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特表2025-505477胆管細胞癌を効果的に殺傷するＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞技術

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-28

(54)【発明の名称】胆管細胞癌を効果的に殺傷するＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞技術

(51)【国際特許分類】

C07K 19/00 20060101AFI20250220BHJP

C07K 16/28 20060101ALI20250220BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20250220BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20250220BHJP

C12N 15/62 20060101ALI20250220BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20250220BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20250220BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20250220BHJP

A61K 35/17 20250101ALI20250220BHJP

A61K 47/68 20170101ALI20250220BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20250220BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20250220BHJP

A61P 37/04 20060101ALI20250220BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N15/62 Z

A61P35/00

A61P1/16

A61K35/76

A61K35/17

A61K47/68

A61K39/395 T

A61K48/00

A61P37/04

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023569753

(86)(22)【出願日】2023-03-16

(85)【翻訳文提出日】2023-11-09

(86)【国際出願番号】 CN2023081894

(87)【国際公開番号】W WO2024152435

(87)【国際公開日】2024-07-25

(31)【優先権主張番号】202310087774.1

(32)【優先日】2023-01-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523185822

【氏名又は名称】北京基因▲啓▼明生物科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110001896

【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】▲閭▼ ▲軍▼

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼ 祥▲賀▼

(72)【発明者】

【氏名】▲馮▼ ▲紀▼▲開▼

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA89X

4B065AA89Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC16

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA751

4C084ZB021

4C084ZB091

4C084ZB261

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB01

4C085BB11

4C085BB12

4C085BB50

4C085CC03

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BC83

4C087CA12

4C087CA16

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA75

4C087ZB02

4C087ZB09

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045FA74

(57)【要約】

本願は、ＭＳＬＮを含むキメラ抗原受容体、該キメラ抗原受容体が形質導入されたｉＮＫＴ細胞、及び肝癌、特に胆管細胞癌の作製におけるそれらの使用を提供する。本願では、ｉＮＫＴ細胞が肝臓にホーミング・定着できるという特性を利用して、適切なＭＳＬＮ抗体配列を選択することで、高い腫瘍殺傷効率及び速いＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞増殖速度を実現し、Ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、肝臓腫瘍の部位まで効果的に浸潤することができ、治療効果を極めて高くし、再発を減少し、毒性・副作用を軽減する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

順次連結されている、ＭＳＬＮ一本鎖抗体、スペーサードメイン又はヒンジ領域、膜貫通領域、細胞内共刺激ドメイン、シグナル領域を含むことを特徴とするキメラ抗原受容体。

【請求項2】

順次連結されている、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＭＳＬＮ一本鎖抗体、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル領域を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記ＭＳＬＮ一本鎖抗体のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．８、１０、１２から選択される、請求項１又は２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記ＭＳＬＮ一本鎖抗体のヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．９、１１、１３から選択される、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記ＭＳＬＮ一本鎖抗体のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．８である、請求項３又は４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記ＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．２であり、ＣＤ８αヒンジ領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１４であり、ＣＤ２８膜貫通領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．４であり、ＣＤ２８共刺激ドメインのアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．６であり、ＣＤ３ζシグナル領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１６である、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記ＣＤ８αシグナルペプチドのヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．３であり、ＣＤ８αヒンジ領域のヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１５であり、ＣＤ２８膜貫通領域のヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．５であり、ＣＤ２８共刺激ドメインのヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．７であり、ＣＤ３ζシグナル領域のヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１７である、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１８、２０、２２から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

前記キメラ抗原受容体のヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９、２１、２３から選択される、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体を担持するベクター。

【請求項11】

前記ベクターはｐＬＶ３００であり、そのヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．２４である、請求項１０に記載のベクター。

【請求項12】

請求項１～９のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体を形質導入した免疫細胞。

【請求項13】

前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はｉＮＫＴ細胞である、請求項１２に記載の免疫細胞。

【請求項14】

前記免疫細胞はｉＮＫＴ細胞である、請求項１２に記載の免疫細胞。

【請求項15】

癌治療薬の製造における請求項１～１４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体、ベクター又は免疫細胞の使用。

【請求項16】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体、ベクター又は免疫細胞を用いることを特徴とする癌治療方法。

【請求項17】

前記癌は、ＭＳＬＮ過剰発現癌である、請求項１５に記載の使用又は請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記癌は肝臓癌である、請求項１７に記載の使用又は方法。

【請求項19】

前記癌は胆管細胞癌である、請求項１８に記載の使用又は方法。

【請求項20】

請求項１０又は１１に記載のベクターを含む形質導入システム。

【請求項21】

前記形質導入システムは、ウイルス形質導入システム及び非ウイルス形質導入システムである、請求項２０に記載の形質導入システム。

【請求項22】

前記形質導入システムは、レンチウイルス形質導入システムである、請求項２１に記載の形質導入システム。

【請求項23】

前記癌はＭＳＬＮ過剰発現癌である、請求項１６に記載の方法。

【請求項24】

前記癌は肝臓癌である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記癌は胆管細胞癌である、請求項２４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２３年１月２０日に中国特許庁に提出された、出願番号２０２３１００８７７７４．１、発明名称が「胆管細胞癌を効果的に殺傷するＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞技術」である中国特許出願の優先権を主張しており、その全ての内容は引用によって本明細書に組み込まれている。

【0002】

［技術分野］
本願は、癌免疫療法の分野に属する。具体的には、本願は、ＭＳＬＮを含むキメラ抗原受容体、該キメラ抗原受容体が形質導入されたｉＮＫＴ細胞、及び肝癌、特に胆管細胞癌の作製におけるそれらの使用を提供する。

【背景技術】

【0003】

ＷＨＯの統計によると、２０２０年に、全世界で新たに増加した肝臓癌は９０万^[1]、中国で新たに増加した肝臓癌の病例は４１万^[2]で、全世界の肝臓癌の発病数の４５％を占め、２０２０年、全世界の肝臓癌による死亡は８３万^[1]、中国の肝臓癌による死亡例は３９万^[2]で、全世界の肝臓癌による死亡数の４６％を占めた。胆管細胞癌は肝癌総数の約１０％を占める^[3]。

【0004】

胆管癌は、肝内や肝外の胆管上皮層で発生する腫瘍の１種である。胆管癌は、早期発見が困難で、診断後の予後が悪く、５年生存率が１０％しかない^[4]。診断後の胆管癌患者のうち約３分の１のみが手術治療に適している^[5]。胆管癌の治療方法には、手術による腫瘍切除、肝移植、放射線治療、化学療法、局部治療、分子標的治療、免疫治療が含まれる^[6]。現在の治療手段は、臨床の要求を満たすことができず、胆管細胞癌には、より安全で有効な治療手段が急務となっている。

【0005】

キメラ抗原受容体技術は、血液腫瘍の治療に顕著な治療効果が得られ、Ｋｙｍｒｉａｈ^[7]とＹｅｓｃａｒｔａ^[8]は２０１７年にＦＤＡからＢ細胞急性リンパ白血病、びまん性大Ｂリンパ腫の治療に用いられることが承認された。中国でも２０２１年６月に血液腫瘍治療用として初めてのキメラ抗原受容体細胞製品が承認された^[9]。

【0006】

Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（ＭＳＬＮ）は、細胞膜の表面に発現するグリコシルホスファチジルイノシトールタンパク質であり、正常な生理条件では、男性の胸膜、腹膜、心膜や鞘膜に発現し、卵巣、卵管や精巣の上皮層に低発現である^[10]。ヒトＭＳＬＮ遺伝子は、１６番染色体に位置し、約７１ｋＤａの分子量を有する６２８個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質をコードする^[14]。ＭＳＬＮ前駆体タンパクは、Ａｒｇ２９５でスプライシングされ、Ｎ末端可溶性タンパク質巨核球増強因子（ＭＰＦ）及び細胞膜表面に結合したグリコシルホスファチジルイノシトールがアンカーするＭＳＬＮになった^[20]。

【0007】

正常な場合、中皮細胞に限られて発現するのに対し、悪性中皮腫^[11]、卵巣癌^[12]、三陰乳癌^[13]、前立腺癌^[14]、肺癌^[15]、胃癌^[16]、子宮内膜癌^[17]、子宮頸癌^[18]、胆管癌^[19]などを含む多種の腫瘍中で、ＭＳＬＮは過剰発現されており、キメラ抗原受容体技術による標的治療に好適な標的である。

【0008】

不変ナチュラルキラーＴ細胞（ｉｎｖａｒｉａｎｔｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒＴｃｅｌｌ、ｉＮＫＴ）は、胸腺由来Ｔ細胞のユニークなサブセットであり、ＣＤ１ｄ制限性を持ち、Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌ、ＮＫ）の両方の系統に特徴的な表面受容体を発現しており、Ｔ細胞とＮＫ細胞に共通の生物学的特徴と、先天的免疫と養子免疫を橋渡しするという重要な役割を持っている。ヒトｉＮＫＴ細胞において、Ｖα２４－Ｊα１８はＴＣＲα鎖を形成した後、Ｖβ１１ＴＣＲβ鎖とＴＣＲを形成する^[21]。

【0009】

ｉＮＫＴ細胞は、胸腺において、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞のサブセットに類似した少なくとも３つのエフェクターサブセットに分化し、先天的リンパ球（ＩＬＣｓ）のサブセットにも類似することがある^[22-24]。機能性ｉＮＫＴ細胞サブセットは、異なる細胞表面マーカーと特徴的な転写因子の発現によって区別される。ＮＫＴ１細胞は、どちらも転写因子Ｔ－ｂｅｔを高発現し、活性化後にＩＦＮ－γを分泌することから、Ｔｈ１細胞やＩＬＣ１ｓに類似している。ＮＫＴ１細胞もまた、他のｉＮＫＴ細胞サブセットよりも大きな細胞毒性機能を示した。ＮＫＴ１細胞がＴｈ１細胞やＩＬＣ１ｓと異なる点は、ＴＣＲ活性化によりＩＦＮ－γを産生するほか、ＩＬ－４などの因子を産生し得ることにある。ＮＫＴ２細胞から分泌されるサイトカインには、Ｔｈ２細胞と同様にＩＬ－４及びＩＬ－１３が含まれる。一方、ＮＫＴ１７細胞はサイトカイン分泌においてＴｈ１７細胞と類似している^[25-27]。

【0010】

異なるｉＮＫＴ細胞サブセットは異なる組織で濃縮されている。ＮＫＴ１細胞は肝臓の中で高度に濃縮され、一方、ＮＫＴ１７細胞は主にリンパ節、皮膚や肺に位置し、脾臓にも少量の細胞がある^[28]。ＮＫＴ２細胞は肺や脾臓を含む複数の部位に存在するが、腸間膜リンパ節に特に豊富である^[28]。周囲リンパ節において、ｉＮＫＴ細胞は迅速に活性化され、病原体との闘いにおいて重要な役割を果たすことができる^[29]。

【0011】

ＮＫＴ細胞の免疫治療についての研究を開始するのが遅く、体内のＮＫＴ細胞の含有量が低く、その特異性抗体の選択が制限されており、現在、ＧＤ２、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４及びＢＣＭＡに対する抗体の設計についての研究しかなく、参考にできる特異性抗体の種類が少なく、選択も設計も困難である。

【0012】

本特許に近い豪国特許出願公開第２０２０２６４３４３号明細書、中国特許出願公開第１１２５７４９５３号明細書では、Ｔ細胞は、ＭＳＬＮ抗原に対するキメラ受容体を発現するように遺伝子改変されており、ここで、ＣＡＲは、ＭＳＬＮ抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、ＭＳＬＮ抗原を持つ癌細胞に対して殺傷作用を示す。しかし、普通のＴ細胞は固形腫瘍に有効に浸潤できないことから、固形腫瘍の腫瘍微小環境では、酸素が不足しており、比較的酸性であり、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖や長期的な生存に非常に不利であるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果が深刻な影響をうけてしまう。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

以上の問題に対して、本出願者は、ｉＮＫＴ細胞の肝臓へのホーミングの特性及び非特異的な殺傷機能を利用して、遺伝子改変を通じてＭＳＬＮ抗原と結合できるキメラ抗原受容体をｉＮＫＴ細胞に持たせ、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞がＭＳＬＮ抗原を持つ胆管癌
の細胞を特異的に殺傷できるようにし、また、異なるｓｃＦｖで構成されたＣＡＲ分子を比較して、癌細胞の表面のＭＳＬＮ抗原と結合し、癌細胞を殺傷するのに有利なＣＡＲ分子を選別した。具体的には、下記通りである。

【0014】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子にＭＳＬＮに特異的なｓｃＦｖを導入し、胆管癌の細胞に特異的に発現するＭＳＬＮ抗原に特異的に結合させるとともに、ＣＡＲ分子に共刺激分子ＣＤ２８細胞内シグナルドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナルドメインを導入することにより、ｉＮＫＴ細胞が増殖して、ＩＦＮ－γ、グラニュラーゼなどを分泌し、癌細胞を殺傷するようにｉＮＫＴ細胞を刺激することができ、ＭＳＬＮ抗原を発現する癌細胞に対する異なるｓｃＦｖで構成されるＣＡＲ分子の殺傷効果を比較することによって、抗癌効果のより高いＣＡＲ分子を選択した。

【0015】

本発明者らは、創造的な労力を払って、アミノ酸配列の設計及び配列の組み合わせとスクリーニングを繰り返して、約数十本のＣＡＲ分子配列に対して無作為スクリーニング試験及び標的性機能検証（例えば、ウイルスベクターを構築し、さらにｉＮＫＴ細胞に感染し、改変ｉＮＫＴ細胞を得、得られた改変ｉＮＫＴ細胞の生体外の殺傷活性を測定するなどの試験）を行い、その後、複数の無作為な組み合わせの結果に基づいてアライメントし、さらに配列を調整し、最終的に、最も効果の高い配列を選別し、本願のヒトＭＳＬＮタンパク質を標的とする力価の高い抗ヒトＭＳＬＮ一本鎖抗体キメラ抗原受容体の配列及びその機能性バリアントを得た。

【課題を解決するための手段】

【0016】

一態様では、本願は、順次連結されている、ＭＳＬＮ一本鎖抗体、スペーサードメイン又はヒンジ領域、膜貫通領域、細胞内共刺激ドメイン、シグナル領域を含むことを特徴とするキメラ抗原受容体を提供する。

【0017】

任意に、前記キメラ抗原受容体は、順次連結されている、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＭＳＬＮ一本鎖抗体、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル領域を含む。

【0018】

任意に、前記ＭＳＬＮ一本鎖抗体のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．８、１０、１２から選択される。

【0019】

任意に、前記ＭＳＬＮ一本鎖抗体のヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．９、１１、１３から選択される。

【0020】

任意に、前記ＭＳＬＮ一本鎖抗体のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．８である。

【0021】

任意に、前記ＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．２であり、ＣＤ８αヒンジ領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１４であり、ＣＤ２８膜貫通領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．４であり、ＣＤ２８共刺激ドメインのアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．６であり、ＣＤ３ζシグナル領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１６である。

【0022】

任意に、前記ＣＤ８αシグナルペプチドのヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．３であり、ＣＤ８αヒンジ領域のヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１５であり、ＣＤ２８膜貫通領域のヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．５であり、ＣＤ２８共刺激ドメインのヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．７であり、ＣＤ３ζシグナル領域のヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１７である。

【0023】

任意に、前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１８、２０、２２から選択される。

【0024】

任意に、前記キメラ抗原受容体のヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９、２１、２３から選択される。

【0025】

別の態様では、本願は、上記キメラ抗原受容体を担持するベクター、任意に、ｐＬＶ３００ベクターを提供する。

【0026】

任意に、前記ｐＬＶ３００ベクターは、そのヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．２４である。

【0027】

別の態様では、本願は、上記キメラ抗原受容体が形質導入された免疫細胞を提供する。

【0028】

任意に、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はｉＮＫＴ細胞である。

【0029】

任意に、前記免疫細胞は、ｉＮＫＴ細胞である。

【0030】

別の態様では、本願は、癌治療薬の製造における上記キメラ抗原受容体、ベクター又は免疫細胞の使用を提供する。

【0031】

別の態様では、本願は、上記キメラ抗原受容体、ベクター又は免疫細胞を用いることを特徴とする癌治療方法を提供する。

【0032】

任意に、前記癌はＭＳＬＮ過剰発現癌である。

【0033】

任意に、前記癌は肝臓癌である。

【0034】

任意に、前記癌は胆管細胞癌である。

【0035】

別の態様では、本願は、上記の発現ベクターを含む形質導入システムを提供する。

【0036】

任意に、前記形質導入システムは、ウイルス形質導入システム及び非ウイルス形質導入システムである。

【0037】

任意に、前記形質導入システムは、レンチウイルス形質導入システムである。

【0038】

本願は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞の表面に発現するキメラ抗原受容体タンパク質を構築するために同時に使用するための、上記の１つ又は複数の要素を含む核酸発現ベクターを含む。必要に応じて種々の市販のベクターを選択してもよいし、分子生物学分野の従来技術に基づいてベクターを構築してもよい。１つの具体的な実施形態において、本願で使用されるベクターは、レンチウイルスプラスミドベクターのｐＬＶ３００ベクターである。このプラスミドは、第４世代の自己不活化レンチウイルスベクターシステムに属し、このシステムには、４つのプラスミド、すなわちＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質をコードするパッケージングプラスミド、Ｒｅｖタンパク質をコードするパッケージングプラスミド、ＶＳＶ－Ｇタンパク質をコードするエンベローププラスミド、及び目的の核酸配列、すなわちキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸配列を組み換え導入するために使用することができる空のｐＬＶ３００ベクターがある。キメラ抗原受容体タンパク質の発現は、ｐＧＫ－３００プロモーターによりｐＬＶ３００ベクター中で調節される。

【0039】

本願は、上記ベクターを含むウイルスであって、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどを含むが、これらに限定されないウイルスを含む。本願のウイルスには、パッケージングされた感染力を有するウイルスが含まれ、また、感染力を有するウイルスとしてパッケージングされるのに必要な成分を含むパッケージング対象ウイルスも含まれる。Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞をトランスフェクションする本分野で知られている他のウイルス及びそれに対応するプラスミドベクターもまた、本願に使用することができる。本願の一実施形態において、前記ウイルスは、上記のｐＬＶ３００－ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ＣＡＲ組換えベクターを含むレンチウイルスである。

【0040】

本願は、本願の核酸、又は該核酸を含有する前記組換えプラスミドを含む本願の上記組換えプラスミド、又は該プラスミドを含むウイルスシステムが導入された、トランスジェニックＴリンパ球、ＮＫ細胞、又はｉＮＫＴ細胞を含む。非ウイルス導入方法及びウイルス導入方法を含む、本分野の従来の核酸導入方法は、本願に使用することができる。非ウイルスに基づく導入方法には、エレクトロポレーション法とトランスポゾン法とが含まれる。最近、Ａｍａｘａ社が研究開発したｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ核トランスフェクション装置は直接外来遺伝子を細胞核に導入することで、目的遺伝子の高効率な形質導入を達成させることができる。また、眠り姫トランスポゾン（ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙｓｙｓｔｅｍ）やＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンなどのトランスポゾンシステムによる形質導入効率が普通のエレクトロポレーションよりも大幅に向上しており、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒトランスフェクション装置とＳＢトランスポゾンシステムの併用が既に報告されており、この方法は、高い形質導入効率に加えて、目的遺伝子の特定の部位への組み込みを実現することができる。本願の一実施形態では、キメラ抗原受容体遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞を実現するための形質導入方法は、レンチウイルスに基づく形質導入方法である。この方法は、形質導入効率が高く、外来遺伝子が安定的に発現でき、臨床レベルの数までｉＮＫＴリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏ培養するのに必要な時間を短縮できるなどの利点がある。レンチウイルストランスフェクションにより導入した核酸は、転写や翻訳によりｉＮＫＴ細胞膜表面に発現する。種々の異なる培養腫瘍細胞についてｉｎｖｉｔｒｏでの細胞傷害性実験を行った結果、本願のキメラ抗原受容体を表面に発現させたトランスジェニックｉＮＫＴ細胞には、高度に特異的な腫瘍細胞殺傷効果がある（細胞傷害性とも呼ばれる）。このため、キメラ抗原受容体タンパク質をコードする本願の核酸、該核酸を含むプラスミド、該プラスミドを含むウイルス、及び上記核酸、プラスミド又はウイルスがトランスフェクションされたトランスジェニックｉＮＫＴ細胞、Ｔリンパ球又はＮＫ細胞は、腫瘍の免疫療法に有効に用いられることができる。

【0041】

本願の核酸は、ＤＮＡ形態又はＲＮＡ形態であってもよい。このＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は人工的に合成されたＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖又は非コード鎖であってもよい。キメラ抗原受容体タンパク質のアミノ酸配列をコードする本願の核酸コドンは縮退可能であり、すなわち、同一のアミノ酸配列をコードする複数の縮退核酸配列は本願の範囲内に含まれる。対応するアミノ酸をコードする縮退核酸コドンは、本分野で公知のものである。本願はまた、本願と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はポリペプチドのフラグメント、アナログ及び誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。このポリヌクレオチドの変異体は、天然に発生する等位変異体であってもよいし、天然に発生しない変異体であってもよい。これらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体、及び挿入変異体を含む。本分野で知られているように、等位変異体は、ポリヌクレオチドの置換形態であり、１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入であってもよいが、それがコードするポリペプチドの機能を実質的に変化させることはない。

【0042】

前記ＭＳＬＮ過剰発現癌には、悪性中皮腫、卵巣癌、三陰乳癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胆管癌などが含まれるが、これらに限定されない。

【0043】

前記ＭＳＬＮ過剰発現とは、分子レベル、タンパク質レベルを含むがこれに限定されない種々の検出方法で検出されたＭＳＬＮ関連核酸又はタンパク質の含有量、又は他の指標が正常レベルよりも高い場合をいう。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ構造の構造概略図である。

【図2】ｐＬＶ３００レンチウイルスベクターの構造概略図である。

【図3】ｉＮＫＴの総細胞の増殖曲線である。

【図4】ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞培養の異なる時間におけるＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞亜群の割合である。

【図5】ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞培養の異なる時間におけるＣＤ４＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞亜群の割合である。

【図6】ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞培養の異なる時間におけるＣＤ４－ＣＤ８－ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞亜群の割合である。

【図7】様々なエフェクター・ターゲット比におけるａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ－ｉＮＫＴの胆管癌細胞ＫＭＣＨに対する殺傷効果である。

【図8】ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞と胆管癌細胞ＫＭＣＨの共培養２４時間後の細胞培養上清中のＩＦＮ－γ含有量である。

【図9】ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞と胆管癌細胞ＫＭＣＨの共培養２４時間後の細胞培養上清中のＩＬ－２含有量である。

【発明を実施するための形態】

【0045】

実施例１キメラ抗原受容体分子を含むレンチウイルスの製造
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を継代し、細胞が６０％～７０％コンフルエンスまで増殖した後、ＣＡＲ分子を含む発現ベクターをパッケージングプラスミドと共にｐＥＩ試薬を用いてＨＥＫ－２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション４時間後に新鮮な培地を交換した。トランスフェクション４８～７２時間後に、細胞培養上清を採取した。上清を超遠心分離することにより、パッケージング後にＣＡＲ分子を含むレンチウイルスを濃縮した。濃縮後のレンタウイルスについてウイルスの力価を測定し、使用時まで－８０℃で凍結保存した。

【0046】

実施例２ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ分子による総ｉＮＫＴ細胞増殖及びＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞分化への影響
ａｎｔｉ－ｉＮＫＴｍｉｒｃｒｏｂｅａｄｓでヒト末梢血単核細胞からｉＮＫＴ細胞を分離した後、２４ウェルプレートに１ウェル当たり２ｘ１０⁵細胞を接種し、１ウェル当たりＸ－ＶＩＶＯ完全培地（１００ＩＵ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌａ－Ｇａｌｃｅｒを含む）を加えて４８時間培養した後、各ウェルから細胞を収集し、４００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた後、新鮮なＸ－ＶＩＶＯ完全培地を加えて再懸濁させた後、２４ウェルプレートに再接種し、各ウェルあたり細胞にａｎｔｉ－ＭＳＬＮ１ＣＡＲ、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ２ＣＡＲ、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ３ＣＡＲを含む異なるレンチウイルスをそれぞれ加えて感染させた。２４時間後、各ウェルの細胞を遠心分離管に収集し、４００ｘｇで５分間遠心分離した後、カウントし、５×１０⁵ｃｅｌｌｓ/ｍｌで新鮮なＸ－ＶＩＶＯ完全培地を加えて培養し、４８時間ごとに液を交換した。それぞれｄａｙ７、ｄａｙ１４、ｄａｙ２１まで培養すると、サンプリングして、それぞれカウント及びフローサイトメトリー検出を行い、それによってキメラ抗原受容体分子の発現を明らかにした。

【0047】

その結果、各ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ分子はｉＮＫＴ細胞の増殖と分化に影響があり、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ１ＣＡＲ、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ２ＣＡＲがｉＮＫＴ細胞に形質導入されると、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ３ＣＡＲ分子よりも細胞の成長に有利となり（図３）、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ１ＣＡＲ、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ２ＣＡＲがｉＮＫＴ細胞に形質導入されると、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ３ＣＡＲ分子よりもＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞への分化に有利となる（図４～６）。

【0048】

実施例３ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍殺傷能力に対する各ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ分子の影響
各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を２１日目まで培養したときに、エフェクター細胞とターゲット細胞の比がそれぞれ１：３、１：１、３：１で、各群から０．３３×１０⁵ ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、１×１０⁵ ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、３×１０⁵ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、１×１０⁵ＫＭＣＨ細胞（ＫＭＣＨは、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ発現陽性の胆管癌細胞系である。蛍光染料ＣＦＳＥと均一に混合して１０分間培養）をそれぞれ用いて６時間共培養した後、各群の培養上清を取り、マイクロプレートリーダーで上清中の蛍光強度（ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺傷能力が強いほど、ＫＭＣＨ細胞内から放出されたＣＦＳＥが多く、蛍光強度が大きい）を検出し、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺傷効率を計算した（図７）。その結果、３種類のａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞はすべてＫＭＣＨ細胞を有効に殺傷できるが、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ１ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺傷能力が最も強いことが分かった。

【0049】

実施例４各ａｎｔｉ－ＭＳＬＮＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞がＭＳＬＮ発現ＫＭＨＣ細胞と共培養した後に分泌したＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の比較
各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を２１日目まで培養した後、エフェクター細胞とターゲット細胞の比が３：１となるように、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（群ごとに３×１０⁵ ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞）をそれぞれ１×１０⁵ ＫＭＨＣ細胞とともに０．５ｍｌＸ－ＶＩＶＯ（ＩＬ－２及びａ－ＧａｌＣｅｒを含まない）で２４時間共培養後、細胞を収集し、４００ｘｇで５分間遠心分離して上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により上清中のＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の含有量を検出した。その結果、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ１ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２を分泌する能力が最も強く、これは、ａｎｔｉ－ＭＳＬＮ１ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の強い増殖能力や腫瘍に対する殺傷能力と一致した（図８～９）。

【0050】

もちろん、本願の上記の実施例は、本願を明確に説明するための例示にすぎず、本願の実施形態を限定するものではない。当業者にとっては、上記の説明に基づいて、さらに他の様々な形態の変化や変更を行うことができる。ここでは、すべての実施形態を網羅する必要はなく、また、網羅することもできない。本願に属する思想からの明らかな変化や変更は、なお、本願の特許範囲に含まれるものとする。

【0051】

参照文献：