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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-21
(54)【発明の名称】バニリンを回収および精製する方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/22 20060101AFI20250214BHJP
C12N 1/16 20060101ALN20250214BHJP
【ＦＩ】
C12P7/22
C12N1/16 G
C12N1/16 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024546416
(86)(22)【出願日】2023-02-14
(85)【翻訳文提出日】2024-09-24
(86)【国際出願番号】 US2023062578
(87)【国際公開番号】W WO2023159017
(87)【国際公開日】2023-08-24
(31)【優先権主張番号】63/310,395
(32)【優先日】2022-02-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524095775
【氏名又は名称】ダンスター フェルメント エージー
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＳＴＡＲ ＦＥＲＭＥＮＴ ＡＧ
(71)【出願人】
【識別番号】519139538
【氏名又は名称】インターナショナル・フレーバー・アンド・フレグランス・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107870
【弁理士】
【氏名又は名称】野村 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100098121
【弁理士】
【氏名又は名称】間山 世津子
(72)【発明者】
【氏名】フランコビッチ， オリバー
(72)【発明者】
【氏名】モータト， マリアンジェラ
(72)【発明者】
【氏名】ロブマイヤー， ゲルハルト マイケル
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC26
4B064CA06
4B064CC15
4B064CC30
4B064CD06
4B064CE06
4B064CE11
4B064CE15
4B064CE20
4B064DA10
4B064DA18
4B064DA20
4B065AA72X
4B065AC14
4B065AC15
4B065BD15
4B065BD18
4B065BD27
4B065BD44
4B065CA05
4B065CA51
4B065CA54
(57)【要約】
本開示は、微生物発酵ブロスからバニリンを回収および精製する方法であって、発酵ブロスが、バニリン複合体を生成および分泌することのできる微生物細胞により微生物発酵中に生成されたバニリン複合体、例えばバニリングルコシドを含む、方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
微生物発酵ブロスからバニリンを回収および精製する方法であって、前記発酵ブロスが、バニリン複合体を生成および分泌することのできる微生物細胞により微生物発酵中に生成されたバニリン複合体を含み、前記方法が、実質的に微生物細胞を含まない液体が残るように前記発酵ブロスから前記微生物細胞を分離および除去し、その後、前記液体に含まれるバニリン複合体をバニリンおよび対応する複合パートナーへと変換する工程（Ｉ）（ａ）、または
前記発酵ブロスに含まれるバニリン複合体をバニリンおよび対応する複合パートナーへと変換し、その後、実質的に微生物細胞を含まない液体が残るように前記発酵ブロスから前記微生物細胞を分離および除去する工程（Ｉ）（ｂ）、
その後、
工程（Ｉ）（ａ）もしくは（Ｉ）（ｂ）で得られた液体に水と混合できる極性有機溶媒を添加する工程（ＩＩ）（ａ）であって、工程（Ｉ）（ａ）で得られた液体が、任意選択で、前記極性有機溶媒の添加前もしくは添加後のいずれかにろ過される、工程（ＩＩ）（ａ）、
工程（ＩＩ）（ａ）で生成されたバニリン溶液を、
（ｉ）陽イオン交換吸着剤およびその後の弱塩基性陰イオン交換吸着剤、もしくは
（ｉｉ）弱塩基性陰イオン交換吸着剤およびその後の陽イオン交換吸着剤
のいずれかで処理する工程（ＩＩ）（ｂ）、および
任意選択で、得られた溶液を吸着剤で脱色する工程（ＩＩ）（ｃ）、または
工程（Ｉ）（ａ）もしくは（Ｉ）（ｂ）で得られた液体を非イオン性吸着剤で処理する工程（ＩＩ’）（ａ）であって、工程（Ｉ）（ａ）で得られた液体が、任意選択で、前記非イオン性吸着剤による処理の前にまずろ過され、工程（ＩＩ’）（ａ）で用いられる非イオン性吸着剤が、バニリンを吸着することができ、前記処理が、バニリンを前記非イオン性吸着剤に結合させる条件下での前記バニリンの吸着工程（ｉ）および前記結合したバニリンの溶液への脱着工程（ｉｉ）を含む、工程（ＩＩ’）（ａ）、
得られたバニリン溶液を、
（ｉ）陽イオン交換吸着剤、
（ｉｉ）弱塩基性陰イオン交換吸着剤、もしくは
（ｉｉｉ）いずれかの順序での陽イオン交換吸着剤および弱塩基性陰イオン交換吸着剤の両方
のいずれかで処理する工程（ＩＩ’）（ｂ）、および
任意選択で、得られた溶液を吸着剤で脱色する工程（ＩＩ’）（ｃ）のいずれか、ならびに
得られた溶液から前記バニリンを結晶化する工程（ＩＩＩ）を含む、方法。
【請求項2】
前記バニリン複合体がバニリングルコシドである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記微生物細胞が真菌細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記真菌細胞が酵母細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
工程（Ｉ）（ａ）または（Ｉ）（ｂ）における前記バニリン複合体のバニリンおよび前記対応する複合パートナーへの変換が、化学的変換または酵素的変換のいずれかにより行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
工程（ＩＩ）（ａ）で用いられる前記極性有機溶媒が、アルコール、または異なるアルコールの混合物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
工程（ＩＩ）（ｂ）で用いられる前記陽イオン交換吸着剤が、強酸性陽イオン交換吸着剤である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
工程（ＩＩ）（ｂ）で用いられる前記弱塩基性陰イオン交換吸着剤が、弱塩基性陰イオン交換樹脂である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
工程（ＩＩ）（ｂ）で用いられる前記弱塩基性陰イオン交換吸着剤が、使用前にアセテート型に変換される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記方法が工程（ＩＩ）（ｂ）（ｉ）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
工程（ＩＩ）（ｃ）で用いられる前記吸着剤が、炭素である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
工程（ＩＩ’）（ａ）で用いられる前記非イオン性吸着剤が、非イオン性樹脂である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
工程（ＩＩ’）（ａ）（ｉｉ）における前記結合したバニリンの溶液への脱着が、溶離液として有機溶媒、異なる有機溶媒の混合物、水と有機溶媒の混合物、または水と異なる有機溶媒の混合物を用いて行われる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
工程（ＩＩ’）（ｂ）で用いられる前記陽イオン交換吸着剤が、強酸性陽イオン交換吸着剤である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
工程（ＩＩ’）（ｂ）で用いられる前記弱塩基性陰イオン交換吸着剤が、弱塩基性陰イオン交換樹脂である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
工程（ＩＩ’）（ｂ）で用いられる前記弱塩基性陰イオン交換吸着剤が、使用前にアセテート型に変換される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記方法が工程（ＩＩ’）（ｂ）（ｉｉｉ）を含み、前記工程において、前記バニリン溶液が、陽イオン交換吸着剤により処理され、その後、弱塩基性陰イオン交換吸着剤により処理される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
工程（ＩＩ’）（ｃ）で用いられる前記吸着剤が、炭素である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
強塩基性陰イオン交換吸着剤による精製工程を含まない、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
７未満のｐＨで起こる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
バニリンの結晶化が、約３．５～５．５のｐＨで行われる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年２月１５日に出願された米国仮出願第６３／３１０，３９５号の優先権および利益を主張し、その内容は、法律により認められる程度までその全体が本明細書において援用される。
本出願は、２０２２年２月１５日に出願された米国仮出願第６３／３１０，３９５号の優先権および利益を主張し、その内容は、法律により認められる程度までその全体が本明細書において援用される。
【0002】
分野
本開示は、微生物発酵ブロスからバニリンを回収および精製する方法であって、発酵ブロスが、バニリン複合体を生成および分泌することのできる微生物細胞により微生物発酵中に生成されたバニリン複合体、例えばバニリングルコシドを含む、方法に関する。
本開示は、微生物発酵ブロスからバニリンを回収および精製する方法であって、発酵ブロスが、バニリン複合体を生成および分泌することのできる微生物細胞により微生物発酵中に生成されたバニリン複合体、例えばバニリングルコシドを含む、方法に関する。
【背景技術】
【0003】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
【課題を解決するための手段】
【0005】
【発明を実施するための形態】
【0006】
１）第１の実施形態において、本開示は、微生物発酵ブロスからバニリンを回収および精製する方法であって、発酵ブロスが、バニリン複合体を生成および分泌することのできる微生物細胞により微生物発酵中に生成されたバニリン複合体を含み、その方法が、
実質的に微生物細胞を含まない液体が残るように発酵ブロスから微生物細胞を分離および除去し、その後、液体に含まれるバニリン複合体をバニリンおよび対応する複合パートナーへと変換する工程（Ｉ）（ａ）、または
発酵ブロスに含まれるバニリン複合体をバニリンおよび対応する複合パートナーへと変換し、その後、実質的に微生物細胞を含まない液体が残るように発酵ブロスから微生物細胞を分離および除去する工程（Ｉ）（ｂ）、
その後、
工程（Ｉ）（ａ）もしくは（Ｉ）（ｂ）で得られた液体に水と混合できる極性有機溶媒を添加する工程（ＩＩ）（ａ）であって、工程（Ｉ）（ａ）で得られた液体が、好ましくは、極性有機溶媒の添加前もしくは添加後のいずれかにろ過される、工程（ＩＩ）（ａ）、
工程（ＩＩ）（ａ）で生成されたバニリン溶液を、
（ｉ）陽イオン交換吸着剤およびその後の弱塩基性陰イオン交換吸着剤、もしくは
（ｉｉ）弱塩基性陰イオン交換吸着剤およびその後の陽イオン交換吸着剤のいずれかで処理する工程（ＩＩ）（ｂ）、および
任意選択で、得られた溶液を吸着剤で脱色する工程（ＩＩ）（ｃ）、または
工程（Ｉ）（ａ）もしくは（Ｉ）（ｂ）で得られた液体を非イオン性吸着剤で処理する工程（ＩＩ’）（ａ）であって、工程（Ｉ）（ａ）で得られた液体が、好ましくは、非イオン性吸着剤による処理の前にまずろ過され、工程（ＩＩ’）（ａ）で用いられる非イオン性吸着剤が、バニリンを吸着することができ、処理が、バニリンを非イオン性吸着剤に結合させる条件下でのバニリンの吸着工程（ｉ）および結合したバニリンの溶液への脱着工程（ｉｉ）を含む、工程（ＩＩ’）（ａ）、
得られたバニリン溶液を、
（ｉ）陽イオン交換吸着剤、
（ｉｉ）弱塩基性陰イオン交換吸着剤、もしくは
（ｉｉｉ）いずれかの順序での陽イオン交換吸着剤および弱塩基性陰イオン交換吸着剤の両方のいずれかで処理する工程（ＩＩ’）（ｂ）、および
任意選択で、得られた溶液を吸着剤で脱色する工程（ＩＩ’）（ｃ）のいずれか、ならびに
得られた溶液からバニリンを結晶化する工程（ＩＩＩ）を含む、方法に関する。
実質的に微生物細胞を含まない液体が残るように発酵ブロスから微生物細胞を分離および除去し、その後、液体に含まれるバニリン複合体をバニリンおよび対応する複合パートナーへと変換する工程（Ｉ）（ａ）、または
発酵ブロスに含まれるバニリン複合体をバニリンおよび対応する複合パートナーへと変換し、その後、実質的に微生物細胞を含まない液体が残るように発酵ブロスから微生物細胞を分離および除去する工程（Ｉ）（ｂ）、
その後、
工程（Ｉ）（ａ）もしくは（Ｉ）（ｂ）で得られた液体に水と混合できる極性有機溶媒を添加する工程（ＩＩ）（ａ）であって、工程（Ｉ）（ａ）で得られた液体が、好ましくは、極性有機溶媒の添加前もしくは添加後のいずれかにろ過される、工程（ＩＩ）（ａ）、
工程（ＩＩ）（ａ）で生成されたバニリン溶液を、
（ｉ）陽イオン交換吸着剤およびその後の弱塩基性陰イオン交換吸着剤、もしくは
（ｉｉ）弱塩基性陰イオン交換吸着剤およびその後の陽イオン交換吸着剤のいずれかで処理する工程（ＩＩ）（ｂ）、および
任意選択で、得られた溶液を吸着剤で脱色する工程（ＩＩ）（ｃ）、または
工程（Ｉ）（ａ）もしくは（Ｉ）（ｂ）で得られた液体を非イオン性吸着剤で処理する工程（ＩＩ’）（ａ）であって、工程（Ｉ）（ａ）で得られた液体が、好ましくは、非イオン性吸着剤による処理の前にまずろ過され、工程（ＩＩ’）（ａ）で用いられる非イオン性吸着剤が、バニリンを吸着することができ、処理が、バニリンを非イオン性吸着剤に結合させる条件下でのバニリンの吸着工程（ｉ）および結合したバニリンの溶液への脱着工程（ｉｉ）を含む、工程（ＩＩ’）（ａ）、
得られたバニリン溶液を、
（ｉ）陽イオン交換吸着剤、
（ｉｉ）弱塩基性陰イオン交換吸着剤、もしくは
（ｉｉｉ）いずれかの順序での陽イオン交換吸着剤および弱塩基性陰イオン交換吸着剤の両方のいずれかで処理する工程（ＩＩ’）（ｂ）、および
任意選択で、得られた溶液を吸着剤で脱色する工程（ＩＩ’）（ｃ）のいずれか、ならびに
得られた溶液からバニリンを結晶化する工程（ＩＩＩ）を含む、方法に関する。
【0007】
本明細書で用いられる場合、「微生物細胞」により、好ましくはバクテリア、真菌、および特に酵母から選択される、原核細胞または真核細胞が意味される。
【0008】
用語「バニリン」は、化学名４－ヒドロキシ－３－メトキシベンズアルデヒドを有する化合物を言う。
【0009】
用語「バニリン複合体」は、更なる分子実体（本明細書中、「複合パートナー」と呼ばれる）に共有結合したバニリンを言い、複合パートナーは、そのような分子実体を含むバニリン複合体の形態での微生物細胞による生成および分泌に適切なあらゆる分子実体であることができ、複合パートナーは、バニリン複合体のバニリンおよび対応する複合パートナーへの変換によりバニリンから分離することができる。複合パートナーは、糖、例えば多糖、二糖、または単糖、好ましくは単糖、例えば極めて好ましくはＤ－グルコースを含むが、これらに限定されない。極めて好ましい実施形態において、用語「バニリン複合体」は、従って、「バニリングルコシド」を言う。
【0010】
用語「バニリングルコシド」は、化合物「バニリン ４－Ｏ－β－Ｄ－グルコシド」を言い、これは「バニリン β－Ｄ－グルコシド」とも呼ばれる。
【0011】
本発明による有用な微生物細胞は、発酵培地にバニリン複合体、例えば特にバニリングルコシドを生成および分泌することのできる原核細胞または真核細胞、例えば特にバニリン複合体、例えば特にバニリングルコシドを生成および分泌することができるように遺伝子操作された細胞であることができる。そのような遺伝子操作された微生物細胞は、例えば、ＷＯ２００４／１１１２５４、Ｈａｎｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５（９）：２７６５～２７７４（２００９）、ＷＯ２０１３／０２２８８１、ＷＯ２０１５／００９５５８、およびＷＯ２０２１／０２２２１６に記載されている。
【0012】
実質的に微生物細胞を含まない液体が残るような工程（Ｉ）（ａ）または（Ｉ）（ｂ）における発酵ブロスからの微生物細胞の分離および除去は、あらゆる適切な分離技術により行うことができる。一般的に、これは遠心分離およびその後のろ過によるか、または膜分離法により達成されるであろう。適切な膜分離技術は、精密ろ過、限外ろ過、ナノろ過、またはそれらの組み合わせのいずれかであり、一方で遠心分離後のろ過に適切な技術は、加圧ろ過および真空ろ過を含む。加圧ろ過が用いられる場合、これはあらゆる適切な装置、例えばキャンドルフィルターまたはフィルタープレスを用いて行うことができる。好ましくは、ろ過は、ろ過助剤の添加により行われる。ろ過助剤は、ろ過される懸濁液に添加されても（例えば０．１～５％ｗ／ｗ）、液体が通過する必要のあるプレコートとしてフィルターに置かれてもいずれでもよい。ろ過効率を改善する固体粒子からなるあらゆる物質を用いることができる。好ましくは、ろ過材料は、セルロース、パーライト、または珪藻土をベースとする。
膜分離法の場合、好ましくは、限外ろ過が用いられる。バイオマス分離は、１～１００ｋＤａ、好ましくは１～１０ｋＤａの範囲の名目上の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を用いた限外ろ過により行うことができる。これらの様々な膜を通って用いられる流動速度および／または収率は、同様であることができる。しかしながら、より多くの不純物を取り除くことから、より小さい分子量カットオフが好ましいことがある。他方で、より細かい限外ろ過装置は、より頻繁に清掃を必要とし、プロセスの停止を必要とするため、清掃のための頻繁な停止によりプロセスの経済的意味を損なうことなく、許容できる純度を得るために、最適な分子量カットオフの選択においてバランスが取られる。好ましくは、複合フッ素ポリマー膜、例えばＡｌｆａ ＬａｖａｌのＥＴＮＡ０１ＰＰ（１ｋＤａ ＭＷＣＯ）またはＥＴＮＡ１０ＰＰ（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）が用いられる。透析ろ過は、濃縮ブロス（保持液）の体積に対して１～２以上、好ましくは１．６倍の脱塩水の体積で行うことができる。
膜分離法の場合、好ましくは、限外ろ過が用いられる。バイオマス分離は、１～１００ｋＤａ、好ましくは１～１０ｋＤａの範囲の名目上の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を用いた限外ろ過により行うことができる。これらの様々な膜を通って用いられる流動速度および／または収率は、同様であることができる。しかしながら、より多くの不純物を取り除くことから、より小さい分子量カットオフが好ましいことがある。他方で、より細かい限外ろ過装置は、より頻繁に清掃を必要とし、プロセスの停止を必要とするため、清掃のための頻繁な停止によりプロセスの経済的意味を損なうことなく、許容できる純度を得るために、最適な分子量カットオフの選択においてバランスが取られる。好ましくは、複合フッ素ポリマー膜、例えばＡｌｆａ ＬａｖａｌのＥＴＮＡ０１ＰＰ（１ｋＤａ ＭＷＣＯ）またはＥＴＮＡ１０ＰＰ（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）が用いられる。透析ろ過は、濃縮ブロス（保持液）の体積に対して１～２以上、好ましくは１．６倍の脱塩水の体積で行うことができる。
【0013】
工程（Ｉ）（ａ）または（Ｉ）（ｂ）におけるバニリン複合体のバニリンおよび対応する複合パートナーへの変換は、化学的変換（例えば加水分解）または酵素的変換のいずれか、好ましくは適切な酵素を適切な条件下で用いた酵素的変換により行うことができる。そのような酵素、例えば、バニリングルコシドのバニリンおよびグルコースへの変換を触媒することのできるβ－グルコシダーゼが当該分野で知られている。好ましい実施形態において、バニリングルコシドのバニリンおよびグルコースへの変換は、約３．０～６．５、好ましくは４．５～５．５のｐＨ、および約３０～６０℃、好ましくは５０～５５℃の温度で、好ましくは２０～４８時間、バニリングルコシド１ｇ当たり約１０酵素単位（ｕ）／ｇの活性を有する０．００２～０．１ｇのβ－グルコシダーゼ（バニリングルコシドに対して約２０～１’０００ｕ／ｋｇに対応する）、好ましくは０．０３～０．０７ｇ／ｇ（バニリングルコシドに対して約３００～７００ｕ／ｋｇに対応する）を用いて行われる。
【0014】
任意選択で、工程（Ｉ）（ａ）におけるバニリン複合体のバニリンおよび対応する複合パートナーへの変換前に、液体が濃縮される。液体は、２以上の体積濃縮係数（ＶＣＦ）で濃縮することができる。好ましくは、濃縮は、逆浸透またはワイパー式薄膜蒸発器により行われる。
濃縮は、約１０～５０℃の温度での逆浸透、または約５０～８０℃、好ましくは約６０～６５℃での蒸発により行うことができる。２５℃、１６ｂａｒｇで２０００ｐｐｍのＮａＣｌについて測定した９８％以上の排除を有する、ポリプロピレン上の薄膜複合ポリマーからなる薄膜複合膜を用いることができる（例えばＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ）。別法として、２５℃、９ｂａｒｇで２０００ｐｐｍのＮａＣｌについて測定した９８％以上の排除を有する、ポリエステル上の薄膜複合ポリマーからなるＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜を用いることができる（例えばＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９）。
濃縮は、約１０～５０℃の温度での逆浸透、または約５０～８０℃、好ましくは約６０～６５℃での蒸発により行うことができる。２５℃、１６ｂａｒｇで２０００ｐｐｍのＮａＣｌについて測定した９８％以上の排除を有する、ポリプロピレン上の薄膜複合ポリマーからなる薄膜複合膜を用いることができる（例えばＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ）。別法として、２５℃、９ｂａｒｇで２０００ｐｐｍのＮａＣｌについて測定した９８％以上の排除を有する、ポリエステル上の薄膜複合ポリマーからなるＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜を用いることができる（例えばＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９）。
【0015】
工程（ＩＩ）（ａ）で用いられる適切な極性有機溶媒は、水と混合でき、バニリンの溶解度を高め、工程（ＩＩ）（ｂ）で用いられるイオン交換吸着剤と共に用いられるのに相性の良い、有機溶媒、または異なる有機溶媒の混合物である。好ましい実施形態において、極性有機溶媒は、好ましくは直鎖型もしくは分岐型の１～６個の炭素原子を含む、アルコール、または異なるアルコールの混合物、例えば不飽和もしくは特に飽和の第１級アルコール、例えばエタノールおよびプロパノール、例えば２－プロパノールである。特に好ましい実施形態において、極性有機溶媒はエタノールまたは２－プロパノールであり、最も好ましくはエタノールである。工程（Ｉ）（ａ）または（Ｉ）（ｂ）からの液体に添加される極性有機溶媒の量は、好ましくは、得られる溶液の全体積に対して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％ｖ／ｖの極性有機溶媒となるようなものである。極めて好ましくは、極性有機溶媒は、得られる溶液の約２０～５０％ｖ／ｖ、特に約２０～４０％ｖ／ｖ、最も好ましくは約２０％ｖ／ｖを構成する。
【0016】
温度に関して用いられるのでない限り、数値「Ｘ」の前に置かれる用語「約」は、好ましくは、本出願において、ＸマイナスＸの１０％からＸプラスＸの１０％に広がる区間を言う。温度についての特別な場合には、温度「Ｙ」の前に置かれる用語「約」は、好ましくは、本出願において、温度Ｙマイナス５℃からＹプラス５℃に広がる区間を言う。
【0017】
工程（ＩＩ）（ａ）または（ＩＩ’）（ａ）によるろ過は、あらゆる適切なろ過技術、例えば加圧ろ過または真空ろ過により行うことができる。好ましくは、ろ過は、ろ過助剤の添加により行われる。ろ過助剤は、ろ過される懸濁液に添加されても（例えば０．１～１％ｗ／ｗ）、液体が通過する必要のあるプレコートとしてフィルターに置かれてもいずれでもよい。ろ過効率を改善する固体粒子からなるあらゆる物質を用いることができる。好ましくは、ろ過材料は、セルロース、パーライト、または珪藻土をベースとする。
【0018】
あらゆる適切な陽イオン交換吸着剤を工程（ＩＩ）（ｂ）または（ＩＩ’）（ｂ）において用いることができる。それは弱酸または強酸の陽イオン交換吸着剤であることができる。好ましくは、用いられる吸着剤は樹脂である。陽イオン交換吸着剤は、好ましくは、強酸性陽イオン交換吸着剤、例えば特に強酸性陽イオン交換樹脂であり、好ましくはＨ型である。好ましくはマクロ多孔性樹脂が用いられる。例えば、マクロ多孔性のポリスチレン系樹脂およびポリスチレン系ゲル樹脂、例えばジビニルベンゼンで架橋された官能基としてスルホン酸を有するマクロ多孔性ポリスチレン樹脂を用いることができる。
【0019】
あらゆる適切な弱塩基性陰イオン交換吸着剤を工程（ＩＩ）（ｂ）または（ＩＩ’）（ｂ）において用いることができる。好ましくは、弱塩基性陰イオン交換吸着剤は、弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えば特に弱塩基性陰イオン交換マクロ多孔性樹脂である、特に、ポリスチレンまたはポリアクリル酸エステルフレームのいずれか、および官能基として第１級～第３級アミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換マクロ多孔性樹脂を用いることができる。マクロ多孔性のポリスチレン系樹脂が好ましいが、ポリスチレン系ゲル樹脂もまた用いることができる。例えば、官能基として第３級アミンを有するジビニルベンゼンで架橋されたポリアクリルを有するゲル型樹脂が適切である。極めて好ましい実施形態において、弱塩基性陰イオン交換吸着剤、例えば特に弱塩基性陰イオン交換樹脂は、使用前にＡｃ型（アセテート型）に変換される。そうするために、５％の酢酸の溶液で処理し、脱塩水で洗浄し、供給溶媒で予め調整することができる。
【0020】
あらゆる適切な非イオン性（中性）吸着剤を工程（ＩＩ’）（ａ）において用いることができる。好ましくは、非イオン性吸着剤は、非イオン性樹脂、特にマクロ多孔性非イオン性樹脂、特に疎水性樹脂である。ポリスチレン系、ポリフェノール系、またはポリメタクリル系非イオン性樹脂を用いることができる。例えば、官能基を有さないマクロ多孔性ポリジビニルベンゼン樹脂が適切である。
【0021】
工程（ＩＩ’）（ａ）（ｉ）におけるバニリンを非イオン性吸着剤に結合させる条件下でのバニリンの吸着は、好ましくは４ＢＶ／ｈ以下の流量で、非イオン性吸着剤を含むカラムに溶液をポンプで送ることにより行うことができる。
【0022】
工程（ＩＩ’）（ａ）（ｉｉ）における結合したバニリンの溶液への脱着は、好ましくは４ＢＶ／ｈ以下の流量で、非イオン性吸着剤を含むカラムに例えば２～４ＢＶ、好ましくは３ＢＶの溶離液をポンプで送ることにより行うことができる。そのような溶離液が水単独と比べてバニリンの溶解度を高め、工程（ＩＩ’）（ａ）で用いられる非イオン性吸着剤と共に用いられるのに相性が良いのであれば、脱着に適切な溶離液は、有機溶媒、異なる有機溶媒の混合物、水と有機溶媒の混合物、または水と異なる有機溶媒の混合物である。好ましい実施形態において、有機溶媒は、好ましくは直鎖型もしくは分岐型の１～６個の炭素原子を含む、アルコール、または異なるアルコールの混合物、例えば不飽和もしくは特に飽和の第１級アルコール、例えばエタノールおよびプロパノール、例えば２－プロパノールである。特に好ましい実施形態において、有機溶媒はエタノールまたは２－プロパノールであり、最も好ましくはエタノールである。有機溶媒の量は、好ましくは、溶離液の全体積に対して少なくとも約４０％、５０％、６０％、または７０％ｖ／ｖである。極めて好ましくは、有機溶媒は、溶離液の全体積の約５０～９０％ｖ／ｖ、特に約７０～８０％ｖ／ｖ、最も好ましくは約８０％ｖ／ｖを構成する。極めて好ましい実施形態において、溶離液は、５０～９０％ｖ／ｖ、特に約７０～８０％ｖ／ｖ、最も好ましくは約８０％ｖ／ｖのエタノールの濃度を有する水性エタノールである。
【0023】
溶液を脱色するための任意の工程（ＩＩ）（ｃ）または（ＩＩ’）（ｃ）で用いられる吸着剤は、炭素、特に活性炭、好ましくは粒状活性炭であることができる。溶液は、例えば、４ＢＶ／ｈ以下の流量および約１５～２５℃の温度で炭素カラムにポンプで送ることができる。炭素必要量は、バニリンのｋｇ当たり、好ましくは約０．０５～２ｋｇ、より好ましくは約０．３～１ｋｇ、最も好ましくは約０．５ｋｇの炭素である。
【0024】
工程（ＩＩＩ）の結晶化を行う前に、バニリン溶液は、ろ過によりポリッシュして、吸着剤のあらゆる痕跡を除去することができる。そのようなろ過は、好ましくは１μｍ以下の細孔径を有する適切なフィルターを用いて行うことができる。
【0025】
工程（ＩＩＩ）の結晶化は、例えば、減圧下、例えば０．１～０．４ｂａｒｇおよび約５０～５５℃の温度での蒸発により、例えば、約１０～６０％、好ましくは約２５～３５％の全乾燥物質となるまでのバニリン溶液の濃縮により行うことができる。バニリンの結晶化は、好ましくは、約３．５～５．５、好ましくは約４～５．５のｐＨで行われる。
蒸発の終わりに、バニリン溶液は、結晶化を開始するために例えば約２５～３５℃まで冷却することができる。結晶化が生じない場合、純粋なバニリンによるシーディングを行うことができる。蒸発による濃縮後にバニリン溶液に約７％ｖ／ｖ以下の有機溶媒が存在する場合、これは通常、例えば約２５～３５℃への濃縮溶液の冷却後に自発的な結晶化をもたらすものであり、シーディングを回避することができる。
蒸発の終わりに、バニリン溶液は、結晶化を開始するために例えば約２５～３５℃まで冷却することができる。結晶化が生じない場合、純粋なバニリンによるシーディングを行うことができる。蒸発による濃縮後にバニリン溶液に約７％ｖ／ｖ以下の有機溶媒が存在する場合、これは通常、例えば約２５～３５℃への濃縮溶液の冷却後に自発的な結晶化をもたらすものであり、シーディングを回避することができる。
【0026】
本開示は、以下の更なる実施形態を提供する。
【0027】
２）１つの実施形態において、本開示は、バニリン複合体がバニリングルコシドである、実施形態１）に記載の方法に関する。
【0028】
３）別の実施形態において、本開示は、微生物細胞が真菌細胞である、実施形態１）または２）に記載の方法に関する。
【0029】
４）別の実施形態において、本開示は、真菌細胞が酵母細胞である、実施形態３）に記載の方法に関する。
【0030】
５）別の実施形態において、本開示は、酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択される、実施形態４）に記載の方法に関する。
【0031】
６）別の実施形態において、本開示は、実質的に微生物細胞を含まない液体が残るような工程（Ｉ）（ａ）または（Ｉ）（ｂ）における発酵ブロスからの微生物細胞の分離および除去が、遠心分離およびその後のろ過によるか、または膜分離法により行われる、実施形態１）～５）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0032】
７）別の実施形態において、本開示は、微生物細胞の分離および除去が、遠心分離およびその後のろ過により行われる、実施形態６）に記載の方法に関する。
【0033】
８）別の実施形態において、本開示は、微生物細胞の分離および除去が限外ろ過により行われる、実施形態６）に記載の方法に関する。
【0034】
９）別の実施形態において、本開示は、工程（Ｉ）（ａ）または（Ｉ）（ｂ）におけるバニリン複合体のバニリンおよび対応する複合パートナーへの変換が、化学的変換（例えば加水分解）または酵素的変換のいずれかにより行われる、実施形態１）～８）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0035】
１０）別の実施形態において、本開示は、バニリン複合体のバニリンおよび対応する複合パートナーへの変換が酵素的変換により行われる、実施形態９）に記載の方法に関する。
【0036】
１１）別の実施形態において、本開示は、バニリン複合体がバニリングルコシドであり、酵素的変換が、酵素としてβ－グルコシダーゼを用いることにより行われる、実施形態１０）に記載の方法に関する。
【0037】
１２）別の実施形態において、本開示は、方法が工程（Ｉ）（ａ）を含む、実施形態１）～１１）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0038】
１３）別の実施形態において、本開示は、工程（Ｉ）（ａ）におけるバニリングルコシド複合体のバニリンおよび対応する複合パートナーへの変換前に、液体が、好ましくは２以上の体積濃縮係数で濃縮される、実施形態１）～１２）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0039】
１４）別の実施形態において、本開示は、工程（Ｉ）（ａ）で得られた液体が、工程（ＩＩ）（ａ）において極性有機溶媒の添加前または添加後のいずれかにろ過される、実施形態１）～１３）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0040】
１５）別の実施形態において、本開示は、工程（Ｉ）（ａ）で得られた液体が、工程（ＩＩ’）（ａ）において非イオン性吸着剤による処理の前にまずろ過される、実施形態１）～１３）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0041】
１６）別の実施形態において、本開示は、方法が工程（Ｉ）（ｂ）を含む、実施形態１）～１１）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0042】
１７）別の実施形態において、本開示は、方法が、工程（ＩＩ）（ａ）および（ＩＩ）（ｂ）、ならびに任意選択で工程（ＩＩ）（ｃ）を含む、実施形態１）～１４）および１６）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0043】
１８）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ）（ａ）で用いられる極性有機溶媒が、好ましくは直鎖型もしくは分岐型の１～６個の炭素原子を含む、アルコール、または異なるアルコールの混合物である、実施形態１）～１４）および１６）～１７）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0044】
１９）別の実施形態において、本開示は、アルコールが、エタノールまたはプロパノール（特に２－プロパノール）、好ましくはエタノールである、実施形態１８）に記載の方法に関する。
【0045】
２０）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ）（ｂ）で用いられる陽イオン交換吸着剤が、強酸性陽イオン交換吸着剤、特に強酸性陽イオン交換樹脂、好ましくはＨ型および好ましくはマクロ多孔性樹脂である、実施形態１）～１４）および１６）～１９）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0046】
２１）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ）（ｂ）で用いられる弱塩基性陰イオン交換吸着剤が、弱塩基性陰イオン交換樹脂、特に弱塩基性陰イオン交換マクロ多孔性樹脂である、実施形態１）～１４）および１６）～２０）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0047】
２２）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ）（ｂ）で用いられる弱塩基性陰イオン交換吸着剤が、使用前にアセテート型に変換される、実施形態１）～１４）および１６）～２１）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0048】
２３）別の実施形態において、本開示は、方法が工程（ＩＩ）（ｂ）（ｉ）を含む、実施形態１）～１４）および１６）～２２）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0049】
２４）別の実施形態において、本開示は、方法が工程（ＩＩ）（ｂ）（ｉｉ）を含む、実施形態１）～１４）および１６）～２２）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0050】
２５）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ）（ｃ）が方法の一部である、実施形態１）～１４）および１６）～２４）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0051】
２６）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ）（ｃ）で用いられる吸着剤が、炭素、特に活性炭、好ましくは粒状活性炭である、実施形態２５）に記載の方法に関する。
【0052】
２７）別の実施形態において、本開示は、方法が、工程（ＩＩ’）（ａ）および（ＩＩ’）（ｂ）、ならびに任意選択で工程（ＩＩ’）（ｃ）を含む、実施形態１）～１３）および１５）～１６）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0053】
２８）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ’）（ａ）で用いられる非イオン性吸着剤が、非イオン性樹脂、特にマクロ多孔性非イオン性樹脂、好ましくは疎水性樹脂である、実施形態２７）に記載の方法に関する。
【0054】
２９）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ’）（ａ）（ｉｉ）における結合したバニリンの溶液への脱着が、溶離液として有機溶媒、異なる有機溶媒の混合物、水と有機溶媒の混合物、または水と異なる有機溶媒の混合物を用いて行われる、実施形態２７）または２８）に記載の方法に関する。
【0055】
３０）別の実施形態において、本開示は、溶離液が、好ましくは直鎖型もしくは分岐型の１～６個の炭素原子を含む、アルコール、または異なるアルコールの混合物である、実施形態２９）に記載の方法に関する。
【0056】
３１）別の実施形態において、本開示は、アルコールが、エタノールまたはプロパノール（特に２－プロパノール）、好ましくはエタノールである、実施形態３０）に記載の方法に関する。
【0057】
３２）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ’）（ｂ）で用いられる陽イオン交換吸着剤が、強酸性陽イオン交換吸着剤、特に強酸性陽イオン交換樹脂、好ましくはＨ型および好ましくはマクロ多孔性樹脂である、実施形態２７）～３１）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0058】
３３）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ’）（ｂ）で用いられる弱塩基性陰イオン交換吸着剤が、弱塩基性陰イオン交換樹脂、特に弱塩基性陰イオン交換マクロ多孔性樹脂である、実施形態２７）～３２）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0059】
３４）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ’）（ｂ）で用いられる弱塩基性陰イオン交換吸着剤が、使用前にアセテート型に変換される、実施形態２７）～３３）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0060】
３５）別の実施形態において、本開示は、方法が工程（ＩＩ’）（ｂ）（ｉ）を含む、実施形態２７）～３２）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0061】
３６）別の実施形態において、本開示は、方法が工程（ＩＩ’）（ｂ）（ｉｉ）を含む、実施形態２７）～３１）および３３）～３４）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0062】
３７）別の実施形態において、本開示は、方法が工程（ＩＩ’）（ｂ）（ｉｉｉ）を含む、実施形態２７）～３４）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0063】
３８）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ’）（ｂ）（ｉｉｉ）において、バニリン溶液が、陽イオン交換吸着剤により処理され、その後、弱塩基性陰イオン交換吸着剤により処理される、実施形態３７）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0064】
３９）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ’）（ｃ）が方法の一部である、実施形態２７）～３８）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0065】
４０）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩ’）（ｃ）で用いられる吸着剤が、炭素、特に活性炭、好ましくは粒状活性炭である、実施形態３９）に記載の方法に関する。
【0066】
４１）別の実施形態において、本開示は、方法が、強塩基性陰イオン交換吸着剤による精製工程を含まない、実施形態１）～４０）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0067】
４２）別の実施形態において、本開示は、方法が７未満、好ましくは６未満のｐＨで起こる、実施形態１）～４１）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0068】
４３）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩＩ）の結晶化を行う前に、バニリン溶液がろ過によりポリッシュされて、吸着剤のあらゆる痕跡を除去する、実施形態１）～４２）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0069】
４４）別の実施形態において、本開示は、工程（ＩＩＩ）の結晶化が、得られたバニリン溶液の濃縮を含む、実施形態１）～４３）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【0070】
４５）別の実施形態において、本開示は、バニリンの結晶化が、約３．５～５．５、好ましくは約４～５．５のｐＨで行われる、実施形態１）～４４）のいずれか１つに記載の方法に関する。
【実施例】
【0071】
本明細書で用いられる略号
ＢＶ ベッドボリューム（複数可）
ＤＳＰ 下流プロセス
ＧＣ ガスクロマトグラフィー
ｈ 時間（複数可）
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＵＦ 限外ろ過
ＶＡＮ バニリン
ｖ／ｖ 体積／体積
ｗ／ｗ 重量／重量
ＢＶ ベッドボリューム（複数可）
ＤＳＰ 下流プロセス
ＧＣ ガスクロマトグラフィー
ｈ 時間（複数可）
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＵＦ 限外ろ過
ＶＡＮ バニリン
ｖ／ｖ 体積／体積
ｗ／ｗ 重量／重量
【0072】
実施例１
下流プロセスＡ
Ａ型の完全な下流プロセスを分析するために、バニリングルコシドを生成および分泌することのできるバニリングルコシド生成酵母株により製造された発酵ブロスを用いた。本実施例および以下の実施例で用いられるバニリングルコシド生成酵母株は、バニリングルコシドの生成および分泌を可能にする例えばＨａｎｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５（９）：２７６５～２７７４（２００９）に記載された新たな合成経路を含むように設計された、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株である。本実施例および以下の実施例で用いられる発酵ブロスは、１０ｇ／Ｌを超える濃度でバニリングルコシドを含んでいた。
発酵ブロスを遠心分離し、得られた上澄みをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過した。得られた４１６０ｍＬのろ過溶液は、バニリングルコシドを含み、ｐＨ４．８６を有していた。バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．４６ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を溶液に添加し、溶液を５０℃で４８時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過し、エタノールで希釈して水中２０％ｖ／ｖのエタノールとした。実験室スケールのカラム２本：３００ｍＬの強酸性陽イオン交換Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ樹脂（Ｈ２ＳＯ４ ５％で再生および活性化）で充填した実験室スケールのカラム、およびその後の３００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓ樹脂（酢酸５％で処理）で充填した実験室スケールのカラムを順次接続した。次いで、ｐＨ５．０４および７．２８μＳ／ｃｍの伝導率を有する水性エタノール２０％ｖ／ｖ溶液中のバニリン３０９０ｍＬを、強酸性陽イオン交換樹脂から始まる２本のカラムを通して、４．８ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール２０％ｖ／ｖで洗浄した。以下の画分を収集および分析した。
下流プロセスＡ
Ａ型の完全な下流プロセスを分析するために、バニリングルコシドを生成および分泌することのできるバニリングルコシド生成酵母株により製造された発酵ブロスを用いた。本実施例および以下の実施例で用いられるバニリングルコシド生成酵母株は、バニリングルコシドの生成および分泌を可能にする例えばＨａｎｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５（９）：２７６５～２７７４（２００９）に記載された新たな合成経路を含むように設計された、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株である。本実施例および以下の実施例で用いられる発酵ブロスは、１０ｇ／Ｌを超える濃度でバニリングルコシドを含んでいた。
発酵ブロスを遠心分離し、得られた上澄みをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過した。得られた４１６０ｍＬのろ過溶液は、バニリングルコシドを含み、ｐＨ４．８６を有していた。バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．４６ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を溶液に添加し、溶液を５０℃で４８時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過し、エタノールで希釈して水中２０％ｖ／ｖのエタノールとした。実験室スケールのカラム２本：３００ｍＬの強酸性陽イオン交換Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ樹脂（Ｈ２ＳＯ４ ５％で再生および活性化）で充填した実験室スケールのカラム、およびその後の３００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓ樹脂（酢酸５％で処理）で充填した実験室スケールのカラムを順次接続した。次いで、ｐＨ５．０４および７．２８μＳ／ｃｍの伝導率を有する水性エタノール２０％ｖ／ｖ溶液中のバニリン３０９０ｍＬを、強酸性陽イオン交換樹脂から始まる２本のカラムを通して、４．８ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール２０％ｖ／ｖで洗浄した。以下の画分を収集および分析した。
【0073】
【表1】
【0074】
バニリンのｇ当たり１．７５ｇの化学的粒状活性炭Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥを、前の工程で得られた混ぜ合わせた主要３画分に添加した。褐色溶液を室温で３時間撹拌し、次いで、ろ過し、炭素処理後に黄色溶液を得た。炭素を撹拌下、室温で１時間、６００ｍＬのエタノールで洗浄した。それぞれの溶液の試料をろ過および分析した。炭素処理のバニリン収率は８１．８９％であった。
活性炭により処理された溶液および洗浄画分を混ぜ合わせ、０．４５μｍのＮｙｌｏｎフィルターでろ過し、その後、７５０ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮した。濃縮物を室温まで冷却し、結晶化が生じた。室温で一晩スラリーを撹拌後、形成した固体を真空ろ過により分離し、３００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。ＧＣによる９７．４９％ｗ／ｗの純度およびＨＰＬＣによる９７．４５％ｗ／ｗの純度を有するオフホワイト色から黄色のバニリンを得た。
活性炭により処理された溶液および洗浄画分を混ぜ合わせ、０．４５μｍのＮｙｌｏｎフィルターでろ過し、その後、７５０ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮した。濃縮物を室温まで冷却し、結晶化が生じた。室温で一晩スラリーを撹拌後、形成した固体を真空ろ過により分離し、３００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。ＧＣによる９７．４９％ｗ／ｗの純度およびＨＰＬＣによる９７．４５％ｗ／ｗの純度を有するオフホワイト色から黄色のバニリンを得た。
【0075】
実施例２
活性炭処理を含まない、下流プロセスＡ、異なるｐＨ値での結晶化
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．７５の３４６５ｍＬの発酵ブロスを以下の実験に用いた。発酵ブロスを遠心分離し、得られた上澄みをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１によりろ過した。ｐＨ４．８３を有する２Ｌの得られた溶液をバニリングルコシドの酵素的加水分解に用いた。バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２６ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を溶液に添加し、溶液を５０℃で４８時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過し、エタノールで希釈して水中５０％ｖ／ｖのエタノールとした。実験室スケールのカラム２本：２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０ ＷＸ４ ２００～４００メッシュ（Ｈ２ＳＯ４で再生および活性化）で満たした実験室スケールのカラム、およびその後の２００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ ５３（酢酸５％で処理）で満たした実験室スケールのカラムを順次接続した。次いで、前の工程で得られた３．１５Ｌのバニリン溶液を、強酸性陽イオン交換樹脂から始まる２本のカラムを通して、４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール５０％ｖ／ｖで洗浄した。以下の３画分を収集および分析した。
活性炭処理を含まない、下流プロセスＡ、異なるｐＨ値での結晶化
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．７５の３４６５ｍＬの発酵ブロスを以下の実験に用いた。発酵ブロスを遠心分離し、得られた上澄みをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１によりろ過した。ｐＨ４．８３を有する２Ｌの得られた溶液をバニリングルコシドの酵素的加水分解に用いた。バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２６ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を溶液に添加し、溶液を５０℃で４８時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過し、エタノールで希釈して水中５０％ｖ／ｖのエタノールとした。実験室スケールのカラム２本：２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０ ＷＸ４ ２００～４００メッシュ（Ｈ２ＳＯ４で再生および活性化）で満たした実験室スケールのカラム、およびその後の２００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ ５３（酢酸５％で処理）で満たした実験室スケールのカラムを順次接続した。次いで、前の工程で得られた３．１５Ｌのバニリン溶液を、強酸性陽イオン交換樹脂から始まる２本のカラムを通して、４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール５０％ｖ／ｖで洗浄した。以下の３画分を収集および分析した。
【0076】
【表2】
【0077】
異なるｐＨ値でのバニリンの結晶化を分析するために、ｐＨ３．８３の第１の画分を用いた。
ａ）「画分１」の５００ｍＬのｐＨを、ＮａＯＨ３０％でｐＨ３．８３から５．０６に調整した。ｐＨ調整中、溶液の色は変化しなかった。次いで、溶液を５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、その中に黒色油のスポットを観察した。室温への冷却後、黒色のスポットが完全に溶解するまで、純粋エタノールを添加した。次いで、３０．３４ｍｇの９８％以上の純度のバニリン粉末によりシーディングを行い、溶液を２４時間、４℃に維持した。その後、形成した固体を真空ろ過により母液から分離し、１０ｍＬの予め冷却した水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。結晶化、ろ過、湿った固体の洗浄、および乾燥のバニリン収率は８８．４７％であった。ＨＰＬＣによる９８．６２％ｗ／ｗの純度を有する褐色結晶性バニリンを得た。
ａ）「画分１」の５００ｍＬのｐＨを、ＮａＯＨ３０％でｐＨ３．８３から５．０６に調整した。ｐＨ調整中、溶液の色は変化しなかった。次いで、溶液を５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、その中に黒色油のスポットを観察した。室温への冷却後、黒色のスポットが完全に溶解するまで、純粋エタノールを添加した。次いで、３０．３４ｍｇの９８％以上の純度のバニリン粉末によりシーディングを行い、溶液を２４時間、４℃に維持した。その後、形成した固体を真空ろ過により母液から分離し、１０ｍＬの予め冷却した水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。結晶化、ろ過、湿った固体の洗浄、および乾燥のバニリン収率は８８．４７％であった。ＨＰＬＣによる９８．６２％ｗ／ｗの純度を有する褐色結晶性バニリンを得た。
【0078】
ｂ）「画分１」の５００ｍＬのｐＨを、ＮａＯＨ３０％でｐＨ３．８３から７．２０に調整した。ｐＨ調整中、溶液の色は黄色からオレンジ色に変化した。溶液を５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、その中に黒色油のスポットを観察した。室温への冷却後、黒色のスポットが完全に溶解するまで、純粋エタノールを添加した。次いで、３４．０２ｍｇの９８％以上の純度のバニリンによりシーディングを行い、溶液を３日間、４℃に維持した。形成した固体を真空ろ過により母液から分離し、１０ｍＬの予め冷却した水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。結晶化、ろ過、湿った固体の洗浄、および乾燥のバニリン収率は７３．１５％であった。ＨＰＬＣによる９９．１４％ｗ／ｗの純度を有する暗黄色バニリンを得た。
【0079】
ｃ）「画分１」の５００ｍＬのｐＨを、ＮａＯＨ３０％でｐＨ３．８３から８．５７に調整した。ｐＨ調整中、溶液の色は暗赤色になり、その後、暗褐色に変化した。溶液を５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、室温への冷却後、一晩４℃に維持した。形成した固体を真空ろ過により母液から分離し、１０ｍＬの予め冷却した水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。結晶化、ろ過、湿った固体の洗浄、および乾燥のバニリン収率は５７．６０％であった。ＨＰＬＣによる９７．３９％ｗ／ｗの純度を有する暗褐色バニリンを得た。
【0080】
実施例３
溶媒として２－プロパノールを用いることによる、下流プロセスＡ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．９６の１７．７Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。発酵ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により４．９０Ｌまで濃縮した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を４９００ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液（ｐＨ５．２３）に添加し、溶液を５０℃で１２０時間撹拌した。
形成したスラリーをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１の存在下でろ過し、２－プロパノールで希釈して４０％ ２－プロパノールｖ／ｖの最終濃度とした。得られた溶液はｐＨ５．８０を有していた。実験室スケールのカラム２本：３００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化および再生）で充填した実験室スケールのカラム、およびその後の３００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓ（酢酸５％で処理）で充填した実験室スケールのカラムを順次接続した。次いで、水性２－プロパノール４０％ｖ／ｖ溶液中のバニリン９００ｍＬを、強酸性陽イオン交換樹脂から始まる２本のカラムを通して、４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。
その後、樹脂を水性２－プロパノール４０％ｖ／ｖで洗浄した。４画分を収集および分析した。
溶媒として２－プロパノールを用いることによる、下流プロセスＡ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．９６の１７．７Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。発酵ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により４．９０Ｌまで濃縮した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を４９００ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液（ｐＨ５．２３）に添加し、溶液を５０℃で１２０時間撹拌した。
形成したスラリーをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１の存在下でろ過し、２－プロパノールで希釈して４０％ ２－プロパノールｖ／ｖの最終濃度とした。得られた溶液はｐＨ５．８０を有していた。実験室スケールのカラム２本：３００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化および再生）で充填した実験室スケールのカラム、およびその後の３００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓ（酢酸５％で処理）で充填した実験室スケールのカラムを順次接続した。次いで、水性２－プロパノール４０％ｖ／ｖ溶液中のバニリン９００ｍＬを、強酸性陽イオン交換樹脂から始まる２本のカラムを通して、４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。
その後、樹脂を水性２－プロパノール４０％ｖ／ｖで洗浄した。４画分を収集および分析した。
【0081】
【表3】
【0082】
前の工程で得られた主要３画分および洗浄画分を混ぜ合わせた。化学的粒状活性炭Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥ（０．５９ｋｇ ＢＧＥ／１ｋｇ ＶＡＮ）を得られた溶液に添加し、バッチ中、室温で３時間撹拌した。溶液の重大な色の悪化は観察されなかった。次いで、炭素をろ過し、室温で１時間、撹拌下で１３３ｍＬの水中４０％ｖ／ｖ２－プロパノールによりバッチ中で洗浄した。炭素処理後の主要溶液を炭素洗浄画分と混ぜ合わせ、０．４５μｍのＮｙｌｏｎフィルターでろ過し、９０ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮した。濃縮物を連続的に撹拌しながら室温まで冷却し、次いで、一晩４℃に維持した。４０．９９ｍｇの９９％の純度のバニリンを添加することによりシーディングを行い、すぐに結晶化が生じた。形成した固体を真空ろ過により母液から分離し、４０ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。ＨＰＬＣによる９２．７５％ｗ／ｗの純度およびＧＣによる９６．１８％ｗ／ｗの純度を有する黄色バニリンを得た。
【0083】
実施例４
活性炭処理を含まない、下流プロセスＡ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．７５の３４６５ｍＬの発酵ブロスを以下の実験に用いた。発酵ブロスを遠心分離し、得られた上澄みをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１によりろ過した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２６ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を２Ｌのろ過した上澄み（ｐＨ４．８３）に添加し、溶液を５０℃で４８時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過し、エタノールで希釈して水中５０％ｖ／ｖのエタノールとした。
実験室スケールのカラムを２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０ ＷＸ４ ２００～４００メッシュ（Ｈ２ＳＯ４で活性化）で充填し、２００ｍＬのエタノールによるろ過溶液を、１．５ＢＶ／ｈの流量にて上昇流方向にそのカラムを通してポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール５０％ｖ／ｖで洗浄し、異なる３画分を収集し、分析した。
活性炭処理を含まない、下流プロセスＡ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．７５の３４６５ｍＬの発酵ブロスを以下の実験に用いた。発酵ブロスを遠心分離し、得られた上澄みをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１によりろ過した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２６ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を２Ｌのろ過した上澄み（ｐＨ４．８３）に添加し、溶液を５０℃で４８時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過し、エタノールで希釈して水中５０％ｖ／ｖのエタノールとした。
実験室スケールのカラムを２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０ ＷＸ４ ２００～４００メッシュ（Ｈ２ＳＯ４で活性化）で充填し、２００ｍＬのエタノールによるろ過溶液を、１．５ＢＶ／ｈの流量にて上昇流方向にそのカラムを通してポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール５０％ｖ／ｖで洗浄し、異なる３画分を収集し、分析した。
【0084】
【表4】
【0085】
実験室スケールのカラムを２００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ ５３（５％酢酸で処理）で充填し、前の工程で得られた３画分を、主要画分から開始して別々に、７．２ＢＶ／ｈの流量にて上昇流方向に樹脂カラムを通してポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール５０％ｖ／ｖで洗浄し、異なる４画分を収集および分析した。
【0086】
【表5】
【0087】
前の工程で得られた全画分を混ぜ合わせることにより得られた溶液を０．２２μｍのＰＴＦＥフィルターにポンプで送り、８００ｍＬの透明ろ液を、５２ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮した。濃縮物を室温まで冷却し、２４ｍｇの９８％以上の純度のバニリンによりシーディングを行った。すぐに結晶化が生じ、溶液を一晩４℃に維持した。形成した固体を真空ろ過により母液から分離し、１０ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。ＨＰＬＣによる９６．５％ｗ／ｗの純度およびＧＣによる９８．５％ｗ／ｗの純度を有する黄色バニリンを得た。
【0088】
実施例５
強酸性陽イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂による処理後の強塩基性陰イオン交換樹脂への／強塩基性陰イオン交換樹脂からのバニリンの吸着および放出
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ５．０１の９．５８Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により濃縮した。
得られた４９５０ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液は５．０３のｐＨを有していた。バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２６ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を溶液に添加し、溶液を５０℃で４８時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過し、その後、エタノールで希釈して２０％エタノールｖ／ｖの最終濃度とした。得られた溶液のｐＨは５．３４であった。
実験室スケールのカラム２本：３００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化および再生）で充填した３５０ｍＬの実験室スケールのカラム、およびその後の３００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓ（酢酸５％で処理）で充填した３５０ｍＬの実験室スケールのカラムを順次接続し、１．１７Ｌのエタノールによる透明ろ液を、強酸性陽イオン交換樹脂から開始して、４ＢＶ／ｈの流量にて上昇流方向に、２本の樹脂カラムを通してポンプ送液した。その後、両方の樹脂カラムを水性エタノール２０％ｖ／ｖで洗浄した。異なる５画分を収集および分析した。
強酸性陽イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂による処理後の強塩基性陰イオン交換樹脂への／強塩基性陰イオン交換樹脂からのバニリンの吸着および放出
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ５．０１の９．５８Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により濃縮した。
得られた４９５０ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液は５．０３のｐＨを有していた。バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２６ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を溶液に添加し、溶液を５０℃で４８時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過し、その後、エタノールで希釈して２０％エタノールｖ／ｖの最終濃度とした。得られた溶液のｐＨは５．３４であった。
実験室スケールのカラム２本：３００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化および再生）で充填した３５０ｍＬの実験室スケールのカラム、およびその後の３００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓ（酢酸５％で処理）で充填した３５０ｍＬの実験室スケールのカラムを順次接続し、１．１７Ｌのエタノールによる透明ろ液を、強酸性陽イオン交換樹脂から開始して、４ＢＶ／ｈの流量にて上昇流方向に、２本の樹脂カラムを通してポンプ送液した。その後、両方の樹脂カラムを水性エタノール２０％ｖ／ｖで洗浄した。異なる５画分を収集および分析した。
【0089】
【表6】
【0090】
４５ｍＬの強塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ ４２（ＮａＯＨ ５％で活性化および脱塩水で洗浄）で充填した実験室スケールのカラムに、２２５ｍＬの上記の画分全てを混ぜ合わせることにより得られた溶液を供給した。混ぜ合わせた溶液を４ＢＶ／ｈの流量でカラムを通してポンプ送液した後、５画分を収集し、その後、樹脂を脱塩水で洗浄した後、３洗浄画分を収集および分析した。
【0091】
【表7】
【0092】
その後、樹脂カラムを通して４ＢＶ／ｈの流量で５％酢酸を含む水性エタノール７０％ｖ／ｖをポンプ送液することによりバニリンを放出させた。バニリン放出の間の５画分を収集および分析した。
【0093】
【表8】
【0094】
強塩基性陰イオン交換樹脂に吸着したバニリンの６７．８６％を、５％酢酸を含む水性エタノール７０％ｖ／ｖによる溶離によって放出させたが、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ４２により結合したバニリン全体は、供給溶液により供給された総量の１３．６０％のみであった。従って、強塩基性陰イオン交換樹脂による精製のバニリン収率全体は９．２２％であった。強塩基性陰イオン交換樹脂の適用によりもたらされる低効率のために、結晶化を行うことなく本実施例の精製プロセスを中断した。
【0095】
実施例６
下流プロセスＢ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．９６の１７．７Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により４．９０Ｌまで濃縮した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を４９００ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液（ｐＨ５．２３）に添加し、溶液を５０℃で１２０時間撹拌した。８５０ｍＬの形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過した。バニリンを含む透明ろ液を、４ＢＶ／ｈの流量で非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ４００（脱塩水で予め調整）で充填した２００ｍＬのカラムを通して下降流方向にポンプ送液した。５００ｍＬの５画分（それぞれ２．５ＢＶ）を収集した（８５０ｍＬが供給物に、１６５０ｍＬが洗浄物に対応）。供給物を投入後、淡黄色の色合いを有する水が樹脂カラムから出てくるまで、樹脂を８ＢＶの脱塩水で洗浄して着色不純物を除去した。その後、４ＢＶ／ｈの流量での上昇流方向への水性８０％ｖ／ｖエタノールによる溶離によってバニリンを樹脂から放出させた。８画分で１．６７２Ｌの溶離液を収集した。バニリンはすぐに脱着し、脱着物は褐色を有していたが、より希釈された脱着物は黄色であった。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ４００からの脱着画分を、Ｈ型の強酸性陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗｘ４（ＢＶ＝２００ｍＬ）を通してポンプ送液したが、ここでは樹脂カラムを脱塩水で十分に予め洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整した。脱着画分を、４ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に次々に樹脂カラムにポンプ送液し、最初のものから開始して最後のもので終了した。終わりに、水中８０％ｖ／ｖエタノールを、カラムを通してポンプ送液し、樹脂を洗浄した。合計で２００ｍＬの８画分を収集した。
強酸性陽イオン交換樹脂の後に収集された画分を、５％酢酸で予め処理し、脱塩水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整した、弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ５３（ＢＶ＝２００ｍＬ）で充填したカラムを通してポンプ送液した。画分を、４ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に次々に樹脂カラムにポンプで送り、前の工程の最初の画分から開始して最後のもので終了した。次いで、水中８０％ｖ／ｖエタノールをカラムにポンプで送って樹脂を洗浄した。合計で２００ｍＬの８画分を収集した。
収集された全画分を炭素処理のために混ぜ合わせ、粒状活性炭Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥ（比 ０．５９ｋｇ ＢＧＥ／ｋｇ ＶＡＮ）を５０ｍＬのカラムに投入し、樹脂処理からの混ぜ合わせた画分のオレンジ色溶液を、２０時間、８ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に炭素カラムに再循環させた。炭素処理により、溶液の色がオレンジ色から黄色に変化した。炭素カラムを５ＢＶの水中８０％ｖ／ｖエタノール（５×５０ｍＬ）で洗浄した。炭素で処理された主要な画分および炭素洗浄画分を混ぜ合わせた。
得られた溶液を０．４８μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過して残った炭素粒子を除去し、フィルターを４０ｍＬの水中８０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、ｐＨ４．９４および１５μＳ／ｃｍの伝導率を有する合計で１７４０ｍＬの体積を得た。
透明ろ液を、５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下（２２０ｍｂａｒから８０ｍｂａｒまで）で濃縮した。残った黄色濃縮物に４ｍＬのエタノール９６％を添加して結晶化を開始させた。２０ｍｇの純粋なバニリンによりシーディングを行った。溶液を冷却し、約３５℃で結晶化が生じてバニリン結晶を形成した。スラリーを室温で１６時間撹拌し、その後、４℃で４時間維持し、結晶を熟成させた。
バニリン結晶をブフナー漏斗でろ取し、予め冷却した脱塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、真空下（１０ｍｂａｒ、５０℃）で１６時間乾燥させた。ＨＰＬＣによる９９．４４％ｗ／ｗの純度およびＧＣによる９９．２８％ｗ／ｗの純度を有する淡黄色の結晶性バニリンを得た。
下流プロセスＢ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．９６の１７．７Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により４．９０Ｌまで濃縮した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を４９００ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液（ｐＨ５．２３）に添加し、溶液を５０℃で１２０時間撹拌した。８５０ｍＬの形成したスラリーをろ過助剤としてＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１を添加することによりろ過した。バニリンを含む透明ろ液を、４ＢＶ／ｈの流量で非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ４００（脱塩水で予め調整）で充填した２００ｍＬのカラムを通して下降流方向にポンプ送液した。５００ｍＬの５画分（それぞれ２．５ＢＶ）を収集した（８５０ｍＬが供給物に、１６５０ｍＬが洗浄物に対応）。供給物を投入後、淡黄色の色合いを有する水が樹脂カラムから出てくるまで、樹脂を８ＢＶの脱塩水で洗浄して着色不純物を除去した。その後、４ＢＶ／ｈの流量での上昇流方向への水性８０％ｖ／ｖエタノールによる溶離によってバニリンを樹脂から放出させた。８画分で１．６７２Ｌの溶離液を収集した。バニリンはすぐに脱着し、脱着物は褐色を有していたが、より希釈された脱着物は黄色であった。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ４００からの脱着画分を、Ｈ型の強酸性陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗｘ４（ＢＶ＝２００ｍＬ）を通してポンプ送液したが、ここでは樹脂カラムを脱塩水で十分に予め洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整した。脱着画分を、４ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に次々に樹脂カラムにポンプ送液し、最初のものから開始して最後のもので終了した。終わりに、水中８０％ｖ／ｖエタノールを、カラムを通してポンプ送液し、樹脂を洗浄した。合計で２００ｍＬの８画分を収集した。
強酸性陽イオン交換樹脂の後に収集された画分を、５％酢酸で予め処理し、脱塩水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整した、弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ５３（ＢＶ＝２００ｍＬ）で充填したカラムを通してポンプ送液した。画分を、４ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に次々に樹脂カラムにポンプで送り、前の工程の最初の画分から開始して最後のもので終了した。次いで、水中８０％ｖ／ｖエタノールをカラムにポンプで送って樹脂を洗浄した。合計で２００ｍＬの８画分を収集した。
収集された全画分を炭素処理のために混ぜ合わせ、粒状活性炭Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥ（比 ０．５９ｋｇ ＢＧＥ／ｋｇ ＶＡＮ）を５０ｍＬのカラムに投入し、樹脂処理からの混ぜ合わせた画分のオレンジ色溶液を、２０時間、８ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に炭素カラムに再循環させた。炭素処理により、溶液の色がオレンジ色から黄色に変化した。炭素カラムを５ＢＶの水中８０％ｖ／ｖエタノール（５×５０ｍＬ）で洗浄した。炭素で処理された主要な画分および炭素洗浄画分を混ぜ合わせた。
得られた溶液を０．４８μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過して残った炭素粒子を除去し、フィルターを４０ｍＬの水中８０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、ｐＨ４．９４および１５μＳ／ｃｍの伝導率を有する合計で１７４０ｍＬの体積を得た。
透明ろ液を、５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下（２２０ｍｂａｒから８０ｍｂａｒまで）で濃縮した。残った黄色濃縮物に４ｍＬのエタノール９６％を添加して結晶化を開始させた。２０ｍｇの純粋なバニリンによりシーディングを行った。溶液を冷却し、約３５℃で結晶化が生じてバニリン結晶を形成した。スラリーを室温で１６時間撹拌し、その後、４℃で４時間維持し、結晶を熟成させた。
バニリン結晶をブフナー漏斗でろ取し、予め冷却した脱塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、真空下（１０ｍｂａｒ、５０℃）で１６時間乾燥させた。ＨＰＬＣによる９９．４４％ｗ／ｗの純度およびＧＣによる９９．２８％ｗ／ｗの純度を有する淡黄色の結晶性バニリンを得た。
【0096】
実施例７
強酸性陽イオン交換樹脂を使用しない、下流プロセスＢ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．９６の１７．７Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、次いで、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により４．９０Ｌまで濃縮した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を４９００ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液（ｐＨ５．２３）に添加し、溶液を５０℃で１２０時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ｆｉｌｔｅｘ ７（２５ｇ）の存在下で加圧フィルターによりろ過した。
８００ｍＬの透明ろ液を供給物として用い、ろ過助剤のケークを洗浄するために用いられる２００ｍＬの水を、供給および以下の工程における非イオン性樹脂の洗浄のためにも用いた。非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ４００で充填した２００ｍＬのカラムを水で洗浄した。供給物を下降流方向にカラムにポンプで送り（ろ液、８００ｍＬ）、その後、４ＢＶ／ｈの流量で洗浄供給物をポンプ送液した（２００ｍＬ、ろ過助剤を洗浄するために調製）。２００ｍＬ（１ＢＶ）の画分を収集し、溶離水が淡黄色の色合いを有するまで、樹脂を更に７ＢＶの水で洗浄して色および不純物を除去した。その後、８０％ｖ／ｖ水性エタノールによる溶離によってバニリンを樹脂から放出させた。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ４００からの脱着物を、５％酢酸で予め処理し、脱塩水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整した、弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ５３（ＢＶ＝２００ｍＬ）に供給した。画分を、４ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に次々にポンプで送り、前の工程の最初の画分から開始して最後のもので終了した。その後、水中８０％ｖ／ｖエタノールを、４ＢＶ／ｈの流量にて上昇流方向で樹脂カラムにポンプ送液した。合計で２００ｍＬの９画分を収集した。
弱塩基性陰イオン交換樹脂からの最初の５画分を炭素処理のために混ぜ合わせた。粒状活性炭Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥ（比 ０．５８ｋｇ ＢＧＥ／ｋｇ ＶＡＮ）を５０ｍＬのカラムに投入し、混ぜ合わせた画分の赤色溶液を、２０時間、８ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に炭素カラムに再循環させた。溶液の色が赤色からオレンジ色に変化した。炭素カラムを５ＢＶの水中８０％ｖ／ｖエタノール（５×５０ｍＬ）で洗浄した。
炭素処理後の主要な画分を炭素洗浄５画分と共にプールし、合わせた溶液を０．４８μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過して残った炭素粒子を除去した。フィルターを３５ｍＬの水中８０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、ｐＨ５．４２および５２μＳ／ｃｍの伝導率を有する合計で１２８５ｍＬの溶液の体積を得た。
前の工程で得られた１２８５ｍＬの溶液を、５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下（２２０ｍｂａｒから８０ｍｂａｒまで）で濃縮した。残った黄色濃縮物に４ｍＬの水中エタノール９６％ｖ／ｖを添加してバニリンの結晶化を開始させた。２０ｍｇの純粋なバニリンを添加することによりシーディングを行った。溶液を冷却し、約３５℃で結晶化が生じてバニリン結晶を形成した。スラリーを室温で１６時間撹拌し、その後、４℃で４時間維持し、結晶を熟成させた。バニリン結晶をブフナー漏斗でろ取し、予め冷却した脱塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、真空オーブン（１０ｍｂａｒ、５０℃）で１６時間乾燥させた。ＨＰＬＣによる９８．５４％ｗ／ｗの純度およびＧＣによる９８．１２％ｗ／ｗの純度を有する淡黄色の結晶性バニリンを得た。
本実施例７の精製プロセスにより得られた、即ち強酸性陽イオン交換樹脂処理を含まないバニリンの風味は、強酸性陽イオン交換樹脂による工程を含む実施例６で得られたバニリンと比較して、異臭が強く、強くクリーミーであった。実施例６で得られたバニリンの風味は、わずかにクリーミーな雰囲気のあるより強烈なバニラであった。望ましい風味はより強烈なバニラであり、従って、実施例６で得られたバニリンの風味が好ましい。
強酸性陽イオン交換樹脂を使用しない、下流プロセスＢ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．９６の１７．７Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、次いで、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により４．９０Ｌまで濃縮した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を４９００ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液（ｐＨ５．２３）に添加し、溶液を５０℃で１２０時間撹拌した。形成したスラリーをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ｆｉｌｔｅｘ ７（２５ｇ）の存在下で加圧フィルターによりろ過した。
８００ｍＬの透明ろ液を供給物として用い、ろ過助剤のケークを洗浄するために用いられる２００ｍＬの水を、供給および以下の工程における非イオン性樹脂の洗浄のためにも用いた。非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ４００で充填した２００ｍＬのカラムを水で洗浄した。供給物を下降流方向にカラムにポンプで送り（ろ液、８００ｍＬ）、その後、４ＢＶ／ｈの流量で洗浄供給物をポンプ送液した（２００ｍＬ、ろ過助剤を洗浄するために調製）。２００ｍＬ（１ＢＶ）の画分を収集し、溶離水が淡黄色の色合いを有するまで、樹脂を更に７ＢＶの水で洗浄して色および不純物を除去した。その後、８０％ｖ／ｖ水性エタノールによる溶離によってバニリンを樹脂から放出させた。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ４００からの脱着物を、５％酢酸で予め処理し、脱塩水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整した、弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ５３（ＢＶ＝２００ｍＬ）に供給した。画分を、４ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に次々にポンプで送り、前の工程の最初の画分から開始して最後のもので終了した。その後、水中８０％ｖ／ｖエタノールを、４ＢＶ／ｈの流量にて上昇流方向で樹脂カラムにポンプ送液した。合計で２００ｍＬの９画分を収集した。
弱塩基性陰イオン交換樹脂からの最初の５画分を炭素処理のために混ぜ合わせた。粒状活性炭Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥ（比 ０．５８ｋｇ ＢＧＥ／ｋｇ ＶＡＮ）を５０ｍＬのカラムに投入し、混ぜ合わせた画分の赤色溶液を、２０時間、８ＢＶ／ｈの流量にて下降流方向に炭素カラムに再循環させた。溶液の色が赤色からオレンジ色に変化した。炭素カラムを５ＢＶの水中８０％ｖ／ｖエタノール（５×５０ｍＬ）で洗浄した。
炭素処理後の主要な画分を炭素洗浄５画分と共にプールし、合わせた溶液を０．４８μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過して残った炭素粒子を除去した。フィルターを３５ｍＬの水中８０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、ｐＨ５．４２および５２μＳ／ｃｍの伝導率を有する合計で１２８５ｍＬの溶液の体積を得た。
前の工程で得られた１２８５ｍＬの溶液を、５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下（２２０ｍｂａｒから８０ｍｂａｒまで）で濃縮した。残った黄色濃縮物に４ｍＬの水中エタノール９６％ｖ／ｖを添加してバニリンの結晶化を開始させた。２０ｍｇの純粋なバニリンを添加することによりシーディングを行った。溶液を冷却し、約３５℃で結晶化が生じてバニリン結晶を形成した。スラリーを室温で１６時間撹拌し、その後、４℃で４時間維持し、結晶を熟成させた。バニリン結晶をブフナー漏斗でろ取し、予め冷却した脱塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、真空オーブン（１０ｍｂａｒ、５０℃）で１６時間乾燥させた。ＨＰＬＣによる９８．５４％ｗ／ｗの純度およびＧＣによる９８．１２％ｗ／ｗの純度を有する淡黄色の結晶性バニリンを得た。
本実施例７の精製プロセスにより得られた、即ち強酸性陽イオン交換樹脂処理を含まないバニリンの風味は、強酸性陽イオン交換樹脂による工程を含む実施例６で得られたバニリンと比較して、異臭が強く、強くクリーミーであった。実施例６で得られたバニリンの風味は、わずかにクリーミーな雰囲気のあるより強烈なバニラであった。望ましい風味はより強烈なバニラであり、従って、実施例６で得られたバニリンの風味が好ましい。
【0097】
実施例８
溶媒として２－プロパノールを用いることによる、下流プロセスＢ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．９６の１７．７Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、次いで、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により４．９０Ｌまで濃縮した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を４９００ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液（ｐＨ５．２３）に添加し、溶液を５０℃で１２０時間撹拌した。得られたスラリーをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１によりろ過し、その後、エタノールで希釈して２０％エタノールｖ／ｖの最終濃度とした。
６５０ｍＬのろ過されたバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填した実験室スケールのカラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を脱塩水で洗浄した。
樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向に水性８０％ｖ／ｖ２－プロパノールをポンプで送ることにより、バニリンを樹脂から放出させ、５００ｍＬの６画分を収集した。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００から収集された最初の３放出画分を、２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化、脱塩水で洗浄、および水中８０％ｖ／ｖ２－プロパノールで予め調整）で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性２－プロパノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。１０画分を収集および分析した。
溶媒として２－プロパノールを用いることによる、下流プロセスＢ
バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含むｐＨ４．９６の１７．７Ｌの発酵ブロスを以下の実験に用いた。ブロスをＵＦ １ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ０１ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０により限外ろ過し、次いで、透析ろ過し、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜による逆浸透により４．９０Ｌまで濃縮した。
バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．２７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を４９００ｍＬの濃縮バニリングルコシド溶液（ｐＨ５．２３）に添加し、溶液を５０℃で１２０時間撹拌した。得られたスラリーをろ過助剤としてのＤａｌ－Ｃｉｎ Ａｌｆａｔｅｘ １０１によりろ過し、その後、エタノールで希釈して２０％エタノールｖ／ｖの最終濃度とした。
６５０ｍＬのろ過されたバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填した実験室スケールのカラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を脱塩水で洗浄した。
樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向に水性８０％ｖ／ｖ２－プロパノールをポンプで送ることにより、バニリンを樹脂から放出させ、５００ｍＬの６画分を収集した。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００から収集された最初の３放出画分を、２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化、脱塩水で洗浄、および水中８０％ｖ／ｖ２－プロパノールで予め調整）で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性２－プロパノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。１０画分を収集および分析した。
【0098】
【表9】
【0099】
前の工程で強酸性陽イオン交換樹脂から収集された最初の８画分を、酢酸５％で予め処理し、脱塩水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖ２－プロパノールで予め調整した、２００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓで充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性２－プロパノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。１０画分を収集および分析した。
【0100】
【表10】
【0101】
前の工程で弱塩基性陰イオン交換樹脂から収集された１０画分を合わせ、得られた暗赤色溶液を、室温で３日間、８ＢＶ／ｈの流量で再循環ループにおいて５０ｍＬの化学的粒状活性炭Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥ（比 ０．５９ｋｇ ＢＧＥ／ｋｇ ＶＡＮ）で充填したカラムに下降流方向にポンプ送液した。炭素処理後の溶液はオレンジ色であった。炭素を５ＢＶの水中８０％ｖ／ｖ２－プロパノールで洗浄した。それぞれの溶液の試料をろ過し、分析した。脱色された主要バニリン溶液および洗浄画分を混ぜ合わせ、０．４５μｍのＮｙｌｏｎフィルターでろ過した。
ろ過および脱色された溶液を、１１８ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、次いで、連続的に撹拌しながら室温まで冷却した。４ｍＬのエタノール１００％を濃縮物に添加して濃縮中に溶液中に形成された褐色油を可溶化し、２９．２１ｍｇのバニリン（純度９９％）を添加することによりシーディングを行った。溶液を一晩４℃に維持した。形成した固体を真空ろ過により母液から分離し、１００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。ＨＰＬＣによる９７．７７％ｗ／ｗの純度およびＧＣによる９９．７０％ｗ／ｗの純度を有する暗黄色バニリンを得た。
ろ過および脱色された溶液を、１１８ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、次いで、連続的に撹拌しながら室温まで冷却した。４ｍＬのエタノール１００％を濃縮物に添加して濃縮中に溶液中に形成された褐色油を可溶化し、２９．２１ｍｇのバニリン（純度９９％）を添加することによりシーディングを行った。溶液を一晩４℃に維持した。形成した固体を真空ろ過により母液から分離し、１００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、３時間、真空下、４５℃で乾燥させた。ＨＰＬＣによる９７．７７％ｗ／ｗの純度およびＧＣによる９９．７０％ｗ／ｗの純度を有する暗黄色バニリンを得た。
【0102】
実施例９
強酸性陽イオン交換樹脂による処理の前に弱塩基性陰イオン交換樹脂の処理が存在する、下流プロセスＢ
バニリングルコシドを含む発酵ブロスをＵＦ １０ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜により限外ろ過および透析ろ過し、次いで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜による逆浸透により濃縮した。得られた濃縮物におけるバニリングルコシドを、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からのβ－グルコシダーゼ溶液により、５５℃で３０時間、バニリングルコシドのｋｇ当たり０．４５ｋｇの酵素溶液を適用して、加水分解した。得られた懸濁液をろ過助剤Ｄａｌ－Ｃｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍ０９の存在下、フィルタープレスでろ過して、５．０４のｐＨを有する透明褐色バニリン含有ろ液を得た。１Ｌのこのろ過したバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を３ＢＶの脱塩水で洗浄し、樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向に水性８０％ｖ／ｖエタノールをポンプで送ることによりバニリンを樹脂から放出させた。４ＢＶを収集し、混ぜ合わせた。
前の工程で得られた１Ｌの脱着物を、酢酸５％で前処理し、脱塩水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整した、２００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓで充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。７画分を収集および分析した。
強酸性陽イオン交換樹脂による処理の前に弱塩基性陰イオン交換樹脂の処理が存在する、下流プロセスＢ
バニリングルコシドを含む発酵ブロスをＵＦ １０ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜により限外ろ過および透析ろ過し、次いで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜による逆浸透により濃縮した。得られた濃縮物におけるバニリングルコシドを、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からのβ－グルコシダーゼ溶液により、５５℃で３０時間、バニリングルコシドのｋｇ当たり０．４５ｋｇの酵素溶液を適用して、加水分解した。得られた懸濁液をろ過助剤Ｄａｌ－Ｃｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍ０９の存在下、フィルタープレスでろ過して、５．０４のｐＨを有する透明褐色バニリン含有ろ液を得た。１Ｌのこのろ過したバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を３ＢＶの脱塩水で洗浄し、樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向に水性８０％ｖ／ｖエタノールをポンプで送ることによりバニリンを樹脂から放出させた。４ＢＶを収集し、混ぜ合わせた。
前の工程で得られた１Ｌの脱着物を、酢酸５％で前処理し、脱塩水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整した、２００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓで充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。７画分を収集および分析した。
【0103】
【表11】
【0104】
前の工程で得られた７画分を、２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化、水で洗浄、および水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整）で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。７画分を収集および分析した。
【0105】
【表12】
【0106】
強酸性陽イオン交換樹脂から収集された７画分を混ぜ合わせ、得られた暗赤色溶液を、室温で一晩、８ＢＶ／ｈの流量でＣｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥ（比 ０．４８ｋｇ ＢＧＥ／ｋｇ ＶＡＮ）からの化学的粒状活性炭で充填したカラムに下降流方向に再循環させた。炭素処理の終わりに溶液は黄色であった。次いで、炭素を４ＢＶの８０％エタノールで洗浄した。脱色されたバニリン溶液および洗浄画分を混ぜ合わせ、０．４５μｍのＮｙｌｏｎフィルターでろ過し、分析した。
前の工程で得られたろ過および脱色された溶液を、１３５ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、連続的に撹拌しながら室温まで冷却した。４ｍＬのエタノール９９．９％をこの溶液に添加して濃縮中に溶液中に形成された褐色油を可溶化した。その後、３５ｍｇの９８％以上の純度のバニリンを添加することによりシーディングを行った。得られたスラリーを一晩室温で撹拌し、その後、固体を真空ろ過により母液から分離し、１００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、一晩、真空下、５０℃で乾燥させた。ＧＣによる９９．６０％ｗ／ｗの純度を有する黄色バニリンを得た。
前の工程で得られたろ過および脱色された溶液を、１３５ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、連続的に撹拌しながら室温まで冷却した。４ｍＬのエタノール９９．９％をこの溶液に添加して濃縮中に溶液中に形成された褐色油を可溶化した。その後、３５ｍｇの９８％以上の純度のバニリンを添加することによりシーディングを行った。得られたスラリーを一晩室温で撹拌し、その後、固体を真空ろ過により母液から分離し、１００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、一晩、真空下、５０℃で乾燥させた。ＧＣによる９９．６０％ｗ／ｗの純度を有する黄色バニリンを得た。
【0107】
実施例１０
弱塩基性陰イオン交換樹脂を使用せず、活性炭処理を含まない、下流プロセスＢ
バニリングルコシドを含む発酵ブロスをＵＦ １０ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜により限外ろ過および透析ろ過し、次いで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜による逆浸透により濃縮した。得られた濃縮物におけるバニリングルコシドを、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からのβ－グルコシダーゼ溶液により、５５℃で３０時間、バニリングルコシドのｋｇ当たり０．４５ｋｇの酵素溶液を適用して、加水分解した。得られた懸濁液をろ過助剤Ｄａｌ－Ｃｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍ０９の存在下、フィルタープレスでろ過して、５．０４のｐＨを有する透明褐色バニリン含有ろ液を得た。１Ｌのこのろ過したバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を３ＢＶの脱塩水で洗浄した。樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向に水性８０％ｖ／ｖエタノールをポンプで送ることによりバニリンを樹脂から放出させた。４ＢＶを収集および分析した。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００への／からの吸着および放出の後に前の工程で得られた７００ｍＬの脱着物を、４ＢＶ／ｈの流量で、２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化）で満たし、水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整したカラムに下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。５画分を収集および分析した。
弱塩基性陰イオン交換樹脂を使用せず、活性炭処理を含まない、下流プロセスＢ
バニリングルコシドを含む発酵ブロスをＵＦ １０ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜により限外ろ過および透析ろ過し、次いで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜による逆浸透により濃縮した。得られた濃縮物におけるバニリングルコシドを、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からのβ－グルコシダーゼ溶液により、５５℃で３０時間、バニリングルコシドのｋｇ当たり０．４５ｋｇの酵素溶液を適用して、加水分解した。得られた懸濁液をろ過助剤Ｄａｌ－Ｃｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍ０９の存在下、フィルタープレスでろ過して、５．０４のｐＨを有する透明褐色バニリン含有ろ液を得た。１Ｌのこのろ過したバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を３ＢＶの脱塩水で洗浄した。樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向に水性８０％ｖ／ｖエタノールをポンプで送ることによりバニリンを樹脂から放出させた。４ＢＶを収集および分析した。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００への／からの吸着および放出の後に前の工程で得られた７００ｍＬの脱着物を、４ＢＶ／ｈの流量で、２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化）で満たし、水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整したカラムに下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を水性エタノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。５画分を収集および分析した。
【0108】
【表13】
【0109】
前の工程で強酸性陽イオン交換樹脂から収集された５画分を混ぜ合わせた。得られた溶液を５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、連続的に撹拌しながら室温まで冷却した。４ｍＬのエタノール９９．９％をこの溶液に添加して濃縮中に溶液中に形成された褐色油を可溶化し、その後、３５．８４ｍｇの９８％以上の純度のバニリンを添加することによりシーディングを行った。得られたスラリーを一晩室温で撹拌し、その後、固体を真空ろ過により母液から分離し、１００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、一晩、真空下、５０℃で乾燥させた。ＧＣによる９４．１０％ｗ／ｗの純度を有する褐色バニリンを得た。
【0110】
実施例１１
活性炭処理を含まない、下流プロセスＢ
バニリングルコシドを含む発酵ブロスをＵＦ １０ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜により限外ろ過および透析ろ過し、次いで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜による逆浸透により濃縮した。得られた濃縮物におけるバニリングルコシドを、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からのβ－グルコシダーゼ溶液により、５５℃で３０時間、バニリングルコシドのｋｇ当たり０．４５ｋｇの酵素溶液を適用して、加水分解した。得られた懸濁液をろ過助剤Ｄａｌ－Ｃｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍ０９の存在下、フィルタープレスでろ過して、５．０４のｐＨを有する透明褐色バニリン含有ろ液を得た。１Ｌのこのろ過したバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を３ＢＶの脱塩水で洗浄し、樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向に水性８０％ｖ／ｖエタノールをポンプで送ることによりバニリンを樹脂から放出させた。４ＢＶを収集および分析した。
前の工程で得られた１Ｌの脱着物を、２つの２００ｍＬの樹脂カラムに順次４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した：強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化）で充填した第１のカラム、およびその後の弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓ（酢酸５％で前処理）で充填したカラム。その後、カラムを水性エタノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。７ＢＶの単一の画分を収集および分析した。
活性炭処理を含まない、下流プロセスＢ
バニリングルコシドを含む発酵ブロスをＵＦ １０ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜により限外ろ過および透析ろ過し、次いで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜による逆浸透により濃縮した。得られた濃縮物におけるバニリングルコシドを、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からのβ－グルコシダーゼ溶液により、５５℃で３０時間、バニリングルコシドのｋｇ当たり０．４５ｋｇの酵素溶液を適用して、加水分解した。得られた懸濁液をろ過助剤Ｄａｌ－Ｃｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍ０９の存在下、フィルタープレスでろ過して、５．０４のｐＨを有する透明褐色バニリン含有ろ液を得た。１Ｌのこのろ過したバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を３ＢＶの脱塩水で洗浄し、樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向に水性８０％ｖ／ｖエタノールをポンプで送ることによりバニリンを樹脂から放出させた。４ＢＶを収集および分析した。
前の工程で得られた１Ｌの脱着物を、２つの２００ｍＬの樹脂カラムに順次４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した：強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化）で充填した第１のカラム、およびその後の弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ａ８４５Ｓ（酢酸５％で前処理）で充填したカラム。その後、カラムを水性エタノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。７ＢＶの単一の画分を収集および分析した。
【0111】
【表14】
【0112】
前の工程で得られた溶液を、１１５ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、連続的に撹拌しながら室温まで冷却した。４ｍＬのエタノール９９．９％を溶液に添加して濃縮中に形成された褐色油を可溶化し、溶液を一晩室温で撹拌した。その後、形成した固体を真空ろ過により母液から分離し、１００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、一晩、真空下、５０℃で乾燥させた。ＧＣによる９７．１０％ｗ／ｗの純度を有する黄色バニリンを得た。
【0113】
実施例１２
弱塩基性陰イオン交換樹脂を使用しない、下流プロセスＢ
バニリングルコシドを含む発酵ブロスをＵＦ １０ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜により限外ろ過および透析ろ過し、次いで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜による逆浸透により濃縮した。得られた濃縮物におけるバニリングルコシドを、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からのβ－グルコシダーゼ溶液により、５５℃で３０時間、バニリングルコシドのｋｇ当たり０．４５ｋｇの酵素溶液を適用して、加水分解した。得られた懸濁液をろ過助剤Ｄａｌ－Ｃｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍ０９の存在下、フィルタープレスでろ過して、５．０４のｐＨを有する透明褐色バニリン含有ろ液を得た。１Ｌのこのろ過したバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を３ＢＶの脱塩水で洗浄し、樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向に水性８０％ｖ／ｖエタノールをポンプで送ることによりバニリンを樹脂から放出させた。４ＢＶを収集および分析した。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００への／からの吸着および放出の後に得られた７００ｍＬの脱着物を、２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化）で満たし、水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂カラムを水性エタノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。１Ｌの１画分を収集および分析した。
弱塩基性陰イオン交換樹脂を使用しない、下流プロセスＢ
バニリングルコシドを含む発酵ブロスをＵＦ １０ｋＤａ Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜により限外ろ過および透析ろ過し、次いで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９９膜による逆浸透により濃縮した。得られた濃縮物におけるバニリングルコシドを、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からのβ－グルコシダーゼ溶液により、５５℃で３０時間、バニリングルコシドのｋｇ当たり０．４５ｋｇの酵素溶液を適用して、加水分解した。得られた懸濁液をろ過助剤Ｄａｌ－Ｃｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍ０９の存在下、フィルタープレスでろ過して、５．０４のｐＨを有する透明褐色バニリン含有ろ液を得た。１Ｌのこのろ過したバニリン溶液を、５００ｍＬの非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂を３ＢＶの脱塩水で洗浄し、樹脂カラムに４ＢＶ／ｈの流量で上昇流方向に水性８０％ｖ／ｖエタノールをポンプで送ることによりバニリンを樹脂から放出させた。４ＢＶを収集および分析した。
非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００への／からの吸着および放出の後に得られた７００ｍＬの脱着物を、２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ（Ｈ２ＳＯ４ ５％で活性化）で満たし、水で洗浄し、水中８０％ｖ／ｖエタノールで予め調整したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。その後、樹脂カラムを水性エタノール８０％ｖ／ｖで洗浄した。１Ｌの１画分を収集および分析した。
【0114】
【表15】
【0115】
強酸性陽イオン交換樹脂の後に収集された画分を、室温で一晩、８ＢＶ／ｈの流量で粒状活性炭Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥ（比 ０．５３ｋｇ ＢＧＥ／ｋｇ ＶＡＮ）で充填したカラムに下降流方向で再循環させた。炭素処理後に溶液はオレンジ色であった。炭素を４ＢＶの水中８０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、主要溶液を洗浄画分と合わせて０．４５μｍのＮｙｌｏｎフィルターでろ過した。
透明ろ液を、２４０ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、連続的に撹拌しながら室温まで冷却した。４ｍＬのエタノール９９．９％をこの溶液に添加して濃縮中に溶液中に形成された褐色油を可溶化し、得られた溶液を一晩室温で撹拌してスラリーを形成した。固体を真空ろ過により母液から分離し、１００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、一晩、真空下、５０℃で乾燥させた。ＧＣによる９５．９０％ｗ／ｗの純度を有する黄色バニリンを得た。
透明ろ液を、２４０ｍＬまで５５℃の水浴中でロータリーエバポレーターにより真空下で濃縮し、連続的に撹拌しながら室温まで冷却した。４ｍＬのエタノール９９．９％をこの溶液に添加して濃縮中に溶液中に形成された褐色油を可溶化し、得られた溶液を一晩室温で撹拌してスラリーを形成した。固体を真空ろ過により母液から分離し、１００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、一晩、真空下、５０℃で乾燥させた。ＧＣによる９５．９０％ｗ／ｗの純度を有する黄色バニリンを得た。
【0116】
実施例１３
下流プロセスＣ
Ｃ型の完全な下流プロセスを分析するために、バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含む１１．５６Ｌの発酵ブロスを用いた。バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．５７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を発酵ブロスに添加し、５５℃で４８時間撹拌した。
ｐＨ５．０３のブロスをＵＦ １０ｋＤａ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０で限外ろ過および透析ろ過した。２．５Ｌの透過物を、４ＢＶ／ｈの流量にて上昇流方向で非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００（５００ｍＬ）にポンプ送液した。樹脂カラムを３ＢＶの脱塩水で洗浄し、樹脂カラムに２．５ＢＶの水中８０％ｖ／ｖエタノール、その後に約６００ｍＬの水をポンプで送ることによりバニリンを脱着させた。５００ｍＬの４脱着画分を収集した。
２つのカラムを順次接続した：２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ Ｈ型で充填したカラム、およびその後の２００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ５３（酢酸５％で前処理）で充填したカラム。前の工程からの脱着物の４画分を混ぜ合わせ、強酸性陽イオン交換樹脂から開始して２つのカラムに順次、上昇流方向にポンプ送液した。４画分を収集および分析した。
下流プロセスＣ
Ｃ型の完全な下流プロセスを分析するために、バニリングルコシド生成酵母株により製造された、バニリングルコシドを含む１１．５６Ｌの発酵ブロスを用いた。バニリングルコシド１ｇ当たり、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｇ０１６Ｌ（β－グルコシダーゼ活性：１０ｕ／ｇ、生物学的起源：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、酵素濃度：約６．３％）からの０．５７ｇのβ－グルコシダーゼ溶液を発酵ブロスに添加し、５５℃で４８時間撹拌した。
ｐＨ５．０３のブロスをＵＦ １０ｋＤａ ＥＴＮＡ１０ＰＰ膜を有するＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＴｅｓｔＵｎｉｔ Ｍ２０で限外ろ過および透析ろ過した。２．５Ｌの透過物を、４ＢＶ／ｈの流量にて上昇流方向で非イオン性樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｕｒｏｓｏｒｂ ＰＡＤ ４００（５００ｍＬ）にポンプ送液した。樹脂カラムを３ＢＶの脱塩水で洗浄し、樹脂カラムに２．５ＢＶの水中８０％ｖ／ｖエタノール、その後に約６００ｍＬの水をポンプで送ることによりバニリンを脱着させた。５００ｍＬの４脱着画分を収集した。
２つのカラムを順次接続した：２００ｍＬの強酸性陽イオン交換樹脂Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃ１５０ＳＨ Ｈ型で充填したカラム、およびその後の２００ｍＬの弱塩基性陰イオン交換樹脂ＤｕＰｏｎｔ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ５３（酢酸５％で前処理）で充填したカラム。前の工程からの脱着物の４画分を混ぜ合わせ、強酸性陽イオン交換樹脂から開始して２つのカラムに順次、上昇流方向にポンプ送液した。４画分を収集および分析した。
【0117】
【表16】
【0118】
４画分全てを合わせて溶液を得たが、この溶液は、１６時間、粒状活性炭Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ａｃｔｉｃａｒｂｏｎｅ ＢＧＥ（比 ０．５０ｋｇ ＢＧＥ／ｋｇ ＶＡＮ）で充填したカラムに４ＢＶ／ｈの流量で下降流方向にポンプ送液した。炭素処理により、溶液の色が黄褐色から黄色に変化した。その後、炭素を３ＢＶの水中８０％エタノールで洗浄し、炭素で処理された主要溶液を洗浄画分と混ぜ合わせ、その後、０．４８μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過を行った。
透明ろ液（ｐＨ４．５０）を１Ｌの反応器中で真空下（３００～１５０ｍｂａｒ）、６０℃で濃縮して２８０ｍＬの二相性エマルション（油状褐色バニリンと水）を得た。エマルションは２０℃まで冷却することによりすぐにスラリーに変化し、１６時間撹拌し、その後、更に１０～１５℃まで冷却し、その後、真空ろ過により母液から固体を分離した。湿った固体を２００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、４８時間、真空下（１０ｍｂａｒ）、４５℃で乾燥させた。ＧＣによる９９．０％ｗ／ｗの純度を有する黄色バニリンを得た。
透明ろ液（ｐＨ４．５０）を１Ｌの反応器中で真空下（３００～１５０ｍｂａｒ）、６０℃で濃縮して２８０ｍＬの二相性エマルション（油状褐色バニリンと水）を得た。エマルションは２０℃まで冷却することによりすぐにスラリーに変化し、１６時間撹拌し、その後、更に１０～１５℃まで冷却し、その後、真空ろ過により母液から固体を分離した。湿った固体を２００ｍＬの予め冷却した脱塩水で洗浄し、４８時間、真空下（１０ｍｂａｒ）、４５℃で乾燥させた。ＧＣによる９９．０％ｗ／ｗの純度を有する黄色バニリンを得た。
【0119】
本明細書の上記に記載された実施例１～４および６～１３のプロセスのバニリン収率全体は４０～９０％の範囲内であった。
【国際調査報告】