特表 2025-505256 ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-21

(54)【発明の名称】ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20250214BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250214BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20250214BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20250214BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20250214BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20250214BHJP

   A61K 38/46 20060101ALN20250214BHJP

   A61K 38/18 20060101ALN20250214BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20250214BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20250214BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

A61K48/00

A61P29/00

A61P21/04

A61P37/02

A61P37/08

A61K38/46

A61K38/18

C12N15/86 Z ZNA

C12N15/55

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024547640

(86)(22)【出願日】2023-02-09

(85)【翻訳文提出日】2024-09-24

(86)【国際出願番号】 NL2023050057

(87)【国際公開番号】W WO2023158300

(87)【国際公開日】2023-08-24

(31)【優先権主張番号】2030945

(32)【優先日】2022-02-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511256233

【氏名又は名称】アマルナ ホールディング ベー．フェー．

【氏名又は名称原語表記】ＡＭＡＲＮＡ ＨＯＬＤＩＮＧ Ｂ．Ｖ．

【住所又は居所原語表記】Ｊ．Ｈ．Ｏｏｒｔｗｅｇ ２１ Ｌｅｉｄｅｎ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100075557

【弁理士】

【氏名又は名称】西教 圭一郎

(72)【発明者】

【氏名】ファン ディーメン，フェルディ ルドルフ

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア トスカーノ，ミゲル

(72)【発明者】

【氏名】コール，シモン デルフィン

(72)【発明者】

【氏名】フェルダース，マークウィン パウル

(72)【発明者】

【氏名】デ ハーン，ペトルス セオドルス

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA02

4C084DB52

4C084DC22

4C084MA58

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA94

4C084ZB07

4C084ZB11

4C084ZB13

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA58

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA94

4C087ZB07

4C087ZB11

4C087ZB13

(57)【要約】

本発明は、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関する。特に、本発明は、アルカリホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ならびに／もしくはインスリンおよび／またはインスリン様成長因子またはその前駆体などの成長因子タンパク質をコードする核酸配列をさらに含むポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関する。さらに、本発明は、被験体における炎症部位での損傷関連分子パターンの除去または不活性化による治療の方法における使用のための、本発明に従ったポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子、および本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を含む組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項2】

ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子が、複製欠損ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を含む、請求項１に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項3】

ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子が霊長類ポリオーマウイルス、好ましくはサル類ポリオーマウイルス、例えばサル類ポリオーマウイルス・シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する、請求項１または２に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項4】

ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列が、分泌型のホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項5】

ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列が、哺乳動物、特にヒトのアルカリホスファターゼまたはその活性誘導体などのアルカリホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項6】

アルカリホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列が、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）の分泌型変異体、ヒト腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＬＰ）、ヒト生殖細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ）、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）またはそれらの活性誘導体、好ましくはヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＰＡＬＰ）の分泌型変異体、をコードする核酸配列を含む請求項５に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項7】

アルカリホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列が、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＰＡＬＰ）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項５または６に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項8】

ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子が、分泌型エクトヌクレオチダーゼなどのエクトヌクレオチダーゼをコードする核酸配列を含まないという但し書きを付した、請求項５～７のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項9】

前記粒子が、成長因子タンパク質またはその前駆体をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項10】

前記粒子が、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１の核酸分子と、成長因子タンパク質またはその前駆体をコードする核酸配列を含む第２の核酸分子とを含む、請求項９に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項11】

前記粒子が、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列および成長因子タンパク質またはその前駆体をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項９に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項12】

成長因子タンパク質またはその前駆体をコードする核酸配列が、分泌型の成長因子タンパク質またはその前駆体をコードする核酸配列を含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項13】

前記粒子が、成長因子結合タンパク質またはその前駆体をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項14】

疾患、炎症性疾患、変性疾患、ジストロフィー性疾患、自己免疫疾患および／またはアレルギーの（予防的）治療方法における使用のための、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項15】

被験体の炎症部位における損傷関連分子パターンの除去または不活性化による（予防的）治療方法における使用のための、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項16】

被験体における細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の除去による（予防的）治療方法における使用のための、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項17】

炎症性、変性性、ジストロフィー性、自己免疫疾患および／またはアレルギーを有する被験体を治療する方法に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項18】

請求項１４～１７のいずれか１項に記載の使用のためのポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子であって、該使用が、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を被験体に投与することを含む、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項19】

請求項１８に記載の使用のためのポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子であって、該ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子が、静脈内注射、滑膜内注射、肺内注射、硝子体内注射または網膜下注射により投与される、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項20】

被験体がヒトである、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の使用のためのポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子。

【請求項21】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子の有効量を含む組成物。

【請求項22】

医薬品として使用するための請求項２１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関する。本発明はさらに、たとえば、被験体における炎症部位での損傷関連分子パターンの除去または不活性化による、被験体における炎症の治療または予防的治療の方法における使用のための、本発明に従ったポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関する。さらに、本発明は、本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

自己免疫疾患およびアレルギーは、慢性的または再燃性の炎症、およびそれぞれ自己抗原またはアレルゲンと名付けられた、自己タンパク質または非自己タンパク質に対する免疫と関連している。現在までのところ、自己免疫疾患およびアレルギーは治すことができない。患者の免疫系を全般的に抑制することによって、症状を隠したり緩和したりすることはできる。一般的な免疫抑制剤の長期使用は、病原菌に感染しやすくなったり、がん、炎症性疾患、変性疾患、ジストロフィー、自己免疫疾患、アレルギーなど、免疫に関連する他の疾患の発症など、しばしば重篤な副作用を伴う。したがって、患者の免疫系を無傷のまま残す自己免疫疾患およびアレルギーの新規治療法が緊急に必要とされている。

【0003】

慢性炎症あるいは再燃性炎症を抑制することは、炎症性、変性性、ジストロフィー性、自己免疫性組織破壊、アレルギー反応を阻止するための魅力的なアプローチである。炎症、変性、ジストロフィー、自己免疫疾患、アレルギーの患者において、それぞれ一次自己抗原（ｐＳＡｇ）またはアレルゲンに対する免疫寛容を回復させることにより、炎症を抑制することができる。しかし、これまでのところ、自己抗原またはアレルゲンに対する寛容化アプローチの有効性は低い。さらに、ほとんどの自己免疫疾患では、ｐＳＡｇは今のところ同定されていない。

【0004】

ｐＳＡｇが同定されていない自己免疫疾患を治療するために、自然免疫レベルに作用する別のアプローチは、損傷細胞から放出される損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）と名付けられたアラーム分子を除去することによって、疾患の進行を止めることである。パイロトーシス細胞から放出される細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は最も強力なＤＡＭＰの一つである。細胞外ＡＴＰは炎症、組織損傷、死亡率を促進する（Cauwels, Anje, et al. “Extracellular ATP drives systemic inflammation, tissue damage and mortality.”. Cell death & disease 5.3 (2014): e1102-e1102）。

【0005】

細胞外ＡＴＰを除去する魅力的なアプローチは、炎症部位に存在するホスファターゼによるアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、一リン酸（ＡＭＰ）、またはアデノシン（ＡＤＯ）への変換である。細胞外ＡＴＰ分子の除去は、罹患した組織の細胞を攻撃し破壊する自然免疫反応と適応免疫反応のさらなる活性化を防ぎ、自己免疫疾患の進行を遅らせたり止めたりする。

【0006】

細胞外のＡＴＰは、膜に結合しＧタンパク質と結合したＰ２受容体によって感知される（図１も参照）。結合後、ミトコンドリアは過剰な活性酸素を産生し始め、細胞質のＮｏｄ様受容体タンパク質３（ＮＬＲＰ３）タンパク質がインフラムソームに集合し、局所的な炎症反応が開始される。細胞外ＡＴＰは２つの膜結合型エクトヌクレオチダーゼ、ＣＤ３９（エクトアピラーゼ）とＣＤ７３（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ）とによってアデノシン（ＡＤＯ）に分解される。両ヌクレオチダーゼはＴ制御細胞（Ｔｒｅｇ）の表面に存在し、免疫細胞の活性化を防いでいる。細胞外のＡＴＰは非常に炎症性であるが、その脱リン酸化誘導体であるＡＤＰ、ＡＭＰ、ＡＤＯは膜結合型Ｐ１レセプターによって感知され、炎症に対抗し、免疫寛容の回復を促進する。

【0007】

米国特許出願公開第２００９／０１３００９２号は、炎症部位への白血球浸潤を阻害することにより、被験体における免疫炎症性、血栓性または虚血性障害を治療または予防する方法を開示しており、この方法は、炎症部位に有効量のエクト－アピラーゼおよび／またはエクト－５’－ヌクレオチダーゼタンパク質を被験体に投与することを含む。このような方法の欠点の一つは、タンパク質がｉｎ ｖｉｖｏでは比較的半減期が短いことである。このことは、炎症を低いレベルに維持するために、患者にタンパク質を生涯にわたって繰り返し投与しなければならないことを意味する。

【0008】

エクトアピラーゼタンパク質および／またはエクト－５’－ヌクレオチダーゼタンパク質の生体内での半減期が短いという問題は、炎症部位でエクトアピラーゼタンパク質および／またはエクト－５’－ヌクレオチダーゼタンパク質（可溶性形態またはその融合タンパク質）を発現させるためにウイルス遺伝子送達ベクターを使用することによって回避され得る。

【0009】

このような目的で現在使用されているウイルス遺伝子送達ベクターの中では、レンチウイルス（ＬＶ）ベクターとアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとが最も広く使用されている。どちらのベクターについても、このような複製欠損ウイルスベクターは、同族ウイルスに対してナイーブな宿主では非免疫原性あるいは寛容原性であることが示されている。

【0010】

ＬＶベクターは宿主ゲノムにランダムに組み込まれるため、挿入突然変異誘発のリスクが高まる。さらに、ＬＶベクター粒子は生体内で投与されると急速に分解される。このような理由から、ＬＶベクターは主に、血液関連の遺伝性疾患、リソソーム貯蔵病、あるいは癌を治療するために、白血球および／またはその前駆細胞の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）導入に用いられている。

【0011】

ＡＡＶベクターは、主にｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療に使用される。たとえば、国際公開第２０１４／００３５５３号は、炎症部位でエクトアピラーゼおよび／またはエクト－５’－ヌクレオチダーゼタンパク質またはそれらの融合タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターの使用を開示している。米国特許出願公開第２０１５／０１９０４８１号およびＡｎｔｏｎｉｏｎｉ（Antonioli,Luca,et al.“CD39 and CD73 in immunity and inflammation.”Trends in molecular medicine 19.6(2013):355-367）は、炎症性疾患を治療するためのウイルス遺伝子送達ベクターにおけるエクトアピラーゼおよび／またはエクト－５’－ヌクレオチダーゼコード配列を扱っている。エクトアピラーゼタンパク質および／またはエクト－５’－ヌクレオチダーゼタンパク質は、形質導入された細胞の細胞表面に結合したままであるため、炎症組織におけるホスファターゼ活性は非常に低く、治療効果は限定的である。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．は、分泌型組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）をコードするＡＡＶベクターを用いて、ヒト小児低ホスファターゼ症モデル動物におけるＴＮＡＬＰ活性を回復させ、治療動物におけるてんかん発作などの特徴的な疾患症状を和らげることを目的とした(Matsumoto,Tae,et al.“Rescue of severe infantile hypophosphatasia mice by AAV-mediated sustained expression of soluble alkaline phosphatase.”Human gene therapy 22.11 (2011):1355-1364)。

【0012】

しかし、ＡＡＶベクターによる治療を受ける前に、ヒトの大多数はすでに野生型ＡＡＶとそのヘルパーウイルス（風邪の原因となるアデノウイルス）とに遭遇しており、ＡＡＶキャプシドタンパク質に対する強い体液性および細胞性免疫記憶をすでに獲得している。組換えＡＡＶベクターを用いた臨床研究では、ベクター粒子を投与した患者の大部分において、ウイルスおよび導入遺伝子がコードされたタンパク質に対する自然免疫および適応免疫応答が惹起され、時間の経過とともに治療用導入遺伝子の発現レベルが低下し、体内から導入細胞が排除されてベクターの再投与ができなくなることが明らかになった。長期間の導入遺伝子発現を示した少数の治療患者は、ＡＡＶに感染したことがなく、従って試験で使用されたベクターに対して免疫学的にナイーブであった可能性が高い。これらの理由から、ＡＡＶベクターを用いたｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療の有効性は限られている。

【発明の概要】

【0013】

詳細説明
以上のことから、自己免疫疾患および／またはアレルギーに対する新規な治療法であって、高い有効性を有し、かつ／または患者の不快感を軽減し、しかも患者の免疫系は無傷のままである治療法が必要とされている。本発明は、第１の態様において、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を提供する。本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、ＡＴＰに暴露された細胞がパイロプトーシスを受けるのを効果的に防御することが見出された。本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子で形質導入された細胞は、ＡＴＰ誘導性パイロプトーシスから効果的に保護される。

【0014】

本明細書で使用する「ウイルス遺伝子送達ベクター粒子」という用語は、導入遺伝子構築物を組み込んだウイルスベクターゲノムを取り囲む粒子表面に露出したカプシドタンパク質を含む形質導入適格ウイルス粒子を指す。

【0015】

本明細書で使用する「導入遺伝子構築物」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする、ウイルス遺伝子送達ベクター粒子に組み込まれた核酸配列を指す。

【0016】

本明細書で使用する用語「ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子」は、ポリオーマウイルス由来のウイルスベクター粒子を指す。ポリオーマウイルス（科：ポリオーマウイルス科）は、主に哺乳動物および鳥類に自然感染し、慢性無症候性感染を引き起こす。それぞれのポリオーマウイルス種は、その自然宿主において厳密に複製する。現在までに知られている約１２０種のポリオーマウイルスのうち、ヒトに感染することが知られているのは１４種のみである。これらのポリオーマウイルスはヒトポリオーマウイルスと呼ばれている。その他のポリオーマウイルスはヒトには感染せず、非ヒトポリオーマウイルスと呼ばれている。このことは、ヒトには非ヒトポリオーマウイルスに対する免疫記憶がないことを意味している。その結果、本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子はヒトにおいて非免疫原性である。本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子をヒトに投与すると、導入遺伝子構築物によりコードされるウイルスタンパク質およびタンパク質に向けられた免疫寛容応答が誘導される。典型的には、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクターは、安全であり、遺伝子送達に非常に効率的であり、ヒトにおいて非免疫原性／寛容原性である。

【0017】

特に、本発明は、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関し、該ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、複製欠損ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を含む。従って、ウイルスゲノムの複製またはウイルス粒子の合成およびアセンブリに必須である１つ以上の機能に欠損を有する遺伝子送達ベクター粒子を提供する。

【0018】

本発明の好ましい実施態様では、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は霊長類ポリオーマウイルス、好ましくはサルポリオーマウイルス、たとえばサルポリオーマウイルスのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するものであってもよい。ＳＶ４０ベクター、好ましくは複製欠損ＳＶ４０ベクターは、臨床遺伝子治療のためのＡＡＶベクターの魅力的な代替物であることが見出された。ＳＶ４０は、５．２５ｋｂの長さの円形二本鎖ＤＮＡゲノムを含む４５ナノメートルの正２０面体のカプシドを持つポリオーマウイルスである。このウイルスは自然宿主であるサルにおいて厳密に複製され、無症状の慢性感染を引き起こす。ＳＶ４０粒子はカベオーラ・エンドソーム経路で感染細胞に侵入するが、他のウイルスとは対照的にリソソームコンパートメントを回避することができ、宿主免疫系への暴露を回避している。

【0019】

複製欠損ＳＶ４０ベクターは、ラージＴ抗原（ＬＴａｇ）とスモールＴ抗原（ＳＴａｇ）と呼ばれる２つの初期非構造タンパク質のコード領域を欠失させることによって作製され、治療用タンパク質またはＲＮＡをコードする導入遺伝子をクローニングするための２．７ｋｂのスペースを与えている。ＳＶ４０ベクターはｉｎ ｖｉｖｏで広範な細胞型に導入され、その治療可能性はヒト疾患の動物モデルで実証されている。ヒトはＳＶ４０に対して免疫学的にナイーブであるため、複製欠損ＳＶ４０ベクターは臨床に応用する場合、非免疫原性および寛容原性である。ヒトにおける非免疫原性と導入遺伝子タンパク質に対する免疫寛容を誘導する能力により、ＳＶ４０ベクターは遺伝子治療における使用に非常に魅力的である（Toscano, M. G., et al. "Generation of a vero-based packaging cell line to produce SV40 gene delivery vectors for use in clinical gene therapy studies. "Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 6 (2017)： Toscano, M. G., and De Haan, P. "How simian virus 40 hijacks the intracellular protein trafficking pathway to its own benefit... and ours. "Frontiers in Immunology 9 (2018)： 1160; Vera, M. and Fortes, P. "Simian virus-40 as a gene therapy vector. "DNA and cell biology 23.5 (2004)： 271-282)。

【0020】

本明細書中で使用される用語「ホスファターゼ活性保有ポリペプチド」は、ホスファターゼ活性を有するホスファターゼまたはその活性誘導体を指し、すなわち、化合物を脱リン酸化することができるポリペプチド（たとえば、タンパク質）を指す。本発明のポリペプチドは、ホスファターゼ活性を有するポリペプチドの分泌型であってもよい。アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドを選択することにより、特に良好な結果が観察される。本発明のポリペプチドは、アルカリホスファターゼの群から、原核生物および真核生物を問わず、多数の生物にわたって見出され、同じ一般的機能を有するが、それらが機能する環境に適した異なる構造形態を有するものとして選択され得る。好ましくは、アルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドは、ヒトのような哺乳動物のアルカリホスファターゼまたはその活性誘導体の群から選択される。

【0021】

本発明の第１の態様において、本発明は、炎症を抑制するためのエクト－アピラーゼおよび／またはエクト－５’－ヌクレオチダーゼの使用の欠点は、エクト－アピラーゼおよびエクト－５’－ヌクレオチダーゼのホスファターゼ活性が、特にアルカリホスファターゼのそれと比較して低いことであるという洞察を提供する。生殖細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、腸管アルカリホスファターゼ（ＩＡＬＰ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の４種類の膜結合型アルカリホスファターゼを発現可能なポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を提供することにより、非常に有効な自己免疫療法および／またはアレルギー療法を提供することができる。特にアルカリホスファターゼのホスファターゼ活性は、エクトアピラーゼおよびエクト－５’－ヌクレオチダーゼのホスファターゼ活性よりも高いことが見出された。すなわち、本明細書において「アルカリホスファターゼ活性保有ポリペプチド」とは、エクトアピラーゼおよびエクト－５’－ヌクレオチダーゼと比較して高いホスファターゼ活性を有するアルカリホスファターゼまたはその誘導体をいう。

【0022】

特に、分泌型アルカリホスファターゼまたはその活性誘導体をコードする核酸配列を含んでなるポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子が、ＡＴＰへの曝露後にパイロプトーシスを受けることから細胞を保護する最も効果的な方法をもたらすことが見出された。好ましい実施形態において、分泌型アルカリホスファターゼまたはその活性誘導体は、ヒトＰＡＬＰの分泌型変異体（ＳＰＡＬＰ）、ヒトＩＡＬＰの分泌型変異体（ＳＩＡＬＰ）、ヒトＧＣＡＬＰの分泌型変異体（ＳＧＣＡＬＰ）、ヒトＴＮＡＬＰの分泌型変異体（ＳＴＮＡＬＰ）またはそれらの活性誘導体から選択される。より好ましくは、アルカリホスファターゼ活性保有ポリペプチドは、ＳＰＡＬＰをコードする核酸配列を含む。

【0023】

本発明は、アルカリホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関するものであるので、アルカリホスファターゼ誘導体もまた、ホスファターゼ活性を保有するために使用され得ることに留意されたい。結果として、核酸配列は、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＰＡＬＰ）と（少なくとも部分的に）同一の核酸配列を含むが、核酸配列は、標的核酸配列（ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする）と実質的な核酸配列相同性を有していてもよい。好ましくは、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＰＡＬＰ）に対して少なくとも７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有する核酸配列を、少なくとも部分的に）、含む。

【0024】

本明細書で使用する「核酸配列相同性」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の相同性の存在を示す。ポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列が同じであるか、または一方のポリヌクレオチドのセンス配列と他方のポリヌクレオチドのアンチセンス配列とが、最大限の対応のために整列されたときに同じである場合に、「相同」配列を有する。２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列比較は、一般に、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、比較ウィンドウにわたって少なくとも２つの配列の一部を比較することによって行われる。比較ウィンドウの長さは、一般に約２０から２００連続ヌクレオチドである。

【0025】

少なくとも７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性のような、本発明のポリヌクレオチド配列についての「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定され得、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のための参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは以下のようにして計算される：（ａ）両方の配列において同一の核酸塩基が出現する位置の数を決定して、一致した位置の数を得る；（ｂ）一致した位置の数を、比較のウィンドウにおける位置の総数で除算する；および（ｃ）結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージ（配列相同性とも呼ばれる）を得る。比較のための配列の最適なアラインメントは、既知のアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって、または検査によって実施され得る。すぐに利用できる配列比較および多重配列アライメントアルゴリズムは、それぞれBasic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul S. F. et al., Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol： Altschul S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)およびClustalWプログラムがインターネット上で入手可能である。その他の適切なプログラムとしては、Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wl, USA)のGAP、BESTFIT、FASTAがある。

【0026】

核酸配列間の相同性は、変性（たとえば、４００ｍＭ ＮａＣＩ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡの条件下、温度５０℃～６５℃、１２～１６時間のハイブリダイゼーション、次いで洗浄）時に核酸配列が互いにハイブリダイズする能力を参照して決定され得る（Molecular Cloning: a Laboratory Manual： 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 または Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel, F. et al. eds., John Wiley & Sons, 1992）。

【0027】

一般に、当業者であれば、本発明での使用、すなわちホスファターゼ活性保有ポリペプチドの発現に適したポリオーマウイルス遺伝子送達ベクターの構築およびプロトコルの設計が十分に可能である。適切なベクターは、プロモーター配列、ターミネータ断片、ポリアデニル化配列、エンハンサ配列、マーカー遺伝子および適切な他の配列を含む、適切な調節配列を含むものを選択または構築することができる。さらなる詳細については、たとえば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual： 2nd edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。

【0028】

本発明の一実施形態において、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、アルカリホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列から本質的に構成されていてもよい。換言すれば、本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、分泌型エクトヌクレオチダーゼなどのエクトヌクレオチダーゼをコードする核酸配列を実質的に含まないか、または含まなくてもよい。エクトヌクレオチダーゼのホスファターゼ活性は、特に炎症を抑制するためにはアルカリホスファターゼに比べて低すぎることが見出された。特に、本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、エクトアピラーゼおよびエクト－５’－ヌクレオチダーゼをコードする核酸配列を実質的に含まないか、または含まなくてもよい。

【0029】

本発明の第２の態様において、本発明は、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関し、該粒子は、成長因子タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。成長因子タンパク質は、細胞増殖、創傷治癒、細胞分化を刺激することができる天然に存在するタンパク質である。成長因子タンパク質の例としては、アドレノメデュリン、アンジオポエチン、自己分泌運動因子、骨形態形成タンパク質、毛様体神経栄養因子ファミリ、コロニ刺激因子、上皮成長因子、エフリン、エリスロポエチン、線維芽細胞成長因子、リガンドのＧＤＮＦファミリ、成長分化因子－９、肝細胞成長因子、肝腫由来成長因子、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インターロイキン、ケラチノサイト成長因子、遊走刺激因子、マクロファージ刺激タンパク質、ミオスタチン、神経グリン、ニューロトロフィン、胎盤成長因子、血小板由来成長因子、レナラーゼ、Ｔ細胞成長因子、トロンボポエチン、トランスフォーミング成長因子、腫瘍壊死因子‐アルファ、血管内皮成長因子がある。

【0030】

本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子によって発現されるホスファターゼは、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびインスリン様成長因子２（ＩＧＦ２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を含むインスリンおよび／またはＩＧＦをコードする核酸配列と組み合わせて特に活性であることが見出された。

【0031】

好ましくは、インスリンおよび／またはＩＧＦまたはその前駆体をコードする核酸配列は、分泌型のインスリンおよび／またはＩＧＦまたはその前駆体をコードする核酸配列を含む。また、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列と同様に、インスリンおよび／またはＩＧＦまたはその前駆体をコードする核酸配列は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＩＧＦ１）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＩＧＦ２）に対して、少なくとも７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有する核酸配列を（少なくとも部分的に）含む。

【0032】

本発明の一実施形態において、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１の核酸分子と、インスリンおよび／またはＩＧＦまたはそれらの前駆体をコードする核酸配列を含む第２の核酸分子とを含み得る。

【0033】

本発明の代替的な実施形態において、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、ホスファターゼ活性保有ポリペプチドをコードする核酸配列と、インスリンおよびＩＧＦまたはその前駆体をコードする核酸配列とを含む核酸分子を含み得る。

【0034】

本発明のさらなる実施形態において、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、成長因子結合タンパク質、たとえばインスリン成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ、これはＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ６およびＩＧＦＢＰ７を含む）またはその前駆体をコードする核酸配列を含み得る。

【0035】

本明細書で用いる「核酸分子」という用語には、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ分子およびｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子、ならびにヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体の両方が含まれる。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【0036】

本発明の第３の態様において、本発明は、炎症性、変性性、ジストロフィー性、自己免疫疾患および／またはアレルギーの治療または予防的治療（たとえば予防）の方法における使用のための本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関する。一実施形態において、本発明は、被験体における炎症部位での損傷関連分子パターンの除去または不活性化による治療または予防的治療の方法における使用のための本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関する。特に、本発明は、被験体における細胞外ＡＴＰの除去による治療または予防的治療の方法における使用のための、本発明に従ったポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子に関することができる。たとえば、本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、炎症性、変性性、ジストロフィー性、自己免疫疾患および／またはアレルギーを有する被験体を治療する方法において使用され得る。

【0037】

本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子による治療に適した疾患の例としては、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、緑内障および糖尿病性網膜症（ＤＲ）などの散発性網膜変性疾患を挙げることができる。たとえば、ＡＭＤは、一般に、黄斑網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の慢性炎症と、それに続く炎症ＲＰＥ細胞下の脈絡膜血管過多とに関連し、その結果、不可逆的なＴ細胞媒介黄斑損傷および中心視力の喪失および失明をもたらす。網膜のＲＰＥ、神経細胞、内皮細胞から放出されるＡＴＰが、それぞれＡＭＤ、緑内障、ＤＲの発症に重要な役割を果たすことが報告されている（Ventura, Ana Lucia Marques, et al. "Purinergic signaling in the retina: From development to disease. "Brain research bulletin 151 (2019): 92-108）。

【0038】

本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子による治療に適した疾患の他の例としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、関節炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、およびリウマチ性関節炎および変形性関節炎を挙げることができる。

【0039】

被験者を治療するために、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を被験者に投与する。好ましくは、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、炎症部位に、たとえば、静脈内注射、肺内注射、硝子体内注射または網膜下注射により投与される。ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、ポリオーマウイルスに対してナイーブな哺乳動物に投与することができる。しかしながら、好ましくは、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子は、被験体がヒトである被験体に投与される。

【0040】

本発明の第４の態様において、本発明は、有効量の本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を含む組成物に関する。本発明はさらに、医薬品として使用するための有効量のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子を含む組成物に関する。

【0041】

本発明の実施形態において、組成物は、インスリン、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２などのＩＧＦおよび／またはＩＧＦＢＰまたはそれらの前駆体をさらに含み得る。本発明のポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子によって発現されるホスファターゼは、インスリン、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２などのＩＧＦ、並びに／またはＩＧＦＢＰ若しくはそれらの前駆体と組み合わせて特に活性であることが見出された。

【0042】

本明細書で使用する「有効量」という用語は、無治療と比較して対象の治療が有効であるために十分な投与量を意味する。「有効量」という用語は、所望の治療効果を有する量、すなわち「治療上有効な量」を意味する。

【0043】

本明細書で使用される「治療上有効な量」という用語は、所定の疾患およびその合併症の臨床症状を治癒、緩和、または部分的に阻止するのに十分な量を指す。これを達成するのに十分な量を「治療上有効な量」または「有効量」と定義する。それぞれの目的に対する有効量は、被験者の体重および全身状態だけでなく、疾患または傷害の重症度によって異なる。適切な投与量の決定は、日常的な実験を用いて、値のマトリックスを構築し、マトリックス内のさまざまな点をテストすることによって達成されることが理解され、これはすべて訓練を受けた医師または獣医の通常の技能の範囲内である。

【0044】

本発明に関して、（治療上）有効量は、ポリオーマウイルス遺伝子送達ベクター粒子の数で表すことができる。有効量はベクター粒子の実際の数に大きく依存するので、被験体に投与するベクター粒子の実際の数を決定することもできる。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【発明を実施するための形態】

【0046】

実験
ヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌型変異体（ＳＰＡＬＰ）をコードするシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来の遺伝子送達ベクター（以下、「ＳＶｅｃベクター」と称する）の、硝子体内投与によるＡＭＤ治療への使用の可能性を検討した。

【0047】

使用した遺伝子送達ベクターは、国際公開第２０１０／１２２０９４号およびＴｏｓｃａｎｏ（Toscano, M. G., et al. "Generation of a vero-based packaging cell line to produce SV40 gene delivery vectors for use in clinical gene therapy studies. "Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 6 (2017)： 124-134)に開示された方法を用いて調製した。

【0048】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＭＤ疾患モデル
ＡＭＤは特発性網膜症であり、確立された動物疾患モデルは利用できない。Ｐｈｅｎｏｃｅｌｌ ＳＡＳ社が開発したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースモデルは、ＳＶｅｃに基づくドライＡＭＤ治療の原理実証を得るために使用された。Ｐｈｅｎｏｃｅｌｌ ＳＡＳが開発したｉｎ ｖｉｔｒｏドライＡＭＤモデルの概要を図２に示す。

【0049】

このモデルは、ミオシン阻害剤ブレッビスタチンで処理した後にＲＰＥ様細胞に分化（成熟）するヒト人工多能性幹細胞に依存している（Maruotti, J., et al. "A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. "Stem cells translational medicine 2.5 (2013)： 341-354; Frank, D. and Vince J. E. "Pyroptosis versus necroptosis: similarities, differences, and crosstalk. "Cell Death & Differentiation 26.1 (2019): 99-114)。

【0050】

この１５日間の成熟段階の後、ＲＰＥ様細胞は網膜光増感剤Ａ２Ｅとさらに１５日間インキュベートされる（Ａ２Ｅ負荷）。Ａ２Ｅはリポフスチンのレチノイド成分であり、ＤＡＭＰとして酸化ストレスを誘導し、細胞内に活性酸素種（ＲＯＳ）を産生させる。

【0051】

ブルーライトを４日間照射すると、活性酸素の発生がさらに促進され、ＲＰＥ様細胞のパイロプトーシスが誘導される。ＲＰＥ様細胞のブルーライト誘導性パイロプトーシスの根底にある炎症過程についての洞察を得るために、３４日目の総ＲＯＳ産生およびパイロプトーシスによる細胞死を測定した。さらに、３４日目に、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γなどの炎症性遺伝子、カスパーゼ１、Ｃ３、ＩＧＦ－１、ＧＦＡＰの発現をＰＣＲまたはＥＬＩＳＡで測定する。

【0052】

ＧＦＰ発現ＳＶ４０ベクターを用いたマウス網膜細胞の効率的かつ長期的遺伝子導入
ＳＶ４０由来のベクターがＣ５７ＢＬ／６マウスの網膜細胞に導入できることを証明するために、クラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＳＶ４０ベクター（ＳＶＧＦＰ）を使用した。ＧＦＰ ｃＤＮＡの発現はＳＶ４０初期プロモーターによって駆動される。ベクター粒子（ベクター・ゲノム、ＶＧ）の投与量は１０^７から１０^８ＶＧの２種類、投与経路は網膜下と硝子体内との２種類を試験した。ベクター投与は片眼で行い、対照眼には同量のＰＢＳを注射した。１ヵ月後、蛍光眼底鏡検査によりＧＦＰ発現を測定した。ＧＦＰの蛍光シグナルは、ＳＶＧＦＰベクターを網膜下腔に投与したマウスの網膜で検出された。このシグナルはマウスの眼球上に広く広がっていた。また、高用量のベクターを硝子体内投与したマウスの網膜ではＧＦＰ蛍光シグナルが検出されたが、低用量のベクターを投与したマウスでは検出されなかった。

【0053】

網膜下腔に高用量のベクターを投与したマウスの網膜におけるＧＦＰ蛍光を、眼底鏡検査で１２ヶ月までモニターした。ＧＦＰ蛍光シグナルは１２ヶ月までのすべての測定で検出された。定性的には、蛍光の広がりと強度は１０ヶ月目まで同程度に維持されていた。実験終了時には、蛍光シグナルの強度はわずかに減少したが、依然として検出可能であった。

【0054】

ＳＶＧＦＰ粒子を網膜下投与または硝子体内投与した後、どの細胞タイプが優先的に標的となったかを調べるため、マウスの眼球を処理して凍結切片を得、共焦点顕微鏡または構造化照明（アポトーム）顕微鏡で評価した。いずれの場合も、組織構造を明らかにするためにＤＡＰＩ染色を用いた。まず、抗ＧＦＰ抗体を用いて、ＧＦＰ蛍光を検出する４８８ｎｍチャンネルで得られたシグナルがＧＦＰタンパク質のシグナルに属することを確認した。マウスの網膜にＧＦＰが存在することが確認された。ＧＦＰシグナルの位置から、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞が主に形質導入されていることが示された。このことは、ＲＰＥ細胞層を標識するＲＰＥ６５タンパク質に対する抗体を用いて確認した。ＧＦＰは視細胞層には見られないことが観察された。しかし、試験した用量では、効率は試験的なものであったが、視細胞とミュラー細胞とはどちらもＳＶＧＦＰで形質導入されやすい。

【0055】

第２に、ＳＶＧＦＰ粒子の硝子体内投与を受けたマウスから得られたスライドも、ＲＰＥ層と視細胞層とを同定するために抗体で単一標識した。ＧＦＰシグナルはＲＰＥ層にも視細胞層にも存在しなかったが、形質導入された細胞の大部分はミクログリアであると思われる。ミクログリアは外核層と内核層内とに広く分布し、神経節細胞層にも近い。ＧＦＰ発現は神経節細胞層の細胞にも見られた。注射したマウスの眼球の網膜電図から、網膜細胞の形質導入はその視覚機能を損なわないことが明らかになった。

【0056】

マウスにおけるＳＶＧＦＰベクターの生体内分布解析
ＳＶＧＦＰ粒子が網膜下あるいは硝子体内投与後、網膜外の他の細胞型に導入可能かどうかを評価するため、異なる組織からゲノムＤＮＡを単離し、ＳＶ４０ゲノムの後期領域の配列に特異的なプライマーを用いてｑＰＣＲを行った。ベクター粒子数の測定に用いたのと同じセットアップを用いた。したがって、鋳型として、脳、腎臓、肺、脾臓、肝臓、目から単離したゲノムＤＮＡを用いた。ＳＶＧＦＰ特異的ＤＮＡ配列は、ベクターを注入した眼球から単離したＤＮＡサンプルでのみ検出できた（図３Ａ）。ＳＶＧＦＰ粒子は、試験した残りの組織から単離したＤＮＡサンプルのいずれにも検出されなかった。網膜下投与群のマウスの脳組織では、ＳＶＧＦＰベクター粒子の存在に有意ではない増加が検出された（図３Ｂ）。しかし、これらのマウスの脳組織から調製した免疫染色スライドのさらなる共焦点解析では、ベクターの存在は確認されなかった（データは示されていない）。

【0057】

抗ＳＶ４０中和抗体の解析
他の遺伝子治療ベクターで観察されたように、ベクター自体に対する中和抗体の存在または誘導は、導入遺伝子の発現レベルを低下させ、結果として体内から導入細胞を排除する可能性がある。そこで、網膜下投与と硝子体内投与との両方において、ＳＶ４０キャプシド成分に対する抗体が検出できるかどうか、またこれらの抗体が中和活性を有するかどうかを検討した。ＶＰ１はＳＶ４０粒子の主要なカプシド蛋白である。まず、ＶＰ１キャプシド蛋白の供給源として、ＳＶＧＦＰを導入したＳｕｐｅｒＶｅｒｏ細胞（Ａｍａｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）のライセートを用いてウェスタンブロットを行った。非形質転換ＳｕｐｅｒＶｅｒｏ細胞をネガティブコントロールとして用いた。ＶＰ１キャプシドタンパク質に対する抗体を含む市販の抗血清を、ＶＰ１の検出のポジティブコントロールとして使用した（図４Ａ、中央のレーン）。ＳｕｐｅｒＶｅｒｏ細胞溶解物を含む膜を、網膜下および眼内ＳＶＧＦＰ投与マウスの両方から採取した血清サンプルとインキュベートしても、ＶＰ１の存在は認められなかった（図４Ａ）。同じ膜をＶＰ１市販血清または抗ＧＡＰＤＨ抗体とインキュベートし、膜にＳｕｐｅｒＶｅｒｏ細胞溶解液のＶＰ１タンパク質が含まれていることを確認した（図４Ｂ）。

【0058】

第２に、中和アッセイをＣＯＳ－１細胞を用いて行った。ＣＯＳ－１細胞は、網膜下および硝子体内ＳＶＧＦＰ投与動物から得た血清の異なる希釈液でプレインキュベートしたＳＶＬｕｃ粒子で１００のＭＯＩで形質導入した（図４Ｃおよび図４Ｄ）。ベクター粒子はまた、未処置の対照マウスから得た血清の希釈液とプレインキュベートした。市販のウサギ抗ＶＰ１血清を用いた中和抗体活性の陽性対照を図４Ｅに示す。ＳＶ４０ベクター粒子をＳＶ４０ベクターで形質導入した動物から得た血清でプレインキュベートしても、ＳＶ４０ベクター粒子の形質導入能の低下は観察されず、ＳＶ４０ベクター粒子が眼内投与後に中和抗体の生成を誘導しないことを示している。

【0059】

標的細胞におけるＳＶ４０メイン・キャプシド・タンパク質ＶＰ１の解析
ウイルス構造タンパク質をコードするＳＶ４０初期遺伝子は、ＳｕｐｅｒＶｅｒｏパッケージング細胞でベクター粒子を産生する間、ウイルスＬａｒｇｅ Ｔ抗原を発現するマカク細胞でのみ発現する（Toscano, M. G., et al. "Generation of a vero-based packaging cell line to produce SV40 gene delivery vectors for use in clinical gene therapy studies. "Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 6 (2017)： 124-134)。ウイルス構造遺伝子が生体内で発現していないことの確認を得るために、ＳＶＧＦＰ投与マウスの眼球におけるＶＰ１キャプシドタンパク質の有無を決定した。ＳＶＧＦＰ導入マウスと非導入マウスの眼およびＳＶＧＦＰを導入したＳｕｐｅｒＶｅｒｏ細胞から得たタンパク質サンプルを対照として用い、ベクター粒子を投与したマウスの眼にＶＰ１キャプシドタンパク質が存在しないことを確認した。ＳＶ４０ベクターによって送達されたトランスジーンタンパク質（この場合はＧＦＰ）のみが、処理されたマウスの眼球からの溶解液中に検出された（図５）。

【0060】

抗炎症性ホスファターゼをコードするＳＶｅｃベクターのＲＰＥ細胞のブルーライト誘発パイロプトーシス抑制能に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ＳＣＤ３９Ｌ４とＳＰＡＬＰとをコードするＳＶｅｃベクターを構築し、それぞれｐＳＶＳＣＤ３９Ｌ４（ｐＡＭ３９６）とｐＳＶＳＰＡＬＰ（ｐＡＭ３９７）とを得た。ヒト多能性幹細胞をｐＳＶＧＦＰ ＤＮＡでヌクレオフェクションし、３０日後に蛍光顕微鏡でＧＦＰ発現を測定した。誘導されたＲＰＥ様細胞は安定したＧＦＰ発現を維持しており、実験セットアップが有効であることを示している。

【0061】

ヒト多能性幹細胞をｐＳＶＧＦＰ ＤＮＡでヌクレオフェクションした。その後、細胞を成熟させ、Ａ２Ｅを負荷し、３０日後にブルーライトを照射した。ヌクレオフェクション後３４日目に、パイロプトーシスによる細胞死を測定した。ケルセチンは細胞をパイロプトーシスから保護し、実験では陽性対照として用いた。Ａ２Ｅ負荷およびブルーライト照射の後、細胞生存率の強い減少が観察された（ビヒクル条件では３２％であったが、Ａ２Ｅ条件では０．０１％まで減少）。生細胞の損失は、ケルセチン処理によって有意に相殺された（１５．５％の生細胞）。

【0062】

ブルーライトを照射しなかった場合、ＲＰＥ様細胞は健全な表現型（９１．７％の生存細胞）を維持したが、ケルセチンを照射すると細胞の生存率は３２．５％まで回復した。次に、ヒト多能性幹細胞をｐＳＶＧＦＰ、ｐＳＶＳＣＤ３９Ｌ４（ｐＡＭ３９６）またはｐＳＶＳＰＡＬＰ（ｐＡＭ３９７）のＤＮＡでヌクレオフェクションした。細胞を成熟させ、Ａ２Ｅを負荷し、ブルーライトを照射し、ヌクレオフェクション後３４日目に活性酸素産生および細胞死を測定した。さらに、炎症マーカーの産生をＰＣＲまたはＥＬＩＳＡで測定した。

【0063】

ｐＳＶＳＰＡＬＰ（ｐＡＭ３９７）ＤＮＡでＲＰＥ様細胞をヌクレオフェクションすると、ブルーライト照射後の細胞の生存率が著しく向上し、３５．２％の生存細胞（ビヒクルレベルをわずかに上回る）が得られ、ケルセチンで処理した細胞（１５％）よりもさらに良好であった（図６）。ヌクレオフェクション後３４日目の活性酸素測定および炎症マーカーの産生測定では、未処理細胞とヌクレオフェクション細胞との間に差は見られなかった（結果は示さず）。全体として、ｐＳＶＣＤ３９Ｌ４ではなくベクターｐＳＶＳＰＡＬＰを含むＲＰＥ様細胞は、ブルーライト曝露後のパイロプトーシスから効果的に保護される。

【0064】

ｐＳＶＳＰＡＬＰのｐＳＶＩＧＦ１との併用は治療効果を高める
ｐＳＶＳＰＡＬＰとｐＳＶＩＧＦ１とのＤＮＡの組み合わせでＲＰＥ様細胞をヌクレオフェクションすると、ヌクレオフェクション後４１日目のブルーライト曝露後の細胞生存率において有意な相乗的レスキューが得られ、４６％の生存細胞（ビヒクル（未処理）対照レベルをわずかに下回る）が得られ、陽性対照であるケルセチンで処理した細胞よりもさらに良好であった（図７）。これらの結果は、細胞生存率のマーカーとして細胞内ＡＴＰを測定する第２のアッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）でも確認できた。ここで、ｐＳＶＳＰＡＬＰとｐＳＶＩＧＦ１との組み合わせは、ｐＳＶＳＰＡＬＰまたはｐＳＶＩＧＦ１単独のヌクレオフェクションを上回った（図８）。全体として、ベクターｐＳＶＳＰＡＬＰ、ｐＳＶＩＧＦ１を含むＲＰＥ様細胞は、ブルーライト曝露後のパイロプトーシスから保護された。しかしながら、ｐＳＶＳＰＡＬＰとｐＳＶＩＧＦ１との両方を投与したＲＰＥ様細胞の細胞培養物は、ｐＳＶＳＰＡＬＰまたはｐＳＶＩＧＦ１を単独で投与した場合よりも、ブルーライト曝露後のパイロプトーシスから有意に良好に保護された。

【0065】

結論
以上のことから、クラゲ緑色蛍光タンパク質（ＳＶＧＦＰ）をコードするＳＶｅｃベクターをマウスの眼内に注射し、網膜にＧＦＰを発現させ、投与後１年までモニターした結果、副作用または視力低下を起こすことなく、神経節細胞およびミクログリアに効率よく導入されることが示された。分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＶＳＰＡＬＰ）をコードするＳＶｅｃベクターが、ブルーライト照射後のパイロプトーシスからＲＰＥ様細胞を効果的に保護することが示された。この保護は、ＲＰＥ様細胞から放出されたＳＰＡＬＰが、炎症を起こした細胞から放出されたＡＴＰを不活性代謝産物ＡＤＰおよびＡＭＰに変換することに基づくと考えられる。

【0066】

以上の実験結果を総合すると、ＳＶｅｃベクターは眼科疾患の治療において非常に有望な遺伝子送達ベクターであることがわかる。加えて、ＳＶＳＰＡＬＰは網膜の炎症を効果的に止め、ＡＭＤだけでなく、緑内障、ＤＲ、その他の局所組織の炎症を伴う自己免疫疾患を治療するのに非常に有望なベクターである。

【0067】

上記に加えて、ＳＰＡＬＰ（ＳＶＳＰＡＬＰ）と呼ばれるヒトＰＡＬＰの可溶型をコードする複製欠損ＳＶ４０遺伝子送達ベクターが、ＡＴＰ曝露後のＶｅｒｏ細胞をパイロプトーシスから効果的に保護することが見出された。さらに、ＳＶＳＰＡＬＰによってコードされるＳＰＡＬＰを発現する網膜色素上皮細胞は、ブルーライト誘発性パイロプトーシスから保護される。このベクターはさらに、加齢黄斑変性、非アルコール性脂肪性肝炎、関節炎、喘息のマウスモデルで使用され、炎症を止め、病気の進行を防いだ。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】