特表 2025-504803 ＧＰＲＣ５Ｄを標的とするキメラ抗原受容体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-19

(54)【発明の名称】ＧＰＲＣ５Ｄを標的とするキメラ抗原受容体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20250212BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20250212BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20250212BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20250212BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20250212BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20250212BHJP

   C12N 5/0787 20100101ALI20250212BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20250212BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250212BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250212BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20250212BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20250212BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20250212BHJP

   A61K 35/17 20250101ALN20250212BHJP

   A61K 35/15 20250101ALN20250212BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C07K14/705

C12N15/62 Z

C12N15/12

C12N15/13

C12N5/10

C12N5/0735

C12N5/0781

C12N5/0783

C12N5/0786

C12N5/0787

C12N5/0789

A61P35/00

A61K39/395 T

A61K47/68

C12N15/86 Z

C12N15/867 Z

C07K16/18

A61K35/17

A61K35/15

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024541709

(86)(22)【出願日】2023-01-12

(85)【翻訳文提出日】2024-07-10

(86)【国際出願番号】 CN2023071869

(87)【国際公開番号】W WO2023134718

(87)【国際公開日】2023-07-20

(31)【優先権主張番号】202210044655.3

(32)【優先日】2022-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520358863

【氏名又は名称】オリセル セラピューティクス カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フー シャオウェン

(72)【発明者】

【氏名】ヂョウ ジンツァイ

(72)【発明者】

【氏名】シー ヂョンジュン

(72)【発明者】

【氏名】チェン シーイエ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ユエ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB11

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087NA05

4C087NA13

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本願は、キメラ抗原受容体に関する。当該キメラ抗原受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣのグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）タンパク質を標的とする第１抗原結合ドメインと、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質を標的とする第２抗原結合ドメインと、を含む。本願は、前記キメラ抗原受容体を含む細胞及びその使用を更に提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体であって、
Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣのグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）タンパク質を標的とする第１抗原結合ドメインと、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質を標的とする第２抗原結合ドメインと、を含む、
キメラ抗原受容体。

【請求項2】

前記第１抗原結合ドメイン及び／又は前記第２抗原結合ドメインは、抗体若しくはその抗原結合断片を含む、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及び／又はｄＡｂを含む、
請求項２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記抗原結合断片はＶＨＨを含む、
請求項２～３の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記第１抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域ＶＨのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含み、前記ＶＨは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～４の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、
請求項１～５の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２７の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、
請求項１～６の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む、
請求項１～７の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２６の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む、
請求項１～８の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、
請求項１～９の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項11】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２５の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、
請求項１～１０の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項12】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、
請求項１～１１の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項13】

前記第１抗原結合ドメインはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（２）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに
（４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１２の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項14】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ１を含み、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は、前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的又は間接的に連結する、
請求項１０～１３の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項15】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１２、配列番号２８及び配列番号２３の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ２を含み、前記Ｈ－ＦＲ２は、前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置する、
請求項１０～１４の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項16】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１３又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３は、前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置する、
請求項８～１５の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項17】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は、前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結する、
請求項６～１６の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項18】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、
請求項１～１７の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項19】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨＨである、
請求項１～１８の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項20】

前記第２抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域ＶＨのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含み、前記ＶＨは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～１９の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項21】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、
請求項１～２０の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項22】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２７の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、
請求項１～２１の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項23】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む、
請求項１～２２の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項24】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２６の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む、
請求項１～２３の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項25】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、
請求項１～２４の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項26】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２５の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、
請求項１～２５の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項27】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、
請求項１～２６の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項28】

前記第２抗原結合ドメインはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（２）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに
（４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列を含む、
請求項１～２７の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項29】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ１を含み、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は、前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的又は間接的に連結する、
請求項２５～２８の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項30】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１２、配列番号２８及び配列番号２３の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ２を含み、前記Ｈ－ＦＲ２は、前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置する、
請求項２５～２９の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項31】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１３又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３は、前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置する、
請求項２３～３０の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項32】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は、前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結する、
請求項２１～３１の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項33】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、
請求項１～３２の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項34】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨＨである、
請求項１～３３の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項35】

前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列は、
（１）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（２）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（３）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（４）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（５）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（６）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（７）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（８）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（９）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１０）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１１）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１２）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１３）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１４）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１５）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、並びに
（１６）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列である、
請求項１～３４の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項36】

前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄの同じエピトープを標的とする、
請求項１～３５の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項37】

前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、同じ又は異なるアミノ酸配列を含む、
請求項１～３６の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項38】

前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、直接的又は間接的に連結される、
請求項１～３７の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項39】

前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、リンカーを介して連結される、
請求項１～３８の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項40】

前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列を含み、但し、前記ｎは１～１０の任意の正の整数である、
請求項３９に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項41】

前記リンカーは（ＥＡＡＡＫ）ｎのアミノ酸配列を含み、但し、前記ｎは１～１０の任意の正の整数である、
請求項３９に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項42】

共刺激シグナル領域を含み、前記共刺激シグナル領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３のリガンド、ＣＤ４０及びＭｙＤ８８からなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する細胞内共刺激シグナル領域を含む、
請求項１～４０の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項43】

前記共刺激シグナル領域は、４－１ＢＢに由来する細胞内共刺激シグナル領域である、
請求項４１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項44】

前記共刺激シグナル領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項４２～４３の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項45】

細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２及び少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する細胞内シグナル領域を含む、
請求項１～４４の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項46】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインである、
請求項４５に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項47】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項４５～４６の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項48】

膜貫通領域を含み、前記膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及びＳＬＡＭからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む、
請求項１～４７の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項49】

前記膜貫通領域は、ＣＤ８に由来する膜貫通領域である、
請求項４８に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項50】

前記膜貫通領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項４８～４９の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項51】

ヒンジ領域を更に含み、前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０及びＬＩＧＨＴからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来するヒンジ領域を含む、
請求項１～５０の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項52】

前記ヒンジ領域は、ＣＤ８に由来するヒンジ領域である、
請求項５１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項53】

前記ヒンジ領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項５１～５２の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項54】

低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片を更に含む、
請求項１～５３の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項55】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、前記細胞内シグナル領域のＣ末端に位置する、
請求項５４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項56】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２及びその機能的断片からなる群より選ばれる１種又は複数種を含む、
請求項５４～５５の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項57】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５及び／又は６或いはその断片である、
請求項５４～５６の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項58】

前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項５４～５７の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項59】

シグナルペプチドを更に含む、
請求項１～５８の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項60】

前記シグナルペプチドは、ＣＤ８タンパク質のシグナルペプチドに由来する、
請求項５９に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項61】

前記シグナルペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項５９～６０の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項62】

１種又は複数種の単離された核酸分子であって、
請求項１～６１の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体をコードする、
核酸分子。

【請求項63】

プロモーターを更に含む、
請求項６２に記載の核酸分子。

【請求項64】

前記プロモーターは構成的プロモーターである、
請求項６３に記載の核酸分子。

【請求項65】

前記プロモーターはＥＦ１αプロモーターである、
請求項６３～６４の何れか１項に記載の核酸分子。

【請求項66】

ベクターであって、
請求項６２～６５の何れか１項に記載の核酸分子を含む、
ベクター。

【請求項67】

ウイルスベクターである、
請求項６６に記載のベクター。

【請求項68】

レンチウイルスベクターである、
請求項６６～６７の何れか１項に記載のベクター。

【請求項69】

請求項１～６１の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６２～６５の何れか１項に記載の核酸分子、及び／又は請求項６６～６８の何れか１項に記載のベクターを含む、
細胞。

【請求項70】

免疫エフェクター細胞である、
請求項６９に記載の細胞。

【請求項71】

Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球、末梢血単核細胞、胚性幹細胞、リンパ前駆細胞及び／又は多能性幹細胞を含む、
請求項６９～７０の何れか１項に記載の細胞。

【請求項72】

Ｔ細胞である、
請求項６９～７１の何れか１項に記載の細胞。

【請求項73】

請求項１～６１の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体を製造する方法であって、
請求項１～６１の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体を発現可能な条件下で、請求項６９～７２の何れか１項に記載の細胞を培養することを含む、
方法。

【請求項74】

修飾された免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、
免疫エフェクター細胞に請求項６６～６８の何れか１項に記載のベクターを導入することを含む、
方法。

【請求項75】

医薬組成物であって、
請求項１～６１の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６２～６５の何れか１項に記載の核酸分子、請求項６６～６８の何れか１項に記載のベクター、及び／又は請求項６９～７２の何れか１項に記載の細胞、並びに選択可能な薬学的に許容される担体を含む、
医薬組成物。

【請求項76】

疾患及び／又は病状を予防、治療及び／又は緩和するための薬物の製造における、請求項１～６１の何れか１項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６２～６５の何れか１項に記載の核酸分子、請求項６６～６８の何れか１項に記載のベクター、請求項６９～７２の何れか１項に記載の細胞、及び／又は請求項７５に記載の医薬組成物の使用。

【請求項77】

前記疾患及び／又は病状は、ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患及び／又は病状を含む、
請求項７６に記載の使用。

【請求項78】

前記ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患及び／又は病状は腫瘍を含む、
請求項７７に記載の使用。

【請求項79】

前記腫瘍は固形腫瘍を含む、
請求項７８に記載の使用。

【請求項80】

前記腫瘍は非固形腫瘍を含む、
請求項７８に記載の使用。

【請求項81】

前記腫瘍は血液腫瘍及び／又はリンパ腫を含む、
請求項７９～８０の何れか１項に記載の使用。

【請求項82】

前記腫瘍は骨髄腫を含む、
請求項７８～８１の何れか１項に記載の使用。

【請求項83】

前記骨髄腫は難治性／再発性多発性骨髄腫を含む、
請求項８２に記載の使用。

【請求項84】

疾患及び／又は病状を予防、治療及び／又は緩和する方法であって、
必要とする対象に、請求項６９～７２の何れか１項に記載の細胞、及び／又は請求項７５に記載の医薬組成物を投与することを含む、
方法。

【請求項85】

前記疾患及び／又は病状は、ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患及び／又は病状を含む、
請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患又は病状は腫瘍を含む、
請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記腫瘍は固形腫瘍を含む、
請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記腫瘍は非固形腫瘍を含む、
請求項８６に記載の方法。

【請求項89】

前記腫瘍は血液腫瘍及び／又はリンパ腫を含む、
請求項８７～８８の何れか１項に記載の方法。

【請求項90】

前記腫瘍は骨髄腫を含む、
請求項８７～８９の何れか１項に記載の方法。

【請求項91】

前記骨髄腫は難治性／再発性多発性骨髄腫を含む、
請求項９０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、生物医薬分野に関し、具体的には、新型抗ＧＰＲＣ５Ｄのキメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体を含む細胞、及び腫瘍の治療におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

多発性骨髄腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ、ＭＭ）は、２番目の一般的な悪性血液疾患であり、そしてがんによる死亡率では第２位にランクされている。ＭＭは形質細胞の悪性腫瘍であり、多くの場合、多発性溶骨性損傷、腎臓機能損傷、骨髓浸潤、高カルシウム血症及び貧血を伴っている。ＭＭの現在の主な治療法は全身化学療法であるが、重篤な副作用があり、そして完全に治癒することができない。

【0003】

Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣのグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）タンパク質は、非典型的な表面オーファン受容体である。ＧＰＲＣＤ５は、他のＣ５ファミリー受容体と同様に、アミノ末端が短すぎるため、構造的にはＣ４ファミリーと非常に類似している。正常組織におけるその発現は毛包に限定されているが、ＭＭ患者の骨髓においても特異的に高発現され、形質細胞腫瘍負荷及び遺伝子変異と高度に相関する。

【0004】

プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの新薬の介入により、ＭＭの治療法も拡大しているが、依然として再発率が極めて高いと共に、薬剤耐性が発生している。一方、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）による治療は、ＭＭにおいて顕著な治療効果及び制御可能な毒性をもたらし、その中で、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とする主流のＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ＢＣＭＡ陰性又はＢＣＭＡ低発現のＭＭ患者において、標的回避の問題がある。ＧＰＲＣ５Ｄは、形質細胞において特異的に高発現されるため、ＭＭの理想的な治療標的となっているが、これを標的とする薬物治療製品は、まだ成熟していない。

【発明の概要】

【0005】

［発明の内容］
本願は、何れもＧＰＲＣ５Ｄを標的とすることができる２つの抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体を提供する。本願は、前記キメラ抗原受容体を含む細胞を更に提供する。前記細胞は、（１）増幅能力が強いこと、（２）ＧＰＲＣ５Ｄを発現する標的細胞を殺傷することができること、（３）標的細胞の刺激下でサイトカインを分泌すること、（４）標的細胞の刺激下で増殖能力が比較的強いこと、（４）腫瘍の成長を抑制すること、及び（５）安全性が良好であること、といった性質の１種又は複数種を有する。

【0006】

一態様によれば、本願は、Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣのグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）タンパク質を標的とする第１抗原結合ドメインと、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質を標的とする第２抗原結合ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を提供する。

【0007】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び／又は前記第２抗原結合ドメインは、抗体若しくはその抗原結合断片を含む。

【0008】

幾つかの実施形態において、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及び／又はｄＡｂを含む。

【0009】

幾つかの実施形態において、前記抗原結合断片はＶＨＨを含む。

【0010】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域ＶＨのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含み、前記ＶＨは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0011】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。

【0012】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２７の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。

【0013】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む。

【0014】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２６の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む。

【0015】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む。

【0016】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２５の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む。

【0017】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。

【0018】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（２）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに
（４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列を含む。

【0019】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ１を含み、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は、前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的又は間接的に連結される。

【0020】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１２、配列番号２８及び配列番号２３の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ２を含み、前記Ｈ－ＦＲ２は、前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置する。

【0021】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１３又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３は、前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置する。

【0022】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は、前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結される。

【0023】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。

【0024】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨＨである。

【0025】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域ＶＨのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含み、前記ＶＨは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0026】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。

【0027】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２７の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。

【0028】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む。

【0029】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２６の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む。

【0030】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む。

【0031】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２５の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む。

【0032】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。

【0033】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（２）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２且つ、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに
（４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列を含む。

【0034】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ１を含み、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は、前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的又は間接的に連結される。

【0035】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１２、配列番号２８及び配列番号２３の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ２を含み、前記Ｈ－ＦＲ２は、前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置する。

【0036】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１３又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３は、前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置する。

【0037】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は、前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結される。

【0038】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。

【0039】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨＨである。

【0040】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列は、
（１）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（２）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（３）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（４）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（５）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（６）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（７）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（８）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（９）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１０）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１１）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１２）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１３）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１４）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１５）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、並びに
（１６）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列である。

【0041】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄの同じエピトープを標的とする。

【0042】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、同じ又は異なるアミノ酸配列を含む。

【0043】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、直接的又は間接的に連結される。

【0044】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、リンカーを介して連結される。

【0045】

幾つかの実施形態において、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列を含み、但し、前記ｎは１～１０の任意の正の整数である。

【0046】

幾つかの実施形態において、前記リンカーは（ＥＡＡＡＫ）ｎのアミノ酸配列を含み、但し、前記ｎは１～１０の任意の正の整数である。

【0047】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は共刺激シグナル領域を含み、但し、前記共刺激シグナル領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３のリガンド、ＣＤ４０及びＭｙＤ８８からなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する細胞内共刺激シグナル領域を含む。

【0048】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記共刺激シグナル領域は、４－１ＢＢに由来する細胞内共刺激シグナル領域である。

【0049】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記共刺激シグナル領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0050】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２及び少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する細胞内シグナル領域を含む。

【0051】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインである。

【0052】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0053】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は膜貫通領域を含み、前記膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及びＳＬＡＭからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む。

【0054】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記膜貫通領域は、ＣＤ８に由来する膜貫通領域である。

【0055】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記膜貫通領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。

【0056】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体はヒンジ領域を更に含み、前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０及びＬＩＧＨＴからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来するヒンジ領域を含む。

【0057】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記ヒンジ領域は、ＣＤ８に由来するヒンジ領域である。

【0058】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記ヒンジ領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0059】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片を更に含む。

【0060】

幾つかの実施形態において、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、前記細胞内シグナル領域のＣ末端に位置する。

【0061】

幾つかの実施形態において、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２及びその機能的断片からなる群より選ばれる１種又は複数種を含む。

【0062】

幾つかの実施形態において、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５及び／又は６或いはその断片である。

【0063】

幾つかの実施形態において、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0064】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドを更に含む。

【0065】

幾つかの実施形態において、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８タンパク質のシグナルペプチドに由来する。

【0066】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記シグナルペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。

【0067】

別の態様によれば、本願は、１種又は複数種の単離された核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を更に提供する。

【0068】

幾つかの実施形態において、前記核酸分子はプロモーターを更に含む。

【0069】

幾つかの実施形態において、前記プロモーターは構成的プロモーターである。

【0070】

幾つかの実施形態において、前記プロモーターはＥＦ１αプロモーターである。

【0071】

別の態様によれば、本願は、前記核酸分子を含む担体を更に提供する。

【0072】

幾つかの実施形態において、前記担体はウイルス担体である。

【0073】

幾つかの実施形態において、前記担体はレンチウイルス担体である。

【0074】

別の態様によれば、本願は、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子、及び／又は前記担体を含む細胞を更に提供する。

【0075】

幾つかの実施形態において、前記細胞は免疫エフェクター細胞である。

【0076】

幾つかの実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球、末梢血単核細胞、胚性幹細胞、リンパ前駆細胞及び／又は多能性幹細胞を含む。

【0077】

幾つかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。

【0078】

別の態様によれば、本願は、前記キメラ抗原受容体を製造する方法であって、前記キメラ抗原受容体を発現可能な条件下で、前記細胞を培養することを含む方法を更に提供する。

【0079】

別の態様によれば、本願は、修飾された免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、免疫エフェクター細胞に前記担体を導入することを含む方法を更に提供する。

【0080】

別の態様によれば、本願は、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子、前記担体、及び／又は前記細胞、並びに選択可能な薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を更に提供する。

【0081】

別の態様によれば、本願は、疾患及び／又は病状を予防、治療及び／又は緩和するための薬物の製造における、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子、前記担体、前記細胞、及び／又は前記医薬組成物の使用を更に提供する。

【0082】

幾つかの実施形態において、前記疾患及び／又は病状は、ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患及び／又は病状を含む。

【0083】

幾つかの実施形態において、前記ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患及び／又は病状は腫瘍を含む。

【0084】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は固形腫瘍を含む。

【0085】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は非固形腫瘍を含む。

【0086】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は非固形腫瘍を含む。

【0087】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は血液腫瘍及び／又はリンパ腫を含む。

【0088】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は骨髄腫を含む。

【0089】

幾つかの実施形態において、前記骨髄腫は難治性／再発性多発性骨髄腫を含む。

【0090】

別の態様によれば、本願は、疾患及び／又は病状を予防、治療及び／又は緩和する方法であって、必要とする対象に、前記細胞、及び／又は前記医薬組成物を投与することを含む方法を更に提供する。

【0091】

幾つかの実施形態において、前記疾患及び／又は病状は、ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患及び／又は病状を含む。

【0092】

幾つかの実施形態において、前記ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患及び／又は病状は腫瘍を含む。

【0093】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は固形腫瘍を含む。

【0094】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は非固形腫瘍を含む。

【0095】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は非固形腫瘍を含む。

【0096】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は血液腫瘍及び／又はリンパ腫を含む。

【0097】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は骨髄腫を含む。

【0098】

幾つかの実施形態において、前記骨髄腫は難治性／再発性多発性骨髄腫を含む。

【0099】

当業者は、後述の詳細な説明から本願の他の態様及び利点を容易に認識することができる。後述の詳細な説明は、本願の例示的な実施形態を示し、説明するものに過ぎない。当業者に認識されるように、本願の内容によれば、当業者は、本願に関わる発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された具体的な実施形態を変更することができる。対応的には、本願の図面及び明細書における説明は、例示的なものに過ぎず、制限するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0100】

本願に関する発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されている。以下に詳細に説明する例示的な実施形態及び図面を参照することによって、本願に関する発明の特徴及び利点をよりよく理解することができる。図面の簡単な説明は以下の通りである。

【図1】本願に記載されるキメラ抗原受容体の各部の要素及び連結順序を示す図である。

【図2A】二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲレンチウイルス感染後のＴ細胞の陽性率を示す。

【図2B】単一Ｖ_ＨＨ ＣＡＲレンチウイルス感染後のＴ細胞の陽性率を示す。

【図3】単一Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の体外増幅曲線を示す。

【図4A】二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ発現を示す。

【図4B】単一Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ発現を示す。

【図5A】二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的殺傷を示す。

【図5B】単一Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的殺傷を示す。

【図6A】二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔサイトカインの分泌レベルを示す。

【図6B】単一Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔサイトカインの分泌レベルを示す。

【図7A】二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的増殖倍数を示す。

【図7B】単一Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的増殖倍数を示す。

【図8】ＣＡＲ－Ｔ細胞の記憶表現型フローサイトメトリーチャートを示す。

【図9】ＣＤ８^＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を示す。

【図10】ＣＤ３^＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化ｍａｒｋｅｒ発現を示す。

【図11】ＣＤ３^＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇性ｍａｒｋｅｒ発現を示す。

【図12】ＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫シナプスの共焦点画像を示す。

【図13】ＭＴＯＣとシナプスとの距離の定量的分析を示す。

【図14】ＮＳＧマウス体内腫瘍抑制実験のフローチャートを示す。

【図15A-15D】皮下腫瘍モデルＮＳＧマウスの体内腫瘍抑制効果を示す図である。

【図16】同所性移植モデルＮＳＧマウスの体内腫瘍抑制効果を示す図である。

【図17】抗体親和性の検出チャートを示す。

【図18】抗体結合活性のフローチャートを示す。

【図19】Ｇ５Ｖ_ＨＨ１とＧ５Ｖ_ＨＨ２との競合的結合のフローチャートを示す。

【図20】二重結合ドメインＶ_ＨＨ－ｈＦｃ抗体と異なる種の標的抗原との交差結合活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0101】

以下、特定の具体的な実施例により本願の発明の実施形態を説明し、当業者であれば、本明細書に開示された内容から、本願の発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。

【0102】

用語の定義
使用される「抗体」という用語は、完全抗体及びその結合断片を含む。一般的には、断片は、その由来する完全抗体と抗原への特異的結合を競合する。任意選択的には、抗体又はその結合断片は、他のタンパク質と化学結合するか、又は他のタンパク質と融合タンパク質の形態で発現することができる。例えば、前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体であってもよい。例えば、前記抗体又はその結合断片の結合タンパク質は、ＧＰＲＣ５Ｄを含んでもよい。例えば、前記抗体又はその結合断片は、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的であってもよい。

【0103】

「抗原結合断片」という用語は、完全抗体の一部を指し、また完全抗体の抗原決定可変領域を指す。例えば、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片及び一本鎖Ｆｖ断片、タンデムＦｖ断片、ＶＨＨ、二重特異性抗体を含んでもよい。例えば、前記抗原結合断片は、ＶＨＨであってもよい。例えば、前記抗原結合断片は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合することができる。例えば、前記抗原結合断片は、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的であってもよい。

【0104】

本願において、「ＶＨＨ」又は「Ｖ_ＨＨ」という用語は互換的に使用され、一般的には、重鎖抗体の可変抗原結合ドメインを含む抗体を指す。ＶＨＨは、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（Ｎｂ）及び／又は単一ドメイン抗体とも呼ばれる。例えば、前記ＶＨＨは、ＧＰＲＣ５Ｄに結合することができる。例えば、前記ＶＨＨは、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的であってもよい。

【0105】

本願において、前記抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含んでもよい。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域からなる。「重鎖定常領域」という用語は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３という３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域からなる。「軽鎖定常領域」という用語は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で、アミノ末端からカルボキシ末端へ配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

【0106】

本願において、「Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣのグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）タンパク質」という用語は、非典型的な表面オーファン受容体である。ＧＰＲＣＤ５は、他のＣ５ファミリー受容体と同様に、アミノ末端が短すぎるため、構造的にはＣ４ファミリーと非常に類似している。正常組織におけるその発現は毛包に限定されているが、ＭＭ患者の骨髓においても顕著に発現され、形質細胞腫瘍負荷及び遺伝子変異と高度に相関する。例えば、本願におけるＧＰＲＣ５Ｄは、特にＭＭ患者の体内で発現されるＧＰＲＣ５Ｄを指してもよい。

【0107】

本願において、「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、一般的には、少なくとも抗原又は標的に特異的に結合する細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内ドメインを含む組換えポリペプチドを指す。例えば、前記細胞外ドメインと前記膜貫通領域との間にヒンジ領域を含む。例えば、前記キメラ抗原受容体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片を更に含んでもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドを含んでもよい。標的細胞の表面上の標的抗原へのＣＡＲの細胞外ドメインの結合によって、ＣＡＲクラスター化を引き起こし、活性化刺激をＣＡＲ含有細胞に伝達する。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の特異性を方向転換し、そして増殖、サイトカイン産生、主要組織適合性（ＭＨＣ）に依存しない方法で標的抗原を発現する細胞死を媒介することができる分子の食作用及び／又は産生を引き起こすことができる。例えば、前記細胞外構造は、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合することができる。

【0108】

本願において、「細胞内ドメイン」という用語は、活性化シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の切断された部分を含むことを意味する。前記細胞内ドメインは、細胞内シグナル領域及び／又は共刺激シグナル領域を含んでもよい。「細胞内シグナル領域」という用語は、ＣＡＲ含有細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲを発現するＮＫ細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成することができる細胞内領域を指す。例えば、前記細胞内シグナル領域は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２及び少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質の細胞内シグナル領域を含んでもよい。例えば、前記細胞内シグナル領域は、ＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインであってもよい。「共刺激シグナル領域」という用語は、エフェクターシグナルを伝達することができる前記細胞内シグナル領域のＣＡＲの一部を指す。例えば、前記共刺激シグナル領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３のリガンド、ＣＤ４０及びＭｙＤ８８からなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する細胞内共刺激シグナル領域を含んでもよい。例えば、前記共刺激シグナル領域は、４－１ＢＢに由来する細胞内共刺激シグナル領域であってもよい。

【0109】

本願において、「膜貫通領域」という用語は、細胞質膜を貫通することができるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のドメインを指す。これらのドメインを用いて細胞外ドメインを細胞膜に固定することができる。例えば、前記膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及びＳＬＡＭからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質の膜貫通ドメインを含んでもよい。例えば、前記膜貫通領域は、ＣＤ８に由来する膜貫通領域であってもよい。

【0110】

本願において、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを連結される抗体重鎖ポリペプチドの一部、例えば、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けシステムに従う約２１６位～約２３０位を表す。ヒンジ領域は、一般的には、同じアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は、一般的には、約２５アミノ酸残基を含み、柔軟性があり、抗原結合領域の独立した移動が可能である。ヒンジ領域は、上部、中間、下部のヒンジドメインという３つのドメインに細分することができる。例えば、前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０及びＬＩＧＨＴからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来するヒンジ領域を含んでもよい。例えば、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８に由来するヒンジ領域であってもよい。

【0111】

本願において、「低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）という用語は、生体内で広く分布され、非常に大きな組織間差異性があり、細胞増殖並びにステロイドホルモン及び胆汁酸塩の合成のためにコレステロールを細胞内に摂取することを主な機能とする、エンドサイトーシス受容体に属する細胞表面タンパク質を指す。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質は、任意の脊椎動物に由来することができる。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片可以は、前記細胞内シグナル領域のＣ末端に位置する。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２及びその機能的断片からなる群より選ばれる１種又は複数種を含んでもよい。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６又はその断片であってもよい。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５又はその断片であってもよい。

【0112】

本願において、「シグナルペプチド」という用語は、翻訳中又は翻訳後に新生タンパク質を小胞体に誘導し、後続で表面発現される新生ＣＡＲタンパク質のアミノ末端（Ｎ－末端）にあるリーダー配列を指す。例えば、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８タンパク質のシグナルペプチドに由来する。

【0113】

本願において、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含む。１つの核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「プロモーター」という用語は、一般的には、プロモーターと操作可能に連結可能な選択されるＤＮＡ配列の発現を調節することによって、細胞内の選択されるＤＮＡ配列の発現に影響を与えるＤＮＡ配列を指す。例えば、前記核酸分子は、対応する抗原結合タンパク質及び／又は前記キメラ抗原受容体をコードすることができる。例えば、前記核酸分子は、プロモーターを含んでもよい。例えば、前記プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。例えば、前記プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターであってもよい。

【0114】

本願において、「担体」という用語は、一般的には、本願の１種又は複数種の核酸分子を付着することができる分子を指す。例えば、前記担体は、ウイルス担体であってもよい。例えば、前記担体は、レンチウイルス担体であってもよい。

【0115】

本願において、「細胞」という用語は、核酸がトランスフェクトされる細胞を指し、「細胞」という用語は、プラスミドの繁殖に用いられる原核細胞、及び発現の核酸及びコードされたポリペプチドの産生に用いられる真核細胞を含む。例えば、細胞は、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子及び／又は前記担体を含んでもよい。例えば、前記細胞は、免疫エフェクター細胞であってもよい。「免疫エフェクター細胞」という用語は、一般的には、免疫応答に関与し、エフェクター機能を実行する免疫細胞を指す。例えば、前記エフェクター機能の実行は、異物抗原の除去又は免疫エフェクター応答の促進などを含んでもよい。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球、末梢血単核細胞、胚性幹細胞、リンパ前駆細胞及び／又は多能性幹細胞を含んでもよい。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞であってもよい。

【0116】

本願において、「医薬組成物」という用語は、一般的には、哺乳動物個体への投与に適する化学的又は生物学的組成物を指す。例えば、前記医薬組成物は、前記抗原結合タンパク質、前記キメラ抗原受容体、前記ポリペプチド、前記核酸分子、前記担体及び／又は前記細胞、並びに選択可能な薬学的に許容される担体を含んでもよい。前記医薬組成物は、ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患又は病状の予防、治療及び／又は緩和に使用できる。例えば、前記ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現に関連する疾患又は病状は、腫瘍を含んでもよい。例えば、前記腫瘍は、固形腫瘍及び／又は非固形腫瘍を含んでもよい。例えば、前記腫瘍は、血液腫瘍及び／又はリンパ腫を含んでもよい。例えば、前記腫瘍は、骨髄腫を含んでもよい。

【0117】

発明の詳細
一態様によれば、本願は、Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣのグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）タンパク質を標的とする第１抗原結合ドメインと、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質を標的とする第２抗原結合ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を提供する。

【0118】

幾つかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び／又は前記第２抗原結合ドメインは、抗体若しくはその抗原結合断片を含んでもよい。例えば、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及び／又はｄＡｂを含む。例えば、前記抗原結合断片はＶＨＨを含む。

【0119】

本願において、前記ＣＤＲは、ＩＭＧＴ分割方法によって分割することができる。

【0120】

第１抗原結合ドメイン
本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質を標的とすることができる。

【0121】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域ＶＨのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含んでもよく、前記ＶＨは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0122】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含んでもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２７の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。

【0123】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ２を含んでもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２６の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ２を含んでもよい。

【0124】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ１を含んでもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２５の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ１を含んでもよい。

【0125】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ１、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ３を含んでもよい。

【0126】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含んでもく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（２）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに
（４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列を含む。

【0127】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨ－ＦＲ１を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は、前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的又は間接的に連結される。

【0128】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１２、配列番号２８及び配列番号２３の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨ－ＦＲ２を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ２は、前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置する。

【0129】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１３又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨ－ＦＲ３を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ３は、前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置する。

【0130】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもいＨ－ＦＲ４を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は、前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結される。

【0131】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＶＨを含んでもよい。

【0132】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＶＨＨであってもよい。

【0133】

第２抗原結合ドメイン
本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質を標的とすることができる。

【0134】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域ＶＨのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含んでもよく、前記ＶＨは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0135】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含んでもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２７の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。

【0136】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ２を含んでもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２６の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ２を含んでもよい。

【0137】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ１を含んでもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２５の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ１を含んでもよい。

【0138】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ１、配列番号３４（ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５Ｔ、但し、Ｘ_１はＮ又はＴ、Ｘ_２はＳ又はＷ、Ｘ_３はＧ又はＳ、Ｘ_４はＤ又はＧ、Ｘ_５はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨＣＤＲ３を含んでもよい。

【0139】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、
（５）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（６）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（７）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに
（８）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列を含む。

【0140】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨ－ＦＲ１を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は、前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的又は間接的に連結される。

【0141】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１２、配列番号２８及び配列番号２３の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨ－ＦＲ２を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ２は、前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置する。

【0142】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１３又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨ－ＦＲ３を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ３は、前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置する。

【0143】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよいＨ－ＦＲ４を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結される。

【0144】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＶＨを含んでもよい。

【0145】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよいＶＨＨであってもよい。

【0146】

キメラ抗原受容体
本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含んでもよい。

【0147】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0148】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0149】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0150】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0151】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0152】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0153】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0154】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0155】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0156】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0157】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0158】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0159】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0160】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0161】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0162】

例えば、第１抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗原結合ドメインにおいて、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0163】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄの同じエピトープを標的とすることができる。本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄの異なるエピトープを標的とすることができる。

【0164】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、同じ又は異なるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0165】

本願において、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、直接的又は間接的に連結されることができる。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、リンカーを介して連結されることができる。

【0166】

本願において、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列を含んでもよく、但し、前記ｎは１～１０の任意の正の整数である。例えば、前記ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい。

【0167】

本願において、前記リンカーは（ＥＡＡＡＫ）ｎのアミノ酸配列を含んでもよく、但し、前記ｎは１～１０の任意の正の整数である。例えば、前記ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい。

【0168】

本願において、前記キメラ抗原受容体は、共刺激シグナル領域を含んでもよく、但し、前記共刺激シグナル領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３のリガンド、ＣＤ４０及びＭｙＤ８８からなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する細胞内共刺激シグナル領域を含む。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記共刺激シグナル領域は、４－１ＢＢに由来する細胞内共刺激シグナル領域であってもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記共刺激シグナル領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0169】

本願において、前記キメラ抗原受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよく、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２及び少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する細胞内シグナル領域を含む。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインであってもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0170】

本願において、前記キメラ抗原受容体は膜貫通領域を含んでもよく、前記膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及びＳＬＡＭからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記膜貫通領域は、ＣＤ８に由来する膜貫通領域であってもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記膜貫通領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0171】

本願において、前記キメラ抗原受容体はヒンジ領域を更に含んでもよく、前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０及びＬＩＧＨＴからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来するヒンジ領域を含む。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記ヒンジ領域は、ＣＤ８に由来するヒンジ領域であってもよい。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記ヒンジ領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0172】

本願において、前記キメラ抗原受容体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片を更に含んでもよい。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、前記細胞内シグナル領域のＣ末端に位置する。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１～１２及びその機能的断片からなる群より選ばれる１種又は複数種を含む。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５及び／又は６或いはその断片である。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0173】

本願において、前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドを更に含んでもよい。例えば、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８タンパク質のシグナルペプチドに由来する。例えば、前記キメラ抗原受容体の前記シグナルペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。

【0174】

本願において、前記キメラ抗原受容体における前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、自己切断ペプチド（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａなどの２Ａペプチド）によってＣＡＲのＣ末端に連結されることができる。例えば、前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片は、Ｔ２Ａによって細胞内シグナル領域のＣ末端に連結されることができる。

【0175】

本願において、Ｎ末端からＣ末端へ、前記キメラ抗原受容体は、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質に結合する抗原結合ドメイン、前記ヒンジ領域、前記膜貫通ドメイン、前記共刺激シグナル領域及び前記細胞内シグナル領域を順に含んでもよい。例えば、Ｎ末端からＣ末端へ、前記キメラ抗原受容体は、前記抗原結合ドメイン、ＣＤ８に由来するヒンジ領域、ＣＤ８に由来する膜貫通領域、４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル領域、及びＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル領域を順に含んでもよい。

【0176】

本願において、Ｎ末端からＣ末端へ、前記キメラ抗原受容体は、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質に結合する抗原結合ドメイン、前記ヒンジ領域、前記膜貫通ドメイン、前記共刺激シグナル領域、前記細胞内シグナル領域及び前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片を順に含んでもよい。例えば、Ｎ末端からＣ末端へ、前記キメラ抗原受容体は、前記抗原結合ドメイン、ＣＤ８に由来するヒンジ領域、ＣＤ８に由来する膜貫通領域、４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル領域、ＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル領域及び前記低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片を順に含んでもよい。

【0177】

例えば、前記キメラ抗原受容体は、配列番号３１又は配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0178】

本願において、前記キメラ抗原受容体は、下記の表に示される構造を含んでもよい。

【0179】

但し、Ａは（ＧＧＧＧＳ）ｎを表し、Ｂは（ＥＡＡＡＫ）ｎを表す。但し、ｎは１～１０の任意の正の整数である。

【0180】

例えば、３Ｂ５のＨＣＤＲ１は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、３Ｂ５のＨＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、３Ｂ５のＨＣＤＲ３は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、３Ｂ５のＶＨＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0181】

例えば、３Ｅ７のＨＣＤＲ１は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、３Ｅ７のＨＣＤＲ２は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、３Ｅ７のＨＣＤＲ３は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、３Ｅ７のＶＨＨは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む。

【0182】

例えば、４Ａ２のＨＣＤＲ１は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、４Ａ２のＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、４Ａ２のＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、４Ａ２のＶＨＨは配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0183】

例えば、４Ｂ３のＨＣＤＲ１は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、４Ｂ３のＨＣＤＲ２は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、４Ｂ３のＨＣＤＲ３は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含み、４Ｂ３のＶＨＨは配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0184】

例えば、前記ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0185】

例えば、前記ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0186】

例えば、前記ＣＤ８α膜貫通領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0187】

例えば、前記４－１ＢＢ共刺激シグナルは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0188】

例えば、前記ＣＤ３ζ細胞内シグナル領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0189】

例えば、前記Ｏｒｉは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0190】

核酸分子
別の態様によれば、本願は、任意の長さの単離されたヌクレオチド、デオキシヌクレオチド及び／リボヌクレオチドであり得る１種又は複数種の核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体をコードすることができる核酸分子を更に提供する。

【0191】

例えば、前記核酸分子は、プロモーターを含んでもよい。例えば、前記プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。例えば、前記プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターであってもよい。

【0192】

担体
別の態様によれば、本願は、前記核酸分子を含んでもよい担体を更に提供する。前記担体は、宿主細胞を形質転換、形質導入又はトランスフェクトして、その保有する遺伝物質の要素を宿主細胞において発現することができる。例えば、担体は、プロモーター、転写物、エンハンサー、レプリコン、選択要素及びレポーター遺伝子を含んでもよい。例えば、担体は、細胞への侵入を助ける成分を含んでもよい。前記核酸分子を担体内で複製させるために、前記核酸分子の５’末端及び３’末端は、長末端反復配列を更に含んでもよい。

【0193】

例えば、前記担体は、ウイルス担体であってもよい。例えば、前記担体は、レンチウイルス担体であってもよい。

【0194】

細胞
別の態様によれば、本願は、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子及び／又は前記担体を含んでもよい細胞を更に提供する。前記細胞は、単一細胞の子孫を含んでもよい。自然、偶発的又は意図的な変異により、子孫は元の親細胞（総ＤＮＡ相補体の形態又はゲノムにおいて）と必ずしも同一でなくてもよい。

【0195】

幾つかの実施形態において、前記細胞は、免疫エフェクター細胞であってもよい。幾つかの実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球、末梢血単核細胞、胚性幹細胞、リンパ前駆細胞及び／又は多能性幹細胞を含んでもよい。例えば、前記細胞は、Ｔ細胞であってもよい。

【0196】

医薬組成物
別の態様によれば、本願は、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子、前記担体及び／又は前記細胞、及び任意選択的に薬学的に許容されるアジュバントを含んでもよい医薬組成物を更に提供する。

【0197】

幾つかの実施形態において、前記医薬組成物は、１種又は複数種の（薬学的に効果的な）キャリア、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤及び／又は防腐剤の適切な製剤を更に含んでもよい。組成物の許容される成分は、使用される用量及び濃度において、好ましくは受容者に対して無毒である。本発明の医薬組成物は、液体、凍結組成物及び凍結乾燥組成物を含んでもよい。

【0198】

幾つかの実施形態において、前記薬学的に許容されるアジュバントは、薬物の投与に適合し、一般的に安全で、無毒であり、且つ生物学的にもその他の点でも望ましくない、任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤を含んでもよい。

【0199】

幾つかの実施形態において、前記医薬組成物は、腸胃外、経皮、管腔内、動脈内、くも膜下腔内及び／又は鼻腔内投与或いは組織への直接注射を含んでもよい。例えば、前記医薬組成物は、注入又は注射により患者又は対象に投与することができる。幾つかの実施形態において、前記医薬組成物の投与は、静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、局所又は真皮内投与などの、様々な方法によって行うことができる。

【0200】

製造方法
別の態様によれば、本願は、前記キメラ抗原受容体を製造する方法を更に提供する。前記方法は、前記キメラ抗原受容体を発現可能な条件下で、前記細胞を培養することを含んでもよい。

【0201】

本願は、修飾された免疫エフェクター細胞を製造する方法を更に提供する。前記方法は、免疫細胞に前記担体を導入することを含んでもよい。

【0202】

使用
別の態様によれば、本願は、腫瘍の予防、緩和及び／又は治療に使用できる薬物の製造における、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子、前記担体、前記細胞及び／又は前記医薬組成物の使用を更に提供する。

【0203】

別の態様によれば、本願は、腫瘍を予防、緩和及び／又は治療する方法であって、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子、前記担体、前記細胞及び／又は前記医薬組成物を対象に投与することを含んでもよい方法を更に提供する。

【0204】

別の態様によれば、本願は、腫瘍の予防、緩和及び／又は治療に使用される前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子、前記担体、前記細胞及び／又は前記医薬組成物を更に提供する。

【0205】

本願において、前記腫瘍は、ＧＰＲＣ５Ｄ異常発現の腫瘍を含んでもよい。

【0206】

本願において、前記腫瘍は、固形腫瘍及び／又は非固形腫瘍を含んでもよい。

【0207】

本願において、前記腫瘍は、血液腫瘍及び／又はリンパ腫を含んでもよい。

【0208】

本願において、前記腫瘍は、骨髄腫を含んでもよい。本願において、前記骨髄腫は、難治性／再発性多発性骨髄腫を含んでもよい。

【0209】

本願において、前記対象は、ヒト又は非ヒト動物を含んでもよい。

【0210】

別の態様によれば、本願は、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子、前記担体、前記細胞及び／又は前記医薬組成物を含む試薬キット又は投与装置を提供する。

【0211】

任意の理論に制限されることなく、後述する実施例は、本願の発明の各技術的解決手段を解釈するものにすぎず、本願の発明の範囲を制限するものではない。

【0212】

実施例
実施例１人工合成ナノ抗体ライブラリーＮａｎｏＯｒｉ＿１．０を利用した抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のスクリーニング
ＰＤＢデータバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）における反復配列のない２９６本のナノ抗体及びその構造をアラインメントし、ＣＤＲｓ変異ポリシーを決定し、ここで、ＣＤＲ３の長さは、１４、１７及び２１アミノ酸である。市販されているナノ抗体カラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）を骨格として選択し、Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂのヌクレオチド配列の完全遺伝子合成を行い、次にそれをＨＰ１５３ファージベクターにクローンした後、ＨＰ１５３の一本鎖ＤＮＡを抽出し、Ｋｕｎｋｅｌ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法によってナノ抗体のＣＤＲｓを変異させ、二本鎖ＤＮＡを得た。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを事前感染させたコンピテント大腸菌ＳＳ３２０に二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーションし、一晩培養した後にファージ上清を収集し、最終的に多様性１．４４×１０^１０の人工合成ナノ抗体ライブラリーＮａｎｏＯｒｉ＿１．０（原啓生物科技（上海）有限責任公司）を構築し、シードバンクとして抗体配列のスクリーニングを行った。

【0213】

Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入したＧＰＲＣ５Ｄ完全長配列（ｃａｔ：ＨＧ２４４４７－ＵＴ）を、同社の既存のレンチウイルスベクターに構築し、レンチウイルス形質導入を行い、標的細胞ＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ及び標的細胞ＨＥＫ２９３－ＧＰＲＣ５Ｄの過剰発現細胞株を製造した。標的細胞ＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ及びＨＥＫ２９３－ＧＰＲＣ５Ｄを利用して人工合成ナノ抗体ライブラリー（原啓生物科技（上海）有限責任公司）を交互にパンニングし、合計４ラウンドのパンニングを行った。

【0214】

人工合成ナノ抗体ライブラリーＮａｎｏＯｒｉ＿１．０から１つのチューブを取り出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌを加え、再沈殿させて使用した。標的細胞ＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ及びＨＥＫ２９３－ＧＰＲＣ５Ｄを選択して細胞パンニングの交互的なスクリーニングに使用された。５００μＬのファージ及び５００μＬの１０％のＦＢＳ／ＰＢＳ緩衝液を取って最終体積が１ｍＬになるまで混合し、２ｍＬの低吸着ＥＰ管に入れ、４℃で穏やかに回転するか、又は定期的に均一に混合して１時間ブロックした。１４０ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、ＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ細胞を取得し、１０ｍＬのＰＢＳで１回洗浄した。カウントし、生存細胞数が９５％以上に達すると、５％のＦＢＳ／ＰＢＳ緩衝液でＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ細胞を３回洗浄した。次に、細胞数が１×１０^７個になるように１ｍＬの５％のＦＢＳ／ＰＢＳ緩衝液に再懸濁させた。その間に細胞を氷上に置いた。４℃でＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ細胞を１４０ｇで２ｍｉｎ遠心分離し、ブロックされた１ｍＬのファージ抗体ライブラリーに再懸濁させ、４℃又は室温で穏やかに回転するか、又は定期的に均一に混合して２時間結合し、上清を除去し、取得した細胞を１ｍＬの５％のＦＢＳ／ＰＢＳ緩衝液に再懸濁させ、洗浄を２回繰り返し、最後に細胞を再懸濁させた後、ＥＰ管に非特異的に吸着したファージの溶出を回避するために、新しい２ｍＬの低吸着ＥＰ管に交換した。

【0215】

１ｍＬの１００ｎＭのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で細胞を再懸濁させ、室温で１０ｍｉｎインキュベートした後、４℃で１４０ｇで２ｍｉｎ遠心分離し、上清を新しいＥＰ管に移し、２５μＬの２ＭのＴｒｉｓ中和液を加えた。約１ｍＬの中和液を、約５００μＬの７．５％のＦＢＳ／ＰＢＳ緩衝液で更に中和した。

【0216】

３部の同じ吸着細胞ＣＨＯを遠心分離し、処理方法はＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ細胞と同じであった。溶出後に中和したファージをＣＨＯ細胞に再懸濁させた。４℃で穏やかに回転するか、又は定期的に均一に混合して３０ｍｉｎ結合した。４℃で１４０ｇで２ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、次の吸着プロセスに使用され、合計３回行った。最後のファージ上清はＴＧ１細胞の感染に使用された。標的細胞ＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄの数を５×１０^６とし、洗浄回数を３回とするように、同じ方法を用いて２ラウンド目の細胞パンニングを行った。標的細胞をＨＥＫ２９３－ＧＰＲＣ５Ｄに交換し、細胞数を１×１０^６とし、洗浄回数を１０回まで増加させるように、同じ操作方法を用いて３ラウンド目及び４ラウンド目の細胞パンニングを行った。

【0217】

４ラウンドのパンニング後、標的細胞に対する輸出されたファージの顕著な特異的濃縮が観察された。細胞に基づいた単一ファージＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｍｏｎｏ ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ）を利用してパンニングして得られたファージ抗体クローンを同定した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、３×１０^４細胞／ウェルでＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ標的細胞をコーティングし、４℃で一晩置いた。次に５％の脱脂粉乳を用いて非特異的結合部位をブロックし、十分に洗浄した後、モノクローナルファージ上清（脱脂粉乳と混合済み）を９６ウェルプレートに加え、２時間インキュベートし、十分に洗浄した後、Ａｎｔｉ－Ｍ１３－ＨＲＰを加え、４５ｍｉｎ反応させ、十分に洗浄した後、ＴＭＢを加えて発色させ、室温で５～１０ｍｉｎ作用した後、２Ｍの硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍで各ウェルのＯＤ値を測定した。

【0218】

パンニング後、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合することができる３４個のファージ抗体クローンを同定し、配列決定後に一本鎖Ｖ_ＨＨ遺伝子配列を得た。

【0219】

例示的には、３Ｂ５ Ｖ_ＨＨ（Ｖ_ＨＨのアミノ酸配列は配列番号１５に示される）、３Ｅ７ Ｖ_ＨＨ（Ｖ_ＨＨのアミノ酸配列は配列番号１９に示される）、４Ａ２ Ｖ_ＨＨ（Ｖ_ＨＨのアミノ酸配列は配列番号２４に示される）及び４Ｂ３ Ｖ_ＨＨ（Ｖ_ＨＨのアミノ酸配列は配列番号３０に示される）抗体配列を選択し、フローサイトメトリー蛍光選別技術（ＦＡＣＳ）によって、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーター（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社から購入）を使用し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳを緩衝液として、細胞表面標的抗原（ＧＰＲＣ５Ｄ）と抗体の細胞結合活性を検出した。

【0220】

緩衝液を使用して濃度１×１０^６細胞／ｍＬの標的細胞（即ちＭＭ１Ｓ骨髄腫細胞）を調製し、３０μＬ／ウェルで円錐底９６ウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ３８９４）に加え、緩衝液を使用して検出抗体濃度が１０μｇ／ｍＬになるように調製し、３倍の比率で抗体を希釈し、８濃度勾配を形成し、調製された異なる濃度の抗体を、播種された標的細胞に３０μＬ／ウェルで加えて均一に混合し、４℃の冷蔵庫で１時間インキュベートし、１５０μＬ／ウェルで緩衝液を加え、３００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた後に、細胞を緩めるように振とうし、洗浄を１回繰り返し、緩衝液を使用して１：２００の配合比で蛍光二次抗体（ａｂ９８５９３）を調製し、３０μＬ／ウェルで細胞に加えて均一に混合し、４℃の冷蔵庫で３０分間インキュベートし、１５０μＬ／ウェルで緩衝液を加え、３００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた後に、細胞を緩めるように振とうし、洗浄を１回繰り返し、３５μＬ／ウェルで緩衝液を加えて均一に混合した後、フローサイトメーターによって検出した。抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体と細胞表面ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質の結合活性は表１に示された。ここで、ＥＴ１５０－５ｓｃＦｖは、配列が特許出願ＣＮ１０７４２８８２９Ａに示されている陽性対照抗体であり、３Ｂ５Ｖ_ＨＨのアミノ酸配列は配列番号１５に示され、３Ｅ７Ｖ_ＨＨのアミノ酸配列は配列番号１９に示され、４Ａ２Ｖ_ＨＨのアミノ酸配列は配列番号２４に示され、４Ｂ３Ｖ_ＨＨのアミノ酸配列は配列番号３０に示された。結果は、本願に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ Ｖ_ＨＨが何れも、細胞表面のＧＰＲＣ５Ｄに結合することができ、且つ結合能力が陽性対照ＥＴ１５０－５ ｓｃＦｖに相当し、更に陽性対照よりも高いことを示した。

【0221】

【0222】

実施例２ＣＡＲレンチウイルス発現担体の構築
より強い親和性及びより優れた抗腫瘍効果を有する抗ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞製品を得るために、発明者らは、体外機能検証において比較的優れた標的細胞殺傷活性、比較的高い標的増殖能力及び比較的低いｔｏｎｉｃシグナルレベルを有する３Ｂ５Ｖ_ＨＨ、３Ｅ７Ｖ_ＨＨ、４Ａ２Ｖ_ＨＨ及び４Ｂ３Ｖ_ＨＨという４つの抗体配列を、異なるペプチドリンカーを介してＣＡＲ構造に結合して、二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲを構築した。例示的な二重結合ドメインｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ構築物は表１に示された。構築物の製造ステップは以下の通りであった。具体的には、（ＧＧＧＧＳ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（但し、ｎは正の整数であってもよい）によって２つのＶ_ＨＨ配列を融合し、次にＳｐｈＩ及びＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ（ＮＥＢから購入）を使用してＣＡＲレンチウイルスコア空プラスミド（原啓生物科技（上海）有限責任公司が自己構築し、Ｏｒｉ新しい要素を含み、以下にＣＡＲレンチウイルス空担体と略称）を二重酵素消化して８９９２ｂｐ線形化断片を生成し、ゲル切断及び回収後に融合により得られたｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ断片とモル比１：３で混合し、相同組換えを行った後、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。単一コロニーを選択し、配列決定を同定した。二重結合ドメインｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ構造の連結順序は表２に詳しく示された。

【0223】

二重結合ドメインｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ構造の３２種類の異なる組み合わせについて、ＣＡＲ－Ｔ細胞体外増殖活性、標的殺傷能力、サイトカイン分泌レベルなどを含むＣＡＲ－Ｔ体外生物学的機能を検証することによって、そのうちの１種のｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ構造の組み合わせを例示的に選択し、ＯｒｉＣＡＲ－０１７（即ちｏｒｉＣＡＲ－ＤＧ５０８Ｍ）と命名し、次いで単一ドメインのＧ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲ（但し、標的部分のＧ５Ｖ_ＨＨ１のアミノ酸配列は配列番号１９に示される（３Ｅ７））及びＧ５Ｖ_ＨＨ２ ＣＡＲ（但し、標的部分のＧ５Ｖ_ＨＨ２のアミノ酸配列は配列番号３０に示される（４Ｂ３））、陽性対照ＥＴ１５０－８（そのアミノ酸配列は特許番号ＵＳ１０６３３４２６Ｂ２に示される）と共にＣＡＲ－Ｔ体外生物学的機能実験を行い、各ＣＡＲレンチウイルス担体の各部分の要素及び連結順序は図１に詳しく示された。但し、ＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号１に示され、ＣＤ８αヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号２に示され、ＣＤ８α膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号３に示され、４－１ＢＢ共刺激シグナルのアミノ酸配列は配列番号４に示され、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域のアミノ酸配列は配列番号５に示され、Ｏｒｉ新しい要素のアミノ酸配列は配列番号７に示された。リンカーＡの例示的な選択配列は（ＧＧＧＧＳ）５であり、リンカーＢの例示的な選択配列は（ＥＡＡＡＫ）３であった。

【0224】

【0225】

Ａ：（ＧＧＧＧＳ）ｎ、但し、ｎは０以上の整数であり、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列は配列番号３９に示される
Ｂ：（ＥＡＡＡＫ）ｎ、但し、ｎは０以上の整数であり、ＥＡＡＡＫのアミノ酸配列は配列番号４０に示される

【0226】

実施例３ レンチウイルスのパッケージング及びウイルス力価の測定
例として、本発明の構築に使用されるレンチウイルス担体システムは第３世代に属し、当該システムは、Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質をコードするパッケージングプラスミドｐＲＨ１、Ｒｅｖタンパク質をコードするパッケージングプラスミドｐＶＨ３、エンベロープタンパク質ＶＳＶ－ＧをコードするｐＭＨ２プラスミド、及びコアプラスミドといった、Ｖ_ＨＨ配列を含む上記実施例２における各ＣＡＲレンチウイルスプラスミドである、合計４つのプラスミドで構成された。各ＣＡＲレンチウイルスプラスミドにおけるＣＡＲ遺伝子の発現は、伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーターによって調節された。

【0227】

３．１レンチウイルスのパッケージング：
（１）成長状態が良好である約２．５×１０^６個の２９３Ｔ細胞を５ｍＬの２９３Ｔ細胞の完全培地（１０％のＦＢＳを含む高糖ＤＭＥＭ）に入れ、均一に混合した後、６ｃｍの培養皿に接種し（２０～２４ｈ後の細胞のコンフルエンスが８０～９０％になるように確保）、３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターに一晩培養した。
（２）約２０～２４ｈ後、３００ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を取り、合計６．９ｕｇの３種類のプラスミド（質量比ｐＲＨ１：ｐＭＨ２：ｐＶＨ３：ＣＡＲレンチウイルスコアプラスミド＝１：１：２：２の比率で加える）を加え、均一に混合した後、２０．７ｕＬのＦｕＧＥＮＥＨＤトランスフェクト試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１１）を加え、慎重に均一に混合した後、室温で１５～２０ｍｉｎ静置し、次に混合液を６ｃｍの培養皿に慎重に滴下し、培養皿を慎重に振とうし、３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターに一晩培養した。
（３）約２０～２４ｈトランスフェクトした後、６ｃｍの培養皿内の上層液体を慎重に捨て、次に５ｍＬの２９３Ｔ細胞完全培地をゆっくりと加えた。
（４）約４８ｈトランスフェクトした後、６ｃｍの培養皿内の上層液体（死細胞と破片を含む）を収集し、３０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した後、細胞破片が除去された上層ウイルス液を新しい遠心分離管に移し、分注後、－８０℃に保存した。

【0228】

３．２レンチウイルス力価の検出：
（１）上記で製造されたウイルス液を速やかに解凍した。
（２）成長状態が良好である２９３Ｔ細胞（一般に２０世代以内の培養細胞）を取り、上層の廃液を捨て、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、０．２５％のトリプシン（ＧＩＢＣＯ）を使用して３７℃で約３ｍｉｎ消化し、細胞が完全に消化した後、一定の体積の２９３Ｔ細胞完全培地を加えて反応を停止させ、サンプリングしてカウントし、次に細胞密度を２．０×１０^５／ｍＬに調整し、そして最終濃度１０ｕｇ／ｍＬのｐｏｌｙｂｒｅｎｅを加え、更に２．５ｍＬ／ウェルの接種量で細胞を６ウェルプレートに接種した。
（３）次に６ウェルプレートに上記ウイルス液をそれぞれ加え、一般に各ウイルス液を、２ｕＬ、５ｕＬ及び１０ｕＬの３つのサンプルロード勾配を作成し、そしてウイルス液を加えない１～２個のブランクウェルをフローサイトメトリーの陰性対照として追加する必要がある。
（４）細胞培養板を３７℃、５％のＣＯ_２インキュベーターにおいて静置培養した。
（５）細胞を４８ｈ静置培養した後、上層の廃液を捨て、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、０．２５％のトリプシン（ＧＩＢＩＣＯ）を使用して３７℃で約３分間消化し、細胞が完全に消化した後、一定の体積の２９３Ｔ細胞完全培地を加えて反応を停止させ、サンプリングしてカウントし、次に約５×１０^５個の細胞を１．５ｍｌの無菌遠心分離管に入れ、マークを付けた。
（６）ＮＢＳ溶液（１％のウシ新生児血清を含むＰＢＳ溶液）を用いて１．２～１．５ｍＬに補充し、４℃で、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。
（７）各管に１ｍＬのＮＢＳを加え、軽く吹いて均一に混合し、４℃で、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を十分に捨てた。
（８）各管に５０μＬのＮＢＳ及び０．８μｇのＢｉｏｔｉｎ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆ（ａｂ）２抗体（１０９－０６６－００６）を加え、ピペットで軽く吹いて均一に混合し（陰性対照に一次抗体を加えない）、４℃で６０ｍｉｎインキュベートした。
（９）インキュベート完了後、１ｍｌのＮＢＳを直接加えて細胞を再懸濁させ、４℃で、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。
（１０）各管に５０μＬのＮＢＳ及び０．５μｇのＡＰＣ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（５５４０６７）蛍光二次抗体（陰性対照にこのタンパク質を加えない）を加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。
（１１）ステップ（９）を繰り返した。
（１２）各管に２００μＬのＮＢＳを加えて細胞を再懸濁させた。
（１３）ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター上で蛍光発現百分率を検出し、ＦｌｏｗＪｏ－Ｖ１０ソフトウェアを用いてデータを処理した。

【0229】

各試験管の陽性率－陰性対照の陽性率が５％～２０％である場合でのみ、結果は利用可能であり、ウイルス力価の計算式は以下の通りである：

【0230】

【数1】

【0231】

検出により、上記のＶ_ＨＨを含む各ＣＡＲウイルス力価の範囲は１～１０×１０^６ＴＵ／ｍＬであった。

【0232】

実施例４Ｔ細胞の感染及びＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の体外増幅
各組み合わせの二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ抗体配列及び単一Ｖ_ＨＨ ＧＰＲＣ５Ｄ抗体配列のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法は以下の通りである：
（１）Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法により、アフェレーシス装置で採取した血液サンプルからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離して得た（アフェレーシス装置は、上海原能細胞集団方舟計画ボランティアにより提供される）。
（２）ＰＢＭＣは、ＣＤ３陽性磁気ビーズによる選別後、純度＞９５％のＣＤ３^＋Ｔ細胞を得た。Ｔ細胞選別の具体的な方法は、製品の取扱説明書（ＭＡＣＳ、ＤＳ１３０－０５０－１０１）に示された。
（３）Ｔ細胞完全培地（Ｘ－ＶＩＶＯ^１５（Ｌｏｎｚａ）＋５％ＦＢＳ＋サイトカイン）でＣＤ３^＋Ｔ細胞を再懸濁させ、更に３倍の比率で既に洗浄したＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、４０２０３Ｄ）を加え、次にＴ細胞完全培地を補充し、細胞密度が１．０～１．２×１０^６細胞／ｍＬになるように調整し、３７℃、５％のＣＯ_２インキュベーターに置いて活性化培養した。
（４）一般的には、Ｔ細胞を２０～２４ｈ活性化した後、レンチウイルスを形質導入した。
（５）２０～２４ｈ活性化したＴ細胞を収集し、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した後、一定の体積のＴ細胞完全培地で細胞を再懸濁させた後、サンプリングしてカウントし、ウイルス感染多重度（ＭＯＩ）が３の比率で、実施例３で力価が既に測定されたウイルス液をそれぞれ加え、次に最終濃度が５μｇ／ｍＬになるようにｐｏｌｙｂｒｅｎｅを加え、更にＴ細胞完全培地を補充し、細胞密度が０．６～１．０×１０^６／ｍＬになるように調整し、更に細胞を３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターに置いて培養し、別のＴ細胞を取ってレンチウイルス感染を行わず、陰性対照群とした。
（６）ウイルスを約２０～２４ｈ形質導入した後、各群のＴ細胞を収集し、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した後、一定の体積のＴ細胞完全培地で細胞を再懸濁させた後、サンプリングしてカウントし、Ｔ細胞完全培地を補充し、細胞密度が０．５～０．７×１０^６細胞／ｍＬになるように調整した。
（７）その後、１～２日ごとに、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対するカウント処理を行い、実際の状況に応じてＴ細胞完全培地を補充し、細胞密度が０．５～１．０×１０^６細胞／ｍＬになるように調整した。
（８）一般的には、５日目培養する時、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去し、総培養周期は１２日程度であった。

【0233】

実験結果は図２Ａ～２Ｂに示され、活性化及び培養増幅後、二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲレンチウイルス感染後のＴ細胞ＣＡＲの陽性率は５５％～７５％の間に介在し、単一Ｖ_ＨＨ ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲの陽性率は８０％～９０％の間に介在し、ＣＡＲ遺伝子はＴ細胞上で安定して発現され、且つ各群の間に有意差がなかった。図３に示すように、体外ＣＤ３／ＣＤ２８刺激後、ＣＡＲ－Ｔ細胞は安定して増殖し、特に共培養の９日目から、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲＴ及びＯｒｉＣＡＲ－０１７細胞は、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２ ＣＡＲ－Ｔ及び陽性対照ＥＴ１５０－８ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも優れた増殖の可能性を示し、累積増幅倍数はそれぞれ１０００倍及び２００倍であり、細胞学的機能実験に使用できた。

【0234】

実施例５ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の脱顆粒分子ＣＤ１０７ａの発現レベルの測定
ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞毒性の発揮の重要な経路の１つは、パーフォリン及びグランザイムの放出であり、ＣＡＲ－Ｔ細胞の脱顆粒エフェクターもＣＡＲＴ細胞活性化の重要な表現であるため、細胞脱顆粒機能分子ＣＤ１０７ａの発現レベルは、ＣＡＲ Ｔ殺傷エフェクターを評価する重要な指標であった。標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔの活性化能力を検出するために、発明者らは、同時インキュベートウェル内のＣＤ３陽性細胞におけるＣＤ１０７ａの発現含有量を検出し、含有量によってＣＡＲ－Ｔの活性化及び殺傷能力を判断した。

【0235】

図４Ａ～４Ｂに示すように、異なる二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞は、１：１であるエフェクターと標的の比率で４ｈ共培養した後、各群のＣＡＲ－Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａの発現レベルが均一ではなく、何れもＭｏｃｋ Ｔ対照細胞のＣＤ１０７ａの発現よりも高く、但し、ＯｒｉＣＡＲ－０１７のＣＤ１０７ａ発現の陽性率は２８％程度であり、２つの単一ドメイン抗体ＣＡＲＴ細胞群及び陽性対照ＥＴ１５０－８群と比べて、比較的高いＣＤ１０７ａ発現の陽性率を有し、実験は、ＯｒｉＣＡＲ－０１７が特異的標的細胞に対して明らかな脱顆粒エフェクターを有することを示し、良好な活性化及びエフェクター殺傷の可能性があることを示唆した。

【0236】

実施例６ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の体外エフェクター殺傷活性の評価
標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力を正確に検出するために、発明者らは、レンチウイルスによりＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子をＣＨＯ細胞に導入し、更にフローソーターによりＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞、即ちＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ細胞を選別した。標的細胞はＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ細胞で、陰性細胞はＣＨＯ陰性細胞であった。エフェクターと標的の比率が３：１である比率で、９日目培養したエフェクター細胞をそれぞれ、標的細胞と共に２０時間インキュベートし、ＬＤＨ法により、標的細胞の生存状況（即ちＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷力）を判断した。

【0237】

細胞の殺傷毒性は、下記の式により計算された。

【0238】

【数2】

【0239】

図５Ａ～５Ｂに示すように、ブランクエフェクター細胞はＴ細胞と比べて、結果は、二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞に対して明らかな殺傷効果を有し、単一Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞に対して明らかな殺傷効果を有し、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞と比べて、単一ドメイン抗体Ｇ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲ－Ｔ、単一ドメイン抗体Ｇ５Ｖ_ＨＨ２ ＣＡＲ－Ｔ、ダブルエピトープ標的のＯｒｉＣＡＲ－０１７及び陽性対照ＥＴ１５０－８が何れも標的細胞に対する顕著な殺傷効果を有することを示した。特に、エフェクターと標的の比率が１：９である場合、ＭＭ．１Ｓ標的細胞に対するＯｒｉＣＡＲ－０１７の殺傷率は、単一ドメイン抗体ＣＡＲ－Ｔ及び陽性対照ＥＴ１５０－８よりも明らかに高く、７０％に達した。

【0240】

実施例７ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の体外殺傷後のサイトカイン分泌
実施例６を参照し、９６ウェルプレートにおいて標的細胞の殺傷実験を行い、エフェクター細胞と標的細胞の比率は１：１であり、次に各９６ウェルのエフェクター細胞数を２×１０^４個に固定し、標的細胞及びエフェクター細胞を順に加え、各群ではエフェクターと標的の各比率で２つの平行ウェルを設定し、また、各群では２つの単独のエフェクター細胞ウェルを設定する必要があり、エフェクター細胞のバックグラウンド因子の分泌量を検出した。

【0241】

標的細胞殺傷後の約２４時間に、９６ウェルプレートを遠心分離し、各ウェルの上清液を収集し、エフェクター細胞を遠心分離して上清を捨て、Ｘ－ＶＩＶＯで３×１０^５細胞／ｍＬに希釈し、各ウェルから１００μＬを取って使用した。標的無しの細胞（即ち腫瘍細胞と共培養しないＣＡＲ－Ｔ細胞）及びＭＭ．１Ｓ細胞の両方をエフェクターと標的の比率が１：１の比率で丸底９６ウェルプレートに混合し、２４時間同時インキュベートした後、上清を吸引し、Ｒ＆Ｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｋｉｔにより上清液中のＩＬ－２及びＩＦＮ－γの含有量を検出した。

【0242】

図６Ａ～６Ｂに示すように、ＭＭ．１Ｓ標的細胞の刺激下で、二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＬ－２及びＩＦＮ－γの分泌レベルは何れもＭｏｃｋ Ｔ細胞群より高く、各ＣＡＲ－Ｔ群のＩＦＮ－γ分泌は何れもＭｏｃｋ Ｔ細胞群より明らかに高く、且つ２つの単一ドメイン抗体ＣＡＲ－Ｔ細胞群及び陽性対照ＥＴ１５０－８群と比べて、ダブルエピトープ標的のＯｒｉＣＡＲ－０１７は、より高いＩＦＮ－γ分泌レベルを有し、ＯｒｉＣＡＲ－０１７が比較的強い抗原特異的活性化効果を有することを示した。また、各ＣＡＲ－Ｔ群のＩＬ－２分泌は何れもＭｏｃｋ Ｔ細胞より明らかに高いが、ＯｒｉＣＡＲ－０１７のＩＬ－２分泌レベルは単一ドメイン抗体ＣＡＲ－Ｔ細胞と比べて比較的低く、これも、ＯｒｉＣＡＲ－０１７は一定の活性化増殖特性を有することを示した。

【0243】

実施例８ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的増殖能力
この実施例のＣＡＲ－Ｔ細胞の標的増殖能力の検出には、処理されていないＭＭ．１Ｓ細胞を活性化標的細胞として選択した。

【0244】

一般的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞を９～１２日程度培養する時に行われ、各群のＣＡＲ陽性率を事前に検出し、更にブランクエフェクターＴ細胞で各群のＣＡＲ陽性率を一致にするように調整する必要がある（培地は、任意の添加物を含有しないＸ－ＶＩＶＯ^１５培地である）。

【0245】

ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＭＭ．１Ｓ細胞に対して、エフェクターと標的の比率が１：１である比率で１ラウンド目の標的刺激を行い、５日間同時インキュベートした後、全ての細胞を収集し、サンプリングしてカウントし、更に１：３（全ＣＡＲ－Ｔ細胞：新ＭＭ．１Ｓ細胞）の比率で、２ラウンド目の標的刺激を行い、更に４～５日間同時インキュベートした後、３ラウンド目の標的刺激を行った（２種類の細胞間の比率は２ラウンド目の標的刺激と同じである）。３ラウンドの標的刺激の期間に、細胞成長状況に応じて１～２日ごとに、適量のＸ－ＶＩＶＯ^１５培地を補充した。

【0246】

図７Ａに示すように、二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞に刺激された後、異なる程度の標的増殖能力があり、２ラウンドの繰り返し刺激の増殖倍数は５０～２００倍の間であり、対照Ｍｏｃｋ Ｔ細胞と比べて有意差があり、二重結合ドメインＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞が生体内で特異的腫瘍に対して効率的且つ迅速に増幅できることを示唆した。図７Ｂに示すように、各群のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＭ．１Ｓ標的細胞に刺激された後、強い細胞増殖能力が示され、３ラウンドの標的細胞の刺激後の増殖倍数は１０００～３５００倍に達することができ、対照ｍｏｃｋ Ｔ細胞と比べて、増殖活性が明らかに増加し、ここでＧ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は標的細胞の刺激下で増幅効率が最も高かった。また、ＯｒｉＣＡＲ－０１７細胞の標的増殖の増幅効率は、陽性対照ＥＴ１５０－８ ＣＡＲ Ｔ細胞より高かった。この結果は、ＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ Ｔ細胞が標的細胞の刺激によって迅速に増殖し、それが生体内で特異的腫瘍に対して効率的且つ迅速に増幅できることを示した。

【0247】

実施例９ ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞表現型の分析
レンチウイルス感染によって活性化されたＣＤ３^＋ Ｔ細胞がＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ発現の検出で陽性結果を得た後、共培養後の１２日目に細胞の記憶表現型、活性化表現型、枯渇表現型の検出を行った。４群のエフェクターＣＡＲ Ｔ細胞（Ｇ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲ－Ｔ、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２ ＣＡＲ－Ｔ、ＯｒｉＣＡＲ－０１７細胞、陽性対照ＥＲ１５０－８を含む）をそれぞれ収集し、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌの細胞比率を含む各群のＣＤ３^＋Ｔ細胞内の記憶Ｍａｒｋｅｒｓを検出し、ＣＤ２５、ＣＤ６９の細胞比率を含む各群のＣＤ３＋Ｔ細胞内の活性化ｍａｒｋｅｒｓを検出し、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３の細胞比率を含む各群のＣＤ３＋Ｔ細胞内の枯渇ｍａｒｋｅｒｓを検出した。

【0248】

表３及び図８、図９に示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞を１２日目培養する時、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２（Ｔ_ＳＣＭ：７．７９％、Ｔ_ＣＭ：５１．１％）及びＥＴ１５０－８ ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｔ_ＳＣＭ：３．９１％、Ｔ_ＣＭ：４３．１％）と比べて、ＯｒｉＣＡＲ－０１７（Ｔ_ＳＣＭ：２２．７％、Ｔ_ＣＭ：２５．７％）及びＧ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｔ_ＳＣＭ：２２．８％、Ｔ_ＣＭ：３４．４％）は、比較的高い幹細胞記憶（Ｔ_ＳＣＭ）表現型、比較的低い中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）表現型が示され、Ｔ細胞分化の程度が低かった。図１０に示すように、ＣＡＲ Ｔ細胞を１２日目培養する時、ＯｒｉＣＡＲ－０１７及びＧ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化ｍａｒｋｅｒ ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現レベルは、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２及びＥＴ１５０－８ ＣＡＲ Ｔ細胞より低く、即ちＴ細胞の活性化の程度が比較的低く、ＯｒｉＣＡＲ－０１７ Ｔ細胞は、活性化細胞表現型より低いという利点を有した。図１１に示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞を１２日目培養する時、ＯｒｉＣＡＲ－０１７ Ｔ細胞枯渇ｍａｒｋｅｒ ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３の発現レベルは、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２及びＥＴ１５０－８ ＣＡＲ－Ｔ細胞より低く、即ちＴ細胞の枯渇の程度が比較的低く、ＯｒｉＣＡＲ－０１７ Ｔ細胞は、枯渇細胞表現型が低いという利点を有した。

【0249】

【0250】

実施例１０ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫シナプスメカニズムの研究
免疫シナプス（Ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｎａｐｓｅ、ＩＳ）は、特定の活性化受容体と連結した後に形成された構造であり、ＣＡＲ－Ｔ細胞識別抗原であり、増殖及び活性化の重要なステップであり、体の細胞免疫反応及び体液免疫反応の重要な構成部分であり、免疫シナプスの形成は、ＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能に関連し、ＣＡＲ－Ｔレベルでは、免疫シナプス構造の微小管組織中心（ＭＴＯＣ）の分極を測定して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能の利点を更に評価した。ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞は、１：１の比率で５分間共培養した後、Ｎｕｎｃ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅｓに移し、２０分間インキュベートし、４％のＰＦＡで室温で固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後、免疫染色透過化溶液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、室温でインキュベートし、１０％のウマ血清／免疫染色透過化溶液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、室温でインキュベートし、２％のウマ血清／免疫染色透過化溶液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で希釈した一次抗体を加えて室温でインキュベートし、２％のウマ血清／免疫染色透過化溶液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で希釈した二次抗体を加えて室温でインキュベートし、スライドを分離し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄでシールし、乾燥して凝固させた後、レーザー共焦点１００倍のオイルレンズ、紫外線、４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、１０２４×１０２４、Ｚ軸スキャン０．４μｍを利用し、重ね合わせて３Ｄ画像及びビデオを取得した。

【0251】

図１２に示すように、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２及びＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ Ｔ細胞の共焦点イメージングが行われ、但し、細胞核は青色に染色され、γ－微小管タンパク質は緑色に染色され、Ｔ細胞は赤色に染色され、白い矢印はＩＳの微小管組織中心ＭＴＯＣの分極位置を表し、ＭＴＯＣとＩＳとの距離が近いほど、ＩＳ構造が安定した。図１３に示すように、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１及びＧ５Ｖ_ＨＨ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比べて、ＩＳに対するＯｒｉＣＡＲ－０１７細胞のＭＴＯＣ分極レベルが明らかに増加し、ＭＴＯＣとＩＳとの距離の減少として現れ、それによって、より優れた、より安定したＩＳ構造が得られるため、より優れた機能上の利点を有し、ＯｒｉＣＡＲ－０１７細胞媒介性細胞毒性が単一標的のＧＰＲＣ５Ｄ Ｖ_ＨＨ１及びＧＰＲＣ５ＤＶ_ＨＨ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも優れることを示した。

【0252】

実施例１１．ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞のマウス体内実験
発明者らは、ＮＳＧマウス体内でＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍除去と腫瘍抑制作用を更に検証した。具体的には、実験は、各群５匹のマウスで、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲ－Ｔ、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２ ＣＡＲ－Ｔ、ＥＴ１５０－８ ＣＡＲ－Ｔ及びＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔ細胞群といった５群に分けられた。まず、ＮＳＧマウス皮下に、１×１０^７細胞／匹の用量でＭＭ１Ｓ細胞を接種し、約２週間後（腫瘍サイズが５０～１５０ｍｍ^３）、尾静脈に１０～１２日間培養したＣＡＲ－Ｔ（又はＴ）細胞を注射し、用量は何れも１．６×１０^６ＣＡＲ－Ｔ細胞／匹の用量であった（各マウスに接種された細胞の総数はＴ細胞と一致するように調整された）。ＣＡＲ－Ｔ（又はＴ）細胞の接種後、ＣＡＲ－Ｔ（又はＴ）細胞接種後の７日目及び１４日目に、マウス末梢血中のサイトカイン分泌を検出し、マウス腫瘍サイズ及び体重を週に３回測定し、３週間観察した。

【0253】

ＮＳＧマウス体内腫瘍抑制の実験フローは図１４に示された。図１５Ａに示すように、注射後の７日目に分泌されたサイトカインＩＦＮ－γを検出し、ＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔ細胞群で産生されたＩＦＮ－γはＧ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲ－Ｔ、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２ ＣＡＲ－Ｔ及び陽性対照ＥＴ１５０－８ ＣＡＲ－Ｔより顕著に高かった。安全性に関しては、図１５Ｂに示すように、マウス体重は時間の経過と共に安定した増加傾向を示し、全てのＣＡＲ－Ｔ細胞実験群はＭｏｃｋ Ｔ群のマウスの体重曲線の傾向と一致した。また、ＯｒｉＣＡＲ－０１７注射後のマウスの毛皮は明るく、マウスの行動などのバイタルサインは正常であり、ＯｒｉＣＡＲ－０１７はマウス体内で良好な安全性を有することを実証した。体内腫瘍抑制効果に関しては、図１５Ｃに示すように、単一結合ドメインのＧ５Ｖ_ＨＨ１ ＣＡＲ－Ｔ及びＧ５Ｖ_ＨＨ２ ＣＡＲ－ Ｔ細胞、並びに陽性対照ＥＴ１５０－８ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比べて、ＯｒｉＣＡＲ－０１７細胞群は、非常に顕著な抗腫瘍効果を示し、腫瘍抑制率は１００％近く達することができた。図１５Ｄに示すように、ＯｒｉＣＡＲ－０１７細胞群は、研究期間中にマウスの生存率が１００％に達し、そのマウス生存率は単一結合ドメインのＶ_ＨＨ ＣＡＲ Ｔ細胞群及びＰｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ陽性対照ＥＴ１５０－８ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもはるかに高く、ＯｒｉＣＡＲ－０１７が臨床的に比較的優れた抗腫瘍活性を示す可能性があることを示した。

【0254】

人体内の血液腫瘍の分布を更にシミュレーションするために、発明者らは、生体内イメージング技術に基づいて、Ｂ－ＮＳＧマウス体内でＯｒｉＣＡＲ－０１７細胞の腫瘍除去、腫瘍抑制作用を更に検証した。Ｂ－ＮＳＧマウスの尾静脈にＭＭ１Ｓ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞を注射し、マウスの生物発光強度に応じて、各群５匹でランダムに群分けし、事前に凍結保存された、異なる用量のＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔ又はＭｏｃｋ Ｔ細胞を尾静脈に注射し、ＣＡＲ－Ｔの再注入後、毎週火曜日及び木曜日に動物生体内イメージングシステムを用いてマウス体内の生物発光変化を観察し、マウスの体重及び健康状態を観察し、観察期間中、サイトカインを検出するためにマウスの眼球又は尾静脈から３回採血し、ＢＤフローサイトメトリーによりＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞比率を検出した。

【0255】

図１６に示すように、Ｍｏｃｋ Ｔと比べて、異なる用量のＯｒｉＣＡＲ－０１７凍結保存細胞は何れも、明らかな抗腫瘍活性を示し、マウスの腫瘍負荷を大幅に軽減した。但し、低用量群は再注入後の７日目に効率的な腫瘍除去効果を示したが、ＯｒｉＣＡＲ－０１７中程度用量及び高用量群は再注入後の短期間内（４日目）に明らかな腫瘍抑制活性を示し、特に高用量群では、再注入後に腫瘍を迅速に除去すると共に、腫瘍成長を継続的に抑制することができ、２１日目に高用量群の腫瘍の完全除去率は６０％に達することができた。

【0256】

実施例１２．難治性／再発性多発性骨髄腫患者におけるＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔの臨床研究
難治性又は再発性多発性骨髄腫（「ｒ／ｒ ＭＭ」）と診断されたヒト患者の治療におけるＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の安全性及び有効性を決定するために、単群、非盲検、第Ｉ相多施設臨床研究を行った。臨床試験登録情報は、ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖであり、識別子はＮＣＴ０５０１６７７８であった。

【0257】

この研究では、患者の自己Ｔ細胞に由来するＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて難治性／再発性多発性骨髄腫患者を治療した。１×１０^６／ｋｇ、３×１０^６／ｋｇ、６×１０^６／ｋｇのＣＡＲ^＋ Ｔ細胞用量は静脈内注射により各患者に投与された。この研究の１日目～３０日目に、患者の有害事象を監視し、評価のために患者サンプルを取得した。ＣＡＲ Ｔ投与後、全ての患者に対して少なくとも３６か月間追跡調査した。研究の主要結果は、ＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔ細胞注射後１～３０日以内の、有害事象共通用語基準（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ、ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０によって評価された治療関連の有害事象の発生を測定し、副次的な結果は、ＣＡＲ－Ｔ誘発性抗骨髄腫応答を評価し、例えばＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与前及び投与後に血清中の異常免疫グロブリンレベル及び患者骨髓中の多発性骨髄腫細胞の数を測定した。研究の有効性の目標は、病理学的完全応答の比率、３年間の無病生存率、３年間の無増悪生存率を含む。２０２２年のＡＳＣＯ年次総会（２０２２ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｃｏｐｕｂｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／ａｂｓ／１０．１２００／ＪＣＯ．２０２２．４０．１６＿ｓｕｐｐｌ．８００４）でこの研究を詳細に紹介した。２０２２年４月３０日の時点で、１２例の患者がこの研究に登録され、アフェレーシスを受け、１０例の患者がＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－Ｔ注入が完了し、年齢中央値は６４歳（範囲、４１～７１）、以前の治療ライン数の中央値は５．５（範囲、３～１７）であった。５例（５０．０％）の患者が以前に抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ治療を受けた。用量制限性毒性は発生しなかった。最も一般的な治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）は、好中球減少症、血小板減少症、白血球減少症、リンパ球減少症及び貧血であった。神経毒性は報告されていなかった。全患者がサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を発症し、９例がグレード１、１例がグレード２であった。従来の介入（トシリズマブ及びステロイド）の後、全てのＣＲＳが迅速に緩和した。発症までの時間の中央値は２日（範囲、１～９）、持続期間の中央値は６日（範囲、３～９）であった。客観的奏効率（ＯＲＲ）は１００％、ＭＲＤは１００％陰性、完全奏功／厳密に完全奏効（ＣＲ／ｓＣＲ）率は６０％であった。以前に抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ治療を受けた５例の患者に対して治療効果を評価することができ、２例はｓＣＲを達成し、２例はＶＧＰＲを達成し、１例はＰＲを達成し、具体的には表４及び５に示された。

【0258】

【0259】

【0260】

ＯＲＲ＝（ＣＲ＋ｓＣＲ＋ＶＧＰＲ＋ＰＲ例数）／治療効果を評価できる集団内の対象の例数×１００％。
ＤＣＲ＝（ＣＲ＋ｓＣＲ＋ＶＧＰＲ＋ＰＲ＋ＭＲ例数）／治療効果を評価できる集団内の対象の例数×１００％。
百分率は、治療効果を評価できる集団内の各用量群に登録した対象の例数に基づいて計算された。
［１］Ｃｌｏｐｐｅｒ Ｐｅａｒｓｏｎ法に基づいて両側対応ＣＩを計算した。

【0261】

実施例１３．ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞における２つのＶ_ＨＨドメインの異なるエピトープの結合実験
ＯｒｉＣＡＲ－０１７ ＣＡＲ－ＴのＧＰＲＣ５Ｄ Ｖ_ＨＨドメインのエピトープを同定した。ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する異なるエピトープの２つの異なる抗ＧＰＲＣ５Ｄ Ｖ_ＨＨドメインを有する例示的な二価ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲを構築した。Ｇ５Ｖ_ＨＨ１及びＧ５Ｖ_ＨＨ２を含む二価／ダブルエピトープＣＡＲをＯｒｉＣＡＲ－０１７として命名し、例示的な表２に列挙された二重結合ドメインのＧＰＲＣ５Ｄ ｄｏｕｂｌｅ Ｖ_ＨＨ ＣＡＲであった。

【0262】

１３．１ＦＯＲＴＥＢＩＯ抗体測定
Ｇ５Ｖ_ＨＨ１及びＧ５Ｖ_ＨＨ２抗体配列を、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片（ｈＩｇＧ１Ｆｃ）配列を含むｐ３．４－ｈＩｇＧ１Ｆｃの真核担体にクローンし、ＧＰＲＣ５Ｄ Ｖ_ＨＨ－ｈＩｇＧ１Ｆｃの組換え発現を促進して組換えタンパク質を取得し、精製した。Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－ｈＩｇＧ１Ｆｃ及びＧ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃの、ＧＰＲＣ５Ｄに対する親和性及びＮ末端ペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ）に対する親和性を測定した。簡単に言えば、ビオチン（ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ、２１３２７）を用いてヒトＧＰＲＣ５ＤのＮ末端ペプチド（＞ｓｐ｜Ｑ９ＮＺＤ１｜１～２７：ＭＹＫＤＣＩＥＳＴＧＤＹＦＬＬＣＤＡＥＧＰＷＧＩＩＬＥ）タンパク質を標識した。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により、分子間相互作用解析装置ｆｏｒｔｅｂｉｏｏｃｔｅｔＲＥＤ３８４（ＰＡＬＬ）を用いて抗原と抗体の間の結合動態分析を行った（抗原、抗体は何れも、０．１％のＢＳＡ及び０．０２％のＴｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液で希釈した）。ビオチン結合された濃度２０ｎＭの抗原を用いてＳＡセンサに固定し、３ｍｉｎ結合した後、倍率希釈された抗体（即ちＧ５Ｖ_ＨＨ１及びＧ５Ｖ_ＨＨ２抗体）溶液に５ｍｉｎ結合し、最後に５ｍｉｎ解離した。得られた結果は、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ９．０ソフトウェア（ｆｏｒｔｅｂｉｏ）によってデータ分析を行うことで、抗原と抗体の結合強度を算出し、ＫＤ値、Ｋａ（１／Ｍｓ）値及びＫｄ（１／ｓ）値を得た。Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－ｈＩｇＧ１ＦｃとＧ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃの結合親和性結果は図１７に示され、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１抗体検出の回帰方程式では、サンプルデータポイントのフィッティング適合度Ｒ２値（０．７９１４）が低く、モデルは信頼できなかった。Ｇ５Ｖ_ＨＨ１がＧＰＲＣ５ＤのＮ末端ペプチドに結合しないが、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２抗体がＮ末端ペプチドに結合し、ＫＤが７．６９Ｅ－０８Ｍであることが分かった。Ｇ５Ｖ_ＨＨ１、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２がＧＰＲＣ５Ｄ標的に結合するエピトープに違いがあることを更に示した。

【0263】

１３．２競合性結合の測定
細胞に基づいた競合的結合測定によってＧ５Ｖ_ＨＨ１及びＧ５Ｖ_ＨＨ２の異なるエピトープ結合を更に検証した。ヒトＧＰＲＣ５Ｄを過剰発現する安定的なＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ）は測定に使用された。簡単に言えば、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１及びＧ５Ｖ_ＨＨ２を、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片（ｈＩｇＧ１Ｆｃ）配列を含むｐ３．４－ｈＩｇＧ１Ｆｃの真核担体及び６×Ｈｉｓラベルを含む発現担体にクローンし、ＧＰＲＣ５Ｄ Ｖ_ＨＨ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ及びＧＰＲＣ５Ｄ Ｖ_ＨＨ－Ｈｉｓの組換え発現を促進して精製し、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－ｈＩｇＧ１Ｆｃ、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃ、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓ、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２－Ｈｉｓ組換えタンパク質を取得した。

【0264】

ＰＢＳ緩衝液を使用して濃度１×１０^６細胞／ｍＬのＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ標的細胞を調製し、３０μＬ／ウェルで円錐底９６ウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ３８９４）に加え、ＰＢＳ緩衝液を使用して濃度が３０μｇ／ｍＬとなるように検出抗体Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－ｈＩｇＧ１Ｆｃ、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃを調製し、３倍の比率で抗体を希釈し、８濃度勾配（最終濃度０）を形成し、調製された異なる濃度の抗体を、播種された標的細胞に３０μＬ／ウェルで加えて均一に混合し、４℃の冷蔵庫で１時間インキュベートし、１５０μＬ／ウェルで緩衝液を加え、３００ｇで５分間遠心分離して上清を捨て、洗浄を１回繰り返し、緩衝液を使用して１：２００の配合比でヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異性、ａｂ９８５９３）蛍光二次抗体を調製し、３０μＬ／ウェルで細胞に加えて均一に混合し、４℃の冷蔵庫で３０分間インキュベートし、１７０μＬ／ウェルで緩衝液を加え、３００ｇで５分間遠心分離して上清を捨て、洗浄を１回繰り返し、３５μＬ／ウェルで緩衝液を加えて均一に混合した後、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーター（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社から購入）により検出された。フローサイトメトリー親和性結合実験の分析結果により、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－ｈＩｇＧ１Ｆｃ、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃの結合活性ＥＣ８０値が分かり、図１８に示された。

【0265】

ＥＣ８０に対応する抗体濃度に従って、０．６５ｎｇ／ｍＬのＧ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃは細胞総数３×１０^４のＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ細胞と共に１ｈインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液を用いて濃度が８０μｇ／ｍＬとなるように検出抗体Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓを調製し、３倍の比率で抗体を希釈し、１２濃度勾配（最終濃度０）を形成し、次に連続希釈したＧ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓ組換え抗体をウェルプレートに加え、そして４℃で更に１ｈインキュベートした。インキュベート後、１４０μＬ／ウェルで緩衝液を加え、３００ｇで５分間遠心分離して上清を捨て、洗浄を１回繰り返し、緩衝液を使用して１：２００の配合比でヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異性、ａｂ９８５９３）蛍光二次抗体を調製し、３０μＬ／ウェルで細胞に加えて均一に混合し、４℃の冷蔵庫で３０分間インキュベートし、１７０μＬ／ウェルで緩衝液を加え、３００ｇで５分間遠心分離して上清を捨て、洗浄を１回繰り返し、３５μＬ／ウェルで緩衝液を加えて均一に混合した後、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーター（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社から購入）により検出された。測定対照として、上記と同じ手順に従って、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃの非存在下でＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ細胞で直接インキュベートし、連続希釈したＧ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓは、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－ＨｉｓとＣＨＯ－ＧＰＲＣ５Ｄ細胞の結合の検出に使用された。

【0266】

図１９に示すように、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃと細胞が飽和して結合する場合、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓは依然として抗体勾配依存性を有し、且つＧ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃの非存在下でのＧ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓ結合活性と近く、即ちＧ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃの存在はＧ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓへの結合に影響を与えなかった。また、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃと細胞が飽和して結合する場合、同時にＧ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓを加えて標的細胞に結合すると、Ｇ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃは、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓの非存在下でのＧ５Ｖ_ＨＨ２－ｈＩｇＧ１Ｆｃ結合活性と近く、即ちＧ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓの存在はＧ５Ｖ_ＨＨ１－Ｈｉｓへの結合に影響を与えなかったことが分かった。以上から分かるように、Ｇ５Ｖ_ＨＨ１及びＧ５Ｖ_ＨＨ２がＧＰＲＣ５Ｄ標的に結合するエピトープに違いがあり、両者は互いに影響しなかった。

【0267】

実施例１４．ＣＡＲ抗体配列と異なる種の標的抗原の交差結合の研究
ヒトＧＰＲＣ５Ｄ、カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ（配列番号３６）、マウスＧＰＲＣ５Ｄ（配列番号３７）、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ対照サブタイプＧＰＲＣ５Ａ（配列番号３８）を発現する安定的なトランスフェクトＣＨＯ細胞を使用し、フローサイトメトリー同定により、ヒト、カニクイザル及びマウスＧＰＲＣ５Ｄへの異なる抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の結合を評価した。簡単に言えば、ＰＢＳ緩衝液を使用して濃度１×１０^６細胞／ｍＬのＣＨＯ－ＨｕＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＨＯ－ＣｙＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＨＯ－ＭｕＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＨＯ－ＨｕＧＰＲＣ５Ａ標的細胞を調製し、３０μＬ／ウェルでＶ型底９６ウェルプレートに加え、ＰＢＳ緩衝液を用いて濃度が３０μｇ／ｍＬとなるように検出抗体Ｄｏｕｂｌｅ－Ｖ_ＨＨ ｈＦｃを調製し、３倍の比率で抗体を希釈し、８濃度勾配（最終濃度０）を形成し、調製された異なる濃度の抗体を、播種された標的細胞に３０μＬ／ウェルで加えて均一に混合し、４℃の冷蔵庫で１時間インキュベートし、１５０μＬ／ウェルで緩衝液を加え、３００ｇで５分間遠心分離して上清を捨て、洗浄を１回繰り返し、緩衝液を使用して１：２００の配合比でＤｙｎａ６５０－ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異性、ａｂ９８５９３）蛍光二次抗体を調製し、３０μＬ／ウェルで細胞に加えて均一に混合し、４℃の冷蔵庫で３０分間インキュベートし、１７０μＬ／ウェルで緩衝液を加え、３００ｇで５分間遠心分離して上清を捨て、洗浄を１回繰り返し、３５μＬ／ウェルで緩衝液を加えて均一に混合した後、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーター（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社から購入）により検出された。

【0268】

フローサイトメトリー結合活性検出結果は図２０に示され、結合特性のまとめは表６に示された。二重結合ドメインＶ_ＨＨ－ｈＦｃ抗体では、二重結合ドメインＶ_ＨＨ－ｈＦｃ抗体がヒトＧＰＲＣ５Ｄとの結合活性が強く、マウスＧＰＲＣ５Ｄ、カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄとの結合活性が比較的弱いことを示し、ブランクＣＨＯ細胞への二重結合ドメインＶ_ＨＨ－ｈＦｃ抗体の結合が検出されず、ヒトＧＰＲＣ５Ｄと同一ファミリーの異なるサブタイプを発現するＧＰＲＣ５ＡのＣＨＯ細胞への二重結合ドメインＶ_ＨＨ－ｈＦｃ抗体の結合が検出されず、本製品に適用される二重結合ドメインＶ_ＨＨ－ｈＦｃ抗体の高度特異性が様々なオフターゲット副作用の発生リスクを低減できることが分かった。

【0269】

【0270】

前述の詳細な説明は、解釈や例示的な方法により提供され、添付される特許請求の範囲を制限するものではない。現在、本願に列挙された実施形態の様々な変化は、当業者にとって明らかであり、且つ添付される特許請求の範囲及びその同等方法の範囲内に保留されている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-08-07

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体であって、
Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣのグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）タンパク質を標的とする第１抗原結合ドメインと、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質を標的とする第２抗原結合ドメインと、を含み、前記第１抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域ＶＨのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含み、前記ＶＨは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含む、
キメラ抗原受容体。

【請求項2】

前記第１抗原結合ドメイン及び／又は前記第２抗原結合ドメインは、抗体若しくはその抗原結合断片を含み、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及びｄＡｂを含む、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号３４（ＩＸ _１ Ｘ _２ Ｘ _３ Ｘ _４ ＧＸ _５ Ｔ、但し、Ｘ _１ はＮ又はＴ、Ｘ _２ はＳ又はＷ、Ｘ _３ はＧ又はＳ、Ｘ _４ はＤ又はＧ、Ｘ _５ はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２７の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２６の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、並びに配列番号８、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２５の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記第１抗原結合ドメインはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（２）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに
（４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記第１抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨＨである、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号３４（ＩＸ _１ Ｘ _２ Ｘ _３ Ｘ _４ ＧＸ _５ Ｔ、但し、Ｘ _１ はＮ又はＴ、Ｘ _２ はＳ又はＷ、Ｘ _３ はＧ又はＳ、Ｘ _４ はＤ又はＧ、Ｘ _５ はＮ、Ｓ又はＴ）に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、並びに配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２７の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２６の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、並びに配列番号８、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２５の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

前記第２抗原結合ドメインはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（２）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに
（４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、且つ配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記第２抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号３０の何れか１つに示されるアミノ酸配列を含むＶＨＨである、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項11】

前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列は、
（１）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（２）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（３）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（４）前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（５）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（６）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（７）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（８）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（９）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１０）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１１）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１２）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１３）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１４）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
（１５）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、並びに
（１６）前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第１抗原結合ドメイン、前記ＨＣＤＲ１が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む第２抗原結合ドメイン、
からなる群より選ばれる任意の一組のアミノ酸配列である、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項12】

前記第１抗原結合ドメイン及び前記第２抗原結合ドメインは、リンカーを介して連結され、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列及び／又は（ＥＡＡＡＫ）ｎのアミノ酸配列を含み、但し、前記ｎは１～１０の任意の正の整数である、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項13】

共刺激シグナル領域、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通領域、ヒンジ領域及び／又はシグナルペプチドを含み、前記共刺激シグナル領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３のリガンド、ＣＤ４０及びＭｙＤ８８からなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する細胞内共刺激シグナル領域を含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４ Ｎｅｆ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＨＳＫＶ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２及び少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する細胞内シグナル領域を含み、前記膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及びＳＬＡＭからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含み、前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０及びＬＩＧＨＴからなる群より選ばれる１種又は複数種のタンパク質に由来するヒンジ領域を含み、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８タンパク質のシグナルペプチドに由来する、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項14】

低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質又はその断片を更に含む、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項15】

１種又は複数種の単離された核酸分子であって、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする、
核酸分子。

【請求項16】

ベクターであって、
請求項１５に記載の核酸分子を含む、
ベクター。

【請求項17】

請求項１５に記載の核酸分子を含む、
細胞。

【請求項18】

Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球、末梢血単核細胞、胚性幹細胞、リンパ前駆細胞及び／又は多能性幹細胞を含む免疫エフェクター細胞である、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体を含む、細胞。

【請求項19】

医薬組成物であって、
請求項１に記載のキメラ抗原受容体及び薬学的に許容される担体を含む、
医薬組成物。

【請求項20】

腫瘍の予防、治療及び／又は緩和に使用するための、請求項１に記載のキメラ抗原受容体を含む、医薬組成物。

【国際調査報告】