特表 2025-504557 ナチュラルキラーＴ細胞及びそれを使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-12

(54)【発明の名称】ナチュラルキラーＴ細胞及びそれを使用する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20250204BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20250204BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20250204BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250204BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250204BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20250204BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250204BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20250204BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250204BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20250204BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20250204BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20250204BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20250204BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20250204BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N5/0783

C12N15/24

A61K35/17

A61P35/00

A61K38/20

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 E

A61K39/395 T

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/867 Z

C07K14/705

C07K16/30

C07K19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024544707

(86)(22)【出願日】2023-01-30

(85)【翻訳文提出日】2024-08-21

(86)【国際出願番号】 US2023061600

(87)【国際公開番号】W WO2023147564

(87)【国際公開日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】63/304,556

(32)【優先日】2022-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】501345323

【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＮＯＲＴＨ ＣＡＲＯＬＩＮＡ ＡＴ ＣＨＡＰＥＬ ＨＩＬＬ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ドッティ， ジャンピエトロ

(72)【発明者】

【氏名】ランドーニ， イライザ

(72)【発明者】

【氏名】サヴォルド， バーバラ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA02

4C084BA04

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA12

4C084MA16

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB26

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087MA16

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

ヒトＩＬ－１２を発現する修飾されたＮＫＴ、修飾されたＮＫＴを含む組成物、及び修飾されたＮＫＴを使用する治療方法が本明細書において開示される。本明細書において記載される修飾されたＮＫＴは、ＩＬ－１２の発現がＣＡＲの発現を備えたカップルされる場合に、長期間の存続性を実証するリプログラミングされたＮＫＴである。これらのＮＫＴは、腫瘍細胞を除去する長期間の能力及びＩＬ－１２を発現するＮＫＴの長期間の存続性を獲得する。ＣＡＲ及び外来性膜結合部分（ＩＬ－１２等）を発現するように形質転換された修飾された細胞も本明細書において開示される。
【選択図】図１－１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾されたナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞であって、トランスジェニックＩＬ－１２を発現する、前記ＮＫＴ細胞。

【請求項2】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項3】

前記ＣＡＲがＧＤ２．ＣＡＲである、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項4】

前記ＣＡＲがＣＤ１９．ＣＡＲである、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項5】

前記ＮＫＴ細胞がヒトＮＫＴ細胞である、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項6】

前記ＮＫＴ細胞が非ヒトＮＫＴ細胞である、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項7】

前記ＮＫＴ細胞がマウスＮＫＴ細胞である、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項8】

前記ＮＫＴ細胞が末梢血液から単離される、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項9】

トランスジェニックＩＬ－１２を発現する前記ＮＫＴ細胞が、ＩＬ１２を含むレトロウイルス上清によるＮＫＴ細胞の形質導入によって産生される、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項10】

前記トランスジェニックＩＬ－１２が、前記ＮＫＴ細胞膜へ結合される、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項11】

前記トランスジェニックＩＬ－１２が、ＣＤ４またはＣＤ８のスタークを介して前記ＮＫＴ細胞膜へ結合される、請求項１０に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項12】

前記トランスジェニックＩＬ－１２が、ＣＤ８スタークを介して前記ＮＫＴ細胞膜へ結合される、請求項１０に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項13】

前記ＣＤ８スタークが、ＣＤ８のヒンジ領域及び膜貫通ドメインを含む、請求項１２に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項14】

前記ＣＤ８スタークが、前記ヒンジ領域から１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾される、請求項１３に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項15】

前記ＣＤ８スタークが、前記ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基により置換するように修飾される、請求項１３に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項16】

前記ＣＤ８スタークがＣＤ８ａスタークである、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項17】

前記ＣＤ８スタークが、配列番号１２のアミノ酸配列を有するヒンジ領域を含む、請求項１６に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項18】

前記トランスジェニックＩＬ－１２が、ＣＤ４スタークを介して前記ＮＫＴ細胞膜へ結合される、請求項１０に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項19】

前記ＣＤ４スタークが、ＣＤ４のヒンジ領域及び膜貫通ドメインを含む、請求項１８に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項20】

前記ＣＤ４スタークが、前記ヒンジ領域から１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾される、請求項１９に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項21】

前記ＣＤ４スタークが、前記ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基により置換するように修飾される、請求項１９に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項22】

前記ＣＤ４スタークが、配列番号１３のアミノ酸配列を有するヒンジ領域を含む、請求項１８に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項23】

前記修飾されたＮＫＴ細胞が、対照細胞に比較して、腫瘍制御の促進及び生存の改善を増進する、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項24】

前記ＮＫＴ細胞が、対照細胞に比較して、腫瘍の再攻撃に際して腫瘍増殖を制御する、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項25】

前記ＮＫＴ細胞が、抗腫瘍性活性の増加を呈する、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項26】

前記ＮＫＴ細胞が、ＣＤ６２Ｌの発現の増加を呈する、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項27】

前記ＮＫＴ細胞が、長期間の存続性を呈する、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項28】

前記ＮＫＴ細胞が、対照細胞に比較して、インビトロでの腫瘍細胞への反復暴露に際しての細胞傷害性活性の促進を呈する、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項29】

前記ＮＫＴ細胞が、移植片対宿主病を引き起こすリスクの減少を呈する、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項30】

前記ＮＫＴ細胞が、ＣＤ６２Ｌを発現しない、請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞。

【請求項31】

請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞の集団。

【請求項32】

末梢血液から単離された遺伝的に修飾されたナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）の集団であって、前記ＮＫＴが、トランスジェニックＩＬ－１２を発現する、前記集団。

【請求項33】

前記ＮＫＴが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項３２に記載の集団。

【請求項34】

前記ＣＡＲが、ＧＤ２．ＣＡＲである、請求項３３に記載の集団。

【請求項35】

前記ＣＡＲが、ＣＤ１９．ＣＡＲである、請求項３３に記載の集団。

【請求項36】

前記ＮＫＴが、ＣＡＲ及びＩＬ－１２により形質導入される、請求項３２に記載の集団。

【請求項37】

前記ＮＫＴが、ＣＤ６２Ｌを発現しない、請求項３２に記載の集団。

【請求項38】

請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞を製造する方法であって、レトロウイルスベクターにより前記ＮＫＴ細胞を形質導入することを含む、前記方法。

【請求項39】

前記レトロウイルスベクターが、ＩＬ－１２を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記レトロウイルスベクターが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記レトロウイルスベクターが、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項42】

前記レトロウイルスベクターが、ＣＡＲを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項43】

前記レトロウイルスベクターが、ＣＤ１９．ＣＡＲを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項44】

前記レトロウイルスベクターが、ＧＤ２．ＣＡＲを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項45】

治療有効量の請求項１に記載の修飾されたＮＫＴ細胞を対象へ投与することを含む、前記対象におけるがんを治療する方法。

【請求項46】

前記対象が哺乳動物である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記対象がヒトである、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記修飾されたＮＫＴ細胞が、前記対象へ静脈内投与される、請求項４５に記載の方法。

【請求項49】

ＣＡＲ及び外来性膜結合部分を発現するように形質転換された細胞であって、前記外来性膜結合部分が、１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾された膜貫通ドメインを含む、前記細胞。

【請求項50】

除去された前記１つまたは複数のシステイン残基が、さもなければ前記ＣＡＲ中に存在するシステイン残基によりジスルフィド結合を形成することが可能である、請求項４９に記載の細胞。

【請求項51】

前記外来性膜結合部分が、ＩＬ－１２である、請求項４９に記載の細胞。

【請求項52】

前記外来性膜結合部分が、ＣＤ４またはＣＤ８のスタークを介して細胞膜へ結合される、請求項４９に記載の細胞。

【請求項53】

前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８スタークを含む、請求項４９に記載の細胞。

【請求項54】

前記ＣＤ８スタークが、ＣＤ８ヒンジ領域を含む、請求項５３に記載の細胞。

【請求項55】

前記膜貫通ドメインが、前記１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基により置換するように修飾される、請求項４９に記載の細胞。

【請求項56】

前記膜貫通ドメインが、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤ８ａヒンジ領域を含む、請求項４９に記載の細胞。

【請求項57】

前記外来性膜結合部分が、ＣＤ４スタークを介して細胞膜へ結合される、請求項４９に記載の細胞。

【請求項58】

前記ＣＤ４スタークが、ＣＤ４ヒンジ領域を含む、請求項５７に記載の細胞。

【請求項59】

前記膜貫通ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤ４ヒンジ領域を含む、請求項４９に記載の細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２２年１月２８日に出願された米国仮出願第６３／３０４，５５６号の利益を主張する。上記の出願の全体の教示は、参照することによって本明細書に援用される。

【0002】

政府の助成
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって授与されたＣＡ２４３５４３ のもとで政府の助成により行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

自然免疫細胞（ｉｎｎａｔｅ ｃｅｌｌ）として及びメモリー様細胞として応答することが実証されたＴ細胞の特定のサブセットであるナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴまたはＮＫＴ細胞）は、自然免疫応答と適応免疫応答を橋渡しし、がん患者における養子Ｔ細胞療法のためのプラットフォームとして有望であることが示されている。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する操作されたＮＫＴは、前臨床的及び臨床的ながんの研究及び治療において有望な結果を示している免疫療法物質のクラスを代表する。

【0004】

ＮＫＴ ＣＡＲは、樹状細胞（ＤＣ）成熟の誘導ならびにＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化サイトカインの分泌を介して、間接的な抗腫瘍活性を増進し得る。しかしながら、悪性細胞がそれらの細胞外微小環境そして自身の表面タンパク質発現を生じさせる多数の免疫抑制性修飾は、これまで特定のがんのためのＣＡＲ治療法の有効性及び範囲を限定してきた。長期間の存続性及び腫瘍細胞除去の能力及び腫瘍再攻撃の保護を保持するように修飾されたＮＫＴ細胞についての必要性は、依然として存在する。

【発明の概要】

【0005】

修飾されたナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞が本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、ＮＫＴは、トランスジェニックＩＬ－１２を発現する。

【0006】

いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。ＣＡＲは、ＧＤ２．ＣＡＲまたはＣＤ１９．ＣＡＲであり得る。

【0007】

一実施形態において、ＮＫＴ細胞は、ヒトＮＫＴ細胞である。一実施形態において、ＮＫＴ細胞は、非ヒトＮＫＴ細胞（例えばマウスＮＫＴ細胞）である。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、末梢血液から単離される。

【0008】

本明細書において記載される修飾されたＮＫＴ細胞は、当業者に公知の任意の方法（例えば形質導入またはトランスフェクションが挙げられる）を使用して産生され得る。一実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２を発現するＮＫＴ細胞は、ＩＬ１２を含むレトロウイルス上清によるＮＫＴ細胞の形質導入によって産生される。一実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２を発現するＮＫＴ細胞は、レンチウイルスベクター（ＬＶ）形質導入を使用して産生される。一実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２を発現するＮＫＴ細胞は、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを使用して産生される。

【0009】

いくつかの実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２は、ＣＤ４またはＣＤ８のスタークを介してＮＫＴ細胞膜へ結合される。一実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２は、ＣＤ８スターク（例えばＣＤ８ａスターク）を介してＮＫＴ細胞膜へ結合される。ＣＤ８スタークは、ＣＤ８のヒンジ領域及び膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、ヒンジ領域から１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾され、いくつかの態様において、ＣＤ８スタークは、１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基により置換することによって修飾される。一実施形態において、ＣＤ８スタークは、配列番号１２のアミノ酸配列のヒンジ領域を含む。一実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２は、ＣＤ４スタークを介してＮＫＴ細胞膜へ結合される。ＣＤ４スタークは、ＣＤ４のヒンジ領域及び膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、ヒンジ領域から１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾され、いくつかの態様において、ＣＤ４スタークは、１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基により置換することによって修飾される。一実施形態において、ＣＤ４スタークは、配列番号１３のアミノ酸配列のヒンジ領域を含む。

【0010】

いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、対照細胞に比較して、腫瘍制御の促進及び生存の改善を増進すること、対照細胞に比較して、腫瘍の再攻撃に際して腫瘍増殖を制御すること、抗腫瘍性活性の増加、ＣＤ６２Ｌの発現の増加、長期間の存続性、対照細胞に比較して、インビトロでの腫瘍細胞への反復暴露に際しての細胞傷害性活性の促進、及び／または移植片対宿主病を引き起こすリスクの減少を含む１つまたは複数の特色を呈する。

【0011】

一実施形態において、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌを発現しない。

【0012】

本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞の集団も本明細書において開示される。末梢血液から単離された遺伝的に修飾されたＮＫＴの集団であって、ＮＫＴがトランスジェニックＩＬ－１２を発現する、前記集団も本明細書において開示される。

【0013】

いくつかの実施形態において、ＮＫＴの集団は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えばＧＤ２．ＣＡＲまたはＣＤ１９．ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＴの集団は、ＣＡＲ及びＩＬ－１２により形質導入される。

【0014】

一実施形態において、ＮＫＴは、ＣＤ６２Ｌを発現しない。

【0015】

レトロウイルスベクターによるＮＫＴの形質導入によって本明細書において開示されるＮＫＴを製造する方法が本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、ＩＬ－１２を含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、ＣＡＲ（例えばＧＤ２．ＣＡＲまたはＣＤ１９．ＣＡＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｂ７Ｈ３ ＣＡＲまたはＣＳＰＧ４ ＣＡＲである。

【0017】

本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞を対象へ投与することによってがんを治療する方法も本明細書において開示される。

【0018】

いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物（例えばヒトまたはマウス）である。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、対象へ静脈内投与される。

【0019】

形質転換されてＣＡＲ及び外来性膜結合部分を発現する細胞であって、外来性膜結合部分が、さもなければＣＡＲ中に存在するシステイン残基によりジスルフィド結合を形成することが可能な１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾された膜貫通ドメインを含む、前記細胞も本明細書において開示される。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1-1】ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰにより形質導入されたＮＫＴが、ＣＤ６２Ｌをアップレギュレートすることを示す。Ａは、ＮＫＴを選択、形質導入、及び増幅するために使用されるプロトコルの図解タイムラインである。Ｂは、ヒトＮＫＴを操作するために使用されるレトロウイルスベクターの概略図を示す。ＩＬ－１２のｐ４０サブユニット及びｐ３５サブユニットは、柔軟なリンカーによって接続される。

【図1-2】ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰにより形質導入されたＮＫＴが、ＣＤ６２Ｌをアップレギュレートすることを示す。Ｃは、非形質導入ＮＫＴ（ＮＴ）、対照ＧＦＰベクター（ＧＦＰ）により形質導入されたＮＫＴ、及びＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰベクターにより形質導入されたＮＫＴにおけるＮＫＴ純度の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。 Ｄは、非形質導入ＮＫＴ（ＮＴ）、対照ＧＦＰベクター（ＧＦＰ）により形質導入されたＮＫＴ、及びＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰベクターにより形質導入されたＮＫＴにおけるＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージとして測定されたＮＫＴ形質導入効率の代表的なフローサイトメトリープロットを提供する。Ｅは、非形質導入ＮＫＴ（ＮＴ）、対照ＧＦＰベクター（ＧＦＰ）により形質導入されたＮＫＴ、及びＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰベクターにより形質導入されたＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。

【図2A】ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰにより形質導入されたＮＫＴが、インビトロでＩＬ１２を放出し、インビボでより長く存続することを実証する。休止条件（非刺激）のまたは抗ＣＤ３抗ＣＤ２８抗体により活性化された、ＮＴ、ＧＦＰ形質導入ＮＫＴ、及びＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰ形質導入ＮＫＴによって産生されたＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－４の定量を示す。サイトカイン無しの２ｍＬの完全培地で２４ウェルプレート中での１＊１０^６細胞／ウェルのプレーティングの２４時間後に収集した上清で、サイトカインを測定した。平均を示し、ｎ＝４；＊、Ｐ＝０．０２７３；＊＊、Ｐ＝０．００２２；＊＊＊、Ｐ＝０．０００６；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；二元配置ＡＮＯＶＡ。

【図2B】ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰにより形質導入されたＮＫＴが、インビトロでＩＬ１２を放出し、インビボでより長く存続することを実証する。ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰ ＮＫＴ、ＧＦＰ ＮＫＴとの間のＲＮＡｓｅｑデータの差次的遺伝子発現（アルファ＜０．２）を例証する火山型プロットを提供する。正のＬＦＣ値は、ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰ ＮＫＴ中の過剰発現を反映する。

【図2C】ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰにより形質導入されたＮＫＴが、インビトロでＩＬ１２を放出し、インビボでより長く存続することを実証する。異種移植ＮＳＧマウスモデルにおけるＮＫＴ存続性を査定するためのインビボの実験の図解表示を示す。マウスに、５＊１０^６のＧＦＰ ＮＫＴまたはＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰホタルルシフェラーゼ標識ＮＫＴを静脈内移植した。マウスを、ＮＫＴ注射後の０、２、４、及び７日目でＩＶＩＳキネティックマシンにより画像化し、１０日目に安楽死させ、末梢血液、肝臓、及び脾臓を収集した。

【図2D】ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰにより形質導入されたＮＫＴが、インビトロでＩＬ１２を放出し、インビボでより長く存続することを実証する。代表的な腫瘍の生物発光画像化（ＢＬＩ）を示す（合計のフラックスｐ／ｓとして測定した）。

【図2E】ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰにより形質導入されたＮＫＴが、インビトロでＩＬ１２を放出し、インビボでより長く存続することを実証する。ＮＫＴ注入の１０日間後に収集された末梢血液、肝臓、及び脾臓のサンプル中のヒトＮＫＴ（ｉＮＫＴ^＋ＣＤ４５^＋）の定量を示す。平均を示し、ｎ＝１０；＊、Ｐ＝０．０１６１、＊＊、Ｐ＝０．００２０、＊＊＊、Ｐ＝０．０００６、対応のないｔ検定。

【図3A】ＧＤ２．ＣＡＲ及びＩＬ－１２により形質導入されたＮＫＴが、ＣＡＲを発現し、ＣＤ６２Ｌをアップレギュレートすることを実証する。ＮＫＴを形質導入するために使用されるレトロウイルスベクターの図表を示す。ＣＤ１９．ＣＡＲに関してｓｃＦｖ ＦＭＣ．６３を使用し、ＧＤ２．ＣＡＲに関して１Ａ７ ｓｃＦｖを使用した。

【図3B】ＧＤ２．ＣＡＲ及びＩＬ－１２により形質導入されたＮＫＴが、ＣＡＲを発現し、ＣＤ６２Ｌをアップレギュレートすることを実証する。培養の１０日目に査定された、対照ＮＫＴ（ＮＴ）及びＣＡＲ形質導入ＮＫＴにおけるＣＡＲ発現の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。

【図3C】ＧＤ２．ＣＡＲ及びＩＬ－１２により形質導入されたＮＫＴが、ＣＡＲを発現し、ＣＤ６２Ｌをアップレギュレートすることを実証する。培養の１０日目に査定された、対照ＮＫＴ（ＮＴ）及びＣＡＲ形質導入ＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌ発現の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。

【図4A】ＩＬ－１２を産生するＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴが、インビトロの腫瘍細胞への反復暴露に際しての細胞傷害性活性の促進を有し、長期間の腫瘍の制御を媒介することを実証する。ＮＫＴをＣＨＬＡ－２２５（Ｅ：Ｔ＝１：１）により共培養し、次いで収集し、抗ｉＴＣＲ（Ｖβ１１）及び抗ＧＤ２により染色してフローサイトメトリーによってそれぞれＮＫＴ及び神経芽腫細胞を同定した、各々のサイクル後の残存する腫瘍細胞の定量の要約を示す。平均を示し、ｎ＝４。

【図4B】ＩＬ－１２を産生するＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴが、インビトロの腫瘍細胞への反復暴露に際しての細胞傷害性活性の促進を有し、長期間の腫瘍の制御を媒介することを実証する。異種移植転移性神経芽腫モデルの図解表示を示す。マウスに、２＊１０^６のＣＨＬＡ－２２５ホタルルシフェラーゼ標識神経芽腫腫瘍細胞を静脈内移植した。１０日後に、マウスに、５＊１０^６のＣＡＲ^＋ ＮＫＴを静脈内投与した。マウスを、毎週ＩＶＩＳキネティックマシンにより画像化し、８０日目に安楽死させ、末梢血液、肝臓、及び脾臓を収集した。

【図4C】ＩＬ－１２を産生するＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴが、インビトロの腫瘍細胞への反復暴露に際しての細胞傷害性活性の促進を有し、長期間の腫瘍の制御を媒介することを実証する。代表的な腫瘍のＢＬＩを示す（合計のフラックスｐ／ｓとして測定した）。

【図4D】ＩＬ－１２を産生するＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴが、インビトロの腫瘍細胞への反復暴露に際しての細胞傷害性活性の促進を有し、長期間の腫瘍の制御を媒介することを実証する。ＮＫＴ注入の８０日間後に収集された末梢血液、肝臓、及び脾臓のサンプル中のヒトＮＫＴ（ｉＮＫＴ^＋ＣＤ４５^＋）の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。

【図5A】ＧＤ２．ＣＡＲ及び膜結合ＩＬ－１２により形質導入されたＮＫＴが、ＣＡＲを発現し、ＣＤ６２Ｌをアップレギュレートすることを実証する。ＮＫＴを形質導入するために使用されるレトロウイルスベクターの図表を提供する。ＧＤ２．ＣＡＲに関して１Ａ７ ｓｃＦｖを使用した。ＮＫＴの膜へＩＬ－１２をアンカーするために、修飾されたＣＤ８ａスターク及び膜貫通ドメインを使用した。

【図5B】ＧＤ２．ＣＡＲ及び膜結合ＩＬ－１２により形質導入されたＮＫＴが、ＣＡＲを発現し、ＣＤ６２Ｌをアップレギュレートすることを実証する。培養の１０日目に査定された、対照ＣＡＲ形質導入ＮＫＴにおけるＣＡＲ発現の代表的なフローサイトメトリープロットを提供する。

【図5C】ＧＤ２．ＣＡＲ及び膜結合ＩＬ－１２により形質導入されたＮＫＴが、ＣＡＲを発現し、ＣＤ６２Ｌをアップレギュレートすることを実証する。培養の１０日目に査定された、対照ＣＡＲ形質導入ＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌ発現の代表的なフローサイトメトリープロットを提供する。

【図6A】膜結合ＩＬ－１２が、細胞表面上で検出され、ＳＴＡＴ４のリン酸化を誘導することを実証する。培養の１０日目に査定された、対照ＮＫＴ（ＮＴ）またはＣＡＲ形質導入ＮＫＴの細胞表面上で検出されたＩＬ－１２発現の代表的なフローサイトメトリープロットを提供する。

【図6B】膜結合ＩＬ－１２が、細胞表面上で検出され、ＳＴＡＴ４のリン酸化を誘導することを実証する。培養の１０日目に査定された、対照ＮＫＴ（ＮＴ）またはＣＡＲ形質導入ＮＫＴの細胞表面上で検出されたＩＬ－１２受容体β（ＩＬ－１２ＲＢ）発現の代表的なフローサイトメトリープロットを提供する。

【図6C】膜結合ＩＬ－１２が、細胞表面上で検出され、ＳＴＡＴ４のリン酸化を誘導することを実証する。培養の１４日目での、ＮＴ、ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰ ＮＫＴ、及びＣＡＲ．ＧＤ２（ｉ）ＩＬ１２ＴＭ ＮＫＴにおけるＳＴＡＴ４リン酸化を例証する代表的なウエスタンブロットを提供する。

【図7A】膜結合ＩＬ－１２を備えたＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴが、インビトロの腫瘍細胞への反復暴露に際して可溶性ＩＬ－１２と匹敵する細胞傷害性活性を有することを実証する。ＮＫＴをＣＨＬＡ－２２５（Ｅ：Ｔ＝１：１）により共培養し、次いで収集し、抗ｉＴＣＲ（Ｖβ１１）及び抗Ｂ７－Ｈ３により染色してフローサイトメトリーによってそれぞれＮＫＴ及び神経芽腫細胞を同定した、各々のサイクル後の残存する腫瘍細胞の定量の代表的なフロープロットを提供する。

【図7B】膜結合ＩＬ－１２を備えたＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴが、インビトロの腫瘍細胞への反復暴露に際して可溶性ＩＬ－１２と匹敵する細胞傷害性活性を有することを実証する。Ｅ：Ｔ比１：１でＣＨＬＡ－２２５と共培養された、対照ＮＫＴＳ（ＮＴ）またはＣＡＲ形質導入ＮＫＴによって産生されたＩＦＮ－γ及びＩＬ－１２ｐｒの定量を示す。サイトカイン無しの２ｍＬの完全培地で２４ウェルプレート中での２．５×１０^５のＮＫＴ細胞／ウェルと２．５×１０^５のＣＨＬＡ－２２５／ウェルのプレーティングの２４時間後に収集した上清で、サイトカインを測定した。平均及び標準偏差を示し、ｎ＝２。

【図7C】膜結合ＩＬ－１２を備えたＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴが、インビトロの腫瘍細胞への反復暴露に際して可溶性ＩＬ－１２と匹敵する細胞傷害性活性を有することを実証する。ＧＤ２．ＣＡＲ（ｉ）ＩＬ１２ＴＭのインビボでの存続性を示す。ＮＳＧマウスに１０＊１０^６のＧＤ２．ＣＡＲ（ｉ）ＩＬ１２ＴＭ ＮＫＴを注入した。２７日後に、ＮＫＴは末梢血液において検出され、ＣＤ６２Ｌの高発現が維持された。

【図8-1】様々なＩＬ－１２コンストラクトについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-2】同上。

【図8-3】同上。

【図9】ＣＤ１９．ＣＡＲ及びＧＤ２．ＣＡＲについてのアミノ酸配列を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0021】

ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴまたはＮＫＴ細胞）は末梢血液から単離され、ヒトＩＬ－１２を発現するように遺伝的に操作された。これらのＮＫＴは、養子移入後の免疫不全マウスにおいてＣＤ６２Ｌの高発現レベルを獲得し、移植片対宿主病を引き起ここと無しに長期間存続することが示された。驚くべきことに、トランスジェニックＩＬ－１２は、単にＮＫＴ細胞を増殖させる可溶性サイトカインとしてではなく、ＮＫＴ細胞のＩＬ－１２発現をリプログラミングし改善するために使用され得ることが見出された。ＩＬ－１２は、それ自体でＮＫＴ細胞の長期間の生着を支援するのに十分であることがさらに示された。いくつかの態様において、ＣＤ６２Ｌは、トランスジェニックＩＬ－１２の効果を支援するのに必要でなくてもよい。

【0022】

修飾されたＮＫＴ細胞、修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物、及び修飾されたＮＫＴ細胞を利用する治療方法が本明細書において記載される。本明細書において記載される修飾されたＮＫＴ細胞は、長期間の存続性を呈すし、ＩＬ－１２の発現がＣＡＲの発現とカップルされる場合に、これらのＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞を除去する長期間の能力及び長期間の存続性を獲得する。

【0023】

修飾されたＮＫＴ
本開示の態様は、修飾されたＴ細胞（例えば修飾または操作されたナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞）に関する。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、トランスジェニックＩＬ－１２を発現するように修飾される。

【0024】

いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。概して当業者に公知であるように、ＣＡＲ Ｔ細胞（例えばＣＡＲ ＮＫＴ細胞）は、当該ＣＡＲ Ｔ細胞を必要とする対象またはドナー対象等からＮＫＴ細胞を得て、それらがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むように、細胞をマニピュレーションすることによって産生され得る。ＣＡＲは、特異的なタンパク質をがん細胞に対して標的化する能力を提供し、抗原認識ドメイン、細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを含む。ＣＡＲ Ｔ細胞は、第一世代、第二世代、第三世代、または第四世代として分類され得る。

【0025】

第一世代ＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインのみで操作される。第二世代ＣＡＲは、ＣＤ３ζドメイン及び共刺激シグナリングドメイン（例えばＣＤ２８または４－１ＢＢ）で操作される。第三世代ＣＡＲは、２つの共刺激シグナリングドメイン（例えばＣＤ２８及びＣＤ１３７の両方）に加えてＣＤ３ζドメインを含むように操作される。最後に、第四世代ＣＡＲ（普遍的なサイトカイン媒介性殺傷のために向け直されたＴ細胞（Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ）（ＴＲＵＣＫ）とも称される）は、ＣＤ３ζドメイン、２つの共刺激シグナリングドメイン（例えばＣＤ２８及びＣＤ１３７の両方）、及びいくつかの追加の遺伝子修飾（サイトカイン分泌または追加の共刺激シグナリングドメインのための導入遺伝子の追加）を含むように操作される。任意のタイプのＣＡＲは、修飾されたＮＫＴ細胞の製造において使用され得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、第二世代ＣＡＲである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＧＤ２．ＣＡＲ、ＣＤ１９．ＣＡＲ、Ｂ７Ｈ３．ＣＡＲ、及びＣＳＰＧ４．ＣＡＲからなる群から選択される。

【0026】

いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。概して当業者に公知であるように、Ｔ細胞受容体を含むＮＫＴ細胞は、当該ＮＫＴ細胞を必要とする対象またはドナー対象等からＮＫＴ細胞を得て、それらがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むように、細胞をマニピュレーションすることによって産生され得る。任意のタイプのＴＣＲは、修飾されたＮＫＴ細胞の製造において使用され得る。

【0027】

いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、ヒトＮＫＴ細胞または非ヒトＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞が使用される。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、霊長動物細胞（ヒト細胞または非ヒト霊長動物細胞）、齧歯動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター）細胞、イヌ、ネコ、ウシ、または他の哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、トリ細胞が使用される。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、末梢血液、骨髄、リンパ、またはリンパ器官から単離される。ＮＫＴ細胞は、当業者に公知の任意の方法によって単離され得る。

【0028】

いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、自己由来細胞である。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、自己由来細胞ではない。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、対象と同じ種である。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、対象の種とは異なる種である。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、当技術分野において公知の分化プロトコルを使用して、インビトロで幹細胞または祖先細胞から分化される。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞の集団は、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、５００倍、またはそれを超えて増幅されて、ＮＫＴ細胞の数の増加を提供する。

【0029】

本明細書において記載される修飾されたＮＫＴ細胞は、１つまたは複数の特色を呈する。修飾されたＮＫＴ細胞の特色の非限定例としては、腫瘍制御の促進及び生存の改善を増進すること（対照細胞に比較して）、腫瘍の再攻撃に際して腫瘍増殖を制御すること（対照細胞に比較して）、抗腫瘍性活性の増加、ＣＤ６２Ｌの発現の増加、長期間の存続性、インビトロでの腫瘍細胞への反復暴露に際しての細胞傷害性活性の促進（対照細胞に比較して）、移植片対宿主病を引き起こすリスクの減少、及びそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、対照細胞に比較して、腫瘍制御の促進及び生存の改善を増進する。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、対照細胞に比較して、腫瘍の再攻撃に際して腫瘍増殖を制御する。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、抗腫瘍性活性の増加を呈する。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌの発現の増加を呈する。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、長期間の存続性を呈する。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、対照細胞に比較して、インビトロでの腫瘍細胞への反復暴露に際しての細胞傷害性活性の促進を呈する。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、対象へ投与した場合に、移植片対宿主病を引き起こすリスクの減少を呈する。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌを発現しない。

【0030】

いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、細胞表面（例えばＮＫＴ細胞の細胞表面）へ付着される膜結合サイトカインを含有する。一実施形態において、膜結合サイトカインは、ＩＬ－１２である。いくつかの態様において、修飾されたＮＫＴ細胞はＩＬ－１２を分泌し、それは、次いでＮＫＴ細胞の表面へ膜結合される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、膜貫通ドメインを介して細胞膜（例えばＮＫＴ細胞膜）へ結合される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、膜貫通ドメインへ融合される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、インテグリンファミリー、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、グリコフォリン、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ糖タンパク質、ＥＧＦ受容体、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリー、受容体チロシンキナーゼ（例えばインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦＲ）及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ））、ポリンファミリー、当業者に公知の他の膜貫通タンパク質、ならびにその組み合わせからなる群から選択される分子の膜貫通ドメインに由来する配列を有する。一実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ４の膜貫通ドメインを含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２は、ＣＤ４またはＣＤ８のスタークを介してＮＫＴ細胞膜へ結合される。一実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２は、ＣＤ８スタークを介してＮＫＴ細胞膜へ結合される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、ＣＤ８のヒンジ領域及び膜貫通ドメインを含む。好適なＣＤ８のヒンジ領域及び膜貫通ドメインは、当業者に公知であり、例示的な例は配列番号６において提供される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、ヒンジ領域から１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、ヒンジ領域からすべてのシステイン残基を除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のシステイン残基は、１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基により置換することによって除去される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、ヒンジ領域のシステイン残基のすべてをセリン残基へ置換することによって修飾される。一実施形態において、ＣＤ８スタークは、ＣＤ８ａスタークである。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、配列番号１２のアミノ酸配列のヒンジ領域、またはそれへ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ８スタークは、配列番号１２のアミノ酸配列のヒンジ領域を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。

【0032】

一実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２は、ＣＤ４スタークを介してＮＫＴ細胞膜へ結合される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、ＣＤ４のヒンジ領域及び膜貫通ドメインを含む。好適なＣＤ４のヒンジ領域及び膜貫通ドメインは、当業者に公知であり、例示的な例は配列番号８において提供される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、ヒンジ領域から１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、ヒンジ領域からすべてのシステイン残基を除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のシステイン残基は、１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基により置換することによって除去される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、ヒンジ領域のすべてのシステイン残基をセリン残基へ置換することによって修飾される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、配列番号１３のアミノ酸配列のヒンジ領域、またはそれへ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ４スタークは、配列番号１３のアミノ酸配列のヒンジ領域を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。

【0033】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＣＤ４またはＣＤ８ａのスタークを介して細胞膜へ結合される。ＣＤ４またはＣＤ８のスタークは、ヒンジ及び膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの態様において、ヒンジ領域（例えばＣＤ８ヒンジ領域）は、共発現されるＣＡＲとの二量体化を最小限にするかまたはさもなければ防止するように修飾される。ヒンジ領域は、１つまたは複数の修飾（例えば１、２、３、４、５、またはそれを超えるアミノ酸の欠失及び／または置換）を含み得る。一実施形態において、ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号６において示されるＣＤ８ａヒンジ領域の位置（複数可）２７及び／または４４で、システイン（Ｃｙｓ）残基への修飾を含む。一実施形態において、ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号６の位置（複数可）Ｃ５７１及び／またはＣ５８８で、システイン（Ｃｙｓ）残基への修飾を含む。一実施形態において、ＣＤ４ヒンジ領域は、配列番号８において示されるＣＤ４ヒンジ領域の位置（複数可）１４及び／または５６で、Ｃｙｓ残基への修飾を含む。一実施形態において、ＣＤ４ヒンジ領域は、配列番号８の位置（複数可）Ｃ５５８及び／またはＣ６００で、Ｃｙｓ残基への修飾を含む。いくつかの態様において、１つまたは複数のシステイン残基は、１つまたは複数のセリン（Ｓｅｒ）残基が置換される。一実施形態において、膜結合サイトカインの膜貫通ドメインは、配列ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＳＤ（配列番号１２）を含む。一実施形態において、膜結合サイトカインの膜貫通ドメインは、配列ＶＶＭＲＡＴＱＬＱＫＮＬＴＳＥＶＷＧＰＴＳＰＫＬＭＬＳＬＫＬＥＮＫＥＡＫＶＳＫＲＥＫＡＶＷＶＬＮＰＥＡＧＭＷＱＳＬＬＳＤＳＧＱＶＬＬＥＳＮＩＫＶＬＰＴＷＳＴＰＶＱＰ（配列番号１３）を含む。驚いたことには、システイン残基を除去するためにＣＤ８ａスタークを修飾することは、アンカーされたＩＬ－１２が共発現されたＣＡＲの有効性を予想外に改善したことが見出された。

【0034】

理論によりまたは適用の特定のモードにより束縛されるものではないが、膜結合部分（ＣＤ４またはＣＤ８のスタークのネイティブな配列を含む）中に存在するシステイン残基が、概して、共発現されたＣＡＲ中に存在するシステイン残基とのジスルフィド結合をおそらく形成し、それによってＣＡＲの有効性を低減することが理解される。膜結合サイトカイン（例えばＩＬ－１２）とＣＡＲとの間でジスルフィド結合を形成することが予想されるシステイン残基を置換することによって、膜結合サイトカインとＣＡＲとの二量体化は、最小限にされるかまたはさもなければ防止され、それによってＣＡＲの有効性を回復させる。したがって、本開示は、形質転換されてＣＡＲ及び外来性膜結合部分を発現する細胞であって、外来性膜結合部分が、さもなければＣＡＲ中に存在するシステイン残基によりジスルフィド結合を形成することが可能な１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾された膜貫通ドメインを含む、前記細胞へも拡張される。

【0035】

いくつかの実施形態において、外来性膜結合部分は、ＣＤ４またはＣＤ８のスタークを介して細胞膜へ結合される。一実施形態において、膜結合治療部分は、ＣＤ８スタークを介して細胞膜へ結合される。いくつかの態様において、ＣＤ８スタークは、ＣＤ８のヒンジ領域及び膜貫通ドメインを含む。好適なＣＤ８のヒンジ領域及び膜貫通ドメインは、当業者に公知であり、例示的な例は配列番号６において示される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、ヒンジ領域から１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、ヒンジ領域からすべてのシステイン残基を除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のシステイン残基は、１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基により置換することによって除去される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、ヒンジ領域のすべてのシステイン残基をセリン残基へ置換することによって修飾される。一実施形態において、ＣＤ８スタークは、ＣＤ８ａスタークである。いくつかの実施形態において、ＣＤ８スタークは、配列番号１２のアミノ酸配列のヒンジ領域、またはそれへ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ８スタークは、配列番号１２のアミノ酸配列のヒンジ領域を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。

【0036】

別の実施形態において、外来性膜結合部分は、ＣＤ４スタークを介して細胞膜へ結合される。いくつかの態様において、ＣＤ４スタークは、ＣＤ４のヒンジ領域及び膜貫通ドメインを含む。好適なＣＤ４のヒンジ領域及び膜貫通ドメインは、当業者に公知であり、例示的な例は配列番号８において示される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、ヒンジ領域から１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、ヒンジ領域からすべてのシステイン残基を除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のシステイン残基は、１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基により置換することによって除去される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、ヒンジ領域のすべてのシステイン残基をセリン残基へ置換することによって修飾される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４スタークは、配列番号１３のアミノ酸配列のヒンジ領域、またはそれへ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ４スタークは、配列番号１３のアミノ酸配列のヒンジ領域を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。

【0037】

本開示は、ＣＡＲ及び外来性膜結合部分を発現するように形質転換された細胞であって、ＣＡＲのアミノ酸配列が、さもなければ外来性膜結合部分の膜貫通ドメイン中に存在するシステイン残基によりジスルフィド結合を形成することが可能な１つまたは複数のシステイン残基を除去するように修飾された、前記細胞へも拡張される。

【0038】

いくつかの実施形態において、外来性膜結合部分は、治療部分である。好適な治療部分は、当業者に公知であり、その例示的な実施形態としては、サイトカイン、インテグリンファミリーメンバー、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、グリコフォリン、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ糖タンパク質、ＥＧＦ受容体、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーメンバー、受容体チロシンキナーゼ（例えばインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦＲ）及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ））、ポリンファミリーメンバー、ならびに上記の任意のものの組み合わせが挙げられる。一実施形態において、治療部分は、サイトカインである。

【0039】

いくつかの実施形態において、細胞は、免疫細胞である。好適な免疫細胞は当業者に公知であり、Ｔ細胞が挙げられる。いくつかの態様において、免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫＴ細胞である。

【0040】

別の実施形態において、膜結合サイトカイン（例えばＩＬ－１２）のヒンジ及び／または膜貫通領域中に存在するシステイン残基によりジスルフィド結合を形成することが予想される膜結合ＣＡＲのシステイン残基の１つまたは複数は、修飾され（例えばセリン残基について置換され）、それによって、膜結合サイトカインとＣＡＲとの二量体化を最小限にするかまたはさもなければ防止し得る。

【0041】

いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインへ融合されたＩＬ－１２は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインへ融合されたＩＬ－１２は、配列番号６または配列番号７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ４膜貫通ドメインへ融合されたＩＬ－１２は、配列番号８または配列番号９の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異された膜貫通ドメインへ融合されたＩＬ－１２は、配列番号７または配列番号９の配列を含む。一実施形態において、膜貫通ドメインへ融合されたＩＬ－１２は、配列番号６の配列を含む。一実施形態において、膜貫通ドメインへ融合されたＩＬ－１２は、配列番号７の配列を含む。一実施形態において、膜貫通ドメインへ融合されたＩＬ－１２は、配列番号８の配列を含む。一実施形態において、膜貫通ドメインへ融合されたＩＬ－１２は、配列番号９の配列を含む。

【0042】

いくつかの実施形態において、膜結合されたまたはアンカーされたＩＬ－１２は、リンカーを含有する。リンカーは、概して当業者に公知である。いくつかの態様において、リンカーは、１つまたは複数アミノ酸を含む。例えば、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるアミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、リンカーは、柔軟なリンカーであり得る。

【0043】

ＮＫＴ細胞は、例えば当業者に公知の任意の方法を使用して、ＩＬ－１２を発現するように修飾され得る。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞への修飾は、ＲＮＡ標的化剤（ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、またはリボザイム等）によって導入され得る。いくつかの事例において、修飾は、遺伝子編集系またはその構成要素を介して導入され得る。遺伝子編集系の例としては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、ＴＡＬＥ系、ＴＡＬＥＮ系、及びメガヌクレアーゼ系が挙げられる。いくつかの実施形態において、遺伝子編集系は、ベクター送達系を使用して送達され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子編集系は、ウイルスベクター送達系を使用して送達され得る。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞への修飾は、形質導入またはトランスフェクションを使用して導入され得る。ＮＫＴ細胞を修飾するための方法の非限定例としては、ウイルス性、非ウイルス性、及びハイブリッド（ウイルス性及び非ウイルス性の）ベースの方法が挙げられる。形質導入の方法としては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、オンコレトロウイルベクタース、及び／または当業者に公知の他のベクターの使用が挙げられ得る。トランスフェクション方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、エレクトロポレーション、ソノポレーション、マグネトフェクション、遺伝子マイクロインジェクション、レーザー照射、及び当業者に公知の他の方法が挙げられ得る。

【0044】

いくつかの実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２を発現するＮＫＴ細胞は、ＩＬ－１２を含むウイルスベクターによりＮＫＴ細胞を形質導入することによって産生され、例えばＮＫＴ細胞は、ＩＬ－１２を含むレトロウイルス上清により形質導入され得る。一実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２を発現するＮＫＴ細胞は、レンチウイルスベクター（ＬＶ）形質導入を使用して産生される。一実施形態において、トランスジェニックＩＬ－１２を発現するＮＫＴ細胞は、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを使用して産生される。

【0045】

いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌの発現を低減またはノックアウトするように修飾される。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、遺伝子編集系（ＣＲＩＳＰＲ関連系等、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を使用して修飾される。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用して、１つまたは複数の標的の発現を低減またはノックアウトするように修飾される。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用して、ＣＤ６２Ｌの発現を低減またはノックアウトするように修飾される。

【0046】

いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は哺乳動物から単離され、ＩＬ－１２により、及びいくつかの実施形態において、ＣＡＲにより、遺伝子的に修飾される（すなわちインビトロで形質導入またはトランスフェクションされる）。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター）により形質導入され得るか、またはプラスミドもしくは核酸コンストラクトによりトランスフェクションされ得る。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、ＩＬ－１２を含む。ＩＬ－１２は、柔軟なリンカーを介して接続されるｐ４０サブユニット及びｐ３５サブユニットを有し得る。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、ＳＦＧ及び／またはＧＦＰをさらに含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲ及びＩＬ－１２により形質導入される。

【0047】

対象への投与のために、本明細書において開示される方法によって産生された修飾されたＮＫＴ細胞は、例えば薬学的に許容される組成物において対象へ投与され得る。これらの薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体（添加物）及び／または希釈物質と一緒に製剤化された、治療有効量の上で記載される修飾されたＮＫＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、希釈物質及び／または他の構成要素、及び／または他のサイトカイン及び／または細胞集団をさらに含む。

【0048】

本明細書において記載される時、本発明の医薬組成物は、特に固体形態または液体形態での投与のために製剤化され得、以下の：（１）経口投与、例えば飲薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁物）、ロゼンジ、ドラジェ、カプセル、ピル、錠剤（例えば頬側、舌下、及び全身的な吸収のために標的化されたもの）、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト；（２）非経口投与、例えば滅菌済みの溶液もしくは懸濁物または持続放出製剤として、例えば皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外の注射による；（３）局所適用、例えば皮膚へ適用されるクリーム、軟膏、または制御放出パッチもしくは噴霧として；（４）膣内または直腸内、例えばペッサリー、クリーム、または泡として；（５）舌下；（６）眼内；（７）経皮；（８）経粘膜；または（９）経鼻に適合したものが挙げられる。追加で、化合物は、患者の中へ植え込まれ得るか、または薬物送達系を使用して注射され得る。例えばＵｒｑｕｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９－２３６（１９８４）；Ｌｅｗｉｓ，ｅｄ．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号；及び米国特許第３５ ３，２７０，９６０号を参照されたい。いくつかの実施形態において、腫瘍及び／または体腔、開口部、及び／または腫瘍を含有する組織への直接投与が所望され得る。

【0049】

本明細書において使用される時、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症無しに、合理的なベネフィット／リスク比に見合うような、ヒト及び動物の組織と接触させる使用に好適な化合物、材料、組成、及び／または投薬形態を指す。

【0050】

本明細書において使用される時、「薬学的に許容される担体」という用語は、対象化合物を１つの器官または身体の一部分から別の器官または身体の一部分へ、運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体の充填物質、希釈物質、賦形剤、製造補助物質（例えば潤滑物質、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ））、または溶媒カプセル化材等の薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各々の担体は、製剤の他の成分と適合性があり且つ患者へ有害でないという意味で「許容され」なくてはならない。薬学的に許容される担体として供され得る材料のいくつかの例としては、（１）糖（ラクトース、グルコース、及びスクロース等）；（２）デンプン（トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン等）；（３）セルロース及びその誘導体（カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、及び酢酸セルロース等）；（４）トラガント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルク等）；（８）賦形剤（カカオバター及び坐剤用ワックス等）；（９）油（落花生油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油等）；（１０）グリコール（プロピレングリコール等）；（１１）ポリオール（グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）；（１２）エステル（オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等）；（１３）アガー；（１４）バッファー剤（水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等）；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェン不含有水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、及び／またはポリ無水物；（２２）充填剤（ポリペプチド及びアミノ酸等）、（２３）血清構成要素（血清アルブミン、ＨＤＬ、及びＬＤＬ等）；（２２）Ｃ_２－Ｃ_１２アルコール（エタノール等）；ならびに（２３）薬学的製剤中で用いられる他の非毒性の適合性のある物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐物質、及び抗酸化物質も、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」という用語、または同種のもの等は、互換的に本明細書において使用される。

【0051】

治療の方法
がんの治療または防止を必要とする対象においてがんを治療または防止する方法が本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、方法は、トランスジェニックＩＬ－１２を発現し、及びいくつかの実施形態において、本明細書において記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、修飾されたＮＫＴ細胞を投与することを包含する。いくつかの実施形態において、方法は、トランスジェニックＩＬ－１２を発現し、及びいくつかの実施形態において、ＣＡＲを含む、治療有効量の修飾されたＮＫＴ細胞を投与することを包含する。

【0052】

修飾されたＮＫＴ細胞の集団を、対象（例えばがんと診断された及び／またはさもなければ当該集団を必要とする対象）において増幅及び／または生成する方法も本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、方法は、トランスジェニックＩＬ－１２を発現するＮＫＴ細胞を対象へ投与することを包含する。いくつかの態様において、修飾されたＮＫＴ細胞の集団は、対象への投与後のある期間（例えば少なくとも１週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、９か月、１年、２年、５年など）で対象において存続する。

【0053】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される細胞（例えば修飾されたＮＫＴ細胞）は、移植可能である（例えば修飾されたＮＫＴ細胞は対象へ投与され得る）。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞が投与される対象は、修飾前のＮＫＴ細胞が得られた（例えば自己由来細胞治療法のために）ものと同じ対象である。いくつかの実施形態において、対象は、異なる対象である。いくつかの実施形態において、対象は、がんに罹患しているかまたは正常な対象である。例えば、移植のための修飾されたＮＫＴ細胞は、移植に好適な形態であり得る。

【0054】

方法は、修飾されたＮＫＴ細胞を、当該投与を必要とする対象（例えば哺乳動物対象、例えばヒト対象）へ投与することをさらに包含し得る。細胞の供給源は、哺乳動物（好ましくはヒト）であり得る。細胞の供給源またはレシピエントは、非ヒト対象（例えば動物モデル）でもあり得る。「哺乳動物」という用語は、生物体を包含し、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、及び好ましくはヒトが挙げられる。同様に、移植可能細胞は、非ヒト遺伝子導入生物を包含するこれらの生物体のうちの任意のものから得られ得る。いくつかの態様において、細胞の供給源は、対象の末梢血液である。

【0055】

修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物は、植え込み型デバイスを使用して、対象へ投与され得る。植え込み型デバイス及び関連する技術は、当技術分野において公知であり、本明細書において描写される化合物または組成物の連続放出または時限放出の送達が所望される場合の送達系として有用である。追加で、植え込み型デバイス送達系は、化合物または組成物の送達の特異的なポイント（例えば局所化される部位、器官）を標的化するのに有用である。Ｎｅｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２（６）：５６３（２００１）。代替送達方法を含む時限放出技術も、本発明において使用され得る。例えば、高分子技術、持続放出技法、及びカプセル化技法（例えばポリマー、リポソーム）にベースの時限放出製剤も、本明細書において描写される化合物及び組成物の送達のために使用され得る。

【0056】

本明細書において使用される時、「投与する」という用語は、所望される効果が産生されるように、所望される部位で組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、対象の中へ組成物を配置することを指す。本発明の方法に好適な投与経路は、局所投与及び全身投与の両方を包含する。概して、局所投与は、投与される修飾されたＮＫＴ細胞が、対象の全身に比較して、特異的な所在位置へより多く送達されることをもたらすが、全身投与は、本質的に対象の全身への修飾されたＮＫＴ細胞の送達をもたらす。

【0057】

修飾されたＮＫＴ細胞の投与の文脈において、「投与」という用語は、対象におけるかかる細胞の移植も包含する。本明細書において使用される時、「移植」という用語は、少なくとも１つの細胞を対象へ植え込むかまたは移行させるプロセスを指す。「移植」という用語は、例えば自己移植（患者の１つの所在位置からの細胞の除去及び同じ患者の同じかまたは別の所在位置への移行）、同種移植（同じ種のメンバー間の移植）、及び異種移植（異なる種のメンバー間の移植）を包含する。当業者は、がんを治療するための細胞の植え込みまたは移植の方法を十分に承知しており、これらは本発明に適する。

【0058】

修飾されたＮＫＴ細胞またはそれを含む組成物は、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され得、経口経路または非経口経路が挙げられるがこれらに限定されず、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、及び、気道与（エアロゾル）、経肺投与、経鼻投与、直腸投与、及び局所（頬側及び舌下が挙げられる）投与を包含する。

【0059】

例示的な投与モードとしては、注射、注入、点滴、吸入、または経口摂取が挙げられるがこれらに限定されない。「注射」としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が限定されずに挙げられる。好ましい実施形態において、組成物は、静脈内の注入または注射によって投与される。

【0060】

本明細書において使用される時、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物（霊長動物、齧歯動物、飼育動物、または狩猟動物等）である。霊長動物としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク（例えばアカゲザル）が挙げられる。齧歯動物としては、マウス、ラット、ヤマネズミ、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。飼育動物及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種（例えばイエネコ）、イヌ科の種（例えばイヌ、キツネ、オオカミ）、トリの種（例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ）、及び魚類（例えばマス、ナマズ、及びサケ）が挙げられる。患者または対象としては、上記のもののうちの任意のサブセット（例えば上記のもののすべてであるが、１つまたは複数の群または種（ヒト、霊長動物、または齧歯動物等）を除外する）が挙げられる。本明細書において記載される態様のある特定の実施形態において、対象は、哺乳動物（例えば霊長動物、例えばヒト）である。「患者」及び「対象」という用語は、本明細書において互換的に使用される。「患者」及び「対象」という用語は、本明細書において互換的に使用される。対象は、オスまたはメスであり得る。

【0061】

好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。加えて、本明細書において記載される方法及び組成物は、飼育動物及び／またはペットを治療するために使用され得る。

【0062】

いくつかの実施形態において、対象は、がんを有するかもしくは発症するかまたはがんを再発する「リスクがある」と見なされる。対象が、がんを有するかもしくは発症するか、またはがんの再発を有するリスクがあるかということは、対象をケアする当業者の裁量内にあり得る決定である。任意の好適な診断的試験及び／または基準も使用され得る。例えば、（ｉ）対象が、突然変異または遺伝的多型を有していない一般集団の他のメンバーに比べて、がんを発症するかまたは有するリスクの増加と関連する、突然変異、遺伝的多型、遺伝子またはタンパク質の発現プロファイル、及び／または血液中の特定の物質の存在を有する；（ｉｉ）対象が、１つまたは複数のリスク因子（がんの家族歴を有すること、発がん物質または腫瘍促進性の薬剤もしくは条件（例えば石綿、タバコ煙、アフラトキシン、放射線、慣性的な感染／炎症など）へ曝露されたこと、加齢等）を有する；（ｉｉｉ）対象が、がんの１つまたは複数の症状を有する、（ｉｖ）対象が、がんの可能性を増加させる既知の医学的病態を有するなどであるならば、対象は、がんを有するかまたは発症する「リスクがある」と判断され得る。

【0063】

本明細書において使用される時、がんのタイプは限定されない。「がん」という用語は、本明細書において使用される時、そのユニークな形質（正常な制御の損失）が、無秩序な増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、及び転移をもたらす細胞の過剰増殖として定義される。本発明の方法に関して、がんは任意のがんであり得、急性リンパ球性癌（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、急性骨髄性白血病、腺癌、胞巣状横紋筋肉腫、肛門癌、血管肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、基底細胞癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、肛門、肛門管、または肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、造血新生物、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、腹膜網、及び腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、肉腫、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、固形腫瘍、扁平上皮癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、尿管癌、膀胱癌、ならびに子宮癌のうちの任意のものが挙げられる。本明細書において使用される時、「腫瘍」という用語は、別段特に指摘されない限り、悪性タイプの細胞または組織の異常増殖を指し、良性タイプの組織を含まない。

【0064】

本明細書において使用される時、「治療する」及び「治療」という用語は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善（例えば有益であるかまたは所望される臨床結果）を有するように、本明細書において記載される方法に従ってエクスビボで変更された有効量の修飾されたＮＫＴ細胞を、対象へ投与することを指す。本発明の目的のために、有益であるかまたは所望される臨床結果としては、検出可能か検出不可能かにかかわらず、１つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、安定化した（すなわち悪化せずに）疾患の状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の軽快または緩和、及び寛解（部分か完全かにかかわらず）が挙げられるがこれらに限定されない。治療することは、治療を受けない場合に予想される生存に比較して、生存を延長することを指し得る。したがって、当業者であれば、治療が疾患病態を改善し得るが、疾患の完全治癒とはなり得ないことを理解する。本明細書において使用される時、「治療」という用語は、予防を包含する。代替的に、疾患の進行が低減または停止されるならば、治療は「有効」である。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存に比較して、生存を延長することも意味し得る。治療を必要とする者は、ポリヌクレオチド配列の発現と関連する障害であると既に診断された者、そして遺伝的感受性または他の因子に起因するかかる障害を発症する可能性がある者を包含する。

【0065】

疾患または障害の「治療」、「予防」、または「軽快」によって、かかる疾患または障害の開始を遅延または予防すること、かかる疾患または障害と関連する病態の進行または重症度の進行、増悪、または悪化を好転、緩和、軽快、阻害、減速、または停止することが意味される。一実施形態において、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％まで緩和される。

【0066】

修飾されたＮＫＴ細胞の投薬量、投与スケジュール、及び投与方法は限定されない。投薬量は様々な因子に依存し、他の治療、用量の数、ならびに年齢、身体条件、サイズ、及び重量を包含する個別の患者パラメーターが挙げられる。これらは当業者に周知の因子であり、単なるルーチンの実験により対処され得る。いくつかの実施形態において、最大忍容用量は、妥当な医学的判断に従って使用され得る（すなわち最も安全且つ忍容される用量）。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞を含む医薬組成物は、約１０^３～約１０^１０細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与され得、いくつかの実施形態において、投薬量は、それらの範囲内のすべての整数値（例えば１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９）を包含する約１０^５～約１０^６細胞／ｋｇ体重であり得る。

【0067】

使用される用量は、最大耐容用量もしくは治療下用量、またはその間の任意の用量であり得る。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、１つまたは複数の薬剤と併用して投与される。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞及び／または１つもしくは複数の薬剤は、定義された投与スケジュールに従って投与される。複数の用量が企図される。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞及び１つまたは複数の薬剤が併用で投与される場合に、１つまたは複数の治療下投薬量の薬剤が使用され得る。「治療下用量」は、本明細書において使用される時、もし他の薬剤の非存在下において投与されたならば対象における治療結果を産生する、その投薬量未満である投薬量を指す。いくつかの態様において、抗がん剤の治療下用量は、本明細書において記載される修飾されたＮＫＴ細胞の投与の非存在下において対象で有用な治療結果を産生しないものである。抗がん剤の治療用量は、がんの治療のための医薬品の分野において周知である。

【0068】

本明細書において使用される時、医薬組成物は、治療有用性を有する１つまたは複数の薬剤または組成物、及び薬学的に許容される担体（例えば薬剤または組成物の送達を容易にする担体）を含む。本明細書において開示される薬剤及び医薬組成物は、任意の好適な手段（経口的、鼻内、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、非経口的、腹腔内、髄腔内に、気管内、眼内、舌下、経腟的、経直腸的、経真皮的に、またはエアロゾルとして等）によって投与され得る。治療される病態のタイプ（例えばがん）に依存して、本発明の化合物は、例えば経口摂取、吸入、または全身経路によって投与され得る。したがって、様々な投与モードまたは経路が利用可能である。選択された特定のモードは、典型的には、選択された特定の化合物、治療されている特定の病態、及び治療有効性のために要求される投薬量等の因子に依存するだろう。本明細書において記載される方法は、概して言えば、医学的に許容される任意の投与モードを使用して実践され得、臨床的に許容できない副作用を引き起こすこと無しに、許容されるレベルの有効性を産生する任意のモードを意味する。好ましい投与モードは、非経口経路及び経口経路である。「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、及び胸骨内の注射または注入の技法を包含する。いくつかの実施形態において、吸入医薬物は、例えば肺癌患者において肺へ直接的に送達されるので、特に有用である。複数のタイプの定量吸入器は、吸入による投与のために通常使用される。これらのタイプのデバイスとしては、定量吸入器（ＭＤＩ）、呼吸作動式ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩと併用したスペーサー／保持チャンバー、及びネブライザーが挙げられる。いくつかの実施形態において、薬剤は、肺エアロゾルによって送達される。他の適切な経路は、当業者に明らかである。

【0069】

修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物の投与の毒性及び治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％への致死性用量）及びＥＤ５０（集団の５０％における治療有効用量）の決定のための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。大きな治療指数を呈する修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物は好ましい。

【0070】

修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物の量は、複数の十分に確立された動物モデルを使用して試験され得る。

【0071】

いくつかの実施形態において、細胞培養アッセイから及び動物研究において得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲の処方において使用され得る。かかる化合物の投薬量は、好ましくはほとんどまたはまったく毒性を伴わないＥＤ５０を含む、血中循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。

【0072】

修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物の治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイからも推定され得る。代替的に、任意の特定の投薬量の効果は、好適なバイオアッセイによってモニタリングされ得る。

【0073】

治療の継続期間及び頻度に関して、治療がいつ治療利益を提供するかを決定するために対象をモニタリングすること、及び投薬量を増加もしくは減少させるか、投与頻度を増加もしくは減少させるか、治療を中止するか、治療を再開するか、または治療レジメンへ他の変更を行うかを決定することは、熟練した臨床医にとっては典型的である。投薬スケジュールは、多数の臨床的因子に依存して、１週間１回から毎日まで変動し得る。所望される用量は、一度で投与されるか、またはサブ用量（例えば２～４のサブ用量）へと分割され、ある期間にわたって（例えばその日を通して適切な間隔で、または他の適切なスケジュールで）投与され得る。かかるサブ用量は、単位投薬形態として投与され得る。いくつかの実施形態において、投与は、長期である（例えば数週間または数か月の期間にわたって毎日の１回または複数回の用量）。投薬スケジュールの例は、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月以上の期間にわたって、毎日、１日２回、１日３回、または１日４回以上の投与である。

【0074】

本発明の他の態様において、方法は、ＮＫＴ細胞の単離された集団の使用を提供する。本発明の一実施形態において、本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞の単離された集団は、治療を必要とする対象（例えばがんを有するかまたはがんを発症するリスクがある対象）の中への移植における使用のための医薬組成物の産生のために使用され得る。例としては、メラノーマまたは膵臓癌の有る対象が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞の単離された集団は、自己由来及び／または同種異系であり得る。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物であり、他の実施形態において、哺乳動物はヒトである。

【0075】

本発明の一実施形態は、有効量の本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物を、がんの有る対象へ投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法に関する。他の実施形態は、有効量の本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物を、腫瘍の有る対象へ投与することを含む、対象における腫瘍を治療する方法に関する。

【0076】

いくつかの実施形態において、本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞は、第２の治療的処置（例えば化学療法、放射線、免疫抑制剤（シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６等）、抗体、または他の免疫アブレーション剤（ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、サイトトキシン、フルダルビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び／または照射等））と併用して、がんを有する対象へ投与される。

【0077】

いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、化学療法剤（フルダラビン、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド等）または抗体（ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨ等）のいずれかを使用して、骨髄移植、Ｔ細胞アブレーション療法と併用して（例えばその前に、それと同時に、及び／またはそれに続いて）、患者へ投与される。別の実施形態において、修飾されたＮＫＴは、Ｂ細胞アブレーション療法（ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサン等）に続いて投与される。例えば、一実施形態において、対象は、高用量化学療法による標準治療に続いて末梢血液幹細胞移植を受け得る。ある特定の実施形態において、移植に続いて、対象は、増幅した修飾されたＮＫＴ細胞の注入を受け得る。追加の実施形態において、増幅した細胞は、手術の前に及び／または手術に続いて投与され得る。

【0078】

がんまたは腫瘍の治療において、修飾されたＮＫＴ細胞は、本明細書において記載される障害または病態の治療において有用な化学療法薬または抗新生物性化合物または放射線療法等の他の異なる細胞傷害剤（例えば化学療法薬または抗新生物性化合物）と共に任意選択で投与され得る。他の化合物は、修飾されたＮＫＴ細胞の投与の前に、それと同時に、及び／またはその後に投与され得る。本明細書において使用される時、「同時に」という単語は、併用する効果を生ずるのに十分に時間的に近接することを意味する（すなわち、同時には、一斉であり得るか、または互いの前または後に起こる２つ以上の投与であり得る）。

【0079】

本明細書において使用される時、「放射線療法」という語句は、外部的に適用される供給源（ビーム等）からまたは小型放射性線源の植え込みによってのいずれかで照射されるＸ線またはγ線を包含するがこれらに限定されない。

【0080】

本明細書において記載される修飾されたＮＫＴ細胞により投与され得る好適な化学療法剤の非限定例としては、ダウノマイシン、シスプラチン、ベラパミル、シトシンアラビノシド、アミノプテリン、デモコルシン（ｄｅｍｏｃｏｌｃｉｎｅ）、タモキシフェン、アクチノマイシンＤ、アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、及びトリアゼンが限定されずに挙げられる）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、及びテモゾロマイド；抗代謝物質（葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、及びアデノシンデアミナーゼ阻害物質が限定されずに挙げられる）：メトトレキサート、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、ならびにゲムシタビン、天然産物及びそれらの誘導体（例えばビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、及びエピポドフィロトキシン）：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アラ－Ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルはＴａｘｏｌ（登録商標）として商業的に入手可能である）、ミトラマイシン、デオキシコ－ホルマイシン、マイトマイシンＣ、Ｌ－アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ－ａ）、エトポシド、及びテニポシドが挙げられる。他の抗増殖性細胞傷害剤は、ナベルベン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ－１１、アナストラゾール、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、レロキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イホサミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、及びドロロキサフィン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）である。追加の抗増殖性細胞傷害剤としては、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎ）、イダトレキサート（ｉｄａｔｒｅｘａｔｅ）、トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ－アスパラギナーゼ、カンプトテシン、トポテカン、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、及びインターロイキンが挙げられるがこれらに限定されない。好ましいクラスの抗増殖性細胞傷害剤は、ＥＧＦＲ阻害物質、Ｈｅｒ－２阻害物質、ＣＤＫ阻害物質、及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）である（例えば米国特許第６，５３７，９８８号；同第６，４２０，３７７号を参照）。かかる化合物は、その投与について現在知られている技法に従って与えられ得る。

【0081】

いくつかの実施形態において、本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞は、任意の生理学的に許容される賦形剤で投与され得、修飾されたＮＫＴ細胞は、複製、分裂増殖、及び／または生着に適切な部位を見出し得る。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞は、注射、カテーテル、または同種のものによって導入され得る。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞は、液体窒素温度で凍結され、長期間保存され得、融解して使用することが可能である。凍結されたならば、修飾されたＮＫＴ細胞は、通常１０％のＤＭＳＯ、５０％のＦＣＳ、４０％のＲＰＭＩ １６４０培地中で保存されるだろう。一旦融解されたならば、細胞は、ＮＫＴ細胞の培養と関連する増殖因子及び／またはフィーダー細胞の使用によって増幅され得る。

【0082】

いくつかの実施形態において、本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞は、ヒト投与のために十分に滅菌済みの条件下で調製された等張賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給され得る。医用製剤における一般的原理については、読者は、Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ｂｙ Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ ＆ Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６；及びＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ ＆ Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００を参照されたい。本明細書において開示される修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物の細胞性賦形剤及び任意の付随要素の選択は、投与のために使用される経路及びデバイスに合わせて適合されるだろう。いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞を含む組成物は、修飾されたＮＫＴ細胞の生着または機能的可動化を容易にする１つまたは複数の他の成分も含み得るかまたは当該成分も付随し得る。好適な成分としては、修飾されたＮＫＴ細胞または相補的な細胞タイプの接着を支援または増進するマトリックスタンパク質が挙げられる。別の実施形態において、組成物は、再吸収性または生物分解性のマトリックススキャフォールドを含み得る。

【0083】

いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、個別の患者の臨床状態、投与の部位及び方法、投与のスケジューリング、患者の年齢、性別、体重、ならびに医療従事者に公知の他の因子を考慮に入れて、良質の医療のための原則に従って投与及び投薬され得る。本明細書における目的のための薬学的な「有効量」は、したがって、当技術分野において公知であるような考慮事項によって決定される。この量は、改善を達成するのに有効でなければならず、当該改善としては、生存率の改善もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは消失、及び当業者によって適切な尺度として選択される他の指標が挙げられるがこれらに限定されない。修飾されたＮＫＴ細胞は、以下の場所：クリニック、医院、救急部、病棟、集中治療室、手術室、カテーテル挿入室（ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｕｉｔｅ）、及び放射線室（ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃ ｓｕｉｔｅ）で対象へ投与され得る。

【0084】

他の実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、後の植え込み／注入のために保存される。修飾されたＮＫＴ細胞の一部分が後の適用のために保持され、一部が対象へ直ちに適用されるように、修飾されたＮＫＴ細胞は、２つ以上のアリコートまたは単位へと分割され得る。細胞バンクにおける細胞のすべてまたは一部の中～長期間の貯蔵も、本発明の範囲内であり、米国特許公開第２００３／００５４３３１号及び特許公開第ＷＯ ０３／０２４２１５号（それらの全体は参照することによって本明細書に援用される）中で開示される。プロセシングの終了時に、濃縮された細胞は、レシピエントへの配置のために送達デバイス（シリンジ等）の中へ当業者に公知の任意の手段によってロードされ得る。

【0085】

有効量のＮＫＴ細胞を含む医薬組成物も、本発明によって企図される。これらの組成物は、有効数の修飾されたＮＫＴ細胞を、任意選択で薬学的に許容される担体、添加物、または賦形剤と併用して含む。修飾されたＮＫＴ細胞の対象への全身投与は、ある特定の適応症において好ましいかもしれないが、腫瘍の部位でのまたは近接における直接投与は、他の適応症において好ましいかもしれない。

【0086】

いくつかの実施形態において、修飾されたＮＫＴ細胞は、所望される目的（対象への投与前の修飾されたＮＫＴ細胞の再構成または融解（もし凍結されたならば）等）のための書面による指示書を備えた好適な容器中で、任意選択でパッケージングされ得る。

【0087】

当業者は、本発明が、目的を実行し、言及された結果及び利点、そして本発明に固有のものを得るために良く適合することを容易に認識する。本明細書における記載の詳細及び実施例は、ある特定の実施形態を代表し、例示的であり、本発明の範囲に対する限定として意図されない。本明細書における修飾及び他の使用は、当業者に思い浮かぶだろう。これらの修飾は、本発明の趣旨内に網羅される。本発明の範囲及び趣旨から逸脱せずに、本明細書において開示される発明への変動する置換及び修飾が行われ得ることは、当業者に容易に明らかであろう。

【0088】

「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書において使用される時、明細書及び特許請求の範囲中で、相反することが明確に指摘されない限り、複数の指示物を包含するように理解されるべきである。群のうちの１つまたは複数のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または記載は、相反することが指摘されない限り、またはさもなければ文脈から明白ではない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つを超える、またはすべてが、所与の産物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはさもなければ関連しているならば、満たされていると判断される。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の産物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはさもなければ関連している実施形態を包含する。本発明は、群の１つを超えるメンバーまたはすべてのメンバーが、所与の産物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはさもなければ関連している実施形態も包含する。さらに、本発明は、すべての変動、組み合わせ、及び順列を提供することを理解すべきであり、ここで、リストされた請求項のうちの１つまたは複数からの１つまたは複数の限定、要素、条項、記述用語などは、別段の指示のない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当業者に明白でない限り、同じ基本請求項（または関連すれば、任意の他の請求項）に依存して、別の請求項の中へ導入される。本明細書において記載されるすべての実施形態は、適切な場合、本発明のすべての異なる態様へ適用可能であることが企図される。実施形態または態様のうちの任意のものは、適切な場合は常に、１つまたは複数の他のかかる実施形態または態様と自由に組み合わせられ得ることも企図される。要素が、例えばマーカッシュ群または類似のフォーマットでリストとして提示される場合、要素の各々の亜群も開示され、任意の要素（複数可）は群から除去され得ることが理解されるべきである。概して、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特色などを含むとして言及される場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、かかる要素、特色などからなるか、または本質的になることが理解されるべきである。単純性の目的のために、これらの実施形態は、すべての事例において、本明細書においてあまり多くの言葉で具体的には説明されてこなかった。特定の除外が明細書において列挙されるかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様は、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されるべきである。例えば、任意の１つまたは複数の活性剤、添加物、成分、任意選択の薬剤、生物体のタイプ、障害、対象、またはそれらの組み合わせが除外され得る。

【0089】

請求項または記載が物質の組成物に関する場合、別段指摘されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当業者に明白でない限り、本明細書において開示される方法のうちの任意のものに従って主題の組成物を作製または使用する方法、及び本明細書において開示される目的のうちの任意のもののために主題の組成物を使用する方法は、本発明の態様であることが理解されるべきである。請求項または記載が方法に関する場合、別段指摘されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当業者に明白でない限り、例えば方法の遂行のために有用な組成物を作製する方法、及び方法に従って産生された産物は、本発明の態様であることが理解されるべきである。

【0090】

範囲が本明細書において与えられる場合、本発明は、エンドポイントが含まれる実施形態、両方のエンドポイントが除外される実施形態、及び１つのエンドポイントが含まれ、他のエンドポイントが除外される実施形態を包含する。別段指摘されない限り、両方のエンドポイントが含まれていることが想定されるべきである。さらに、別段の指示のない限り、またはさもなければ文脈及び当業者の理解から明白ではない限り、範囲として表現される値は、別段文脈が明確に定めない限り、本発明の異なる実施形態において述べられた範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１までとり得ることを理解されたい。１シリーズの数値が本明細書において述べられる場合、本発明は、任意の間に入る値、または当該シリーズ中の任意の２つの値によって定義された範囲に相似して関連する実施形態を包含し、最小値は最小と見なされ得、最大値は最大として見なされ得ることも理解される。数値は、本明細書において使用される時、パーセンテージとして表現される値を含む。数値が「約」または「およそ」によって前置きされる本発明の任意の実施形態について、本発明は、正確な値が列挙される実施形態を包含する。数値が「約」または「およそ」によって前置きされない本発明の任意の実施形態について、本発明は、値が「約」または「およそ」によって前置きされる実施形態を包含する。

【0091】

本明細書において使用される時、Ａ及びＢが異なる請求項用語である「Ａ及び／またはＢ」は、概して、Ａ、Ｂ、またはＡ及びＢの両方のうちの少なくとも１つを意味する。例えば、別の配列へ相補的である及び／またはハイブリダイズする１つの配列は、（ｉ）たとえ１つの配列が、すべて条件下で他の配列へ必ずしもハイブリダイズしなくても、他の配列へ相補的である、１つの配列、（ｉｉ）たとえ１つの配列が他の配列へ完全に相補的でなくても、他の配列へハイブリダイズする、１つの配列、及び（ｉｉｉ）他の配列へ相補的であり且つハイブリダイズする、配列を包含する。

【0092】

「およそ」または「約」は、概して、別段述べられない限り、またはそうでなければ文脈から明白でない限り（かかる数が、可能な値の１００％を許容されないほど越える場合を除いて）、いずれかの方向（その数を超えるかまたはそれ未満）において、１％の範囲内、またはいくつかの実施形態において、数の５％の範囲内、またはいくつかの実施形態において、数の１０％の範囲内に入る数を包含する。相反することが明確に指摘されない限り、２つ以上の行為を包含する本明細書において請求される任意の方法において、方法の行為の順序は、必ずしも方法の行為が列挙される順序に限定されないが、本発明は、順序がそのように限定された実施形態を包含することが理解されるべきである。別段指摘されない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書において記載される任意の産物または組成物は、「単離された」と判断され得ることも理解されるべきである。

【0093】

本明細書において使用される時、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明に必須である組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素（複数可）を参照して使用され、必須であるかどうかにかかわらず、不特定の要素の組み入れへのさらなる余地がある。

【0094】

本明細書において使用される時、「～から本質的になること」という用語は、所与の実施形態のために要求される要素を指す。当該用語は、本発明の実施形態の基本的且つ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響しない追加の要素の存在を許容する。

【0095】

「～からなること」という用語は、本明細書において記載される時、組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素を指し、実施形態のその記載中で列挙されない任意の要素を除外する。

【実施例】

【0096】

修飾されたＮＫＴ細胞は、図１Ａ中で概説された方法を介して任意選択で得られる。０日目、ＮＫＴ細胞を単離し；１～４日目、ＮＫＴ細胞の集団をＩＬ－２により増幅し；５日目、ＮＫＴ細胞を少なくとも１つのレトロウイルスベクターにより形質導入し；６～１３日目、ＮＫＴ細胞の集団をＩＬ－２により増幅し；１４日目、ＮＫＴ細胞を１つまたは複数の機能的アッセイを使用して査定する。５日目でのＮＫＴ細胞の形質導入は、１つまたは複数のレトロウイルスベクターにより生じる（図１Ｂ）。１つのレトロウイルスベクターはＳＦＧ（ｉ）ＧＦＰであり、第２のレトロウイルスベクターはＳＦＧ．ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰである。両方のベクターは、ＩＲＥＳ及びＧＦＰを含む。ＳＦＧ．ＩＬ１２（ｉ）ＧＲＰベクターは、柔軟なリンカーを介して接続されるＩＬ－１２のｐ４０サブユニット及びｐ３５サブユニットを含む。

【0097】

サイトカインを与えた後に、修飾されたＮＫＴ細胞を査定した。フローサイトメトリープロットにより、非形質導ＮＫＴ細胞（ＮＴ）、対照ＧＦＰベクター（ＧＦＰ）により形質導入されたＮＫＴ細胞、及びＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰベクターにより形質導入されたＮＫＴ細胞におけるＮＫＴ細胞純度、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとしてのＮＫＴ細胞形質導入効率、及びＣＤ６２Ｌ発現が示された（図１Ｃ～１Ｅ）。図１Ｅは、ＣＤ６２ＬがＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰにより形質導入されたＮＫＴ細胞において有意にアップレギュレートされることを明確に示す。

【0098】

ＮＫＴ細胞（ＮＴ細胞、ＧＦＰ ＮＫＴ細胞、及びＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰ ＮＫＴ細胞）によって産生されたＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－４を包含する様々なサイトカインを、測定及び定量した（図２Ａ）。ＮＫＴ細胞は、休止条件（非刺激）であったか、または活性化（抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体により処理）された。次いでマウスにＧＦＰ標識ＮＫＴ細胞またはＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰホタルルシフェラーゼ標識ＮＫＴ細胞を移植した異種移植ＮＳＧマウスモデルにおいて、ＮＫＴ細胞存続性を査定した（図２Ｃ）。マウスを、ＮＫＴ細胞注射後の０、２、４、及び７日目にＩＶＩＳキネティックマシンにより画像化し、次いで１０日目に安楽死させた。組織収集には、末梢血液、肝臓、及び脾臓を含めた。腫瘍の生物発光画像化（ＢＬＩ）が、０、２、４、及び７日目で、ＧＦＰマウス及びＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰマウスについて示された（図２Ｄ）。加えて、末梢血液、肝臓、及び脾臓におけるヒトＮＫＴ細胞の定量も、ＮＫＴ細胞注入の１０日後に収集したサンプルのために提供した（図２Ｅ）。

【0099】

ＮＫＴにおいてＩＬ－１２のトランスクリプトーム効果を完全に特徴付けるために、ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰ ＮＫＴ及びＧＦＰ ＮＫＴを、ＲＮＡＳｅｑの遂行によって比較した。ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰ ＮＫＴにおいてレトロウイルスベクターによって導入されたＩＬ－１２Ａ／Ｂの発現増加が観察された。追加で、ＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰ ＮＫＴとＧＦＰ ＮＫＴとの間でおよそ３８０の遺伝子の差次的発現が観察され（図２Ｂ）、ＨＡＶＲＣ２、ＳＥＬＬ、及びＩＦＮＧ、そして炎症誘発性遺伝子が挙げられる。加えて、ＧＦＰ ＮＫＴに比較して、ＣＤ６２Ｌの高発現が同定され、このことはインビボで高い増殖能を備えたヒトＮＫＴと合致する。さらに、ｉＴＣＲまたはＣＡＲを介する活性化後に、ＩＬ－１２ ＮＫＴが、対照ＮＫＴに比較して、より多くのＩＦＮ－ｇ、より少ないＩＬ－４を産生したので、ＩＬ－１２ ＮＫＴは炎症促進性表現型を獲得した。

【0100】

様々なレトロウイルスベクターを、ＣＡＲによるＮＫＴ細胞の形質導入について査定した。第１のレトロウイルスベクターは、ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＣＤ１９（ｉ）ＩＬ１２であり；第２のレトロウイルスベクターは、ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＧＤ２であり；第３のレトロウイルスベクターは、ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＧＤ２（ｉ）ＩＬ１２であり；第４のレトロウイルスベクターは、ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＧＤ２（ｉ）ＩＬ１２ＴＭであった（図３Ａ及び図５Ａ）。ＣＤ１９．ＣＡＲはｓｃＦｖ ＦＭＣ．６３を使用し、ＧＤ２．ＣＡＲは１Ａ７ ｓｃＦｖを使用した。代表的なフローサイトメトリープロットにより、培養の１０日目で査定された対照（ＮＴ）及びＣＡＲ形質導入ＮＫＴ細胞におけるＣＡＲ発現、そしてＣＤ６２Ｌ発現が示された（図３Ｂ～３Ｃ及び図５Ｂ～５Ｃ）。

【0101】

図３Ａからの上で考察した３つのＣＡＲレトロウイルスベクターにより形質導入されたＮＫＴ細胞を、ＣＨＬＡ－２２５（Ｅ：Ｔ＝１：１）と共培養した。残存する腫瘍細胞を収集し、抗ｉＴＣＲ（Ｖβ１１）及び抗ＧＤ２により染色してフローサイトメトリーによってそれぞれＮＫＴ細胞及び神経芽腫細胞を同定及び定量した（図４Ａ）。マウスに、２＊１０^６のＣＨＬＡ－２２５ホタルルシフェラーゼ標識神経芽腫腫瘍細胞を静脈内移植した。１０日後に、マウスに５＊１０^６のＣＡＲ＋ ＮＫＴ細胞を静脈内に与えた（図３Ａ中で記載されるように）。マウスをＩＶＩＳキネティックマシンにより毎週画像化し、８０日目に安楽死させた。サンプルを、末梢血液、肝臓、及び脾臓から収集した（図４Ｂ）。加えて、腫瘍ＢＬＩを、０、１４、２１、３５、５６、及び７９日目で提供し（図４Ｃ）、末梢血液、肝臓、及び脾臓におけるヒトＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ^＋ＣＤ４５^＋）の量を測定及びプロットした（図４Ｄ）。

【0102】

ＮＫＴ細胞を、図５Ａからの上で考察された３つのＣＡＲレトロウイルスベクターにより形質導入した。図５Ｂ中で示されるように、ＧＤ２ ＣＡＲ及び可溶性ＩＬ－１２をコードするレトロウイルスベクターにより形質導入されたＮＫＴ細胞に比較した場合に（ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＧＤ２（ｉ）ＩＬ１２；５２％）、ＧＤ２ ＣＡＲ及び膜結合ＩＬ－１２をコードするレトロウイルスベクターにより予想外に形質導入されたＮＫＴ細胞は、より大きいレベルのＧＤ２ ＣＡＲ発現（ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＧＤ２（ｉ）ＩＬ１２ＴＭ；７８％）を示した。図５Ａからの上で考察した３つのＣＡＲレトロウイルスベクターにより形質導入されたＮＫＴ細胞を、ＣＨＬＡ－２２５（Ｅ：Ｔ＝１：１）と共培養した。残存する腫瘍細胞を収集し、抗ｉＴＣＲ（Ｖβ１１）及び抗ＧＤ２により染色してフローサイトメトリーによってそれぞれＮＫＴ細胞及び神経芽腫細胞を同定及び定量した。図７Ａ中で示されるように、インビトロの腫瘍細胞への反復暴露に際して、膜結合ＩＬ－１２を備えたＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴは、可溶性ＩＬ－１２を発現するＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴと匹敵する細胞傷害性活性を示した。ＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴによるＩＦＮ－γ産生が、対照ＮＫＴ（ＮＴ）を超えたにもかかわらず、膜結合ＩＬ－１２を備えたＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴと可溶性ＩＬ－１２を備えたＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴとの間で、ＩＦＮ－γ産生のレベルにおける有意差はなかった（図７Ｂ）。予想されるように、可溶性ＩＬ－１２を発現するように修飾されたＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴは、ＮＴ及び膜結合ＩＬ－１２を備えたＧＤ２．ＣＡＲ ＮＫＴに比較した場合に、より大きいＩＬ－１２産生を示した（図７Ｂ）。図７Ｃ中で示されるように、ＧＤ２．ＣＡＲ（ｉ）ＩＬ１２ＴＭレトロウイルスベクターにより形質導入されたＮＫＴは、インビボで存続性を示した。マウスに、ＣＨＬＡ－２２５ホタルルシフェラーゼ標識された神経芽腫腫瘍細胞を静脈内移植するだろう。１０日後に、マウスにＣＡＲ＋ ＮＫＴ細胞を静脈内に与えるだろう（図５Ａ中で記載されるように）。マウスをＩＶＩＳキネティックマシンにより毎週画像化し、８０日目に安楽死させるだろう。サンプルを、末梢血液、肝臓、及び脾臓から収集するだろう。加えて、腫瘍ＢＬＩを、様々なポイントの時間で提供し、末梢血液、肝臓、及び脾臓におけるヒトＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ^＋ＣＤ４５^＋）の量は測定及びプロットするだろう。

【0103】

将来のマウスモデルは、上でならびに図３Ａ及び図５Ａ中で記載されるように、ＣＡＲレトロウイルスベクターにより形質導入されたＮＫＴ細胞の使用を包含し、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌの発現を低減または除去するようにさらに修飾されるだろう。ＣＤ６２Ｌの発現は、当業者に公知の任意の技法を使用して、低減または除去され得る。

【0104】

上記の実験からのデータに基づいて、驚いたことには、ＩＬ－１２が、長期間の存続性のためにＮＫＴをリプログラミングすることが見出された。加えて、ＮＫＴ細胞がＣＡＲを共発現するように形質導入された場合に、ＮＫＴは、予想外に腫瘍細胞を除去し、腫瘍の再攻撃からマウスを保護する長期間の能力を獲得し、ＩＬ－１２を発現するＮＫＴの長期間の存続をさらに示す。

【0105】

方法
細胞株。腫瘍細胞株ＣＨＬＡ－２２５を、３７℃で５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気において、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、１％のＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、）及び１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補足したＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）による培養中で維持した。ＣＨＬＡ－２２５細胞株に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＦＦｌｕｃ）をコードするＳＦＧγレトロウイルスベクターを形質導入した。細胞を連続２か月未満の間培養で維持し、その後は、元の増幅したバイアルからのアリコートを使用した。すべての腫瘍細胞株はルーチンに試験してマイコプラズマによる汚染を除外し、フローサイトメトリーによって腫瘍マーカーの発現を査定して同一性を確認した。

【0106】

レトロウイルスコンストラクト及びレトロウイルス上清の生成。レトロウイルス上清を、２９３Ｔ細胞の一過性のトランスフェクションによって調製し、これを使用してＮＫＴ（以下で述べるように単離した）を形質導入した。ＩＬ－１２のｐ４０サブユニット及びｐ３５サブユニットの配列を、ＮＣＢＩウェブサイトから得て、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ．からの記載された柔軟なリンカーと一緒にオーバーラップＰＣＲを介して連結させた（フォワードｐ４０：ＴＡＴＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧ（配列番号１）；リバースｐ４０：ＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣ（配列番号２）；フォワードｐ３５：ＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣ（配列番号３）；リバースｐ３５：ＧＡＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＴＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＴＣ（配列番号４））。ＩＬ－１２カセット全体を、ＩＲＥＳ及びＧＦＰを含有するＳＦＧレトロウイルスベクターの中へクローニングした。対照として、ＩＲＥＳ及びＧＦＰのみを含有するベクターＳＦＧを使用した。ＧＤ２特異的ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１４Ｇ２ａ）、ＣＤ８ａのスターク及び膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ｚ鎖をコードするカセットを、事前にＳＦＧバックボーン（ＧＤ２．ＣＡＲ）の中へクローニングした。次いでＩＬ－１２を、ＩＲＥＳエレメント（ＧＤ２．ＣＡＲ（ｉ）ＩＬ１２）によって分離されたＧＤ２．ＣＡＲカセット中でクローニングした。最終的に、選択された実験のために、ＧＤ２．ＣＡＲ（ｉ）ＩＬ１２ベクター中のｓｃＦｖ１４Ｇ２ａを、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ ＦＭＣ．６３）と交換して、ＣＤ１９．ＣＡＲ（ｉ）ＩＬ１２ベクターを得た。

【0107】

ＧＤ２．ＣＡＲ（ｉ）ＩＬ１２ＴＭコンストラクトを生成するために、終止コドンをｐ３５サブユニットの端部のＧＤ２．ＣＡＲ（ｉ）ＩＬ１２から除去し、ＣＤ８ａのスターク及び膜貫通ドメインを添加した。

【0108】

ＮＫＴ細胞の単離、形質導入、及びインビトロ増殖。健康なボランティア血液ドナーからのバフィーコートを、Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）から購入した。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）密度勾配遠心分離によって単離した。ＮＫＴを、抗ｉＮＫＴマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＰＢＭＣから精製した。ＮＫＴを、４５％のＣｌｉｃｋ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４５％のＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％のＬ－グルタミン（ｇｌｕｔａｍｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ）、及び１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）からなる完全培地中で培養した。ＮＫＴの選択に際して、陰性画分を、照射（４０Ｇｙ）後に、α－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ、１００ｎｇ／ｍＬ、Ｄｉａｇｎｏｃｉｎｅ ＬＬＣ）及びＩＬ－２（２００ＩＵ／ｍＬ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）の存在下において１０：１のＰＢＭＣ：ＮＫＴ比で、フィーダーとして使用した。ＮＫＴを、５日目にレトロネクチンコートプレートにおいて形質導入し、ＩＬ－２の存在下において１０日間さらに増幅させ、次いで機能的アッセイのために使用した。

【0109】

免疫表現型分析：ＮＫＴ細胞を、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＣＤ３（ＡＰＣ－Ｈ７、クローンＳＫ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＢＶ６０５、クローンＤＲＥＧ－５６）、ＣＤ４（ＰＥ－Ｃｙ７、クローンＳＫ３）、ＣＤ８（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、クローンＲＰＡ－Ｔ８ ７００）、及びＣＤ４５（ＡＰＣ）、ならびにＭｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃｈからのＩＬ－１２（ｐ７０、ＡＰＣ）及びＣＤ２１２（ＩＬ１２Ｒ ｂ２、ＡＰＣ）に対する抗体（Ａｂ）により染色した。腫瘍細胞を、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＧＤ２（ＰＥ）及びＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３、ＢＶ４２１、クローン７－５１７）に対するＡｂにより染色した。ＮＫＴの純度を、ＴＣＲ Ｖａ２４鎖について特異的なＰＥコンジュゲートＡｂ（抗ｉＮＫＴ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのクローン６Ｂ１１）またはＴＣＲβ１１鎖について特異的なＡｂ（ＦＩＴＣ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により細胞を染色することによって査定した。形質導入されたＮＫＴ細胞におけるＧＤ２．ＣＡＲ発現を検出するために、１４Ｇ２ａ．ｓｃＦｖについて特異的な１Ａ７抗イディオタイプｍＡｂ及びＰＥまたはＡＰＣコンジュゲートラット抗マウス二次ｍＡｂを使用した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。データ捕捉を、ＢＤ ＦＡＣＳ－Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩまたはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ上で遂行した。データ解析をＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより遂行した。

【0110】

ウエスタンブロット：タンパク質溶解物を、４％～１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で分離した。ポリフッ化ビニリデン膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上へのタンパク質転写後に、膜を、ＴＢＳ－Ｔ中の５％のスキムミルク中でブロッキングし、１％のミルクとＴＢＳ－Ｔ中で一次Ａｂ及び二次Ａｂによりインキュベーションした。以下のＡｂ：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからのα－Ｓｔａｔ４（Ｃ４６Ｂ１０、希釈１：１０００）及びα－ホスホ－Ｓｔａｔ４（Ｔｙｒ６９３、希釈１：１０００）；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚからのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートα－ＣＤ３ζ（希釈１：１０００）；Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＨＲＰコンジュゲート二次Ａｂ（ヤギ－α－ウサギ＃３２４６０、希釈１：５００）を使用した。一次Ａｂによるインキュベーションを４℃で一晩行った一方で、二次Ａｂによるインキュベーションを室温で１時間行った。膜を、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｍａｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔａｒｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）またはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりゲルステーション（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で顕色させた。

【0111】

ＥＬＩＳＡ：ＮＫＴ（５＊１０^５細胞／ウェル）を、抗ＣＤ３（１ｍｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び抗ＣＤ２８（１ｍｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりコーティングされた２４ウェルプレート中で培養した。コーティングされていないウェルを、陰性対照として使用した。上清を、共培養の各々のサイクルから培養の２４時間後に収集した。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、及びＩＬ－１２を、特異的なＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定した。

【0112】

反復共培養：ＮＫＴ（２．５＊１０^５細胞／ウェル）を、サイトカインの非存在下において、２４ウェルプレート中で１：１のＥ：Ｔ比でＣＨＬＡ－２２５と共培養した（サイクルＩ）。３日目に、すべての細胞を、２．５＊１０^５の神経芽腫細胞により前播種した新たなウェルの中へ移した（サイクルＩＩ）。６日目に、すべての細胞を、２．５＊１０^５の神経芽腫細胞により前播種した新たなウェルの中へ移した（サイクルＩＩＩ）。すべてのサイクルの終了時に、細胞を収集し、ＣＤ３またはＴＣＲβ１１及びＧＤ２またはＢ７－Ｈ３のｍＡｂについて染色して、ＮＫＴ及び腫瘍細胞をそれぞれ検出した。培養中に残存する腫瘍細胞の数を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、フローサイトメトリーによって数えた。

【0113】

異種神経芽腫モデル：インビボでのＮＫＴの存続を査定する実験において、メス及びオスのＮＳＧマウス（７～９週齢、ＵＮＣ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅから得た）に、尾部注射を介して５＊１０^６のＦＦｌｕｃ標識のＧＦＰ ＮＫＴまたはＩＬ１２（ｉ）ＧＦＰ ＮＫＴを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＮＫＴ存続性を、ＩＶＩＳキネティックインビボの画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、生物発光（ＢＬＩ；合計のフラックス、光子／秒）によって７日間モニタリングした。マウスを１０日目に安楽死させ、末梢血液を心臓及び脾臓から収集し、肝臓をセルストレーナー上で粉砕し、２ｍＬのＰＢＳにより洗浄した。末梢血液、脾臓、及び肝臓を分析して、ＮＫＴの存在［ＣＤ３（ＡＰＣ－Ｈ７、クローンＳＫ７）及びＣＤ４５（ＡＰＣ、クローン２Ｄ１）に対するＡｂにより染色された］をフローサイトメトリーによって検出して、ヒトＮＫＴのパーセンテージを数えた。ＮＫＴの抗腫瘍性活性をインビボで査定する実験において、メス及びオスのＮＳＧマウス（７～９週齢、ＵＮＣ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅから得た）に、尾部注射を介して２＊１０^６のＦＦｌｕｃ標識ＣＨＬＡ－２２５細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。腫瘍細胞注射の７日後に、マウスに、５＊１０^６のＣＡＲ．ＣＤ１９（ｉ）ＩＬ１２、ＣＡＲ．ＧＤ２、またはＣＡＲ．ＧＤ２（ｉ）のＩＬ１２が形質導入されたＮＫＴをｉ．ｖ．注入した。神経芽腫腫瘍増殖を、ＩＶＩＳキネティックインビボの画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、生物発光（ＢＬＩ；合計のフラックス、光子／秒）によって毎週モニタリングした。腫瘍増殖及び不快感の徴候のために、または実験を終了するために、あらかじめ決定したガイドラインに従ってマウスを屠殺した。マウスを安楽死させた場合に、末梢血液を心臓及び脾臓から収集し、肝臓をセルストレーナー上で粉砕し、２ｍＬのＰＢＳにより洗浄した。末梢血液、脾臓、及び肝臓を分析して、ＮＫＴの存在［ＣＤ３（ＡＰＣ－Ｈ７、クローンＳＫ７）及びＣＤ４５（ＡＰＣ、クローン２Ｄ１）に対するＡｂにより染色された］をフローサイトメトリーによって検出して、ヒトＮＫＴのパーセンテージを数えた。

【図1-1】

【図1-2】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図9】

【国際調査報告】