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特表2025-504067Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ及びＬ－グルホシネート又はその中間体の製造におけるその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-06
(54)【発明の名称】Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ及びＬ－グルホシネート又はその中間体の製造におけるその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/06 20060101AFI20250130BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20250130BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250130BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250130BHJP
C12P 7/52 20060101ALI20250130BHJP
C12P 13/14 20060101ALI20250130BHJP
【ＦＩ】
C12N9/06 Z ZNA
C12N15/53
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12P7/52
C12P13/14 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024545216
(86)(22)【出願日】2023-01-30
(85)【翻訳文提出日】2024-09-27
(86)【国際出願番号】 CN2023073897
(87)【国際公開番号】W WO2023143621
(87)【国際公開日】2023-08-03
(31)【優先権主張番号】202210114692.7
(32)【優先日】2022-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523212656
【氏名又は名称】シャンハイ・チージョウ・ズユェ・バイオテクノロジー・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＱＩＺＨＯＵ ＺＩＹＵＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】ＲＯＯＭ ０８２９， ２ＮＤ ＦＬＯＯＲ， ＢＵＩＬＤＩＮＧ Ｆ， ＮＯ． ５５５ ＤＯＮＧＣＨＵＡＮ ＲＯＡＤ， ＭＩＮＨＡＮＧ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２０１１００， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ジャオ チ
(72)【発明者】
【氏名】ワン シュ
(72)【発明者】
【氏名】ティエン チェンファ
(72)【発明者】
【氏名】チャン ジャンビン
(72)【発明者】
【氏名】マ シュアイ
(72)【発明者】
【氏名】チョン ジン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD05
4B064AE19
4B064CA02
4B064CA19
4B064CB11
4B064CC24
4B064DA12
4B065AA26X
4B065AA26Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA28
4B065CA47
(57)【要約】
Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ及びＬ－グルホシネート又はその中間体の製造におけるその使用を提供する。配列番号１と比較してＤ－アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸序列は、Ｋ２９Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ／Ｃ／Ｌ；Ｖ４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｙ；Ｅ１９５Ｎ／Ｙ／Ｑ；Ｃ２３４Ｌ；Ｖ３２６Ｗから選択される１つ又は複数のアミノ酸残基の差異を含み、且つ配列番号１のアミノ酸配列で表されるＤ－アミノ酸オキシダーゼより活性及び／又は熱安定性が低くないＤ－アミノ酸オキシダーゼを提供する。熱安定性の高いＤ－アミノ酸オキシダーゼを提供し、酵素活性を向上させるだけではなく、酵素の使用温度範囲を拡大し、更に、低温で使用すると酵素の寿命を延ばすことができ、高温で使用すると酵素の触媒効率を向上させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１と比較してアミノ酸序列がＫ２９Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ／Ｃ／Ｌ；Ｖ４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｙ；Ｅ１９５Ｎ／Ｙ／Ｑ；Ｃ２３４Ｌ；Ｖ３２６Ｗから選択される１つ又は複数のアミノ酸残基差異を含み、且つ、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＤ－アミノ酸オキシダーゼより活性及び／又は熱安定性が低くない、
Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ。
【請求項2】
配列番号１と比較して、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列は、Ｖ４２Ｙ、Ｅ１９５Ｙ、Ｖ３２６Ｗ、Ｃ２３４Ｌから選択される２つ又は複数のアミノ酸残基の差異を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼ。
【請求項3】
前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、配列番号１と比較してＣ２３４Ｌのアミノ酸残基の差異を含み、更に、Ｖ４２Ｙ、Ｅ１９５Ｙ及びＶ３２６Ｗの１つ又は２つのアミノ酸残基の差異を含み、好ましくは、配列番号１と比較して前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、
Ｃ２３４Ｌ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ及びＥ１９５Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ及びＶ３２６Ｗ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｋ２９Ｃ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｋ２９Ｇ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｋ２９Ｌ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｖ３２６Ｗ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｖ４２Ｙ及びＥ１９５Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｅ１９５Ｙ及びＶ３２６Ｗ；
のいずれか１つの群から選択されるアミノ酸残基の差異を有することを特徴とする、請求項２に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼ。
【請求項4】
前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、配列番号１と比較してＥ１９５Ｙのアミノ酸差異を含み、更に、Ｖ４２Ｙ又はＶ３２６Ｗのアミノ酸残基差異を含み、好ましくは、配列番号１と比較して前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、
Ｅ１９５Ｙ及びＶ４２Ｙ；
Ｅ１９５Ｙ及びＶ３２６Ｗ；
Ｅ１９５Ｙ、Ｋ２９Ｑ及びＶ４２Ｙ；
Ｅ１９５Ｙ、Ｋ２９Ｗ及びＶ４２Ｙ；
Ｅ１９５Ｙ、Ｋ２９Ｙ及びＶ４２Ｙ；
のいずれか１つの群から選択されるアミノ酸残基の差異を有することを特徴とする、請求項２に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼ。
【請求項5】
配列番号１と比較してＤ－アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸序列は、Ｋ２９Ｇ；Ｋ２９Ｈ；Ｋ２９Ｉ；Ｋ２９Ｎ；Ｋ２９Ｑ；Ｋ２９Ｗ；Ｋ２９Ｙ；Ｖ４２Ｃ；Ｖ４２Ｄ；Ｖ４２Ｅ；Ｖ４２Ｈ；Ｖ４２Ｐ；Ｖ４２Ｙ；Ｅ１９５Ｈ；Ｅ１９５Ｎ；Ｅ１９５Ｙ；Ｅ１９５Ｑ；Ｃ２３４Ｌ；Ｖ３２６Ｗ；
のいずれか１つの群から選択されるアミノ酸残基の差異を有することを特徴とする、請求項１に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼ。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼをコードすることを特徴とする、単離された核酸。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項8】
請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載の組換え発現ベクターを含み、好ましくは、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、形質転換体。
【請求項9】
前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼを発現するのに適した条件下で請求項８に記載の形質転換体を培養することを含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか一項に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼの存在下で、基質を酸化反応させて２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩を得るステップを含み、好ましくは、
前記基質は、Ｄ－グルホシネート又はその塩であり、前記Ｄ－グルホシネート又はその塩は単独で存在してもよく、又はＬ－グルホシネート又はその塩と一緒に存在してもよく、例えば、前記基質はラセミグルホシネート又はその塩の形態で存在し、
及び／又は、前記酸化反応は換気条件下で実行され、前記換気は、好ましくは空気又は酸素を注入することであり、前記換気速度は、好ましくは０．５ＶＶＭ～１．５ＶＶＭであり、例えば１ＶＶＭであり、
及び／又は、上記酸化反応はカタラーゼの存在下で実行され、
及び／又は、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの菌体、粗酵素、純粋酵素又は固定化酵素の形態で存在し、
及び／又は、前記基質の濃度は、０．１～０．５ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１７ｍｏｌ／Ｌであり、
及び／又は、前記酸化反応の反応系のｐＨは７～９であり、好ましくは８であり、
及び／又は、前記酸化反応の反応系の温度は２０～５０℃であり、好ましくは２５℃であり、
より好ましくは、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの菌体と前記基質の質量比は１：（０．５～３）であり、例えば１：１であり、及び／又は、前記カタラーゼと前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの菌体の質量比は１：（２０～６０）であり、例えば１：４０であることを特徴とする、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩の製造方法。
【請求項11】
前記酸化反応の反応系は緩衝液を含み、前記緩衝液は、好ましくはリン酸緩衝液であり、例えば、リン酸二水素アンモニウム及びリン酸水素二アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムであることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項12】
請求項１０又は１１に記載の製造方法により２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩を得るステップ１、グルタミン酸脱水素酵素、無機アミノ供与体及び還元型補助酵素の存在下で、ステップ１で得られた２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩をアンモニア化反応させて前記Ｌ－グルホシネート又はその塩を得るステップ２
を含むことを特徴とする、Ｌ－グルホシネート又はその塩の製造方法。
【請求項13】
前記還元型補助酵素は、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨであり、及び／又は、前記無機アミノ供与体は、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムのうちの１つ又は複数であり、前記アンモニアの使用形態は、好ましくはアンモニア水であり、
及び／又は、前記アンモニア化反応の反応系のｐＨは７～１０であり、好ましくは８．４～８．６であり、
及び／又は、前記アンモニア化反応の反応温度は２８～３５℃であり、好ましくは３０～３３℃であることを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項14】
Ｌ－グルホシネート又はその塩、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩の製造における、請求項１～５のいずれか一項に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本出願は出願日が２０２２年１月３０である中国特許出願２０２２１０１１４６９２７の優先権を主張する。本出願は上記の中国特許出願の全文を引用する。
本出願は出願日が２０２２年１月３０である中国特許出願２０２２１０１１４６９２７の優先権を主張する。本出願は上記の中国特許出願の全文を引用する。
【0002】
本発明はバイオテクノロジーの分野に属し、具体的にはＤ－アミノ酸オキシダーゼ及びＬ－グルホシネート又はその中間体の製造におけるその使用に関する。
［背景技術］
グルホシネート及びグリホサート、パラコートは世界三大除草剤としてすべて非選択的である。その中で、パラコートの毒性が非常に強いため、最近多くの国で使用が厳しく制限又は禁止されており、グリホサートが広く使用されているが、中国では承認されたＡ級緑色食品リストからその使用を除外している。グルホシネートは、活性が高く除草スペクトルが広範囲で環境適合性に優れるなど特徴を持っており、グリホサートより速い速度で除草活性を発揮し、グリホサートに抵抗性のある雑草がある地域でも使用できるため、グルポシネートは市場開発の可能性が大きく、適用見通しが広い。
［背景技術］
グルホシネート及びグリホサート、パラコートは世界三大除草剤としてすべて非選択的である。その中で、パラコートの毒性が非常に強いため、最近多くの国で使用が厳しく制限又は禁止されており、グリホサートが広く使用されているが、中国では承認されたＡ級緑色食品リストからその使用を除外している。グルホシネートは、活性が高く除草スペクトルが広範囲で環境適合性に優れるなど特徴を持っており、グリホサートより速い速度で除草活性を発揮し、グリホサートに抵抗性のある雑草がある地域でも使用できるため、グルポシネートは市場開発の可能性が大きく、適用見通しが広い。
【0003】
２０２０年にグルホシネートのグローバル市場規模は１０．５億ドルに達し、過去６年間でグローバル市場化合物の成長率は６．３％に最も急速に成長する非選択的な除草剤となった。従って、Ｌ－グルホシネート製造プロセスを開発又は最適化することは、経済的利益を高め、使用コストを下げ、環境的圧力を減らすことに大きな意味がある。
【0004】
市販のグルホシネートは、ＤとＬの２つの異性体を有するラセミ体の混合物である。しかし、Ｌ型のみ活性を有し、土壌で容易に分解され毒性が低い。Ｌ－グルホシネートの製造には主に化学的方法と生物学的方法の２つの方法がある。グルホシネートの化学生産は主にＳｔｒｅｃｋｅｒプロセスと熱分解－ＡＣＡプロセスを含む。その中でＳｒｅｃｋｅｒプロセスは複雑であり、可燃性及び爆発性原料が使用され、製品の収率は低い。熱分解－ＡＣＡプロセスは複雑であり、メチルジクロロホスフィン（ＭＤＰ）はこのプロセスの前段階で重要な中間体であり、プロセスの技術的障壁である。生物学的方法は反応条件が穏やかで、生産工程が簡単であり、生成物の分離が容易であり、収率が低く、コストが高く、まだ産業化されていない。
【0005】
ＣＮ１０５６０３０１５Ａでは、２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスホノ）酪酸（ＰＰＯ）及びその塩を基質として使用し、アラニンをアミノ供与体として使用し、体外トランスアミナーゼ又は体外でトランスアミナーゼを発現する細胞を使用して基質を触媒し、アラニンとトランスアミナーゼ反応を行い、Ｌ－グルホシネートを得た。ＣＮ１０６９７８４５３Ｂでは、アミノ酸脱水素酵素を使用してＬ－グルホシネートを製造する方法を提供し、当該方法は基質として２－カルボニル－４－（ヒドロキシメチルホスホノ）酪酸又はその塩を用いたトランスアミネーション反応を行ってＬ－グルホシネートを得た。この方法は原料転化率が高いが、基質合成プロセスが複雑でコストが高い。
【0006】
【化1】
【0007】
ＵＳ９８３４８０２Ｂ２では、原料としてＤ、Ｌ－グルホシネートを使用し、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ突然変異体の触媒作用により中間生成物ＰＰＯが生成され、ＰＰＯがアミノ酸アミノトランスフェラーゼにより触媒されてＬ－グルホシネートが生成されることが発明された。この方法による反応で得られた組成物は、Ｌ－グルホシネート、Ｄ－グルホシネート、ＰＰＯを含み、ここで、Ｌ－グルホシネートの含有量は８０％以上に達し、Ｄ－グルホシネートの含有量は１０％未満であり、ＰＰＯの含有量は２０％未満である。しかしながら、その酵素活性の安定性は依然として改善の必要がある。
【0008】
【化2】
【0009】
従って、酵素活性の安定性が高く、Ｄ－グルホシネート変換率が高く、Ｌ－グルホシネートのｅｅ値が高いＤ－アミノ酸オキシダーゼの発見が緊急に求められる。
［発明の概要］
本発明が解決しようとする技術的問題は、先行技術におけるＤ－アミノ酸オキシダーゼの酵素活性が低く、酵素活性の安定性が悪く、Ｌ－グルホシネート収率が低いなどの欠点を克服するためである。上記の技術的問題を解決するために、本発明はＤ－アミノ酸オキシダーゼ及びＬ－グルホシネート又はその中間体の製造におけるその使用を提供する。熱安定性のより高いＤ－アミノ酸オキシダーゼを使用すると、酵素活性を向上させるだけではなく、酵素の使用温度範囲を拡大し、低温で使用すると酵素の寿命を延ばすことができ、高温で使用すると酵素の触媒効率を向上させることができる。熱安定性の高い酵素は化学反応速度を高め、製品品質を向上させ、活性が安定し、保存期間が長いなどの利点がある。
［発明の概要］
本発明が解決しようとする技術的問題は、先行技術におけるＤ－アミノ酸オキシダーゼの酵素活性が低く、酵素活性の安定性が悪く、Ｌ－グルホシネート収率が低いなどの欠点を克服するためである。上記の技術的問題を解決するために、本発明はＤ－アミノ酸オキシダーゼ及びＬ－グルホシネート又はその中間体の製造におけるその使用を提供する。熱安定性のより高いＤ－アミノ酸オキシダーゼを使用すると、酵素活性を向上させるだけではなく、酵素の使用温度範囲を拡大し、低温で使用すると酵素の寿命を延ばすことができ、高温で使用すると酵素の触媒効率を向上させることができる。熱安定性の高い酵素は化学反応速度を高め、製品品質を向上させ、活性が安定し、保存期間が長いなどの利点がある。
【0010】
本発明の第１の方面は、配列番号１と比較してアミノ酸配列がＫ２９Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ／Ｃ／Ｌ；Ｖ４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｙ；Ｅ１９５Ｎ／Ｙ／Ｑ；Ｃ２３４Ｌ；Ｖ３２６Ｗから選択される１つ又は複数のアミノ酸残基差異を含み、
且つ、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＤ－アミノ酸オキシダーゼより活性及び／又は熱安定性が低くない、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼを提供する。
且つ、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＤ－アミノ酸オキシダーゼより活性及び／又は熱安定性が低くない、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼを提供する。
【0011】
本発明において、アミノ酸残基間の「／」は、当該アミノ酸残基に対応する位置で異なるアミノ酸残基差異の選択を有することを意味する。例えば、Ｅ１９５Ｎ／Ｙ／Ｑは、位置１９５の差異がＮ、Ｙ又はＱであってもよいことを意味する。
【0012】
本発明のいくつかの好ましい実施例において、配列番号１と比較してＤ－アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列は、Ｖ４２Ｙ、Ｅ１９５Ｙ、Ｖ３２６Ｗ、Ｃ２３４Ｌから選択される２つ又は複数のアミノ酸残基の差異を含む。
【0013】
好ましくは、本発明の前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、配列番号１と比較してＣ２３４Ｌのアミノ酸残基の差異を含み、更に、Ｖ４２Ｙ、Ｅ１９５Ｙ及びＶ３２６Ｗのうちの１つ又は２つのアミノ酸残基の差異を含む。
【0014】
より好ましくは、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、配列番号１と比較して下記のいずれか１つの群から選択されるアミノ酸残基の差異を有する。
Ｃ２３４Ｌ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ及びＥ１９５Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ及びＶ３２６Ｗ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｋ２９Ｃ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｋ２９Ｇ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｋ２９Ｌ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｖ３２６Ｗ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｖ４２Ｙ及びＥ１９５Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｅ１９５Ｙ及びＶ３２６Ｗ。
Ｃ２３４Ｌ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ及びＥ１９５Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ及びＶ３２６Ｗ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｋ２９Ｃ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｋ２９Ｇ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｋ２９Ｌ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｖ３２６Ｗ及びＶ４２Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｖ４２Ｙ及びＥ１９５Ｙ；
Ｃ２３４Ｌ、Ｅ１９５Ｙ及びＶ３２６Ｗ。
【0015】
本発明の他のいくつかの好ましい実施形態において、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、配列番号１と比較してＥ１９５Ｙのアミノ酸差異を含み、更に、Ｖ４２Ｙ又はＶ３２６Ｗのアミノ酸残基差異を含み、
好ましくは、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、配列番号１と比較して下記のいずれか１つの群から選択されるアミノ酸残基の差異を有する。
好ましくは、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、配列番号１と比較して下記のいずれか１つの群から選択されるアミノ酸残基の差異を有する。
【0016】
Ｅ１９５Ｙ及びＶ４２Ｙ；
Ｅ１９５Ｙ及びＶ３２６Ｗ；
Ｅ１９５Ｙ、Ｋ２９Ｑ及びＶ４２Ｙ；
Ｅ１９５Ｙ、Ｋ２９Ｗ及びＶ４２Ｙ；
Ｅ１９５Ｙ、Ｋ２９Ｙ及びＶ４２Ｙ。
Ｅ１９５Ｙ及びＶ３２６Ｗ；
Ｅ１９５Ｙ、Ｋ２９Ｑ及びＶ４２Ｙ；
Ｅ１９５Ｙ、Ｋ２９Ｗ及びＶ４２Ｙ；
Ｅ１９５Ｙ、Ｋ２９Ｙ及びＶ４２Ｙ。
【0017】
本発明の他のいくつかの好ましい実施形態において、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、配列番号１と比較して下記のいずれか１つの群から選択されるアミノ酸残基の差異を有する。
Ｋ２９Ｇ；Ｋ２９Ｈ；Ｋ２９Ｉ；Ｋ２９Ｎ；Ｋ２９Ｑ；Ｋ２９Ｗ；Ｋ２９Ｙ；Ｖ４２Ｃ；Ｖ４２Ｄ；Ｖ４２Ｅ；Ｖ４２Ｈ；Ｖ４２Ｐ；Ｖ４２Ｙ；Ｅ１９５Ｈ；Ｅ１９５Ｎ；Ｅ１９５Ｙ；Ｅ１９５Ｑ；Ｃ２３４Ｌ；Ｖ３２６Ｗ。
Ｋ２９Ｇ；Ｋ２９Ｈ；Ｋ２９Ｉ；Ｋ２９Ｎ；Ｋ２９Ｑ；Ｋ２９Ｗ；Ｋ２９Ｙ；Ｖ４２Ｃ；Ｖ４２Ｄ；Ｖ４２Ｅ；Ｖ４２Ｈ；Ｖ４２Ｐ；Ｖ４２Ｙ；Ｅ１９５Ｈ；Ｅ１９５Ｎ；Ｅ１９５Ｙ；Ｅ１９５Ｑ；Ｃ２３４Ｌ；Ｖ３２６Ｗ。
【0018】
本発明の第２の方面は、本発明の第１の方面に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼをコードする単離された核酸を提供する。
本発明の第３の方面は、本発明の第２の方面に記載の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明の第３の方面は、本発明の第２の方面に記載の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
【0019】
本発明の第４の方面は、本発明の第２の方面に記載の核酸又は本発明の第３の方面に記載の組換え発現ベクターを含む形質転換体を提供する。
本発明に記載の形質転換体の宿主細胞は、本技術分野で通常のものであってもよく、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
本発明に記載の形質転換体の宿主細胞は、本技術分野で通常のものであってもよく、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【0020】
本発明の第５の方面は、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼを発現するのに適した条件下で本発明の第４の方面に記載の形質転換体を培養することを含む、本発明に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼの製造方法を提供する。
【0021】
本発明の第６の方面は、本発明の第１の方面に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼの存在下で、基質を酸化反応させて２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩を得るステップを含む、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩の製造方法を提供する。
【0022】
前記基質は、好ましくはＤ－グルホシネート又はその塩であり、前記Ｄ－グルホシネート又はその塩は単独で存在してもよく、又はＬ－グルホシネート又はその塩と一緒に存在してもよく、例えば、前記基質はラセミ体グルホシネート又はその塩の形態で存在する。
【0023】
前記酸化反応は、好ましくは換気条件下で実行され、前記換気は、好ましくは空気又は酸素を注入することであり、前記換気速度は、好ましくは０．５ＶＶＭ～１．５ＶＶＭであり、例えば１ＶＶＭである。
【0024】
上記酸化反応は、好ましくはカタラーゼの存在下で実行される。
前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、好ましくは、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの菌体、粗酵素、純粋酵素又は固定化酵素の形態で存在する。
前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼは、好ましくは、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの菌体、粗酵素、純粋酵素又は固定化酵素の形態で存在する。
【0025】
前記基質の濃度は、好ましくは０．１～０．５ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１７ｍｏｌ／Ｌである。
前記酸化反応の反応系のｐＨは、好ましくは７～９であり、例えば８である。
前記酸化反応の反応系のｐＨは、好ましくは７～９であり、例えば８である。
【0026】
前記酸化反応の反応系の温度は、好ましくは２０～５０℃であり、例えば２５℃である。
いくつかの好ましい実施形態において、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの菌体と前記基質の質量比は１：（０．５～３）であり、例えば１：１である。
いくつかの好ましい実施形態において、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの菌体と前記基質の質量比は１：（０．５～３）であり、例えば１：１である。
【0027】
いくつかのより好ましい実施形態において、前記カタラーゼと前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの菌体の質量比は１：（２０～６０）であり、例えば１：４０である。
前記酸化反応の反応系は、好ましくは緩衝液を更に含み、前記緩衝液は、当技術分野で通常のものであってよく、好ましくはリン酸緩衝液であり、例えばリン酸二水素アンモニウム及びリン酸水素二アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムである。
前記酸化反応の反応系は、好ましくは緩衝液を更に含み、前記緩衝液は、当技術分野で通常のものであってよく、好ましくはリン酸緩衝液であり、例えばリン酸二水素アンモニウム及びリン酸水素二アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムである。
【0028】
前記緩衝液は反応系のｐＨを調節するために使用され、好ましくは、前記緩衝液のｐＨは８．０である。
本発明の第７の方面は、
本発明の第６の方面に記載の製造方法により２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩を得るステップ１、
グルタミン酸脱水素酵素、無機アミノ供与体及び還元型補助酵素の存在下で、ステップ１で得られた２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩をアンモニア化反応させて前記Ｌ－グルホシネート又はその塩を得るステップ２、
を含む、Ｌ－グルホシネート又はその塩の製造方法を提供する。
本発明の第７の方面は、
本発明の第６の方面に記載の製造方法により２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩を得るステップ１、
グルタミン酸脱水素酵素、無機アミノ供与体及び還元型補助酵素の存在下で、ステップ１で得られた２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩をアンモニア化反応させて前記Ｌ－グルホシネート又はその塩を得るステップ２、
を含む、Ｌ－グルホシネート又はその塩の製造方法を提供する。
【0029】
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記還元型補助酵素は、好ましくはＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨである。
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記無機アミノ供与体は、好ましくはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムのうちの１つ又は複数であり、前記アンモニアの使用形態は、好ましくはアンモニア水である。
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記無機アミノ供与体は、好ましくはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムのうちの１つ又は複数であり、前記アンモニアの使用形態は、好ましくはアンモニア水である。
【0030】
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記アンモニア化反応の反応系のｐＨは、好ましくは７～１０であり、より好ましくは８．４～８．６である。
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記アンモニア化反応の反応温度は、好ましくは２８～３５℃であり、より好ましくは３０～３３℃である。
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記アンモニア化反応の反応温度は、好ましくは２８～３５℃であり、より好ましくは３０～３３℃である。
【0031】
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記グルタミン酸脱水素酵素は、好ましくはＣＮ２０１９１０４３４３５０．１の突然変異体１～４である。
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記グルタミン酸脱水素酵素と前記基質Ｄ－グルホシネートとの質量比は、好ましくは１：（０．５～３）であり、例えば１：１．２５である。
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記グルタミン酸脱水素酵素と前記基質Ｄ－グルホシネートとの質量比は、好ましくは１：（０．５～３）であり、例えば１：１．２５である。
【0032】
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法において、前記基質Ｄ－グルホシネートと前記無機アミノ供与体とのモル比は、好ましくは１：（１～１．５）であり、例えば１：１である。
【0033】
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法は、好ましくは脱水素酵素及び水素供与体の存在下で、酸化型補助酵素を還元反応させて前記還元型補助酵素を得るステップを更に含む。
前記脱水素酵素は、好ましくはグルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素又はギ酸脱水素酵素である。
前記脱水素酵素は、好ましくはグルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素又はギ酸脱水素酵素である。
【0034】
前記水素供与体は、好ましくはグルコース、イソプロパノール又はギ酸塩である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、前記脱水素酵素がアルコール脱水素酵素である場合、前記水素供与体はイソプロパノールであり、前記脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である場合、前記水素供与体はグルコースであり、前記脱水素酵素がギ酸脱水素酵素である場合、前記水素供与体はギ酸塩である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、前記脱水素酵素がアルコール脱水素酵素である場合、前記水素供与体はイソプロパノールであり、前記脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である場合、前記水素供与体はグルコースであり、前記脱水素酵素がギ酸脱水素酵素である場合、前記水素供与体はギ酸塩である。
【0035】
本発明に記載のＬ－グルホシネート又はその塩の製造方法はステップを分けて実行されてもよい。例えば、まず酸化反応を実行して２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩を製造した後、アンモニア化反応を実行してＬ－グルホシネート又はその塩を製造し、更に、「ワンポット法」で実行することができ、例えば、全ての原料を混合してＬ－グルホシネート又はその塩を製造することができる。
【0036】
本発明の第８の方面は、Ｌ－グルホシネート又はその塩、２－オキソ－４－（ヒドロキシメチルオキシホスフィノ）酪酸又はその塩の製造における、本発明の第１の方面に記載のＤ－アミノ酸オキシダーゼの使用を提供する。
【0037】
本発明で言及したＤＡＡＯ酵素とＤ－アミノ酸オキシダーゼとは交換して使用することができる。
本発明におけるＤ－アミノ酸オキシダーゼ基質の量は、Ｄ－グルホシネート又はその塩を使用して計算される。
本発明におけるＤ－アミノ酸オキシダーゼ基質の量は、Ｄ－グルホシネート又はその塩を使用して計算される。
【0038】
本技術分野の常識に違反しない限り、前記各好ましい条件は、任意に組み合わせて、本発明の各好ましい実施例を得ることができる。
本発明で使用される試薬及び原料は市販品として入手できる。
本発明で使用される試薬及び原料は市販品として入手できる。
【0039】
本発明の積極的な進歩効果は下記のようである。熱安定性の高いＤ－アミノ酸オキシダーゼを提供して、酵素活性を向上させるだけではなく、酵素の使用温度範囲を拡大し、低温で使用する場合、酵素の寿命を延ばすことができ、高温で使用する場合、触媒効率を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【0040】
以下、実施例の形態によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を前記実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選ばれる。
【0041】
生成物Ｌ－グルホシネートのキラル分析及び濃度分析は、プレカラム誘導体化高速液体クロマトグラフィーによって実施され、具体的な分析方法は下記に示される通りである。
（１）クロマトグラフィー条件：Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ１８、３．５μｍ、１５０×４．６ｍｍ。移動相Ａ：０．１％のＴＦＡ＋Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％のＴＦＡ＋ＣＡＮ。検出波長：３４０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３０℃。
（１）クロマトグラフィー条件：Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ１８、３．５μｍ、１５０×４．６ｍｍ。移動相Ａ：０．１％のＴＦＡ＋Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％のＴＦＡ＋ＣＡＮ。検出波長：３４０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３０℃。
【0042】
（２）誘導体化試薬：Ｍａｒｆｅｙ試薬
（３）誘導体化反応：５０ｍｇの試料を秤量して２５ｍｌの容量フラスコに入れ、１５ｍｌの希釈溶液（純水：アセトニトリル＝５０：５０）を加えて５分間超音波処理した後、精製水を標線まで加えて希釈し、均一に混合した。１ｍＬの上記溶液を５ｍＬの容量フラスコに移し、１ｍＬのＭａｒｆｅｙ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ溶液及び０．１ｍＬの炭酸水素ナトリウム（１Ｍ）溶液を加え、カバーを覆い、５０℃のオーブンで遮光して１時間加熱させ、反応完了後、更に０．１ｍＬの塩酸溶液を加え、均一に混合した。
（３）誘導体化反応：５０ｍｇの試料を秤量して２５ｍｌの容量フラスコに入れ、１５ｍｌの希釈溶液（純水：アセトニトリル＝５０：５０）を加えて５分間超音波処理した後、精製水を標線まで加えて希釈し、均一に混合した。１ｍＬの上記溶液を５ｍＬの容量フラスコに移し、１ｍＬのＭａｒｆｅｙ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ溶液及び０．１ｍＬの炭酸水素ナトリウム（１Ｍ）溶液を加え、カバーを覆い、５０℃のオーブンで遮光して１時間加熱させ、反応完了後、更に０．１ｍＬの塩酸溶液を加え、均一に混合した。
【0043】
１ｍＬの上記混合溶液を秤量し、更に４ｍＬの希釈溶液を加え、均一に混合して注射瓶に注いだ。１０μＬを注入して分析した。
ＰＰＯはイオンペアクロマトグラフィーによって分析され、具体的な分析方法は下記に示される通りである。
ＰＰＯはイオンペアクロマトグラフィーによって分析され、具体的な分析方法は下記に示される通りである。
【0044】
クロマトグラフィー条件：ΜＬｔｉｍａｔｅ ＡＱ－Ｃ１８、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ；移動相：０．０５ｍｏｌ／Ｌ リン酸水素二アンモニウム ＰＨ＝３．６：１０％ 水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液：アセトニトリル＝９１：１：８；検出波長：２０５ｎｍ；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：２５℃。
【0045】
試料：５ｍｇ／ｍＬのＨ２Ｏ溶液。１０μＬを注入して分析した。
本発明の実験方法は、特に説明しない限り通常の方法であり、遺伝子クローニング作業については、具体的にＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋらが編集した『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』を参照することができる。
本発明の実験方法は、特に説明しない限り通常の方法であり、遺伝子クローニング作業については、具体的にＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋらが編集した『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』を参照することができる。
【0046】
本発明のアミノ酸の略語記号は、特に説明しない限り全て当技術分野の通常の記号であり、具体的な略語記号に対応するアミノ酸は表１に示される通りである。
【0047】
【表1】
【0048】
前記アミノ酸に対応するコドンも当該技術分野では通常であり、具体的なアミノ酸とコドンとの対応関係は表２に示される通りである。
【0049】
【表2】
【0050】
ｐＥＴ２８ａプラスミド及びｂｕｇｂｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬はＮｏｖａｇｅｎ社から購入し、ＮｄｅＩ酵素、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から購入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１コンピテント細胞はＢｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎｇ Ｇｕｏ Ｐｒｏｓｐｅｒｏｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入し、カタラーゼはＳｈａｎｄｏｎｇ Ｆｅｎｇｔａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。
【0051】
実施例１ Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）の製造
ＤＡＡＯ酵素工程菌は、特許ＣＮ１１１０１９９１６Ｂに開示されたｓｅｑ．７９を含む工程菌株に由来し、アミノ酸配列は配列番号１に示され、ヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。
ＤＡＡＯ酵素工程菌は、特許ＣＮ１１１０１９９１６Ｂに開示されたｓｅｑ．７９を含む工程菌株に由来し、アミノ酸配列は配列番号１に示され、ヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。
【0052】
ＬＢ液体培地組成物は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌであり、脱イオン水で溶解した後に定容し、使用のために１２１℃で２０分間滅菌した。固体培地は、２％寒天を加えたＬＢ培地である。
【0053】
上記ＤＡＡＯ酵素工程菌を平板プレートに画線活性化した後、単一コロニーを選択して５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１２時間振とうしながら培養し、接種量の２％を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１５０ｍＬの新鮮なＬＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が約０．８に達するまで３７℃で振とうし、３０℃に温度を下げ、最終濃度が０．５ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、１６時間誘導培養を実行し、培養完了後、培地を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を収集し、使用のために－２０℃の冷蔵庫で保存した。
【0054】
培養完了後、収集した菌体を５０ｍＭ ｐＨ ８．０のリン酸緩衝液で２回洗浄し、その後、５０ｍＬ ｐＨ ８．０のリン酸緩衝液に再懸濁し、均質化して破砕した後、破砕液を遠心分離して沈殿を除去して組換えＤＡＡＯ酵素を含む粗酵素液を得た。
【0055】
実施例２ Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）突然変異体の構築
１．工程菌の活性化とプラスミドの抽出
実施例１に記載の活性化ＤＡＡＯ酵素工程菌を５ｍＬのＬＢ培地を含む試験チューブに入れ、３７℃、２００ｒｐｍで８～１２時間培養した。培養菌体を得た後、ｓａｎｇｏｎｇプラスミド抽出キットの使用説明書に従ってプラスミドを抽出した。得られたプラスミドは点突然変異に直接使用するか、又は長期保存のために－８０℃の冷蔵庫に保存することができる。
１．工程菌の活性化とプラスミドの抽出
実施例１に記載の活性化ＤＡＡＯ酵素工程菌を５ｍＬのＬＢ培地を含む試験チューブに入れ、３７℃、２００ｒｐｍで８～１２時間培養した。培養菌体を得た後、ｓａｎｇｏｎｇプラスミド抽出キットの使用説明書に従ってプラスミドを抽出した。得られたプラスミドは点突然変異に直接使用するか、又は長期保存のために－８０℃の冷蔵庫に保存することができる。
【0056】
２．突然変異ライブラリー（Ｋ２９位置、Ｖ４２位置、Ｅ１９５位置、Ｃ２３４位置、Ｖ３２６位置）の構築
遺伝子の突然変異は、全プラスミドＰＣＲ法を使用して突然変異遺伝子を得た。
上記のステップで抽出したプラスミドをテンプレートとして使用し、突然変異したＤ－アミノ酸オキシダーゼ配列のＫ２９、Ｖ４２、Ｅ１９５、Ｃ２３４、Ｖ３２６位置を突然変異させる突然変異ライブラリーに対するＰＣＲプライマー配列を構築・設計し、標的突然変異の遺伝子を得た。プライマー配列は表３に示される通りである。
遺伝子の突然変異は、全プラスミドＰＣＲ法を使用して突然変異遺伝子を得た。
上記のステップで抽出したプラスミドをテンプレートとして使用し、突然変異したＤ－アミノ酸オキシダーゼ配列のＫ２９、Ｖ４２、Ｅ１９５、Ｃ２３４、Ｖ３２６位置を突然変異させる突然変異ライブラリーに対するＰＣＲプライマー配列を構築・設計し、標的突然変異の遺伝子を得た。プライマー配列は表３に示される通りである。
【0057】
【表3】
【0058】
ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれか一つのヌクレオチドを表し、ＭはＡ又はＣを表し、ＫはＧ又はＴを表し、これは、対応する部位で突然変異を起こすアミノ酸をコードするヌクレオチドに基づいて選択され、例えば、Ｋ２９－フォワードプライマーにおけるＮＮＫは、ＡＡＧ（リジン）、ＡＡＴ（アスパラギン酸）、ＡＧＧ（アルギニン）又はＡＧＴ（セリン）などを表すことができる。
ＰＣＲ増幅システムは下記に示される通りである。
ＰＣＲ増幅システムは下記に示される通りである。
【0059】
【表4】
【0060】
ＰＣＲ増幅手順は下記に示される通りである。
【0061】
【表5】
【0062】
ＤｐｎＩ酵素を加えて、ＰＣＲ産物を３７℃で２時間消化した。反応完了後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１コンピタント細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に播種し、３７℃で一晩培養し、菌を回収して突然変異ライブラリーを含む形質転換体を得た。
【0063】
３．組み合わせ突然変異
スクリーニングされた有益な突然変異は、ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを介して様々な突然変異の組み合わせを達成し、新しい突然変異形質転換体を形成した。
スクリーニングされた有益な突然変異は、ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを介して様々な突然変異の組み合わせを達成し、新しい突然変異形質転換体を形成した。
【0064】
実施例３ ハイスループット突然変異ライブラリーの予備スクリーニング
実施例２で得られた形質転換体を９６ウェルプレートに接種し、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとなるように加えた後、３０℃で一晩誘導した。次に菌を収集し、ｂｕｇｂｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬を加えて溶解させ、遠心分離して上清を取り、ＤＡＡＯ突然変異酵素溶液を得た。
実施例２で得られた形質転換体を９６ウェルプレートに接種し、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとなるように加えた後、３０℃で一晩誘導した。次に菌を収集し、ｂｕｇｂｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬を加えて溶解させ、遠心分離して上清を取り、ＤＡＡＯ突然変異酵素溶液を得た。
【0065】
熱安定性のスクリーニング方法：
上記の上清を６０℃の水浴に入れ、２０分間熱処理した。次に、「酵素活性検出分析」を使用して陽性クローンをスクリーニングした。
上記の上清を６０℃の水浴に入れ、２０分間熱処理した。次に、「酵素活性検出分析」を使用して陽性クローンをスクリーニングした。
【0066】
酵素活性検出分析：ｐＨが８．０である１００ｍＭ基質（Ｄ、Ｌ－グルホシネート、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｌａｄｄｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）１００μＬを採取し、更に、５０μＬの発色溶液（６０ｍｇ／ｍＬのＴＢＨＢＡ（３－ヒドロキシ－２，４，６－トリブロモ安息香酸）及び１００ｍｇ／ｍＬの４－ＡＡＰ（４－アミノアンチピリン含有）及び２５μＬのＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、０．１ｍｇ／ｍＬ）を加え、最後に２５μＬの上記ＤＡＡＯ突然変異体酵素溶液を加えて酵素プレート２００μＬ反応系を得、３０℃、ｐＨ８．０の条件でこれについて分析した。それぞれ０分と２０分に５１０ｎｍでの吸光度を記録し、差を確認した後、野生型を参照系として使用して陽性クローンをスクリーニングした。Ｅｎｚ．０１と同等又はそれ以上の酵素活性を有し、かつ改善された熱安定性を有する陽性クローンをスクリーニングして表６に示した。
【0067】
【表6】
【0068】
実施例４ 熱安定性が改善された突然変異体の再スクリーニング
突然変異体の再スクリーニングのための酵素活性検出方法：
５ｍＬの反応系に１ｍＬの５００ｍＭ Ｄ、Ｌ－グルホシネート（アンモニウム塩）、０．２５ｍＬの熱処理（６０℃、２０分）後のＤＡＡＯ突然変異体粗酵素液、１．２５ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、２．５ｍＬの発色色素溶液（６０ｍｇ／ｍＬのＴＢＨＢＡ及び１００ｍｇ／ｍＬの４－ＡＡＰ含有）を加え、反応媒体はｐＨが８．０であるリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液であり、３０℃のシェーカーで振とうしながら反応させ、２分毎に反応溶液の５１０ｎｍでの吸光度をスキャンし、吸光度と時間（ｍｉｎ）の酵素反応動力学曲線を作成し、曲線の傾きに基づいて酵素活性を計算した。
突然変異体の再スクリーニングのための酵素活性検出方法：
５ｍＬの反応系に１ｍＬの５００ｍＭ Ｄ、Ｌ－グルホシネート（アンモニウム塩）、０．２５ｍＬの熱処理（６０℃、２０分）後のＤＡＡＯ突然変異体粗酵素液、１．２５ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、２．５ｍＬの発色色素溶液（６０ｍｇ／ｍＬのＴＢＨＢＡ及び１００ｍｇ／ｍＬの４－ＡＡＰ含有）を加え、反応媒体はｐＨが８．０であるリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液であり、３０℃のシェーカーで振とうしながら反応させ、２分毎に反応溶液の５１０ｎｍでの吸光度をスキャンし、吸光度と時間（ｍｉｎ）の酵素反応動力学曲線を作成し、曲線の傾きに基づいて酵素活性を計算した。
【0069】
単位酵素活性の定義：特定の反応条件（３０℃）下で１分当たりに１μｍｏｌ Ｈ２Ｏ２を生成するのに必要な酵素の量であり、酵素活性の単位はＵである。
上記酵素活性測定方法に従って熱処理前及び熱処理後の酵素活性を検出し、Ｅｎｚ．１に対する熱安定性向上倍数を算出した。結果は下記の表７に示される通りである。＊は熱安定性が１～１．２倍（１．２を除く）向上したことを示し、＊＊は熱安定性が１．２～２倍（２を除く）向上したことを示し、＊＊＊は熱安定性が２倍以上向上したことを示した。熱安定性の増加倍数の計算方法：突然変異体熱処理後の酵素活性と処理前の酵素活性の比率／Ｅｎｚ．０１熱処理後の酵素活性と処理前の酵素活性の比。
上記酵素活性測定方法に従って熱処理前及び熱処理後の酵素活性を検出し、Ｅｎｚ．１に対する熱安定性向上倍数を算出した。結果は下記の表７に示される通りである。＊は熱安定性が１～１．２倍（１．２を除く）向上したことを示し、＊＊は熱安定性が１．２～２倍（２を除く）向上したことを示し、＊＊＊は熱安定性が２倍以上向上したことを示した。熱安定性の増加倍数の計算方法：突然変異体熱処理後の酵素活性と処理前の酵素活性の比率／Ｅｎｚ．０１熱処理後の酵素活性と処理前の酵素活性の比。
【0070】
【表7】
【0071】
上記の表に示されるように、ほとんどの単一点突然変異酵素と組み合わせ突然変異酵素は熱安定性の向上に有意な効果があり、Ｅｎｚ．２７、Ｅｎｚ．２９、Ｅｎｚ．３２がより良い効果を示すことがわかる。
【0072】
実験例５ Ｌ－グルホシネートの製造
本発明に係る反応経路は下記に示される通りである。
本発明に係る反応経路は下記に示される通りである。
【0073】
【化3】
【0074】
ラクトバチルスブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＫＢ２９０）由来のシクロペンタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＢＡＮ０５９９２．１）に基づいてアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を完全に合成した。
【0075】
ＬＢ液体培地組成物は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌであり、脱イオン水で溶解した後に静置し、使用のために１２１℃で２０分間滅菌した。
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子はｐＥＴ２８ａに連結され、酵素切断部位はＮｄｅＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩであり、組換えベクターを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピタント細胞に形質転換してアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む工程菌株を得た。アルコール脱水素酵素遺伝子を含む工程菌株を平板プレートに画線活性化した後、単一コロニーを選択して５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１２時間振とうしながら培養した。接種量の２％を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５０ｍＬの新鮮なＬＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が約０．８に達するまで３７℃で振とうし、最終濃度が０．５ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、１８℃で１６時間誘導培養を実行した。培養完了後、培地を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を収集し、使用のために－２０℃の超低温冷蔵庫で保存した。
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子はｐＥＴ２８ａに連結され、酵素切断部位はＮｄｅＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩであり、組換えベクターを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピタント細胞に形質転換してアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む工程菌株を得た。アルコール脱水素酵素遺伝子を含む工程菌株を平板プレートに画線活性化した後、単一コロニーを選択して５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１２時間振とうしながら培養した。接種量の２％を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５０ｍＬの新鮮なＬＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が約０．８に達するまで３７℃で振とうし、最終濃度が０．５ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、１８℃で１６時間誘導培養を実行した。培養完了後、培地を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を収集し、使用のために－２０℃の超低温冷蔵庫で保存した。
【0076】
酵素溶液の製造：実施例４でスクリーニングした酵素活性の高い菌体（酵素番号はＥｎｚ．２７、Ｅｎｚ．２９、Ｅｎｚ．３２）をｐＨ７．０の５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸アンモニウム緩衝液に入れて均質化し、菌体と緩衝液の比率は１：５（ｇ：ｍＬ）であり、均質化後凝集剤を加えて凝集し、遠心分離して上清を得た。
【0077】
１０Ｌのジャケット反応ケトルに４６００ｇの水を加え、０．２８ｇのリン酸二水素アンモニウムと５．５７ｇのリン酸水素二アンモニウムを入れて攪拌して透明に溶解させた後、反応ケトルに４００ｇのＤ、Ｌ－グルホシネート（アンモニウム塩）を入れて攪拌して溶解させ、アンモニア水で溶液のｐＨを７．９～８．１に調節し、反応ケトルに５ｇのカタラーゼ（酵素活性８０万μ／ｇ）を投入し、１０００ｍＬ（２００ｇ菌体）の突然変異体ＤＡＡＯ酵素溶液（Ｅｎｚ．２７、Ｅｎｚ．２９又はＥｎｚ．３２）を投入し、空気でバブリングさせ、換気量を１分当たり１反応体積に制御し、温度を２５℃に制御し、２０時間反応させた。
【0078】
温度を３０～３３℃に制御し、０．４ｇのＮＡＤＰ＋、７８ｇのイソプロパノール、５０ｇの塩化アンモニウムを加え、アンモニア水でｐＨを８．４～８．６に調節し、０．３５ｇのアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）菌体を加えた。温度とｐＨが正常になったところで、１６０ｇのグルタメート脱水素酵素菌体（当社ＣＮ２０１９１０４３４３５０．１の突然変異体１－４）を反応ケトルに投入して反応を開始させた。６時間反応させ、ＰＰＯ残量が≦２％であると検出した。
【0079】
【表8】
【0080】
反応結果は表８に示される通りであり、２４時間反応後のＥｎｚ．２７、Ｅｎｚ．２９及びＥｎｚ．３２のｅｅ値は全て９８％以上であり、Ｅｎｚ．１より有意に優れていることが示された。
【配列表】
【国際調査報告】