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特表2025-504072キニン又はその誘導体のポリエチレングリコール修飾体とその薬物への使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-06
(54)【発明の名称】キニン又はその誘導体のポリエチレングリコール修飾体とその薬物への使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20250130BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20250130BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20250130BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20250130BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20250130BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250130BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20250130BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47 ZNA
A61K38/08
A61K47/60
A61P9/00
A61P9/10
A61P43/00 111
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024545277
(86)(22)【出願日】2023-01-17
(85)【翻訳文提出日】2024-09-30
(86)【国際出願番号】 CN2023072604
(87)【国際公開番号】W WO2023143246
(87)【国際公開日】2023-08-03
(31)【優先権主張番号】202210113869.1
(32)【優先日】2022-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524159077
【氏名又は名称】江蘇衆紅生物工程創薬研究院有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＺＯＮＨＯＮ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ，ＩＮＣ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲馬▼ 永
(72)【発明者】
【氏名】庄 宇
(72)【発明者】
【氏名】王 俊
(72)【発明者】
【氏名】王 和
(72)【発明者】
【氏名】江 辰▲陽▼
(72)【発明者】
【氏名】▲許▼ 振
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA94
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB11
4C076CC11
4C076CC29
4C076EE23
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF63
4C076FF68
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA17
4C084BA42
4C084DB01
4C084MA52
4C084MA66
4C084NA03
4C084NA05
4C084NA12
4C084NA13
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZC161
4C084ZC162
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
キニン又はその誘導体のポリエチレングリコール修飾体とその薬物への使用。本発明はＰＥＧ修飾技術により、キニンの半減期を大幅に延長させ、同時にその生物学的活性を発揮させ、半減期が短いためドラッガビリティがないという問題を解決した。ＰＥＧ修飾剤はＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳ修飾剤を含むが、これらに限定されない。直鎖型又は分岐型のＰＥＧ修飾剤であってよい。本発明の改造したキニン変異体は受容体への親和性を保持しながら半減期が延長され、さらにＰＥＧ修飾後の薬効が野生型キニンより優れるので、キニンのドラッガビリティをさらに向上させた。本発明のキニンのＰＥＧ修飾体は様々な経路で投与しても顕著な薬効を発現する。特に、皮下注射、経口投与は臨床使用に便利で、患者のコンプライアンスを効果的に向上させ、脳卒中患者の回復期治療など長期的な治療投与に適している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンであって、前記ポリエチレングリコール修飾がＮ末端修飾であり、Ｃ末端修飾ではなく、前記リシルブラジキニン又はブラジキニンが野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンであり、又は野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに改造して得られた誘導体であることを特徴とする、ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項2】
請求項１に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンであって、ＰＥＧ修飾剤がＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳ修飾剤を含むが、これらに限定されないことを特徴とする、ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項3】
請求項１に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンであって、ＰＥＧ修飾剤が直鎖型又は分岐型のＰＥＧ修飾剤であることを特徴とする、ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項4】
請求項３に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンであって、ＰＥＧ修飾剤が直鎖型のＰＥＧ修飾剤であることを特徴とする、ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項5】
請求項１に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンであって、ＰＥＧ修飾剤の分子量が２ＫＤ～２０ＫＤであることを特徴とする、ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項6】
請求項１に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンであって、ＰＥＧ修飾剤の分子量が２ＫＤ、又は１０ＫＤであることを特徴とする、ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項7】
リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であって、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのアミノ酸配列中の任意の位置にシステインを導入したことを特徴とする、リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項8】
請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であって、野生型のリシルブラジキニンのアミノ酸配列の一位のＬｙｓをＣｙｓに突然変異したことを特徴とする、リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項9】
請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であって、野生型のリシルブラジキニンのＮ末端の１位と２位のアミノ酸残基との間に任意の数、任意の種類のアミノ酸を挿入し、又は野生型のブラジキニンのＮ末端の１位のアミノ酸残基の前に任意の数、任意の種類のアミノ酸を挿入したことを特徴とする、リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項10】
請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であって、野生型のリシルブラジキニンのＮ末端の１位と２位のアミノ酸残基との間に１個又は２個又は３個のアミノ酸を挿入し、又は野生型のブラジキニンのＮ末端の１位のアミノ酸残基の前に１個又は２個又は３個のアミノ酸を挿入したことを特徴とする、リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項11】
請求項９、１０のいずれか一項に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であって、前記挿入したアミノ酸がアルギニンであることを特徴とする、リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項12】
請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であって、２個あるいは２個以上のリシルブラジキニン単体を、又は２個あるいは２個以上のブラジキニン単体を、又はリシルブラジキニン単体とブラジキニン単体を繋ぎ合わせたことを特徴とし、前記リシルブラジキニン又はブラジキニンの単体が、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンであってよいし、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに一部のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異体であってもよい、リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項13】
請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であって、野生型リシルブラジキニンの６位のＰｈｅ又は野生型ブラジキニンの５位のＰｈｅを他の任意のアミノ酸に突然変異したことを特徴とする、リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項14】
請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であって、前記誘導体の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示した配列であることを特徴とする、リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項15】
請求項１～６のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンであって、前記リシルブラジキニン又はブラジキニンが請求項７～１４のいずれか一項に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であることを特徴とする、ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項16】
虚血性脳卒中の治療、予防、予後回復、又は再発防止のための請求項１～６、１５のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項17】
注射、経口で投与される請求項１～６、１５のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項18】
虚血性脳卒中の治療、予防、予後回復、又は再発防止のための請求項７～１３のいずれか一項に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項19】
注射、経口で投与される請求項７～１３のいずれか一項に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キニン又はその誘導体のポリエチレングリコール修飾体とその薬物への使用に関し、特に、ＰＥＧ修飾技術によってキニンのドラッガビリティを向上させることに関する。
【背景技術】
【0002】
カリクレイン－キニン系（ＫＫＳ，ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－Ｋｉｎｉｎ ｓｙｓｔｅｍ）は、生体の重要な調節系であり、心血管系、腎臓、神経系の機能調節などさまざまな生理的および病理的な過程に関与している。ＫＫＳ系には、カリクレイン（ＫＬＫ）、キニノゲン、キニン、キニン受容体（Ｂ１、Ｂ２受容体）及びキニナーゼが含まれる。その中で、カリクレイン、キニンがコアとなる構成因子である。現在、ヒト組織カリクレインは少なくとも１５のメンバー（ＫＬＫ１－ＫＬＫ１５）で構成されると考えられており、その中で組織カリクレイン１（ＫＬＫ１）に対する研究が比較的に多く行われている。ＫＬＫ１はキニノゲンをキニンに変換させ、対応する受容体に作用して一連の生物学的作用を発揮する。キニンは、人体中にごく微量に存在する活性ペプチドの一種である。よく研究されているキニンには、リシルブラジキニン（Ｌｙｓ－ＢＫ）、ブラジキニン（ＢＫ）とアンジオテンシンがある。
【0003】
リシルブラジキニンは、主にＫＬＫ１の触媒による低分子キニノーゲンＬＭＷＫの加水分解によって生成され、ＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲの配列を持つ１０個のアミノ酸からなる。リシルブラジキニンは生体内でアミノペプチダーゼによって切断されブラジキニン（ＲＰＰＧＦＳＰＦＲの９ペプチド・ユニット）となるが、両者とも血圧や炎症の調節など幅広い生理機能を持っている。具体的に言えば、両者はＧタンパク質共役型受容体と結合して、細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ １／２，ＥＲＫ１／２）、環状アデノシン－リン酸エフェクター結合タンパク質（ｃＡＭＰ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＥＢ）のリン酸化を活性化し、一酸化窒素（ＮＯ）、環状アデノシン－リン酸（ｃＡＭＰ）とプロスタサイクリンＩ２などのセカンド・メッセンジャーの放出を刺激し、レニン・アンジオテンシン系（ＲＡＳ）の作用に拮抗することを通して、小動脈の拡張、局所血流量の増加、血管透過性の増加、及び血管拡張などの生物学的効果を発揮する。
【0004】
生体内におけるリシルブラジキニンの分解には、主にアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ及びアンジオテンシンＡＣＥＩＩが関与しており、キニンの放出酵素系と分解酵素系により、生体内におけるブラジキニンの動的バランスを維持する。リシルブラジキニン、ブラジキニンを外因的に投与することは血管を弛緩させ、脳心血管疾患の治療へ応用する潜在力がある。しかし、リシルブラジキニンとブラジキニンは生体内での半減期がわずか数秒と極めて短く、キナーゼの加水分解によってはやく失活してしまうため、生物学的半減期の短さが原因でそのドラッガビリティが大きく制限される。
【0005】
現在、ペプチド薬物を長時間作用させる主な策略は、化学修飾法（ポリエチレングリコール修飾、ペプチド主鎖末端修飾、側鎖修飾、環化、アミノ酸置換、グリコシル化修飾などが含まれる）、マイクロスフェア包埋法（マイクロ・ナノ粒子包埋法のことで、脂質キャリア・ナノ粒子、ポリマー・キャリア・ナノ粒子、無機キャリア・ナノ粒子が含まれる）、タンパク質融合技術（現在、一般的に用いられている融合タンパク質はアルブミンと免疫グロブリン（ＩｇＧ）である）などがある。現在、各種の方法が用いられており、そ
れぞれに長所と短所があるが、マイクロ・ナノ粒子包埋法の応用潜在力が比較的に高いと文献に述べられている。（程念、胡中平ほか．ペプチド薬物の長時間作用化についての研究進展[J]．中国新薬雑誌2016年第25巻第22期）。
れぞれに長所と短所があるが、マイクロ・ナノ粒子包埋法の応用潜在力が比較的に高いと文献に述べられている。（程念、胡中平ほか．ペプチド薬物の長時間作用化についての研究進展[J]．中国新薬雑誌2016年第25巻第22期）。
【0006】
アミノ酸置換によって酵素切断部位を除去してペプチドが分解されないようにすることは、ペプチドの生体内での半減期を延長する効果的な方法である。Ｌｏｂｒａｄｉｍｉｌは、ＢＫのアミノ酸配列の３位（Ｐｒｏ）、５位（Ｐｈｅ）、８位（Ｐｈｅ）、９位（Ａｒｇ）をそれぞれ非天然アミノ酸に突然変異して、ＢＫの生体内半減期を延長した薬物である。その主な効果は、血液脳関門の透過性を高め、カルボプラチンベースの化学療法と併用して小児脳腫瘍を治療することであり、安全性は比較的良好であったが、有効性はエンドポイントに達しておらず（Cancer Chemother. Pharmacol. 2006,58:343-347）、第２相臨床試験終了後に当該プロジェクトが中止された。２０１１年にＦＤＡが販売承認したイカチバント（Ｉｃａｔｉｂａｎｔ）もブラジキニンをもとにした薬物である。これはＢＫのアミノ酸配列の３位（Ｐｒｏ）、５位（Ｐｈｅ）、７位（Ｐｒｏ）、８位（Ｐｈｅ）をそれぞれ非天然アミノ酸に突然変異して体内半減期を延長した薬物であり、適応症は遺伝性血管性浮腫という稀な疾患である。この薬物分子はＢ２受容体の選択的な競合的拮抗剤であり、ブラジキニンとは逆の作用を果たす。現在、アミノ酸突然変異によりＬＢＫ／ＢＫの生体内半減期を延長して血管拡張の効果を発揮することを臨床の治療に成功に応用した報告がまだない。
【0007】
ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）による修飾は、タンパク質の生体内での半減期を延長し、安定性を向上させる方法の一つである。現在販売されているＰＥＧ修飾タンパク質の薬物が十数種類ある。しかし、ＰＥＧ修飾ペプチドの薬物はまだ少ない。ペプチドは一般的に体内の受容体に結合することで生物学的機能を発揮する。ペプチド分子が小さいため、ＰＥＧ修飾はペプチドの受容体への結合に影響を及ぼすかねない。その結果、ペプチドの生物学的活性が失われてしまう。例えば、ブラジキニンはわずか９個のアミノ酸からなり、分子構造も小さい。国内外において、ポリエチレングリコール化リシルブラジキニン又はブラジキニンに関する研究報告はまだない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】程念、胡中平ほか．ポリペプチド薬物の長時間作用化についての研究進展[J]．中国新薬雑誌2016年第25巻第22期
【非特許文献2】Cancer Chemother. Pharmacol. 2006,58:343-347
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明が解決しようとする技術的課題は、リシルブラジキニン又はブラジキニンの半減期を延長し、同時にその生体内での生物学的活性を発揮し、そのドラッガビリティ上の問題を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は一方で、ＰＥＧ修飾技術により、リシルブラジキニン又はブラジキニンの半減期を顕著に延長させ、同時にその生体内での生物学的活性を発揮させる。
【0011】
本発明が提供するポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンは、前記ＰＥＧ修飾はＮ末端修飾であり、Ｃ末端修飾ではなく、前記リシルブラジキニン又はブラジキニンは野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンであり、又は野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに改造（非ポリエチレングリコール修飾）し
て得られた誘導体である。前記誘導体は、本発明の実施例で例示した各種突然変異体のみならず、本発明のＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ突然変異体をもとにさらに改造して得られたペプチド、融合タンパク質（アルブミン融合、Ｆｃ融合などを含むが、これらに限定されない）、種々の形式の修飾体（ポリエチレングリコール修飾を除く）をも含む。前記誘導体は、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（受容体に対する結合活性）を保持している。実施例では、リシルブラジキニン又はブラジキニン及びそれらの数種の変異体に対して、そのＰＥＧ修飾体の安定性、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性及びｉｎ
ｖｉｖｏ薬効を検証した結果、すべて良好な安定性を示した。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を保持しているリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体はＰＥＧで修飾された後、全てリシルブラジキニン又はブラジキニンの半減期が延長され、同時にｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性の発揮することができる。一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を保持していない他のリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体はＰＥＧで修飾された後、又はこれらのリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体自体（ＰＥＧで修飾されていない）は、全てｉｎ ｖｉｖｏ薬効を示さなかった。従って、当業者は、実施例で例示した特定のリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体に限定されることなく、受容体に対する結合活性を保持している他のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であれば、ポリエチレングリコールで修飾された後、全てリシルブラジキニン又はブラジキニンの半減期が延長され、同時にｉｎ ｖｉｖｏにおける生物活性を発揮することができると合理的に予想することができる。
て得られた誘導体である。前記誘導体は、本発明の実施例で例示した各種突然変異体のみならず、本発明のＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ突然変異体をもとにさらに改造して得られたペプチド、融合タンパク質（アルブミン融合、Ｆｃ融合などを含むが、これらに限定されない）、種々の形式の修飾体（ポリエチレングリコール修飾を除く）をも含む。前記誘導体は、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（受容体に対する結合活性）を保持している。実施例では、リシルブラジキニン又はブラジキニン及びそれらの数種の変異体に対して、そのＰＥＧ修飾体の安定性、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性及びｉｎ
ｖｉｖｏ薬効を検証した結果、すべて良好な安定性を示した。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を保持しているリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体はＰＥＧで修飾された後、全てリシルブラジキニン又はブラジキニンの半減期が延長され、同時にｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性の発揮することができる。一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を保持していない他のリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体はＰＥＧで修飾された後、又はこれらのリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体自体（ＰＥＧで修飾されていない）は、全てｉｎ ｖｉｖｏ薬効を示さなかった。従って、当業者は、実施例で例示した特定のリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体に限定されることなく、受容体に対する結合活性を保持している他のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であれば、ポリエチレングリコールで修飾された後、全てリシルブラジキニン又はブラジキニンの半減期が延長され、同時にｉｎ ｖｉｖｏにおける生物活性を発揮することができると合理的に予想することができる。
【0012】
ＰＥＧ修飾剤はＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳ修飾剤を含むが、これらに限定されない。ＰＥＧ修飾剤は直鎖型又は分岐型であってよい。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤は直鎖型ＰＥＧ修飾剤である。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は２ＫＤ～２０ＫＤである。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は２ＫＤ～１０ＫＤである。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は２ＫＤ、１０ＫＤである。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤は直鎖型ＰＥＧ修飾剤である。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は２ＫＤ～２０ＫＤである。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は２ＫＤ～１０ＫＤである。
好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は２ＫＤ、１０ＫＤである。
【0013】
本発明はもう一方で、リシルブラジキニン又はブラジキニンのアミノ酸配列を最適化することにより、そのドラッガビリティをさらに向上させる。
【0014】
本発明は、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのアミノ酸配列中の任意の位置にシステイン（Ｃｙｓ）を導入して得られたリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体を提供する。システインを導入したリシルブラジキニン又はブラジキニンは、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬効評価において有意に利点を示した。好ましくは、野生型のリシルブラジキニンのアミノ酸配列の一位のＬｙｓをＣｙｓに突然変異する。即ち、アミノ酸配列をＣＲＰＰＧＦＳＰＦＲになるようにする。
【0015】
本発明はまた、野生型のリシルブラジキニンのＮ末端の１位と２位のアミノ酸残基との間に任意の数、任意の種類のアミノ酸を挿入して得られたリシルブラジキニン誘導体、即ちＫＸＲＰＰＧＦＳＰＦＲ、及び野生型のブラジキニンのＮ末端の１位のアミノ酸残基の前に任意の数、任意の種類のアミノ酸を挿入して得られたブラジキニン誘導体、即ちＸＲＰＰＧＦＳＰＦＲ、を提供する。Ｘは任意の数、任意の種類のアミノ酸を表す。Ｎ末端を延長したリシルブラジキニン又はブラジキニンがより良好な活性を有することは、実験結果により示されている。好ましくは、１個又は２個又は３個のアミノ酸を挿入する。好ましくは、１個又は２個のアルギニン（Ａｒｇ）を挿入する。
【0016】
本発明はまた、２個あるいは２個以上のリシルブラジキニン単体を、又は２個あるいは２個以上のブラジキニン単体を、又はリシルブラジキニン単体とブラジキニン単体を繋ぎ合わせたリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体（例えばｍ１４、ｍ１２）を提供する。前記リシルブラジキニン又はブラジキニン単体は、野生型のリシルブラジキニン又
はブラジキニンであってよいし、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに一部のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異体であってもよい。
はブラジキニンであってよいし、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに一部のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異体であってもよい。
【0017】
本発明はまた、野生型リシルブラジキニンの６位のＰｈｅ又は野生型ブラジキニンの５位のＰｈｅを他のアミノ酸、例えば非天然アミノ酸Ｉｇｌ（α－２－インドリルグリシン）、ＴＨＩ（β－２－チエニルアラニン）に突然変異したリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体を提供する。前記部位突然変異したＬＢＫ又はＢＫは生体内の酵素に認識されにくいため、その生体内での半減期が効果的に延長された。
【0018】
好ましくは、本発明のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示される配列である。
【0019】
本発明はまた、前記リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体を含む組成物を提供する。
【0020】
リシルブラジキニン又はブラジキニンは、対応する受容体に作用して一連の生理作用を発揮する。しかし、リシルブラジキニン及びブラジキニンは、生体内での半減期が数秒と極めて短く、キニナーゼによる加水分解によって速く失活してしまうため、生物学的半減期の短さにそのドラッガビリティが大きく制限される。本発明は、ポリエチレングリコール修飾技術により、リシルブラジキニン又はブラジキニンの生体内での半減期を大幅に延長させ、同時にリシルブラジキニン又はブラジキニンのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける生物学的活性をよく発揮させ、ＭＣＡＯ脳虚血再灌流モデルにおける脳梗塞症状を改善するｉｎ ｖｉｖｏ活性を顕著に発現し、単独のリシルブラジキニン又はブラジキニンでは半減期が短すぎてドラッガビリティがないという問題を解決した。
【0021】
本発明は、虚血性脳卒中の治療、予防、予後回復及び再発防止のための薬物の製造における、ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンの使用を提供する。前記リシルブラジキニン又はブラジキニンは、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンであってよいし、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに改造（非ポリエチレングリコール修飾）して得られた誘導体であってもよい。前記誘導体は、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（即ち、受容体に対する結合活性）を保持しており、本発明の実施例で例示した種々の突然変異体のみならず、本発明のＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ突然変異体をもとにさらに改造して得られたペプチド、融合タンパク質（アルブミン融合、Ｆｃ融合などを含むが、これらに限定されない）、種々の形式の修飾体（ポリエチレングリコール修飾体を除く）をも含む。
【0022】
好ましくは、前記リシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体及びそれらのＰＥＧ複合体は、注射、経口で投与される。
【0023】
従来技術と比較して、本発明には以下のようなメリットがある。
第一に、本発明はポリエチレングリコール修飾技術により、リシルブラジキニン又はブラジキニンの生体内での半減期を大幅に延長させ、同時にリシルブラジキニン又はブラジキニンの生物学的活性をよく発揮させ、単独のリシルブラジキニン又はブラジキニンでは半減期が短すぎてドラッガビリティがないという問題を解決した。Ｉｎ ｖｉｖｏ薬効については、リシルブラジキニン又はブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ修飾体は、ＭＣＡＯ脳虚血再灌流モデルにおける神経欠損症状に対して顕著な改善効果を示し、脳梗塞面積に対して顕著な改善効果を示した。
第一に、本発明はポリエチレングリコール修飾技術により、リシルブラジキニン又はブラジキニンの生体内での半減期を大幅に延長させ、同時にリシルブラジキニン又はブラジキニンの生物学的活性をよく発揮させ、単独のリシルブラジキニン又はブラジキニンでは半減期が短すぎてドラッガビリティがないという問題を解決した。Ｉｎ ｖｉｖｏ薬効については、リシルブラジキニン又はブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ修飾体は、ＭＣＡＯ脳虚血再灌流モデルにおける神経欠損症状に対して顕著な改善効果を示し、脳梗塞面積に対して顕著な改善効果を示した。
【0024】
第二に、本発明の改造したリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体は明らかに利点を持つ。それらの変異体は、受容体に対する親和性を保持しながら、血清系における安
定性が野生型より顕著に優れており、生体内での半減期の延長が示唆される。また、それらの変異体はＰＥＧで修飾された後、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのＰＥＧ修飾体よりもＩｎ ｖｉｖｏ薬効が優れている。
定性が野生型より顕著に優れており、生体内での半減期の延長が示唆される。また、それらの変異体はＰＥＧで修飾された後、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのＰＥＧ修飾体よりもＩｎ ｖｉｖｏ薬効が優れている。
【0025】
第三に、本発明のリシルブラジキニン又はブラジキニンのＰＥＧ修飾体は、静脈注射、皮下注射、経口投与などの様々な投与経路で投与しても顕著な薬効を発現することができる。特に、皮下注射、経口投与は、患者が注射を受けるために定期的に病院に行く必要がなく、在宅自己投与ができるため、臨床使用に便利で、患者のコンプライアンスを効果的に向上させ、脳卒中患者の回復期治療など長期的な治療投与にはより適している。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図2a】図２は、Ｌｙｓ－ＢＫ及びその変異体が下流のＥＲＫ１／２及びＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することを示す図である。その５つのシグナルの中で、β－ａｃｔｉｎは内部対照であり、ｐ－は対応するタンパク質のリン酸化を表し、ｃｏｎｔｒｏｌは緩衝液空白対照であり、Ｌｙｓ－ＢＫ－Ｍ０６－ＥＨはｍ０６と血清と混合してインキュベートした後のサンプルである。
【図2b】図２は、Ｌｙｓ－ＢＫ及びその変異体が下流のＥＲＫ１／２及びＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することを示す図である。その５つのシグナルの中で、β－ａｃｔｉｎは内部対照であり、ｐ－は対応するタンパク質のリン酸化を表し、ｃｏｎｔｒｏｌは緩衝液空白対照であり、Ｌｙｓ－ＢＫ－Ｍ０６－ＥＨはｍ０６と血清と混合してインキュベートした後のサンプルである。
【図2c】図２は、Ｌｙｓ－ＢＫ及びその変異体が下流のＥＲＫ１／２及びＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することを示す図である。その５つのシグナルの中で、β－ａｃｔｉｎは内部対照であり、ｐ－は対応するタンパク質のリン酸化を表し、ｃｏｎｔｒｏｌは緩衝液空白対照であり、Ｌｙｓ－ＢＫ－Ｍ０６－ＥＨはｍ０６と血清と混合してインキュベートした後のサンプルである。
【図2d】図２は、Ｌｙｓ－ＢＫ及びその変異体が下流のＥＲＫ１／２及びＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することを示す図である。その５つのシグナルの中で、β－ａｃｔｉｎは内部対照であり、ｐ－は対応するタンパク質のリン酸化を表し、ｃｏｎｔｒｏｌは緩衝液空白対照であり、Ｌｙｓ－ＢＫ－Ｍ０６－ＥＨはｍ０６と血清と混合してインキュベートした後のサンプルである。
【発明を実施するための形態】
【0027】
特に明記しない限り、本発明における技術用語又は略語は次の意味を持つ。
Ｌｙｓ－ＢＫ：野生型リシルブラジキニンであり、天然ヒトリシルブラジキニンのアミノ酸配列と一致し、そのアミノ酸配列はＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲである。
Ｌｙｓ－ＢＫ：野生型リシルブラジキニンであり、天然ヒトリシルブラジキニンのアミノ酸配列と一致し、そのアミノ酸配列はＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲである。
【0028】
ＢＫ：野生型ブラジキニンであり、天然ヒトブラジキニンのアミノ酸配列と一致し、そのアミノ酸配列はＲＰＰＧＦＳＰＦＲである。
【0029】
突然変異体：野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに一部のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異体である。
【0030】
誘導体：本発明の実施例で例示した各種突然変異体のみならず、本発明のＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ突然変異体をもとにさらに改造して得られたペプチド、融合タンパク質（アルブミン融合、Ｆｃ融合などを含むが、これらに限定されない）、種々の形式の修飾体（ポリエチレングリコール修飾を除く）をも含む。
【0031】
ポリエチレングリコール：略称がＰＥＧであり、通常、エチレンオキシドの重合により形成され、分岐型、直鎖型と多腕型がある。通常のポリエチレングリコールは両末端にヒドロキシ基があり、片末端をメチル基でブロックするとメトキシ・ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が得られる。
【0032】
ポリエチレングリコール修飾剤：略称がＰＥＧ修飾剤であり、官能基を持つポリエチレングリコール誘導体のことを指し、タンパク質とペプチドの薬物の修飾に用いられる活性化されたポリエチレングリコールである。本発明で使用するポリエチレングリコール修飾剤は、江蘇衆紅生物工程創薬研究院有限公司、又は北京鍵凱科技股▲ふん▼有限公司より購入している。特定の分子量であるＰＥＧ修飾剤の実際の分子量は、表示値の９０％～１１０％であってよい。例えばＰＥＧ５Ｋの分子量は４．５ｋＤａ～５．５ｋＤａであってよい。
【0033】
Ｍ－ＳＰＡ－５Ｋ：分子量が約５ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは９８～１２０の整数である。
【0034】
【化1】
【0035】
Ｍ－ＳＰＡ－２Ｋ：分子量が約２ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは３７～４５の整数である。
【0036】
Ｍ－ＳＰＡ－１０Ｋ：分子量が約１０ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは２００～２４５の整数である。
【0037】
Ｍ－ＳＰＡ－２０Ｋ：分子量が約２０ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートであり、構造式は式（１）に示される通りである。式中、ｎは４０５～４９５の整数である。
【0038】
Ｍ－ＳＣＭ－５Ｋ：分子量が約５ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルカルボキシメチレートであり、構造式は式（２）に示される通りである。式中、ｎは９９～１２０の整数である。
【0039】
【化2】
【0040】
Ｍ－ＳＳ－５Ｋ：分子量が約５ｋＤａの直鎖型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルサクシネートであり、構造式は式（３）に示される通りである。式中、ｎは９８～１１９の整数である。
【0041】
【化3】
【0042】
Ｍ－ＹＮＨＳ－１０Ｋ：分子量が約１０ｋＤａの分岐型モノメトキシ・ポリエチレングリコール・スクシンイミジルカルボキシメチレートであり、構造式は式（４）に示される通りである。式中、ｎは９８～１２０の整数である。
【0043】
【化4】
【実施例】
【0044】
実施例１ リシルブラジキニン／ブラジキニンの変異体の設計と合成
リシルブラジキニン／ブラジキニンの配列及び生体内における可能な分解経路に基づいて、一連の変異体を設計した（表１－１）。主にリシルブラジキニン／ブラジキニンの配列中のアミノ酸を構造的に類似する天然アミノ酸又は非天然アミノ酸に置き換えた変異体（ｍ０１～ｍ０４、ｍ０７、ｍ０２はＢＫの変異体である）と、リシルブラジキニン／ブ
ラジキニンの生物学的活性／機能を発揮する最小活性単位を同定するために設計した部分的に切断又は延長されたペプチド変異体（ｍ０５、ｍ０６、ｍ０８～ｍ１１）と、変異体の抗酸化力をさらに高めるためにシステインを導入した変異体（ｍ１３、ｍ１５、ｍ１６）と、ペプチドの安定性をさらに向上させるためにリシルブラジキニン／ブラジキニン単体を繋ぎ合わせた変異体（ｍ１２はＬｙｓ－ＢＫとＢＫと繋ぎ合わせたものであり、ｍ１４は二つのＬｙｓ－ＢＫを繋ぎ合わせた変異体である）と、Ｎ末端の延長が薬効に及ぼす影響を比較するためにペプチドｍ１３を基に設計した変異体ｍ１５、ｍ１６である。
リシルブラジキニン／ブラジキニンの配列及び生体内における可能な分解経路に基づいて、一連の変異体を設計した（表１－１）。主にリシルブラジキニン／ブラジキニンの配列中のアミノ酸を構造的に類似する天然アミノ酸又は非天然アミノ酸に置き換えた変異体（ｍ０１～ｍ０４、ｍ０７、ｍ０２はＢＫの変異体である）と、リシルブラジキニン／ブ
ラジキニンの生物学的活性／機能を発揮する最小活性単位を同定するために設計した部分的に切断又は延長されたペプチド変異体（ｍ０５、ｍ０６、ｍ０８～ｍ１１）と、変異体の抗酸化力をさらに高めるためにシステインを導入した変異体（ｍ１３、ｍ１５、ｍ１６）と、ペプチドの安定性をさらに向上させるためにリシルブラジキニン／ブラジキニン単体を繋ぎ合わせた変異体（ｍ１２はＬｙｓ－ＢＫとＢＫと繋ぎ合わせたものであり、ｍ１４は二つのＬｙｓ－ＢＫを繋ぎ合わせた変異体である）と、Ｎ末端の延長が薬効に及ぼす影響を比較するためにペプチドｍ１３を基に設計した変異体ｍ１５、ｍ１６である。
【0045】
【表1】
【0046】
２０２０年版『中国薬典』の通則０５１２高速液体クロマトグラフィー法を参考に測定を行った。測定クロマトグラフィーのタイプはＣ１８－ＲＰ（逆相クロマトグラフィー）で、流動相はＡ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮで、クロマトグラフィーカラムはＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８：（１．７μｍ，２．１×５０ｍｍ）で、収集条件は２１４ｎｍであった。測定の結果が示すように、各ペプチドの純度はすべて＞９５％であった。Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３を例に、純度分析クロマトグラムは図１に示されている。
【0047】
実施例２ リシルブラジキニン／ブラジキニンとその変異体の安定性研究
リシルブラジキニン／ブラジキニンの安定性をｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系において評価した。２ｍｇ／ｍｌのペプチドとＳＤラット血清を体積比８５：１５で混合し、３７℃で３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分と異なる期間のインキュベートを行った。３％のトリクロロ酢酸（上記のペプチド－血清混合系の５０％の体積で）を加えて終止させ、血清中の基質による干渉も効果的に除去できた。さらに、ＵＰＬＣ－ＲＰ－ＵＶ２１４ｎｍ法に基づいて血清系におけるペプチドサンプルの分解をモニターすることによりペプ
チドサンプルの安定性を評価した。ＲＰ分析法：ロマトグラフィーカラムはＰｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ２．１ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍで、カラム温度は３０℃で、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮで、グラジエント：０－５ｍｉｎ，５％Ｂ；５－１０ｍｉｎ，５－４０％Ｂ；１０－３０ｍｉｎ，４０－６０％Ｂ；３０－３２ｍｉｎ，６０－１００％Ｂ；３２－３５ｍｉｎ，５％Ｂであった。
リシルブラジキニン／ブラジキニンの安定性をｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系において評価した。２ｍｇ／ｍｌのペプチドとＳＤラット血清を体積比８５：１５で混合し、３７℃で３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分と異なる期間のインキュベートを行った。３％のトリクロロ酢酸（上記のペプチド－血清混合系の５０％の体積で）を加えて終止させ、血清中の基質による干渉も効果的に除去できた。さらに、ＵＰＬＣ－ＲＰ－ＵＶ２１４ｎｍ法に基づいて血清系におけるペプチドサンプルの分解をモニターすることによりペプ
チドサンプルの安定性を評価した。ＲＰ分析法：ロマトグラフィーカラムはＰｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ２．１ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍで、カラム温度は３０℃で、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮで、グラジエント：０－５ｍｉｎ，５％Ｂ；５－１０ｍｉｎ，５－４０％Ｂ；１０－３０ｍｉｎ，４０－６０％Ｂ；３０－３２ｍｉｎ，６０－１００％Ｂ；３２－３５ｍｉｎ，５％Ｂであった。
【0048】
【表2】
【0049】
表２－１の結果は、野生型リシルブラジキニンと比較して本発明で設計した複数のペプチドの変異体が血清中でより優れた安定性を有することを示している。このことから、変異体はｉｎ ｖｉｖｏでの安定性と有効性において有利であることが示唆される。
【0050】
実施例３ リシルブラジキニン／ブラジキニンとその変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性評価
一、レポータ遺伝子アッセイによるＢ２受容体への親和性評価
リシルブラジキニン／ブラジキニンは、Ｂ２受容体に結合して下流のシグナル経路を活性化することによりｉｎ ｖｉｖｏでの薬理作用を発揮する。ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞へＢ２受容体レポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションした細胞株Ｂ２－ＮＦＡＴ－ＣＨＯ－Ｋ１を構築し、細胞ライブラリーの構築を完成した。これを用いて、リシルブラジキニン／ブラジキニン又はその変異体、及びそれらのＰＥＧ修飾体のＢ２受容体への結合活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定と評価を行った。
一、レポータ遺伝子アッセイによるＢ２受容体への親和性評価
リシルブラジキニン／ブラジキニンは、Ｂ２受容体に結合して下流のシグナル経路を活性化することによりｉｎ ｖｉｖｏでの薬理作用を発揮する。ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞へＢ２受容体レポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションした細胞株Ｂ２－ＮＦＡＴ－ＣＨＯ－Ｋ１を構築し、細胞ライブラリーの構築を完成した。これを用いて、リシルブラジキニン／ブラジキニン又はその変異体、及びそれらのＰＥＧ修飾体のＢ２受容体への結合活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定と評価を行った。
【0051】
測定方法：細胞を５×１０４個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに敷き詰め、３７
℃、５％ ＣＯ２下で１６～２０時間培養した。その後、濃度勾配をつけて希釈した標準品と試験品の溶液を加えた。５時間後に、Ｂｉｏ－Ｌｉｔｅルシフェラーゼ酵素検出試薬を加え、化学発光強度を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄでグラフを作成し、４パラメータ方程式曲線をフィッティングし、ＥＣ５０値に基づいた相対的活性を算出した。Ｂ２受容体に対するペプチド変異体の相対的親和性を表３－１に示しており、変異体Ｌｙｓ－ＢＫｍ１１、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１５とＬｙｓ－ＢＫｍ１６は野生型リシルブラジキニンと比較して活性の増加を示した。
℃、５％ ＣＯ２下で１６～２０時間培養した。その後、濃度勾配をつけて希釈した標準品と試験品の溶液を加えた。５時間後に、Ｂｉｏ－Ｌｉｔｅルシフェラーゼ酵素検出試薬を加え、化学発光強度を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄでグラフを作成し、４パラメータ方程式曲線をフィッティングし、ＥＣ５０値に基づいた相対的活性を算出した。Ｂ２受容体に対するペプチド変異体の相対的親和性を表３－１に示しており、変異体Ｌｙｓ－ＢＫｍ１１、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１５とＬｙｓ－ＢＫｍ１６は野生型リシルブラジキニンと比較して活性の増加を示した。
【0052】
【表3】
【0053】
二、下流シグナル経路の主要な標的タンパク質に基づく活性分析
Ｂ２Ｒを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞Ｂ２－ＮＦＡＴ－ＣＨＯ－Ｋ１をもとに、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ又はその異なる変異体の投与によるＢ２Ｒの下流シグナルｐ－ＣＲＥＢ、ｐ－ＥＲＫ１／２の変化をＷＢ法で測定した。これを通して、被験物の活性の差異を比較した。細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ １／２，ＥＲＫ１／２）、環状アデノシン－リン酸エフェクター結合タンパク質（ＣＡＭＰ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＥＢ）はともにＢ２Ｒが活性化した後で、下流で直接作用するシグナル分子である。脳卒中発症後に、ＣＲＥＢとＥＲＫ１／２の活性化は虚血後の炎症反応やニューロン損傷の発生を防ぐことができるので、その発現レベルは被験物のＢ２Ｒ活性化能力をある程度反映するとともに、発揮した神経保護作用の効果も側面から反映する。
Ｂ２Ｒを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞Ｂ２－ＮＦＡＴ－ＣＨＯ－Ｋ１をもとに、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ又はその異なる変異体の投与によるＢ２Ｒの下流シグナルｐ－ＣＲＥＢ、ｐ－ＥＲＫ１／２の変化をＷＢ法で測定した。これを通して、被験物の活性の差異を比較した。細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ １／２，ＥＲＫ１／２）、環状アデノシン－リン酸エフェクター結合タンパク質（ＣＡＭＰ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＥＢ）はともにＢ２Ｒが活性化した後で、下流で直接作用するシグナル分子である。脳卒中発症後に、ＣＲＥＢとＥＲＫ１／２の活性化は虚血後の炎症反応やニューロン損傷の発生を防ぐことができるので、その発現レベルは被験物のＢ２Ｒ活性化能力をある程度反映するとともに、発揮した神経保護作用の効果も側面から反映する。
【0054】
対数増殖期のＣＨＯ－Ｋ１（Ｂ２Ｒ＋）細胞を収集し、培地で３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、３×１０５個／ウェルで細胞培養プレートに接種した。細胞を３７．０℃、５．０％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで２４～４８時間培養し、細胞密度が９０％以上に増殖した時点で、細胞をＰＢＳで洗浄した。ウェルごとに１ｍＬ １μＭのＬｙｓ－ＢＫ／ＢＫ又はその変異体を加え、Ｆ１２培地を対照群とした。細胞培養プレートを３７．０℃、５．０％ＣＯ２のインキュベーター内で５分間インキュベートし、ＰＢＳで細胞培養プレートを洗浄した。タンパク質溶解液（ＲＩＰＡ、ＰＭＳＦ、ホスファターゼ阻害剤）を８０μＬ／ウェルで加え、細胞溶解を加速するためにウェルの底をスクレーパーで前後に研磨した。細胞破片と溶解液を遠心チューブに移し、１２，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。上清を吸い取って、５×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと４：１の体積比で均一に混合し、１００℃の金属浴で１０分間煮沸した。等量のタンパク質サン
プルを１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし、ゲルランニング、メンブレン転写、ブロッキング、抗体インキュベーション、発光同定などの操作を行った。
プルを１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし、ゲルランニング、メンブレン転写、ブロッキング、抗体インキュベーション、発光同定などの操作を行った。
【0055】
Ｌｙｓ－ＢＫ／ＢＫ及びその変異体が下流シグナルを活性化する活性の測定結果を図２に示しており、リシルブラジキニン（Ｌｙｓ－ＢＫ）は、下流のＥＲＫ１／２とＣＲＥＢタンパク質のリン酸化を活性化することができる。これは当該薬物の作用メカニズムと一致している。下流のＥＲＫ１／２とＣＲＥＢタンパク質のリン酸化レベルを判定することを通して、サンプルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的活性を定性的に評価した結果、変異体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０５、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０７は既に下流経路を活性化する活性を失っており、変異体ＬＢＫｍ０１、ｍ０２、ｍ０６、ｍ１１、ｍ１２、ｍ１３、ｍ１４、ｍ１５、ｍ１６は全て下流経路を活性化する活性を示した。
【0056】
上記２つのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性評価結果から次のことが分かる：リシルブラジキニン／ブラジキニンはＣ末端を切断されると、Ｂ２Ｒに対する親和性と下流経路を活性化する活性を失う；Ｎ末端からリシンを欠失されることは、リシルブラジキニンのＢ２Ｒに対する親和性と下流経路を活性化する活性に影響しない；Ｎ末端から他のアミノ酸を欠失されることで、リシルブラジキニンはＢ２Ｒに対する親和性と下流経路を活性化する活性を失う；最小活性単位はＲＰＰＧＦＳＰＦＲである；Ｎ末端の延長（ｍ１１）又はシステインの導入（ｍ１３）はＢ２Ｒに対する親和性を高めるのに有利である。図１ｄに示すように、ｍ１２群、ｍ１３群、ｍ１４群のＣＲＥＢタンパク質のリン酸化は、ＬＢＫ群に比べて顕著に高く、ｍ１２、１３、１４はＬＢＫに比べて、より優れたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を持ち、より下流経路を活性化できることが明らかになった。
【0057】
実施例４ リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体の作製
リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ修飾は、当該技術分野の公知の方法で行う。特定の変異体を特定のＰＥＧ修飾剤で修飾する場合、工程パラメータの一部に若干の変更があるが、当業者であれば限られた回数の実験によって修飾方法を最適化することができ、技術上問題がない。Ｍ－ＳＰＡ－５Ｋによる野生型ＢＫの修飾を例にして、作製プロセスは以下の通りである：
リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ修飾は、当該技術分野の公知の方法で行う。特定の変異体を特定のＰＥＧ修飾剤で修飾する場合、工程パラメータの一部に若干の変更があるが、当業者であれば限られた回数の実験によって修飾方法を最適化することができ、技術上問題がない。Ｍ－ＳＰＡ－５Ｋによる野生型ＢＫの修飾を例にして、作製プロセスは以下の通りである：
【0058】
一、ＰＥＧ複合体サンプルの作製
ペプチドサンプルをリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解し、最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調製した。ペプチドとＭ－ＳＰＡ－５Ｋとの質量比が１：７であるように、ペプチド溶液にＰＥＧを加え、均一になるまでゆっくりと撹拌し、その後２～８℃の条件下で１時間反応させた。
ペプチドサンプルをリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解し、最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調製した。ペプチドとＭ－ＳＰＡ－５Ｋとの質量比が１：７であるように、ペプチド溶液にＰＥＧを加え、均一になるまでゆっくりと撹拌し、その後２～８℃の条件下で１時間反応させた。
【0059】
二、反応混合物の精製
第一段階精製のクロマトグラフィー条件は以下の通りである：
精製用充填剤はＧＥ社のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ミディアムを使用し、精製の移動相はｐＨ７．０～７．５、２０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液であった（０．２Ｍ ＮａＣｌを含む）。
サンプルローディング：反応終了後の上記のペプチド－ＰＥＧ修飾反応混合物を取って、直接にロードした。
溶出：サンプルローディングが終わった後で、クロマトグラフィーカラムを移動相で１．５カラムベッド以上の体積で洗浄し、ＵＶ２１４ｎｍのトレンドに基づいて溶出サンプルを段階的に収集した。
第一段階精製のクロマトグラフィー条件は以下の通りである：
精製用充填剤はＧＥ社のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ミディアムを使用し、精製の移動相はｐＨ７．０～７．５、２０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液であった（０．２Ｍ ＮａＣｌを含む）。
サンプルローディング：反応終了後の上記のペプチド－ＰＥＧ修飾反応混合物を取って、直接にロードした。
溶出：サンプルローディングが終わった後で、クロマトグラフィーカラムを移動相で１．５カラムベッド以上の体積で洗浄し、ＵＶ２１４ｎｍのトレンドに基づいて溶出サンプルを段階的に収集した。
【0060】
第二段階精製のクロマトグラフィー条件は以下の通りである：
Ｃ１８逆相カラム分離精製法により、極性の違いで二つの物質の分離を達成した。この方法で、生成物の精製収率が８０％以上に達するほか、遊離ＰＥＧも完全に除去できる。
Ｃ１８逆相カラム分離精製法により、極性の違いで二つの物質の分離を達成した。この方法で、生成物の精製収率が８０％以上に達するほか、遊離ＰＥＧも完全に除去できる。
【0061】
三、ＰＥＧ複合体サンプルの純度分析
（１）ＨＰＬＣによる純度分析
２０２０年版『中国薬典』の通則０５１２高速液体クロマトグラフィー法を参考に測定を行った。測定クロマトグラフィーのタイプはＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）で、流動相は２０ｍＭ ＰＢ７．０＋１０％ＩＰＡで、クロマトグラフィーカラムはＴＳＫ Ｇ２０００で、収集条件は２１４ｎｍであった。
ＲＰ純度分析方法：クロマトグラフィーカラムはＰｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ２．１ｘ１５０ｍｍ，１．７μｍであり、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮであった。
純度分析の結果が示すように、作製した一連のリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ修飾体は生成物ピークが均一で、明らかな不純物ピークが見られず、純度が＞９５％であった。Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋを例にとると、その純度分析クロマトグラムは図３に示す通りである。
（１）ＨＰＬＣによる純度分析
２０２０年版『中国薬典』の通則０５１２高速液体クロマトグラフィー法を参考に測定を行った。測定クロマトグラフィーのタイプはＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）で、流動相は２０ｍＭ ＰＢ７．０＋１０％ＩＰＡで、クロマトグラフィーカラムはＴＳＫ Ｇ２０００で、収集条件は２１４ｎｍであった。
ＲＰ純度分析方法：クロマトグラフィーカラムはＰｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ２．１ｘ１５０ｍｍ，１．７μｍであり、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮであった。
純度分析の結果が示すように、作製した一連のリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ修飾体は生成物ピークが均一で、明らかな不純物ピークが見られず、純度が＞９５％であった。Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋを例にとると、その純度分析クロマトグラムは図３に示す通りである。
【0062】
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度分析
２０２０年版『中国薬典』の０５４１電気泳動法第五法のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に基づきサンプルの純度測定を行った。１２．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてサンプル測定を行った。
電気泳動の結果が示すように、作製した一連のリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ修飾体はバンドが均一で、不純物バンドが見られず、純度が＞９５％であった。
なお、リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体は、Ｎ末端にしか理論的修飾可能部位がないため、そのＰＥＧ修飾体はすべてＮ末端の単一修飾を有する産物である。
２０２０年版『中国薬典』の０５４１電気泳動法第五法のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に基づきサンプルの純度測定を行った。１２．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてサンプル測定を行った。
電気泳動の結果が示すように、作製した一連のリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ修飾体はバンドが均一で、不純物バンドが見られず、純度が＞９５％であった。
なお、リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体は、Ｎ末端にしか理論的修飾可能部位がないため、そのＰＥＧ修飾体はすべてＮ末端の単一修飾を有する産物である。
【0063】
実施例５ リシルブラジキニン／ブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価
一、安定性
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体の安定性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系での安定性評価によって、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を間接的に評価した。評価方法は実施例２と同様である。リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体はｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系での残存期間が全て６時間以上であり（表５－１）、その安定性が著しく向上した。同一分子量のＰＥＧの場合、分岐型複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０Ｋの安定性は直鎖型複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０Ｋよりも優れている。
一、安定性
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体の安定性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系での安定性評価によって、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を間接的に評価した。評価方法は実施例２と同様である。リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体はｉｎ ｖｉｔｒｏ血清系での残存期間が全て６時間以上であり（表５－１）、その安定性が著しく向上した。同一分子量のＰＥＧの場合、分岐型複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０Ｋの安定性は直鎖型複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０Ｋよりも優れている。
【0064】
【表4】
【0065】
二、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体に対して、Ｂ２受容体への親和性及
び下流シグナル経路活性化の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。評価方法は実施例３と同様である。リシルブラジキニン及びその変異体は、ＰＥＧで修飾された後もＢ２受容体に対する親和性を有しており（図４ａ、４ｂ）、またＢ２受容体の下流シグナル経路の主要タンパク質のリン酸化を活性化することができる（図５）。異なる構造タイプと異なる分子量のＰＥＧ修飾剤による複合体は、全てＢ２受容体への結合活性を保持している。ＰＥＧ修飾剤には、分子量２Ｋから２０Ｋ、直鎖型又は分岐型、及び異なる構造（ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳなど）のＰＥＧ修飾剤が含まれた。評価の結果から分かるように、同じ分子量では直鎖型ＰＥＧ複合体の方は分岐型ＰＥＧ複合体よりも活性が高い。これは分子量１０Ｋと２０Ｋの２種類のＰＥＧで示されている。図４ａに示すように、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０ＫとＬｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０ＫのＥＣ５０値はそれぞれ９０．８μｇ／ｍｌ、３４６．６μｇ／ｍｌであり、直鎖型ＰＥＧ複合体の活性は分岐型ＰＥＧ複合体の活性より４倍近く高かった。また、同じ構造タイプのＰＥＧでは、分子量２Ｋ、５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋの４種類のＰＥＧの中で、２Ｋと１０ＫのＰＥＧの複合体の方は比較的に活性が高かった。
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体に対して、Ｂ２受容体への親和性及
び下流シグナル経路活性化の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。評価方法は実施例３と同様である。リシルブラジキニン及びその変異体は、ＰＥＧで修飾された後もＢ２受容体に対する親和性を有しており（図４ａ、４ｂ）、またＢ２受容体の下流シグナル経路の主要タンパク質のリン酸化を活性化することができる（図５）。異なる構造タイプと異なる分子量のＰＥＧ修飾剤による複合体は、全てＢ２受容体への結合活性を保持している。ＰＥＧ修飾剤には、分子量２Ｋから２０Ｋ、直鎖型又は分岐型、及び異なる構造（ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳなど）のＰＥＧ修飾剤が含まれた。評価の結果から分かるように、同じ分子量では直鎖型ＰＥＧ複合体の方は分岐型ＰＥＧ複合体よりも活性が高い。これは分子量１０Ｋと２０Ｋの２種類のＰＥＧで示されている。図４ａに示すように、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０ＫとＬｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０ＫのＥＣ５０値はそれぞれ９０．８μｇ／ｍｌ、３４６．６μｇ／ｍｌであり、直鎖型ＰＥＧ複合体の活性は分岐型ＰＥＧ複合体の活性より４倍近く高かった。また、同じ構造タイプのＰＥＧでは、分子量２Ｋ、５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋの４種類のＰＥＧの中で、２Ｋと１０ＫのＰＥＧの複合体の方は比較的に活性が高かった。
【0066】
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体による下流シグナル経路の活性化を評価した結果（図５）、ＰＥＧで修飾された後もペプチドはＢ２受容体の下流シグナルであるＥＲＫ１／２和ＣＲＥＢのリン酸化を活性化する活性を保持している。Ｌｙｓ－ＢＫペプチドと比較して、上記の活性（特にＥＲＫ１／２リン酸化を活性化する活性）はある程度下がった。同じＳＰＡ５Ｋ－ＰＥＧ修飾剤で修飾される場合、異なるペプチド変異体の中でＬｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ５Ｋは活性が最も高かった。同じペプチド変異体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１をＰＥＧで修飾するの場合、分子量２Ｋと１０ＫのＰＥＧによる複合体の活性が最も高く、さらに直鎖型ＰＥＧの複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ１０Ｋの活性は分岐型ＰＥＧの複合体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＹＮＨＳ１０Ｋより高かった。
【0067】
実施例６ リシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体のｉｎ ｖｉｖｏにおける代謝研究
一、実験方法
ＳＤラットにリシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体（Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋを例として）を０．５ｍｇ／ｋｇで皮下注射で投与し、投与前と投与５分後・１５分後・０．５時間後・１時間後・２時間後・４時間後・８時間後・２４時間後・４８時間後・７２時間後に血漿を採取し、特異的ＥＬＩＳＡ法で血漿サンプル中のＬｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋの含有量を測定した（単位はｎｇ／ｍｌである）。
一、実験方法
ＳＤラットにリシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体（Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋを例として）を０．５ｍｇ／ｋｇで皮下注射で投与し、投与前と投与５分後・１５分後・０．５時間後・１時間後・２時間後・４時間後・８時間後・２４時間後・４８時間後・７２時間後に血漿を採取し、特異的ＥＬＩＳＡ法で血漿サンプル中のＬｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋの含有量を測定した（単位はｎｇ／ｍｌである）。
【0068】
二、測定方法
１、コーティング：ストレプトアビジン（４ｕｇ／ｍｌ）をマイクロプレートにコーティングし、２～８℃で一晩放置した。洗浄液で１回洗浄してブロッキング液を加え、３７℃で２時間ブロッキングして、後で使うように置いておく。
２、捕捉用物質：市販のａｎｔｉ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎをブロッキング液で０．５ｕｇ／ｍｌに希釈して上記のマイクロプレートに加えた。３７℃、３００ｒｐｍで２時間後、洗浄液で３回洗浄して叩いて乾燥させた。
３、サンプルローディング：標準物質又はサンプルを対応する濃度に希釈し、希釈後の標準品又はサンプルをブロッキング液で１０倍希釈して上記のマイクロプレートに加えた。３７℃、３００ｒｐｍで１．５時間後、洗浄液で３回洗浄して叩いて乾燥させた。
４、検出用物質：ＨＲＰ標識抗Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋ特異的抗体を１０００倍希釈して上記のマイクロプレートに加えた。３７℃、３００ｒｐｍで１．５時間後、洗浄液で３回洗浄して叩いて乾燥させた。
５、発色：ＴＭＢを上記のマイクロプレートに加え、３７℃で１５分間発色させた後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えた。
６、プレートリーディング：マイクロプレートリーダーにてＯＤ４５０とＯＤ６３０を読み取った。
ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ９．１を用いて、４パラメータ・フィッティングでサンプル中の薬物の濃度を計算した。
１、コーティング：ストレプトアビジン（４ｕｇ／ｍｌ）をマイクロプレートにコーティングし、２～８℃で一晩放置した。洗浄液で１回洗浄してブロッキング液を加え、３７℃で２時間ブロッキングして、後で使うように置いておく。
２、捕捉用物質：市販のａｎｔｉ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎをブロッキング液で０．５ｕｇ／ｍｌに希釈して上記のマイクロプレートに加えた。３７℃、３００ｒｐｍで２時間後、洗浄液で３回洗浄して叩いて乾燥させた。
３、サンプルローディング：標準物質又はサンプルを対応する濃度に希釈し、希釈後の標準品又はサンプルをブロッキング液で１０倍希釈して上記のマイクロプレートに加えた。３７℃、３００ｒｐｍで１．５時間後、洗浄液で３回洗浄して叩いて乾燥させた。
４、検出用物質：ＨＲＰ標識抗Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋ特異的抗体を１０００倍希釈して上記のマイクロプレートに加えた。３７℃、３００ｒｐｍで１．５時間後、洗浄液で３回洗浄して叩いて乾燥させた。
５、発色：ＴＭＢを上記のマイクロプレートに加え、３７℃で１５分間発色させた後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えた。
６、プレートリーディング：マイクロプレートリーダーにてＯＤ４５０とＯＤ６３０を読み取った。
ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ９．１を用いて、４パラメータ・フィッティングでサンプル中の薬物の濃度を計算した。
【0069】
三、測定結果
ＳＤラット体内におけるＬｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋの薬物濃度－時間曲線は図６に示す通りである。ＳＤラットに１回の皮下投与（０．５ｍｇ／ｋｇ）を行って、雌雄１匹ずつ合計２匹の動物はともに投与４時間後にＣｍａｘに達しており、Ｃｍａｘはそれぞれ８８．０７ｎｇ／ｍｌ、１１４．６８ｎｇ／ｍｌであった。成人にイカチバント（ｉｃａｔｉｂａｎｔ、ブラジキニンの構造類似物質である）を皮下投与で３０ｍｇ投与した後、血中薬物濃度が１．７９時間でピーク（４０５ｎｇ／ｍｌ）に達したとの研究報告がある。（文献：Ｅｆｆｉｃａｃｙ， ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｉｃａｔｉｂａｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｃｕｔｅ ａｔｔａｃｋ ｏｆ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ： Ａ ｐｈａｓｅ ３ ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ ｓｔｕｄｙ）。体表面積換算に基づく等価用量で比較すると、同じ投与量ではＬｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０ＫのほうはＣｍａｘがより高く、ピークになるまでの時間がより長い。このことから、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋがより高いバイオアベイラビリティを有することが推定される。
ＳＤラット体内におけるＬｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋの薬物濃度－時間曲線は図６に示す通りである。ＳＤラットに１回の皮下投与（０．５ｍｇ／ｋｇ）を行って、雌雄１匹ずつ合計２匹の動物はともに投与４時間後にＣｍａｘに達しており、Ｃｍａｘはそれぞれ８８．０７ｎｇ／ｍｌ、１１４．６８ｎｇ／ｍｌであった。成人にイカチバント（ｉｃａｔｉｂａｎｔ、ブラジキニンの構造類似物質である）を皮下投与で３０ｍｇ投与した後、血中薬物濃度が１．７９時間でピーク（４０５ｎｇ／ｍｌ）に達したとの研究報告がある。（文献：Ｅｆｆｉｃａｃｙ， ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｉｃａｔｉｂａｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｃｕｔｅ ａｔｔａｃｋ ｏｆ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ： Ａ ｐｈａｓｅ ３ ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ ｓｔｕｄｙ）。体表面積換算に基づく等価用量で比較すると、同じ投与量ではＬｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０ＫのほうはＣｍａｘがより高く、ピークになるまでの時間がより長い。このことから、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ１０Ｋがより高いバイオアベイラビリティを有することが推定される。
【0070】
実施例７ リシルブラジキニン（突然変異されていない）－ＰＥＧ複合体のｉｎ ｖｉｖｏでの活性評価
一、モデルの作製
ＳＤラット、雄性、ＳＰＦ級、体重２７０～３００ｇの動物を使用した。中大脳動脈線栓法を用いて中大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）脳虚血再灌流モデルを作製した。動物はイソフルランで麻酔し，仰向けに固定し、皮膚を消毒し、頚部正中部を切開し、右側の総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を分離して、迷走神経を優しく剥離し、外頸動脈を結紮、切断した。総頸動脈の近心端をクランプし、外頚動脈の結紮部の遠位に切開し、ＭＣＡＯ線栓（型番２４３８－Ａ５、北京西濃科技有限公司より購入）を挿入し、総頚動脈分岐部を通過して内頚動脈に入り、徐々に挿入し、わずかな抵抗が感じられるところまで（分岐部から約２０ｍｍ）で止まり、中大脳動脈の血流を遮断した。頸部の皮膚を縫合し、消毒後、ラットをケージに戻した。虚血９０分間後、ラットを再度麻酔し、板に固定し、頸部の皮膚を切開し、線栓を見つけて優しく抜き取り、血流を回復させ再灌流を行った。頸部の皮膚を縫合し、消毒後、ラットをケージに戻して飼育した。
一、モデルの作製
ＳＤラット、雄性、ＳＰＦ級、体重２７０～３００ｇの動物を使用した。中大脳動脈線栓法を用いて中大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）脳虚血再灌流モデルを作製した。動物はイソフルランで麻酔し，仰向けに固定し、皮膚を消毒し、頚部正中部を切開し、右側の総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を分離して、迷走神経を優しく剥離し、外頸動脈を結紮、切断した。総頸動脈の近心端をクランプし、外頚動脈の結紮部の遠位に切開し、ＭＣＡＯ線栓（型番２４３８－Ａ５、北京西濃科技有限公司より購入）を挿入し、総頚動脈分岐部を通過して内頚動脈に入り、徐々に挿入し、わずかな抵抗が感じられるところまで（分岐部から約２０ｍｍ）で止まり、中大脳動脈の血流を遮断した。頸部の皮膚を縫合し、消毒後、ラットをケージに戻した。虚血９０分間後、ラットを再度麻酔し、板に固定し、頸部の皮膚を切開し、線栓を見つけて優しく抜き取り、血流を回復させ再灌流を行った。頸部の皮膚を縫合し、消毒後、ラットをケージに戻して飼育した。
【0071】
群分けと投与：偽手術群、モデル群（静脈注射でＰＢＳを投与）、エダラボン群（静脈注射、６ｍｇ／ｋｇで投与）、リシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体群（静脈注射、３ｍｇ／ｋｇで、投与量はペプチドに基づいて算出）を設定した。投与群は再灌流２時間後に注射で１回の投与行った。
【0072】
二、神経欠損症状の評価
【表5】
【0073】
三、脳梗塞体積の測定
動物は１０％の抱水クロラールで麻酔し、頭部を切断し脳を摘出し、嗅球、小脳及び低位脳幹を除去し、生理食塩水で大脳表面の血痕を洗い流し、表面の残留水分を吸い取って、－８０℃で７分間放置した。その後、取り出してすぐに視線の交差平面と垂直して下向きで冠状断面を切り、さらに２ｍｍごとに後方に向かって切片を切った。脳切片を生理食塩水で新鮮に調製したＴＴＣ（２０ｇ／Ｌ）染色液に入れ、３７℃で９０分間温めて、正常な脳組織は濃い赤色に染まり、虚血が生じた脳組織は蒼白色になった。生理食塩水で洗い流した後、すぐに脳切片を前から後ろへ向かって順番に並べ、表面の残留水分を吸い取り、写真を撮った。画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｔｏｏｌ）を使って写真に基づいて統計を取り、右側の虚血面積（白色部分）と右側面積を囲んで、次の計算式により脳梗塞面積の割合を算出した。計算式：脳梗塞面積％＝虚血総面積÷右側総面積×１００。
動物は１０％の抱水クロラールで麻酔し、頭部を切断し脳を摘出し、嗅球、小脳及び低位脳幹を除去し、生理食塩水で大脳表面の血痕を洗い流し、表面の残留水分を吸い取って、－８０℃で７分間放置した。その後、取り出してすぐに視線の交差平面と垂直して下向きで冠状断面を切り、さらに２ｍｍごとに後方に向かって切片を切った。脳切片を生理食塩水で新鮮に調製したＴＴＣ（２０ｇ／Ｌ）染色液に入れ、３７℃で９０分間温めて、正常な脳組織は濃い赤色に染まり、虚血が生じた脳組織は蒼白色になった。生理食塩水で洗い流した後、すぐに脳切片を前から後ろへ向かって順番に並べ、表面の残留水分を吸い取り、写真を撮った。画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｔｏｏｌ）を使って写真に基づいて統計を取り、右側の虚血面積（白色部分）と右側面積を囲んで、次の計算式により脳梗塞面積の割合を算出した。計算式：脳梗塞面積％＝虚血総面積÷右側総面積×１００。
【0074】
四、結果
１、被験物の神経欠損症状への影響
図７ａに示すように、陽性薬群（エダラボン）はモデル群と比較して、神経欠損症状に対して著しい改善効果があった。また、リシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体Ｌｙｓ－ＢＫ－ＳＰＡ５群はモデル群と比較して、神経欠損症状に対して著しい改善効果があり、統計学的に有意差はあった。
１、被験物の神経欠損症状への影響
図７ａに示すように、陽性薬群（エダラボン）はモデル群と比較して、神経欠損症状に対して著しい改善効果があった。また、リシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体Ｌｙｓ－ＢＫ－ＳＰＡ５群はモデル群と比較して、神経欠損症状に対して著しい改善効果があり、統計学的に有意差はあった。
【0075】
【表6】
【0076】
２、被験物の脳梗塞面積（％）への影響
図7bに示すように、陽性薬群（エダラボン）はモデル群と比較して、脳梗塞面積に対して著しい改善効果があった。また、リシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体群はモデル群と比較して、脳梗塞面積に対して著しい改善効果があり、統計学的に有意差があった。
図7bに示すように、陽性薬群（エダラボン）はモデル群と比較して、脳梗塞面積に対して著しい改善効果があった。また、リシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体群はモデル群と比較して、脳梗塞面積に対して著しい改善効果があり、統計学的に有意差があった。
【0077】
【表7】
【0078】
実施例８ リシルブラジキニン／ブラジキニンの変異体－ＰＥＧ複合体のｉｎ ｖｉｖｏでの活性評価
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体に対してＭＣＡＯモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの薬効評価を数回実施した。表７－６を除く全ての実験は、３ｍｇ／ｋｇの投用量で投与し（投与群の投用量は全てペプチドに基づいて算出）、投与法は静脈注射又は皮下注射であり、再灌流２時間後に注射で１回の投与を行った。その他の具体的な実験プロトコールは実施例７を参照して実施した。実験の結果を図８及び表７に示している。
リシルブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ複合体に対してＭＣＡＯモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの薬効評価を数回実施した。表７－６を除く全ての実験は、３ｍｇ／ｋｇの投用量で投与し（投与群の投用量は全てペプチドに基づいて算出）、投与法は静脈注射又は皮下注射であり、再灌流２時間後に注射で１回の投与を行った。その他の具体的な実験プロトコールは実施例７を参照して実施した。実験の結果を図８及び表７に示している。
【0079】
【表8】
【0080】
【表9】
【0081】
【表10】
【0082】
【表11】
【0083】
【表12】
【0084】
【表13】
【0085】
実施例９ 異なる投与経路における異なるＰＥＧ修飾剤による複合体のｉｎ ｖｉｖｏ
での活性評価
本実施例では、同一のモデルにおいて、静脈注射又は皮下注射で投与する場合のリシルブラジキニン変異体－ＰＥＧ複合体の薬効を検討した。投与量は４．５ｍｇ／ｋｇ（ペプチドに基づいて算出）とし、その他の具体的な実験プロトコールは実施例７を参照して実施した。実験の結果を図９、図１０及び表８－１に示した。静脈注射又は皮下注射で投与する場合、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ５Ｋ群はモデル群と比較して、神経欠損症状と脳梗塞面積に対してともに著しい改善効果があり、統計学的に有意差があった。異なる分子量のＰＥＧ修飾剤による複合体の薬効を評価した結果、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ２ＫはＬｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ５Ｋよりもｉｎ ｖｉｖｏ薬効が著しく優れている。
での活性評価
本実施例では、同一のモデルにおいて、静脈注射又は皮下注射で投与する場合のリシルブラジキニン変異体－ＰＥＧ複合体の薬効を検討した。投与量は４．５ｍｇ／ｋｇ（ペプチドに基づいて算出）とし、その他の具体的な実験プロトコールは実施例７を参照して実施した。実験の結果を図９、図１０及び表８－１に示した。静脈注射又は皮下注射で投与する場合、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３－ＳＰＡ５Ｋ群はモデル群と比較して、神経欠損症状と脳梗塞面積に対してともに著しい改善効果があり、統計学的に有意差があった。異なる分子量のＰＥＧ修飾剤による複合体の薬効を評価した結果、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ２ＫはＬｙｓ－ＢＫｍ０１－ＳＰＡ５Ｋよりもｉｎ ｖｉｖｏ薬効が著しく優れている。
【0086】
【表14】
【0087】
実施例１０ 経口投与におけるリシルブラジキニン／ブラジキニンの変異体－ＰＥＧ複合体のｉｎ ｖｉｖｏでの活性評価
ＭＣＡＯモデルにおいてリシルブラジキニンのＰＥＧ複合体とリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ複合体を経口投与してｉｎ ｖｉｖｏでの薬効を比較した。本実施例では、リシルブラジキニンは突然変異されていない野生型のリシルブラジキニンであり、変異体はＭ０１であり、ＰＥＧはＭ－ＳＰＡ－５Ｋである。投与は単回投与で６ｍｇ／ｋｇ（ペプチドに基づいて算出）の投与量で行った。実験の結果を図１１、図１２、表９－１に示した。
ＭＣＡＯモデルにおいてリシルブラジキニンのＰＥＧ複合体とリシルブラジキニン変異体のＰＥＧ複合体を経口投与してｉｎ ｖｉｖｏでの薬効を比較した。本実施例では、リシルブラジキニンは突然変異されていない野生型のリシルブラジキニンであり、変異体はＭ０１であり、ＰＥＧはＭ－ＳＰＡ－５Ｋである。投与は単回投与で６ｍｇ／ｋｇ（ペプチドに基づいて算出）の投与量で行った。実験の結果を図１１、図１２、表９－１に示した。
【0088】
１、被験物の神経欠損症状への影響
表９－１に示すように、リシルブラジキニン突然変異体のＰＥＧ複合体はモデル群と比較して、神経欠損症状に対して著しい改善効果があった。
表９－１に示すように、リシルブラジキニン突然変異体のＰＥＧ複合体はモデル群と比較して、神経欠損症状に対して著しい改善効果があった。
【0089】
２、被験物の脳梗塞面積への影響
表９－１に示すように、突然変異体のＰＥＧ複合体はモデル群と比較して、脳梗塞面積に対して著しい改善効果があった。
神経欠損症状スコアと脳梗塞面積の結果を総合的に見れば、同じＰＥＧ修飾剤を用いてＰＥＧ複合体を作製する場合、リシルブラジキニン変異体－ＰＥＧ複合体はリシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体よりも優れた薬効を示した。
表９－１に示すように、突然変異体のＰＥＧ複合体はモデル群と比較して、脳梗塞面積に対して著しい改善効果があった。
神経欠損症状スコアと脳梗塞面積の結果を総合的に見れば、同じＰＥＧ修飾剤を用いてＰＥＧ複合体を作製する場合、リシルブラジキニン変異体－ＰＥＧ複合体はリシルブラジキニン－ＰＥＧ複合体よりも優れた薬効を示した。
【0090】
【表15】
【0091】
実施例７～１０のデータを総合的に見れば、リシルブラジキニン及びその異なる変異体のＰＥＧ複合体は全て有意な薬効を示し、Ｌｙｓ－ＢＫ、変異体Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０２、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１１、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１２、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１５、及びＬｙｓ－ＢＫｍ１６のＰＥＧ複合体はモデル群と比較して、神経欠損症状、脳梗塞面積に対して著しい改善効果があり、統計学的に有意差があった。
【0092】
分子量の異なるＰＥＧ修飾剤（２Ｋ、５Ｋ、１０Ｋ）で修飾されたリシルブラジキニン／ブラジキニンの変異体は全て良好な薬効を示した。実施例では、修飾剤ＳＰＡで修飾されたリシルブラジキニン／ブラジキニンの変異体のｉｎ ｖｉｖｏ活性の評価結果を示している。実際、受容体への結合活性を保持しているリシルブラジキニン／ブラジキニン又はその変異体を他の種類のＰＥＧ修飾剤を用いて修飾する場合も、リシルブラジキニン／ブラジキニンの生体内での半減期を顕著に延長させるとともに、良好なｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す。
【0093】
一方、ＰＥＧで修飾されていないリシルブラジキニン／ブラジキニン又はその異なる変異体（野生型のリシルブラジキニン／ブラジキニン、ｍ０１、ｍ０２、ｍ１１、ｍ１２など）、又は受容体への結合活性を保持していないリシルブラジキニン／ブラジキニンのＰＥＧ複合体は、異なる投与量かつ多種の投与経路で投与される場合、モデル動物の神経欠損症状及び脳梗塞を改善する効果を示さなかった。これは、それらのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が非常に短いことに関係している可能性があると考えられる。
【0094】
もちろん、異なるリシルブラジキニン変異体－ＰＥＧ複合体の薬効にはある程度の差がある。中でもＬｙｓ－ＢＫｍ１３変異体のＰＥＧ複合体は最も薬効が優れている。Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３群の神経欠損症状及び脳梗塞面積に対する改善効果はモデル群と比較して統計学的に極めて顕著な差が認められた（Ｐ＜０．００１）（表７－４）。一方、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１１群の神経欠損症状及び脳梗塞面積に対する改善効果はモデル群と比較して統計学的に顕著な差が認められた（Ｐ＜０．０１）（表７－３）。Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３とＬｙｓ－ＢＫｍ１１とは一位のアミノ酸が異なるのみであるから、一位のアミノ酸をＣｙｓに突然変異することはｉｎ ｖｉｖｏ薬効に有意に有利であることが示唆された。
【0095】
Ｌｙｓ－ＢＫｍ１１はＬｙｓ－ＢＫｍ０１の一位と２位のアミノ酸の間にＡｒｇを挿入して得られた変異体であり、脳梗塞面積の改善に一定の優位性がある（表７－３）。この結論は、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３とＬｙｓ－ＢＫｍ１５との薬効比較でさらに明らかになった。同じ条件下では、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３変異体のＰＥＧ複合体がよりよい薬効を示した（
表７－６）。さらに、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３をもとにＡｒｇをもう１つ挿入してＬｙｓ－ＢＫｍ１６が得られた。Ｌｙｓ－ＢＫｍ１６のＰＥＧ複合体の薬効はＬｙｓ－ＢＫｍ１３のＰＥＧ複合体と同等であった（表７－５）。このことは、Ｎ末端にＡｒｇを挿入してペプチドを延長することがペプチド－ＰＥＧ複合体の薬効を発揮するのに有利であることを示している。
表７－６）。さらに、Ｌｙｓ－ＢＫｍ１３をもとにＡｒｇをもう１つ挿入してＬｙｓ－ＢＫｍ１６が得られた。Ｌｙｓ－ＢＫｍ１６のＰＥＧ複合体の薬効はＬｙｓ－ＢＫｍ１３のＰＥＧ複合体と同等であった（表７－５）。このことは、Ｎ末端にＡｒｇを挿入してペプチドを延長することがペプチド－ＰＥＧ複合体の薬効を発揮するのに有利であることを示している。
【0096】
Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１は突然変異によりＬｙｓ－ＢＫに非天然アミノ酸を導入して得られた変異体である。Ｌｙｓ－ＢＫｍ０１のＰＥＧ複合体はＬｙｓ－ＢＫのＰＥＧ複合体と比較してよりよい薬効を示している（表９－１）。
【0097】
Ｌｙｓ－ＢＫｍ０６はＬｙｓ－ＢＫｍ０１のＣ末端を延長して得られた変異体である。Ｌｙｓ－ＢＫｍ０６のＰＥＧ修飾体は３ｍｇ／ｋｇの投与量で、神経欠損症状と脳梗塞面積を改善する傾向が認められたが、モデル群と比較して有意差がなく、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬効がＬｙｓ－ＢＫｍ０１のＰＥＧ複合体より低かった（表７－２）。このことから、Ｃ末端構造がブラジキニンの薬効及び活性の発揮に非常に重要であることが示された。これは実施例３での最小活性単位の確認結果と一致している。投与量をさらに増加して投与したら、Ｌｙｓ－ＢＫｍ０６のＰＥＧ修飾体は神経欠損症状、脳梗塞面積に対する顕著な改善効果が観察された。
【0098】
要するに、本発明は従来技術に比べて以下のようなメリットを有する。
第一に、本発明はポリエチレングリコール修飾技術により、リシルブラジキニン又はブラジキニンの生体内での半減期を大幅に延長させ、同時にその生物学的活性をよく発揮させ、単独のリシルブラジキニン又はブラジキニンでは半減期が短すぎてドラッガビリティがないという問題を解決した。Ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬効については、リシルブラジキニン又はブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ修飾体は、ＭＣＡＯ脳虚血再灌流モデルにおける神経欠損症状に対して顕著な改善効果を示し、脳梗塞面積に対して顕著な改善効果を示した。
第一に、本発明はポリエチレングリコール修飾技術により、リシルブラジキニン又はブラジキニンの生体内での半減期を大幅に延長させ、同時にその生物学的活性をよく発揮させ、単独のリシルブラジキニン又はブラジキニンでは半減期が短すぎてドラッガビリティがないという問題を解決した。Ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬効については、リシルブラジキニン又はブラジキニン及びその変異体のＰＥＧ修飾体は、ＭＣＡＯ脳虚血再灌流モデルにおける神経欠損症状に対して顕著な改善効果を示し、脳梗塞面積に対して顕著な改善効果を示した。
【0099】
第二に、本発明の改造したリシルブラジキニン又はブラジキニンの変異体は明らかに利点を持つ。それらの変異体は、受容体に対する親和性を保持しながら、血清系における安定性が野生型より顕著に優れており、生体内での半減期の延長が示唆される。また、それらの変異体はＰＥＧで修飾された後、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのＰＥＧ修飾体よりもＩｎ ｖｉｖｏでの薬効が優れている。
【0100】
第三に、本発明のリシルブラジキニン又はブラジキニンのＰＥＧ修飾体は、静脈注射、皮下注射、経口投与などの様々な投与経路で投与しても顕著な薬効を発現することができる。特に、皮下注射、経口投与は、患者が注射を受けるために定期的に病院に行く必要がなく、在宅自己投与ができるため、臨床使用に便利であり、患者のコンプライアンスを効果的に向上させ、脳卒中患者の回復期治療など長期的な治療投与にはより適している。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図8f】
【図8g】
【図8h】
【図8i】
【図8j】
【図8k】
【図8l】
【図9】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図10e】
【図10f】
【図11a】
【図11b】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンであって、前記ポリエチレングリコール修飾がＮ末端修飾であり、Ｃ末端修飾ではなく、前記リシルブラジキニン又はブラジキニンが野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンであり、又は野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに改造して得られた誘導体であることを特徴とする、ポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項2】
前記ポリエチレングリコール修飾のＰＥＧ修飾剤がＳＰＡ、ＳＣＭ、又はＳＳ修飾剤を含む、請求項１に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項3】
前記ポリエチレングリコール修飾のＰＥＧ修飾剤が直鎖型又は分岐型のＰＥＧ修飾剤であることを特徴とする、請求項１に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項4】
前記ポリエチレングリコール修飾のＰＥＧ修飾剤が直鎖型のＰＥＧ修飾剤であることを特徴とする、請求項３に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項5】
前記ポリエチレングリコール修飾のＰＥＧ修飾剤の分子量が２ＫＤ～２０ＫＤであることを特徴とする、請求項１に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項6】
前記ポリエチレングリコール修飾のＰＥＧ修飾剤の分子量が２ＫＤ、又は１０ＫＤであることを特徴とする、請求項１に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項7】
リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であって、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンのアミノ酸配列中の任意の位置にシステインを導入したことを特徴とする、リシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項8】
前記野生型のリシルブラジキニンのアミノ酸配列の一位のＬｙｓをＣｙｓに突然変異したことを特徴とする、請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項9】
前記野生型のリシルブラジキニンのＮ末端の１位と２位のアミノ酸残基との間に任意の数、任意の種類のアミノ酸を挿入し、又は前記野生型のブラジキニンのＮ末端の１位のアミノ酸残基の前に任意の数、任意の種類のアミノ酸を挿入したことを特徴とする、請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項10】
前記野生型のリシルブラジキニンのＮ末端の１位と２位のアミノ酸残基との間に１個又は２個又は３個のアミノ酸を挿入し、又は前記野生型のブラジキニンのＮ末端の１位のアミノ酸残基の前に１個又は２個又は３個のアミノ酸を挿入したことを特徴とする、請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項11】
前記挿入したアミノ酸がアルギニンであることを特徴とする、請求項９に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項12】
前記挿入したアミノ酸がアルギニンであることを特徴とする、請求項１０に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項13】
２個あるいは２個以上のリシルブラジキニン単体を、又は２個あるいは２個以上のブラジキニン単体を、又はリシルブラジキニン単体とブラジキニン単体を繋ぎ合わせたことを特徴とし、前記リシルブラジキニン又はブラジキニンの単体が、野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニン、又は野生型のリシルブラジキニン又はブラジキニンをもとに一部のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異体である、請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項14】
前記野生型リシルブラジキニンの６位のＰｈｅ又は前記野生型ブラジキニンの５位のＰｈｅを他の任意のアミノ酸に突然変異したことを特徴とする、請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項15】
配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示した配列であることを特徴とする、請求項７に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体。
【請求項16】
前記リシルブラジキニン又はブラジキニンが請求項７～１５のいずれか一項に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニン。
【請求項17】
虚血性脳卒中の治療、予防、予後回復、又は再発防止のための請求項１～６のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンを含む組成物。
【請求項18】
虚血性脳卒中の治療、予防、予後回復、又は再発防止のための請求項１６に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンを含む組成物。
【請求項19】
注射、経口で投与される請求項１～６のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンを含む組成物。
【請求項20】
注射、経口で投与される請求項１６に記載のポリエチレングリコール修飾のリシルブラジキニン又はブラジキニンを含む組成物。
【請求項21】
虚血性脳卒中の治療、予防、予後回復、又は再発防止のための請求項７～１５のいずれか一項に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体を含む組成物。
【請求項22】
注射、経口で投与される請求項７～１５のいずれか一項に記載のリシルブラジキニン又はブラジキニンの誘導体を含む組成物。
【国際調査報告】