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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-12
(54)【発明の名称】ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製技術及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20250101AFI20250204BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250204BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20250204BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20250204BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250204BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250204BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250204BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250204BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250204BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17
C12N5/10 ZNA
C12N5/0783
C12N15/09 110
C12N15/12
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/04
A61K39/395 T
A61K39/395 L
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539790
(86)(22)【出願日】2022-12-29
(85)【翻訳文提出日】2024-06-28
(86)【国際出願番号】 CN2022143615
(87)【国際公開番号】W WO2023125860
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】202111652734.4
(32)【優先日】2021-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202111652757.5
(32)【優先日】2021-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202111657691.9
(32)【優先日】2021-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202111657717.X
(32)【優先日】2021-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520272880
【氏名又は名称】重▲慶▼精准生物技▲術▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＯＮＧＱＩＮＧ ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯＭＰＡＮＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３８ Ｈａｎｘｉｎｇ Ｒｄ， Ｈａｎｇｕ Ｔｏｗｎ， Ｊｉｕｌｏｎｇｐｏ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３８ Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】522456165
【氏名又は名称】重▲慶▼精准生物産業技▲術▼研究院有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＯＮＧＱＩＮＧ ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】５ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ａ，Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈ Ｅｎｔｒｅｐｒｅｎｅｕｒ ｓｈｉｐ Ｐａｒｋ Ｎｏ．１０１－１０９，Ｅｒｌａｎｇ Ｃｈｕａｎｇｙｅ Ｒｏａｄ，Ｊｉｕｌｏｎｇｐｏ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】リー、ウーリン
(72)【発明者】
【氏名】シュイ、イェンミン
(72)【発明者】
【氏名】シェン、チュンチエ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン、チー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB31
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087NA05
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法及びその使用。ユニバーサルＣＡＲ－Ｔを調製するときのＲＮＰ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡからなるＲＮＰ複合体を含む。前記ｓｇＲＮＡは、ＣＤ４のｓｇＲＮＡ及び／又はＣＤ８のｓｇＲＮＡである。このユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞又はＴ細胞のＣＤ４遺伝子及び／又はＣＤ８遺伝子は、ノックアウト及び／又は不活性化されたものである。前記ＣＡＲ－Ｔ細胞発現ＣＤ４４及び／又はＣＤ６２Ｌは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を増強し、ＣＡＲ－Ｔの有効性を向上させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を改善し、疲弊発現を低減し、腫瘍標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷を向上させることができ、腫瘍の標的療法及び同種他家ＣＡＲ－Ｔ療法に適用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを含んでなるＲＮＰ複合体を含むＲＮＰ複合体であって、前記ｓｇＲＮＡは、ＣＤ４のｓｇＲＮＡ及び／又はＣＤ８のｓｇＲＮＡであることを特徴とする、ＲＮＰ複合体。
【請求項2】
前記ＲＮＰ複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９細胞内動作形式であり、細胞外送達手法は、プラスミド送達手法、ウイルス送達手法、タンパク質（Ｃａｓ９）と（ＲＮＡ）ｇＲＮＡ送達手法、ｍＲＮＡ（Ｃａｓ９）とｇＲＮＡ送達手法、ｍＲＮＡ（Ｃａｓ９）とプラスミド（ｇＲＮＡ）送達手法、ウイルス（Ｃａｓ９）とｇＲＮＡ送達手法、ウイルス（Ｃａｓ９）とプラスミド（ｇＲＮＡ）送達手法、プラスミド（Ｃａｓ９）とウイルス（ｇＲＮＡ）送達手法、プラスミド（Ｃａｓ９）とｇＲＮＡ送達手法、及びそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項3】
前記ＣＤ４遺伝子は、ヒト１２番染色体上のＣＤ４遺伝子：６，７８９，５２８－６，８２０，７９９（正方向ストランドに位置する）であり、前記ＣＤ８遺伝子は、ヒト２番染色体上のＣＤ８Ａ遺伝子：８６，７８４，６１０－８６，８０８，３９６（逆方向ストランドに位置する）及びヒト２番染色体上のＣＤ８Ｂ遺伝子：８６，８１５，３３９－８６，８６１，９２４（逆方向ストランドに位置する）であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項4】
前記ＣＤ４のｓｇＲＮＡの配列は、配列番号１－６又は配列番号１４－２４のいずれか１つに示され、前記ＣＤ８のｓｇＲＮＡの配列は、配列番号７－１１又は配列番号２５－３３のいずれか１つに示されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項5】
同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞中のインターフェロン－γ因子の分泌レベル促進剤としての請求項１から４のいずれか１項に記載のＲＮＰ複合体の使用。
【請求項6】
治療性Ｔ－細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞の製造における、細胞増殖剤、活性増強剤、表現型分布改善剤、疲弊マーカー発現阻害剤としてのＣＤ４遺伝子の阻害剤、ノックアウト剤及び／又はＣＤ８遺伝子の阻害剤、ノックアウト剤の使用。
【請求項7】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＲＮＰ複合体を用いて目的部位をノックアウトしたＴ細胞。
【請求項8】
前記Ｔ細胞のＣＤ４遺伝子及び／又はＣＤ８遺伝子がノックアウト及び／又は不活性化されたことを特徴とする、請求項７に記載のＴ細胞。
【請求項9】
前記Ｔ細胞は、ＣＤ４４及び／又はＣＤ６２Ｌを発現することを特徴とする、請求項７又は８に記載のＴ細胞。
【請求項10】
前記ＣＤ４４のアミノ酸配列は、配列番号１２に示され、前記ＣＤ６２Ｌのアミノ酸配列は、配列番号１３に示されることを特徴とする、請求項７から９のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項11】
前記Ｔ細胞は、遺伝子編集により得られたものであることを特徴とする、請求項７から１０のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項12】
前記Ｔ細胞は、天然分離により得られたものであることを特徴とする、請求項７から１１のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項13】
前記Ｔ細胞のβ２－ミクログロブリン、及び／又はＨＬＡクラスＩ分子の共通サブユニット、及び／又はＣＩＩＴＡの遺伝子は、機能しない又は欠失したことを特徴とする、請求項７から１２のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項14】
前記Ｔ細胞は、同種他家Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項７から１３のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項15】
前記Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＨＬＡ－Ｇ及び／又はＨＬＡ－Ｆも発現することを特徴とする、請求項７から１４のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項16】
請求項７から１５のいずれか１項に記載のＴ細胞の調製方法であって、請求項１から４のいずれか１項に記載のＲＮＰ複合体を用いて遺伝子編集技術によりＴリンパ球中のＣＤ４遺伝子及び／又はＣＤ８遺伝子をノックアウト及び／又は不活性化することを特徴とする、調製方法。
【請求項17】
（１）新鮮又は凍結保存に由来のＴ細胞を使用し、遺伝子編集によりＣＤ４及びＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化し、ＣＤ４及びＣＤ８遺伝子を同時にノックアウト又は不活性化してもよく、ＣＤ４又はＣＤ８をノックアウト又は不活性化してからＣＤ８又はＣＤ４をノックアウト又は不活性化してもよく、最後に目的細胞を得る方法；（２）ＣＤ４陽性のＴ細胞を選別し、遺伝子編集によりＣＤ４遺伝子をノックアウト又は不活性化して目的細胞を得る方法；
（３）ＣＤ８陽性のＴ細胞を選別し、遺伝子編集によりＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化して目的細胞を得る方法；及び
（４）ＣＤ４陽性のＴ細胞を選別し、遺伝子編集によりＣＤ４遺伝子をノックアウト又は不活性化し、ＣＤ８陽性のＴ細胞を選別し、遺伝子編集によりＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化し、最後に遺伝子編集によりＣＤ４遺伝子がノックアウト又は不活性化されたＴ細胞と、遺伝子編集によりＣＤ８遺伝子がノックアウト又は不活性化されたＴ細胞とを混合して目的細胞を得る方法；
のいずれか１つの方法により目的細胞を得ることを特徴とする、請求項１６に記載の調製方法。
【請求項18】
前記Ｔ細胞は、活性化及び／又は非活性化のＴリンパ球であることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の調製方法。
【請求項19】
前記Ｔ細胞中のＣＤ４遺伝子及び／又はＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化するタイミングは、Ｔ細胞の増幅後又はＴ細胞の増幅前であることを特徴とする、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項20】
前記遺伝子編集技術は、エレクトロポレーション法又は非エレクトロポレーション法によりＴ細胞を改造するものであることを特徴とする、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項21】
前記遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮのうちの１種又は複数種を含むことを特徴とする、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項22】
請求項１６から２１のいずれか１項に記載の調製方法により得られたＴ細胞。
【請求項23】
請求項７から１５のいずれか１項又は請求項２２に記載のＴ細胞を用いて調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項24】
ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする、請求項２３に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項25】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項２３又は２４に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項26】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、膜結合型ＩＬ１５をさらに発現することを特徴とする、請求項２３から２５のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項27】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、分泌サイトカインをさらに発現し、前記サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ２１又はＩＬ１５のうちの１種又は複数種を含むことを特徴とする、請求項２３から２６のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項28】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍微小環境における分子の融合タンパク質をさらに発現して認識することができ、前記融合タンパク質の細胞外構造は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＳＩＲＰγ、ＳＩＲＰδ又はＴＩＧＩＴのうちの１種又は複数種を認識することを特徴とする、請求項２３から２７のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項29】
前記ＣＡＲ構造は、制御により活性化又は不活性化することができ、活性化又は不活性化を制御する構造は、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、１０アミノ酸（５Ｂ９タグ）、ＦＩＴＣ－ＨＭ－３二機能性分子（ＦＨＢＭ）とｓｃＦｖ、抗体に結合したロイシンＺｉｐＦｖ又はストレプトアビジン２（ｍＳＡ２）ビオチン結合ドメインのうちの１種又は複数種。ことを特徴とする、請求項２３から２８のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項30】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、固形腫瘍、血液系腫瘍細胞／組織を認識することができ、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原認識領域は、抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ）、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤＨ１７、Ｔｒｏｐ２、ＢＣＭＡ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１６、ＣＤ１３３、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒ２、Ｂ７Ｈ３、Ｈｅｒ２、ＣＤ３０、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＧＰＣ３、ＷＴ１又はＴＡＧ－７２のうちの１種又は複数種を認識することができることを特徴とする、請求項２３から２９のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項31】
（１）Ｔ細胞を収集して取得し、ＣＡＲ構造のウイルスに感染させ、ＣＡＲ構造が感染したＴ細胞にエレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入して目的細胞を得る方法；或いは（２）Ｔ細胞を収集して取得し、エレクトロポレーション法によりＲＮＰを前記Ｔ細胞に導入した後、さらにＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させて目的細胞を得る方法；
のいずれか１つの方法により目的細胞を得ることを特徴とする、請求項２３から３０のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法。
【請求項32】
（１）Ｔ細胞を収集して取得し、ＣＤ６２及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、又はＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、ＣＡＲ構造が感染したＴ細胞にエレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入して目的細胞を得る方法；或いは（２）Ｔ細胞を収集して取得し、エレクトロポレーション法によりＲＮＰを前記Ｔ細胞に導入した後、さらにＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、又はＣＤ６２及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させて目的細胞を得る方法；
のいずれか１つの方法により目的細胞を得ることを特徴とする、請求項３１に記載の調製方法。
【請求項33】
（１）Ｔ細胞を収集して取得した後、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、ＣＡＲ構造が感染した後のＴ細胞にエレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入して目的細胞を得る方法；或いは、（２）Ｔ細胞を収集して取得した後、エレクトロポレーション法によりＲＮＰを前記Ｔ細胞に導入した後、さらにＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させて目的細胞を得る方法；
のいずれか１つの方法により目的細胞を得ることを特徴とする、請求項３２に記載の調製方法。
【請求項34】
エレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入する過程において、ＲＮＰ複合体は、請求項１に記載のＲＮＰ複合体であることを特徴とする、請求項３１から３３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項35】
前記Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとのモル比は１：２であることを特徴とする、請求項３１から３４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項36】
請求項２３から３０のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞又は請求項３１から３５のいずれか１項に記載の調製方法により調製された前記ＣＡＲ－Ｔ細胞に感染させた組換えベクターであって、前記組換えベクターは、ＣＡＲ構造を含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項37】
前記組換えベクターは、ＣＤ４４遺伝子機能断片及び／又はＣＤ６２Ｌ遺伝子機能断片を含むことを特徴とする、請求項３６に記載の組換えベクター。
【請求項38】
前記組換えベクターは、（Ｉ）ＣＤ４４及びＣＡＲ構造、
（ＩＩ）ＣＤ６２Ｌ及びＣＡＲ構造、又は
（ＩＩＩ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造
を含むことを特徴とする、請求項３６又は３７に記載の組換えベクター。
【請求項39】
前記組換えベクターに使用される発現ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、逆転写ウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのうちの１種又は複数種であることを特徴とする、請求項３６から３８のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項40】
請求項７から１５のいずれか１項、又は請求項２２に記載のＴ細胞及び／又は請求項２３から３０のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞、又は請求項３１から３５のいずれか１項に記載の調製方法により調製された前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む細胞組成物。
【請求項41】
前記細胞組成物に含まれる前記Ｔ細胞又は前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は、個数基準で９０％、８０％、７０％又は６０％以上であることを特徴とする、請求項４０に記載の細胞組成物。
【請求項42】
前記細胞組成物は、活性化誘導されたＣＩＫ細胞又はＮＫＴ細胞であることを特徴とする、請求項４０又は４１に記載の細胞組成物。
【請求項43】
請求項７から１５のいずれか１項、又は請求項２２に記載のＴ細胞及び／又は請求項２３－３０のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞、請求項３１－３５のいずれか１項に記載の調製方法により調製された前記ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又は請求項３６－３９のいずれか１項に記載の組換えベクター及び／又は請求項４０－４２のいずれか１項に記載の細胞組成物の、細胞治療薬物の調製における使用。
【請求項44】
前記使用は、請求項７から１５のいずれか１項又は請求項２２に記載のＴ細胞及び／又は請求項２３－３０のいずれか１項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞、又は請求項３１－３５のいずれか１項に記載の調製方法により調製された前記ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又は請求項３６－３９のいずれか１項に記載の組換えベクター及び／又は請求項４０－４２のいずれか１項に記載の細胞組成物の、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん及び／又は皮膚がんを治療する薬物の調製における使用であることを特徴とする、請求項４３に記載の使用。
【請求項45】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性増強剤の調製におけるＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＤ４４の使用。
【請求項46】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性増強剤の調製におけるＣＤ４４とＣＤ６２Ｌとの組み合わせの使用。
【請求項47】
ＣＡＲ－Ｔ細胞が分泌するＰＤ－１及びＬＡＧ－３因子の阻害剤の調製におけるＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＤ４４の使用。
【請求項48】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製における、腫瘍細胞殺傷の促進剤としてのＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＤ４４遺伝子の使用であって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、通常ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ４及び／又はＣＤ８遺伝子を発現しないＣＡＲ－Ｔ細胞又はユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞である、使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【0001】
本発明は、２０２１年１２月３０日に提出された中国特許出願第２０２１１１６５２７３４．４号（発明の名称：ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製技術及びその使用）の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、２０２１年１２月３０日に提出された中国特許出願第２０２１１１６５２７５７．５号（発明の名称：ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製技術及びその使用）の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本発明は、２０２１年１２月３０日に提出された中国特許出願第２０２１１１６５７６９１．９号（発明の名称：ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法及びその使用）の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0004】
本発明は、２０２１年１２月３０日に提出された中国特許出願第２０２１１１６５７７１７．Ｘ号（発明の名称：ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法及びその使用）の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0005】
本発明は、細胞生物学、分子生物学、創薬の技術分野に属し、具体的には、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【0006】
ＣＡＲ－Ｔ免疫療法は、遺伝子工学によって患者自身のＴリンパ球を改変してそれにキメラ抗原受容体を発現することにより、腫瘍細胞がＭＨＣ分子の発現をダウンレギュレーションすること及び抗原提示を低下させることなどの免疫逃避を効果的に克服することによって腫瘍細胞を逃避できなくなるようにすることができる。現在、中国で承認されているキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する２種類のＴ細胞製品は、いずれも自家Ｔ細胞に由来するものであり、これらの臨床使用に承認された自家ＣＡＲ－Ｔ細胞は、カスタマイズに基づいて産生されなければならない。しかし、高価な生産コストと長い生産過程により、このような自家Ｔ細胞生産プラットフォームは依然として大規模な臨床応用の重要な制限要素であり、また生産失敗などのリスクも存在する。同時に、個性化、カスタマイズされた自家ＣＡＲ－Ｔ細胞の生産過程も異なる腫瘍タイプでの幅広い応用を制限した。そのため、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するために、ユニバーサルの同種他家Ｔ細胞を使用する必要があり、これらの細胞は「既製」の即時使用可能な治療剤として大規模な臨床応用に使用することができる。ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、治療周期を著しく短縮するとともにコストを低減することができ、移植片拒絶関連反応及び治療効果の問題も、遺伝子編集技術と幹細胞移植ドナー由来Ｔ細胞などの戦略によって徐々に解決することができるため、将来の市場競争もより優位である。
【0007】
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、健常ドナーの末梢血から抽出されたＴ細胞を出発サンプルサンプルとし、遺伝子編集技術により同種他家間の免疫拒絶問題を解決するとともに、Ｔ細胞にがん標的を特異的に標的とするＣＡＲ構造を装着し、最終的に同種他家がん患者の体内に戻して腫瘍細胞を特異的に標的とする他家移植生細胞薬剤である。
【0008】
ゲノム編集技術は、ＺＦＮ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）及びＣＲＩＳＰＲ関連技術を含み、ユニバーサルＴ細胞の調製に用いられる。現在、業界における通常の操作方法は大体同じであり、いずれも遺伝子編集の形式で同種の他家Ｔ細胞において強い免疫拒絶反応を引き起こすＴＣＲ分子及び／又はＭＨＣ関連分子をノックアウトすることにより免疫拒絶の問題を解決する。また、多くの機構は治療効果又は安全性を向上させるために、このような遺伝子編集をもとに、さらにＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５２をノックアウトし又はＣＡＲ自殺遺伝子スイッチなどを導入している。
【0009】
このような操作形式は理論的に実行可能であるが、現在、ＴＲＣ又はＭＨＣ分子を欠損した後のＴ細胞の細胞生存及び機能上の影響を詳細に解析する関連文献はない。これも、業界が現在大きなチャレンジに直面している原因の１つである。
【0010】
現在、業界において直面している大きなチャレンジは、生産されたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビボでの存続期間が比較的悪く、再注入用量や再注入回数を増加させても、理想的な治療効果を達成することが困難であるのに対し、自家ＣＡＲ－Ｔ細胞は、再注入用量が比較的低く、緩和率がより高い。このような結果をもたらす可能な原因が多くある。ＴＣＲは、Ｔ細胞が免疫に関連する各種機能を発揮する重要な遺伝子として、Ｔ細胞の他の機能においても重要又は決定的な補助作用を果たすか否かについては、明確に指摘されている関連研究はまだない。しかし、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞によって実現可能な即時使用可能、既成、低治療コストなどの利点は、自家ＣＡＲ－Ｔ細胞によって実現できないものである。したがって、インビボでの存続時間が長いユニバーサルＣＡＲ－Ｔを調製する必要がある。
【発明の概要】
【0011】
前記の事情に鑑み、本発明は、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製技術及びその使用を提供する。
【0012】
前記の目的を達成するために、本発明は、下記の技術的手段を提供する。
【0013】
本発明の第一の目的は、Ｔ細胞の目的部位のノックアウトに使用され得るＲＮＰ複合体を提供することにある。
【0014】
前記の目的を達成するために、本発明の技術的手段は下記である。
【0015】
Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを含んでなるＲＮＰ複合体であって、前記ｓｇＲＮＡはＣＤ４のｓｇＲＮＡ及び／又はＣＤ８のｓｇＲＮＡであるＲＮＰ複合体。
【0016】
さらに、前記ＲＮＰ複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９細胞内動作形式である。細胞外送達手法は、プラスミド送達手法、ウイルス送達手法、ｍＲＮＡ（Ｃａｓ９）とｇＲＮＡ送達手法、ｍＲＮＡ（Ｃａｓ９）とプラスミド（ｇＲＮＡ）送達手法、ウイルス（Ｃａｓ９）とｇＲＮＡ送達手法、ウイルス（Ｃａｓ９）とプラスミド（ｇＲＮＡ）送達手法、プラスミド（Ｃａｓ９）とウイルス（ｇＲＮＡ）送達手法、プラスミド（Ｃａｓ９）とｇＲＮＡ送達手法を含む。
【0017】
さらに、前記ＲＮＰ複合体において、前記ＣＤ４遺伝子はヒト１２番染色体上のＣＤ４遺伝子：６，７８９，５２８－６，８２０，７９９（正方向ストランド（forward strand）に位置する）であり、前記ＣＤ８遺伝子はヒト２番染色体上のＣＤ８Ａ遺伝子：８６，７８４，６１０－８６，８０８，３９６（逆方向ストランド（reverse strand）に位置する）及びヒト２番染色体上のＣＤ８Ｂ遺伝子：８６，８１５，３３９－８６，８６１，９２４（逆方向ストランドに位置する）である。
【0018】
さらに、前記ＣＤ４のｓｇＲＮＡの配列は、配列番号１－６又は配列番号１４－２４のいずれか１つに示される。前記ＣＤ８のｓｇＲＮＡの配列は、配列番号７－１１又は配列番号２５－３３のいずれか１つに示される。
【0019】
本発明の第二の目的は、ＣＡＲ－Ｔ細胞のさらなる調製に使用され得る、インビボでの存続期間が長いＴ細胞を提供することにある。
【0020】
前記の目的を達成するために、本発明の技術的手段は下記である。
【0021】
ＣＤ４遺伝子及び／又はＣＤ８遺伝子がノックアウトされ及び／又は不活性化されるＴ細胞。
【0022】
本発明で使用される標的配列の一部は、配列番号１－１１で示される。その配列は、ここで挙げられる配列に限定されず、ヒト１２番染色体上のＣＤ４遺伝子：６，７８９，５２８－６，８２０，７９９（正方向ストランドに位置する）、ヒト２番染色体上のＣＤ８Ａ遺伝子：８６，７８４，６１０－８６，８０８，３９６（逆方向ストランドに位置する）及びヒト２番染色体ＣＤ８Ｂ遺伝子：８６，８１５，３３９－８６，８６１，９２４（逆方向ストランドに位置する）を含む。遺伝子編集標がある位置表１（ｔａｂｌｅ １）には、含まれるいずれか１つの領域内における遺伝子自体に欠失を引き起こせる標的配列が示される。
【0023】
さらに、前記Ｔ細胞は、遺伝子編集により得られたものである。
【0024】
さらに、前記Ｔ細胞は、天然分離により得られたものである。
【0025】
さらに、前記Ｔ細胞は、β２－ミクログロブリン、及び／又はＨＬＡクラスＩ分子の共通サブユニット、及び／又はＣＩＩＴＡの遺伝子を機能がしなくなるようにするか又は欠失させる。
【0026】
さらに、前記Ｔ細胞は、同種他家Ｔ細胞である。
【0027】
さらに、前記Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＨＬＡ－Ｇ及び／又はＨＬＡ－Ｆタンパク質も発現する。
【0028】
さらに、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４４を発現する。
【0029】
さらに、好ましくは、前記Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ遺伝子も発現する。
【0030】
さらに、前記Ｔ細胞において、ＣＤ６２Ｌ遺伝子のアミノ酸配列は、配列番号１３－１７に示される。
【0031】
さらに、前記Ｔ細胞において、前記ＣＤ４４のアミノ酸配列は、配列番号１２に示され、前記ＣＤ６２Ｌのアミノ酸配列は、配列番号１３に示される。
【0032】
さらに、前記Ｔ細胞において、前記Ｔ細胞のＣＤ４遺伝子及び／又はＣＤ８遺伝子は、ノックアウト及び／又は不活性化される。前記ＣＤ４４遺伝子のアミノ酸配列は、配列番号１２に示される。前記ＣＤ４遺伝子及びＣＤ８遺伝子の標的配列の一部は、配列番号１－１１に示され、この配列は、ここで挙げられる配列に限定されず、ヒト１２番染色体上のＣＤ４遺伝子：６，７８９，５２８－６，８２０，７９９（正方向ストランドに位置する）、ヒト２番染色体上のＣＤ８Ａ遺伝子：８６，７８４，６１０－８６，８０８，３９６（逆方向ストランドに位置する）及びヒト２番染色体ＣＤ８Ｂ遺伝子：８６，８１５，３３９－８６，８６１，９２４（逆方向ストランドに位置する）を含む。遺伝子編集標的がある位置表１、表３－表５には、含まれるいずれか１つの領域における遺伝子自体に欠失を引き起こせる標的配列が示される。さらに、ノックアウト効率を向上させるために、標的配列における最初の塩基がＧではない配列の前に、１つのグアニンＧを導入することができる。
【0033】
前記ＣＤ６２Ｌ天然アミノ酸配列は、配列番号１３に示される。
【0034】
天然の又は天然配列で発現したＣＤ６２Ｌは、特定の生理状況（活性化程度が比較的高い場合）で発生する自己切断により分解又は加水分解を引き起こすモードが存在するため、そのアミノ酸の置換、削除又は他の短縮などによりそれを下記の非分解モード配列に変異させることでその存続性を向上させることができる。
【0035】
【表1】
【0036】
【表2】
【0037】
本発明の第三の目的は、前記Ｔ細胞の調製方法を提供することにある。この方法は、持続性が長い細胞を提供するために調製イディアを提供する。
【0038】
前記の目的を達成するために、本発明の技術的手段は下記である。
【0039】
前記ＲＮＰ複合体を用いて遺伝子編集技術によりＴリンパ球中のＣＤ４遺伝子及び／又はＣＤ８遺伝子をノックアウト及び／又は不活性化する。
【0040】
前記Ｔ細胞の調製方法では、下記のいずれか１つの方法により目的細胞を得る。
【0041】
（１）新鮮又は凍結由来のＴ細胞を用いて、遺伝子編集によりＣＤ４及びＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化する。ＣＤ４及びＣＤ８遺伝子を同時にノックアウト又は不活性化してもよく、ＣＤ４又はＣＤ８のノックアウト又は不活性化を完成させてからＣＤ８又はＣＤ４のノックアウト又は不活性化を行ってもよい。最後に目的細胞を得る。（２）ＣＤ４陽性のＴ細胞を選択し、遺伝子編集によりＣＤ４遺伝子をノックアウト又は不活性化して目的細胞を得る。（３）ＣＤ８陽性のＴ細胞を選択し、遺伝子編集によりＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化して目的細胞を得る。（４）ＣＤ４陽性のＴ細胞を選択し、遺伝子編集によりＣＤ４遺伝子をノックアウト又は不活性化し、ＣＤ８陽性のＴ細胞を選択し、遺伝子編集によりＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化し、最後に遺伝子編集によりＣＤ４遺伝子がノックアウト又は不活性化されたＴ細胞と、遺伝子編集によりＣＤ８遺伝子がノックアウト又は不活性化されたＴ細胞とを混合して目的細胞を得る。
【0042】
さらに、前記Ｔ細胞は、活性化及び／又は非活性化のＴリンパ球である。
【0043】
さらに、前記Ｔ細胞中のＣＤ４遺伝子及び／又はＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化するタイミングは、Ｔ細胞の増幅後又はＴ細胞の増幅前である。
【0044】
さらに、前記遺伝子編集技術は、エレクトロポレーション法又は非エレクトロポレーション法によりＴ細胞を改造するものである。
【0045】
さらに、前記遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ／（Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮを含む。
【0046】
本発明の第四の目的は、インビボでより持続的なユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞であって、ＣＤ４４及び／又はＣＤ６２Ｌを発現できることを特徴とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を提供することにある。
【0047】
ＣＤ４４遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞間の相互作用、細胞接着及び遊走に関与する細胞表面糖タンパク質である。それは、ヒアルロン酸（ＨＡ）の受容体であり、他のリガンド（例えば、オステオポンチン、コラーゲン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ））と相互作用することもできる。このタンパク質は、リンパ球活性化、再循環とホーミング、造血と腫瘍転移を含む様々な細胞機能に関与する。現在、ＣＤ４４に対する研究は、主にがん幹細胞におけるその役割と、細胞接着におけるその様々な変異体の役割に焦点を当ており、極めて少ない研究では、ＣＤ４４をＣＡＲ－Ｔ細胞療法の標的としており、それをＣＡＲ－Ｔ治療に直接使用する研究についてまだ関連報告はない。
【0048】
Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）遺伝子は、接着／ホーミング受容体ファミリーに属する細胞表面接着分子をコードし、通常Ｔ細胞活性化のマーカーとしてＴ細胞が継続的に活性化されている間、自己スプライシング機構の起動により、細胞上での発現はダウングレードし続ける。研究により分かるように、ダウングレード現象があっても、ＣＤ６２Ｌを発現する細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の抗腫瘍能力もＣＤ６２Ｌを発現しないＣＴＬ（ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２４４８０ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０３７２６１０２）よりも顕著に高い。これはＣＤ６２Ｌのホーミング能力によるものと考えられる。しかし、いくつかの研究では、Ｌ－セレクチンはホーミングと関係がなく、腫瘍内の治療用Ｔ細胞の活性化に関連することも示されている（ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０１３２１）。文献（ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０１３２１）の研究では、養子免疫療法のマウスモデルを使用し、野生型マウスＣＤ８＋Ｔを対照とし、ＣＤ６２Ｌ膜近位加水分解切断部位の一部の配列を削除することにより変異型ＣＤ６２Ｌ遺伝子改変マウスを生成し、この変異型遺伝子改変マウスは、その加水分解断片を変異させることによりマウスＣＤ８＋Ｔ細胞上のＬ－セレクチンの発現を増強する。研究結果から分かるように、変異型ＣＤ６２Ｌ遺伝子改変マウスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が固形腫瘍の増殖を制御する能力を向上させるが、從來技術において、Ｔ細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞上でＣＤ６２Ｌが過剰発現して最後に達成する効果及び具体的な機序はまだ不明である。
【0049】
本発明の第五の目的は、長期間生存能力が高いＣＡＲ－Ｔ細胞及びその調製方法を提供する。前記細胞は、商業的に応用可能であり、前記方法の再現性も良好である。
【0050】
前記の目的を達成するために、本発明の技術的手段は下記である。
【0051】
前記Ｔ細胞により調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞。
【0052】
さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【0053】
さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞である。
【0054】
さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、膜結合型ＩＬ１５も発現する。
【0055】
さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、分泌サイトカインも発現する。前記サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ２１、ＩＬ１５を含む。
【0056】
さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍微小環境における分子の融合タンパク質も発現して認識することができる。前記融合タンパク質の細胞外構造は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＳＩＲＰγ、ＳＩＲＰδ、ＴＩＧＩＴを認識する。
【0057】
さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞における前記ＣＡＲ構造は、制御によって活性化又は不活性化することができる。制御によって活性化又は不活性化する前記構造は、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、１０アミノ酸（５Ｂ９タグ）、ＦＩＴＣ－ＨＭ－３二機能性分子（ＦＨＢＭ）とｓｃＦｖ、抗体に結合したロイシンＺｉｐＦｖ、ストレプトアビジン２（ｍＳＡ２）ビオチン結合ドメインを含む。これらの分子は、ＣＡＲに結合した抗体又はＺｉｐＣＡＲ構造によって認識されることによりＣＡＲ－Ｔ細胞のシグナル経路の誘導及び活性化を引き起こすことができる。このようなシステムは、抗体に結合したスイッチ分子の数を変更することによってＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を制御する。
【0058】
さらに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、固形腫瘍、血液系腫瘍細胞／組織を認識することができる。前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原認識領域は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ）、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤＨ１７、Ｔｒｏｐ２、ＢＣＭＡ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１６、ＣＤ１３３、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒ２、Ｂ７Ｈ３、Ｈｅｒ２、ＣＤ３０、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＧＰＣ３、ＷＴ１又はＴＡＧ－７２を含む抗原を認識することができる。
【0059】
本発明の第六の目的は、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法を提供することにある。前記調製方法は、下記２つの方法のいずれか１つにより目的細胞を得る
【0060】
（１）Ｔ細胞を収集して取得し、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、又はＣＤ６２及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、ＣＡＲ構造に感染したＴ細胞にエレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入して目的細胞を得る；或いは
（２）Ｔ細胞を収集して取得し、エレクトロポレーション法によりＲＮＰをこのＴ細胞に導入した後、さらにＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、又はさらにＣＤ６２及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させて目的細胞を得る。
（２）Ｔ細胞を収集して取得し、エレクトロポレーション法によりＲＮＰをこのＴ細胞に導入した後、さらにＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、又はさらにＣＤ６２及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させて目的細胞を得る。
【0061】
さらに、前記調製方法は、下記２つの方法のいずれか１つにより目的細胞を得る。
【0062】
（１）ＣＤ４及び／又はＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化したＴ細胞を活性化した後、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、ＣＡＲ構造が感染したＴ細胞にエレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入して目的細胞を得る；或いは
【0063】
（２）ＣＤ４及び／又はＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化したＴ細胞を活性化した後、エレクトロポレーション法によりＲＮＰをこのＴ細胞に導入した後、さらにＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させて目的細胞を得る。
【0064】
さらに、前記調製方法において、ＣＤ４及び／又はＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化する際にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によりＴ細胞を改造する。前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術に係るＲＮＰ複合体は、具体的にＣＤ４ｓｇＲＮＡ、ＣＤ８ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ複合体である。
【0065】
さらに、前記調製方法において、前記Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとのモル比は１：２である。
【0066】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製は、
１）目的遺伝子断片（異なるプロモーターで開始させる特定の腫瘍標的に対するＣＡＲ構造配列及びＣＤ６２Ｌ遺伝子断片を含む）を含むウイルスベクターを構築するステップと、
２）ウイルスベクターをＴ細胞に感染させて目的細胞を得るステップと、
を含む。
１）目的遺伝子断片（異なるプロモーターで開始させる特定の腫瘍標的に対するＣＡＲ構造配列及びＣＤ６２Ｌ遺伝子断片を含む）を含むウイルスベクターを構築するステップと、
２）ウイルスベクターをＴ細胞に感染させて目的細胞を得るステップと、
を含む。
【0067】
さらに、前記方法では、前記ステップ２）において、レンチウイルス感染、遺伝子ターゲティング、リポフェクション、エレクトロポレーション法などによりＣＤ６２Ｌ遺伝子の発現を強化する。
【0068】
本発明の第七の目的は、細胞組成物を提供することにある。この組成物には、多くの機能細胞が集まる。この細胞組成物は、治療作用を有する。
【0069】
前記の目的を達成するために、本発明の技術的手段は下記である。
【0070】
前記Ｔ細胞及び／又は前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む細胞組成物。
【0071】
さらに、前記細胞組成物に含まれる前記Ｔ細胞又は前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は、個数基準で９０％、８０％、７０％又は６０％以上である。
【0072】
さらに、前記細胞組成物に含まれる前記Ｔ細胞又は前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は、個数基準で６０％以上である。
【0073】
さらに、前記細胞組成物に含まれる前記Ｔ細胞又は前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は、個数基準で７０％以上である。
【0074】
さらに、前記細胞組成物に含まれる前記Ｔ細胞又は前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は、個数基準で８０％以上である。
【0075】
さらに、前記細胞組成物に含まれる前記Ｔ細胞又は前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は、個数基準で９０％以上である。
【0076】
さらに、前記細胞組成物は、活性化誘導されたＣＩＫ細胞又はＮＫＴ細胞であってもよい。
【0077】
さらに、前記細胞組成物における、ＣＤ４遺伝子及びＣＤ８遺伝子が不活性化したＴリンパ球は、キメラ抗原受容体を発現する。
【0078】
本発明の第八の目的は、前記Ｔ細胞、前記組換えベクター、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は前記細胞組成物の使用を提供することにある。前記使用は、臨床に優れた治療アイデアを提供する。
【0079】
前記の目的を達成するために、本発明の技術的手段は下記である。
【0080】
細胞治療薬物の調製における前記Ｔ細胞、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞、前記組換えベクター、及び／又は前記細胞組成物の使用。
【0081】
さらに、前記使用は、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん及び／又は皮膚がんを治療する薬物における前記Ｔ細胞、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞、前記組換えベクター、及び／又は前記細胞組成物の使用である。
【0082】
腫瘍治療に使用される細胞治療薬における本発明に記載のＲＮＰの使用。
【0083】
治療性Ｔ－細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞の調製における、ＣＤ４遺伝子の阻害剤、ノックアウト剤及び／又はＣＤ４遺伝子の阻害剤、ノックアウト剤は、細胞増殖剤、活性増強剤、表現型分布改善剤、疲弊マーカー発現阻害剤としてのＣＤ４遺伝子の阻害剤、ノックアウト剤としての使用。
【0084】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性増強剤の調製におけるＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＤ４４の使用。
【0085】
さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性増強剤の調製におけるＣＤ４４とＣＤ６２Ｌの組み合わせの使用。
【0086】
ＣＡＲ－Ｔ細胞が分泌するＰＤ－１及びＬＡＧ－３因子の阻害剤の調製におけるＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＤ４４の使用。
【0087】
用語説明
ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製における、腫瘍細胞殺傷促進剤としてのＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＤ４４遺伝子の使用。前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、通常ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ４及び／又はＣＤ８遺伝子を発現しないＣＡＲ－Ｔ細胞、又はユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞である。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製における、腫瘍細胞殺傷促進剤としてのＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＤ４４遺伝子の使用。前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、通常ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ４及び／又はＣＤ８遺伝子を発現しないＣＡＲ－Ｔ細胞、又はユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞である。
【0088】
本発明に記載のＣＡＲ構造は、通常の第一世代、第二世代、第三世代のＣＡＲであってもよく、改良された二重ＣＡＲ、調整可能なＣＡＲ構造（例えば、ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２調整）などの新しいＣＡＲ構造であってもよい。
【0089】
本発明に記載のＣＡＲ構造は、ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）の１種又は複数種の成分を含むため、ＮＫＲ－ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ成分は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１及びＫＩＲ３ＤＰ１）、天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６）、免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー（例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ－Ａ、ＣＲＡ、ＢＬＡＭＥ及びＣＤ２Ｆ－１０）；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ＣＤ１６及びＣＤ６４）、及びＬｙ４９受体（例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ）のうちのいずれかのナチュラルキラー細胞受容体に由来する膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン又は細胞質ドメインであってもよい。前記ＮＫＲ－ＣＡＲ分子は、アダプター分子又は細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＤＡＰ１２）と相互作用することができる。
【0090】
本発明に記載のレンチウイルスベクターは、基本的にヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、ビスナ・マエディウイルスウイルス（ｖｉｓｎａ－ｍａｅｄｉ ｖｉｒｕｓ，ＶＭＶ）、山羊関節炎・脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、牛免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群より選択される。
【0091】
本発明のＣＡＲ－Ｔは、特許出願２０１７１０３０５０７８．８、２０１７１０６１３３１７．６、２０１７１０６１８２９３．３、２０１５１０３０４３８９．３、２０１５１０６４８２５２．Ｘ、２０１８１０２０７７６１．２、２０１８１０９３４６３７．６、２０１８１１１２５９０６．０、２０１９１０４０７００１．０、２０２０１０２５７７６２．５、２０２０１０２５９４５８．４、２０２０１０２６０８０５．５、２０２０１０２６０８４９．８、２０２０１０５５９３６６．８、２０２１１０５５６１４７．９に記載のＣＡＲ－Ｔ構造及び他の公開されたＣＡＲ－Ｔ構造を使用することができる。このようなダブルネガティブユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞療法の使用は、任意のＣＡＲ構造又は標的に適用でき、ＣＡＲ標的、構造により制限されず、ＣＤ４及びＣＤ８遺伝子を発現しないＴ細胞は、全て任意ＣＡＲ構造の発現に影響を与えない。
【0092】
本発明で使用される遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲシリーズ技術（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮを含むが、これらに限定されない。本明細書に記載のダブルネガティブユニバーサルＴ細胞は、任意の遺伝子編集技術により得られることができる。
【0093】
本発明の同種他家Ｔ細胞とは、遺伝子編集技術によりＣＤ４及びＣＤ８遺伝子を不活性化するとともに同種他家に使用して特定の適応症を治療できるＴ細胞を指す。
【0094】
本発明の薬物組成物は、化学療法類薬物、他の腫瘍標的モノクローナル抗体類薬物、抗体－薬物カップリング複合体（ＡＤＣ）、免疫チェックポイント阻害剤類薬物、低分子薬物のうちの１種又は複数種と併用することができる。
【0095】
本発明に記載のＣＡＲ－Ｔ構造におけるヒンジ領域配列は、ＩｇＧ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ４に由来することができる。
【0096】
本発明に記載のＣＡＲ－Ｔ構造における膜貫通領域配列は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１３７、ＣＤ８０及びＣＤ８６に由来することができる。
【0097】
本発明に記載のＣＡＲ－Ｔ構造における細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＰＤ１Ｌ、Ｂ７－Ｈ３、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ１２７に由来することができる。
【0098】
本発明に記載の抗原認識領域は、標的抗原を認識できるリガンド／受容体であってもよい。ＳｃＦｖは、マウス抗体、完全ヒト抗体、又はヒト－マウスキメラ抗体のＳｃＦｖであってもよく、サメ、アルパカ、ラクダ抗体などの単一ドメイン抗体であってもよく、二重特異性抗体であってもよく、人工的に設計された、特定の標的を認識する標的特異性フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインとの組み合わせであってもよい。
【0099】
本発明におけるＣＡＲ－Ｔは、特許出願２０１７１０３０５０７８．８、２０１７１０６１３３１７．６、２０１７１０６１８２９３．３、２０１５１０３０４３８９．３、２０１５１０６４８２５２．Ｘ、２０１８１０２０７７６１．２、２０１８１０９３４６３７．６、２０１８１１１２５９０６．０、２０１９１０４０７００１．０、２０２０１０２５７７６２．５、２０２０１０２５９４５８．４、２０２０１０２６０８０５．５、２０２０１０２６０８４９．８、２０２０１０５５９３６６．８、２０２１１０５５６１４７．９に記載のＣＡＲ－Ｔ構造及び他の公開されたＣＡＲ－Ｔ構造を使用することができる。このようなダブルネガティブユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞療法の使用は、ＣＤ４４標的を除くいずれか１つのＣＡＲに適用でき、ＣＡＲの他の標的、構造によって制限されない。
【0100】
本発明で開示された調製方法において、活性化したＴ細胞は、ウイルスによりＣＡＲ構造に感染してもよく、トランスポゾンシステムを使用してもよい。
【0101】
本発明におけるＤＵ－ＣＡＲ－Ｔとは、ＣＤ４及び／又はＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化したユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を指す。
【0102】
本発明における４４－１９ＣＡＲとは、自己免疫細胞により調製されたＣＤ４４発現ＣＡＲ－Ｔ細胞を指す。
【0103】
本発明におけるＬ－１９ＣＡＲとは、自己免疫細胞により調製されたＣＤ６２発現ＣＡＲ－Ｔ細胞を指す。
【0104】
本発明で開示された調製方法において、活性化したＴ細胞は、ウイルスによりＣＡＲ構造に感染してもよく、トランスポゾンシステムを使用してもよい。
【0105】
本発明において、同種他家細胞を用いて調製された、ＣＤ４４を発現する從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、ＣＵ－４４－ＣＡＲ－Ｔであり、同種他家細胞を用いて調製された、ＣＤ４４を発現するユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、ＤＵ－４４－ＣＡＲ－Ｔである。
【0106】
本発明において、同種他家細胞を用いて調製された、ＣＤ６２Ｌを発現する從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、ＣＵ－６２－ＣＡＲ－Ｔであり、同種他家細胞を用いて調製された、ＣＤ６２を発現するユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、ＤＵ－６２－ＣＡＲ－Ｔである。
【0107】
本発明の有益な効果
１）本発明で提供されるダブルネガティブユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、効果的にＴリンパ球に発現できるだけでなく、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を強化し、ＣＡＲ－Ｔの有効性を向上させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を改善し、疲弊発現を低減し、腫瘍標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷を向上させることができ、腫瘍の標的療法に適用することができる。
２）本発明は、インビボおよびインビトロで腫瘍標的細胞を効果的に殺傷できるだけでなく、腫瘍の標的療法にも使用できるとともに、從來の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞及び從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果よりも高い選択可能なユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞候補細胞を提供する。
３）本発明で提供されるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に、インビトロで低いＧＶＨ応答のみが発生し、同種他家ＣＡＲ－Ｔ療法に適用でき、ＣＡＲ－Ｔの臨床応用及び腫瘍の併用治療の新しい戦略の開発に対して重要な指導意義を持っている。
４）本発明で提供される方法により調製されたＤＵ－ＣＡＲ－Ｔは、從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞と同じレベルの低ＧＶＨ反応を実現するとともに、本発明の４４－ＣＡＲ、Ｌ－ＣＡＲ及びユニバーサルＤＵ－ＣＡＲは、あらゆる面で自家ＣＡＲ細胞よりも優れているか、劣っていない。
５）本発明で提供される方法により調製されたＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、天然のＤＮ－Ｔ又はそれを用いて調製されたＤＮ－ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、本発明のＤＵ－ＣＡＲ－Ｔの増殖能力がより強く、活性がより高く、表現型分布がより良く、疲弊マーカー発現がより低く、インビトロでの有効性がより優れ、極めて顕著な統計的有意差がある。また、本発明の細胞は、より入手しやすく、同じ出発量のＰＢＭＣであっても、最終的に得られる有効な細胞は、ＤＮ－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも遥かに多い。これによって、生産コストが大幅に削減され、その臨床応用に対してより多くの可能性を提供する。
１）本発明で提供されるダブルネガティブユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、効果的にＴリンパ球に発現できるだけでなく、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を強化し、ＣＡＲ－Ｔの有効性を向上させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を改善し、疲弊発現を低減し、腫瘍標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷を向上させることができ、腫瘍の標的療法に適用することができる。
２）本発明は、インビボおよびインビトロで腫瘍標的細胞を効果的に殺傷できるだけでなく、腫瘍の標的療法にも使用できるとともに、從來の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞及び從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果よりも高い選択可能なユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞候補細胞を提供する。
３）本発明で提供されるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に、インビトロで低いＧＶＨ応答のみが発生し、同種他家ＣＡＲ－Ｔ療法に適用でき、ＣＡＲ－Ｔの臨床応用及び腫瘍の併用治療の新しい戦略の開発に対して重要な指導意義を持っている。
４）本発明で提供される方法により調製されたＤＵ－ＣＡＲ－Ｔは、從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞と同じレベルの低ＧＶＨ反応を実現するとともに、本発明の４４－ＣＡＲ、Ｌ－ＣＡＲ及びユニバーサルＤＵ－ＣＡＲは、あらゆる面で自家ＣＡＲ細胞よりも優れているか、劣っていない。
５）本発明で提供される方法により調製されたＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、天然のＤＮ－Ｔ又はそれを用いて調製されたＤＮ－ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、本発明のＤＵ－ＣＡＲ－Ｔの増殖能力がより強く、活性がより高く、表現型分布がより良く、疲弊マーカー発現がより低く、インビトロでの有効性がより優れ、極めて顕著な統計的有意差がある。また、本発明の細胞は、より入手しやすく、同じ出発量のＰＢＭＣであっても、最終的に得られる有効な細胞は、ＤＮ－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも遥かに多い。これによって、生産コストが大幅に削減され、その臨床応用に対してより多くの可能性を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0108】
【図1】ノックアウト率の検出結果を示す。
【図2】ＣＡＲ陽性率の検出結果を示す。
【図3】インビトロ薬力学の検出結果を示す。
【図4】表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の検出結果を示す。
【図5】疲弊マーカー（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）の検出結果を示す。
【図6】活性（ｖｉｔａｌｉｔｙ）の監視結果を示す。
【図7】ＧＶＨ強度の検出結果を示す。
【図8】１９ＣＡＲ、ＤＵ－１９ＣＡＲ及びＣＵ－１９ＣＡＲのインビボでの抗腫瘍検出結果の比較を示す。
【図9】１９ＣＡＲ及び４４－１９ＣＡＲのインビボでの抗腫瘍検出結果の比較を示す。
【図10】ＤＵ－４４－１９ＣＡＲ及び１９ＣＡＲのインビボでの抗腫瘍検出結果の比較を示す。
【図11】ＣＡＲ陽性率の検出結果を示す。
【図12】インビトロ薬力学の検出結果を示す。
【図13】フローサイトメーターの検出結果を示す。
【図14】疲弊マーカーの検出結果を示す。
【図15】ＧＶＨ強度の検出結果を示す。
【図16】フローサイトメトリーの検出結果を示す。
【図17】フローサイトメトリーの検出結果を示す。
【図18】インビトロ薬力学の検出結果を示す。
【図19】因子の検出結果を示す。
【図20】増殖と活性の検出結果を示す。
【図21】表現型の検出結果を示す。
【図22】疲弊マーカーの検出結果を示す。
【図23】活性化マーカーの検出結果を示す。
【図24】フローサイトメーターの検出結果を示す。
【図25】インビトロ薬力学評価の結果を示す。
【図26】表現型の検出結果を示す。
【図27】疲弊物の検出結果を示す。
【図28】増殖と活性の検出結果を示す。
【図29】ＧＶＨ強度の検出結果を示す。
【図30】インビボでの薬効の検出結果を示す。
【図31】ＲＴ－ＰＣＲマウス血液中のＣＡＲ－Ｔコピー数の結果を示す。
【図32】遺伝子ノックアウトの効率図である。
【図33】ＤＵ－１９ＣＡＲ、ＣＤ４シングルネガティブ４Ｎ－１９ＣＡＲ、ＣＤ８シングルネガティブ８Ｎ－１９ＣＡＲのインビトロ殺傷図である。
【図34】同割合で混合したＣＤ４シングルネガティブとＣＤ８シングルネガティブとの混合細胞のＧＶＨ強度測定を示す。
【発明を実施するための形態】
【0109】
本発明は、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製技術及びその使用を開示する。当業者は、本明細書の内容に基づいてプロセスパラメータを適宜に修正して実現することができる。なお、すべての置換及び変更は、当業者にとって自明のものであり、いずれも本発明に含まれるものとみなされる。本発明の方法及び使用は、好ましい実施例により説明されている。当業者は、本発明の内容、思想及び範囲から逸脱しない限り本明細書に記載の方法及び使用を修正又は適宜に変更及び組み合わせを行うことで本発明の技術を実現、応用することができる。
【0110】
本発明で保護されるダブルネガティブＴ細胞は、任意の標的及び構造のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と組み合わせて本発明で開示された技術的効果を得ることができる。ここで、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体を例として具体的に説明する。同様に、前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、逆転写ウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのうちのいずれか１種である。ここで、レンチウイルスベクターを例として説明する。前記調製スキームは、エレクトロポレーション法及び非エレクトロポレーション法を使用することができるが、本実施例においてエレクトロポレーション法を例として説明する。
【0111】
本発明において、磁気ビーズ選別は、ビオチンで標識されたＣＤ４及びＣＤ８抗体と、抗生物質が結合したマイクロビーズを使用するか、又はＣＤ４及びＣＤ８陽性磁気ビーズを使用してカラムにかけて選別する。さらに、フローソーターを用いるか又は必要な部分を得ることができる手法により選別してもよく、最後に必要な部分を選択すればよい。フローサイトメトリーによりノックアウト効率及び選別純度を検出するのに使用される抗体は、ＣＤ３：ＰＥ－ＣＹ７、ＣＤ４：ＦＩＴＣ、ＣＤ８：ＢＶ５１０である。本発明において、前記ダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法は、下記である。即ち、１、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後又は活性化せずにＣＡＲ及び／又はＣＤ４４及び／又はＣＤ６２Ｌ構造を含むウイルスに感染させ、数時間培養した後、ＣＡＲ構造が感染したＴ細胞に対してＲＮＰエレクトロポレーションを行い、引き続き培養し、目的細胞を選別する。２、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後又は活性化せずにＲＮＰをエレクトロポレーション法によりＴ細胞に導入した後、数時間培養した後、ＣＡＲ及び／又はＣＤ４４及び／又はＣＤ６２Ｌ構造を含むウイルスに感染させ、引き続き培養し、目的細胞を選別した。３、凍結保存又は新鮮な単核細胞を取得し、数時間活性化した後又は活性化せずにエレクトロポレーション法によりＲＮＰを細胞核に導入し、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を選別して取得し、さらにエレクトロポレーション法によりＲＮＰを細胞核に導入し、ＣＤ４及びＣＤ８ダブルネガティブのＴ細胞を選別して取得する。４、凍結保存又は新鮮な単核細胞を取得し、数時間活性化数した後又は活性化せずにエレクトロポレーション法によりＲＮＰを細胞核に導入し、ＣＤ４及びＣＤ８ダブルネガティブのＴ細胞を選別して取得し、ＣＡＲ構造及び／又はＣＤ４４及び／又はＣＤ６２Ｌを含むウイルスに感染させ、引き続き培養して目的細胞を得る。
【0112】
本発明で使用されるＣＡＲの構造は、細胞外認識領域（抗ＣＤ１９ＳｃＦｖ）－ＣＤ８由来ヒンジ－ＣＤ８由来膜貫通領域－細胞内シグナル伝達領域（ＣＤ１３７－ＣＤ３）であり、アミノ酸配列は配列番号１２に示される。
【0113】
【化1】
【0114】
本発明で提供されるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製技術及びその使用に用いられる原料及び試薬は、いずれも市販されている。以下、実施例により本発明をさらに説明する。
【0115】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
【0116】
実施例１：Ｔ細胞中のＣＤ４遺伝子及びＣＤ８遺伝子のノックアウト結果
【0117】
Ｌｏｎｚａエレクトロポレーターを用いて、エレクトロポレーション法によるＴ細胞の導入に適したエレクトロポレーションプログラムを選択する。Ｃａｓ９タンパク質：ｓｇＲＮＡのモル比は１：２であり、又は他の適切な比でもよい。ＲＮＰをインビトロで５－１５分間インキュベートする必要がある。その後、エレクトロポレーション緩衝液で再懸濁した適量のＴ細胞と均一に混合してエレクトロポレーションカップに移し、エレクトロポレーションを行う。エレクトロポレーションを完成した後、適量の培地を含む培養フラスコに移して引き続き培養する。エレクトロポレーションの７２ｈ後に、検出可能な蛍光標識を有するＣＤ４又はＣＤ８フローサイトメトリー抗体をインキュベートしてノックアウト効率を検出することができる。図３２は、表６に示される使用される標的のうち、一部のノックアウト効率を示す。異なる条件では、他の標的は、比較的高いノックアウト効果又はより高いノックアウト効果を示すこともできる。ＣＤ４及びＣＤ８がノックアウトされた遺伝子領域における、遺伝子自体に欠失を引き起こさせる任意の標的配列でもよい。
【0118】
本発明において、遺伝子編集標的がある位置表１及び表３－表５には、含まれるいずれか１つの領域における遺伝子自体に欠失を引き起こせる標的配列が示される。結果を図１に示す。使用される標的配列の一部は、配列番号１４－３３に示されてもよい。この配列は、ここで示される配列に限定されず、ＣＤ４及びＣＤ８をノックアウトした遺伝子領域における遺伝子自体に欠失を引き起こさせる任意の標的配列であればよく、かつヒト１２番染色体上のＣＤ４遺伝子：６，７８９，５２８－６，８２０，７９９（正方向ストランドに位置する）、ヒト２番染色体上のＣＤ８Ａ遺伝子：８６，７８４，６１０－８６，８０８，３９６（逆方向ストランドに位置する）及びヒト２番染色体上のＣＤ８Ｂ遺伝子：８６，８１５，３３９－８６，８６１，９２４（逆方向ストランドに位置する）を含む。遺伝子編集標的位置を表６及び表７に示す。以下、含まれる任意の領域における遺伝子自体に欠失を引き起こさせる標的配列を示す。
【0119】
【表3】
【0120】
【表4】
【0121】
【表5】
【0122】
【表6】
【0123】
【表7】
【0124】
実施例２：ＤＵ－１９ＣＡＲの調製
本発明の技術方法により調製されたＤＵ－１９ＣＡＲの取得方法
出発サンプルは健常人の末梢血であり、磁気ビーズ又はフローサイトメトリー技術によりそれぞれＣＤ４／ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を選別した。ＣＤ３、ＣＤ２８の抗体を含むＤｙｎａｂｅａｄｓにより持続的に刺激して通常の陰性対照群ＣＴ／ＣＤ４、シングルポジティブ対照群４Ｐ－ＣＴ／ＣＤ８、シングルポジティブ対照群８Ｐ－ＣＴを取得した。ＣＡＲを含むレンチウイルスに感染させて通常のＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ４シングルポジティブ４Ｐ－ＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ８シングルポジティブ８Ｐ－ＣＡＲ－Ｔを得た。
本発明の技術方法により調製されたＤＵ－１９ＣＡＲの取得方法
出発サンプルは健常人の末梢血であり、磁気ビーズ又はフローサイトメトリー技術によりそれぞれＣＤ４／ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を選別した。ＣＤ３、ＣＤ２８の抗体を含むＤｙｎａｂｅａｄｓにより持続的に刺激して通常の陰性対照群ＣＴ／ＣＤ４、シングルポジティブ対照群４Ｐ－ＣＴ／ＣＤ８、シングルポジティブ対照群８Ｐ－ＣＴを取得した。ＣＡＲを含むレンチウイルスに感染させて通常のＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ４シングルポジティブ４Ｐ－ＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ８シングルポジティブ８Ｐ－ＣＡＲ－Ｔを得た。
【0125】
或いは、エレクトロポレーション法によりＣＤ４及び／又はＣＤ８を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質のＲＮＰ複合体を導入し（具体的な実施形態は実施例１をご参照）、エレクトロポレーション後、フローサイトメトリー又は磁気ビーズによりＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ及び／又はＣＤ４／ＣＤ８シングルネガティブ４Ｎ－ＣＡＲ－Ｔ／８Ｎ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、培養液に適量の因子、又はＴ細胞の培養に適した任意の培地とサイトカインの組み合わせを加えてもよい。ここで、ＣＡＲ－Ｔ細胞調製過程における他のステップは、本社の前の特許出願に記載されたステップに従う。
【0126】
実施例３：ＣＤ４とＣＤ８ダブルネガティブＤＵ－１９ＣＡＲの評価
１、ＣＡＲ陽性率の検出方法
ＰＥで標識されたＰＬ抗体。図１１から分かるように、１９ＣＡＲ上のＣＤ４及びＣＤ８に対して遺伝子編集を行い、磁気ビーズにより高純度のダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞を選別した。非遺伝子編集群のＣＤ４及びＣＤ８の割合はそれぞれ５３．４６％及び４３．４３％であり、遺伝子ノックアウト後、ＤＴの割合は８９．９３％にも達し、磁気ビーズにより選別した後に純度が９９．９４％と高いダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。このような操作は、ＣＡＲ構造のＴ細胞上の発現に影響を与えなかった。ＤＵ－１９ＣＡＲ群及び１９ＣＡＲ群の陽性発現量はいずれも約８５％であるのに対し、從來のユニバーサルＣＵ－１９ＣＡＲ発現量は７６％であり、他の２群よりもやや低かった。
１、ＣＡＲ陽性率の検出方法
ＰＥで標識されたＰＬ抗体。図１１から分かるように、１９ＣＡＲ上のＣＤ４及びＣＤ８に対して遺伝子編集を行い、磁気ビーズにより高純度のダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞を選別した。非遺伝子編集群のＣＤ４及びＣＤ８の割合はそれぞれ５３．４６％及び４３．４３％であり、遺伝子ノックアウト後、ＤＴの割合は８９．９３％にも達し、磁気ビーズにより選別した後に純度が９９．９４％と高いダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。このような操作は、ＣＡＲ構造のＴ細胞上の発現に影響を与えなかった。ＤＵ－１９ＣＡＲ群及び１９ＣＡＲ群の陽性発現量はいずれも約８５％であるのに対し、從來のユニバーサルＣＵ－１９ＣＡＲ発現量は７６％であり、他の２群よりもやや低かった。
【0127】
２、インビトロ薬効、殺傷の評価方法
特定のエフェクター対ターゲット比（Ｅ：Ｔ＝ＣＡＲ－Ｔ：腫瘍細胞）でプレーティングし、１６４０完全培地中で所定時間培養し、ルシフェラーゼ溶解法により標的細胞の生存率を検出し、細胞毒性効率を算出した。インターフェロン－γ因子の分泌レベルの検出は、この因子レベルに適用できるキットを使用すればよい。詳細は各製造業者のキットの説明書を参照することができる。
特定のエフェクター対ターゲット比（Ｅ：Ｔ＝ＣＡＲ－Ｔ：腫瘍細胞）でプレーティングし、１６４０完全培地中で所定時間培養し、ルシフェラーゼ溶解法により標的細胞の生存率を検出し、細胞毒性効率を算出した。インターフェロン－γ因子の分泌レベルの検出は、この因子レベルに適用できるキットを使用すればよい。詳細は各製造業者のキットの説明書を参照することができる。
【0128】
図１２に示されるインビトロ薬力学評価の結果から分かるように、ＤＵ－１９ＣＡＲインビトロ殺傷は、從來のユニバーサルＣＵ－１９ＣＡＲに相当し、比が１：４、殺傷時間が２４ｈである場合、その殺傷効率はいずれも約９０％に達するのに対し、本発明の新しいユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲ群は、因子分泌レベルが從來ユニバーサルＣＵ－１９ＣＡＲ群の２倍であり、これは、本発明の方法は、その腫瘍殺傷能力を向上させ、腫瘍細胞をより強力に攻撃するのに有利であることを示している。
【0129】
３、表現型の検出方法
フローサイトメーター検出
抗体：ＣＣＲ７：ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ：ＢＶ４２１、ＣＤ４５ＲＯ：Ｐｅｒｃｐ５．５
表現型の分類標準
Ｔメモリー幹細胞：ＴＳＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋）、類Ｔメモリー幹細胞：ＴＳＣＭ－Ｌｉｋｅ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリーＴ：ＴＥＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、セントラルメモリーＴ：ＴＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターＴ：ＴＥ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－）、その他（１００％－ＴＳＣＭ－ＴＳＣＭ－Ｌｉｋｅ－ＴＥＭ－ＴＣＭ－ＴＥ）
図１３に示すように、表現型検出の結果から分かるように、從來の自家１９ＣＡＲと比較して、ユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲ各群は、サブタイプ分布が比較的近く、ＴＳＣＭがやや低いが、ＴＥがやや高く、腫瘍細胞の瞬時殺傷に有利である。
フローサイトメーター検出
抗体：ＣＣＲ７：ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ：ＢＶ４２１、ＣＤ４５ＲＯ：Ｐｅｒｃｐ５．５
表現型の分類標準
Ｔメモリー幹細胞：ＴＳＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋）、類Ｔメモリー幹細胞：ＴＳＣＭ－Ｌｉｋｅ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリーＴ：ＴＥＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、セントラルメモリーＴ：ＴＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターＴ：ＴＥ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－）、その他（１００％－ＴＳＣＭ－ＴＳＣＭ－Ｌｉｋｅ－ＴＥＭ－ＴＣＭ－ＴＥ）
図１３に示すように、表現型検出の結果から分かるように、從來の自家１９ＣＡＲと比較して、ユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲ各群は、サブタイプ分布が比較的近く、ＴＳＣＭがやや低いが、ＴＥがやや高く、腫瘍細胞の瞬時殺傷に有利である。
【0130】
４、疲弊マーカー検出方法
フローサイトメーター検出
抗体：ＰＤ－１：ＡＰＣ、ＬＡＧ－３：ＢＶ４２１、ＴＩＭ－３：Ｐｅｒｃｐ５．５
図１４に示すように、疲弊マーカー検出の発現量データ結果から分かるように、２群のＣＡＲはいずれもＴＩＭ－３を発見させないが、從來の自家１９ＣＡＲと比較して、本発明のユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲ上のＰＤ－１及びＬＡＧ－３の発現はいずれもより低く、これは、本発明のユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲがより長い持続性を有し、抗腫瘍能力の向上に有利であることを示している。
フローサイトメーター検出
抗体：ＰＤ－１：ＡＰＣ、ＬＡＧ－３：ＢＶ４２１、ＴＩＭ－３：Ｐｅｒｃｐ５．５
図１４に示すように、疲弊マーカー検出の発現量データ結果から分かるように、２群のＣＡＲはいずれもＴＩＭ－３を発見させないが、從來の自家１９ＣＡＲと比較して、本発明のユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲ上のＰＤ－１及びＬＡＧ－３の発現はいずれもより低く、これは、本発明のユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲがより長い持続性を有し、抗腫瘍能力の向上に有利であることを示している。
【0131】
５、ＧＶＨ強度の測定方法
ミクロスフェア絶対計数の方法により混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を測定し、特定の比でドナー細胞（ＣＡＲ－Ｔ）：レシピエント細胞（ドナー細胞と異なるＨＬＡサブタイプの健常人ＰＢＭＣ）の混合系を調製し、１６４０基礎培地で８日間培養し、それぞれ０日目及び８日目にフローサイトメトリーにより細胞の絶対計数を検出し、細胞数の変化によりＧＶＨの相対強度を算出した。
ミクロスフェア絶対計数の方法により混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を測定し、特定の比でドナー細胞（ＣＡＲ－Ｔ）：レシピエント細胞（ドナー細胞と異なるＨＬＡサブタイプの健常人ＰＢＭＣ）の混合系を調製し、１６４０基礎培地で８日間培養し、それぞれ０日目及び８日目にフローサイトメトリーにより細胞の絶対計数を検出し、細胞数の変化によりＧＶＨの相対強度を算出した。
【0132】
図１５に示される検出結果から分かるように、本発明のダブルネガティブＤＵ－１９ＣＡＲによって引き起こされるＧＶＨ反応の強度は從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞ＣＵ－１９ＣＡＲに相当し、いずれも対照群の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞１９ＣＡＲ及びＣＴ群よりも低かった。この結果は、本発明の方法により調製されたＤＵ－１９ＣＡＲが從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に同種他家ＣＡＲ－Ｔ免疫療法に適用できることを示している。
【0133】
６、インビボでの薬力学評価方法
１１ｄａｙにマウスを導入し、マウスに対して検疫などの一連の検査作業を行った後、試験に組み入れることができる。－３ｄａｙに５ｅ５Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃ－ＧＦＰ標的細胞尾静脈注射を行い、ｄａｙ０にランダムに群分けした後、ＣＡＲ－Ｔ有効細胞数が２ｅ６となるようにＣＡＲ－Ｔ細胞を再注入し、その後、７日ごとに生体イメージングを行ってマウスのインビボでの腫瘍除去状況を観察した。
１１ｄａｙにマウスを導入し、マウスに対して検疫などの一連の検査作業を行った後、試験に組み入れることができる。－３ｄａｙに５ｅ５Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃ－ＧＦＰ標的細胞尾静脈注射を行い、ｄａｙ０にランダムに群分けした後、ＣＡＲ－Ｔ有効細胞数が２ｅ６となるようにＣＡＲ－Ｔ細胞を再注入し、その後、７日ごとに生体イメージングを行ってマウスのインビボでの腫瘍除去状況を観察した。
【0134】
図８に示されるインビボでの薬効結果から分かるように、１９ＣＡＲ群、ＤＵ－１９ＣＡＲ群及びＣＵ－１９ＣＡＲ群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ群と比較してインビボで顕著な腫瘍抑制作用を有した。ＤＵ－１９ＣＡＲ群及びＣＵ－１９ＣＡＲ群の蛍光値曲線データ分析から分かるように、ＤＵ－１９ＣＡＲ群と比較してＣＵ－１９ＣＡＲ群はインビボでの薬効が顕著に優れており、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲインビボでの薬効は自家群１９ＣＡＲよりもやや優れており、これは、本発明の新しいユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの抗腫瘍効果が從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞よりも遥かに高いとともに、從來の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高いことを示している。これも本発明の予想外の発見の一つである。
【0135】
前記をまとめると、本発明で設計されたＤＵ－１９ＣＡＲに対してインビトロ・インビボ薬効学評価、表現型検出、疲弊マーカー検出を行った結果、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲはあらゆる面で從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞よりも優れている。ミクロスフェア絶対計数の方法により混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を測定した結果、本発明で設計された新しいユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲによって引き起こされるＧＶＨ反応の程度は、從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＵ－１９ＣＡＲ）に相当し、同種他家の再注入治療に使用できる。
【0136】
実施例４：ＣＤ４シングルネガティブ、ＣＤ８シングルネガティブ、及びＣＤ４シングルネガティブとＣＤ８シングルネガティブとの組み合わせのＤＵ－１９ＣＡＲの評価
【0137】
１、インビトロ薬力学評価
図３３に示されるインビトロ薬力学評価結果から分かるように、ＤＵ－１９ＣＡＲ、ＣＤ４シングルネガティブ４Ｎ－１９ＣＡＲ、ＣＤ８シングルネガティブ８Ｎ－１９ＣＡＲのインビトロ抗腫瘍能力は、対照群自家１９ＣＡＲに相当し、その殺傷効率はいずれも８０％以上に達した。Ｋ５６２－Ｌｕｃ－ＧＦＰに示される非特異的な殺傷は正常現象である。これは、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲ又はＣＤ４陰性及びＣＤ８陰性１９ＣＡＲからなるＤＵ－１９ＣＡＲのインビトロ抗腫瘍能力は遺伝子編集により低下しないことを示している。
図３３に示されるインビトロ薬力学評価結果から分かるように、ＤＵ－１９ＣＡＲ、ＣＤ４シングルネガティブ４Ｎ－１９ＣＡＲ、ＣＤ８シングルネガティブ８Ｎ－１９ＣＡＲのインビトロ抗腫瘍能力は、対照群自家１９ＣＡＲに相当し、その殺傷効率はいずれも８０％以上に達した。Ｋ５６２－Ｌｕｃ－ＧＦＰに示される非特異的な殺傷は正常現象である。これは、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲ又はＣＤ４陰性及びＣＤ８陰性１９ＣＡＲからなるＤＵ－１９ＣＡＲのインビトロ抗腫瘍能力は遺伝子編集により低下しないことを示している。
【0138】
２、ＧＶＨ強度の測定
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）及びフローサイトメトリー検出の方法により測定し、特定の割合で調製した。具体的には、まず、レシピエント細胞（ドナー細胞と異なるＨＬＡサブタイプの健常人ＰＢＭＣ）をマイトマイシンＣで処理してその成長を抑制し、干渉を排除し、次に、ドナー細胞及び／又はレシピエント細胞を異なる色の染料（ＣＴＶ及び／又はＣＦＳＥ）で染色して区別し、ドナー細胞（活性化したＴ細胞）：レシピエント細胞を特定の割合で混合した。ここで、ドナー細胞がＣＤ４陽性／陰性及びＣＤ８陽性／陰性Ｔ細胞からなるＤＵ－ＣＴ及びＣＴでは、各群の細胞の成分比を表８に示す。混合した直後、直ちにフローサイトメトリーにより検出してそれぞれの割合を区別し、１６４０基礎培地で培養し、それぞれ所定の時間にフローサイトメトリーによりそれぞれの割合の変化状況を検出し、細胞割合の変化によりＧＶＨの相対強度を計算した。
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）及びフローサイトメトリー検出の方法により測定し、特定の割合で調製した。具体的には、まず、レシピエント細胞（ドナー細胞と異なるＨＬＡサブタイプの健常人ＰＢＭＣ）をマイトマイシンＣで処理してその成長を抑制し、干渉を排除し、次に、ドナー細胞及び／又はレシピエント細胞を異なる色の染料（ＣＴＶ及び／又はＣＦＳＥ）で染色して区別し、ドナー細胞（活性化したＴ細胞）：レシピエント細胞を特定の割合で混合した。ここで、ドナー細胞がＣＤ４陽性／陰性及びＣＤ８陽性／陰性Ｔ細胞からなるＤＵ－ＣＴ及びＣＴでは、各群の細胞の成分比を表８に示す。混合した直後、直ちにフローサイトメトリーにより検出してそれぞれの割合を区別し、１６４０基礎培地で培養し、それぞれ所定の時間にフローサイトメトリーによりそれぞれの割合の変化状況を検出し、細胞割合の変化によりＧＶＨの相対強度を計算した。
【0139】
図３４では、４日間共培養した後、ドナー細胞の宿主ＰＢＭＣに対する拒絶作用による細胞増殖比率から分かるように、ＤＵ－ＣＴ群は対照群ＣＴよりも顕著に低かった。これらの結果は、本発明の方法により調製されたダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞が同種他家ＣＡＲ－Ｔ免疫療法に使用できることを示している。
【0140】
【表8】
【0141】
実施例５：ナチュラルＤＮＴ又はそれを用いて調製されたＤＮ－ＣＡＲ－Ｔ（ＤＮ－１９ＣＡＲ：天然のＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞）と、本発明の技術により調製されたユニバーサルＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ（ＤＵ－１９ＣＡＲ：遺伝子編集により得られたＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞）の比較結果
【0142】
ナチュラルＤＮＴとは、ヒト末梢血中の天然のＣＤ４及びＣＤ８を発現しないダブルネガティブＴ細胞を指す。このような細胞は、抗原提示経路がＭＨＣによって制限されず、同種他家の使用に同種拒絶を引き起こす確率が極めて低い（末梢血中の総リンパ球の１－５％）が、ヒト末梢血におけるこの細胞の存在割合が極めて低く、インビトロ増幅が非常に困難であり、適応症に対する治療効果が良くない。本発明の技術により調製されたユニバーサルダブルネガティブ細胞は、最初ヒト末梢血中のＣＤ４シングルポジティブ又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞に由来し（末梢血中の総リンパ球の４０－８０％）、このような細胞は、抗原提示過程がＭＨＣによって制限され、同種他家用途に直接使用できず、同種拒絶反応を回避するためにさらなる操作が必要である。本発明は、遺伝子編集技術によりＣＤ４及びＣＤ８を不活性化してＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブのＴ細胞を得た。本発明において、このような細胞は從來のユニバーサルＴ細胞と同様に同種他家治療に適用できる必要な条件を有することを示している（ＧＶＨ関連データを参照）。
【0143】
１、ナチュラルＤＮＴの取得方法
出発サンプル：健常人末梢血
（１）磁気ビーズでＣＤ４／ＣＤ８ＳＰＴ細胞（ＣＤ４又はＣＤ８細胞）を除去し、ＣＤ３、ＣＤ２８を含む抗体で２４－４８ｈ持続的に刺激し、次に、ＩＬ２及びＩＬ４（及び／又は）ＩＬ７（及び／又は）ＩＬ１５（及び／又は）ＩＬ２１を含む培地で集積培養した。（２）フローサイトメトリーによりＣＤ３＋ＣＤ４－／ＣＤ８－Ｔ細胞を選別し、ＣＤ３、ＣＤ２８を含む抗体で２４－４８ｈ持続的に刺激し、次に、ＩＬ２及びＩＬ４（及び／又は）ＩＬ７（及び／又は）ＩＬ１５（及び／又は）ＩＬ２１を含む培地で集積培養した。
出発サンプル：健常人末梢血
（１）磁気ビーズでＣＤ４／ＣＤ８ＳＰＴ細胞（ＣＤ４又はＣＤ８細胞）を除去し、ＣＤ３、ＣＤ２８を含む抗体で２４－４８ｈ持続的に刺激し、次に、ＩＬ２及びＩＬ４（及び／又は）ＩＬ７（及び／又は）ＩＬ１５（及び／又は）ＩＬ２１を含む培地で集積培養した。（２）フローサイトメトリーによりＣＤ３＋ＣＤ４－／ＣＤ８－Ｔ細胞を選別し、ＣＤ３、ＣＤ２８を含む抗体で２４－４８ｈ持続的に刺激し、次に、ＩＬ２及びＩＬ４（及び／又は）ＩＬ７（及び／又は）ＩＬ１５（及び／又は）ＩＬ２１を含む培地で集積培養した。
【0144】
ＤＮ－１９ＣＡＲの取得方法：ナチュラルＤＮＴを取得し、２４ｈ培養し、ＣＡＲ含有レンチウイルスに感染させた。
【0145】
異なる供給源からの健常人の末梢血を６バッチ収集し、そのＰＢＭＣを分離し、検出によりＤＮＴ含有量が最も高い３バッチを選択した（選別指標：ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８－）。ＤＵ－１９ＣＡＲの調製に使用する必要がある出発細胞はＳＰＴであった（選別指標：ＣＤ３＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）。結果を表９に示す。
【0146】
【表9】
【0147】
それぞれ出発量１ｅ８で計算し、細胞活性化の６日目に取得したＣＡＲ－Ｔ細胞数の統計を表１０に示す。表のデータから分かるように、同じ出発量のＰＢＭＣの場合、ＤＮＴ割合が比較的高いバッチを選別した後、得られたＤＵ－１９ＣＡＲ細胞は、少なくともＤＮ－１９ＣＡＲ細胞の３倍であり、最大３５倍以上にも達した。活性化の６日目に監視し始めた増殖データについては、図２３に示すように、後期の増殖において、ＤＮ－１９ＣＡＲ細胞はＤＵ－１９ＣＡＲ細胞よりも遥かに低かった。前記の結果から分かるように、ＤＵ－１９ＣＡＲ細胞の応用範囲はより広く、様々な用途、特に臨床応用のように細胞量に対する要求が高い分野のニーズを満たすことができる。図１６から分かるように、ＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ陽性率は６０％以上であり、Ｎ－ＤＮ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の２５．４％よりも遥かに高く、つまり、有効細胞の割合が高く、腫瘍細胞の殺傷により有利である。
【0148】
【表10】
【0149】
３、ＤＵ－１９ＣＡＲの取得方法
調製は前と同じ、磁気ビーズにより選別し、ビオチンで標識されたＣＤ４及びＣＤ８抗体、並びに抗生物質が結合したマイクロビーズを用いてカラムにかけて選別した。図１７に示すように、陰性部分を選択すればよい。フローサイトメトリーによりノックアウト効率及び選択純度を選択するのに使用される抗体は、ＣＤ３：ＰＥ－ＣＹ７、ＣＤ４：ＦＩＴＣ、ＣＤ８：ＢＶ５１０であった。
調製は前と同じ、磁気ビーズにより選別し、ビオチンで標識されたＣＤ４及びＣＤ８抗体、並びに抗生物質が結合したマイクロビーズを用いてカラムにかけて選別した。図１７に示すように、陰性部分を選択すればよい。フローサイトメトリーによりノックアウト効率及び選択純度を選択するのに使用される抗体は、ＣＤ３：ＰＥ－ＣＹ７、ＣＤ４：ＦＩＴＣ、ＣＤ８：ＢＶ５１０であった。
【0150】
図１７から分かるように、ＤＵ－１９ＣＡＲ細胞の純度は１００％にも達し、選別純度が高く、ＤＮ－ＣＡＲ－Ｔ細胞のＤＮＴ割合が９６．６％であった。これは、集積により得られたＤＮＴの純度が比較的高いが、本発明の方法よりもやや低いことを示している。これは、安全性の面では、本発明の方法により得られたＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞はより大きな優位性を有することを示している。
【0151】
４、インビトロ薬力学評価
図１８に示すように、エフェクター対ターゲット比が１：８である場合、殺傷結果は、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲと從來の自家１９ＣＡＲとの間に統計学的有意差があり、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲと天然ＤＮＴによるＤＮ－１９ＣＡＲとの間に極めて顕著な統計学的有意差がある。これは、本発明のＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力がＤＮ－ＣＡＲ－Ｔ細胞より顕著に高く、自家ＣＡＲ－Ｔ細胞群よりやや優れたことを示している。
図１８に示すように、エフェクター対ターゲット比が１：８である場合、殺傷結果は、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲと從來の自家１９ＣＡＲとの間に統計学的有意差があり、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲと天然ＤＮＴによるＤＮ－１９ＣＡＲとの間に極めて顕著な統計学的有意差がある。これは、本発明のＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力がＤＮ－ＣＡＲ－Ｔ細胞より顕著に高く、自家ＣＡＲ－Ｔ細胞群よりやや優れたことを示している。
【0152】
５、因子検出結果
図１９に示されるから分かるように、検出インターフェロンγの検出に使用できる任意のキットを用いて検出すればよく、殺傷後の上清培地を検出し、方法は各試薬の説明書を参照することができる。結果から分かるように、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲは、從來の自家１９ＣＡＲとの間に顕著な統計学的有意差があり、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲは、天然ＤＮＴによるＤＮ－１９ＣＡＲとの間に極めて顕著な統計学的有意差がある。これは、因子分泌のレベルから本発明のダブルネガティブユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞がより高いインビトロ薬効を有することを示している。
図１９に示されるから分かるように、検出インターフェロンγの検出に使用できる任意のキットを用いて検出すればよく、殺傷後の上清培地を検出し、方法は各試薬の説明書を参照することができる。結果から分かるように、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲは、從來の自家１９ＣＡＲとの間に顕著な統計学的有意差があり、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲは、天然ＤＮＴによるＤＮ－１９ＣＡＲとの間に極めて顕著な統計学的有意差がある。これは、因子分泌のレベルから本発明のダブルネガティブユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞がより高いインビトロ薬効を有することを示している。
【0153】
６、増殖と活性の監視
磁気ビーズにより高純度のダブルネガティブＤＵ－１９ＣＡＲを選別したとき（活性化後のｄａｙ５又はｄａｙ６）から監視し始めた。監視方法については、各群から所定の同じ出発量（例えば、１ｅ６）の細胞を取って監視し、その後、２－３日ごとに監視し、ある群の細胞が増殖しなくなりかつ活性が低下し始めたのを観察すると、監視を停止した。監視プロセス全体を通じてセルを破棄してはならない。図２０に示すように、本発明のユニバーサルＤＵ－ＣＡＲ－Ｔは、増殖能力と細胞活性がいずれもナチュラルダブルネガティブＤＮ－Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ又はそれによるダブルネガティブＤＮ－１９ＣＡＲ細胞よりも顕著に優れている。これは、本発明の調製方法により得られたユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲ細胞は、増殖及び活性がいずれも影響を受けず、意外な効果もあるのに対し、ナチュラルＤＮＴは増殖が悪く、治療に必要な量に迅速に応えることが難しく、製造コストも大幅に高くなるため、臨床応用への推進が困難である。
磁気ビーズにより高純度のダブルネガティブＤＵ－１９ＣＡＲを選別したとき（活性化後のｄａｙ５又はｄａｙ６）から監視し始めた。監視方法については、各群から所定の同じ出発量（例えば、１ｅ６）の細胞を取って監視し、その後、２－３日ごとに監視し、ある群の細胞が増殖しなくなりかつ活性が低下し始めたのを観察すると、監視を停止した。監視プロセス全体を通じてセルを破棄してはならない。図２０に示すように、本発明のユニバーサルＤＵ－ＣＡＲ－Ｔは、増殖能力と細胞活性がいずれもナチュラルダブルネガティブＤＮ－Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ又はそれによるダブルネガティブＤＮ－１９ＣＡＲ細胞よりも顕著に優れている。これは、本発明の調製方法により得られたユニバーサルＤＵ－１９ＣＡＲ細胞は、増殖及び活性がいずれも影響を受けず、意外な効果もあるのに対し、ナチュラルＤＮＴは増殖が悪く、治療に必要な量に迅速に応えることが難しく、製造コストも大幅に高くなるため、臨床応用への推進が困難である。
【0154】
７、表現型、疲弊マーカー、活性化マーカーの検出
１）表現型の検出結果：図２１に示すように、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲ群は、ＴＥ割合がＤＮ－１９ＣＡＲ群よりも顕著に高かった。ＣＡＲ－Ｔの作用時間が短く、瞬時殺傷能力が薬効の重要な指標であるため、本実施例の殺傷結果は本発明のＤＵ－１９ＣＡＲの殺傷能力がより高いことを示している。
１）表現型の検出結果：図２１に示すように、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲ群は、ＴＥ割合がＤＮ－１９ＣＡＲ群よりも顕著に高かった。ＣＡＲ－Ｔの作用時間が短く、瞬時殺傷能力が薬効の重要な指標であるため、本実施例の殺傷結果は本発明のＤＵ－１９ＣＡＲの殺傷能力がより高いことを示している。
【0155】
２）疲弊マーカーの検出結果：図２２に示すように、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲにおいて、３種類の疲弊分子の発現量がいずれもＤＮ－１９ＣＡＲよりも低かった。この結果から分かるように、本発明のＤＵ－１９ＣＡＲは、より高い持続性を有し、アポトーシスの速度がより遅いため、その抗腫瘍薬効をより良く発揮することができる。
【0156】
３）活性化マーカーの検出方法：フローサイトメーター検出
抗体：ＣＤ２５：ＦＩＴＣ、ＣＤ４４：ＢＶ４２１、ＣＤ９５：ＢＶ４７１１
図２３に示される活性化マーカーの検出結果から分かるように、ＣＤ２５に小さな違いが見られた以外、ＣＤ９５及ＣＤ４４はいずれも類似の発現を示している。
抗体：ＣＤ２５：ＦＩＴＣ、ＣＤ４４：ＢＶ４２１、ＣＤ９５：ＢＶ４７１１
図２３に示される活性化マーカーの検出結果から分かるように、ＣＤ２５に小さな違いが見られた以外、ＣＤ９５及ＣＤ４４はいずれも類似の発現を示している。
【0157】
実施例６：ＣＤ４４発現Ｔ細胞と４４－１９ＣＡＲ（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）細胞の調製
ＣＤ４４は、任意の標的及び構造のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と組み合わせて本発明で開示された技術的効果を得ることができる。ここで、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体を例として具体的に説明する。同様に、前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、逆転写ウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのうちのいずれか１種であってもよい。ここで、レンチウイルスベクターを例として説明する。
ＣＤ４４は、任意の標的及び構造のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と組み合わせて本発明で開示された技術的効果を得ることができる。ここで、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体を例として具体的に説明する。同様に、前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、逆転写ウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのうちのいずれか１種であってもよい。ここで、レンチウイルスベクターを例として説明する。
【0158】
１）ＣＤ４４発現ベクターの構築
配列番号１２に示されるＣＤ４４アミノ酸配列に対応する遺伝子断片のように、前記目的断片とベクター断片とをＴ４リガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）により結合してキメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターを得た。プラスミド抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりプラスミドを抽出した（具体的な方法は説明書を参照）。前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、逆転写ウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのいずれか１種であってもよい。具体的な調製方法を説明するために、ここでレンチウイルスベクターを例として説明する。
配列番号１２に示されるＣＤ４４アミノ酸配列に対応する遺伝子断片のように、前記目的断片とベクター断片とをＴ４リガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）により結合してキメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターを得た。プラスミド抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりプラスミドを抽出した（具体的な方法は説明書を参照）。前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、逆転写ウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのいずれか１種であってもよい。具体的な調製方法を説明するために、ここでレンチウイルスベクターを例として説明する。
【0159】
得られたＣＤ４４分子をコードする遺伝子配列を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）を二重消化し、また、制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩをレンチウイルス発現ベクターｐＲＲＬＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ＰＧＫ－ＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドを酵素消化し（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１２２５２／）、制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩでｐＲＲＬＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ＰＧＫ－ＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドを同時に酵素消化した（酵素消化反応は説明書を参照）。酵素消化物をアガロースゲル電気泳動により分離した後、アガロースゲルＤＮＡ断片回収キットによりＤＮＡ断片を回収し、その後、合成したＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を有するＣＤ４４配列断片を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで同時に酵素消化した後、回収して得られた前記のＤＮＡ断片に結合し、ＣＤ４４発現ベクターを得た。
【0160】
２）ＣＤ４４を発現し及び腫瘍のＣＡＲ遺伝子を特異的に認識するベクターの構築
抗ヒトＣＤ１９抗原を含む一本鎖抗体ＳｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達セグメントを含むキメラ抗原受容体配列を合成した。
抗ヒトＣＤ１９抗原を含む一本鎖抗体ＳｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達セグメントを含むキメラ抗原受容体配列を合成した。
【0161】
その後、キメラ抗原受容体配列及びＣＤ４４分子をそれぞれテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行った。反応系については、ＫＯＤ ＦＸ ＮＥＯ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社から購入）の説明書に従って注入し、ＰＣＲ反応条件は、９５℃、５ｍｉｎ予備変性；９５℃、１０ｓ変性；５５℃、１５ｓアニーリング；６８℃、３０ｓ伸長；３０サイクルであった。増幅産物を１％アガロースゲル（ｗ／ｖ）で同定した。その後、回収キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によりＤＮＡ断片を回収した（具体的な方法は説明書を参照）。回収してキメラ抗原受容体及びＣＤ４４分子断片を取得し、ＤＮＡ回収断片をシーケンシングした。
【0162】
（２）キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターの構築：ＣＤ１９ＣＡＲ－結合ペプチド（ポリシストロニック構造）－ＣＤ４４を標的とした。
【0163】
前記ＣＡＲ分子とＣＤ４４分子とをポリシストロニック構造により結合した。前記ポリシストロニック構造は、自己切断ペプチド又は内部リボソーム進入部位ＩＲＥＳであった。前記自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａであった。ここで、Ｐ２Ａを例としてＣＤ１９ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ４４を標的とする発現ベクターを得た。
【0164】
酵素消化反応は、説明書に従って行った。酵素消化物をアガロースゲル電気泳動により分離した後、アガロースゲルＤＮＡ断片回収キットでＤＮＡ断片を回収し、その後、目的断片とベクター断片とをＴ４リガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）結合し、キメラ抗原受容体及びＣＤ４４分子を発現するレンチウイルスベクターを得た。レンチウイルスベクターを５μＬ取って大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換し、３０℃で１６ｈ培養した後、モノクローナル抗体を選択し、選択されたモノクローナル抗体を３０℃の条件下で１２ｈ培養した後、プラスミド抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でプラスミドを抽出した（具体的な方法は説明書を参照）。抽出されたプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより酵素消化して電気泳動で同定した。
【0165】
３）ステップ２）及び３）でベクターを得てレンチウイルスを調製
（１）レンチウイルスのパッケージング
本実施例において、レンチウイルスのパッケージングはリン酸カルシウム法を使用した。具体的なステップは下記である。即ち、１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地で２９３Ｔ細胞を好適な状態に培養し、その後、２９３Ｔ細胞を１×１０５／ｃｍ２の密度で１つの７５ｃｍ２の培養フラスコに移して２２ｈ培養し、トランスフェクションするときの細胞コンフルエントが７０－８０％であることを保証した。さらに、予熱した２％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地で培養液を交換し、２ｈ培養してバックアップとした。６８０μＬのｄｄＨ２Ｏ、２０μｇレンチウイルスベクター（ステップ１）及び２）に記載のベクター）、１００μＬの２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を１５ｍＬ遠沈管に入れ、均一に混合した後、ピペットを用いて混合液に２×ＨＢＳを滴下し、１０ｍＬピペットでピペッティングして均一に混合し、その後、室温で１５ｍｉｎ静置し、次に、混合液を調製された前記細胞に滴下し、引き続き１２－１６ｈ培養した後、１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地で培養液を交換した。細胞を４８ｈ、７２ｈ培養した後、それぞれ細胞上清を収集してウイルス精製に使用した。
（１）レンチウイルスのパッケージング
本実施例において、レンチウイルスのパッケージングはリン酸カルシウム法を使用した。具体的なステップは下記である。即ち、１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地で２９３Ｔ細胞を好適な状態に培養し、その後、２９３Ｔ細胞を１×１０５／ｃｍ２の密度で１つの７５ｃｍ２の培養フラスコに移して２２ｈ培養し、トランスフェクションするときの細胞コンフルエントが７０－８０％であることを保証した。さらに、予熱した２％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地で培養液を交換し、２ｈ培養してバックアップとした。６８０μＬのｄｄＨ２Ｏ、２０μｇレンチウイルスベクター（ステップ１）及び２）に記載のベクター）、１００μＬの２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を１５ｍＬ遠沈管に入れ、均一に混合した後、ピペットを用いて混合液に２×ＨＢＳを滴下し、１０ｍＬピペットでピペッティングして均一に混合し、その後、室温で１５ｍｉｎ静置し、次に、混合液を調製された前記細胞に滴下し、引き続き１２－１６ｈ培養した後、１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地で培養液を交換した。細胞を４８ｈ、７２ｈ培養した後、それぞれ細胞上清を収集してウイルス精製に使用した。
【0166】
（２）レンチウイルスの精製
ウイルス上清を５０ｍｌ遠沈管に収集し、３０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離した後、０．４５μｍ濾過膜で濾過し、濾液を３０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離した後、新しい５０ｍＬ遠沈管に移した。ウイルス上清の量に応じてそれぞれ５０％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ）、４ＭＮａＣｌを加え、さらに医療食塩水で総体積３５ｍＬ（ＰＥＧ６０００最終濃度８．５％、ＮａＣｌ最終濃度０．３Ｍ）に定容し、４℃冷蔵庫に９０ｍｉｎ静置し、３０ｍｉｎ／回で転倒混和し、サンプルを４℃、５０００ｒ／ｍｉｎの条件下で３０ｍｉｎ遠心分離し、上清を全部捨て、２００μＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地でウイルスを再懸濁し、４０μＬ／管で１．５ｍＬのＥＰ管に分注し、－８０℃で保存してバックアップとした。
ウイルス上清を５０ｍｌ遠沈管に収集し、３０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離した後、０．４５μｍ濾過膜で濾過し、濾液を３０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離した後、新しい５０ｍＬ遠沈管に移した。ウイルス上清の量に応じてそれぞれ５０％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ）、４ＭＮａＣｌを加え、さらに医療食塩水で総体積３５ｍＬ（ＰＥＧ６０００最終濃度８．５％、ＮａＣｌ最終濃度０．３Ｍ）に定容し、４℃冷蔵庫に９０ｍｉｎ静置し、３０ｍｉｎ／回で転倒混和し、サンプルを４℃、５０００ｒ／ｍｉｎの条件下で３０ｍｉｎ遠心分離し、上清を全部捨て、２００μＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地でウイルスを再懸濁し、４０μＬ／管で１．５ｍＬのＥＰ管に分注し、－８０℃で保存してバックアップとした。
【0167】
（３）レンチウイルス力価の測定
Ａ、ウイルス感染２９３Ｔ細胞
１２ｈ前に２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）ＤＭＥＭ培養液を含む２４ウェルプレートにプレーティングし、ウイルス感染前の細胞コンフルエントが４０％－７０％でありかつ細胞状態が良好であることを確保した。各ウェルに１μＬの６ｇ／ｍＬポリブレン溶液を加え、その後、精製したレンチウイルスベクター１μＬを取り、医療用生理食塩水で１０倍希釈して作動液を調製してそれぞれ対応するウェルに加え、２４ｈ後に１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地で培養液を交換し、７２ｈ感染した後、１０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集し、遺伝子群を抽出した。
Ａ、ウイルス感染２９３Ｔ細胞
１２ｈ前に２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）ＤＭＥＭ培養液を含む２４ウェルプレートにプレーティングし、ウイルス感染前の細胞コンフルエントが４０％－７０％でありかつ細胞状態が良好であることを確保した。各ウェルに１μＬの６ｇ／ｍＬポリブレン溶液を加え、その後、精製したレンチウイルスベクター１μＬを取り、医療用生理食塩水で１０倍希釈して作動液を調製してそれぞれ対応するウェルに加え、２４ｈ後に１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地で培養液を交換し、７２ｈ感染した後、１０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集し、遺伝子群を抽出した。
【0168】
Ｂ、ゲノムの抽出
収集した細胞をＰＢＳで再懸濁し、１０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を完全に捨て、１回繰り返し、さらに２００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、２０μＬプロテアーゼＫ、２００μＬのＡＬ溶解液を加え、ピペッティングで均一に混合し、５６℃で１０ｍｉｎインキュベートし、その後、２００μＬの予冷したエタノールに加え、上下に転倒混和し、溶液を濾過カラムに移し、室温で１ｍｉｎ静置し、８０００ｒ／ｍｉｎで１ｍｉｎ遠心分離し、上清を完全に捨て、次に、７００μＬのＡＷ１溶液を加え、８０００ｒ／ｍｉｎで１ｍｉｎ遠心分離し、上清を完全に捨て、さらに５００μＬのＡＷ２溶液を加え、８０００ｒ／ｍｉｎで１ｍｉｎ遠心分離し、上清を完全に捨て、濾過カラムを新しい１．５ｍＬのＥＰ管に移し、エタノールを揮発させるために蓋を開けたまま１ｍｉｎ静置した。５０μＬ滅菌ｄｄＨ２Ｏ（６０℃で予熱）を加え、２ｍｉｎ静置し、１２０００ｒ／ｍｉｎで１ｍｉｎ遠心分離した。（ゲノム抽出キットはＱｉａｇｅｎ社から購入されたＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔである）。
収集した細胞をＰＢＳで再懸濁し、１０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を完全に捨て、１回繰り返し、さらに２００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、２０μＬプロテアーゼＫ、２００μＬのＡＬ溶解液を加え、ピペッティングで均一に混合し、５６℃で１０ｍｉｎインキュベートし、その後、２００μＬの予冷したエタノールに加え、上下に転倒混和し、溶液を濾過カラムに移し、室温で１ｍｉｎ静置し、８０００ｒ／ｍｉｎで１ｍｉｎ遠心分離し、上清を完全に捨て、次に、７００μＬのＡＷ１溶液を加え、８０００ｒ／ｍｉｎで１ｍｉｎ遠心分離し、上清を完全に捨て、さらに５００μＬのＡＷ２溶液を加え、８０００ｒ／ｍｉｎで１ｍｉｎ遠心分離し、上清を完全に捨て、濾過カラムを新しい１．５ｍＬのＥＰ管に移し、エタノールを揮発させるために蓋を開けたまま１ｍｉｎ静置した。５０μＬ滅菌ｄｄＨ２Ｏ（６０℃で予熱）を加え、２ｍｉｎ静置し、１２０００ｒ／ｍｉｎで１ｍｉｎ遠心分離した。（ゲノム抽出キットはＱｉａｇｅｎ社から購入されたＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔである）。
【0169】
Ｃ、ｑＲＴ－ＰＣＲによるウイルス力価の測定
反応系は、ＳＹＢＲ(R)Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（商標）ＩＩ（２×）１０μＬ、上流プライマー（ＧＡＧ ｕｐ）１μＬ、下流プライマー（ＧＡＧ ｄｎ）１μＬ、抽出したゲノム１μＬ、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ７μＬであった。各サンプル、標準品について少なくとも３つの重複ウェルを設けた。その後、下記のプロセスで増幅を行った。即ち、９５℃、３０ｓ予備変性；，９５℃、５ｓ変性；６０℃、３０ｓアニーリング；７２℃、３０ｓ伸長。反応終了後、解析ソフトウェアでデータを分析し、標準曲線によりウイルス力価を計算した。結果をＴＵ／ｍＬで示す。
反応系は、ＳＹＢＲ(R)Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（商標）ＩＩ（２×）１０μＬ、上流プライマー（ＧＡＧ ｕｐ）１μＬ、下流プライマー（ＧＡＧ ｄｎ）１μＬ、抽出したゲノム１μＬ、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ７μＬであった。各サンプル、標準品について少なくとも３つの重複ウェルを設けた。その後、下記のプロセスで増幅を行った。即ち、９５℃、３０ｓ予備変性；，９５℃、５ｓ変性；６０℃、３０ｓアニーリング；７２℃、３０ｓ伸長。反応終了後、解析ソフトウェアでデータを分析し、標準曲線によりウイルス力価を計算した。結果をＴＵ／ｍＬで示す。
【0170】
４）レンチウイルス感染Ｔ細胞
（１）ヒト末梢血単核細胞の分離
抗凝固剤を加えた採血管で正常ヒト末梢血を約６０ｍＬ採血し、２つの５０ｍＬ遠沈管に分注し（３０ｍＬ／管）、それぞれ７．５ｍＬヒドロキシエチルデンプンを加えて希釈した。遠沈管を室温で静置して約３０ｍｉｎ自然沈降させ、上層血漿を収集し、その後、１４００ｒ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心分離した後、生理食塩水で再懸濁して沈殿させた。細胞懸濁液を体積比１：１でリンパ球分離液に慎重に加え、４００ｇで１５ｍｉｎ勾配遠心し、遠心機減速度ＤＥＣを５に設定した。遠心分離した後、遠沈管を上から下まで血漿層、環状乳白色末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）層、透明分離液層及び赤血球層の４層に分けた。第２層のＰＢＭＣを新しい遠沈管に慎重に吸い取って生理食塩水で２回洗浄し、１回目４００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、２回目１１００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、次に、生理食塩水で細胞を再懸濁し、ピペットでＰＢＭＣ細胞懸濁液を吸い取って培養フラスコに移し、１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＲＰＭＩ １６４０完全培地で培養した。
（１）ヒト末梢血単核細胞の分離
抗凝固剤を加えた採血管で正常ヒト末梢血を約６０ｍＬ採血し、２つの５０ｍＬ遠沈管に分注し（３０ｍＬ／管）、それぞれ７．５ｍＬヒドロキシエチルデンプンを加えて希釈した。遠沈管を室温で静置して約３０ｍｉｎ自然沈降させ、上層血漿を収集し、その後、１４００ｒ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心分離した後、生理食塩水で再懸濁して沈殿させた。細胞懸濁液を体積比１：１でリンパ球分離液に慎重に加え、４００ｇで１５ｍｉｎ勾配遠心し、遠心機減速度ＤＥＣを５に設定した。遠心分離した後、遠沈管を上から下まで血漿層、環状乳白色末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）層、透明分離液層及び赤血球層の４層に分けた。第２層のＰＢＭＣを新しい遠沈管に慎重に吸い取って生理食塩水で２回洗浄し、１回目４００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、２回目１１００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、次に、生理食塩水で細胞を再懸濁し、ピペットでＰＢＭＣ細胞懸濁液を吸い取って培養フラスコに移し、１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＲＰＭＩ １６４０完全培地で培養した。
【0171】
（２）レンチウイルスベクター感染Ｔリンパ球
１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０完全培地で新たに調製された単核細胞ＰＢＭＣを培養し、１日目に抗ＣＤ３モノクローナル抗体を加えて活性化し、前の３日間にレンチウイルス感染を行った。それぞれ２感染多重度（ＭＯＩ）の１）及び２）に記載のレンチウイルスベクターを加え、未感染の末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）をブランク対照とした。２４ｈ後に培地を５００ＩＵ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２を含むＲＰＭＩ １６４０完全培地に交換し、引き続き１０－２０日間培養した。
１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０完全培地で新たに調製された単核細胞ＰＢＭＣを培養し、１日目に抗ＣＤ３モノクローナル抗体を加えて活性化し、前の３日間にレンチウイルス感染を行った。それぞれ２感染多重度（ＭＯＩ）の１）及び２）に記載のレンチウイルスベクターを加え、未感染の末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）をブランク対照とした。２４ｈ後に培地を５００ＩＵ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２を含むＲＰＭＩ １６４０完全培地に交換し、引き続き１０－２０日間培養した。
【0172】
いくつかの実施例において、ＣＤ４４及びＣＡＲを共発現するＴ細胞は、下記のスキームで調製することもできる。
Ａ、前記ステップ１）のスキームでＣＤ４４発現Ｔ細胞を調製し、ＣＤ４４発現Ｔ細胞を得た後、さらに、ＣＤ４４のＴ細胞にＣＡＲ遺伝子を形質導入し、ＣＤ４４及びＣＡＲを同時に発現するＴ細胞を得た。
Ｂ、前記ステップ２）と類似のステップによりＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を得た。相違点として、ＣＡＲ発現ベクターがＣＤ４４の遺伝子を含まず、さらに得られたＣＡＲ－Ｔ細胞をもとにＣＤ４４遺伝子を形質導入し、ＣＤ４４及びＣＡＲを同時に発現するＴ細胞（４４－１９ＣＡＲ）を得た。
ＣＤ４４及びＣＡＲの発現を図２に示す。ＣＤ４４とＣＡＲは、いずれもＴ細胞で正常に発現することができる。
Ａ、前記ステップ１）のスキームでＣＤ４４発現Ｔ細胞を調製し、ＣＤ４４発現Ｔ細胞を得た後、さらに、ＣＤ４４のＴ細胞にＣＡＲ遺伝子を形質導入し、ＣＤ４４及びＣＡＲを同時に発現するＴ細胞を得た。
Ｂ、前記ステップ２）と類似のステップによりＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を得た。相違点として、ＣＡＲ発現ベクターがＣＤ４４の遺伝子を含まず、さらに得られたＣＡＲ－Ｔ細胞をもとにＣＤ４４遺伝子を形質導入し、ＣＤ４４及びＣＡＲを同時に発現するＴ細胞（４４－１９ＣＡＲ）を得た。
ＣＤ４４及びＣＡＲの発現を図２に示す。ＣＤ４４とＣＡＲは、いずれもＴ細胞で正常に発現することができる。
【0173】
実施例７：ＤＵ－４４－１９ＣＡＲの調製
１、遺伝子ノックアウト実験
実施例１を参照してＣＤ４とＣＤ８が同時にノックアウトされたＤＵ－Ｔ細胞を調製した。
１、遺伝子ノックアウト実験
実施例１を参照してＣＤ４とＣＤ８が同時にノックアウトされたＤＵ－Ｔ細胞を調製した。
【0174】
２、ＤＵ－４４－１９ＣＡＲの取得方法
出発サンプルは、健常人末梢血であった。磁気ビーズ又はフローサイトメトリーによりＣＤ４／ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を選別し、ＣＤ３、ＣＤ２８の抗体を含むＤｙｎａｂｅａｄｓで持続的に刺激し、ＣＡＲを含むレンチウイルスに感染させ、エレクトロポレーションによりＣＤ４及びＣＤ８を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質のＲＮＰ混合物を導入し、エレクトロポレーションした後、フローサイトメトリー又は磁気ビーズによりＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、培養液に適量の因子、又はＴ細胞の培養に適した任意の培地とサイトカインの組み合わせを加えた。
出発サンプルは、健常人末梢血であった。磁気ビーズ又はフローサイトメトリーによりＣＤ４／ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を選別し、ＣＤ３、ＣＤ２８の抗体を含むＤｙｎａｂｅａｄｓで持続的に刺激し、ＣＡＲを含むレンチウイルスに感染させ、エレクトロポレーションによりＣＤ４及びＣＤ８を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質のＲＮＰ混合物を導入し、エレクトロポレーションした後、フローサイトメトリー又は磁気ビーズによりＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、培養液に適量の因子、又はＴ細胞の培養に適した任意の培地とサイトカインの組み合わせを加えた。
【0175】
ＤＵ－４４－１９ＣＡＲの取得方法（以下の２つの方法はいずれも利用可能である）
１、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、数時間培養した後、感染したＴ細胞にエレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入し、引き続き培養して目的細胞を選別した。
２、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後、エレクトロポレーション法によりＲＮＰをこのＴ細胞に導入した後、数時間培養した後、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、引き続き培養して目的細胞を選別した。
１、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、数時間培養した後、感染したＴ細胞にエレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入し、引き続き培養して目的細胞を選別した。
２、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後、エレクトロポレーション法によりＲＮＰをこのＴ細胞に導入した後、数時間培養した後、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、引き続き培養して目的細胞を選別した。
【0176】
４４－１９ＣＡＲの取得方法の調製順序：ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後、ＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、引き続き培養すればよい。
【0177】
実施例８：ＤＮ－４４－１９ＣＡＲ及び４４－１９ＣＡＲの評価
１、ＣＡＲの発現
４４－１９ＣＡＲ細胞上のＣＤ４及びＣＤ８に対して遺伝子編集を行い、磁気ビーズで高純度のダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞を選別した。このような操作は、ＣＡＲ構造のＴ細胞上の発現に影響を与えない。図２から分かるように、４４－１９ＣＡＲ及びＤＵ－４４－１９ＣＡＲ細胞上のＣＡＲ発現量はいずれも５５％以上であった。ＤＵ－１９ＣＡＲ選別後、ダブルネガティブＣＡＲ－Ｔの割合は９９％以上と高かった。
１、ＣＡＲの発現
４４－１９ＣＡＲ細胞上のＣＤ４及びＣＤ８に対して遺伝子編集を行い、磁気ビーズで高純度のダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞を選別した。このような操作は、ＣＡＲ構造のＴ細胞上の発現に影響を与えない。図２から分かるように、４４－１９ＣＡＲ及びＤＵ－４４－１９ＣＡＲ細胞上のＣＡＲ発現量はいずれも５５％以上であった。ＤＵ－１９ＣＡＲ選別後、ダブルネガティブＣＡＲ－Ｔの割合は９９％以上と高かった。
【0178】
２、インビトロ殺傷
特定のエフェクター対ターゲット比Ｅ：Ｔ＝ＣＡＲ－Ｔ：腫瘍細胞でプレーティングし、１６４０完全培地中で所定時間培養し、ルシフェラーゼ溶解法により標的細胞の生存率を検出し、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）効率を算出した。インターフェロン－γ因子の分泌レベル検出は、この因子レベルの検出に使用可能なキットを使用することができる。詳しい操作は、各製造業者製のキットの説明書を参照することができる。
特定のエフェクター対ターゲット比Ｅ：Ｔ＝ＣＡＲ－Ｔ：腫瘍細胞でプレーティングし、１６４０完全培地中で所定時間培養し、ルシフェラーゼ溶解法により標的細胞の生存率を検出し、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）効率を算出した。インターフェロン－γ因子の分泌レベル検出は、この因子レベルの検出に使用可能なキットを使用することができる。詳しい操作は、各製造業者製のキットの説明書を参照することができる。
【0179】
図３及び表１１～表１４に示すように、インビトロ薬力学評価結果として、４４－１９ＣＡＲインビトロ薬効は、自家１９ＣＡＲに相当し、エフェクター対ターゲット比が１：４、殺傷時間が２４ｈである場合、その殺傷効率は９０％以上にも達し、同様にＤＵ－４４－１９ＣＡＲは、１９ＣＡＲと比較して、殺傷能力も相当した。因子分泌の結果として、４４－１９ＣＡＲ及びＤＵ－４４－１９ＣＡＲは、いずれも１９ＣＡＲよりも低かった。これは、同等の殺傷能力の場合では、本発明の４４－１９ＣＡＲ及びＤＵ－４４－１９ＣＡＲがより少ない因子を分泌してもその殺傷能力に影響を与えなかったことを示している。これによって、サイトカインストームのリスクが低減され、ＣＡＲ－Ｔ治療の安全性が向上する。ここで、ＩＦＮ－γについては、ＩＦＮ－γはＴＨ１類分子であり、現在ＣＡＲ－Ｔ細胞が特異性機能を発揮するものである一方、ＩＦＮ－γ分泌が高すぎると、ＣＡＲ－Ｔ治療に発生する副作用サイトカイン「ストーム」（ＣＲＳ）に関係するため、ＩＦＮ－γの高分泌には利点も欠点もある。図３に対応するデータを以下に示す。
【0180】
表１１：４４－１９ＣＡＲの殺傷データ
【表11】
【0181】
表１２：ＤＵ－４４－１９ＣＡＲの殺傷データ
【表12】
【0182】
表１３：４４－１９ＣＡＲのＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍｌ）分泌のデータ
【表13】
【0183】
表１４：ＤＵ－４４－１９ＣＡＲのＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍｌ）分泌のデータ
【表14】
【0184】
３、表現型結果及び疲弊マーカー
フローサイトメーターによる検出；抗体：ＣＣＲ７：ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ：ＢＶ４２１、ＣＤ４５ＲＯ：Ｐｅｒｃｐ５．５；表現型の分類標準：Ｔメモリー幹細胞：ＴＳＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋）、類Ｔメモリー幹細胞：ＴＳＣＭ－Ｌｉｋｅ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリーＴ：ＴＥＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、セントラルメモリーＴ：ＴＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターＴ：ＴＥ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－）、その他（１００％－ＴＳＣＭ－ＴＳＣＭ－Ｌｉｋｅ－ＴＥＭ－ＴＣＭ－ＴＥ）。
疲弊マーカーの検出方法：フローサイトメーターによる検出；抗体：ＰＤ－１：ＡＰＣ、ＬＡＧ－３：ＢＶ４２１、ＴＩＭ－３：Ｐｅｒｃｐ５．５。
フローサイトメーターによる検出；抗体：ＣＣＲ７：ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ：ＢＶ４２１、ＣＤ４５ＲＯ：Ｐｅｒｃｐ５．５；表現型の分類標準：Ｔメモリー幹細胞：ＴＳＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋）、類Ｔメモリー幹細胞：ＴＳＣＭ－Ｌｉｋｅ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリーＴ：ＴＥＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）、セントラルメモリーＴ：ＴＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターＴ：ＴＥ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－）、その他（１００％－ＴＳＣＭ－ＴＳＣＭ－Ｌｉｋｅ－ＴＥＭ－ＴＣＭ－ＴＥ）。
疲弊マーカーの検出方法：フローサイトメーターによる検出；抗体：ＰＤ－１：ＡＰＣ、ＬＡＧ－３：ＢＶ４２１、ＴＩＭ－３：Ｐｅｒｃｐ５．５。
【0185】
図４及び表１５～表１６に示すように、表現型の検出結果として、自家１９ＣＡＲと比較して、４４－１９ＣＡＲ及びユニバーサルＤＵ－４４－１９ＣＡＲは、各群のサブタイプ分布が比較的近く、ＴＳＣＭがやや高く、ＴＥがやや低いが、殺傷結果の比較はその腫瘍細胞の殺傷能力に影響を与えなかった。また、図５及び表１７～表１８から分かるように、疲弊マーカー検出発現量のデータ結果から分かるように、３群のＣＡＲはいずれもＴＩＭ－３を発現しないが、自家１９ＣＡＲと比較して、本発明の４４－１９ＣＡＲ及びユニバーサルＤＵ－４４－１９ＣＡＲ上のＰＤ－１及びＬＡＧ－３の発現はいずれもより低く、これは、本発明のユニバーサル４４－１９ＣＡＲ及びＤＵ－４４－１９ＣＡＲがより長い持続性を有することで抗腫瘍能力の向上に有利であることも示唆している。図４に対応するデータを以下に示す。
【0186】
表１５：４４－１９ＣＡＲの表現型データ
【表15】
【0187】
表１６：ＤＵ－４４－１９ＣＡＲの表現型データ
【表16】
【0188】
【0189】
４、活性検出
エレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入した後、選別により目的細胞を精製する必要がある。この時点は、一般的に活性化後の５－７日目に行われる。選別当日に細胞活性を監視し始める。主な実施形態は、細胞計数装置により計数する方式により所定時点での細胞活性を得ることである。実験の一貫性を保持するために、１９ＣＡＲと４４－１９ＣＡＲを選別する必要がないが、いずれもＤＵ－４４－１９ＣＡＲと同じ時点で監視する。
エレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入した後、選別により目的細胞を精製する必要がある。この時点は、一般的に活性化後の５－７日目に行われる。選別当日に細胞活性を監視し始める。主な実施形態は、細胞計数装置により計数する方式により所定時点での細胞活性を得ることである。実験の一貫性を保持するために、１９ＣＡＲと４４－１９ＣＡＲを選別する必要がないが、いずれもＤＵ－４４－１９ＣＡＲと同じ時点で監視する。
【0190】
活性の監視結果について、図６及び表１９～表２０に示すように、本発明の４４－１９ＣＡＲ及びユニバーサルＤＵ－４４－１９ＣＡＲは、選別後の最初の数日間に、活性が１９ＣＡＲに相当した。しかし、７日後に、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の活性は依然として８０％以上に維持するのに対し、自家１９ＣＡＲ群は顕著に低下した。図６に対応するデータを以下に示す。
【0191】
表１９：４４－１９ＣＡＲの活性値
【表19】
【0192】
表２０：ＤＵ－４４－１９ＣＡＲの活性値
【表20】
【0193】
５、ＧＶＨ強度の検出
ミクロスフェア絶対計数の方法により混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を測定した。特定の比でドナー細胞（ＣＡＲ－Ｔ）：レシピエント細胞（ドナー細胞と異なるＨＬＡサブタイプの健常人ＰＢＭＣ）の混合系を調製し、１６４０基礎培地で８日間培養し、それぞれ０日目及び８日目にフローサイトメトリーにより細胞の絶対計数を検出し、細胞数の変化によりＧＶＨの相対強度を算出した。
ミクロスフェア絶対計数の方法により混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を測定した。特定の比でドナー細胞（ＣＡＲ－Ｔ）：レシピエント細胞（ドナー細胞と異なるＨＬＡサブタイプの健常人ＰＢＭＣ）の混合系を調製し、１６４０基礎培地で８日間培養し、それぞれ０日目及び８日目にフローサイトメトリーにより細胞の絶対計数を検出し、細胞数の変化によりＧＶＨの相対強度を算出した。
【0194】
ＧＶＨ強度の検出結果を図７及び表２１に示す。本発明のユニバーサルＤＵ－４４－１９ＣＡＲは、８日目に引き起こせるＧＶＨ反応強度は、從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞ＣＵ－４４－１９ＣＡＲに相当し、いずれも対照群自家１９ＣＡＲ、４４－１９ＣＡＲ及びＣＴ群よりも弱かった。この結果から分かるように、本発明の方法により調製されたＤＵ－４４－１９ＣＡＲは、從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に、同種他家ＣＡＲ－Ｔ免疫療法に使用することができる。図７に対応するデータを以下に示す。
【0195】
表２１：ＤＵ－４４－１９ＣＡＲの抗ＧＶＨ値
【表21】
【0196】
７、インビボ薬効実験２（１９ＣＡＲと４４－１９ＣＡＲ、ＤＵ－４４－１９ＣＡＲと１９ＣＡＲの比較）
－１１ｄａｙにマウスを導入し、マウスに対して検疫などの一連の検査作業を行って初めて実験に組み入れることができる。－３ｄａｙに５ｅ５Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃ－ＧＦＰ標的細胞尾静脈注射を行い、ｄａｙ０にランダムに群分けした後、ＣＡＲ－Ｔ有効細胞数が２ｅ６となるようにＣＡＲ－Ｔ細胞を再注入し、その後、７日ごとに生体イメージングを行ってマウスのインビボでの腫瘍除去状況を観察した。
－１１ｄａｙにマウスを導入し、マウスに対して検疫などの一連の検査作業を行って初めて実験に組み入れることができる。－３ｄａｙに５ｅ５Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃ－ＧＦＰ標的細胞尾静脈注射を行い、ｄａｙ０にランダムに群分けした後、ＣＡＲ－Ｔ有効細胞数が２ｅ６となるようにＣＡＲ－Ｔ細胞を再注入し、その後、７日ごとに生体イメージングを行ってマウスのインビボでの腫瘍除去状況を観察した。
【0197】
図９に示すように、インビボ薬効の結果として、１９ＣＡＲ群及び４４－１９ＣＡＲ群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ群と比較してインビボで顕著な腫瘍抑制作用を示した。インビボでの抗腫瘍効果のデータは、１９ＣＡＲ群が４４－１９ＣＡＲ群に相当することを示している。しかし、ＣＡＲ－Ｔの存続結果から分かるように、４４－１９ＣＡＲの存続がより多く、これは、本発明の４４－１９ＣＡＲがＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ存続を向上できるため、腫瘍を持続的に殺傷できることを示している。
【0198】
ＤＵ－４４－１９ＣＡＲ群及び１９ＣＡＲ群の蛍光値曲線データを分析した結果、図９に示すように、ＤＮ－４４－１９ＣＡＲの抗腫瘍効果は、１９ＣＡＲ群よりも顕著に優れている。これは、本発明のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞ＤＵ－４４－１９ＣＡＲは、ユニバーサルを実現するとともに、從來の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較してより高い薬効を有することを示している。
【0199】
上記をまとめると、本発明で設計されたＤＵ－４４－１９ＣＡＲ－Ｔに対してインビトロ薬力学評価、ＧＶＨ強度検出及びインビボ抗腫瘍検出などを行った結果、サイトカインストームのリスクの低減、インビボ存続の改善、及び抗腫瘍効果のいずれにおいても從來のＣＡＲ－Ｔよりも優れている。
【0200】
実施例９：ＣＤ６２Ｌ発現Ｔ細胞及びＬ－１９ＣＡＲ（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）細胞の調製
【0201】
ＣＤ６２Ｌ分子は、任意の標的及び構造のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と組み合わせて本発明で開示された技術効果を得ることができる。ここで、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体を例として具体的に応用して説明する。同様に、前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、逆転写ウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのいずれか１つであってもよい。ここで、レンチウイルスベクターを例として説明する。具体的な調製ステップは実施例１を参照する。
【0202】
ＣＤ６２Ｌのアミノ酸配列に対応する遺伝子断片は、配列番号１３に示される。
【0203】
いくつかの実施例において、ＣＤ６２Ｌ及びＣＡＲを共発現するＴ細胞は、実施例６に記載の方法により調製することもできる。ＣＤ４４の代わりにＣＤ６２Ｌを使用すればよい。
【0204】
ＣＤ６２Ｌ及びＣＡＲの発現を図２４に示す。ＣＤ６２Ｌ及びＣＡＲは、いずれもＴ細胞で正常に発現することができた。
【0205】
実施例１０：ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲの調製
１、遺伝子ノックアウト実験
実施例１を参照してＣＤ４及びＣＤ８が同時にノックアウトされたＤＵ－Ｔ細胞を得た。
１、遺伝子ノックアウト実験
実施例１を参照してＣＤ４及びＣＤ８が同時にノックアウトされたＤＵ－Ｔ細胞を得た。
【0206】
２、ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲの取得方法
出発サンプルは健常人の末梢血であった。磁気ビーズ又はフローサイトメトリーによりＣＤ４／ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を選別し、ＣＤ３、ＣＤ２８の抗体を含むＤｙｎａｂｅａｄｓを用いて持続的に４８ｈ刺激し、２４ｈにＣＡＲを含むレンチウイルスに感染させ、４８ｈにＣＤ４及びＣＤ８を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質のＲＮＰ混合物をエレクトロポレーションにより導入し、エレクトロポレーションの７２ｈ後にフローサイトメトリー又は磁気ビーズによりＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、培養液に１６４０で適量の因子（ＩＬ２及びＩＬ４（及び／又は）ＩＬ７（及び／又は）ＩＬ１５（及び／又は）ＩＬ２１）、又はＴ細胞の培養に適した任意の培地と細胞因子の組み合わせを加えてもよい。
出発サンプルは健常人の末梢血であった。磁気ビーズ又はフローサイトメトリーによりＣＤ４／ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を選別し、ＣＤ３、ＣＤ２８の抗体を含むＤｙｎａｂｅａｄｓを用いて持続的に４８ｈ刺激し、２４ｈにＣＡＲを含むレンチウイルスに感染させ、４８ｈにＣＤ４及びＣＤ８を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質のＲＮＰ混合物をエレクトロポレーションにより導入し、エレクトロポレーションの７２ｈ後にフローサイトメトリー又は磁気ビーズによりＤＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、培養液に１６４０で適量の因子（ＩＬ２及びＩＬ４（及び／又は）ＩＬ７（及び／又は）ＩＬ１５（及び／又は）ＩＬ２１）、又はＴ細胞の培養に適した任意の培地と細胞因子の組み合わせを加えてもよい。
【0207】
ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲの取得方法
１、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後、ＣＤ６２Ｌ及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、数時間培養した後、感染したＴ細胞に対してＲＮＰエレクトロポレーションを行い、引き続き培養して目的細胞を選別した。
２、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後、ＲＮＰをエレクトロポレーション法によりＴ細胞に導入した後、数時間培養した後、ＣＤ６２Ｌ及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、引き続き培養して目的細胞を選別した。
１、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後、ＣＤ６２Ｌ及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、数時間培養した後、感染したＴ細胞に対してＲＮＰエレクトロポレーションを行い、引き続き培養して目的細胞を選別した。
２、ＣＤ４及び／又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を取得し、数時間活性化した後、ＲＮＰをエレクトロポレーション法によりＴ細胞に導入した後、数時間培養した後、ＣＤ６２Ｌ及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、引き続き培養して目的細胞を選別した。
【0208】
実施例１１：ＤＮ－Ｌ－１９ＣＡＲ及びＬ－１９ＣＡＲの評価
１、ＣＡＲの発現
Ｌ－１９ＣＡＲ細胞上のＣＤ４及びＣＤ８に対して遺伝子編集を行い、磁気ビーズにより高純度のＤＵ－１９ＣＡＲ細胞を選別した。このような操作は、ＣＡＲ構造のＴ細胞上での発現に影響を与えない。図２４から分かるように、ＣＡＲの発現量は、いずれも７０％より高く、ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ選別後に、そのダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は１００％にも達した。
１、ＣＡＲの発現
Ｌ－１９ＣＡＲ細胞上のＣＤ４及びＣＤ８に対して遺伝子編集を行い、磁気ビーズにより高純度のＤＵ－１９ＣＡＲ細胞を選別した。このような操作は、ＣＡＲ構造のＴ細胞上での発現に影響を与えない。図２４から分かるように、ＣＡＲの発現量は、いずれも７０％より高く、ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ選別後に、そのダブルネガティブＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は１００％にも達した。
【0209】
２、インビトロ殺傷
【0210】
特定のエフェクター対ターゲット比でプレーティングした。詳細は各製造業者のキットの説明書を参照されたい。
【0211】
インビトロ薬力学評価の結果を図２５及び表２２～表２５に示す。Ｌ－１９ＣＡＲ及びＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲのインビトロ薬効は、自家１９ＣＡＲに相当し、エフェクター対ターゲット比が１：４、殺傷時間が２４ｈである場合、その殺傷効率は９０％以上に達し、因子分泌の検出結果は違いがないことを示している。図２５に関するデータを下表に示す。
【0212】
表２２：Ｌ－１９ＣＡＲの殺傷データ
【表22】
【0213】
表２３：ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲの殺傷データ
【表23】
【0214】
表２４：Ｌ－１９ＣＡＲのＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍｌ）の分泌データ
【表24】
【0215】
表２５：ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲのＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍｌ）の分泌データ
【表25】
【0216】
３、表現型の結果
フローサイトメーター検出
表現型の検出結果を図２６及び表２６～表２７に示す。自家１９ＣＡＲと比較して、Ｌ－１９ＣＡＲとユニバーサルＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ群は、それぞれのサブタイプの分布が比較的近く、ＴＳＣＭがやや低いが、ＴＥやや高かった。これは、ＣＡＲ－Ｔ瞬時殺傷能力の向上に有利である。図２６に関するデータを下表に示す。
フローサイトメーター検出
表現型の検出結果を図２６及び表２６～表２７に示す。自家１９ＣＡＲと比較して、Ｌ－１９ＣＡＲとユニバーサルＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ群は、それぞれのサブタイプの分布が比較的近く、ＴＳＣＭがやや低いが、ＴＥやや高かった。これは、ＣＡＲ－Ｔ瞬時殺傷能力の向上に有利である。図２６に関するデータを下表に示す。
【0217】
表２６：Ｌ－１９ＣＡＲの表現型データ
【表26】
【0218】
表２７：ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲの表現型データ
【表27】
【0219】
４、疲弊マーカー
疲弊マーカーの検出方法：フローサイトメーター検出
抗体：ＰＤ－１：ＡＰＣ、ＬＡＧ－３：ＢＶ４２１、ＴＩＭ－３：Ｐｅｒｃｐ５．５
疲弊マーカーの検出方法：フローサイトメーター検出
抗体：ＰＤ－１：ＡＰＣ、ＬＡＧ－３：ＢＶ４２１、ＴＩＭ－３：Ｐｅｒｃｐ５．５
【0220】
疲弊マーカーの発現量検出データ結果について、図２７から分かるように、各群のＣＡＲはいずれもＴＩＭ－３を発現しないが、自家１９ＣＡＲと比較して本発明のＬ－１９ＣＡＲ及びユニバーサルＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ上でのＬＡＧ－３及びＰＤ－１の発現量がいずれもより低かった。これも、本発明のＬ－１９ＣＡＲ及びユニバーサルＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲがより長い持続性を有し、アポトーシスまでの時間がより長いことを示している。そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続的な抗腫瘍能力の向上に有利である。
【0221】
５、増殖と活性の検出
ＲＮＰをエレクトロポレーション法により導入した後、選別により目的細胞を精製する必要がある。この時点は、一般的に活性化後の５－７日目である。選別当日に細胞活性を監視し始める。主な実施形態は、細胞計数装置で計数することにより特定時点での細胞活性を得ることである。実験の一貫性を保持するために、１９ＣＡＲとＬ－１９ＣＡＲを選別する必要がないが、ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲと同じ時点で監視する。
ＲＮＰをエレクトロポレーション法により導入した後、選別により目的細胞を精製する必要がある。この時点は、一般的に活性化後の５－７日目である。選別当日に細胞活性を監視し始める。主な実施形態は、細胞計数装置で計数することにより特定時点での細胞活性を得ることである。実験の一貫性を保持するために、１９ＣＡＲとＬ－１９ＣＡＲを選別する必要がないが、ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲと同じ時点で監視する。
【0222】
増殖と活性の監視結果を図２８及び表２８～表２９に示す。結果から分かるように、本発明のユニバーサルＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲは、増殖能力及び細胞活性が自家１９ＣＡＲよりも優れている。そのうち、増殖の倍数では、本発明のＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲは、他の２群との間に大きな差があり、増殖速度が自家１９ＣＡＲ群よりも顕著に優れており、細胞活性も自家１９ＣＡＲ群よりも高かった。これは、本発明の調製方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力を顕著に向上させる作用を有することを示している。そのため、この方法は、さらに治療用途に使用できる。
【0223】
【0224】
表２９：ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲの増殖数
【表29】
【0225】
６、ＧＶＨ強度検出
ＧＶＨ強度検出の結果を図２９及び表３０に示す。本発明のダブルネガティブＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲによって引き起こされるＧＶＨ反応の強度は、いずれも從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞ＣＵ－Ｌ－１９ＣＡＲよりも低く、かつ対照群自家ＣＡＲ－Ｔ細胞Ｌ－１９ＣＡＲ、１９ＣＡＲ群及びＣＴ群よりも顕著に低かった。この結果は、本発明の方法により調製されたＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲが從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に同種他家ＣＡＲ－Ｔによる免疫療法に適用されることを示している。
ＧＶＨ強度検出の結果を図２９及び表３０に示す。本発明のダブルネガティブＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲによって引き起こされるＧＶＨ反応の強度は、いずれも從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞ＣＵ－Ｌ－１９ＣＡＲよりも低く、かつ対照群自家ＣＡＲ－Ｔ細胞Ｌ－１９ＣＡＲ、１９ＣＡＲ群及びＣＴ群よりも顕著に低かった。この結果は、本発明の方法により調製されたＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲが從來のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に同種他家ＣＡＲ－Ｔによる免疫療法に適用されることを示している。
【0226】
【0227】
７、インビボ実験（ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ、Ｌ－１９ＣＡＲ及び１９ＣＡＲの比較）
【0228】
１１ｄａｙにマウスを導入し、マウスに対して検疫などの一連の検査作業を行って初めて試験に組み入れることができる。－３ｄａｙに５ｅ５Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃ－ＧＦＰ標的細胞の尾静脈注射を行い、ｄａｙ０にランダムに群分けし、ＣＡＲ－Ｔの有効細胞数が２ｅ６となるようにＣＡＲ－Ｔ細胞を再注入し、その後、７日ごとに生体イメージングを行ってマウスのインビボでの腫瘍除去状況を観察した。
【0229】
インビボでの薬効結果について、図３０に示すように、１９ＣＡＲ群、ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ群及びＬ－１９ＣＡＲ群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ群と比較してインビボで顕著な腫瘍抑制作用を示した。ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ群、Ｌ－１９ＣＡＲ群及び１９ＣＡＲ群の蛍光値曲線データを分析した結果、ＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ群及びＬ－１９ＣＡＲ群は、１９ＣＡＲ群と比較してより高いインビボでの薬効を有する。これは、本発明の方法により調製されたＬ－１９ＣＡＲ群は、より高い薬効を有することを示している。本発明のユニバーサルＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲは、ユニバーサルを実現するだけでなく、從來の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較してより高い薬効を有する。これは、ユニバーサルＣＲＡ－Ｔ細胞の治療分野に対して強い啓発作用を有する。
【0230】
さらに、ＲＴ－ＰＣＲマウス血液中のＣＡＲ－Ｔコピー数を検出した結果、図３１に示すように、本発明のＬ－１９ＣＡＲは、インビボで存続するＣＡＲ－Ｔ細胞が從來の自家１９ＣＡＲ群の２倍以上である。これは、本発明の方法によりＣＡＲ－Ｔのインビボ存続が改善されることで、ＣＡＲ－Ｔのインビボでの持続的な抗腫瘍能力がさらに改善されることを示すのに十分である。
【0231】
以上をまとめると、本発明で設計されたＤＵ－Ｌ－１９ＣＡＲ－Ｔに対してインビトロ薬力学評価、増殖と活性監視、及びＧＶＨ強度検出などを行った結果から分かるように、抗腫瘍効果、細胞増殖能力、細胞活性及びインビボ存続などの全ての面において從來のＣＡＲ－Ｔよりも優れている。
【0232】
以上、本発明で提供されるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製技術及びその使用を詳しく説明した。本明細書では、具体的な実施例により本発明の原理及び実施形態を説明したが、前記の実施例の説明は、本発明の方法及びその趣旨を理解するためのものに過ぎない。なお、当業者であれば、本発明の原理から逸脱しない限り、本発明に対して若干の改良及び修飾を行うことができ、これらの改良及び修飾も本発明の特許請求の範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞療法に使用される医薬組成物であって、ＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性Ｔ細胞を含み、
前記ＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性Ｔ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてＴリンパ球の目的部位をノックアウトすることを含む方法により得られたものであり、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムはＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとからなり、前記ｓｇＲＮＡはＣＤ４のｓｇＲＮＡ及び／又はＣＤ８のｓｇＲＮＡであり、
前記ＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性Ｔ細胞は同種他家の再注入により投与されるものである、医薬組成物。
【請求項2】
前記ＣＤ４のｓｇＲＮＡの配列は、配列番号１－６又は配列番号１４－２４のいずれか１つに示され、前記ＣＤ８のｓｇＲＮＡの配列は、配列番号７－１１又は配列番号２５－３３のいずれか１つに示される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性Ｔ細胞は、ＣＤ４４及び／又はＣＤ６２Ｌを発現する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記ＣＤ６２Ｌのアミノ酸配列は、配列番号１３に示され、前記ＣＤ４４のアミノ酸配列は、配列番号１２に示される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記Ｔリンパ球は、天然分離により得られたものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性Ｔ細胞はＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性ＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記方法は、
（１）新鮮又は凍結保存に由来のＴ細胞を使用し、遺伝子編集によりＣＤ４及びＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化し、ＣＤ４及びＣＤ８遺伝子を同時にノックアウト又は不活性化してもよく、ＣＤ４又はＣＤ８をノックアウト又は不活性化してからＣＤ８又はＣＤ４をノックアウト又は不活性化してもよく、最後に目的細胞を得る方法；
（２）ＣＤ４陽性のＴ細胞を選別し、遺伝子編集によりＣＤ４遺伝子をノックアウト又は不活性化して目的細胞を得る方法；
（３）ＣＤ８陽性のＴ細胞を選別し、遺伝子編集によりＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化して目的細胞を得る方法；及び
（４）ＣＤ４陽性のＴ細胞を選別し、遺伝子編集によりＣＤ４遺伝子をノックアウト又は不活性化し、ＣＤ８陽性のＴ細胞を選別し、遺伝子編集によりＣＤ８遺伝子をノックアウト又は不活性化し、最後に遺伝子編集によりＣＤ４遺伝子がノックアウト又は不活性化されたＴ細胞と、遺伝子編集によりＣＤ８遺伝子がノックアウト又は不活性化されたＴ細胞とを混合して目的細胞を得る方法；
を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性Ｔ細胞は、活性化及び／又は非活性化のＴリンパ球である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、エレクトロポレーション法又は非エレクトロポレーション法により前記Ｔリンパ球の改造に使用される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記ＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性Ｔ細胞は、固形腫瘍、血液系腫瘍細胞／組織を認識することができ、前記ＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性Ｔ細胞の抗原認識領域は、抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ）、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤＨ１７、Ｔｒｏｐ２、ＢＣＭＡ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１６、ＣＤ１３３、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒ２、Ｂ７Ｈ３、Ｈｅｒ２、ＣＤ３０、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＧＰＣ３、ＷＴ１又はＴＡＧ－７２のうちの１種又は複数種を認識することができる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記方法は、
（１）Ｔ細胞を収集して取得し、ＣＡＲ構造のウイルスに感染させ、ＣＡＲ構造が感染したＴ細胞にエレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入して目的細胞を得る方法；或いは
（２）Ｔ細胞を収集して取得し、エレクトロポレーション法によりＲＮＰを前記Ｔ細胞に導入した後、さらにＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させて目的細胞を得る方法；
を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記方法は、（１）Ｔ細胞を収集して取得し、ＣＤ６２及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、又はＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、ＣＡＲ構造が感染したＴ細胞にエレクトロポレーション法によりＲＮＰを導入して目的細胞を得る方法；或いは
（２）Ｔ細胞を収集して取得し、エレクトロポレーション法によりＲＮＰを前記Ｔ細胞に導入した後、さらにＣＤ４４及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させ、又はＣＤ６２及びＣＡＲ構造を含むウイルスに感染させて目的細胞を得る方法；
を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記細胞療法は、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん及び／又は皮膚がんの治療に使用される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記方法は、前記Ｔリンパ球の細胞増殖剤、活性増強剤、表現型分布改善剤又は疲弊マーカー発現阻害剤としてのＣＤ４遺伝子の阻害剤もしくはノックアウト剤および／またはＣＤ８遺伝子の阻害剤もしくはノックアウト剤を提供する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
腫瘍細胞殺傷の促進剤を調製する方法であって、
ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＤ４４遺伝子の発現の促進剤を提供し、
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は従来のＣＡＲ－Ｔ細胞であり、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞又はユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＤ４及び／又はＣＤ８遺伝子を発現しない、方法。
【国際調査報告】