特表 2025-504722 修飾細胞及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-18

(54)【発明の名称】修飾細胞及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20250210BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250210BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20250210BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20250210BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20250210BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20250210BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250210BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20250210BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250210BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20250210BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20250210BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20250210BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20250210BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/12

C12N15/113 140Z

C07K14/705

C12N5/078

C12N15/85 Z

A61K35/17

A61P37/06

A61P35/00

A61P31/00

A61P9/00

A61P3/00

C12N5/0789

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024544543

(86)(22)【出願日】2023-01-20

(85)【翻訳文提出日】2024-07-25

(86)【国際出願番号】 CN2023073331

(87)【国際公開番号】W WO2023143443

(87)【国際公開日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2022/073625

(32)【優先日】2022-01-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522021985

【氏名又は名称】上海邦耀生物科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＢＲＬ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｃ．

【住所又は居所原語表記】Ｆｌｏｏｒ １， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １４ Ｎｏ． ３６９９， Ｙｕａｎｊｉａｎｇ Ｒｏａｄ， Ｍｉｎｈａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１１０９ ＣＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110002619

【氏名又は名称】弁理士法人ＰＯＲＴ

(72)【発明者】

【氏名】タン，ビンヘ

(72)【発明者】

【氏名】ドゥ，ビン

(72)【発明者】

【氏名】シ，シュジュアン

(72)【発明者】

【氏名】ザン，ジキン

(72)【発明者】

【氏名】リュウ，ミンヤオ

(72)【発明者】

【氏名】シ，ザイシ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA36

4C087ZB08

4C087ZB26

4C087ZB32

4C087ZC21

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045EA22

4H045EA28

4H045EA29

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、修飾免疫細胞、ＰＤ－Ｌ１変異体をコードするタンパク質、及びＰＤ－Ｌ１変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらを含む医薬組成物、及び、疾患の治療方法もまた提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾細胞又はその集団であって、前記修飾細胞は、未修飾の対応する細胞と比較して、
内因性阻害チェックポイント分子を欠損しており、かつ
前記欠損型内因性阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられている、
修飾細胞又はその集団。

【請求項2】

前記リガンドは、同族リガンドの変異体であり、前記同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下している、
ことを特徴とする、請求項１に記載の修飾細胞。

【請求項3】

修飾細胞又はその集団であって、前記修飾細胞は、阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられており、前記リガンドは、同族リガンドの変異体であり、前記同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下している、
ことを特徴とする、前記修飾細胞又はその集団。

【請求項4】

前記細胞は、前記リガンドに対応する阻害チェックポイント分子を欠損している、
請求項３に記載の修飾細胞。

【請求項5】

前記細胞は、
ａ）動物細胞若しくはヒト細胞であり、
ｂ）免疫細胞であり、
ｃ）幹細胞、若しくは、前記幹細胞から分化した細胞であり、
ｄ）移植に適しており、
ｅ）前記細胞に対する、意図するレシピエントに関して同種異系であり、又は
ｆ）これらの任意の組み合わせである、
先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項6】

ａ）前記細胞は免疫細胞であり、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、単核細胞、樹状細胞（ＤＣ細胞）、好中球、若しくはγδＴ細胞であり、又は
ｂ）前記細胞は、幹細胞、若しくは、前記幹細胞から分化した細胞であり、前記幹細胞は、造血前駆細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、マクロファージ前駆細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋細胞、胚幹細胞の細胞株、間葉系幹細胞、若しくはｉＰＳＣ細胞である、
請求項５に記載の修飾細胞。

【請求項7】

前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、サイトカイン誘発キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球からなる群から選択され、任意選択的に、活性化Ｔ細胞である、
請求項６に記載の修飾細胞。

【請求項8】

ａ）前記阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択され、かつ／又は
ｂ）前記リガンドは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＭＧＢ１、Ｃｅａｃａｍ－１、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、ＦＧＬ１、アデノシン、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエータ）、ＣＤ２８、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＭＨＣクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、及びＣＤ４７からなる群から選択される、
請求項１、２、又は４～７のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項9】

ａ）前記阻害チェックポイント分子はＰＤ－１であり、前記リガンドは、ＰＤ－Ｌ１若しくはその変異体、若しくは、ＰＤ－Ｌ２若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｂ）前記阻害チェックポイント分子はＴＩＭ３であり、前記リガンドは、ガレクチン９、ＨＭＧＢ１、Ｃｅａｃａｍ－１、若しくはホスファチジルセリン（ＰＳ）、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｃ）前記阻害チェックポイント分子はＬＡＧ－３であり、前記リガンドは、ガレクチン－３、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、若しくはＦＧＬ１、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｄ）前記阻害チェックポイント分子はＴＩＧＩＴであり、前記リガンドは、ＣＤ１５５、ＣＤ１１３、若しくはＣＤ１１２、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｅ）前記阻害チェックポイント分子は、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）であり、前記リガンドはアデノシンを含み、
ｆ）前記阻害チェックポイント分子はＢＴＬＡであり、前記リガンドは、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエータ）若しくはその機能的等価物を含み、
ｇ）前記阻害チェックポイント分子はＣＴＬＡ－４であり、前記リガンドはＣＤ２８若しくはその機能的等価物を含み、
ｈ）前記阻害チェックポイント分子は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）であり、前記リガンドは、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ以外の）、若しくはその機能的等価物を含み、
ｉ）前記阻害チェックポイント分子は、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子）であり、前記リガンドは、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｊ）前記阻害チェックポイント分子は、ＳＩＧＬＥＣ－７（シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン７、ＣＤ３２８）であり、前記リガンドは、シアロ糖タンパク質若しくはその機能的等価物を含み、又は
ｋ）前記阻害チェックポイント分子は、ＳＩＧＬＥＣ－９（ＣＤ３２９）であり、前記リガンドは、シアロ糖タンパク質若しくはその機能的等価物を含む、
請求項８に記載の修飾細胞。

【請求項10】

ａ）前記細胞はＴ細胞であり、前記阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択され、
ｂ）前記細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり、前記阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＫＩＲ、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択され、
ｃ）前記細胞は樹状細胞（ＤＣ細胞）であり、阻害チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、及びＴＤＯからなる群から選択され、又は
ｄ）前記細胞はマクロファージであり、前記阻害チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、及びＣＤ２４からなる群から選択される、
請求項８に記載の修飾細胞。

【請求項11】

前記変異体は、前記同族リガンドの、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている、
請求項２～１０のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項12】

前記変異体は、前記同族リガンドが免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、少なくとも１つの変異を含む、
請求項１１に記載の修飾細胞。

【請求項13】

前記少なくとも１つの変異は、置換、欠失、挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含む、
請求項１２に記載の修飾細胞。

【請求項14】

前記少なくとも１つの変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含む、
請求項１３に記載の修飾細胞。

【請求項15】

前記同族リガンドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、
請求項２～１４のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項16】

前記少なくとも１つの変異は、前記同族リガンドの前記細胞内ドメイン内、若しくは、前記同族リガンドの前記膜貫通ドメイン内、若しくは、前記同族リガンドの前記細胞外ドメイン内、又はこれらの任意の組み合わせにある、
請求項１５に記載の修飾細胞。

【請求項17】

前記変異体は、ＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体である、
請求項９～１６のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項18】

前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、前記細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）内、若しくは、前記膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）内、若しくは、前記細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）内、若しくは、前記細胞外ドメインと前記細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）内に、又は、これらの任意の組み合わせに、少なくとも１つの変異を含み、前記少なくとも１つの変異は、前記ＰＤ－Ｌ１が免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、
請求項１７に記載の修飾細胞。

【請求項19】

前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、ＰＤ－Ｌ１の前記細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の前記膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の前記細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）の少なくとも一部の欠失、若しくは、前記細胞外ドメインと前記細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）の少なくとも一部の欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む、
請求項１７又は１８に記載の修飾細胞。

【請求項20】

前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１、又は、配列番号１１と等しい長さの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含まない、
請求項１７～１９のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項21】

前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、
請求項１９に記載の修飾細胞。

【請求項22】

前記修飾細胞は、ａ）前記阻害チェックポイント分子のゲノム領域内の、コード配列若しくは調節配列内の第１の変異であって、前記第１の変異は、前記阻害チェックポイント分子の発現若しくは活性を低下させる、前記第１の変異、又は、ｂ）前記阻害チェックポイント分子のｍＲＮＡを標的とする、第１の干渉オリゴヌクレオチドであって、前記第１の干渉オリゴヌクレオチドは、前記阻害チェックポイント分子の発現を低下させる、前記第１の干渉オリゴヌクレオチド、ｃ）前記阻害チェックポイント分子の前記発現及び／若しくは活性を阻害する、導入されたタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子を含む、
請求項１～２、４～２１のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項23】

前記修飾細胞は、前記リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを含む、
先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項24】

前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、前記リガンドに対する前記コード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含む、
請求項２３に記載の修飾細胞。

【請求項25】

前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、前記リガンドに対する前記コード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含む、
請求項２３又は２４に記載の修飾細胞。

【請求項26】

前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又は発現ベクター、任意選択的に、ウイルス発現ベクターである、
請求項２４又は２５に記載の修飾細胞。

【請求項27】

前記修飾細胞には、前記リガンドの発現が導入されている、
先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項28】

前記細胞は、ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質、又はｂ）ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子、又はｃ）ａ）とｂ）の両方、を更に欠損している、
先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項29】

前記ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ、若しくはＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はこれらの任意の組み合わせを含み、任意選択的に、前記細胞は、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方を更に欠損している、
請求項２８に記載の修飾細胞。

【請求項30】

前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、又はこれらの任意の組み合わせを含み、任意選択的に、前記細胞は、ＨＬＡ－ＤＲを更に欠損している、
請求項２８～２９のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項31】

前記ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子はＣＩＩＴＡであり、任意選択的に、前記細胞は、ＣＩＩＴＡを欠損している、
請求項２８～３０のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項32】

前記細胞は、内因性ＴＣＲを更に欠損しており、任意選択的に、前記細胞は、Ｔ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、Ｔ細胞受容体β定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体β定常２（ＴＲＢＣ２）、又はこれらの任意の組み合わせを更に欠損している、
先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項33】

前記修飾細胞は、ａ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列の第２の変異であって、前記第２の変異は、前記ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現若しくは活性を低下させる、前記第２の変異、又は、ｂ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質のｍＲＮＡを標的とし、これにより、前記ＭＨＣクラスＩタンパク質の、中での発現を低下させる、第２の干渉オリゴヌクレオチドを含む、
請求項２８～３０のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項34】

前記修飾細胞は、ａ）前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列内の第３の変異であって、前記第３の変異は、前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）の発現若しくは活性を低下させる、前記第３の変異、又は、ｂ）前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）のｍＲＮＡを標的とし、これにより、前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）の、中での発現を低下させる、第３の干渉オリゴヌクレオチドを含む、
請求項２８～３１のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項35】

前記修飾細胞は、ａ）内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列内の第４の変異であって、前記第４の変異は、内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２の発現若しくは活性を低下させる、前記第４の変異、又は、ｂ）内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２のｍＲＮＡを標的とし、これにより、ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２の、中での発現を低下させる、第４の干渉オリゴヌクレオチドを含む、
請求項２８～３４のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項36】

前記第２の変異、若しくは前記第３の変異、若しくは前記第４の変異、又はこれらの任意の組み合わせは、遺伝子編集により導入される、
請求項３３～３５のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項37】

前記修飾細胞は修飾されており、又は、更に修飾されて、対象となるポリペプチドに対するコード配列を含む第２の外因性ポリヌクレオチドが導入され、任意選択的に、前記修飾細胞は、前記対象となるポリペプチドを発現する、
先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項38】

前記対象となるポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又は、組換えＴＣＲ、又は他の細胞表面受容体、又はリガンドを含む、
請求項３７に記載の修飾細胞。

【請求項39】

前記ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、更に任意選択的に、前記ＣＡＲは、共刺激シグナル領域を更に含む、
請求項３８に記載の修飾細胞。

【請求項40】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲシグナル伝達ドメインを含む、
請求項３９に記載の修飾細胞。

【請求項41】

前記組換えＴＣＲは、組換え抗原結合ドメインを含む、
請求項３８に記載の修飾細胞。

【請求項42】

前記修飾細胞は、修飾Ｔ細胞であり、任意選択的に、前記修飾Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体を更に欠損する、
請求項３７～４１のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項43】

前記ＣＡＲ又は前記組換えＴＣＲの前記抗原結合ドメインは、標的抗原、任意選択的に、標的細胞抗原に結合可能である、
請求項３７～４１のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項44】

前記標的細胞抗原は、腫瘍抗原、炎症関連抗原、自己免疫関連抗原、又は、感染体関連抗原を含む、
請求項４３に記載の修飾細胞。

【請求項45】

前記標的細胞抗原は、癌、自己免疫疾患、感染症、代謝性疾患、及び遺伝病からなる群から選択される疾患と関連している、
請求項４４に記載の修飾細胞。

【請求項46】

前記腫瘍抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ １７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、クローディン１８．２、ＣＳ－ｌ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、メソセリン、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、又はＲＯＲ１である、
請求項４４に記載の修飾細胞。

【請求項47】

前記細胞は、エクスビボで増殖する、
先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞。

【請求項48】

先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞の集団であって、前記修飾細胞の前記集団は、前記内因性阻害チェックポイント分子、及び、前記内因性阻害チェックポイント分子に対する前記リガンドの両方を発現する、対応する細胞、又は、自然細胞（即ち、自然免疫細胞）である、対応する細胞の、比較集団と比較して、
ａ）自己抑制の低下、
ｂ）エフェクター細胞機能の改善、並びに／又は
ｃ）細胞活性化及び／若しくは増殖の改善、
のうちの１つ以上の特徴を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞の集団。

【請求項49】

先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞の産生方法であって、
ａ）出発細胞を提供することと、
ｂ）前記出発細胞を修飾して、前記内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低減し、前記内因性阻害チェックポイント分子の前記リガンドの発現又は活性を増大させることにより、前記修飾細胞を得ることと、を含む、
方法。

【請求項50】

先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞の産生方法であって、
ａ）前記内因性阻害チェックポイント、及び、前記内因性阻害チェックポイント分子に対する前記リガンドを発現する出発細胞を提供することと、
ｂ）前記出発細胞を修飾して、前記内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させることにより、前記修飾細胞を得ることと、を含む、
方法。

【請求項51】

先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞の産生方法であって、
ａ）前記内因性阻害チェックポイント分子を欠損する出発細胞を提供することと、
ｂ）前記出発細胞を修飾して、前記内因性阻害チェックポイント分子に対する前記リガンドの発現又は活性を増大させることにより、前記修飾細胞を得ることと、を含む、
方法。

【請求項52】

前記出発細胞を修飾して、前記内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させるステップは、
ａ）前記出発細胞に、前記阻害チェックポイント分子のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列に対する第１の変異を導入することにより、前記阻害チェックポイント分子が、前記出発細胞内で発現の低下若しくは活性の低下を引き起こすようにすること、又は
ｂ）前記出発細胞に、前記阻害チェックポイント分子のｍＲＮＡを標的とする第１の干渉オリゴヌクレオチドを導入することにより、前記阻害チェックポイント分子が、前記出発細胞内で発現の低下を引き起こすようにすることを含む、
請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記第１の変異は、遺伝子編集により導入される、
請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記遺伝子編集は、
ａ）前記細胞に、ｉ）配列標的化タンパク質、又は、前記配列標的化タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、ｉｉ）前記コード配列内の標的配列、又は、前記阻害チェックポイント分子のゲノム領域内の調節配列に相補的なオリゴヌクレオチドを導入することを含む、
請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記配列標的化タンパク質は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ、任意選択的にＣａｓ９を含む、
請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記オリゴヌクレオチドは、前記標的配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を含む、
請求項５４又は５５に記載の方法。

【請求項57】

前記出発細胞を修飾して、前記阻害チェックポイント分子の前記リガンドの発現又は活性を増大させるステップは、
ａ）前記出発細胞に、前記リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを導入することにより、前記出発細胞からの前記リガンドの発現を引き起こすこと、
ｂ）１つ以上の抑制転写因子をノックアウト若しくはノックダウンすること、
ｃ）前記リガンドをコードする遺伝子の発現のために、１つ以上の調節配列を編集すること、又は
ｄ）前記リガンドをコードする遺伝子をノックインすること、を含む、
請求項４９～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、前記リガンドに対する前記コード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含む、
請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、発現ベクター、任意選択的にレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクターである、
請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記発現ベクターは、ウイルス発現ベクター、任意選択的にレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、
請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記出発細胞は、自然細胞若しくは分化細胞、又は、自然細胞若しくは分化細胞から遺伝子組換えされた、組換え細胞である、
請求項４９～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記分化細胞は、幹細胞から分化している、
請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記幹細胞は、造血前駆細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、マクロファージ前駆細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋細胞、胚幹細胞の細胞株、間葉系幹細胞、若しくはｉＰＳＣ細胞である、
請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

請求項１～４８のいずれか１項に記載の修飾細胞と、薬学的に許容される媒体と、を含む、
医薬組成物。

【請求項65】

請求項１～４８のいずれか１項に記載の修飾細胞を含む、
キット。

【請求項66】

必要とする対象における状態又は疾患の治療方法であって、
前記対象に、治療有効量の、請求項１～４８のいずれか１項に記載の修飾細胞を投与することを含む、
方法。

【請求項67】

前記対象は、癌、自己免疫疾患、感染症、加齢、代謝性疾患、及び心臓血管疾患から選択される疾患を有する、
請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

ＰＤ－Ｌ１変異体を含むタンパク質であって、前記変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１と比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下している、
ことを特徴とする、タンパク質。

【請求項69】

前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１の、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている、
請求項６８に記載のタンパク質。

【請求項70】

前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、少なくとも１つの変異を含む、
請求項６８に記載のタンパク質。

【請求項71】

前記少なくとも１つの変異は、置換、欠失、挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含む、
請求項７０に記載のタンパク質。

【請求項72】

前記少なくとも１つの変異は、ＰＤ－Ｌ１の細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）内、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）内、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）内、若しくは、細胞外ドメインと細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）内、又はこれらの任意の組み合わせにある、
請求項７１に記載のタンパク質。

【請求項73】

前記少なくとも１つの変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含む、
請求項７０～７２のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項74】

前記欠失は、ＰＤ－Ｌ１の前記細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の前記膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の前記細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）の少なくとも一部の欠失、若しくは、前記細胞外ドメインと前記細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）の少なくとも一部の欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む、
請求項７３に記載のタンパク質。

【請求項75】

前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１、又は、配列番号１１と等しい長さの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号１１のアミノ酸配列を含まない、
請求項７４に記載のタンパク質。

【請求項76】

前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、
請求項７５に記載のタンパク質。

【請求項77】

前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、任意選択的に、リンカーを介して、対象となるポリペプチドに連結される、
請求項６８～７６のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項78】

前記リンカーは切断可能である、請求項７７に記載のタンパク質。

【請求項79】

前記対象となるポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組換えＴＣＲ、又は他の細胞表面受容体、又はリガンドを含む、
請求項７８に記載のタンパク質。

【請求項80】

前記タンパク質は、シグナルペプチドを更に含む、請求項７８に記載のタンパク質。

【請求項81】

請求項６８～８０のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項82】

請求項８１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項83】

請求項８２に記載の発現ベクターを含む、組換え細胞。

【請求項84】

請求項８３に記載の組換え細胞の産生方法であって、出発細胞に、請求項８２に記載の発現ベクターを、請求項８１に記載のポリヌクレオチドを前記細胞内で発現させるのに適した条件下で導入することを含む、
方法。

【請求項85】

請求項８４に記載の方法によりエクスビボで産生される、細胞集団。

【請求項86】

前記細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が、検出可能なレベルの、請求項６８～８０のいずれか１項に記載のタンパク質を発現する、
請求項８５に記載の細胞集団。

【請求項87】

免疫寛容が増大した組換え細胞の産生方法であって、前記細胞内で、請求項８１に記載ポリヌクレオチドを発現させるのに適した条件下で、前記細胞に、請求項８２に記載の発現ベクターを導入することにより、前記組換え細胞の免疫寛容を増大させることを含む、
方法。

【請求項88】

免疫拒絶のリスクを下げて、細胞を対象に移植する方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項８３に記載の組換え細胞の移植組織を、又は、請求項１～４７のいずれか１項に記載の修飾細胞を、前記対象に投与することを含み、前記組換え細胞又は修飾細胞は、前記対象に対して同種異系である、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、その医薬組成物、並びに、疾患を予防及び／又は処置するための、そのようなものの使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

自己由来の、患者由来のキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法は、いくつかの癌（例えば、血液癌）の処置において、顕著な有効性を示している。しかし、自己由来のＣＡＲ－Ｔ療法では、個別化された療法の必要性により、製造課題、及び、財政的負担が生じる。したがって、同種異系のＴ細胞又は「オフザシェルフ」Ｔ細胞を用い、自己由来生成物に対して同様の臨床的有効性プロファイルを有する、同種異系のＣＡＲ－Ｔ療法が注目されてきた。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

同種異系のＣＡＲ－Ｔ療法は、製品のコスト、及びロット毎のばらつきを下げる可能性があるが、同種異系の免疫細胞は、宿主免疫系による認識及び拒絶を受けやすい傾向にあり、それ故に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療有効性が損なわれる。更に、同種異系のＣＡＲ－Ｔ療法は、免疫抑制を更に被る可能性があり、これにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能及び細胞毒性が低下する可能性がある。したがって、エフェクター機能が増加し、免疫原性が低下した、新規の適応性細胞療法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0004】

一態様では、本開示は、修飾細胞又はその集団を提供し、修飾細胞は、未修飾の対応する細胞と比較して、内因性阻害チェックポイント分子を欠損しており、欠損型内因性阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられている。ある特定の実施形態では、リガンドは、同族リガンドの変異体であり、同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下していることを特徴とする。

【0005】

一態様では、本開示は、修飾細胞又はその集団を提供し、修飾細胞は、阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられており、リガンドは、同族リガンドの変異体であり、同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下していることを特徴とする。ある特定の実施形態では、細胞は、リガンドに対応する阻害チェックポイント分子を欠損している。

【0006】

いくつかの実施形態では、細胞は、ａ）動物細胞若しくはヒト細胞であり、ｂ）免疫細胞であり、ｃ）幹細胞、若しくは、幹細胞から分化した細胞であり、ｄ）移植に適しており、ｅ）細胞に対する、意図するレシピエントに関して同種異系であり、又は、ｆ）これらの任意の組み合わせである。

【0007】

いくつかの実施形態では、細胞は、ａ）免疫細胞であり、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、単核細胞、樹状細胞（ＤＣ細胞）、好中球、若しくはγδＴ細胞であり、又は、ｂ）細胞は、幹細胞、若しくは、幹細胞から分化した細胞であり、幹細胞は、造血前駆細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、マクロファージ前駆細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋細胞、胚幹細胞の細胞株、間葉系幹細胞、若しくはｉＰＳＣ細胞である。このような実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、サイトカイン誘発キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球からなる群から選択され、任意選択的に、活性化Ｔ細胞である。

【0008】

いくつかの実施形態では、ａ）阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択され、並びに／又は、ｂ）リガンドは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＭＧＢ１、Ｃｅａｃａｍ－１、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、ＦＧＬ１、アデノシン、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエータ）、ＣＤ２８、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＭＨＣクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、及びＣＤ４７からなる群から選択される。

【0009】

いくつかの実施形態では、ａ）阻害チェックポイント分子はＰＤ－１であり、リガンドは、ＰＤ－Ｌ１若しくはその変異体、若しくは、ＰＤ－Ｌ２若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、ｂ）阻害チェックポイント分子はＴＩＭ３であり、リガンドは、ガレクチン９、ＨＭＧＢ１、Ｃｅａｃａｍ－１、若しくはホスファチジルセリン（ＰＳ）、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、ｃ）阻害チェックポイント分子はＬＡＧ－３であり、リガンドは、ガレクチン－３、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、若しくはＦＧＬ１、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、ｄ）阻害チェックポイント分子はＴＩＧＩＴであり、リガンドは、ＣＤ１５５、ＣＤ１１３、若しくはＣＤ１１２、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、ｅ）阻害チェックポイント分子は、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）であり、リガンドはアデノシンを含み、ｆ）阻害チェックポイント分子はＢＴＬＡであり、リガンドはＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエータ）若しくはその機能的等価物を含み、ｇ）阻害チェックポイント分子はＣＴＬＡ－４であり、リガンドはＣＤ２８若しくはその機能的等価物を含み、ｈ）阻害チェックポイント分子は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）であり、リガンドは、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ以外の）、若しくはその機能的等価物を含み、ｉ）阻害チェックポイント分子は、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子）であり、リガンドは、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、ｊ）阻害チェックポイント分子はＳＩＧＬＥＣ－７（シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン７、ＣＤ３２８）であり、リガンドはシアロ糖タンパク質若しくはその機能的等価物を含み、又は、ｋ）阻害チェックポイント分子はＳＩＧＬＥＣ－９（ＣＤ３２９）であり、リガンドは、シアロ糖タンパク質若しくはその機能的等価物を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、ａ）細胞はＴ細胞であり、阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択され、ｂ）細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり、阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＫＩＲ、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択され、ｃ）細胞は樹状細胞（ＤＣ細胞）であり、阻害チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、及びＴＤＯからなる群から選択され、又は、ｄ）細胞はマクロファージであり、阻害チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、及びＣＤ２４からなる群から選択される。

【0011】

いくつかの実施形態では、変異体は、同族リガンドの、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている。いくつかの実施形態では、変異体は、同族リガンドが免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、置換、欠失、挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、同族リガンドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、同族リガンドの細胞内ドメイン内、若しくは、同族リガンドの膜貫通ドメイン内、若しくは、同族リガンドの細胞外ドメイン内、又はこれらの任意の組み合わせにある。

【0012】

いくつかの実施形態では、変異体は、ＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）内、若しくは、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）内、若しくは、細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）内、若しくは、細胞外ドメインと細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）内に、又は、これらの任意の組み合わせに、少なくとも１つの変異を含み、少なくとも１つの変異は、ＰＤ－Ｌ１が免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、ＰＤ－Ｌ１の細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）の少なくとも一部の欠失、若しくは、細胞外ドメインと細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）の少なくとも一部の欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１、又は、配列番号１１と等しい長さの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％同一のアミノ酸配列を含み、ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、修飾細胞は、ａ）阻害チェックポイント分子のゲノム領域内の、コード配列若しくは調節配列内の第１の変異であって、当該第１の変異は、阻害チェックポイント分子の発現若しくは活性を低下させる、上記第１の変異、又は、ｂ）阻害チェックポイント分子のｍＲＮＡを標的とする、第１の干渉オリゴヌクレオチドであって、当該第１の干渉オリゴヌクレオチドは、阻害チェックポイント分子の発現を低下させる、上記第１の干渉オリゴヌクレオチド、ｃ）阻害チェックポイント分子の発現及び／若しくは活性を阻害する、導入されたタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子、を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、修飾細胞は、リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを含む。このような実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、リガンドに対するコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含む。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、リガンドに対するコード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又は発現ベクターであり、任意選択的に、ウイルス発現ベクターである。

【0015】

いくつかの実施形態では、修飾細胞には、リガンドの発現が導入されている。いくつかの実施形態では、細胞は更に、ＭＨＣクラスＩタンパク質を欠損しているか、又は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子を欠損しているか、又は、これら両方を欠損している。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ、若しくはＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はこれらの任意の組み合わせを含み、任意選択的に、細胞は、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方を更に欠損している。ある特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、又はこれらの任意の組み合わせを含み、任意選択的に、細胞は、ＨＬＡ－ＤＲを更に欠損している。ある特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子はＣＩＩＴＡであり、任意選択的に、細胞は、ＣＩＩＴＡを欠損している。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＴＣＲを更に欠損しており、任意選択的に、細胞は、Ｔ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、Ｔ細胞受容体β定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体β定常２（ＴＲＢＣ２）、又はこれらの任意の組み合わせを更に欠損している。

【0016】

いくつかの実施形態では、修飾細胞は、ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列の第２の変異であって、当該第２の変異は、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現若しくは活性を低下させる、上記第２の変異、又は、ｂ）ＭＨＣクラスＩタンパク質のｍＲＮＡを標的とし、これにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質の、中での発現を低下させる、第２の干渉オリゴヌクレオチド、を含む。いくつかの実施形態では、修飾細胞は、ａ）ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列内の第３の変異であって、当該第３の変異は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）の発現若しくは活性を低下させる、上記第３の変異、又は、ｂ）ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）のｍＲＮＡを標的とし、これにより、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）の、中での発現を低下させる、第３の干渉オリゴヌクレオチド、を含む。いくつかの実施形態では、修飾細胞は、ａ）内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列内の第４の変異であって、当該第４の変異は、内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２の発現若しくは活性を低下させる、上記第４の変異、又は、ｂ）内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２のｍＲＮＡを標的とし、これにより、ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２の、中での発現を低下させる、第４の干渉オリゴヌクレオチド、を含む。ある特定の実施形態では、第２の変異、若しくは第３の変異、若しくは第４の変異、又はこれらの任意の組み合わせは、遺伝子編集により導入される。

【0017】

いくつかの実施形態では、修飾細胞は修飾されており、又は、更に修飾されて、対象となるポリペプチドに対するコード配列を含む第２の外因性ポリヌクレオチドが導入され、任意選択的に、修飾細胞は、対象となるポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又は、組換えＴＣＲ、又は他の細胞表面受容体、又はリガンドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、更に任意選択的に、ＣＡＲは、共刺激シグナル領域を更に含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、組換えＴＣＲは、組換え抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、修飾細胞は、修飾Ｔ細胞であり、任意選択的に、修飾Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体を更に欠損する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ又は組換えＴＣＲの抗原結合ドメインは、標的抗原、任意選択的に、標的細胞抗原に結合可能である。いくつかの実施形態では、標的細胞抗原は、腫瘍抗原、炎症関連抗原、自己免疫関連抗原、又は、感染体関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞抗原は、癌、自己免疫疾患、感染症、代謝性疾患、及び遺伝病からなる群から選択される疾患と関連している。このような実施形態では、腫瘍抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ １７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、クローディン１８．２、ＣＳ－ｌ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、メソセリン、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、又はＲＯＲ１である。いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボで増殖する。

【0018】

別の態様では、本出願は、修飾細胞の集団であって、修飾細胞の集団は、内因性阻害チェックポイント分子、及び、内因性阻害チェックポイント分子に対するリガンドの両方を発現する、対応する細胞、又は、自然細胞（即ち、自然免疫細胞）である、対応する細胞の、比較集団と比較して、ａ）自己抑制の低下、ｂ）エフェクター細胞機能の改善、並びに／又は、ｃ）細胞活性化及び／若しくは増殖の改善のうちの１つ以上の特徴を有する、修飾細胞の集団について開示する。

【0019】

更に別の態様では、本出願は、ａ）出発細胞を提供することと、ｂ）出発細胞を修飾して、内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させ、内因性阻害チェックポイント分子のリガンドの発現又は活性を増大させることにより、修飾細胞を入手することと、を含む、本明細書で提供する修飾細胞の産生方法について開示する。

【0020】

更に別の態様では、本出願は、ａ）内因性阻害チェックポイント、及び、内因性阻害チェックポイント分子に対するリガンドを発現する出発細胞を提供することと、ｂ）出発細胞を修飾して、内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させることにより、修飾細胞を入手することと、を含む、本明細書で提供する修飾細胞の産生方法について開示する。

【0021】

更に別の態様では、本出願は、ａ）内因性阻害チェックポイント分子を欠損する出発細胞を提供することと、ｂ）出発細胞を修飾して、内因性阻害チェックポイント分子に対するリガンドの発現又は活性を増大させることにより、修飾細胞を入手することと、を含む、本明細書で提供する修飾細胞の産生方法について開示する。

【0022】

いくつかの実施形態では、出発細胞を修飾して、内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させるステップは、ａ）出発細胞の阻害チェックポイント分子のゲノム領域内のコード配列又は調節配列に第１の変異を導入することにより、阻害チェックポイント分子が、出発細胞内で発現の低下若しくは活性の低下を引き起こすようにすること、又は、ｂ）出発細胞に、阻害チェックポイント分子のｍＲＮＡを標的とする第１の干渉オリゴヌクレオチドを導入することにより、阻害チェックポイント分子が、出発細胞内で発現の低下を引き起こすようにすること、を含む。いくつかの実施形態では、第１の変異は、遺伝子編集により導入される。

【0023】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、ａ）細胞に、ｉ）配列標的化タンパク質、又は、それをコードするポリヌクレオチド、及び、ｉｉ）コード配列内の標的配列、又は、阻害チェックポイント分子のゲノム領域内の調節配列に相補的なオリゴヌクレオチドを導入すること、を含む。いくつかの実施形態では、配列標的化タンパク質は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ、任意選択的にＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、出発細胞を修飾して、阻害チェックポイント分子のリガンドの発現又は活性を増大させるステップは、ａ）出発細胞に、リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを導入することにより、出発細胞からのリガンドの発現を引き起こすこと、ｂ）１つ以上の抑制転写因子をノックアウト若しくはノックダウンすること、ｃ）リガンドをコードする遺伝子の発現のために、１つ以上の調節配列を編集すること、又は、ｄ）リガンドをコードする遺伝子をノックインすること、を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、リガンドに対するコード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、発現ベクター、任意選択的にレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクターである。このような実施形態では、発現ベクターは、ウイルス発現ベクター、任意選択的にレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。

【0025】

いくつかの実施形態では、出発細胞は、自然細胞若しくは分化細胞、又は、自然細胞若しくは分化細胞から遺伝子組換えされた、組換え細胞である。いくつかの実施形態では、分化細胞は、幹細胞から分化している。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血前駆細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、マクロファージ前駆細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋細胞、胚幹細胞の細胞株、間葉系幹細胞、若しくはｉＰＳＣ細胞である。

【0026】

更に別の態様では、本出願は、本明細書で提供する修飾細胞を含むキットについて開示する。

【0027】

更に別の態様では、本出願は、必要とする対象における状態又は疾患の治療方法であって、上記対象に、治療有効量の、本明細書で提供する修飾細胞を投与することを含む、方法について開示する。このような実施形態では、対象は、癌、自己免疫疾患、感染症、加齢、代謝性疾患、及び心臓血管疾患から選択される疾患を有する。

【0028】

更に別の態様では、本出願は、ＰＤ－Ｌ１変異体を含むタンパク質について開示し、変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１と比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下していることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１の、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、置換、欠失、挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、ＰＤ－Ｌ１の細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）内、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）内、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）内、若しくは、細胞外ドメインと細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）内、又はこれらの任意の組み合わせにある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、欠失は、ＰＤ－Ｌ１の細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）の少なくとも一部の欠失、若しくは、細胞外ドメインと細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）の少なくとも一部の欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１、又は、配列番号１１と等しい長さの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号１１のアミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、任意選択的に、リンカーを介して、対象となるポリペプチドに連結される。このような実施形態では、リンカーは切断可能である。

【0030】

いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組換えＴＣＲ、又は他の細胞表面受容体、又はリガンドを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、シグナルペプチドを更に含む。

【0031】

更に別の態様では、本出願は、本明細書で開示するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0032】

更に別の態様では、本出願は、本明細書で開示するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

【0033】

更に別の態様では、本出願は、本明細書で開示する発現ベクターを含む組換え細胞を提供する。

【0034】

更に別の態様では、本出願は、出発細胞に、本明細書で提供する発現ベクターを、細胞内でポリヌクレオチドを発現させるのに適した条件下で導入することを含む、本明細書で提供する組換え細胞の産生方法を提供する。

【0035】

更に別の態様では、本出願は、本明細書に記載される方法により、エクスビボで産生される細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が、検出可能なレベルの、本明細書で提供するタンパク質を発現する。

【0036】

更に別の態様では、本出願は、免疫寛容が増大した組換え細胞の産生方法であって、細胞内で、本明細書で提供するポリヌクレオチドを発現させるのに適した条件下で、細胞に、本明細書で提供する発現ベクターを導入することにより、組換え細胞の免疫寛容を増大させることを含む、方法を提供する。

【0037】

更に別の態様では、本出願は、免疫拒絶のリスクを下げて、細胞を対象に移植する方法であって、対象に、治療有効量の、本明細書で提供する組換え細胞の移植組織を、又は、本明細書で提供する修飾細胞を、対象に投与することを含み、組換え細胞又は修飾細胞は、対象に対して同種異系である、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1A】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現構築物の概略図を示す。

【図1B】ＣＡＲ発現構築物をレンチウイルスベクターに組み込む概略図を示す。

【図2】様々な量のウイルス（即ち、１μＬ／ウェル、１０μＬ／ウェル、２０μＬ／ウェル、３０μＬ／ウェル、又は５０μＬ／ウェル）で、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＴｒＰＤ－Ｌ１のレンチウイルス発現でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、フローサイトメトリーによって検出されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図3A】ＣＤ１９ ＣＡＲの発現を示す。

【図3B】ＴｒＰＤ－Ｌ１の発現を示す。これらは共に、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＴｒＰＤ－Ｌ１に対する発現カセットを含有するレンチウイルスをトランスフェクトした、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞内でのフローサイトメトリーにより検出される。

【図3C】フローサイトメトリーにより確認される、ＰＤ－Ｌ１ ＣＡＲＴにおける、ＣＤ１９－ＣＡＲ、及び完全長ｗｔＰＤ－Ｌ１の発現を示す。

【図4A】異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比における、２４時間（図４Ａ）のインキュベーション後の、ルシフェラーゼを発現する細胞（Ｒａｊｉ－Ｌｕｃｉ）における、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞の細胞溶解効果を示す。天然Ｔ細胞を対照として使用した。

【図4B】異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比における、４８時間（図４Ｂ）のインキュベーション後の、ルシフェラーゼを発現する細胞（Ｒａｊｉ－Ｌｕｃｉ）における、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞の細胞溶解効果を示す。天然Ｔ細胞を対照として使用した。

【図5A】２４時間の、ルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－Ｌｕｃｉ）によるインキュベーション後の、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞からの、ＴＮＦα（図５Ａ）の放出を示す。

【図5B】２４時間の、ルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－Ｌｕｃｉ）によるインキュベーション後の、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞からの、ＩＦＮγ（図５Ｂ）の放出を示す。

【図6】プラスミドｐＥＬＰＳの概略図を示す。

【図7】ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及び組換えＰＤ－１による処理後の、ＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞における、ｐ－Ｐ３８及びｐ－ＡＫＴのレベルを示す。

【図8】組換えＰＤ－１及び組換えＰＤ－Ｌ１の存在下で、ＰＤ－１がノックアウトされ、ＴｒＰＤ－Ｌ１を発現する、又は、ＰＤ－１がノックアウトされ、ＰＤ－Ｌ１を発現する、又は、ＰＤ－１及びＴｒＰＤ－Ｌ１を発現する、又は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１を発現するＴ細胞の、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる活性化後の、Ｔ活性化を示す、ＦＡＣＳの結果を示す。

【図9A】ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ－Ｔ細胞、及び、ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を示す。

【図9B】ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ－Ｔ、及びＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞における、サイトカインＩＦＮγ放出を誘導する活性を示す。

【図10-1】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-2】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-3】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-4】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-5】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-6】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-7】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-8】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-9】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-10】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-11】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-12】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-13】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-14】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-15】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-16】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【図10-17】本開示で開示される配列のいくつかを示す。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本発明の以下の説明は、本発明の様々な実施形態を単に示すためのものである。そのため、論ずる特定の変更が、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。本発明の範囲を逸脱することなく、様々な等価物、変化、及び変更を加えることができることが、当業者には明らかとなり、このような等価な実施形態は、本明細書に含まれることができることが理解される。公報、特許、及び特許出願を含む、本明細書で列挙される全ての参考文献は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

【0040】

本開示の様々な技術的特徴が、単独の実施形態に記載されるものの、特徴は、個別に、及び／又は、任意の好適な組み合わせでもまた提供することができる。逆に、本開示の様々な技術的特徴は、明確性のため、別個の実施形態で本明細書に記載され、これらの特徴のいずれかは、単独の実施形態でもまた実装可能である。

【0041】

定義
本明細書で使用される場合、用語又は技術用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定を意図するものではない。

【0042】

単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、１つ以上の細胞を意味し、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本明細書で開示する、及び／又は、当業者に周知の、等価なステップ及び方法などへの言及を含む。同様に、「又は」という語句は、文脈が明確に別の意味を示さない限り、「及び」を含むことを意図する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び物質を、本開示の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び物質を以下に記載する。略語の「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語の「ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ」に由来し、本明細書では、非限定例を示すために用いられる。したがって、略語「例えば（ｅ．ｇ．）］は、用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。

【0043】

本出願において、一連の数値が列挙される場合は全て、列挙される数値のいずれかが、数値の範囲の上限又は下限であり得ることと理解することができる。本発明は、このような数の範囲、即ち、上限数値及び下限数値の組み合わせを有する範囲を全て包含し、上限及び下限のそれぞれに対する数値が、本明細書で引用される任意の数値であることができることと、更に理解することができる。本明細書で提供する範囲は、当該範囲内の全ての値を含むことと理解することができる。例えば、１～１０は、値１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０、並びに、必要に応じて分数値の全てを含むことと理解される。同様に、「少なくとも」により定められる範囲は、提供されるより低い値、及び全てのより高い数を含むものと理解される。

【0044】

本明細書で使用される場合、「約」とは、平均の３標準偏差以内、又は特定の技術において許容される標準範囲内を含むものと理解される。ある特定の実施形態では、約とは、０．５以下の変動を含むものと理解される。

【0045】

「含む」という用語は、「を含むがこれらに限定されない」という語句を意味するように本明細書で用いられ、この語句と同じ意味で用いられる。同様の、「など」という用語は、「限定されるものではないが、例えば」という語句を意味するように本明細書で用いられ、この語句と同じ意味で用いられる。

【0046】

本明細書で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法又は組成物にとって不可欠である、組成物、方法、及び、対応するその構成要素を指して用いられ、なおかつ、不可欠であるか否かに関係なく、明記されていない要素を包含する余地がある。

【0047】

「からなる」という用語は、本明細書に記載する組成物、方法、及び、対応するその構成要素を意味し、実施形態の当該記載で列挙されないあらゆる要素を排除する。

【0048】

「作動可能に連結する」、又は「作動可能に連結した」という用語は、スペーサー又はリンカーの有無にかかわらず、２つ以上の、対象となる生物学的配列が、目的の方法で機能することを可能にする関係となるように、、並置されることを意味する。タンパク質に関して使用される場合、タンパク質配列が、連結した生成物に、目的の生物学的機能を付与することを可能にするように連結されることを意味することが意図される。この用語はまた、ポリヌクレオチドに関しても用いることができる。例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結される場合、ポリヌクレオチド配列が、タポリヌクレオチドからのタンパク質の発現の制御を可能にするように連結されることを意味することを目的としている。

【0049】

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において同じ意味で用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する自然に存在するアミノ酸の人工キメラ模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに、自然に存在するアミノ酸ポリマー及び自然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。

【0050】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」、「核酸」、又は「ポリヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチド（即ち、短いポリヌクレオチド）を含む。これらはまた、合成、及び／又は自然に存在しない核酸分子（例えば、ヌクレオチド類似体、又は修飾主鎖残基若しくは結合を含む）を意味する。この用語はまた、一本鎖又は二本鎖の形態のいずれかにおける、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを意味する。この用語は、自然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸を包含する。この用語は、合成骨格を有する核酸に似た構造もまた包含する。特に示さない限り、特定のポリヌクレオチド配列はまた、明示された配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば縮重コドン置換）、アレル、オーソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を産生させることによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５～２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１～９８（１９９４）を参照されたい）。

【0051】

「パーセント（％）配列同一性」とは、配列をアラインし、かつ必要に応じてギャップを導入し、最大数の同一アミノ酸（又は、核酸）を達成した後の、参照配列内のアミノ酸（又は、核酸）残基と同一の候補配列内における、アミノ酸（又は、核酸）残基の割合として定義される。言い換えれば、アミノ酸配列（又は、核酸配列）のパーセント配列同一性は、比較されている参照配列と同一のアミノ酸残基（又は、塩基）の数を、候補配列中、又は参照配列中（いずれか短いほう）における、アミノ酸残基（又は、塩基）の総数によって除することにより計算することができる。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基とはみなされない。パーセントアミノ酸（又は、核酸）配列同一性を測定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３～４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９～３４０２（１９９７）もまた参照されたい）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイトで入手可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３～４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７－８（２００７）もまた参照されたい）、及び、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、一般に入手可能なツールを用いて達成することができる。当業者は、ツールにより提供されるデフォルトのパラメーターを用いることができるか、又はパラメーターを、例えば、好適なアルゴリズムを選択することにより、アラインメントに適したパラメーターにカスタマイズすることができる。

【0052】

アミノ酸配列を言及しての「保存的置換」とは、アミノ酸残基を、同様の生理化学的性質を持つ側鎖を有する、異なるアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ）間で、中性の親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ）間で、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）間で、塩基性側鎖を有するアミノ酸間（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＡｒｇ）間で、又は芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅ）間で、行うことができる。当技術分野において周知のとおり、保存的置換は通常、タンパク質コンホメーション構造の顕著な変化を引き起こさず、故に、タンパク質の生物学的活性を保持することができる。

【0053】

本明細書で使用される場合、「機能的等価物」という用語は、アミノ酸配列、又は化学構造が異なる断片にもかかわらず、依然として、親分子の実質的な生物学的活性を維持している、親分子の様々な形態（変異体、、融合物、誘導体、及び模倣物など）を意味する。本明細書で使用される場合、「実質的な生物学的活性を維持する」という表現は、親分子の生物学的活性の、少なくとも一部（例えば、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満）、又は、全てを示すことを意味する。親タンパク質の機能的等価物は、組換え法又は化学合成により得られたものなどの、自然に存在する変異体形態と、自然に存在しない形態の両方を含むことができる。機能的等価物は、非天然アミノ酸残基を含有することができる。

【0054】

本明細書で使用される場合、「欠損」という用語は、活性又はレベルの不十分さを意味し、例えば、通常の活性若しくはレベルを下回っていること、又は、活性若しくはレベルが存在しない、若しくはゼロであることを挙げることができる。

【0055】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」という用語と同じ意味で用いることができる、「ＣＡＲ」という用語は、組換え受容体若しくは人工受容体、又はこれをコードするポリヌクレオチドを意味する。組換え受容体又は合成受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞外ドメインを含み、これらは互いに結合し、又は、互いに作動可能に連結され、免疫エフェクター細胞上で抗原に対する特異性を付与し、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ制限をバイパスする。

【0056】

「ＣＡＲ－Ｔ細胞」又は「ＣＡＲＴ細胞」という用語と同じ意味で用いられる、「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞表面上でＣＡＲを発現するように、（例えば、遺伝子組換えにより）組換えられている、Ｔ細胞又はその集団を意味する。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴヘルパーＣＤ４＋、及び／又はＴエフェクターＣＤ８＋細胞であることができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的抗原を発現する標的細胞に結合し、標的細胞に対して免疫反応を開始することができる。

【0057】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」という用語、又は「ＴＣＲ複合体」という用語と同じ意味で用いることができる「ＴＣＲ」という用語は、自然（若しくは、内因性）ＴＣＲ、又は組換えＴＣＲを意味する。ＴＣＲとは、通常、高度に可変性であり、１つのＣＤ３γ、１つのＣＤ３δ、並びに２つのＣＤ３ε及びＣＤ３ζ連鎖と複合体化した、α鎖及びβ鎖を含む、ジスルフィド結合した膜結合ヘテロ二量体のタンパク質複合体を意味する。α連鎖及びβ鎖のアミノ酸配列は、異なるＴ細胞間で変化する。α鎖及びβ鎖の膜貫通領域は、オープンバレル内のＣＤ３膜貫通領域によって囲まれている。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε分子の細胞内テールはそれぞれ、免疫受容体チロシン型活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）と呼ばれる単一の保存モチーフを含有し、これは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に重要であり、また、抗原ＭＨＣ複合体への結合時のシグナル形質導入を開始するのに重要である。

【0058】

本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ－Ｔ」という用語と同じ意味で用いられる、「Ｔ細胞受容体Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞表面上でＴＣＲを発現するように、生物学的方法（例えば、遺伝子組換え）によって組換えられている、Ｔ細胞又はその集団を意味する。ＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＴヘルパーＣＤ４＋、及び／又はＴエフェクターＣＤ８＋細胞であることができる。ＴＣＲ－Ｔは、ＭＨＣ結合細胞を識別し、免疫反応を開始させることができ、故に、標的細胞の細胞内標的を標的とすることができる。

【0059】

本明細書で使用される場合、「β－２－マイクログロブリン」という用語と互換的に用いられる「Ｂ２Ｍ」という用語は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の構成成分であるタンパク質を意味し、これは、免疫制御活性を保持する、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ６１７６９又はその変異体で記載されるアミノ酸配列を含む、又は、上述したタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。Ｂ２Ｍは、ＭＨＣクラスＩの、細胞表面での発現に、及びペプチド結合溝の安定性のために、必要である。ＭＨＣクラスＩ分子のほとんどは、Ｂ２Ｍが存在しない細胞表面では検出することができない。

【0060】

本明細書で使用される場合、「主要組織適合性複合体」という用語と互換的に用いられる「ＭＨＣ」という用語は、抗原として、細胞表面上に細胞内ペプチドを提示することができ、細胞表面上に存在する抗原と複合体を形成可能なタンパク質をコードする、タンパク質又はポリヌクレオチドを意味する。ＭＨＣと抗原の複合体は、ＴＣＲ、及びその共受容体と相互作用し、免疫応答（例えば、Ｔ細胞の活性化）を誘発することができる。ＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びＭＨＣクラスＩＩＩにカテゴライズすることができる。有核細胞及び血小板の全てにおいて発現するＭＨＣクラスＩ分子は、細胞内病原体（例えば、ウイルス及び細菌）に対する細胞免疫を支える。ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩと呼ばれ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＥ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇ分子を含む。一般に、マクロファージ、Ｂ細胞、及び樹状細胞においてのみ生じるＭＨＣクラスＩＩは、ある特定の条件下で、抗原の免疫寛容に対する免疫付与を媒介することができる。ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩＩは、ＨＬＡクラスＩＩと呼ばれる。ＭＨＣ（又は、ＨＬＡ）分子は、移植手順において、抗原としての役割を果たし、レシピエントにおいて免疫反応を惹起し、移植拒絶反応を引き起こすことができる（Ａｂｂａｓ ＡＢ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ ＡＨ（２００９）．「Ｃｈ．１０ Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ」．Ｂａｓｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ（３ｒｄ ｅｄ．）．Ｓａｕｎｄｅｒｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）．ＩＳＢＮ ９７８－１－４１６０－４６８８－２）。

【0061】

本明細書で使用される場合、「クラスＩＩ、主要組織適合性複合体、トランス活性化因子」という用語と互換的に用いられる「ＣＩＩＴＡ」という用語は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１２７３３３１．１若しくはその機能的断片に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を有しながら、依然として免疫制御活性を維持するアミノ酸配列を含むタンパク質を意味する、又は、上述したタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。ＣＩＩＴＡは、転写共活性化因子として分類され、これは、転写因子ＲＦＸ５を活性化することにより、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現を正に制御するように機能する。

【0062】

本明細書で使用される場合、免疫細胞に関する「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊機能、例えば、食細胞活性、細胞溶解活性、又はＴ細胞に対するサイトカインの分泌を含むヘルパー活性を意味する。

【0063】

本明細書で使用される場合、状態を「治療すること」、又は、状態の「治療」とは、状態を緩和すること、状態の開始若しくは進行速度を遅くすること、状態の進行リスクを軽減すること、状態と関連する症状の進行を予防する若しくは遅らせること、状態と関連する症状を軽減する若しくは終わらせること、状態の完全な若しくは部分的な退行を生み出すこと、状態を治癒すること、又は、これらのいくつかの組み合わせを含む。

【0064】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、当該タンパク質の発現をもたらすように、作動可能に挿入され得る、ビヒクルを意味する。ベクターを使用して、宿主細胞内で、ベクター運搬する遺伝エレメントの発現をもたらすように、宿主細胞の形質転換、形質導入、又はトランスフェクションを行うことができる。ベクターの例としては、プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；ラムダファージ又はＭ１３ファージなどのバクテリオファージ；及び動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして用いられる動物ウイルスのカテゴリーとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能エレメント、及びレポーター遺伝子を含む、発現を制御するための様々なエレメントを含有することができる。加えて、ベクターは、複製起点を含有することができる。ベクターは、限定されるものではないが、ウイルス粒子、リポソーム、又はタンパク質コーティングを含む、細胞への、ベクターの導入を補助するための物質もまた含むことができる。ベクターは、発現ベクター又はクローニングベクターであってもよい。本開示は、融合タンパク質をコードする、本明細書で提供する核酸配列、核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、及び、少なくとも１つの選択マーカーを含有するベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。ベクターの例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ラムダファージ、及びＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８－Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ－Ｈｙｇ－ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ－ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ．、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ ２．１、ｐＥＦ－１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ－Ｂｏｓなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という語句は、外因性ポリヌクレオチド及び／又はベクターが導入されている細胞を意味する。

【0066】

「薬学的に許容される」という用語は、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤、及び／又は塩が一般的に、化学的に、及び／又は、物理的に、配合物に含まれる他の成分と適合し、そのレシピエントと生理学的に適合することを示す。

【0067】

本明細書で使用される場合、「対象」、又は「個体」、又は「動物」、又は「患者」という用語は、疾患又は障害の診断、予後、軽減、予防。及び／又は処置を必要とする、哺乳類又は霊長類を含む、ヒト又は非ヒト動物を意味する。哺乳類対象には、ヒト、飼育動物、家畜、及び動物園、スポーツ、又は愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどが含まれる。

【0068】

Ｉ．概要
養子細胞療法は、自己由来細胞（即ち、レシピエント自身に由来する細胞）、又は同種異系細胞（即ち、レシピエントとは異なるドナーに由来する細胞）の、養子移植を伴う。例えば、免疫細胞、又はより具体的には、Ｔ細胞に、非常に治療上の関心が集まっている。免疫細胞又はＴ細胞をエクスビボで修飾し、細胞表面上でＣＡＲ又はＴＣＲを発現させ、ある特定の標的抗原を発現する標的細胞（例えば、癌細胞）に対して特異的な免疫応答を媒介させることができる。

【0069】

同種異系細胞は、オフザシェルフ細胞療法を上手くもたらすものと、臨床上の設定において非常に望まれている一方で、同種異系細胞はまた、同種異系細胞の表面で発現するＭＨＣクラスＩ分子の認識による、宿主の免疫系による拒絶が原因で、移植片対宿主拒絶反応（ＧＶＨＤ）のリスクとも関連している。

【0070】

加えて、治療用免疫細胞（ＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞など）は、治療用免疫細胞のエフェクター機能の低下、及び故に、治療効果の低下をもたらす免疫抑制を受ける可能性がある。免疫抑制は、例えば、これらの免疫細胞に存在するＰＤ－１などの免疫チェックポイントと、腫瘍細胞などの標的細胞で発現するＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイントリガンドとの相互作用により誘発されることができる。

【0071】

本発明は、一方では、同種異系のレシピエントからの、免疫が媒介する認識及び破壊を受けにくく、他方では、治療される標的細胞に対する望ましい治療効果（例えば、細胞毒性）を維持する修飾細胞を提供する。以下、本発明をより詳細に説明する。

【0072】

ＩＩ．修飾細胞
一態様では、本開示は、修飾細胞又はその集団を提供し、修飾細胞は、未修飾の対応する細胞と比較して、ｉ）内因性阻害チェックポイント分子を欠損しており、ｉｉ）欠損型内因性阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられている。ある特定の実施形態では、細胞は免疫細胞である。

【0073】

宿主免疫系からの免疫拒絶を軽減する、又は回避するために、同種異系免疫細胞を修飾して、発現したリガンドが、宿主免疫細胞に発現した阻害チェックポイント分子（例えば、ＰＤ－１）と相互作用することで、同種異系免疫細胞を、宿主免疫系による免疫拒絶から保護することができるように、阻害チェックポイント分子のリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１）を発現することができる。しかし、本発明者らによって、修飾した同種異系免疫細胞自体が、阻害チェックポイント分子（例えば、ＰＤ－１）を内因的に発現する場合、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）に存在する内因性阻害チェックポイント分子が、別の修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）に存在するそのリガンドと相互作用する可能性がある自己免疫抑制を、潜在的にもたらす可能性があることが、予想外に発見されている。したがって、本発明者らは、一方では、内因性阻害チェックポイント分子を欠損し、他方では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられた修飾細胞を想到した。このような修飾細胞は、本開示では、自己免疫抑制を抑制し、顕著に向上した治療効果を付与するのに有用であることが示されている。

【0074】

別の態様では、本開示は、阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられており、リガンドは、同族リガンドの変異体であり、変異体は、同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下していることを特徴とする、修飾細胞又はその集団を提供する。ある特定の実施形態では、変異体リガンドは、同族リガンドの、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている。

【0075】

同種異系細胞での、阻害チェックポイント分子の同族リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１）の発現は、免疫拒絶を避けるのに有用である可能性がある一方で、本発明者らによって、細胞（例えば、免疫細胞）での、このようなリガンドの発現は、おそらくは、同族リガンド固有の免疫阻害シグナル伝達ドメインによって、リガンドを発現する細胞での免疫抑制もまた誘発可能であることが、予想外に発見されている。阻害チェックポイント分子のある特定のリガンドは、膜貫通型タンパク質（例えば、ＰＤ－Ｌ１）であり、免疫阻害シグナル伝達を媒介することができる細胞質ドメインを含有することが、見出されている。宿主免疫細胞での、リガンドのその対応する阻害チェックポイント分子との相互作用の後で、リガンド自体もまた、リガンドを発現する細胞（例えば、免疫細胞）で免疫阻害シグナル伝達を媒介するように、活性化されることができる。したがって、本発明の別の態様は、同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下した変異体リガンドを発現するように組換えられ、故に、リガンドを発現する同種異系細胞での免疫抑制の可能性を著しく低減する、又は最小限に抑える、修飾細胞を提供する。

【0076】

更に別の態様では、本開示は、修飾細胞又はその集団を提供し、修飾細胞は、未修飾の対応する細胞と比較して、ｉ）内因性阻害チェックポイント分子を欠損しており、ｉｉ）欠損型内因性阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられており、リガンドは、同族リガンドの変異体であり、（例えば、同族リガンドの機能的な免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠く）同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下している。

【0077】

更に別の態様では、本開示は、修飾細胞又はその集団を提供し、修飾細胞は、阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられており、リガンドは、同族リガンドの変異体であり、同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下していることを特徴とし、細胞は、リガンドに対応阻害チェックポイント分子を欠損している。

【0078】

細胞に関して、本明細書で使用される場合、「修飾された」という用語は、細胞が、構造的又は機能的のいずれかに変化していることを意味する。例えば、細胞は、核酸、又は生物学的活性剤を導入することで修飾することができる。

【0079】

ある特定の実施形態では、修飾細胞は、動物細胞又はヒト細胞である。

【0080】

ある特定の実施形態では、修飾細胞は、免疫細胞、又は細胞溶解活性若しくはエフェクター機能などの細胞活性を保持するのが望ましい、任意の他の種類の細胞である。ある特定の実施形態では、修飾細胞は免疫細胞である。本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、活性化されると、標的抗原に対して免疫反応を誘発することができる細胞を意味する。例示的な免疫細胞としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、サイトカイン誘発キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞（例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞、又はＣＤ４を発現するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）））、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、単核細胞、樹状細胞、好中球、及びγδＴ細胞が挙げられる。

【0081】

免疫細胞は、免疫細胞が対象に存在する任意の場所、例えば、血液、臍帯血、胸腺、胸水、リンパ節、脾臓、脾臓組織、腫瘍、及び骨髄などから入手することができる。単離された免疫細胞は、直接組換え可能であるか、又は、一定期間（例えば、凍結により）保存することができる。

【0082】

ある特定の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、単核細胞、樹状細胞、好中球、若しくはγδＴ細胞であることができる。

【0083】

ある特定の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、サイトカイン誘発キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は活性化Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、当該技術分野において周知の様々な技術、例えば、アフェレーシスを用いて、対象から収集した血液から入手することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋ヘルパー及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が単離される。

【0084】

ある特定の実施形態では、修飾細胞は、幹細胞、又は幹細胞から分化した細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、そのゲノム内に１つ以上の遺伝子組換え（例えば、ヌクレオチド挿入、欠失、及び置換）を含む。遺伝子組換えは維持され、分化、増殖、継代、及び／又は移植後に誘導される細胞（例えば、本明細書で提供する組換え細胞）においても機能的なままである。幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）を組換え、組換え幹細胞を分化させて機能的な分化細胞を得る方法についての詳細の説明は、例えば、ＷＯ２０２１０１１９１９に見出すことができ、当該開示は、その全体が本明細書に組み込まれている。

【0085】

ある特定の実施形態では、幹細胞は、造血前駆細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、マクロファージ前駆細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋細胞、胚幹細胞の細胞株、間葉系幹細胞、若しくはｉＰＳＣ細胞である。

【0086】

ある特定の実施形態では、細胞は、移植に適している。細胞は、移植に有用な、又は宿主からの免疫拒絶を低減するのに望ましい、任意の種類の細胞であってもよい。

【0087】

一実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞は、対象、例えば、特定の疾患若しくは状態を有することが疑われる対象、特定の疾患若しくは状態に罹りやすい対象、又は、特定の疾患若しくは状態の治療を受ける予定の、受けている、若しくは受けた対象などのヒト対象から単離された細胞（例えば、免疫細胞）に由来することができる。ある特定の実施形態では、修飾細胞は、細胞（例えば、健常なボランティア、若しくは健常なドナーである対象から単離された免疫細胞）、又は血液バンクに由来する。したがって、本明細書で提供する修飾細胞は、目的の対象に対して自己由来又は同種異系であってもよい。

【0088】

ある特定の実施形態では、修飾細胞は、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）に対する、意図するレシピエントに関して同種異系である。

【0089】

ある特定の実施形態では、細胞は、エクスビボで増殖する。ある特定の実施形態では、細胞は、目的の対象への移植前に活性化される。ある特定の実施形態では、細胞は、ある特定のマーカー（例えば、ＣＤ３）の有無に対して濃縮される。

【0090】

ある特定の実施形態では、本開示は、上述した修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の集団を提供する。上述した修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の集団は、対応する細胞（例えば、対応する免疫細胞）の比較集団に対して、１）自己抑制の低下、２）エフェクター細胞機能の改善、並びに、３）細胞活性化及び／又は増殖の改善のうちの１つ以上の特徴を有する。

【0091】

一実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞は、同種異系環境において免疫原性が低下しており、また、抑制されていないエフェクター機能を維持する。

【0092】

ｉ）内因性阻害チェックポイント分子の欠損
ある特定の実施形態では、修飾細胞は、内因性阻害チェックポイント分子が欠損している。

【0093】

ある特定の実施形態では、修飾細胞は、未修飾の対応する細胞と比較して、内因性阻害チェックポイント分子が欠損している。本明細書で使用される場合、「対応する細胞」という用語は、細胞が、修飾細胞と同じ細胞型であることを意味する。対応する細胞は、修飾細胞と同じ個体から入手することができるか、又は異なる個体から入手することができる。本明細書で使用される場合、「未修飾」という用語とは、対応する細胞が、修飾細胞と同じ修飾を有しない、又は代わりに、修飾を全く有しないことを意味する。ある特定の実施形態では、未修飾の対応する細胞は、修飾細胞と同じ型で、修飾されていない天然又は自然細胞であってもよい。ある特定の実施形態では、未修飾の対応する細胞（例えば、対応する免疫細胞）は、内因性阻害チェックポイント分子を欠損している。ある特定の実施形態では、未修飾の対応する細胞は、自然免疫細胞である。

【0094】

本明細書で使用される場合、「阻害チェックポイント分子」という用語は、宿主の免疫系に阻害効果を有する免疫系の阻害性制御因子を意味する。免疫チェックポイント分子の活性化により、免疫反応、例えば、サイトカインの分泌、ＮＫ細胞の活性化、Ｔ細胞の増殖、及び抗体の産生などを阻害することができる。阻害チェックポイント分子は、そのような阻害チェックポイント分子の阻害性チェックポイントリガンドを発現する特定の癌細胞の免疫回避を媒介する。

【0095】

ある特定の実施形態では、阻害チェックポイント分子は、未修飾細胞に対して内因性である。タンパク質に対して本明細書で使用される「内因性」とは、タンパク質が、細胞内で自然に、又は天然に発現することを意味する。

【0096】

例示的な阻害チェックポイント分子としては、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0097】

「ＰＤ－１」とは、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）受容体の略語である。ヒトＰＤ－１の例示的な配列は、ヒトＰＤ－１タンパク質及びヒトＰＤ－１遺伝子を含む。より詳細な説明は、例えば、Ｐｈｉｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｊａｎｕａｒｙ １，２０１５）．「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：３９～４６に見出すことができる。

【0098】

「ＴＩＭ３」は、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３の略語であり、より詳細な説明は、例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，（Ａｕｇｕｓｔ １１，２０１０）．ＴＩＭ－３ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．３５０．ｐｐ．１～１５に見出すことができる。

【0099】

「ＴＩＧＩＴ」は、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体の略語であり、より詳細な説明は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，（Ｊａｎ ２００９）．「Ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＩＧＩＴ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ」．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（１）：４８～５７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．１６７４に見出すことができる。

【0100】

「ＬＡＧ３」は、リンパ球活性化遺伝子３の略語であり、より詳細な説明は、例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（Ｏｃｔｏｂｅｒ １，２００４）．「Ｒｏｌｅ ｏｆ ＬＡＧ－３ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ」．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２１（４）：：５０３－１３；Ｇｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １，２００７）．「ＬＡＧ－３ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｓｅｌｆ－ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍｓ」．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１７（１１）：３３８３－９２．に見出すことができる。

【0101】

「Ａ２ＡＲ」は、アデノシンＡ２Ａ受容体の略語であり、より詳細な説明は、例えば、Ｌｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，（Ａｐｒｉｌ ８，２０１５）．「Ａ２ａＲ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」．Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．１３：２６５－７２に見出すことができる。

【0102】

「ＢＴＬＡ」は、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーターの略語であり、「ＣＤ２７２」という用語と同じ意味で用いられ、より詳細な説明は、例えば、Ｄｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，（Ｊａｎｕａｒｙ １，２０１０）．「ＢＴＬＡ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｂｙ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ」．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２０（１）：１５７－６７．に見出すことができる。

【0103】

「ＣＴＬＡ－４」は、細胞毒性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４の略語であり、ＣＤ１５２とも呼ばれ、より詳細な説明は、例えば、Ｋｏｌａｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｊａｎｕａｒｙ １，２００９）．「ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２） ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ」．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．６０（１）：１２３－３２に見出すことができる。

【0104】

「ＩＤＯ１」及び「ＩＤＯ２」は、それぞれ、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ１、及びインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ２の略語であり、より詳細な説明は、例えば、Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １，２０１４）．「Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ」．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６３（７）：７２１－３５に見出すことができる。

【0105】

「ＴＤＯ」は、トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼの略語である。

【0106】

「ＫＩＲ」は、ナチュラルキラー細胞での、ＭＨＣクラスＩ分子に対する受容体である、キラー細胞免疫グロブリン様受容体の略語である。

【0107】

「ＮＯＸ２」は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートＮＡＤＰＨオキシダーゼアイソフォーム２の略語であり、より詳細な説明は、例えば、Ｍａｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｏｃｔｏｂｅｒ １，２０１８）．「ＮＯＸ２ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２４７（２）：１５１～１５４に見出すことができる。

【0108】

「ＶＩＳＴＡ」は、Ｔ細胞の活性化のＶドメインＩｇ抑制因子の略語であり、より詳細な説明は、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（Ｍａｒｃｈ １４，２０１１）．「ＶＩＳＴＡ，ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｌｉｇａｎｄ ｔｈａｔ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０８（３）：５７７－９２及びＬｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（Ａｐｒｉｌ １，２０１４）．「ＶＩＳＴＡ ｉｓ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ」．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７４（７）：１９２４－３２に見出すことができる。

【0109】

ＰＶＲ（ＣＤ１５５）は、ポリオウイルス受容体の略語であり、タンパク質のネクチン様ファミリーのメンバーである。ＰＶＲは、細胞外領域内での、免疫グロブリンドメインＶ、Ｃ１様ドメイン、及びＣ２ドメインの存在により定義される、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。

【0110】

「ＳＩＧＬＥＣ７」は、ＣＤ３２８とも示される、シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン７の略語である。「ＳＩＧＬＥＣ９」は、ＣＤ３２９とも示される、シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン９の略語であり、より詳細な説明は、例えば、Ｖａｒｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００７）．「Ｓｉｇｌｅｃｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ」．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．７（４）：２５５～２６６に見出すことができる。

【0111】

ある特定の実施形態では、阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択される。

【0112】

ある特定の実施形態では、細胞はＴ細胞であり、内因性阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択される。

【0113】

ある特定の実施形態では、細胞はＮＫ細胞であり、内因性阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＫＩＲ、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択される。

【0114】

ある特定の実施形態では、細胞はＤＣ細胞であり、内因性阻害チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、及びＴＤＯからなる群から選択される。

【0115】

ある特定の実施形態では、細胞はマクロファージであり、内因性阻害チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、及びＣＤ２４からなる群から選択される。

【0116】

本明細書で使用される場合、「欠損」という用語は、修飾細胞内の内因性阻害チェックポイント分子が、活性若しくはレベルが存在しない若しくはゼロであるか、又は未修飾の対応する細胞における活性若しくはレベルと比較して、通常の活性若しくはレベルを下回るいずれかであることを意味する。例えば、修飾細胞内の、内因性阻害チェックポイント分子の遺伝子を欠失又は変異させて、機能喪失表現型を付与することができる。別の例としては、内因性阻害チェックポイント分子は、修飾細胞内で、低下したレベルで、又は活性が低下した形態で発現することができる。内因性阻害チェックポイント分子のレベル及び／活性は、免疫組織化学法、ウェスタンブロット、免疫蛍光顕微鏡法、及び定量フローサイトメトリーなどの、当該技術分野において周知の様々な技術を用いて測定することができる。

【0117】

例えば、遺伝子編集により、内因性阻害チェックポイント分子の発現と干渉させることにより、又は内因性阻害チェックポイント分子若しくはそのコードｍＲＮＡの分解を促進することにより、任意の好適な方法を使用して細胞を修飾し、内因性阻害チェックポイント分子を欠損させることができる。ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、阻害チェックポイント分子のゲノム領域内の、コード配列又は調節配列内の第１の変異を含み、この変異は、阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させる。ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、阻害チェックポイント分子のｍＲＮＡを標的とする第１の干渉オリゴヌクレオチドを含み、干渉オリゴヌクレオチドは、阻害チェックポイント分子の発現を低下させる。ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、阻害チェックポイント分子の発現及び／又は活性を阻害する、導入されたタンパク質、ポリペプチド、又は低分子を含む。

【0118】

ある特定の実施形態では、阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１である。ある特定の実施形態では、修飾細胞は、内因性ＰＤ－１を欠損している。

【0119】

ＰＤ－１のレベルは、免疫組織化学法、ウェスタンブロット、免疫蛍光顕微鏡法、及び定量フローサイトメトリーなどの、当該技術分野において周知の方法により測定することができる。

【0120】

ＰＤ－１の活性（即ち、ＰＤ－１が媒介する免疫阻害）は、活性化版のＰＤ－１（例えば、ＰＤ－１阻害機能の送達に不可欠な、リン酸化Ｙ２４８を有するＰＤ－１などの、リン酸化ＰＤ－１（Ｋａｎｋａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤ－１－Ｙ２４８ ｉｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ＰＤ－１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｜（２０１９）９：１７２５２））の発現量を測定することにより、決定することができる。ＰＤ－１の活性はまた、グリコスフィンゴリピド濃縮マイクロドメイン１（ＰＡＧ）と関連するリン酸化リンタンパク質などの、免疫細胞内でのＰＤ－１の阻害機能に寄与する、ＰＤ－１の下流にある活性化版のタンパク質の発現量を測定することにより測定することができる（Ｍａｒｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＡＧ ｉｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ＰＤ－１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ，ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ＢＩＯＬＯＧＹ｜（２０２１）４：６７２）。

【0121】

ｉｉ）阻害チェックポイント分子のリガンドを発現させるための組換え
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞を組換えて、阻害チェックポイント分子のリガンドを発現させる。

【0122】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞を組換えて、本明細書で提供する欠損型内因性阻害チェックポイント分子のリガンドを発現させる。

【0123】

本明細書で使用される場合、阻害チェックポイント分子に関する「リガンド」という用語は、阻害チェックポイント分子に結合し、阻害チェックポイント分子を活性化して、免疫抑制効果を発揮することができる分子を意味する。ある特定の実施形態では、リガンドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む膜貫通型タンパク質を含む。

【0124】

リガンドは、阻害チェックポイント分子の同族リガンドであってもよく、又は代わりに、同族リガンドの変異体であってもよく、又は代わりに、阻害チェックポイント分子の任意のアゴニストであってもよい。本明細書で使用される場合、「同族リガンド」という用語は、タンパク質の内因性リガンド又は天然リガンドを意味する。

【0125】

任意の好適な方法を用いて、細胞を組換え、阻害チェックポイント分子のリガンドを発現させることができる。ある特定の実施形態では、修飾細胞は、リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、リガンドに対するコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含む。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、リガンドに対するコード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含む。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又は発現ベクター、任意選択的に、ウイルス発現ベクターである。

【0126】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）には、リガンドの発現が導入されている。本明細書で使用される場合、リガンドに関する「導入される発現」という用語は、リガンドに対する核酸（例えば、コード配列）を細胞に提供することによる、リガンドの発現を意味する。核酸は、細胞のゲノムに組み込まれてもよく、又は細胞に一過的に提供されてもよい。

【0127】

ある特定の実施形態では、リガンドは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＭＧＢ１、Ｃｅａｃａｍ－１、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、ＦＧＬ１、アデノシン、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエータ）、ＣＤ２８、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＭＨＣクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、及びＣＤ４７からなる群から選択される。これらのリガンドは、当該技術分野において周知であり、コード遺伝子は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、アメリカ国立医学図書館の遺伝子データベースなどの、公的なデータベースから、例えば、それぞれの遺伝子ＩＤ：ＰＤ－Ｌ１（遺伝子ＩＤ：２９１２６）、ＰＤ－Ｌ２（遺伝子ＩＤ：８０３８０）、ＨＭＧＢ１（遺伝子ＩＤ：３１４６）、Ｃｅａｃａｍ－１（遺伝子ＩＤ：６３４）、ＬＳＥＣｔｉｎ（遺伝子ＩＤ：３３９３９０）、ａ－シヌクレイン（遺伝子ＩＤ：６６２２）、ＦＧＬ１（遺伝子ＩＤ：２２６７）、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエータ）（遺伝子ＩＤ：８７６４）、ＣＤ２８（遺伝子ＩＤ：９４０）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）（遺伝子ＩＤ：８０３８１）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）（遺伝子ＩＤ：７９６７９）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）（遺伝子ＩＤ：５８１７）、ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ１１２（遺伝子ＩＤ：５８１９）、ＣＤ１１３（遺伝子ＩＤ：２５９４５）、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９（遺伝子ＩＤ：１６８５９）、ＣＤ２４（遺伝子ＩＤ：１００１３３９４１）、及びＣＤ４７（遺伝子ＩＤ：９６１）で入手可能である。

【0128】

ａ）発現されたリガンドは、欠損型内因性阻害チェックポイント分子と対形成される

【0129】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞は、内因性阻害チェックポイント分子を欠損しており、一方では、組換えられ、そのような内因性阻害チェックポイント分子のリガンドを発現する。換言すれば、欠損型阻害チェックポイント分子、及び発現されたリガンドが対形成される。

【0130】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子はＰＤ－１であり、発現されたリガンドは、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２、又は、その機能的等価物、若しくはその変異体のうちの少なくとも１つを含む。

【0131】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子はＴＩＭ３であり、発現されたリガンドは、ガレクチン９、ＨＭＧＢ１、Ｃｅａｃａｍ－１、若しくはホスファチジルセリン（ＰＳ）、又はＴＩＭ３に結合可能なその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含む。

【0132】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子はＬＡＧ－３であり、発現されたリガンドは、ガレクチン－３、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、若しくはＦＧＬ１、又はＬＡＧ－３に結合可能なその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含む。

【0133】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子はＴＩＧＩＴであり、発現されたリガンドは、ＣＤ１５５、ＣＤ１１３、若しくはＣＤ１１２、又はＴＩＧＩＴに結合可能なその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含む。

【0134】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子はアデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）であり、リガンドはアデノシンを含む。

【0135】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子はＢＴＬＡであり、発現されたリガンドは、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）、又はＢＴＬＡに結合可能なその機能的等価物を含む。

【0136】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子はＣＴＬＡ－４であり、発現されたリガンドは、ＣＤ２８、又はＣＴＬＡ４に結合可能なその機能的等価物を含む。

【0137】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）であり、発現したリガンドは、ＭＨＣクラスＩ、又はＫＩＲに結合可能なその機能的等価物を含む。

【0138】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子は、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子）であり、発現されたリガンドは、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２、又はＶＩＳＴＡに結合可能なその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含む。

【0139】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子は、シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン７（ＳＩＧＬＥＣ－７、ＣＤ３２８）であり、リガンドは、ＳＩＧＬＥＣ－７に結合可能なシアロ糖タンパク質又はその機能的等価物を含む。

【0140】

ある特定の実施形態では、欠損型内因性阻害チェックポイント分子はＳＩＧＬＥＣ－９（ＣＤ３２９）であり、リガンドは、ＳＩＧＬＥＣ－９に結合可能なシアロ糖タンパク質又はその機能的等価物を含む。

【0141】

ある特定の実施形態では、修飾細胞は、そのゲノムに、阻害チェックポイント分子のコード配列若しくは調節配列内の第１の変異、及び／又は阻害チェックポイント分子のリガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを含み、第１の変異は、阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させ、第１の外因性ポリヌクレオチドは、阻害チェックポイント分子のリガンドの導入された発現をもたらす。

【0142】

ある特定の実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の内因性阻害チェックポイント分子を、更に欠損している。

【0143】

ある特定の実施形態では、阻害チェックポイント分子がＰＤ－１である場合、リガンドは、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２、又は機能的等価物であってもよい。ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２、又は機能的等価物をＰＤ－１に結合させることによって、ホスファターゼ１及び２を含有するＳｒｃ相同性２ドメイン（ＳＨＰ－１／ＳＨＰ－２）が、ＰＤ－１のチロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）に動員され、これは、ＣＤ３ζ、ＰＫＣθ、及びＺＡＰ７０などのシグナル伝達キナーゼの脱リン酸化に繋がり、Ｔ細胞増殖の、全体的な阻害作用がもたらされる（Ｙｏｋｏｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １ ｆｏｒｍｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｉｃｒｏｃｌｕｓｔｅｒｓ ｔｈａｔ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＳＨＰ２．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０１２；２０９：１２０１－１７）。

【0144】

上述したリガンドは、リガンドの変異体のライブラリーを生成し、その阻害チェックポイント分子への結合親和性、加えて、変異体固有の免疫阻害シグナル伝達を試験することによりスクリーニングすることができる。阻害チェックポイント分子に対して高い結合親和性を維持するこれらの変異体は、依然として、固有の免疫阻害シグナル伝達の減少が、本開示の修飾細胞（例えば、免疫細胞）のリガンドとして選択されることを示す。固有の免疫阻害シグナル伝達は、当該技術分野において周知の様々な技術、例えば、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、ウェスタンブロットにより、又は細胞内のシグナル伝達タンパク質若しくはその修飾物の発現を検出することにより、測定することができる。

【0145】

ある特定の実施形態では、リガンドは、阻害チェックポイント分子を活性化可能な、分泌されたアゴニスト又は細胞表面アゴニストを含む。例えば、ＰＤ－１アゴニストは、ＰＤ－１が媒介する阻害性シグナル伝達を導入するために、ＰＤ－１に結合可能であり、それ故に、改変して、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の表面から放出されることができる、又は修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の表面に発現することができる。例示的なＰＤ－１アゴニストとしては、限定されるものではないが、計算により設計可能であり、ＰＤ－１と相互作用してＴ細胞の活性化を阻害することができる、ＰＤ－１結合タンパク質又はミニタンパク質が挙げられる（Ｃａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＰＤ－１ ａｇｏｎｉｓｔ．ＰＮＡＳ Ｊｕｌｙ ２０，２０２１ １１８（２９） ｅ２１０２１６４１１８）。タンパク質組換え技術、例えば、ＰＤ－１アゴニストを、膜貫通ドメイン、及び表面に結合している間に細胞表面の外側でＰＤ－１アゴニストを発現させるために必要な他のエレメントに融合させることにより、これらのＰＤ－１アゴニストを、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の表面に組換えることができる。

【0146】

ｂ）阻害チェックポイント分子のリガンドの変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供するリガンドは、内因性阻害チェックポイント分子の同族リガンドの変異体である。

【0147】

本明細書で使用される場合、リガンドの「変異体」という用語は、同族又は自然リガンドと異なるが相同であり、同族又は自然リガンドが結合パートナー（例えば、免疫チェックポイント分子）に結合する能力を実質的に維持しているタンパク質を意味する。変異体は、親ペプチドと、１つ以上のアミノ酸残基が異なっている場合がある。例えば、変異体は、親タンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の、保存的置換、欠失、又は挿入を有することができる。ある特定の実施形態では、変異体は、同族リガンドに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有しながら、実質的に、同族リガンドが、その結合パートナー（例えば、免疫チェックポイント分子）に結合する能力を維持する。。天然又は自然リガンド（例えば、自然ＰＤ－Ｌ１）の「変異体」は、自然に存在する、又は自然リガンドの、断片、変異体、融合物、又はこれらの任意の組み合わせを含む、異なる形態であってもよいが、これらに限定されない。変異体リガンドは、完全長の自然リガンドを含有しない。しかし、変異体は、自然リガンドの断片若しくは部分、又はこのような断片若しくは部分を含む融合タンパク質を含有することができる。変異体リガンドは、完全長の自然リガンドの変異形態、若しくは、自然リガンドの断片の変異形態、又はこのような変異形態を含む融合タンパク質もまた含むことができる。

【0148】

変異体リガンドは、同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下している。

【0149】

阻害チェックポイント分子の少なくともいくつかの同族リガンドは、免疫阻害シグナル伝達を媒介可能なシグナル伝達ドメインを有することが見出されている。同族リガンドの、その対応する阻害チェックポイント分子との相互作用に続いて、同族リガンド自体もまた、同族リガンドを発現する修飾細胞内で免疫阻害シグナル伝達を媒介するように活性化可能である。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、同族リガンドの免疫阻害シグナル伝達ドメインの変異又は欠失によって、リガンドを発現する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）での「バックシグナル伝達」が低減することが想到される。リガンドの、対応する阻害チェックポイント分子（例えば、レシピエントの免疫細胞に存在するもの）への結合の際に。これは、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）のエフェクター機能を損なう可能性のある修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）における阻害性シグナル伝達を低下させるのに役立ち得、したがって、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）のエフェクター機能を増加させることができる。

【0150】

ある特定の実施形態では、変異体リガンドは、同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達が低下している。ある特定の実施形態では、変異体の免疫阻害シグナル伝達は、同族リガンドの免疫阻害シグナル伝達の、通常、又は基準レベルを、実質的に下回る（例えば、少なくとも２０％下回る、少なくとも４０％下回る、少なくとも６０％下回る、又は少なくとも８０％下回る）ように低下している。

【0151】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞を組換えて、阻害チェックポイント分子のリガンドを発現させ、ここで、リガンドは、同族リガンドの変異体であり、同族リガンドの機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている。

【0152】

ある特定の実施形態では、変異体は、同族リガンドが免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、少なくとも１つの変異を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、置換、欠失、挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含む。

【0153】

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、少なくとも５０個のアミノ酸残基、又はそれ以上の欠失を含む。

【0154】

ある特定の実施形態では、同族リガンドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む膜貫通型タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、同族リガンドの細胞内ドメイン内、若しくは、同族リガンドの膜貫通ドメイン内、若しくは、同族リガンドの細胞外ドメイン内、又はこれらの任意の組み合わせにある。

【0155】

ある特定の実施形態では、免疫阻害シグナル伝達ドメインは、同族リガンドの細胞内ドメイン又は膜貫通ドメイン内に存在する。例えば、阻害チェックポイント分子のいくつかのリガンドは、膜貫通型タンパク質（例えば、ＰＤ－Ｌ１）であり、免疫阻害シグナル伝達を媒介することができる細胞質ドメインを含有することが、見出されている。

【0156】

ある特定の実施形態では、変異体は、免疫阻害性チェックポイント分子の同族リガンドの変異体であり、同族リガンドは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＭＨＣクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、及びＣＤ４７からなる群から選択され、変異体は、同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下しており、及び／又は対応する同族リガンドの機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている。

【0157】

細胞を、上述した方法を用いて、即ち、修飾細胞に、リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを導入することで、組換え、阻害チェックポイント分子の変異体リガンドを発現することができる。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、変異体リガンドに対するコード配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、変異体リガンドに対するコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含む。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、変異体リガンドに対するコード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含む。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又は発現ベクター、任意選択的に、ウイルス発現ベクターである。ある特定の実施形態では、修飾細胞は、変異体リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0158】

ｃ）ＰＤ－Ｌ１変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する阻害チェックポイント分子の変異体リガンドは、ＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体である。

【0159】

ＰＤ－Ｌ１は、約４０ｋＤａのサイズを有するＩ型膜貫通型タンパク質であり、ＩｇＶ様及びＩｇＣ様細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、並びに３０～３１個のアミノ酸で作製される短い細胞質テールで構成される。（Ｋｙｔｈｒｅｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＤ－Ｌ１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．７１，１８９～１９４（２０１８）； Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂ７－Ｈ１，ａ ｔｈｉｒｄ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ７ ｆａｍｉｌｙ，ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９９；５：１３６５－９； ａｎｄ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤ－Ｌ１： ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１６；２７：４０９－１６．）。ＰＤ－Ｌ１は、ヒトの染色体９の位置ｐ２４．１において見出されるＰＤＣＤＬ１遺伝子によりコードされる（ＮＣＢＩ ｇｅｎｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＣＤ２７４ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ｈｕｍａｎ）］－ｇｅｎｅ－ＮＣＢＩ．２０１７ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ ｇｅｎｅ（ａｃｃｅｓｓｅｄ ２９ Ｊｕｎ ２０１７）．）。ＰＤ－Ｌ１の完全長は、７つのエクソンによりコードされ、これは、そのシグナルペプチドを含む２９０個のアミノ酸のタンパク質に対応する。最近の研究は、ＰＤ－Ｌ１の関与によって、活性化の際に、ＰＤ－１の細胞内シグナル伝達に類似する細胞内シグナル伝達を誘発することで、Ｔ細胞アポトーシスが誘発されたことを見出し、これは、「バックシグナル伝達」と名付けられた（Ｂｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＤ－Ｌ１ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｅｌｆ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｜ ＶＯＬ ２１ ４４２ ｜ Ａｐｒｉｌ ２０２０ ｜ ４４２～４５４）。

【0160】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体は、安定して発現することができる。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体は、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下しているが、依然として、ＰＤ－１への結合能力、又はＰＤ－１に対する結合親和性を実質的に維持している。

【0161】

ＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体の結合能力及び／又は親和性は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーアッセイ、及び他の結合アッセイなどの、任意の好適なアッセイにより測定することができる。ある特定の実施形態では、結合能力及び／又は親和性は、フローサイトメトリーにより測定される。一般に、ＰＤ－Ｌ１発現細胞を、一定範囲の濃度の、ＰＤ－１発現細胞又は可溶性ＰＤ－Ｌ１（例えば、任意選択的に、Ｆｃが融合したＰＤ－１細胞外ドメイン）でインキュベートし、続いて、蛍光標識した二次抗体でインキュベートした後、蛍光シグナル強度を分析することができる。

【0162】

ＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体の免疫阻害シグナル伝達は、任意の好適なアッセイによって測定することができる。例えば、ＰＤ－１ノックアウト（ＰＤ－１^－／－）Ｔ細胞を組換え、ＰＤ－Ｌ１、又は本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１変異体を発現させることができ、得られた組換えＴ細胞を、ＰＤ－１発現細胞又は可溶性ＰＤ－１（例えば、任意選択的に、Ｆｃが融合したＰＤ－１細胞外ドメイン）でインキュベートし、続けて、Ｔ細胞の活性化又は増殖又は分化を検出することができる。組換えＴ細胞が完全長ＰＤ－Ｌ１を発現する場合、ＰＤ－１が関与することで、組換えＴ細胞の活性化又は増殖又は分化を阻害することができる一方で、本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１変異体を発現する組換えＴ細胞は、ＰＤ－１の関与によって、はるかに低い阻害を示す。

【0163】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体は、完全長野生型ＰＤ－Ｌ１の、免疫阻害シグナル伝達８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％又は５％以下の、免疫阻害シグナル伝達を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体は、検出不可能な免疫阻害シグナル伝達を有する。

【0164】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、上記自然ＰＤ－Ｌ１の、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２変異体は、上記自然ＰＤ－Ｌ２の、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、完全長ＰＤ－Ｌ１を含有しない。ＰＤ－Ｌ１変異体は、完全長の自然ＰＤ－Ｌ１を含有しない。ＰＤ－Ｌ２変異体は、完全長の自然ＰＤ－Ｌ２を含有しない。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、切断型自然ＰＤ－Ｌ１、又は、切断型変異体ＰＤ－Ｌ１を含む。ある特定の実施形態では、切断型変異体は、Ｃ末端切断型ＰＤ－Ｌ１を含む。

【0165】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１と比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、少なくとも１つの変異を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）内、若しくは膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）内、若しくは細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）内、又はこれらの任意の組み合わせに、少なくとも１つの変異を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）内に少なくとも１つの変異を含み、これは、ＰＤ－Ｌ１の２６０番目から２９０番目のアミノ酸残基までまたがり、少なくとも１つの変異は、２６８番目から２７１番目のアミノ酸残基にまたがるモチーフ内にある。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、ＰＤ－Ｌ１の２６８番目の残基、２６９番目の残基、２７０番目の残基、及び／又は２７１番目の残基において少なくとも１つの変異を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、細胞外ドメインと細胞内ドメインにまたがるドメイン、例えば、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなるドメイン内に、少なくとも１つの変異を含む。他の実施形態では、少なくとも１つの変異は、免疫阻害シグナル伝達の形質導入に関与する１つ以上のドメインの外に変異を含むが、依然として、免疫阻害シグナル伝達の形質導入を妨害する、構造上の変化をもたらす。

【0166】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、ＰＤ－Ｌ１の細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）の少なくとも一部の欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、細胞外ドメインと細胞内ドメインにまたがるドメイン、例えば、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなるドメインの少なくとも一部の欠失を含む。

【0167】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１の配列番号１のアミノ酸配列に対応する領域内に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、又は少なくとも３１個のアミノ酸残基の欠失を含む。

【0168】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１の、組換え細胞内ドメイン及び／又は組換え膜貫通ドメインは、配列番号２の位置１～２１にまたがる領域内に、自然ＰＤ－Ｌ１の配列番号２のアミノ酸配列に対応する領域内に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、又は少なくとも２１個のアミノ酸残基の欠失を含む。

【0169】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１の配列番号５のアミノ酸配列に対応する領域内に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、少なくとも５０個のアミノ酸残基、又は少なくとも５１個のアミノ酸残基の欠失を含む。

【0170】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、Ｃ末端欠失を有する、Ｃ末端切断型変異体である。

【0171】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体（例えば、Ｃ末端切断型変異体）は、自然ＰＤ－Ｌ１（例えば、配列番号１１）、又は、配列番号１１と等しい長さの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％同一のアミノ酸配列を含みながら、依然として、ＰＤ－１への結合能力を実質的に維持する。ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含まない。

【0172】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体（例えば、Ｃ末端切断型変異体）は、自然ＰＤ－Ｌ１（例えば、配列番号７）、又は、配列番号７と等しい長さの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％同一のアミノ酸配列を含みながら、依然として、ＰＤ－１への結合能力を実質的に維持する。

【0173】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、切断型ＰＤ－Ｌ１（例えば、Ｃ末端切断型ＰＤ－Ｌ１）を含む。切断型ＰＤ－Ｌ１は、切断版の自然ＰＤ－Ｌ１、又は切断版の変異体ＰＤ－Ｌ１であってもよい。ある特定の実施形態では、切断型ＰＤ－Ｌ１は、２７１アミノ酸残基未満、２７０アミノ酸残基未満、２６５アミノ酸残基未満、２６０アミノ酸残基未満、２５５個アミノ酸残基未満、２５０アミノ酸残基未満、２４５アミノ酸残基未満、２４０アミノ酸残基未満、２３５アミノ酸残基未満、２３０アミノ酸残基未満、２２５アミノ酸残基未満、２２０アミノ酸残基未満（例えば、２２０～２７２、２２０～２７１、２２０～２７０、２２０～２６９、２２０～２６８、２２０～２６７、２２０～２６５、２２０～２６４、２２０～２６３、２２０～２６２、２２０～２６１、２２０～２６０、２２０～２５９、２２０～２５８、２２０～２５７、２２０～２５６、２２０～２５５、２２０～２５４、２２０～２５３、２２０～２５２、２２０～２５１、２２０～２５０、２２０～２４９、２２０～２４８、２２０～２４７、２２０～２４６、２２０～２４５、２２０～２４４、２２０～２４３、２２０～２４２、２２０～２４１、２４１～２７２、２４１～２７１、２４１～２７０、２４１～２６９、２４１～２６８、２４１～２６７、２４１～２６５、２４１～２６４、２４１～２６３、２４１～２６２、２４１～２６１、２４１～２６０、２４１～２５９、２４１～２５８、２４１～２５７、２４１～２５６、２４１～２５５、２４１～２５４、２４１～２５３、２４１～２５２、２４１～２５１、２４１～２５０、２４１～２４９、２４１～２４８、２４１～２４７、２４１～２４６、２４１～２４５、２４１～２４４、２４１～２４３、２４１～２４２アミノ酸残基）の長さを有する。

【0174】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体のアミノ酸配列は配列番号７である。

【0175】

上述した方法を用いて、即ち、修飾細胞に、ＰＤ－Ｌ１変異体に対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを導入することで、細胞を組換え、ＰＤ－Ｌ１変異体を発現させることができる。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ＰＤ－Ｌ１変異体に対するコード配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ＰＤ－Ｌ１変異体に対するコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ＰＤ－Ｌ１変異体に対するコード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含む。ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又は発現ベクター、任意選択的に、ウイルス発現ベクターである。

【0176】

ある特定の実施形態では、修飾細胞は、ＰＤ－Ｌ１変異体に対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0177】

ｄ）ＰＤ－Ｌ１変異体をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む細胞
別個の態様では、本開示は、自然ＰＤ－Ｌ１と比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下したＰＤ－Ｌ１変異体を含むタンパク質を更に提供する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１の、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いている。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、少なくとも１つの変異を含む。他の態様のＰＤ－Ｌ１変異体は、上記のセクションで記載したものと同じである。

【0178】

ある特定の実施形態では、タンパク質は、対象となるポリペプチドに連結したＰＤ－Ｌ１変異体を含む。ある特定の実施形態では、対象となるポリペプチドは、細胞表面上に発現されてもよく、又は分泌されてもよい。ある特定の実施形態では、対象となるポリペプチドは、本明細書で提供する標的抗原（例えば、標的細胞抗原）に結合することができる。ある特定の実施形態では、対象となるポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又は組換えＴＣＲ、又は他の細胞表面受容体、又はリガンドである。対象となるポリペプチド、ＣＡＲ、及び組換えＴＣＲの更なる詳細は、以下に記載され、本明細書における実施形態に適用可能である。

【0179】

ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、リンカーを介して、対象となるポリペプチドに連結される。ある特定の実施形態では、リンカーは切断可能である。ある特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、自己切断ペプチド、例えば、２Ａペプチド、例えば、Ｐ２Ａ（例えば、配列番号１６）、Ｔ２Ａ、又はＦ２Ａである。ある特定の実施形態では、Ｐ２Ａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５のヌクレオチド配列を有する。

【0180】

ある特定の実施形態では、タンパク質は、シグナルペプチドを更に含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１変異体は、シグナルペプチドを更に含む。

【0181】

ある特定の実施形態では、タンパク質は、リンカー、任意選択的に、切断可能なリンカーに連結された、ＰＤ－Ｌ１変異体を含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、Ｐ２Ａに連結されたＰＤ－Ｌ１変異体を含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。

【0182】

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に提供する。ある特定の実施形態では、このようなポリヌクレオチドは、任意選択的に、同じタンパク質をコードするか、又は、少なくとも９０％、若しくは９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するタンパク質変異体をコードする、配列番号１３、１４、若しくは１８を含むヌクレオチド配列、又は、少なくとも５０％の配列同一性を有する、その相同配列を有する。

【0183】

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを更に提供する。

【0184】

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供する発現ベクターを含む組換え細胞を更に提供する。ある特定の実施形態では、組換え細胞は、動物細胞又はヒト細胞である。ある特定の実施形態では、組換え細胞は免疫細胞である。ある特定の実施形態では、組換え細胞は、幹細胞、又は幹細胞から分化した細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、移植に適している。ある特定の実施形態では、組換え細胞は、組換え細胞に対する、意図するレシピエントに関して同種異系である。

【0185】

別の態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体を発現するように組換えられた、組換え細胞又はその集団を提供する。

【0186】

別の態様では、本開示は、上述した方法により、エクスビボで産生される組換え細胞の集団もまた提供する。ある特定の実施形態では、細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が、検出可能なレベルの、本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１変異体を発現する。

【0187】

別の態様では、本開示は、同種異系宿主において免疫寛容が増大した組換え細胞の産生方法であって、細胞内で、本明細書で提供するポリヌクレオチドを発現させるのに適した条件下で、細胞に、本明細書で提供する発現ベクターを導入することにより、組換え細胞の免疫寛容を増大させることを含む、方法を提供する。本明細書で使用される場合、「免疫寛容」という用語は、同種異系宿主の免疫系による、組換え細胞の免疫拒絶を寛容する又は低減する能力を意味する。ある特定の実施形態では、組換え細胞は、ＭＨＣ Ｉクラスタンパク質（例えば、ＨＬＡクラスＩ）、及び／又はＭＨＣ ＩＩクラスタンパク質（例えば、ＨＬＡクラスＩタンパク質）若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）などの、抗原提示タンパク質を更に欠損している。

【0188】

ｉｉｉ）他の対象となるポリペプチドの発現
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）又はその集団は、対象となる別のポリペプチドを更に発現する。

【0189】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）若しくはその集団は修飾されているか、又は、更に修飾されて、対象となるポリペプチドに対するコード配列を含む第２の外因性ポリヌクレオチドが導入され、任意選択的に、修飾細胞は、対象となるポリペプチドを発現する。

【0190】

ある特定の実施形態では、対象となるポリペプチドは、上記細胞表面上に発現されてもよく、又は分泌されてもよい。ある特定の実施形態では、対象となるポリペプチドは、標的細胞抗原などの標的抗原に結合することができる。

【0191】

標的細胞抗原は、対象となる疾患又は状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーであってもよい。ある特定の実施形態では、標的細胞抗原は、腫瘍抗原、炎症関連抗原、又は、感染体関連抗原（例えば、ウイルス抗原）を含む。ある特定の実施形態では、標的細胞抗原は、癌、自己免疫疾患、又は感染症からなる群から選択される疾患と関連している。

【0192】

腫瘍抗原の例としては、限定されるものではないが、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ １７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、クローディン１８．２、ＣＳ－ｌ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、メソセリン、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、及びＲＯＲ１が挙げられる。

【0193】

任意の好適な方法を使用して細胞を組換え、対象となるポリペプチドを更に発現させることができる。ある特定の実施形態では、修飾細胞は、対象となる他のポリペプチドに対するコード配列を含む、第２の外因性ポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、第２の外因性ポリヌクレオチドは、対象となる他のポリペプチドに対するコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含む。ある特定の実施形態では、第２の外因性ポリヌクレオチドは、対象となる他のポリペプチドに対するコード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含む。ある特定の実施形態では、第２の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又は発現ベクター、任意選択的に、ウイルス発現ベクターである。

【0194】

ある特定の実施形態では、対象となる他のポリペプチドは、内因性阻害チェックポイント分子のリガンドと共発現する。ある特定の実施形態では、対象となる他のポリペプチドは、リガンド又は変異体リガンドとの融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、対象となる他のポリペプチドは、任意選択的に、リンカー、例えば、切断可能なリンカーを介して、内因性阻害チェックポイント分子のリガンド（又は、同族リガンドの変異体）に連結される。

【0195】

ある特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドである。２Ａペプチドは、１８～２２個のアミノ酸残基の長さを有するウイルスオリゴペプチドであり、真核細胞の翻訳中に、ポリペプチドの切断を媒介する。様々なウイルス２Ａペプチドは一般的に、それらが由来するウイルスから名付けられており、例えば、Ｆ２Ａは、手足口病ウイルスに由来し、Ｅ２Ａはウマ鼻炎Ａウイルスに由来し、Ｐ２Ａはブタテッショウウイルス－１ ２Ａに由来し、Ｔ２Ａは、ゾセア・アシグナウイルス２Ａに由来する（詳細については、Ｌｉｕ，Ｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌｕｍｅ ７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２１９３（２０１７）を参照されたい）。高度に保存された配列ＧＤＶＥＸＮＰＧＰ（配列番号６、配列中、Ｘは任意のアミノ酸残基であってもよい）は、Ｃ末端において異なる２Ａによって分かち合われており、立体障害及びリボソームスキッピングの生成に不可欠である。２Ａペプチドは、複数遺伝子の共発現のための、高レベルの下流タンパク質発現を誘導するのに有用であり、これらは、サイズが小さく、故に、共発現した遺伝子の機能に干渉するリスクが低い。２Ａペプチドは、ポリシストロニック及びバイシストロニック多重遺伝子発現に、上手く利用されている。ある特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、Ｐ２Ａ（例えば、配列番号１６）、Ｆ２Ａ（例えば、配列番号９、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）、Ｔ２Ａ（例えば、配列番号７１、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、及びＥ２Ａ（例えば、配列番号７２、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｐ２Ａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５のヌクレオチド配列を有する。

【0196】

このような実施形態では、第２の外因性ポリヌクレオチド及び第１の外因性ポリヌクレオチドは、内因性阻害チェックポイント分子の対象となるポリペプチド及びリガンド（例えば、同族リガンドの変異体）を含む融合タンパク質をコードする、１つの組み合わされたポリヌクレオチドである。組み合わされたポリヌクレオチドは、融合タンパク質に対するコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含み得る。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、組み合わされたポリヌクレオチドは、融合タンパク質に対するコード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含み得る。

【0197】

ある特定の実施形態では、対象となるポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又は組換えＴＣＲ、又は他の細胞表面受容体、又はリガンドである。

【0198】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ又は組換えＴＣＲは、上述した標的細胞表面抗原などの、標的細胞抗原に結合可能である。

【0199】

ある特定の実施形態では、修飾細胞は、修飾Ｔ細胞であり、任意選択的に、修飾Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体を更に欠損する。詳細は、以下のセクションでより詳細に説明される。

【0200】

ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合ドメインを、免疫細胞活性化のための１つ以上のシグナル伝達ドメインと組み合わせる、組換えキメラ受容体である。標的抗原に結合する際に、ＣＡＲは、修飾免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）での、抗原特異的細胞免疫活性を媒介することができ、このようなＣＡＲ発現免疫細胞が、標的抗原を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を排除することを可能にする。ＣＡＲにより媒介される細胞免疫活性としては、ＣＡＲ発現免疫細胞の増殖、細胞毒性因子、例えば、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシンの放出、並びに、標的細胞の細胞崩壊及び／又はアポトーシスの開始もまた挙げることができる。

【0201】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲシグナル伝達ドメインを含む。

【0202】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナル領域を更に含む。共刺激シグナル領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを、任意選択的に、適した長さ、例えば、２～１０アミノ酸などを有する、短いペプチドリンカー（例えば、グリシン－セリンダブレットリンカー）により、無作為に、又は、特定の順序で、互いに連結することができる。

【0203】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、標的抗原に対する抗体に由来する、１つ以上の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に用いられるのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトで使用するためには、ヒト抗体又はヒト化抗体に由来するＣＡＲで用いられる抗原結合ドメインを有することが、有益であり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及び（Ｆａｂ’）_２、並びに二機能性（即ち、二重特異的）ハイブリッド抗体断片を含む様々な他の形態で存在することができる（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））。ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ又はｓｃＦｖを含む。

【0204】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに融合した膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ内のドメインの１つと自然に関連するように、選択することができる。場合によっては、膜貫通ドメインを、Ｔ細胞受容体複合体の他のメンバーの膜貫通ドメインと結合しないように、選択又は修飾することができる。

【0205】

本明細書で提供するＣＡＲの膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β、又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４などの、任意の自然膜結合又は膜貫通型タンパク質の膜貫通ドメインに由来することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインはまた、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジなどの、様々なヒトヒンジを使用することができる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗体のヒンジ領域を更に含む。例えば、ヒンジ領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２６のアミノ酸配列を任意選択的に含む、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＴＭ）を更に含む。

【0206】

あるいは、本明細書で提供するＣＡＲの膜貫通ドメインは、合成のものであることができ、例えば、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含むことができる。一実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に含まれる。任意選択的に、２～１０アミノ酸長の、短いオリゴ又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間で連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレットが、特に好適なリンカーをもたらす。

【0207】

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞を活性化し、免疫細胞の通常のエフェクター機能の１つ、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性を発揮することができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、完全長の、天然の細胞内シグナル形質導入ドメイン、又は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な、その断片のいずれかであることができる。

【0208】

本明細書で提供するＣＡＲにおいて有用な、例示的な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、抗原受容体が関与した後にシグナル形質導入を共同して開始する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びコレセプターの細胞質配列、加えて、これらの配列の任意の誘導体又は変異体、及び、同じ機能上の能力を有する合成配列が挙げられる。

【0209】

ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲシグナル伝達ドメインを含む。刺激によって機能するＴＣＲシグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られている、シグナル伝達モチーフを含有し得る。本明細書で提供するＣＡＲにおいて有用なＴＣＲシグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸配列の配列番号２８を含むＣＤ３ζシグナル形質導入ドメインを更に含む。

【0210】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＡＲは、共刺激シグナル伝達領域を更に含む。共刺激シグナル伝達領域は、抗原とは独立して機能し、ＣＡＲシグナル伝達又は活性化を媒介することができ、リンパ球の、抗原に対する効率的な応答のために必要な共刺激分子に由来することができる。例示的な共刺激分子としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、４－１ＢＢ共刺激シグナル領域を更に含む。

【0211】

ＣＡＲの一例としては、例えば、ＣＤ３ζ膜貫通及びエンドドメインに融合したモノクローナル抗体に由来する、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。このようなＣＡＲは、ｓｃＦｖの、その標的への特異的結合に応じて、ゼータシグナルの伝達をもたらす。ＣＡＲの調製方法は、一般に入手可能である（例えば、本明細書中に、それぞれの全体が参照により組み込まれる、Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３６８：１５０９～１５１８，２０１３；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９：５５０～５５７，２０１１；Ｈａｓｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１３） Ｂｌｏｏｄ，１２１，１１６５～１１７４；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．６：４７，２０１３；ＷＯ２０１２／０７９０００；米国公報第２０１２／０２１３７８３号；及びＷＯ２０１３／０５９５９３を参照されたい）。ＣＡＲについての詳細の説明は、例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７） ５：２２；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ； ２２（６）：５０９～５１５にもまた見出すことができる。

【0212】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含む。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、任意選択的に、リンカー（例えば、配列番号２３のアミノ酸配列を含む）を介して連結した、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含むＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３に由来する。

【0213】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖを含む。抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖは、任意選択的に、リンカー（例えば、配列番号２３のアミノ酸配列を含む）を介して連結した、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含むＣＤ１９抗体Ｊ５９１に由来する。

【0214】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、任意選択的に、リンカー、例えば、切断可能なリンカーを介して、本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１変異体に連結される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、Ｐ２Ａリンカーを介して、ＰＤ－Ｌ１変異体に連結される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、Ｐ２Ａリンカーを介してＰＤ－Ｌ１変異体に連結された抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含み、このようなタンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、Ｐ２Ａリンカーを介してＰＤ－Ｌ１変異体に連結された抗ＰＳＭＡ ＣＡＲを含み、このようなタンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。

【0215】

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に提供する。ある特定の実施形態では、このようなポリヌクレオチドは、任意選択的に、同じタンパク質をコードする、又は、少なくとも９０％、若しくは９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するタンパク質変異体をコードする、配列番号２０、配列番号８４を含むヌクレオチド配列、又は、少なくとも５０％の配列同一性を有する、その相同配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、そのＮ末端にシグナルペプチドを更に含む。

【0216】

ｂ）組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、組換え抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲの、細胞表面抗原に対する親和性は、野生型ＴＣＲにおける親和性よりも高い。他の実施形態では、ＴＣＲは、修飾α又はβ鎖などの修飾鎖を含むことができる。このような修飾としては、Ｎ－脱グリコシル化、変化したドメイン（特異的抗原を標的とするか、又は親和性を増大させる、組換え可変領域など）、１つ以上のジスルフィド結合の付加、異なる種に由来する鎖全体又は断片、及び、これらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0217】

ＴＣＲを組換え、発現させるための技術は、当該技術分野において周知である。例えば、ＴＣＲを、対応するサブユニットと会合する自然ジスルフィド結合を含むＴＣＲヘテロ二量体として産生することが可能である。例えば、Ｇａｒｂｏｃｚｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ ３８４（６６０５）：１３４－４１；Ｇａｒｂｏｃｚｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７（１２）：５４０３－１０；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：１１４０８～１１４１２；Ｄａｖｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２１）：１５４５５～１５４６０；Ｇｏｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．２０６：１６３～１６９；米国特許第６，０８０，８４０号を参照されたい。組換えＴＣＲについての詳細の説明は、例えば、Ｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ２０１８，９（３）：２５４～２６６にもまた、見出すことができる。

【0218】

ｉｖ）抗原提示タンパク質及び他のタンパク質を更に欠損している修飾細胞
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、限定されるものではないが、β－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、及びＩＣＰ４７ポリペプチドを含む、抗原処理、抗原提示、抗原認識、及び／又は抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質を更に欠損している。

【0219】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、ＭＨＣクラスＩタンパク質を更に欠損しているか、又は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（若しくは、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子）を更に欠損しているか、又は、これら両方を欠損している。

【0220】

ある特定の実施形態では、修飾細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はこれらの任意の組み合わせを含む、ＭＨＣクラスＩタンパク質を更に欠損している。ある特定の実施形態では、修飾細胞は、ＨＬＡ－ＡとＨＬＡ－Ｂの両方を欠損している。

【0221】

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、「非自己」抗原に対して、「自己」抗原を認識する免疫系に対する主要マーカーの１つである（Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｇ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ－ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｄｉｓｅａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１６）７：２８１．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１６．００２８１）。ＨＬＡクラスＩ分子は、同種異系移植の間に、宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）を誘発する主要抗原である。同種異系細胞上のＨＬＡクラスＩ分子を組換えるか、又はノックダウンすることによって、同種異系細胞の免疫原性を低減することができる。例えば、それらの開示全体が本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０２１０５０６０１、ＷＯ２０２１０６２２２７、ＷＯ２０２１０１１９１９を参照されたい。

【0222】

ＭＨＣクラスＩ分子は、高度可変α鎖及び定常β鎖で構成されるヘテロ二量体であり、定常β鎖は、βマイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とも呼ばれる。ＭＨＣクラスＩ分子のα鎖及びβ鎖は、アセンブリのために、細胞内の抗原ペプチドに結合して集合し、集合したＨＬＡ抗原ペプチド複合体は、細胞表面上に輸送される。ＭＨＣクラスＩ分子にロードされた抗原ペプチドは、サイトゾル内で生成され、抗原処理と関連するトランスポーター（ＴＡＰ）によって小胞体（ＥＲ）に輸送される（Ｍｉｃｈａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３６３（６４２９）：５５２～５５４）。ＥＲ内で、抗原ペプチドは、アミノペプチダーゼＥＲＡＰ１及びＥＲＡＰ２によって、更にトリミングすることができる（Ｓａｖｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，（２００５） Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒｉｍｍｉｎｇ ｂｙ ｈｕｍａｎ ＥＲＡＰ１ ａｎｄ ＥＲＡＰ２ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６（７）：６８９～６９７．）。したがって、ＭＨＣクラスＩ分子のα鎖若しくはβ鎖、又は、ＭＨＣの、ペプチドへの集合に関与するタンパク質（例えば、ＴＡＰタンパク質）の欠損は、ＭＨＣクラスＩ分子の、抗原ペプチドへのアセンブリ、及び、その細胞表面発現に悪影響を及ぼす。加えて、タパシンなどの抗原処理機構（ＡＰＭ）のタンパク質の調節異常は、ＭＨＣクラスＩ細胞表面発現量の低下もまたもたらす（Ｃａｍｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｉｓ ｍｏｓｔ ｔｉｇｈｔｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔａｐａｓｉｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２０１５）１１３，９５２～９６２）。

【0223】

任意の好適な方法を用いて、例えば、遺伝子編集により、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を干渉することにより、又は、ＭＨＣクラスＩタンパク質若しくはそのコードｍＲＮＡの分解を促進することにより、細胞をＭＨＣクラスＩタンパク質欠損型にすることができる。ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、ＭＨＣクラスＩタンパク質又はＢ２Ｍのゲノム領域内のコード配列又は調節配列内に第２の変異を含み、この変異（例えば、欠失、置換、挿入）は、ＭＨＣクラスＩタンパク質又はＢ２Ｍの発現又は活性を低下させる。ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、ＭＨＣクラスＩ又はＢ２ＭのｍＲＮＡを標的とし、これにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質又はＢ２Ｍにおける発現を低下させる、第２の干渉オリゴヌクレオチドを含む。

【0224】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、又はこれらの任意の組み合わせを含むＭＨＣクラスＩＩタンパク質を更に欠損している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、ＣＩＩＴＡであるＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子を欠損している。

【0225】

任意の好適な方法を用いて、例えば、遺伝子編集により、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を干渉することにより、又は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはそのコードｍＲＮＡの分解を促進することにより、細胞をＭＨＣクラスＩＩタンパク質欠損型にすることができる。ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質又はＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）のゲノム領域内のコード配列又は調節配列内の第３の変異を含み、この変異（例えば、欠失、置換、挿入）は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質又はＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）の発現又は活性を低下させる。ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質又はＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）のｍＲＮＡを標的とする第３の干渉オリゴヌクレオチドを含み、これにより、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）の、中での発現を低下させる。

【0226】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞、修飾Ｔ細胞）は、内因性Ｔ細胞受容体を更に欠損している。

【0227】

「内因性Ｔ細胞受容体を欠損している」とは、修飾細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）に存在する内因性ＴＣＲのレベル、又は内因性ＴＣＲ分子の数が、高用量（例えば、免疫原の投与を受ける対象において、Ｔ細胞の上述の機能を誘発するための飽和付近の用量）の免疫原においてさえも、Ｔ細胞の機能（例えば、増殖する、サイトカインを産生する、及び／又は溶解作用を誘発するなど）を誘発しないか、又はは機能の１０％未満しか誘発しないことを意味する。Ｔ細胞に存在するＴＣＲのレベル、又はＴＣＲ分子の数を、例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｌｅｎｃｙ，ａｖｉｄｉｔｙ，ｃｌｏｎｅｓ，ａｎｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３３，１９７～２０５；Ｌａｂｒｅｃｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｗ ｍｕｃｈ ＴＣＲ ｄｏｅｓ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｎｅｅｄ？ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１；１５：７１～８２ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＣＲ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｔｈｅ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｂｙ ＴＣＲ ｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１０；１８４：４２８４－９４；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｐ：ｐｏｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａ（２＋）ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６，８４７１～８４７６．に記載のとおりに、定量フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、及び光学トラップなどの方法によって測定することができる。例えば、マウスでの高用量免疫原にて、インビボでの免疫付与にＴ細胞が応答するには、約１０００個以下（例えば、２００～４００、４５０個）の表面ＴＣＲ分子が必要であることが、研究により示されている（Ｌａｂｒｅｃｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｗ ｍｕｃｈ ＴＣＲ ｄｏｅｓ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｎｅｅｄ？Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１；１５：７１～８２；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｐ：ｐｏｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａ（２＋）ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６，８４７１～８４７６）。

【0228】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞、修飾Ｔ細胞）は、Ｔ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、Ｔ細胞受容体β定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体β定常２（ＴＲＢＣ２）、又はこれらの任意の組み合わせを更に欠損している。

【0229】

任意の好適な方法を用いて、例えば、遺伝子編集により、内因性ＴＣＲの発現を干渉することにより、又は、内因性ＴＣＲ若しくはそのコードｍＲＮＡの分解を促進することにより、細胞を内因性ＴＣＲ欠損型とすることができる。ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２、又はこれらの任意の組み合わせのゲノム領域内の、コード配列又は調節配列内に第４の変異を含み、この変異（例えば、欠失、置換、挿入）は、内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２、又はこれらの任意の組み合わせの発現又は活性を低下させる。ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）は、内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２、又はこれらの任意の組み合わせのｍＲＮＡを標的とする第４の干渉オリゴヌクレオチドを含むことにより、内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２、又はこれらの任意の組み合わせの、中での発現の低下を引き起こす。

【0230】

ある特定の実施形態では、第２の変異、若しくは第３の変異、若しくは第４の変異、又はこれらの任意の組み合わせは、限定されるものではないが、例えば遺伝子編集により、当該技術分野において周知の任意の好適な手段により導入される。好適な方法を、本開示の以下のセクションでより詳細に記載する。

【0231】

ｖ）修飾細胞内での修飾の組み合わせ
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾細胞、又はその集団は、分子の組み合わせ、例えば、内因性免疫阻害チェックポイント分子とＭＨＣクラスＩタンパク質の組み合わせ；又は、内因性免疫阻害チェックポイント分子とＭＨＣクラスＩＩタンパク質（若しくは、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子）の組み合わせ；又は、内因性免疫阻害チェックポイント分子と、ＭＨＣクラスＩタンパク質と、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（若しくは、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子）の組み合わせを欠損するように修飾される。ある特定の実施形態では、修飾細胞がＴ細胞である場合、それらは、内因Ｔ細胞受容体を欠損するように更に修飾される。

【0232】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、欠損した免疫阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように、更に組換えられる。

【0233】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂを欠損している。

【0234】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＣＩＩＴＡを欠損している。

【0235】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＰＤ－１を欠損している。ある特定のこれらの実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２を発現するように、更に組換えられている。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１変異体である。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２は、ＰＤ－Ｌ２変異体である。

【0236】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＴＩＭ－３を欠損している。ある特定のこれらの実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＴＩＭ３のリガンド（例えば、ガレクチン９）を発現するように、更に組換えられている。ある特定の実施形態では、ＴＩＭ３ ９のリガンド（例えば、ガレクチン９）は、自然リガンド（例えば、自然ガレクチン９）と比較して、免疫阻害シグナル伝達が低下した変異体である。

【0237】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＬＡＧ－３を欠損している。ある特定のこれらの実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＬＡＧ３のリガンド（例えば、ガレクチン－３、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、ＦＧＬ１、又はＭＨＣＩＩ）を発現するように、更に組換えられている。ある特定の実施形態では、ＬＡＧ３のリガンドは、ＬＡＧ３の自然リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達が低下した変異体である。

【0238】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＴＩＧＩＴを欠損している。ある特定のこれらの実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＴＩＧＩＴのリガンド（例えば、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、又はＣＤ１１３）を発現するように、更に組換えられている。ある特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴのリガンドは、ＴＩＧＩＴの自然リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達が低下した変異体である。

【0239】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＰＤ－１を欠損している。ある特定のこれらの実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２を発現するように、更に組換えられている。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１変異体である。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２は、ＰＤ－Ｌ２変異体である。

【0240】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＴＩＭ３を欠損している。ある特定のこれらの実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＴＩＭ３ ９のリガンド（例えば、ガレクチン９）を発現するように、更に組換えられている。ある特定の実施形態では、ＴＩＭ３ ９のリガンド（例えば、ガレクチン９）は、自然リガンド（例えば、自然ガレクチン９）と比較して、免疫阻害シグナル伝達が低下した変異体である。

【0241】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＬＡＧ３を欠損している。ある特定のこれらの実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＬＡＧ３のリガンド（例えば、ガレクチン－３、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、ＦＧＬ１、又はＭＨＣＩＩ）を発現するように、更に組換えられている。ある特定の実施形態では、ＬＡＧ３のリガンドは、ＬＡＧ３の自然リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達が低下した変異体である。

【0242】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＴＩＧＩＴを欠損している。ある特定のこれらの実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、未修飾の対応する細胞と比較して、ＴＩＧＩＴのリガンド（例えば、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、又はＣＤ１１３）を発現するように、更に組換えられている。ある特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴのリガンドは、ＴＩＧＩＴの自然リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達が低下した変異体である。

【0243】

ある特定の実施形態では、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又はその集団は、対象となるポリペプチド（例えば、ＣＡＲ若しくは組換えＴＣＲ、又は他の細胞表面受容体若しくはリガンド）を発現するように、更に組換えられている。

【0244】

修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の産生方法
出発細胞を提供することと、出発細胞を修飾して、内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低減し、内因性阻害チェックポイント分子のリガンドの発現又は活性を増大させることにより、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）を得ることと、を含む、上述した修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の産生方法もまた、本明細書で提供する。内因性阻害チェックポイント分子及びそのリガンドは、上記セクションで記載したものと同じであってもよい。ある特定の実施形態では、出発細胞は、免疫細胞、例えば、内因性阻害チェックポイント分子を発現する免疫細胞である。ある特定の実施形態では、出発細胞は、免疫細胞、例えば、内因性阻害チェックポイント分子と、内因性阻害チェックポイント分子に対するリガンドの両方を発現する免疫細胞である。

【0245】

内因性阻害チェックポイント分子、及び、内因性阻害チェックポイント分子を発現する出発細胞（例えば、免疫細胞）を提供することと、出発細胞（例えば、免疫細胞）を修飾して、内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させることにより、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）を得ることと、を含む、上述した修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の産生方法もまた、本明細書で提供する。内因性阻害チェックポイント分子及びそのリガンドは、上記セクションで記載したものと同じであってもよい。

【0246】

内因性阻害チェックポイント分子を欠損する出発細胞（例えば、免疫細胞）を提供することと、出発細胞（例えば、免疫細胞）を修飾して、内因性阻害チェックポイント分子に対するリガンドの発現又は活性を増大させることにより、修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）を得ることと、を含む、上述した修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の産生方法もまた、本明細書で提供する。内因性阻害チェックポイント分子及びそのリガンドは、上記セクションで記載したものと同じであってもよい。

【0247】

出発細胞を提供することと、出発細胞を修飾して阻害チェックポイント分子のリガンドを発現させることであって、リガンドは、同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下している同族リガンドの変異体である、発現させることと、を含む、上述した修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）の産生方法もまた、本明細書で提供する。同族リガンドの変異体は、上記セクションで記載したものと同じであってもよい。

【0248】

ある特定の実施形態では、出発細胞（例えば、免疫細胞）を修飾して、内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低減させるステップは、ａ）出発細胞に、阻害チェックポイント分子のゲノム領域内のコード配列又は調節配列に対する第１の変異を導入することにより、阻害チェックポイント分子が、出発細胞内で発現の低下若しくは活性の低下を引き起こすようにすること、又は、ｂ）出発細胞（例えば、免疫細胞）に、阻害チェックポイント分子のｍＲＮＡを標的とする第１の干渉オリゴヌクレオチドを導入することにより、阻害チェックポイント分子が、出発細胞内で発現の低下を引き起こすようにすること、又は、ｃ）出発細胞（例えば、免疫細胞）に、阻害チェックポイント分子の発現及び／若しくは活性を阻害するタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子を導入すること、又は、ｄ）出発細胞（例えば、免疫細胞）を、阻害チェックポイント分子の発現及び／若しくは活性を阻害するタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子と接触させること、を含む。

【0249】

ある特定の実施形態では、方法は、ａ）出発細胞、若しくは、出発細胞から修飾した細胞に、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＢ２Ｍ）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列に対する第２の変異を導入することにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質が、出発細胞内で発現の低下又は活性の低下を引き起こすようにするステップ、又は、ｂ）出発細胞（例えば、免疫細胞）、若しくは出発細胞から修飾した細胞に、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＢ２Ｍ）のｍＲＮＡを標的とする第２の干渉オリゴヌクレオチドを導入することにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質が、出発細胞内で発現の低下を引き起こすようにするステップ、又は、ｃ）出発細胞（例えば、免疫細胞）、若しくは出発細胞から修飾した細胞に、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＢ２Ｍ）の発現及び／若しくは活性を阻害するタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子を導入するステップ、又は、ｄ）出発細胞（例えば、免疫細胞）、若しくは出発細胞から修飾した細胞を、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現及び／若しくは活性を阻害するタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子と接触させるステップ、を含む、出発細胞（例えば、免疫細胞）、又は、出発細胞から修飾された細胞を修飾して、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現又は活性を低下させるステップを更に含むことができる。

【0250】

ある特定の実施形態では、方法は、ａ）出発細胞、若しくは、出発細胞から修飾した細胞に、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（又は、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子、例えば、ＣＩＩＴＡ）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列に対する第３の変異を導入することにより、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質が、出発細胞内で発現の低下又は活性の低下を引き起こすようにするステップ、又は、ｂ）出発細胞（例えば、免疫細胞）、若しくは出発細胞から修飾した細胞に、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（又は、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子、例えば、ＣＩＩＴＡ）のｍＲＮＡを標的とする第２の干渉オリゴヌクレオチドを導入することにより、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質が、出発細胞内で発現の低下を引き起こすようにするステップ、又は、ｃ）出発細胞（例えば、免疫細胞）、若しくは出発細胞から修飾した細胞に、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（例えば、ＣＩＩＴＡ）の発現及び／若しくは活性を阻害するタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子を導入するステップ、又は、ｄ）出発細胞（例えば、免疫細胞）、若しくは出発細胞から修飾した細胞を、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現及び／若しくは活性を阻害するタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子と接触させるステップ、を含む、出発細胞（例えば、免疫細胞）、又は、出発細胞から修飾された細胞を修飾して、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現又は活性を低下させるステップを更に含むことができる。

【0251】

ある特定の実施形態では、方法は、ａ）出発細胞、若しくは、出発細胞から修飾した細胞に、内因性ＴＣＲ（例えば、ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列に対する第４の変異を導入することにより、内因性ＴＣＲが、出発細胞内で発現の低下又は活性の低下を引き起こすようにするステップ、又は、ｂ）出発細胞（例えば、免疫細胞）、若しくは出発細胞から修飾した細胞に、内因性ＴＣＲ（例えば、ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２）のｍＲＮＡを標的とする第３の干渉オリゴヌクレオチドを導入することにより、内因性ＴＣＲが、出発細胞内で発現の低下を引き起こすようにするステップ、又は、ｃ）出発細胞（例えば、免疫細胞）、若しくは出発細胞から修飾した細胞に、内因性ＴＣＲの発現及び／若しくは活性を阻害するタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子を導入するステップ、又は、ｄ）出発細胞（例えば、免疫細胞）、若しくは出発細胞から修飾した細胞を、内因性ＴＣＲの発現及び／若しくは活性を阻害するタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子と接触させるステップ、を含む、出発細胞（例えば、免疫細胞）、又は、出発細胞から修飾された細胞を修飾して、内因性ＴＣＲの発現又は活性を低下させるステップを更に含むことができる。

【0252】

ある特定の実施形態では、第１の変異、第２の変異、第３の変異、及び／又は第４の変異は、遺伝子編集により導入される。多くの、核酸ベースの組成物及び方法は、例えば、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴミールＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲシステムなどの、遺伝子編集に対して有用である。

【0253】

ある特定の実施形態では、遺伝子編集は、免疫細胞に、ｉ）配列標的化タンパク質、又は、配列標的化タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに、ｉｉ）コード配列内の標的配列、又は、阻害チェックポイント分子（例えば、阻害チェックポイント分子、ＭＨＣクラスＩタンパク質、及び／若しくはＭＨＣクラスＩＩタンパク質、若しくは内因性ＴＣＲ）のゲノム領域内の調節配列に相補的なオリゴヌクレオチドを導入することを含む。ある特定の実施形態では、配列標的化タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｔ７、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、及びＦｏｋ１などの、配列ガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。

【0254】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ガイド核酸を含む。ガイド核酸配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、これらの組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）、又は、合成ヌクレオチドを含む配列を含む。ガイド核酸配列は、単一分子、又は二重分子であってもよい。一実施形態では、ガイド核酸配列は、シングルガイドＲＮＡを含む。一実施形態では、ガイド核酸配列は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、又はそれ以上のヌクレオチド長である。

【0255】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＢ２Ｍ）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列、ｂ）ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（若しくは、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子、例えば、ＣＩＩＴＡ）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列、ｃ）阻害チェックポイント分子（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、若しくはＴＩＧＩＴ）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列、又は、ｄ）内因性ＴＣＲ（例えば、ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列、を標的とする１つ以上のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む。

【0256】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ａのゲノム領域を標的とする１つ以上のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）を含み、配列番号６３又は６４の断片に相補的である。

【0257】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ｂのゲノム領域を標的とする１つ以上のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）を含み、配列番号６５又は６６の断片に相補的である。

【0258】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｂ２Ｍのゲノム領域を標的とする１つ以上のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）を含み、配列番号６７の断片に相補的である。

【0259】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡのゲノム領域を標的とする１つ以上のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）を含み、配列番号６８の断片に相補的である。

【0260】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＰＤ－１のゲノム領域を標的とする１つ以上のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）を含み、配列番号６９の断片に相補的である。

【0261】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＴＲＡＣのゲノム領域を標的とする１つ以上のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）を含み、配列番号７０の断片に相補的である。

【0262】

ある特定の実施形態では、出発細胞（例えば、免疫細胞）を修飾して、阻害チェックポイント分子のリガンドの発現又は活性を増大させるステップは、ａ）出発細胞（例えば、免疫細胞）に、リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを導入することにより、出発細胞からのリガンドの発現を引き起こすこと、ｂ）１つ以上の抑制転写因子をノックアウト若しくはノックダウンすること、ｃ）リガンドをコードする遺伝子の発現のために、１つ以上の調節配列を編集すること、又は、ｄ）リガンドをコードする遺伝子をノックインすること、を含む。例えば、Ｋｅｉｓｕｋｅ ｅｔ ａｌ．は、ＰＤ－Ｌ１転写物の３’－未翻訳（３’－ＵＴＲ）の切断が、様々な癌におけるＰＤ－Ｌ１の発現増加に繋がることを見出した（Ｋｅｉｓｕｋｅ ｅｔ ａｌ．Ａｂｅｒｒａｎｔ ＰＤ－Ｌ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ３’－ＵＴＲ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ｊｕｎ １６；５３４（７６０７）：４０２－６．）。したがって、ＰＤ－Ｌ１転写物の３’ＵＴＲ領域において切断を含む修飾免疫細胞は、ＰＤ－Ｌ１の発現増加をもたらすと予想することができる。ＰＤ－Ｌ１転写物の３’－ＵＴＲ領域の破壊方法は、例えば、Ｋｅｉｓｕｋｅ ｅｔ ａｌ．Ａｂｅｒｒａｎｔ ＰＤ－Ｌ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ３’－ＵＴＲ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ｊｕｎ １６；５３４（７６０７）：４０２－６に見出すことができる。

【0263】

ある特定の実施形態では、出発細胞（例えば、免疫細胞）を修飾して、同族リガンドの変異体を発現させる方法は、ａ）出発細胞（例えば、免疫細胞）に、変異体に対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを導入することにより、由来する変異体の発現を引き起こすこと、又は、ｂ）変異体をコードする遺伝子をノックインすること、を含む。

【0264】

ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、リガンドに対する、又は、リガンドの変異体に対するコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含む。

【0265】

ある特定の実施形態では、リガンドに対する、又は、リガンドの変異体に対するコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含む。

【0266】

ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、リガンドに対するコード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含む。

【0267】

ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、発現ベクター、任意選択的にレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、又はＲＮＡベクターである。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルス発現ベクター、任意選択的にレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。

【0268】

ある特定の実施形態では、出発細胞は自然細胞又は分化細胞である。ある特定の実施形態では、出発細胞は、自然細胞から遺伝子組換えされた、又は、分化細胞から遺伝子組換えされた、組換え細胞である。

【0269】

ある特定の実施形態では、分化細胞は、幹細胞から分化している。ある特定の実施形態では、幹細胞は、造血前駆細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、マクロファージ前駆細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋細胞、胚幹細胞の細胞株、間葉系幹細胞、若しくはｉＰＳＣ細胞である。幹細胞はまず、阻害チェックポイント分子のリガンドの発現又は活性を増大するように修飾することができ、続いて、内因性阻害チェックポイント分子での遺伝子編集により、内因性阻害チェックポイント分子、ＭＨＣクラスＩタンパク質、及び／又はＭＨＣクラスＩＩタンパク質、及び／又は内因性ＴＣＲの発現又は活性を低下させることができる。幹細胞を修飾又は組換えた後で、修飾又は組換え幹細胞を、適した条件下で分化させ、本開示の修飾細胞を得ることができる。組換えＴＣＲ又はＣＡＲを発現するように遺伝子組換えされた、分化した造血性リネージ細胞に対して、細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号に記載されている方法を用いて活性化し、増殖させることができる。ある特定の実施形態では、出発細胞及び／又は修飾細胞は、輸液前に、エクスビボで増殖する、及び／又は活性化させることができる。

【0270】

本明細書で提供する方法は、源から出発細胞を得ること、細胞を培養すること、細胞を活性化すること、及び細胞を増殖させることを更に含むことができる。

【0271】

本明細書で提供する方法は、当該技術分野において周知の様々な技術、例えば、フローサイトメトリーを用いて、出発細胞（例えば、免疫細胞）を単離するステップもまた伴うことができる。簡潔に述べると、出発細胞（例えば、免疫細胞）のマーカーに対する親和性を有する、蛍光標識された抗体を使用して、試料中の出発細胞を標識する。マーカーを発現する細胞に適したゲーティング戦略を使用して、細胞を分離する。例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、及びＣＤ４５などの細胞マーカーに特異的な、蛍光標識抗体、並びに対応するゲーティング方法を使用することにより、Ｔ細胞を、試料中の他の細胞から分離することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ３を欠損するＴ細胞が分離されるか、又は濃縮される。

【0272】

ポリヌクレオチド及びベクター
好適な組換え技術を使用して、阻害チェックポイント分子に対するリガンドをコードする、又は、変異体リガンドをコードする、又は、ＰＤ－Ｌ１変異体をコードするなどの、本明細書で提供する核酸又はポリヌクレオチドを構築することができる。必要に応じて、１種以上のリンカーをコードするポリヌクレオチド配列もまた作動可能に連結され、所望の生成物の発現を可能にする。

【0273】

コードするポリヌクレオチド配列はｍＲＮＡであることができ、ｍＲＮＡはインビトロ転写することができ、任意選択的に、脂質ナノ粒子などの好適な送達ビヒクルに封入することができる。

【0274】

コードポリヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知の組換え技術を用いて、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、又は発現のために、ベクターに挿入することができる。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成成分としては一般的に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｓｐ６、ａｒａＢＡＤ、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、ｐＬｍ、Ａ３、ｌａｃ、ｌｐｐ、ｎｐｒ、ｐａｃ、ｓｙｎ、ｔｒｃ、及びＴ３などの原核細胞プロモーター、又は、ＳＶ４０、ＣＭＶ、及びＥＦ－１αなどの真核細胞プロモーター）、並びに、転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。

【0275】

別の態様では、本開示は、本明細書で提供するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する発現ベクターは、発現のための、十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞により提供されることができるか、又は、インビトロ発現系に提供されることができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する発現ベクターは、例えば、核局在化、核小体局在化、又はミトコンドリア局在化のためのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列もまた含む。

【0276】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する発現ベクターは、本開示のリガンドをコードするポリヌクレオチド、及び、１種以上のＣＡＲ又はＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0277】

本明細書で提供する発現ベクターは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするポリヌクレオチド、及び、１つ以上の核局在化配列、及び任意選択的に、１つ以上のデアミナーゼもまた含むことができる。

【0278】

本開示の発現ベクターは、任意の好適な数の制御／調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、又はペプチド２Ａ（Ｐ２Ａ）配列もまた含むことができる。これらのエレメントは、当該技術分野において周知である。

【0279】

発現ベクターは、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、又はＲＮＡベクターからなる群から選択することができる。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルス発現ベクター、任意選択的にレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。一般的に、ウイルスベクターは、少なくとも１つの生体において機能的な複製起点、プロモーター、制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１種以上の選択可能なマーカーを含む。

【0280】

本明細書で提供する発現ベクターは、レンチウイルスベクターであることができ、これは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、非増殖細胞のゲノムに長期的に安定して組み込むことで、宿主細胞、例えば、宿主Ｔ細胞においてＣＡＲの安定した発現をもたらすのに有利である。レンチウイルスは、有糸分裂、及び有糸分裂後細胞の両方において感染し、これらの遺伝子を発現可能な、複雑なレトロウイルスである。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、最も一般的なレンチウイルスとして知られており、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて、広範囲の細胞型を標的とする。レンチウイルスの調製については、Ｇｕｓｔａｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｖｏｌｕｍｅ １，ｐａｇｅｓ ２４１～２４５（２００６）に記載されている。

【0281】

プラスミドベクター、ファージミドベクター、ファージ誘導体ベクター、コスミドベクター、トランスポゾンベクター、部分特異的挿入ベクター（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ）、インビトロ転写ＲＮＡベクター、及びスーサイド発現ベクターなどの、他の発現ベクターもまた、本開示の意図の範囲内である。

【0282】

本明細書で提供する発現ベクターを、当該技術分野において周知の様々な技術を用いて、例えば、物理的、化学的、又は生物学的手段により、宿主細胞に送達することができる。発現ベクターを宿主細胞に形質導入するための物理的方法としては、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、粒子衝突法、マイクロインジェクション、及び電気穿孔法が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的方法としては、遺伝子を宿主細胞に挿入するための、ウイルスベクター（特に、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター）の使用が挙げられるが、これらに限定されない。化学的手段としては、コロイド状分散体系（例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ）、並びに、脂質ベースの系（例えば、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソーム）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0283】

医薬組成物
別の態様では、本開示は、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、本明細書で提供する組換え細胞、本明細書で提供するタンパク質、又は、本明細書で提供するポリヌクレオチド、及び、薬学的に許容される媒体を含む医薬組成物もまた提供する。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、医薬品用途のために製剤化される組成物を意味する。

【0284】

「薬学的に許容される」という用語は、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤、及び／又は塩が一般的に、化学的に、及び／又は、物理的に、配合物に含まれる他の成分と適合し、そのレシピエントと生理学的に適合することを示す。

【0285】

「薬学的に許容される媒体」とは、対象にとって許容される生体活性を有し、無毒である活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。本明細書で開示する医薬組成物で使用するための、薬学的に許容される媒体としては、例えば、薬学的に許容される液体、ゲル、若しくは固体担体、水性若しくは非水性ビヒクル、抗菌剤、緩衝剤、酸化防止剤、等張剤、懸濁／分散剤、金属イオン封鎖若しくはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、若しくは無毒性補助物質、又は、これらの様々な組み合わせを挙げることができる。

【0286】

本開示の医薬組成物は、当該技術分野において周知の様々な技術を使用して調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．２００５）を参照されたい。簡潔に述べると、修飾細胞／組換え細胞、又はその集団を、使用又は保存前に、適した媒体と混合する。好適な、薬学的に許容される媒体は一般に、１）医薬組成物の、対象への投与、２）医薬組成物の、送達可能な調製物への加工、及び／又は、３）投与前の医薬組成物の保管に役立つ、不活性物質を含む。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される媒体は、製剤の形態、コンシステンシー、粘度、ｐＨ、薬物動態、及び／又は溶解度を、安定化させ、最適化させ、又は変化させることができる剤を含む。このような剤としては、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル化剤、及び皮膚浸透促進剤、例えば、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、スクロース、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0287】

例示的な、薬学的に許容される媒体としては、糖類（例えば、乳糖、グルコース、及びスクロース）、デンプン（例えば、コーンスターチ及びバレイショデンプン）、セルロース及びその誘導体（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、及び酢酸セルロース）、トラガント粉末、麦芽、ゼラチン、平滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルク）、賦形剤（例えば、カカオバター及び坐剤ワックス）、油類（例えば、ピーナッツオイル、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油）、グリコール類（例えば、プロピレングリコール）、ポリオール類（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、エステル（例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル）、寒天、緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム）、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、ｐＨ緩衝溶液、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ無水物、充填剤（例えば、ポリペプチド及びアミノ酸）、血清アルコール（例えば、エタノール）、（滅菌）リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、並びに、薬物製剤で用いられる他の無毒性で相溶性の物質が挙げられる。

【0288】

本発明の医薬組成物は、１種以上の薬学的又は生理学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載する修飾細胞を含むことができる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などといった緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチド、又はグリシンなどのアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び、防腐剤を含むことができる。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために製剤化される。

【0289】

キット
別の態様では、本開示は、自己抑制が低下した、エフェクター細胞機能が改善された、並びに、細胞活性化及び／又は増殖が改善された、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）、又は組換え細胞を含むキットもまた提供する。別の態様では、本開示は、本明細書で提供するタンパク質、自己抑制が低下した、エフェクター細胞機能が改善された、並びに、細胞活性化及び／又は増殖が改善された、ＣＡＲを発現する、又はＴＣＲを発現する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）又は組換え細胞の生成で使用するための、本明細書で提供するポリヌクレオチド又は発現ベクターを含むキットもまた提供する。

【0290】

いくつかの実施形態では、本開示のキットは、キットを使用するための、書面による取扱説明書を含む。ある特定の実施形態では、取扱説明書は、以下のうちの少なくとも１つ：臨床研究、注意事項、警告、及び／又は参考文献を含む。取扱説明書は、容器に直接印刷されるか（存在する場合）、又は、容器に貼り付けられるラベルとして、若しくは、別個のシート、パンフレット、若しくはフォルダとして、容器内に、又は容器と共に提供されるかの、いずれかであることができる。好適な容器としては、例えば、ボトル、シリンジ、バイアル、及び試験管が挙げられる。容器は、プラスチック又はガラスなどの様々な材料から形成することができる。ある特定の実施形態では、容器は、本明細書で提供する医薬組成物を保持し、滅菌したアクセスポートを有する。

【0291】

ある特定の実施形態では、キットは、上述した薬学的に許容される媒体を含む第２の容器を更に含む。ある特定の実施形態では、キットは、他の希釈剤、緩衝剤、針、フィルター、シリンジ、及び、使用のための取扱説明書を含む添付文書などの、商業的に望ましい、又はユーザーフレンドリーな他の材料を更に含む。

【0292】

治療方法
別の態様では、本開示は、必要とする対象における状態又は疾患の治療方法であって、上記対象に、治療有効量の、本明細書で提供する修飾細胞（例えば、修飾免疫細胞）を投与することを含む、方法を提供する。

【0293】

ある特定の実施形態では、対象は、癌、自己免疫疾患、感染症、加齢、代謝性疾患、及び心臓血管疾患から選択される疾患を有する。細胞療法は、癌を治療するために認可されており、多くの他の異なる状態及び疾患の治療において有用であることが見出されている。更なる詳細は、Ｃｈｕ Ｅ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ．２０２０ Ｍａｒ；９（３）：５６３；Ｒｕｒｉｋ Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｊｕｒｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７５，９１～９６（２０２２）；Ａｇｈａｊａｎｉａｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，５７３，４３０～４３３（２０１９）；Ａｍｏｒ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ，５８３，１２７～１３２（２０２０）；Ｗａｇｎｅｒ Ｖ．ｅｔ ａｌ， Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ，５８３，３７～３８（２０２０），Ｎｅｚｈａｄ，Ｍ．Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｈｏｗ Ｃｌｏｓｅ Ａｒｅ Ｗｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ？ Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０２０，Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ： ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｐｄａｔｅ，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ２０２１ Ｊａｎ－Ｄｅｃ；８：２０４９９３６１２１１０３６７７３などの出版物で確認されており、これら全体が、本明細書に組み込まれている。

【0294】

ある特定の実施形態では、癌は、血液学的癌又は充実性腫瘍である。

【0295】

ある特定の実施形態では、状態又は疾患は血液学的癌である。ある特定の実施形態では、血液学的癌はＢ細胞癌である。ある特定の実施形態では、血液学的癌は、白血病、骨髄腫、リンパ腫、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、血液学的癌は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、菌状息肉症、セザリー症候群、末梢性Ｔリンパ腫、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、未分化の大型細胞リンパ腫ＡＬＫ＋、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、Ｔ細胞大型顆粒リンパ性白血病（Ｔ－ＬＧＬＬ）、血管免疫芽球性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０＋リンパ増殖症候群、結節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、皮下脂肪層炎様Ｔ細胞リンパ腫（ＳＰＴＣＬ）、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫（ＰＣＧＤ－ＴＣＬ）、アグレッシブＮＫ細胞白血病（ＡＮＫＬ）、及び、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）からなる群から選択される。

【0296】

ある特定の実施形態では、状態又は疾患は、充実性腫瘍である。ある特定の実施形態では、充実性腫瘍は、乳癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、膠腫及びリンパ腫、頭頸腫瘍、神経内分泌腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍、胸腫瘍、肺腫瘍（小細胞及び非小細胞肺腫瘍など）、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸腫瘍、腎臓腫瘍、脳腫瘍、肝臓腫瘍、カポジ肉腫、ＣＮＳ腫瘍、神経芽細胞腫、毛細血管芽腫、髄膜腫、脳転移、黒色腫、胃腸及び腎臓癌／肉腫（例えば、胃癌）、横紋筋肉腫、グリア芽腫、好ましくは多形性膠芽腫、平滑筋肉腫、悪性ケラチノサイト（例えばヒト悪性ケラチノサイト）の増殖を抑圧することにより処置可能な扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、及び皮膚癌からなる群から選択される。

【0297】

ある特定の実施形態では、自己免疫疾患は、エリテマトーデス、関節リウマチ、及びＧＶＨＤからなる群から選択される。

【0298】

ある特定の実施形態では、感染症は、真菌感染症、寄生生物／原生動物感染症、マラリア、コクシジオイデス・イミチス、ヒストプラスマ症、爪真菌症、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ・アルビカンス、パラコクシジオイオミセス症、微胞子虫症、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ）感染症、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、包虫症、象皮病、蟯虫症、肝蛭病、肥大吸虫症、フィラリア症、ランブル鞭毛虫症、顎口虫症、膜様条虫疾患、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、メタゴニムス症、蝿幼虫症、オンコセルカ症、シラミ症、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染症、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、疥癬、住血吸虫症、嗜眠性脳炎、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、鞭虫症、トリパノゾーマ症、蠕虫感染症、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒトパピローマ・ウイルス、アデノウイルス、カポジウエスト肉腫関連ヘルペスウイルス流行病、薄型リングウイルス（Ｔｏｒｑｕｅｔｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヒトＴリンパ増殖性ウイルスＩ、ヒトＴリンパ増殖性ウイルスＩＩ、水疱瘡帯状疱疹、ＪＣウイルス及びＢＫウイルスの感染症からなる群から選択される。

【0299】

ある特定の実施形態では、レシピエントは、移植片対宿主拒絶反応（ＧＶＨＤ）を有するか、又はＧＶＨＤが進行する性質を有する。

【0300】

ある特定の実施形態では、レシピエントは腫瘍形成（例えば、白血病）を有するか、又は腫瘍形成（例えば、白血病）が進行する性質を有する。

【0301】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する方法は、対象に、１種以上の追加の修飾免疫細胞若しくはその集団、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体）、１種以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、若しくはこれらの組み合わせ）、又は、１種以上の化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、リツキシマブ、オビヌツズマブ、ベンダムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イブルチニブ、メトトレキサート、シタラビン、デキサメタゾン、シスプラチン、ボルテゾミブ、フルダラビン、イデラリシブ、アカラブルチニブ、レナリドマイド、ベネトクラクス、シクロホスファミド、イホスファミド、エトポシド、ペントスタチン、メルファラン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、パノビノスタット、ダラツムマブ、エロツズマブ、サリドマイド、レナリドマイド、若しくはポマリドミド、若しくはこれらの組み合わせ）などの、１種以上の追加の治療剤を投与することを更に含む。上述した１種以上の追加の治療剤を、本明細書で提供する組換え細胞又は修飾細胞の投与前、投与と同時、又は投与後に、投与することができる。

【0302】

別の態様では、本開示は、対象に、治療有効量の、本明細書で提供する組換え細胞又は修飾細胞の移植組織を投与することにより、レシピエントの免疫反応を低減することを含む、細胞の移植に対するレシピエントの免疫反応を低減する方法もまた提供する。

【0303】

別の態様では、本開示は、免疫拒絶のリスクを下げて、細胞を対象に移植する方法であって、対象に、治療有効量の、本明細書で提供する組換え細胞の移植組織を、又は、本明細書で提供する修飾細胞を投与することを含み、組換え細胞又は修飾細胞は、対象に対して同種異系である、方法もまた提供する。

【0304】

いくつかの実施形態では、レシピエントに投与される本開示の修飾細胞又は組換え細胞は、インビボで増殖し、長期間にわたり、対象に留まることができる。修飾細胞が修飾免疫細胞である場合、修飾免疫細胞は、メモリー免疫細胞に成熟し、レシピエント内で循環して留まり、その後、修飾免疫細胞のＣＡＲにより認識されるマーカーを発現する、病気の、又は異常な細胞の再発に積極的に応答可能な細胞集団を生成することができる。

【0305】

ある特定の実施形態では、レシピエントには、少なくとも１×１０^４個の細胞、少なくとも５×１０^４個の細胞、少なくとも１×１０^５個の細胞、少なくとも５×１０^５個の細胞、少なくとも１×１０^６個の細胞、少なくとも５×１０^６個の細胞、少なくとも１×１０^７個の細胞、少なくとも５×１０^７個の細胞、少なくとも１×１０^８個の細胞、少なくとも５×１０^８個の細胞、少なくとも１×１０^９個の細胞、少なくとも２×１０^９個の細胞、少なくとも３×１０^９個の細胞、少なくとも４×１０^９個の細胞、少なくとも５×１０^９個の細胞、又は、少なくとも１×１０^１０個の細胞が投与される。ある特定の実施形態では、レシピエントには、少なくとも１×１０^３個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも５×１０^３個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０^４個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも５×１０^４個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０^５個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも５×１０^５個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０^６個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも５×１０^６個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０^７個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも５×１０^７個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０^８個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも２×１０^８個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも３×１０^８個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも４×１０^８個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも５×１０^８個の細胞／体重１ｋｇ、又は、少なくとも６×１０^８個の細胞／体重１ｋｇが投与される。

【0306】

本明細書で提供する医薬組成物の用量は、サイズ、年齢、性別、体重、及び状態などの、レシピエントの各種因子に基づいて決定可能であることを、当業者は理解するであろう。用量は、本開示、及び、当該技術分野における知識から、当業者によって容易に決定することができる。

【0307】

同業者は容易に、修飾／組換え細胞の数、並びに、組成物における、及び、本開示の方法で投与可能な、任意の添加剤、ビヒクル、媒体、及び／又は担体の量を決定することができる。典型的には、添加剤は、存在する場合、リン酸緩衝生理食塩水中に０．００１～５０％（重量）溶液の量で存在し、活性成分（例えば、本明細書で提供する修飾／組換え細胞）は、マイクログラム～ミリグラムのオーダー、例えば、約０．０００１～約５重量％、好ましくは約０．０００１～約１重量％、更により好ましくは約０．０００１～約０．０５重量％又は約０．００１～約２０重量％、好ましくは約０．０１～約１０重量％、及び更により好ましくは、約０．０５～約５重量％で存在する。

【0308】

適した動物モデル（例えば、マウス）において、例えば、致死量（ＬＤ）及びＬＤ５０を測定することにより、ある特定の用量における毒性を測定するのが好ましいであろう。好適な応答を誘発する、組成物の投与タイミングを決定することもまた、好ましいであろう。このような測定には、当業者及び本開示の知識からの、過度な実験を必要としない。

【0309】

本明細書で提供する医薬組成物の投与は、注入、輸液、又は非経口投与を含むが、これらに限定されない、様々な従来技術を用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、非経口投与は、血管内、腫瘍内、静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、経気管内、髄腔内、腹腔内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、及び胸骨内輸液又は注入を含む。

【0310】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、疾患部位（例えば、腫瘍部位）に局所投与される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、対象に、注射により、カテーテルにより、座薬により、又は、（例えば、多孔性、非多孔性、若しくはゼラチン状材料、例えば、シアラスティック膜などの膜の）インプラントにより投与される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、制御放出系で送達される。

【0311】

本明細書で提供する治療方法は、ヒト対象が、本明細書で提供する医薬組成物で治療されていない場合に予想される、レシピエント（例えば、ヒト対象）の生存時間と比較して、レシピエント（例えば、ヒト対象）の生存時間の増大をもたらす。別の実施形態では、ヒト対象の生存時間の増大は、少なくとも３０日である。ヒト対象の生存時間の増大は、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年であってもよい。ある特定の実施形態では、レシピエント（例えば、ヒト対象）は、疾患及び／又は状態（例えば、癌）の、１回以上の他の治療に対して、不耐性及び／又は不応性である。ある特定の実施形態では、レシピエント（例えば、ヒト対象）は、本開示の治療方法の前に、疾患及び／又は状態（例えば、癌）の治療及び／又は治療法が、少なくとも１回は失敗に終わっていた。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する方法の治療を受けることができるレシピエント（例えば、ヒト対象）は、子ども（例えば、０～１８歳）、又は、成人（例えば、１８歳以上）である。

【0312】

ある特定の実施形態では、本開示の治療方法は、ＣＡＲを発現する修飾免疫細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）の使用に関する。ＣＡＲは特異的に、宿主の望ましくない細胞（例えば、癌細胞）に存在する抗原標的に向けることができる。ある特定の実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）は、その標的に対する細胞毒性応答が増強されている。ある特定の実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）は、参照細胞（例えば、自然Ｔ細胞）と比較して、その標的に対する、増強された細胞毒性応答を誘発する。

【0313】

ある特定の実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）は、参照細胞（例えば、自然Ｔ細胞）と比較して、少なくとも１．２倍、１．４倍、１．６倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍又はそれ以上の強化された細胞毒性応答を示す。

【0314】

いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）は、参照細胞（例えば、自然Ｔ細胞）よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、又は少なくとも２０００％以上の標的細胞を殺傷することができる。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）は同種異系宿主に投与され、修飾免疫細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）は、宿主による拒絶が軽減しているか、又は、拒絶がない（若しくは、無視できるか、若しくは最小限である）。

【実施例】

【0315】

本開示は、特定の実施形態（そのいくつかは、好ましい実施形態である）を参照して具体的に図示及び説明されているものの、本明細書で開示する本開示の精神と範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変化を加えることができることが、当業者によって理解されなければならない。

【0316】

実施例１：ｓｇＲＮＡ設計
それぞれ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、及びＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ配列を、全エクソンスケール（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌｓ／ｓｇｒｎａ－ｄｅｓｉｇｎ）にて、ＧＰＰ ｓｇＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡのオンラインデザインツール）を用いて、ゲノム配列に基づき設計した。「ＣＲＩＳＰＲｋｏ」、「ＳｐｙｏＣａｓ９ ＮＧＧ」、及び「Ｈｕｍａｎ ＧＲＣｈ３８」を含むツールを選択し、これらの遺伝子に対する、可能性のあるｓｇＲＮＡを全て生成し（表１～表４）、各遺伝子の上位１０種類のｓｇＲＮＡを、優先順位に従い、好ましい配列として選択した。

【0317】

標的遺伝子配列における「ＮＧＧ」の特徴に従い、それぞれ、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子（表１）、ＣＩＩＴＡ（表２）、並びに、ＴＲＡＣ（表３）の上流及び下流配列中の標的ＤＮＡ配列を標的とするように、複数のセットのｓｇＲＮＡ配列を設計した。下表１は、ｓｇＲＮＡにより標的とされる、ＨＬＡ－Ａ（「ＡＵ」と名付ける）の上流の、ＨＬＡ－Ａ（「ＡＤ」と名付ける）の下流の、ＨＬＡ－Ｂ（「ＢＵ」と名付ける）の上流の、及び、ＨＬＡ－Ｂ（「ＢＤ」と名付ける）の下流の、標的ＤＮＡ配列を一覧に示す。

【0318】

表１ 標的遺伝子（ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂ）、並びに、標的ＤＮＡ配列

【表1】

【0319】

表２ 標的遺伝子（ＣＩＩＴＡ）及び標的ＤＮＡ配列

【表2】

【0320】

表３ 標的化遺伝子（ＴＲＡＣ）及び標的ＤＮＡ配列

【表3】

【0321】

表４ 標的化遺伝子（ＰＤ－１）及び標的ＤＮＡ配列

【表4】

【0322】

表Ａ 標的化遺伝子（Ｂ２Ｍ）及び標的ＤＮＡ配列

【表5】

【0323】

上記表１～表４に列挙する標的ＤＮＡ配列に基づき、ｓｇＲＮＡ配列を設計し、以下のとおりに合成した。本出願の各ｓｇＲＮＡは、５’標的化断片及び３’Ｃａｓ結合断片で構成される。５’標的化断片は、ゲノム内の標的部位に相補的であり、チミン（Ｔ）が全て、ウラシル（Ｕ）で置き換えられていることを除いて、ＰＡＭ配列ＮＧＧの上流の２０ヌクレオチド配列（即ち、上記表１～表４、及び表Ａにおける標的ＤＮＡ配列）と同一である。３’Ｃａｓ結合断片は、コンセンサスモチーフであり、以下のとおりのヌクレオチド配列を有する：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号５９）。

【0324】

ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡを例に取ると、５’標的ＤＮＡ配列は、ＴのＵへの置換を除いて、ＣＧＡＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＧＴ（配列番号６０）の配列を有し、これは、３’末端で、配列番号５９のコンセンサスモチーフに連結する。ＰＤ－１を標的とする完全ｓｇＲＮＡ配列（５’ー３’）を、以下に示す：
ＣＧＡＣＵＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＵＧＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号６１）。

【0325】

本実施例の各ｓｇＲＮＡは化学修飾されており、具体的な修飾としては、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、加えて、ｓｇＲＮＡの３’末端の、２番目、３番目、及び４番目のヌクレオチドにおける、ホスホロチオエート間結合、及び、２’－Ｏ－メチル（２－ＯＭｅ修飾）リボース糖修飾が挙げられたことに留意すべきである。最終的な化学修飾ｓｇＲＮＡ配列を以下に記載し、配列中、修飾ヌクレオチドは太字かつ斜体字フォーマットであり、アスタリスク記号（＊）を付している：
Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊ＣＵＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＵＧＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ（配列番号６２）

【0326】

別途記載のない限り、（表１～表４における）標的ＤＮＡ配列から転換されたｓｇＲＮＡ配列は全て、上記規則により合成され、ｓｇＲＮＡは化学合成により調製される。

【0327】

実施例２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ベクターの構築
本実施例は、Ｐ２Ａにより切断型ＰＤ－Ｌ１（配列番号１９）に連結したＣＡＲを発現するＣＡＲ発現カセットを含む、発現ベクターの構築物（図１Ａ）について示す。

【0328】

ＣＡＲは、抗体ＦＭＣ６３（ＣＤ１９－ｓｃＦｖ）に由来する抗ＣＤ１９一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、続いて、ＣＤ８ａ膜貫通領域（ＣＤ８ａＴＭ）、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ζを含有する。

【0329】

野生型ＰＤ－Ｌ１（１～２９０、配列番号１２）と比較して、切断型ＰＤ－Ｌ１（本明細書では、ＴｒＰＤ－Ｌ１と略す）は、Ｃ末端の位置２６０～２９０の配列を欠いている。

【0330】

ＣＡＲ発現カセットを構築するために、以下のエレメントをコードするＤＮＡ配列を合成し、５’から３’の順にライゲーションした：シグナルペプチド（アミノ酸配列配列番号２１）、ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３（アミノ酸配列配列番号２２）の軽鎖可変領域、リンカー（アミノ酸配列配列番号２３）、ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３（アミノ酸配列配列番号２４）の重鎖可変領域、ヒンジ領域（アミノ酸配列配列番号２５）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＴＭ）（アミノ酸配列配列番号２６）、４－１ＢＢ共刺激シグナル領域（アミノ酸配列配列番号２７）、ＣＤ３ζシグナル形質導入ドメイン（アミノ酸配列配列番号２８）、Ｐ２Ａ（アミノ酸配列配列番号１６）、及び、切断型ＰＤ－Ｌ１（ＴｒＰＤ－Ｌ１）（アミノ酸配列配列番号８）。得られる発現カセットは、配列番号１９の完全長アミノ酸配列を有する融合タンパク質ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＴｒＰＤ－Ｌ１をコードし、ポリヌクレオチド配列を、配列番号２０に示す。

【0331】

上述したＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＴｒＰＤ－Ｌ１発現カセット内のＴｒＰＤ－Ｌ１配列を、野生型ＰＤ－Ｌ１配列で置き換え、対照ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ｗｔＰＤ－Ｌ１発現カセットを作製することにより、対照ＣＡＲ発現カセットもまた構築した。

【0332】

上述した、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＴｒＰＤ－Ｌ１発現カセット又はＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ｗｔＰＤ－Ｌ１対照発現カセットを、それぞれ、ｐＥＬＰＳレンチウイルスベクター（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入）の、５及び３末端ＬＴＲ配列の間に組み込み（図１Ｂ）、ＣＡＲ発現マスタープラスミドＣＤ１９ＤＬ１－０１、又は対照プラスミドＣＤ１９ｗｔＬ１を構築し、これをその後、供給元により提供される取扱説明書に従い、レンチウイルス内にパッケージングした。

【0333】

実施例３．レンチウイルスのパッケージング及び検出
ＣＤ１９ＤＬ１－０１プラスミドを、レンチウイルスパッケージングプラスミドＰＭＤＬＧ／ＰＲＲＥ、ＰＲＳＶ／ｒｅｖ（Ｗｕｘｉ Ｓｈｅｎｇｊｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）、及び、レンチウイルスエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ｗｕｘｉ Ｓｈｅｎｇｊｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）と共に、トランスフェクション試薬ＰＥＩ（ポリエーテルイミド、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃから購入）を用いて、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を培養し、培養液の上清を回収し、限外ろ過及び超遠心分離によって濃縮して、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＴｒＰＤ－Ｌ１を発現させるためのレンチウイルスを得た。

【0334】

ウイルス力価は、フローサイトメトリーにより検出した。具体的には、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＴｒＰＤ－Ｌ１を発現させるためのレンチウイルス溶液を１００倍希釈し、１μＬ／ウェル、１０μＬ／ウェル、２０μＬ／ウェル、３０μＬ／ウェル、又は５０μＬ／ウェルで、２４ウェルプレートで８時間培養した２９３Ｔ細胞に添加した。２４時間後、ウイルス感染した２９３Ｔ細胞を遠心分離にかけ、再懸濁して、１×１０^６／ｍＬの細胞密度に調整し、続けて、１μｇ／ｍＬの終濃度のビオチン－ＣＤ１９抗原を添加した後、二次抗体ＡＰＣ－ストレプトアビジン（ＢＤから購入）でインキュベートし、その後、フローサイトメトリーにより、２９３Ｔ細胞でのＣＤ１９ ＣＡＲの発現を検出した。

【0335】

本実施例のウイルスパッケージング系により調製されたウイルス溶液は、２９３Ｔ細胞の感染に成功し、良好な感染能力を有することを、実験結果（図２）は示した。ＣＤ１９ ＣＡＲは、ウイルスがトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞でもまた発現し、ＣＤ１９抗原を認識可能であった。ウイルス力価が２．７９×１０^８ＴＵ／ｍＬ（形質導入単位／ｍＬ）であったことを、計算結果は示す。

【0336】

同様の方法で、実施例２で調製した対照プラスミドＣＤ１９ｗｔＬ１を用いて、レンチウイルスのパッケージングを行い、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ｗｔＰＤ－Ｌ１を発現させるための対照ウイルスを得て、試験した。対照ウイルスもまた、２９３Ｔ細胞においてＣＤ１９ ＣＡＲの発現を誘発可能であることを、結果は示した（データは図示せず）。

【0337】

実施例４．Ｔ細胞の単離及び活性化
ＰＢＭＣ細胞を液体窒素タンクから取り出して回収し、計数した。ＰＢＭＣ細胞の総量を、細胞計数に従い計算した。インキュベーション系もまた調製した。ＣＤ４及びＣＤ８磁気選別ビーズを、選別のために添加した。最後に、選別したＴ細胞の総量に従い、ＩＬ－２及び１０％ ＦＢＳを含有するｘ－ｖｉｖｏ培養培地を添加した。Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ磁気ビーズを添加した。混合後、これらを３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターに配置し、活性化して２日間培養した。

【0338】

実施例５．活性化Ｔ細胞のウイルストランスフェクション
ＣＤ１９ーＣＡＲ、及び切断型ＰＤ－Ｌ１ ＴｒＰＤ－Ｌ１を発現するＴ細胞を調製するために、実施例４に従い、（活性化の４８時間後に）Ｔ細胞を活性化し、１×１０^６／ｍＬの密度に調節し、続けて、実施例３から得られたＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＴｒＰＤ－Ｌ１レンチウイルスで、１５の感染多重度（ＭＯＩ）にてトランスフェクトした。ウイルス感染の２４時間後に細胞を収集し、ＣＤ１９－ＣＡＲ及び切断型ＰＤ－Ｌ１（ＴｒＰＤ－Ｌ１）の発現を、フローサイトメトリーにより検出した。結果は、ＣＤ１９－ＣＡＲ（図３Ａを参照）及び切断型ＰＤ－Ｌ１（ＴｒＰＤ－Ｌ１）（図３Ｂを参照）は両方とも、感染したＴ細胞により高度に発現することができ、２つの割合は同期していた（ＣＤ１９－ＣＡＲ及びＴｒＰＤ－Ｌ１の、正の発現割合はそれぞれ、３７．４２％及び４１．４９％であった）ことを示し、このことは、用いた遺伝子過剰発現系が効率的であり、安定しており、一貫性があることを示している。ＣＤ１９－ＣＡＲ及び切断型ＰＤ－Ｌ１（ＴｒＰＤ－Ｌ１）を発現する、得られたＴ細胞は、本出願では、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞とも呼ぶ。

【0339】

対照として、４８時間活性化させたＴ細胞に、同じ方法を用いて、実施例３から得られたＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ｗｔＰＤ－Ｌ１レンチウイルスを感染させ、ＣＤ１９－ＣＡＲ及び得られた完全長ｗｔＰＤ－Ｌ１を発現するＴ細胞は、本出願では、ＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞と呼び、そしてＣＤ１９－ＣＡＲ及び完全長ｗｔＰＤ－Ｌ１の発現は、フローサイトメトリーにより確認した（図３Ｃを参照）。

【0340】

実施例６．Ｔ細胞電気穿孔法（Ｓ１－Ｓ７）及びフローサイトメトリーのための、ユニバーサルＣＡＲＴの調製
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞（ＵＣＡＲＴとしても知られている）を調製するために、標的遺伝子ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＰＤ－１を、実施例５で調製したＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞又はＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞でノックアウトした。

【0341】

ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞又はＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞を収集して計数し、電気穿孔緩衝液及びＲＮＰ（リボ核タンパク質、リボ核タンパク質複合体：主成分は、実施例１で調製したＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡにより形成される複合体である）で穏やかに混合した後、電気穿孔法を開始した。具体的には、ＨＬＡ－Ａを標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号７４及び２９の配列を有し、ＨＬＡ－Ｂを標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号３８及び４４の配列を有し、ＣＩＩＴＡを標的とするｓｇＲＮＡは配列番号５３の配列を有し、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡは配列番号５７の配列を有し、ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡは配列番号５８の配列を有する。電気穿孔法の後、混合物を、予め温めた培地で培養した。電気穿孔法の後、細胞をサンプリングして２日毎に計数し、細胞生存率、総生存細胞数、及び細胞直径などの、重要なパラメーターを記録した。７日間培養した後、関連する遺伝子のノックアウト効率を検出した。

【0342】

上記標的遺伝子（ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＰＤ－１）がノックアウトされた、得られたＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞を、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞と呼んだ。上記標的遺伝子（ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＰＤ－１）がノックアウトされた、得られたＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞を、ＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞と呼んだ。

【0343】

電気穿孔法の７日後、十分な数の自然Ｔ細胞、実施例５から得られたＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ、及び、本実施例から得られたＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞を、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ（ＣＩＩＴＡのノックアウトを検証するため）、及び、ＣＤ３（ＴＲＡＣのノックアウトを検証するため）の発現に関して、フローサイトメトリーにより検出した。検出抗体を、下表に示す、推奨される希釈比に従い、染色緩衝液を用いて、暗所で希釈した。

【0344】

表５

【表6】

【0345】

結果は、上記遺伝が、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞内で効率的にノックアウトされており、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ３発現の陽性比率はそれぞれ、２５．３８％、４．６７％、２３．８５％、及び２３．８３％まで低下したことを示した。実験結果を、表６に以下のとおりに示す。ＰＤ－１発現もまた、効率的にノックアウトされた（データは図示せず）。ＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞は、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞と同様の、ＣＤ３、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ発現割合を有した。

【0346】

表６．細胞内での、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ３発現の陽性割合

【表7】

【0347】

実施例７．ＣＤ３陰性細胞の濃縮
ＣＤ３陰性細胞を濃縮するために、実施例６から得られたＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞を、適切な密度で、適量の濃縮緩衝液に再懸濁し、その後、細胞の総数に比例して、抗ヒトＣＤ３磁気ビーズを添加し、磁気ビーズカラムクロマトグラフィーにより、ＣＤ３陰性細胞を濃縮した。適量の精製細胞を、ＣＤ３の陽性割合を検出するためのフローサイトメトリーのために採取し、残りの細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターに一晩静置した。以下の表７は、フローサイトメトリーにより検出された濃縮結果を示す。

【0348】

表７ 細胞内でのＣＤ３発現の陽性割合

【表8】

【0349】

結果は、ＣＤ３の陽性割合が、濃縮前は２５．６％であり（即ち、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞の２５．６％がＣＤ３を発現した）、濃縮後には０．３６％まで低下した（即ち、濃縮ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞のわずか０．３６％がＣＤ３を発現した）ことを示した。これは、ＣＤ３陰性ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞の純度が、大幅に改善されたことを示した。

【0350】

実施例８．ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴの細胞毒性の検出
ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴの細胞毒性を試験するために、実施例７で得られた濃縮ＣＤ３陰性ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴをエフェクター細胞として、及び、ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞を標的細胞として用いて、細胞殺傷実験を行った。対照として、自然Ｔ細胞、又は、実施例５から得られたＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞を、同じ標的細胞を用いる平行対照実験において、エフェクター細胞として用いた。

【0351】

十分なエフェクター及び標的細胞を得て、エフェクター細胞を、４．０×１０^６／ｍＬの密度まで希釈し、標的細胞を、２．０×１０^５／ｍＬの密度まで希釈した。ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴは、６３．０５％の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現率を有することが測定され、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴは、７５．５８％の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現率を有することが測定された。これらの細胞の抗ＣＤ１９ ＣＡＲのレベルが確実に、同等であるようにするために、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴに対して、１：１．１９で希釈されるように、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞の体積を更に調節した。

【0352】

次に、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴのエフェクター細胞を、以下の勾配：２０：１、１５：１、１０：１、５：１、２：１、及び１：１に従い、Ｘ－ＶＩＶＯ完全培地に更に希釈した。

【0353】

エフェクター細胞（自然Ｔ細胞、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ、又はＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ）を、５０ｕＬ／ウェル：５０ｕＬ／ウェルで、標的細胞と混合した。培養の２４時間及び４８時間後に、１００ｕＬ／ウェルの、ルシフェラーゼの基質を添加し、ＯＤ値をマイクロプレートリーダによって読み取り、細胞内でのルシフェラーゼ活性を検出した。

【0354】

結果（図４Ａ及び４Ｂ）は、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴが標的細胞を有意に殺傷することができ、殺傷効果が、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比の増大に伴い向上したことを示した。このことは、本発明に従って構築した、切断型ＰＤ－Ｌ１を発現するＣＡＲＴ及びＵＣＡＲＴ細胞が、標的細胞にて良好な細胞毒性を有したことを示した。

【0355】

実施例９．ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴにより分泌された、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αのＥＬＩＳＡ検出
細胞毒性を試験するために、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴをエフェクター細胞として使用して、ルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ細胞を標的細胞として使用し、サイトカインＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの放出を、エフェクター細胞の、標的細胞によるインキュベーションの２４時間後に検出した。対照として、自然Ｔ細胞、又は、実施例５から得られたＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞を、平行対照実験においてエフェクター細胞として試験した。

【0356】

共培養の２４時間後に、細胞上清を新たな遠心管に移し、遠心分離にかけて細胞破片を除去し、上清を採取して、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γを検出した。

【0357】

結果は、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴとＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴの両方が、標的細胞との共培養後に、ＴＮＦ－αとＩＦＮ－γを有意に放出することができることを示し（図５）、このことは、本発明に従って構築したユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が、通常のサイトカイン発現能を有したことを示した。

【0358】

実施例１０．同種異系ＰＢＭＣを用いるＭＬＲ（混合リンパ球反応）実験
切断型ＰＤ－Ｌ１ ＴｒＰＤＬ１を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞が、インビボで同種異系宿主免疫系由来の免疫拒絶を軽減することができるか否かを評価するために、混合リンパ球反応実験を行い、ここでは、同種異系個体由来の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として用い、切断型ＰＤ－Ｌ１ ＴｒＰＤＬ１を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を標的細胞として用いた。

【0359】

１）天然Ｔ細胞、２）ＴｒＰＤＬ１－Ｂ２Ｍ^－／－ －ＣＡＲＴ細胞、３）ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞（実施例５で調製）、４）ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞（実施例６で調製し、実施例７でＣＤ３陰性に対して濃縮）を含む、異なる標的細胞を試験した。

【0360】

ＴｒＰＤＬ１－Ｂ２Ｍ^－／－ －ＣＡＲＴ細胞を、実施例６に記載するものと同様の方法を用いて調製した。簡潔に述べると、実施例５から得られたＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞を、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ（実施例１を参照）を用いてノックアウトし、ノックアウト効率を、実施例６に示すものと同様の方法によって検出した。結果は、ＴｒＰＤＬ１－Ｂ２Ｍ^－／－ －ＣＡＲＴ細胞におけるＢ２Ｍの発現率は２．２５％であったことを示した。

【0361】

上記標的細胞と同種異系ＰＢＭＣとの、混合リンパ球反応を、以下のとおりに実施した。

【0362】

エフェクター細胞の調製：同種異系単球及びＰＢＭＣ細胞を、１２００ｒｐｍで遠心分離にかけて計数し、ＰＢＳで洗浄して再懸濁した。将来の使用のために、細胞密度を、２×１０^５／ｍＬに調節した。

【0363】

標的細胞の調製：自然Ｔ細胞、ＴｒＰＤＬ１－Ｂ２Ｍ^－／－ －ＣＡＲＴ細胞、ＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞、及びＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞に、２Ｇｙを照射して、それらの増殖能力を破壊した後、５μＭの細胞増殖色素ＣＦＳＥで、１５分間室温で染色し、将来の使用のために、細胞密度を、２×１０^５／ｍＬに調節した。

【0364】

混合リンパ球反応：染色した標的細胞及び同種異系ＰＢＭＣを、９６ウェルプ培養プレートにて、適切な割合で共培養し、２４時間の培養後に細胞を収集した。

【0365】

ＣＤ４５＋ＣＦＳＥ＋二重陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定し、混合リンパ球反応における、標的細胞の除去効率を計算した。同種異系ＰＢＭＣ細胞が標的細胞にて免疫拒絶を有する場合、標的細胞が溶解して細胞膜が破壊されることで、標的細胞表面でのＣＦＳＥ蛍光は検出されない。ＣＤ４５は汎白血球マーカーであり、白血球を局在化するために使用され、ＰＢＭＣ中の非白血球を除外することで、標的細胞をより正確に局在化する。

【0366】

実験結果を以下の表８に示す。結果は、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴを、同種異系個体由来のＰＢＭＣと共培養した場合、同種異系ＰＢＭＣ由来の免疫拒絶を著しく阻害することができ、同種異系ＰＢＭＣによって除去されないことを示した。対照的にＴｒＰＤＬ１－Ｂ２Ｍ^－／－ －ＣＡＲＴ細胞及びＴｒＰＤＬ１－ＣＡＲＴ細胞は依然として、同種異系ＰＢＭＣにより除去された。このことは、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴは、同種異系細胞に対する免疫拒絶を顕著に低減することができ、Ｂ２ＭがノックアウトされただけのユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞よりも顕著に効率的であったことを示唆している。

【0367】

表８

【表9】

【0368】

実施例１１．ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ及びＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞に対するＰＤ－１関与の影響
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の両方が、Ｔ細胞への阻害性シグナル伝達を媒介することができる。完全長ＰＤ－Ｌ１配列は、細胞内ドメインを含有する。ＰＤ－Ｌ１の細胞内ドメインの切断が、ＰＤ－Ｌ１活性化の際にＴ細胞に伝達される阻害性シグナル伝達を低減することができるか否かを検証するために、ＰＤ－１発現細胞の存在下で、完全長ｗｔＰＤ－Ｌ１を発現するＵＣＡＲ－Ｔ細胞と、切断型ＰＤ－Ｌ１ ＴｒＰＤＬ１を発現するＵＣＡＲ細胞の、細胞増殖及び細胞毒性を比較した。

【0369】

エフェクター細胞の調製：ＣＤ１９結合ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞及びＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞を、実施例６に従い調製し、続いて１５分間室温で、５μＭの細胞増殖色素ＣＦＳＥで染色し、将来の使用のために、２×１０^５／ｍＬ細胞密度に調節した。

【0370】

標的細胞の調製：実施例８で提供するＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞に、ヒトＰＤ－１を組換え発現させることにより、ＰＤ－１を発現するＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞を得た。Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞はまた、ＣＤ１９も自然に発現する。将来の使用のために、細胞密度を、２×１０^５／ｍＬに調節した。

【0371】

混合リンパ球反応：上記で調製したエフェクター細胞及び標的細胞を１：１の比で混合して、９６ウェル培養プレートで培養し、細胞をそれぞれ、０時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に収集した。

【0372】

フローサイトメトリーによって、ＣＦＳＥ＋陽性細胞及びＣＤ１９陽性細胞の割合を測定することにより、混合リンパ球反応での、エフェクター細胞の増殖、及び、標的細胞の除去効率を評価した。

【0373】

結果を、以下の表９及び表１０に示す。結果は、ＰＤ－１を発現する細胞の存在下において、完全長ＰＤ－Ｌ１を発現するＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞は、増殖及び標的細胞の細胞毒性の両方において顕著な阻害を被ることを示し、７２時間における増殖はわずか１倍であり、標的細胞における殺傷効果はわずか４０％未満であった。対照的に、切断型ＰＤ－Ｌ１ ＴｒＰＤＬ１を発現するＵＣＡＲＴは、高い細胞増殖（７２時間の時点において、１７を上回る倍数増殖）を維持しただけでなく、顕著な標的細胞の殺傷（７２時間の時点で、標的細胞の９９％の殺傷が観察された）もまた示した。このことは、切断型ＰＤ－Ｌ１ ＴｒＰＤＬ１が、ＰＤ－１関与の後に、ＰＤ－Ｌ１が媒介する阻害を顕著に低減することができ、ＵＣＡＲＴ細胞増殖及び細胞殺傷効果の両方を大いに改善することができることを示唆している。

【0374】

表９

【表10】

【0375】

表１０

【表11】

【0376】

実施例１２．ＰＤ－１ノックアウトなしのＵＣＡＲＴの評価
ＰＤ－１がノックアウトされた、又はされていない、ＰＤ－Ｌ１を発現したＵＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び細胞毒性を、更に試験した。

【0377】

エフェクター細胞の調製：実施例６に示される方法に従いＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴを調製し、ここで、ＰＤ－１がノックアウトされ、切断型ＰＤ－Ｌ１ ＴｒＰＤＬ１が発現した。実施例６に記載されるものと同様の方法を用いて、ＰＤ－１及び切断型ＰＤ－Ｌ１の両方を発現する、ＰＤ－１がノックアウトされていないＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴの変異体細胞を調製し、ＰＤ－１＋ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴと呼んだ。ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ及びＰＤ－１＋ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴの両方を、１５分間室温で、５μＭの細胞増殖色素ＣＦＳＥで染色し、将来の使用のために、細胞密度を、２×１０^５／ｍＬに調節した。

【0378】

標的細胞の調製：実施例８に示されるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞の細胞密度を、将来の使用のために、２×１０^５／ｍＬに調節した。この細胞は、ＣＤ１９もまた自然に発現する。

【0379】

混合リンパ球反応：上記エフェクター細胞及び標的細胞を、１：１の比で９６ウェル培養プレートで混合し、１００μＬの標的細胞及びエフェクター細胞懸濁液を、各群に３とおりのウェルで、各ウェルに添加した。細胞を、５％ ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で培養し、細胞を０時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に収集した。

【0380】

ＣＦＳＥ陽性エフェクター細胞及びＣＤ１９陽性標的細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定し、混合リンパ球反応における、エフェクター細胞の増殖、及び、標的細胞クリアランスの効率を評価した。結果を、以下の表１１及び１２に示す。

【0381】

表１１

【表12】

【0382】

表１２

【表13】

【0383】

結果は、ＵＣＡＲＴ細胞がＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の両方を発現した場合、これらの細胞増殖及び細胞毒性は著しく阻害され、７２時間における増殖は１．８８倍であり、標的細胞に対する細胞毒性はわずか５０％を下回っていたことを示した。本実験で用いた標的細胞はＰＤ－１を発現しないため、ＵＣＡＲＴ細胞で発現したＰＤ－１と、別のＵＣＡＲＴ細胞で発現したＰＤ－Ｌ１の相互作用は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の両方を発現するＵＣＡＲＴ細胞の、増殖及び細胞毒性の自己阻害に繋がると推測される。

【0384】

対照的にＰＤ－Ｌ１を発現したＵＣＡＲＴ細胞がＰＤ－１でＰＤ－１がノックアウトした場合、これらは、高い細胞増殖を維持し、７２時間における増殖が１１倍を上回っていただけでなく、７２時間において、標的細胞の９９％の殺傷効果という、細胞毒性の顕著な増加もまた示した。このことは、ＵＣＡＲＴ細胞にて、ノックアウトされたチェックポイントに対するリガンドを発現しながらの、内因性阻害チェックポイント分子のノックアウトは、ＵＣＡＲＴ細胞の増殖及び細胞毒性を顕著に改善し、ＵＣＡＲＴ細胞間での自己阻害を回避することができることを示唆している。

【0385】

実施例１３．ウェスタンブロットによる、完全長ＰＤ－Ｌ１及び切断型ＰＤ－Ｌ１を発現するＵＣＡＲＴの評価
ＵＣＡＲ－Ｔ細胞における、切断型ＰＤ－Ｌ１ ＴｒＰＤＬ１と完全長ＰＤ－Ｌ１の違いを評価するために、実施例６に従いＵＣＡＲ－Ｔ細胞を調製した。ここで、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＰＤ－１を含む標的遺伝子が、Ｃａｓ９タンパク質、及び、これらの標的遺伝子に対して向けられるｓｇＲＮＡを用いてノックアウトされた。切断型ＰＤ－Ｌ１ ＴｒＰＤＬ１（本明細書では、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞と呼ばれる）を発現するか、又は、完全長ＰＤＬ１（本明細書では、ＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴと呼ばれる）を発現するような、このようなＵＣＡＲ－Ｔ細胞もまた作製した。ＵＣＡＲ－Ｔ細胞の２つの群は、同じドナーに由来した。

【0386】

ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞及びＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（２０μＬ×１０^８個の細胞）及び組換え（Ｈｉｓタグ付き）ヒトＰＤ－１タンパク質（１０μｇ／１×１０^８個の細胞、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ：１０３７７－Ｈ０８Ｈ－Ｂ）で２時間で処理した。処理後、細胞を収集して溶解し、続いてウェスタンブロットにより、リン酸化ｐ３８（ｐ－Ｐ３８）タンパク質及びリン酸化ＡＫＴタンパク質（ｐ－ＡＫＴ）を分析した。Ｔ細胞の活性化は、Ｐ３８及びＡＫＴのリン酸化をもたらすが故に、ｐ－Ｐ３８及びｐ－ＡＫＴのレベルは、ＣＤ３／ＣＤ２８及び組換えヒトＰＤ－１タンパク質の処理後の、Ｔ細胞の活性化のレベルを示すことができる。

【0387】

図７に示されるように、完全長ＰＤ－Ｌ１を発現するＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞において、ＣＤ３／ＣＤ２８の処理後の、ｐ－Ｐ３８及びｐ－ＡＫＴのレベルは、組換えヒトＰＤ－１タンパク質の存在によって顕著に阻害された。対照的に、組換えヒトＰＤ－１タンパク質が存在するにもかかわらず、ＰＤ－１の存在を示唆するＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの処理後に、良好なレベルのｐ－Ｐ３８及びｐ－ＡＫＴを維持した切断型ＰＤ－Ｌ１を発現するＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞は、切断型ＰＤ－Ｌ１を発現するＴ細胞の作用を顕著に阻害しなかった。このことは、完全長ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１との相互作用の後に免疫阻害シグナルを媒介することができるものの、切断型ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１が存在するにもかかわらず、このような免疫阻害シグナルを伝達しないことを示唆している。したがって、ＴｒＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞は、Ｔ細胞の活性化有効性において、ＰＤＬ１－ＵＣＡＲＴ細胞よりも効果的である。

【0388】

実施例１４．ＦＡＣＳによる、完全長ＰＤ－Ｌ１及び切断型ＰＤ－Ｌ１を発現するＴ細胞の評価
Ｔ細胞における、ＰＤ－１発現とＰＤ－Ｌ１発現の違いを評価するために、自然Ｔ細胞を得て、１人のドナーから精製した。

【0389】

Ｔ細胞を、４つの群に分けた。群１及び群２の細胞では、Ｃａｓ９タンパク質、及び、ＰＤ－１に向けられるｓｇＲＮＡを用いて、ＰＤ－１をノックアウトした。実施例３に記載されるとおり、群１の細胞に、ＰＤ－Ｌ１をコードするベクターを更にトランスフェクトし、群２の細胞に、ＴｒＰＤ－Ｌ１をコードするベクターを更にトランスフェクトした。ＰＤ－１のノックアウト、及び、ＰＤ－Ｌ１又はＴｒＰＤ－Ｌ１の発現を、ＦＡＣＳを用いて確認した。得られた群１の細胞を、ＰＤ１^－／－ ＋ＴｒＰＤ－Ｌ１細胞と呼び、得られた群２の細胞を、ＰＤ１^－／－ ＋ＰＤ－Ｌ１細胞と呼ぶ。

【0390】

実施例３に記載されるとおり、群３の細胞に、ＰＤ－Ｌ１をコードするベクターをトランスフェクトし、群４の細胞に、ＴｒＰＤ－Ｌ１をコードするベクターを更にトランスフェクトした。群３又は群４の細胞には、他の修飾を加えなかった。ＰＤ－Ｌ１又はＴｒＰＤ－Ｌ１の発現を、ＦＡＣＳを用いて確認した。得られた群３の細胞を、ＰＤ１^＋／＋ ＋ＴｒＰＤ－Ｌ１細胞と呼び、得られた群４の細胞を、ＰＤ１^＋／＋ ＋ＰＤ－Ｌ１細胞と呼ぶ。

【0391】

細胞の４つの群を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（２０μＬ／１×１０^８個の細胞）、及び組換え（Ｈｉｓタグ付き）ヒトＰＤ－１タンパク質（１００μｇ／１×１０^８個の細胞、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ：１０３７７－Ｈ０８Ｈ－Ｂ）で処理し、１５分後に、組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質（２００μｇ／１×１０^８個の細胞）（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ：１００８４－Ｈ０２Ｈ）を細胞に添加した。野生型Ｔ細胞を対照として使用し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（２０μＬ／１×１０^８個の細胞）のみで処理した。処理の６時間後に細胞を収集し、透過処理をして固定し、続いてＦＡＣＳにより、リン酸化ｐ３８（ｐ－Ｐ３８）タンパク質及びリン酸化ＡＫＴタンパク質（ｐ－ＡＫＴ）を分析した。

【0392】

結果は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、組換えヒトＰＤ－１タンパク質、及び組換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質の存在下では、群１の細胞（ＰＤ１^－／－ ＋ＴｒＰＤ－Ｌ１ Ｔ細胞）におけるｐ－Ｐ３８及びｐ－ＡＫＴの発現量は、対照Ｔ細胞の発現量に匹敵したことを示し、このことは、ＴｒＰＤ－Ｌ１が発現したにもかかわらず、免疫阻害がこのような細胞では観察されなかったことを示している。対照的に、群２（ＰＤ１^－／－ ＋ＰＤ－Ｌ１ Ｔ細胞）及び群４の細胞（ＰＤ１^＋／＋ ＋ＰＤ－Ｌ１ Ｔ細胞）において、ｐ－Ｐ３８及びｐ－ＡＫＴの発現量は有意に低下し（図８を参照）、群４の細胞では、ｐ－Ｐ３８及びｐ－ＡＫＴの発現量が最低であり、このような細胞が最も強力な免疫阻害を有することを示している。

【0393】

実施例１５．ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ－Ｔの調製及び評価

【0394】

抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを、抗ＰＳＭＡ抗体Ｊ５９１の軽鎖可変領域（アミノ酸配列配列番号８１）、及び、抗ＰＳＭＡ抗体Ｊ５９１の重鎖可変領域（アミノ酸配列配列番号８２）を有する、抗体Ｊ５９１に由来する抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ（ＰＳＭＡ－ｓｃＦｖ）によって置き換えたことを除いて、実施例２で概略を述べたのと同様の手順に従い、ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ発現カセットを構築した。得られる発現カセットは、配列番号８３の完全長アミノ酸配列を有する融合タンパク質ＰＳＭＡ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＴｒＰＤ－Ｌ１をコードし、ポリヌクレオチド配列を、配列番号８４に示す。

【0395】

実施例３、４、及び５に記載されるものと同じ手順に従い、ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製し、抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ及びＴｒＰＤ－Ｌ１を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。これらの細胞は、ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞と呼ばれ、対照として用いる。

【0396】

ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するために、実施例６に記載のとおり、ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｃａｓ９タンパク質、並びに、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡで更に処理し、これらの標的遺伝子をノックアウトした。

【0397】

上記標的遺伝子（ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＣＩＩＴＡ、及びＰＤ－１）がノックアウトされた、得られたＰＳＭＡ標的化ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲＴ細胞と呼んだ。実施例７に記載のとおり、ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ細胞を処理し、ＣＤ３陰性細胞を濃縮した。結果は、上記遺伝子はＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ Ｔ細胞内で効率的にノックアウトされており、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ３発現の陽性比率はそれぞれ、９８．００％、９７．３％、６７．６％、及び９８．９％まで低下したことを示した。実験結果を、表１３に以下のとおりに示す。ＰＤ－１発現もまた、効率的にノックアウトされた（データは図示せず）。

【0398】

表１３

【表14】

【0399】

ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒性を試験するために、実施例８に記載されるものと同じ手順に従い、０．２５：１、０．５：１、１：１、及び２：１の、様々なエフェクター標的比で、細胞殺傷実験を、エフェクター細胞及び標的細胞（ルシフェラーゼ発現前立腺癌ＰＣ３細胞である）を用いて実施した。濃縮されたＣＤ３陰性ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ及びＴｒＰＤ－Ｌ１を発現し、標的遺伝子をノックアウトしていない対照ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞、並びに、自然Ｔ細胞を含む、３種類のエフェクター細胞を平行して研究した。

【0400】

培養の２４時間後に、ルシフェラーゼの基質を添加し、ＯＤ値をマイクロプレートリーダによって読み取り、細胞内でのルシフェラーゼ活性を検出した。これは標的細胞の生存能を示したため、細胞崩壊割合に変換した。結果（図９Ａ）は、ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ Ｔ及びＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔは共に、有意に標的細胞を殺傷し、殺傷効果は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比の増大に伴い向上したことを示した。このことは、ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ－Ｔ及びＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔが、標的細胞にて良好な細胞毒性を有したことを示す。ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ－Ｔは、同じエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比の下で、ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔよりも良好な細胞毒性を示した。

【0401】

細胞毒性を試験するために、実施例９に記載されるとおり、エフェクター細胞を標的細胞でインキュベーションした２４時間後に、サイトカインＩＦＮ－γ放出をＥＬＩＳＡによって検出した。

【0402】

結果は、ＰＳＭＡ標的化ＵＣＡＲ－Ｔ及びＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔの両方が、標的細胞との共培養の後に、ＩＦＮ－γを有意に放出することができることを示し（図９Ｂ）、このことは、抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞及び抗ＰＳＭＡ ＵＣＡＲＴ細胞が、通常のサイトカイン発現能を有したことを示している。

【0403】

実施例１５．ＰＤ－Ｌ１変異体
少なくとも１つの変異（特に、欠失）が、ＰＤ－Ｌ１の細胞内ドメイン、特に、完全長ＰＤ－Ｌ１に対応する２６８番目から２７１番目のアミノ酸残基にまたがるモチーフに、導入されているＰＤ－Ｌ１変異体を調製する。２６８番目から２７１番目のアミノ酸残基のモチーフは、ベータシートであり、ＰＤ－Ｌ１の細胞内ドメインの生物学的活性にとって重要な、三次構造を含有するか、又は、三次構造の一部であると考えられている。このモチーフ内の変異又は欠失は、ＰＤ－Ｌ１の細胞内シグナル伝達を破壊することができ、場合により、免疫阻害シグナル伝達を低下させることができる。

【0404】

完全長のＰＤ－Ｌ１に対応する、２６８番目、２６９番目、２７０番目、及び／又は２７１番目のアミノ酸残基に欠失が導入されたＰＤ－Ｌ１変異体の群を作製する。ＰＤ－Ｌ１変異体は、ヒトドナーから単離されたＴ細胞においてそれぞれ発現する。ＰＤ－Ｌ１変異体を発現するＴ細胞は、Ｈｉｓ－ＰＤ－１タンパク質の存在下、又は不存在下にて、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて活性化され、続いてウェスタンブロット（実施例１３に記載される手順に類似する）を用い、又は、ＦＡＣＳ（実施例１４に記載される手順に類似する）により、Ｐ３８及びＡＫＴのリン酸化を検出する。結果は、ＰＤ－Ｌ１の、２６８番目から２７１番目のアミノ酸残基の断片内の欠失及び変異は、ＰＤ－Ｌ１の細胞内シグナル伝達を低下させることができることを示す。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図10-5】

【図10-6】

【図10-7】

【図10-8】

【図10-9】

【図10-10】

【図10-11】

【図10-12】

【図10-13】

【図10-14】

【図10-15】

【図10-16】

【図10-17】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-09-10

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾細胞又はその集団であって、
（１）前記修飾細胞は、未修飾の対応する細胞と比較して、
内因性阻害チェックポイント分子を欠損しており、かつ
前記欠損型内因性阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられており、
好ましくは、前記リガンドは、同族リガンドの変異体であり、前記同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下している、ことを特徴とする、または
（２）前記修飾細胞は、阻害チェックポイント分子のリガンドを発現するように組換えられており、前記リガンドは、同族リガンドの変異体であり、前記同族リガンドと比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下している、ことを特徴としており、
好ましくは、前記細胞は、前記リガンドに対応する阻害チェックポイント分子を欠損している、
修飾細胞。

【請求項2】

前記細胞は、
ａ）動物細胞若しくはヒト細胞であり、
ｂ）免疫細胞であり、
ｃ）幹細胞、若しくは、前記幹細胞から分化した細胞であり、
ｄ）移植に適しており、
ｅ）前記細胞に対する、意図するレシピエントに関して同種異系であり、又は
ｆ）これらの任意の組み合わせである、または
好ましくは、
ａ）前記細胞は免疫細胞であり、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、単核細胞、樹状細胞（ＤＣ細胞）、好中球、若しくはγδＴ細胞であり、又は
ｂ）前記細胞は、幹細胞、若しくは、前記幹細胞から分化した細胞であり、前記幹細胞は、造血前駆細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、マクロファージ前駆細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋細胞、胚幹細胞の細胞株、間葉系幹細胞、若しくはｉＰＳＣ細胞であり、
好ましくは、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、サイトカイン誘発キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球からなる群から選択され、任意選択的に、活性化Ｔ細胞である、または
ａ）前記阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択され、かつ／又は
ｂ）前記リガンドは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＭＧＢ１、Ｃｅａｃａｍ－１、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、ＦＧＬ１、アデノシン
、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエータ）、ＣＤ２８、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＭＨＣクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、及びＣＤ４７からなる群から選択され、または
好ましくは、
ａ）前記阻害チェックポイント分子はＰＤ－１であり、前記リガンドは、ＰＤ－Ｌ１若しくはその変異体、若しくは、ＰＤ－Ｌ２若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｂ）前記阻害チェックポイント分子はＴＩＭ３であり、前記リガンドは、ガレクチン９、ＨＭＧＢ１、Ｃｅａｃａｍ－１、若しくはホスファチジルセリン（ＰＳ）、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｃ）前記阻害チェックポイント分子はＬＡＧ－３であり、前記リガンドは、ガレクチン－３、ＬＳＥＣｔｉｎ、ａ－シヌクレイン、若しくはＦＧＬ１、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｄ）前記阻害チェックポイント分子はＴＩＧＩＴであり、前記リガンドは、ＣＤ１５５、ＣＤ１１３、若しくはＣＤ１１２、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｅ）前記阻害チェックポイント分子は、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）であり、前記リガンドはアデノシンを含み、
ｆ）前記阻害チェックポイント分子はＢＴＬＡであり、前記リガンドは、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエータ）若しくはその機能的等価物を含み、
ｇ）前記阻害チェックポイント分子はＣＴＬＡ－４であり、前記リガンドはＣＤ２８若しくはその機能的等価物を含み、
ｈ）前記阻害チェックポイント分子は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）であり、前記リガンドは、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ以外の）、若しくはその機能的等価物を含み、
ｉ）前記阻害チェックポイント分子は、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子）であり、前記リガンドは、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２、若しくはその機能的等価物のうちの少なくとも１つを含み、
ｊ）前記阻害チェックポイント分子は、ＳＩＧＬＥＣ－７（シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン７、ＣＤ３２８）であり、前記リガンドは、シアロ糖タンパク質若しくはその機能的等価物を含み、又は
ｋ）前記阻害チェックポイント分子は、ＳＩＧＬＥＣ－９（ＣＤ３２９）であり、前記リガンドは、シアロ糖タンパク質若しくはその機能的等価物を含む、または
ａ）前記細胞はＴ細胞であり、前記阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択され、
ｂ）前記細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり、前記阻害チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＫＩＲ、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）からなる群から選択され、
ｃ）前記細胞は樹状細胞（ＤＣ細胞）であり、阻害チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、及びＴＤＯからなる群から選択され、又は
ｄ）前記細胞はマクロファージであり、前記阻害チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、
ＣＤ４７、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、及びＣＤ２４からなる群から選択される、
請求項１に記載の修飾細胞又はその集団。

【請求項3】

前記変異体は、前記同族リガンドの、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いており、且つ／又は、 前記同族リガンドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記少なくとも１つの変異は、好ましくは、前記同族リガンドの前記細胞内ドメイン内、若しくは、前記同族リガンドの前記膜貫通ドメイン内、若しくは、前記同族リガンドの前記細胞外ドメイン内、又はこれらの任意の組み合わせにあり、
好ましくは、前記変異体は、前記同族リガンドが免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、少なくとも１つの変異を含み、
前記少なくとも１つの変異は、好ましくは、置換、欠失、挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含み、
例えば、前記少なくとも１つの変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含む、
請求項１に記載の修飾細胞。

【請求項4】

前記変異体は、ＰＤ－Ｌ１変異体又はＰＤ－Ｌ２変異体であり、
前記ＰＤ－Ｌ１変異体又は前記ＰＤ－Ｌ２変異体は、１以上の以下の条件を満たす、
請求項２に記載の修飾細胞：
（ｉ）前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）内、若しくは、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）内、若しくは、細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）内、若しくは、前記細胞外ドメインと前記細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）内に、又は、これらの任意の組み合わせに、少なくとも１つの変異を含み、前記少なくとも１つの変異は、前記ＰＤ－Ｌ１が免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、
（ｉｉ）前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、ＰＤ－Ｌ１の前記細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の前記膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の前記細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）の少なくとも一部の欠失、若しくは、前記細胞外ドメインと前記細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）の少なくとも一部の欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含み、前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、
（ｉｉｉ）前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１、又は、配列番号１１と等しい長さの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含まない。

【請求項5】

前記修飾細胞は、以下の条件の１以上を満たす、請求項１に記載の修飾細胞：
（Ｉ）前記修飾細胞は、ａ）前記阻害チェックポイント分子のゲノム領域内の、コード配列若しくは調節配列内の第１の変異であって、前記第１の変異は、前記阻害チェックポイント分子の発現若しくは活性を低下させる、前記第１の変異、又は、ｂ）前記阻害チェックポイント分子のｍＲＮＡを標的とする、第１の干渉オリゴヌクレオチドであって、前記第１の干渉オリゴヌクレオチドは、前記阻害チェックポイント分子の発現を低下させる、前記第１の干渉オリゴヌクレオチド、ｃ）前記阻害チェックポイント分子の前記発現及び／若しくは活性を阻害する、導入されたタンパク質、ポリペプチド、若しくは低分子を含む、
（ＩＩ）前記修飾細胞は、前記リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを含み、
好ましくは、前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、前記リガンドに対する前記コード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドに対するコード配列を更に含み、且つ／又は
前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、前記リガンドに対する前記コード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含み、且つ／又は
前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又は発現ベクター、任意選択的に、ウイルス発現ベクターである
。

【請求項6】

前記修飾細胞は、以下の条件の１以上を満たす、請求項１に記載の修飾細胞：
（Ａ）前記修飾細胞には、前記リガンドの発現が導入されている、
（Ｂ）前記細胞は、ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質、又はｂ）ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子、又はｃ）ａ）とｂ）の両方、を更に欠損しており、
好ましくは、前記ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ、若しくはＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はこれらの任意の組み合わせを含み、任意選択的に、前記細胞は、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方を更に欠損しており、且つ／又は
前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、又はこれらの任意の組み合わせを含み、任意選択的に、前記細胞は、ＨＬＡ－ＤＲを更に欠損しており、且つ／又は
前記ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子はＣＩＩＴＡであり、任意選択的に、前記細胞は、ＣＩＩＴＡを欠損しており、且つ／又は
（Ｃ）前記細胞は、内因性ＴＣＲを更に欠損しており、任意選択的に、前記細胞は、Ｔ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、Ｔ細胞受容体β定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体β定常２（ＴＲＢＣ２）、又はこれらの任意の組み合わせを更に欠損しており、
好ましくは、（Ｂ）において、前記修飾細胞は、ａ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列の第２の変異であって、前記第２の変異は、前記ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現若しくは活性を低下させる、前記第２の変異、又は、ｂ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質のｍＲＮＡを標的とし、これにより、前記ＭＨＣクラスＩタンパク質の、中での発現を低下させる、第２の干渉オリゴヌクレオチドを含み、且つ／又は
前記修飾細胞は、ａ）前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列内の第３の変異であって、前記第３の変異は、前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）の発現若しくは活性を低下させる、前記第３の変異、又は、ｂ）前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）のｍＲＮＡを標的とし、これにより、前記ＭＨＣクラスＩＩタンパク質若しくはＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）の、中での発現を低下させる、第３の干渉オリゴヌクレオチドを含み、且つ／又は
前記修飾細胞は、ａ）内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列内の第４の変異であって、前記第４の変異は、内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２の発現若しくは活性を低下させる、前記第４の変異、又は、ｂ）内因性ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２のｍＲＮＡを標的とし、これにより、ＴＣＲ若しくはＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２の、中での発現を低下させる、第４の干渉オリゴヌクレオチドを含み、
より好ましくは、（Ｂ）において、前記第２の変異、若しくは前記第３の変異、若しくは前記第４の変異、又はこれらの任意の組み合わせは、遺伝子編集により導入され、
（Ｄ）前記修飾細胞は修飾されており、又は、更に修飾されて、対象となるポリペプチドに対するコード配列を含む第２の外因性ポリヌクレオチドが導入され、任意選択的に、前記修飾細胞は、前記対象となるポリペプチドを発現し、
好ましくは、前記対象となるポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又は、組換えＴＣＲ、又は他の細胞表面受容体、又はリガンドを含み、且つ／又は、前記修飾細胞は、修飾Ｔ細胞であり、任意選択的に、前記修飾Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体を更に欠損し、
より好ましくは、前記ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、更に任意選択的に、前記ＣＡＲは、共刺激シグナル領域を更に含み、且つ／又は、前記組換えＴＣＲは、組換え抗原結合ドメインを含み、且つ／又は、前記ＣＡＲ又は前記組換えＴＣＲの前記抗原結合ドメインは、標的抗原、任意選択的に、標的細胞抗原に結合可能であり、前記標的細胞抗原は、腫瘍抗原、炎症関連抗原、自己免疫関連抗原、又は、感染体関連抗原を含み、
さらに好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲシグナル伝達ドメインを含み、且つ／又は、
前記標的細胞抗原は、癌、自己免疫疾患、感染症、代謝性疾患、及び遺伝病からなる群から選択される疾患と関連しており、且つ／又は
前記腫瘍抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ １７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、クローディン１８．２、ＣＳ－ｌ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、メソセリン、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、又はＲＯＲ１であり、且つ／又は
前記細胞は、エクスビボで増殖し、且つ／又は
前記修飾細胞の前記集団は、前記内因性阻害チェックポイント分子、及び、前記内因性阻害チェックポイント分子に対する前記リガンドの両方を発現する、対応する細胞、又は、自然細胞（即ち、自然免疫細胞）である、対応する細胞の、比較集団と比較して、
ａ）自己抑制の低下、
ｂ）エフェクター細胞機能の改善、並びに／又は
ｃ）細胞活性化及び／若しくは増殖の改善、
のうちの１つ以上の特徴を有する。

【請求項7】

請求項１に記載の修飾細胞の産生方法であって、
（１）：
ａ）出発細胞を提供することと、
ｂ）前記出発細胞を修飾して、前記内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低減し、前記内因性阻害チェックポイント分子の前記リガンドの発現又は活性を増大させることにより、前記修飾細胞を得ることと、を含み、
（２）：
先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞の産生方法であって、
ａ）前記内因性阻害チェックポイント、及び、前記内因性阻害チェックポイント分子に対する前記リガンドを発現する出発細胞を提供することと、
ｂ）前記出発細胞を修飾して、前記内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させることにより、前記修飾細胞を得ることと、を含む、
（３）：
先行請求項のいずれか１項に記載の修飾細胞の産生方法であって、
ａ）前記内因性阻害チェックポイント分子を欠損する出発細胞を提供することと、
ｂ）前記出発細胞を修飾して、前記内因性阻害チェックポイント分子に対する前記リガンドの発現又は活性を増大させることにより、前記修飾細胞を得ることと、を含み、
好ましくは、前記出発細胞を修飾して、前記内因性阻害チェックポイント分子の発現又は活性を低下させるステップは、
ａ）前記出発細胞に、前記阻害チェックポイント分子のゲノム領域内のコード配列若しくは調節配列に対する第１の変異を導入することにより、前記阻害チェックポイント分子が、前記出発細胞内で発現の低下若しくは活性の低下を引き起こすようにすること、又は
ｂ）前記出発細胞に、前記阻害チェックポイント分子のｍＲＮＡを標的とする第１の干渉オリゴヌクレオチドを導入することにより、好ましくは、前記第１の変異は、遺伝子編集により導入され、前記阻害チェックポイント分子が、前記出発細胞内で発現の低下を引き起こすようにすることを含む、
より好ましくは、前記遺伝子編集は、
ａ）前記細胞に、ｉ）配列標的化タンパク質、又は、前記配列標的化タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、ｉｉ）前記コード配列内の標的配列、又は、前記阻害チェックポイント分子のゲノム領域内の調節配列に相補的なオリゴヌクレオチドを導入することを含み、
好ましくは、前記配列標的化タンパク質は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ、任意選択的にＣａｓ９を含み、
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、前記標的配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を含む、
方法。

【請求項8】

前記出発細胞を修飾して、前記阻害チェックポイント分子の前記リガンドの発現又は活性を増大させるステップは、
ａ）前記出発細胞に、前記リガンドに対するコード配列を含む第１の外因性ポリヌクレオチドを導入することにより、前記出発細胞からの前記リガンドの発現を引き起こし、前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは、前記リガンドに対する前記コード配列作動可能に連結されたプロモーターを更に含み、
ｂ）１つ以上の抑制転写因子をノックアウト若しくはノックダウンすること、
ｃ）前記リガンドをコードする遺伝子の発現のために、１つ以上の調節配列を編集すること、又は
ｄ）前記リガンドをコードする遺伝子をノックインすること、を含み、
好ましくは、前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、発現ベクター、任意選択的にレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクターであり、前記出発細胞は、自然細胞若しくは分化細胞、又は、自然細胞若しくは分化細胞から遺伝子組換えされた、組換え細胞であり、
さらに好ましくは、前記発現ベクターは、ウイルス発現ベクター、任意選択的にレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、且つ／又は
前記分化細胞は、幹細胞から分化しており、
好ましくは、前記幹細胞は、造血前駆細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、マクロファージ前駆細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋細胞、胚幹細胞の細胞株、間葉系幹細胞、若しくはｉＰＳＣ細胞である、
請求項７に記載の方法。

【請求項9】

請求項１に記載の修飾細胞と、薬学的に許容される媒体と、を含む、
医薬組成物又はキット。

【請求項10】

対象は、癌、自己免疫疾患、感染症、加齢、代謝性疾患、及び心臓血管疾患から選択される疾患を有する、
状態又は疾患の治療における使用のための請求項１に記載の修飾細胞。

【請求項11】

ＰＤ－Ｌ１変異体を含むタンパク質であって、前記変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１と比較して、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力が低下しており、
好ましくは、前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、自然ＰＤ－Ｌ１の、機能的免疫阻害シグナル伝達ドメインを欠いており、且つ／又は
前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、免疫阻害シグナル伝達を誘発する能力を低下させる、少なくとも１つの変異を含み、
好ましくは、前記少なくとも１つの変異は、置換、欠失、挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含み、
より好ましくは、前記少なくとも１つの変異は、ＰＤ－Ｌ１の細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）内、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）内、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）内、若しくは、細胞外ドメインと細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）内、又はこれらの任意の組み合わせであり、且つ／又は
前記少なくとも１つの変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含み、
好ましくは、前記欠失は、ＰＤ－Ｌ１の前記細胞内ドメイン（例えば、配列番号１）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の前記膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２）の少なくとも一部の欠失、若しくは、ＰＤ－Ｌ１の前記細胞外ドメイン（例えば、配列番号３）の少なくとも一部の欠失、若しくは、前記細胞外ドメインと前記細胞内ドメインにまたがるドメイン（例えば、配列番号５）の少なくとも一部の欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含み、
より好ましくは、前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号１１、又は、配列番号１１と等しい長さの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号１１のアミノ酸配列を含まず、
前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、
例えば、前記ＰＤ－Ｌ１変異体は、任意選択的に、リンカーを介して、対象となるポリペプチドに連結され、
好ましくは、前記リンカーは切断可能であり、
より好ましくは、前記対象となるポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組換えＴＣＲ、又は他の細胞表面受容体、又はリガンドを含み、
前記タンパク質は、シグナルペプチドを更に含む、タンパク質。

【請求項12】

請求項１１に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む、発現ベクター、又は
前記発現ベクターを含む、組換え細胞。

【請求項13】

（１）組換え細胞が、請求項１２に記載の組換え細胞であり、出発細胞に、発現ベクターを、ポリヌクレオチドを前記細胞内で発現させるのに適した条件下で導入すること、
（２）組換え細胞は免疫寛容が増大した組換え細胞であり、前記細胞内で、ポリヌクレオチドを発現させるのに適した条件下で、前記細胞に、発現ベクターを導入することにより、前記組換え細胞の免疫寛容を増大させることを含み、
前記ポリヌクレオチド及び前記発現ベクターは、請求項１２で定義されたものである、
組換え細胞の産生方法。

【請求項14】

請求項１３に記載の方法によりエクスビボで産生される、細胞集団であって、
前記組換え細胞が、請求項１２に記載の組換え細胞であり、出発細胞に、発現ベクターを、ポリヌクレオチドを前記細胞内で発現させるのに適した条件下で導入し、
好ましくは、前記細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が、検出可能なレベルの、請求項１１に記載のタンパク質を発現する、
細胞集団。
を含む、
方法。

【請求項15】

免疫拒絶のリスクを下げて、細胞を対象に移植することにおける使用のための請求項１２に記載の組換え細胞の移植組織、又は、請求項１に記載の修飾細胞であって、前記組換え細胞又は修飾細胞は、前記対象に対して同種異系である、
移植組織又は修飾細胞。

【国際調査報告】