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特表2025-504081フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療及び予防のための方法及び医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-06
(54)【発明の名称】フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療及び予防のための方法及び医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/76 20150101AFI20250130BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20250130BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250130BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20250130BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20250130BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20250130BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20250130BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20250130BHJP
【ＦＩ】
A61K35/76
A61P25/02
A61K48/00
C12N15/864 100Z
C12N15/11 Z ZNA
C12N7/01
C07K14/47
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024545832
(86)(22)【出願日】2023-02-01
(85)【翻訳文提出日】2024-09-26
(86)【国際出願番号】 US2023061766
(87)【国際公開番号】W WO2023150563
(87)【国際公開日】2023-08-10
(31)【優先権主張番号】63/305,494
(32)【優先日】2022-02-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/341,669
(32)【優先日】2022-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508057896
【氏名又は名称】コーネル・ユニバーシティー
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＮＥＬＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(71)【出願人】
【識別番号】524286281
【氏名又は名称】レクセオ セラピューティクス，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100225598
【弁理士】
【氏名又は名称】桐島 拓也
(72)【発明者】
【氏名】ロナルド ジー．クリスタル
(72)【発明者】
【氏名】スティーブン エム．カミンスキー
(72)【発明者】
【氏名】ドーラン ソンディ
(72)【発明者】
【氏名】ジェイ エー．バース
(72)【発明者】
【氏名】リッチー カンナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93Y
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA221
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA08
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA22
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療のための方法及び組成物を提供する。本開示の方法及び組成物は、フラタキシンポリペプチドをコードする核酸配列を含む導入遺伝子核酸分子を含む、ＡＡＶベクター及びＡＡＶウイルスベクターを含む。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるフリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を治療または予防する方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療有効量を前記対象に投与することを含み、前記ＡＡＶベクターが、５’→３’方向に第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
エンハンサー配列、
プロモーター配列、
キメラ型イントロン、
フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドをコードする前記核酸配列、
ポリＡ配列、及び
第２のＩＴＲ配列を含み、
前記ベクターが、約１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｇｃ／ｋｇの範囲の用量で前記対象に静脈内投与される、前記方法。
【請求項2】
対象におけるフリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を治療または予防する方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療有効量を前記対象に投与することを含み、前記ＡＡＶベクターが、配列番号９に記載の核酸配列を含み、前記ベクターが、約１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇまたは約５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇの用量で前記対象に静脈内投与される、前記方法。
【請求項3】
フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドをコードする前記核酸配列が、配列番号３に記載の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項4】
前記第１のＩＴＲ配列が、配列番号１に記載の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記第２のＩＴＲ配列が、配列番号２に記載の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記エンハンサー配列が、配列番号５に記載の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記プロモーター配列が、配列番号６に記載の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記ポリＡ配列が、配列番号８に記載の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＡＡＶベクターが、配列番号９に記載の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターとしてパッケージ化される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記用量が約１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記用量が約５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記対象が、プレドニゾンをさらに投与される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記プレドニゾンが以下の投与量で投与される、請求項１５に記載の方法：ＡＡＶウイルスベクターを投与する２４時間前に１日１回４０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１週目～８週目に１日１回４０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の９週目に１日１回３０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１０週目に１日１回２０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１１週目に１日１回１０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１２週目に１日１回５ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１３週目に１日１回２．５ｍｇ、及び
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１４週目に１日おきに２．５ｍｇ。
【請求項17】
前記静脈内投与が約６０分にわたり行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、ピークＶＯ２の増加を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記対象における前記ピークＶＯ２が、ＡＡＶベクターを投与してから約１２週間後、約２４週間後、約３６週間後、約５２週間後、約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、及び／または約５年後に測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ピークＶＯ２が、腕エルゴメトリーを用いた心肺運動負荷試験（ＣＰＥＴ）により測定される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して左心室重量係数（ＬＶＭｉ）の減少を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
ＬＶＭｉの前記減少が、ＡＡＶベクターを投与してから約１２週間後、約２４週間後、約３６週間後、約５２週間後、約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、及び／または約５年後に測定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ＬＶＭｉの前記減少が心臓ＭＲＩにより測定される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項24】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、心臓ＭＲＩによる測定において、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、長軸方向グローバルストレインの減少、一回心拍出量の増加、左室駆出率（ＬＶＥＦ）の増加、及び心臓線維化の減少または安定のうちの１つ以上を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
心臓ＭＲＩによる前記測定が、ＡＡＶベクターを投与してから約１２週間後、約２４週間後、約３６週間後、約５２週間後、約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、及び／または約５年後に行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、血清ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ｈｓＴＮＴ、及びＣＫ－ＭＢレベルの減少を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して心不整脈の減少を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
心不整脈が、遠隔心調律モニタリングにより評価される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、修正疲労影響スケール（ＭＦＩＳ）または疲労重症度スケール（ＦＳＳ）による測定において、疲労の減少を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、修正ボルグ呼吸困難、ボルグ知覚疲労評価（ＲＰＥ）、及びＣＰＥＴを用いた狭心症スケールによる測定において、（腕エルゴメトリーによるＣＰＥＴ中の）労作症状の改善を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、ＦＸＮ発現レベルの増加を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記ＦＸＮレベルが心筋ＦＸＮ発現レベルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
心筋ＦＸＮ発現が心臓生検により測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記対象が、ＦＸＮ発現レベルの少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％の増加を経験する、請求項３１に記載の方法。
【請求項35】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、フリードライヒ運動失調症評価スケール（ＦＡＲＳ）または修正フリードライヒ運動失調症評価スケール（ｍＦＡＲＳ）の改善または安定化を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、運動失調の評価スケール（ＳＡＲＡ）の改善または安定化を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、息切れ日常活動スコア（ＳＯＢＤＡ）の改善または安定化を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記対象が、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、シアトル狭心症質問票（ＳＡＱ）の改善または安定化を経験する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記用量が約１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約６．０×１０１２ｇｃ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項40】
前記用量が約６．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｇｃ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６３／３０５，４９４号（２０２２年２月１日出願）及び米国仮出願第６３／３４１，６６９号（２０２２年５月１３日出願）の優先権及び利益を主張する。これらの各内容は、参照により全体として本明細書に援用される。
アスキーテキストファイルでの配列表の提出
本出願は、米国仮出願第６３／３０５，４９４号（２０２２年２月１日出願）及び米国仮出願第６３／３４１，６６９号（２０２２年５月１３日出願）の優先権及び利益を主張する。これらの各内容は、参照により全体として本明細書に援用される。
アスキーテキストファイルでの配列表の提出
【0002】
電子配列表（ＬＥＸＥ＿００９＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ、サイズ：１７，７０３バイト、作成日：２０２３年１月３１日）の内容を、参照により全体として本明細書に援用する。
【0003】
政府による資金提供
本発明は、国立衛生研究所の認可を受けたＲ６１ ＨＬ１５１３５５の下、政府支援によって行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所の認可を受けたＲ６１ ＨＬ１５１３５５の下、政府支援によって行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0004】
本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の予防または治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【背景技術】
【0005】
フリードライヒ運動失調症は常染色体劣性進行性神経変性運動障害であり、典型的な発症年齢は１０～１５歳である。臨床症状としては、不安定歩行及び高頻度の転倒が挙げられ、可動性及び協調性に進行性の影響を及ぼす。
【0006】
フリードライヒ運動失調症は、９ｑ２１４にある常染色体ＦＸＮ遺伝子の変異により引き起こされる。ＦＸＮタンパク質は、ミトコンドリアに向けられている（Ｌｕｐｏｌｉ ２０１８；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，５９２：７１８－２７）。ＦＡ患者の９６パーセント（９６％）は、第１のイントロン内のＧＡＡトリヌクレオチド伸長においてホモ接合性であり、これによってエピジェネティックな変化を伴う機序により転写サイレンシングが引き起こされ、最終的には、健康な対象と比較してＦＸＮメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルが低減される。罹患した個体では、全ての組織においてＦＸＮタンパク質が低減する（Ｐｕｃｃｉｏ ２０００；Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，９： ８８７－９２）。残りの対象（４％）は、ＧＡＡ伸長と、他方のアレルにおけるより古典的な変異（点変異、小さな欠失または挿入）とを有するため複合ヘテロ接合性であり、これがＦＸＮタンパク質の機能喪失につながっている（Ｃａｍｐｕｚａｎｏ １９９６；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１４２３－７）。
【0007】
ＦＸＮ遺伝子は、８５ｋｂのゲノムＤＮＡに広がる７つのエキソンから構成されている（Ｐａｎｄｏｌｆｏ ２００６；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｃｈａｐｔｅｒ １７）。主要な転写産物（１．３ｋｂ）は、４０ｋｂ間隔以内に局在する最初の５つのエキソンから構成されている（Ｃａｍｐｕｚａｎｏ １９９６；Ｐａｎｄｏｌｆｏ ２００６）。フラタキシンは、核コードミトコンドリアタンパク質に典型的な成熟プロセスを経る２１０アミノ酸タンパク質をコードする（Ｍｉｒａｎｄａ ２００２；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，５１２：２９１－７；Ｐｕｃｃｉｏ ２００１；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２７：１８１－６）。標的化配列はアミノ酸１～８０の間に含まれ、アルファ－ヘリックス内の正に荷電した残基（アルギニン）からなる（Ｍａｒｔｅｌｌｉ ２０１４；Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５：１３０）。成熟プロセスは、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼにより２ステップで発生し、４１位と４２位との間の切断によってＦＸＮの中間形態に至り、次にアミノ酸８１８で開始する切断によって成熟形態が得られる（Ｓｅｚｎｅｃ ２００４；Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００４；１３：１０１７－１０２４）。
【0008】
ＦＸＮのレベルが低減するとミトコンドリア機能不全が生じ、鉄－硫黄（Ｆｅ－Ｓ）クラスター酵素活性（アコニターゼ及び呼吸鎖複合体Ｉ～ＩＩＩ）の喪失、ミトコンドリア鉄蓄積、ならびに酸化ストレスに対する感受性増加を伴う（Ａｄｉｎｏｌｆｉ ２００９；Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１６：３９０－６；Ｈｕｙｎｅｎ ２００１；Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，１０：２４６３－８；Ｍｕｈｌｅｎｈｏｆｆ ２００２；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７：２９８１０－６；Ｐｕｃｃｉｏ ２００１；Ｓｃｈｍｕｃｋｅｒ ２０１１；ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６：ｅ１６１９９；Ｔｓａｉ ２０１０；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９：９１３２－９）。
【0009】
ヒトＦＸＮ遺伝子をコードするＡＡＶベクターが開示されている。ＡＡＶベクターは静脈内に注入される。ｒｈ１０カプシドは、心筋への送達を標的とするように特異的に設計されており、心筋でＦＸＮ遺伝子の正常なコピーを送達して、心筋細胞内でのＦＸＮ発現を増加させる。このベクターは、心肺運動負荷試験（ＣＰＥＴ）及び心臓磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による測定においてＦＡに関連する心筋症を安定化及び／または改善させるという仮説が立てられている。
【発明の概要】
【0010】
本開示は、対象におけるフリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を治療または予防する方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療有効量を対象に投与することを含み、ベクターが、約１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｇｃ／ｋｇの範囲の用量で対象に静脈内投与される、方法を提供する。
【0011】
本開示は、対象におけるフリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を治療または予防する方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療有効量を対象に投与することを含み、ＡＡＶベクターが、配列番号９に記載の核酸配列を含み、ベクターが、約１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇまたは約５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇの用量で対象に静脈内投与される、方法を提供する。
【0012】
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、５’→３’方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、キメラ型イントロン、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドをコードする核酸配列、ポリＡ配列、及び第２のＩＴＲ配列を含む。
【0013】
いくつかの態様において、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様において、第１のＩＴＲ配列は、配列番号１に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様において、第２のＩＴＲ配列は、配列番号２に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様において、エンハンサー配列は、配列番号５に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様において、プロモーター配列は、配列番号６に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリＡ配列は、配列番号８に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、配列番号９に記載の核酸配列を含む。
【0014】
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターとしてパッケージ化される。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質である。
【0015】
いくつかの態様において、投与量は約１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇである。
【0016】
いくつかの態様において、対象は、さらにプレドニゾンを投与される。いくつかの態様において、プレドニゾンは、ＡＡＶウイルスベクターを投与する２４時間前に１日１回４０ｍｇ、ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１週目～８週目に１日１回４０ｍｇ、ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の９週目に１日１回３０ｍｇ、ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１０週目に１日１回２０ｍｇ、ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１１週目に１日１回１０ｍｇ、ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１２週目に１日１回５ｍｇ、ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１３週目に１日１回２．５ｍｇ、及びＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１４週目に１日おきに２．５ｍｇの投与量で投与される。
【0017】
いくつかの態様において、静脈内投与は、約６０分にわたり行われる。
【0018】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、ピークＶＯ２の増加を経験する。
【0019】
いくつかの態様において、対象におけるピークＶＯ２は、ＡＡＶベクターを投与してから約１２週間後、約２４週間後、約３６週間後、約５２週間後、約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、及び／または約５年後に測定される。いくつかの態様において、ピークＶＯ２は、腕エルゴメトリーを用いた心肺運動負荷試験（ＣＰＥＴ）により測定される。
【0020】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、左心室重量係数（ＬＶＭｉ）の減少を経験する。いくつかの態様において、ＬＶＭｉの減少は、ＡＡＶベクターを投与してから約１２週間後、約２４週間後、約３６週間後、約５２週間後、約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、及び／または約５年後に測定される。いくつかの態様において、ＬＶＭｉは心臓ＭＲＩにより測定される。
【0021】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、心臓ＭＲＩによる測定において、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、長軸方向グローバルストレインの減少、一回心拍出量の増加、左室駆出率（ＬＶＥＦ）の増加、及び心臓線維化の減少または安定のうちの１つ以上を経験する。いくつかの態様において、心臓ＭＲＩによる測定は、ＡＡＶベクターを投与してから約１２週間後、約２４週間後、約３６週間後、約５２週間後、約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、及び／または約５年後に行われる。
【0022】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、血清ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ｈｓＴＮＴ、及びＣＫ－ＭＢレベルの減少を経験する。
【0023】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、心不整脈の減少を経験する。いくつかの態様において、心不整脈は、遠隔心調律モニタリングにより評価される。
【0024】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、修正疲労影響スケール（ＭＦＩＳ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆａｔｉｇｕｅ Ｉｍｐａｃｔ Ｓｃａｌｅ）または疲労重症度スケール（ＦＳＳ）による測定において、疲労の減少を経験する。
【0025】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、修正ボルグ呼吸困難、ボルグ知覚疲労評価（ＲＰＥ）、及びＣＰＥＴを用いた狭心症スケールによる測定において、（腕エルゴメトリーによるＣＰＥＴ中の）労作症状の改善を経験する。
【0026】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、ＦＸＮ発現レベルの増加を経験する。いくつかの態様において、ＦＸＮレベルは心筋ＦＸＮ発現レベルである。いくつかの態様において、心筋ＦＸＮ発現は、心臓生検により測定される。
【0027】
いくつかの態様において、対象は、ＦＸＮ発現レベルの少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％の増加を経験する。
【0028】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、フリードライヒ運動失調症評価スケール（ＦＡＲＳ）または修正フリードライヒ運動失調症評価スケール（ｍＦＡＲＳ）の改善または安定化を経験する。
【0029】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、運動失調の評価スケール（ＳＡＲＡ）の改善または安定化を経験する。
【0030】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、息切れ日常活動スコア（ＳＯＢＤＡ）の改善または安定化を経験する。
【0031】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、シアトル狭心症質問票（ＳＡＱ）の改善または安定化を経験する。
【0032】
上記の任意の態様、または本明細書に記載する任意の他の態様は、任意の他の態様と組み合わせることができる。
【0033】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。本明細書において、文脈による別段の明確な定めがない限り、単数形は複数形も含み、例として、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は単数または複数であるように理解され、「または」という用語は包括的であるものと理解される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは１つ以上の要素を意味する。
【0034】
本開示の実施または試験を行う際は、本明細書に記載の方法及び材料と同様または同等のものを使用することができるが、好適な方法及び材料について以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が援用される。本明細書で引用されている参考文献は、特許請求されている発明に対する先行技術として認められるものではない。矛盾が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先されるものとする。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示的なものに過ぎず、限定的であるようには意図されていない。本開示における他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1A】様々な用量のＡＡＶｒｈ．１０ＦＸＮがＭＣＫマウスにおけるｈＦＸＮの心臓発現に及ぼす影響を示すグラフを示している。図１Ａは、３つの投与量を静脈内投与した後の用量依存的な心臓ｈＦＸＮレベルを示す折れ線グラフを示している。ｘ軸は投与量を示す。ｙ軸はｈＦＸＮタンパク質の総心臓レベルを示す。
【図1B】様々な用量のＡＡＶｒｈ．１０ＦＸＮがＭＣＫマウスにおけるｈＦＸＮの心臓発現に及ぼす効果を示すグラフを示している。図１Ｂは、ＦＡホモ接合体をヘテロ接合体に変換するためのヒトレベル推定に関連する用量依存的心臓ｈＦＸＮレベルを示す棒グラフである。ｘ軸は投与量を示す。ｙ軸は心臓組織中のｈＦＸＮタンパク質レベルを示す。ＦＡにヘテロ接合性の対象における心臓フラタキシンレベルの範囲が、グラフ内の灰色の枠で示されている。
【図2A】ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮの静脈内投与が雄雌ＭＣＫマウスの体重に及ぼす有効性を示す２つのグラフである。ｘ軸は、ベクターを投与した後の時間（日数）を示す。ｙ軸は体重（グラム）を示す。ＰＢＳ処置ＭＣＫマウスの死亡予想が垂直方向の破線で示されている。図２Ａは雄マウスにおけるグラフを示す。
【図2B】ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮの静脈内投与が雄雌ＭＣＫマウスの体重に及ぼす有効性を示す２つのグラフである。ｘ軸は、ベクターを投与した後の時間（日数）を示す。ｙ軸は体重（グラム）を示す。ＰＢＳ処置ＭＣＫマウスの死亡予想が垂直方向の破線で示されている。図２Ｂは雌マウスにおけるグラフを示す。
【図3】３つの処置群（野生型／無処置；ＭＣＫ／ＰＢＳモック処置；ＭＣＫ／１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ）において、処置後の複数の時点でマウスの心臓組織を撮影した一連の心エコー検査画像を示している。画像は、傍胸骨短軸像からの左心室の側壁（上）及び中隔壁（下）を示す。垂直方向の破線は、収縮期（緑色）及び拡張期（赤色）における壁の相対的な位置を比較するものである。
【図4A】１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇのＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを静脈内投与したＭＣＫマウスにおける心機能改善を示す２つのグラフである。図４Ａは、３つの処置群におけるマウスの心臓駆出率を示している。治療群ごとに線を表示している。ｘ軸はマウスの週齢を示す。ｙ軸は駆出率を示す。
【図4B】１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇのＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを静脈内投与したＭＣＫマウスにおける心機能改善を示す２つのグラフである。図４Ｂは、それぞれの線の隣に示す３群のマウスにおける心臓短縮率を示している。ｘ軸はマウスの週齢を示す。ｙ軸は短縮パーセンテージを示す。
【図5】ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮの静脈内投与がＭＣＫマウスの生存に及ぼす用量依存的影響を示す生存曲線を示している。マウスに３つの用量のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ、またはＰＢＳによるモック処置を投与した。線は処置に従って表示されている。ｘ軸はマウスの日齢を示す。ｙ軸は生存パーセントを示す。
【図6】ＭＣＫマウスにおいて定量された最小有効用量及び有意な有効用量の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における影響について評価する例示的モデルの模式図を示している。２つの用量を静脈内投与し、モック処置したＰＢＳ対照と比較した。投与から１２週間後に心臓組織を採取し、ｈＦＸＮレベルを評価した。
【図7A】図６に示す例示的なモデルを用いて、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮが非ヒト霊長類におけるｈＦＸＮの心臓発現に及ぼす影響を示す２つのグラフを示している。図７Ａは、非ヒト霊長類の心臓組織における用量依存的なｈＦＸＮレベルを示す棒グラフを示している。ｘ軸は処置群を示す。ｙ軸はｈＦＸＮレベルを示す。ＰＢＳ対照群のｈＦＸＮレベルは水平方向の破線で示されている。
【図7B】図６に示す例示的なモデルを用いて、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮが非ヒト霊長類におけるｈＦＸＮの心臓発現に及ぼす影響を示す２つのグラフを示している。図７Ｂは、ｈＦＸＮのヘテロ接合体標的レベルに対する関連性を示す棒グラフを示している。ｘ軸はベクター用量を示す。ｙ軸はｈＦＸＮレベルを示す。ＦＡにおいてヘテロ接合性の対象における心臓フラタキシンレベルの範囲が、グラフ内の灰色の枠により示されている。
【発明を実施するための形態】
【0036】
本開示は、対象におけるフリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を治療または予防する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療有効量を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、ベクターは、１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｇｃ／ｋｇの範囲の用量の治療有効量で投与される。いくつかの態様において、ベクターは静脈内投与される。
【0037】
ＡＡＶベクター
いくつかの態様において、フラタキシン（ＦＸＮ）をコードする核酸配列を含む単離核酸配列は、ＡＡＶベクターであり得る。
いくつかの態様において、フラタキシン（ＦＸＮ）をコードする核酸配列を含む単離核酸配列は、ＡＡＶベクターであり得る。
【0038】
本明細書で使用する場合、「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」という用語は、この名称に関連し、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、共感染ヘルパーウイルスによってある特定の機能を与えられた細胞内で成長する一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶについての全般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。様々な血清型が、構造及び機能の両方において、さらには遺伝子レベルでも、かなり密接に関連していることが周知されているため、これらの概説で述べられているのと同じ原理が、これらの概説の発表日以降に特徴付けられたさらなるＡＡＶ血清型にも適用可能であることは十分に予想される（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．のｐｐ．１６５－１７４）；及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１ （１９７４）を参照）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子により媒介される非常に類似した複製特性を明らかに示しており、いずれもＡＡＶ２で発現されるような３つの関連するカプシドタンパク質を有する。さらに、ゲノムの長さに沿った血清型間での広範なクロスハイブリダイゼーション、及び「逆方向末端リピート配列」（ＩＴＲ）に対応する類似の自己アニーリングセグメントが末端に存在することを明らかにしたヘテロデュプレックス分析により、関連性の程度がさらに示唆される。また、感染性パターンの類似性からは、各血清型における複製機能が同様の調節制御下にあることも示唆される。このウイルスの複数の血清型が遺伝子送達に適していることが知られており、全ての既知の血清型が様々な組織タイプの細胞に感染することができる。少なくとも１１の連続でナンバリングされたＡＡＶ血清型が当技術分野で知られている。本明細書で開示する方法に有用な非限定的な例示的な血清型としては、１１の血清型のいずれか、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはバリアント血清型、例えば、ＡＡＶ－ＤＪ及びＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂが挙げられる。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルスタンパク質ＶＰｌ、ＶＰ２、及びＶＰ３を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。いくつかの態様において、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶｒｈ．１０を指す。
【0039】
例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスとしては、限定されるものではないが、全ての血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、及びＡＡＶｒｈ．１０）が挙げられる。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスとしては、限定されるものではないが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、ならびにある血清型のゲノム及び別の血清型のカプシドを含むＡＡＶハイブリッド（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８）が挙げられる。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスとしては、限定されるものではないが、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＫＰ－１（詳細はＫｅｒｕｎ ｅｔ ａｌ．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１９；４（２２）：ｅ１３１６１０に記載）、及びＡＡＶ－ＮＰ５９（詳細はＰａｕｌｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８；２６（１）：２８９－３０３に記載）が挙げられる。
【0040】
ＡＡＶは複製欠損型パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムの長さは約４．７ｋｂであり、２つの１４５ヌクレオチド逆方向末端リピート（ＩＴＲ）が含まれる。ＡＡＶには複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムの塩基配列が知られている。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿ｌ８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、米国特許第９，４３４，９２８号に記載されている。また、米国特許第９，４３４，９２８号も、カプシドタンパク質の配列及び自己相補的ゲノムを提供している。いくつかの態様において、ＡＡＶゲノムは自己相補的ゲノムである。ウイルスのＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド化／パッケージ化、及び宿主細胞の染色体統合を指示するシス作用配列が、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（相対的なマップ位置からｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と称される）が、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）により、１つのＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７及び２２２７）の差次的スプライシングを伴って、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）が生成される。ｒｅｐタンパク質は複数の酵素的性質を有し、究極的にはウイルスゲノムの複製に関与する。
【0041】
ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現し、３つのカプシドタンパク質ＶＰｌ、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位が、３つの関連カプシドタンパク質の生成に関与する。より具体的には、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の各々が翻訳される単一のｍＲＮＡが転写された後、これが２つの異なる方法でスプライシングされる。すなわち、長いイントロンまたは短いイントロンが切除され得、その結果、２．３ｋｂ長及び２．６ｋｂ長の２つのｍＲＮＡプールが形成される。長い方のイントロンがしばしば好まれるため、２．３ｋｂ長のｍＲＮＡはメジャースプライスバリアントと呼ばれることがある。この形態は、ＶＰ１タンパク質の合成を開始する最初のＡＵＧコドンが欠如しており、その結果、ＶＰ１タンパク質の合成レベルが全体的に低減される。メジャースプライスバリアントに残存する最初のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかし、同じオープンリーディングフレーム内のこのコドンの上流には、最適なＫｏｚａｋ（翻訳開始）コンテキストに囲まれたＡＣＧ配列（スレオニンをコード）が存在する。これは、ＶＰ２タンパク質（実際には、ＶＰ１と同様に、ＶＰ３タンパク質にＮ末端残基が付加されたもの）が低いレベルで合成されることに寄与している（Ｂｅｃｅｒｒａ ＳＰ ｅｔ ａｌ．，（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８５）．“Ｄｉｒｅｃｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ：ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ＡＣＧ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．８２（２３）：７９１９－２３；Ｃａｓｓｉｎｏｔｔｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８８）．“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ：ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｉｎｏｒ ｓｐｌｉｃｅｄ ｍＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１６７（１）：１７６－８４；Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｊａｎｕａｒｙ １９９４）．“Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６８（１）：１７０－６；及びＴｒｅｍｐｅ ＪＰ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８８）．“Ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６２（９）：３３５６－６３（これらの各々が、参照により本明細書に援用される）に記載されている通り）。単一のコンセンサスポリＡ部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に存在する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）で概説されている。
【0042】
各ＶＰ１タンパク質は、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、及びＶＰ３部分を含む。ＶＰ１部分は、ＶＰ１タンパク質にユニークなＶＰ１タンパク質のＮ末端部分である。ＶＰ２部分は、ＶＰ１タンパク質内に存在するアミノ酸配列であり、これはＶＰ２タンパク質のＮ末端部分にも存在する。ＶＰ３部分及びＶＰ３タンパク質は同じ配列を有する。ＶＰ３部分は、ＶＰ１及びＶＰ２タンパク質と共有されるＶＰ１タンパク質のＣ末端部分である。
【0043】
ＶＰ３タンパク質はさらに、離散した可変表面領域Ｉ～ＩＸ（ＶＲ－Ｉ～ＩＸ）に分類することができる。可変表面領域（ＶＲ）の各々は、単独でまたは他のＶＲの各々の特定のアミノ酸配列との組合せで、ユニークな感染表現型（例えば、他のＡＡＶ血清型と比較しての抗原性の減少、形質導入の改善、及び／または組織特異的トロピズム）を特定の血清型に付与することができる、特定のアミノ酸配列を含むまたは含有することができる（ＤｉＭａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．８６（１２）：６９４７－６９５８，Ｊｕｎｅ ２０１２（この内容は参照により本明細書に援用される）に記載の通り）。
【0044】
ＡＡＶは、例えば遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしての魅力をもたらすユニークな特徴を有する。ＡＡＶの培養下細胞への感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物への自然感染は無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳類細胞に感染することから、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的とする可能性が得られる。さらに、ＡＡＶは、ゆっくり分裂する細胞及び非分裂細胞に形質導入し、転写的に活性の核エピソーム（染色体外エレメント）として、本質的にそれらの細胞の一生にわたり持続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、クローンＤＮＡとしてプラスミドに挿入されるため、組換えゲノムの構築を実現可能にする。さらに、ＡＡＶ複製及びゲノムカプシド化を指示するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、（複製及び構造カプシドタンパク質ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）ゲノムの内部のおよそ４．３ｋｂの一部または全部を外来ＤＮＡで置き換えて、ＡＡＶベクターを生成することができる。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質はトランスで提供されることもある。ＡＡＶのもう１つの重要な特徴は、極めて安定し頑健なウイルスであるということである。アデノウイルスの不活性化に使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐えることから、ＡＡＶの低温保存は重要ではない。ＡＡＶはさらに凍結乾燥することができる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は重複感染に抵抗性ではない。
【0045】
複数の研究から、組換えＡＡＶ媒介性タンパク質が長期（１．５年超）にわたり筋肉内で発現することが実証されている。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃ ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）；及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照。また、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照。さらに、筋肉は高度に血管形成されているため、組換えＡＡＶ形質導入を行った結果、筋肉内注射後に、全身循環中に導入遺伝子産物が出現した（Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載の通り）。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が正しい抗体グリコシル化、フォールディング、及び分泌に必要な細胞因子を有することを実証した。これは、筋肉で分泌タンパク質治療薬の安定した発現が可能であることを示すものである。本発明の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳに対し向けられた少なくとも１つのショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子と、核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲとを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。シュードタイプｒＡＡＶの生成については、例えば、ＷＯ２００１０８３６９２で開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照。当技術分野では、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が知られている。
【0046】
本明細書で使用する場合、「ＡＡＶベクター」とは、１つ以上の導入遺伝子配列と、１つ以上のＡＡＶ逆方向末端リピート配列（ＩＴＲ）とを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなるベクターに関するものである。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、エンハンサー、プロモーター、少なくとも１つのタンパク質をコードすることができる少なくとも１つの核酸、イントロン配列、及びポリＡ配列のうちの１つ以上を含む。
【0047】
いくつかの態様において、本発明は、心筋症の治療または予防を、それを必要とする対象において行うのに使用するための、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターに関する。
【0048】
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療または予防を、それを必要とする対象において行うのに使用するための、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターに関する。
【0049】
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の症状の回復または安定化を、それを必要とする対象において行うための、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターに関する。
【0050】
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心臓ミトコンドリアの機能不全の回復を、それを必要とする対象において行うための、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターに関する。
【0051】
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心臓ミトコンドリアの改善を、それを必要とする対象において行うための、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターに関する。
【0052】
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を患う対象における心機能を修復するための、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターに関する。
【0053】
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を患う対象における心機能を改善するための、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターに関する。
【0054】
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療を、それを必要とする無症候性または前症候性の対象において行うのに使用するための、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターに関する。
【0055】
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療を、それを必要とする症候性の対象において行うのに使用するための、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターに関する。
【0056】
いくつかの態様において、本開示の方法に使用されるＡＡＶベクターは、５’→３’方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、キメラ型イントロン配列、フラタキシンをコードする核酸配列、ポリＡ配列、及び第２のＩＴＲ配列を含む。
【0057】
いくつかの態様において、本開示のフラタキシンコードＡＡＶベクターは、配列番号９に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
フラタキシンをコードする核酸配列
フラタキシンをコードする核酸配列
【0058】
いくつかの態様において、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0059】
いくつかの態様において、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0060】
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を治療するための、配列番号３またはそのバリアントを含む核酸配列を提供する。
【0061】
バリアントとしては、例えば、個体間のアレル変異（例えば、多型）に起因する天然のバリアント、選択的スプライシング形態、特に転写バリアント２及び３（アクセッション番号ＮＭ＿００１１６１７０６及びＮＭ＿１８１４２５）などが挙げられる。バリアントという用語は、他の供給源または生物からのＦＸＮ遺伝子配列も含む。バリアントは、好ましくは、配列番号３と実質的に相同であり、すなわち、配列番号３に対し、典型的には少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性を示す。また、ＦＸＮ遺伝子のバリアントは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記で定義されるような配列（またはその相補鎖）にハイブリダイズする核酸配列も含む。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３０℃超、好ましくは３５℃超、より好ましくは４２℃を上回る温度、及び／または約５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満の塩分が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者が、温度、塩分、及び／または他の試薬（例えば、ＳＤＳ、ＳＳＣなど）の濃度を変更することにより調整することができる。
【0062】
いくつかの態様において、ＦＸＮコード核酸は配列番号３のフラグメントである。
【0063】
いくつかの態様において、ミトコンドリア標的化シグナルまたはミトコンドリア標的化シグナルとして知られる配列を、ＦＸＮコード配列またはそのバリアント（例えば、ＦＸＮコード配列「８１－２１０」を含む）に付加することができる。ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ）標的化シグナルまたはミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）標的化シグナルとして知られる配列は、当業者にＭＴＳと称されている。
【0064】
ＭＴＳ配列は、当業者によりタンパク質または核酸の配列内で特定することができる。
【0065】
ほとんどのミトコンドリア標的ペプチドは、約１５～１００残基、好ましくは約２０～８０残基のＮ末端プレ配列からなる。これらは、アルギニン、ロイシン、セリン、及びアラニンに富む。ミトコンドリアプレ配列は、正に荷電したアミノ酸残基（ほとんどはアルギニン残基を介し提供される）の統計的バイアス偏りを示し、ごく少数の配列は負に荷電したアミノ酸を含む。ミトコンドリア標的化ペプチドは、両親媒性アルファヘリックスを形成する能力も共有する。
【0066】
ＭＴＳを特定する方法についての完全な説明は、Ｍ．Ｇ．Ｃｌａｒｏｓ，Ｐ．Ｖｉｎｃｅｎｓ，１９９６（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４１，７７９－７８６（１９９６），“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”）（当該文献の内容は参照により本明細書に援用される）で得られる。
【0067】
逆方向末端リピート配列
「逆方向末端リピート」または「ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの両端に存在する当技術分野で認識された領域を意味し、ＤＮＡ複製の起点として、またウイルスのパッケージ化シグナルとして、シスで一緒に機能する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒に、２つのフランキングＩＴＲの間に介在するヌクレオチド配列を効率的に切除し、レスキューし、哺乳類細胞ゲノムに統合する。ＡＡＶ ＩＴＲ領域の塩基配列が知られている。例えば、ＡＡＶ－２配列についてはＫｏｔｉｎ，１９９４；Ｂｅｒｎｓ，ＫＩ“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照。本明細書で使用する場合、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、必ずしも野生型ヌクレオチド配列を含むとは限らず、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により改変されてもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、数種のＡＡＶ血清型（限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６などを含む）のうちのいずれかに由来してもよい。さらに、ＡＡＶベクター内の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、意図された通りに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的配列を切除しレスキューできるようにし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在するときに、異種配列をレシピエント細胞ゲノムに統合できるように機能する限り、必ずしも同一である必要はなく、また同じＡＡＶ血清型または単離株に由来する必要もない。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、数種のＡＡＶ血清型（限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６などを含む）のうちのいずれかに由来してもよい。さらに、ＡＡＶ発現ベクター内の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、意図された通りに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的配列を切除及びレスキューできるようにし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在するときに、ＤＮＡ分子をレシピエント細胞ゲノムに統合できるように機能する限り、必ずしも同一である必要はなく、また同じＡＡＶ血清型または単離株に由来する必要もない。
「逆方向末端リピート」または「ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの両端に存在する当技術分野で認識された領域を意味し、ＤＮＡ複製の起点として、またウイルスのパッケージ化シグナルとして、シスで一緒に機能する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒に、２つのフランキングＩＴＲの間に介在するヌクレオチド配列を効率的に切除し、レスキューし、哺乳類細胞ゲノムに統合する。ＡＡＶ ＩＴＲ領域の塩基配列が知られている。例えば、ＡＡＶ－２配列についてはＫｏｔｉｎ，１９９４；Ｂｅｒｎｓ，ＫＩ“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照。本明細書で使用する場合、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、必ずしも野生型ヌクレオチド配列を含むとは限らず、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により改変されてもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、数種のＡＡＶ血清型（限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６などを含む）のうちのいずれかに由来してもよい。さらに、ＡＡＶベクター内の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、意図された通りに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的配列を切除しレスキューできるようにし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在するときに、異種配列をレシピエント細胞ゲノムに統合できるように機能する限り、必ずしも同一である必要はなく、また同じＡＡＶ血清型または単離株に由来する必要もない。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、数種のＡＡＶ血清型（限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６などを含む）のうちのいずれかに由来してもよい。さらに、ＡＡＶ発現ベクター内の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、意図された通りに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的配列を切除及びレスキューできるようにし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在するときに、ＤＮＡ分子をレシピエント細胞ゲノムに統合できるように機能する限り、必ずしも同一である必要はなく、また同じＡＡＶ血清型または単離株に由来する必要もない。
【0068】
いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、当技術分野で知られている任意のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ配列であり得る。
【0069】
したがって、いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0070】
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列または修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0071】
いくつかの態様において、第１のＩＴＲは、配列番号１に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列またはその相補配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。いくつかの態様において、第１のＩＴＲは、配列番号２に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列またはその相補配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0072】
いくつかの態様において、第２のＩＴＲは、配列番号１に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列またはその相補配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
いくつかの態様において、第２のＩＴＲは、配列番号２に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列またはその相補配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
いくつかの態様において、第２のＩＴＲは、配列番号２に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列またはその相補配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0073】
プロモーター及びエンハンサー配列
本明細書で使用する場合、「プロモーター」及び「プロモーター配列」という用語は、遺伝子または導入遺伝子などのコード配列の転写の開始及び速度が制御されるポリヌクレオチド配列の一領域である制御配列を意味する。プロモーターは、例えば、構成的、誘導性、抑制性、または組織特異的であり得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合することができる遺伝子エレメントを含むことができる。
本明細書で使用する場合、「プロモーター」及び「プロモーター配列」という用語は、遺伝子または導入遺伝子などのコード配列の転写の開始及び速度が制御されるポリヌクレオチド配列の一領域である制御配列を意味する。プロモーターは、例えば、構成的、誘導性、抑制性、または組織特異的であり得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合することができる遺伝子エレメントを含むことができる。
【0074】
選択されたヌクレオチド配列、例えばフラタキシンコードヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｖｏで対象におけるその転写または発現を指示する制御エレメントに作用可能に結合している。このような制御エレメントは、選択された遺伝子に通常関連する制御配列を含むことができる。
【0075】
代替形態として、異種の制御配列を用いてもよい。有用な異種の制御配列としては、概して、哺乳類またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来する配列が挙げられる。例としては、限定されるものではないが、ホホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）プロモーター、ＣＡＧ、ＭＣＫ（筋クレアチンキナーゼ）、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。プロモーターは、ヒト起源であっても、マウスを含む他の種に由来してもよい。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列も本明細書で使用される。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。
【0076】
異種プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーターが挙げられる。
【0077】
誘導性プロモーターの例としては、エクジソン、テトラサイクリン、ハイポキシア、及びオーフィン（ａｎｄａｕｆｉｎ）に対するＤＮＡ応答性エレメントが挙げられる。
【0078】
エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター及びエンハンサーの両方の機能を提供可能な配列を含むポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの長末端リピートには、プロモーター及びエンハンサーの両方の機能が含まれる。エンハンサー／プロモーターは、「内在性」の場合も「外在性」の場合も「異種性」の場合もある。「内在性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子と天然に結合しているものである。「外在性」または「異種性」のエンハンサーまたはプロモーターは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）または合成技法により遺伝子に並列して配置され、その結果遺伝子の転写が結合したエンハンサー／プロモーターによって指示されるエンハンサーまたはプロモーターである。本明細書で提供する方法、組成物、及びコンストラクトに使用するための結合したエンハンサー／プロモーターの非限定的な例としては、ＣＢＡプロモーターに結合したＣＭＶエンハンサーが挙げられる。当技術分野では、エンハンサーは離れた位置でも、また内在性または異種プロモーターの位置に対する向きにかかわらず作用し得ると理解されている。したがって、プロモーターから離れた位置で作用するエンハンサーは、ベクター内の位置またはプロモーターの位置に対する向きにかかわらず、そのプロモーターに「作用可能に結合」しているとさらに理解される。
【0079】
本開示の全体で使用する場合、「作用可能に結合した」という用語は、空間的に接続したプロモーターの制御下にある遺伝子（すなわち、導入遺伝子）の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）側または３’（下流）側に位置することができる。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）側に位置することができる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子内でのプロモーターとプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。プロモーターと遺伝子との間の距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに適応させることができる。
【0080】
いくつかの態様において、エンハンサー配列は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。ＣＭＶエンハンサー配列は、配列番号５に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0081】
いくつかの態様において、プロモーター配列は、ニワトリβ－アクチンプロモーター配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。ニワトリβ－アクチンプロモーター配列は、配列番号６に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0082】
イントロン配列
いくつかの態様において、イントロン配列は、当技術分野で知られている任意のイントロン配列を含むことができる。いくつかの態様において、イントロン配列はキメラ型イントロン配列であり得る。いくつかの態様において、キメラ型イントロン配列は、配列番号７に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含むか、本質的になることができる。
いくつかの態様において、イントロン配列は、当技術分野で知られている任意のイントロン配列を含むことができる。いくつかの態様において、イントロン配列はキメラ型イントロン配列であり得る。いくつかの態様において、キメラ型イントロン配列は、配列番号７に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含むか、本質的になることができる。
【0083】
ポリアデニル化配列
いくつかの態様において、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、当技術分野で知られている任意のポリＡ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ポリＡ配列はβ－グロビンポリＡ配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。β－グロビンポリＡ配列は、配列番号８に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
いくつかの態様において、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、当技術分野で知られている任意のポリＡ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ポリＡ配列はβ－グロビンポリＡ配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。β－グロビンポリＡ配列は、配列番号８に対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはこの間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。
【0084】
ＡＡＶウイルスベクター
本開示のＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスベクターとしてパッケージ化することができる。
本開示のＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスベクターとしてパッケージ化することができる。
【0085】
「ＡＡＶウイルスベクター」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、カプシド化ポリヌクレオチドＡＡＶベクターとを含むウイルス粒子を指す。したがって、ＡＡＶウイルスベクターの生成は、必然的にＡＡＶベクターの生成を含む。「ウイルスカプシド」または「カプシド」という用語は、ウイルス粒子のタンパク質性の殻または被膜を指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシド化し、保護し、輸送し、宿主細胞内に放出する。概して、カプシドは、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「カプシドタンパク質」）から構成されている。本明細書で使用する場合、「カプシド化」という用語は、ウイルスカプシド内に封入されていることを意味する。ＡＡＶのウイルスカプシドは、３つのウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の混合物から構成されている。
【0086】
本発明の実施に有用なＡＡＶウイルスベクターは、分子生物学の技術分野で周知されている方法論を利用して構築することができる。典型的には、導入遺伝子を有するＡＡＶウイルスベクターは、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、好適な調節エレメント、及び細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の生成に必要なエレメントから組み立てられる。
【0087】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法またはシステムを指す。このような方法により、統合されていない移入ＤＮＡを一過性発現したり、移入レプリコン（例えば、エピソーム）を染色体外で複製及び発現させたり、移入遺伝子材料を宿主細胞のゲノムＤＮＡに統合したりすることができる。
【0088】
ウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。
【0089】
このような組換えウイルスは、当技術分野で知られている技法（例えば、パッケージ化細胞の形質移入、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスによる一過性形質移入）により生成することができる。ウイルスパッケージ化細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコルについては、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６、及びＷＯ９４／１９４７８で見出すことができる。
【0090】
１つの実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが用いられる。
【0091】
他の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．１０、またはヒト、サル、もしくは他の種に感染することができる当技術分野で知られている任意の他のＡＡＶ血清型である。
【0092】
例示的な実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶｒｈ１０ベクターである。
【0093】
「ＡＡＶベクター」とは、アデノ随伴ウイルス血清型（限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶｒｈ．１０を含む）に由来するベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上を、全体的または部分的に、好ましくはｒｅｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子を欠失させることができるが、機能的フランキングＩＴＲ配列は保持することができる。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、及びパッケージ化に必要である。したがってＡＡＶベクターは、本明細書では、少なくともウイルスの複製及びパッケージ化にシスで要求される配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含むものと定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、また配列が機能的なレスキュー、複製、及びパッケージ化を提供する限りはヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により改変されてもよい。ＡＡＶ発現ベクターは、少なくとも、転写方向に作用可能に結合した構成要素として、転写開始領域と目的ＤＮＡ（すなわちＦＸＮ遺伝子）と転写終結領域とを含む制御エレメントを提供するために、既知の技法を用いて構築される。
【0094】
制御エレメントは、哺乳類細胞で機能するように選択される。作用可能に結合した構成要素を含む得られたコンストラクトは、機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列と（５’及び３’に）結合している。
【0095】
特に好ましいのは、哺乳類の心筋の細胞、特に心筋細胞及び心筋細胞前駆体に対するトロピズム及び高い導入効率を有するＡＡＶ血清型に由来するベクターである。異なる血清型の形質導入効率の概説と比較については、Ｃｅａｒｌｅｙ ＣＮ ｅｔ ａｌ．，２００８に示されている。他の非限定的な例において、好ましいベクターとしては、心筋細胞の細胞を形質導入することも示されているＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０のような任意の血清型に由来するベクターが挙げられる。
【0096】
ＡＡＶ ＩＴＲにより結合している目的ＤＮＡ分子を有するＡＡＶ発現ベクターは、そこから主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を切除したＡＡＶゲノムに、選択された配列（複数可）を直接挿入することにより構築することができる。ＡＡＶゲノムの他の部分も、複製及びパッケージ化機能を得るのに十分なＩＴＲの部分が残存する限りは欠失させてもよい。このようなコンストラクトは、当技術分野で周知されている技法を用いて設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び同第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日発行）及び同第ＷＯ９３／０３７６９号（１９９３年３月４日発行）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｃａｒｔｅｒ，１９９２；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２ ；Ｋｏｔｉｎ，１９９４；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９４；ならびにＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照。代替形態として、ＡＡＶ ＩＴＲは、標準的なライゲーション技法を用いて、ウイルスゲノムから、または同じものを含むＡＡＶベクターから切除し、別のベクターに存在する選択された核酸コンストラクトの５’及び３’を融合させることができる。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターについては、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。詳細には、この文献にはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）からアクセッション番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５、及び５３２２６で入手可能ないくつかのＡＡＶベクターが記載されている。さらに、キメラ遺伝子は、１つ以上の選択された核酸配列の５’及び３’に配置されたＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むように合成的に生成することができる。哺乳類ＣＮＳ細胞内でキメラ型遺伝子配列を発現するのに好ましいコドンを使用することができる。完全なキメラ型配列は、標準的な方法により調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，１９８１；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照。ＡＡＶビリオンを生成するため、ＡＡＶ発現ベクターは、形質移入などの既知の技法を用いて好適な宿主細胞に導入される。多くの形質移入技法が当技術分野で一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ ｅｔａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１を参照。特に好適な形質移入方法としては、リン酸カルシウム共沈殿（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３）、培養細胞への直接マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８０）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、リポソーム媒介遺伝子移入（Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、脂質媒介形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、及び高速マイクロプロジェクタイルを用いた核酸送達（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）が挙げられる。
【0097】
例えば、ＡＡＶｒｈ１０などの好ましいウイルスベクターは、ＦＸＮをコードする核酸配列に加えて、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲを有するＡＡＶベクターの骨格、プロモーター、例えば、マウスＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）遺伝子もしくはサイトメガロウイルス最初期遺伝子由来のエンハンサーからなるサイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ）、ニワトリβ－アクチン遺伝子由来のプロモーター、スプライスドナー、及びイントロン、ウサギβ－グロビン由来のスプライスアクセプター、またはＰＧＫ、ＣＡＧ、ＭＣＫなどの任意のプロモーターを含む。
【0098】
本開示のＡＡＶウイルスベクターは、ｉ）本明細書に記載のＡＡＶベクターと、ｉｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質とを含む。
【0099】
いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は任意のＡＡＶカプシドタンパク質であり得る。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である。
【0100】
治療方法
本発明の第１の目的は、心筋症の治療または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
本発明の第１の目的は、心筋症の治療または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0101】
特定の実施形態において、心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症である。
【0102】
別の特定の実施形態において、心筋症は、脂肪酸化の欠損（限定されるものではないが、原発性カルニチン欠損症、ＬＣＨＡＤ、トランスロカーゼ、ＶＬＣＡＤを含む）に起因する心筋症であり得る。
【0103】
別の特定の実施形態において、心筋症は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症であり得る。
【0104】
特定の実施形態において、ＡＡＶベクター内の核酸配列によりコードされる遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のサブユニットをコードする核遺伝子、酸化的リン酸化に関与する複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、もしくはＶのサブユニットをコードする核もしくはミトコンドリア遺伝子、移入ＲＮＡをコードするミトコンドリア遺伝子、ＳＩＲＴ１などのミトコンドリアの生合成に関与する遺伝子、ＯＰＡ１などのミトコンドリアの融合に関与する遺伝子、ＦＩＳ１などのミトコンドリアの分裂に関与する遺伝子、または超長鎖特異的アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼなどの脂肪酸の酸化に関与する遺伝子であり得る。
【0105】
特定の実施形態において、ＡＡＶベクター内の核酸配列によりコードされる遺伝子は、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子である。
【0106】
本明細書で最も広い意味で使用する場合、「予防すること」または「予防」という用語は、疾患または状態が、それを有するとまだ診断されていないまたは臨床症状を有しない対象に発生するのを予防することを指す。
【0107】
本明細書で使用する場合、「治療すること」または「治療」という用語は、このような用語が該当する障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の１つ以上の症状の進行を回復、緩和、または阻害することを意味する。「治療有効量」は、対象に治療上の利益を付与するのに必要な活性薬剤の最小量が意図されている。例えば、患者に対する「治療有効量」とは、障害に屈することに関連するまたは抵抗性の病理学的症状、疾患の進行、または生理的状態を誘導、緩和、安定化、その進行を低速化する、または他の形で改善を引き起こす量である。
【0108】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳類（例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類）を意味する。いくつかの態様において、本発明に従う対象はヒトである。本発明の文脈において、「それを必要とする対象」とは、対象、好ましくはヒト、より詳細にはフリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を有する対象を示す。フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を有する対象は、いくつかの心臓の症状を提示し、このような症状は、限定されるものではないが、駆出率の減少、心室重量の増加、または心肥大であり得る。したがって、本発明の方法は、このような症状を提示する疾患（フリードライヒ運動失調症）を有する対象の治療に非常に有用である。
【0109】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、転写及び翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることが可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。
【0110】
本明細書で使用する場合、「コード配列」、「特定のタンパク質をコードする配列」、または「コード核酸」という用語は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列を示す。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列としては、限定されるものではないが、原核生物または真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が挙げられる。
【0111】
特定の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の予防または治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0112】
特定の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0113】
特定の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の症状の回復または安定化を、それを必要とする対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0114】
本明細書で使用する場合、「フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の症状を回復させる」という用語は、例えば、駆出率の改善及び／または心室重量の減少により、心機能の復旧を、それを必要とする対象において行うことを示す。
【0115】
特定の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心臓ミトコンドリアの機能不全の回復を、それを必要とする対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0116】
特定の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心臓ミトコンドリアの改善を、それを必要とする対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0117】
特定の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を患う対象における心機能を回復させるための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0118】
特定の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を患う対象の心機能を改善するための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0119】
特定の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療を、それを必要とする無症候性または前症候性の対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0120】
別の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療を、それを必要とする症候性の対象において行うための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0121】
本明細書で使用する場合、「無症候性」または「前症候性」という用語は、遺伝子診断により定義される疾患（フリードライヒ運動失調症）（概説はＬｙｎｃｈ ＤＲ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．２００２；５９：７４３－７４７を参照）を有するが、検出可能な臨床的心臓症状を有しない対象を示す。
【0122】
本明細書で使用する場合、症候性という用語は、遺伝子診断により定義される疾患（フリードライヒ運動失調症）を有し、心臓症状（心肥大、線維化、心筋灌流予備係数の低下、心筋または骨格筋ミトコンドリア呼吸鎖機能の障害、不顕性心筋症、上室性不整脈、心不全、収縮期左心室機能不全、疲労…）が存在する対象を示す。
【0123】
ＦＸＮ遺伝子はタンパク質フラタキシンをコードする。フラタキシンは、ミトコンドリアに局在するタンパク質である。フラタキシンは、鉄の進入及びシステイン脱硫酵素の活性を調節することにより、鉄－硫黄クラスターの組立に関与する。
【0124】
いくつかの態様において、本発明は、フラタキシン欠損に関連する疾患の予防または治療を、それを必要とする対象において行うのに使用するための方法であって、フラタキシンをコードする核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0125】
いくつかの態様において、本発明は、心筋症の予防または治療を、それを必要とする対象において行うのに使用するための方法であって、フラタキシン（ＦＸＮ）コード核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、方法に関する。
【0126】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、ピーク酸素消費（ピークＶＯ２）の増加を経験する。いくつかの態様において、対象におけるピークＶＯ２は、ＡＡＶベクターを投与してから約１２週間後、約２４週間後、約３６週間後、約５２週間後、約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、及び／または約５年後に測定される。いくつかの態様において、ＶＯ２は、酸素消費の速度を表す基準である。いくつかの態様において、ＶＯ２は、単位時間当たりに消費される酸素の量である。
【0127】
いくつかの態様において、ピークＶＯ２は、腕エルゴメトリーを用いた心肺運動負荷試験（ＣＰＥＴ）により測定される。
【0128】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、左心室重量係数（ＬＶＭｉ）の減少を経験する。
【0129】
いくつかの態様において、ＬＶＭｉの減少は、ＡＡＶベクターを投与してから約１２週間後、約２４週間後、約３６週間後、約５２週間後、ＡＡＶベクターを投与してから約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、及び／または約５年後に測定される。いくつかの態様において、ＬＶＭｉは心臓ＭＲＩにより測定される。
【0130】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、心臓ＭＲＩによる測定において、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、長軸方向グローバルストレインの減少、一回心拍出量の増加、左室駆出率（ＬＶＥＦ）の増加、及び心臓線維化の減少または安定のうちの１つ以上を経験する。
【0131】
いくつかの態様において、心臓ＭＲＩによる測定は、ＡＡＶベクターを投与してから約１２週間後、約２４週間後、約３６週間後、約５２週間後、約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、及び／または約５年後に行われる。
【0132】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、血清ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ｈｓＴＮＴ、及び／またはＣＫ－ＭＢレベルの減少を経験する。
【0133】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、心不整脈の減少を経験する。いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、心筋梗塞の発生の減少を経験する。
【0134】
いくつかの態様において、心不整脈は、遠隔心調律モニタリングにより評価される。
【0135】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、修正疲労影響スケール（ＭＦＩＳ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆａｔｉｇｕｅ Ｉｍｐａｃｔ Ｓｃａｌｅ）または疲労重症度スケール（ＦＳＳ）による測定において、疲労の減少を経験する。
【0136】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、修正ボルグ呼吸困難、ボルグ知覚疲労評価（ＲＰＥ）、及びＣＰＥＴを用いた狭心症スケールによる測定において、（腕エルゴメトリーによるＣＰＥＴ中の）労作症状の改善を経験する。
【0137】
フリードライヒ運動失調症のヘテロ接合体（１つの正常なＦＸＮアレルを有する）はＦＡの臨床症状を有しないことが知られている。一方、ＦＡホモ接合体（２つの異常な及び／または変異したＦＸＮアレルを有する個体）は症状を経験する。５例の健康な個体の心臓の剖検試料において平均ＦＸＮレベルを分析したところ、ヒト心臓におけるＦＸＮの正常レベルが５９±５ｎｇ／ｍｇタンパク質であることが示された。ＦＡホモ接合体の平均心臓フラタキシンタンパク質レベルは約９．４ｎｇ／ｍｇと推定されている。さらに、ＦＡヘテロ接合体は、健康な個体と比較して、正常レベルの３０～８０％（１９～５０ｎｇ／ｍｇフラタキシンタンパク質）のＦＸＮを有することが知られている。理論に束縛されることは望まないが、ＦＡホモ接合体のフラタキシンレベルをＦＡヘテロ接合体または健康な個体のレベル付近またはそれを超えるまで増加させることで、結果としてＦＡホモ接合体による症状の経験が改善すると予想することは合理的である。いくつかの態様において、本明細書で開示するＦＸＮコードベクターのＡＡＶベクターを投与した後、患者はフラタキシンタンパク質発現の増加を経験する。いくつかの態様において、フラタキシンの発現増加は心臓で発生する。
【0138】
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターを投与した後の対象の心臓におけるフラタキシンの量は、投与前のベースラインと比較して、約１ｎｇ／ｍｇ、約２ｎｇ／ｍｇ、約３ｎｇ／ｍｇ、約４ｎｇ／ｍｇ、約５ｎｇ／ｍｇ、約６ｎｇ／ｍｇ、約７ｎｇ／ｍｇ、約８ｎｇ／ｍｇ、約９ｎｇ／ｍｇ、約１０ｎｇ／ｍｇ、約１１ｎｇ／ｍｇ、約１２ｎｇ／ｍｇ、約１３ｎｇ／ｍｇ、約１４ｎｇ／ｍｇ、約１５ｎｇ／ｍｇ、約２０ｎｇ／ｍｇ、約２５ｎｇ／ｍｇ、約３０ｎｇ／ｍｇ、約３５ｎｇ／ｍｇ、約４０ｎｇ／ｍｇ、約４５ｎｇ／ｍｇ、約５０ｎｇ／ｍｇ、約６０ｎｇ／ｍｇ、約７０ｎｇ／ｍｇ、約８０ｎｇ／ｍｇ、約９０ｎｇ／ｍｇ、約１００ｎｇ／ｍｇ、約２００ｎｇ／ｍｇ、約３００ｎｇ／ｍｇ、約４００ｎｇ／ｍｇ、または約５００ｎｇ／ｍｇだけ増加する。
【0139】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、ＦＸＮ発現レベルの増加を経験する。いくつかの態様において、ＦＸＮレベルの増加とは、ＦＸＮのｍＲＮＡレベルの増加を指す。いくつかの態様において、ＦＸＮレベルの増加とは、フラタキシン（ＦＸＮ）タンパク質レベルの増加を指す。
【0140】
いくつかの態様において、ＦＸＮレベルは心筋ＦＸＮ発現レベルである。いくつかの態様において、心筋ＦＸＮ発現は、心臓生検により測定される。
【0141】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、ＦＸＮ発現レベルの少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％の増加を経験する。
【0142】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、フリードライヒ運動失調症評価スケール（ＦＡＲＳ）または修正フリードライヒ運動失調症評価スケール（ｍＦＡＲＳ）の改善または安定化を経験する。
【0143】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、運動失調の評価スケール（ＳＡＲＡ）の改善または安定化を経験する。
【0144】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、息切れ日常活動スコア（ＳＯＢＤＡ）の改善または安定化を経験する。
【0145】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターを投与した後に、ＡＡＶベクターを投与する前のベースラインと比較して、シアトル狭心症質問票（ＳＡＱ）の改善または安定化を経験する。
【0146】
ベクターの送達
本明細書では、対象におけるフリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を治療するための方法であって、（ａ）上記で定義されるような、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターを準備することと、（ｂ）当該ＡＡＶベクターを、それを必要とする対象に送達して、ＦＸＮが形質導入細胞により治療有効レベルで発現することとを含む、方法を提供する。
本明細書では、対象におけるフリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を治療するための方法であって、（ａ）上記で定義されるような、フラタキシン（ＦＸＮ）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターを準備することと、（ｂ）当該ＡＡＶベクターを、それを必要とする対象に送達して、ＦＸＮが形質導入細胞により治療有効レベルで発現することとを含む、方法を提供する。
【0147】
好ましい用量及びレジメンは、医師により決定され得、また対象の年齢、性別、体重、及び疾患のステージに依存し得る。
【0148】
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、対象に静脈内（ＩＶ）投与される。いくつかの態様において、ＩＶ注入は、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４０分、少なくとも約５０分、少なくとも約６０分、少なくとも約７０分、少なくとも約８０分、少なくとも約９０分、少なくとも約１００分、少なくとも約１１０分、または少なくとも約１２０分にわたり行われる。いくつかの態様において、ＩＶ注入は６０分にわたり行われる。
【0149】
いくつかの態様において、対象は、本開示のＡＡＶベクターを治療有効な投与量で投与される。いくつかの態様において、投与量は、１キログラム（ｋｇ）当たり約１．０×１０１０ゲノムコピー（ｇｃ）（ｇｃ／ｋｇ）～約９．９×１０１４ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約６．０×１０１３ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約９．９×１０１３ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約９．９×１０１２ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約９．９×１０１１ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ～約９．９×１０１４ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約９．９×１０１４ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．０×１０１３ｇｃ／ｋｇ～約９．９×１０１４ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．０×１０１４ｇｃ／ｋｇ～約９．９×１０１４ｇｃ／ｋｇである。
【0150】
いくつかの態様において、投与量は、約１．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１．１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１．２×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１．３×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１．４×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１．５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１．６×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１．７×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１．８×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１．９×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．２×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．３×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．４×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．６×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．７×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．８×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約２．９×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．２×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．３×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．４×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．６×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．７×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．８×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約３．９×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．２×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．３×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．４×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．６×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．７×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．８×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約４．９×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．２×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．３×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．４×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．６×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．７×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．８×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約５．９×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．２×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．３×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．４×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．６×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．７×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．８×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約６．９×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．２×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．３×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．４×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．６×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．７×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．８×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約７．９×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．２×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．３×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．４×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．６×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．７×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．８×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約８．９×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約９．０×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約９．１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約９．２×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約９．３×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約９．４×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約９．５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約９．６×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約９．７×１０１０ｇｃ／ｋｇ、約９．８×１０１０ｇｃ／ｋｇ、または約９．９×１０１０ｇｃ／ｋｇである。
【0151】
いくつかの態様において、投与量は、約１．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約３．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約４．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約７．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約８．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約９．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約９．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約９．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約９．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約９．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約９．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約９．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約９．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約９．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、または約９．９×１０１１ｇｃ／ｋｇである。
【0152】
いくつかの態様において、投与量は、約１．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、または約９．９×１０１２ｇｃ／ｋｇである。
【0153】
いくつかの態様において、投与量は、約１．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約２．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、または約２．８×１０１１ｇｃ／ｋｇである。
【0154】
いくつかの態様において、投与量は、約５．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約５．９×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．０×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．２×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．３×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約６．５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、または約６．６×１０１１ｇｃ／ｋｇである。
【0155】
いくつかの態様において、投与量は、約１．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、または約２．０×１０１２ｇｃ／ｋｇである。
【0156】
いくつかの態様において、投与量は約１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与量は約１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇである。
【0157】
いくつかの態様において、投与量は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）力価により測定される。いくつかの態様において、投与量は、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）力価により測定される。
【0158】
いくつかの態様において、治療有効投与量は、ＡＡＶカプシド血清型ごとに調整することができる。いくつかの態様において、治療有効投与量は、異なるＡＡＶカプシド血清型における心臓トロピズムの違いを考慮して調整される。
【0159】
いくつかの態様において、対象は、ＡＡＶベクターの単回用量を投与される。いくつかの態様において、対象はさらに、ＡＡＶベクターの第２、第３、第４、または第５の投与量が投与される。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターの第２以降の投与は、第１の投与量とは異なる投与量で行うことができる。
【0160】
いくつかの態様において、対象はさらに、ＡＡＶベクター投与とともにプレドニゾンを投与される。
【0161】
いくつかの態様において、プレドニゾンは、以下の投与量で投与される：
ＡＡＶウイルスベクターを投与する２４時間前に１日１回４０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１週目～８週目に１日１回４０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の９週目に１日１回３０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１０週目に１日１回２０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１１週目に１日１回１０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１２週目に１日１回５ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１３週目に１日１回２．５ｍｇ、及び
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１４週目に１日おきに２．５ｍｇ。
ＡＡＶウイルスベクターを投与する２４時間前に１日１回４０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１週目～８週目に１日１回４０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の９週目に１日１回３０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１０週目に１日１回２０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１１週目に１日１回１０ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１２週目に１日１回５ｍｇ、
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１３週目に１日１回２．５ｍｇ、及び
ＡＡＶウイルスベクターを投与した後の１４週目に１日おきに２．５ｍｇ。
【0162】
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、心外膜注射に続いて小開胸術、冠動脈内注射、心内膜注射、心膜下もしくは心外膜注射、または心臓で有用な他のタイプの注射を行うことにより、心筋内に直接送達される。
【0163】
さらなる投与経路は、直接可視化下でのベクターの局所適用、例えば、表層皮質適用、または他の非定位適用も含むことができる。ベクターは、髄腔内、心室内、または静脈内注射により投与することができる。
【0164】
本発明のベクターの標的細胞は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症に罹患した対象の心筋の細胞である。好ましくは、対象はヒトであり、成人または小児である。
【0165】
ただし、本発明は、疾患の生物学的モデルへのベクター送達も包含する。その場合、生物学的モデルは、送達時に任意の発達段階（例えば、胎生期、胎児期、乳児期、幼若期、または成体期）にある哺乳類とすることができる。さらに、標的心筋細胞は、本質的に任意の供給源からのものとすることができ、特にＦＲＤＡ患者、非ヒト霊長類、ならびにげっ歯目（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）、食肉目（ネコ、イヌ）、及び偶蹄目（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）の哺乳類、ならびに他の任意の非ヒト系（例えば、ゼブラフィッシュモデル系）からのｈｉＰＳに由来する任意の細胞とすることができる。
【0166】
本明細書で使用されるベクターは、送達のための任意の好適なビヒクルで製剤化することができる。例えば、ベクターは、医薬的に許容される懸濁液、溶液、またはエマルションに入れることができる。好適な媒体としては、食塩水及びリポソーム調製物が挙げられる。より具体的には、医薬的に許容される担体としては、無菌の水性または（ｏｆ）非水性溶液、懸濁液、及びエマルションを挙げることができる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。水性担体としては、水、アルコール／水性溶液、エマルション、または懸濁液（食塩水及び緩衝媒体を含む）が挙げられる。静注用ビヒクルとしては、液体及び栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。
【0167】
防腐剤及び他の添加物、例えば、抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどが存在してもよい。
【0168】
コロイド分散系も、標的遺伝子送達に使用することができる。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベース系（水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む）が挙げられる。
【0169】
いくつかの態様において、本発明は、対象におけるフリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の治療または予防に使用するためのＦＸＮコード核酸を含むベクターであって、ＡＡＶベクターがそれを必要とする対象に送達され、ＦＸＮが、治療有効レベルで形質導入された細胞により発現する、ベクターに関する。
【0170】
特定の実施形態において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の症状の回復を、それを必要とする対象において行うためのＦＸＮコード核酸を含むベクターであって、当該ＡＡＶベクターが、それを必要とする対象に送達され、ＦＸＮが、形質導入細胞により治療有効レベルで発現する、ベクターに関する。
【0171】
非ウイルス性ベクター
特定の実施形態において、本発明に従うベクター使用は非ウイルス性ベクターである。典型的には、非ウイルス性ベクターは、上記のようなＦＸＮ遺伝子またはそのバリアントをコードする核酸配列を含むプラスミドであり得る。
特定の実施形態において、本発明に従うベクター使用は非ウイルス性ベクターである。典型的には、非ウイルス性ベクターは、上記のようなＦＸＮ遺伝子またはそのバリアントをコードする核酸配列を含むプラスミドであり得る。
【0172】
医薬組成物
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の予防または治療を、それを必要とする対象において行うための医薬組成物であって、ＦＸＮをコードする核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を含む、医薬組成物に関する。
いくつかの態様において、本発明は、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症の予防または治療を、それを必要とする対象において行うための医薬組成物であって、ＦＸＮをコードする核酸を含むＡＡＶベクターの治療有効量を含む、医薬組成物に関する。
【0173】
「治療有効量」とは、フリードライヒ運動失調症に関連する心筋症を任意の医学的治療に適用できる合理的なベネフィット／リスク比で治療するのに十分な本発明のＡＡＶベクターの量を意味する。
【0174】
本発明の化合物及び組成物の単回投与量または１日の合計投与量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることが理解されよう。いかなる特定の患者に対する特定の治療有効用量レベルも、治療する障害、障害の重症度、用いる特定の化合物の活性、用いる特定の組成物、患者の年齢、体重、全体の健康状態、性別、及び食事、用いる特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排泄率、治療の持続期間、用いる特定のポリペプチドと組み合わせでまたは同時に使用する薬物、ならびに医学分野で周知されている類似の因子を含めた様々な因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始すること、及び所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、十分に当業者の技能範囲である。ただし、生成物の１日投与量は、１日当たりの成人１人当たりにおいて広い範囲で変動し得る。投与すべき本発明に従うベクターの治療有効量、ならびに本発明のウイルスまたは非ウイルス粒子及び／または医薬組成物の数による病的状態の治療のための投与量は、多数の因子（患者の年齢及び状態、妨害または障害の重症度、投与の方法及び頻度、ならびに使用されるべき特定のペプチドを含む）に依存する。
【0175】
本発明によるＡＡＶベクターを含む医薬組成物の表現は、選択された投与様式、例えば、心室内投与、心筋内投与、冠動脈内投与、または静脈内投与に適した任意の形態をとることができる。
【0176】
筋肉内投与、静脈内投与、心筋内投与、冠動脈内投与、または心室内投与のための本発明の医薬組成物において、有効成分は、単独で、または別の有効成分と組み合わせて、単位投与形態で、従来の医薬支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。
【0177】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤として医薬的に許容されるビヒクルを含む。これらは、詳細には等張溶液、無菌溶液、食塩水（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくはマグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）、あるいは乾燥、特に凍結乾燥組成物であり得、場合により、滅菌水または生理食塩水を加えて注射可能な溶液の構成を可能にする。
【0178】
注射使用に適した医薬形態としては、無菌の水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌の注射用溶液または分散液を即時調製するための無菌の粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は無菌かつ流動性でなければならない。形態は、製造条件及び貯蔵条件下で安定しなければならず、かつ細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から守られなければならない。
【0179】
本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容される塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中、ならびに油中でも調製することができる。通常の貯蔵条件及び使用条件下では、このような調製物は微生物の成長を予防するために防腐剤を含む。
【0180】
本発明に従うＡＡＶベクターは、中性または塩形態で組成物に製剤化することができる。医薬的に許容される塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成された）酸付加塩が含まれ、これは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄）、及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）に由来してもよい。
【0181】
また担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散させる場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより防止することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射用組成物は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）の組成物中で使用することにより、持続的に吸収させることができる。
【0182】
無菌注射液は、必要とされる量の活性ポリペプチドを、必要に応じて上に挙げたいくつかの他の成分とともに適切な溶媒中に組み込み、次に濾過滅菌することにより調製される。概して、分散液は、様々な無菌化された活性成分を、塩基性分散媒と上に挙げた他の成分のうち必要とされる成分とを含む無菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び冷凍乾燥の技法であり、これらを用いることで事前に滅菌濾過した溶液から活性成分及び任意の追加的な所望成分を含む粉末が得られる。
【0183】
溶液は、製剤化されると、投与製剤に適合する方式で、かつ治療上有効であるような量で投与される。製剤は、様々な投与形態（例えば、上述の注射溶液）で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを用いてもよい。
【0184】
複数の用量を投与することもできる。
【0185】
いくつかの態様において、本発明は、フラタキシン欠損に関連する疾患の治療または予防を、それを必要とする対象において行うための医薬組成物であって、フラタキシンをコードする核酸を含むベクターの治療有効量を当該対象に投与することを含む、医薬組成物に関する。
【実施例】
【0186】
本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに例示する。ただし、これらの実施例及び図面は、いかなる形においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0187】
実施例１：フラタキシンＡＡＶベクター療法の前臨床評価
ｉｎ ｖｉｖｏのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子療法を成功させるには、最小有効臨床用量の特定及びヒト臨床試験の治療目標の設定が不可欠である。フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）は、疾患修飾療法が存在しない生命を脅かす疾患であり、神経及び心臓の機能障害を特徴とする。ほとんどのＦＡ患者は、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の第１イントロン内のＧＡＡトリヌクレオチド伸長においてホモ接合性であり、これにより転写サイレンシングが引き起こされ、ＦＸＮのｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの低減につながる。進行性神経疾患が可動性を制限するのに対し、心筋症はほぼ３分の２の個体の死因となっている。実験動物における先行研究から、ヒトＦＸＮを発現するアデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ）が、ＦＡのマウスモデルにおいて心臓症状を効果的に治療することが知られているが、治療ウインドウは狭く、高用量のｈＦＸＮ導入遺伝子は毒性を伴う。そのため、対象におけるＦＡの心臓所見を効果的に治療する用量を確立することが不可欠である。
ｉｎ ｖｉｖｏのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子療法を成功させるには、最小有効臨床用量の特定及びヒト臨床試験の治療目標の設定が不可欠である。フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）は、疾患修飾療法が存在しない生命を脅かす疾患であり、神経及び心臓の機能障害を特徴とする。ほとんどのＦＡ患者は、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の第１イントロン内のＧＡＡトリヌクレオチド伸長においてホモ接合性であり、これにより転写サイレンシングが引き起こされ、ＦＸＮのｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの低減につながる。進行性神経疾患が可動性を制限するのに対し、心筋症はほぼ３分の２の個体の死因となっている。実験動物における先行研究から、ヒトＦＸＮを発現するアデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ）が、ＦＡのマウスモデルにおいて心臓症状を効果的に治療することが知られているが、治療ウインドウは狭く、高用量のｈＦＸＮ導入遺伝子は毒性を伴う。そのため、対象におけるＦＡの心臓所見を効果的に治療する用量を確立することが不可欠である。
【0188】
１つの正常なＦＸＮアレルを有するＦＡヘテロ接合体はＦＡの臨床的徴候を有しないことが知られている。そのため、ＦＡホモ接合体の心臓をヘテロ接合体の心臓に変換するのに必要なＦＸＮのレベルを推定した。５例の個体の心臓剖検試料における平均ＦＸＮレベルを分析したところ、ヒト心臓におけるＦＸＮの正常レベルは５９±５ｎｇ／ｍｇタンパク質であることが示された。ＦＡホモ接合体の平均心臓フラタキシンタンパク質レベルは約９．４ｎｇ／ｍｇと推定されている。さらに、ＦＡヘテロ接合体は、正常レベルの３０～８０％（１９～５０ｎｇ／ｍｇフラタキシンタンパク質）のＦＸＮを有することが知られている。有効となるためには、ＡＡＶベクターが９ｎｇ／ｍｇを上回るフラタキシンタンパク質（ヘテロ接合体１９～５０ｎｇ／ｍｇ－ＦＡホモ接合体約１０ｎｇ／ｍｇ＝９～４０ｎｇ／ｍｇ）を有効な療法のために発現する必要があることが推定された。
【0189】
マウス投与量試験
ＭＣＫ（クレアチンキナーゼ－／－ｆｘｎ欠損）マウスは、心筋及び骨格筋においてマウスＦＸＮタンパク質が完全に欠損した重症心疾患モデルである。ＭＣＫマウスは進行的に疾患が悪化し、無処置動物の場合１１週目までに死亡する。
ＭＣＫ（クレアチンキナーゼ－／－ｆｘｎ欠損）マウスは、心筋及び骨格筋においてマウスＦＸＮタンパク質が完全に欠損した重症心疾患モデルである。ＭＣＫマウスは進行的に疾患が悪化し、無処置動物の場合１１週目までに死亡する。
【0190】
心臓内で８．３ｎｇ／ｍｇ超を生成するのに必要なＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮの用量を決定するため、１．８×１０１１、５．７×１０１１、または１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ（ｑＰＣＲで決定）のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを７週齢のＭＣＫマウス（ｎ＝２０／用量；雌１０頭、雄１０頭）に静脈内投与した。これらの用量は、過去に毒性が示された用量（１４～１４０倍）よりも顕著に低いため選択した。投与後、心臓組織中のｈＦＸＮタンパク質レベル、体重、心エコー図、心機能、及び死亡率を評価した。
【0191】
マウス心臓組織におけるｈＦＸＮの発現
ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを投与した後のＭＣＫマウスの心臓組織中のｈＦＸＮ総タンパク質を評価したところ、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮの静脈内への用量増加に伴い、心臓ｈＦＸＮ発現における用量依存的増加が認められることが示された。図１Ａに示すように、１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、及び１８×１０１２ｇｃ／ｋｇ用量のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮベクターの静脈内投与は、それぞれ０．５１ｎｇ／ｍｇ、６．０７ｎｇ／ｍｇ、及び３３．７１ｎｇ／ｍｇの心臓ｈＦＸＮタンパク質レベルに関連した。ＭＣＫマウスで観察された心臓レベルが「治療的」範囲にあるのかを確証するため、これらの心臓ｈＦＸＮレベルを、上記で引用したＦＡ患者における予想内在性ＦＸＮレベルに加えた。図１Ｂに示すように、５．７×１０１１及び１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇにおいて、内在的に加えたときのＦＸＮレベルの増加は、それぞれ正常なヒト心臓ＦＸＮレベルの２６％及び７３％に達し、１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ用量においてはヘテロ接合性の範囲内であった。
ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを投与した後のＭＣＫマウスの心臓組織中のｈＦＸＮ総タンパク質を評価したところ、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮの静脈内への用量増加に伴い、心臓ｈＦＸＮ発現における用量依存的増加が認められることが示された。図１Ａに示すように、１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、及び１８×１０１２ｇｃ／ｋｇ用量のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮベクターの静脈内投与は、それぞれ０．５１ｎｇ／ｍｇ、６．０７ｎｇ／ｍｇ、及び３３．７１ｎｇ／ｍｇの心臓ｈＦＸＮタンパク質レベルに関連した。ＭＣＫマウスで観察された心臓レベルが「治療的」範囲にあるのかを確証するため、これらの心臓ｈＦＸＮレベルを、上記で引用したＦＡ患者における予想内在性ＦＸＮレベルに加えた。図１Ｂに示すように、５．７×１０１１及び１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇにおいて、内在的に加えたときのＦＸＮレベルの増加は、それぞれ正常なヒト心臓ＦＸＮレベルの２６％及び７３％に達し、１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ用量においてはヘテロ接合性の範囲内であった。
【0192】
静脈内投与がマウスの体重に及ぼす有効性
３つの用量（１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、及び１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ）のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを静脈内投与した後のＭＣＫマウスの体重をモニターし、対照としてのＰＢＳを投与したマウスと比較した。図２Ａは、ＰＢＳと比較して３つの用量のベクターを投与した雄マウスの体重を示している。図２Ｂは、ＰＢＳ対照と比較して３つの用量のベクターを投与した雌マウスの体重を示している。ＰＢＳ処置コホートと１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ ＡＡＶｒｈ．１０ＦＸＮコホート（雄雌混合；時間の影響を伴う反復測定ＡＮＯＶＡ）との間で有意差（ｐ＜０．００１）が観察された。
３つの用量（１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、及び１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ）のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを静脈内投与した後のＭＣＫマウスの体重をモニターし、対照としてのＰＢＳを投与したマウスと比較した。図２Ａは、ＰＢＳと比較して３つの用量のベクターを投与した雄マウスの体重を示している。図２Ｂは、ＰＢＳ対照と比較して３つの用量のベクターを投与した雌マウスの体重を示している。ＰＢＳ処置コホートと１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ ＡＡＶｒｈ．１０ＦＸＮコホート（雄雌混合；時間の影響を伴う反復測定ＡＮＯＶＡ）との間で有意差（ｐ＜０．００１）が観察された。
【0193】
強化投与量試験
より高用量及びより高いフラタキシン発現レベルからさらなる利益が得られるかを判定するため、７週齢のＭＣＫマウスに、ビヒクル（０ｇｃ／ｋｇ）、１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ（３．３倍）、１．８×１０１３ｇｃ／ｋｇ（１０倍）、５．７×１０１３ｇｃ／ｋｇ（３３倍）と１／２対数ずつ増加させたＡＡＶｒｈ．１０ ＦＸＮを静脈内投与した（図８Ａ）。目標としてのヘテロ接合性心筋ＦＸＮレベルに基づいたオリジナル用量（１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ）を参照して、これらの用量を３．３倍、１０倍、及び３３倍用量コホートと称する。ベクターを投与した後、健康及び行動評価、心エコー図、ならびに心臓及び肝臓のヒトＦＸＮレベルを得た（図８Ｂ及び図８Ｃ）。全ての高用量コホートが、非ＦＡヒト心臓に基づく目標を上回るヒト心臓ＦＸＮレベルを有し、３３倍用量コホートでは２０，８００±３，２００ｎｇ／ｍｇタンパク質まで上昇した（図８Ｃ）。
より高用量及びより高いフラタキシン発現レベルからさらなる利益が得られるかを判定するため、７週齢のＭＣＫマウスに、ビヒクル（０ｇｃ／ｋｇ）、１．８×１０１１ｇｃ／ｋｇ、５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ（３．３倍）、１．８×１０１３ｇｃ／ｋｇ（１０倍）、５．７×１０１３ｇｃ／ｋｇ（３３倍）と１／２対数ずつ増加させたＡＡＶｒｈ．１０ ＦＸＮを静脈内投与した（図８Ａ）。目標としてのヘテロ接合性心筋ＦＸＮレベルに基づいたオリジナル用量（１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ）を参照して、これらの用量を３．３倍、１０倍、及び３３倍用量コホートと称する。ベクターを投与した後、健康及び行動評価、心エコー図、ならびに心臓及び肝臓のヒトＦＸＮレベルを得た（図８Ｂ及び図８Ｃ）。全ての高用量コホートが、非ＦＡヒト心臓に基づく目標を上回るヒト心臓ＦＸＮレベルを有し、３３倍用量コホートでは２０，８００±３，２００ｎｇ／ｍｇタンパク質まで上昇した（図８Ｃ）。
【0194】
心エコー検査による評価における心機能
１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇのＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを投与したマウスの心機能を心エコー検査により評価し、無処置の野生型ＭＣＫマウス及びＰＢＳでモック処置したＭＣＫマウスと比較した。図３は、３つの処置を比較する一連の心エコー検査画像である。投与の１週間前、投与の２週間後、及び投与の４週間後に左心室傍胸骨短軸像の心エコー検査画像を撮影した。画像は、左心室の側心室壁及び中隔壁、ならびに収縮期及び拡張期におけるこれらの相対位置を評価するために使用した。ＰＢＳモック対照を投与した無処置ＭＣＫマウスは、４週時点まで生存することはなかった。
１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇのＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを投与したマウスの心機能を心エコー検査により評価し、無処置の野生型ＭＣＫマウス及びＰＢＳでモック処置したＭＣＫマウスと比較した。図３は、３つの処置を比較する一連の心エコー検査画像である。投与の１週間前、投与の２週間後、及び投与の４週間後に左心室傍胸骨短軸像の心エコー検査画像を撮影した。画像は、左心室の側心室壁及び中隔壁、ならびに収縮期及び拡張期におけるこれらの相対位置を評価するために使用した。ＰＢＳモック対照を投与した無処置ＭＣＫマウスは、４週時点まで生存することはなかった。
【0195】
心臓駆出率及び短縮率を実験期間中に測定した。図４Ａ～Ｂは、３つの処置におけるマウスの駆出率及び短縮率をそれぞれ示している。１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇを投与したところ、ＰＢＳ対照と比較して駆出率及び短縮率が改善された（ｐ＜０．０５、両方の比較）。
【0196】
心エコー図により評価したところ、基準用量（１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ）と比較して、１１週時の駆出率が、無処置対照群の１８．９±４．５％から基準用量群の３１．９±２．９％へと有意な用量依存的増加が認められ、１０倍（１．８×１０１３ｇｃ／ｋｇ）用量コホートでは５４．５±９．８％に増加した。３３倍用量（５．７×１０１３ｇｃ／ｋｇ）では、心臓毒性と整合する駆出率減少が認められた。要約すると、フリードライヒ運動失調症のＭＣＫマウスモデルにおいて、ＡＡＶ媒介性のフラタキシン発現は、正常な生理学的レベルを上回るかなりの生存率及び心臓の利益が認められるものの、高用量では毒性が見られる。
【0197】
生存率
３つの用量のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを投与したマウスの生存率を評価し、ＰＢＳを投与したモック処置マウスと比較した。生存曲線を作成して、各治療後の経時的なマウスの生存パーセントを比較した。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて、ＰＢＳ対照処置コホートとＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ用量コホートとの間の生存曲線（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）の比較を行った。図５に示すように、最小有効用量の５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ用量により、わずかではあるものの有意な死亡率の改善が見られた（対照と比較してｐ＜０．０１）。１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇの有意な有効用量により死亡率の２１．５％改善を媒介した（無処置対照と比較してｐ＜０．００１）。
３つの用量のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを投与したマウスの生存率を評価し、ＰＢＳを投与したモック処置マウスと比較した。生存曲線を作成して、各治療後の経時的なマウスの生存パーセントを比較した。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて、ＰＢＳ対照処置コホートとＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ用量コホートとの間の生存曲線（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）の比較を行った。図５に示すように、最小有効用量の５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ用量により、わずかではあるものの有意な死亡率の改善が見られた（対照と比較してｐ＜０．０１）。１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇの有意な有効用量により死亡率の２１．５％改善を媒介した（無処置対照と比較してｐ＜０．００１）。
【0198】
生存期間は、基準用量（１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ）における中央値８７．５日から、３．３倍コホート（５．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ）では１１９日に増加し、１０倍コホート（１．８×１０１３ｇｃ／ｋｇ）では１２８日でプラトーに達した。３３倍用量（５．７×１０１３ｇｃ／ｋｇ）では生存期間に様々な影響が認められ、一部の動物は２００日超生存したが、一部の動物は１０倍コホートよりも早く死亡した。これは、おそらくはこの用量における毒性を表すものである。
【0199】
結論
ＭＣＫマウスでは、最小有効用量の５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇで、生存率に軽度の改善傾向が見られた。この用量は、正常なヒト内在性レベルの２６％をもたらし（ＦＡ対象における１６％の残存レベルと合わせた場合）、４％の死亡率改善を示した。体重、心機能、及び生存率については、１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇで有意な改善が見られた。この用量は、ＭＣＫマウスにおいて、正常なヒト内在性レベルの７３％（ＦＡ対象における１６％の残存レベルと合わせた場合）をもたらし、無処置ＭＣＫマウスと比較して駆出率及び短縮率が有意に改善するという有益なアウトカムが得られた。これらのデータは、フリードライヒ運動失調症の心臓所見の治療に臨床的に関連する潜在可能性を有する最小有効用量及び有意な有効用量を特定するものである。
ＭＣＫマウスでは、最小有効用量の５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇで、生存率に軽度の改善傾向が見られた。この用量は、正常なヒト内在性レベルの２６％をもたらし（ＦＡ対象における１６％の残存レベルと合わせた場合）、４％の死亡率改善を示した。体重、心機能、及び生存率については、１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇで有意な改善が見られた。この用量は、ＭＣＫマウスにおいて、正常なヒト内在性レベルの７３％（ＦＡ対象における１６％の残存レベルと合わせた場合）をもたらし、無処置ＭＣＫマウスと比較して駆出率及び短縮率が有意に改善するという有益なアウトカムが得られた。これらのデータは、フリードライヒ運動失調症の心臓所見の治療に臨床的に関連する潜在可能性を有する最小有効用量及び有意な有効用量を特定するものである。
【0200】
マウスにおける毒性学試験
７週齢の野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｎマウスに、１．２×１０１２、３．７Ｅ×１０１２、及び１．２×１０１３ｇｃ／ｋｇのＬＸ２００６（ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ、すなわちフラタキシンをコードするＡＡＶベクター）を１か月間及び３か月間、５．６×１０１１、１．８×１０１２、及び５．６×１０１２ｇｃ／ｋｇのＬＸ２００６を１０か月間投与して、安全性及び毒性を評価した。
７週齢の野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｎマウスに、１．２×１０１２、３．７Ｅ×１０１２、及び１．２×１０１３ｇｃ／ｋｇのＬＸ２００６（ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ、すなわちフラタキシンをコードするＡＡＶベクター）を１か月間及び３か月間、５．６×１０１１、１．８×１０１２、及び５．６×１０１２ｇｃ／ｋｇのＬＸ２００６を１０か月間投与して、安全性及び毒性を評価した。
【0201】
１か月及び３か月コホートの動物は予定された終了時まで生存したが、１０か月コホートの動物は体重減少の時期が２回あり、そのため早期の安楽死が必要となった。最初の時点はおよそ１．５か月（６週間）であり、５．６×１０１２ｇｃ／ｋｇの１０か月コホートにおける１２頭中４頭の雄で発生した。早期死亡は、１０か月コホートでは肝毒性に起因するものであった。これらのマウスでは、ヒトフラタキシンタンパク質（ｈＦＸＮ）レベルは定量されなかったものの、１か月コホートからの同様の用量群（３．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ）に基づけば、肝臓のｈＦＸＮレベルが高く、毒性に寄与した可能性があることが分かった。中用量（３．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ）及び高用量（１．２×１０１３ｇｃ／ｋｇ）の雄では、１か月及び３か月の時点で、重症度がより低い（しかし依然として有害な）複数の肝臓所見が見られたが、雌では投与から３か月後まで有害作用は認められなかった。
【0202】
１０か月コホートで早期安楽死に至った第２の体重減少時点は、投与後７か月（３０週）で発生した。高用量（５．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ）群の残りの動物及び中用量（１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ）群の雌マウスの１２頭中６頭は、予定された３か月コホートと同様の最小限～中程度の肝臓の変化を示した。臨床病理変化は、５．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ群のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の上昇に限定された。この時点までにおいて、１か月後に見られた高い肝臓ｈＦＸＮレベルは減少しており、一方、心臓ｈＦＸＮレベルは５．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ群においてレベルが同等となるように増加していた。この用量レベルにおいて、雄マウスにおける心臓コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）組織化学スコアが減少した（雄対照値の８８％）ことからは、７か月目に安楽死させたマウスの体重減少には、肝フラタキシンレベル及び場合によっては心臓フラタキシンレベルの両方が寄与した可能性があるという仮説が支持される。
【0203】
予定された１０か月後の剖検で、唯一の有害な処置関連所見は肝細胞癌（ＨＣＣ）であり、これは５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇでは雄６頭中１頭、１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇで雄６頭中３頭で観察された。この所見は試験の文脈では有害とみなされたものの、大量の入手可能なデータからは、ＡＡＶ処置後にマウスで観察されたＨＣＣは、より高等な種またはヒトでは観察されていないため、ヒトのリスクに至る可能性は低いことが示唆される（ＦＤＡ，Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｒｉｓｋｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＧＴ）”０２－０３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２０２１）。したがって、臨床対象がＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ治療後にＨＣＣを発症するリスクは極めて低い。
【0204】
投与から１０か月後、最低用量レベルの５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇでは、処置関連の臨床徴候、体重変化、血清トロポニンの変化を含む血液学的または臨床化学的所見は認められず、病理組織学的所見も、気管気管支リンパ節濾胞過形成（免疫学的応答を示し、有害とはみなされない）及び１頭の雄マウスにおけるＨＣＣ以外には認められなかった。ＡＡＶ関連肝細胞新生物は、マウス以外の種において、ＡＡＶ前臨床試験の動物にもＡＡＶ臨床試験のヒト対象にも観察されていない（ＦＤＡ ２０２１）ため、臨床対象がＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮ治療後にＨＣＣを発症するリスクは極めて低い。
【0205】
マウスにおける中枢神経系（ＣＮＳ）病理学（脊髄及び脳）については、全ての用量及び全ての時点において特に所見は認められなかった。後根神経節（ＤＲＧ）毒性は、いずれの動物においてもいずれの用量でも観察されなかった。
【0206】
雄及び雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスにＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを静脈内投与したところ、用量依存的及び時間依存的な毒性が生じた。これは（６週目及び３０週目に安楽死させた雄マウスにおいて、５．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ用量レベルでの、対照と比較した心臓ＳＤＨ組織化学低減に基づけば）肝臓及び場合によっては心臓におけるｈＦＸＮの発現レベルと関連するように思われた。５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇの低用量では、試験全体において有害な所見は、１０か月後の剖検で１頭の雄マウスがＨＣＣを有したこと以外では認められなかった。ＨＣＣは、１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇの用量レベル（雄の動物が試験期間中生存した唯一の用量レベル）でも６頭中３頭の雄マウスで観察され、このことからこれは処置関連事象であることが示唆される。このことから、５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇの用量レベルは、雄マウスにおける最小毒性量（ＬＯＡＥＬ）、雌マウスにおける無毒性量（ＮＯＡＥＬ）であることが示唆される。ただし、雄マウスにおけるＡＡＶ関連ＨＣＣは、他の種で対応する所見が欠如していることに基づけば、ヒトに関連することは予想されない。この所見は試験の文脈では有害とみなされたものの、入手可能なデータからは、ＡＡＶ処置後にマウスで観察されたＨＣＣがヒトのリスクに至る可能性は低く、より高等な種またはヒトでは観察されていない（ＦＤＡ ２０２１）。
【0207】
非ヒト霊長類投与量試験
ＭＣＫマウスで定量された１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇという有意な有効用量が、大型動物モデルにおいてヘテロ接合体レベルを達成できるのかを判定するため、この用量をアフリカミドリ非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（ｎ＝１０）に静脈内投与した。図６は、ＮＨＰにおける投与及び投与量の評価の方法を示す模式図を示している。有意な有効用量を投与してから１２週間後、心臓でのレベルは約１８ｎｇ／ｍｇであり、ＦＡホモ接合体をＦＡヘテロ接合体に変換するのに必要と推定される範囲内のレベルに匹敵するものであった。
ＭＣＫマウスで定量された１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇという有意な有効用量が、大型動物モデルにおいてヘテロ接合体レベルを達成できるのかを判定するため、この用量をアフリカミドリ非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（ｎ＝１０）に静脈内投与した。図６は、ＮＨＰにおける投与及び投与量の評価の方法を示す模式図を示している。有意な有効用量を投与してから１２週間後、心臓でのレベルは約１８ｎｇ／ｍｇであり、ＦＡホモ接合体をＦＡヘテロ接合体に変換するのに必要と推定される範囲内のレベルに匹敵するものであった。
【0208】
ＭＣＫマウスにおいて定量した最小有効用量（５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ）及び有意な有効用量（１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ）を含む２つの用量を、非ヒト霊長類において評価した。２つの用量のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮをアフリカミドリ非ヒト霊長類に静脈内投与し（用量当たり霊長類４頭、２頭／性／用量）、ＰＢＳ投与（霊長類合計２頭、１頭／性）と比較した。投与から１２週間後、心臓の５つの領域（左右心室壁、左右心房、及び中隔）から試料を採取し、ｈＦＸＮレベルを調べた。全体の心臓組織の測定のために５つの領域全てからのデータを合わせた。
【0209】
非ヒト霊長類心臓組織におけるｈＦＸＮの発現
【0210】
２つの投与量のＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮを投与した後のＮＨＰの心臓組織中のｈＦＸＮ総タンパク質を評価したところ、心臓のｈＦＸＮ発現における用量依存的な増加が示された。ＰＢＳを投与したＮＨＰの心臓試料は、抗体の交差反応性に起因するＦＸＮのバックグラウンドレベルを有した。図７Ａに示すように、５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ及び１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇのＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮの静脈内投与は、それぞれ４９ｎｇ／ｍｇ及び６３．１ｎｇ／ｍｇの心臓ｈＦＸＮタンパク質レベルと関連した。ＰＢＳ対照群のｈＦＸＮタンパク質レベルは４５．２ｎｇ／ｍｇであった。
【0211】
ＮＨＰで観察された心臓レベルが「治療的」範囲にあるのかを確証するため、これらのｈＦＸＮレベルを、上記で先に引用した予想内在性ＦＸＮレベルに加えた。図７Ｂに示すように、５．７×１０１１及び１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇにおいて、内在的に加えたときのＦＸＮレベルの増加は、それぞれ正常なヒト心臓ＦＸＮレベルの２２％及び４６％に達し、１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ用量においてはヘテロ接合性の範囲内であった。
【0212】
結論
非ヒト霊長類では、５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ及び１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇの静脈内投与で、ＦＡ対象における１６％の残存レベルと合わせた場合、それぞれ２２％及び４６％の正常な内在性レベルが得られた。
非ヒト霊長類では、５．７×１０１１ｇｃ／ｋｇ及び１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇの静脈内投与で、ＦＡ対象における１６％の残存レベルと合わせた場合、それぞれ２２％及び４６％の正常な内在性レベルが得られた。
【0213】
ヒトにおける治療用ＦＸＮタンパク質の要求されるレベルを慎重に決定することにより、「無毒性」レベルの閾値を設定した。２つの動物モデル（ＭＣＫマウス及び非ヒト霊長類）を用いた用量設定試験により、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＦＸＮの用量（１．８×１０１１、５．６～５．７×１０１１、及び１．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ）がＦＡ疾患進行における意味のある改善を媒介する可能性が示された。これらのデータを合わせると、フリードライヒ運動失調症の心臓所見の治療に臨床的に関連する潜在可能性を有する最小有効用量及び治療的有効用量が特定される。
【0214】
実施例２：フラタキシンＡＡＶベクター療法におけるヒト投与量の評価
心筋症のエビデンスを有するＦＡ患者において、ＬＸ２００６（本開示のフラタキシンＡＡＶベクター）のファーストインヒューマン（ＦＩＨ）５２週間用量漸増非盲検試験を行い、次にＬＸ２００６を投与した全ての参加者に対する長期追跡調査（ＬＴＦＵ）部分を行う。
心筋症のエビデンスを有するＦＡ患者において、ＬＸ２００６（本開示のフラタキシンＡＡＶベクター）のファーストインヒューマン（ＦＩＨ）５２週間用量漸増非盲検試験を行い、次にＬＸ２００６を投与した全ての参加者に対する長期追跡調査（ＬＴＦＵ）部分を行う。
【0215】
２つの連続コホート（それぞれＮ＝５例の成人ＦＡ参加者）をＬＸ２００６の漸増用量（１．８×１０１１、５．６×１０１１ｇｃ／ｋｇ）で登録する。全ての参加者は投与後に２泊入院し、次いで３日目に退院する。各コホートの最初の２例の参加者は、最初の４週間、施設の近くに居住する。次の３例の参加者（＃３、４、及び５）は、最低２週間、施設の近くに滞在する。過去の参加者からの４週間安全性データ（臨床検査を含む）を取得するため、各コホートの参加者間で少なくとも４週間の間隔を設定する。過去の全ての参加者からの利用可能な安全性データからは、追加参加者の用量設定も決定される。
【0216】
治療期間は、試験コホートに応じた適切な用量のＬＸ２００６を単回投与し、６０分にわたり低速な静脈内（ＩＶ）注入として投与する。さらに、ＡＡＶベース療法に対する宿主の免疫応答を最小限に抑えるため、患者に予防的プレドニゾンを投与する。参加者に、－１日目から８週目まで１日１回（ＱＤ）４０ｍｇを投与する。漸減は９週目に開始し１４週目まで継続するが、後述のように、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の値に応じて用量調整を行う。プレドニゾンは、１日１回服用とし、午前中の服用を推奨する。
【0217】
安全性及び有効性の評価
ｈＦＸＮ発現はＦＡ疾患の安全性及び有効性に関連する重要な決定因子であるため、非臨床試験を行うことで、どの用量が毒性に関連し、どの用量が安全かつ効果的なＦＸＮ発現をもたらすことができるかをよりよく理解することができる。要約すると、正常なヒト心筋ＦＸＮレベルのおよそ３０％を達成することで、ＦＡ患者に臨床的に意味のある利益がもたらされることが予想される。
ｈＦＸＮ発現はＦＡ疾患の安全性及び有効性に関連する重要な決定因子であるため、非臨床試験を行うことで、どの用量が毒性に関連し、どの用量が安全かつ効果的なＦＸＮ発現をもたらすことができるかをよりよく理解することができる。要約すると、正常なヒト心筋ＦＸＮレベルのおよそ３０％を達成することで、ＦＡ患者に臨床的に意味のある利益がもたらされることが予想される。
【0218】
主要有効性目標
心肺運動負荷試験（ＣＰＥＴ）（腕エルゴメトリー使用）に基づいてＬＸ２００６がピークＶ０２に及ぼす効果を評価する。測定は、治療前ベースラインに対する５２週目のピークＶＯ２の変化を見る。
心肺運動負荷試験（ＣＰＥＴ）（腕エルゴメトリー使用）に基づいてＬＸ２００６がピークＶ０２に及ぼす効果を評価する。測定は、治療前ベースラインに対する５２週目のピークＶＯ２の変化を見る。
【0219】
副次的目標
心臓ＭＲＩにより測定した左心室重量係数（ＬＶＭｉ）にＬＸ２００６が及ぼす効果を評価する。ＬＶＭｉのベースラインからの変化を５２週目に測定する。ＬＶＭｉのベースラインからの変化を１２週目、２４週目、及び３６週目に測定し、ＬＴＦＵで年１回４年間測定する。
心臓ＭＲＩにより測定した左心室重量係数（ＬＶＭｉ）にＬＸ２００６が及ぼす効果を評価する。ＬＶＭｉのベースラインからの変化を５２週目に測定する。ＬＶＭｉのベースラインからの変化を１２週目、２４週目、及び３６週目に測定し、ＬＴＦＵで年１回４年間測定する。
【0220】
ＣＰＥＴ（腕エルゴメトリー使用）に基づいてピークＶＯ２にＬＸ２００６が及ぼす効果を評価する。ピークＶＯ２のベースラインからの変化を、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及びＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0221】
心臓磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に基づいて長軸方向グローバルストレインを測定する。長軸方向グローバルストレインのベースラインからの変化を、投与した後の１２週目、３６週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0222】
心臓ＭＲＩに基づいて一回心拍出量を測定する。一回心拍出量のベースラインからの変化を、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0223】
心臓ＭＲＩに基づいて左室駆出率（ＬＶＥＦ）を測定する。ＬＶＥＦのベースラインからの変化を、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0224】
心臓ＭＲＩに基づいて心臓線維化を測定する。心臓線維化のベースラインからの変化を、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0225】
血清ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ｈｓＴＮＴ、及びＣＫ－ＭＢレベルを測定する。心臓バイオマーカーのベースラインからの変化を、投与した後の２週目、１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0226】
遠隔心調律モニタリングに基づく心筋梗塞の測定。投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間における心筋梗塞の有無及び重症度。
【0227】
修正疲労影響スケール（ＭＦＩＳ）及び疲労重症度スケール（ＦＳＳ）に基づいて疲労度を測定する。疲労の有無及び重症度を、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0228】
修正ボルグ呼吸困難、ボルグ知覚疲労評価（ＲＰＥ），及びにＣＰＥＴ中の狭心症スケールに基づいて労作症状を測定する。修正ボルグ呼吸困難、ボルグＲＰＥ、及び狭心症スケールのベースラインからの変化を、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0229】
第３の目標
心臓生検においてベクターコピー数（ＶＣＮ）を定量する。ベクターコピーのベースラインからの変化を１２週目に測定する。
心臓生検においてベクターコピー数（ＶＣＮ）を定量する。ベクターコピーのベースラインからの変化を１２週目に測定する。
【0230】
心エコー図（ＥＣＨＯ）に基づいて心臓パラメーター（限定されるものではないが、ＬＶＭｉ、ＬＶＥＦ、及び長軸方向グローバルストレインを含む）を測定する。心臓ＥＣＨＯ測定値のベースラインからの変化を、投与した後の１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0231】
１２誘導心電図（ＥＣＧ）パラメーター（限定されるものではないが、ＳＴ－Ｔ波の変化を含む）を測定する。１２誘導ＥＣＧのベースラインからの変化を、投与した後の１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0232】
シアトル狭心症質問票、息切れ－日常活動スコア、視覚的浮腫スコア、及び足首の直径に基づいて症状を測定する。シアトル狭心症質問票、息切れ－日常活動スコアのベースラインからの変化を、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0233】
ＬＸ２００６が他のＣＰＥＴ基準（限定されるものではないが、１．二酸化炭素産生に対する分時換気量（ＶＥ／ＶＣＯ２）スロープ；２．呼気終末ＣＯ２分圧（ＰＥＴＣＯ２）；３．ＣＰＥＴ中の運動の持続時間；４．換気閾値（ＶＴ）におけるＶＯ２；５．酸素摂取効率スロープ（ＯＵＥＳ）を含む）に及ぼす効果を評価する。ＶＥ／ＶＣＯ２スロープ、ＰＥＴＣＯ２、運動の持続時間、ＶＴ時のＶＯ２、及びＯＵＥＳのベースラインからの変化を、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0234】
探索的目的
心臓の細胞外容積（ＥＣＶ）を調べる。心臓ＥＣＶのベースラインからの変化を、心臓ＭＲＩに基づき、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
心臓の細胞外容積（ＥＣＶ）を調べる。心臓ＥＣＶのベースラインからの変化を、心臓ＭＲＩに基づき、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0235】
ＬＸ２００６が頬細胞及びＰＢＭＣにおけるＦＸＮタンパク質レベルに及ぼす効果を調べる。頬細胞及びＰＢＭＣのＦＸＮタンパク質のベースラインからの変化を、４週目、１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目に測定する。
【0236】
ＬＸ２００６がＦＡの基準（限定されるものではないが、フリードライヒ運動失調症評価スケール（ＦＡＲＳ）、フリードライヒ運動失調症評価スケール－日常生活の活動（ＦＡＲＳ－ＡＤＬ）、修正フリードライヒ運動失調症評価スケール（ｍＦＡＲＳ）、運動失調の評価スケール（ＳＡＲＡ）を含む）に及ぼす効果を調べる。ＦＡＲＳ、ＦＡＲＳ－ＡＤＬ、ｍＦＡＲＳ、ＳＡＲＡ、及びその他のベースラインからの変化を、投与した後の１２週目、２４週目、３６週目、及び５２週目、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0237】
ＬＸ２００６のベクター排出を調べる。頬、尿、血液、便の試料のベクター排出を、投与した後の１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目、及び５２週目に、ならびにＬＴＦＵで年１回４年間、合計５年間測定する。
【0238】
心臓生検：
蛍光透視検査及び超音波を心臓生検に使用する。これは、遺伝子療法の開始前及び治療した後の１２週目に、試験施設で適切な訓練を受けたスタッフが実施する。全ての対象に身体検査を行って、参加者のリスクを高める任意の併発性状態が存在するかを判定する。中隔の採取断片はおよそ８片に分割することができる。評価には、ベクターコピー数、ＦＸＮタンパク質、心筋細胞ＦＸＮ染色（利用可能な場合）、及び電子顕微鏡検査が含まれる。
蛍光透視検査及び超音波を心臓生検に使用する。これは、遺伝子療法の開始前及び治療した後の１２週目に、試験施設で適切な訓練を受けたスタッフが実施する。全ての対象に身体検査を行って、参加者のリスクを高める任意の併発性状態が存在するかを判定する。中隔の採取断片はおよそ８片に分割することができる。評価には、ベクターコピー数、ＦＸＮタンパク質、心筋細胞ＦＸＮ染色（利用可能な場合）、及び電子顕微鏡検査が含まれる。
【0239】
組織サンプリングについての詳細は心臓生検マニュアルに示す。さらに、心臓生検手順中にＳｗａｎ－Ｇａｎｚカテーテルを使用して、Ｆｉｃｋの式を用いて心拍出量を測定する。各コホート内の最後の患者が１２週目に生検を受けた後、全ての組織を一緒に解析する。
【0240】
心臓エコー：
全ての参加者は、スクリーニング／ベースライン時及び本開示で詳述している時点に心臓ＥＣＨＯを受け、これにはＬＶＭｉ、ＬＶＥＦ、一回心拍出量、及びストレインの測定が含まれる。
全ての参加者は、スクリーニング／ベースライン時及び本開示で詳述している時点に心臓ＥＣＨＯを受け、これにはＬＶＭｉ、ＬＶＥＦ、一回心拍出量、及びストレインの測定が含まれる。
【0241】
心臓ＭＲＩ：
全ての参加者に、心臓のＭＲＩスキャンをスクリーニング／ベースライン時及び本開示に詳述されている時点で行う。ＬＴＦＵにおいて、心臓ＭＲＩ検査を１日目（用量漸増中の５２週目の来院時にまだ行われていない場合）及び年１回実施する。参加者は、除外基準＃１３に記載のように、造影剤（例えば、ガドリニウム）を許容できなければならない。心臓ＭＲＩ評価には、ＬＶＭｉ、ＬＶＥＦ、一回心拍出量、ストレイン、及び線維化の測定が含まれる。
全ての参加者に、心臓のＭＲＩスキャンをスクリーニング／ベースライン時及び本開示に詳述されている時点で行う。ＬＴＦＵにおいて、心臓ＭＲＩ検査を１日目（用量漸増中の５２週目の来院時にまだ行われていない場合）及び年１回実施する。参加者は、除外基準＃１３に記載のように、造影剤（例えば、ガドリニウム）を許容できなければならない。心臓ＭＲＩ評価には、ＬＶＭｉ、ＬＶＥＦ、一回心拍出量、ストレイン、及び線維化の測定が含まれる。
【0242】
心調律モニタリング：
心不整脈の測定は、遠隔心調律モニタリングに基づく。パッチを参加者の胸部に設置し、連続７日間遠隔で装着して、直接の来院後に中央で評価する。
心不整脈の測定は、遠隔心調律モニタリングに基づく。パッチを参加者の胸部に設置し、連続７日間遠隔で装着して、直接の来院後に中央で評価する。
【0243】
臨床医報告型アウトカム
フリードライヒ運動失調症評価スケール（ＦＡＲＳ）及びｍＦＡＲＳ
ＦＡＲＳは、臨床医報告型のアウトカム基準であり、３つの下位スケール：運動失調の総合スコア、日常生活の活動（ＡＤＬ）のスコア、及び神経学的検査からなる。神経学的検査は、ＦＡを有する個体の神経学的機能を測定するために開発された評価手段である。完全な評価手段は２５項目あり、最高スコアは１２５である。ＦＡＲＳの５つのドメインは、延髄機能、上肢協調性、下肢協調性、末梢神経系、及び直立安定性である。各項目を、試験中の対象の状況に基づいて評価する。
フリードライヒ運動失調症評価スケール（ＦＡＲＳ）及びｍＦＡＲＳ
ＦＡＲＳは、臨床医報告型のアウトカム基準であり、３つの下位スケール：運動失調の総合スコア、日常生活の活動（ＡＤＬ）のスコア、及び神経学的検査からなる。神経学的検査は、ＦＡを有する個体の神経学的機能を測定するために開発された評価手段である。完全な評価手段は２５項目あり、最高スコアは１２５である。ＦＡＲＳの５つのドメインは、延髄機能、上肢協調性、下肢協調性、末梢神経系、及び直立安定性である。各項目を、試験中の対象の状況に基づいて評価する。
【0244】
修正ＦＡＲＳ（ｍＦＡＲＳ）は、ＦＡＲＳスケールにおける神経学的検査のサブセットである。ｍＦＡＲＳスコアは、完了したＦＡＲＳスケールの神経学的検査から導き出される。ｍＦＡＲＳは、ＦＡＲＳ評価の５つのドメインのうちの４つを有し、末梢神経系は含まない。
【0245】
運動失調の評価スケール（ＳＡＲＡ）
ＳＡＲＡは、歩行、立位、座位、言語障害、指追い、鼻指試験、手の高速交互運動、及び踵脛スライドを評価する８項目パフォーマンススケールである。合計スコアは、運動失調がないことを示す０点から最も重度の運動失調を示す４０点までの範囲であり得る。
ＳＡＲＡは、歩行、立位、座位、言語障害、指追い、鼻指試験、手の高速交互運動、及び踵脛スライドを評価する８項目パフォーマンススケールである。合計スコアは、運動失調がないことを示す０点から最も重度の運動失調を示す４０点までの範囲であり得る。
【0246】
患者報告型アウトカム
息切れ日常活動スコア（ＳＯＢＤＡ）
ＳＯＢＤＡ １３項目質問票は、参加者の日常活動に関する呼吸困難の認知を定量化し、経時的な変化を評価するために開発された日常質問票である。参加者に、直接来院の７日前から毎日ＳＯＢＤＡに記入するよう依頼する。
息切れ日常活動スコア（ＳＯＢＤＡ）
ＳＯＢＤＡ １３項目質問票は、参加者の日常活動に関する呼吸困難の認知を定量化し、経時的な変化を評価するために開発された日常質問票である。参加者に、直接来院の７日前から毎日ＳＯＢＤＡに記入するよう依頼する。
【0247】
シアトル狭心症質問票（ＳＡＱ）
ＳＡＱは、心臓病の患者に広く使用されている患者報告型アウトカム基準である。ＳＡＱは自己記入式であり、１９項目からなる。この質問票は、健康関連クオリティーオブライフの以下の５つの領域を測定するし、想起期間は４週間である。これらのドメインは、身体的制限（９項目）、狭心症の安定性（１項目）、狭心症の頻度（２項目）、治療満足度（４項目）、及び疾患の知覚（３項目）である。項目は、５または６ポイントリッカートスケールでスコア化される。
ＳＡＱは、心臓病の患者に広く使用されている患者報告型アウトカム基準である。ＳＡＱは自己記入式であり、１９項目からなる。この質問票は、健康関連クオリティーオブライフの以下の５つの領域を測定するし、想起期間は４週間である。これらのドメインは、身体的制限（９項目）、狭心症の安定性（１項目）、狭心症の頻度（２項目）、治療満足度（４項目）、及び疾患の知覚（３項目）である。項目は、５または６ポイントリッカートスケールでスコア化される。
【0248】
疲労スケール（ＦＳＳ、ＭＦＩＳ）
疲労重症度スケール（ＦＩＳＳ）は、疲労の影響を評価する患者報告型スケールである。７ポイントリッカートスケールを使用して、９項目を支持または否定する。この評価手段の想起期間は、最近１週間以内である。評価手段の最後にある視覚的アナログ疲労スケールは全体的な疲労を取り込むものであり、０が最悪の疲労レベルを表し、１０が正常を表す。
疲労重症度スケール（ＦＩＳＳ）は、疲労の影響を評価する患者報告型スケールである。７ポイントリッカートスケールを使用して、９項目を支持または否定する。この評価手段の想起期間は、最近１週間以内である。評価手段の最後にある視覚的アナログ疲労スケールは全体的な疲労を取り込むものであり、０が最悪の疲労レベルを表し、１０が正常を表す。
【0249】
修正疲労影響スケール（ＭＦＩＳ）は、身体的、認知的、及び心理社会的機能の観点から疲労の影響を評価する。この評価手段には２１項目が含まれ、想起期間は４週間である。
【0250】
ピッツバーグ睡眠質問票（ＰＳＱＩ）
ＰＳＱＩは、過去４週間にわたる睡眠の質及び障害を測定するために使用する１９項目の患者報告型評価手段である。睡眠の質の７つの構成要素は、１）睡眠時間、２）睡眠障害、３）睡眠潜時、４）眠気による日中時の機能不全、５）睡眠効率、６）総合的な睡眠の質、及び７）睡眠薬の使用である。
ＰＳＱＩは、過去４週間にわたる睡眠の質及び障害を測定するために使用する１９項目の患者報告型評価手段である。睡眠の質の７つの構成要素は、１）睡眠時間、２）睡眠障害、３）睡眠潜時、４）眠気による日中時の機能不全、５）睡眠効率、６）総合的な睡眠の質、及び７）睡眠薬の使用である。
【0251】
短形式健康調査（ＳＦ－３６）
ＳＦ－３６は、健康関連のクオリティーオブライフを測定するための３６項目の患者報告型評価手段である。身体的機能、身体的役割、身体の疼痛、全身健康状態、活力、社会的機能、感情的役割、及び精神健康状態を測定する。
ＳＦ－３６は、健康関連のクオリティーオブライフを測定するための３６項目の患者報告型評価手段である。身体的機能、身体的役割、身体の疼痛、全身健康状態、活力、社会的機能、感情的役割、及び精神健康状態を測定する。
【0252】
ＣＰＥＴ中の評価
修正ボルグ呼吸困難スケール
修正ボルグ呼吸困難スケールは、ＣＰＥＴ中の患者による報告における呼吸の困難を測定するのに使用される１０ポイントスケールであり、１０が困難が最大であることを表し、０は全く呼吸困難がないことを表す。
修正ボルグ呼吸困難スケール
修正ボルグ呼吸困難スケールは、ＣＰＥＴ中の患者による報告における呼吸の困難を測定するのに使用される１０ポイントスケールであり、１０が困難が最大であることを表し、０は全く呼吸困難がないことを表す。
【0253】
狭心症スケール
狭心症スケールは、ＣＰＥＴ中の参加者による報告において知覚された胸痛を標準化するために使用される、言語記述子を伴う４ポイントスケールである。
狭心症スケールは、ＣＰＥＴ中の参加者による報告において知覚された胸痛を標準化するために使用される、言語記述子を伴う４ポイントスケールである。
【0254】
ボルグ知覚労作評価スケール（ＲＰＥ）
ボルグスケールは、身体的作業中に個体が知覚する努力及び労作を測定するためのツールである。これは１５ポイントスケールであり、ＣＰＥＴ中の参加者による報告において知覚された労作を標準化するための言語記述子を伴う。
ボルグスケールは、身体的作業中に個体が知覚する努力及び労作を測定するためのツールである。これは１５ポイントスケールであり、ＣＰＥＴ中の参加者による報告において知覚された労作を標準化するための言語記述子を伴う。
【0255】
バイオマーカー評価
血液試料は、この治療アプローチに有益であり得る心臓バイオマーカー（例えば、ＦＸＮ発現、血清Ｎ末端プロホルモンＢ型ナトリウム利尿ペプチド［ＮＴｐｒｏＢＮＰ］、ｈｓＴＮＴ、クレアチンキナーゼ［ＣＫ］、及びそのＭＢアイソザイム［ＣＫ－ＭＢ］）のために採取する。試料は、ＳｏＡに記載されたスケジュールに従い、施設に別途提供される実験マニュアルに詳述されている通りに採取する。バイオマーカー試料はＣＰＥＴ評価の前に採取すべきである。
血液試料は、この治療アプローチに有益であり得る心臓バイオマーカー（例えば、ＦＸＮ発現、血清Ｎ末端プロホルモンＢ型ナトリウム利尿ペプチド［ＮＴｐｒｏＢＮＰ］、ｈｓＴＮＴ、クレアチンキナーゼ［ＣＫ］、及びそのＭＢアイソザイム［ＣＫ－ＭＢ］）のために採取する。試料は、ＳｏＡに記載されたスケジュールに従い、施設に別途提供される実験マニュアルに詳述されている通りに採取する。バイオマーカー試料はＣＰＥＴ評価の前に採取すべきである。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【配列表】
【国際調査報告】