特表 2025-505148 核酸ガイド型ニッカーゼ融合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-21

(54)【発明の名称】核酸ガイド型ニッカーゼ融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/16 20060101AFI20250214BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20250214BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250214BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250214BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20250214BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250214BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20250214BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250214BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250214BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20250214BHJP

【ＦＩ】

C12N9/16 ZNA

C12N15/55

C12N1/15

C12N1/19

C12N9/12

C12N5/10

C07K19/00

C12N15/62 Z

C12N15/09 110

C12N15/54

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024545893

(86)(22)【出願日】2023-02-02

(85)【翻訳文提出日】2024-09-27

(86)【国際出願番号】 US2023061877

(87)【国際公開番号】W WO2023150637

(87)【国際公開日】2023-08-10

(31)【優先権主張番号】63/306,062

(32)【優先日】2022-02-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/421,609

(32)【優先日】2022-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518454564

【氏名又は名称】インスクリプタ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジュハン

(72)【発明者】

【氏名】マイツ、ベンジャミン

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA60

4H045AA10

4H045BA41

4H045DA89

4H045EA60

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、標的核酸分子の編集に有用な組成物及び方法を提供する。本開示は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド、逆転写酵素、及び融合タンパク質並びにＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド、逆転写酵素、及び融合タンパク質を使用して核酸分子をインビボ及びインビトロの両方で編集する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項2】

配列番号１と比較してＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項3】

配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項4】

配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項5】

配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項6】

配列番号１と比較してＳ４０９Ｒアミノ酸置換、Ｌ５００Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項7】

配列番号１と比較してＶ１１４３Ｔアミノ酸置換及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項8】

配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項9】

配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｒアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項10】

配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｄ１１３９Ｎアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項11】

配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、Ａ１２２１Ｈアミノ酸置換、及びＫ１２８５Ｒアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項12】

配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項13】

少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか一項に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸配列。

【請求項15】

請求項１～１３のいずれか一項に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及び核酸分子を含む核タンパク質複合体。

【請求項16】

前記核酸分子は、（ａ）ガイド；（ｂ）ホモロジーアーム；又は（ｃ）ガイド及びホモロジーアームを含む、請求項１５に記載の核タンパク質複合体。

【請求項17】

前記核酸分子は、ＲＮＡ分子である、請求項１５又は１６に記載の核タンパク質複合体。

【請求項18】

請求項１～１３のいずれか一項に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む真核細胞。

【請求項19】

請求項１４に記載の核酸配列を含む真核細胞。

【請求項20】

請求項１５～１７のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体を含む真核細胞。

【請求項21】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む融合タンパク質。

【請求項22】

逆転写酵素をさらに含む、請求項２１に記載の融合タンパク質。

【請求項23】

前記逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＴｆ１逆転写酵素である、請求項２２に記載の融合タンパク質。

【請求項24】

前記Ｔｆ１逆転写酵素は、配列番号１２と比較してＤ３６４Ｎアミノ酸置換を含む、請求項２３に記載の融合タンパク質。

【請求項25】

前記Ｔｆ１逆転写酵素は、配列番号１３を含む、請求項２３に記載の融合タンパク質。

【請求項26】

前記逆転写酵素は、ＨＩＶ－１（ヒト免疫不全ウイルス）逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、及びＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素からなる群から選択される逆転写酵素に由来する、請求項２２に記載の融合タンパク質。

【請求項27】

少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項28】

リンカーアミノ酸配列を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項29】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドと前記逆転写酵素との間に位置するリンカーアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の融合タンパク質。

【請求項30】

配列番号１２と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＴｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質。

【請求項31】

前記Ｔｆ１逆転写酵素は、配列番号１２と比較してＤ３６２Ｎアミノ酸置換を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。

【請求項32】

前記Ｔｆ１逆転写酵素は、配列番号１３を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。

【請求項33】

ニッカーゼをさらに含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項34】

前記ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、請求項３３に記載の融合タンパク質。

【請求項35】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項36】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項37】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項38】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項39】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項40】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項41】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項42】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＭＡＤ２０１９ポリペプチドである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項43】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項44】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドである、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項45】

配列番号１と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをさらに含み、前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａニッカーゼは、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項46】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項47】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項48】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項49】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項50】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＳ４０９Ｒアミノ酸置換、Ｌ５００Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項51】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＶ１１４３Ｔアミノ酸置換及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項52】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項53】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｒアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項54】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｄ１１３９Ｎアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項55】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、Ａ１２２１Ｈアミノ酸置換、及びＫ１２８５Ｒアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項56】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項57】

少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含む、請求項３０～５６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項58】

リンカーアミノ酸配列を含む、請求項３０～５７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項59】

前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドと前記Ｔｆ１逆転写酵素との間に位置するリンカーアミノ酸配列を含む、請求項４５～５６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項60】

前記ニッカーゼと前記Ｔｆ１逆転写酵素との間に位置するリンカーアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の融合タンパク質。

【請求項61】

請求項２１～６０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。

【請求項62】

請求項２１～６０のいずれか一項に記載の融合タンパク質及び核酸分子を含む核タンパク質複合体。

【請求項63】

前記核酸分子は、（ａ）ガイド；（ｂ）ホモロジーアーム；又は（ｃ）ガイド及びホモロジーアームを含む、請求項６２に記載の核タンパク質複合体。

【請求項64】

前記核酸分子は、ＲＮＡ分子である、請求項６２又は６３に記載の核タンパク質複合体。

【請求項65】

請求項２１～６０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む真核細胞。

【請求項66】

請求項６１に記載の核酸配列を含む真核細胞。

【請求項67】

請求項６２～６４のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体を含む真核細胞。

【請求項68】

ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを細胞に提供する方法であって、
（ａ）細胞を得ること；及び
（ｂ）前記細胞に、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド、又は前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を提供すること
を含む方法。

【請求項69】

融合タンパク質を細胞に提供する方法であって、
（ａ）細胞を得ること；及び
（ｂ）前記細胞に、請求項２１～６０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は前記融合タンパク質をコードする核酸分子を提供すること
を含む方法。

【請求項70】

前記細胞に、（ａ）ガイド；（ｂ）ホモロジーアーム；又は（ｃ）ガイド及びホモロジーアームをコードする核酸分子をトランスフェクトすることをさらに含む、請求項６８又は６９に記載の方法。

【請求項71】

前記ガイドは、前記細胞内で前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドとの核タンパク質複合体を形成するＲＮＡ分子である、請求項６９に記載の方法。

【請求項72】

前記ガイドは、前記細胞内の標的核酸分子と相補的な配列を含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記核タンパク質複合体は、前記細胞内の前記標的核酸分子を編集する、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ガイドは、前記細胞内で前記融合タンパク質との核タンパク質複合体を形成するＲＮＡ分子である、請求項７０に記載の方法。

【請求項75】

前記ガイドは、前記細胞内の標的核酸分子と相補的な配列を含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記核タンパク質複合体は、前記細胞内の前記標的核酸分子を編集する、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記標的核酸分子は、前記細胞の核ゲノム内に位置する、請求項７２、７３、７５、及び７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記標的核酸分子は、前記細胞のミトコンドリアゲノム内に位置する、請求項７２、７３、７５、及び７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記提供は、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群から選択される方法を含む、請求項６８～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

少なくとも１つの真核細胞を編集する方法であって、
（ａ）
（ｉ）前記少なくとも１つの真核細胞に、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド、又は前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を；及び
（ｉｉ）前記少なくとも１つの真核細胞に、ガイドＲＮＡであって、前記真核細胞のゲノム内の標的核酸分子と相補的な核酸配列を含むガイドＲＮＡ又は前記ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を
導入することであって；
前記ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及び前記ガイドＲＮＡは、前記少なくとも１つの真核細胞内で核タンパク質複合体を形成し、前記核タンパク質複合体は、前記標的核酸分子の一方の鎖を開裂させ、少なくとも１つの編集は、前記標的核酸分子の対照バージョンと比較して前記標的核酸分子内で作製されること；並びに
（ｂ）前記少なくとも１つの編集を含む少なくとも１つの真核細胞を同定すること
を含む方法。

【請求項81】

少なくとも１つの真核細胞を編集する方法であって、
（ａ）
（ｉ）前記少なくとも１つの真核細胞に、請求項２１～６０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は前記融合タンパク質をコードする核酸分子を；及び
（ｉｉ）前記少なくとも１つの真核細胞に、ガイドＲＮＡであって、前記真核細胞のゲノム内の標的核酸分子と相補的な核酸配列を含むガイドＲＮＡ又は前記ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を
導入することであって；
前記融合タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは、前記少なくとも１つの真核細胞内で核タンパク質複合体を形成し、前記核タンパク質複合体は、前記標的核酸分子の一方の鎖を開裂させ、少なくとも１つの編集は、前記標的核酸分子の対照バージョンと比較して前記標的核酸分子内で作製されること；並びに
（ｂ）前記少なくとも１つの編集を含む少なくとも１つの真核細胞を同定すること
を含む方法。

【請求項82】

前記方法のステップ（ａ）は、少なくとも１つのホモロジーアーム、又は前記ホモロジーアームをコードする核酸分子を、前記真核細胞に導入することをさらに含み、前記少なくとも１つのホモロジーアームは、前記少なくとも１つの編集を含む核酸配列を含む、請求項８０又は８１に記載の方法。

【請求項83】

前記少なくとも１つの編集は、挿入を含む、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記少なくとも１つの編集は、欠失を含む、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記少なくとも１つの編集は、置換を含む、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記少なくとも１つの編集は、単一ヌクレオチドの置換を含む、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

単一ヌクレオチドの前記置換は、トランシジョンを含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

単一ヌクレオチドの前記置換は、トランスバージョンを含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項89】

配列番号２４と少なくとも８０％同一の核酸配列を有する足場領域を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。

【請求項90】

前記核酸配列は、配列番号２４と少なくとも９０％同一である、請求項８９に記載のｇＲＮＡ。

【請求項91】

前記核酸配列は、配列番号２４と少なくとも９５％同一である、請求項８９に記載のｇＲＮＡ。

【請求項92】

前記核酸配列は、配列番号２４と１００％同一である、請求項８９に記載のｇＲＮＡ。

【請求項93】

融合タンパク質及び請求項８９～９２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む核タンパク質複合体。

【請求項94】

前記融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む、請求項９３に記載の核タンパク質複合体。

【請求項95】

前記融合タンパク質は、逆転写酵素を含む、請求項９３又は９４に記載の核タンパク質複合体。

【請求項96】

ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及び請求項８９～９２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む核タンパク質複合体。

【請求項97】

ニッカーゼ及び請求項８９～９２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む核タンパク質複合体。

【請求項98】

請求項８９～９２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む核タンパク質複合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、工学操作核酸ガイド型タンパク質（例えば、ニッカーゼ）及び融合タンパク質を提供する。提供されるタンパク質は、生存細胞中の核酸分子に対して標的化編集を作製するために使用することができる。

【背景技術】

【0002】

生存細胞のゲノムに対して正確に標的化変化を作製する能力は、生物医学的な研究及び開発における長年の目的である。近年、遺伝子配列、及びしたがって遺伝子機能の操作を可能とする種々のヌクレアーゼが同定されている。

【0003】

同定されたヌクレアーゼとしては、核酸ガイド型ヌクレアーゼ及び核酸ガイド型ヌクレアーゼに由来するニッカーゼが挙げられる。ニッカーゼは、二本鎖分解ではなく一本鎖分解を生成する。ＤＮＡの一本鎖のみを開裂させる能力は、ある編集作業のための核酸ガイド型ヌクレアーゼの多用途性を増加させ得る。

【0004】

ニッカーゼを使用する１つの編集作業は、プライム編集である。プライム編集は、ニッカーゼを逆転写酵素と組み合わせて融合タンパク質を作出する。融合タンパク質は、編集すべき標的部位を規定するとともに所望の編集をコードするプライム編集ガイドＲＮＡとの核タンパク質複合体を形成する。プライム編集は、挿入、欠失、及び点突然変異の１２タイプ全てを作出し得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

当技術分野において、異なる生物からの細胞中の変化した活性を有し、異なる切断モチーフを有し、及び／又は変更された酵素フィデリティを有する新規ヌクレアーゼ及び新規ニッカーゼに由来するニッカーゼが必要とされている。本明細書に提供される新規ポリペプチドは、このアンメットニーズを満たす。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一態様において、本開示は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドを提供する。
一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。

【0007】

一態様において、本開示は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
一態様において、本開示は、配列番号１３と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＴｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質を提供する。

【0008】

一態様において、本開示は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＴｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質を提供する。
一態様において、本開示は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む核タンパク質複合体を提供する。

【0009】

一態様において、本開示は、本明細書に提供される融合タンパク質を含む核タンパク質複合体を提供する。
一態様において、本開示は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む真核細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される融合タンパク質を含む真核細胞を提供する。

【0010】

一態様において、本開示は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを細胞に提供する方法であって、（ａ）細胞を得ること；及び（ｂ）細胞に、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８バリアントポリペプチド又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を提供することを含む方法を提供する。

【0011】

一態様において、本開示は、融合タンパク質を細胞に提供する方法であって、（ａ）細胞を得ること；及び（ｂ）細胞に、本明細書に提供される融合タンパク質、又は融合タンパク質をコードする核酸分子を提供することを含む方法を提供する。

【0012】

一態様において、本開示は、少なくとも１つの真核細胞を編集する方法であって、（ａ）（ｉ）少なくとも１つの真核細胞に、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を；及び（ｉｉ）少なくとも１つの真核細胞に、ガイドＲＮＡであって、真核細胞のゲノム内の標的核酸分子と相補的な核酸配列を含むガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することであって；ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びガイドＲＮＡは、少なくとも１つの真核細胞内で核タンパク質複合体を形成し、核タンパク質複合体は、標的核酸分子の一方の鎖を開裂させ、少なくとも１つの編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子内で作製されること；並びに（ｂ）少なくとも１つの編集を含む少なくとも１つの真核細胞を同定することを含む方法を提供する。

【0013】

一態様において、本開示は、少なくとも１つの真核細胞を編集する方法であって、（ａ）（ｉ）少なくとも１つの真核細胞に、本明細書に提供される融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸分子を；及び（ｉｉ）少なくとも１つの真核細胞に、ガイドＲＮＡであって、真核細胞のゲノム内の標的核酸分子と相補的な核酸配列を含むガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することであって；融合タンパク質及びガイドＲＮＡは、少なくとも１つの真核細胞内で核タンパク質複合体を形成し、核タンパク質複合体は、標的核酸分子の一方の鎖を開裂させ、少なくとも１つの編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子内で作製されること；並びに（ｂ）少なくとも１つの編集を含む少なくとも１つの真核細胞を同定することを含む方法を提供する。

【0014】

一態様において、本開示は、配列番号２４と少なくとも８０％同一の核酸配列を有する足場領域を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。本開示はまた、配列番号２４と少なくとも８５％同一の核酸配列を有する足場領域を含むｇＲＮＡを含む核タンパク質複合体を提供する。

【0015】

配列の簡単な説明
表１は、本開示により提供される核酸配列及びアミノ酸配列のリストを提供する。
表１．核酸配列及びアミノ酸配列。

【0016】

【表1-1】

【0017】

【表1-2】

【0018】

【表1-3】

【0019】

【表1-4】

【0020】

【表1-5】

【0021】

【表1-6】

【0022】

【表1-7】

【0023】

【表1-8】

【0024】

【表1-9】

【0025】

【表1-10】

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】いかなる科学的理論によっても限定されるものではないが、図１は、ＣＲＥＡＴＥ融合編集についての機序を示す。

【図2】図２は、切断活性及びＣＲＥＡＴＥ融合活性についてのニッカーゼのスクリーニングのための作業手順の一例を示す。

【図3A】図３Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のニッカーゼ融合酵素ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ：：逆転写酵素を用いた編集の結果を示す。

【図3B】図３Ｂは、人工多能性幹細胞中のニッカーゼ融合酵素ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ：：逆転写酵素を用いた編集の結果を示す。

【図4】図４は、逆転写酵素Ｔｆ１（配列番号１２）に融合しているＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ（配列番号１）又は逆転写酵素Ｔｆ１－Ｄ３６４Ｎ（配列番号１３）に融合しているＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａを用いた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）への編集の結果を示す。

【図5】図５は、ＣＦＥ１９（配列番号２０）及びＣＦＥ１９バリアント（例えば、配列番号２１～２３など）を用いたＧＦＰのＢＦＰへの編集の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

特に定義のない限り、使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。用語が単数形で提供される場合、本発明者らは、その用語の複数形により記載される本開示の態様も企図する。参照により組み込まれる参照文献において使用される用語及び定義に相違が生じる場合、本出願において使用される用語は、本明細書に挙げられる定義を有するものとする。使用される他の技術用語は、種々の技術分野専門辞典、例えば、「アメリカン・ヘリテージ（登録商標）科学辞典（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ）」（アメリカン・ヘリテージ辞典（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ）の編者、２０１１年、ホートン・ミフリン・ハーコート（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍｉｆｆｌｉｎ Ｈａｒｃｏｕｒｔ）、ボストン及びニューヨーク）、「マグローヒル科学技術用語大辞典（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ）」（第６版、２００２年、マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク）、又は「オックスフォード生物学辞典（Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（第６版、２００８年、オックスフォード大学プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード及びニューヨーク）により例示される、それらが使用される技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。

【0028】

本明細書に記載される技術の実施は、特に示されない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学及びシーケンシング技術の慣用の技術及び説明を用い得、それらは当業者の技能の範囲内である。このような慣用の技術としては、ポリマーアレイ合成並びにポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びライゲーションが挙げられる。好適な技術の具体的な説明は、本明細書の実施例を参照することにより得ることができる。しかしながら、無論、他の均等な慣用の手順を使用することもできる。このような慣用の技術及び説明は、標準的な実験室マニュアル、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら編、１９９９年、「ゲノム分析：実験室マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ）」、第Ｉ～ＩＶ巻；ウェイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）、ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）、スティーブンズ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）編、２００７年、「遺伝子変異：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；ディーフェンバハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）、ドベクスラー（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）編、２００３年、「ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；マウント（Ｍｏｕｎｔ）著、２００４年、「バイオインフォマティクス：配列及びゲノム分析（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、２００６年、「分子クローニングからのプロトコル要約：実験室マニュアル（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；並びにサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、２００２年、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（全てコールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）から）；ストライヤー・Ｌ．（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．）著、１９９５年、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第４版、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク；ガイト（Ｇａｉｔ）著、「オリゴヌクレオチド合成：実践アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、１９８４年、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）及びコックス（Ｃｏｘ）著、２０００年、「レーニンジャの新生化学：生化学と分子生物学の基本原理（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第３版、Ｗ．Ｈ．フリーマン出版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．）、ニューヨーク；「ウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」（カプリフト（Ｋａｐｌｉｆｔ）及びローウィ（Ｌｏｅｗｙ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９５年）に見出すことができ；それらは全て、あらゆる目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる。哺乳類／幹細胞培養及び方法については、例えば、「基礎細胞培養プロトコル（Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、第４版（ヘルガソン（Ｈｅｌｇａｓｏｎ）及びミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２００５年）；「動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ）」、第７版（フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２０１６年）；「マイクロ流路細胞培養（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、第２版（ボレンステイン（Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ）、バンドン（Ｖａｎｄｏｎ）、タオ（Ｔａｏ）及びチェアレスト（Ｃｈａｒｅｓｔ）編、エルセビアプレス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ）、２０１８年）；「ヒト細胞培養（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２０１１年）；「３Ｄ細胞培養（３Ｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（コレドバ（Ｋｏｌｅｄｏｖａ）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２０１７年）；「細胞及び組織培養：バイオテクノロジーにおける実験室手順（Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（ドイル（Ｄｏｙｌｅ）及びグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）編、ジョン・ウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９８年）；「基本的な幹細胞方法（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、（ランザ（Ｌａｎｚａ）及びクリマンスカヤ（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、２０１１年）；「幹細胞療法：臨床供与の品質及び安全性を確保するための好機：合同ワークショップの要旨（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｅｎｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｆｆｅｒｉｎｇｓ：Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ａ Ｊｏｉｎｔ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）」（ヘルスサイエンス政策委員会（Ｂｏａｒｄ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｏｌｉｃｙ）、ナショナル・アカデミーズ・プレス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ）、２０１４年）；「幹細胞生物学の要点（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、（ランザ（Ｌａｎｚａ）及びアタラ（Ａｔａｌａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、２０１３年）；並びに「幹細胞ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）」、（アタラ（Ａｔａｌａ）及びランザ（Ｌａｎｚａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、２０１２年）参照。ＣＲＩＳＰＲ専門技術は、例えば、「ゲノム編集及び工学操作 ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲから分子手術まで（Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ ＴＡＬＥＮｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲｓ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ）」、アパサニ（Ａｐｐａｓａｎｉ）及びチャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）著、２０１８年；並びに「ＣＲＩＳＰＲ：方法及びプロトコル（ＣＲＩＳＰＲ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、リンドグレン（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）及びシャルパンティエ（Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ）著、２０１５年に見出すことができる。

【0029】

例えば、全ての特許、公開特許出願、及び非特許刊行物を含む本明細書に引用される任意の参照文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
選択肢の群が提示される場合、その選択肢の群を構成するメンバーのありとあらゆる組み合わせが具体的に想定される。例えば、項目がＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤからなる群から選択される場合、本発明者らは、各選択肢を個々に（例えば、Ａ単独、Ｂ単独など）、並びに組み合わせ、例えば、Ａ、Ｂ、及びＤ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣなどを具体的に想定する。

【0030】

用語「及び／又は」は、２つ以上の項目のリストにおいて使用される場合、列記される項目をそれ自体のいずれか１つで、又は他の列記される項目のいずれか１つ以上との組み合わせで意味する。例えば、表現「Ａ及び／又はＢ」は、Ａ及びＢのいずれか又は両方、例えば、Ａ単独、Ｂ単独、又はＡ及びＢの組み合わせを意味することが意図される。表現「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢの組み合わせ、Ａ及びＣの組み合わせ、Ｂ及びＣの組み合わせ、又はＡ、Ｂ、及びＣの組み合わせを意味することが意図される。

【0031】

数字の範囲が本明細書に提供される場合、範囲は、範囲の端部及び範囲の定義される端部間の任意の数字を含むことが理解される。例えば、「１～１０」には、１～１０の任意の数字、並びに数字１及び数字１０が含まれる。

【0032】

本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が特に明示しない限り複数の参照対象が含まれる。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」には、それらの混合物を含む複数の化合物が含まれ得る。

【0033】

本明細書に提供される核酸ガイド型ニッカーゼは、核酸ニッカーゼ融合指向ゲノム編集を実施して所望の編集を生存真核細胞に導入することを可能とするために用いられる。本明細書に提供される核酸ガイド型ニッカーゼは、核酸ニッカーゼ融合指向ゲノム編集を実施して所望の編集をインビトロ環境中の標的核酸分子に導入することを可能とするためにも用いられる。

【0034】

本明細書において使用される場合、「ニッカーゼ」は、二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖を開裂させるヌクレアーゼを指す（例えば、ニッカーゼはＤＮＡ分子を「ニッキングする」）。ニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖を開裂させない。ニッカーゼ又は核酸ガイド型ヌクレアーゼの例は、米国特許第９，９８２，２７９号明細書；同第１０，３３７，０２８号明細書；同第１０，４３５，７１４号明細書；同第１０，０１１，８４９号明細書；同第１０，６２６，４１６号明細書；同第１０，６０４，７４６号明細書；同第１０，６６５，１１４号明細書；同第１０，６４０，７５４号明細書；同第１０，６８９，６６９号明細書；同第１０，８７６，１０２号明細書；同第１０，８８３，０７７号明細書；同第１０，７０４，０３３号明細書；同第１０，７４５，６７８号明細書；同第１０，７２４，０２１号明細書；同第１０，７６７，１６９号明細書；同第１０，８７０，７６１号明細書；同第１０，８８３，０７７号明細書；同第１１，０５３，４８５号明細書；同第１１，０８５，０３０号明細書；同第１１，２００，０８９号明細書；同第１１，２６８，０７８号明細書；同第１１，２９３，１１５号明細書；同第１１，３０６，２９８号明細書；及び同第１１，３３２，７４２号明細書；並びに米国特許出願公開第２０２１／０２１４６７１号明細書に見出すことができる。

【0035】

ニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖を開裂させるヌクレアーゼに由来し又は工学操作することができる。一部の例において、ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素に由来する。工学操作ニッカーゼの非限定的な例は、ＭＡＤ２０１９並びにＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ（配列番号１）及び表２に提供されるバリアントを含むバリアントである。一態様において、ニッカーゼは、核酸分子（例えば、ガイド）により標的核酸分子内の特異的部位にガイドされ得る。核酸分子によりガイドされるニッカーゼは、「核酸ガイド型ニッカーゼ」と称される。

【0036】

本明細書に提供される核酸ガイド型ニッカーゼは、逆転写酵素と組み合わせて標的核酸分子への配列特異的な結合及びニッキングの両方を行い、修復テンプレート（例えば、ホモロジーアーム）を利用してヌクレオチドをニックの部位の標的核酸配列中に取り込み得る融合酵素（例えば、融合タンパク質）を生成することができる。このような酵素は、本明細書において「核酸ガイド型ニッカーゼ融合酵素」、「ＣＲＥＡＴＥ融合酵素」、又は「ＣＦ酵素」として称することができる。このような酵素を使用して標的核酸分子を編集するプロセスは、「ＣＲＥＡＴＥ融合編集」と称される。

【0037】

図１は、編集、フラップ平衡、フラップ除去及び修復、並びにＤＮＡ複製及び細胞分裂のステップを含む、ＣＲＥＡＴＥ融合編集のプロセスの簡易図を提供する。
核酸ガイド型ニッカーゼに加え、種々のガイドＲＮＡ足場配列及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の増強物が、編集効率を改善するために本明細書に提供されるニッカーゼ及び融合タンパク質と使用されることが同定されている。例えば、２０２１年１１月３０日に出願された米国特許第１１，２６８，０７８号明細書及び米国特許出願第１７／５３８，０６６号明細書参照。

【0038】

いかなる科学的理論によっても限定されるものではないが、細胞中でガイド核酸と複合体化された核酸ガイド型ニッカーゼ融合酵素は、標的核酸分子内の細胞のゲノムをニッキングし得る。ガイド核酸は、核酸ガイド型ニッカーゼ融合酵素を標的核酸分子の一方の鎖の認識及び切断について支援する。ガイド核酸分子のヌクレオチド配列を操作することにより、適切なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）が近傍に位置する限り開裂のための任意のＤＮＡ配列を標的化するように核酸ガイド型ニッカーゼ融合酵素をプログラムすることができる。当技術分野において公知のとおり、ＰＡＭについての正確な配列及び長さの要件は、異なる核酸ガイド型ヌクレアーゼ及び核酸ガイド型ニッカーゼ間で変動する。しかしながら、ＰＡＭは、典型的には、２ヌクレオチド～１０ヌクレオチド長（最も典型的には、２ヌクレオチド～６ヌクレオチド）を含み、それらは通常、所望のニック部位に隣接しており、又はその１０ヌクレオチド以内に存在する。ＰＡＭ部位の非限定的な例は、配列５’－ＮＧＧ－３’である。ＰＡＭは、標的核酸分子内の所望のニック部位の５’又は３’に位置させることができる。

【0039】

一態様において、編集は、ＰＡＭに対する編集を含む。一態様において、ＰＡＭに対する編集は、標的核酸分子からのＰＡＭの除去をもたらす。一態様において、ＰＡＭに対する編集は、標的核酸分子中のＰＡＭの不活性化をもたらす。

【0040】

ＣＲＥＡＴＥ融合編集を使用してニッカーゼＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａを改変して「ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド」を同定した。ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むが、それらはまた、配列番号１のナンバリングに従う８４８位のアラニンを維持する。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を開裂させる（例えば、ニッキングする）。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖を開裂させない。限定的であることは意図されないが、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドの具体例は表２に提供される。

【0041】

一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも７０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも７５％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも８０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも８５％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも９２．５％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも９５％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも９６％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも９７％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも９８％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも９９％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と少なくとも９９．５％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１と１００％類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。一態様において、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを提供する。

【0042】

用語「同一性パーセント」又は「同一パーセント」は、２つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して本明細書において使用される場合、（ｉ）比較のウィンドウ（「アライン可能な」１つ又は複数の領域）にわたり２つの最適にアラインされた配列（ヌクレオチド又はアミノ酸）を比較すること、（ｉｉ）同一の核酸塩基（ヌクレオチド配列について）又はアミノ酸残基（タンパク質及びポリペプチドについて）が両方の配列中に存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を得ること、（ｉｉｉ）マッチ位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数により除すこと、及び次いで（ｉｖ）この商に１００％を乗じて同一性パーセントを得ることにより算出される。「同一性パーセント」が、特定の比較ウィンドウを規定せずに参照配列に関して算出されている場合、同一性パーセントは、アラインメントの領域にわたるマッチ位置の数を参照配列の全長により除すことにより決定される。したがって、本出願の目的のために、２つの配列（クエリ及びサブジェクト）が最適にアラインされる場合（それらのアラインメントにおけるギャップを許容）、クエリ配列についての「同一性パーセント」は、２つの配列間の同一位置の数をその長さ（又は比較ウィンドウ）にわたるクエリ配列中の位置の総数により除し、次いでそれに１００％を乗じたものに等しい。

【0043】

配列同一性の割合がアミノ酸に関して使用される場合、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが多く、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって分子の機能的特性を変化させないことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的特質を補正するために上方に調整することができる。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。

【0044】

配列の同一性パーセントを算出するための配列の最適なアラインメントのため、種々のペアワイズ又は多重配列アラインメントアルゴリズム及びプログラム、例えば、クラスタルダブル（ＣｌｕｓｔａｌＷ）又はベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（登録商標）（ブラスト（ＢＬＡＳＴ）（商標））などが当技術分野において公知であり、それらは２つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸配列間の配列同一性又は類似性を比較するために使用することができる。他のアラインメント及び比較方法が当技術分野において公知であるが、２つの配列間のアラインメント及び同一性パーセント（上記の同一性パーセントの範囲を含む）は、クラスタルダブル（ＣｌｕｓｔａｌＷ）アルゴリズムにより決定されるものであり得、例えば、全内容及び開示が参照により本明細書に組み込まれるチェンナ（Ｃｈｅｎｎａ）ら著、「プログラムのクラスタルシリーズを用いる多重配列アラインメント（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｌｕｓｔａｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３１巻、ｐ．３４９７～３５００、２００３年；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら著、「クラスタルダブル：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及び重みマトリックス選択を介するプログレッシブな多重配列アラインメントの感度の改善（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２２巻、ｐ．４６７３～４６８０、１９９４年；ラーキン・ＭＡ（Ｌａｒｋｉｎ ＭＡ）ら著、「クラスタルダブル及びクラスタルエックスバージョン２．０（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）」、バイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、第２３巻、ｐ．２９４７～４８、２００７年；及びアルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、「ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２１５巻、ｐ．４０３～４１０、１９９０年参照。

【0045】

用語「相補性パーセント」又は「相補的パーセント」は、２つのヌクレオチド配列に関して本明細書において使用される場合、同一性パーセントの概念に類似するが、クエリ及びサブジェクト配列が二次フォールディング構造、例えば、ループもステムもヘアピンもなしで線状に配置され、最適に塩基対形成される場合にサブジェクト配列のヌクレオチドに最適に塩基対形成又はハイブリダイズするクエリ配列のヌクレオチドの割合を指す。このような相補性パーセントは、２つのＤＮＡ鎖間、２つのＲＮＡ鎖間、又はＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖との間のものであり得る。「相補性パーセント」は、（ｉ）比較のウィンドウにわたり２つのヌクレオチド配列を線状で、完全に伸ばした配置（例えば、フォールディング構造も二次構造もなし）で、最適に塩基対形成又はハイブリダイズさせること、（ｉｉ）比較のウィンドウにわたり２つの配列間で塩基対形成する位置の数を決定して相補的位置の数を得ること、（ｉｉｉ）相補的位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数により除すこと、及び（ｉｖ）この商に１００％を乗じて２つの配列の相補性パーセントを得ることにより算出することができる。２つの配列の最適な塩基対形成は、水素結合を介するヌクレオチド塩基の公知の対形成、例えば、Ｇ－Ｃ、Ａ－Ｔ、及びＡ－Ｕに基づき決定することができる。「相補性パーセント」が、特定の比較ウィンドウを規定せずに参照配列に関して算出されている場合、同一性パーセントは、２つの線状配列間の相補的位置の数を参照配列の全長により除すことにより決定される。したがって、本出願の目的のため、２つの配列（クエリ及びサブジェクト）が最適に塩基対形成される場合（ミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチドを許容）、クエリ配列についての「相補性パーセント」は、２つの配列間の塩基対形成位置の数をその長さにわたるクエリ配列中の位置の総数により除し、次いでそれに１００％を乗じたものに等しい。

【0046】

用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」の使用は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むポリヌクレオチドに本開示を限定することを意図しない。例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）分子も想定される。当業者は、ポリヌクレオチド及び核酸分子がリボヌクレオチド並びにリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含み得ることを認識する。このようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドとしては、天然に存在する分子及び合成アナログの両方が挙げられる。本開示のポリヌクレオチドはまた、限定されるものではないが、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステムループ構造などを含む配列の全ての形態を包含する。一態様において、本明細書に提供される核酸分子は、ＤＮＡ分子である。別の態様において、本明細書に提供される核酸分子は、ＲＮＡ分子である。一態様において、本明細書に提供される核酸分子は、一本鎖である。別の態様において、本明細書に提供される核酸分子は、二本鎖である。一態様において、核酸分子は、ポリペプチドをコードする。

【0047】

一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意の逆転写酵素をコードする核酸分子を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のガイドをコードする核酸分子を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のホモロジーアームをコードする核酸分子を提供する。

【0048】

一態様において、本明細書に提供される任意の核酸分子、融合タンパク質、又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、インビトロでの使用のために提供される。一態様において、本明細書に提供される任意の核酸分子、融合タンパク質、又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、インビボでの使用のために提供される。一態様において、本明細書に提供される任意の核酸分子、融合タンパク質、又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、エクスビボでの使用のために提供される。

【0049】

一態様において、核酸分子は、プロモータを含む。一態様において、プロモータは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に結合している。一態様において、プロモータは、逆転写酵素をコードする核酸分子に作動可能に結合している。一態様において、プロモータは、融合タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に結合している。一態様において、プロモータは、ガイドをコードする核酸分子に作動可能に結合している。一態様において、プロモータは、ホモロジーアームをコードする核酸分子に作動可能に結合している。目的の細胞中の発現に好適な任意のプロモータを使用することができる。

【0050】

当技術分野において一般に理解されるとおり、用語「プロモータ」は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、及び／又はＴＡＴＡボックスを含有し、付随する転写可能なポリヌクレオチド配列及び／又は遺伝子（若しくはトランス遺伝子）の転写及び発現を支援又は促進するＤＮＡ配列を指す。プロモータは、合成により産生し、変化させ、又は公知の若しくは天然に存在するプロモータ配列若しくは他のプロモータ配列に由来することができる。プロモータには、２つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモータも含まれ得る。したがって、本出願のプロモータには、組成が公知の又は本明細書に提供される他のプロモータ配列と類似するが同一でないプロモータ配列のバリアントが含まれ得る。

【0051】

本明細書において使用される場合、「作動可能に結合している」は、２つ以上のエレメント間の機能的結合を指す。例えば、目的のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモータ）との間の作動可能な結合は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能とする機能的結合である。作動可能に結合しているエレメントは、連続又は非連続であり得る。一態様において、プロモータは、異種核酸分子に作動可能に結合している。

【0052】

一態様において、プロモータは、誘導性プロモータである。本明細書において使用される場合、「誘導性プロモータ」は、特異的刺激に応答して細胞中で活性になる調節されるプロモータ（例えば、それは、作動可能に結合している配列の発現をドライブする）を指す。

【0053】

一態様において、プロモータは、構成的プロモータである。本明細書において使用される場合、「構成的プロモータ」は、インビボで常に活性であるプロモータを指す。典型的には、構成的プロモータの活性は、好適な濃度の好適なＲＮＡポリメラーゼの存在によってのみ制限される。

【0054】

一態様において、核酸分子は、転写ターミネータを含む。一態様において、転写ターミネータは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に結合している。一態様において、転写ターミネータは、逆転写酵素をコードする核酸分子に作動可能に結合している。一態様において、転写ターミネータは、融合タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に結合している。一態様において、転写ターミネータは、ガイドをコードする核酸分子に作動可能に結合している。一態様において、転写ターミネータは、ホモロジーアームをコードする核酸分子に作動可能に結合している。目的の細胞中の核酸分子の転写終結に好適な任意の転写ターミネータを使用することができる。

【0055】

本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、少なくとも２つの共有結合しているアミノ酸の鎖を指す。ポリペプチドは、本明細書に提供されるポリヌクレオチドによりコードされ得る。本明細書に提供されるタンパク質は、本明細書に提供される核酸分子によりコードされ得る。タンパク質は、本明細書に提供されるポリペプチドを含み得る。本明細書において使用される場合、「タンパク質」は、構造又は酵素的活性を細胞に提供し得るアミノ酸残基の鎖を指す。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、タンパク質である。

【0056】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して６７位のトレオニンのグリシンへのアミノ酸置換（Ｔ６７Ｇ）を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して４０９位のセリンのアルギニンへのアミノ酸置換（Ｓ４０９Ｒ）を含む。

【0057】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して５００位のロイシンのリジンへのアミノ酸置換（Ｌ５００Ｋ）を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して５００位のロイシンのアルギニンへのアミノ酸置換（Ｌ５００Ｒ）を含む。

【0058】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して５７８位のグリシンのフェニルアラニンへのアミノ酸置換（Ｇ５７８Ｆ）を含む。

【0059】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して６２４位のロイシンのグルタミンへのアミノ酸置換（Ｌ６２４Ｑ）を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して６６９位のアスパラギンのセリンへのアミノ酸置換（Ｎ６６９Ｓ）を含む。

【0060】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して７００位のアスパラギン酸のアラニンへのアミノ酸置換（Ｄ７００Ａ）を含む。

【0061】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して７０１位のアスパラギン酸のプロリンへのアミノ酸置換（Ｄ７０１Ｐ）を含む。

【0062】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して７０１位のアスパラギン酸のアスパラギンへのアミノ酸置換（Ｄ７０１Ｎ）を含む。

【0063】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して７０１位のアスパラギン酸のトレオニンへのアミノ酸置換（Ｄ７０１Ｔ）を含む。

【0064】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して７２０位のリジンのセリンへのアミノ酸置換（Ｋ７２０Ｓ）を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１１１０位のロイシンのアルギニンへのアミノ酸置換（Ｌ１１１０Ｒ）を含む。

【0065】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１１４２位のイソロイシンのアルギニンへのアミノ酸置換（Ｉ１１４２Ｒ）を含む。

【0066】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１１４２位のイソロイシンのリジンへのアミノ酸置換（Ｉ１１４２Ｋ）を含む。

【0067】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１１４３位のバリンのトレオニンへのアミノ酸置換（Ｖ１１４３Ｔ）を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１２２１位のアラニンのヒスチジンへのアミノ酸置換（Ａ１２２１Ｈ）を含む。

【0068】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１２８５位のリジンのアルギニンへのアミノ酸置換（Ｋ１２８５Ｒ）を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１３２１位のアラニンのアルギニンへのアミノ酸置換（Ａ１３２１Ｒ）を含む。

【0069】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１３２１位のアラニンのリジンへのアミノ酸置換（Ａ１３２１Ｋ）を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１３３６位のセリンのグルタミンへのアミノ酸置換（Ｓ１３３６Ｑ）を含む。

【0070】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１３３９位のアラニンのアルギニンへのアミノ酸置換（Ａ１３３９Ｒ）を含む。

【0071】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択される少なくとも４つのアミノ酸置換を含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択される少なくとも５つのアミノ酸置換を含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択される少なくとも６つのアミノ酸置換を含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択される少なくとも７つのアミノ酸置換を含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択される少なくとも８つのアミノ酸置換を含む。

【0072】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む。

【0073】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む。

【0074】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＳ４０９Ｒアミノ酸置換、Ｌ５００Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む。

【0075】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＶ１１４３Ｔアミノ酸置換及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む。

【0076】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｒアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む。

【0077】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｄ１１３９Ｎアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む。

【0078】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、Ａ１２２１Ｈアミノ酸置換、及びＫ１２８５Ｒアミノ酸置換を含む。

【0079】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して改善されたニッキング効率を含む。
一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の２．５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の７．５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１０％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１２．５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の２０％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の２５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の３０％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の３５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の４０％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の４５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の５０％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の５５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の６０％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の６５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の７０％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の７５％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の８０％以内の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の９０％以内の効率でニッキングする。

【0080】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％～９０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％～７５％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％～６０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％～５０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％～４０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％～３０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％～２０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％～１０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１０％～７０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１０％～６０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１０％～５０％の効率でニッキングする。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子を配列番号１のニッキング効率の１％～２５％の効率でニッキングする。

【0081】

ニッキング効率は、当技術分野において任意の好適な方法を使用して測定することができる。例えば、ウェイ（Ｗｅｉ）ら著、サイエンティフィック・リポーツ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ）、第６巻、ｐ．３２５６０、２０１６年参照。

【0082】

一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。一態様において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＮＬＳを含む。核局在化シグナルは、当技術分野において、核輸送を介する細胞の核中へのインポートのためにタンパク質を「タグ付けする」短鎖（例えば、限定されるものではないが、典型的には、２５アミノ酸未満）アミノ酸配列として公知である。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも２つのＮＬＳを含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも３つのＮＬＳを含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも４つのＮＬＳを含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも５つのＮＬＳを含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも６つのＮＬＳを含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも７つのＮＬＳを含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも８つのＮＬＳを含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも９つのＮＬＳを含む。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、少なくとも１０個のＮＬＳを含む。

【0083】

一態様において、ＮＬＳは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８ＡバリアントポリペプチドのＮ末端前に位置する。一態様において、ＮＬＳは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８ＡバリアントポリペプチドのＣ末端後に位置する。一態様において、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、そのＮ末端前に第１のＮＬＳ及びそのＣ末端後に第２のＮＬＳを含む。

【0084】

一態様において、ＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端前に位置する。一態様において、ＮＬＳは、融合タンパク質のＣ末端後に位置する。一態様において、融合タンパク質は、そのＮ末端前に第１のＮＬＳ及びそのＣ末端後に第２のＮＬＳを含む。

【0085】

一態様において、ＮＬＳは、５０個以下のアミノ酸を含む。一態様において、ＮＬＳは、４０個以下のアミノ酸を含む。一態様において、ＮＬＳは、３０個以下のアミノ酸を含む。一態様において、ＮＬＳは、２５個以下のアミノ酸を含む。一態様において、ＮＬＳは、２０個以下のアミノ酸を含む。一態様において、ＮＬＳは、１５個以下のアミノ酸を含む。一態様において、ＮＬＳは、１０個以下のアミノ酸を含む。

【0086】

任意の好適なＮＬＳは、本明細書に提供されるＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドと使用することができる。一態様において、ＮＬＳは、配列番号１５又は１９と少なくとも７０％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＮＬＳは、は、配列番号１５又は１９と少なくとも８０％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＮＬＳは、配列番号１５又は１９と少なくとも８５％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＮＬＳは、配列番号１５又は１９と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＮＬＳは、配列番号１５又は１９と少なくとも９２．５％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＮＬＳは、配列番号１５又は１９と少なくとも９５％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＮＬＳは、配列番号１５又は１９と少なくとも９７．５％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＮＬＳは、配列番号１５又は１９と少なくとも９９％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＮＬＳは、配列番号１５及び１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0087】

一態様において、本開示は、ＮＬＳをコードする核酸配列を提供する。
一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９２．５％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９７．５％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９．５％同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１、１２、１３、及び１５～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも１００％類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。

【0088】

一態様において、本開示は、本明細書に提供されるＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドのいずれか及び核酸分子を含む核タンパク質複合体を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれか及び核酸分子を含む核タンパク質複合体を提供する。本明細書において使用される場合、「核タンパク質複合体」は、核酸分子とコンジュゲートしているタンパク質を指す。核タンパク質複合体がＲＮＡ分子を含む場合、それはリボ核タンパク質複合体と称することができる。核タンパク質複合体がＤＮＡ分子を含む場合、それはデオキシリボ核タンパク質複合体と称することができる。一態様において、本明細書に提供される核タンパク質複合体は、リボ核タンパク質複合体である。一態様において、本明細書に提供される核タンパク質複合体は、デオキシリボ核タンパク質複合体である。一態様において、核タンパク質複合体の核酸分子構成成分は、ＲＮＡ分子である。一態様において、核タンパク質複合体の核酸分子構成成分は、ＤＮＡ分子である。

【0089】

一態様において、本明細書に提供される核酸分子は、ガイドをコードする。一態様において、本明細書に提供される核酸分子は、ガイドを含む。本明細書において使用される場合、「ガイド」は、それが複合体化しているタンパク質を標的核酸分子にガイドし得る核酸分子を指す。典型的には、ガイドは、標的核酸分子と相補的であるが、完全な（例えば、１００％の）相補性は要求されず、ガイドは標的核酸分子とハイブリダイズし得る。一態様において、ガイドは、ＤＮＡ分子である。一態様において、ガイドは、ＲＮＡ分子である。一態様において、ガイドは、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含む。一態様において、ガイドは、一本鎖である。一態様において、ガイドは、二本鎖である。一態様において、ガイドは、一本鎖である１つ以上のセクション及び二本鎖である１つ以上の領域を含む。

【0090】

ガイドがＲＮＡ分子である場合、それは「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称することができる。一態様において、核タンパク質複合体又はリボ核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを標的核酸分子にガイドし得る。一態様において、ｇＲＮＡは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを標的核酸分子にガイドする。一態様において、ｇＲＮＡは、融合タンパク質を標的核酸分子にガイドし得る。一態様において、ｇＲＮＡは、融合タンパク質を標的核酸分子にガイドする。

【0091】

一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びｇＲＮＡを含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びｇＲＮＡを含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びガイドを含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びガイドを含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド、ホモロジーアーム、及びｇＲＮＡを含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質、ホモロジーアーム、及びｇＲＮＡを含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド、ホモロジーアーム、及びガイドを含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質、ホモロジーアーム、及びガイドを含む。

【0092】

一態様において、ガイドは、少なくとも５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも１０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも１５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも２０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも２５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも３０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも３５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも４０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも４５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも６０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも７０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも８０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも９０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、少なくとも１２５ヌクレオチドを含む。

【0093】

一態様において、ガイドは、５ヌクレオチド～１５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、５ヌクレオチド～１２５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、５ヌクレオチド～１００ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、５ヌクレオチド～７５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、５ヌクレオチド～５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、５ヌクレオチド～４０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、５ヌクレオチド～３０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、５ヌクレオチド～２５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、１５ヌクレオチド～３０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、１５ヌクレオチド～２５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、２０ヌクレオチド～１５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、２０ヌクレオチド～１２５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、２０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、２０ヌクレオチド～７５ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、２０ヌクレオチド～５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、４０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、５０ヌクレオチド～１５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ガイドは、５０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドを含む。

【0094】

一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、ミスマッチは存在しない。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、１つ以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、２つ以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、３つ以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、４つ以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、５つ以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、６つ以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、７つ以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、８つ以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、９つ以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、１０個以下のミスマッチが存在する。一態様において、ガイド又はｇＲＮＡと標的核酸分子との間には、最適にアラインされた場合、１５個以下のミスマッチが存在する。

【0095】

一態様において、ガイドは、細胞内でＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドとの核タンパク質複合体を形成する。一態様において、ｇＲＮＡは、細胞内でＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドとの核タンパク質複合体を形成する。一態様において、ガイドは、細胞内で融合タンパク質との核タンパク質複合体を形成する。一態様において、ｇＲＮＡは、細胞内で融合タンパク質との核タンパク質複合体を形成する。

【0096】

一態様において、ガイドは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドとの核タンパク質複合体を形成する。一態様において、ｇＲＮＡは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドとの核タンパク質複合体を形成する。一態様において、ガイドは、融合タンパク質との核タンパク質複合体を形成する。一態様において、ｇＲＮＡは、融合タンパク質との核タンパク質複合体を形成する。

【0097】

一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８０％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９２．５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９７．５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と１００％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。

【0098】

一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８０％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９２．５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９７．５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と１００％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。

【0099】

一態様において、核タンパク質複合体は、ニッカーゼ及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８０％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ニッカーゼ及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ニッカーゼ及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ニッカーゼ及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９２．５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ニッカーゼ及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ニッカーゼ及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９７．５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ニッカーゼ及びｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と１００％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。

【0100】

一態様において、核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８０％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９２．５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９７．５％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。一態様において、核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、配列番号２４と１００％同一の核酸配列を含む足場領域を含む。

【0101】

一態様において、本明細書に提供されるｇＲＮＡは、少なくとも１つのステムループ構造を含む。一態様において、本明細書に提供されるｇＲＮＡは、標的核酸分子の両方の鎖に結合し得る。一態様において、本明細書に提供されるｇＲＮＡは、逆転写酵素テンプレートを含む。一態様において、本明細書に提供されるｇＲＮＡは、標的核酸分子中に組み込まれることが所望される編集を含む。一態様において、本明細書に提供されるｇＲＮＡは、プライマー結合部位領域を含む。一態様において、本明細書に提供されるｇＲＮＡは、スペーサ領域を含む。一態様において、本明細書に提供されるｇＲＮＡは、足場領域を含む。

【0102】

本明細書において使用される場合、「スペーサ領域」は、本明細書に提供されるＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドにより切断されない標的核酸分子の鎖にハイブリダイズするｇＲＮＡのサブセクションを指す。本明細書において使用される場合、「足場領域」は、スペーサ領域と逆転写酵素テンプレートとの間に位置するｇＲＮＡ領域を指す。一態様において、足場領域は、少なくとも１つのステムループ構造を含む。一態様において、足場領域は、少なくとも２つのステムループ構造を含む。いかなる科学的理論によっても限定されるものではないが、足場領域は、タンパク質（例えば、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド）と相互作用又は複合体化し得る。本明細書において使用される場合、「プライマー結合部位領域」は、本明細書に提供されるＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドにより切断される標的核酸分子の鎖にハイブリダイズするｇＲＮＡのサブセクションを指す。典型的には、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、プライマー結合部位領域の下流の標的核酸分子をニッキングする。プライマー結合部位領域は逆転写酵素テンプレートのすぐ上流に存在し、それ自体は足場領域の上流に存在する。一態様において、逆転写酵素は、逆転写酵素テンプレートを逆転写する。一態様において、逆転写酵素テンプレートは、標的核酸分子中に組み込まれることが所望される少なくとも１つの編集を含む。

【0103】

一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８０％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８２．５％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８５％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも８７．５％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９０％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９１％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９２％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９３％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９４％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９５％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９６％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９７％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９８％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と少なくとも９９％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号２４と１００％同一の核酸配列を有する足場領域を含む。

【0104】

一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも２０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも３０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも４０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも６０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも７０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも８０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも９０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも１１０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも１２０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも１３０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも１４０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも１５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも１７５ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも２００ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、少なくとも２５０ヌクレオチドを含む。

【0105】

一態様において、ｇＲＮＡは、２０ヌクレオチド～５００ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、２０ヌクレオチド～４００ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、２０ヌクレオチド～３００ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、２０ヌクレオチド～２００ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、２０ヌクレオチド～１５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、２０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、５０ヌクレオチド～２５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、５０ヌクレオチド～２００ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、５０ヌクレオチド～１５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、７５ヌクレオチド～２５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ｇＲＮＡは、１００ヌクレオチド～２５０ヌクレオチドを含む。

【0106】

一態様において、ｇＲＮＡは、プライム編集ｇＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）である。ｐｅｇＲＮＡは、タンパク質を標的核酸分子にガイドするためのその５’末端上の配列と、プライマー結合部位領域と、所望の編集を含むその３’末端上の逆転写酵素テンプレート配列とを含む。

【0107】

一態様において、核酸分子は、ホモロジーアームを含む。一態様において、核酸分子は、ホモロジーアームをコードする。本明細書において使用される場合、「ホモロジーアーム」は、標的核酸分子中に組み込まれることが所望される編集を含むが、他の点では標的核酸分子配列と同一又は相補的である核酸分子を指す。一態様において、ホモロジーアームは、逆転写酵素により標的核酸分子中に取り込まれる。一態様において、ホモロジーアームは、逆転写酵素を含む融合タンパク質により標的核酸分子中に取り込まれる。一態様において、２つのホモロジーアームが所望の編集を標的核酸分子中に組み込むために使用される。一態様において、１つのホモロジーアームが所望の編集を標的核酸分子中に組み込むために使用される。

【0108】

一態様において、ホモロジーアームは、ＤＮＡを含む。一態様において、ホモロジーアームは、ＲＮＡを含む。一態様において、ホモロジーアームは、一本鎖である。一態様において、ホモロジーアームは、二本鎖である。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも１０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも２０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも３０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも４０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも６０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも７０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも７５ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも８０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも９０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも２５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも５００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも７５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも１０００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、少なくとも１５００ヌクレオチドを含む。

【0109】

一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～２５００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～５００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～４００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～３００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～２５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～１２５ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～７５ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１０ヌクレオチド～５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、５０ヌクレオチド～５００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、５０ヌクレオチド～４００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、５０ヌクレオチド～３００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、５０ヌクレオチド～２００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、５０ヌクレオチド～１５０ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、５０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１００ヌクレオチド～１０００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、１００ヌクレオチド～５００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、２５０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、２５０ヌクレオチド～５００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、５００ヌクレオチド～２０００ヌクレオチドを含む。一態様において、ホモロジーアームは、５００ヌクレオチド～１０００ヌクレオチドを含む。

【0110】

所望の編集に言及する場合、「対照配列」（本明細書において「標的核酸分子の対照バージョン」とも称される）は、比較点として使用される。対照配列と比較してホモロジーアーム中に存在する任意の相違は、そのホモロジーアームについての「所望の編集」又は「編集」とみなすべきである。対照配列は、未編集配列を指す。対照配列は、天然に存在し、又は天然に存在しないトランスジェニック若しくは合成産生（例えば、人工）配列であり得る。例えば、酵母細胞のゲノム中に挿入されたＧＦＰをコードする配列は、編集すべきトランス遺伝子の対照配列を提供し得る。標的核酸分子の対照バージョンは、未編集の標的核酸分子を指す。標的核酸分子の対照バージョンは、天然に存在し、又は天然に存在しないトランスジェニック若しくは合成産生（例えば、人工）配列であり得る。

【0111】

一態様において、所望の編集は、対照配列と比較して少なくとも１ヌクレオチドの欠失を含む。一態様において、所望の編集は、対照配列と比較して少なくとも１ヌクレオチドの挿入を含む。一態様において、所望の編集は、対照配列と比較して少なくとも１ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、所望の編集は、対照配列と比較して少なくとも２ヌクレオチドの挿入を含む。

【0112】

一態様において、編集は、欠失を含む。一態様において、少なくとも１ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも２ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも３ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも４ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも５ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも１０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも１５ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも２０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも２５ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも３０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも４０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも５０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも７５ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも１００ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも２５０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。一態様において、少なくとも５００ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子から欠失される。

【0113】

一態様において、編集は、挿入を含む。一態様において、少なくとも１ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも２ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも３ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも４ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも５ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも１０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも１５ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも２０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも２５ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも３０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも４０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも５０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも７５ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも１００ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも２５０ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。一態様において、少なくとも５００ヌクレオチドが標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中に挿入される。

【0114】

一態様において、編集は、置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の単一ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも２ヌクレオチドの置換を含む。２つ以上のヌクレオチドが核酸分子中で置換される場合、置換は互いに隣接する必要がない。２つ以上のヌクレオチド置換は、非編集ヌクレオチドにより分離することができる。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも３ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも４ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも５ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも６ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも７ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも８ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも９ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも１０ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも１５ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも２０ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも３０ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも４０ヌクレオチドの置換を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも５０ヌクレオチドの置換を含む。

【0115】

一態様において、編集は、逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも２ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも３ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも４ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも５ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも１０ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも２０ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも３０ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも４０ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも５０ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも７５ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも１００ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも１５０ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも２００ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも５００ヌクレオチドの逆位を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子中の少なくとも１０００ヌクレオチドの逆位を含む。

【0116】

一態様において、編集は、少なくとも１つの欠失及び少なくとも１つの挿入を含む。一態様において、編集は、少なくとも１つの欠失及び少なくとも１つの置換を含む。一態様において、編集は、少なくとも１つの欠失及び少なくとも１つの逆位を含む。一態様において、編集は、少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの置換を含む。一態様において、編集は、少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの逆位を含む。一態様において、編集は、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの逆位を含む。

【0117】

一態様において、編集は、少なくとも１つの欠失、少なくとも１つの挿入、及び少なくとも１つの置換を含む。一態様において、編集は、少なくとも１つの欠失、少なくとも１つの挿入、及び少なくとも１つの逆位を含む。一態様において、編集は、少なくとも１つの挿入、少なくとも１つの置換、及び少なくとも１つの逆位を含む。

【0118】

一態様において、編集は、少なくとも１つの欠失、少なくとも１つの挿入、少なくとも１つの置換、及び少なくとも１つの逆位を含む。
一態様において、編集は、タンパク質をコードする核酸配列中への未成熟終止コドンの導入を含む。一態様において、編集は、標的核酸分子中の機能喪失突然変異をもたらす。

【0119】

一態様において、編集は、ナンセンス編集、ミスセンス編集、フレームシフト編集、スプライス部位編集、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の突然変異タイプを含む。本明細書において使用される場合、「ナンセンス編集」は、核酸配列によりコードされるアミノ酸配列に未成熟終止コドンを導入する核酸配列に対する編集を指す。本明細書において使用される場合、「ミスセンス編集」は、核酸配列によりコードされるアミノ酸配列内の置換を引き起こす核酸配列に対する編集を指す。本明細書において使用される場合、「フレームシフト編集」は、核酸配列をアミノ酸配列に翻訳するためのフレームをシフトする核酸配列に対する挿入又は欠失を指す。「スプライス部位編集」は、タンパク質翻訳のための、又は代替的にタンパク質翻訳からのエクソン除外のためのイントロンの保持を引き起こす核酸配列中の編集を指す。スプライス部位編集は、ナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト編集を引き起こし得る。

【0120】

遺伝子のコード領域中の編集（例えば、エクソン編集）は、突然変異メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がタンパク質又はポリペプチドに翻訳される場合、トランケートタンパク質又はポリペプチドをもたらし得る。一態様において、本開示は、タンパク質又はポリペプチドのトランケーションをもたらす編集を提供する。本明細書において使用される場合、「トランケート」タンパク質又はポリペプチドは、内因性対照タンパク質又はポリペプチドと比較して少なくとも１つ少ないアミノ酸を含む。例えば、内因性プロテインＡが１００アミノ酸を含む場合、プロテインＡのトランケートバージョンは、１～９９アミノ酸を含み得る。

【0121】

いかなる科学的理論によっても限定されるものではないが、タンパク質又はポリペプチドトランケーションを引き起こす１つの手法は、内因性遺伝子のｍＲＮＡ転写産物中の未成熟終止コドンの導入によるものである。一態様において、本開示は、内因性遺伝子のｍＲＮＡ転写産物中の未成熟終止コドンをもたらす編集を提供する。本明細書において使用される場合、「終止コドン」は、タンパク質翻訳の終結をシグナリングするｍＲＮＡ転写産物内のヌクレオチドトリプレットを指す。「未成熟終止コドン」は、内因性ｍＲＮＡ転写産物中の通常の終止コドン位置よりも前に（例えば、５’側上で）位置する終止コドンを指す。限定されるものではないが、いくつかの終止コドンが当技術分野において公知であり、それとしては「ＵＡＧ」、「ＵＡＡ」、「ＵＧＡ」、「ＴＡＧ」、「ＴＡＡ」、及び「ＴＧＡ」が挙げられる。

【0122】

本明細書において使用される場合、「機能喪失編集」は、編集を含む遺伝子によりコードされるタンパク質についての完全な機能損失を付与する編集、又は代替的に、ゲノム遺伝子座によりコードされる低分子ＲＮＡについての完全な機能損失を付与する編集を指す。機能喪失編集は、ｍＲＮＡ転写産物産生の欠落、低分子ＲＮＡ転写産物産生の欠落、タンパク質機能の欠落、又はそれらの組み合わせを引き起こし得る。

【0123】

タンパク質又は核タンパク質複合体が標的核酸分子を「編集する」場合、タンパク質又は核タンパク質複合体は、標的核酸分子配列の対照バージョンと比較して標的核酸分子配列中の少なくとも１つの欠失、挿入、置換、又は逆位を引き起こす。一態様において、核タンパク質複合体は、細胞内の標的核酸分子を編集する。

【0124】

一態様において、単一ヌクレオチドの置換は、トランジションを含む。トランジション置換は、あるプリンの別のものに代わる置換（例えば、アデニンのグアニンに代わる置換若しくはその逆）又はあるピリミジンの別のものに代わる置換（例えば、シトシンのチミンに代わる置換若しくはその逆）である。

【0125】

一態様において、単一ヌクレオチドの置換は、トランスバージョンを含む。トランスバージョン置換は、あるプリンのピリミジンに代わる置換又はその逆（例えば、アデニンのシトシンに代わる置換又はその逆；アデニンのチミンに代わる置換又はその逆；グアニンのシトシンに代わる置換若しくはその逆；グアニンのチミンに代わる置換又はその逆）である。

【0126】

一態様において、編集は、標的核酸分子のエクソン内に位置する。一態様において、編集は、標的核酸分子のイントロン内に位置する。一態様において、編集は、標的核酸分子の５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）内に位置する。一態様において、編集は、標的核酸分子の３’－ＵＴＲ内に位置する。一態様において、編集は、標的核酸分子の非コード領域内に位置する。一態様において、編集は、標的核酸分子のコード領域に位置する。標的核酸分子のコード領域は、タンパク質又は非コードＲＮＡをコードし得る。一態様において、編集は、標的核酸分子中の遺伝子内に位置する。一態様において、編集は、プロモータ内に位置する。一態様において、編集は、転写ターミネータ内に位置する。一態様において、編集は、ポリアデニル化部位内に位置する。

【0127】

本明細書において使用される場合、「標的核酸分子」は、編集が所望される核酸配列を含む任意の核酸分子を指す。一態様において、標的核酸分子は、細胞のゲノム内に位置する。一態様において、標的核酸分子は、核ゲノム内に位置する。一態様において、標的核酸分子は、ミトコンドリアゲノム内に位置する。一態様において、標的核酸分子は、クロロプラストゲノム内に位置する。一態様において、標的核酸分子は、プラスミド内に位置する。一態様において、標的核酸分子は、二本鎖である。一態様において、標的核酸分子は、ＤＮＡ分子である。

【0128】

一態様において、標的核酸分子は、遺伝子を含む。一態様において、標的核酸分子は、プロモータを含む。一態様において、標的核酸分子は、タンパク質コード配列を含む。一態様において、標的核酸分子は、非コードＲＮＡ分子をコードする配列を含む。非コードＲＮＡは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ分子である。非コードＲＮＡ分子の非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、ｇＲＮＡなどが挙げられる。

【0129】

一態様において、標的核酸分子は、少なくとも１つのエクソンを含む。一態様において、標的核酸分子は、少なくとも１つのイントロンを含む。一態様において、標的核酸分子は、非翻訳領域（例えば、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ）を含む。

【0130】

一態様において、標的核酸分子は、レポータ遺伝子をコードする。本明細書において使用される場合、「レポータ遺伝子」は、作動可能に結合しているプロモータの転写活性をアッセイするために使用することができる任意の遺伝子を指す。レポータ遺伝子活性は、限定されるものではないが、ＭＲＩ、ＰＥＴ、生物発光又は蛍光の可視化、変色、及び細胞がある培地上で成長し得るか否かにより検出することができる。限定されるものではないが、レポータ遺伝子の編集は、融合タンパク質又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドの編集効率及び／又は有効性を決定するために使用することができる。例えば、実施例１参照。

【0131】

一態様において、レポータ遺伝子は、蛍光分子をコードする。本明細書において使用される場合、「蛍光分子」は、励起時に再発光し得る分子を指す。蛍光分子は、当技術分野においてフルオロフォアとも称される。一態様において、蛍光分子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。一態様において、蛍光分子は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である。一態様において、蛍光分子は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。一態様において、蛍光分子は、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）である。一態様において、蛍光分子は、ｍチェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）、ｍオレンジ（ｍＯｒａｎｇｅ）、ｍラズベリー（ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ）、ｍＫＯ、タグＲＦＰ（ＴａｇＲＦＰ）、ｍケイト（ｍＫａｔｅ）、ｍルビー（ｍＲｕｂｙ）、フュージョンレッド（ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ）、ｍスカーレット（ｍＳｃａｒｌｅｔ）、及びＤｓＲｅｄ－エクスプレス（ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ）からなる群から選択される。

【0132】

一態様において、レポータ遺伝子は、生物発光分子をコードする。一態様において、生物発光分子は、ルシフェラーゼである。
一態様において、レポータ遺伝子は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする。

【0133】

一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のポリペプチド、融合タンパク質、ＤＮＡ分子、又はＲＮＡ分子を含む細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意の核タンパク質複合体を含む細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドバリアントを含む細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意の融合タンパク質を含む細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のガイドを含む細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のホモロジーアームを含む細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意の逆転写酵素を含む細胞を提供する。

【0134】

一態様において、細胞は、原核細胞である。一態様において、原核細胞は、細菌細胞である。一態様において、原核細胞は、古細菌細胞である。態様において、原核細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。

【0135】

一態様において、細胞は、真核細胞である。
一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のポリペプチド、融合タンパク質、ＤＮＡ分子、又はＲＮＡ分子を含む真核細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意の核タンパク質複合体を含む真核細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドバリアントを含む真核細胞を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に提供される任意の融合タンパク質を含む真核細胞を提供する。

【0136】

一態様において、真核細胞は、動物細胞である。一態様において、真核細胞は、魚類細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、昆虫細胞、クモ形類細胞、扁形動物細胞、環形動物細胞、及び甲殻類細胞からなる群から選択される。一態様において、真核細胞は、哺乳類細胞である。一態様において、哺乳類細胞は、霊長類細胞である。一態様において、真核細胞は、ヒト細胞である。一態様において、哺乳類細胞は、ネコ細胞、イヌ細胞、ウサギ細胞、げっ歯類細胞、有蹄動物細胞、有袋動物細胞、及びコウモリ細胞からなる群から選択される。

【0137】

一態様において、真核細胞は、インビボ細胞である。一態様において、真核細胞は、エクスビボ細胞である。
一態様において、真核細胞は、ヒト細胞でない。一態様において、真核細胞は、非ヒト哺乳類細胞である。一態様において、真核細胞は、非ヒト動物細胞である。一態様において、ヒト細胞は、エクスビボ細胞である。

【0138】

一態様において、ヒト細胞は、人工多能性幹細胞である。一態様において、ヒト細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
一態様において、ヒト細胞は、骨細胞、靭帯細胞、腱細胞、筋細胞、舌細胞、口唇細胞、唾液腺細胞、咽頭細胞、食道細胞、胃細胞、小腸細胞、大腸細胞、直腸細胞、肝臓細胞、胆嚢細胞、腸間膜細胞、膵臓細胞、鼻腔細胞、咽頭細胞、喉頭細胞、気管細胞、気管支細胞、細気管支細胞、肺細胞、腎臓細胞、尿管細胞、膀胱細胞、尿道細胞、生殖器系細胞、下垂体細胞、松果腺細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、膵臓細胞、心臓細胞、動脈細胞、静脈細胞、毛細血管細胞、リンパ管細胞、リンパ節細胞、骨髄細胞、胸腺細胞、脾臓細胞、扁桃腺細胞、間質細胞、脳細胞、脊髄細胞、神経細胞、眼細胞、及び耳細胞からなる群から選択される。

【0139】

一態様において、真核細胞は、真菌細胞である。一態様において、真核細胞は、酵母細胞である。一態様において、真核細胞は、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）細胞である。一態様において、真核細胞は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。

【0140】

一態様において、真核細胞は、植物細胞である。
一態様において、本開示は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。一態様において、融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及び逆転写酵素を含む。一態様において、本開示は、配列番号１２と少なくとも８０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＴｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１３と少なくとも８０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＴｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質であって、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む融合タンパク質を提供する。一態様において、本開示は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＴｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質を提供する。

【0141】

本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」は、２つ以上のポリペプチド（又はタンパク質）アミノ酸配列を一緒に結合させることにより作出されるタンパク質を指す。一態様において、融合タンパク質は、単一核酸分子によりコードされる。一態様において、融合タンパク質は、ヌクレアーゼ及び逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、ニッカーゼ及び逆転写酵素を含む。

【0142】

一態様において、融合タンパク質は、配列番号１を含むニッカーゼ及びＨＩＶ－１逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、配列番号１を含むニッカーゼ及びＭ－ＭＬＶ逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、配列番号１を含むニッカーゼ及びＡＭＶ逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、配列番号１６を含むニッカーゼ及びＨＩＶ－１逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、配列番号１６を含むニッカーゼ及びＭ－ＭＬＶ逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、配列番号１６を含むニッカーゼ及びＡＭＶ逆転写酵素を含む。

【0143】

一態様において、融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びＴｆ１逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びＴｆ１－Ｄ３６４Ｎ逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びＨＩＶ－１逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びＭ－ＭＬＶ逆転写酵素を含む。一態様において、融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びＡＭＶ逆転写酵素を含む。

【0144】

一態様において、融合タンパク質は、配列番号２０～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一態様において、融合タンパク質は、リンカーアミノ酸配列を含む。本明細書において使用される場合、「リンカーアミノ酸配列」は、融合タンパク質を含む２つ以上のポリペプチド配列間に配置されるアミノ酸残基を指す。リンカーアミノ酸配列はそれ自体、酵素的活性を有さないことが認識される。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ニッカーゼと逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドと逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８ＡバリアントポリペプチドとＴｆ１逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８ＡバリアントポリペプチドとＴｆ１－Ｄ３６４Ｎ逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８ＡバリアントポリペプチドとＨＩＶ－１逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８ＡバリアントポリペプチドとＭ－ＭＬＶ逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８ＡバリアントポリペプチドとＡＭＶ逆転写酵素との間に位置する。

【0145】

一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＮＬＳとニッカーゼとの間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＮＬＳと逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＮＬＳとＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドとの間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＮＬＳとＴｆ１逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＮＬＳとＴｆ１－Ｄ３６４Ｎ逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＮＬＳとＨＩＶ－１逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＮＬＳとＭ－ＭＬＶ逆転写酵素との間に位置する。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、ＮＬＳとＡＭＶ逆転写酵素との間に位置する。

【0146】

一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも１アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも２アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも３アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも４アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも５アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも６アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも７アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも８アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも９アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも１０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも１５アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも２０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも２５アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも３０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも３５アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも４０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも４５アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも５０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも６０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、少なくとも７０アミノ酸残基を含む。

【0147】

一態様において、リンカーアミノ酸配列は、１アミノ酸残基～７５アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、１アミノ酸残基～５０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、１アミノ酸残基～４０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、１アミノ酸残基～３０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、１アミノ酸残基～２０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、１アミノ酸残基～１０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、１０アミノ酸残基～５０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、１０アミノ酸残基～４０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、２０アミノ酸残基～５０アミノ酸残基を含む。一態様において、リンカーアミノ酸配列は、２０アミノ酸残基～４０アミノ酸残基を含む。

【0148】

本明細書において使用される場合、「逆転写酵素」は、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成し得る任意の酵素である。逆転写酵素は、酵素番号及びＣＡＳ登録番号（ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｕｍｂｅｒ）（登録商標）９０６８－３８－６によるセクション２．７．７．４９のもと分類される。逆転写酵素アミノ酸配列の非限定的な例は、配列番号１２及び１３（両方ともＴｆ１逆転写酵素である）として提供される。

【0149】

一態様において、逆転写酵素は、Ｔｆ１逆転写酵素である。一態様において、逆転写酵素は、Ｔｆ１逆転写酵素に由来する。一態様において、逆転写酵素は、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）逆転写酵素である。一態様において、逆転写酵素は、ＨＩＶ－１逆転写酵素に由来する。一態様において、逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素である。一態様において、逆転写酵素は、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素に由来する。一態様において、逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素である。一態様において、逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素に由来する。一態様において、逆転写酵素は、ＨＩＶ－１逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、及びＡＭＶ逆転写酵素からなる群から選択される。一態様において、逆転写酵素は、ＨＩＶ－１逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、及びＡＭＶ逆転写酵素からなる群から選択される逆転写酵素に由来する。

【0150】

一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも８０％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも８５％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９１％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９２％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９３％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９４％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９５％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９６％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９７％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９８％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９９％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１２と１００％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。

【0151】

一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも８０％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも８５％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９１％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９２％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９３％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９４％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９５％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９６％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９７％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９８％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と少なくとも９９％同一又は類似のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号１３と比較して３６４位のアスパラギンを含む。一態様において、逆転写酵素は、配列番号１３と１００％同一又は類似のアミノ酸配列を含む。

【0152】

一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、ニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、Ｃａｓ９ニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９ニッカーゼをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドをさらに含む。一態様において、Ｔｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをさらに含む。

【0153】

一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導ニッカーゼである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導ニッカーゼである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導ニッカーゼである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導ニッカーゼである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導ニッカーゼである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導ニッカーゼである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９誘導ニッカーゼである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＭＡＤ２０１９誘導ニッカーゼである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドである。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドである。

【0154】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖回文反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）－ＣＲＩＳＰＲ会合タンパク質）酵素は、ガイドを使用して特異的ＤＮＡ標的を認識し、開裂させるヌクレアーゼである。いかなる科学的理論によっても限定されるものではないが、ニッカーゼは、ヌクレアーゼから（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素）、ヌクレアーゼを突然変異させ、又は編集することにより誘導することができる。一態様において、ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素に由来する。

【0155】

Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びＧＳＵ００５４が挙げられる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ４、Ｃａｓ９、及びＣｓｎ２が挙げられる。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｘ１０、及びＣｓｘ１１が挙げられる。ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の非限定的な例は、Ｃｓｆ１である。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても公知）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１としても公知）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３としても公知）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹとしても公知）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸとしても公知）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃａｓ１４又はＣ２ｃ１０としても公知）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５としても公知）、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、及びＣ２ｃ９が挙げられる。ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２としても公知）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄが挙げられる。

【0156】

一態様において、本開示は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを細胞に提供する方法であって、（ａ）細胞を得ること；及び（ｂ）細胞に、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を提供することを含む方法を提供する。一態様において、本開示は、融合タンパク質を細胞に提供する方法であって、（ａ）細胞を得ること；及び（ｂ）細胞に、融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸分子を提供することを含む方法を提供する。一態様において、方法は、細胞に、ガイドをコードする核酸分子をトランスフェクトすることをさらに含む。一態様において、方法は、細胞に、ホモロジーアームをコードする核酸分子をトランスフェクトすることをさらに含む。一態様において、方法は、細胞に、ガイド及びホモロジーアームをコードする核酸分子をトランスフェクトすることをさらに含む。一態様において、方法は、細胞に、（ａ）ガイド；（ｂ）ホモロジーアーム；又は（ｃ）ガイド及びホモロジーアームをコードする核酸分子をトランスフェクトすることをさらに含む。

【0157】

一態様において、本明細書に提供される核酸分子は、細胞中のゲノム中に安定的に組み込まれる。一態様において、本明細書に提供される核酸分子は、細胞中に一過的に導入される。一態様において、本明細書に提供される核酸分子は、プラスミド内に位置する。本明細書において使用される場合、「プラスミド」は、環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。一態様において、プラスミドは、複製起点を含む。一態様において、プラスミドは、選択マーカ遺伝子を含む。

【0158】

細胞中への任意の核酸分子の一過的形質転換又は安定的組み込みを含む方法が本明細書に提供される。本明細書において使用される場合、「安定的組み込み」又は「安定的に組み込まれる」は、標的化細胞が導入される核酸分子を次世代の形質転換生物に移すことを可能とする、標的化細胞のゲノム中への核酸分子の導入を指す。

【0159】

本明細書において使用される場合、「一過的に導入される」、「一過的に形質転換される」、又は「一過的形質転換」は、次世代の形質転換生物に導入されない、細胞中へのＤＮＡの導入を指す。

【0160】

細胞を核酸分子又は核タンパク質複合体で形質転換する（例えば、細胞に核酸分子又は核タンパク質複合体を提供する）多数の方法が当技術分野において公知であり、それらを本出願の方法に従って使用することができる。当技術分野において公知の細胞の形質転換のための任意の好適な方法又は技術が本方法に従って使用され得る。細胞の形質転換のための非限定的な方法としては、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、及びエレクトロポレーションが挙げられる。一態様において、方法は、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、及びエレクトロポレーションからなる群から選択される方法を使用して１つ以上の核酸分子又は核タンパク質複合体を細胞に導入することを含む。

【0161】

一態様において、方法は、ポリエチレングリコール媒介形質転換を介して細胞に核酸分子を提供することを含む。一態様において、方法は、バイオリスティック形質転換を介して細胞に核酸分子を提供することを含む。一態様において、方法は、リポソーム媒介トランスフェクションを介して細胞に核酸分子を提供することを含む。一態様において、方法は、ウイルス形質導入を介して細胞に核酸分子を提供することを含む。一態様において、方法は、１つ以上の送達粒子の使用を介して細胞に核酸分子を提供することを含む。一態様において、方法は、マイクロインジェクションを介して細胞に核酸分子を提供することを含む。一態様において、方法は、エレクトロポレーションを介して細胞に核酸分子を提供することを含む。一態様において、方法は、マイクロインジェクションを介して細胞に核タンパク質複合体を提供することを含む。一態様において、方法は、エレクトロポレーションを介して細胞に核タンパク質複合体を提供することを含む。

【0162】

形質転換の他の方法、例えば、減圧浸潤、圧力処理、超音波処理、及び炭化ケイ素繊維撹拌も当技術分野において公知であり、本明細書に提供される任意の方法での使用に想定される。

【0163】

細胞を形質転換する方法は、当業者に周知である。例えば、核酸分子でコーティングされた粒子を用いるマイクロプロジェクティルボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）による植物細胞の形質転換（例えば、バイオリスティック形質転換）についての具体的な指示は、米国特許第５，５５０，３１８号明細書；同第５，５３８，８８０号明細書、同第６，１６０，２０８号明細書；同第６，３９９，８６１号明細書；及び同第６，１５３，８１２号明細書に見出される。

【0164】

リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（商標）及びリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質としては、フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。

【0165】

核酸分子の１つ以上のエレメントの発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びそれらの構成成分は、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレットにおいて使用されるものである。一態様において、核酸分子又はタンパク質を細胞に提供する方法は、送達粒子を介する送達を含む。一態様において、核酸分子を細胞に提供する方法は、送達ベシクルを介する送達を含む。一態様において、送達ベシクルは、エクソソーム及びリポソームからなる群から選択される。一態様において、核酸分子を細胞に提供する方法は、ウイルスベクターを介する送達を含む。一態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される。別の態様において、核酸分子を細胞に提供する方法は、ナノ粒子を介する送達を含む。一態様において、核酸分子を細胞に提供する方法は、マイクロインジェクションを含む。一態様において、核酸分子を細胞に提供する方法は、ポリカチオンを含む。一態様において、核酸分子を細胞に提供する方法は、カチオン性オリゴペプチドを含む。

【0166】

一態様において、送達粒子は、エクソソーム、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ナノ粒子、ポリカチオン、及びカチオン性オリゴペプチドからなる群から選択される。一態様において、本明細書に提供される方法は、１つ以上の送達粒子の使用を含む。別の態様において、本明細書に提供される方法は、２つ以上の送達粒子の使用を含む。別の態様において、本明細書に提供される方法は、３つ以上の送達粒子の使用を含む。

【0167】

細胞中への核酸分子の導入を容易にするための好適な作用因子としては、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対する細胞の透過性を増加させる作用因子が挙げられる。細胞中への組成物の導入を容易にするためのこのような作用因子としては、化学的作用因子、若しくは物理的作用因子、又はそれらの組み合わせが挙げられる。コンディショニングのための化学的作用因子としては、（ａ）界面活性剤、（ｂ）有機溶媒、水溶液、若しくは有機溶媒の水性混合物、（ｃ）酸化剤、（ｅ）酸、（ｆ）塩基、（ｇ）油、（ｈ）酵素、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0168】

ポリヌクレオチドによる透過に対する細胞の実験室コンディショニングのための作用因子としては、例えば、化学的作用因子の適用、酵素的処理、加熱若しくは冷蔵、陽圧若しくは陰圧による処理、又は超音波処理が挙げられる。

【0169】

一態様において、本開示は、少なくとも１つの真核細胞を編集する方法であって、（ａ）（ｉ）少なくとも１つの真核細胞に、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド、又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を；及び（ｉｉ）少なくとも１つの真核細胞に、ガイドＲＮＡであって、真核細胞のゲノム内の標的核酸分子と相補的な核酸配列を含むガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することであって；ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びガイドＲＮＡは、少なくとも１つの真核細胞内で核タンパク質複合体を形成し、核タンパク質複合体は、標的核酸分子の一方の鎖を開裂させ、少なくとも１つの編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子内で作製されること；並びに（ｂ）少なくとも１つの編集を含む少なくとも１つの真核細胞を同定することを含む方法を提供する。一態様において、方法のステップ（ａ）は、少なくとも１つのホモロジーアーム、又はホモロジーアームをコードする核酸分子を真核細胞に導入することをさらに含み、少なくとも１つのホモロジーアームは、少なくとも１つの編集を含む核酸配列を含む。

【0170】

一態様において、本開示は、少なくとも１つの真核細胞を編集する方法であって、（ａ）（ｉ）少なくとも１つの真核細胞に、融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸分子を；及び（ｉｉ）少なくとも１つの真核細胞に、ガイドＲＮＡであって、真核細胞のゲノム内の標的核酸分子と相補的な核酸配列を含むガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することであって；融合タンパク質及びガイドＲＮＡは、少なくとも１つの真核細胞内で核タンパク質複合体を形成し、核タンパク質複合体は、標的核酸分子の一方の鎖を開裂させ、少なくとも１つの編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子内で作製されること；並びに（ｂ）少なくとも１つの編集を含む少なくとも１つの真核細胞を同定することを含む方法を提供する。一態様において、方法のステップ（ａ）は、少なくとも１つのホモロジーアーム、又はホモロジーアームをコードする核酸分子を真核細胞に導入することをさらに含み、少なくとも１つのホモロジーアームは、少なくとも１つの編集を含む核酸配列を含む。

【0171】

非限定的な実施形態の以下の実施例が具体的に想定される：
１．配列番号１と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドであって、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【0172】

２．配列番号１と比較してＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。
３．配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【0173】

４．配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【0174】

５．配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。
６．配列番号１と比較してＳ４０９Ｒアミノ酸置換、Ｌ５００Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【0175】

７．配列番号１と比較してＶ１１４３Ｔアミノ酸置換及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。
８．配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【0176】

９．配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｒアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【0177】

１０．配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｄ１１３９Ｎアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【0178】

１１．配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、Ａ１２２１Ｈアミノ酸置換、及びＫ１２８５Ｒアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【0179】

１２．配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。

【0180】

１３．少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。
１４．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸配列。

【0181】

１５．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及び核酸分子を含む核タンパク質複合体。
１６．核酸分子は、（ａ）ガイド；（ｂ）ホモロジーアーム；又は（ｃ）ガイド及びホモロジーアームを含む、実施形態１５に記載の核タンパク質複合体。

【0182】

１７．核酸分子は、ＲＮＡ分子である、実施形態１５又は１６に記載の核タンパク質複合体。
１８．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む真核細胞。

【0183】

１９．実施形態１４に記載の核酸配列を含む真核細胞。
２０．実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の核タンパク質複合体を含む真核細胞。

【0184】

２１．実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む融合タンパク質。
２２．逆転写酵素をさらに含む、実施形態２１に記載の融合タンパク質。

【0185】

２３．逆転写酵素は、配列番号１２と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＴｆ１逆転写酵素である、実施形態２２に記載の融合タンパク質。
２４．Ｔｆ１逆転写酵素は、配列番号１２と比較してＤ３６２Ｎアミノ酸置換を含む、実施形態２３に記載の融合タンパク質。

【0186】

２５．Ｔｆ１逆転写酵素は、配列番号１３を含む、実施形態２３に記載の融合タンパク質。
２６．逆転写酵素は、ＨＩＶ－１（ヒト免疫不全ウイルス）逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、及びＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素からなる群から選択される逆転写酵素に由来する、実施形態２２に記載の融合タンパク質。

【0187】

２７．少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含む、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２８．リンカーアミノ酸配列を含む、実施形態２１～２７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0188】

２９．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドと逆転写酵素との間に位置するリンカーアミノ酸配列を含む、実施形態２２に記載の融合タンパク質。
３０．配列番号１２と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＴｆ１逆転写酵素を含む融合タンパク質。

【0189】

３１．Ｔｆ１逆転写酵素は、配列番号１２と比較してＤ３６２Ｎアミノ酸置換を含む、実施形態３０に記載の融合タンパク質。
３２．Ｔｆ１逆転写酵素は、配列番号１３を含む、実施形態３０に記載の融合タンパク質。

【0190】

３３．ニッカーゼをさらに含む、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
３４．ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、実施形態３３に記載の融合タンパク質。

【0191】

３５．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。
３６．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。

【0192】

３７．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。
３８．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。

【0193】

３９．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。
４０．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。

【0194】

４１．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。
４２．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＭＡＤ２０１９ポリペプチドである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。

【0195】

４３．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。
４４．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼは、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドである、実施形態３４に記載の融合タンパク質。

【0196】

４５．配列番号１と少なくとも９０％同一又は類似のアミノ酸配列を含むＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをさらに含み、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａニッカーゼは、配列番号１に従う８４８位のアラニンを含む、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0197】

４６．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。
４７．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0198】

４８．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｒアミノ酸置換、Ｄ７００Ａアミノ酸置換、Ｄ７０１Ｐアミノ酸置換、Ｋ７２０Ｓアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0199】

４９．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0200】

５０．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＳ４０９Ｒアミノ酸置換、Ｌ５００Ｋアミノ酸置換、及びＶ１１４３Ｔアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0201】

５１．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＶ１１４３Ｔアミノ酸置換及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0202】

５２．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0203】

５３．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｉ１１４２Ｒアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0204】

５４．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｄ１１３９Ｎアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、及びＡ１２２１Ｈアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0205】

５５．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＬ５００Ｋアミノ酸置換、Ｖ１１４３Ｔアミノ酸置換、Ａ１２２１Ｈアミノ酸置換、及びＫ１２８５Ｒアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0206】

５６．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ６７Ｇ、Ｓ４０９Ｒ、Ｌ５００Ｋ、Ｌ５００Ｒ、Ｇ５７８Ｆ、Ｌ６２４Ｑ、Ｎ６６９Ｓ、Ｄ７００Ａ、Ｄ７０１Ｐ、Ｄ７０１Ｎ、Ｄ７０１Ｔ、Ｋ７２０Ｓ、Ｌ１１１０Ｒ、Ｄ１１３９Ｎ、Ｉ１１４２Ｒ、Ｉ１１４２Ｋ、Ｖ１１４３Ｔ、Ａ１２２１Ｈ、Ｋ１２８５Ｒ、Ａ１３２１Ｒ、Ａ１３２１Ｋ、Ｓ１１３６Ｑ、及びＡ１１３９Ｒからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質。

【0207】

５７．少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含む、実施形態３０～５６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
５８．リンカーアミノ酸配列を含む、実施形態３０～５７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0208】

５９．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８ＡバリアントポリペプチドとＴｆ１逆転写酵素との間に位置するリンカーアミノ酸配列を含む、実施形態４５～５６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0209】

６０．ニッカーゼとＴｆ１逆転写酵素との間に位置するリンカーアミノ酸配列を含む、実施形態３３に記載の融合タンパク質。
６１．実施形態２１～６０のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。

【0210】

６２．実施形態２１～６０のいずれか１つに記載の融合タンパク質及び核酸分子を含む核タンパク質複合体。
６３．核酸分子は、（ａ）ガイド；（ｂ）ホモロジーアーム；又は（ｃ）ガイド及びホモロジーアームを含む、実施形態６２に記載の核タンパク質複合体。

【0211】

６４．核酸分子は、ＲＮＡ分子である、実施形態６２又は６３に記載の核タンパク質複合体。
６５．実施形態２１～６０のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含む真核細胞。

【0212】

６６．実施形態６１に記載の核酸配列を含む真核細胞。
６７．実施形態６２～６４のいずれか１つに記載の核タンパク質複合体を含む真核細胞。

【0213】

６８．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを細胞に提供する方法であって、
（ａ）細胞を得ること；及び
（ｂ）細胞に、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド、又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を提供すること
を含む方法。

【0214】

６９．融合タンパク質を細胞に提供する方法であって、
（ａ）細胞を得ること；及び
（ｂ）細胞に、実施形態２１～６０のいずれか１つに記載の融合タンパク質、又は融合タンパク質をコードする核酸分子を提供すること
を含む方法。

【0215】

７０．細胞に、（ａ）ガイド；（ｂ）ホモロジーアーム；又は（ｃ）ガイド及びホモロジーアームをコードする核酸分子をトランスフェクトすることをさらに含む、実施形態６８又は６９に記載の方法。

【0216】

７１．ガイドは、細胞内でＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドとの核タンパク質複合体を形成するＲＮＡ分子である、実施形態６９に記載の方法。
７２．ガイドは、細胞内の標的核酸分子と相補的な配列を含む、実施形態７１に記載の方法。

【0217】

７３．核タンパク質複合体は、細胞内の標的核酸分子を編集する、実施形態７２に記載の方法。
７４．ガイドは、細胞内で融合タンパク質との核タンパク質複合体を形成するＲＮＡ分子である、実施形態７０に記載の方法。

【0218】

７５．ガイドは、細胞内の標的核酸分子と相補的な配列を含む、実施形態７４に記載の方法。
７６．核タンパク質複合体は、細胞内の標的核酸分子を編集する、実施形態７５に記載の方法。

【0219】

７７．標的核酸分子は、細胞の核ゲノム内に位置する、実施形態７２、７３、７５、及び７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．標的核酸分子は、細胞のミトコンドリアゲノム内に位置する、実施形態７２、７３、７５、及び７６のいずれか１つに記載の方法。

【0220】

７９．提供は、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群から選択される方法を含む、実施形態６８～７６のいずれか１つに記載の方法。

【0221】

８０．少なくとも１つの真核細胞を編集する方法であって、
（ａ）
（ｉ）少なくとも１つの真核細胞に、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド、又はＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドをコードする核酸分子を；及び
（ｉｉ）少なくとも１つの真核細胞に、ガイドＲＮＡであって、真核細胞のゲノム内の標的核酸分子と相補的な核酸配列を含むガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸分子を
導入することであって；
ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及びガイドＲＮＡは、少なくとも１つの真核細胞内で核タンパク質複合体を形成し、核タンパク質複合体は、標的核酸分子の一方の鎖を開裂させ、少なくとも１つの編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子内で作製されること；並びに
（ｂ）少なくとも１つの編集を含む少なくとも１つの真核細胞を同定すること
を含む方法。

【0222】

８１．少なくとも１つの真核細胞を編集する方法であって、
（ａ）
（ｉ）少なくとも１つの真核細胞に、実施形態２１～６０のいずれか１つに記載の融合タンパク質、又は融合タンパク質をコードする核酸分子を；及び
（ｉｉ）少なくとも１つの真核細胞に、ガイドＲＮＡであって、真核細胞のゲノム内の標的核酸分子と相補的な核酸配列を含むガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸分子を
導入することであって；
融合タンパク質及びガイドＲＮＡは、少なくとも１つの真核細胞内で核タンパク質複合体を形成し、核タンパク質複合体は、標的核酸分子の一方の鎖を開裂させ、少なくとも１つの編集は、標的核酸分子の対照バージョンと比較して標的核酸分子内で作製されること；並びに
（ｂ）少なくとも１つの編集を含む少なくとも１つの真核細胞を同定すること
を含む方法。

【0223】

８２．方法のステップ（ａ）は、少なくとも１つのホモロジーアーム、又はホモロジーアームをコードする核酸分子を、真核細胞に導入することをさらに含み、少なくとも１つのホモロジーアームは、少なくとも１つの編集を含む核酸配列を含む、実施形態８０又は８１に記載の方法。

【0224】

８３．少なくとも１つの編集は、挿入を含む、実施形態８０～８２のいずれか１つに記載の方法。
８４．少なくとも１つの編集は、欠失を含む、実施形態８０～８２のいずれか１つに記載の方法。

【0225】

８５．少なくとも１つの編集は、置換を含む、実施形態８０～８２のいずれか１つに記載の方法。
８６．少なくとも１つの編集は、単一ヌクレオチドの置換を含む、実施形態８０～８２のいずれか１つに記載の方法。

【0226】

８７．単一ヌクレオチドの置換は、トランシジョンを含む、実施形態８６に記載の方法。
８８．単一ヌクレオチドの置換は、トランスバージョンを含む、実施形態８６に記載の方法。

【0227】

８９．配列番号２４と少なくとも８０％同一の核酸配列を有する足場領域を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
９０．核酸配列は、配列番号２４と少なくとも９０％同一である、実施形態８９に記載のｇＲＮＡ。

【0228】

９１．核酸配列は、配列番号２４と少なくとも９５％同一である、実施形態８９に記載のｇＲＮＡ。
９２．核酸配列は、配列番号２４と１００％同一である、実施形態８９に記載のｇＲＮＡ。

【0229】

９３．融合タンパク質及び実施形態８９～９２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡを含む核タンパク質複合体。
９４．融合タンパク質は、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを含む、実施形態９３に記載の核タンパク質複合体。

【0230】

９５．融合タンパク質は、逆転写酵素を含む、実施形態９３又は９４に記載の核タンパク質複合体。
９６．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド及び実施形態８９～９２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡを含む核タンパク質複合体。

【0231】

９７．ニッカーゼ及び実施形態８９～９２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡを含む核タンパク質複合体。
９８．実施形態８９～９２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡを含む核タンパク質複合体。

【0232】

本開示を目下一般的に記載したが、それは、説明として提供され、規定のない限り本開示の限定と意図されない以下の実施例への言及を介してより容易に理解される。

【実施例】

【0233】

実施例１．作業手順概要
ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ（配列番号１）をベースとする、本明細書に提供されるＭＡＤ２０１９バリアントポリペプチドは、図２に示される方法を使用して同定した。最初に、配列番号１の全ての残基についての部位飽和突然変異誘発により、バリアントのプール（図２のＳｅｑ １；Ｓｅｑ １は、アラニンに代えて８４８位のアミノ酸ヒスチジンを有する配列番号１バリアントを指す）を生成した。全ての残基についての部位飽和突然変異誘発により、Ｈ８４８を有するＳｅｑ １のバリアントの別のプールを生成した。次に、スクリーニングを実施して配列番号１Ｓｅｑ １を含む融合タンパク質と比較して改善された切断効率を有する配列番号１バリアントを同定し（図２のスクリーニング１）、又はＳｅｑ １若しくはＳｅｑ １を含む融合タンパク質と比較して改善されたＣＲＥＡＴＥ融合編集効率を有するバリアントを同定した（図２のスクリーニング２）。例えば、米国特許第１１，２６８，０７８号明細書参照。

【0234】

改善された切断効率についての候補の同定後、さらなる評価のためにＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ（図２）中にバリアントを導入する。全ての残基についての部位飽和突然変異誘発により生成された、改善されたＣＲＥＡＴＥ融合編集を有するＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを同定するための２回目のスクリーニングラウンド。両方のスクリーニングからの候補のプール（図２の候補のコレクション）をさらにバリデートして複数のアッセイ（例えば、バリデーション）を介してＣＲＥＡＴＥ融合編集の改善を測定する。表２は、少なくとも１つのアッセイ（例えば、図２のアッセイＴ２１、アッセイＴ２２、アッセイＴ２３、アッセイＴ２４）においてＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａと比較して改善されたＣＲＥＡＴＥ融合編集を示したＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントのリストを提供する。

【0235】

切断効率についてのスクリーニングは、細胞のゲノム中にランダムに組み込まれた合成緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の単一コピーの発現から生成された蛍光を検出することを含む。切断が行われない場合、ＧＦＰシグナルは、同様の条件下で成長させた対照細胞からのＧＦＰ発現と同様である。ＧＦＰの正常な発現又は活性を中断する二本鎖分解が生成される場合、ＧＦＰシグナルの低減が観察される。しかしながら、正確な編集が行われる場合、ＧＦＰは変換されて青色波長の蛍光（ＢＦＰ）を放出し得、それを検出及び定量することができる。例えば、ハイム（Ｈｅｉｍ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９１巻、ｐ．１２５０１～１２５０４、１９９４年；及びグレイザー（Ｇｌａｓｅｒ）ら著、モレキュラー・セラピー・ヌクレイック・アシッズ（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）、第５巻、ｅ３３４、２０１６年参照。

【0236】

表２．ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ（配列番号１）と比較して少なくとも１つのアッセイにおいて改善されたＣＲＥＡＴＥ融合編集を有するＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド。ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドバリアント欄は、各バリアントについてのアミノ酸残基変化及び変化の位置を示す。例えば、Ｔ６７Ｇは、配列番号１の６７位のトレオニン（Ｔ）からグリシン（Ｇ）への変化を指す。アッセイ欄の値は、配列番号１と比較した活性倍率を指し、１．０の値は配列番号１と等しい活性を指す。アッセイは、表３に提供されるガイド配列を指す。

【0237】

【表2】

【0238】

実施例２．ＭＡＤザイム（ＭＡＤｚｙｍｅ）のためのベクター構築物及びガイド発現プラスミド
ＭＡＤ２０１９バリアントポリペプチドを、ＣＭＶプロモータの制御下でクローニングしてＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト腎）細胞中で発現させた。ＭＡＤ２０１９バリアントポリペプチドを、ＥＦ１－アルファプロモータ下においてもクローニングして人工多能性幹細胞（ＰＧＰ１６８）中で発現させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系は、そのゲノム中にランダムに組み込まれた合成緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の単一コピーを含んだ。ＣＲＥＡＴＥ融合編集アッセイのため、ＭＡＤ２０１９ポリペプチド及びＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドバリアントを逆転写酵素と融合させ、単一融合構築物として発現させた。

【0239】

ＧＦＰ遺伝子座を標的化するガイドＲＮＡを、ヒトＵ６プロモータの制御下で、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）足場（配列番号２４）及び各ｓｇＲＮＡの５’末端に位置するガイド配列（表３参照）とともにクローニングした。最終配列の３’末端における追加のＲＮＡ安定化配列エレメント（例えば、配列番号２５）とそれに続く転写ターミネータ（例えば、５’－ＴＴＴＴＴＴＴ－３’）を用いてＣＲＥＡＴＥ融合編集アッセイを実施した場合、各ｓｇＲＮＡ（表３参照）の３’末端にＣＲＥＡＴＥ融合ホモロジーアームを位置させた。

【0240】

表３．ＣＲＥＡＴＥ融合アッセイにおいて使用されたガイド及びホモロジーアーム配列。ＰＡＭは、プロトスペーサ隣接モチーフを指す。

【0241】

【表3】

【0242】

実施例３．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のトランスフェクション
１μＬのポリフェクト（ＰｏｌｙＦｅｃｔ）（商標）トランスフェクション試薬と、ガイドを発現するプラスミド（５０ｎｇ）、又は陰性対照としてのｐＵＣ１９、及びＭ－ＭＬＶ逆転写酵素と融合しているＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド（表２参照）を発現するプラスミド（５０ｎｇ）を混合し、３５μＬのオプティメム（ＯｐｔｉＭｅｍ）（商標）中で希釈した。この混合物は、リバーストランスフェクションのために１００μＬのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で合成ＧＦＰ標的遺伝子座を含む２５０００個のトリプＬＥ（ＴｒｙｐＬＥ）単体化ＨＥＫ２９３Ｔ宿主細胞に添加した。

【0243】

トランスフェクションの６日後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、フローサイトメータを使用して分析してＧＦＰの発現を妨げた二本鎖分解の証拠であるＧＦＰシグナルの枯渇を検出し、又は正確なゲノム編集の証拠であるＢＦＰシグナルを検出した。図３Ａ参照。

【0244】

実施例４．人工多能性幹細胞中のトランスフェクション
０．７５μＬのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）ステムトランスフェクション試薬と、ガイドを発現するプラスミド（２５ｎｇ）、又は陰性対照としてのｐＵＣ１９、及びＭ－ＭＬＶ逆転写酵素と融合しているＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチド（表２参照）を発現するプラスミド（２５ｎｇ）を混合し、オプティメム（ＯｐｔｉＭｅｍ）（商標）中で希釈した。事前にプレーティングされた人工多能性幹細胞に対するフォワードトランスフェクションを実施した。

【0245】

トランスフェクションの６日後、人工多能性幹細胞を回収し、フローサイトメータを使用して分析してＧＦＰの発現を妨げた二本鎖分解の証拠であるＧＦＰシグナルの枯渇を検出し、又は正確なゲノム編集の証拠であるＢＦＰシグナルを検出した。図３Ｂ参照。

【0246】

実施例５．ＭＡＤザイムのためのベクター構築物及びガイド発現プラスミド
哺乳類動物中の発現のためにＣＭＶプロモータの制御下でプラスミド中に、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ又は表２に記載のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドバリアントと、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）逆転写酵素Ｔｆ１（配列番号１２）又はＴｆ１バリアントＴｆ１－Ｄ３６４Ｎ（配列番号１３）との融合タンパク質をクローニングした。

【0247】

ＧＦＰ遺伝子座を標的化するガイドＲＮＡを、ヒトＵ６プロモータの制御下で、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）足場（配列番号１４）及び各ｓｇＲＮＡの５’末端に位置するガイド配列（表３参照）とともにクローニングした。各ｓｇＲＮＡ（表３参照）の３’末端にＣＲＥＡＴＥ融合ホモロジーアームを位置させた。

【0248】

構築物は、細胞のゲノム中にランダムに組み込まれたＧＦＰの単一コピーを含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に導入されることが意図される。
実施例６．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のトランスフェクション
プラスミドセットの２つの群を調製し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトする。

【0249】

第１の群は、ガイドを発現するプラスミド（５０ｎｇ）、又は陰性対照としてのｐＵＣ１９、及びＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ：：Ｔｆ１（それぞれ配列番号１及び１２）を発現するプラスミド（５０ｎｇ）を含み、それらを１μＬのポリフェクト（ＰｏｌｙＦｅｃｔ）（商標）トランスフェクション試薬と混合し、３５μＬのオプティメム（ＯｐｔｉＭｅｍ）（商標）中で希釈する。この混合物は、リバーストランスフェクションのために１００μＬのＤＭＥＭ中で合成ＧＦＰ標的遺伝子座を含む２５０００個のトリプＬＥ（ＴｒｙｐＬＥ）単体化ＨＥＫ２９３Ｔ宿主細胞に添加した。

【0250】

第２の群は、ガイドを発現するプラスミド（５０ｎｇ）、又は陰性対照としてのｐＵＣ１９、及びＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａ：：Ｔｆ１－Ｄ３６４Ｎ（それぞれ配列番号１及び１３）を発現するプラスミド（５０ｎｇ）を含み、それらを１μＬのポリフェクト（ＰｏｌｙＦｅｃｔ）（商標）トランスフェクション試薬と混合し、３５μＬのオプティメム（ＯｐｔｉＭｅｍ）（商標）中で希釈する。この混合物は、リバーストランスフェクションのために１００μＬのＤＭＥＭ中で合成ＧＦＰ標的遺伝子座を含む２５０００個のトリプＬＥ（ＴｒｙｐＬＥ）単体化ＨＥＫ２９３Ｔ宿主細胞に添加した。

【0251】

トランスフェクションの６日後、人工多能性幹細胞を回収し、フローサイトメータを使用して分析してＧＦＰの発現を妨げた二本鎖分解の証拠であるＧＦＰシグナルの枯渇を検出し、又は正確なゲノム編集の証拠であるＢＦＰシグナルを検出した。図４参照。

【0252】

実施例７．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中の追加のトランスフェクション
プラスミドセットの２つの追加の群を調製し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトする。

【0253】

第１の群は、２３個のユニーク混合物を含む。各混合物は、ガイドを発現するプラスミド（５０ｎｇ）、又は陰性対照としてのｐＵＣ１９、及び表２に提供される２３個のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドバリアントの１つ：：Ｔｆ１（５０ｎｇ）を含む。１μＬのポリフェクト（ＰｏｌｙＦｅｃｔ）（商標）トランスフェクション試薬と２３個の混合物の各々を独立して混合し、３５μＬのオプティメム（ＯｐｔｉＭｅｍ）（商標）中で希釈する。リバーストランスフェクションのために１００μＬのＤＭＥＭ中で合成ＧＦＰ標的遺伝子座を含む２５０００個のトリプＬＥ（ＴｒｙｐＬＥ）単体化ＨＥＫ２９３Ｔ宿主細胞の単一の独立アリコートに混合物の各々を添加し、プラスミド／細胞の組み合わせの２３個のユニークセットをもたらす。

【0254】

第２の群は、２３個のユニーク混合物を含む。各混合物は、ガイドを発現するプラスミド（５０ｎｇ）、又は陰性対照としてのｐＵＣ１９、及び表２に提供される２３個のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａポリペプチドバリアントの１つ：：Ｔｆ１－Ｄ３６４Ｎ（５０ｎｇ）を含む。１μＬのポリフェクト（ＰｏｌｙＦｅｃｔ）（商標）トランスフェクション試薬と２３個の混合物の各々を独立して混合し、３５μＬのオプティメム（ＯｐｔｉＭｅｍ）（商標）中で希釈する。リバーストランスフェクションのために１００μＬのＤＭＥＭ中で合成ＧＦＰ標的遺伝子座を含む２５０００個のトリプＬＥ（ＴｒｙｐＬＥ）単体化ＨＥＫ２９３Ｔ宿主細胞の単一の独立アリコートに混合物の各々を添加し、プラスミド／細胞の組み合わせの２３個のユニークセットをもたらす。

【0255】

トランスフェクションの６日後、人工多能性幹細胞を回収し、フローサイトメータを使用して分析してＧＦＰの発現を妨げた二本鎖分解の証拠であるＧＦＰシグナルの枯渇を検出し、又は正確なゲノム編集の証拠であるＢＦＰシグナルを検出した。

【0256】

実施例８．追加のＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドの生成
ＣＲＥＡＴＥ融合酵素１９（ＣＦＥ１９）は、核局在化シグナル（配列番号１５）、ＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａニッカーゼ（配列番号１６）、リンカー（配列番号１７）、ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号１８）及び第２の核局在化シグナル（配列番号１９）を含む。ＣＦＥ１９についての全長アミノ酸配列は、配列番号２０に提供する。

【0257】

ＣＦＥ１９は編集に供してコンビナトリアルＭＡＤ２０１９－Ｈ８４８Ａバリアントポリペプチドを生成する。表４は、産生されたバリアントのまとめを提供する。
表４．ＣＦＥ１９バリアント

【0258】

【表4】

【0259】

表４に提供されるＣＦＥ１９バリアントの各々は、人工多能性幹細胞に導入した後にＥＦ１－アルファプロモータの制御下でプラスミドから発現させる。各ＣＦＥ１９バリアントの発現は、Ｔ２Ａリンカーにより連結されているｍチェリーレポータを介してモニタリングする。

【0260】

ランダムに挿入されたＧＦＰコード配列の単一コピーを含む、事前にプレーティングされた人工多能性幹細胞に対するフォワードトランスフェクションを実施した。
トランスフェクションの６日後、人工多能性幹細胞を回収し、フローサイトメータを使用して分析してＧＦＰの発現を妨げた二本鎖分解の証拠であるＧＦＰシグナルの枯渇を検出し、又は正確なゲノム編集の証拠であるＢＦＰシグナルを検出した。図５参照。特に、ＣＦＥ１９ｖ３は、複数の標的についての全体的な性能改善を示した。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【配列表】

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【国際調査報告】