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特表2025-505538アレルギー性喘息の治療および／または予防のためのスーパーオキシドジスムターゼの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-28
(54)【発明の名称】アレルギー性喘息の治療および／または予防のためのスーパーオキシドジスムターゼの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/44 20060101AFI20250220BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20250220BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20250220BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250220BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250220BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20250220BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20250220BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20250220BHJP
A61K 31/137 20060101ALI20250220BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20250220BHJP
【ＦＩ】
A61K38/44
A61P11/06
A61P37/08
A61P43/00 121
A61K45/00
A61P43/00 111
A61K9/12
A61K9/20
A61K47/42
A61K31/137
A61K47/36
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024544853
(86)(22)【出願日】2022-02-21
(85)【翻訳文提出日】2024-09-04
(86)【国際出願番号】 IB2022000094
(87)【国際公開番号】W WO2023156805
(87)【国際公開日】2023-08-24
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524280315
【氏名又は名称】アイソセル エス．エー．エス
【氏名又は名称原語表記】ＩＳＯＣＥＬＬ Ｓ．Ａ．Ｓ．
【住所又は居所原語表記】５３ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ ｄｕ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍａｒｔｉａｌ Ｖａｌｉｎ ７５０１５ Ｐａｒｉｓ （ＦＲ）
(74)【代理人】
【識別番号】110003487
【氏名又は名称】弁理士法人東海特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】インテス，ローラン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA24
4C076AA36
4C076BB01
4C076CC07
4C076CC15
4C076EE30
4C076EE41
4C076FF70
4C084AA02
4C084AA19
4C084CA13
4C084DC24
4C084MA13
4C084MA52
4C084NA14
4C084ZA61
4C084ZB13
4C084ZC41
4C084ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA10
4C206MA01
4C206MA02
4C206MA04
4C206MA33
4C206MA72
4C206NA14
4C206ZA61
4C206ZB13
4C206ZC41
4C206ZC75
(57)【要約】
哺乳類におけるアレルギー性喘息の治療および／または予防のためのスーパーオキシドジスムターゼの使用であり、当該スーパーオキシドジスムターゼは、単独で経口投与されるか、または任意で、少なくとも１つのβ２アドレナリン受容体アゴニストを含むエアロゾル調製物の投与と組み合わせて投与される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳類におけるアレルギー性喘息の治療および／または予防のためのスーパーオキシドジスムターゼの使用であて、前記スーパーオキシドジスムターゼは、単独で経口投与されるか、または任意で、少なくとも１つのβ２アドレナリン受容体アゴニストを含むエアロゾル調製物の投与と組み合わせて投与される、使用。
【請求項2】
前記哺乳類は、ヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記スーパーオキシドジスムターゼは、非相同スーパーオキシドジスムターゼ、好ましくは植物由来スーパーオキシドジスムターゼである、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項4】
前記植物由来スーパーオキシドジスムターゼは、メロンスーパーオキシドジスムターゼ、および小麦スーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項5】
前記スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、プロラミンと組み合わせた植物由来のスーパーオキシドジスムターゼを含む固形調製物からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項6】
前記スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、グリアジンと組み合わせた植物由来のスーパーオキシドジスムターゼを含む固形調製物からなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項7】
前記スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、以下含む固形調製物からなる、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用：ａ）前記固形調製物の総重量に対して、０．５０％～５．００％の標準化された力価のスーパーオキシドジスムターゼを含む乾燥メロンジュース由来の抽出物；
ｂ）前記調製物の総重量に対して、１．５０％～５．００％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）前記スーパーオキシドジスムターゼは、１～５ＩＵ／ｍｇの酵素活性を有すること。
【請求項8】
前記スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、以下からなる固形調製物からなる、請求項７に記載の使用：ａ）前記固形調製物の総重量に対して、１．３３％の標準化された力価のスーパーオキシドジスムターゼを含む乾燥メロンジュース由来の抽出物；
ｂ）前記調製物の総重量に対して、３．３３％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）前記スーパーオキシドジスムターゼは、１．５Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
【請求項9】
前記スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、以下含む固形調製物からなる、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用：ａ）前記調製物の総重量に対して、０．０４％～０．４０％の小麦由来スーパーオキシドジスムターゼ；
ｂ）前記調製物の総重量に対して、１．５０％～５．００％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）前記スーパーオキシドジスムターゼは、１～１０Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
【請求項10】
前記スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、以下を含む固形調製物からなる、請求項９に記載の使用：ａ）前記調製物の総重量に対して、０．１８％の小麦由来スーパーオキシドジスムターゼ；
ｂ）前記調製物の総重量に対して、３．５０％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）前記スーパーオキシドジスムターゼは、４．５Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
【請求項11】
前記スーパーオキシドジスムターゼは、１日当たり１００ｍｇ～２０００ｍｇの量で、最低１５日間連続してヒトに経口投与される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項12】
前記スーパーオキシドジスムターゼは、１日当たり５００ｍｇの量で、最短１５日間、および最長１８０日間連続してヒトに経口投与される、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
前記少なくとも１つのβ２アドレナリン受容体アゴニストは、ビトルテロール、フェノテロール、イソプレナリン、レボサルブタモール、オルシプレナリン、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、サルブタモール、およびテルブタリンからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項14】
前記少なくとも１つのβ２アドレナリン受容体アゴニストは、サルブタモールである、請求項１に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アレルギー性喘息の治療および／または予防におけるスーパーオキシドジスムターゼの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
スーパーオキシドジスムターゼ（Ｅ．Ｃｌ．１５．１．１．）は略してＳＯＤとも呼ばれ、スーパーオキシド（０２－）アニオンの不均化に関与する普遍的な金属酵素のファミリーを含む。生体内でのスーパーオキシドラジカル種の蓄積、または過剰な生成は、ほとんどの生物にとって有害である。このような状態が生じた生理学的状態は酸化ストレスとして知られており、多くの代謝障害と関連しており、それ自体が発癌、動脈硬化、老化、およびセリアック病などの炎症性疾患など、さまざまな病理学的プロセスに関与している。進化の程度または細胞内局在とは別に、ＳＯＤは分子内に含まれる金属イオンによって区別される３つの主な形態、すなわち銅亜鉛またはＣｕＺｎ－ＳＯＤ、マンガンまたはＭｎ－ＳＯＤ、および鉄またはＦｅ－ＳＯＤで存在する。ＣｕＺｎ－ＳＯＤおよびＭｎ－ＳＯＤは、植物のペルオキシソームまたは葉緑体などのより特殊な細胞構造にも見られるが、哺乳類では、細胞外ＣｕＺｎ－ＳＯＤまたはＥｃ－ＳＯＤが細胞外区画に特異的に存在している。多くの実験により、すべてのＳＯＤが同じ基本的な抗ラジカル活性を持っているとしても、特定の治療適応症および標的生物に関して、それらの有効な生物学的活性は同一ではないことが示されている。これは、相同ＳＯＤと非相同ＳＯＤの活性の違いに関しても当てはまることが示されている。本明細書において、「相同ＳＯＤ」という表現は、調査対象の種の細胞によって天然に生成されるＳＯＤを指す。「非相同ＳＯＤ」という表現は、調査対象の種とは異なる種によって生成されるか、または異なる種に由来する、外来起源のＳＯＤを指す。例えば、ラットのカラギーナンまたはアドリアマイシンによって誘発された足の浮腫における相同ＳＯＤの抗炎症活性は、非相同起源のＳＯＤの抗炎症活性と比較して機能的ではない。相同ＳＯＤの有効性は、活性部位に存在する金属の種類または酵素全体の分子量ではなく、酵素のアミノ酸の、たとえ微妙な変化であっても、その変化に依存するようである。
【0003】
ＳＯＤを投与する一般的な方法は経口投与であり、多くの場合、固形剤形調製物として調製され、錠剤または摂取可能なカプセルとして提供されます。しかし、ＳＯＤの経口投与は、ＳＯＤが消化管内で急速に分解され、そうして生物学的利用能と有効性が低下するという問題が生じる可能性があります。この問題は、ＳＯＤが最も効果を発揮する特定の細胞位置にＳＯＤを届けるのが難しいことでさらに複雑になる。経口投与されたＳＯＤの体内消化安定性の問題に対処する既知の商業的開発の１つは、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）（Ｉｓｏｃｅｌｌ， Ｆｒａｎｃｅ）と呼ばれる固形剤形製品であり、これには小麦から得られるプロラミン、特にグリアジンとして知られるプロラミンと組み合わせた植物由来のＳＯＤが含まれる。Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）は現在、白斑などの皮膚の脱色問題に悩む人々のための栄養補助食品として、また人体全体の健康、ならびにアンチエイジングの皮膚治療および美容剤として知られ、販売されている。他の多くの研究でも、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）の経口投与による以下の効果が報告されている：
【0004】
酸化ストレスの抑制：
Ｖｏｕｌｄｏｕｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｌｉａｄｉｎ－ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｎｔ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｄｅｆｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ”， Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４， １８（１２）， ９５７－９６２；
Ｖｏｕｌｄｏｕｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｌｉａｄｉｎ－ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｎｔ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｄｅｆｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ”， Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４， １８（１２）， ９５７－９６２；
【0005】
Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．， “Ｏｒａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｅｌｏｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｄｅｆｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｍｅｍｏｒｙ”， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００９， ２００（１）， １５－２１；
【0006】
Ｃ． Ｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｏｒａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＳＯＤ ｏｎ ｈｙｐｅｒｂａｒｉｃ， ｏｘｙｇｅｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄａｍａｇｅ” Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， Ｕｌｍ ，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４；
【0007】
紫外線による酸化ストレスの抑制： Ｍａｃ－Ｍａｒｙ ｅｔ ａｌ， “Ｃｏｕｌｄ ａ ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｂｅ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （ＧｌｉＳＯＤｉｎ）？”， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， ２００７， １７（３）， ２５４－２５５）；
【0008】
免疫調節を促進する： Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｅｎｉｇｎ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ”， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ２００６， ９４（６）， ８５４－８６２）；
【0009】
血管の炎症を抑制する： Ｍ． Ｃｌｏａｒｅｃ， ａｎｄ ａｌ．， “ＧｌｉＳＯＤｉｎ， ａ ｖｅｇｅｔａｌ ＳＯＤ ｗｉｔｈ Ｇｌｉａｄｉｎ， ａｓ ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｖｓ． ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， ａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｏｔｉｄ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－Ｂ Ｉｍａｇｉｎｇ” Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｐａｒｉｓ， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｎｎｕａｌｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００７；
【0010】
喘息は下気道に影響を及ぼす慢性の病状であり、その症状は炎症、気管支収縮、および気管支分泌過多として現れる。世界中で３億人以上が喘息患者であると考えられており、その人のうちの約７０％がアレルギー性喘息を患っていると推定されている。
【0011】
アレルギー性喘息は、ダニ、動物の残骸および落屑、真菌の胞子、ならびに花粉などの植物粒子などによって形成されるもののような吸入粒子に対する免疫系の異常な反応を特徴とする。大多数の人々にとって、これらの粒子は免疫システムによって認識され、また許容されるため、好ましくない反応を引き起こすことはない。しかし、感染した対象では、これらの粒子がＴヘルパー２細胞（Ｔｈ２）免疫反応を誘発し、それに続いてＩｇＥ免疫グロブリンの生成を引き起こし、それが今度は好塩基球および肥満細胞の脱顆粒につながり、それによってヒスタミンおよびロイコトリエンなどの多くの炎症反応メディエーターを放出する。これらのメディエーターは気管支収縮を引き起こし、喘息発作の原因となる。しかし、Ｔヘルパー１７細胞またはＴレギュレーターなど、他のＴヘルパー細胞集団も喘息に関与していることが知られている。これらのさまざまな免疫メカニズムは、粘液の過剰生成および呼吸経路の平滑筋構造の収縮を伴い、人間の気道の組織リモデリングを引き起こす。
【0012】
喘息には単一のタイプだけではなく、人間には多数の表現型が存在することも知られているが、主に２つの表現型を区別できる。Ｔｈ２高とＴｈ２低。Ｔｈ２高表現型は、血清ＩｇＥレベルが高く、好酸球の割合が高いことが特徴である。Ｔｈ２低表現型には、Ｔｈ１７細胞などの他のメディエーターが関与する。現在の治療法、例えば、重症でない形態の喘息に対するコルチコステロイドの使用、あるいは、１０年ほど前から利用可能となっているモノクローナル抗体オマリズマブまたは、より最近では抗ＩＬ－５モノクローナル抗体レスリズマブなどの抗ＩｇＥ治療は、概してこれらの症状を管理することができる。しかし、これらの製品は静脈内投与する必要があり、問題となる可能性のある副作用が多数あり、その副作用には、咳、嚥下困難、めまい、失神、横になったりまたは座ったりした状態から急に立ち上がったときのふらつき、心拍数の上昇、じんましん、かゆみ、または皮膚の発疹、まぶたもしくは目の周り、顔、唇、または舌の腫れまたはむくみ、皮膚の赤み、胸の圧迫感、および異常な疲労感または脱力感を含む。
【0013】
したがって、本発明の一態様は、他の現代的な治療処置の静脈内投与に関連する欠点がなく、必要に応じて、喘息状態を管理するためのより古典的な治療計画と任意にかつ追加的に組み合わせることができる、アレルギー性喘息に対する、より侵襲性が低く、かつより問題の少ない別の治療法を提供することである。
【0014】
したがって、一態様によると、本発明は、哺乳類におけるアレルギー性喘息の治療および／または予防のためのスーパーオキシドジスムターゼの使用であって、スーパーオキシドジスムターゼは、単独で経口投与されるか、または任意で、少なくとも１つのβ２アドレナリン受容体アゴニストを含むエアロゾル調製物の投与と組み合わせて投与される、使用に関する。
【0015】
さらに別の態様によれば、アレルギー性喘息の治療および／または予防のためのスーパーオキシドジスムターゼの使用は、哺乳類がヒトである場合の使用に関する。
【0016】
スーパーオキシドジスムターゼは、当業者に一般的に知られているものから選択することができ、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、動物スーパーオキシドジスムターゼ、細菌スーパーオキシドジスムターゼ、酵母スーパーオキシドジスムターゼおよび植物スーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択され得る。しかしながら、有利には、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼ、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｉスーパーオキシドジスムターゼ、およびＦｅスーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択される。一態様によると、スーパーオキシドジスムターゼは、相同または非相同スーパーオキシドジスムターゼである。
【0017】
さらに別の有利な態様よると、非相同スーパーオキシドジスムターゼが好ましい。
【0018】
特に有利な態様によると、スーパーオキシドジスムターゼは植物由来スーパーオキシドジスムターゼであり、さらに有利には非相同植物スーパーオキシドジスムターゼである。このようなスーパーオキシドジスムターゼは、さまざまな方法で取得または生成され得る。例えば、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは植物から抽出され得る。少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼの抽出または生成に植物が使用される場合、そのような植物は、ウリ科、ナス科、およびコムギ科の植物種、ならびに／またはそれらの様々な栽培品種からなる群から選択されるメンバーであることが有益であり、メロン（例えば、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、トマト（例えば、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、および小麦（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、およびＴｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）などからなる群から選択されることが有利である。
【0019】
利用可能な様々な植物スーパーオキシドジスムターゼの中で、別の態様によると、スーパーオキシドジスムターゼは、ペルオキシソーム、葉緑体および細胞質スーパーオキシドジスムターゼからなる植物スーパーオキシドジスムターゼの群から選択される。
【0020】
さらに別の態様によると、スーパーオキシドジスムターゼは、メロンスーパーオキシドジスムターゼ、および小麦スーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択される植物由来スーパーオキシドジスムターゼである。
【0021】
このような植物由来スーパーオキシドジスムターゼの抽出技術はそれ自体周知であり、例えばメロンまたは小麦などの対応する乾燥抽出物は市販されている。例えば、野菜メロン種（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ Ｌ）の品種から得られるスーパーオキシドジスムターゼについては、スーパーオキシドジスムターゼは通常、メロン果汁の凍結乾燥抽出物として粉末の形で提供されており、フランスのビオノフ社（Ｂｉｏｎｏｖ， Ｆｒａｎｃｅ）から「ＳＯＤ Ｂ（登録商標）」という商品名で市販されている。このような粉末は一般に淡いオレンジ色で、測定されたＳＯＤ酵素活性は９０，０００Ｕ（ＮＢＴ）／ｇ～１５０，０００Ｕ（ＮＢＴ）／ｇと測定される。同様に、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ植物由来の小麦ＳＯＤの乾燥抽出物は、ＩＮＣＩ名「Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ｖｕｌｇａｒｅ （Ｗｈｅａｔ） Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ」、ＣＡＳ Ｎ° ８４０１２－４４－２でＳｉｌａｂから市販されており、前記抽出物はベージュ色の凍結乾燥粉末として存在し、ＳＯＤ酵素活性は１，５００，０００Ｕ（ＮＢＴ）／ｇ～３，０００，０００Ｕ（ＮＢＴ）／ｇである。本明細書において、ＳＯＤの酵素活性は、単位Ｕ（ＮＢＴ）／ｇで表され、活性の測定は、例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ， ｉｎ Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ． ２００６， Ｍａｒ １８； ４０（５）：１１４３－８， ｉｎ Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１， ２．２．１， ２．３．１， ２．４．２ ａｎｄ ２．４．２．１に記載されたものなどの既知のＮＢＴ分析プロトコルに従って行われ、その内容は本明細書において参考をもって組み込まれる。
【0022】
さらに別の態様によると、スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、プロラミンと組み合わせた植物由来のスーパーオキシドジスムターゼを含む固形調製物からなる。有利には、プロラミンは、グリアジンの断片またはその誘導体、類似体、塩もしくは代謝物からなる群から選択される少なくとも１つのプロラミンベースのペプチドを含むことができる。さらに有利なことに、プロラミンベースのペプチド断片はグリアジンの非免疫原性類似体である。特に有利な態様では、プロラミンベースのペプチド断片は、免疫原性プロラミンベースのペプチドに対して競合阻害活性を有するグリアジンの非免疫原性類似体である。少なくとも１つのプロラミンベースのペプチド断片は、完全に加水分解された、実質的に加水分解された、またはわずかに加水分解されたプロラミンベースのペプチド断片からなる群から適切に選択することもできる。しかし、一般的には、プロラミンは、胃腸の加水分解のプロセスを模倣したＰＴＣ（パンクレアチン、トリプシン、キモトリプシン）加水分解プロラミンから得られるそれらの断片からなる群から選択されるプロラミン断片である。特に有利な一態様によると、プロラミンは、腸管内で標的シグナルとしてそれが機能する程度まで加水分解されたプロラミン断片である。
【0023】
有利には、また別の態様によると、スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、グリアジンと組み合わせた植物由来スーパーオキシドジスムターゼを含む固形調製物を投与することからなる。このような製品は、フランスのＩｓｏｃｅｌｌ社（Ｉｓｏｃｅｌｌ， Ｆｒａｎｃｅ）によって、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）という商標名で販売されている固形剤形調製物として商業的に知られている。
【0024】
さらに別の態様によると、スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、以下を含む固形調製物からなる：
固形調製物の総重量に対して、０．５０％～５．００％の標準化された力価のスーパーオキシドジスムターゼを含む乾燥メロンジュース由来の抽出物；
ａ）固形調製物の総重量に対して、０．５０％～５．００％の標準化された力価のスーパーオキシドジスムターゼを含む乾燥メロンジュース由来の抽出物；
ｂ）前記調製物の総重量に対して、１．５０％～５．００％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）スーパーオキシドジスムターゼは、１～５Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
固形調製物の総重量に対して、０．５０％～５．００％の標準化された力価のスーパーオキシドジスムターゼを含む乾燥メロンジュース由来の抽出物；
ａ）固形調製物の総重量に対して、０．５０％～５．００％の標準化された力価のスーパーオキシドジスムターゼを含む乾燥メロンジュース由来の抽出物；
ｂ）前記調製物の総重量に対して、１．５０％～５．００％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）スーパーオキシドジスムターゼは、１～５Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
【0025】
別の有利な態様によると、スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、以下からなる固形調製物からなる：
ａ）固形調製物の総重量に対して、１．３３％の標準化された力価のスーパーオキシドジスムターゼを含む乾燥メロンジュース由来の抽出物；
ｂ）調製物の総重量に対して、３．３３％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）スーパーオキシドジスムターゼは、１．５Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
ａ）固形調製物の総重量に対して、１．３３％の標準化された力価のスーパーオキシドジスムターゼを含む乾燥メロンジュース由来の抽出物；
ｂ）調製物の総重量に対して、３．３３％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）スーパーオキシドジスムターゼは、１．５Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
【0026】
別の態様によると、スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、以下を含む固形調製物からなる：
ａ）調製物の総重量に対して、０．０４％～０．４０％の小麦由来スーパーオキシドジスムターゼ；
ｂ）調製物の総重量に対して、１．５０％～５．００％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）スーパーオキシドジスムターゼは、１～１０Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
ａ）調製物の総重量に対して、０．０４％～０．４０％の小麦由来スーパーオキシドジスムターゼ；
ｂ）調製物の総重量に対して、１．５０％～５．００％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）スーパーオキシドジスムターゼは、１～１０Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
【0027】
なおもさらに別の態様によると、スーパーオキシドジスムターゼの経口投与は、以下を含む固形調製物からなる：
ａ）調製物の総重量に対して、０．１８％の小麦由来スーパーオキシドジスムターゼ；
ｂ）調製物の総重量に対して、３．５０％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）スーパーオキシドジスムターゼは、４．５Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
ａ）調製物の総重量に対して、０．１８％の小麦由来スーパーオキシドジスムターゼ；
ｂ）調製物の総重量に対して、３．５０％のグリアジン；
ｃ）ｑｓｐマルトデキストリン；
ｄ）スーパーオキシドジスムターゼは、４．５Ｕ（ＮＢＴ）／ｍｇの酵素活性を有すること。
【0028】
さらにさらなる態様によると、スーパーオキシドジスムターゼは、１日当たり１００ｍｇ～２０００ｍｇの量で、最低１５日間連続してヒトに経口投与される。
【0029】
さらに別の有利な態様によると、スーパーオキシドジスムターゼは、１日当たり５００ｍｇの量で、最短１５日間、および最長１８０日間連続してヒトに経口投与される。
【0030】
上で示したように、別の態様によると、スーパーオキシドジスムターゼは経口投与されるが、少なくとも１つのβ２アドレナリン受容体アゴニストを含むエアロゾル調製物の投与と組み合わせて投与される。β２アドレナリン受容体アゴニストを用いたアレルギー性喘息の短期治療自体は知られている。したがって、別の態様によると、少なくとも１つのβ２アドレナリン受容体アゴニストは、ビトルテロール、フェノテロール、イソプレナリン、レボサルブタモール、オルシプレナリン、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、サルブタモール、およびテルブタリンからなる群から選択される、短時間作用型β２アドレナリン受容体アゴニスト（略してＳＡＢＡとしても知られている）である。別の有利な態様によると、少なくとも１つのβ２アドレナリン受容体アゴニストは、サルブタモールである。
【図面の簡単な説明】
【0031】
本発明は、本明細書で提示された様々な態様の非限定的な例示目的に役立つ以下の詳細な実施例に関して、添付の図面を参照して説明される。
【図1】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無で、ナイーブな対照マウスおよび喘息マウスにおけるインビトロ混合リンパ球反応分析の結果をプロットした一連のグラフである。
【図2】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、アレルギー性喘息養子移入モデルにおけるリンパ球の再活性化および増殖の結果をプロットした一連のグラフである。
【図4】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、マウスにおけるハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー状態によって誘発される総免疫グロブリン産生をプロットした一連のグラフである。
【図5】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、マウスにおけるハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー状態によって誘発されるアレルギー特異的免疫グロブリン産生をプロットした一連のグラフである。
【図6】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー誘発マウスにおける化学誘引物質分析をプロットした一連のグラフである。
【図7】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー誘発マウスの呼吸機能をプロットした一連のグラフである。
【図8】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、サルブタモールの共投与の有無での、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー誘発マウスの呼吸機能をプロットした一連のグラフである。
【図9】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、サルブタモールの共投与の有無での、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー誘発マウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）からの細胞集団をフローサイトメトリーを使用して分析してプロットした一連のグラフである。
【図10】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、サルブタモールの共投与の有無での、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー誘発マウスの免疫応答をプロットした一連のグラフである。
【図11】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、サルブタモールの共投与の有無での、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー誘発マウスの血清ＩｇＥ値をプロットした一連のグラフである。
【図12】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、サルブタモールの共投与の有無での、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー誘発マウスのサイトカイン反応をプロットした一連のグラフである。
【図13】本明細書に記載のＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無における、サルブタモールの共投与の有無での、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギー誘発マウスから採取した肺サンプルの一連の組織学的染色である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
植物由来ＳＯＤの哺乳類への投与の効果を実証するために、いくつかの実験が行われた。実験評価の目的で、以下のＧｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤が調製された。
【表1】
【0033】
実験プロトコル
実験評価は次の領域に重点を置いた：
１）混合リンパ球反応またはＭＬＲとしても知られるアレルギー性喘息モデルにおけるリンパ球再活性化に対するＧｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤のインビトロでの影響；
２）養子移入モデルまたはＡＴとしても知られるアレルギー性喘息モデルにおけるリンパ球再活性化に対するＧｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤のインビボでの影響；
３）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤が分子スケールでの体液反応および化学誘引分子の生成に与える影響；
４）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤を投与されたマウス、および／またはサルブタモールで治療されたマウスの呼吸機能の分析；
５）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウスに対する抗炎症効果の分析。
６）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウスの比較免疫応答の分析；
７）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウス間の体液反応の比較分析；
８）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウス間のサイトカイン反応の比較分析；
９）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウス間の比較組織学的分析。
実験評価は次の領域に重点を置いた：
１）混合リンパ球反応またはＭＬＲとしても知られるアレルギー性喘息モデルにおけるリンパ球再活性化に対するＧｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤のインビトロでの影響；
２）養子移入モデルまたはＡＴとしても知られるアレルギー性喘息モデルにおけるリンパ球再活性化に対するＧｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤のインビボでの影響；
３）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤が分子スケールでの体液反応および化学誘引分子の生成に与える影響；
４）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤を投与されたマウス、および／またはサルブタモールで治療されたマウスの呼吸機能の分析；
５）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウスに対する抗炎症効果の分析。
６）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウスの比較免疫応答の分析；
７）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウス間の体液反応の比較分析；
８）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウス間のサイトカイン反応の比較分析；
９）Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）および／またはサルブタモールのいずれかで治療されたマウス間の比較組織学的分析。
【0034】
ハウスダストダニへの曝露を伴うアレルギー性喘息マウスモデルを使用した。このモデルは、Ｂａｌｂ／ｃｊマウスにハウスダストダニ抽出物全体を経皮的に投与する（０、７、１４、および２１日目）予備的な感作チャレンジ段階と、その後の２回の鼻腔内刺激（２７日目および３４日目）で構成され、それらは試験対象にアレルギー誘発性喘息の症状を誘発する。Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有効性は、最初の鼻腔内感作チャレンジの２４時間後から５週間にわたり毎週５日連続で、水に希釈した５ｍｇのＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤をマウスに強制給餌して毎日投与することで評価された。比較のために、同じプロトコルを使用して、Ｇｌｉｓｏｄｉｎとサルブタモールの併用投与の効果を評価し、この場合、サルブタモールは、各感作チャレンジの１時間前に、噴霧エアロゾルとして５ｍｇ／ｍｌの溶液濃度で３０秒間投与された。
【0035】
パート１－体外混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
分析のパート１、すなわちインビトロＭＬＲでは、６週齢のＢａｌｂ／ｃｊマウスの樹状細胞を脛骨骨髄幹細胞、すなわち骨髄由来細胞（ＢＭＤＣとしても知られている）から分化させた。同様に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（ＬＴ）リンパ球を同じマウスの脾臓から分離し、ネガティブ選択を使用して濃縮した。喘息マウスから採取したリンパ球は、アレルゲン、すなわちハウスダストダニを負荷した樹状細胞を使用して再活性化された。Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤がＴリンパ球とＢＭＤＣの相互作用に与える影響を測定するために、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤の有無でＢＭＤＣとＬＴの共培養を実施した。共培養後、Ｔリンパ球は以下のマーカーを用いたフローサイトメトリーによる表現型分析を受けた：ＩＦＮ－ＦＩＴＣ、Ｆｏｘｐ３－Ｐｅ、ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ５．５、ＩＬ－４－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｈ７、ＩＬ－１７－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１、およびＣＤ２５－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０。
分析のパート１、すなわちインビトロＭＬＲでは、６週齢のＢａｌｂ／ｃｊマウスの樹状細胞を脛骨骨髄幹細胞、すなわち骨髄由来細胞（ＢＭＤＣとしても知られている）から分化させた。同様に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（ＬＴ）リンパ球を同じマウスの脾臓から分離し、ネガティブ選択を使用して濃縮した。喘息マウスから採取したリンパ球は、アレルゲン、すなわちハウスダストダニを負荷した樹状細胞を使用して再活性化された。Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤がＴリンパ球とＢＭＤＣの相互作用に与える影響を測定するために、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤の有無でＢＭＤＣとＬＴの共培養を実施した。共培養後、Ｔリンパ球は以下のマーカーを用いたフローサイトメトリーによる表現型分析を受けた：ＩＦＮ－ＦＩＴＣ、Ｆｏｘｐ３－Ｐｅ、ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ５．５、ＩＬ－４－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｈ７、ＩＬ－１７－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１、およびＣＤ２５－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０。
【0036】
結果は図１に示される。メロンＧｌｉｓｏｄｉｎ（図１Ａおよび１Ｄ参照）または小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（図１Ｅおよび１Ｈ参照）の有無で、ヒトダストダニを負荷した自己樹状細胞から、ナイーブマウス（ＣＴＬ＝対照、白と濃い灰色）または喘息マウス（ＦＡ、薄い灰色と黒のヒストグラム）のリンパ球分化を測定した。ＣＤ４＋リンパ球の分化も集団識別によって測定された：Ｔｈ１（図１Ａおよび１Ｅ）、Ｔｈ２（図１Ｂおよび１Ｆ）、Ｔｈ１７（図１Ｃおよび１Ｇ）、およびＴｒｅｇ（図１Ｄおよび１Ｈ）。Ｔｕｋｅｙ検定を使用したＡＮＯＶＡ分析を適用すると、図に示すように信頼区間が得られた：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（マウス集団は群あたりｎ＝６～８匹）。
【0037】
γ－インターフェロン（γ－ＩＦＮ）の分泌を特徴とするＴｈ１リンパ球に関しては、ナイーブマウスの細胞と喘息マウスの細胞を比較した場合、分化の変化は観察されず、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無による顕著な影響も見られず（図１Ａおよび１Ｅを参照）、プロファイルは表面上は同じままであった。Ｔｈ１応答は主に抗菌および抗ウイルス免疫応答に関係しており、アレルギー応答にはほとんど関与していないことを考えると、これらの結果は予想通りであった。これとは対照的に、Ｔｈ２リンパ球は主に抗寄生虫反応および抗アレルギー反応に関与している。喘息マウスのＴｈ２リンパ球は、ナイーブマウスと比較して顕著な分化が観察され、分化は１００～７００％のオーダーで増加した（図１Ｂおよび１Ｆ、白と薄い灰色のヒストグラムを参照）。ここで特に興味深いのは、細胞がＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の存在下では分化が観察されないことであり、これは、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤によってアレルギー誘発性Ｔｈ２分化が阻害されることを示唆している（図１Ｂおよび１Ｆ、濃い灰色と黒のヒストグラムを参照）。さらに、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の存在は、ナイーブマウスのＴｈ２リンパ球の分化に影響を与えない。同様に、炎症反応に関与するＴｈ１７リンパ球の分化は、喘息マウスではナイーブマウスに比べて３～５倍増加する（図１Ｃおよび１Ｇを参照）。ここでも特に注目すべきは、小麦ＧｌｉｓｏｄｉｎまたはメロンＧｌｉｓｏｄｉｎのいずれかの存在も、ナイーブマウスほどではないものの、Ｔｈ１７リンパ球の分化を阻害するという事実である（図１Ｃおよび１Ｇを参照）。また、これらのリンパ球反応はＴ制御リンパ球（Ｔｒｅｇ）によって制御されており、その分化はＣＤ２５と転写因子ＦｏｘＰ３の高発現によって特徴付けられることにも注目すべきである（図１Ｄと１Ｈを参照）。予想通り、喘息マウスではナイーブマウスと比較して分化したＴｒｅｇの数の減少が観察される。それにもかかわらず、ここでも、Ｇｌｉｓｏｄｉｎの存在は、ナイーブマウスと喘息マウスの両方において、喘息マウスと比較してＴｒｅｇ分化の頻度を増加させる（図１Ｄおよび１Ｈを参照）。要約すると、これらの結果は、小麦とメロンのＧｌｉｓｏｄｉｎはどちらもＴｈ１分化には影響を与えないようであるが、アレルギー性環境下ではＴｈ２とＴｈ１７リンパ球の分化を阻害することを示す。これとは対照的に、Ｇｌｉｓｏｄｉｎの存在は、アレルギー性環境の有無に関係なく、Ｔｒｅｇリンパ球の分化を増加させることがわかり得る。
【0038】
さらなる分析では、アレルギー誘発性喘息において肺の炎症を維持する能力があることが知られているｙ－ＩＦＮを産生する能力を測定することにより、ＣＤ８＋リンパ球の活性化を判定することを含んだ。得られた結果では、２種類のマウスの間に統計的に有意な差はなく、また、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤に使用されている植物由来のＳＯＤの種類にも有意な差はないことを示した。これらの結果は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球で観察された効果とは対照的に、ＣＤ８＋Ｔリンパ球に関してはＧｌｉｓｏｄｉｎの効果がないことを示唆する。
【0039】
パート２－インビボ養子免疫伝達
分析のパート２について、すなわちインビボ養子免疫伝達（ＡＴ）では、Ｔリンパ球ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞をナイーブまたは喘息のＢａｌｂ／ｃｊ Ｌｙ５．１マウスの脾臓から分離し、ネガティブ選択によって濃縮する。アレルギー反応中のＴリンパ球の再活性化に対するＧｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）の効果を決定るために、分離したＴリンパ球をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識してそれらの増殖を測定し、その後、２００万～３００万個の細胞レベルでナイーブマウスに静脈内再注入する。これに続いて、マウスは、注入された細胞をインビボで再活性化するために、ハウスダストダニに２回曝され、比較のため、マウスには、上記のＧｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤の投与も受けたか受けなかったかのいずれかも行われる。Ｔリンパ球の再活性化後、後者は、以下のフローサイトメトリーマーカーを使用して、マウスの肺と脾臓におけるＴリンパ球の増殖と表現型が分析される：ＣＦＳＥ、ＣＤ１２２－ＦＩＴＣ、Ｌｙ５．１－Ｐｅ、ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ５．５、ＣＣＲ４－Ｐｅ－Ｃｙ７、ＣＣＲ６－Ｐｅ－Ｃｙ７、ＧＡＴＡ３－ＡＰＣ、ＲＯＲγｔ－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｈ７、ＩＬ－１７－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１、ＣＤ４４－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１、ＣＸＣＲ３－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０、ＩＬ－１７ＲＡ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０。
分析のパート２について、すなわちインビボ養子免疫伝達（ＡＴ）では、Ｔリンパ球ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞をナイーブまたは喘息のＢａｌｂ／ｃｊ Ｌｙ５．１マウスの脾臓から分離し、ネガティブ選択によって濃縮する。アレルギー反応中のＴリンパ球の再活性化に対するＧｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）の効果を決定るために、分離したＴリンパ球をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識してそれらの増殖を測定し、その後、２００万～３００万個の細胞レベルでナイーブマウスに静脈内再注入する。これに続いて、マウスは、注入された細胞をインビボで再活性化するために、ハウスダストダニに２回曝され、比較のため、マウスには、上記のＧｌｉｓｏｄｉｎ（登録商標）製剤の投与も受けたか受けなかったかのいずれかも行われる。Ｔリンパ球の再活性化後、後者は、以下のフローサイトメトリーマーカーを使用して、マウスの肺と脾臓におけるＴリンパ球の増殖と表現型が分析される：ＣＦＳＥ、ＣＤ１２２－ＦＩＴＣ、Ｌｙ５．１－Ｐｅ、ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ５．５、ＣＣＲ４－Ｐｅ－Ｃｙ７、ＣＣＲ６－Ｐｅ－Ｃｙ７、ＧＡＴＡ３－ＡＰＣ、ＲＯＲγｔ－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｈ７、ＩＬ－１７－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１、ＣＤ４４－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１、ＣＸＣＲ３－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０、ＩＬ－１７ＲＡ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０。
【0040】
ハウスダストダニへの曝露後にリンパ球の増殖を測定し、その結果を図２に示す。この測定値は、ＣＦＳＥの漸進的希釈を分析することによって得られ、その結果は肺細胞と脾臓細胞の増殖に関して図２Ａ～２Ｄに示され、図２Ｅ～２Ｈはそれぞれ肺（図２Ｅと２Ｆ）と脾臓（図２Ｇと２Ｈ）の増殖率を示す。Ｔｕｋｅｙ検定を使用したＡＮＯＶＡ分析を適用すると、図に示すように信頼区間が得られた：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
【0041】
Ｌｙ５．２マーカーを使用して、喘息マウスに移植されたＴリンパ球（薄い灰色のヒストグラム）では、増殖の兆候を示さなかったナイーブマウスのリンパ球（白いヒストグラム）と比較して、Ｔリンパ球増殖の顕著な増加が観察されました（図２Ｅ～２Ｈを参照）。したがって、観察された増殖は、ハウスダストダニへの曝露後に感作されたリンパ球の再活性化のマーカーとなる。同様に、喘息マウスからＧｌｉｓｏｄｉｎにも曝露されたマウスに移されたリンパ球（黒のヒストグラム）の再活性化も、ナイーブマウスのそれらのリンパ球（濃い灰色のヒストグラム）と比較して増加していることが観察された。しかし、特に興味深いのは、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤にも曝露されたマウスでは、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤に曝露されなかったマウスと比較して、リンパ球の再活性化が約５０％減少したという観察結果である。小麦ＳＯＤとメロンＳＯＤ Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の間には、活性に有意な差は見られなかった。
【0042】
ここでさらに分析を行い、増殖したＣＤ４＋Ｔリンパ球のサブ集団を特定した。その結果を図３に示す。これは、Ｌｙ５．２マーカーとＣＦＳＥ希釈を使用して、ドナーから得られた増殖した細胞の間で集団分析を実行することによって達成された。図３Ａに示すように、アレルギー誘発環境によるものでも、Ｇｌｉｓｏｄｉｎの適用によるものでも、Ｔｈ１リンパ球の頻度は影響を受けないことが観察された。それにもかかわらず、アレルギーマウスでは対照マウスと比較して、Ｔｈ２およびＴｈ１７リンパ球の増殖の増加が観察された（図３Ｂおよび３Ｃを参照）。さらに、インビトロの結果の確認として、インビボの結果から、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤がアレルギーによって誘発されるＴｈ２およびＴｈ１７リンパ球の両方の細胞増殖を阻害することがわかる（図３Ｂおよび３Ｃを参照）。これらの結果は、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤のインビトロおよびインビボの両方での抗炎症および抗アレルギー効果を裏付ける。
【0043】
パート３－分子スケールの分析
実験のパート３では、パート（ａ）のマウス血清が使用される。ＥＬＩＳＡを使用して、ハウスダストダニに対する以下の抗体の総量と特定の量を評価した：ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ。同様に、パート（２）の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を使用して、以下の化学誘引物質および炎症誘発性分子の量を測定した：ＲＡＮＴＥＳまたはＣＣＬ５は、Ｔ細胞、好酸球、および好塩基球の既知の走化性分子であり、それは炎症部位での白血球の動員に積極的な役割を果たし、ＥｏｔａｘｉｎまたはＣＣＬ１１は、好酸球の既知の走化性分子であり、ＫＣまたはケラチノサイト由来ケモカインまたはＣＸＣＬ１は、好中球の既知の走化性分子であり、ＭＣＰ－１またはＣＣＬ２は、単球、リンパ球、および好塩基球の既知の走化性分子であり、それらは脱顆粒を引き起こし、ＭＩＰ１またはＣＣＬ３は、急性炎症状態で多形核白血球の動員と活性化に関与し、そしてＴＡＲＣまたはＣＣＬ１７は、制御性Ｔ細胞を引き付ける強力なケモカインである。これらの決定は、次のように４２のサンプルにわたって行われた；
小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の７つの対照；
メロンＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の８つの対照；
小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の９つの喘息検査サンプル；
メロンＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の８つの喘息検査サンプル；
陽性対照としての１０つの喘息検査サンプル；
実験のパート３では、パート（ａ）のマウス血清が使用される。ＥＬＩＳＡを使用して、ハウスダストダニに対する以下の抗体の総量と特定の量を評価した：ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ。同様に、パート（２）の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を使用して、以下の化学誘引物質および炎症誘発性分子の量を測定した：ＲＡＮＴＥＳまたはＣＣＬ５は、Ｔ細胞、好酸球、および好塩基球の既知の走化性分子であり、それは炎症部位での白血球の動員に積極的な役割を果たし、ＥｏｔａｘｉｎまたはＣＣＬ１１は、好酸球の既知の走化性分子であり、ＫＣまたはケラチノサイト由来ケモカインまたはＣＸＣＬ１は、好中球の既知の走化性分子であり、ＭＣＰ－１またはＣＣＬ２は、単球、リンパ球、および好塩基球の既知の走化性分子であり、それらは脱顆粒を引き起こし、ＭＩＰ１またはＣＣＬ３は、急性炎症状態で多形核白血球の動員と活性化に関与し、そしてＴＡＲＣまたはＣＣＬ１７は、制御性Ｔ細胞を引き付ける強力なケモカインである。これらの決定は、次のように４２のサンプルにわたって行われた；
小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の７つの対照；
メロンＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の８つの対照；
小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の９つの喘息検査サンプル；
メロンＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の８つの喘息検査サンプル；
陽性対照としての１０つの喘息検査サンプル；
【0044】
まず、マウスの血清から生成された抗体の総量を測定した。この測定はＥＬＩＳＡによって行われ、ＡＮＯＶＡ分析が適用され、マークされている信頼区間が得られた：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１および集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス。
【0045】
アレルギーマウスでは、対照マウスと比較してＩｇＥの総数の増加が観察された（図４Ａを参照）。しかし、対照またはアレルギー誘発喘息マウスのいずれにおいても、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無にかかわらず、総ＩｇＥ産生に対する顕著な影響は観察されなかった（図４Ａを参照）。さらに、調査対象のマウスの種類、およびＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤の有無にかかわらず、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａの産生に変化は見られなかった（図４Ｂ～４Ｄを参照）。メロンＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤でも同様の結果が得られた（結果は示されていない）。これらの観察結果を試みて、よりよく理解するために、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）特異的Ｉｇを測定した。その結果は図５に示されており、Ｔｕｋｅｙ検定を使用したＡＮＯＶＡ分析を適用して、次のように信頼区間が得られる：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
【0046】
総Ｉｇに関して観察されたものとは対照的に、喘息マウスでは対照マウスと比較して、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）に特異的なＩｇＥの増加が観察された（図５Ａを参照）。Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤の存在は、ナイーブ対照マウスには目立った影響を与えなかったが、アレルギー性喘息プロトコルで誘発された特異的ＩｇＥの増加を阻害することがわかった（図５Ａを参照）。対照的に、アレルギー対象ではハウスダストダニ（ＨＤＭ）特異的ＩｇＡが減少しており、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤も対照マウスと比較してこの減少を抑制した（図５Ｂを参照）。Ｇｌｉｓｏｄｉｎは、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）特異的Ｉｇ２ａおよびＩｇＧ１の産生を減少させる効果は認められなかった（図５Ｃおよび５Ｄを参照）。これらの結果を総合すると、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤は、特異的ＩｇＥの減少と特異的ＩｇＡの増加を中心としたアレルギー反応に対する保護効果を発揮することが実証される。メロンＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤でも同様の結果が得られた（示されていない）。したがって、これらの製剤に含まれるＳＯＤは、アレルギー性喘息の治療および予防に役立つ。
【0047】
同様に、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤に曝されたマウスの前回の実験からの気管支肺胞洗（ＢＡＬ）についても、図６に示すように、つまり、ＲＡＮＴＥＳ、ＫＣ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ１、ＴＡＲＣ、エオタキシンなどの特定の化学誘引物質の存在と量についてさらに分析し、Ｔｕｋｅｙ検定を使用したＡＮＯＶＡ分析を実行して、マークされている信頼区間が得られた：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１ ｅｔ ＊＊＊＝ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹マウス）。結果は、対照マウスと比較して、アレルギーマウスではＲＡＮＴＥＳ、ＫＣ、エオタキシン、およびＴＡＲＣの産生が増加していることを示すが（図６Ａ、６Ｂ、６Ｄ、および６Ｅを参照）、この増加はＭＩＰ１およびＭＣＰ１では観察されていない（図６Ｃおよび６Ｆを参照）。ここで特に興味深いのは、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤を補給されたマウスでは、アレルギー性喘息によって産生が誘導されるこれらの化学誘引物質ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、およびＴＡＲＣの産生の抑制が増加したこと示したことである（図６Ａ、６Ｄ、および６Ｅを参照）。同様に、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤はＫＣ、ＭＩＰ１、ＭＣＰ１に対して目立った効果を示さなかった（図６Ｂ、６Ｃ、６Ｆを参照）。
【0048】
パート４－呼吸機能
マウスの呼吸機能は、ＳｃｉＲｅｑから入手可能なｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（商標）システムを使用して分析され、その結果は図７および８に示される。この結果から、健康なマウスではＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤単独では何の効果も見られず、喘息マウスの呼吸機能が大幅に改善されたことが示された。この効果は、図７Ａおよび７Ｄに示すように、気道抵抗の減少として見られ、これは、空気が肺を通過するときの抵抗を反映しており、喘息の影響を受けた肺では気管支の直径が狭くなるため、この抵抗が増加する。Ｇｌｉｓｏｄｉｎによってもたらされる呼吸機能の改善は、図７Ｂおよび７Ｅに示すコンプライアンスプロットでも確認でき、ここでのコンプライアンスとは、圧力の変化に応じて肺が容積を適応させる能力であるが、図７Ｃおよび７Ｆに示すように、コンプライアンスの逆数であり、肺の弾力性を示す弾性の変化にも応じて肺が容積を適応させる能力である。図７のチャートでは、ナイーブ未治療マウスは対照、またはＣＴＬとして、小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎを投与されたナイーブマウスはＣＴＬｗＧｌｉとして、メロンＧｌｉｓｏｄｉｎを投与されたナイーブマウスはＣＴＬｍＧｌｉとして、喘息マウスはＨＤＭとして、そして小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（ＨＤＭｗＧｌｉ）またはメロンＧｌｉｓｏｄｉｎ（ＨＤＭｍＧｌｉ）のいずれかを投与された喘息マウスが示されている。気管支収縮薬メタコリンの投与量増加に応答する呼吸機能を、ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（商標）システムを使用して測定した。Ｔｕｋｅｙ検定を使用したデータのＡＮＯＶＡ分析が実行され、グラフに示されている信頼区間が確立された：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
マウスの呼吸機能は、ＳｃｉＲｅｑから入手可能なｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（商標）システムを使用して分析され、その結果は図７および８に示される。この結果から、健康なマウスではＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤単独では何の効果も見られず、喘息マウスの呼吸機能が大幅に改善されたことが示された。この効果は、図７Ａおよび７Ｄに示すように、気道抵抗の減少として見られ、これは、空気が肺を通過するときの抵抗を反映しており、喘息の影響を受けた肺では気管支の直径が狭くなるため、この抵抗が増加する。Ｇｌｉｓｏｄｉｎによってもたらされる呼吸機能の改善は、図７Ｂおよび７Ｅに示すコンプライアンスプロットでも確認でき、ここでのコンプライアンスとは、圧力の変化に応じて肺が容積を適応させる能力であるが、図７Ｃおよび７Ｆに示すように、コンプライアンスの逆数であり、肺の弾力性を示す弾性の変化にも応じて肺が容積を適応させる能力である。図７のチャートでは、ナイーブ未治療マウスは対照、またはＣＴＬとして、小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎを投与されたナイーブマウスはＣＴＬｗＧｌｉとして、メロンＧｌｉｓｏｄｉｎを投与されたナイーブマウスはＣＴＬｍＧｌｉとして、喘息マウスはＨＤＭとして、そして小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎ（ＨＤＭｗＧｌｉ）またはメロンＧｌｉｓｏｄｉｎ（ＨＤＭｍＧｌｉ）のいずれかを投与された喘息マウスが示されている。気管支収縮薬メタコリンの投与量増加に応答する呼吸機能を、ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（商標）システムを使用して測定した。Ｔｕｋｅｙ検定を使用したデータのＡＮＯＶＡ分析が実行され、グラフに示されている信頼区間が確立された：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
【0049】
Ｇｌｉｓｏｄｉｎの有効性は、喘息発作の治療に使用される気管支拡張作用および抗炎症作用を持つサルブタモール、β２アドレナリン受容体アゴニストとの併用でも分析され、その結果は図８に示される。ここでは、サルブタモールの投与による呼吸機能の改善に対する有意な効果が、抵抗（図８Ａおよび８Ｄを参照）、コンプライアンス（図８Ｂおよび８Ｅを参照）、および気道の弾性（図８Ｃおよび８Ｆを参照）に関して明らかになった。しかし、Ｇｌｉｓｏｄｉｎ投与とサルブタモール投与の両方を組み合わせても、相乗効果または相加効果は見られなかった。グラフでは、ＣＴＬまたは対照は、未治療、未治療の喘息マウス（ＨＤＭ）、サルブタモール治療を受けた喘息マウス（サルブタモール）、サルブタモールと小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎを投与された喘息マウス（サルブ小麦）、またはサルブタモールとメロンＧｌｉｓｏｄｉｎを投与された喘息マウス（サルブメロン）を示し、すべて気管支収縮剤メタコリンの用量増加に対する反応としてｆｌｅｘｉＶｅｎｔによって測定された。Ｔｕｋｅｙ検定を使用したデータのＡＮＯＶＡ分析が実行され、グラフに示されている信頼区間が確立された：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
【0050】
パート５－炎症反応
マウスの研究プロトコルの最後に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を採取し、フローサイトメトリーを使用して細胞集団を分析した。この分析の結果は図９に示されており、これは、細胞の総数（Ｔｏｔａｌ）、Ｌｙ６Ｃ＋好中球の数（Ｎｅｕ）、ＣＣＲ３＋好中球の数（Ｅｏ）、Ｌｙ６Ｇ＋単球の数（Ｍｏ）、およびＣＤ３＋リンパ球の数（Ｌｙ）を示しており、ここで、ＣＴＬはナイーブ未治療マウスであり、ＣＴＬｗＧｌｉは小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎを投与したナイーブマウスであり、ＣＴＬｍＧｌｉはメロンＧｌｉｓｏｄｉｎを投与したナイーブマウスであり、ＨＤＭは未治療の喘息マウスであり、ＨＤＭｗＧｌｉは小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎを投与した喘息マウスであり、ＨＤＭｍＧｌｉはメロンＧｌｉｓｏｄｉｎを投与した喘息マウスであり、サルブタモールは、サルブタモール治療を受けた喘息マウスであり、サルブ小麦は、サルブタモール／小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎ治療の併用を受けた喘息マウスであり、そしてサルブメロンは、サルブタモール／メロンＧｌｉｓｏｄｉｎ治療の併用を受けた喘息マウスである。Ｔｕｋｅｙ検定を使用したデータのＡＮＯＶＡ分析が実行され、グラフに示されている信頼区間が確立された：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
マウスの研究プロトコルの最後に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を採取し、フローサイトメトリーを使用して細胞集団を分析した。この分析の結果は図９に示されており、これは、細胞の総数（Ｔｏｔａｌ）、Ｌｙ６Ｃ＋好中球の数（Ｎｅｕ）、ＣＣＲ３＋好中球の数（Ｅｏ）、Ｌｙ６Ｇ＋単球の数（Ｍｏ）、およびＣＤ３＋リンパ球の数（Ｌｙ）を示しており、ここで、ＣＴＬはナイーブ未治療マウスであり、ＣＴＬｗＧｌｉは小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎを投与したナイーブマウスであり、ＣＴＬｍＧｌｉはメロンＧｌｉｓｏｄｉｎを投与したナイーブマウスであり、ＨＤＭは未治療の喘息マウスであり、ＨＤＭｗＧｌｉは小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎを投与した喘息マウスであり、ＨＤＭｍＧｌｉはメロンＧｌｉｓｏｄｉｎを投与した喘息マウスであり、サルブタモールは、サルブタモール治療を受けた喘息マウスであり、サルブ小麦は、サルブタモール／小麦Ｇｌｉｓｏｄｉｎ治療の併用を受けた喘息マウスであり、そしてサルブメロンは、サルブタモール／メロンＧｌｉｓｏｄｉｎ治療の併用を受けた喘息マウスである。Ｔｕｋｅｙ検定を使用したデータのＡＮＯＶＡ分析が実行され、グラフに示されている信頼区間が確立された：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
【0051】
喘息マウスでは、対照マウスと比較して、ＢＡＬと肺の総細胞数が有意に増加していた。それにもかかわらず、小麦またはメロンＧｌｉｓｏｄｉｎを投与されたこれらのマウスでは、未治療の喘息マウスと比較して、この数は大幅に減少した（図９Ａおよび９Ｃを参照）。細胞数の減少は好酸球とリンパ球で最も顕著に見られ、単球でも程度は低いものの、好中球では顕著ではない。呼吸機能分析と同様に、小麦とメロンＧｌｉｓｏｄｉｎを並べて比較した場合、細胞数の減少に有意な差は観察されなかった。Ｇｌｉｓｏｄｉｎ投与とサルブタモール投与を組み合わせた場合の累積効果または相乗効果の試験も実施し、結果を図９Ｂおよび９Ｄに示した。サルブタモールは特徴的な抗炎症作用を示し、ＢＡＬ内の細胞数、特に好酸球とリンパ球の数を減少させた。小麦またはメロンＧｌｉｓｏｄｉｎの併用治療投与では、相補効果は観察されなかった（図９Ｂおよび９Ｄを参照）。
【0052】
パート６－免疫反応
治療プロトコルの最後に、マウスの肺を採取し、粉砕し、全ダストダニ抽出物で再刺激し、得られた細胞集団をフローサイトメトリーを使用して分析した。結果は図１０に示されており、次の細胞種類がカウントされた：Ｔｈ１（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＦＮγ＋）、Ｔｈ２（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－１３＋）、およびＴｈ１７（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－１７＋）。Ｔｕｋｅｙ検定を使用したデータのＡＮＯＶＡ分析が実行され、グラフに示されている信頼区間が確立された：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
治療プロトコルの最後に、マウスの肺を採取し、粉砕し、全ダストダニ抽出物で再刺激し、得られた細胞集団をフローサイトメトリーを使用して分析した。結果は図１０に示されており、次の細胞種類がカウントされた：Ｔｈ１（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＦＮγ＋）、Ｔｈ２（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－１３＋）、およびＴｈ１７（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－１７＋）。Ｔｕｋｅｙ検定を使用したデータのＡＮＯＶＡ分析が実行され、グラフに示されている信頼区間が確立された：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
【0053】
Ｔリンパ球の分化とは、抗原に対して一定の特異性を持つナイーブＴリンパ球が、特定の効果を発揮する能力も獲得する現象である。このプロセスは、特定の抗原を提示する細胞とナイーブＴリンパ球との相互作用中にリンパ節で誘発される。これらの抗原提示細胞は、リンパ器官に移動する前に活性化された環境に応じて、Ｔリンパ球のさまざまな異なる分化プログラムを誘導できるさまざまなサイトカインを生成する。その結果、Ｔリンパ球の分化には複数の経路が存在し、それらは相互に排他的であると言える。このようにして、産生されるサイトカインの種類と分布によって、さまざまな異なるＴリンパ球集団を区別することができる。要約すると、これらは次のように示される：
γ－ＩＦＮを産生し、抗ウイルスおよび抗菌反応に関与するＴｈ１リンパ球；
抗寄生虫反応およびアレルギー反応に関与するＩＬ－４およびＩＬ－１３を主に産生するＴｈ２リンパ球；
炎症反応に関与するＩＬ－１７を産生するＴｈ１７リンパ球。
γ－ＩＦＮを産生し、抗ウイルスおよび抗菌反応に関与するＴｈ１リンパ球；
抗寄生虫反応およびアレルギー反応に関与するＩＬ－４およびＩＬ－１３を主に産生するＴｈ２リンパ球；
炎症反応に関与するＩＬ－１７を産生するＴｈ１７リンパ球。
【0054】
図１０から、喘息マウスでは対照マウスと比較してＴｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７リンパ球細胞数がすべて有意に多いことがわかる。これとは対照的に、Ｇｌｉｓｏｄｉｎを投与された喘息マウスでは、Ｔｈ１リンパ球数が著しく減少していることが示される（図１０Ａおよび１０Ｄを参照）。同様に、サルブタモールで治療されたマウスでは、Ｇｌｉｓｏｄｉｎとの併用治療の有無にかかわらず、Ｔｈ１リンパ球数の減少が見られたが、累積効果は観察されなかった（図１０Ａおよび１０Ｄを参照）。２つのＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤間に顕著な違いは観察されなかった。Ｔｈ２リンパ球反応（図１０Ｂおよび１０Ｅを参照）およびＴｈ１７リンパ球反応（図１０Ｃおよび１０Ｆを参照）に関しても同様の結果が観察され、Ｇｌｉｓｏｄｉｎとサルブタモールの間には累積効果の傾向が見られた。
【0055】
パート７－体液性反応
アレルギー性喘息では、抗原が認識されると、クローン選択と増殖が起こり、続いてＢリンパ球が形質細胞に分化し、ＩｇＥとアレルゲンの間で免疫複合体が形成され、作用細胞の脱顆粒とヒスタミンおよびＭＣＰ－１などの化学伝達物質の放出が起こる。Ｇｌｉｓｏｄｉｎ治療による喘息発作の発現に対する効果を評価するために、ハウスダストダニに特異的なＩｇＥの血清レベルをＥＬＩＳＡで測定し、ＭＣＰ－１の産生レベルを測定した。これらの測定の結果は図１１に示されており、Ｔｕｋｅｙ検定を使用したデータのＡＮＯＶＡ分析を適用して、作成されたグラフに示されている信頼区間を導き出している。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１ ｅｔ ＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
アレルギー性喘息では、抗原が認識されると、クローン選択と増殖が起こり、続いてＢリンパ球が形質細胞に分化し、ＩｇＥとアレルゲンの間で免疫複合体が形成され、作用細胞の脱顆粒とヒスタミンおよびＭＣＰ－１などの化学伝達物質の放出が起こる。Ｇｌｉｓｏｄｉｎ治療による喘息発作の発現に対する効果を評価するために、ハウスダストダニに特異的なＩｇＥの血清レベルをＥＬＩＳＡで測定し、ＭＣＰ－１の産生レベルを測定した。これらの測定の結果は図１１に示されており、Ｔｕｋｅｙ検定を使用したデータのＡＮＯＶＡ分析を適用して、作成されたグラフに示されている信頼区間を導き出している。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１ ｅｔ ＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹のマウス）。
【0056】
ＨＤＭ特異的ＩｇＥのレベルは、喘息マウスでは対照マウスよりも高く、さらにサルブタモールとＧｌｉｓｏｄｉｎの両方が累積効果の兆候なしにそのレベルを低下させることができたことが観察された（図１１Ａおよび１１Ｃを参照）。同様に、喘息発作の開始時には、ＭＣＰ－１の産生によって特徴付けられるが、喘息マウスでは対照マウスよりもこの分子のレベルが高いことが観察される（図１１Ｂおよび１１Ｄを参照）。しかし、他の分析で示された結果とは反対に、この場合、サルブタモールは生成されたＭＣＰ－１のレベルを低下させたのに対し、Ｇｌｉｓｏｄｉｎはそれほど効果的ではなかったようである（図１１Ｂおよび１１Ｄを参照）。
【0057】
パート８－サイトカイン反応
サイトカインは、異物の表面に存在する抗原、または免疫によって異物とみなされる分子に反応して生成される。抗原反応が開始されると、免疫防御の発達を担う細胞が活性化され、特にリンパ球の増殖と分化が刺激される。今回のケースでは、Ｔｈ２炎症経路サイトカイン（例えばＩＬ－５、ＩＬ－１３）とＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ－１７など）がさまざまなマウス群のＢＡＬ上清で測定され、その結果が図１２に示され、Ｔｕｋｅｙ検定を使用してデータのＡＮＯＶＡ分析を適用し、確立されたグラフに示されている信頼区間が得られた。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹マウス）。
サイトカインは、異物の表面に存在する抗原、または免疫によって異物とみなされる分子に反応して生成される。抗原反応が開始されると、免疫防御の発達を担う細胞が活性化され、特にリンパ球の増殖と分化が刺激される。今回のケースでは、Ｔｈ２炎症経路サイトカイン（例えばＩＬ－５、ＩＬ－１３）とＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ－１７など）がさまざまなマウス群のＢＡＬ上清で測定され、その結果が図１２に示され、Ｔｕｋｅｙ検定を使用してデータのＡＮＯＶＡ分析を適用し、確立されたグラフに示されている信頼区間が得られた。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１（集団は群あたりｎ＝６～８匹マウス）。
【0058】
図１２に示すように、喘息マウスでは対照マウスと比較してサイトカイン数の増加が観察された。Ｇｌｉｓｏｄｉｎ製剤とサルブタモールは、ＩＬ－５数を減らすのに効果的であり、ＩＬ－１７数を減少させる傾向がある。しかし、サルブタモールも試験したさまざまなＧｌｉｓｏｄｉｎ製剤もＩＬ－１３のレベルを低下させることができなかったことも観察された（図１２Ａ～１２Ｄ）。
【0059】
パート９－組織劣化
炎症、気管支収縮、および喘息の重症度のインサイチュ評価は、組織学的分析によって行われ、様々なマウス群の肺サンプルをエオシンおよびヘマトキシリンで染色し、１群あたり６匹のマウスを母集団とし、図１３に示すように、画像を１００μｍの縮尺で示した。組織劣化の程度は、スコアリングシステムを使用して２人の独立した評価者によって二重盲検プロトコルで評価された。Ｇｌｉｓｏｄｉｎまたはサルブタモールで治療されたマウスでは喘息の重症度の軽減が観察されたが、両方の治療を併用した有意な累積効果は観察されなかった。さらに、２つのＧｌｉｓｏｄｉｎ製品間にも顕著な違いは見られなかった。
炎症、気管支収縮、および喘息の重症度のインサイチュ評価は、組織学的分析によって行われ、様々なマウス群の肺サンプルをエオシンおよびヘマトキシリンで染色し、１群あたり６匹のマウスを母集団とし、図１３に示すように、画像を１００μｍの縮尺で示した。組織劣化の程度は、スコアリングシステムを使用して２人の独立した評価者によって二重盲検プロトコルで評価された。Ｇｌｉｓｏｄｉｎまたはサルブタモールで治療されたマウスでは喘息の重症度の軽減が観察されたが、両方の治療を併用した有意な累積効果は観察されなかった。さらに、２つのＧｌｉｓｏｄｉｎ製品間にも顕著な違いは見られなかった。
【0060】
上で実行され説明されたさまざまな分析から導かれる結論は、興味深いことに、Ｇｌｉｓｏｄｉｎは喘息における気道過敏性の発症を防ぎ、アレルギーマウスの気道好酸球増多を抑制したということである。 さらに、アレルギー性マウスの肺におけるＩＬ－５の増加を防ぎ、ＨＤＭ誘発性のＴｈ２およびＴｈ１７反応を減少させた。Ｇｌｉｓｏｄｉｎの投与は喘息マウスの呼吸機能の改善につながる。この効果は、免疫反応に対する抗炎症効果と、それに伴う体液性反応の減少に関連する。Ｇｌｉｓｏｄｉｎの投与は喘息症状の悪化を防ぐようには見えなかったが、アレルギー性感作には良い効果があった。これらの結論は組織学的分析によってさらに確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】