特表 2025-505546 キメラＩＬＴ受容体組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-28

(54)【発明の名称】キメラＩＬＴ受容体組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20250220BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20250220BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250220BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250220BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250220BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20250220BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250220BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20250220BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250220BHJP

   A61K 35/15 20250101ALI20250220BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250220BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250220BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K14/705

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N15/867 Z

C12N5/10

C12N5/0783

A61K35/17

A61K35/15

A61P35/00

A61K39/395 D

A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024545105

(86)(22)【出願日】2023-02-03

(85)【翻訳文提出日】2024-09-19

(86)【国際出願番号】 US2023061966

(87)【国際公開番号】W WO2023150698

(87)【国際公開日】2023-08-10

(31)【優先権主張番号】63/306,514

(32)【優先日】2022-02-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524282629

【氏名又は名称】エヌケーアイエルティー セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】ベイル ジョゼフ アンリ

(72)【発明者】

【氏名】ズオン ミリン ティ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB65

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

ＩＬＴ２又はＩＬＴ４からのターゲティング領域と、膜貫通ドメインと、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）とを含むキメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）が提供される。前記ＩＣＤは、シグナル伝達領域（例えば、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ｚ））及び任意選択的に共刺激領域（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０など）を含む。主題のＣＩＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）、並びに主題のＣＩＲを発現する遺伝子改変細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、マクロファージなどの免疫細胞）も提供される。例えば、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ ＣＩＲをコードする核酸を含むＮＫ細胞などの遺伝子改変免疫細胞が提供される。本主題のＣＩＲは、ＨＬＡ－Ｇを発現するがんに対するＮＫ細胞、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、及びマクロファージなどの免疫細胞による細胞傷害性を活性化するように設計される。
【選択図】図５Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＨＬＡ－Ｇを標的とし、免疫グルリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｕｌｉｎ）様転写産物２（ＩＬＴ２）又は免疫グルリン様転写産物４（ＩＬＴ４）のＤ１～Ｄ２細胞外ドメインを含む、ターゲティング領域と、
（ｂ）膜貫通アミノ酸配列を含む、膜貫通（ＴＭ）領域と、
（ｃ）ＨＬＡ－Ｇへの前記ターゲティング領域の結合により免疫エフェクター細胞の内部にシグナルを伝達してエフェクター細胞の機能を誘発することができるシグナル伝達領域を含む、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）と
を含む、キメラ受容体タンパク質。

【請求項2】

前記ターゲティング領域が、配列番号５７に示されるＩＬＴ４アミノ酸配列のＹ９６又は配列番号３１に示されるＩＬＴ２アミノ酸配列のＹ９６に対応する位置にアミノ酸変異を含む、請求項１に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項3】

前記Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインである、請求項１又は２に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項4】

前記Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインである、請求項１又は２に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項5】

前記ターゲティング領域が、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４のＤ３～Ｄ４細胞外ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項6】

前記ターゲティング領域が、配列番号５５に示されるＩＬＴ４アミノ酸配列のＹ３９４又は配列番号３１に示されるＩＬＴ２アミノ酸配列のＹ３９５に対応する位置にアミノ酸変異を含む、請求項５に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項7】

前記ターゲティング領域が、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを欠く、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項8】

ストークドメインを含む、請求項５に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項9】

前記ストークドメインが、ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＣＤ２８、ＣＨ２／ＣＨ３、ＣＨ３、又はＣＤ８ストークドメインを含む、請求項８に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項10】

ＴＭドメインが、ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＣＤ２８、又はＣＤ８ ＴＭドメインである、請求項１～９のいずれか一項に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項11】

前記シグナル伝達領域が、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項12】

前記シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項13】

前記シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項14】

前記ＩＣＤが、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む共刺激領域を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項15】

前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項１４に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項16】

前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項１４又は１５に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項17】

前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＭｙＤ８８、ＩＬ－１Ｒα、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＩＬ－１Ｒβ、ＣＤ７０、ＩＬ－１８Ｒα、ＣＤ４０、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－３３Ｒα、ＣＤ３０、若しくはＩＬ－３３Ｒβ共刺激ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項18】

前記Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインであり、
前記細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを欠き、
前記キメラ受容体タンパク質が、ＣＤ８ストークドメインを含み、
前記ＴＭ領域が、ＣＤ ＴＭであり、
前記シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、
前記キメラ受容体タンパク質が、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、
請求項１に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項19】

前記Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインであり、
前記細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを欠き、
前記キメラ受容体タンパク質が、ＣＤ８ストークドメインを含み、
前記ＴＭ領域が、ＣＤ ＴＭであり、
前記シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、
前記キメラ受容体タンパク質が、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、
請求項１に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項20】

前記Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインであり、
前記細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを含み、
前記キメラ受容体タンパク質が、ＣＤ８ストークドメインを含み、
前記ＴＭ領域が、ＣＤ ＴＭであり、
前記シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、
前記キメラ受容体タンパク質が、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、
請求項１に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項21】

前記Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインであり、
前記細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを含み、
前記キメラ受容体タンパク質が、ＣＤ８ストークドメインを含み、
前記ＴＭ領域が、ＣＤ ＴＭであり、
前記シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、
前記キメラ受容体タンパク質が、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、
請求項１に記載のキメラ受容体タンパク質。

【請求項22】

請求項１～２１のいずれか一項に記載のキメラ受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。

【請求項23】

前記ヌクレオチド配列が、構成的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２２に記載の核酸。

【請求項24】

前記ヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２２に記載の核酸。

【請求項25】

発現ベクターである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項26】

前記発現ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はプラスミドベクターである、請求項２５に記載の核酸。

【請求項27】

請求項１～２２のいずれか一項に記載のキメラ受容体タンパク質を発現する、遺伝子改変細胞。

【請求項28】

免疫細胞である、請求項２７に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項29】

前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、又はマクロファージである、請求項２８に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項30】

前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２８に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項31】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項２８に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項32】

安全スイッチを発現する、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項33】

前記安全スイッチが、誘導性である、請求項３２に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項34】

前記安全スイッチが、リミドゥシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）によって、又はラパマイシン若しくはラパマイシンの類似体によって誘発される、請求項３３に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項35】

キメラ抗原受容体を更に発現する、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項36】

前記キメラ受容体タンパク質に融合されていない共刺激ポリペプチドを更に発現する、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項37】

前記キメラ受容体タンパク質に融合されていない前記共刺激ポリペプチドが、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＭｙＤ８８、ＩＬ－１Ｒα、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＩＬ－１Ｒβ、ＣＤ７０、ＩＬ－１８Ｒα、ＣＤ４０、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－３３Ｒα、ＣＤ３０、若しくはＩＬ－３３Ｒβ共刺激ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３６に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項38】

請求項２７～３７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞を、必要のある個体に投与することを含む、治療方法。

【請求項39】

前記遺伝子改変細胞が、前記個体に対して自己である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記遺伝子改変細胞が、前記個体に対して同種である、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記個体が、がんを有する、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記個体が、固形腫瘍を有する、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

遺伝子改変細胞を産生する方法であって、
請求項２２～２６のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入し、それによって、遺伝子改変細胞を産生することを含む、前記方法。

【請求項44】

前記遺伝子改変細胞が、免疫細胞である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、又はマクロファージである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項４４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２２年２月４日に出願された米国仮特許出願第６３／３０６，５１４号の利益を主張するものであり、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＸＭＬファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０２３年２月３日に作成され、１４２，６２７バイトのサイズを有する配列表ＸＭＬ「ＮＫＬＴ－００１ＷＯ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ．ｘｍｌ」として本明細書とともに提供される。配列表ＸＭＬの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

Ｉ．序論
免疫細胞療法は、疾患細胞を特異的に標的にするのに役立つ。この治療は、悪性及び非悪性状態の両方を治癒できる可能性がある。例えば、ドナーリンパ球注入、同種Ｔ細胞、及び同種ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用して、白血病の増殖を制御することができる。更に、遺伝子改変は、治療目的で、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、γδＴ細胞、誘導性ＮＫＴ細胞、及びマクロファージを含む免疫細胞の特異性を、所与の標的細胞集団に向けることができる。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を使用して、Ｔ細胞特異性を、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とは独立して、腫瘍関連細胞表面分子に再指示することができる。臨床試験では、多発性骨髄腫に対するＣＤ１９又はＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）などの抗原を標的とすることによって、特に、Ｂ細胞白血病及びリンパ腫などの血液悪性腫瘍におけるＣＡＲ－Ｔ療法の有効性が示されている。これらの標的は、Ｂ細胞及び形質細胞、並びにそれらのそれぞれの腫瘍タイプにおいて別個の発現を有し、ＣＤ１９及びＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍外ターゲティングに起因する形成不全は、免疫グロブリン置き換え療法によって置き換えることができる。３つの自己ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法産物が、米国ＦＤＡによって承認されている。より最近では、ＣＤ１９に対して指向されたＣＡＲを発現するＮＫ（ＣＡＲ－ＮＫ）細胞によって、治療有効性が示されている。

【0004】

急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）とも呼ばれる急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）は、形質転換した骨髄前駆細胞及び単球系統に向かってより分化した細胞の疾患である。ＡＭＬ芽球上に発現されたＣＤ３３及びＣＤ１２３などの標的に対するＣＡＲ－Ｔ療法は、正常な骨髄系前駆細胞上の標的の発現に課題があり、治療による除去が非常に有害な血球減少をもたらす。ＡＭＬのより別個に発現された標的に対するＣＡＲ又は他の指向性細胞療法が必要である。１つのかかる標的は、クラス１Ｂ（又は非古典的）ＭＨＣ－１タンパク質であるＨＬＡ－Ｇである。

【0005】

ＨＬＡ－Ｇは、胎児胎盤の栄養膜細胞の表面に豊富に発現され、ほとんどのクラスのリンパ系及び骨髄系細胞の強力な阻害によって、母親による免疫攻撃から胎児にバリアを提供する。免疫攻撃を回避し、それによって腫瘍の増殖を促進するメカニズムとして、ＨＬＡ－Ｇは、ＡＭＬを含む多様な腫瘍タイプで過剰発現しているが、造血前駆細胞は、免疫攻撃からの先天的な寛容性のためにＨＬＡ－Ｇを発現しない。

【0006】

ＨＬＡ－Ｇ遺伝子は、選択的ｍＲＮＡスプライシングを介して複数の異なるＲＮＡ転写産物を産生し、次いで、少なくとも７つの異なるタンパク質産物を産生する。これらのタンパク質産物は、腫瘍細胞の形質膜上、又はβ２－ミクログロブリン（β２－Ｍ）との複合体形成の有無にかかわらず、腫瘍微小環境内に分泌形態として存在し得る。更に、ＨＬＡ－Ｇは、改変された三次構造を有する単量体又はジスルフィド結合ホモ二量体として存在し得る。従来のＣＡＲ－Ｔ産物は、抗体に由来する一本鎖断片（ｓｃＦｖ）又はキメラ受容体におけるラクダ類由来ＶｈＨドメインを用いて、抗原を標的にする。ＨＬＡ－Ｇ上の所与のｓｃＦｖによってターゲティングされたエピトープは、いくつかのＨＬＡ－Ｇアイソフォームにおいて除去又は排除される可能性が高く、このエピトープを含むアイソフォームの発現を除去するが、ＨＬＡ－Ｇの免疫抑制活性を保持するアイソフォームを発現する腫瘍細胞を選択する。免疫抑制が可能な全てのアイソフォームを含む、ＨＬＡ－Ｇに対する細胞療法のためのターゲティング剤が必要である。

【発明の概要】

【0007】

ＩＩ．概要
本開示によって提供されるのは、キメラ受容体タンパク質を発現するように操作された遺伝子改変細胞であり、キメラ受容体タンパク質は、改変細胞が対象において免疫応答を刺激することができるような親和性及び特異性を有する。例えば、キメラ受容体タンパク質は、形質転換されていない正常組織と比較して、腫瘍組織において高レベルで発現されたタンパク質を標的にし、腫瘍に対する細胞傷害応答又は炎症応答を生成し得る。ＣＡＲは、抗体－抗原相互作用によって可能になる親和性及び特異性に基づいて、腫瘍組織の抗原特異的認識を生成するために頻繁に用いられる。本開示の組成物及び方法について、親和性及び特異性は、抗体又はＶｈＨ関係の使用によって、又はランダムに生成されたペプチドの標的抗原への結合によって維持されるのではなく、むしろ、親和性及び特異性が進化によって維持されるリガンド：受容体相互作用の使用によって維持される。

【0008】

例えば、好ましい実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＨＬＡ－Ｇに対して高い親和性を有するキメラ受容体を発現する。ＨＬＡ－Ｇは、選択的ｍＲＮＡスプライシング及び翻訳後改変によって生成された７つの既知の形態のうちの１つ以上で腫瘍組織において存在し得る標的タンパク質である。ＨＬＡ－Ｇは、免疫細胞の表面上の負のシグナル伝達を行う免疫グルリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｕｌｉｎ）様転写産物２（ＩＬＴ２）及びＩＬＴ４受容体との関与を通して、免疫応答を抑制する作用物質として天然に機能する。これらの好ましい実施形態では、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４による活性型ＨＬＡ－Ｇの認識が代わりに活性化シグナルを生成するように、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞、又はマクロファージが操作される。これらの好ましい実施形態では、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４の細胞内シグナル伝達要素が取り除かれ、免疫細胞活性化及び細胞傷害性を駆動するＣＤ３ζ鎖のＩＴＡＭ含有シグナル伝達ドメインで置き換えられる。そのようなタンパク質は、「キメラＩＬＴ受容体」又は「ＣＩＲ」と呼ばれる。

【0009】

したがって、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４からのターゲティング領域、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内ドメイン（ＩＣＤ）（シグナル伝達領域（例えば、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ））及び任意選択的に共刺激領域（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０など）を含む）を含む、キメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）［加えて、それらをコードする核酸及びそれらを発現する免疫細胞などの遺伝子改変細胞］が提供される。本発明者らは、このアプローチが、抗体ベースのターゲティング領域（例えば、ｓｃＦｖ）を使用することよりも有利であることを理解する。抗体ベースのターゲティングアプローチは、標的にされたエピトープを欠くＨＬＡ－Ｇアイソフォームを発現する腫瘍細胞の選択を引き起こし、したがって、がんが治療を回避できる可能性がある。反対に、主題のＩＬＴ２又はＩＬＴ４ベースのキメラＩＬＴ受容体は、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４がそれらのアイソフォームに天然に結合するため、より多くの、及びおそらく全てのＨＬＡ－Ｇアイソフォームを標的にするはずである。これにより、特定のＨＬＡ－Ｇアイソフォームの選択によって治療を回避するがん細胞の能力が大幅に低下し、おそらく除去されるであろう。

【0010】

ＩＬＴ２及びＩＬＴ４は、細胞外領域において構造的に類似しており、細胞の原形質膜に対して遠位から近位に配置された４つの折り畳まれたドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４）で構成される。ＨＬＡ－Ｇは、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４のＤ１及びＤ２ドメインと相互作用し、これらのＤ１及びＤ２ドメインは、ＨＬＡ－Ｇとの相互作用を維持しながら、ＩＬＴタンパク質の残りの部分から分離することができる。ＨＬＡ－Ｇ以外の細胞タンパク質は、ＩＬＴ４のＤ３及びＤ４ドメインと相互作用することができる。治療設定で毒性を生成する可能性のあるこれらのタンパク質とのオフターゲット相互作用を防止するために、かかるオフＨＬＡ－Ｇ相互作用を消失させることが望ましい。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ３～Ｄ４は、キメラ受容体融合物において、ストーク及び膜貫通ドメインとして機能する別の細胞外ドメインと置き換えられ、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２をＨＬＡ－Ｇ発現標的細胞に提示する。Ｄ１～Ｄ２を提示するストークタンパク質の例は、ＣＤ２８、ＣＤ８α、ＩｇＧ４のＣＨ２－ＣＨ３領域、ＨＥＲ２膜近位、及びｍＧｌｕＲ２に由来する。他の実施形態では、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４のＤ３～Ｄ４ドメインは、単に欠失される。したがって、いくつかの実施形態では、主題のキメラＩＬＴ受容体は、ＩＬＴ２のＤ１～Ｄ２を含むが、ＩＬＴ２のＤ３～Ｄ４を欠く。いくつかの実施形態では、主題のキメラＩＬＴ受容体は、ＩＬＴ４のＤ１～Ｄ２を含み、ＩＬＴ４のＤ３～Ｄ４を欠く。

【0011】

いくつかのタンパク質は、ＩＬＴ４のＤ１及びＤ４領域との結合相互作用を行うことができる。Ｄ４の除去の状況では、そのようなＤ１単独との相互作用が弱くなる可能性が高い。ＨＬＡ－Ｇ以外の他の細胞タンパク質との望ましくない相互作用を更に低減するために、いくつかの実施形態では、ＩＬＴ４のＤ１におけるアミノ酸の置き換えをコードする変異が作製される。例えば、チロシン９６は、アラニンを含む任意のアミノ酸で置き換えることができる。

【0012】

更に別の実施形態では、免疫応答の一部としての生存、持続性、細胞傷害性、及びサイトカインを分泌する能力を改善するための共刺激要素が、キメラ受容体の細胞内部分の一部として含まれ、他の実施形態では、共刺激要素は、キメラ受容体とは別個に発現するように操作される。これらの共刺激要素は、以下のタンパク質のうちのいずれか又はそれらの組み合わせに由来し得る：４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＭｙＤ８８、ＩＬ－１Ｒα、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＩＬ－１Ｒβ、ＩＬ－１８Ｒα、ＣＤ４０、ＩＬ－１８Ｒβ、ＣＤ３０、ＩＬ－３３Ｒα、ＢＣＭＡ、又はＩＬ－３３β。

【0013】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、同じ細胞でキメラ受容体タンパク質と共発現することができる。このスイッチの目的は、ＣＩＲを含む遺伝子改変細胞によって生成される可能性のある毒性を低減することである。そのような毒性は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、免疫細胞活性化神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）、オフターゲット腫瘍外相互作用、又はＨＬＡ－Ｇを発現する可能性のある正常組織に対するターゲティングを引き起こす活動亢進に起因し得る。そのような一実施形態では、安全スイッチは、誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）であり、カスパーゼのアポトーシス促進活性が合成ダイマライザーリガンドであるリミドゥシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）の制御下にあるように、バリアントＦＫＢＰ１２とカスパーゼ９の切断型との融合物である。

【0014】

キメラＩＬＴ受容体に関する試薬、組成物、キット／系、及び方法が提供される。例えば、遺伝子改変細胞の作製方法及び治療方法（例えば、個体に主題のＣＩＲを発現するＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はマクロファージなどの免疫細胞を投与すること）が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

ＩＩＩ．図面の簡単な説明
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことが理解されるべきである。図面は、技術のある特定の実施形態を示しており、限定的ではない。説明を明確にし、容易にするために、図面は縮尺に応じて作られておらず、場合によっては、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が誇張又は拡大されて示されている場合がある。

【図1】図１Ａ～１Ｂ：ＨＬＡ－Ｇ及びＨＬＡ－Ｇの抑制性受容体。（図１Ａ）β２－Ｍと複合体を形成した腫瘍細胞の形質膜に繋留されたＨＬＡ－Ｇ１の概略図。また、ＨＬＡ－Ｇの受容体（主にリンパ球上で発現されたＩＬＴ２タンパク質及び主に骨髄系統に由来する細胞上で発現されたＩＬＴ４）も示されている。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４タンパク質上の４つの別個に折り畳まれた細胞外ドメインは、原形質膜へのそれらの近接性に従ってＤ１～Ｄ４と標識される。細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＣＤ）も示されている。（図１Ｂ）ＨＬＡ－Ｇと複合体を形成したＩＬＴ４（左）又はＩＬＴ２の図。ペプチド結合クレフトを介した古典的なＭＨＣ－Ｉ相互作用とは異なり、ＩＬＴタンパク質は、ＨＬＡ－Ｇの膜近位α３ドメイン及びβ２－Ｍと相互作用する。複合体の形成は、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４のＩＣＤからのシグナル伝達及び免疫細胞活性化の抑制を開始する。

【図2】二量体ＨＬＡ－ＧとのＩＬＴ４複合体の形成。ＨＬＡ－Ｇタンパク質のサブセットは、α１又はα３ドメインにジスルフィド結合二量体を形成する。二量体ＨＬＡ－Ｇは、おそらくＩＬＴシグナル伝達の増強及び免疫細胞の抑制をもたらすアビディティ効果により、ＩＬＴ２／４に対してより高い親和性を有する。

【図3】図３Ａ～３Ｂ：免疫細胞活性化のためのキメラＩＬＴタンパク質。（図３Ａ）ＩＬＴ４の天然ＩＣＤが、免疫細胞活性化受容体又は活性化アダプタータンパク質に由来するシグナル伝達ドメインで置き換えられたキメラＩＬＴ４受容体（ＣＩＲ）の概略図。二量体ＨＬＡ－ＧとのＣＩＲの関与は、免疫細胞を活性化するシグナル伝達を開始する。（図３Ｂ）単量体ＨＬＡ－Ｇと複合体を形成したキメラＩＬＴ４受容体の図。

【図4】図４Ａ～４Ｂ：ＩＬＴ２及びＩＬＴ４のＤ１及びＤ２ドメインのＨＬＡ－Ｇアイソフォームとの相互作用。（図４Ａ）ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームと複合体を形成した単離されたＩＬＴ４（左）及びＩＬＴ２（右）の模式図。ＩＬＴタンパク質のＤ３及びＤ４ドメインは、ＨＬＡ－Ｇとの相互作用には必須ではない（図４Ｂ）。ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームと複合体を形成した単離されたＩＬＴ４（左）及びＩＬＴ２（右）の模式図。

【図5A】図５Ａ～５Ｂ：ＩＬＴ４ Ｄ１Ｄ２ ＣＩＲとＨＬＡ－Ｇとの相互作用。（図５Ａ）キメラハイブリッドとして、別個のタンパク質に由来するストーク及び膜貫通ドメインと融合され、活性化細胞内シグナル伝達部分と更に融合された、ＩＬＴ４のＤ１及びＤ２ドメインの模式図。Ｄ１Ｄ２とＨＬＡ－Ｇとの相互作用は、免疫細胞を活性化するためのシグナル伝達を開始する。

【図5B】図５Ａ～５Ｂ：ＩＬＴ４ Ｄ１Ｄ２ ＣＩＲとＨＬＡ－Ｇとの相互作用。（図５Ｂ）ＩＬＴ４ Ｄ１Ｄ２ ＣＩＲを含むストークと二量体ＨＬＡ－Ｇとの相互作用。

【図6A】図６Ａ～６Ｅ：構築されたγ－レトロウイルスベクターからのＣＩＲタンパク質の形質導入及び発現。（図６Ａ）キメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）と称するＩＬＴ２及びＩＬＴ４融合タンパク質を発現するレトロウイルス構築物の概略図。Ｄ１～Ｄ４は、天然ＩＬＴ２又はＩＬＴ４に由来する細胞外ドメインＤ１～Ｄ４のコードを示す。ＳＴＭは、細胞外Ｄドメインを膜貫通ドメイン（ＴＭ）と連結するリンカードメインであるステム（Ｓ）を指し、これらはＩＬＴ２、ＩＬＴ４、又はＣＤ８α（ＣＤ８ａ）に由来する。ＦＬは、天然ＩＬＴ２及びＩＬＴ４の全長バージョンを指す。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４のＩＣＤは、免疫細胞への抑制シグナルを促進するＩＬＴ２及びＩＬＴ４の天然の細胞内ドメインを指す。ＢＢ．ζは、各々が免疫細胞への活性化シグナルを促進する４－１ＢＢの共刺激ドメイン及びＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインを有する融合物に由来する細胞内ドメインを指す。これらのγ－レトロウイルス構築物の各々はまた、別個のマーカータンパク質ΔＣＤ１９をコードして、形質導入の有効性を決定する。また、表１３Ｂ、１５Ｂ、１６Ｂ、２０Ｂ、２１Ｂ、２３Ｂ、２４Ｂ、２８Ｂ、３６、及び３７（図６Ｂ）、レトロウイルス構築物の初代ヒトＴ細胞への形質導入を参照されたい。フローサイトメトリープロットは、オレンジナノランタン・レニラ（Ｏｒａｎｇｅｎａｎｏｌａｎｔｅｒｎ ｒｅｎｎｉｌａ）ルシフェラーゼ（ＯＮＬ）をコードする別個の共形質導入マーカーウイルスの発現とともに、ＣＩＲ構築物の発現と連結されたΔＣＤ１９マーカータンパク質の発現を示す。示されたプロットは、２人の健康な血液ドナーのうちの１人に由来するＴ細胞を表す。陰性対照（Ｎｅｇ ｃｔｌ）は、Ｔ細胞の機能を阻害し、陰性対照として機能するＩＬＴ２及びＩＬＴ４の全長（ＦＬ）タンパク質を発現するＩＬＴ２及びＩＬＴ４の全長構築物の形質導入を示す（Ｎｅｇ．Ｃｔｌ．）。（図６Ｃ）初代ヒトＴ細胞（Ｎ＝２）ドナーへのレトロウイルス形質導入の効率の定量。（図６Ｄ）フローサイトメトリーによって決定された、抗体染色の平均蛍光強度によって決定された、形質導入後７日目の形質導入ヒトＴ細胞におけるＩＬＴ４細胞外ドメインの発現。（図６Ｅ）フローサイトメトリーによって決定された抗体染色の平均蛍光強度によって決定された、形質導入後７日目の形質導入ヒトＴ細胞におけるＩＬＴ２細胞外ドメインの発現。

【図6B-1】図６Ａの説明を参照のこと。

【図6B-2】図６Ａの説明を参照のこと。

【図6B-3】図６Ａの説明を参照のこと。

【図6C】図６Ａの説明を参照のこと。

【図6D】図６Ａの説明を参照のこと。

【図6E】図６Ａの説明を参照のこと。

【図7A-1】図７Ａ～７Ｂ：ＴＨＰ１急性骨髄性白血病細胞におけるＨＬＡ－Ｇアイソフォームのトランスジェニック発現。（図７Ａ）内因性ＨＬＡ－Ｇタンパク質発現を欠くＴＨＰ１細胞において、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、及びＨＬＡ－Ｇ５を発現するγ－レトロウイルス構築物の安定した発現。形質導入効率は、レトロウイルス構築物によって共発現されたΔＥＧＦＲの発現によって特徴付けられる。ＨＬＡ－Ｇ１発現は、ＨＬＡ－Ｇ１に特異的なＭＥＭ－Ｇ／９抗体を用いたフローサイトメトリーによって容易に検出される。（図７Ｂ）ＨＬＡ－Ｇ１を安定して発現するＴＨＰ１細胞におけるＧＦＰ－ｆｆルシフェラーゼの安定した発現。

【図7A-2】図７Ａ－１の説明を参照のこと。

【図7B】図７Ａ－１の説明を参照のこと。

【図8】ＣＩＲ－Ｔ細胞によるＴＨＰ１－ＨＬＡ－Ｇ１細胞増殖の対照。示されたＩＬＴ２及びＩＬＴ４ ＣＩＲ構築物又は全長ＩＬＴ２若しくはＩＬＴ４（Ｎｅｇ Ｃｔｌ）で形質導入された初代ヒトＴ細胞（Ｎ＝２ドナー）を、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォーム及びＧＦＰ－ｆｆｌｕｃマーカーで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞と共培養した。ＴＨＰ１の増殖又は殺滅を、４８時間にわたるＩｎｃｕｃｙｔｅにおけるＧＦＰ蛍光によって定期的に測定した。Ｔ細胞発現及びＨＬＡＧ１特異的キメラ抗原受容体（ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ）、又はＡＭＬを標的にするＣＤ３３特異的ＣＡＲ（ＣＤ３３ ＣＡＲ）は、陽性対照として機能した。ＮＴ＝未形質導入。

【図9】ＣＩＲ－Ｔ細胞の短期細胞傷害性。示されたＩＬＴ２及びＩＬＴ４ ＣＩＲ構築物又は全長ＩＬＴ２若しくはＩＬＴ４（Ｎｅｇ Ｃｔｌ）で形質導入された初代ヒトＴ細胞（Ｎ＝２ドナー）を、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォーム及びＧＦＰ－ｆｆｌｕｃマーカーで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞と２４時間共培養した。ＴＨＰ１殺滅は、腫瘍標的からのルシフェラーゼ活性の喪失によって測定した。Ｔ細胞発現及びＨＬＡＧ１特異的キメラ抗原受容体（ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ）、又はＡＭＬを標的にするＣＤ３３特異的ＣＡＲ（ＣＤ３３ ＣＡＲ）は、陽性対照として機能した。ＮＴ＝未形質導入。

【図10】ＣＩＲレトロウイルス構築物のストーク及び膜貫通ドメインの改変。４－１ＢＢ及びＣＤ３ζからの細胞内ドメインとともに、ＣＤ８αのヒンジ／ストーク及び膜貫通ドメインに連結されたＩＬＴ４のＨＬＡ－Ｇ結合ドメインＤ１及びＤ２をコードするＣＩＲ４の誘導体を示す概略表を示す。ＣＩＲ構築物６～１０は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４のストーク、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン、又はＣＤ２８に由来するストークの置き換えをコードする。これらを、示されるように、ＣＤ８α又はＣＤ２８の膜貫通ドメインと融合させた。また、表２８Ｂ及び３８～４２も参照されたい。

【図11A】図１１Ａ～１１Ｃ：誘導体ストーク及び膜貫通ドメインを有するＣＩＲタンパク質をコードするγ－レトロウイルス構築物の発現。（図１１Ａ）同じレトロウイルス構築物によって発現された、ΔＣＤ１９マーカーによって特徴付けられる示されたストーク及び膜貫通誘導体をコードするレトロウイルス構築物の形質導入後７日目（黒色）及び１４日目（灰色）の形質導入効率。（図１１Ｂ）アイソタイプ対照のベースラインによってゲーティングされた、ＩＬＴ４抗体を用いてフローサイトメトリーによって決定された代替のストーク及び膜貫通ドメインを有するＣＩＲ構築物の発現。（図１１Ｃ）フローサイトメトリーによるＩＬＴ４特異的抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって決定された、代替のストーク及び膜貫通ドメインを有するＣＩＲ構築物の発現。

【図11B】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図11C】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図12】ヒトＡＭＬ細胞株におけるＨＬＡ－Ｇの発現。Ｍｏｌｍ１３－ＧＦＰ及びＭｏｌｍ１４－ＧＦＰ細胞を、ＨＬＡ－Ｇに特異的な蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーに供した。標識されたアイソタイプ対照抗体で染色することによって、ゲーティングを設定した。

【図13】図１３Ａ～１３Ｂ：Ｍｏｌｍ－１４腫瘍標的に対するＣＩＲ構築物の抗腫瘍有効性。（図１３Ａ）ＧＦＰｆｆｌｕｃで安定的に形質導入されたＨＬＡ－Ｇ陽性Ｍｏｌｍ１４細胞を、５：１のエフェクター対標的比率で、非形質導入初代ヒトＴ細胞、ＣＩＲ－Ｔ細胞、又はＨＬＡ－Ｇ指向性ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した（Ｎ＝２人のドナー）。４８時間におけるＭｏｌｍ１４の増殖は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ顕微鏡インキュベーターにおけるＧＦＰ蛍光によって測定した。（図１３Ｂ）Ｍｏｌｍ１４腫瘍標的に対するＣＩＲ－Ｔ細胞の短期細胞傷害性。ＩＬＴ４ ＣＩＲ構築物又はＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲで形質導入された初代ヒトＴ細胞（Ｎ＝２人のドナー）を、Ｍｏｌｍ１４－ＧＦＰｆｆｌｕｃ細胞と２４時間共培養した。Ｍｏｌｍ１４殺滅は、腫瘍標的からのルシフェラーゼ活性の喪失によって測定した。

【図14】図１４Ａ～１４Ｂ：ＨＬＡ－Ｇアイソフォームを発現するＴＨＰ１細胞に対するＩＬＴ４ ＣＩＲの共培養。（図１４Ａ）初代ヒトＴ細胞（ＮＴ）、ＩＬＴ４ ＣＩＲ－Ｔ細胞、又はＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ｇ１アイソフォームで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞と培養した。ＣＩＲ又はＣＡＲの関与によるＴ細胞の活性化は、培養培地へのインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の分泌によって監視された。（図１４Ｂ）ＨＬＡ－Ｇ２を発現するように安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞を有するＣＩＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞の共培養において産生されたインターフェロン－γの分泌。

【発明を実施するための形態】

【0016】

ＩＶ．詳細な説明
ＩＬＴ２又はＩＬＴ４からのターゲティング領域と、膜貫通ドメインと、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）とを含むキメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）が提供される。ＩＣＤは、シグナル伝達領域（例えば、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ））及び任意選択的に共刺激領域（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０など）を含む。主題のＣＩＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）、並びに主題のＣＩＲを発現する遺伝子改変細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、マクロファージなどの免疫細胞）も提供される。例えば、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ ＣＩＲをコードする核酸を含むＮＫ細胞などの遺伝子改変免疫細胞が提供される。また、遺伝子改変細胞の作製方法及び治療方法（例えば、個体に主題のＣＩＲを発現するＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はマクロファージなどの免疫細胞を投与すること）も提供される。

【0017】

本発明を更に説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、それ自体は勿論、変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することが意図されるものではないことも理解されるべきである。

【0018】

値の範囲が提供される場合、文脈が別段明示しない限り、各介在値は、その範囲の上限及び下限と、その記載された範囲内の任意の他の記載値又は介在値との間に、下限の単位の１０分の１まで包含されることが理解されよう。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、より小さな範囲に含まれ得、また、記述の範囲内の任意の特定の除外された制限に従うことを条件として、本発明内に包含される。記載された範囲が限定の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれか又は両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。

【0019】

ある特定の範囲は、「約」という用語が数値に先行して本明細書で提示される。本明細書では、「約」という用語は、それが先行する正確な数、及びその用語が先行する数に近い、又は近似する数について文字通りの支持を提供するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近いか、又は近似するかどうかを決定する際に、その近い又は近似する列挙されていない数は、それが提示されている文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価物を提供する数であってもよい。

【0020】

別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、本発明の実施又は試験で使用することができるが、代表的な例示的な方法及び材料がここで説明される。

【0021】

本明細書で引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が、参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されるかのように参照により本明細書に組み込まれ、方法及び／又は材料を刊行物が引用されるものに関して開示及び記載するために参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、本出願日以前のその開示に関するものであり、本発明が以前の発明によってそのような刊行物に先行する資格を与えられないことを容認するものとして解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。

【0022】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈において明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という冠詞は、本明細書では、その冠詞の文法的目的語の１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への参照は、複数のかかる細胞を含み、「ポリペプチド（ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への参照は、当業者に既知の１つ以上のポリペプチド及びその等価物などを含む。特許請求の範囲は、任意の任意選択的な要素を除外するように起草される場合があることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求要素の列挙に関連した「もっぱら（ｓｏｌｅｌｙ）」及び「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語の使用のための、又は「消極的な」限定の使用のための先行詞として機能することが意図される。

【0023】

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離され得るか、又はこれらと組み合わされ得る別個の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本発明のある特定の特徴はまた、単一の実施形態では組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別個に又は任意の好適な部分的組み合わせで提供され得る。本発明に係る実施形態の全ての組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、あたかもありとあらゆる組み合わせが本明細書に個別にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びその要素の全ての部分的組み合わせも本発明に具体的に包含され、あたかもありとあらゆるそのような部分的組み合わせが本明細書に個別にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。

【0024】

装置及び方法は、文法的流動性のために、機能的な説明で記載されているか又は記載されるが、特許請求の範囲は、米国特許法第１１２条下で明確に記載されない限り、「手段」又は「ステップ」限定の構文によって必然的に限定されるとなんら解釈されるべきでなく、司法均等論下で特許請求の範囲によって提供される定義の意味及び均等物の完全な範囲を付与されるべきであり、特許請求の範囲は、米国特許法第１１２条下で明確に記載される場合、米国特許法第１１２条下で完全な法定による均等物が付与されるべきであることを明確に理解されたい。

【0025】

本明細書で参照される各特許、特許出願、刊行物、及び文書の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。特許、特許出願、刊行物、及び文書の引用は、前述のうちのいずれかが関連する先行技術であることを承認するものではなく、これらの刊行物又は文書の内容又は日付に関するいかなる承認を構成するものでもない。これらの引用は、関連する開示の検索を示すものではない。文書の日付又は内容に関する全ての記述は、入手可能な情報に基づいており、その正確性又は正当性を認めるものではない。

【0026】

技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述に対して変更を行うことができる。本技術は、１つ以上の特定の実施形態を参照して実質的に詳細に記載されているが、当業者は、本出願に具体的に開示された実施形態に変更が行われ得ることを認識するであろう。しかし、これらの修正及び改善は、本技術の範囲及び趣旨内である。

【0027】

本明細書に例示的に記載された技術は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素の不在下で好適に実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各事例において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語のいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。用いられた用語及び表現は、限定ではなく、説明の用語として使用され、そのような用語及び表現の使用は、示され説明された特徴又はその一部のいずれかの均等物を排除するものではなく、特許請求される技術の範囲内で様々な修正が可能である。「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という用語は、説明される要素のうちの１つ又は２つ以上が文脈的に明確でない限り、それが改変する要素のうちの１つ又は複数を指し得る（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つ以上の試薬を意味し得る）。本明細書で使用される「約」という用語は、基礎となるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラス又はマイナス１０％）を指し、一連の値の先頭で「約」という用語を使用すると、値の各々が変更される（すなわち、「約１、２、及び３」は、約１、約２、及び約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム～１１０グラムの重量を含み得る。更に、値のリストが本明細書に記載されている場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、又は８６％）、リストは、その全ての中間値及び分数値（例えば、５４％、８５．４％）を含む。したがって、本技術は、代表的な実施形態及び任意選択的な特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正及び変形は、当業者によって行われ得、そのような修正及び変形は、本技術の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。

【0028】

１．ＭＨＣクラスＩ（「ＭＨＣ－Ｉ」）分子
ヒトにおけるＭＨＣ－Ｉ分子としては、古典的なＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ α鎖、並びに非古典的なＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈ α鎖が挙げられる。古典的なＭＨＣ－Ｉ分子は、細胞内から細胞傷害性Ｔ細胞にペプチド断片を提示する。非自己抗原がＭＨＣ－Ｉ複合体に提示されると、ＭＨＣ：ペプチド複合体に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣ－Ｉ提示細胞を認識し、殺滅することができる。これらの細胞傷害性シグナルはまた、共刺激シグナル伝達と組み合わせてＴ細胞の増殖能力を活性化する。

【0029】

ＭＨＣクラスＩ分子は、２つのポリペプチド鎖（α及びβ_２－ミクログロブリンβ２－Ｍ）からなるヘテロ二量体である。２本の鎖は、β２－Ｍ及びα_３ドメインの相互作用を介して非共有結合的に連結される。α鎖（ＨＬＡ遺伝子によってコードされる）は、高度に多型であるが、β２－Ｍサブユニット（β_２－マイクログロブリン遺伝子によってコードされる）は、そうではない。α_３ドメインは、形質膜貫通型であり、Ｔ細胞のＣＤ８＋共受容体と相互作用する。α_３－ＣＤ８相互作用は、ＭＨＣ－Ｉ分子を所定の位置に保持し、細胞傷害性Ｔ細胞の表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、そのα_１－α_２ヘテロ二量体リガンドに結合し、カップリングしたペプチドの抗原性をチェックする。α_１及びα_２ドメインが折り畳まれて、ペプチドが結合するためのαヘリックス溝を形成する［Ｂｊｏｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６］。

【0030】

ドナー及びレシピエントを、それらのＨＬＡサブタイプ（例えば、Ａ、Ｂ、又はＣ）に基づいて一致させることが可能であるが、細胞表面に提示されたＭＨＣ－Ｉ：ペプチド複合体は、依然として非自己として認識され得る。同種Ｔ細胞療法の場合、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）につながる正常な宿主組織の同種認識を防ぎ、宿主対移植片（ＨｖＧ）応答を緩和することによって移植細胞の持続性を改善するために、古典的なＨＬＡタイプを一致させることが有益である。しかしながら、がんに対する同種ナチュラルキラー細胞療法は、特にＮＫ細胞によるＫＩＲ認識の不一致及びそれらの先天性細胞傷害性応答の増強を促進することができる対立遺伝子を含むＨＬＡ－Ｃ１、ＨＬＡ－Ｃ２、及びＨＬＡ－Ｂｗ４上の古典的なＨＬＡサブタイプの不一致から恩恵を受ける。

【0031】

非古典的ＭＨＣ－Ｉタンパク質（ＭＨＣクラスＩｂタンパク質とも呼ばれる）も同様のドメイン構造で構成され、一般に、β２－Ｍと結合している［Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２：３３６０］。それらはまた、細胞内部からのペプチド断片に結合するが、結合したペプチドの多様性は限定され、これらのペプチドをＣＤ３－ＴＣＲ複合体に提示して細胞傷害性を指示することはない。代わりに、これらのタンパク質は、免疫細胞のサブセット上で発現された抑制性受容体に関与して、免疫細胞の機能を阻害又は減弱する。ＨＬＡ－Ｅは、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ複合体と関与し、ＨＬＡ－Ｇは、多様なグループの免疫エフェクター上のＩＬＴタンパク質と相互作用する。

【0032】

２．ＨＬＡ－Ｇ
非古典的ＭＨＣ－Ｉタンパク質ＨＬＡ－Ｇは、母体－胎児発生に対する免疫寛容性の維持における主要な因子である［Ｋｏｖａｔｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４８：２２０、Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ，（２０１７）Ｉ ３８：２７２］。その正常な発現は、胎児胎盤の絨毛外栄養膜細胞で最も高く、ほとんどのタイプの母体免疫細胞（特に、ハプロタイプ一致ＭＨＣハプロタイプを有する胎児からのＴ細胞及びＮＫ細胞）の活性化及び浸潤を遮断するように機能する。それは、角膜、間葉系幹細胞のサブセット［Ｃｈａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８：４２５７、Ｓｅｌｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：２１２］及び内分泌膵臓［Ｌｅ Ｄｉｓｃｏｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６４：１０３９、Ｃｉｒｕｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５５：１２１４］を含む他の免疫特権組織において、はるかに低いレベルで維持されている。ＨＬＡ－Ｇは、多様なセットの固形腫瘍タイプ及び白血病［Ｌｉｎ ａｎｄ Ｙａｎ（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍ．９：Ａｒｔ ２１６４で概説］で発現されており、これには、黒色腫［Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９５：４５１０］、大腸がん、ＡＭＬ、ＡＬＬ、腎細胞がん［Ｔｒｏｎｉｋ－Ｌｅ Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ，（２０１７）Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１１：１５６１］、乳がん、及び肺がんが含まれる。がんにおけるその機能は、免疫攻撃を直接回避することであるが、ＨＬＡ－Ｇは、寛容原性ＤＣ－１０樹状細胞でも発現されており、この細胞は、抑制性サイトカインの分泌によってリンパ球応答を抑制し、Ｔｒｅｇ細胞及び骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を活性化して免疫抑制性腫瘍微小環境を生成する［Ｃａｒｏｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８：６４９９、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，（２０１８）ＢＢＡ １８６９：２７８で概説］。したがって、ＨＬＡ－Ｇは、腫瘍促進の重要なチェックポイントメディエーターとみなすことができる。

【0033】

ＨＬＡ－Ｇ遺伝子は、少なくとも７つの異なるタンパク質産物をコードする複数のｍＲＮＡ転写産物を産生する［Ｉｓｈｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ８９：３９４７］（配列番号９、１５、１７、１９、２１）。ＨＬＡ－Ｇ１は、αヘリックスペプチド結合溝を有するα１－α２－α３ドメイン構造と、膜貫通ドメインと、短い細胞内カルボキシ末端ドメインと、を含む（図１を参照）。このドメイン構造は、ＭＨＣ－Ｉ産物にとって標準的である。他の発現されたスプライス産物は、ドメイン全体が欠失しており、例えば、ＨＬＡ－Ｇ２は、α１、α３、及び膜貫通ドメインをコードし、α２が欠失している。ＨＬＡ－Ｇ４は、α３ドメインが欠失し、ＨＬＡ－Ｇ３は、α１ドメインのみをコードする。導入遺伝子としてＭ８細胞で発現させた場合、これらの形態のＨＬＡ－Ｇの各々は、ＮＫ細胞攻撃に向けて免疫抑制活性を示すことが報告された［Ｒｉｔｅａｕ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６６：５０１８］。選択的スプライシングによって生成された分泌形態としては、ＨＬＡ－Ｇ５及びＨＬＡ－Ｇ６が挙げられ、これらは、それぞれＨＬＡ－Ｇ１及びＧ２のドメイン構造を維持するが、イントロン４のスプライスドナー部位を使用せず、代わりにイントロン４に由来する短い分泌型ペプチドをコードする。同様に、ＨＬＡ－Ｇ７は、イントロン２に由来する３つのアミノ酸ペプチドを使用する。一部のＨＬＡ－Ｇ１の細胞表面を除くために、マトリックスメタロプロテイナーゼによる膜貫通ドメインでの切断によって、ＨＬＡ－Ｇ１の更なる分泌形態が生成される［Ｒｉｚｚｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３８１：２４３］。

【0034】

ＨＬＡ－Ｇは、単量体形態及びオリゴマー形態で存在する。オリゴマーは、主に、（α１における）Ｃｙｓ４２又は（α２における）Ｃｙｓ１４７でのジスルフィド結合によって指向された二量体である［Ｇｏｎｅｎ－Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ，（２００５）Ｊ．Ｉｍｍ．１７５：４８６６、Ｂｏｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９９：１６１８０］。ＨＬＡ－Ｇの二量体形態が主な免疫抑制形態であり、天然の単量体の二量体形態と比較して、ねじれた四次構造をとるという証拠が存在する［Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０３：１００９５、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２：３３６０、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｃｅｌ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍ．１７：９６６］。

【0035】

異なるＨＬＡ－Ｇ形態は一緒に、ターゲティング剤としての抗体由来ｓｃＦｖ又はＶｈＨドメインの結合に依存するＣＡＲベースの療法に対する課題を生み出す。異なるスプライス形態は、所与の抗体のエピトープを削除するため、免疫抑制活性を保持しながら、ＣＡＲのバインダーによって認識されないエピトープのみを発現するために、ＣＡＲ療法によって選択が行われる。更に、オリゴマー化は、構造変化により、ｓｃＦｖのエピトープを覆い隠す可能性がある。同様に、ＨＬＡ－Ｇ ４Ｈ８４及び８７Ｇのための一般的に使用される抗体試薬のうちの２つは、ＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ細胞のオフターゲット、腫瘍外ターゲティングにつながり得る他のＨＬＡ種に対する交差反応性を示す［Ａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ（２０２１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ ２１：８６７８、Ｐｏｌａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｈｕｍ．Ｉｍｍ．６５：１５７、Ｓｗｅｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１８）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍ １９４：８０、Ｆｕｒｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ（２０１９）Ｉｎｔ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ ２０：５９４７］。

【0036】

３．ＩＬＴ２及びＩＬＴ４
ＨＬＡ－Ｇは、標的免疫細胞上の抑制性受容体免疫グロブリン様転写産物２（ＩＬＴ２）及びＩＬＴ４（それぞれ、ＬＩＲＢ１及びＬＩＲＢ２、又はＣＤ８５ｊ及びＣＤ８５ｄとも呼ばれる）の膜結合リガンドとしてのその免疫抑制活性を指示する［Ｃｏｌｏｎｎａ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：３０９６、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ（２０１８）ＢＢＡ １８６９：２７８で概説］。ＩＬＴ２（配列番号２９）は、ナチュラルキラー細胞、ｉＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び樹状細胞のサブセットで発現される。ＩＬＴ４（配列番号５３）は、主に骨髄系細胞及び幹細胞（マクロファージ、骨髄系由来サプレッサー細胞を含む）（単球系統上の低分化細胞の集団）、顆粒球（好中球、単球、造血幹細胞を含む）、及び一部のニューロンにおいてより広範な発現パターンを有する。

【0037】

ＩＬＴ２は、膜遠位Ｄ１からほとんどの膜近位Ｄ４までの列状に配置された免疫グロブリンドメイン（Ｉｇドメイン）と配列相同性及び構造相同性を有する４つのドメインからなる細胞外ドメイン構造、続いて、膜貫通ドメイン、及び４つの反復免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを有する。ＩＬＴ４は、同様の細胞外及び膜貫通アーキテクチャを有するが、その細胞内ドメインには３つのＩＴＩＭのみを有する。

【0038】

ＩＬＴ２（例えば、配列番号３７及び７１を参照）及びＩＬＴ４（例えば、配列番号５７及び７５を参照）のＤ１及びＤ２ドメインは、ＨＬＡ－Ｇとの相互作用を支配し、Ｄ３及びＤ４ドメインから分離され得る［Ｄｏｎａｄｉ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６８：３６９、Ｍｏｒａｌｅｓ（２００７）１２２：１７９、ＨｏＷａｎＹｉｎ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６９：４０４１、Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０３：１００９５、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｃｅｌ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍ．１７：９６６］。古典的なＭＨＣ－Ｉを有するＣＤ３複合体によって形成された活性化相互作用とは異なり、ＮＫ細胞のＩＬＴ２及びＩＬＴ４のＫＩＲタンパク質によって形成される抑制性及び活性化相互作用は、ペプチド結合溝を含むα１－α２ドメインとは結合しないが、代わりに、膜近位α３ドメイン及びβ２－ミクログロブリンと相互作用する（図１Ｂを参照）。ＩＬＴ２は、β２－Ｍと広範な接触を行い、ＨＬＡ－Ｇのα３と比較的少ない接触を行い、たとえ低い親和性相互作用を維持するにもβ２－ＭのＨＬＡ－Ｇとの会合を必要とする。逆に、ＩＬＴ４は、α３と広範な接触を行い、おそらく、α１ドメインのみを含むＨＬＡ－Ｇ３／Ｇ７を除いて、ＨＬＡ－Ｇの全ての既知の能動的な免疫抑制形態との相互作用を維持することができる。

【0039】

ＩＬＴ２及びＩＬＴ４は、他のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣＩ様タンパク質、特に、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、並びにＨＬＡ－Ｆ、ＣＤ１ｄ、及びＵＬ１８と相互作用することができる。ＵＬ１８、サイトメガロウイルスからのデコイＭＨＣ－Ｉ［Ｗｉｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ ２：６］を除いて、これらは、２μＭ～４０μＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する低親和性相互作用である。免疫抑制シグナル伝達の関連性は、これほど弱い親和性では実証されていない。同様に、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４とＨＬＡ－Ｇの単量体形態との相互作用は、μＭ範囲で弱い。しかしながら、二量体ＨＬＡ－Ｇ形態は、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４との高い親和性（２～４ｎＭ）相互作用を示すが、これはおそらく、更なる接触部位の提示、又は代替的に、ＩＬＴ解離の解離速度を低下させるアビディティ効果によるものである［Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２８１：１０４４０、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍ １７：９６６］。したがって、ＨＬＡ－Ｇの二量体形態は、生物活性である可能性が最も高く［Ｇｏｎｅｎ－Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ，（２００５）Ｊ．Ｉｍｍ．１７５：４８６６］、腫瘍環境で免疫抑制のために機能し、更に、キメラ受容体による細胞ベースの免疫療法のために標的にされた分子として関連する可能性が最も高い。

【0040】

ＩＬＴ４は、アンジオポエチン様タンパク質２及び５を含む非ＭＨＣリガンドの受容体である［Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４８５：６５６、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ １２４：９２４］。可溶性ＡＮＧＰＴＬ２及びＡＮＧＰＴＬ５による調節は、ＩＬＴ４を発現する造血幹細胞の自己再生及び生存のための骨髄間質からの保護シグナルを提供すると考えられる。ＩＬＴ４とＡＮＧＬＰとの間の相互作用は、ＩＬＴ４のＤ４ドメインと協調してＤ１ドメインによって指向され、Ｄ１又はＤ４のいずれかの特異的残基は、高い親和性相互作用を維持するために不可欠である。特に、チロシン９６のアラニンへの変異は、ＡＮＧＰＴＬ２／５の結合を減少させたが、全長ＩＬＴ４とのＨＬＡ－Ｇ１の相互作用を低減させなかった［Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ １２４：９２４］。

【0041】

ＩＬＴ４は、ミエリンに由来する抑制性Ｎｏｇｏ受容体リガンドに対する中程度の親和性で相互作用する［Ａｔｗａｌ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：９６７、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ，（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２８６：２５７３９］。ＩＬＴタンパク質のマウスオーソログであるＰＩＲＢは、ニューロンのサブセットにも見出され、ミエリンベースのＭＡＧ、Ｎｏｇｏ、及びＯＭｇｐ［米国特許第２０１０／００４７２３２号］、並びにＳｅｍａ４ａ［Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．７：７４２］との相互作用によって軸索伸長を調節し得る。高親和性相互作用を、ＩＬＴ４、ＰＩＲＢについてのマウスオーソログにおいて特徴付けられ、ＨＬＡ－Ｇ結合Ｄ１及びＤ２ドメインにはマッピングされず、むしろＰＩＲＢの膜近位ドメインにマッピングされた［Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ，（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２８６：２５７３９］。

【0042】

４．キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（又はＣＡＲ）は、細胞に抗原特異性を与えるように設計された人工受容体である。それらは、一般に、細胞を活性化するために選択された抗原特異的成分、膜貫通成分、及び細胞内成分を含む。ＣＡＲを発現する細胞は、がん療法を含む様々な療法で使用され得る。

【0043】

ＣＡＲは、例えば、膜貫通ポリペプチドと、細胞を活性化するために選択され、それによって特異的免疫を提供する細胞内ドメインポリペプチドと、に連結された標的抗原（抗原認識ドメイン）を認識するポリペプチド配列を含むキメラポリペプチドである。抗原認識ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であってもよく、例えば、Ｔ細胞受容体又はラクダ類ＶｈＨメインなどの他の分子に由来してもよい。細胞内ドメインは、細胞の活性化を引き起こす少なくとも１つのポリペプチド（「シグナル伝達領域」）を含み、例えば、限定されないが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）（例えば、配列番号３３を参照）、及び任意選択的に、共刺激分子（「共刺激領域」）（例えば、限定されないが、ＣＤ２８（例えば、配列番号４９を参照）、ＯＸ４０、及び４－１ＢＢ（例えば、配列番号３５を参照））を含む。

【0044】

したがって、ＣＡＲの使用の典型的な例では、細胞は、リンカー領域を含む膜貫通ドメイン及びＣＤ３ゼータ成分（例えば、配列番号３３を参照）に由来する細胞内ドメインに融合された一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように改変される。天然Ｔ細胞及びＮＫ細胞では、ＣＤ３ゼータからのシグナルは、ＮＦ－ＡＴｃ転写因子へのシグナル伝達を通して、Ｔ細胞の初期活性化を駆動する。これらのシグナルは、細胞傷害性Ｔリンパ球における標的にされた細胞の殺滅を駆動し、共刺激シグナル伝達経路と相乗作用して、Ｔ細胞免疫応答の堅牢な細胞増殖を駆動する。遺伝子改変細胞は、ＣＡＲを発現する核酸、及びキメラシグナル伝達ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸（同じ又は異なる）による形質導入又はトランスフェクションによって改変され得る（以下を参照）。他の実施形態では、ＣＡＲは、キメラシグナル伝達ポリペプチドも発現することなく発現する。

【0045】

キメラ抗原受容体は、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞、又はマクロファージで発現させて、抗原特異的細胞傷害を生成することができる。

【0046】

ＣＡＲには、抗体に由来するキメラ受容体が含まれるが、キメラＴ細胞受容体も含まれる。これらのキメラＴ細胞受容体は、標的抗原を認識するポリペプチド配列を含んでもよく、認識配列は、例えば、限定されないが、Ｔ細胞受容体又はｓｃＦｖに由来する認識配列であってもよい。細胞内ドメインポリペプチドは、Ｔ細胞を活性化するように作用するものである。キメラＴ細胞受容体は、例えば、Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｅｓｈａｒ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９２）６：３３７０－３３７８及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：１－１３で議論されている。

【0047】

５．ＩＬＴタンパク質によってターゲティングされたキメラ受容体（すなわち、「キメラＩＬＴ受容体」又は「ＣＩＲ」）
Ｔ細胞又はＮＫ細胞の細胞傷害特異性の再指示は、抗原ｓｃＦｖ（又はＴＣＲ）相互作用の関与によって制御され得るが、標的リガンドの受容体が、免疫細胞を活性化するためのシグナルの伝達を可能に維持しながら、細胞との高い親和性相互作用を維持することができるキメラタンパク質に形成され得るように、受容体－リガンド対合によっても制御され得る（以下では例として、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を使用する）。ＣＡＲ様タンパク質の結合物質としてのそのような受容体の使用に不可欠なのは、標的タンパク質との高い親和性相互作用（５０ｎＭ未満）であり、免疫細胞の標的との安定した接着、及びＴ細胞又はＮＫ細胞を活性化するための安定したシグナル伝達を可能にする。更に、非常に好ましい実施形態では、標的と関与するために使用される受容体又は受容体の一部は、腫瘍外ターゲティングを防ぐために標的のみに特異的である。第三に、ｓｃＦｖ及び類似のバインダーと同様に、標的タンパク質又はリガンドの高レベルの発現が、正常組織と比較して標的組織（例えば、腫瘍）に対して維持されることが不可欠である。

【0048】

（ｉ）ターゲティング領域
ＩＬＴ２の細胞外ドメイン（Ｄ１～Ｄ４）（例えば、Ｄ１～Ｄ４に加えてＩＬＴ２の膜貫通領域を含む、配列番号３１を参照）は、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞を標的にし、かつ、天然に抑制性のＩＴＩＭ含有ＩＬＴ２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を活性化シグナルを駆動するシグナル伝達成分（例えば、ＣＤ３ζ及び４－１ＢＢのＩＣＤ）に置き換えるキメラバージョンのＩＬＴ２を発現する免疫細胞において活性化シグナルの伝達を生成するように、操作され得る。

【0049】

同様に、ＩＬＴ４の細胞外ドメイン（Ｄ１～Ｄ４）（例えば、Ｄ１～Ｄ４に加えてＩＬＴ４の膜貫通領域を含む、配列番号５５を参照）は、ＩＬＴ４ ＩＣＤを活性化シグナル伝達部分（例えば、ＣＤ３ζ及び４－１ＢＢのＩＣＤ）に置き換えることによって、免疫細胞で活性化シグナルを生成するように操作され得る。ターゲティング領域にＩＬＴ２又はＩＬＴ４のＤ１～Ｄ４細胞外ドメインを使用すると、ＩＬＴ２ Ｄ１～Ｄ４キメラ受容体（すなわち、ＩＬＴ２ Ｄ１～Ｄ４ ＣＩＲ）又はＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ４キメラ受容体（すなわち、ＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ４ ＣＩＲ）が生成される（図４Ａを参照）。したがって、いくつかの場合では、主題のキメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）のターゲティング領域は、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ４ドメイン（したがって、ＨＬＡ－Ｇを標的にする）を含む。

【0050】

ＩＬＴ４は、ＨＬＡ重鎖上のα３とのより多くの接触を維持し、ＨＬＡ－Ｇの遊離重鎖形態と相互作用することができるが、ＩＬＴ２ Ｄ１／Ｄ２は、ＨＬＡ－Ｇとの相互作用を維持するためにβ２－Ｍ及びα３との接触を必要とする（図４Ｂ）。

【0051】

ＩＬＴ２及びＩＬＴ４は、二量体ＨＬＡ－Ｇ及び低親和性（Ｋ_Ｄは、単量体ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ１ｄを含む他のＭＨＣ－Ｉタンパク質との相互作用に対してμＭである）との高い親和性（Ｋ_Ｄ 低ｎＭ）相互作用を維持するため、高レベルのＨＬＡ－Ｇを保有する腫瘍に対する特異性は、二量体形態でのＨＬＡ－Ｇの量を比例して増加し、高レベルの古典的ＭＨＣ－Ｉを発現するが、ＨＬＡ－Ｇはほとんど又はまったく発現しない正常組織よりも腫瘍組織の選択を可能にする。ＨＬＡ－Ｇ１の、Ｃｙｓ４２位からＳｅｒへの変異又はＣｙｓ１４７位からＳｅｒへの変異は、ＨＬＡ－Ｇ１の二量体化を遮断し、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ ＣＩＲ－Ｔ細胞又はＣＩＲ－ＮＫ細胞によるターゲティングを著しく低下させる。

【0052】

本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇがいくつかの異なるアイソフォームで存在することを認識している。抗体ベースのターゲティング領域（ｓｃＦｖなど）を含むＣＡＲは、抗原結合領域（例えば、ｓｃＦｖ）によってターゲティングされたエピトープを含むＨＬＡ－Ｇアイソフォームのみを標的にすることができるであろう。これにより、標的にされたエピトープを欠くＨＬＡ－Ｇアイソフォームを発現する腫瘍細胞が選択される可能性があり、したがって、がんが治療を回避できる可能がある。反対に、主題のＩＬＴ２又はＩＬＴ４ベースのキメラ受容体タンパク質（ＨＬＡ－Ｇを標的とする）は、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４がそれらのアイソフォームに天然に結合するため、より多くの、及びおそらく全てのＨＬＡ－Ｇアイソフォームを標的にするはずである。

【0053】

ＩＬＴ２ Ｄ１／Ｄ２ ＣＩＲ及びＩＬＴ４ Ｄ１／Ｄ２ ＣＩＲの構築
Ｄ１及びＤ２ドメインは、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４のＨＬＡ－Ｇへの直接結合に十分であるが、Ｄ３及びＤ４ドメインは、Ｄ１及びＤ２をＨＬＡ－Ｇに提示する足場として機能する可能性が高い［Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ Ａｐｒ １４；２８１（１５）：１０４３９－４７］。いくつかの実施形態では、Ｄ３及びＤ４ドメインは、ＩＬＴ２ ＣＩＲ又は及びＩＬＴ４ ＣＩＲから欠失され得、ＨＬＡ－Ｇ形態（図４Ａを参照）を有するＩＬＴ２（例えば、配列番号７１を参照）又はＩＬＴ４（例えば、配列番号７５を参照）からのＤ１～Ｄ２ドメインを介して機能的相互作用を維持する。したがって、いくつかの場合では、主題のＩＬＴ２又はＩＬＴ４キメラ受容体のターゲティング領域は、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４のＤ１～Ｄ２ドメインを含み（例えば、ＩＬＴ２のＤ１～Ｄ２については配列番号７１、ＩＬＴ４のＤ１～Ｄ２については配列番号７５を参照）、場合によっては、ターゲティング領域は、Ｄ３～Ｄ４ドメインを含まない（すなわち、欠く）であろう。

【0054】

いくつかの実施形態では、主題のＩＬＴ２キメラ受容体のターゲティング領域（Ｄ１～Ｄ２ドメインを含む領域）は、配列番号３７、７０、７１、及び７２（その配列は以下のとおりである）のうちのいずれか１つに示されるＩＬＴ２配列と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＭＨＬＰＫＰＴＬＷＡＥＰＧＳＶＩＴＱＧＳＰＶＴＬＲＣＱＧＧＱＥＴＱＥＹＲＬＹＲＥＫＫＴＡＰＷＩＴＲＩＰＱＥＬＶＫＫＧＱＦＰＩＰＳＩＴＷＥＨＴＧＲＹＲＣＹＹＧＳＤＴＡＧＲＳＥＳＳＤＰＬＥＬＶＶＴＧＡＹＩＫＰＴＬＳＡＱＰＳＰＶＶＮＳＧＧＮＶＴＬＱＣＤＳＱＶＡＦＤＧＦＩＬＣＫＥＧＥＤＥＨＰＱＣＬＮＳＱＰＨＡＲＧＳＳＲＡＩＦＳＶＧＰＶＳＰＳＲＲＷＷＹＲＣＹＡＹＤＳＮＳＰＹＥＷＳＬＰＳＤＬＬＥＬＬＶＬＧ（配列番号３７）
ＭＨＬＰＫＰＴＬＷＡＥＰＧＳＶＩＴＱＧＳＰＶＴＬＲＣＱＧＧＱＥＴＱＥＹＲＬＹＲＥＫＫＴＡＬＷＩＴＲＩＰＱＥＬＶＫＫＧＱＦＰＩＰＳＩＴＷＥＨＡＧＲＹＲＣＹＹＧＳＤＴＡＧＲＳＥＳＳＤＰＬＥＬＶＶＴＧＡＹＩＫＰＴＬＳＡＱＰＳＰＶＶＮＳＧＧＮＶＩＬＱＣＤＳＱＶＡＦＤＧＦＳＬＣＫＥＧＥＤＥＨＰＱＣＬＮＳＱＰＨＡＲＧＳＳＲＡＩＦＳＶＧＰＶＳＰＳＲＲＷＷＹＲＣＹＡＹＤＳＮＳＰＹＥＷＳＬＰＳＤＬＬＥＬＬＶＬＧ（配列番号７０）
ＰＫＰＴＬＷＡＥＰＧＳＶＩＴＱＧＳＰＶＴＬＲＣＱＧＧＱＥＴＱＥＹＲＬＹＲＥＫＫＴＡＰＷＩＴＲＩＰＱＥＬＶＫＫＧＱＦＰＩＰＳＩＴＷＥＨＴＧＲＹＲＣＹＹＧＳＤＴＡＧＲＳＥＳＳＤＰＬＥＬＶＶＴＧＡＹＩＫＰＴＬＳＡＱＰＳＰＶＶＮＳＧＧＮＶＴＬＱＣＤＳＱＶＡＦＤＧＦＩＬＣＫＥＧＥＤＥＨＰＱＣＬＮＳＱＰＨＡＲＧＳＳＲＡＩＦＳＶＧＰＶＳＰＳＲＲＷＷＹＲＣＹＡＹＤＳＮＳＰＹＥＷＳＬＰＳＤＬＬＥＬＬＶＬＧ（配列番号７１）
ＰＫＰＴＬＷＡＥＰＧＳＶＩＴＱＧＳＰＶＴＬＲＣＱＧＧＱＥＴＱＥＹＲＬＹＲＥＫＫＴＡＬＷＩＴＲＩＰＱＥＬＶＫＫＧＱＦＰＩＰＳＩＴＷＥＨＡＧＲＹＲＣＹＹＧＳＤＴＡＧＲＳＥＳＳＤＰＬＥＬＶＶＴＧＡＹＩＫＰＴＬＳＡＱＰＳＰＶＶＮＳＧＧＮＶＩＬＱＣＤＳＱＶＡＦＤＧＦＳＬＣＫＥＧＥＤＥＨＰＱＣＬＮＳＱＰＨＡＲＧＳＳＲＡＩＦＳＶＧＰＶＳＰＳＲＲＷＷＹＲＣＹＡＹＤＳＮＳＰＹＥＷＳＬＰＳＤＬＬＥＬＬＶＬＧ（配列番号７２）

【0055】

いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号３７、７０、７１、及び７２のうちのいずれか１つに示される配列と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号３７、７０、７１、及び７２のうちのいずれか１つに示される配列と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号３７、７０、７１、及び７２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの場合では、ＩＬＴ２キメラ受容体のターゲティング領域（Ｄ１～Ｄ２ドメインを含む領域）は、配列番号３７として示される配列と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号３７として示される配列と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号３７として示される配列と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号３７として示されるアミノ酸配列を含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、主題のＩＬＴ４キメラ受容体のターゲティング領域（Ｄ１～Ｄ２ドメインを含む領域）は、配列番号５７、７４、及び７５（それらの配列は以下のとおりである）のうちのいずれか１つに示されるＩＬＴ４配列と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＭＴＰＩＶＴＶＬＩＣＬＧＬＳＬＧＰＲＴＨＶＱＴＧＴＩＰＫＰＴＬＷＡＥＰＤＳＶＩＴＱＧＳＰＶＴＬＳＣＱＧＳＬＥＡＱＥＹＲＬＹＲＥＫＫＳＡＳＷＩＴＲＩＲＰＥＬＶＫＮＧＱＦＨＩＰＳＩＴＷＥＨＴＧＲＹＧＣＱＹＹＳＲＡＲＷＳＥＬＳＤＰＬＶＬＶＭＴＧＡＹＰＫＰＴＬＳＡＱＰＳＰＶＶＴＳＧＧＲＶＴＬＱＣＥＳＱＶＡＦＧＧＦＩＬＣＫＥＧＥＤＥＨＰＱＣＬＮＳＱＰＨＡＲＧＳＳＲＡＩＦＳＶＧＰＶＳＰＮＲＲＷＳＨＲＣＹＧＹＤＬＮＳＰＹＶＷＳＳＰＳＤＬＬＥＬＬＶＰＧ（配列番号５７）
ＭＴＰＩＶＴＶＬＩＣＬＧＬＳＬＧＰＲＴＲＶＱＴＧＴＩＰＫＰＴＬＷＡＥＰＤＳＶＩＴＱＧＳＰＶＴＬＳＣＱＧＳＬＥＡＱＥＹＲＬＹＲＥＫＫＳＡＳＷＩＴＲＩＲＰＥＬＶＫＮＧＱＦＨＩＰＳＩＴＷＥＨＴＧＲＹＧＣＱＹＹＳＲＡＲＷＳＥＬＳＤＰＬＶＬＶＭＴＧＡＹＰＫＰＴＬＳＡＱＰＳＰＶＶＴＳＧＧＲＶＴＬＱＣＥＳＱＶＡＦＧＧＦＩＬＣＫＥＧＥＤＥＨＰＱＣＬＮＳＱＰＨＡＲＧＳＳＲＡＩＦＳＶＧＰＶＳＰＮＲＲＷＳＨＲＣＹＧＹＤＬＮＳＰＹＶＷＳＳＰＳＤＬＬＥＬＬＶＰＧ（配列番号７４）
ＰＫＰＴＬＷＡＥＰＤＳＶＩＴＱＧＳＰＶＴＬＳＣＱＧＳＬＥＡＱＥＹＲＬＹＲＥＫＫＳＡＳＷＩＴＲＩＲＰＥＬＶＫＮＧＱＦＨＩＰＳＩＴＷＥＨＴＧＲＹＧＣＱＹＹＳＲＡＲＷＳＥＬＳＤＰＬＶＬＶＭＴＧＡＹＰＫＰＴＬＳＡＱＰＳＰＶＶＴＳＧＧＲＶＴＬＱＣＥＳＱＶＡＦＧＧＦＩＬＣＫＥＧＥＤＥＨＰＱＣＬＮＳＱＰＨＡＲＧＳＳＲＡＩＦＳＶＧＰＶＳＰＮＲＲＷＳＨＲＣＹＧＹＤＬＮＳＰＹＶＷＳＳＰＳＤＬＬＥＬＬＶＰＧ（配列番号７５）

【0058】

いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号５７、７４、及び７５のうちのいずれか１つに示される配列と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号５７、７４、及び７５のうちのいずれか１つに示される配列と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号５７、７４、及び７５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0059】

いくつかの場合では、ＩＬＴ４キメラ受容体のターゲティング領域（Ｄ１～Ｄ２ドメインを含む領域）は、配列番号５７として示される配列と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号５７として示される配列と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号５７として示される配列と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ターゲティング領域は、配列番号５７として示されるアミノ酸配列を含む。

【0060】

本セクションで論じられる上記の実施形態のうちのいずれかについて、いくつかの場合では、本主題のＩＬＴ２又はＩＬＴ４キメラ受容体は、Ｄ３及びＤ４ドメインを欠く（すなわち、それぞれ、ＩＬＴ２（配列番号７３）又はＩＬＴ４（配列番号７６）のＤ３～Ｄ４ドメインに対応する領域を欠く）。ＩＬＴ２の場合、Ｄ３～Ｄ４ドメインを有する領域は、以下のとおりである：
ＰＬＤＩＬＩＡＧＱＦＹＤＲＶＳＬＳＶＱＰＧＰＴＶＡＳＧＥＮＶＴＬＬＣＱＳＱＧＷＭＱＴＦＬＬＴＫＥＧＡＡＤＤＰＷＲＬＲＳＴＹＱＳＱＫＹＱＡＥＦＰＭＧＰＶＴＳＡＨＡＧＴＹＲＣＹＧＳＱＳＳＫＰＹＬＬＴ（配列番号７３）。
ＩＬＴ４の場合、Ｄ３～Ｄ４ドメインを有する領域は、以下のとおりである：
ＱＰＧＰＶＭＡＰＧＥＳＬＴＬＱＣＶＳＤＶＧＹＤＲＦＶＬＹＫＥＧＥＲＤＬＲＱＬＰＧＲＱＰＱＡＧＬＳＱＡＮＦＴＬＧＰＶＳＲＳＹＧＧＱＹＲＣＹＧＡＨＮＬＳＳＥＣＳＡＰＳＤＰＬＤＩＬＩＴＧＱＩＲＧＴＰＦＩＳＶＱＰＧＰＴＶＡＳＧＥＮＶＴＬＬＣＱＳＷＲＱＦＨＴＦＬＬＴＫＡＧＡＡＤＡＰＬＲＬＲＳＩＨＥＹＰＫＹＱＡＥＦＰＭＳＰＶＴＳＡＨＡＧＴＹＲＣＹＧＳＬＮＳＤＰＹＬＬＳＨＰＳＥＰＬＥＬ（配列番号７６）。

【0061】

いくつかの場合では、主題のＣＩＲは、配列番号７３として示される配列と８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を欠く。いくつかの場合では、主題のＣＩＲは、配列番号７６として示される配列と８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を欠く。いくつかの場合では、主題のＣＩＲは、配列番号７３及び７６のうちのいずれか１つに示される配列と８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を欠く。

【0062】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４からのＤ１～Ｄ２ドメインと原形質膜とのキメラとして融合され得、Ｄ３及びＤ４ドメインを置き換えるストークとして機能する。これらの実施形態では、Ｄ３～Ｄ４の欠失は、例えば、ＡＮＧＰＴＬ２及びＡＮＧＰＴＬ５とＩＬＴ４ Ｄ４との相互作用、並びにｎｏｇｏ、Ｏｍｇｐ、及びＭＡＧとＩＬＴ４ Ｄ３～Ｄ４との相互作用など、Ｄ３又はＤ４ドメインを介して天然ＩＬＴ２又はＩＬＴ４と相互作用するＨＬＡ－Ｇ以外のタンパク質とのＣＩＲの相互作用を妨げ得る。そのような相互作用の防止により、ＣＩＲを発現する細胞と骨髄間質、ミエリン、及び内皮などの非腫瘍組織との潜在的に有毒な誤ターゲティングが減少する可能性がある。

【0063】

ストークドメイン
上記の実施形態では、Ｄ３～Ｄ４の置き換えは、別個の細胞上で発現されたＨＬＡ－Ｇの状況で、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２バインダーを適切に提示する任意のタンパク質又はタンパク質の一部で行うことができる。ある特定の実施形態では、短いポリペプチドリンカーは、膜貫通ドメインとキメラＩＬＴ受容体の細胞内ドメインとの間の結合を形成し得る。したがって、キメラＩＬＴ受容体は、ストーク（すなわち、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のアミノ酸の細胞外領域）を更に含み得る。ストークドメインの目的は、Ｄ１／Ｄ２ドメインを形質膜から離れて、標的タンパク質ＨＬＡ－Ｇに向かって延長することである。例えば、ストークは、選択された膜貫通ドメインに天然に会合するアミノ酸の配列であり得る。いくつかの実施形態では、キメラＩＬＴ受容体は、ＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ある特定の実施形態では、キメラＩＬＴ受容体は、膜貫通ドメインの細胞外部分における追加のアミノ酸とともにＣＤ８膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ８ストークを含む。特定の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、本明細書に開示される配列を含む（又はそれからなる）（表４～４２を参照）。別の特定の実施形態では、ＣＤ８ストークは、本明細書に開示される配列を含む（又はそれからなる）（表４～４２を参照）。キメラＩＬＴ受容体は、膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間のアミノ酸の領域を更に含み得、これは、膜貫通ドメインが由来するポリペプチドと天然に会合する。

【0064】

形質導入後、細胞は今やその表面でＣＩＲを発現し、ＨＬＡ－Ｇとの接触及び連結時に、細胞傷害性及び細胞活性化を誘導するＣＤ３ゼータ鎖を介したシグナルを発現する。かかるドメインが他のタンパク質に対して親和性を有さず、それによって、ＣＩＲを発現する免疫細胞の潜在的な誤ターゲティングを引き起こすことが重要である。そのようなキメラストーク部分の例としては、ＣＤ８αの膜近位部分（例えば、配列番号４３及び１０７を参照）、ＩｇＧのＣＨ２／ＣＨ３ドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４）（例えば、配列番号５１及び９８を参照）、ＩｇＧのＣＨ３ドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４）（例えば、配列番号１０２を参照）、ＨＥＲ２、ｍＧｌｕＲ２、ＣＤ２８（例えば、配列番号４７及び１０６を参照）、及びＣＴＬＡ４（図５Ａを参照）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

例えば、いくつかの場合では、主題のＣＩＲのストークドメインは、ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＣＤ２８、ＣＨ２／ＣＨ３、ＣＨ３、及びＣＤ８ストークドメインから選択される。例えば、以下を参照されたい：
ＶＶＳＧＰＳＧＧＰＳＳＰＴＴＧＰＴＳＴＳＧＰＥＤＱＰＬＴＰＴＧＳＤＰＱＳＧＬＧＲＨＬＧＶＶＩＧＩＬＶＡＶＩＬＬＬＬＬＬＬＬＬＦＬＩＬＲＨＲＲＱ（配列番号３９）、これには、ＩＬＴ２ストーク及びＴＭドメインが含まれる；
ＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１０７）、これには、ＣＤ８ストークドメインが含まれる；
ＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲ（配列番号４３）、これには、ＣＤ８ストーク及びＴＭが含まれる；
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０６）、これには、ＣＤ２８ストークが含まれる；
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号４７）、これには、ＣＤ２８ストーク及びＴＭドメインが含まれる；
ＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＥＬ（配列番号９８）、これには、ＣＨ２ＣＨ３ストークが含まれる；
ＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＥＬ（配列番号１０２）、これには、ＣＨ３ストークが含まれる；
ＤＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号５１）、これには、ＣＨ２ＣＨ３ストーク及びＣＤ２８ ＴＭドメインが含まれる；
ＶＶＳＧＰＳＭＧＳＳＰＰＰＴＧＰＩＳＴＰＡＧＰＥＤＱＰＬＴＰＴＧＳＤＰＱＳＧＬＧＲＨＬＧＶＶＩＧＩＬＶＡＶＶＬＬＬＬＬＬＬＬＬＦＬＩＬＲＨＲＲＱ（配列番号５９）、これには、ＩＬＴ４ストーク及びＴＭドメインが含まれる。

【0066】

いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのドメインのストークは、配列番号３９、４３、４７、５１、及び５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のストーク配列部分と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのドメインのストークは、配列番号３９、４３、４７、５１、及び５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のストーク配列部分と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのドメインのストークは、配列番号３９、４３、４７、５１、及び５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のストーク配列部分を含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのドメインのストークは、配列番号９８、１０２、１０６、及び１０７のうちのいずれか１つに示されるストーク配列と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのドメインのストークは、配列番号９８、１０２、１０６、及び１０７のうちのいずれか１つに示されるストーク配列と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのドメインのストークは、配列番号９８、１０２、１０６、及び１０７のうちのいずれか１つに示されるストーク配列を含む。

【0068】

Ｄ１／Ｄ２ストーク含有ＣＩＲと二量体ＨＬＡ－Ｇとの相互作用は、ある特定の実施形態ではＩＣＤの活性化及び細胞シグナル伝達を刺激することができる細胞内シグナル伝達ドメインを二量体化する効果を有するであろう（図５Ｂ）。

【0069】

ＩＬＴ２ Ｄ１／Ｄ２ ＣＩＲ又はＩＬＴ４ Ｄ１／Ｄ２ ＣＩＲの変異体形態
更なる実施形態では、変異は、ＣＩＲ内に含まれるＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ１又はＤ２ドメイン内で行われ得、他の潜在的に相互作用するタンパク質よりも、ＨＬＡ－Ｇに対するＣＩＲの特異性を増加させる。例えば、変異は、ＩＬＴ４（配列番号５７）の天然アミノ酸９６（Ｙ９６）又はＩＬＴ２（配列番号３１）（例えば、Ｙ９６Ａ）の相関する位置で、チロシン以外のアミノ酸をコードするように作製され得る。そのような変異体形態の効果は、ＨＬＡ－Ｇに対する結合親和性を保持しながら、ＡＮＧＰＴＬ２及びＡＮＧＰＴＬ５との潜在的な相互作用を低減することである。更に別の実施形態では、同様の変異を、ドメインＤ４における変異（配列番号５５のチロシン３９４（Ｙ３９４）に対応する位置）とともに、Ｄ１～Ｄ４ドメインを含む全長ＩＬＴ４ ＣＩＲに配置し、ＡＮＧＰＴＬ２及びＡＮＧＰＴＬ５との相互作用を更に不安定化することができる（例えば、Ｙ３９４Ａ変異、配列番号６１を参照）。ＩＬＴ２の対応する位置は、配列番号３１のチロシン３９５（Ｙ３９５）である。

【0070】

したがって、いくつかの場合では、主題のＩＬＴ４ ＣＩＲは、配列番号５７のＹ９６に対応するアミノ酸位置に変異（例えば、Ｙ９６Ａ）を含む。いくつかの場合では、主題のＩＬＴ２ ＣＩＲは、配列番号３１のＹ９６に対応するアミノ酸位置に変異（例えば、Ｙ９６Ａ）を含む。いくつかの場合では、主題のＩＬＴ４ ＣＩＲは、配列番号５５のＹ３９４に対応するアミノ酸位置に変異（例えば、Ｙ３９４Ａ）を含む。いくつかの場合では、主題のＩＬＴ２ ＣＩＲは、配列番号３１のＹ３９５に対応するアミノ酸位置に変異（例えば、Ｙ３９５Ａ）を含む。いくつかの場合では、主題のＩＬＴ４ ＣＩＲは、配列番号５５のＹ９６に対応するアミノ酸位置での変異（例えば、Ｙ９６Ａ）及び配列番号５５のＹ３９４に対応するアミノ酸位置での変異（例えば、Ｙ３９４Ａ）（例えば、Ｙ９６Ａ／Ｙ３９４Ａ）を含む。いくつかの場合では、主題のＩＬＴ２ ＣＩＲは、配列番号３１のＹ９６に対応するアミノ酸位置での変異（例えば、Ｙ９６Ａ）及び配列番号３１のＹ３９５に対応するアミノ酸位置での変異（例えば、Ｙ３９５Ａ）（例えば、Ｙ９６Ａ／Ｙ３９５Ａ）を含む。

【0071】

他の実施形態は、同様に、ＨＬＡ－Ｇに対する結合を保持しながら、古典的ＨＬＡタンパク質又はＣＤ１との相互作用を制限し得る。これらの変異は、これらのＨＬＡの重鎖に特異的であるか、又は表面でβ２－Ｍに結合したα３ドメインで相互作用部位を置き換えることができる。

【0072】

（ｉｉ）膜貫通（ＴＭ）領域
ＣＩＲは、一回膜貫通又は複数回膜貫通配列（例えば、キメラタンパク質のＮ末端若しくはＣ末端、又はタンパク質内、例えば、細胞外ターゲティング領域を細胞内ドメインに接続する）を含み得る。一回膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼ受容体、セリン／スレオニンキナーゼ受容体、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、アクチビン、及びホスファターゼに見出される。一回膜貫通領域は、多くの場合、約２０～約２５個のアミノ酸のシグナルペプチド領域及び膜貫通領域を含み、その多くは、疎水性アミノ酸であり、αヘリックスを形成することができる。正に荷電したアミノ酸の短いトラックは、多くの場合、膜にタンパク質をアンカーする膜貫通スパンが続く。複数回膜貫通タンパク質は、イオンポンプ、イオンチャネル、及びトランスポーターを含み、膜を複数回貫通する２つ以上のヘリックスを含む。複数回膜貫通タンパク質の全て又は実質的に全てが、キメラタンパク質に組み込まれる。一回膜貫通及び複数回膜貫通領域の配列は既知であり、キメラタンパク質分子への組み込みのために選択することができる。

【0073】

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＩＲの細胞外ドメインに融合される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞外領域及び細胞内領域に融合され、それによって、細胞外及び細胞内領域が互いに接続される。一実施形態では、ＣＩＲのドメインのうちの１つに天然に会合している膜貫通ドメインが使用される。他の実施形態では、ＣＩＲのドメインのうちの１つと天然に会合していない膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合では、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換（例えば、典型的には、疎水性残基に変更される）によって選択又は改変され得る。

【0074】

膜貫通（ＴＭ）ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、又はゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＬＴ２、ＨＥＲ２、ＩＬＴ４、若しくはＣＤ１５４に由来するか、又はその構造（例えば、膜貫通）特性の実質的な部分を保持するものなどのその機能的バリアントを含む膜貫通領域であり得、それを使用することができる。例えば、Ｋａｈｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：９１６０－９１６６、Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０６：１９１－２０５、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ４：７５－８３、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：４１２、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６、Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：３３６０－５、Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １：４５８－６６）、及びＧｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９８：２３６４－７１を参照されたい。

【0075】

又は、いくつかの例では、膜貫通ドメインは、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及びバリンなどの疎水性残基を大部分含む、新規に合成され得る。本発明で使用するための好適なＣＤ８ストーク配列、膜貫通配列、及びＣＤ３ζ配列は、表４～４２に開示される。

【0076】

例えば、いくつかの場合では、主題のＣＩＲのＴＭドメインは、ＩＬＴ２（例えば、配列番号３９を参照）、ＩＬＴ４（例えば、配列番号５９を参照）、ＣＤ２８（例えば、配列番号４７及び１０４を参照）、及びＣＤ８（例えば、配列番号４３及び１００を参照）のＴＭドメインから選択される。例えば、以下を参照されたい：
ＶＶＳＧＰＳＧＧＰＳＳＰＴＴＧＰＴＳＴＳＧＰＥＤＱＰＬＴＰＴＧＳＤＰＱＳＧＬＧＲＨＬＧＶＶＩＧＩＬＶＡＶＩＬＬＬＬＬＬＬＬＬＦＬＩＬＲＨＲＲＱ（配列番号３９）、これには、ＩＬＴ２ストーク及びＴＭドメインが含まれる；
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲ（配列番号１００）、これには、ＣＤ８ ＴＭドメインが含まれる；
ＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲ（配列番号４３）、これには、ＣＤ８ストーク及びＴＭドメインが含まれる；
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１０４）、これには、ＣＤ２８ＴＭドメインが含まれる；
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号４７）、これには、ＣＤ２８ストーク及びＴＭドメインが含まれる；
ＤＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号５１）、これには、ＣＨ２ＣＨ３ストーク及びＣＤ２８ ＴＭドメインが含まれる；並びに
ＶＶＳＧＰＳＭＧＳＳＰＰＰＴＧＰＩＳＴＰＡＧＰＥＤＱＰＬＴＰＴＧＳＤＰＱＳＧＬＧＲＨＬＧＶＶＩＧＩＬＶＡＶＶＬＬＬＬＬＬＬＬＬＦＬＩＬＲＨＲＲＱ（配列番号５９）、これには、ＩＬＴ４ストーク及びＴＭドメインが含まれる。

【0077】

いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのＴＭドメインは、配列番号３９、４３、４７、５１、及び５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のＴＭドメイン配列部分と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのＴＭドメインは、配列番号３９、４３、４７、５１、及び５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のＴＭドメイン配列部分と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのＴＭドメインは、配列番号３９、４３、４７、５１、及び５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のＴＭドメイン配列部分を含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのストークドメインに加えてＴＭドメイン（ストーク／ＴＭドメイン）は、配列番号３９、４３、４７、５１、及び５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのストークドメインに加えてＴＭドメイン（ストーク／ＴＭドメイン）は、配列番号３９、４３、４７、５１、及び５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのストークドメインに加えてＴＭドメイン（ストーク／ＴＭドメイン）は、配列番号３９、４３、４７、５１、及び５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのＴＭドメインは、配列番号１００及び１０４のうちのいずれか１つに示されるＴＭドメイン配列と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのＴＭドメインは、配列番号１００及び１０４のうちのいずれか１つに示されるＴＭドメイン配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのＴＭドメインは、配列番号１００及び１０４のうちのいずれか１つに示されるＴＭドメイン配列を含む。

【0080】

（ｉｉｉ）細胞内ドメイン（ＩＣＤ）
上記のように、主題のキメラＩＬＴ受容体（ＩＬＴ２又はＩＬＴ４に基づく）は、抑制性であるＩＬＴ２又はＩＬＴ４の天然の細胞内部分を、活性化しているＣＡＲのＩＣＤで置き換える細胞内領域（細胞内ドメイン又はＩＣＤ）を含む。したがって、主題のＣＩＲ（ＩＬＴ２バージョン又はＩＬＴ４バージョン）のＩＣＤは、細胞の活性化を引き起こす少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを有する「シグナル伝達領域」を含み、任意選択的に、１つ以上の共刺激ドメインを含み得る「共刺激領域」を含み得る。

【0081】

シグナル伝達領域
ＣＩＲの「シグナル伝達領域」（又は「細胞内シグナル伝達ドメイン」）とは、標的分子（主題のＣＩＲの場合はＨＬＡ－Ｇ）へのＣＩＲ結合からのシグナルを、免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能（例えば、ＣＩＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出又は細胞外ＣＩＲドメインに結合する標的分子によって誘発される他の細胞応答を含む、活性化、サイトカイン産生、増殖、及び／又は細胞傷害活性）を誘発することに関与するＣＩＲの部分を指す。したがって、「シグナル伝達領域」（「細胞内シグナル伝達ドメイン」）という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特定の機能を行うように指示するタンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限り、かかる切断部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、全長細胞内シグナル伝達ドメインの代わりに使用され得る。シグナル伝達領域という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。いくつかの場合では、シグナル伝達領域は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（又は「ＩＴＡＭ」）として知られているシグナル伝達モチーフを含む。

【0082】

主題のＣＩＲのシグナル伝達領域において使用され得る細胞内ドメイン配列の例としては、リンパ球受容体鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体タンパク質、Ｆｃ受容体サブユニット、ＩＬ－２受容体サブユニット、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃｓＲｌ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられる。

【0083】

いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのシグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む（例えば、配列番号３３を参照）。したがって、いくつかの場合では、主題のキメラＩＬＴ受容体のＩＣＤ（ＩＬＴ２バージョン又はＩＬＴ４バージョン）は、配列番号３３と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号３３と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号３３と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号３３として示されるアミノ酸配列を含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのシグナル伝達領域は、ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのシグナル伝達領域は、ＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインを含む。

【0085】

共刺激領域
いくつかの実施形態では、主題ＣＩＲのＩＣＤは、共刺激領域も含む。共刺激領域は、少なくとも１つの共刺激ドメイン（例えば、１、２、３つ、１つ以上、２つ以上、又は３つ以上の共刺激ドメイン）を含む。共刺激ドメインの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＲＡＮＫ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、及びＩＣＯＳ共刺激ドメイン。共刺激ドメインの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＭｙＤ８８、ＩＬ－１Ｒα、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＩＬ－１Ｒβ、ＣＤ７０、ＩＬ－１８Ｒα、ＣＤ４０、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－３３Ｒα、ＣＤ３０、及びＩＬ－３３Ｒβ。共刺激ドメインの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＭｙＤ８８、ＩＬ－１Ｒα、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＩＬ－１Ｒβ、ＣＤ７０、ＩＬ－１８Ｒα、ＣＤ４０、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－３３Ｒα、ＣＤ３０、及びＩＬ－３３Ｒβ。いくつかの場合では、共刺激領域は、以下からなる群から選択される１つ以上（例えば、１、２、３つ、１つ以上、又は２つ以上）の共刺激ドメインを含む：ＣＤ２８（例えば、配列番号４９を参照）、４－１ＢＢ（例えば、配列番号３５を参照）、及びＯＸ４０、又はそれらの任意の組み合わせ。いくつかの場合では、ＣＤ２８共刺激ドメインが使用される。いくつかの場合では、４－１ＢＢ共刺激ドメインが使用される。いくつかの場合では、ＣＤ２８共刺激ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインの両方が使用される（すなわち、それらは両方とも使用される）。いくつかの場合では、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＯＸ４０共刺激ドメインが使用される。

【0086】

いくつかの場合では、共刺激領域は、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＲＡＮＫ、ＯＸ４０、又はＩＣＯＳなどの共刺激の受容体メディエーターのシグナル伝達ドメインと融合された切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを含む。いくつかの場合では、共刺激領域は、ＭｙＤ８８ポリペプチド又は切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、並びにＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される共刺激ドメインを含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、主題のキメラＩＬＴ受容体のＩＣＤ（ＩＬＴ２バージョン又はＩＬＴ４バージョン）は、番号４９と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共刺激領域を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号４９と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号４９と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号４９として示されるアミノ酸配列を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、主題のキメラＩＬＴ受容体のＩＣＤ（ＩＬＴ２バージョン又はＩＬＴ４バージョン）は、番号３５と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共刺激領域を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号３５と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号３５と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、主題のキメラＩＬＴ受容体のＩＣＤ（ＩＬＴ２バージョン又はＩＬＴ４バージョン）は、番号３５と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列と、番号４９と８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列と、を含む共刺激領域を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、番号３５と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列と、番号４９と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、番号３５と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列と、番号４９と９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号３５に記載されるアミノ酸配列と、配列番号４９に記載されるアミノ酸配列と、を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのシグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含み、共刺激領域は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのシグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含み、共刺激領域は、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのシグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含み、共刺激領域は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、主題のＣＩＲのシグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含み、共刺激領域は、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＯＸ４０共刺激ドメインを含む。

【0091】

４－１ＢＢ、ＣＤ２８、及びＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメインの非限定的な例は、Ｕ．Ｓ．２０１３／０２６６５５１、米国特許第５，６８６，２８１号、Ｇｅｉｇｅｒ，Ｔ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８：２３６４－２３７１（２００１）、Ｈｏｍｂａｃｈ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：６１２３－６１３１（２００１）、Ｍａｈｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：７０－７５（２００２）、Ｈａｙｎｅｓ Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：５７８０－５７８６（２００２）、Ｈａｙｎｅｓ Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １００：３１５５－３１６３（２００２）、Ｕ．Ｓ．２０１２／２０１４８５５２に見出すことができる（これらは全て、共刺激ドメインに関連するそれらの教示について、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0092】

細胞活性化を誘導するのに有用なキメラポリペプチドの非限定的な例、及び例えば、発現構築物、ベクターを構築するための方法、及び活性又は機能のアッセイを含む治療用細胞の活性化を誘導するための関連する方法は、以下の特許及び特許出願にも見出され得る：ＵＳ２０１４－０２８６９８７－Ａ１、ＷＯ２０１４／１５１９６０、ＵＳ２０１６／００４６７００、ＷＯ２０１５／１２３５２７、ＵＳ２００４／０２０９８３６、米国特許第７，４０４，９５０号、ＷＯ２００４／０７３６４１、ＵＳ２０１１／００３３３８８、米国特許第８，６９１，２１０号、ＷＯ２００８／０４９１１３、ＵＳ２０１４／００８７４６８、米国特許第９，３１５，５５９号、ＷＯ２０１０／０３３９４９、ＵＳ２０１１／０２８７０３８、ＷＯ２０１１／１３０５６６、ＵＳ２０１６／０１７５３５９、ＷＯ２０１６／０３６７４６、ＷＯ２０１６／１００２４１、ＵＳ２０１７／０１６６８７７、ＷＯ２０１７／１０６１８５、及びＷＯ２０１８／２０８８４９（これらの各々は、細胞活性化ドメイン（例えば、細胞シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメイン）の記載に関連する目的を含めて、全ての目的のために、全てのテキスト、表、及び図面を含めて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0093】

例示的なＣＩＲ
主題のＣＩＲの異なる領域／ドメインは、モジュール式であり、便利なように組み合わせることができる。図６Ａ及び図１０は、主題のＣＩＲがとることができる様々な形態の例を提供し、図に示されているものは、実施例セクション全体を通して様々なアッセイで生成及び試験された。例えば、図６Ａでは、フォーマットＣＩＲ１、ＣＩＲ２、ＣＩＲ３、及びＣＩＲ４が導入され、図１０では、フォーマットＣＩＲ６、ＣＩＲ７、ＣＩＲ８、ＣＩＲ９、及びＣＩＲ１０が導入される。図１０は、ＩＬＴ４のためのこれらのフォーマットのみを示すが、当業者は、必要に応じて、同じフォーマットを使用してＩＬＴ２ ＣＩＲが生成され得ることを理解するであろう。

【0094】

いくつかの場合では、主題のＣＩＲは、ＩＬＴ２ ＣＩＲ４ 又はＩＬＴ４ ＣＩＲ４（すなわち、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２ターゲティングドメイン、ＣＤ８ストーク及びＴＭ、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン、並びに４－１ＢＢ共刺激ドメイン（Ｔ２Ａ－デルタ－ＣＤ１９領域は任意選択的であり、すなわち、いくつかの場合では不在となる）。例えば、図６Ａを参照されたい。

【0095】

いくつかの場合では、主題のＣＩＲは、ＩＬＴ２ ＣＩＲ３ 又はＩＬＴ４ ＣＩＲ３（すなわち、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ４ターゲティングドメイン、ＣＤ８ストーク及びＴＭ、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン、並びに４－１ＢＢ共刺激ドメイン（Ｔ２Ａ－デルタ－ＣＤ１９領域は任意選択的であり、すなわち、いくつかの場合では不在となる）。図６Ａを参照されたい。

【0096】

いくつかの場合では、主題のＣＩＲは、ＩＬＴ２ ＣＩＲ２又はＩＬＴ４ ＣＩＲ２（すなわち、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２ターゲティングドメイン、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ストーク及びＴＭ、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン、並びに４－１ＢＢ共刺激ドメイン（Ｔ２Ａ－デルタ－ＣＤ１９領域は任意選択的であり、すなわち、いくつかの場合では不在となる）。図６Ａを参照されたい。

【0097】

いくつかの場合では、主題のＣＩＲは、ＩＬＴ２ ＣＩＲ１又はＩＬＴ４ ＣＩＲ１（すなわち、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ４ターゲティングドメイン、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ストーク及びＴＭ、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン、並びに４－１ＢＢ共刺激ドメイン（Ｔ２Ａ－デルタ－ＣＤ１９領域は任意選択的であり、すなわち、いくつかの場合では不在となる）。図６Ａを参照されたい。

【0098】

ＣＩＲバリエーション
本発明の範囲には、本明細書に記載の本発明のＣＩＲの機能部分が含まれる。「機能部分」という用語は、ＣＩＲに関して使用される場合、本発明のＣＩＲの任意の部分又は断片を指し、その部分又は断片は、それが一部であるＣＩＲ（親ＣＩＲ）の生物学的活性を保持する。機能部分は、例えば、親ＣＩＲと同様の程度、同じ程度、又はより高い程度で、標的（ＨＬＡ－Ｇ）若しくは標的細胞を認識する能力を保持するか、又は疾患を検出、治療、若しくは予防する能力を保持する、ＣＩＲの部分を包含する。親ＣＩＲに関して、機能部分は、例えば、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上の親ＣＩＲを含むことができる。

【0099】

機能部分は、その部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端、又は両方の末端に追加のアミノ酸を含むことができ、その追加のアミノ酸は、親ＣＩＲのアミノ酸配列に見出されない。望ましくは、追加のアミノ酸は、生物学的機能を妨げず、例えば、標的細胞の認識、がんの検出、がんの治療、又は予防などを妨げない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親ＣＩＲの生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。

【0100】

本発明の範囲には、本明細書に開示される本発明のＣＩＲの機能的バリアント又は生物学的均等物が含まれる。機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る。代替的又は追加的に、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害又は阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、親ポリペプチドと比較して、機能的バリアントの生物学的活性が増加するように、機能的バリアントの生物学的活性を増強させ得る。

【0101】

このような生物学的バリアント（その機能部分を含む）は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。

【0102】

そのような生物学的バリアント（その機能部分を含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、環化（例えば、ジスルフィド架橋を介した）、又は酸付加塩への変換、及び／あるいは任意選択的に二量体化若しくは重合、又はコンジュゲートされ得る。

【0103】

そのような生物学的バリアント（その機能部分を含む）は、当該技術分野で既知の方法によって得ることができる。ポリペプチドは、ポリペプチド又はタンパク質を作製する任意の好適な方法によって作製され得る。ポリペプチド及びタンパク質を新規に合成する好適な方法は、例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，ｅｄ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００１、及び米国特許第５，４４９，７５２号に記載されている。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え方法を使用して、本明細書に記載の核酸を使用して組換え的に産生され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。

【0104】

６．共刺激ポリペプチド
主題のキメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）を発現する遺伝子改変細胞は、共刺激ポリペプチドを更に発現し得る（例えば、ＣＩＲを発現することに加えて）。共刺激ポリペプチドの発現は、誘導性又は構成的であり得る。

【0105】

共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＩＬ－１８Ｒ、ＤＡＰ１２、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ－１Ｒ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＩＬ－３３Ｒ、ＭｙＤ８８、若しくはＣＤ４０などの１つ以上の共刺激シグナル伝達領域、又は例えば、その細胞質領域を含み得る。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＩＬ－１８Ｒ、ＤＡＰ－１２、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ－１Ｒ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＩＬ－３３Ｒ、ＭｙＤ８８、又はＣＤ４０によって活性化されたシグナル伝達経路を活性化する１つ以上の好適な共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激ポリペプチドには、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリー（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ－Ｒ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ）、及びＣＤ２８ファミリーメンバー（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）のＮＦ－κＢ経路、ＭｙＤ８８経路、ＳＴＡＴ５経路、ＳＴＡＴ１経路、Ａｋｔ経路、及び／又はｐ３８経路を活性化する任意の分子又はポリペプチドが含まれる。複数の共刺激ポリペプチド又は共刺激ポリペプチドの細胞質領域が、改変細胞で発現され得る。

【0106】

本発明とともに使用するための好適なＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、及びＩＣＯＳ配列は、表４ｄ－３６に開示されている。

【0107】

細胞は、例えば、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、又はＩＣＯＳなどの共刺激の受容体メディエーターのシグナル伝達ドメインと融合されているキメラシグナル伝達ポリペプチドを含む、キメラシグナル伝達ポリペプチドを含み得る。

【0108】

７．安全スイッチ
主題のキメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）を発現する遺伝子改変細胞はまた、誘導性自殺遺伝子又は自殺スイッチとしても知られている安全スイッチを発現することができる。これは、必要に応じて、例えば、ＧｖＨＤが発症する場合、インビボで治療用細胞を根絶するために使用することができる。いくつかの例では、治療用細胞は、ＣＩＲに起因するオフターゲット毒性などの有害事象を誘発し得るか、若しくは改変細胞を使用する治療中に患者が陰性症状を経験し得るか、若しくは健康な組織に対する非特異的攻撃に起因する副作用が存在し得るか、又は、時には、治療用細胞はもはや必要ではない可能性があるか、若しくは療法が特定の期間意図され、例えば、治療用細胞が腫瘍細胞若しくは腫瘍サイズを減少させるように機能してもよく、もはや必要ではない可能性もある。したがって、遺伝子改変細胞がまた、誘導性カスパーゼ９ポリペプチドなどの細胞を死滅させるポリペプチドを誘導的に発現する可能性がある場合に有用であり得る。例えば、治療用細胞の数を低減する必要がある場合、スイッチを誘発することができる。

【0109】

これらのスイッチは、治療用細胞を根絶することが望まれる場合に供給され、細胞死を引き起こす（例えば、壊死又はアポトーシスを引き起こす）薬理学的作用物質などの誘発物質に応答する。これらの作用物質は、毒性遺伝子産物の新規発現をもたらす可能性があるが、遺伝子改変細胞が既に作用物質に応答して毒性形態に切り替えられているタンパク質を発現している場合、より迅速な応答を得ることができる。

【0110】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、対象に誘発分子（リガンド誘導剤とも称される）を投与することによって誘発され得るアポトーシス促進性タンパク質に基づく。アポトーシス促進性タンパク質が、誘発分子に結合するポリペプチド配列に融合される場合、この誘発分子の送達により、２つのアポトーシス促進性タンパク質が接近し、それにより、アポトーシスが誘発され得る。例えば、カスパーゼ９を、薬理学的作用物質リミドゥシド（ＡＰ１９０３）に応答して二量体化するように誘導され得る改変ヒトＦＫ結合タンパク質に融合してもよい。例えば、カスパーゼ９などのヒトアポトーシス促進タンパク質に基づく安全スイッチの使用は、スイッチを発現する細胞が、ヒト対象の免疫系によって異物として認識されるリスクを最小限に抑える。したがって、対象へのリミドゥシドの送達により、カスパーゼ９スイッチを発現する細胞のアポトーシスを誘発することができる。

【0111】

細胞死又はアポトーシスを誘導するのに有用なキメラポリペプチドの更なる非限定的な例は、以下の特許及び特許出願に見出され得る（それらの各々は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。米国特許出願ＵＳ２０１１／０２８６９８０、米国特許９，０８９，５２０、米国特許出願ＵＳ２０１４／０２５５３６０、米国特許第９，４３４，９３５号、ＷＯ２０１４／１６４３８、ＵＳ２０１６／０１５１４６５、ＷＯ２０１４／１９７６３８、ＵＳ２０１５／０３２８２９２、ＷＯ２０１５／１３４８７７、ＵＳ２０１６／０１６６６１３、ＷＯ２０１６／１００２３６、ＵＳ２０１６／０１７５３５９、ＷＯ２０１６／１００２４１、ＵＳ２０１７／０１６６８７７、ＷＯ２０１７／１０６１８５（これらの各々は、全ての目的のために、全てのテキスト、表、及び図面を含めて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの特定のスイッチ及びアプローチの詳細も以下に与えられる。

【0112】

誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）：このアポトーシス促進性スイッチは、カスパーゼ９とＦＫＢＰ１２又は誘導体との融合物を含む。リガンドの不在下では潜在的であるが、細胞のアポトーシスの固有の経路からのイニシエーターカスパーゼであるカスパーゼ９の二量体化を駆動する。二量体化は、カスパーゼ９の活性化、エフェクターカスパーゼであるカスパーゼ－３の切断及び活性化、並びにアポトーシスによる急速な細胞死をもたらす。誘導性カスパーゼ９は、毒性応答を遮断するための細胞療法における安全スイッチとして特に有用である。

【0113】

カスパーゼ９スイッチ：例は、上記のＤｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）に記載されている。また、Ｙａｇｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３（９）：１４７５－８５、Ｒｏｓｓｉｇｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４１７－０１８－００３４－１、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１４．００２５４、米国特許第９，４３４，９３５号、米国特許第９，９１３，８８２号、米国特許第９，３９３，２９２号、及び米国特許出願２０１５／０３２８２９２も参照されたい。

【0114】

安全スイッチは、改変された活性、例えば、ホモ二量体リガンドの不在下で基底活性が低減した改変されたカスパーゼ９ポリペプチドを含み得る。改変されたカスパーゼ９ポリペプチドは、例えば、上記の米国特許第９，９１３，８８２号及び米国特許第２０１５／０３２８２９２号に記載されており、例えば、３３０位のアミノ酸置換（例えば、Ｄ３３０Ｅ若しくはＤ３３０Ａ）又は例えば、４５０位のアミノ酸置換（例えば、Ｎ４０５Ｑ）、又はそれらの組み合わせ（例えば、Ｄ３３０Ｅ－Ｎ４０５Ｑ及びＤ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑを含む）を含み得る。基底活性が低いカスパーゼ９ポリペプチドは、例えば、米国特許第９，４３４，９３５号、同第９，９３２，５７２号、及び同第９，９１３，８８２号、並びに米国特許出願第６２／６６８，２２３号、同第６２／７５６，４４２号、同第６２／８１６，７９９号、同第１５／９０１，５５６号、同第１５／８８８，９４８号に以前に記載されている。

【0115】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、例えば、上記のＤｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）で論じられているｉＣａｓｐ９であり得、これは、その内因性カスパーゼの活性化及び動員ドメインを欠く改変されたヒトカスパーゼ９（ＣＡＳＰ９）にＳＧＧＧＳリンカーを介して接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）の配列からなる。Ｆ３６Ｖ変異は、ＦＫＢＰ１２の、合成ホモ二量体ＡＰ２０１８７及びリミドゥシドに対する結合親和性を増加させる。

【0116】

リミドゥシドによるＦＫＢＰ１２対立遺伝子特異的結合：リミドゥシドは、ＦＫＢＰ１２のバリン３６対立遺伝子に高い親和性（約０．１ｎＭ）で結合するが、野生型フェニルアラニン３６ ＦＫＢＰ１２対立遺伝子には低い親和性（約５００ｎＭ）で結合する。ラパマイシン及びラパログは、いずれかのＦＫＢＰ対立遺伝子に結合することができる。リミドゥシドは、バリン３６形態（ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）、ＦＫＢＰ１２ｖ３６、ＦＫＢＰＶ、Ｆ_Ｖ３６、又は単にＦ_ｖとして様々に知られている）に対して各々高い親和性及び特異性を有する２つの同一のタンパク質結合表面が逆方向に配置されている。Ｊｅｍａｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１－９６（２００８）、Ｓｃｈｅｒ ＆ Ｋｅｌｌｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１，１５６６－７２（１９９３））を参照されたい。タンパク質の２つのタンデムコピーも、リミドゥシドによる架橋時に高次オリゴマーが誘導されるように、構築物において使用され得る。ホモ二量体化に通常依存する１つ以上の細胞シグナル伝達分子に１つ以上のＦ_Ｖドメインを結合すると、そのタンパク質がリミドゥシド制御スイッチに変換され得る。ＦＫＢＰ１２バリアントも使用され得る。バリアントは、ラパマイシン又はラパログに結合し得るが、例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６よりもリミドゥシドに対する親和性が低い。ＦＫＢＰ１２バリアントの例としては、例えば、酵母を含む多くの種からのものが挙げられる。一実施形態では、ＦＫＢＰ１２バリアントは、ＦＫＢＰ１２．６（カルスタブリン）である。

【0117】

自殺スイッチは、誘発分子（二量体化又は多量体化リガンドなど）を含む薬学的組成物によって制御されてもよい。誘発分子を含む薬学的組成物の有効量は、遺伝子改変細胞を殺滅する所望の結果を達成する量である。殺滅の程度は、高い（例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％超）か又は完全であり得、逆に、時には、部分的な除去のみ（例えば、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％未満の遺伝子改変細胞が殺滅される）が望まれるであろう。このため、遺伝子改変は、誘発分子に対する様々な感受性を示し得る。したがって、誘発分子を使用して、一部の細胞（例えば、少なくとも１０％）を生存させながら、一部の細胞のみ（例えば、少なくとも１０％）を根絶することができる。誘発分子の濃度は、細胞の生死の所望のバランスに従って選択することができ、例えば、より高い割合の細胞の根絶（又は完全な根絶）が望まれる場合、より高い濃度が送達される。

【0118】

これらの濃度は、誘発分子に応答して細胞死のレベルを監視する単純な用量範囲実験によって決定することができる。任意の適切なアッセイを使用して、殺滅される遺伝子改変細胞のパーセントを決定することができる。アッセイは、誘発分子の投与前に対象から第１の試料を得るステップと、誘発分子の投与後に対象から第２の試料を得るステップと、第１の試料及び第２の試料における治療用細胞の数又は濃度を比較して、殺滅される治療用細胞のパーセントを決定するステップと、を含み得る。過度の実験をすることなく、本明細書に提示される特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。

【0119】

細胞は、例えば、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＲＡＮＫ、ＯＸ４０、又はＩＣＯＳなどの共刺激の受容体メディエーターのシグナル伝達ドメインと融合されているキメラシグナル伝達ポリペプチドを含む、キメラシグナル伝達ポリペプチドを含み得る。

【0120】

いくつかの実施形態では、キメラシグナル伝達ポリペプチドは、例えば、４－１ＢＢ及びＣＤ２８などの２つの共刺激ポリペプチド、又はＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域からの細胞質シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラシグナル伝達ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド又は切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドと、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域とを含む。

【0121】

上記のように、細胞活性化を誘導するのに有用なキメラポリペプチドの非限定的な例、及び例えば、発現構築物、ベクターを構築するための方法、及び活性又は機能のアッセイを含む治療用細胞の活性化を誘導するための関連する方法は、以下の特許及び特許出願にも見出され得る（これらの各々は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）：ＵＳ２０１４－０２８６９８７－Ａ１、ＷＯ２０１４／１５１９６０、ＵＳ２０１６／００４６７００、ＷＯ２０１５／１２３５２７、ＵＳ２００４／０２０９８３６、米国特許第７，４０４，９５０号、ＷＯ２００４／０７３６４１、ＵＳ２０１１／００３３３８８、米国特許第８，６９１，２１０号、ＷＯ２００８／０４９１１３、ＵＳ２０１４／００８７４６８、米国特許第９，３１５，５５９号、ＷＯ２０１０／０３３９４９、ＵＳ２０１１／０２８７０３８、ＷＯ２０１１／１３０５６６、ＵＳ２０１６／０１７５３５９、ＷＯ２０１６／０３６７４６、ＷＯ２０１６／１００２４１、ＵＳ２０１７／０１６６８７７、ＷＯ２０１７／１０６１８５、及びＷＯ２０１８／２０８８４９（これらの各々は、全ての目的のために、全てのテキスト、表、及び図面を含めて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0122】

いくつかの実施形態では、細胞は、構成的に活性な療法を提供するように設計される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、キメラＩＬＴ２又はＩＬＴ４受容体（又はＣＩＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドと、を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの５’に位置する。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの３’に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に位置する。第３のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドの３’及び第２のポリヌクレオチドの５’に位置する場合、リンカーポリペプチドは、翻訳後も無傷のまま残ってもよく、又は翻訳中若しくは翻訳後に第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを分離してもよい。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、翻訳中又は翻訳後に、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを分離することができる２Ａポリペプチド（本明細書の他箇所を参照）である。高レベルの共刺激は、リーキーな２Ａ共翻訳配列（本明細書の他箇所を参照）を使用して、キメラシグナル伝達ポリペプチドからＣＩＲを分離する代替的なメカニズムを介して構成的に提供される。２Ａの（例えば、リーキー２Ａ配列からの）分離が不完全である場合、発現されたキメラシグナル伝達ポリペプチド分子の大部分は、キメラ抗原受容体ポリペプチドから分離され、細胞質に留まってもよく、いくつかの部分又はキメラシグナル伝達ポリペプチド分子は、ＣＩＲに結合又は連結されたままである。

【0123】

「構成的に活性な」とは、キメラ刺激ポリペプチドの細胞活性化の活性が、誘導剤の不在下でさえ活性であることを意味する。構成的に活性なシグナル伝達を生成する１つの方法は、膜貫通ドメイン又は脂質ターゲティング部分を介して、活性化タンパク質因子を原形質膜に繋ぎ止めることである。

【0124】

免疫細胞療法はまた、構成的に活性なＴ細胞又はＮＫ細胞などの構成的に活性な療法を提供するように設計され得るが、誘導性の安全スイッチを提供して、必要に応じて、療法を停止又はレベルを低減させることができる（上記参照）。いくつかの実施形態では、ＣＩＲ－Ｔ細胞又はＣＩＲ－ＮＫ細胞などの免疫細胞は、キメラ抗原受容体及びキメラシグナル伝達ポリペプチドを発現する。

【0125】

８．リンカーポリペプチド
２つのポリペプチドが単一の転写産物においてコードされるように、それらが単一の遺伝子にコードされることが望まれる場合、２つのポリペプチドは、リンカーポリペプチドによって結合され得る。例えば、これらは、ＭｙＤ８８－ＣＤ４０キメラポリペプチドにおけるＭｙＤ８８とＣＤ４０との間、又はＣＡＲ又はＣＩＲの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域とＣＤ３ζ部分との間に含まれ得る。必要に応じて、リンカーは、本明細書に記載の領域／ドメインのうちのいずれかの間に位置し得る。例えば、いくつかの場合では、リンカーは、ＴＭドメインとシグナル伝達領域若しくは共刺激領域との間、ＩＬＴ２若しくはＩＬＴ４ターゲティング領域（例えば、Ｄ１～Ｄ２ドメイン）とストークとの間、シグナル伝達領域と共刺激領域との間、２つの共刺激ドメインとの間、共刺激若しくはシグナル伝達領域とＴ２Ａ配列との間、又はそれらの任意の組み合わせの間に配置される。

【0126】

リンカーポリペプチドは、切断可能及び切断不能なリンカーポリペプチドを含む。リンカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＧＲ、ＧＳ、ＶＤ、及びＰＲＧＳＧ（配列番号６７）。追加のリンカーは、当業者に既知であり、任意の好都合なリンカーが使用され得る。

【0127】

リンカーポリペプチドとしては、例えば、約２～約３０個のアミノ酸（例えば、フーリン切断部位（ＧＧＧＧＳ）_ｎ）からなるリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、約１８～２２個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、２０個のアミノ酸からなる。

【0128】

切断可能なリンカーには、改変細胞における酵素によって切断されるリンカーが含まれる。酵素は、細胞に対して外因性であり得る。例えば、酵素は、リンカーをコードするポリヌクレオチドと同時又は異なる時間のいずれかでのトランスフェクション又は形質導入によって細胞に導入されるポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、例えば、細胞内で天然に発現される酵素、及び細胞に対して天然のポリヌクレオチドによってコードされる酵素（例えば、リゾチームなど）を含む、集団内の改変細胞に対して内因性の酵素によって切断されるリンカーを含む。「切断可能なリンカー」という用語は、例えば、ペプチドスキッピングなどの非酵素的手段を含む任意の手段によって切断されるリンカーにも及ぶ。

【0129】

切断可能なリンカーの１つの利点は、２つのポリペプチドの発現の本質的に固定された化学量論比（２つの成熟したポリペプチドが単一の切断可能なリンカーによって連結されている場合は１：１の比率）を可能にすることである。

【0130】

リンカーポリペプチドは、例えば、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）昆虫ウイルスを含む多くの異なるウイルスに由来し得る２Ａ様配列であってもよい。これらの配列は、「ペプチドスキッピング配列」としても知られることがある。このタイプの配列が、分離されることが意図された２つのポリペプチド間のシストロン内に配置されると、リボソームは、ペプチド結合をスキップするように見え、トセア・アシグナ配列の場合、カルボキシ末端「Ｐ－Ｇ－Ｐ」でのＧｌｙ及びＰｒｏアミノ酸間の結合が省略される。これにより、２～３個のポリペプチド、例えば、誘導性キメラアポトーシス促進性ポリペプチド及びキメラ抗原受容体、又は、例えば、マーカーポリペプチド及び誘導性キメラアポトーシス促進性ポリペプチドが残る可能性がある。この配列を使用する場合、２Ａ配列の５’にコードされるポリペプチドは、カルボキシ末端で追加のアミノ酸（Ｇｌｙ残基及び２Ａ配列における任意の上流残基を含む）で終わる可能性がある。２Ａ配列の３’にコードされるペプチドは、Ｐｒｏ残基及び２Ａ配列に続く任意の下流残基を含む、アミノ末端での追加のアミノ酸で終わる可能性がある。

【0131】

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）に由来する２Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、２Ａ共翻訳配列は、２Ａ様配列である。いくつかの実施形態では、２Ａ共翻訳配列は、Ｔ２Ａ（トセア・アシグナウイルス２Ａ）、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）、Ｐ２Ａ（ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ）、ＢｍＣＰＶ ２Ａ（細胞質多角体病ウイルス２Ａ）、ＢｍＩＦＶ ２Ａ（Ｂ．モリ（Ｂ．ｍｏｒｉ）の軟化病ウイルス２Ａ）、又はＥ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ）である。いくつかの実施形態では、２Ａ共翻訳配列は、Ｔ２Ａ－ＧＳＧ、Ｆ２Ａ－ＧＳＧ、Ｐ２Ａ－ＧＳＧ、又はＥ２Ａ－ＧＳＧである。いくつかの実施形態では、２Ａ共翻訳配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される。特定の実施形態では、２ＴＡは、本明細書に開示される配列を含む（又はそれからなる）。本明細書に開示される配列（例えば、以下の実施例に開示される配列）を含む（又はそれからなる）。

【0132】

２Ａ様配列は、ポリペプチドのうちのいくつかが翻訳中に分離されず、代わりに、翻訳後に１つの長いポリペプチドとして残るという点で、時には「リーキー」である。リーキーリンカーの原因に関する１つの理論は、短い２Ａ配列が、リボソームスキッピングを促進する必要な構造に折り畳まれない場合がある（「２Ａ折り畳み」）ということである。これらの事例では、リボソームは、プロリンペプチド結合を見逃すことなく、次いで、融合タンパク質がもたらされる。リーキーなレベルを低減し、したがって、形成される融合タンパク質の数を低減するために、ＧＳＧ（又は同様の）リンカーが、２Ａポリペプチドのアミノ末端側に付加されてもよい。このＧＳＧリンカーは、新たに翻訳されたポリペプチドの二次構造が自発的に折り畳まれ、「２Ａ折り畳み」を破壊することを遮断する。例えば、同じコードされたポリペプチドを細胞表面に指向され得るが、他の場合では細胞質に残るように、リーキーな２Ａ配列を使用することができる。

【0133】

ある特定の実施形態では、２Ａリンカーは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、２Ａリンカーは、ポリペプチドのアミノ末端にＧＳＧアミノ酸配列を更に含み、他の実施形態では、２Ａリンカーは、ポリペプチドのアミノ末端にＧＳＧＰＲ（配列番号６８）アミノ酸配列を含む。したがって、「２Ａ」配列によって、この用語は、本明細書に記載の実施例における２Ａ配列を指し得るか、又はリンカーのアミノ末端にＧＳＧ若しくはＧＳＧＰＲ（配列番号６８）配列を更に含む本明細書に列挙される２Ａ配列を指し得る。

【0134】

いくつかの実施形態では、リンカー、例えば、２Ａリンカーは、翻訳されたポリペプチドの約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％で切断される。

【0135】

本発明で使用するための好適なリンカーポリペプチド（Ｔ２Ａリンカーを含む）は、表４～４２（「フレックス」リンカーポリペプチド配列を含む）に開示される。

【0136】

９．膜ターゲティング配列
膜ターゲティング配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供する。細胞膜と会合する分子は、膜会合を促進するある特定の領域を含み、そのような領域をキメラタンパク質分子に組み込んで、膜標的分子を生成することができる。いくつかの実施形態では、ＣＩＲは、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４の天然シグナルペプチドを介した小胞体の管腔へのシグナル依存性翻訳を通して細胞表面に輸送され得る。他の実施形態では、この天然シグナルペプチドは、他の分泌タンパク質のもので置き換えることができる。これらの実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦ又は免疫グロブリン軽鎖に由来し得るが、これらのタンパク質からの誘導に限定されない。

【0137】

例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化されたＮ末端又はＣ末端に配列を含み、これらのアシル部分は、膜会合を促進する。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、多くの場合、特定の配列モチーフに適合する。ある特定のアシル化モチーフは、単一のアシル部分（多くの場合、アニオン性脂質頭部基との会合を改善するためのいくつかの正荷電残基（例えば、ヒトｃ－Ｓｒｃ：ＭＧＳＮＫＳＫＰＫＤＡＳＱＲＲＲ、配列番号６９）が続く）で改変されることができ、他のアシル化モチーフは、複数のアシル部分で改変することができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ））及びＧタンパク質アルファサブユニットのＮ末端領域内に位置する。かかる二重アシル化領域は、多くの場合、かかるタンパク質の最初の１８個のアミノ酸内に位置し、配列モチーフＭｅｔ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｃｙｓに準拠し、Ｍｅｔは切断され、ＧｌｙはＮ－アシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つはＳ－アシル化される。多くの場合、Ｇｌｙはミリストイル化され、Ｃｙｓはパルミトイル化され得る。配列モチーフＣｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に準拠するアシル化領域は、Ｇタンパク質ガンマサブユニット及び他のタンパク質のＣ末端からのＣ１５又はＣ１０イソプレニル部分で改変され得（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｅｎｔｒｙ／ＩｎｔｅｒＰｒｏ／ＩＰＲ０３１７７１／ｏｒ ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ＰＳ００２９４）、これも用いられ得る。これら及び他のアシル化モチーフには、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ－Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １５：２２０５－２２１７（２００４）、Ｇｌａｂａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：６９７－７００（１９９４）、及びＺｌａｋｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０：６７３－６７９（１９９７）で論じられているものが含まれ、キメラ分子に組み込んで膜局在化を誘導することができる。

【0138】

いくつかの実施形態では、膜ターゲティング領域は、ミリストイル化領域を含む。いくつかの実施形態では、膜ターゲティング領域は、受容体からのミリストイル化ターゲティング配列、パルミトイル化ターゲティング配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル－ゲラニル化、ＣＡＡＸボックス）、タンパク質－タンパク質相互作用モチーフ、又は膜貫通配列（シグナルペプチドを用いる）からなる群から選択される。例としては、例えば、ｔｅｎ Ｋｌｏｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（２００７）９９，１－１２、又はＶｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：９３６－４０，１０９８（２００３）で論じられているものが挙げられる。

【0139】

ポリペプチドが膜ターゲティング領域を含まないか、又は本明細書に提供されるある特定のキメラポリペプチドなどの膜ターゲティング領域を欠く場合、ポリペプチドは、キメラタンパク質の細胞膜への輸送を提供する領域を含まない。ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドを細胞表面膜に輸送する配列を含まなくてもよく、又はポリペプチドは、例えば、ポリペプチドを細胞表面膜に輸送しない機能不全の膜ターゲティング領域（例えば、ミリストイル化ターゲティング領域の機能を破壊するプロリンを含むミリストイル化領域）を含んでもよい。（例えば、Ｒｅｓｈ，Ｍ．Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４５１：１－１６（１９９９）を参照されたい）。膜に輸送されないポリペプチドは、細胞質ポリペプチドと考えられる。

【0140】

本発明で使用するのに好適なミリストイル化配列は、表４～４２に開示されている。

【0141】

１０．遺伝子改変細胞
遺伝子改変細胞（例えば、主題のキメラＩＬＴ受容体（コードする核酸を含む）を発現する免疫細胞などの細胞）は、細胞療法に有用な任意の細胞、例えば、免疫細胞であり得る。細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、末梢血細胞、造血前駆細胞、又は骨髄細胞であり得る。好ましい実施形態では、改変細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞である。

【0142】

本明細書に開示されるように遺伝子改変されている細胞（例えば、主題のキメラＩＬＴ受容体（例えば、コードする核酸を含む）を発現する免疫細胞などの細胞）は、それらの投与から利益を得ることができる（例えば、ドナーリンパ球の投与から利益を得ることができる）対象に投与するのに有用である。これらの対象は典型的にはヒトであり、そのため、本発明は典型的にはヒト細胞を使用して行われることになる。

【0143】

細胞の供給源
遺伝子改変される細胞は、自己、同系、又は同種であり得る。同種細胞は、任意の健康なドナーに由来し得、同系細胞は、意図されたレシピエントに適切に関連する任意の健康なドナーに由来し得る。ドナーは、一般に、成人（少なくとも１８歳）であるが、子供もまた、細胞ドナーとして好適である（例えば、Ｓｔｙｃｚｙｎｓｋｉ ２０１８，Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ａｐｈｅｒ Ｓｃｉ ５７（３）：３２３－３３０を参照されたい）。

【0144】

「自己」という用語は、それが後で投与される同じ個体に由来する細胞を意味する。「同種」という用語は、宿主細胞とドナー細胞との間で抗原的に異なるＨＬＡ又はＭＨＣ遺伝子座を指す。したがって、同じ種からの細胞は、抗原的に異なる可能性がある。「同系」という用語は、組織移植を可能にするのに十分に同一若しくは密接に関連する遺伝子型を有するか、又は免疫学的に適合する細胞を指す。例えば、一卵性双生児又は近親者は、同系であり得る。

【0145】

細胞は、血液細胞であり得る。例えば、細胞の供給源は、例えば、臍帯血、骨髄、又は末梢血であり得、それらは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。これらには、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、又は単球が含まれる。本明細書で使用される場合、「末梢血」という用語は、血液の細胞成分（例えば、赤血球、白血球、及び血小板）を指し、これらは、血液の循環プールから取得又は調製され、リンパ系、脾臓、肝臓、又は骨髄内に隔離されない。臍帯血は、リンパ系、脾臓、肝臓又は骨髄内に隔離された末梢血及び血液とは異なり、出産後に胎盤及び付着した臍帯に残存する血液を指す。臍帯血は、多くの場合、造血細胞を含む幹細胞を含む。

【0146】

ヒトからＴ細胞を得るための好適なプロセスは、Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：１６７３－８３（「プロトコル」）に付随する公開されたプロトコルに記載されている。一般的に言えば、Ｔ細胞が得られ、遺伝子改変及び選択に供され、次いで、レシピエント対象に投与され得る。Ｔ細胞の有用な供給源は、ヒトの末梢血である。末梢血試料は、一般に、白血球について濃縮された試料を提供するために、白血球分離に供されることになる。この濃縮された試料（ロイコパックとしても知られている）は、単球、リンパ球、血小板、血漿、及び赤血球を含む様々な血液細胞から構成され得る。ロイコパックは、典型的には、静脈穿刺又はバフィーコート製品と比較して、より高い濃度の細胞を含む。

【0147】

試料は、（プロトコルで論じられているように）同種枯渇（ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）に供され得るが、試料は同種枯渇に供されないことが好ましい。したがって、好ましい試料は、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｌｏｏｄ １２５：４１０３－１３で論じられているように、同種充満（ａｌｌｏｒｅｐｌｅｔｅ）である。これらの集団は、治療目的でより堅牢なＴ細胞レパートリーを提供することができる。したがって、本発明の好ましい組成物は、Ｔ細胞同種枯渇されておらず、同種枯渇のステップに供されていない。

【0148】

Ｔ細胞は、一般に、遺伝子改変される前に（通常、活性化条件下で、例えば、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体を使用して、任意選択的にＩＬ－２とともに）培養される。このステップは、改変プロセスの終了時にＴ細胞のより高い収率をもたらす。

【0149】

ヒトからＮＫ細胞を取得及び増殖するためのプロセスは、Ｃｈｏ ＆ Ｃａｍｐａｎａ（２００９）Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２９：８９－９６、Ｓｏｍａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ４８：２５４０ ａｎｄ ｉｎ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ．４：１９５０に記載されている。

【0150】

ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞
主題の組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る。ロイコパックにおけるＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の比率は、典型的には２を上回るが、いくつかの実施形態では、本発明の組成物における遺伝子改変ＣＤ４＋細胞と遺伝子改変ＣＤ８＋細胞の比率は、２未満、例えば、１．５未満である。理想的には、組成物中に、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも多く存在し、すなわち、比率は、１未満、例えば、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、又は好ましくは０．５未満である。したがって、ドナー細胞から始まり、遺伝子改変Ｔ細胞を産生する全体的な手順は、理想的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ８＋細胞Ｔ細胞を濃縮する。好ましくは、遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも６０％は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、より好ましくは、少なくとも６５％である。遺伝子遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団内で、ＣＤ８＋Ｔ細胞の好ましい範囲は、５５～７５％（例えば、６３～７３％）である。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は、フローサイトメトリーによって容易に評価することができ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を選別及び計数する方法は、当該技術分野において従来のものである。

【0151】

メモリーＴ細胞サブセット（Ｍａｈｎｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４３：２７９７－８０９を参照されたい）
遺伝子改変Ｔ細胞の集団には、ターミナルエフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－細胞として定義される、「ＴＥＭＲＡ」）、Ｔエフェクターメモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－細胞として定義される、「ＥＭ」）、Ｔセントラルメモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋細胞として定義される、「ＣＭ」）、及びナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋細胞として定義される）が含まれ得る。これらの細胞は、ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ及びＣＣＲ７マーカーを使用して、フローサイトメトリーによって評価することができる。ＣＣＲ７を認識し、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５ＲＯアイソフォームを区別できる標識試薬は、商業サプライヤーから容易に入手可能である。

【0152】

平均的なロイコパックは、典型的には、ターミナルエフェクター細胞及びＴエフェクターメモリー細胞の各々を約２０％含む。ドナー細胞から遺伝子改変Ｔ細胞までの全体的な手順は、Ｔエフェクターメモリー細胞と比較して、ターミナルエフェクターメモリーＴ細胞を濃縮し得る。

【0153】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の６０％未満は、例えば、５８％未満、好ましくは５５％未満、より好ましくは５０％未満のナイーブＴ細胞である。遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団内で、ナイーブＴ細胞の好ましい範囲は、３０～６０％、より好ましくは４２～４９％、最も好ましくは４３～４６％である。ナイーブＴ細胞のこの割合は、Ｔ細胞レシピエントにおいて良好な転帰と相関することが見出されている。ナイーブＥＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ及びＣＣＲ７マーカーを使用して、フローサイトメトリーによって評価することができる。

【0154】

遺伝子改変Ｔ細胞の集団内では、ＴＥＭＲＡ、ＥＭ、及びナイーブＴ細胞に加えて、Ｔセントラルメモリー細胞の割合は、一般に、１０％未満である。

【0155】

いくつかの実施形態では、組成物中の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約１０％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞及び約６０％～約９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団は、約１５％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞及び約６０％～約８５％のＣＤ８＋Ｔ細胞、より好ましくは約２０％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞及び約６０％～約８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る。

【0156】

ＮＫ細胞
ＮＫ細胞は、ナチュラルキラー細胞又は大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）としても知られ、自然免疫系にとって重要な細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞の役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性Ｔ細胞の役割に類似している。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した細胞に迅速な応答を提供し、腫瘍形成に応答する。

【0157】

Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化に必要な最初のステップとして、標的細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とＭＨＣ－ペプチド複合体との間のプライミング相互作用に依存する。結果として、Ｔ細胞は、単一の抗原を認識することができ、腫瘍細胞は、抗原提示を大幅に低減させる変異によって、Ｔ細胞の認識を回避することができる。対照的に、ＮＫ細胞は、単一の抗原の提示に依存することなく、多数の形質転換細胞及び感染細胞を認識することができる。したがって、ＮＫ細胞による治療は、Ｔ細胞ベースの治療に対する耐性メカニズムのいくつかをバイパスすることができる。

【0158】

自然細胞として、ＮＫ細胞は、炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインを分泌して、Ｔ細胞及びＢ細胞からなる体の適応免疫系を動員及び活性化し、持続的な抗腫瘍応答の第２波を生み出すことができる。更に、ＮＫ細胞は、サイトカイン放出症候群及び中枢神経系毒性などのＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関連するある特定の毒性とは関連しない。

【0159】

ＮＫ細胞は、それらの先天性の細胞傷害メカニズムのために、抗原又は受容体ベースの指向性細胞療法の供給源として有用であり得る。ＮＫ細胞は、典型的なドナーの末梢血中に約１０～１５％のリンパ球を含み、容易に精製、増殖、及びウイルス形質導入することができる。腫瘍内の細胞に対する指向性細胞療法（例えば、ＨＬＡ－Ｇ）の標的が失われた場合、活性化ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ｐ４６、ｐ４４、ｐ３０、ＤＮＡＭ、及びＣＤ１６を含む細胞傷害機能を指示するための代替的な先天性のメカニズムを有する。

【0160】

細胞の遺伝子改変
細胞は、それに（主題のキメラＩＬＴ受容体をコードする）発現構築物を導入ことによって遺伝子改変される。そのような導入は、遺伝子導入のウイルス法又は非ウイルス法を用いることができる。このセクションでは、遺伝子導入の方法及び組成について説明する。

【0161】

発現ベクターは、様々な手段によって細胞に導入することができる。「トランスフェクション」及び「形質導入」という用語は、互換的であり、外因性核酸配列が真核宿主細胞に導入されるプロセスを指す。トランスフェクション（又は形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクションなどを含むいくつかの手段のうちのいずれか１つによって達成され得る。

【0162】

任意の適切な方法を使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）をトランスフェクト又は形質転換することができる。ある特定の非限定的な例が本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ １３：９１３－２４及びＤｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：１６７３－８３で論じられているように、ＳＦＧベースのウイルスベクターである。

【0163】

細胞は、本明細書に記載のポリペプチドをコードするウイルスベクターを使用して形質導入することができる。好適な形質導入技術は、フィブロネクチン断片ＣＨ－２９６を含み得る。ウイルスベクターを使用する形質導入の代替として、細胞は、例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ）、磁気ビーズ、エレクトロポレーション、及び市販の脂質ベースの試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）及びＦｕｇｅｎｅ（商標））を使用して、関連するポリペプチドをコードするＤＮＡなどを用いて、当該技術分野で既知の任意の好適な方法でトランスフェクトされ得る。形質導入／トランスフェクションステップの１つの結果は、様々なドナー細胞が、ＣＩＲ及び任意の他の所望のポリペプチドを発現することができる遺伝子改変細胞となることである。

【0164】

いくつかの実施形態では、形質導入に使用されるウイルスベクターは、上記のＴｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ １３：９１３－２４及びＤｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）によって開示されているレトロウイルスベクターである。このベクターは、ｉＣａｓｐ９自殺スイッチ及びΔＣＤ１９細胞表面導入遺伝子マーカーをコードする、テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ－Ｖ）シュードタイプレトロウイルスに基づく（更に以下を参照されたい）。上記のＴｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）によって論じられているように、ＰＧ１３パッケージング細胞株で産生され得る。また、所望のタンパク質をコードする他のウイルスベクターも使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞当たり高コピー数のプロウイルス組み込み体を提供することができるレトロウイルスベクターが、形質導入に使用される。

【0165】

形質導入／トランスフェクション後、細胞を形質導入／トランスフェクション材料から分離し、再び培養して、遺伝子改変細胞を増殖させることができる。細胞は、所望の最小数の遺伝子改変細胞が達成されるように増殖させることができる。

【0166】

次いで、遺伝子改変細胞は、得られた細胞集団から選択され得る。ＣＩＲは、所望の細胞の陽性選択に好適ではない可能性があるため、いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞に、目的の細胞表面導入遺伝子マーカーを発現させる必要がある（以下を参照）。この表面マーカーを発現する細胞は、例えば、免疫磁気技法を使用して選択することができる。例えば、目的の細胞表面導入遺伝子マーカーを認識するモノクローナル抗体にコンジュゲートされた常磁性ビーズを使用（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ系（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから入手可能）を使用）することができる。

【0167】

代替手順では、遺伝子改変細胞は、形質導入のステップの後に選択され、培養され、次いで供給される。したがって、形質導入、供給、及び選択の順序を変更することができる。

【0168】

これらの手順の結果は、遺伝子改変細胞を含み、したがって、キメラＩＬＴ受容体（及び任意の他の所望のポリペプチド（例えば、共刺激ポリペプチド）、自殺スイッチ、細胞表面導入遺伝子マーカーなど）を発現することができる組成物である。これらの遺伝子改変細胞は、レシピエントに投与され得るが、それらは、投与される前に、任意選択的に、更なる増殖の後に、最初に保存され得る（例えば、凍結保存され得る）。

【0169】

選択マーカー
細胞は、その発現をインビトロ又はインビボで特定され得るポリペプチドを発現するように改変され得、それによって、例えば、遺伝子改変細胞を未改変細胞から分離するために、遺伝子改変細胞の選択を可能にする。そのようなマーカーは、細胞に特定可能な変化を付与し、所望の発現構築物を含む細胞の容易な特定を可能にする。

【0170】

薬物選択マーカーの包含は、クローニング及び形質転換体の選択を補助する。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。代替的に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が用いられる。

【0171】

細胞外非シグナル伝達ドメイン、又は様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）を含む免疫学的表面マーカーを使用することもでき、磁気又は蛍光抗体媒介性選別のための簡単な方法を可能にする。これらのマーカーは、例えば、タンパク質に結合する標識された抗体を使用して検出することができる。

【0172】

用いられる選択マーカーは、所望の遺伝子産物（例えば、主題のＣＩＲ）をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要であるとは考えられない。更に、マーカーは、理想的には、初期（ドナー）細胞によって発現されないポリペプチドであるべきであるが、マーカーが実際に初期細胞に対して内因性である状況では、発現レベルの違いを利用することができる。

【0173】

理想的には、マーカーを発現する細胞がヒト対象の免疫系によって外来物として認識されるリスクを最小限に抑えるため（例えば、それらが治療的に投与された後）、マーカーはヒトタンパク質に基づく。例えば、Ｔ細胞が所望のタイプの細胞である場合、Ｔ細胞によって天然に発現されないヒトＣＤタンパク質を、この目的のために使用することができる。

【0174】

本明細書に提供される遺伝子改変細胞は、主題のＣＩＲを発現する発現ベクター上に存在する細胞表面導入遺伝子マーカーを発現することができ、かつ／又はいくつかの実施形態では、例えば、ＣＡＲ、アポトーシス促進ポリペプチド安全スイッチ、又は共刺激ポリペプチドなどのＣＩＲ以外のタンパク質をコードする発現ベクター上に存在し得る。

【0175】

一実施形態では、細胞表面導入遺伝子マーカーは、細胞質内ドメインの大部分を除去するためにアミノ酸３３３で切断されたヒトＣＤ１９を含む切断型ＣＤ１９（ΔＣＤ１９）ポリペプチド（上記のＤｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１））である（例えば、配列番号１２（ヌクレオチド）及び１３（タンパク質）を参照）。細胞外ＣＤ１９ドメインは、依然として認識することができる（例えば、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、又はＭＡＣＳにおいて）が、細胞内シグナル伝達を誘発する可能性は最小限に抑えられる。ＣＤ１９は、通常、Ｔ細胞又はＮＫ細胞ではなく、Ｂ細胞によって発現されるため、ＣＤ１９＋細胞の選択は、遺伝子改変細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞）を未改変細胞から分離することを可能にする。

【0176】

別の有用なマーカーは、ＣＤ３４であり、これは、マーカーとして有用である１６アミノ酸の最小エピトープ（配列番号４１）を有する。

【0177】

コード遺伝子の５’末端に所望のタンパク質をコードし、３’末端にマーカーをコードすることにより、（例えば、翻訳の早期終了による）所望のポリペプチドを有しない細胞を選択するリスクを最小限に抑える。このようにして、マーカー及び所望のポリペプチドの発現は並行して実行される。

【0178】

本発明で使用するための好適なＣＤ３４マーカー配列は、表４～４２に開示されている。

【0179】

１１．操作された発現構築物
主題のキメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。いくつかの場合では、そのような核酸は、発現構築物である。キメラＩＬＴ受容体（及び任意選択的に、キメラ抗原受容体、シグナル伝達ポリペプチド、安全スイッチなどの他の所望のポリペプチド）を発現させるための発現構築物が、本明細書に提供される。いくつかの例では、１つ以上のポリペプチドが、プロモーターに「作動可能に連結された」と言われる。これは、プロモーター配列が第２の配列に機能的に連結され、プロモーター配列が、第２の配列に対応してＲＮＡポリメラーゼ開始及びＤＮＡの転写を制御し、それによって、得られた転写物が目的のポリペプチドをコードするように、その第２の配列に関して正しい位置及び配向にあることを示す。

【0180】

「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構によって認識されたか、又は合成機構に導入されたＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、発生的に調節されたプロモーター、すなわち、発生プログラム又は経路によって制御、開始、又は影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するためのＲＮＡポリメラーゼの初期結合部位として機能するプロモーターである。

【0181】

「発現構築物」という用語は、核酸コード配列の一部又は全てが転写され得る遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物である。転写産物は、タンパク質に翻訳され得るが、翻訳される必要はない。ある特定の実施形態では、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳との両方を含む。他の実施形態では、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。発現ベクターは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の転写及び場合によっては翻訳に必要な核酸配列を指す、様々な制御配列を含むことができる。

【0182】

「ベクター」は、核酸配列を標的細胞（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状担体、及びリポソーム）に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」、及び「遺伝子導入ベクター」は、目的の核酸の発現を誘導することができ、核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング及び発現ビヒクル、並びにウイルスベクターを含む。

【0183】

ある特定の例では、ＣＩＲをコードするポリヌクレオチドは、第二のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同じベクター（例えば、ウイルス又はプラスミドベクター）に含まれる。この第２のポリペプチドは、例えば（及び本明細書の他箇所に記載されるように）、内因性タンパク質の下方調節因子、抑制性受容体に対する遮断抗体若しくはｓｃＦｖ、シグナル伝達ポリペプチド、誘導性自殺スイッチ、又はマーカーポリペプチドであり得る。他の例では、追加の発現転写産物は、タンパク質をコードしないが、代わりに、細胞産物中の望ましくないタンパク質をコードするある特定の内因性ＲＮＡの発現を除去するように設計された短いヘアピンＲＮＡ産物を生成してもよい。

【0184】

構築物は、リンカーポリペプチド（例えば、２Ａポリペプチドなどの切断可能なリンカーポリペプチド）によって連結された、ポリペプチドの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸に動作可能に連結された１つのプロモーターで設計され得る。この例では、第１及び第２のポリペプチドは、単一の翻訳事象中に産生されるが、次いで、それらは、分離されてもよい。他の例では、２つのポリペプチドは、同じベクターから別々に発現されてもよく、ポリペプチドのうちの１つをコードするポリヌクレオチドを含む各核酸は、別個のプロモーターに作動可能に連結される。更に他の例では、１つのプロモーターは、２つの別個のＲＮＡ転写産物（したがって、２つのポリペプチド）の産生を指示する２つのポリヌクレオチドに作動可能に連結されてもよく、１つの例では、プロモーターは、双方向であってもよく、コード領域は、反対方向５’－３’であってもよい。したがって、本明細書で論じられる発現構築物は、少なくとも１つ、又は少なくとも２つのプロモーターを含み得る。

【0185】

更に他の例では、２つのポリペプチド（例えば、ＣＩＲ及びマーカータンパク質など）は、２つの別個のベクターを使用して細胞で発現され得る。細胞は、ベクターと共トランスフェクト又は共形質転換されてもよく、又はベクターが異なる時間に細胞に導入されてもよい。

【0186】

これらのアプローチの任意の組み合わせは、遺伝子改変細胞における所望のポリペプチドの発現を達成するために使用され得る。

【0187】

いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ウイルスベクター内に含まれる。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボでウイルスベクターと接触し、いくつかの実施形態では、細胞は、インビボでウイルスベクターと接触することが理解される。したがって、発現構築物は、ベクター（例えば、ウイルスベクター又はプラスミド）に挿入され得る。提供される方法のステップは、任意の好適な方法を使用して行われてもよく、これらの方法は、限定されないが、本明細書に記載の核酸を形質導入する、形質転換する、又はそうでなければ細胞に提供する方法を含む。

【0188】

目的のポリヌクレオチド配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、一般に、所望の細胞におけるポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、特に重要ではない。したがって、ヒト細胞が標的にされる場合、ポリヌクレオチド配列のコード領域は、例えば、ヒト細胞で発現され得るプロモーターに隣接し、その制御下に置かれ得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーター又はウイルスプロモーターのいずれかを含み得る。本明細書に提供されるＣＩＲ及び他のポリペプチドを発現するために使用されるベクターに適切なプロモーターを選択することができる。

【0189】

例えば、発現ベクターがレトロウイルスである様々な実施形態では、適切なプロモーターの例は、マウスモロニー白血病ウイルスプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、例えば、ＣＭＶ最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長鎖末端反復、β２－ミクログロブリン、リボソームタンパク質３１、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ＥＦ１α、□－アクチン、ラットインスリンプロモーター、及びグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、目的のコード配列の高レベルの発現を得ることができる。目的のコード配列の発現を達成するために当該技術分野で周知である他のウイルス又は哺乳動物細胞プロモーターの使用も企図されるが、発現レベルが所与の目的に十分であることであることを条件とする。周知の特性を有するプロモーターを用いることによって、トランスフェクション又は形質転換後の目的のポリペプチドの発現レベル及びパターンを最適化することができる。

【0190】

他の実施形態では、発現ベクターは、ＣＩＲ及び関連するマーカータンパク質、共活性化タンパク質若しくは内因性因子の阻害剤、又は腫瘍微小環境をコードする遺伝子要素が、一過性に共発現されたトランスポザーゼによって認識される要素を担持するプラスミドベクター上に担持されるようなトランスポゾンである。トランスポザーゼの作用は、トランスポザーゼによって認識される反復要素と細胞ゲノムとの間で運ばれる導入遺伝子の融合を触媒することである。これらの実施形態で使用され得るトランスポゾン系の例は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ系及びＰｉｇｇｙｂａｃｋ系である。トランスポゾン内に担持されるプロモーター要素が導入遺伝子の発現を指示する。プロモーターは、例えば、ＣＭＶ最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長鎖末端反復、β２－ミクログロブリン、リボソームタンパク質３１、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ＥＦ１α、β－アクチン、ラットインスリンプロモーター、及びグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼであり得る。トランスポゾン及びトランスポザーゼのプラスミドを細胞に導入するための方法は、ウイルス形質導入ではなくトランスフェクションである。

【0191】

プロモーター及び他の調節要素は、所望の細胞又は組織においてそれらが機能するように選択される。更に、このプロモーターのリストは、網羅的又は限定的あると解釈されるべきではない。本明細書に開示されるプロモーター及び方法と併せて使用される他のプロモーター。

【0192】

ポリヌクレオチドの順序は変動してもよく、任意の特定の方法に対する構築物の好適性を決定するために試験されてもよく、したがって、核酸は、成分（ａ）～（ｄ）の順序の変動も考慮される様々な順序のポリヌクレオチドを含んでもよいことが理解される。そして、核酸は、以下の順序のうちのいずれかにおいて第１～第４のポリヌクレオチドを含んでもよく、１、２、３、及び４（例えば、細胞内領域、例えば、（１）シグナル伝達領域、（２）第１の共刺激ドメイン、（３）第２の共刺激ドメイン、及び（４）表面マーカーにおける成分の配置を表す）は、５’から３’方向の核酸におけるポリヌクレオチドの第１、第２、第３、及び第４の順序を示す。他のポリヌクレオチド、例えば、２Ａポリペプチドをコードするものなどは、該当する場合、列挙されたポリヌクレオチドの間に存在し得ることが理解される。

【0193】

（表１）

【0194】

同様に、核酸は、上記の表に提供される３つのポリペプチドをコードする３つのポリヌクレオチドのみを含み得る。いくつかの実施例では、細胞は、上記の表１に含まれる４つのポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクト又は形質導入される。他の例では、細胞は、例えば、表２に提供される３つのポリペプチドをコードする３つのポリヌクレオチドをコードする核酸でトランスフェクト又は形質導入される。

【0195】

（表２）

【0196】

同様に、核酸は、上記の表に提供される２つのポリペプチドをコードする２つのポリヌクレオチドのみを含んでもよい。

【0197】

（表３）

【0198】

様々なポリペプチド要素の順序の変更は、例えば、表４～４２に見られる。

【0199】

いくつかの実施形態では、細胞は、２つのポリヌクレオチドをコードする核酸でトランスフェクト又は形質導入され、細胞はまた、第３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、かつ／又は細胞はまた、第４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、３つのポリヌクレオチドをコードする核酸でトランスフェクト又は形質導入され、細胞はまた、第４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。例えば、細胞は、第１、第２、及び第３のポリヌクレオチドを含む核酸を含んでもよく、細胞はまた、キメラカスパーゼ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含んでもよい。また、細胞は、第１、第２、及び第４のポリヌクレオチドを含む核酸を含んでもよく、細胞はまた、キメラＩＬＴ受容体をコードするポリヌクレオチド、天然ＩＬＴ２機能のｓｃＦｖモジュレーター又はインターロイキン１５を含む核酸を含んでもよい。

【0200】

１２．疾患を治療するための方法
例えば、注入による細胞（例えば、主題のＣＩＲを発現する細胞）の投与が有益であり得る疾患の治療方法又は予防方法も提供される。細胞は、例えば、例えば、疾患細胞の機能を置き換えるために、再生に使用され得る。本明細書に記載の遺伝子改変細胞は、細胞療法に使用され得る。

【0201】

本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」などの用語は、所望される薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に又は部分的に予防するという点では予防的であり得、かつ／あるいは疾患及び／若しくは疾患に起因する有害作用に対する部分的又は完全な治癒という点では治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を網羅し、（ａ）疾患の素因があるか又は疾患を獲得する危険性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患の発生を防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発達を阻止すること、及び（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。

【0202】

「個体」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ヒト及び非ヒト霊長類（サル及びヒトを含む）、哺乳動物競技動物（例えば、ウマ）、哺乳動物家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）、哺乳動物愛玩動物（イヌ、ネコなど）、及びげっ歯動物（例えば、マウス、ラットなど）を含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。

【0203】

「有効量」又は「十分量」は、単回又は複数回用量で、単独で又は１つ以上の他の組成物（治療剤、例えば、薬物）、治療、プロトコル、若しくは治療レジメンとの組み合わせで、任意の持続期間（長期又は短期）の検出可能な応答、任意の測定可能若しくは検出可能な程度の、又は任意の持続期間の（例えば、数分、数時間、数日間、数か月間、数年間、若しくは治癒）、対象における予期若しくは所望される転帰又は対象への利益を提供する量（例えば、有効量の細胞）を指す。

【0204】

治療のための（例えば、寛解させるか、又は治療的利益若しくは改善を提供するための）「有効量」又は「十分量」の用量は、典型的には、疾患の１つ、複数又は全ての有害な症状、帰結又は合併症、例えば、疾患によって引き起こされるか又はそれに関連する１つ以上の有害な症状、障害、疾病、病態、又は合併症に対する、測定可能な程度の応答を提供するのに有効であるが、疾患の進行又は悪化の減少、低減、阻害、抑制、制限又は制御もまた、満足のいく転帰である。

【0205】

本明細書に提供される遺伝子改変細胞（すなわち、主題のＣＩＲを発現する細胞）は、その必要のあるヒト対象を治療するための方法で使用され得、そのような対象を治療するための薬剤を調製するために使用され得る。細胞は、通常、注入によってレシピエント対象に送達されることになる。

【0206】

遺伝子改変細胞は、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、マクロファージ、又はＮＫ細胞であり得る。対象における療法のためのＴ細胞又はＮＫ細胞の典型的な用量は、１０^５～１０^７細胞／ｋｇである。小児患者は、一般に、約１０^６細胞／ｋｇの用量を投与されるが、成人患者は、例えば、３×１０^６細胞／ｋｇのより高い用量を投与されることになる。

【0207】

一般的に言えば、本発明の遺伝子改変Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、既知のドナー白血球注入（ＤＬＩ）と同じ方法で使用され得るが、それらは、ＣＩＲの更なる利点を有する。

【0208】

遺伝子改変Ｔ細胞又はＮＫ細胞を投与される対象は、典型的には、同種ドナーから他の組織も投与されることになり、例えば、造血細胞及び／又は造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）が投与され得る。この同種移植組織及び遺伝子改変Ｔ細胞は、理想的には、それらが遺伝的に一致するように、同じドナーに由来する。更に、ドナー及びレシピエントは、好ましくは、例えば、一致した無関係のドナー、又は好適な家族メンバーである。例えば、ドナーは、レシピエントの親又は子であり得る。したがって、対象が遺伝子改変Ｔ細胞を必要とすると特定される場合、好適なドナーをＴ細胞ドナーとして特定され得る。

【0209】

レシピエントは、遺伝子改変Ｔ細胞を投与される前に（及び同種移植片を投与される前に）リンパ枯渇コンディショニングを受ける場合がある。したがって、レシピエント自身のα／β Ｔ細胞（及びＢ細胞）は、遺伝子改変Ｔ細胞又はＮＫ細胞を投与される前に枯渇され得る。

【0210】

レシピエントは、血液がん（治療抵抗性血液がんなど）又は遺伝性血液疾患を有し得る。例えば、レシピエントは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡ）、ファンコニ貧血、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、又は多発性骨髄腫を有し得る。

【0211】

ＣＩＲを発現するＴ細胞又はＮＫ細胞のレシピエントは、ＨＬＡ－Ｇを発現する非血液がんを有し得る。例えば、レシピエントは、腎細胞がん（ＲＣＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、大腸がん（ＣＲＣ）、乳がん、神経芽腫、肝細胞がん（ＨＣＣ）を有し得る。

【0212】

他の細胞型もまた、療法で使用することができ、所望の治療結果のために患者に投与される任意の細胞を含む。治療用細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、又はマクロファージなどの免疫細胞、又はそれらの組み合わせであり得、治療用細胞は、例えば、末梢血細胞、造血前駆細胞、骨髄細胞、又は腫瘍細胞であり得る。より免疫原性であるように腫瘍微小環境を更に改善するために、治療を、１つ以上のアジュバント（例えば、ＩＬ－１２、ＴＬＲ、ＩＤＯ阻害剤など）と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、腫瘍床への細胞の送達などの固形腫瘍を治療するために送達されてもよい。

【0213】

いくつかの実施形態では、核酸も提供され、これを対象に投与し、それによって、標的細胞をインビボで形質転換又は形質導入して、インサイツで遺伝子改変細胞を形成することができる。

【0214】

有効量の遺伝子改変細胞が投与される。有効量のリガンド又は改変細胞が投与されるかどうかを決定するために、標的細胞の数、又は標的抗原の量、又は腫瘍のサイズをアッセイ又は測定する任意の手段を使用して、標的細胞の数、標的抗原の量、又は腫瘍のサイズが増加しているか、減少しているか、又は同じままであるかどうかを決定することができる。改変細胞又はリガンドの投与前に取得された試料、画像、又は他の測定手段を使用して、改変細胞又はリガンドの投与後に取得された試料、画像、又は他の測定手段と比較してもよい。したがって、例えば、標的抗原を発現する細胞の量又は濃度が増加しているか、減少しているか、又は同じままであるかどうかを決定するために、第１の試料を、リガンド又は改変細胞の投与前に対象から得てもよく、第２の試料を、リガンド又は改変細胞の投与後に対象から得てもよい。第１の試料における標的抗原を発現する細胞の量又は濃度は、リガンド又は改変細胞の投与後、標的抗原を発現する細胞の量又は濃度が増加しているか、減少しているか、又は同じままであるかどうかを決定するために、第２の試料における標的抗原を発現する細胞の量又は濃度と比較され得る。

【0215】

任意の特定の用途の有効量は、治療される疾患又は状態、投与される特定の組成物、対象のサイズ、及び／又は疾患若しくは状態の重症度などの因子に応じて変動し得る。本明細書に提示される特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。

【0216】

本明細書に提示される改変細胞の有効性を高めるために、これらの組成物及び方法を、疾患の治療に有効な作用物質と組み合わせることが望ましい場合がある。

【0217】

薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔で他の作用物質に先行、並行、及び／又は後行してもよい。薬学的組成物及び他の作用物質が別々に細胞、組織又は生物に適用される実施形態では、一般に、各送達の時間の間に著しい期間が満了しないことを確実にして、その結果、薬学的組成物及び作用物質が、依然として、細胞、組織、又は生物に対する有利に組み合わされた効果を発揮することができる。例えば、そのような場合、細胞、組織、又は生物を、実質的に同時に（すなわち、約１分以内に）２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のモダリティで、薬学的組成物と接触させることができることが企図される。他の態様では、１つ以上の作用物質は、発現ベクターを投与する前及び／又は投与した後に、実質的に同時に、約１分間から、約２４時間まで約７日間まで約１週間まで約８週間またはそれ以上まで、及びその中で導出可能な任意の範囲で投与され得る。更に、本明細書に提示される薬学的組成物の様々な併用レジメン、及び１つ以上の作用物質が用いられ得る。

【0218】

治療又は予防され得る疾患には、ウイルス、細菌、酵母、寄生虫、原虫、がん細胞などによって引き起こされる疾患が含まれる。治療及び／又は予防され得る例示的な疾患としては、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタインバー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、パピローマウイルスなどのウイルス性病因の感染症；又は肺炎、結核、梅毒などの細菌性病因の感染症；又はマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などの寄生虫性病因の感染症が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的組成物（形質導入細胞、発現ベクター、発現構築物など）を使用して治療又は予防され得る前腫瘍状態又は過形成状態には、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などの前腫瘍状態又は過形成状態が含まれるが、これらに限定されない。

【0219】

細胞を使用して治療され得る固形腫瘍を含むがんには、原発性又は転移性黒色腫、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、結腸がん、多発性骨髄腫、神経芽腫、ＮＰＣ、膀胱がん、子宮頸がんなど含まれるが、これらに限定されない。

【0220】

本明細書に提示される治療用細胞及び他の治療用細胞活性化系を使用して治療され得る固形腫瘍を含む他の過増殖性疾患には、関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化、前腫瘍性病変（例えば、腺腫様過形成及び前立腺上皮内腫瘍）、上皮内がん、口腔毛状白板症、又は乾癬が含まれるが、これらに限定されない。

【0221】

標的抗原、例えば、血管系において、例えば、ＨＬＡ－Ｇを発現する任意の腫瘍、例えば、肺、骨、肝臓、前立腺、又は脳、また、例えば、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、軟組織、骨塊、及びリンパ系に存在する固形腫瘍を含む、任意の組織又は臓器由来の固形腫瘍は、本方法を使用して治療され得る。治療され得る他の固形腫瘍には、例えば、膠芽腫、及び悪性多発性骨髄腫が含まれる。

【0222】

対象は、ＣＩＲに含まれる任意の亜鉛依存性因子又はＣＩＲを含む細胞療法産物において発現される補因子が、完全な活性を可能にするためのこのイオンの適切な供給源を有することを確実にするために、亜鉛サプリメントが投与され得る。

【0223】

また、本開示の細胞を作製する方法も提供される。いくつかの実施形態では、かかる方法は、本開示の核酸又は発現ベクター（例えば、主題のＣＩＲをコードするもの）で細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用される。細胞膜内に外因性ＤＮＡが導入された場合、細胞は「トランスフェクション」されている。いくつかのトランスフェクション技術は、一般に、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術は、１つ以上の外因ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。この用語は、遺伝材料の安定した取り込み及び一過性の取り込みの両方を指す。

【0224】

いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ＣＩＲをコードするウイルスベクターで細胞を形質導入することによって産生される。ある特定の態様では、ポリペプチドはＣＩＲを含み、細胞はＴ細胞であり、そのため、ＣＩＲ Ｔ細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、かかる方法は、Ｔ細胞の集団（例えば、ＣＩＲ Ｔ細胞療法が投与されるであろう個体から得られたＴ細胞）を活性化することと、Ｔ細胞の集団を刺激して増殖させることと、ＣＩＲを含むポリペプチドをコードするウイルスベクターでＴ細胞を形質導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ）は、レトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター若しくはレンチウイルスベクター）又はＣＩＲをコードするＡＡＶで形質導入される。ある特定の態様では、免疫細胞のＴ細胞は、ポリペプチドをコードするレンチウイルスベクターで形質導入される。ある特定の態様では、ポリペプチドはＣＩＲを含み、細胞はＣＩＲ ＮＫ細胞であり、そのため、（例えば、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用することによって）ＣＩＲ ＮＫ細胞を産生する方法が提供される。

【0225】

１３．一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなり得るか、又は追加のものが含まれ得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

【0226】

数値ｘに関する「約」という用語は、任意選択的であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

【0227】

「実質的に」という単語は、「完全に」を除外するものではない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という単語は、本発明の定義から省略される場合がある。

【0228】

２つの値に関して「間」という用語は、それら２つの値、例えば、１０ｍｇ～２０ｍｇの「間」の範囲は、とりわけ１０、１５、及び２０ｍｇを包含する。

【0229】

特に明記されない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、混合の任意の特定の順序を必要としない。したがって、成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合、２つの成分を互いに組み合わせることができ、次いで、その組み合わせを、第３の成分などと組み合わせることができる。

【0230】

方法の様々なステップは、同じ又は異なる時間で、同じ又は異なる地理的位置（例えば、国）で、及び同じ又は異なる人々又は団体によって実行され得る。

【0231】

「薬学的に許容される」という用語は、動物又はヒトに投与された場合に望ましくない有害反応、アレルギー反応、又は他の有害反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。

【0232】

２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性パーセントに基づくことができる。本明細書における「配列同一性」とは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」とは、類似性の程度を評価する目的で、最大レベルの同一性を達成するように２つ以上の配列を整列させるプロセスを意味する。配列をアラインメントし、類似性／同一性を評価するための多数の方法は、例えば、クラスター法など、当該技術分野で既知であり、類似性が、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズム、並びにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＦＡＳＴＡに基づいている。これらのプログラムのうちのいずれかを使用する場合、最も高い配列類似性をもたらす設定が選択され得る。

【0233】

１４．特定の核酸及びアミノ酸配列の例
以下のセクション及び表は、キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードするポリペプチド及びヌクレオチド配列の例を含む。例えば、切断型ＩＬＴ２及びＩＬＴ４ポリペプチド、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、安全スイッチなどの、これらの実施例で提供される個々のポリペプチドの配列を使用して、本実施形態のキメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする他の発現ベクターを構築することができることが理解される。
表４は、マーカータンパク質ΔＣＤ１９とともにＨＬＡ－Ｇ１配列を含むγ－レトロウイルスの送達のための完全なベクター配列の例を含む。表５～２０は、同じ例のγ－レトロウイルスベクターによって発現された導入遺伝子のみを含む。

【0234】

（表４）プラスミドＡ：ｐＮＴ１０１－ＳＦＧ－ＨＬＡＧ１－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0235】

（表５）プラスミドＢ：ｐＮＴ１０２－ＳＦＧ－ＨＬＡＧ２－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0236】

（表６）プラスミドＣ：ｐＮＴ１０３－ＳＦＧ－ＨＬＡＧ３－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0237】

（表７）プラスミドＤ：ｐＮＴ１０４－ＳＦＧ－ＨＬＡＧ４－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0238】

（表８）プラスミドＥ：ｐＮＴ１０５－ＳＦＧ－ＨＬＡＧ５－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0239】

（表９）プラスミドＦ：ｐＮＴ１０６－ＳＦＧ－ＨＬＡＧ５Ｃ４２Ｓ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0240】

（表１０）プラスミドＧ：ｐＮＴ１０７－ＳＦＧ－ＨＬＡＧ１Ｃ４２Ｓ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0241】

（表１１）プラスミドＨ：ｐＮＴ１０８－ＳＦＧ－ＨＬＡＧ１Ｃ４２ＳＣ１４７Ｓ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0242】

（表１２）プラスミドＩ：ｐＮＴ１０９－ＳＦＧ－ＨＬＡＧ１Ｃ１４７Ｓ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0243】

（表１３Ａ）プラスミドＫ：ｐＮＴ－１１０ ＳＦＧ－ＩＬＴ２－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0244】

（表１３Ｂ）プラスミドＫ：ｐＮＴ－１１０ ＳＦＧ－ＩＬＴ２－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0245】

（表１４）プラスミドＬ：ｐＮＴ－１１１ ＳＦＧ－ＩＬＴ２．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0246】

（表１５Ａ）プラスミドＭ：ｐＮＴ－１１２ ＳＦＧ－ＩＬＴ２．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0247】

（表１５Ｂ）プラスミドＭ：ｐＮＴ－１１２ ＳＦＧ－ＩＬＴ２．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0248】

（表１６Ａ）プラスミドＮ：ｐＮＴ－１１３ ＳＦＧ－ＩＬＴ２Ｄ１Ｄ２ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0249】

（表１６Ｂ）プラスミドＮ：ｐＮＴ－１１３ ＳＦＧ－ＩＬＴ２Ｄ１Ｄ２ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0250】

（表１７）プラスミド０：ｐＮＴ－１１４ ＳＦＧ－ＩＬＴ２Ｄ１Ｄ２．Ｑ．８ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0251】

（表１８）プラスミドＰ：ｐＮＴ－１１５ ＳＦＧ－ＩＬＴ２Ｄ１Ｄ２．Ｑ．２８ＳＴＭ．ＣＤ２８．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0252】

（表１９）プラスミドＲ：ｐＮＴ－１１６ ＳＦＧ－ＩＬＴ２Ｄ１Ｄ２．Ｑ．ＣＨ２ＣＨ３．８ＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0253】

（表２０Ａ）プラスミドＳ：ｐＮＴ－１１７ ＳＦＧ－ＩＬＴ２Ｄ１Ｄ２．ＣＤ８ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0254】

（表２０Ｂ）プラスミドＳ：ｐＮＴ－１１７ ＳＦＧ－ＩＬＴ２Ｄ１Ｄ２．ＣＤ８ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0255】

（表２１Ａ）プラスミドＴ：ｐＮＴ－１１８ ＳＦＧ－ＩＬＴ４－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0256】

（表２１Ｂ）プラスミドＴ：ｐＮＴ－１１８ ＳＦＧ－ＩＬＴ４－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0257】

（表２２）プラスミドＵ：ｐＮＴ－１１９ ＳＦＧ－ＩＬＴ４．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0258】

（表２３Ａ）プラスミドＶ：ｐＮＴ－１２０ ＳＦＧ－ＩＬＴ４．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0259】

（表２３Ｂ）プラスミドＶ：ｐＮＴ－１２０ ＳＦＧ－ＩＬＴ４．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0260】

（表２４Ａ）プラスミドＷ：ｐＮＴ－１２１ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0261】

（表２４Ｂ）プラスミドＷ：ｐＮＴ－１２１ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0262】

（表２５）プラスミドＸ：ｐＮＴ－１２２ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２．Ｑ．８ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0263】

（表２６）プラスミドＹ：ｐＮＴ－１２３ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２．Ｑ．２８ＳＴＭ．ＣＤ２８．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0264】

（表２７）プラスミドＺ：ｐＮＴ－１２４ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２．Ｑ．ＣＨ２ＣＨ３．８ＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0265】

（表２８Ａ）プラスミドＡＡ：ｐＮＴ－１２４ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２．ＣＤ８ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0266】

（表２８Ｂ）プラスミドＡＡ：ｐＮＴ－１２４ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２．ＣＤ８ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0267】

（表２９）プラスミドＵ：ｐＮＴ－１１９ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｙ３９４Ａ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0268】

（表３０）プラスミドＡＣ：ｐＮＴ－１２６ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｙ３９４Ａ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0269】

（表３１）プラスミドＡＤ：ｐＮＴ－１２８ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２Ｙ９６Ａ．ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0270】

（表３２）プラスミドＡＥ：ｐＮＴ－１２９ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２Ｙ９６Ａ．Ｑ．８ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0271】

（表３３）プラスミドＡＦ：ｐＮＴ－１３０ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２Ｙ９６Ａ．Ｑ．２８ＳＴＭ．ＣＤ２８．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0272】

（表３４）プラスミドＡＧ：ｐＮＴ－１３１ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２Ｙ９６Ａ．Ｑ．ＣＨ２ＣＨ３．８ＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0273】

（表３５）プラスミドＡＨ：ｐＮＴ－１３２ ＳＦＧ－ＩＬＴ４Ｄ１Ｄ２Ｙ９６Ａ．ＣＤ８ＳＴＭ．ＢＢ．ζ－Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９

【0274】

（表３６）ｐＮＴ１３３－ｐＳＦＧ－ＩＬＴ２（Ｄ１－Ｄ４）．ＣＤ８ストークＴＭ．ＢＢ．ｚ．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９

【0275】

（表３７）ｐＮＴ１３４－ｐＳＦＧ－ＩＬＴ４（Ｄ１－Ｄ４）．ＣＤ８ストークＴＭ．ＢＢ．ｚ．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９

【0276】

（表３８）ｐＮＴ１３８ ＳＦＧ－ＩＬＴ４（Ｄ１－Ｄ２）．ＣＨ２ＣＨ３（４－２ＮＱ）．ＣＤ８ＴＭ．ＢＢ．ｚ．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９

【0277】

（表３９）ｐＮＴ１３９ ＳＦＧ－ ＩＬＴ４（Ｄ１－Ｄ２）．ＣＨ３．ＣＤ８ｔｍ．ＢＢ．ｚ．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９

【0278】

（表４０）ｐＮＴ－１５９ ＳＦＧ－ＩＬＴ４（Ｄ１－Ｄ２）．ＣＨ２ＣＨ３（４－２ＮＱ）ｓ．ＣＤ２８ｔｍ．ＢＢ．ｚ．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９

【0279】

（表４１）ｐＮＴ－１６０ ＳＦＧ－ＩＬＴ４（Ｄ１－Ｄ２）．ＣＨ３ｓ．ＣＤ２８ｔｍ．ＢＢ．ｚ．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９

【0280】

（表４２）ｐＮＴ－１５８ ＳＦＧ－ ＩＬＴ４（Ｄ１－Ｄ２）．ＣＤ２８ｓ．ＣＤ２８ｔｍ．ＢＢ．ｚ．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９

【0281】

本開示の例示的な非限定的な態様
上記の本主題の実施形態を含む態様は、単独で、又は１つ以上の他の態様若しくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の説明を限定することなく、本開示のある特定の非限定的な態様を以下に提供する（セットＡ及びセットＢを参照）。本開示を読んだ際に当業者に明らかになるように、個々に番号付けされた態様の各々は、それに先行するか又はそれに続く個々に番号付けされた態様のうちのいずれかとともに使用又は組み合わされ得る。これは、態様の全てのそのような組み合わせの支持を提供することを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせには限定されない。本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正が行われ得ることは、当業者には明白であろう。
セットＡ
１．遺伝子改変細胞が、抗体、ＶｈＨドメイン、又は合成的に誘導されたポリペプチドに由来しない結合ドメインを有するタンパク質又は炭水化物を特異的に標的にするキメラ受容体タンパク質を発現する、組成物。
２．キメラ受容体タンパク質が、抗体、ＶｈＨドメイン、又は合成的に誘導されたポリペプチドに由来しないＨＬＡ－Ｇを標的にする認識ドメイン又は結合ドメインを用いる、１に記載の組成物。
３．キメラ受容体タンパク質が、それらの生物学的作用機序の一部として、ＨＬＡ－Ｇを含む標的タンパク質を天然に認識するヒト受容体タンパク質を用いる、１又は２に記載の組成物。
４．キメラ受容体タンパク質が、ヒト又はサル配列に由来するＩＬＴ２を用いる、３に記載の組成物。
５．キメラ受容体タンパク質が、ヒト又はサル配列に由来するＩＬＴ４を用いる、３に記載の組成物。
６．キメラ受容体タンパク質が、ヒト又はサル配列に由来するＩＬＴ２の天然多型形態を用いる、４に記載の組成物。
７．キメラ受容体タンパク質が、ヒト又はサル配列に由来するＩＬＴ４の天然多型形態を用いる、５に記載の組成物。
８．キメラ受容体タンパク質が、ＩＬＴ２に由来するＤ１及びＤ２ドメインを用いる、４及び６に記載の組成物。
９．キメラ受容体タンパク質が、ＩＬＴ４に由来するＤ１及びＤ２ドメインを用いる、５及び７に記載の組成物。
１０．ＩＬＴ２又はＩＬＴ４のＤ１又はＤ２ドメインが、ＨＬＡ－Ｇ以外のタンパク質の親和性を低減しながら、キメラ受容体の活性化に十分なＨＬＡ－Ｇに対する親和性を保持する目的で、代替アミノ酸をコードするように変異導入される、先行項目のいずれか一項に記載の組成物。
１１．変異が、ＩＬＴ４におけるアミノ酸９６又は３９４に対応する位置にアミノ酸置換を生成する、１０に記載の組成物。
１２．遺伝子改変細胞が、安全スイッチを更に発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
１３．安全スイッチが、誘導性である、１２に記載の組成物。
１４．安全スイッチが、リミドゥシドによって、又はラパマイシン若しくはラパマイシンの類似体によって誘発される、１２に記載の組成物。
１５．遺伝子改変細胞が、第２のキメラ抗原受容体を更に発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
１６．遺伝子改変細胞が、１～１１のいずれか１つに記載の組成物を有する融合要素として、ＮＫ細胞又はＴ細胞に対する細胞傷害性の活性化を駆動する細胞質シグナル伝達ドメインを更に発現する、１～１１のいずれかに記載の組成物。
１７．融合された細胞傷害性シグナル伝達要素が、ＩＴＡＭ配列を含む、１６に記載の組成物。
１８．融合されたシグナル伝達要素が、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、又はＤＡＰ１２に由来する、１６又は１７に記載の組成物。
１９．遺伝子改変細胞が、キメラ受容体の一部として共刺激ポリペプチドを更に発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
２０．遺伝子改変細胞が、キメラ受容体タンパク質から分離された単位として共刺激ポリペプチドを更に発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
２１．共刺激ポリペプチドが、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＭｙＤ８８、ＩＬ－１Ｒα、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＩＬ－１Ｒβ、ＣＤ７０、ＩＬ－１８Ｒα、ＣＤ４０、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－３３Ｒα、ＣＤ３０、又はＩＬ－３３Ｒβに由来するシグナル伝達要素を含む、１９及び２０に記載の組成物。
２２．遺伝子改変細胞が、（ｉ）Ｔ細胞、（ｉｉ）ＮＫ細胞、（ｉｉｉ）ｉＮＫＴ細胞、又は（ｉｖ）マクロファージである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
２３．ヒト対象を治療する方法であって、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む、方法。
２４．ヒト対象を治療する方法であって、対象ががん患者である場合、任意の先行項目に記載の組成物を患者に投与することを含む、方法。
２５．１～２１のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現構築物。
２６．レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はプラスミドベクターである、２５に記載の発現構築物を含む、ベクター。
セットＢ
１．
（ａ）ＨＬＡ－Ｇを標的とし、免疫グルリン様転写産物２（ＩＬＴ２）又は免疫グルリン様転写産物４（ＩＬＴ４）のＤ１～Ｄ２細胞外ドメインを含む、ターゲティング領域と、
（ｂ）膜貫通アミノ酸配列を含む、膜貫通（ＴＭ）領域と、
（ｃ）ＨＬＡ－Ｇへの当該ターゲティング領域の結合により免疫エフェクター細胞の内部にシグナルを伝達してエフェクター細胞の機能を誘発することができるシグナル伝達領域を含む、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）と
を含む、キメラ受容体タンパク質。
２．ターゲティング領域が、配列番号５７に示されるＩＬＴ４アミノ酸配列のＹ９６又は配列番号３１に示されるＩＬＴ２アミノ酸配列のＹ９６に対応する位置にアミノ酸変異を含む、１に記載のキメラ受容体タンパク質。
３．Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインである、１又は２に記載のキメラ受容体タンパク質。
４．Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインである、１又は２に記載のキメラ受容体タンパク質。
５．ターゲティング領域が、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４のＤ３～Ｄ４細胞外ドメインを含む、１～４のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質。
６．ターゲティング領域が、配列番号５５に示されるＩＬＴ４アミノ酸配列のＹ３９４又は配列番号３１に示されるＩＬＴ２アミノ酸配列のＹ３９５に対応する位置にアミノ酸変異を含む、５に記載のキメラ受容体タンパク質。
７．ターゲティング領域が、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを欠く、１～４のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質。
８．ストークドメインを含む、５に記載のキメラ受容体タンパク質。
９．ストークドメインが、ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＣＤ２８、ＣＨ２／ＣＨ３、ＣＨ３、又はＣＤ８ストークドメインを含む、８に記載のキメラ受容体タンパク質。
１０．ＴＭドメインが、ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＣＤ２８、又はＣＤ８ ＴＭドメインである、１～９のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質。
１１．当該シグナル伝達領域が、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、１～１０のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質。
１２．当該シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、１～１０のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質。
１３．当該シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、１～１０のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質。
１４．ＩＣＤが、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む共刺激領域を更に含む、１～１３のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質。
１５．当該少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む、１４に記載のキメラ受容体タンパク質。
１６．当該少なくとも１つの共刺激ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、１４又は１５に記載のキメラ受容体タンパク質。
１７．当該少なくとも１つの共刺激ドメインが、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＭｙＤ８８、ＩＬ－１Ｒα、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＩＬ－１Ｒβ、ＣＤ７０、ＩＬ－１８Ｒα、ＣＤ４０、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－３３Ｒα、ＣＤ３０、若しくはＩＬ－３３Ｒβ共刺激ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、１４に記載のキメラ受容体タンパク質。
１８．
Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインであり、
細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを欠き、
キメラ受容体タンパク質が、ＣＤ８ストークドメインを含み、
ＴＭ領域が、ＣＤ ＴＭであり、
シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、
キメラ受容体タンパク質が、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、
１に記載のキメラ受容体タンパク質。
１９．
Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインであり、
細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを欠き、
キメラ受容体タンパク質が、ＣＤ８ストークドメインを含み、
ＴＭ領域が、ＣＤ ＴＭであり、
シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、
キメラ受容体タンパク質が、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、
１に記載のキメラ受容体タンパク質。
２０．
Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインであり、
細胞外ドメインが、ＩＬＴ２ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを含み、
キメラ受容体タンパク質が、ＣＤ８ストークドメインを含み、
ＴＭ領域が、ＣＤ ＴＭであり、
シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、
キメラ受容体タンパク質が、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、
１に記載のキメラ受容体タンパク質。
２１．
Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２細胞外ドメインであり、
細胞外ドメインが、ＩＬＴ４ Ｄ３～Ｄ４細胞外ドメインを含み、
キメラ受容体タンパク質が、ＣＤ８ストークドメインを含み、
ＴＭ領域が、ＣＤ ＴＭであり、
シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、
キメラ受容体タンパク質が、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、
１に記載のキメラ受容体タンパク質。
２２．１～２１のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
２３．当該ヌクレオチド配列が、構成的プロモーターに作動可能に連結されている、２２に記載の核酸。
２４．当該ヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、２２に記載の核酸。
２５．発現ベクターである、２２～２４のいずれか１つに記載の核酸。
２６．発現ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はプラスミドベクターである、２５に記載の核酸。
２７．１～２２のいずれか１つに記載のキメラ受容体タンパク質を発現する、遺伝子改変細胞。
２８．免疫細胞である、２７に記載の遺伝子改変細胞。
２９．免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、又はマクロファージである、２８に記載の遺伝子改変細胞。
３０．免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、２８に記載の遺伝子改変細胞。
３１．免疫細胞が、Ｔ細胞である、２８に記載のシステム。
３２．安全スイッチを発現する、２７～３１のいずれか１つに記載の遺伝子改変細胞。
３３．安全スイッチが、誘導性である、３２に記載の遺伝子改変細胞。
３４．安全スイッチが、リミドゥシドによって、又はラパマイシン若しくはラパマイシンの類似体によって誘発される、３３に記載の遺伝子改変細胞。
３５．キメラ抗原受容体を更に発現する、２７～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変細胞。
３６．キメラ受容体タンパク質に融合されていない共刺激ポリペプチドを更に発現する、２７～３５のいずれか１つに記載の遺伝子改変細胞。
３７．当該キメラ受容体タンパク質に融合されていない共刺激ポリペプチドが、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＭｙＤ８８、ＩＬ－１Ｒα、ＨＶＥＭ、ＴＲＡＮＣＥ、ＩＬ－１Ｒβ、ＣＤ７０、ＩＬ－１８Ｒα、ＣＤ４０、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－３３Ｒα、ＣＤ３０、若しくはＩＬ－３３Ｒβ共刺激ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、３６に記載の遺伝子改変細胞。
３８．２７～３７のいずれか１つに記載の遺伝子改変細胞を、必要のある個体に投与することを含む、治療方法。
３９．遺伝子改変細胞が、個体に対して自己である、３８に記載の方法。
４０．遺伝子改変細胞が、個体に対して同種である、３８に記載の方法。
４１．個体が、がんを有する、３８～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．個体が、固形腫瘍を有する、４１に記載の方法。
４３．遺伝子改変細胞を産生する方法であって、
２２～２６のいずれか１つに記載の核酸を細胞に導入し、それによって、遺伝子改変細胞を産生することを含む、方法。
４４．遺伝子改変細胞が、免疫細胞である、４３に記載の方法。
４５．免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、又はマクロファージである、４４に記載の方法。
４６．免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、４４に記載の方法。
４７．免疫細胞が、Ｔ細胞である、４４に記載の方法。

【実施例】

【0282】

実験実施例
以下の実施例は、単に例示の目的のために提供され、特に指定されない限り、限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形例を包含するものと解釈されるべきである。

【0283】

更なる説明なしに、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作成及び用い、特許請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本開示の残りの部分を決して限定するものとして解釈されるべきではない。

【0284】

分子生化学及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的なテキストブックにおいて見出され得、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本開示において言及されるか又はそれに関連する方法のための試薬、クローニングベクター、細胞、及びキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．などのような商業的販売会社、並びに、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）などのような貯蔵所から入手可能である。

【0285】

実施例１：初代ヒトＴ細胞における操作されたＣＩＲ構築物の発現
ＨＬＡ－Ｇを標的とするキメラ受容体の発現の有用性を実証するために、免疫機能対抑制性シグナル伝達を活性化するシグナルを生成するように変更されたその天然受容体への結合を介して、組換えＤＮＡ構築物をＳＦＧ γ－レトロウイルスベクターにおいて操作した（図６Ａの概略図を参照）。一実施例では、ＩＬＴ４をコードする全長遺伝子を、ＣＤ１９の細胞外ドメインをコードする遺伝子（ΔＣＤ１９）の５’側にクローニングした（表２１Ｂを参照）。全長ΔＣＤ１９は、このベクターで導入された導入遺伝子の発現をマークするのに有用であった。ＩＬＴ４及びＣＤ１９をコードするシストロンを、トセア・アシグナウイルスに由来するＴ２Ａ共翻訳切断部位によって分離して、個々のｍＲＮＡ分子から別個のタンパク質を発現できるようにした。他の全ての例は、Ｔ２Ａ配列によって分離された、同様にマークされたΔＣＤ１９であった。

【0286】

発現構築物の別の例は、ＩＬＴ４のＤ１～Ｄ４ドメイン及び膜貫通ドメインをコードするが、ＩＬＴ４の天然の細胞内ドメインをヒト４－１ＢＢに由来する共刺激ドメイン及びヒトＣＤ３ζ（ＢＢ．ζ）に由来するシグナル伝達ドメインに置き換えたキメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）をコードした。この構築物は、この実施例ではＣＩＲ１を示すＣＩＲタンパク質をコードした（表２３Ｂを参照）。更なる例は、Ｄ３及びＤ４ドメインではなく、ＨＬＡ－Ｇと直接相互作用するＤ１及びＤ２ドメインのみをコードする配列を含むＣＩＲ２をコードした。これらの配列を、ＩＬＴ４膜貫通ドメイン並びに４－１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの共刺激ドメインをコードする配列と融合させた（表２４Ｂを参照）。更なる実施例は、ＩＬＴ４ストーク及び膜貫通ドメインをコードする配列を、ＣＤ８αのストーク及び膜貫通ドメインをコードする配列に置き換えた。これらの構築物は、ＩＬＴ４ ＣＩＲ３（表３７を参照）及びＣＩＲ４（表２８Ｂを参照）をコードした。

【0287】

また更なる例では、ＩＬＴ４のＤ１～Ｄ４ドメインをコードする配列を、ＩＬＴ２又はＩＬＴ２のＤ１及びＤ２ドメインのみをコードする配列に置き換えた。これらの構築物は、ＩＬＴ２ ＣＩＲ１、ＣＩＲ２、ＣＩＲ３、及びＣＩＲ４をコードした（それぞれ、表１５Ｂ、１６Ｂ、３６、及び２０Ｂを参照）。ＩＬＴ２ ＣＩＲ１及びＣＩＲ２では、ＩＬＴ２のストーク及び膜貫通ドメインをコードする配列を用い、ＣＩＲ３及びＣＩＲ４は、これらの配列を、ＣＤ８αストーク及び膜貫通ドメインをコードする配列に置き換えた。更なる実験では、２つの更なる構築物が陽性対照として生成された。それらは、ＣＤ８αストーク並びにＣＤ８α及びＢＢ．ζ細胞内ドメインの膜貫通ドメインと融合されたＨＬＡ－Ｇ特異的抗体１５Ｅ７の結合要素をコードした（米国特許第１１３１２７７４Ｂ２号を参照）。これは、ともに、及びＨＬＡ－Ｇキメラ抗原受容体（ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ）をコードする。第２の陽性対照の構築物は、ＣＤ３３に対して指向されたＣＡＲをコードし（Ｄｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｏｎｃ．１２：１２４）、ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ）によって一般的に発現された標的タンパク質である。

【0288】

γ－レトロウイルスを、逆転写酵素並びにウイルスカプシド及びエンベロープタンパク質をコードするヘルパープラスミドとともに、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションすることによって、これらのＤＮＡ構築物から産生した。これらのレトロウイルスベクターを使用して、２人の健康なドナーに由来する初代ヒトＴ細胞を形質導入した。形質導入の効率は、フローサイトメトリーによって検出されたΔＣＤ１９マーカータンパク質の発現によって特徴付けられた（図６Ｂを参照）。形質導入の効率は、各組換えレトロウイルスについて８０％を超えた（図６Ｃ）。ＩＬＴ４及びＩＬＴ２の細胞外ドメインを含むＣＩＲ構築物の発現は、染色された形質導入細胞の集団の平均蛍光強度によって定量化された、ＩＬＴ４（図６Ｄ）及びＩＬＴ２（図６Ｅ）に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって決定された。ＩＬＴ２ ＣＩＲ４の発現レベルは、他のＣＩＲタンパク質と比較して顕著に低減したが、ＣＩＲタンパク質の安定した発現は、容易に検出可能であった。

【0289】

この実施例に記載される実験は、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４に由来するＣＩＲタンパク質をコードする組換えレトロウイルスを生成することができること、並びにこれらのレトロウイルスによる初代ヒト免疫細胞の形質導入を行って、ＣＩＲタンパク質を安定的に発現する免疫細胞を生成できることを実証した。

【0290】

方法：ＤＮＡ構築物をＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアで設計し、ＤＮＡ配列を、ＩＤＴ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによってＧＢｌｏｃｋ断片から合成した。合成ＤＮＡ断片を、モロニーマウス白血病ウイルスに基づくレトロウイルスの産生のための組換えＤＮＡのＳＦＧ ＤＮＡベクターへのアセンブリについての標準的なクローニング技法でクローニングした。

【0291】

実施例２：ＣＩＲ－Ｔ細胞による抗腫瘍有効性
ＨＬＡ－Ｇの異なるアイソフォームを安定して発現する腫瘍細胞株を生成するために、ＨＬＡ－ＧアイソフォームであるＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、及びＨＬＡ－Ｇ５をコードする組換えレトロウイルスを生成した。これらのレトロウイルスの各々はまた、マーカータンパク質ΔＥＧＦＲをコードし、これは、ウイルス形質導入の効率を検出するために、Ｔ２Ａ共翻訳切断要素を用いてＨＬＡ－Ｇから分離される。これらのγ－レトロウイルスを使用して、安定した高レベル発現ＨＬＡ－ＧアイソフォームのためのＴＨＰ１ ＡＭＬ細胞を形質導入した。ＥＧＦＲに対する抗体で染色することによって特徴付けられる形質導入効率は、フローサイトメトリーによって検出され、各組換えレトロウイルスについて高かった。形質導入ＴＨＰ１細胞におけるＨＬＡ－Ｇの発現はまた、ＨＬＡ－Ｇ１に特異的であり、ＨＬＡ－Ｇ２には特異的ではないＭＥＭ－Ｇ／９抗体を用いたフローサイトメトリーによって決定され、発現は、形質導入細胞で高レベルであった。

【0292】

ＨＬＡ－Ｇ１も発現するＴＨＰ１－ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰ－ｆｆｌｕｃマーカータンパク質の発現は、高レベルであった（図７Ｂ）。ＧＦＰｆｆルシフェラーゼの発現は、経時的な緑色蛍光の減少又はルシフェラーゼ酵素活性の喪失によって、ＣＩＲ－Ｔ細胞との共培養実験におけるＴＨＰ１細胞の生存能の喪失を間接的に測定するのに有用であった。したがって、ＨＬＡ－Ｇを発現するＴＨＰ１細胞は、ＣＩＲを発現するＴ細胞の細胞傷害性の決定のための適切な標的細胞であった。

【0293】

２人の健康なドナーからの初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるＣＩＲ及びＣＡＲをコードするレトロウイルスの同じコホートで形質導入した。ＣＩＲ－Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ、又はモック形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞を、ＴＨＰ１－ＧＦＰ細胞を発現するＨＬＡ－Ｇ１と５：１のエフェクター対標的比率で共培養し、２日間にわたって定期的に撮像することができる顕微鏡を備えたＩｎｃｕｃｙｔｅインキュベーターに配置した。ＴＨＰ１－ＨＬＡＧ１ ＧＦＰ細胞からの緑色蛍光を、腫瘍の増殖又は腫瘍細胞の殺滅の間接的尺度として、共培養期間中１２時間ごとに定量した（図８）。モック形質導入Ｔ細胞との共培養又は天然抑制性シグナル伝達ドメインを含む完全長ＩＬＴ２若しくはＩＬＴ４を発現するように形質導入されたＴ細胞との共培養（陰性対照、Ｎｅｇ ｃｔｌ）は、腫瘍標的においてＧＦＰの安定した発現を示した。ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養は、腫瘍制御を示す最初の１２時間の時点から始まるＧＦＰ蛍光の減少を示した。これらのＣＡＲ－Ｔ細胞は、この実験において陽性対照として機能した。各ドナーに由来するＩＬＴ２ ＣＩＲ－Ｔ細胞も、低減したＧＦＰ蛍光及び効果的な腫瘍制御を示した。ＣＩＲ４構築物は、おそらく、この構築物の発現レベルの低下に起因して、その抗腫瘍有効性が低減したことに留意されたい（図６Ｅを参照）。ＩＬＴ４ ＣＩＲ－Ｔ細胞はまた、ＴＨＰ－１ ＨＬＡ－Ｇ１の増殖の効果的な制御を示した。

【0294】

同じＴＨＰ－１ ＨＬＡ－Ｇ１に対する短い２４時間経過にわたる抗腫瘍有効性は、形質導入されたヒトＴ細胞との共培養での腫瘍標的におけるＧＦＰ－ルシフェラーゼ発現に関連するルシフェラーゼ活性の測定によって決定された（図９）。全長ＩＬＴ２（Ｎｅｇ Ｃｔｌ）を発現するＴ細胞（Ｅ：Ｔ － ５：１及び１：１）との共培養は、１０万光単位を超える測定可能なルシフェラーゼ活性を有し、ＴＨＰ１－ＨＬＡ－Ｇ１－ＧＦＰｆｆｌｕｃ標的を殺滅する他のＩＬＴ２ ＣＩＲ構築物の能力の参照として機能した。ＩＬＴ２ ＣＩＲ－Ｔ細胞共培養は、ルシフェラーゼ活性を著しく低減させ、ＩＬＴ２ ＣＩＲ－Ｔ細胞の殺滅能力を実証した。ＩＬＴ２ ＣＩＲ４細胞は、おそらくＣＩＲ発現の低減に起因して、他のＣＩＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞陽性対照と比較して、低減した抗腫瘍細胞傷害性を示したことに再び留意されたい。ＩＬＴ４ ＣＩＲ－Ｔ細胞との共培養はまた、全長ＩＬＴ４（Ｎｅｇ Ｃｔｌ）と比較して、増強された抗ＴＨＰ１－ＨＬＡＧ１細胞傷害性を示した。この場合、ＣＩＲ４－Ｔ細胞は、他のＣＩＲ－Ｔ細胞及びＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、優れた抗腫瘍細胞傷害性を有することに留意されたい。

【0295】

この実施例に記載の実験は、ヒト免疫細胞（この特定の例示的な実施形態でのＴ細胞）におけるＣＩＲタンパク質の発現が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の特異性をＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍標的に再指示することができることを実証する。更に、これらの実験は、ＨＬＡ－ＧとＩＬＴ２又はＩＬＴ４配列との間の結合相互作用が、抗腫瘍有効性に十分ではなく、むしろ、Ｔ細胞機能を活性化するドメインによる天然ＩＬＴ２又はＩＬＴ４細胞内シグナル伝達ドメインの置き換えが、細胞傷害性の増強に必要であることを実証する。更に、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４のＤ１及びＤ２ドメインは、キメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）構築物におけるＨＬＡ－Ｇを標的とするのに十分であることが実証された。

【0296】

実施例３：ＣＩＲ構築物におけるストーク及び膜貫通ドメインの改変
標的細胞との結合相互作用及び関与時の細胞内シグナルの伝達の両方を促進するように設計された、操作されたキメラタンパク質において、最適なリンカードメインの選択は、効率の向上を得るために重要であり得る。ストークドメインは、細胞膜から標的特異的結合要素を伸長し、標的タンパク質との関与を阻害しない状況で結合要素を提示する。膜貫通ドメインは、関与時に細胞内ドメインへのシグナルの伝達を促進し、形質膜における安定した発現を維持する。

【0297】

実施例１及び２は、ＩＬＴ４ ＣＩＲ４が、ヒトＴ細胞における形質導入時に適切な発現レベルを示し、他のＣＩＲ構築物と比較して、増強された抗腫瘍細胞傷害性を示した。ＩＬＴ４のＤ１及びＤ２ドメインをＢＢ．ζシグナル伝達要素と一緒に含むこの構築物設計は、ＣＤ８αストーク及び膜貫通ドメインを他のシグナル伝達受容体のストーク及び膜貫通ドメインに置き換える「組み合わせ」実験で使用された。作成された構築物は、図１０に示されている。一例として、ＣＩＲ６は、ＣＤ８αストークを、ヒト免疫グロブリンタンパク質ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインに置き換えた。２つ目の例は、ＣＤ８α膜貫通ドメインと融合されたヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインのみをコードすることによって、ストークの長さを低減させた。別の例は、ＣＨ３ＣＨ２ストークをヒトＣＤ２８に由来する膜貫通ドメインと融合させ、４つ目の例はまた、ストークの長さをＣＨ３ドメインのみに短縮し、また、ＣＤ２８ ＴＭと融合させた。また更なる例は、ＣＤ２８膜貫通ドメインと融合された短いＣＤ２８由来ストークをコードした。これらのＣＩＲ構築物を、ＣＩＲ６、ＣＩＲ７、ＣＩＲ８、ＣＩＲ９、及びＣＩＲ１０で示した（それぞれ、表３８～４２を参照）。これらの代替的なＩＬＴ４ ＣＩＲ誘導体をコードするレトロウイルス構築物はまた、Ｔ２Ａ共翻訳切断部位によって分離されたΔＣＤ１９マーカータンパク質をコードした。

【0298】

ＩＬＴ４ ＣＩＲ構築物をコードするγ－レトロウイルスを作製し、初代ヒトＴ細胞を形質導入した。低及び高多重度の感染には、２又は８ミリリットル（ｍＬ）のレトロウイルス上清を用いて形質導入を行った。全体的な形質導入効率を、フローサイトメトリーによって監視して、形質導入後７日目及び１４日目のΔＣＤ１９マーカーの発現を検出した（図１１Ａ）。形質導入効率は、ＩＬＴ２ ＣＩＲ４、ＩＬＴ４ ＣＩＲ４（親構築物）、及びＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲをコードする対照構築物について、６０％よりも大きかった。形質導入効率は、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含むＩＬＴ４ ＣＩＲ誘導体と同等であった。しかしながら、ＣＨ２ＣＨ３又はＣＨ３ストークと一致するＣＤ８α膜貫通ドメインをコードするＣＩＲ構築物については、形質導入効率が比較的低かった。ＩＬＴ４ ＣＩＲ誘導体の発現レベルを、ＩＬＴ４特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって調べた（図１１Ｂ、図１１Ｃ）。ＣＤ８αストーク及び膜貫通ドメインを含むＣＩＲ４の発現は、バックグラウンド以上でゲーティングされた細胞の％として（図１１Ｂ）、又はシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）として調べた場合に堅牢であった。逆に、代替的なストーク又は膜貫通ドメインを有するＩＬＴ４ ＣＩＲ誘導体のＭＦＩは、ＩＬＴ４ ＣＩＲを発現しないＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ又はＩＬＴ２ ＣＩＲ４などの対照構築物で形質導入されたＴ細胞で観察されたバックグラウンドシグナルよりも上昇しなかった。

【0299】

この実施例に記載される実験は、ＩＬＴ４のＤ１及びＤ２ドメインの提示の状況が、ＣＩＲの安定した発現、及びひいてはＣＩＲ－Ｔ細胞の最適な機能性にとって重要であり得ることを示す。

【0300】

実施例４：ＨＬＡ－ＧアイソフォームのＣＩＲ－Ｔ細胞ターゲティングに対する幅広い特異性
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、典型的には抗体に由来する結合ドメイン、抗体に類似するＶｈＨドメイン、又はそれほど一般的ではないが、標的親和性について選択され標的特異性についてスクリーニングされた合成ペプチドを介して、その巨大分子標的に関与する。これらの場合の各々において、結合ドメインは、ランダムに特異性及び親和性を達成し、バインダーは、潜在的なバインダーのプールの幅広い多様性から選択される。重要なことに、バインダーによって関与される標的上のエピトープは、最も頻繁に、選択的ｍＲＮＡスプライシング又は翻訳後改変によって産生された標的タンパク質の異なる機能的アイソフォームの配列同一性の変化によって除去又は再構築され得るアミノ酸の直鎖状グループである。ＨＬＡ－Ｇの場合、ＨＬＡ－Ｇ２アイソフォームは、α２ドメイン全体を除去し、α２の曝露を必要とするエピトープを使用する任意の抗体は、ＨＬＡ－Ｇ２との相互作用からマスクされるであろう。本発明者らは、逆に、タンパク質間の受容体－リガンド相互作用が、天然に選択されるであろう結合相互作用の幅広い領域を有する傾向があることに気付いた。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４とのＨＬＡ－Ｇ相互作用の例では、本発明者らは、胎児胎盤又は腫瘍細胞による免疫回避の作用物質としてのＨＬＡ－Ｇの機能の性能が、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４と相互作用する各機能的アイソフォームを必要とする可能性が高いことに気付いた。したがって、幅広い特異性に対するこの自然選択が、キメラＩＬＴ受容体（ＣＩＲ）が、典型的なＨＬＡ－Ｇ標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）よりもＨＬＡ－Ｇアイソフォームに対して幅広い特異性を有することを意味するかどうかを試験するように実験を設計した。

【0301】

Ｍｏｌｍ１３－ＧＦＰｆｆｌｕｃ及びＭｏｌｍ１４－ＧＦＰｆｆｌｕｃ細胞は、ＡＭＬ腫瘍に由来し、各々を安定的に形質導入して、ホタルルシフェラーゼとの融合物としてＧＦＰを発現させた。フローサイトメトリーによって、各々をＨＬＡ－Ｇの発現について評価し、Ｍｏｌｍ１４細胞がＨＬＡ－Ｇ陽性であることを見出した（図１２）。２人のドナーからの初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ８α膜貫通ドメイン及びＣＤ８αストーク（ＣＩＲ４）、ＣＨ２ＣＨ３ストーク（ＣＩＲ６）、又はＣＨ３ストーク（ＣＩＲ７）を有するＨＬＡ－Ｇバインダーとして、ＩＬＴ４ Ｄ１及びＤ２ドメインをコードするＩＬＴ４ ＣＩＲ４、ＣＩＲ６、及びＣＩＲ７構築物で形質導入した。これらの実験では、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞も産生された。

【0302】

形質導入Ｔ細胞とＨＬＡＧを発現するＭｏｌｍ１４標的との共培養を、５：１のＥ：Ｔ比率で行った。Ｉｎｃｕｃｙｔｅインキュベーター／顕微鏡でＧＦＰ蛍光を監視することによって、ＣＩＲ－Ｔ又はＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍増殖を制御する能力について共培養を評価した（図１３Ａ）。ＣＩＲ又はＣＡＲを発現しないモック形質導入Ｔ細胞は、４８時間にわたってＭｏｌｍ１４の増殖を制御しなかったが、ＩＬＴ４ ＣＩＲ４－Ｔ共培養物は、モック形質導入細胞と比較して、はるかに低減したＧＦＰ蛍光を示した。実施例３に示されたこれらの構築物の乏しい発現を考慮すると、ＣＩＲ６及びＣＩＲ７－Ｔ細胞は、予想されるように、Ｍｏｌｍ１４細胞の低い制御を示した。驚くべきことに、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞はまた、Ｍｏｌｍ１４－ＧＦＰｆｆｌｕｃ細胞の増殖を制御する能力が低いことを示した。

【0303】

同様の共培養を行って、ルシフェラーゼ活性の低下によって、２４時間にわたるＭｏｌｍ１４－ＧＦＰｆｆｌｕｃ細胞に対するＣＩＲ－Ｔ及びＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を決定した（図１３Ｂ）。モック形質導入Ｔ細胞と共培養されたＭｏｌｍ１４－ＧＦＰｆｆｌｕｃ細胞によって産生されたルシフェラーゼ活性は、単独で培養された腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性と同一であった。産生されたＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養は、モック形質導入Ｔ細胞との共培養と非常に類似したルシフェラーゼ活性を有した。これは、細胞傷害性についての独立したアッセイにおいて、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＭｏｌｍ１４ ＡＭＬ細胞を標的にすることができなかったことを示す。逆に、ＩＬＴ４ ＣＩＲ４－Ｔ細胞は、Ｍｏｌｍ１４－ＧＦＰｆｆｌｕｃ標的に対して実質的な細胞傷害性を有した。これらの結果は、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、代わりにＩＬＴ４ Ｄ１Ｄ２ ＣＩＲによって特定及びターゲティングされるＭｏｌｍ１４細胞上に存在するＨＬＡ－Ｇアイソフォームを認識しない可能性があるという仮説につながった。

【0304】

ＩＬＴ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＨＬＡ－Ｇアイソフォームを標的にするための幅広い特異性を示すかどうかを決定するために、最適なストーク及び膜貫通ドメインを発現するＩＬＴ４ ＣＩＲ－Ｔ細胞（ＣＩＲ４）又は発現を低減する最適以下のドメインを発現するＩＬＴ４ ＣＩＲ－Ｔ細胞（ＣＩＲ６、ＣＩＲ７）、又はＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ｇ１のみ（図１４Ａ）又はＨＬＡ－Ｇ２のみ（図１４Ｂ）を発現するように形質導入されたＴＨＰ１－ＧＦＰｌｕｃ細胞と共培養した。バインダーと標的タンパク質との関与及びシグナルの伝達の活性化に際して、炎症誘発性サイトカインの産生が誘導される。インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の培地への分泌を、共培養におけるＴ細胞の活性化状態の代わりとして使用した。実施例２に示された結果から予想されるように、ＨＬＡ－Ｇ１発現標的細胞とＩＬＴ４ ＣＩＲ４－Ｔ細胞及びＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養は、両方とも、ＩＦＮ－γ産生の増強を示した（図１４Ａ）。興味深いことに、ＩＦＮ－γの産生は、ＴＨＰ１－ＨＬＡ－Ｇ２－ＧＦＰｆｆｌｕｃ標的細胞と共培養されたＩＬＴ４ ＣＩＲ４－Ｔ細胞でのみ刺激され、ＩＦＮ－γの分泌は、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＨＬＡ－Ｇ２のみを発現する標的細胞との共培養では支持されなかった（図１４Ｂ）。

【0305】

この実施例で提示された結果は、古典的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）における抗体由来バインダーの特異性と比較して、ＩＬＴ Ｄ１及びＤ２含有結合物質（ＩＬＴ４ Ｄ１～Ｄ２がこの特定の例示的な実施形態で使用された）を使用することによって、ＨＬＡ－Ｇアイソフォームのターゲティングの特異性を高めることができる（例えば、標的にされ得るアイソフォームの範囲を広げることができる）ことを示した。

【0306】

上記の発明は、明確な理解のために例示及び例によって多少詳しく説明されてきたが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、それらの発明に対してある特定の変更及び修正が行われ得ることは、容易に明らかである。

【0307】

したがって、上記は単に本発明の原理を例示するにすぎない。当業者は、本明細書に明示的に記載又は示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々な配置を考案することができることが理解されるであろう。更に、本明細書に列挙された全ての例及び条件的文言は、主として本発明の原理及び発明者らにより当該技術の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、そのような具体的に列挙された例及び条件への限定ではないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにその特定の例を記載する本明細書における全ての記述は、その構造的及び機能的等価物の両方を包含することを意図する。追加的に、そのような等価物は、現在既知の等価物及び将来開発される等価物の両方、すなわち、構造に関係なく、同じ機能を実施する開発される任意の要素を含むことが意図される。更に、本明細書に開示のいかなるものも、そのような開示が特許請求の範囲に明示的に列挙されているかどうかにかかわらず、公ともに供することを意図しない。

【0308】

したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、説明された例示的な実施形態に限定されることを意図されていない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。特許請求の範囲において、米国特許法第１１２条（ｆ）又は米国特許法第１１２条（６）は、特許請求の範囲におけるそのような限定の冒頭に正確な語句「のための手段」又は正確な語句「のためのステップ」が列挙されるときにのみ、特許請求の範囲における限定のために引用されるものとして明示的に定義され、そのような正確な語句が特許請求の範囲における限定で使用されない場合、米国特許法第１１２条（ｆ）又は米国特許法第１１２条（６）は引用されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B-1】

【図6B-2】

【図6B-3】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A-1】

【図7A-2】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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【国際調査報告】