特表 2025-504052 酵素による核酸又はポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）合成方法、及びその方法を実施するためのキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-06

(54)【発明の名称】酵素による核酸又はポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）合成方法、及びその方法を実施するためのキット

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/34 20060101AFI20250130BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20250130BHJP

   C12N 9/22 20060101ALN20250130BHJP

【ＦＩ】

C12P19/34 Z

C12N9/12 ZNA

C12N9/22

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024545092

(86)(22)【出願日】2023-01-18

(85)【翻訳文提出日】2024-07-29

(86)【国際出願番号】 US2023060847

(87)【国際公開番号】W WO2023147239

(87)【国際公開日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】63/304,282

(32)【優先日】2022-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524120011

【氏名又は名称】ワイディー バイオラブス カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＹＤ ＢｉｏＬａｂｓ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】４Ｆ．， Ｎｏ． ２， Ｓｅｃ． ２， Ｓｈｅｎｇｙｉ Ｒｄ．， Ｚｈｕｂｅｉ Ｃｉｔｙ， Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｏｕｎｔｙ ３０２０５８， Ｔａｉｗａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，チェン－ヤオ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，イー－ウェン

(72)【発明者】

【氏名】ウ，ツ－イン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ウェン－ティン

【テーマコード（参考）】

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B064AF27

4B064CA21

4B064CC30

4B064DA13

(57)【要約】

【課題】酵素によるポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）合成方法、及びその方法を実施するためのキットを提供する。
【解決手段】遊離３’－ヒドロキシル基を有するイニシエーターを有し、イニシエーターにヌクレオチドモノマーが取り込まれることにより、遊離３’－ヒドロキシル基から核酸鎖のポリメラーゼを形成し、前記核酸鎖は、エンドヌクレアーゼにより認識されるガイドヌクレオチド（ｇｕｉｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含み、且つ、前記エンドヌクレアーゼが前記核酸鎖を切断することにより、所定のポリヌクレオチドを放出すると共に、残りの前記核酸鎖における３’－末端に新しい遊離３’－ヒドロキシル基が形成され、前記残りの核酸鎖は、再使用可能なイニシエーターとする。前記ポリヌクレオチド合成方法を実施するためのキットも提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

遊離３’－ヒドロキシル基を有する３’－末端ヌクレオチドを含むイニシエーターを用意する工程と、
ポリメラーゼによってヌクレオチドモノマーを前記イニシエーターに取り込んで、前記遊離３’－ヒドロキシル基から核酸鎖を伸長させる工程であって、前記ヌクレオチドモノマーは、エンドヌクレアーゼにより認識されるガイドヌクレオチドを含み、前記ガイドヌクレオチドが前記核酸鎖の特定の位置に取り込まれるようにする工程と、
前記ガイドヌクレオチドの位置に従い前記エンドヌクレアーゼに前記核酸鎖を切断させて、所定のポリヌクレオチドを放出すると共に、新しい遊離３’－ヒドロキシル基を有する残りの前記核酸鎖を残すようにする工程とを含む酵素によるポリヌクレオチド合成方法であって、
前記エンドヌクレアーゼは、前記ガイドヌクレオチドの位置を特異的に認識し、前記ガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、前記ガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、前記ガイドヌクレオチドの５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、又は前記ガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を切断することで、前記所定のポリヌクレオチドが得られ、前記新しい遊離３’－ヒドロキシル基を有する前記残りの核酸鎖は、次のラウンドにおけるポリヌクレオチド合成のために保留して使用される新しいイニシエーターとする、酵素によるポリヌクレオチド合成方法。

【請求項2】

前記核酸鎖が、鋳型非依存性方法で合成される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記核酸鎖が、鋳型指向性方法で合成される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ガイドヌクレオチドの核酸塩基が、ウラシル、キサンチン又はヒポキサンチンである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ガイドヌクレオチドが、ウラシル又はイノシンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記ポリメラーゼが、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記エンドヌクレアーゼが、サーモコッカス・バロフィルス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｂａ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ，Ｐｆｕ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ，Ｍａｃ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ，Ｂｐｕ）、ピロコッカス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ，Ｐａｂ）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ，Ｔｋｏ）、サーモコッカス・ガンマトレランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ，Ｔｇａ）又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂｓｕ）に由来する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記エンドヌクレアーゼが、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ）、枯草菌エンドヌクレアーゼＶ （Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶ （Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）、サーモコッカス・コダカラエンシスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｋｏ Ｅｎｄｏ Ｖ）、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼ Ｑ （Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ）、メタノサルシナ・アセチボランスエンドヌクレアーゼ Ｑ（Ｍａｃ Ｅｎｄｏ Ｑ）、バチルス・プミルスエンドヌクレアーゼＱ（Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑ）、ピロコッカス・アビッシ ＮｕｃＳ エンドヌクレアーゼ（Ｐａｂ ＮｕｃＳ）、サーモコッカス・コダカラエンシス ＥｎｄｏＭＳ エンドヌクレアーゼ（Ｔｋｏ ＥｎｄｏＭＳ、配列番号１７）、サーモコッカス・ガンマトレランス ＮｕｃＳ エンドヌクレアーゼ（Ｔｇａ ＮｕｃＳ）及びこれらの変異体からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ガイドヌクレオチド３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合を切断するために、前記エンドヌクレアーゼが、枯草菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）、大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｅｃｏ Ｅｎｄｏ Ｖ）、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶ （Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ）、サーモコッカス・コダカラエンシスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｋｏ Ｅｎｄｏ Ｖ）及びこれらの酵素変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記ガイドヌクレオチド５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合を切断するために、前記エンドヌクレアーゼが、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼ Ｑ （Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ）、メタノサルシナ・アセチボランスエンドヌクレアーゼ Ｑ（Ｍａｃ Ｅｎｄｏ Ｑ）、バチルス・プミルスエンドヌクレアーゼＱ（Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑ）及びこれらの酵素変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記ガイドヌクレオチド５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合を切断するために、前記エンドヌクレアーゼが、サーモコッカス・ガンマトレランスＮｕｃＳエンドヌクレアーゼ（Ｔｇａ ＮｕｃＳ）、ピロコッカス・アビッシＮｕｃＳエンドヌクレアーゼ（Ｐａｂ ＮｕｃＳ）及びこれらの酵素変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記ガイドヌクレオチド５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を切断するために、前記エンドヌクレアーゼが、サーモコッカス・コダカラエンシスＥｎｄｏＭＳエンドヌクレアーゼ（Ｔｋｏ ＥｎｄｏＭＳ）及びこれらの酵素変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

１０℃～１００℃の範囲の温度で行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記イニシエーターが、５’末端で固相担体に固定化される、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

エンドヌクレアーゼにより特異的に認識されるガイドヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチドを用意する工程と、
所定のポリヌクレオチドを放出するために、前記ガイドヌクレオチドの位置に従い合成ポリヌクレオチドをエンドヌクレアーゼに切断させる工程とを含む酵素によりポリヌクレオチドを得る方法であって、
前記エンドヌクレアーゼは、前記ガイドヌクレオチドを認識すると共に、前記ガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、前記ガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、前記ガイドヌクレオチドの５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、或いは前記ガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を切断することで、所定のポリヌクレオチドが得られる、酵素によりポリヌクレオチドを得る方法。

【請求項16】

遊離３’－ヒドロキシル基を有する３’－末端ヌクレオチドを含む核酸イニシエーターと、
ヌクレオチドモノマーを前記イニシエーターに取り込んで前記遊離３’－ヒドロキシル基から核酸鎖を伸長させるためのポリメラーゼであって、前記ヌクレオチドモノマーがガイドヌクレオチドを含み、前記ガイドヌクレオチドが前記核酸鎖に取り込まれるようにするポリメラーゼと、
前記ガイドヌクレオチドの位置に従い前記核酸鎖を切断して所定の前記ポリヌクレオチドを放出すると共に、残りの核酸鎖の３’末端に新しい遊離３’－ヒドロキシル基を残すエンドヌクレアーゼとを含む酵素によるポリヌクレオチドを合成するためのキットであって、
前記エンドヌクレアーゼは前記ガイドヌクレオチドを特異的に認識すると共に、前記ガイドヌクレオチド３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、前記ガイドヌクレオチド５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、前記ガイドヌクレオチド５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合又は前記ガイドヌクレオチド５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を切断することで、前記所定のポリヌクレオチドが得られ、前記新しい遊離３’－ヒドロキシル基を有する前記残りの核酸鎖は、次のラウンドのポリヌクレオチド合成のために保留して使用される新しいイニシエーターとする、酵素によるポリヌクレオチドを合成するためのキット。

【請求項17】

ガイドヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチドと、
前記合成ポリヌクレオチドを切断して所定のポリヌクレオチドを放出するためのエンドヌクレアーゼとを含む酵素によりポリヌクレオチドを得るためのキットであって、
前記エンドヌクレアーゼは前記ガイドヌクレオチドの位置を認識すると共に、前記ガイドヌクレオチド３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、前記ガイドヌクレオチド５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、前記ガイドヌクレオチド５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合又は前記ガイドヌクレオチド５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を切断することで、前記所定のポリヌクレオチドが得られる、酵素によりポリヌクレオチドを得るためのキット。

【請求項18】

前記ガイドヌクレオチドが、ウラシル又はイノシンを含む、請求項１６又は１７に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、２０２２年０１月２８日に出願された米国仮出願番号第６３／３０４，２８２号の優先権を主張し、その全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（配列表に関する記載）
３７ＣＦＲ§１．８３１－８３５に従い本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出され、以下の提出内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態の配列表（ＸＭＬ形式のファイル名：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ、該テキストファイル作成日：２０２３年１月１８日、サイズ：２０．８ｋｂ）。

【0003】

本開示は、異なる条件下で酵素による核酸又はポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）合成方法、及びその方法を実施するためのキットに関するものである。

【背景技術】

【0004】

酵素法を用いた核酸デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成方法は、使用者定義の配列及長さに従い核酸又はポリヌクレオチドを製造するための様々な新たな応用分野（合成生物学、次世代シーケンシング、核酸に基づく治療、診断、ワクチン、ＤＮＡデータ記憶など）における急増する需要を満たすため、急速に開発されている。

【0005】

現在酵素による核酸合成法は、例えば、イニシエーターにヌクレオチドを反復的に付加するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＴｄＴ）などの鋳型非依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）ポリメラーゼに依存しなければならない。イニシエーターは通常、新しい核酸又はポリヌクレオチド合成の開始点として一本鎖核酸又はポリヌクレオチドで構成される。通常、合成イニシエーターは固相担体上に固定化する必要がある。したがって酵素による核酸合成は、所望の長さと配列が得られるまで、イニシエーターから核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖を伸長し続けることができる。

【0006】

このような核酸の酵素合成の実用的実施を考案する場合、主要な課題の１つは、固相担体上に固定されたイニシエーターから新たに合成されたオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド生成物を効率的に得ることである。例えば米国特許第１０，６８３，５３６ Ｂ２号では新たに合成された核酸又はポリヌクレオチドを核酸イニシエーターから切り離す（ｄｅｃｏｕｐｌｅ）ために、アルカリ溶液、金属イオン及びＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（ｔｙｐｅ ＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）などの特定の切断試薬を必要とするポリヌクレオチドを合成するための酵素法を記載している。しかし、アルカリ溶液を利用して新生核酸又はポリヌクレオチドを放出するには、部位特異的切断反応（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のために、新たに合成された核酸とイニシエーターとの間に固有の化学リンカーを使用する必要があるため、日常的な実施には不便である。一方、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを使用してイニシエーターから新生核酸又はポリヌクレオチドを切断することに関する前記の記述には、実現可能性を証明する例がまだ欠けている。また、本技術分野において知られたＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが機能するには配列特異的認識部位に依存しなければならず、例えば、典型的には４～８塩基の回文配列（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を使用してＤＮＡ鎖を切断するために、酵素によるデノボ核酸合成におけるその広範な適応が制限されている。

【0007】

また、米国特許出願公開第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号には、鋳型非依存的酵素核酸合成のポリヌクレオチド産物を切断する方法が記載されており、この方法では、イニシエーターは、部位特異的な（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）３’末端から２番目のデオキシイノシン（ｄＩ）を保持するように考案されている。このイニシエーター内のｄＩの位置は、エンドヌクレアーゼＶ（ＥｎｄｏＶ）により認識されるため、ＥｎｄｏＶがイニシエーターから新たに合成されたＤＮＡ鎖を正確に切断するためのガイドとして機能する。この開示によれば、ＤＮＡ鎖切断活性は、大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（ＥｃｏＥｎｄｏＶ）のみによって達成され、全体的な性能は、大腸菌ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）のデオキシウリジンによるデオキシイノシンの切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）と、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＶＩＩＩ）によるＤＮＡ鎖切断を組み合わせることにより、イニシエーターからＤＮＡ鎖を解放する２酵素ベースのＵＳＥＲ法に相当する。ただし、ＥｃｏＥｎｄｏＶ法とＵＳＥＲ法の両方は、核酸イニシエーターの部位特異的認識において、それぞれデオキシイノシンとデオキシウリジンの使用必要に制限されている。さらに、ＥｃｏＥｎｄｏＶ及びＵＳＥＲの酵素反応は、中程度の反応温度（＜５０℃）で実行する必要があり、高温（≧５０℃）での核酸切断反応には適していない。これら２つの酵素システムの切断能力は、異なる条件や用途でデノボポリヌクレオチド合成（ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を採用するという使用者の要求を満たすことができない。

【0008】

したがって、新たに合成された核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖を得ると共に、遊離ヒドロキシル基を有するイニシエーターを同じ工程で再生することで、次のラウンドの酵素による核酸合成を可能にする、より効率的で、より多様で、コスト利益がより高く、耐熱性のある方法が緊急に必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本明細書では、例えばカスタムポリヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、又はＲＮＡプローブの調製用など、複数の用途向けに合成ポリヌクレオチドを調製するための方法及びキットを開示する。

【0010】

本明細書では、使用者の意図に応じて所定の配列及び長さのポリヌクレオチドを得るための部位特異的取得方法及びキットを開示する。本明細書で開示された方法を採用することにより、使用者は、所定のポリヌクレオチドの配列及び長さ、ならびに新たに合成された核酸内のガイドヌクレオチドの位置を設定し、単一の酵素を使用した部位特異的ポリヌクレオチド切断によって、所望の所定のポリヌクレオチドを直接得ることができる。したがって、本明細書で開示された方法及びキットによれば、使用者は、所定の配列及び長さのポリヌクレオチドを正確かつ効率的に得ることができる。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本明細書で提供される方法は、酵素によるポリヌクレオチド合成方法である。前記方法は、遊離３’－ヒドロキシル基を有する３’－末端ヌクレオチドを含むイニシエーターを用意する工程と、ポリメラーゼによってヌクレオチドモノマーをイニシエーターに取り込んで、遊離３’－ヒドロキシル基から核酸鎖を伸長させる工程であって、前記ヌクレオチドモノマーは、エンドヌクレアーゼにより認識されるガイドヌクレオチドを含み、ガイドヌクレオチドが新たに合成された核酸鎖の特定の位置に取り込まれるようにする工程と、前記ガイドヌクレオチドの位置に従いエンドヌクレアーゼに核酸鎖を切断させて、所定の配列及び長さのポリヌクレオチドを放出すると共に、遊離３’－ヒドロキシル基を有する残りの核酸鎖又はイニシエーターを残すようにする工程とを含み、エンドヌクレアーゼは、新たに合成された核酸鎖中のガイドヌクレオチドの位置を特異的に認識し、ガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、又はガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を切断することで、所定の配列及び長さの所望のポリヌクレオチドが得られ、残りの核酸鎖は、遊離３’－ヒドロキシル基を有し、これは、次のラウンドのポリヌクレオチド合成のために使用される新しいイニシエーターとする。

【0012】

一部の実施形態において、本明細書で提供される方法は、鋳型非依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）又は鋳型依存性（すなわち、鋳型指向性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ））ポリヌクレオチド合成に使用することができる。鋳型非依存性ポリヌクレオチド合成において、イニシエーターは、新生核酸鎖を伸長するための遊離３’－ヒドロキシル基を有する一本鎖核酸である。鋳型依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）ポリヌクレオチド合成において、イニシエーターは、相補鋳型核酸とアニール（ａｎｎｅａｌ）してプライマー－鋳型二重鎖（ｐｒｉｍｅｒ－ｔｅｍｐｌａｔｅ ｄｕｐｌｅｘ）を形成し、ポリメラーゼによる核酸合成を誘導する一本鎖プライマーである。ポリメラーゼは、鋳型の配列情報に従いプライマーを伸長する。

【0013】

一部の実施形態において、ガイドヌクレオチドは、天然的、非天然又は修飾を受けたヌクレオチドであり、ヌクレオチドの核酸塩基は、例えばウラシル、キサンチン又はヒポキサンチンである。

【0014】

一部の実施形態において、ガイドヌクレオチドは、天然的、非天然又は修飾を受けたヌクレオチドであり、例えばウラシル又はイノシンを含むヌクレオチドである。
一部の実施形態において、本明細書で提供される方法は、鋳型非依存性ポリメラーゼ又は鋳型依存性ポリメラーゼの使用を含み、前記鋳型非依存性ポリメラーゼは、例えばファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼであり得る。

【0015】

本明細書では、酵素によりポリヌクレオチドを得る方法が提供され、この方法は、エンドヌクレアーゼにより特異的に認識されるガイドヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチドを用意する工程と、所定の配列及び長さのポリヌクレオチドを放出するために、合成ポリヌクレオチドを前記エンドヌクレアーゼに切断させる工程とを含み、前記エンドヌクレアーゼは、合成ポリヌクレオチド中のガイドヌクレオチドの位置を認識し、ガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、或いは前記ガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を切断することで、所定の配列及び長さのポリヌクレオチドが得られる。

【0016】

一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼが、サーモコッカス・バロフィルス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｂａ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｆｕ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍａｃ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂｐｕ）、ピロコッカス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐａｂ）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｋｏ）、サーモコッカス・ガンマトレランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｔｇａ）又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｓｕ）に由来する。

【0017】

一部の実施形態において、本明細書で提供される方法は、新たに合成された核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖中に取り込まれたガイドヌクレオチドを特異的に認識することができる超好熱性（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ）或いは中温性（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ）のエンドヌクレアーゼの使用を含み、したがって、前記エンドヌクレアーゼは、核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖中のガイドヌクレオチドの位置に従い核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖を切断し、ガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、又はガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合は、それぞれ対応するエンドヌクレアーゼにより特異的に切断され得る。

【0018】

一部の実施形態において、超好熱性エンドヌクレアーゼが、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ）、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）、サーモコッカス・コダカラエンシスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｋｏ Ｅｎｄｏ Ｖ）、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼ Ｑ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ）、メタノサルシナ・アセチボランスエンドヌクレアーゼＱ（Ｍａｃ Ｅｎｄｏ Ｑ）、ピロコッカス・アビッシＮｕｃＳ エンドヌクレアーゼ（Ｐａｂ ＮｕｃＳ）、サーモコッカス・コダカラエンシスＥｎｄｏＭＳエンドヌクレアーゼ（Ｔｋｏ ＥｎｄｏＭＳ）、サーモコッカス・ガンマトレランスＮｕｃＳエンドヌクレアーゼ（Ｔｇａ ＮｕｃＳ）及びこれらの酵素変異体或は突然変異体からなる群に由来する。

【0019】

一部の実施形態において、本明細書で提供される方法は、新たに合成された核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖において、枯草菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖ；配列番号１１）、バチルス・プミルスエンドヌクレアーゼＱ（Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑ；配列番号１２）及びこれらの酵素変異体などの群からの中温性エンドヌクレアーゼの使用を含む。

【0020】

一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼが、枯草菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）、大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｅｃｏ Ｅｎｄｏ Ｖ；配列番号７）、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ；配列番号８）、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ；配列番号１０）、サーモコッカス・コダカラエンシスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｋｏ Ｅｎｄｏ Ｖ、配列番号１６）又はこれらの酵素変異体からなる群から選択され、かつガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合を特異的に切断する。

【0021】

一部の実施形態において、前記エンドヌクレアーゼが、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ；配列番号９）、メタノサルシナ・アセチボランスエンドヌクレアーゼＱ（Ｍａｃ Ｅｎｄｏ Ｑ、配列番号１４）、バチルス・プミルスエンドヌクレアーゼＱ（Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑ、配列番号１２）及びこれらの酵素変異体からなる群から選択され、新たに合成された核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖中のガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合を特異的に切断する。

【0022】

一部の実施形態において、前記エンドヌクレアーゼが、サーモコッカス・ガンマトレランスＮｕｃＳエンドヌクレアーゼ（Ｔｇａ ＮｕｃＳ；配列番号１５）、ピロコッカス・アビッシＮｕｃＳエンドヌクレアーゼ（Ｐａｂ ＮｕｃＳ；配列番号１３）及びこれらの酵素変異体からなる群から選択され、新たに合成された核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖中のガイドヌクレオチドの５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合を特異的に切断する。

【0023】

一部の実施形態において、前記エンドヌクレアーゼが、サーモコッカス・コダカラエンシスＥｎｄｏＭＳエンドヌクレアーゼ（Ｔｋｏ ＥｎｄｏＭＳ、配列番号１７）及びこれらの酵素変異体からなる群から選択され、新たに合成された核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖中のガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を特異的に切断する。

【0024】

一部の実施形態において、ガイドヌクレオチドに近くの特定のホスホジエステル結合で切断するために、前記エンドヌクレアーゼは、新生核酸ストランド又は合成ポリヌクレオチド中のガイドヌクレオチドを認識する。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法は、従来に使用されている方法よりも高い温度で実施することができる。実施のための温度範囲は、例えば１０℃～１００℃、５０℃～９０℃、又は７０℃～９０℃であり得る。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法において核酸イニシエーターは、遊離型であり、または本明細書に開示される方法に従いその ５’末端を介して固相担体に付着と固定化される、二重鎖構造（ｄｕｐｌｅｘ）の合成／合成ポリヌクレオチドを形成する。固相担体は、例えば顆粒、樹脂、ビーズ、スライド、チップ、アレイ、膜、マトリックス、フローセル、ウェル、チャンバー、マイクロ流体チャンバー、チャネル、マイクロ流体チャネル、ゲル、合成ポリマー或いは合成核酸鎖又はポリヌクレオチドを付着させることができる任意の表面であり得る。

【0025】

本開示は、酵素によりポリヌクレオチドを合成するためのキットをさらに提供する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドの配列及び長さは、予め決定されているか、又は設計されている。本開示の予め決定された配列及び長さのオリゴヌクレオチドを合成するためのキットは、遊離３’－ヒドロキシル基を有する３’－末端ヌクレオチドを含む核酸イニシエーターと、複数のヌクレオチドモノマーをイニシエーターに取り込んでイニシエーターの遊離３’－ヒドロキシル基から核酸鎖を伸長させるためのポリメラーゼとを含み得、ヌクレオチドモノマーは、エンドヌクレアーゼにより特異的に認識されるガイドヌクレオチドを含むことで、ガイドヌクレオチドを核酸鎖の指定された位置に取り込ませる。そして、エンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドの位置に従い核酸鎖を切断して、所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを放出すると共に、残りの核酸鎖の３’末端に遊離の３’－ヒドロキシル基を残す。エンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドを特異的に認識すると共に、それぞれガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合又はガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を切断する。したがって、所望の配列及長さのポリヌクレオチドが得られ、新しい遊離３’－ヒドロキシル基を有する残りの核酸鎖は、新しいイニシエーターとして次のラウンドのポリヌクレオチド合成に使用されることができる。

【0026】

本開示は、さらに、酵素により所定の配列及び長さのポリヌクレオチドを得るためのキットを提供する。一部の実施形態において、切断しようとする標的ポリヌクレオチドは、事前に調製された任意の合成ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記キットは、部位特異的なガイドヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチドと、合成ポリヌクレオチドを切断して所定のポリヌクレオチドを放出するエンドヌクレアーゼとを含み、エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド中のガイドヌクレオチドの位置を認識し、それぞれガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、又はガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を切断することで、所望の所定のポリヌクレオチドが得られる。

【0027】

一部の実施形態において、核酸ストランド又はポリヌクレオチド鎖にウラシル或いはイノシンを含むガイドヌクレオチドは、既存のものであるか、若しくは化学法又は酵素法を用いて新たに合成されるものであってもよい。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕本開示の少なくとも１つの実施形態による概略図である［イニシエーター（３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有する）から鋳型非依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）デノボ合成を行い、新たに合成されたＤＮＡ鎖を切断して所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを得、合成されたＤＮＡ鎖を切断した後、残った核酸鎖から新しい遊離３’－ヒドロキシル基を再生して所定のポリヌクレオチドを得ると共に、残りの核酸鎖を核酸合成の次のラウンドで新しい再利用可能なイニシエーターとして使用することを示す。核酸合成反応の前に、イニシエーターの５’末端が固相担体（ＳＳ）に固定される。Ｘは、ガイドヌクレオチドを表し、核酸鎖内のヌクレオチド位置に番号を付ける起点として使用される。Ｎは、取り込まれたヌクレオチドモノマーを表し、下付き添字番号は、核酸鎖の３’末端側又は下流に向かって昇順（例：Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４及びＮ_５）、下付き添字番号は、核酸鎖の５’末端側又は上流に向かって降順（例：Ｎ_－１、Ｎ_－２及Ｎ_－３）になる。Ｅ１～Ｅ４は、異なるエンドヌクレアーゼを表す。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３又はＥ４酵素によりそれぞれＮ_２とＮ_１との間、ＸとＮ_－１との間、Ｎ_－１とＮ_－２との間又はＮ_－２とＮ_－３との間のホスホジエステル結合で切断できることを含み、イニシエーターの５’末端は、固相担体（ＳＳ）に連結される酵素核酸合成プロセスを概略で説明する。］。
〔図２Ａ及び図２Ｂ〕本開示の少なくとも１つの実施形態による概略図である［イニシエーター（３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有する）（すなわちプライマー）からの鋳型指向性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＤＮＡ合成、所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを得るための新生ＤＮＡ鎖の切断、及び次のラウンドの核酸合成のための新しい再利用可能なイニシエーターを形成するための残りの核酸鎖の３’末端の遊離３’－ヒドロキシル基の再生を示す。イニシエーターの５’末端は、核酸合成反応の前に固相担体（ＳＳ）に固定される。したがって、鋳型ＤＮＡは、３’末端を介して固相担体に連結されるか（図２Ａ）、又はアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）法或いは他の既知のハイブリダイゼーション技術によりイニシエーターに部分的にハイブリダイズされる（図２Ｂ）。Ｘは、ガイドヌクレオチドを表し、核酸鎖に番号を付ける起点として使用される。Ｎは、取り込まれたヌクレオチドモノマーを表し、下付き添字番号は、核酸鎖の３’末端側又は下流に向かって昇順（例：Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４及びＮ_５）で、下付き添字番号は、核酸鎖の５’末端側又は上流に向かって降順（例：Ｎ_－１、Ｎ_－２及Ｎ_－３）になる。Ｅ１～Ｅ４は、異なるエンドヌクレアーゼを表す。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３又はＥ４酵素によりそれぞれＮ_２とＮ_１との間、ＸとＮ_－１との間、Ｎ_－１とＮ_－２との間又はＮ_－２とＮ_－３との間のホスホジエステル結合で切断できることを含む酵素核酸合成手段を概略で説明する。］。
〔図３〕本開示の少なくとも１つの実施形態による鋳型非依存性核酸合成の実現可能性を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［レーン（ｌａｎｅ）Ｓは、イニシエーターＤＮＡのみ（ビオチン－ＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡ）を示す。レーン１は、ポリメラーゼにより３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシウリジン（Ｕ）で伸長されたイニシエーターＤＮＡを示す。レーン２は、各ヌクレオチド取り込み及び３’－脱保護工程の後に、３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシウリジン（Ｕ）及び３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシグアノシン（Ｇ）で連続的に伸長されたイニシエーターＤＮＡを示す。レーン３は、３’－脱保護工程後に３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシウリジンで伸長され、続いてｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物）で伸長されたイニシエーターＤＮＡを示す。］。
〔図４Ａ及び図４Ｂ〕それぞれ実施例１及び２の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像であり、３７℃又は７０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ、図４Ａ）或いはデオキシウリジン（Ｕ、図４Ｂ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図４Ａ（１）及び図４Ｂ（１））又は固定化型（図４Ａ（２）及び図４Ｂ（２））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型（図４Ａ（３） 及び図４Ｂ（３））又は固定化型（図４Ａ（４）及び図４Ｂ（４））の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の部位特異的切断を示している。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｐｆｕ ＥｎｄｏＶは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ２は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーぜ（ｈｕｍａｎ ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ，ｈＡＡＧ）及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＥｎｄｏＶＩＩＩ）を含む自製の酵素混合物を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。
〔図５Ａ及び図５Ｂ〕それぞれ実施例３及び４の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃又は７０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ、図５Ａ）或いはデオキシウリジン（Ｕ、図５Ｂ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図５Ａ（１）及び図５Ｂ（１））又は固定化型（図５Ａ（２）及び図５Ｂ（２））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型（図５Ａ（３）及び図５Ｂ（３））又は固定化型（図５Ａ（４）及び図５Ｂ（４））の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の部位特異的切断を示している。Ｐｆｕ ＥｎｄｏＱは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ２は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラー（ｈＡＡＧ）及びＥｎｄｏＶＩＩＩを含む自製の酵素混合物を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。
〔図６Ａ及び６Ｂ〕それぞれ実施例５及び６の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃又は７０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ、図６Ａ）或いはデオキシウリジン（Ｕ、図６Ｂ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図６Ａ（１）及び図６Ｂ（１））又は固定化型（図６Ａ（２）及び図６Ｂ（２））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型（図６Ａ（３）及び図６Ｂ（３））又は固定化型（図６Ａ（４）及び図６Ｂ（４））の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の部位特異的切断を示している。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ２は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラー（ｈＡＡＧ）及びＥｎｄｏＶＩＩＩを含む自製の酵素混合物を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。
〔図７〕それぞれ実施例７の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃で、例示的な酵素でデオキシウリジン（Ｕ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図７（１）の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（図７（２）の部位特異的切断を示している。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖは、枯草菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。
〔図８Ａ及び図８Ｂ〕実施例８の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃、５５℃及／又は６０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ，図８Ａ（１）、８Ａ（２）、８Ｂ（１）、及び８Ｂ（２））及びデオキシウリジン（Ｕ，図８Ａ（３）、８Ａ（４）、８Ｂ（３）、及び８Ｂ（４））を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図８Ａ（１）、８Ａ（３）、８Ｂ（１）、及８Ｂ（３））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は固定化型（図８Ａ（２）、８Ａ（４）、８Ｂ（２）、及８Ｂ（４））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）からの伸長ＤＮＡ鎖産物の部位特異的切断を示す。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｔｂａは、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱを意味する。Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、バチルス・プミルスエンドヌクレアーゼＱを意味する。］。

【発明を実施するための形態】

【0028】

以下の実施形態は、本発明を詳細に説明するために提供される。当業者は、本明細書の開示を読んだ後、本開示の利点及び効果を容易に理解することができ、且つ他の異なる実施形態で実現及び使用することができる。したがって、本明細書の開示を実現するために、異なる態様又は用途に対して、本発明の範囲に離脱しない前提で、以下の実施形態を調整及び／又は変更することができ、本明細書に開示された内容の範囲内における任意の要素或いは方法は、本明細書の他の実施形態における他の任意の要素若しくは方法と組み合わせることができる。

【0029】

本明細書で使用されるように、単数形「一つ」、及び「該」は、文脈上明らかに単数形であることが示されない限り、複数形も同様に含むことを意図することである。用語「又は」は、文脈上明らかにそうでないとされる限り、用語「及び／又は」と互換的に使用されている。

【0030】

本明細書で使用されるように、用語「包括する」、「含む」、「含有する」及びこれらのいかなる変形用語も、非排他的な包含を網羅するものとする。例えば物体が制限条件を「含む」と記述する場合、特に指定がない限り、他の成分、要素、組成物／コンポーネント、構造、領域、部品、デバイス、システム、ステップ、或いは連結などが追加で含まれることができ、しかも他の制限は除外されない。

【0031】

本明細書で用いられる数値範囲は、包括的かつ組み合わせ可能であり、本明細書の数値範囲内にある任意の数値を最大値又は最小値として、そこからサブ範囲を導き出すことができる。例えば、「１０℃～１００℃」という数値範囲は、最小値１０℃から最大値１００℃までの任意のサブ範囲、例えば１０℃～５０℃、６０℃～１００℃、７０℃～９０℃などのサブ範囲を含む。なお、本明細書で用いられる複数の数値を、最大値及び最小値として任意に選択して、数値範囲を導き出すことができる。例えば、３７℃、５５℃、及び７０℃の数値範囲から、３７℃～５５℃、３７℃～７０℃、５５℃～７０℃等の数値範囲を導き出すことができる。

【0032】

本明細書で使用されている「約」という用語は、一般的に包含するように意図される数値を意味し、その範囲は、与えられた数値又は与えられた数値範囲から±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又は±０．１％の変動をカバーする。数値のこのような変動は、例えば、実験誤差や、化合物、組成物、濃縮物、或いは製剤を製造するための測定若しくは取り扱い手順における典型的な誤差や、本開示で使用される出発材料又は成分の供給源、製造又は純度の差や、同様の考慮事項により発生する可能性がある。或いは、用語「約」は、当業者が考慮した場合に、その値が平均値の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。特に明記しない限り、本明細書で開示されている材料の量、時間の長さ、温度、動作条件、量の比率などの数値範囲、量、値、及びパーセンテージは、全ての場合において「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。

【0033】

本明細書で使用されるように、用語「核酸」、「核酸配列」及び「核酸断片」とは、一本鎖又は二本鎖の形態のヌクレオチド或いはリボヌクレオチド配列を指し、その供給源は本明細書に限定されず、一般的に天然ヌクレオチド或いは人工の化学模倣物が含まれる。本明細書で使用される用語「核酸」は、天然又は非天然の「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、及び「ｍＲＮＡ」を含む用語と互換的に使用されることができる。

【0034】

本明細書で使用される核酸には、核酸類似体も含まれる。核酸類似体という用語は、天然に存在するＲＮＡ及びＤＮＡと機能的又は構造的に同等である化合物或いは人工核酸を表すことが知られている。核酸類似体は、１つ又は複数の修飾を受けたヌクレオチド部分(リン酸骨格、五炭糖、核酸塩基)を有する場合がある。ヌクレオチド上のこれらの修飾は、核酸の構造、幾何学的形状、及びそれと核酸ポリメラーゼとの相互作用を変化させる。核酸類似体は、天然物とは異なる新種の形態（ｎｅｗ－ｔｏ－ｎａｔｕｒｅ）の糖骨格を持つように設計された異種核酸（ｘｅｎｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＸＮＡ）などなどの、新たなカテゴリーの人工核酸もカバーする。

【0035】

核酸類似体の例としては、４つの標準塩基すべてと塩基対を形成できる、イノシン、３－ニトロピロール（３－ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ）及び５－ニトロインドール（５－ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）などのユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）と、核酸の骨格特性に影響を与えるペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸－糖骨格類似体と、アミン反応性アミノアリルヌクレオチド（ａｍｉｎｅ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、チオール（ｔｈｉｏｌ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）含有ヌクレオチド、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）結合ヌクレオチド、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）結合ヌクレオチド及びシアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）結合ヌクレオチドなどの化学リンカー又はフルオロフォア結合類似体と、２－アミノプリン（２－ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ，２－ＡＰ）、３－メチルイソキサントプテリン（３－ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｎｔｈｏｐｔｅｒｉｎ、３－ＭＩ）、６－メチルイソキサントプテリン（６－ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｎｔｈｏｐｔｅｒｉｎ、６－ＭＩ）、４－アミノ－６－メチルイソキサントプテリン（４－ａｍｉｎｏ－６－ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｎｔｈｏｐｔｅｒｉｎ、６－ＭＡＰ）及び４－ジメチルアミノピリジン（４－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、ＤＭＡＰ）などの蛍光塩基類似体と、蛍光レポーター色素に結合したオリゴヌクレオチド（ＡＬＥＸＡ、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＣＹ３、ＣＹ５、ＶＩＣ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ など）及び／又は蛍光クエンチャー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ）（ＢＨＱ）などの各種遺伝子使用の核酸プローブと、ステムループ（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）構造及びフルオロフォアとクエンチャーで二重標識される一本鎖核酸プローブを含む分子ビーコン（ＭＢ）と、核酸アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）とが挙げられるが、これらに限定されない。

【0036】

本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリリボヌクレオチド、ポリデオキシリボヌクレオチドヌクレオチド、又はプリン或いはピリミジン塩基を有するＮ－グリコシドからなる他のポリヌクレオチドを含む、あらゆる種類のポリヌクレオチドの総称である。本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、長さの違いを指すものでなく、これらの分子構造のみを指すため、本明細書では互換的に使用されることができる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチド、損傷されたヌクレオチド、或いは修飾を受けたヌクレオチドをさらに含み得る。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに含まれる核酸塩基としては、例えばアデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン（ｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、イソグアニン（ｉｓｏｇｕａｎｉｎｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、５－ヒドロキシメチルウラシル（５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、５－ホルミルシトシン（５－ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５－カルボキシルシトシン（５－ｃａｒｂｏｘｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、３－メチルアデニン（３－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、３－メチルグアニン（３－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、７－メチルアデニン（７－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、７－メチルグアニン（７－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ６－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニン（８－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｎｉｎｅ）、５－ヒドロキシルシトシン（５－ｈｙｄｒｏｘｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５－ヒドロキシルラシル（５－ｈｙｄｒｏｘｙｌｕｒａｃｉｌ）、ジヒドロキシウラシル（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｕｒａｃｉｌ）、エテノシトシン（ｅｔｈｅｎｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、エテノアデニン（ｅｔｈｅｎｏａｄｅｎｉｎｅ）、チミングリコール（ｔｈｙｍｉｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、シトシングリコール（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、２，６－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－Ｎ－メチルホルムアミドピリミジン（２，６－ｄｉａｍｉｎｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、アデニンのホルムアミドピリミジン（ｆｏｒｍａｍｉｄｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）誘導体、グアニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンの反対側のアデニン（ａｄｅｎｉｎｅ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｇｕａｎｉｎｅ）、グアニンの反対側のウラシル、アデニンの反対側のウラシル、グアニンの反対側のチミン、グアニンの反対側のエテノシトシン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニンの反対側のアデニン及びグアニンの反対側の２－ヒドロキシルアデニンであり得る。

【0037】

本明細書で使用される用語「エンドヌクレアーゼ活性」は、特定の認識可能な核酸部位での結合を切断し、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの切断反応を引き起こす酵素活性を指す。エンドヌクレアーゼ活性は、天然に存在する酵素及びその修飾を受けた誘導体により提供され得る。修飾を受けた誘導体の例としては、具酵素活性を有する変異体/変異体、酵素断片、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素に由来する組換えタンパク質が挙げられる。例えば、エンドヌクレアーゼは、一方で一本鎖ＤＮＡを切断すると共に、５’－リン酸（５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を持つオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドを放出し、、他方で残りの核酸ストランドに遊離の３’－ヒドロキシル基を残すことができる。

【0038】

用語の「脱塩基（ａｂａｓｉｃ）」、「脱プリン／脱ピリミジン（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ）」及びＤスペーサー（Ｄ－ｓｐａｃｅｒ）は、塩基が存在しないが、糖リン酸骨格がそのまま残っている部位を示すために、互換的に使用することができる。したがって、脱塩基部位エンドヌクレアーゼは、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼとしても知られている。

【0039】

本明細書で使用される用語「鋳型」は、所望の又は未知の標的ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド或いはポリヌクレオチド模倣物を指す。場合によっては、用語の「標的配列」、「鋳型ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」、「核酸鋳型」、「鋳型配列」、及びこれらの変形は、互換的に使用されることができる。例えば、用語「鋳型」は、鋳型依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）又は鋳型指向性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）核酸ポリメラーゼによる複製を介してヌクレオチド或いはヌクレオチド類似体から相補的コピー（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｃｏｐｙ）が合成される核酸鎖を指す。核酸二重らせん（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｕｐｌｅｘ）構造では、慣習的な定義により鋳型鎖が「下側」鎖として描かれ、説明される。同様に、非鋳型鎖は、「上側」鎖として描かれ、説明される。「鋳型」鎖は、「センス（ｓｅｎｓｅ）」又は「プラス（ｐｌｕｓ）」鎖と呼ばれることもあり、非鋳型鎖は、「アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）」又は「マイナス（ｍｉｎｕｓ）」鎖と呼ばれることもある。

【0040】

本明細書で使用される「イニシエーター」という用語は、核酸ポリメラーゼが核酸のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成を開始するモノヌクレオシド、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は修飾を受けた類似体を指す。「イニシエーター」という用語は、ＸＮＡ又は３’－ヒドロキシル基を有するペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ，ＰＮＡ）を指す場合もある。本明細書で使用される用語「プライマー」は、鋳型と組み合わせ、核酸ポリメラーゼによる核酸合成を開始するために使用される短い一本鎖オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いは修飾を受けた核酸類似体を指す。

【0041】

本明細書に開示されるヌクレオチドモノマーには、典型的なヌクレオチド及びヌクレオチド類似体が含まれる。「ヌクレオチド類似体」という用語は、典型的なヌクレオチドの構造模倣物である化学的に修飾されたヌクレオチド又は人工ヌクレオチドを指すことが当業者に知られている。これらのヌクレオチド類似体は、核酸を合成するための核酸ポリメラーゼの基質として使用できる。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの１つ又は複数の変更されたヌクレオチド成分(例：リン酸骨格、五炭糖及び核酸塩基)を有する場合があり、これらはヌクレオチドの構造及び立体配置を変更すると共に、該ヌクレオチド類似体と他の核酸塩基及び核酸ポリメラーゼとの相互作用に影響を与える。例えば、変更された核酸塩基を有するヌクレオチド類似体は、ＤＮＡ又はＲＮＡに別の塩基対合（ｂａｓｅ－ｐａｉｒｉｎｇ）及び塩基スタッキング（ｂａｓｅ－ｓｔａｃｋｉｎｇ）特性を与えることができる。また、例として、塩基の修飾により、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、メチル－５－デオキシシチジン（ｍｅｔｈｙｌ－５－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、デオキシウリジン（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、ジメチルアミノ－５－デオキシウリジン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－５－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、ジアミノ－２，６－プリン（ｄｉａｍｉｎｏ－２，６－ｐｕｒｉｎｅ）又はブロモ－５－デオキシウリジン（ｂｒｏｍｏ－５－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）などのヌクレオシド、及びハイブリダイゼーションを可能にする他の任意の類似体を生成することができる。他の例示的な態様において、修飾は、糖部分（ｓｕｇａｒ ｍｏｉｅｔｙ）（例えば、類似体によるデオキシリボースの置換）及び／又はリン酸基（例えば、ボロン酸塩、アルキルホスホン酸塩、或いはホスホロチオエート誘導体）で行うことができる。ヌクレオチド類似体モノマーは、一リン酸（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、二リン酸、三リン酸、四リン酸、五リン酸、及び六リン酸を有するリン酸基から選択され得る。

【0042】

ヌクレオチド類似体の他の例としては、除去可能なブロッキング部分（ｒｅｍｏｖａｂｌｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を有するヌクレオチドが挙げられる。除去可能なブロッキング部分の例としては、３’－Ｏ－ブロッキング部分（３’－Ｏ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）、塩基ブロッキング部分（ｂａｓｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。３’－Ｏ－ブロッキング部分の例としては、Ｏ－アジド（Ｏ－Ｎ_３）、Ｏ－アジドメチル（Ｏ－ａｚｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）、Ｏ－アミノ（Ｏ－ａｍｉｎｏ）、Ｏ－アリル（Ｏ－ａｌｌｙｌ）、Ｏ－フェノキシアセチル（Ｏ－ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｙｌ）、Ｏ－メトキシアセチル（Ｏ－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｙｌ）、Ｏ－アセチル（Ｏ－ａｃｅｔｙｌ）、Ｏ－（ｐ－トルエン）スルホン酸塩［Ｏ－（ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅ）ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］、Ｏ－リン酸塩（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｏ－硝酸塩（Ｏ－ｎｉｔｒａｔｅ）、Ｏ－［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル｛Ｏ－［４－ｍｅｔｈｏｘｙ］－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｔｈｉｏｐｙｒａｎｙｌ｝、Ｏ－テトラヒドロチオピラニル（Ｏ－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｔｈｉｏｐｙｒａｎｙｌ）、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロフラニル｛Ｏ－［５－ｍｅｔｈｙｌ］－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎｙｌ｝、Ｏ－［２－メチル，４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル ｛Ｏ－［２－ｍｅｔｈｙｌ，４－ｍｅｔｈｏｘｙ］－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒａｎｙｌ｝、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロピラニル｛Ｏ－［５－ｍｅｔｈｙｌ］－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒａｎｙｌ｝及びＯ－テトラヒドロチオフラニル（Ｏ－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｔｈｉｏｆｕｒａｎｙｌ）、Ｏ－２－ニトロベンジル（Ｏ－２－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）、Ｏ－メチル（Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ）及びＯ－アシル（Ｏ－ａｃｙｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。塩基ブロッキング部分の例としては、可逆的ダイターミネーター（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｄｙｅ－ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）が挙げられる。可逆的ダイターミネーターの例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩＸの可逆的ダイターミネーター、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅの可逆的ダイターミネーター、及びＬａｓｅｒＧｅｎのライトニングターミネーター（ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0043】

本明細書で使用される用語「ポリメラーゼ」は、天然に存在する酵素及びその修飾を受けた誘導体を含むＤＮＡポリメラーゼを総称するものである。例えば、５’から３’又は３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を除去するための配列修飾をポリメラーゼに使用することができる。ポリメラーゼの性能を改善する手段には、ポリメラーゼの官能基或いは配列に対する突然変異若しくは欠失も含まれる。

【0044】

本開示によれば、ポリメラーゼは、鋳型依存性ポリメラーゼ又は鋳型非依存性ポリメラーゼであり得る。ポリメラーゼは、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ（例：Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ γ、θ及び ν）、ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼ（例：Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ Ｂ、 Ｐｏｌ ζ、Ｐｏｌ α、δ及びε）、ファミリーＣ ＤＮＡポリメラーゼ（例：Ｐｏｌ ＩＩＩ）、ファミリーＤ ＤＮＡポリメラーゼ（例：ＰｏｌＤ）、ファミリーＸ ＤＮＡポリメラーゼ（例：Ｐｏｌ β、Ｐｏｌ σ、Ｐｏｌ λ、Ｐｏｌ μ及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ファミリーＹ ＤＮＡポリメラーゼ（例：Ｐｏｌ ι、Ｐｏｌ κ、Ｐｏｌ η、ＤｉｎＢ、Ｐｏｌ ＩＶ及びＰｏｌ Ｖ）、逆転写酵素（例え：テロメラーゼ和Ｂ型肝炎ウイルス）及びこれらの酵素活性を有する断片からなる群から選択され得る。

【0045】

広く使用される鋳型依存性ポリメラーゼの非限定的な例としては、ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼであるＴ７ファージのＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ３ファージのＴ３ ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼであるＴ７ファージのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ３ファージのＴ３ ＲＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼである大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ）又はクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片と呼ばれるその断片と、熱安定的なＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼであるサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ及びＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼである真核生物ＤＮＡポリメラーゼβと、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼであるテロメラーゼと、修飾を受けたＲＮＡ（リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）；Ｕｎｒａｕ＆Ｂａｒｔｅｌ，１９９８）などの非タンパク質触媒分子、及び鋳型依存性ポリメラーゼ活性を持つＤＮＡとが挙げられる。

【0046】

鋳型非依存性ポリメラーゼの非限定的な例としては、逆転写酵素、ポリＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼθ（θ）、ＤＮＡポリメラーゼμ（μ）、ＤｐｏＩＶポリメラーゼ、及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼが挙げられる。核酸合成及び連結ヌクレオチドの付加に適したポリメラーゼは、当業者の専門知識及び従来技術の範囲内で理解できるはずであるため、簡潔にするために、ここでその詳細な説明を省略する。

【0047】

一部の実施形態において、本明細書で提供される方法は、ファミリーＢポリメラーゼの使用を含む。ファミリーＢポリメラーゼの例としては、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ，Ｅｃｏ）、緑膿菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ）、エシェリヒアファージＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）、エシェリヒアファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４）、バチルスファージ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９）、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡポリメラーゼデルタ触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ）、ヒトＤＮＡポリメラーゼデルタ触媒ｐ１２５サブユニット（ｈＰＯＬＤ）、スルホロブス・ソルファタリカスＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ （Ｐｉｓ）、超好熱菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（９°Ｎ－７株）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、サーモコッカスゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）、及びサーモコッカスリトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

本明細書に記載されるヌクレオチドモノマーは、除去可能なブロッキング部分を有してもよい。該除去可能なブロッキング部分の例としては、３’－Ｏ－ブロッキング部分、塩基ブロッキング部分及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。該除去可能なブロッキング部分を有するヌクレオチドモノマーは、可逆的ターミネーター（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）とも呼ばれる。したがって、該３’－Ｏ－ブロッキング部分を有するヌクレオチドモノマーは、３’－ブロックされた可逆的ターミネーター（３’－ｂｌｏｃｋｅｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）又は３’－Ｏ－修飾された可逆的ターミネーター（３’－Ｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）とも呼ばれ、該塩基ブロック部分を有するヌクレオチドモノマーは、３’ブロックされていない可逆的ターミネーター（３’－ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）又は３’－ＯＨブロックされていない可逆的ターミネーター（３’－ＯＨ ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）とも呼ばれる。本明細書で使用される用語「可逆的ターミネーター」は、化学修飾されたヌクレオチドモノマーを意味する。この可逆的ターミネーターがポリメラーゼにより成長中の核酸に取り込まれると、ポリメラーゼによる別のヌクレオチドモノマーのさらなる取り込みをブロックする。このような「可逆的ターミネーター」塩基及び核酸は、化学的又は物理的処理により脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）することができ、このような脱保護後、該核酸は、ポリメラーゼによりさらに伸長することができる。３’－Ｏ－ブロッキング部分の例としては、Ｏ－アジドメチル、Ｏ－アミノ、Ｏ－アリル、Ｏ－フェノキシアセチル、Ｏ－メトキシアセチル、Ｏ－アセチル、Ｏ－（ｐ－トルエン）スルホン酸エステル、Ｏ－リン酸エステル、Ｏ－硝酸エステル、Ｏ－［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロフラニル、Ｏ－［２－メチル、４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロピラニル、及びＯ－テトラヒドロチオフラニル、Ｏ－２－ニトロベンジル、Ｏ－メチルメチル及びＯ－アシルアシルが挙げられるが、これらに限定されない。３’－ブロックされていない可逆的ターミネーターの例としては、７－［（Ｓ）－１－（５－メトキシ－２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］メチル－７－デアザ－ｄＡＴＰ ｛７－［（Ｓ）－１－（５－ｍｅｔｈｏｘｙ－２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２，２－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｐｙｌｏｘｙ］ ｍｅｔｈｙｌ－７－ｄｅａｚａ－ｄＡＴＰ｝、５－［（Ｓ）－１－（５－メトキシ－２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］メチル－ｄＣＴＰ｛５－［（Ｓ）－１－（５－ｍｅｔｈｏｘｙ－２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２，２－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｐｙｌｏｘｙ］ ｍｅｔｈｙｌ－ｄＣＴＰ｝、１－［（５－メトキシ－２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］－５－メチル－７－デアザ－ｄＧＴＰ｛１－［（５－ｍｅｔｈｏｘｙ－２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２，２－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｐｙｌｏｘｙ］－５－ｍｅｔｈｙｌ－７－ｄｅａｚａ－ｄＧＴＰ｝、５－［（Ｓ）－１－（５－メトキシ－２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］メチル－ｄＵＴＰ ｛５－［（Ｓ）－１－（５－ｍｅｔｈｏｘｙ－２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎ－ｙｌ）－２，２－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｐｙｌｏｘｙ］ ｍｅｔｈｙｌ－ｄＵＴＰ｝及び５－［（Ｓ）－１－（２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］メチル－ｄＵＴＰ｛５－［（Ｓ）－１－（２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２，２－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｐｙｌｏｘｙ］ ｍｅｔｈｙｌ－ｄＵＴＰ｝が挙げられるが、これらに限定されない。該塩基ブロック部分は、可逆的ダイターミネーター（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｄｙｅ－ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）であってもよい。可逆的ダイターミネーターの例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩＸの可逆的ダイターミネーター、ＬａｓｅｒＧｅｎのライトニングターミネーター、及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅの可逆的ダイターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0049】

一部の実施形態において、ガイドヌクレオチドは、天然、非天然又は修飾を受けたヌクレオチドであり、該ヌクレオチドの核酸塩基は、例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、５－フルオロウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、３－メチルアデニン、３－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－メチルグアニン、Ｎ６－メチルアデニン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニン、５－ヒドロキシルシトシン、５－ヒドロキシルラシル、ジヒドロキシウラシル、エテノシトシン、エテノアデニン、チミングリコール、シトシングリコール、２，６－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－Ｎ－メチルホルムアミドピリミジン、アデニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンの反対側のアデニン、グアニンの反対側のウラシル、アデニンの反対側のウラシル、グアニンの反対側のチミン、グアニンの反対側のエテノシトシン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニンの反対側のアデニン及びアデニンの反対側の２－ヒドロキシルアデニンであり得る。少なくとも１つの実施形態において、ガイドヌクレオチドは、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、シトシン、及グアニンからなる群から選択される核酸塩基を含有する。一部の実施形態において、ガイドヌクレオチドは、脱プリン／脱ピリミジン損傷を含有し、該脱プリン／脱ピリミジン損傷は、脱塩基部位又はＤスペーサーである。

【0050】

可逆的ターミネーターは、当業者にとって周知でありながら、一般に使用されているものであるため、簡潔にするために本明細書ではさらなる詳細を省略する。それにも関わらず、適用可能な３’－ブロックされた可逆的ターミネーター、適用可能な３’－ブロックされていない可逆的ターミネーター、及び保護と脱保護に適用できる条件（すなわち、該除去可能なブロッキング部分を付加又は除去するための条件）は、例えば、Gardner et al. (2012), Nucleic Acids Research, 40(15):7404-7415、Litosh et al. (2011)、Nucleic Acids Research, 39(6):e39及びChen et al. (2013), Genomics Proteomics Bioinformatics, 11:34-40などの文献で見つけることができる。

【0051】

本開示によれば、イニシエーター又はプライマー－鋳型二重鎖（ｐｒｉｍｅｒ－ｔｅｍｐｌａｔｅ ｄｕｐｌｅｘ）は、核酸合成のための出発物質として使用され得る。該イニシエーター／プライマー－鋳型二重鎖の５’末端は、固相担体と連結できる。イニシエーターは、固相担体に直接付着することもできるし、リンカーを介して固相担体に付着することもできる。固相担体の例としては、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）、ビーズ（コーティング或いは非コーティング）、カラム、光ファイバー、ワイプ（ｗｉｐｅｓ）、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化膜（ｄｉａｚｏｔｉｚｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）（紙又はナイロン）、シリコーン樹脂（ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金屬、半金属（ｍｅｔａｌｌｏｉｄｓ）、半導体材料、磁性顆粒、プラスチック（例：ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）及びポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ））、ゲル－形成材料（例：ゼラチン）、リポ多糖類、ケイ酸塩（ｓｉｌｉｃａｔｅｓ）、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｓ）、メタクリル酸メチルポリマー（ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈｒａｃｒｙｌａｔｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、ゾルゲル、多孔質ポリマー、ヒドロゲル、ナノ構造表面ナノチューブ（ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）（例：カーボンナノチューブ）、及びナノ顆粒（例：金ナノ顆粒又は量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0052】

具体的には、開示された方法が酵素による核酸合成のシナリオの下で使用され、ポリメラーゼは、イニシエーターに複数のヌクレオチドモノマーを付加することにより核酸鎖を伸長することができ、ヌクレオチドモノマーには、部位特異的で認識可能なヌクレオチドモノマーが含まれる。所定の核酸塩基又は脱プリン／脱ピリミジン損傷は、ガイドヌクレオチドとして定義される。酵素による核酸合成の間、指定の位置でガイドヌクレオチドを核酸鎖に取り込み、続いて部位特異的な酵素切断が行われることにより、新たに合成された核酸鎖から所望の目標ポリヌクレオチドが得られる。したがって、所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを効果的に得る前、核酸鎖の配列及び長さ、並びに対応する切断酵素を事前に柔軟に設計及びカスタマイズすることができる。

【0053】

使用者の設計に応じて、得られる所望の核酸鎖又はポリヌクレオチドにおいて、新たに合成された核酸を含んでもよく、或いは市販のすぐに使用できる（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）合成核酸を使用してもよい。本明細書に開示される切断酵素は、指定された核酸鎖を特定の位置で優先的に又は特異的に切断することにより、所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを放出する。

【0054】

本開示は、酵素による規定の配列及び長さのポリヌクレオチドの合成方法を提供し、この方法は、３’末端に遊離の３’－ヒドロキシル基を有するイニシエーター、ポリメラーゼにより新たに合成された核酸鎖、及び新たに合成された核酸鎖内の特定のホスホジエステル結合を切断する、ポリヌクレオチド切断活性を有する酵素/エンドヌクレアーゼの使用を含む。具体的には、ポリメラーゼは、遊離の３’－ヒドロキシル基から核酸鎖を伸長させるために、ガイドヌクレオチドを含むヌクレオチドモノマーをイニシエーターに取り込む。したがって、ポリメラーゼの取り込みにより、ガイドヌクレオチドは、伸長された核酸鎖上の特定の位置にある。次いで、選択されたエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドを認識すると共に、ガイドヌクレオチドの位置に従って新たに合成された核酸鎖を切断することにより、所望の又は所定の配列及び長さのポリヌクレオチドを放出する。

【0055】

新たに合成された核酸鎖を切断することによって所定の、又は所望の配列及び長さを有するポリヌクレオチドは、選択されたエンドヌクレアーゼで新生核酸鎖におけるガイドヌクレオチドの位置を特異的に認識し、それぞれガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチのド５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合又はガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を優先的に切断する。また、エンドヌクレアーゼで核酸鎖を切断することにより、遊離３’－ヒドロキシル基を有する残りの核酸鎖を残したため、次のラウンドの核酸合成の新しいイニシエーター又は使用可能なイニシエーターとして使用することができる。

【0056】

なお、好熱性エンドヌクレアーゼを利用して、新生核酸鎖内のガイドヌクレオチドの位置を認識することにより、部位特異的核酸切断を実行することができる。好熱性酵素自体の耐熱性により、熱安定化したエンドヌクレアーゼは、反応温度の上昇などのさまざまな反応条件下で核酸の切断を加速することができる。一部の実施形態において、本開示のエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＱ、ＮｕｃＳエンドヌクレアーゼ又はＥｎｄｏＭＳエンドヌクレアーゼである。

【0057】

本明細書で提供される方法は、切断に使用できる核酸鎖を制限せず、使用者はさまざまなシナリオですぐに使用できる出発物質を入手できるため、本明細書は、酵素により所定の配列及び長さのポリヌクレオシドを得る方法も提供する。この方法は、選択されたエンドヌクレアーゼにより特異的に認識されるように配置設定されたガイドヌクレオチドを含む合成核酸を用意する工程と、核酸内のガイドヌクレオチドの位置に従いエンドヌクレアーゼに合成核酸を切断させ、所定又は所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを放出する工程とを含む。前述のように、エンドヌクレアーゼは、核酸内のガイドヌクレオチドの位置を特異的に認識し、それぞれガイドヌクレオチドの３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある１番目のホスホジエステル結合、ガイドヌクレオチドの５’末端側にある２番目のホスホジエステル結合又はガイドヌクレオチドの５’末端側にある３番目のホスホジエステル結合を優先的に切断することにより、所定のポリヌクレオチドが得られる。

【0058】

本明細書に開示される方法によれば、本発明は、所定のポリヌクレオチドを合成及び得るためのキットを提供する。酵素を用いた核酸合成シナリオの下で、該キットは、３’－末端ヌクレオチドに遊離の３’ヒドロキシル基を有するイニシエーターと、ヌクレオチドモノマー（ガイドヌクレオチドモノマーを含む）をイニシエーターに取り込んで遊離３’－ヒドロキシル基から核酸鎖を伸長させ、ガイドヌクレオチドを新たに合成された核酸鎖の指定された位置に取りみ込まれるようにするためのポリメラーゼと、新たに合成された核酸鎖中のガイドヌクレオチドを認識し、ガイドヌクレオチドの位置に従って核酸鎖を切断して、所定の、又は所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを放出することで、残りの核酸鎖に新しい遊離３’－ヒドロキシル基を有させて、次のラウンドの核酸合成の新しいイニシエーターとして容易に使用できるエンドヌクレアーゼとを含み得る。酵素を用いてポリヌクレオチドを得るシナリオの下で、該キットは、指定されたガイドヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチドと、ガイドヌクレオチドを認識し、合成ポリヌクレオチドを切断して、所定の又は所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを放出するエンドヌクレアーゼとを含み得る。エンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドを認識すると共に、合成ポリヌクレオチド中のガイドヌクレオチドの位置に従って特定のホスホジエステル結合を切断することにより、所望の又は所定の配列及び長さのポリヌクレオチドが得られる。どちらのシナリオにおいても、キットに含まれるエンドヌクレアーゼの部位特異性特性（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は、前述したとおりである。

【0059】

以下により詳細に例示されるように、本発明により提供される方法及びキットは、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ又はＢｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑ、Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖ或いはＴｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ、及び核酸イニシエーター若しくはプライマー－鋳型二重鎖を利用して、異なる固有のガイドヌクレオチドを含む核酸鎖を生成し、そのガイドヌクレオチドは、部位特異的認識に使用され、かつホスホジエステル結合の切断反応は、一般的な酵素反応温度（例えば周囲温度（例：１０℃～４０℃）、３７℃）で実行することができ、高温の反応温度（例：７０℃）で実行することもできる。以下の実施例及び対応する結果は、本発明により提供される方法及びキットが、核酸イニシエーター又はプライマー－鋳型二重鎖を利用して、固有のガイドヌクレオチドを含む核酸鎖を生成でき、該ガイドヌクレオチドが認識及び部位特異的核酸切断のために用いられ、所定の、又は所望の配列及び長さのポリヌクレオチド鎖を広範囲の反応温度で正確に放出することにより、酵素による核酸合成の応用及び有用性が広がることができることを示す。

【0060】

エンドヌクレアーゼは、ヌクレオチドを接続するホスホジエステル結合で核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を切断する酵素であり、生物学的機能（例：核酸ミスマッチ修復（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ））の維持に重要な役割を果たしている。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ操作用途にも使用される。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、ミスマッチ修復やゲノム編集（突然変異や欠失など）に広く使用されている。該酵素は、ＤＮＡミスマッチを認識すると共に、ミスマッチ位置の５’末端側にある１番目、２番目、又は３番目のホスホジエステル結合を切断する。大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｅｃｏ Ｅｎｄｏ Ｖ）は、ＤＮＡ部位を特異的に認識して核酸鎖を切断できるもう１つの酵素である。大腸菌ＥｎｄｏＶは、ＤＮＡ内のデオキシイノシン（ｄＩ）損傷を認識すると共に、ｄＩ損傷の３’末端側にある２番目のホスホジエステル結合を切断することにより、ＤＮＡ鎖切断を生じる。上述したように、大腸菌Ｅｎｄｏ Ｖは、イニシエーターと新たに合成されたＤＮＡの間のホスホジエステル結合を切断するために、酵素法によるデノボＤＮＡ合成に使用されている。しかし、大腸菌Ｅｎｄｏ Ｖは、基質特異性が狭く、耐熱性が限られているため、その有用性は限られており、新たな酵素ＤＮＡ合成で広く使用されることが困難になっている。

【0061】

他のエンドヌクレアーゼ、例えば、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）又はサーモコッカス・バロフィルス（Ｔｂａ）由来のエンドヌクレアーゼＶや、それぞれピロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍａｃ）及バチルス・プミルス（Ｂｐｕ）由来のエンドヌクレアーゼＱや、それぞれピロコッカス・アビッシ（Ｐａｂ）及びサーモコッカス・ガンマトレランス（Ｔｇａ）由来のＮｕｃＳ エンドヌクレアーゼや、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｋｏ）由来のＥｎｄｏＭＳエンドヌクレアーゼなどは、大腸菌Ｅｎｄｏ Ｖよりも広い基質範囲を持っている。これらのエンドヌクレアーゼは、例えば核酸内のデオキシウリジンやデオキシイノシンなど、さまざまな脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｅｄ）又は酸化された塩基を認識する。また、これらのエンドヌクレアーゼは、例えば脱塩基部位や構造的に脱塩基部位に類似したｄＳｐａｃｅｒ（脱塩基フランともよばれる）などの、ＤＮＡ内の脱プリン／脱ピリミジン損傷を認識することもできる。

【0062】

なお、これらのエンドヌクレアーゼ群は、耐熱性がより高い。Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ、Ｍａｃ Ｅｎｄｏ Ｑ、Ｐａｂ ＮｕｃＳ、Ｔｋｏ ＥｎｄｏＭＳ、及びＴｇａ ＮｕｃＳによってＤＮＡ鎖を切断するための反応温度範囲は、大腸菌Ｅｎｄｏ Ｖよりもはるかに広く、例示的な結果に示すように、例えば１０℃～１００℃、２０℃～３０℃、３０℃～４０℃、４０℃～５０℃、５０℃～６０℃、６０℃～７０℃、７０℃～８０℃、８０℃～９０℃、９０℃～１００℃の温度範囲である。従来技術に対して、本明細書に開示される方法及びキットは、異なる種類の脱アミノ化又は酸化された塩基（例：核酸鎖の部位特異的認識及び切断のためのデオキシウリジン又はデオキシイノシン）を含む核酸イニシエーター又はプライマーを利用する、エンドヌクレアーゼベースに基づく核酸鎖切断が改良された方法を提供する。さらに、本明細書に開示される方法及びキットは、酵素による核酸合成の用途及び有用性を広げるため、より広い範囲の反応温度で実施することができる、熱安定性エンドヌクレアーゼに基づく核酸切断が改良された方法を提供する。また、所定の又は所望の配列及び長さの核酸鎖或いはポリヌクレオチド鎖の放出後、正常な３’－ヒドロキシル基を有する核酸イニシエーター或いはプライマーを再生できる。したがって、該核酸イニシエーター或いはプライマーは、新しいラウンドの酵素による核酸合成に再利用できる。

【0063】

図１、図２Ａ及び図２Ｂは、鋳型非依存性（図１）及び鋳型指向性／鋳型依存性（図２Ａ及び図２Ｂ）の核酸合成における本発明の例示的なスキームを示す。図１、図２Ａ、及び図２Ｂに示すように、固相担体に付着したイニシエーター（ｓｓＤＮＡ）を提供する。鋳型非依存性の核酸合成に対して、鋳型指向性／鋳型依存性の核酸合成は、核酸鋳型を固相担体に付着させるか（図２Ａ）、接着法或いは他の既知のハイブリダイゼーション技術によりイニシエーターにハイブリダイズさせる必要がある（図２Ｂ）。一部の実施形態において、鋳型依存性シナリオの下で、プライマーと鋳型と組み合わせて使用することにより、ＤＮＡ合成用のプライマー／鋳型二重鎖（Ｐ／Ｔ二本鎖と略称する）を生成する。スキーム例では、イニシエーター又はプライマーの伸長は、それぞれ通常の３’－ヒドロキシル或いは３’－ブロッキング化学部分を含むヌクレオチドモノマー（Ｎ）を使用し、鋳型非依存性又は鋳型依存性ポリメラーゼ（ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼなど）により所望の配列（Ｎ_－３～Ｎ_ｎ）を有するオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド鎖を合成する。核酸鎖配列は、選択されたエンドヌクレアーゼによる認識するために、所定の核酸塩基又は所定の脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）損傷を有する少なくとも１つのガイドヌクレオチド（Ｘ）を含むように構成される。一部の実施形態において、所定の核酸塩基は、デオキシウリジン又はデオキシイノシンであってもよく、脱プリン／脱ピリミジン損傷は、脱塩基部位或いはｄＳｐａｃｅｒであり得、認識可能な各デオキシヌクレオチド残基は異なる種類の対応するエンドヌクレアーゼにより特異的に認識され得る。よって、この方法及びキットは、使用者のニーズに応じて部位特異的に切断できるために、ポリメラーゼによりヌクレオチドモノマー（典型的ヌクレオチド及び非典型的ヌクレオチドを含む）をイニシエーターに取り込ことにより、カスタマイズのポリヌクレオシドを合成して得られるスキームを提供する。

【0064】

本発明者らは、意外に本明細書に開示されるエンドヌクレアーゼの核酸切断活性が、特定部位の切断可能領域（部位特異的切断可能領域）においてガイドヌクレオチドを認識できることを発見した。所望の核酸鎖を生成するためにヌクレオチドの付加／取り込みを複数のサイクルに十分に行った後、エンドヌクレアーゼに基づく切断反応を利用して、ガイドヌクレオチドに近く且つ部位特異性切断可能領域に含まれる核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖を切断及び／又は変性する。部位特異的切断可能領域におけるエンドヌクレアーゼに基づく認識するために用いられるガイドヌクレオチド(X)に対して、対応するエンドヌクレアーゼを使用して核酸切断が行われる。本開示の少なくとも１つの実施形態において、部位特異的切断可能領域を有する核酸鎖は、それぞれデオキシイノシン又はデオキシウリジンを含み、エンドヌクレアーゼで処理して所定の伸長核酸鎖を放出することができる。使用されるエンドヌクレアーゼは、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍａｃ）又はバチルス・プミルス（Ｂｐｕ）由来のエンドヌクレアーゼＱや、枯草菌（Ｂｓｕ）、大腸菌（Ｅｃｏ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）又はサーモコッカス・バロフィルス（Ｔｂａ）由来のエンドヌクレアーゼＶや、サーモコッカス・ガンマトレランス（Ｔｇａ）又はピロコッカス・アビッシ（Ｐａｂ）由来のＮｕｃＳエンドヌクレアーゼや、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｋｏ）由来のＥｎｄｏＭＳエンドヌクレアーゼであり得る。スキーム例では、エンドヌクレアーゼＥ１～Ｅ４は、ガイドヌクレオチド（Ｘ）を認識すると共に、Ｎ_２とＮ_１との間、ＸとＮ_－１との間、Ｎ_－１とＮ_－２との間及びＮ_－２とＮ_－３との間のホスホジエステル結合をそれぞれ切断する。一部の実施形態において、Ｘは、デオキシイノシン又はデオキシウリジンであってもよく、Ｅ１は、Ｂｓｕ ＥｎｄｏＶ、Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ、Ｐｆｕ ＥｎｄｏＶ或いはＴｂａ ＥｎｄｏＶであってもよく、Ｅ２は、Ｐｆｕ ＥｎｄｏＱ、Ｍａｃ ＥｎｄｏＱ、Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑであってもよく、Ｅ３は、Ｔｇａ ＮｕｃＳであってもよく、Ｅ４は、Ｔｋｏ ＥｎｄｏＭＳであってもよいが、本開示は、これらに限定されない。また、本明細書に開示されるエンドヌクレアーゼの熱安定性特性により、核酸鎖切断反応を広範囲の反応温度にわたって実施することが可能になる。本明細書に開示されるエンドヌクレアーゼの有利な特性と組み合わせて、本開示の方法は、酵素による核酸合成の様々な状況及び用途に使用することができる。エンドヌクレアーゼによる新たに合成された核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖の部位特異的切断は、所望のポリヌクレオチド断片を放出するだけでなく、残りの核酸鎖の３’末端に新しい遊離３’－ヒドロキシル基も生成され、該３’－ヒドロキシル基は、新たな合成反応ラウンドで使用される。したがって、ヌクレオチドモノマー付加の適切な設計と設定と組み合わせると、追加の酵素処理（ホスファターゼによる脱リン酸化など）に中断されることなく、酵素合成をサイクル効率的に行うことができる。したがって、本開示は、所定の核酸鎖又はポリヌクレオチド鎖を得ると共に、同じ工程で遊離ヒドロキシル基を有する再利用可能な核酸イニシエーターを再生してユーザーに需要の核酸合成を加速することにより、正確で、効率的で、コスト利益が高く、熱安定性の高い方法を提供する。

【実施例】

【0065】

本開示は、以下の実施例を介して詳細に説明される。しかしながら、これらの実施例は、本開示を単に例示するものであり、本開示の範囲及び意味をいかなる形によって限定するものではない。実際には、本明細書を読むと、当業者にとっては、本開示の多くの調整及び変形を明らかに理解でき、その範囲から逸脱することなく調整及び変形を行うことができる。

【0066】

〔Ａ．ヌクレオチドモノマーをイニシエーターに取り込むための核酸ポリメラーゼによる核酸合成〕
次の合成ポリヌクレオチドイニシエーターであるＦＡＭ－４５－ｍｅｒ ＤＮＡイニシエーターを本実施例における鋳型非依存性ＤＮＡ合成に使用する。

【0067】

ＦＡＭ－４５－ｍｅｒ ＤＮＡイニシエーター：

【0068】

【化1】

【0069】

この一本鎖４５－ｍｅｒポリヌクレオチドイニシエーターは、５’末端でビオチン基を用いて修飾されており、その内部における２３番目のチミン塩基（下線Ｔ）がフルオレセインアミダイト（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ａｍｉｄｉｔｅ，ＦＡＭ）色素を含み、且つその３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有する。また、イニシエーターの５’末端は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ Ｍ－２８０ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）ビーズに固定化されている。それにもかかわらず、他の実施形態において、該イニシエーターは、本明細書に開示されるヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）又はその他の蛍光レポーター色素で内部標識をすることができ、且つ該イニシエーターは、遊離形態となってもよく、或いは５’末端が本明細書に開示されるＤｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ －２８０ストレプトアビジンビーズ以外の他の固相担体に固定化されていてもよい。

【0070】

又、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（１μＭ）を使用して鋳型非依存性核酸合成反応を実施することにより、連結した３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシウリジン三リン酸（１００μＭ）をイニシエーターの３’末端に取り込み、反応は、１５分間続いた。合成イニシエーターの３’末端にデオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）を取り込んだ直後に鋳型非依存性核酸合成が可能であることを実証するために、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（１μＭ）を使用して３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシグアノシン三リン酸（１００μＭ）又はｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及ｄＴＴＰ）（１００μＭ）を３’末端にデオキシウリジン（Ｕ）が含まれたイニシエーターに段階的に取り込んだ。１０ｍＭのマンガンカチオンを添加することによって合成反応を開始し、次いで７５℃で１５分間インキュベートした。１０μＬの２×クエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）溶液（９５％脱イオンホルムアミド及び２５ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えることによって反応を停止させ、９８℃で１０分間熱変性を行う。反応生成物を１５％変性尿素ポリアクリルアミドゲルで分析し、ゲルの分析結果がＡｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）に示される。

【0071】

図３に示すように、レーンＳは、イニシエーターのみを示し、レーン１は、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）がＢファミリーＤＮＡポリメラーゼによりイニシエーターの３'末端に効率的に取り込まれたことを示す。また、レーン２及びレーン３は、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼが、イニシエーターの３’末端にデオキシウリジン（Ｕ）を取り込んだ直後に、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）及びｄＮＴＰ（Ｎ１、Ｎ２など）をそれぞれ取り込むことができることを示す。レーン１及びレーン２のポリヌクレオチドサンプルは、それぞれ配列番号２及び配列番号３に示される配列を有する。

【0072】

したがって、実施例は、使用者のニーズに応じて、少なくとも１つの例示的なガイドヌクレオチド（エンドヌクレアーゼによる認識のためにユーザーの所望の位置に位置する）を含むカスタマイズのポリヌクレオチド鎖を合成するために、ポリメラーゼにより典型（例えばｄＮＴＰ）又は非典型ヌクレオチド（例えばデオキシウリジン或いはデオキシグアノシン三リン酸）をイニシエーターに取り込む方法を実証した。

【0073】

上述の実施例は、鋳型非依存性核酸合成の結果を実証したが、他の実施形態において、イニシエーターを鋳型依存性核酸合成用に設計することにより、同様の結果を達成することもできる。例えば、イニシエーターの相補的な鋳型核酸は、固相担体に付着されるか（図２Ａ）、或いはイニシエーターにハイブリダイズして二重鎖又は二本鎖を形成することができる（図２Ｂ）。

【0074】

〔Ｂ．エンドヌクレアーゼにより新たに合成されたポリヌクレオチドを切断又は変性して、所望の核酸断片を放出し、次のラウンドの核酸合成のためのイニシエーターを再生〕
エンドヌクレアーゼによる、新しく合成されたポリヌクレオチドの切断／変性と合成イニシエーターの再生の実現可能性を実証するために、上記のセクションＡで述べた方法を使用してデオキシウリジン（Ｕ）又はデオキシイノシン（Ｉ）を含む、Ｈｅｘ色素で標識された一本鎖３８－ｍｅｒポリヌクレオチドを合成し、それぞれＨｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８－ｍｅｒ及びＨｅｘ－Ｔｏｐ－Ｉ３８－ｍｅｒと呼ばれる。これら２つのポリヌクレオチドは、鋳型非依存性核酸合成により得られた核酸生成物を表しており、該核酸生成物には、イニシエーターと新たに合成されたポリヌクレオチドとが含まれている。また、鋳型依存性核酸合成により得られた核酸生成物（イニシエーターと新たに合成したポリヌクレオチドを含む）を例示するために、該Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８－ｍｅｒとＨｅｘ－Ｔｏｐ－Ｉ３８－ｍｅｒ、及び相補的な一本鎖３８ｍｅｒの核酸（Ｂｏｔ－Ａ３８－ｍｅｒ）を、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１ｘＴＥ緩衝液の中で１：１．５のモル比でハイブリダイズさせた。Ｂｉｏ－ＲａｄサーマルサイクラーマシンでＤＮＡアニール反応を実施し、サンプル混合物を９５℃に３分間加熱し、徐々に４℃まで冷却（５°Ｃ／３０秒）することにより、二重鎖及び二本鎖の３８－ｍｅｒ核酸を形成した。以下の実施例において、これら２つの核酸生成物をＤＮＡ基質として使用した。

【0075】

実施例のポリヌクレオチド配列、緩衝液及び溶液シリーズを以下の表に示す。Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８－ｍｅｒ及びＨｅｘ－Ｔｏｐ－Ｉ３８－ｍｅｒは、５’末端にヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）標識を有し、３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有するが、本発明はこの態様に限定されない。他の実施形態において、イニシエーターの５’末端は、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）又は本明細書に開示される他の蛍光レポーター色素によって標識され得る。また、イニシエーターは、遊離型であっても、又は本明細書に開示される異なる実施形態の固相担体に固定化されてもよい。

【0076】

【表1】

【0077】

【表2】

【0078】

鋳型非依存性合成又は鋳型依存性核酸合成により得られた、新たに合成されたポリヌクレオチド（所定の核酸塩基又は脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）損傷を有するガイドヌクレオチドを含む）が認識され、切断されて次のラウンドの核酸合成のイニシエーターを再生できるかどうかをテストするため、次の実験手順を実施した。

【0079】

実施例１：２つの異なる反応温度においてＰｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖによるデオキシイノシンの認識及びＤＮＡ鎖の切断
サンプル群には、（１）陰性対照群となるＤＮＡ基質（Ｓ）のみ、（２）米国特許出願公開第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施可能な自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶ型（Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ）（配列番号７）、（３）ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）（配列番号８）、（４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手した大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｃ１）、及び（５）核酸生成物中のデオキシイノシン切除及びガイドヌクレオチド位置でＤＮＡ鎖切断の結果を表し、陽性対照群となるヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラー（ｈＡＡＧ）及びＥｎｄｏＶＩＩＩを含む酵素混合物（Ｃ２）が含まれた。各サンプル群について、１００ｎＭの一本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｉ３８－ｍｅｒ ＤＮＡ基質又は二本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｉ３８－ｍｅｒ／Ｂｏｔ－Ａ３８－ｍｅｒ ＤＮＡ基質を含むサンプル混合物（１０μＬ）と４００ｎＭのエンドヌクレアーゼを酵素反応緩衝液中でインキュベートした。サンプル混合物をそれぞれ３７℃及び７０℃で２０分間インキュベートし、等量（１０μＬ）の２×クエンチ溶液を添加することにより、各酵素反応を停止させた。

【0080】

合計２０μＬのサンプルを９５℃で１０分間変性し、各サンプル混合物を、１×ＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ Ｔｒｉｓ－アルカリ、９０ｍＭ 硼酸及び２ｍＭ ＥＤＴＡ）で８Ｍ尿素を含む２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した（各サンプル４μＬ）。次に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーでゲルイメージングの結果を分析した。

【0081】

図４Ａ及び以下の表３に示すように、Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ、及びＣ１は、３７℃の反応温度でデオキシイノシン（Ｉ）を効率的に認識すると共に、デオキシイノシン（Ｉ）からＤＮＡの３’末端（又は下流）へ数えて１番目のヌクレオチド（Ｇ）と２番目のヌクレオチド（Ｃ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２３－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドにおける核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。これに対して、Ｃ２は、３７℃の反応温度でデオキシイノシン（Ｉ）の切除とＤＮＡ鎖の切断のみを実施して１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出したが、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を生成できなかったため、新しいラウンドの核酸合成には使用できなかった。この実施例では、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖだけが、反応温度７０℃で上記のようにＤＮＡ鎖を効率的に切断或いは変性できることも示した。

【0082】

【表3】

【0083】

実施例２：２つの異なる反応温度におけるＰｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖによるデオキシウリジンの認識及びＤＮＡ鎖の切断
サンプル群には、（１）陰性対照群となるＤＮＡ基質（Ｓ）のみ、（２）米国特許出願公開第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施可能な自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶ型（Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ）、（３）ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）、（４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手した大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｃ１）、及び（５）陽性対照群となるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手したウラシル特異的切除試薬（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（Ｃ３）が含まれた。サンプル混合物（１０μＬ）は、１００ｎＭの一本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８ｍｅｒ ＤＮＡ基質又は二本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８－ｍｅｒ／Ｂｏｔ－Ａ３８－ｍｅｒ ＤＮＡ基質を含んだ。サンプルは、実施例１に記載されているように処理及び分析され、簡潔にするために、ここでその詳細な説明を省略する。

【0084】

図４Ｂ及び以下の表４に示すように、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖは、３７℃又は７０℃の反応温度でデオキシウリジン（Ｕ）を効率的に認識すると共に、デオキシウリジン（Ｕ）からＤＮＡの３’末端（又は下流）へ数えて１番目のヌクレオチド（Ｇ）と２番目のヌクレオチド（Ｃ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２３－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドの核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。これに対して、Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ及びＣ１は、このような部位特異的な切断或いは変性を示せなかった。又、Ｃ３は、３７℃の反応温度でデオキシウリジン（Ｕ）からＤＮＡの５’末端（又は上流）へ数えてデオキシウリジン（Ｕ）と１番目のヌクレオチド（Ｇ）との間のホスホジエステル結合のみを切断することにより、１７－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出したが、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を生成できなかったため、新しいラウンドの核酸合成に使用できなかった。

【0085】

【表4】

【0086】

実施例３：２つの異なる反応温度におけるＰｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑによるデオキシイノシンの認識及びＤＮＡ鎖の切断
サンプル群には、（１）ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ）（配列番号９）、（２）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手した大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｃ１）、（３）核酸生成物中のデオキシイノシン切除及びガイドヌクレオチド位置でＤＮＡ鎖切断の結果を表し、陽性対照群となるヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラー（ｈＡＡＧ）及びＥｎｄｏＶＩＩＩを含む酵素混合物（Ｃ２）が含まれた。サンプル混合物（１０μＬ）は、１００ｎＭの一本鎖Ｈｅｘ－ＴＯＰ－Ｉ３８ｍｅｒ ＤＮＡ基質又は二本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｉ３８－ｍｅｒ／Ｂｏｔ－Ａ３８－ｍｅｒ ＤＮＡ基質を含んだ。サンプルは、実施例１に記載されているように処理及び分析され、簡潔にするために、ここでその詳細な説明を省略する。

【0087】

図５Ａ及び以下の表５に示すように、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、３７℃又は７０℃の反応温度でデオキシイノシン（Ｉ）を効率的に認識すると共に、デオキシイノシン（Ｉ）からＤＮＡの５’末端へ数えてデオキシイノシン（Ｉ）と１番目のヌクレオチド（Ｃ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１７－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドの核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。Ｃ１は、デオキシイノシン（Ｉ）も認識でき、３７℃の反応温度でデオキシイノシン（Ｉ）からＤＮＡの３’末端へ数えて１番目のヌクレオチド（Ｇ）と２番目のヌクレオチド（Ｇ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２３－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドの核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。だだし、Ｃ１は、７０℃の反応温度でこのようなＤＮＡでの部位特異的な切断を示せなかった。また、Ｃ２は、デオキシイノシン（Ｉ）の切除とＤＮＡ鎖の切断を行って１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出することだけが示されており、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を生成できなかったため、新しいラウンドの核酸合成に使用できなかった。

【0088】

【表5】

【0089】

実施例４：２つの異なる反応温度におけるＰｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑによるデオキシウリジンの認識及びＤＮＡ鎖の切断
サンプル群には、（１）ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ）、（２）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手した大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｃ１）、（３）陽性対照群となるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手したウラシル特異的切除試薬（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（Ｃ３）が含まれた。サンプル混合物（１０μＬ）は、１００ｎＭの一本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８ｍｅｒ ＤＮＡ基質又は二本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８－ｍｅｒ／Ｂｏｔ－Ａ３８－ｍｅｒ ＤＮＡ基質を含んだ。サンプルは、実施例１に記載されているように処理及び分析され、簡潔にするために、ここでその詳細な説明を省略する。

【0090】

図５Ｂ及び以下の表６に示すように、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、３７℃又は７０℃の反応温度でデオキシウリジン（Ｕ）を効率的に認識すると共に、デオキシイノシン（Ｉ）からＤＮＡの５’末端へ数えてデオキシウリジン（Ｕ）と１番目のヌクレオチド（Ｃ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１７－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドの核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。ＤＮＡを部位特異的に切断するＣ３の能力は、１７ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出できるＰｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑの能力と類似しているが、Ｃ３は、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を生成できなかったため、新しいラウンドの核酸合成に使用できなかった。これに対して、Ｃ１は、３７℃又は７０℃の反応温度でＤＮＡ上での部位特異的切断を示せなかった。

【0091】

【表6】

【0092】

実施例５：２つの異なる反応温度におけるＴｂａ Ｅｎｄｏ Ｖによるデオキシイノシンの認識及びＤＮＡ鎖の切断
サンプル群には、（１）陰性対照群となるＤＮＡ基質（Ｓ）のみ、（２）米国特許出願公開第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施可能な自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶ型（Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ）、（３）サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ）（配列番号１０）、（４）核酸生成物中のデオキシイノシン切除及びガイドヌクレオチド位置でＤＮＡ鎖切断の結果を表し、陽性対照群となるヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラー（ｈＡＡＧ）及びＥｎｄｏＶＩＩＩを含む酵素混合物（Ｃ２）が含まれた。サンプル混合物（１０μＬ）は、１００ｎＭの一本鎖Ｈｅｘ－ＴＯＰ－Ｉ３８ｍｅｒ ＤＮＡ基質又は二本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｉ３８－ｍｅｒ／Ｂｏｔ－Ａ３８－ｍｅｒ ＤＮＡ基質を含んだ。サンプルは、実施例１に記載されているように処理及び分析され、簡潔にするために、ここでその詳細な説明を省略する。

【0093】

図６Ａ及び以下の表７示すように、Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ、及びＣ１は、３７℃の反応温度でデオキシイノシン（Ｉ）を効率的に認識すると共に、デオキシイノシン（Ｉ）からＤＮＡの３’末端へ数えて１番目のヌクレオチド（Ｇ）と２番目のヌクレオチド（Ｃ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２３－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドの核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。これに対して、Ｃ２は、反応温度でデオキシイノシン（Ｉ）の切除とＤＮＡ鎖の切断のみが示され、１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出したが、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を生成できなかったため、新しいラウンドの核酸合成には使用できなかった。また、Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ及びＣ１に比較して、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖのみは、上記のように７０℃の反応温度で効率よくＤＮＡ鎖を切断或いは変性することがわかった。

【0094】

【表7】

【0095】

実施例６：２つの異なる反応温度におけるＴｂａ Ｅｎｄｏ Ｖによるデオキシイノシンの認識及びＤＮＡ鎖の切断
サンプル群には、（１）陰性対照群となるＤＮＡ基質（Ｓ）のみ、（２）米国特許出願公開第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施可能な自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶ型（Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ）、（３）サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ）、（４）陽性対照群となるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手したウラシル特異的切除試薬（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（Ｃ３）が含まれた。サンプル混合物（１０μＬ）は、１００ｎＭの一本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８ｍｅｒ ＤＮＡ基質又は二本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８－ｍｅｒ／Ｂｏｔ－Ａ３８－ｍｅｒ ＤＮＡ基質を含んだ。サンプルは、実施例１に記載されているように処理及び分析され、簡潔にするために、ここでその詳細な説明を省略する。

【0096】

図６Ｂ及び以下の表８に示すように、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、７０℃の反応温度でデオキシウリジン（Ｕ）を効率的に認識すると共に、デオキシイノシン（Ｉ）からＤＮＡの３’末端へ数えて１番目のヌクレオチド（Ｇ）と２番目のヌクレオチド（Ｃ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２３－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドの核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。これに対して、Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ及Ｃ１は、７０℃の反応温度でＤＮＡの部位特異的切断を示せなかった。また、Ｃ３は、ＤＮＡにＰｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑと同様の部位特異的切断を示せて、１７－ｍｅｒ一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出したが、Ｃ３は、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を生成できなかったため、新しいラウンドの核酸合成に使用できなかった。

【0097】

【表8】

【0098】

Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖの実験結果は、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ及びＰｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑと同様である。実施例５及び実施例６に示すように（それぞれ図６Ａ及び６Ｂを参照）、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、デオキシイノシン又はデオキシウリジンを含むＤＮＡイニシエーター／プライマーからＤＮＡ鎖を効率的かつ部位特異的に切断した。逆に、大腸菌Ｅｎｄｏ Ｖは、デオキシイノシンを含むＤＮＡイニシエーター／プライマーのみからＤＮＡ鎖を切断した。また、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、３７℃及び７０℃の両方の温度でデオキシイノシン又はデオキシウリジンを含むＤＮＡイニシエーター／プライマーからＤＮＡ鎖を効率的かつ部位特異的に切断したが、大腸菌Ｅｎｄｏ Ｖは、３７℃のみでＤＮＡ鎖を切断した。同様に、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、デオキシイノシン又はデオキシウリジンを含むプライマー鋳型ＤＮＡ二重鎖も効率的に切断した。本明細書のｈＡＡＧプラスＥｎｄｏＶＩＩＩ及びＮＥＢ ＵＳＥＲの個々の結果、及び市販のＮＥＢ Ｅｃｏ Ｅｎｄｏ Ｖ酵素の結果に基づいて、完全なＤＮＡ断片及びＴｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ切断により生成されたＤＮＡ断片のゲルにおける相対的な位置を確認した。

【0099】

実施例１～６（それぞれ図４Ａ～６Ｂを参照）に示すように、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ、及びＴｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、デオキシイノシン又はデオキシウリジンを含む、合成された一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのＤＮＡ鎖を効率的かつ部位特異的に切断した。逆に、Ｅｃｏ Ｅｎｄｏ Ｖは、デオキシイノシンを含むＤＮＡのみからＤＮＡ鎖を切断した。また、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ、及びＴｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、３７℃及び７０℃の両方の温度でＤＮＡを効率的かつ部位特異的に切断できるが、大腸菌Ｅｎｄｏ Ｖは、３７℃のみでＤＮＡ鎖を切断した。また、イニシエーターが遊離型であっても固定化型であっても、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ、及びＴｂａ Ｅｎｄｏ ＶのＤＮＡ切断活性に影響を与えなかった。なお、陽性対照群Ｃ２及びＣ３は、どちらもＤＮＡを切断できたが、残りの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を生成できず、且つ新しいラウンドの核酸合成に使用できない。上述をまとめて、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ、及びＴｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、広い範囲の反応温度（超高温反応温度を含む）でガイドヌクレオチドを部位特異的に認識し、ガイドヌクレオチドの位置により核酸鎖を切断し、３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有するイニシエーターを効果的に再生できる。

【0100】

実施例７：Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖによるデオキシウリジンの認識及びＤＮＡ鎖の切断
サンプル群には、（１）陰性対照群となるＤＮＡ基質（Ｓ）のみ、（２）米国特許出願公開第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施可能な自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶ型（Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ）、（３）枯草菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）（配列番号１１）、（４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手した大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（Ｃ１）、（５）陽性対照群となるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手したウラシル特異的切除試薬（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（Ｃ３）が含まれた。サンプル混合物（１０μＬ）は、１００ｎＭの一本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８ｍｅｒ ＤＮＡ基質又は二本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８－ｍｅｒ／Ｂｏｔ－Ａ３８－ｍｅｒ ＤＮＡ基質を含んだ。サンプルは、実施例１に記載されているように処理及び分析され、簡潔にするために、ここでその詳細な説明を省略する。

【0101】

図７及び以下の表９に示すように、Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖは、デオキシウリジン（Ｕ）を効率的に認識すると共に、デオキシウリジン（Ｕ）からＤＮＡの３’末端へ数えて１番目のヌクレオチド（Ｇ）と２番目のヌクレオチド（Ｃ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２３－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドの核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。これに対して、Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ及びＣ１は、このような部位特異的な切断或いは変性を示せなかった。また、Ｃ３は、デオキシウリジン（Ｕ）からＤＮＡの５’末端へ数えてデオキシウリジン（Ｕ）と１番目のヌクレオチド（Ｇ）との間のホスホジエステル結合のみを切断して、１７－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出したが、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を生成できなかったため、新しいラウンドの核酸合成に使用できなかった。したがって、Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖは、ガイドヌクレオチドを部位特異的に認識し、ガイドヌクレオチドの位置により核酸鎖を切断すると共に、３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有するイニシエーターを効果的に再生できる。

【0102】

【表9】

【0103】

実施例８：３つの異なる反応温度におけＥｎｄｏ Ｖ及びＥｎｄｏ Ｑによるデオキシイノシンとデオキシウリジンの認識及びＤＮＡ鎖の切断
サンプル群には、（１）陰性対照群となるＤＮＡ基質（Ｓ）のみ、（２）米国特許出願公開第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施可能な自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶ型（Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶ）、（３）ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ）、（４）ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱ（Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ）、（５）サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶ（Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ）、及び（６）バチルス・プミルスエンドヌクレアーゼ Ｑ（Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑ）（配列番号１２）が含まれた。各サンプル群について、１００ｎＭの一本鎖Ｈｅｘ－Ｔｏｐ－Ｕ３８ｍｅｒ ＤＮＡ基質又はＨｅｘ－Ｔｏｐ－Ｉ３８ｍｅｒ ＤＮＡ基質を含むサンプル混合物（１０μＬ）と、２００ｎＭのエンドヌクレアーゼとを酵素反応緩衝液中でインキュベートした。サンプル混合物は、それぞれ３７℃、５５℃或いは６０℃で２０分間インキュベートされる。等量（１０μＬ）の２×クエンチ溶液を添加することにより、各酵素反応を停止させた。

【0104】

合計２０μＬのサンプルを９５℃で１０分間変性し、各サンプル混合物を、１×ＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ Ｔｒｉｓ－アルカリ、９０ｍＭ 硼酸及び２ｍＭ ＥＤＴＡ）で８Ｍ尿素を含む２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した（各サンプル４μＬ）。次に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナー（Ｃｙｔｉｖａ， Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ）でゲルイメージングの結果を分析した。

【0105】

結果は、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ及びＰｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑが５５℃及び６０℃で、デオキシイノシン又はデオキシウリジンを含む遊離型及固定化型のＤＮＡ鎖の両方を部位特異的に切断したこと、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖが５５℃でデオキシウリジンを含む遊離型及び固定化型のＤＮＡ鎖の両方を部位特異的に切断したこと及びＢｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑが３７℃でデオキシイノシン又はデオキシウリジンを含む遊離型及び固定化型のＤＮＡ鎖の両方を部位特異的に切断したことを示している。逆に、大腸菌Ｅｎｄｏ Ｖは、３７℃でデオキシイノシンを含むＤＮＡ鎖のみを切断したが、デオキシウリジンを含むＤＮＡ鎖を切断しなかった。

【0106】

図８Ａ、図８Ｂ及び以下の表１０と表１１に示すように、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ及びＴｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、デオキシイノシン（Ｉ）又はデオキシウリジン（Ｕ）を効率的に認識すると共に、デオキシイノシン（Ｉ）又はデオキシウリジン（Ｕ）からＤＮＡの３’末端へ数えて１番目のヌクレオチド（Ｇ）と２番目のヌクレオチド（Ｃ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１５－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２３－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドの核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。これに対して、Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、デオキシイノシンを含むＤＮＡのみに対してこのような活性を示せた。また、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ及びＢｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、どちらもデオキシイノシン（Ｉ）又はデオキシウリジン（Ｕ）を効率的に認識すると共に、デオキシイノシン（Ｉ）又はデオキシウリジン（Ｕ）からＤＮＡの５’末端へ数えてデオキシイノシン（Ｉ）又はデオキシウリジン（Ｕ）と１番目のヌクレオチド（Ｃ）との間のホスホジエステル結合を切断して、１７－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを放出し、残りの２１－ｍｅｒの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基があるため、直ちに次のラウンドの核酸合成の新しい（或いは再利用可能な）イニシエーターとして使用できる。

【0107】

更に、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ及びＰｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、両方とも、５５℃及び６０℃でデオキシイノシン又はデオキシウリジンを含むＤＮＡ鎖を部位特異的かつ効率的に切断し、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは５５℃及び６０℃でデオキシイノシン又はデオキシウリジンを含むＤＮＡ鎖を部位特異的かつ効率的に切断し、Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、３７℃でデオキシイノシン又はデオキシウリジンを含むＤＮＡ鎖を部位特異的かつ効率的に切断した。これに対して、大腸菌ＥｎｄｏＶは、３７℃でデオキシウリジンを含むＤＮＡ鎖のみを切断した。

【0108】

上述をまとめて、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖ、Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑ、Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖ、及びＢｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、広い範囲の反応温度（周囲反応温度を含む）でガイドヌクレオチドを部位特異的に認識し、ガイドヌクレオチドの位置により核酸鎖を切断し、３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有するイニシエーターを効果的に再生できる。

【0109】

【表10】

【0110】

【表11】

【0111】

本発明は、その実施形態により説明されたが、本開示の範囲から逸脱することなく、本開示の実施形態を様々に変更できることが理解されるべきである。したがって、記載された実施形態は、本開示の範囲内の変更を網羅することを意図するものであり、本発明を限定するものではない。したがって、特許請求の範囲は、そのような全ての変更を含むように最も広範に解釈されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0112】

【図1】本開示の少なくとも１つの実施形態による概略図である［イニシエーター（３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有する）から鋳型非依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）デノボ合成を行い、新たに合成されたＤＮＡ鎖を切断して所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを得、合成されたＤＮＡ鎖を切断した後、残った核酸鎖から新しい遊離３’－ヒドロキシル基を再生して所定のポリヌクレオチドを得ると共に、残りの核酸鎖を核酸合成の次のラウンドで新しい再利用可能なイニシエーターとして使用することを示す。核酸合成反応の前に、イニシエーターの５’末端が固相担体（ＳＳ）に固定される。Ｘは、ガイドヌクレオチドを表し、核酸鎖内のヌクレオチド位置に番号を付ける起点として使用される。Ｎは、取り込まれたヌクレオチドモノマーを表し、下付き添字番号は、核酸鎖の３’末端側又は下流に向かって昇順（例：Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４及びＮ_５）、下付き添字番号は、核酸鎖の５’末端側又は上流に向かって降順（例：Ｎ_－１、Ｎ_－２及Ｎ_－３）になる。Ｅ１～Ｅ４は、異なるエンドヌクレアーゼを表す。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３又はＥ４酵素によりそれぞれＮ_２とＮ_１との間、ＸとＮ_－１との間、Ｎ_－１とＮ_－２との間又はＮ_－２とＮ_－３との間のホスホジエステル結合で切断できることを含み、イニシエーターの５’末端は、固相担体（ＳＳ）に連結される酵素核酸合成プロセスを概略で説明する。］。

【図2A】本開示の少なくとも１つの実施形態による概略図である［イニシエーター（３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有する）（すなわちプライマー）からの鋳型指向性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＤＮＡ合成、所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを得るための新生ＤＮＡ鎖の切断、及び次のラウンドの核酸合成のための新しい再利用可能なイニシエーターを形成するための残りの核酸鎖の３’末端の遊離３’－ヒドロキシル基の再生を示す。イニシエーターの５’末端は、核酸合成反応の前に固相担体（ＳＳ）に固定される。したがって、鋳型ＤＮＡは、３’末端を介して固相担体に連結されるか（図２Ａ）、又はアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）法或いは他の既知のハイブリダイゼーション技術によりイニシエーターに部分的にハイブリダイズされる（図２Ｂ）。Ｘは、ガイドヌクレオチドを表し、核酸鎖に番号を付ける起点として使用される。Ｎは、取り込まれたヌクレオチドモノマーを表し、下付き添字番号は、核酸鎖の３’末端側又は下流に向かって昇順（例：Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４及びＮ_５）で、下付き添字番号は、核酸鎖の５’末端側又は上流に向かって降順（例：Ｎ_－１、Ｎ_－２及Ｎ_－３）になる。Ｅ１～Ｅ４は、異なるエンドヌクレアーゼを表す。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３又はＥ４酵素によりそれぞれＮ_２とＮ_１との間、ＸとＮ_－１との間、Ｎ_－１とＮ_－２との間又はＮ_－２とＮ_－３との間のホスホジエステル結合で切断できることを含む酵素核酸合成手段を概略で説明する。］。

【図2B】本開示の少なくとも１つの実施形態による概略図である［イニシエーター（３’末端に遊離３’－ヒドロキシル基を有する）（すなわちプライマー）からの鋳型指向性（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＤＮＡ合成、所望の配列及び長さのポリヌクレオチドを得るための新生ＤＮＡ鎖の切断、及び次のラウンドの核酸合成のための新しい再利用可能なイニシエーターを形成するための残りの核酸鎖の３’末端の遊離３’－ヒドロキシル基の再生を示す。イニシエーターの５’末端は、核酸合成反応の前に固相担体（ＳＳ）に固定される。したがって、鋳型ＤＮＡは、３’末端を介して固相担体に連結されるか（図２Ａ）、又はアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）法或いは他の既知のハイブリダイゼーション技術によりイニシエーターに部分的にハイブリダイズされる（図２Ｂ）。Ｘは、ガイドヌクレオチドを表し、核酸鎖に番号を付ける起点として使用される。Ｎは、取り込まれたヌクレオチドモノマーを表し、下付き添字番号は、核酸鎖の３’末端側又は下流に向かって昇順（例：Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４及びＮ_５）で、下付き添字番号は、核酸鎖の５’末端側又は上流に向かって降順（例：Ｎ_－１、Ｎ_－２及Ｎ_－３）になる。Ｅ１～Ｅ４は、異なるエンドヌクレアーゼを表す。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３又はＥ４酵素によりそれぞれＮ_２とＮ_１との間、ＸとＮ_－１との間、Ｎ_－１とＮ_－２との間又はＮ_－２とＮ_－３との間のホスホジエステル結合で切断できることを含む酵素核酸合成手段を概略で説明する。］。

【図3】本開示の少なくとも１つの実施形態による鋳型非依存性核酸合成の実現可能性を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［レーン（ｌａｎｅ）Ｓは、イニシエーターＤＮＡのみ（ビオチン－ＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡ）を示す。レーン１は、ポリメラーゼにより３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシウリジン（Ｕ）で伸長されたイニシエーターＤＮＡを示す。レーン２は、各ヌクレオチド取り込み及び３’－脱保護工程の後に、３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシウリジン（Ｕ）及び３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシグアノシン（Ｇ）で連続的に伸長されたイニシエーターＤＮＡを示す。レーン３は、３’－脱保護工程後に３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシウリジンで伸長され、続いてｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物）で伸長されたイニシエーターＤＮＡを示す。］。

【図4A】それぞれ実施例１及び２の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像であり、３７℃又は７０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ、図４Ａ）或いはデオキシウリジン（Ｕ、図４Ｂ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図４Ａ（１）及び図４Ｂ（１））又は固定化型（図４Ａ（２）及び図４Ｂ（２））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型（図４Ａ（３） 及び図４Ｂ（３））又は固定化型（図４Ａ（４）及び図４Ｂ（４））の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の部位特異的切断を示している。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｐｆｕ ＥｎｄｏＶは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ２は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーぜ（ｈｕｍａｎ ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ，ｈＡＡＧ）及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＥｎｄｏＶＩＩＩ）を含む自製の酵素混合物を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。

【図4B】それぞれ実施例１及び２の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像であり、３７℃又は７０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ、図４Ａ）或いはデオキシウリジン（Ｕ、図４Ｂ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図４Ａ（１）及び図４Ｂ（１））又は固定化型（図４Ａ（２）及び図４Ｂ（２））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型（図４Ａ（３） 及び図４Ｂ（３））又は固定化型（図４Ａ（４）及び図４Ｂ（４））の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の部位特異的切断を示している。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｐｆｕ ＥｎｄｏＶは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ２は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーぜ（ｈｕｍａｎ ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ，ｈＡＡＧ）及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＥｎｄｏＶＩＩＩ）を含む自製の酵素混合物を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。

【図5A】それぞれ実施例３及び４の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃又は７０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ、図５Ａ）或いはデオキシウリジン（Ｕ、図５Ｂ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図５Ａ（１）及び図５Ｂ（１））又は固定化型（図５Ａ（２）及び図５Ｂ（２））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型（図５Ａ（３）及び図５Ｂ（３））又は固定化型（図５Ａ（４）及び図５Ｂ（４））の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の部位特異的切断を示している。Ｐｆｕ ＥｎｄｏＱは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ２は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラー（ｈＡＡＧ）及びＥｎｄｏＶＩＩＩを含む自製の酵素混合物を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。

【図5B】それぞれ実施例３及び４の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃又は７０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ、図５Ａ）或いはデオキシウリジン（Ｕ、図５Ｂ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図５Ａ（１）及び図５Ｂ（１））又は固定化型（図５Ａ（２）及び図５Ｂ（２））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型（図５Ａ（３）及び図５Ｂ（３））又は固定化型（図５Ａ（４）及び図５Ｂ（４））の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の部位特異的切断を示している。Ｐｆｕ ＥｎｄｏＱは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ２は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラー（ｈＡＡＧ）及びＥｎｄｏＶＩＩＩを含む自製の酵素混合物を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。

【図6A】それぞれ実施例５及び６の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃又は７０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ、図６Ａ）或いはデオキシウリジン（Ｕ、図６Ｂ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図６Ａ（１）及び図６Ｂ（１））又は固定化型（図６Ａ（２）及び図６Ｂ（２））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型（図６Ａ（３）及び図６Ｂ（３））又は固定化型（図６Ａ（４）及び図６Ｂ（４））の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の部位特異的切断を示している。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ２は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラー（ｈＡＡＧ）及びＥｎｄｏＶＩＩＩを含む自製の酵素混合物を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。

【図6B】それぞれ実施例５及び６の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃又は７０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ、図６Ａ）或いはデオキシウリジン（Ｕ、図６Ｂ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図６Ａ（１）及び図６Ｂ（１））又は固定化型（図６Ａ（２）及び図６Ｂ（２））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型（図６Ａ（３）及び図６Ｂ（３））又は固定化型（図６Ａ（４）及び図６Ｂ（４））の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の部位特異的切断を示している。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｔｂａ Ｅｎｄｏ Ｖは、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ２は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラー（ｈＡＡＧ）及びＥｎｄｏＶＩＩＩを含む自製の酵素混合物を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。

【図7】それぞれ実施例７の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃で、例示的な酵素でデオキシウリジン（Ｕ）を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図７（１）の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、及び遊離型の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（図７（２）の部位特異的切断を示している。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｂｓｕ Ｅｎｄｏ Ｖは、枯草菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｃ１は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手したエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ Ｅｃｏ ＥｄｏＶ）（Ｃａｔ．＃Ｍ０３０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）を意味する。Ｃ３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからのウラシル特異的切除試薬（ＮＥＢ ＵＳＥＲ）（Ｃａｔ．＃Ｍ５５０５Ｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を意味する。］。

【図8A】実施例８の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃、５５℃及／又は６０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ，図８Ａ（１）、８Ａ（２）、８Ｂ（１）、及び８Ｂ（２））及びデオキシウリジン（Ｕ，図８Ａ（３）、８Ａ（４）、８Ｂ（３）、及び８Ｂ（４））を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図８Ａ（１）、８Ａ（３）、８Ｂ（１）、及８Ｂ（３））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は固定化型（図８Ａ（２）、８Ａ（４）、８Ｂ（２）、及８Ｂ（４））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）からの伸長ＤＮＡ鎖産物の部位特異的切断を示す。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｔｂａは、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱを意味する。Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、バチルス・プミルスエンドヌクレアーゼＱを意味する。］。

【図8B】実施例８の結果を示す尿素ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である［３７℃、５５℃及／又は６０℃で、例示的な酵素でそれぞれデオキシイノシン（Ｉ，図８Ａ（１）、８Ａ（２）、８Ｂ（１）、及び８Ｂ（２））及びデオキシウリジン（Ｕ，図８Ａ（３）、８Ａ（４）、８Ｂ（３）、及び８Ｂ（４））を優先的又は特異的に認識することにより、遊離型（図８Ａ（１）、８Ａ（３）、８Ｂ（１）、及８Ｂ（３））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は固定化型（図８Ａ（２）、８Ａ（４）、８Ｂ（２）、及８Ｂ（４））の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）からの伸長ＤＮＡ鎖産物の部位特異的切断を示す。Ｓは、基質ＤＮＡのみを意味する。Ｅｃｏ ＥｎｄｏＶは、米国特許出願第２０２１／０２５４１１４ Ａ１号を参照して実施できる自製の大腸菌エンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｖは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｔｂａは、サーモコッカス・バロフィルスエンドヌクレアーゼＶを意味する。Ｐｆｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、ピロコッカス・フリオサスエンドヌクレアーゼＱを意味する。Ｂｐｕ Ｅｎｄｏ Ｑは、バチルス・プミルスエンドヌクレアーゼＱを意味する。］。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【配列表】

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【国際調査報告】