージャー部分に投入し、３０秒間、３，０００ｇの遠心力および１０ｍＬ／分の流量に付して、流動細胞床を確立した。次いで、形質導入細胞を２，５００ｇの遠心力および４０ｍＬ／分の流量（６２．５のＧ／ＦＲ）または７５ｍＬ／分の流量（３３．３のＧ／ＦＲ）のどちらかに付した。次いで、これらの条件下で、「洗浄」工程の際に培地を交換して１．２５％ヒト血清アルブミンを含有するＰｌａｓｍａＬｙｔｅ ｐＨ７．４にし、廃棄物画分の収集および分析のための生存不能な細胞の水簸を可能にした。

【0799】

対照として、同じドナーに由来し、同じ方法によって生成した、形質導入Ｔ細胞組成物を、自動化されたデッドエンド遠心分離および緩衝液交換の代替方法（「代替方法」）に付した。

【0800】

連続向流ベースの方法または代替方法によって生成したインプット組成物、洗浄済み産物画分および廃棄物画分の細胞生存率を、前に説明したように評価した。図４Ａ（各線はドナーを表す）に示すように、インプット組成物の連続向流遠心分離は、洗浄済み産物画分において改善された細胞生存率を一貫してもたらし、これは、遠心分離および緩衝液交換の代替方法に付したインプット組成物では観察されなかった。観察結果は、試験した両方のＧ／ＦＲについて同様であった。
［実施例３］

【0801】

凍結保存産物における改善された生存率の維持
実施例２からの洗浄済み産物（ＷＰ）画分を、その後、２５％緩衝液および７５％ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ－１０培地に再懸濁させて、製剤化薬物製品（ＦＤＰ）を生産した。ＦＤＰの生存率を、おおむね説明したように評価した。洗浄済み産物画分において観察された改善された細胞生存率は、ＦＤＰにおいて維持されることが見出された。次いで、ＦＤＰを速度制御フリーザーにおいて凍結して凍結保存薬物製品（ＣＤＰ）を生産した。ＣＤＰを液体窒素中で少なくとも３日間、保管した後、室温での解凍のために取り出した。解凍ＣＤＰの生存率は、洗浄前産物画分（「回収産物」；ＨＰ）、ＷＰ画分およびＦＤＰの生存率と比較して低下することが観察された（図４Ｂ）。

【0802】

ＦＤＰと解凍ＣＤＰ間の生存率の喪失がドナー依存性であるかどうかを決定するために、各ドナーについてのＷＰ画分、ＦＤＰ、および解凍ＣＤＰの細胞生存率を、同じドナーの洗浄前産物画分における細胞の初期生存率に対して正規化した（図４Ｃ）。ドナー特異的効果は、観察されなかった。低い生存率を有するドナー洗浄前産物画分においてＣＣＥベースの遠心分離プロトコールによって生細胞が濃縮されることをさらに確認するために、プロセスの各工程中の細胞の数および位置を、最低生存率を有するドナー洗浄前産物画分において追跡した。洗浄前産物（ＨＰ）画分は、６１％細胞生存率を示したが、洗浄済み産物（ＷＰ）画分は、９２％生存率を示した（図４Ｄ）。これは、生細胞および生存不能な細胞が、洗浄前産物画分生存率にかかわらず、ＣＣＥベースの遠心分離中に分離され、異なる画分へ分配されることを示す。

【0803】

ＣＣＥベースの遠心分離プロトコールを、解凍ＣＤＰにおいて観察される生存率向上の喪失を低減させるように改変した（「改変されたＣＣＥベースの方法」）。具体的には、遠心力および流量を、細胞に対する遠心応力を低下させるように下方調整した。図４Ｅ（低い生存率（＜７０％）を有するインプット画分が菱形およびアスタリスクによって指定されている）に示すように、遠心力を２５００ｇから１０００ｇに低下させることおよび２８．５ｍＬ／分の流量を実行すること（３５のＧ／ＦＲ）によって、解凍ＣＤＰにおける生存率向上効果が保たれた。改変されたＣＣＥベースの方法は、代替方法と比較して細胞数の匹敵する収率を達成することも見出された（図４Ｆ）。理論に捉われようとは思わないが、これらの観察結果は、より低い遠心力および流量は解凍ＣＤＰにおいて観察される細胞生存率の喪失を低減させることができるという発見と一致する。

【0804】

関連実験では、ドナー試料からの細胞の低（２３０～４００×１０^６細胞）、中（４００～７５０×１０^６細胞）および高（＞７５０×１０^６細胞）投入量を、実施例２で説明した改変されたＣＣＥベースの方法（「Ｍｏｄ ＣＣＥ」）または代替方法（「Ａｌｔ」）のどちらかに付した。ドナー試料をそれぞれの改変されたＣＣＥベースの方法と代替方法とで合致させた。細胞投入量が、改変されたＣＣＥベースの方法から生産されたＣＤＰの生存率に影響を及ぼすことは、観察されなかった。加えて、改変されたＣＣＥベースの方法によって生産されたＣＤＰは、細胞投入量に関係なく、代替方法と比較して同様のまたはより高い生存率を示した（図４Ｇ）。

【0805】

モデル化を実施して、洗浄前産物（ＨＰ）画分において様々な生存率を示すドナー試料の中での改変されたＣＣＥベースの方法または代替方法のどちらかから生産されるＣＤＰの細胞生存率の改善を予測した。図４Ｈ、４Ｉおよび４Ｊに示すように、改変されたＣＣＥベースの方法が、代替方法と比較して、特に、より低い生存率を示す洗浄前産物画分（「ＨＰ」）を有するドナーの中で、生存率向上の増大をもたらすことが、このモデル化によって予測された。したがって、生存率向上を、匹敵する最終製品収率を維持しながら達成することができる。潜在的な不純物（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、細胞残屑、および製造中に使用した試薬）を除去するＣＣＥベースの方法の能力も、流入および流出培地のモデル化によって、ならびに流入培地の実際の測定によって評価した。特に、図４Ｋは、流入および流出培地中の不純物の予測濃度、ならびに流入培地中の不純物の測定濃度を示す。

【0806】

この結果として、モデル化は、改変されたＣＣＥベースの方法は製品製造が成功を収めるドナーの数を増加させることができることを示す。
［実施例４］

【0807】

拡大培養プロトコールに従う連続向流遠心分離による形質導入生細胞の濃縮
Ｔ細胞を活性化の開始後合計して合計１５日間培養する拡大プロトコールに細胞を付したことを除いて、実施例２で説明したように初代ヒトＴ細胞組成物を生成し、形質導入した。活性化の開始後１５日間、Ｔ細胞組成物をインキュベートすることによって、細胞は、あまり活性化されなくなり得、その結果、それらのサイズが変化し得る。それ故、Ｇ／ＦＲ比率が拡大プロトコールに付した生細胞の濃縮にどのような影響を及ぼすのかを理解するための実験に着手した。

【0808】

拡大培養プロトコールに従って、５０％細胞生存率を示す形質導入Ｔ細胞インプット組成物を、連続向流遠心分離機システム（ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）の円錐形のエンクロージャー部分に投入し、３０秒間、３，０００ｇの遠心力および１０ｍＬ／分の流量に付して、流動細胞床を確立した。次いで、遠心量を２，５００ｇに低下させ、流量を４０ｍＬ／分に増加させ、その結果、６２．５のＧ／ＦＲ比率をもたらした。実施例２の場合と同様に、「洗浄」工程の際に培地を交換して、１．２５％ヒト血清アルブミンを含有するＰｌａｓｍａＬｙｔｅ ｐＨ７．４にし、廃棄物画分の収集および分析のための生存不能な細胞の水簸を可能にした。

【0809】

生細胞および生存不能な細胞の数を、前に説明したように評価した。図５Ａ（左側のパネル）に示すように、遠心力および流量を６２．５のＧ／ＦＲで遠心分離プロセス全体を通して一定に保ったとき、産物画分（洗浄済み産物１）中の生細胞のパーセンテージは、インプット組成物（インプット）中の生細胞のパーセンテージと比較してほとんど変化しなかった。加えて、洗浄済み廃棄物画分（洗浄廃棄物）中には生存不能な細胞がほとんど存在しなかった。

【0810】

追加の生存不能な細胞を水簸するために、第２の洗浄工程を、第１の洗浄中に収集した細胞（洗浄済み産物１）に対して実行した。第２の洗浄工程中、遠心力を２，５００ｇに保ち、流量を７５ｍＬ／分で維持し、その結果、３３．３のＧ／ＦＲ比率をもたらした。３３．３のＧ／ＦＲ比率での第２の洗浄後、有意な数の生存不能な細胞が、洗浄済み廃棄物画分（洗浄廃棄物）中に見出され（図５Ａ；右側のパネル）、産物画分（洗浄済み産物２）中の生細胞のパーセンテージは、インプット組成物中の細胞のパーセンテージと比較し有意に改善された（図５Ｂ）。実施例３に記載した結果と併せて、より低いＧ／ＦＲ比率（例えば、３３．３または３５）は、生細胞についての濃縮を改善することが観察される。

【0811】

理論に捉われようとは思わないが、拡大プロトコール後の細胞サイズの変化は遠心力、流量、およびこれらの比率の相違の一因となり得、それらを拡大された細胞の生存率向上に使用することができる。拡大プロトコール後の細胞のサイズは、図５Ｃ（下のパネル）に示すように洗浄済み産物１の細胞に基づいて決定した。洗浄済み産物１の生細胞（Ｖ）と生存不能な細胞（ＮＶ）の両方が９μｍ未満の平均サイズを有した。比較のために、別の実験における３日の活性化後の細胞のサイズを図５Ｃ（上のパネル）に示す。３日間活性化された細胞は、活性化の開始から１５日後に収集した洗浄済み産物１の細胞よりも平均して大きかった。この発見は、細胞が最初の活性化中にサイズが増加し、その後、培養における拡大中にあまり活性化しなくなり、サイズが減少することと一致する。加えて、３日間活性化された細胞のうちの生存不能な細胞（ＮＶ）は、約９μｍ未満の平均サイズを有した一方で、３日間活性化された細胞のうちの生細胞（Ｖ）の大半は、より大きいサイズ（約１４μｍ）を有した。
［実施例５］

【0812】

連続向流遠心分離によるウイルス形質導入の効率
実施例１の場合と同様に、初代ヒトＴ細胞組成物をヒト成人ドナーからの白血球アフェレーシス試料から生成し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするスベクターの存在下で遠心分離のＣＣＥベースの方法に付してＴ細胞に形質導入した。連続向流遠心分離方法の多様なパラメーターを、次の節で説明するように独立して変えて、形質導入効率を評価した。

【0813】

Ａ．形質導入効率に対する遠心力および流量の効果
遠心力および流量を変えたことを除いて、おおむね実施例１で説明したように、ＣＣＥベースの方法を使用して抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いてＴ細胞組成物に形質導入した。細胞およびベクター粒子の流動床の確立後、遠心力を６２５×ｇまたは１，５００×ｇのどちらかに調整し、流量を１０ｍＬ／分または２４ｍＬ／分のどちらかに調整し、その結果、６２．５または１５０どちらかのＧ／ＦＲ比率をもたらした（表Ｅ１を参照されたい）。

【0814】

【表1】

【0815】

形質導入効率は、ＣＡＲの表面発現を有するＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを決定することによって算出した。図６Ａに示すように、ＣＡＲをコードするクターを用いて表Ｅ１に記載の遠心力および流量でＴ細胞組成物に形質導入した。試験した異なるパラメーターは、ＣＤ３＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の同様のパーセンテージをもたらした。

【0816】

対照として、連続向流遠心分離機システムベースの方法を、実施例１の亜節Ｂで説明した形質導入の規模縮小スピノキュレーション方法と比較した。遠心分離後ベクター統合を実施例１で説明したように進行させ、形質導入効率を評価した。規模縮小スピノキュレーションベースの形質導入の結果を図６Ｂに示す。２つの方法の形質導入効率は、匹敵することが観察され、したがって、ＣＣＥベースの方法は、匹敵する形質導入効率をもたらしたが、より高い細胞生存率をもたらした。

【0817】

さらなる遠心力および流量、具体的には、３００Ｇの遠心力－対－１０ｍＬ／分の流量（３００Ｇ／１０ＦＲ）および３０００Ｇ／３０ＦＲ条件を、再循環について試験した。３００Ｇ／１０ＦＲでの再循環は、表Ｅ１中の試験したパラメーターで達成される形質導入効率に匹敵する形質導入効率をもたらした。図６Ｃに示すように、３０００Ｇ／３０ＦＲでの再循環は、６２５Ｇ／１０ＦＲでの再循環および規模縮小スピノキュレーション対照方法を用いて達成された形質導入効率と比較して低下した形質導入効率をもたらした。

【0818】

１５００Ｇ／１０ＦＲ条件を１分間適用し、続いて３００Ｇ／１０ＦＲ条件を１分間適用する、別の再循環手順を試験した。この手順を３０分インキュベーションにわたって繰り返すことによって、インキュベーション全体を通して円錐形のエンクロージャーにおける流動床のサイズを周期変動させた。図６Ｄに示すように、この周期変動再循環手順は、６２５Ｇ／１０ＦＲでの再循環を用いて達成される形質導入効率に匹敵する形質導入効率をもたらした。

【0819】

Ｂ．形質導入効率に対するベクター力価の効果
おおむね前の節で説明したように、ＣＣＥベースの方法によって１００万細胞当たり１．１１または３．３３μＬのどちらかのベクターでＴ細胞組成物に形質導入した。図７Ａに示すように、１００万細胞当たり３．３３μＬのベクターを使用したとき、ＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセントが増加した。

【0820】

６２５Ｇ／１０ＦＲの再循環条件下で１００万細胞当たり別のベクターロットからのベクター６μＬを形質導入に使用するさらなる実験を実施した。５名のドナーからの形質導入Ｔ細胞について図７Ｂに示すように、このベクター力価は、６９３Ｇでの大規模スピノキュレーション対照方法に匹敵する形質導入効率をもたらした。これは、大規模スピノキュレーション対照方法に匹敵する効率を最適な力価で達成することができたことを示す。

【0821】

Ｃ．形質導入効率に対するインキュベーション体積の効果
ベクター力価を一定に保ちつつ形質導入体積を変えたことを除いて、おおむね前の節で説明したように、連続向流遠心分離機システム（ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）においてＴ細胞に形質導入した。Ｔ細胞を１００万細胞当たり１．１１μＬのベクターと共に３０ｍＬまたは６０ｍＬの総体積で遠心分離した（表Ｅ２を参照されたい）。図８Ａに示し、図８Ｂにおいて定量化するように、結果は、形質導入体積がＣＣＥベースの方法の形質導入効率に対して有意な影響を及ぼさないことを示した。同様の結果が、２５ｍＬ、３５ｍＬおよび６５ｍＬの形質導入体積を試験した追加のドナーから生産した形質導入Ｔ細胞について得られた。

【0822】

【表2】

【0823】

Ｄ．形質導入効率に対するＴ細胞数の効果
別の実験では、形質導入体積およびベクター力価を一定に保ちつつＴ細胞の数を変えたことを除いて、おおむね前の節で説明したように、連続向流遠心分離機システム（ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）においてＴ細胞に形質導入した。表Ｅ３に示すように、２億個または６億個どちらかのＴ細胞を１００万細胞当たり１．１１μＬのベクターと共に３５ｍＬの総体積で遠心分離した。対照として、１５００万個のＴ細胞を、前に説明した規模縮小スピノキュレーション方法に付した。６億個のＴ細胞を含有する組成物は、２億個のＴ細胞を含有する組成物より大きいかつ密度の高い流動細胞床をもたらした（データを示さない）。形質導入効率は、前の節で説明したように決定した。結果は、図９Ａに示し、図９Ｂにおいて定量化するように、ＣＣＥ条件間で、インプット組成物中のＴ細胞の数が多いほど高い形質導入率をもたらすことを実証した。

【0824】

【表3】

【0825】

Ｅ．形質導入効率に対するインキュベーション時間の効果
アウトプット画分を３０分または９０分のどちらかにわたって連続向流遠心分離機システムの円錐形のエンクロージャーを通って再循環させることによってインキュベーション時間を変えたことを除いて、おおむね前の節で説明したように、連続向流遠心分離機システム（ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）において２００×１０^６個のＴ細胞に形質導入した。上清試料を遠心分離機チャンバーから定期的に収集して、レンチウイルスベクターの消費を経時的にモニタリングした。Ｊｕｒｋａｔ細胞に試料で形質導入し、各上清試料中のレンチウイルスベクターの量を形質導入効率に基づいて評価した。連続向流遠心分離機システムによって形質導入されたＴ細胞の形質導入効率も評価した。

【0826】

図１０Ａに示すように、５分のインキュベーション後に得られたレンチウイルスベクター上清試料によって形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞のパーセントは、出発レンチウイルスベクター材料によって形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞と比較しておよそ２０％低下した。図１０Ｂに示すように、レンチウイルスベクター粒子と共に３０分間インキュベートしたＴ細胞と、粒子と共に９０分間インキュベートしたＴ細胞との間に、形質導入効率の有意差は観察されなかった。理論に捉われようとは思わないが、この実験の結果は、レンチウイルスベクターの大部分がインキュベーションの最初の５分以内に消費され、そのため、より長いインキュベーション時間が形質導入効率を上昇させない可能性があることを示す。

【0827】

Ｆ．ベクター濃度に対する遠心分離機システム容量の効果
連続向流遠心分離機システムの総容量を流路へのインキュベーションバッグの追加によって増加させたことと除いて、実施例１で説明したＣＣＥベースの方法を使用して６２５Ｇ／１０ＦＲの再循環条件下でＴ細胞に形質導入した。インキュベーションバッグなしの総システム容量は、２５ｍＬであった。総システム容量をインキュベーションバッグの追加によって３９ｍＬまたは７２ｍＬに増加させた。円錐形のエンクロージャー部分の容量は、１５ｍＬであった。

【0828】

３９ｍＬから７２ｍＬに総システム容量を増加させることは、形質導入効率に影響を及ぼさなかった。さらなる分析によって、３９ｍＬシステムでは、ウイルスベクターは、遠心力場が存在する円錐形のエンクロージャー部分において、円錐形のエンクロージャー部分が総システム容量の１５ｍＬしか占めないにもかかわらず、優先的に濃縮されることが明らかになった（図１１、左側のパネル）。７２ｍＬシステムでは、ウイルスベクターのさほど優先的でない濃縮が観察された（図１１、右側のパネル）。
［実施例６］

【0829】

遠心水簸によるビーズ－細胞組成物の脱ビーズ化
初代ヒトＴ細胞組成物を実施例１で説明したように生成した。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でコーティングしたおよそ２００×１０^６個の常磁性ポリスチレンビーズと共に２４時間、摂氏３７度でインキュベートして、Ｔ細胞を刺激した。刺激後、細胞およびビーズ組成物を７．５×１０^５細胞／ｍＬに希釈し、さらに摂氏３７度で７２時間インキュベートした。さらなるインキュベーション後、自動化細胞計数器によって分析して、細胞組成物は６６％生存率を有する１．６０×１０^６細胞／ｍＬを含有すると判定した。次いで、細胞－ビーズの組成物を連続向流遠心分離機システム（ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）の円錐形の流体エンクロージャー部分に「インプット」組成物として入れ、遠心分離の連続向流水簸（「ＣＣＥ」）ベースの方法に付した。インプット組成物を最初に１，０００ｇの遠心力および３０ｍＬ／分の流量に付して、円錐形の流体エンクロージャーにおいて細胞－ビーズの組成物の流動床を確立した。

【0830】

その後、細胞－ビーズの組成物の流動床を５０ｍＬ／分の流量に付した。遠心力を１，０００ｇから２００ｇへ１００ｇ刻みで段階的に減少させた。試料を細胞数および生存率の分析のために間隔を置いて採取した。収集したデータに基づいて、５０ｍＬ／分の流量および６００ｇの遠心力を後続の実験に選択した。

【0831】

後続の実験では、Ｔ細胞インプット組成物をおよそ２００×１０^６個のビーズと６９．５％生存率を有する２．０８×１０^６細胞／ｍＬとを含有するように生成した。最初に１，０００ｇの遠心力および３０ｍＬ／分の流量に付して細胞－ビーズ組成物の流動床を確立した後、インプット組成物を６００ｇの遠心力および５０ｍＬ／分の流量に付し、その結果、Ｔ細胞の「アウトプット」画分を得、この画分を、それを「産物」画分として最終収集チャンバーへ方向転換するまで、連続向流遠心分離機システムを通って流路で再循環させた。

【0832】

インプット組成物ならびに産物および廃棄物画分中のビーズの数を、蛍光顕微鏡法ベースのＣｙｔａｔｉｏｎ（商標）５細胞イメージングシステムを使用して決定した。最終産物画分は、インプット組成物に存在するビーズ粒子のおよそ０．０１％に相当する２２０ビーズ／ｍＬを含有した。収集された廃棄物画分は、４０，９３０細胞／ｍＬを含有した。アウトプット画分中の細胞およびビーズ粒子の数を表Ｅ４に示す。

【0833】

【表4】

産物_１は、インプット組成物全体をチャンバーに通した後の第１の水簸画分である。
産物_２は、チャンバーを緩衝液ですすいだ後の第２の水簸画分である。
［実施例７］

【0834】

連続向流遠心分離機システムにおける形質導入のための追加の方法
連続向流遠心分離機システム（ＣＴＳ Ｒｏｔｅａ（商標）向流遠心分離システム）において細胞に形質導入するための追加の方法を、形質導入効率に対するそれらの効果について試験した。下に記載する改変以外、追加の方法は、他の点では実施例１で説明したとおりであった。

【0835】

試験した１つの追加の方法では、Ｔ細胞およびレンチウイルスベクター粒子を、細胞およびベクター粒子の流動床を確立した後１分間インキュベートし、次いでその直後に、形質導入産物画分を再循環することなく収集した。この方法は、実施例１で説明した６２５Ｇ／１０ＦＲ ＣＣＥ方法を用いて達成される形質導入効率と比較して低下した形質導入効率をもたらした。

【0836】

試験した別の追加の方法では、Ｔ細胞およびレンチウイルスベクター粒子を、細胞およびベクター粒子の流動床を確立した後３０分間、６２５Ｇ／１０ＦＲ条件下でインキュベートした。しかし、インキュベーション中に、流路における流れを、円錐形のエンクロージャー部分の中心を通って半径方向内向きの向流ではなく、円錐形のエンクロージャー部分の尖端を通って半径方向外向きに向かわせた。この方法は、実施例１で説明した６２５Ｇ／１０ＦＲ ＣＣＥ方法を用いて達成される形質導入効率に匹敵する形質導入効率をもたらした。

【0837】

試験した別の追加の方法では、細胞およびベクター粒子の流動床を２５００Ｇ／４０ＦＲで確立し、１分間、６２５Ｇ／１０ＦＲでインキュベートし、その後、流れを６２５Ｇ／１０ＦＲのままで逆転させて、細胞およびベクター粒子を流動床から、円錐形のエンクロージャー部分の長さに沿って伸びている狭いカニューレを通って、円錐形のエンクロージャー部分の尖端から中心へと強制的に進ませた。細胞およびウイルス粒子を１分間にわたってカニューレから収集し、その後、未回収の細胞およびベクター粒子を用いて細胞およびベクター粒子の流動床を再確立した。この手順を３０分のインキュベーションにわたって繰り返した。この方法は、実施例１で説明した６２５Ｇ／１０ＦＲ ＣＣＥ方法を用いて達成される形質導入効率に匹敵する形質導入効率をもたらした。

【0838】

まとめると、これらの結果は、非向流方法、または連続向流遠心分離機システムからの細胞の定期的回収を含む方法を含む、連続向流遠心分離機システムにおける形質導入のための他の方法を、実施することができることを確証する。

【0839】

本発明は、例えば本発明の種々の態様を説明するために提供される特定の開示される実施形態に、範囲が限定されることを意図しない。記載される組成物および方法の種々の改変は、本明細書の記載および教示から明らかになるであろう。そのような変形形態は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内にあることが意図される。

【0840】

配列

【0841】

【表5】

【表6】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【配列表】

2025504002000001.xml

【国際調査報告】