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▶ アイオワ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-28
(54)【発明の名称】ｍＲＮＡの発現及び送達システム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20250220BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20250220BHJP
C12N 15/44 20060101ALI20250220BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250220BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250220BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250220BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20250220BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20250220BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20250220BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250220BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20250220BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250220BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20250220BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20250220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/50
C12N15/44
C12N15/13
C12N5/10
A61K48/00
A61K39/00
A61K39/145
A61K39/215
A61K39/395 H
A61K35/12
A61P37/04
A61P31/14
A61P31/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024545925
(86)(22)【出願日】2023-02-08
(85)【翻訳文提出日】2024-08-01
(86)【国際出願番号】 US2023062194
(87)【国際公開番号】W WO2023154734
(87)【国際公開日】2023-08-17
(31)【優先権主張番号】63/267,703
(32)【優先日】2022-02-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】304057287
【氏名又は名称】アイオワ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】バーホーベン， デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】ミラー， ワイアット アレン
(72)【発明者】
【氏名】ナラシムハン， バラジ
(72)【発明者】
【氏名】キンバー， マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ジョーンズ， ダグラス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA05
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA44
4C084MA59
4C084MA66
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB33
4C085AA03
4C085AA14
4C085BA01
4C085BA55
4C085BA71
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085GG01
4C085GG03
4C085GG10
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087CA12
4C087MA59
4C087MA66
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB33
(57)【要約】
本開示は、高価な修飾の必要性を排除する、植物ウイルス、昆虫ウイルス、及びフラビウイルス由来の配列に基づくＲＮＡ発現システムを提供する。インビトロ転写及び脂質ナノ粒子を必要とせずにＲＮＡポリヌクレオチドを発現及びパッケージ化する方法が提供される。また、室温で安定であり、鼻腔スプレーによる送達に好適である合成ポリ無水物ナノ粒子を使用して、ＲＮＡポリヌクレオチドをパッケージ化する方法も提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と、を含むＲＮＡポリヌクレオチドであって、前記５’ＵＴＲ又は前記３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス（ｐａｎｉｃｕｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）様キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はエキソリボヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ（ｘｒＲＮＡ）要素を含む、ＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記５’ＵＴＲ又は前記３’ＵＴＲが、ｘｒＲＮＡ要素を含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記ｘｒＲＮＡ要素が、配列番号６、２５、３１、又は３６を含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記５’ＵＴＲ又は前記３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス様キャップ非依存性翻訳エンハンサーを含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記５’ＵＴＲ又は前記３’ＵＴＲが、薄いスズメノヒエ（Ｔｈｉｎ ｐａｓｐａｌｕｍ）無症候性ウイルス（ＴＰＡＶ）、トマトブッシースタントウイルス（Ｔｏｍａｔｏ Ｂｕｓｈｙ Ｓｔｕｎｔ Ｖｉｒｕｓ）（ＴＢＳＶ）、スイートクローバー壊疽モザイクウイルス（ＳＣＮＭＶ）、レッドクローバー壊疽モザイクウイルス（ＲＣＮＭＶ）、又はケシモザイクウイルス（ＯＰＭＶ）に由来する、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記５’ＵＴＲ又は前記３’ＵＴＲが、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記５’ＵＴＲが、配列番号７、１４、２６、２８、２９、３２、３３、又は３７を含み、前記３’ＵＴＲが、配列番号８、１３、１５、１６、２７、３０、３５、又は３８を含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項9】
ＩＲＥＳが、配列番号９、１０、１２、又は３４を含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項10】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＲＮＡタンパク質結合ドメインを含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項11】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’キャップ構造又はポリＡテールを含まない、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項12】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、修飾ヌクレオシドを含まない、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項13】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、抗原ポリペプチドを含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項14】
前記抗原ポリペプチドが、インフルエンザウイルス又はコロナウイルスに由来する、請求項１３に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項15】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、抗体の軽鎖及び重鎖を含む、請求項１に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項16】
ポリ無水物ポリマーと、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡポリヌクレオチドと、を含む、ポリ無水物組成物であって、前記ポリ無水物ポリマーが、前記ＲＮＡポリヌクレオチドを封入する、ポリ無水物組成物。
【請求項17】
前記ポリ無水物ポリマーが、１，８－ビス（カルボキシフェノキシ）－３，６－ジオキサオクタン（ＣＰＴＥＧ）及び１，６－ビス－（ｐ－カルボキシフェノキシ）ヘキサン（ＣＰＨ）のコポリマーを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
ＣＰＴＥＧ：ＣＰＨ比が、約２０：８０～約５０：５０である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
ＲＮＡポリヌクレオチドの送達のためのエクソソームであって、前記エクソソームが、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡポリヌクレオチドを含む、エクソソーム。
【請求項20】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡポリヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項21】
対象において目的のポリペプチドを産生するか、対象にＲＮＡポリヌクレオチドを送達するか、対象において免疫応答を誘導するか、又は対象へ抗体を送達する方法であって、前記方法が、前記対象に、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡポリヌクレオチド、又は前記ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、ポリ無水物組成物、エクソソーム、若しくは医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項22】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド、前記ポリ無水物組成物、前記エクソソーム、又は前記医薬組成物が、前記対象に、筋肉内、鼻腔内、又は皮膚内投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記対象が、ヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
ＲＮＡポリヌクレオチドの送達のためのエクソソームを産生するための方法であって、前記方法が、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡポリヌクレオチドを発現するポリヌクレオチド構築物で細胞を形質転換することと、
前記細胞を増殖培地中で培養することであって、前記ＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソームが、細胞外の増殖培地中に放出される、培養することと、
前記細胞を前記増殖培地から除去することと、
前記増殖培地から前記ＲＮＡポリヌクレオチドを含む前記エクソソームを採取することと、を含む、方法。
【請求項25】
前記採取することが、超遠心分離によるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞が、Ａ５４９細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記ポリヌクレオチド構築物が、プロモーターを含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年２月８日に出願された米国仮出願第６３／２６７，７０３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２２年２月８日に出願された米国仮出願第６３／２６７，７０３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表ＸＭＬ
本出願は、電子提出によりＸＭＬファイル形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２３年２月７日に作成されたＸＭＬファイルは、Ｐ１３６５３ＷＯ００．ｘｍｌの名称であり、５８，８１９バイトのサイズである。
本出願は、電子提出によりＸＭＬファイル形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２３年２月７日に作成されたＸＭＬファイルは、Ｐ１３６５３ＷＯ００．ｘｍｌの名称であり、５８，８１９バイトのサイズである。
【背景技術】
【0003】
ｍＲＮＡワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするｍＲＮＡワクチンによって実証されるように、ウイルスに対して非常に有効であり得る。しかしながら、現在の技術には、以下のようないくつもの欠点がある：（１）プソイドウリジンのような修飾ｒＮＴＰ、及び５’末端にあるキャップ構造［例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮ］、及び３’末端にある一連の５０個以上の連続したアデノシン残基［ポリ（Ａ）テール］を使用することによるｍＲＮＡの修飾の必要性（これらの全ては、製造に高価なステップを必要とする）、（２）-２０～-８０℃を除く熱安定性の欠如、（３）その化学組成が有害な免疫応答を引き起こすことが知られている脂質ナノ粒子、（４）産物の最大２５％が、タンパク質を作製せず、それについてほとんどが分かっていない小さなＲＮＡである複雑な精製システム、並びに（５）訓練を受けた医療専門家を必要とする筋肉内注射による送達の要件。
【発明の概要】
【0004】
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と、を含むＲＮＡポリヌクレオチドであって、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス（ｐａｎｉｃｕｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）様キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はエキソリボヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ（ｘｒＲＮＡ）要素を含む、ＲＮＡポリヌクレオチドが提供される。
【0005】
ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲは、薄いスズメノヒエ（Ｔｈｉｎ ｐａｓｐａｌｕｍ）無症候性ウイルス（ＴＰＡＶ）、トマトブッシースタントウイルス（Ｔｏｍａｔｏ Ｂｕｓｈｙ Ｓｔｕｎｔ Ｖｉｒｕｓ）（ＴＢＳＶ）、スイートクローバー壊疽モザイクウイルス（ＳＣＮＭＶ）、レッドクローバー壊疽モザイクウイルス（ＲＣＮＭＶ）、又はケシモザイクウイルス（ＯＰＭＶ）に由来する。ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’キャップ構造又はポリＡテールを含まない。ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを含まない。ある特定の実施形態では、コードされたポリペプチドは、抗原ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、抗体の軽鎖及び重鎖である。
【0006】
本明細書に開示のＲＮＡポリヌクレオチドのうちのいずれかと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物が提供される。
【0007】
本明細書に開示のＲＮＡポリヌクレオチドのうちのいずれかを送達するためのエクソソームが提供される。
【0008】
ポリ無水物ポリマーと、本明細書に開示のＲＮＡポリヌクレオチドのうちのいずれかと、を含む安定したポリ無水物組成物が提供される。ポリ無水物ポリマーと、本明細書に開示のエクソソームのうちのいずれかと、を含むポリ無水物組成物もまた提供される。
【0009】
５’ＵＴＲと、ポリペプチドをコードする配列を挿入するための異種多重クローニング部位と、３’ＵＴＲと、を含むＲＮＡポリヌクレオチドであって、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス様キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はｘｒＲＮＡ要素を含む、ＲＮＡポリヌクレオチドが提供される。
【0010】
対象に、本明細書に開示のＲＮＡポリヌクレオチド、医薬組成物、ポリ無水物組成物、又はエクソソームのうちのいずれかを投与することを含む、対象において目的のポリペプチドを産生する方法が提供される。
【0011】
対象に、本明細書に開示のＲＮＡポリヌクレオチド、医薬組成物、ポリ無水物組成物、又はエクソソームのうちのいずれかを投与することを含む、対象にＲＮＡポリヌクレオチドを送達する方法が提供される。
【0012】
対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象において抗原特異的免疫応答を産生するのに有効な量のＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物を、対象に投与することを含み、ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲと、少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードする配列と、３’ＵＴＲと、を含み、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス様キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はｘｒＲＮＡ要素を含む、方法が提供される。
【0013】
抗体を対象に送達する方法であって、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物を対象に投与することを含み、ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲと、抗体の軽鎖をコードする配列と、抗体の重鎖をコードする配列と、少なくとも１つの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、３’ＵＴＲと、を含み、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス様キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はｘｒＲＮＡ要素を含む、方法が提供される。
【0014】
ＲＮＡポリヌクレオチドの送達のためのエクソソームを産生するための方法であって、ＲＮＡポリヌクレオチドを発現するポリヌクレオチド構築物で細胞を形質転換することであって、ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲと、少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列と、３’ＵＴＲと、を含み、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス様キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はｘｒＲＮＡ要素を含む、形質転換することと、細胞を増殖培地中で培養することであって、ＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソームが、細胞外の増殖培地中に放出される、培養することと、細胞を増殖培地から除去することと、増殖培地からＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソームを採取することと、を含む、方法が提供される。
【0015】
複数の実施形態が開示されるが、本開示の更に他の実施形態は、本開示の例示的な実施形態を示し、説明する以下の詳細な説明から、当業者に明らかになるであろう。したがって、図面及び詳細な説明は、本質的に例示するものであり、限定するものではないとみなされるべきである。
【0016】
以下の図面は、本明細書の一部分を形成し、本開示のある特定の実施形態又は様々な態様を更に実証するために含まれる。いくつかの場合では、本明細書に提示される詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することによって本開示の実施形態を最もよく理解することができる。説明及び添付の図面は、本開示のある特定の具体的な実施例、又はある特定の態様を強調する場合がある。しかしながら、当業者は、実施例又は態様の一部分が、本開示の他の実施例又は態様と組み合わせて使用され得ることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ｍＲＮＡワクチン転写産物の５’及び３’ＵＴＲにおけるキャップ非依存性翻訳及び安定性要素を示す。太い黒色の線：レポーター（ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）又はｍＫＡＴＥ２）又はワクチン抗原をコードするＯＲＦ（太いボックス）に隣接するＵＴＲ。翻訳／安定性要素のＲＮＡ二次構造は、擬似ノット塩基対合を示す湾曲した破線を有するワイヤー図として示される。直線の破線は、要素が挿入されるおおよその位置を示し、代替構造は同じ部位にマップされる。５’末端に追加されたキャップ類似体（湾曲した矢印）は、左上のボックス内にある。要素の名前はテキストと同じであり、長さが表示されている。Ａ（６０）－Ｘ－Ａ（６０）は、１～６個の非Ａ塩基によって中断された２つの６０Ａトラクトを示す。
【図2】キャップなし及びテールなしのｍＲＮＡのｍＲＮＡトランスフェクション後の発現を示す。インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して、市販のキットによってｍＲＮＡを生成し、ｍＲＮＡトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクションした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に検査した。ＴＰＡＶ及びｘｒＲＮＡカセットは、ｂ－アクチンよりはるかに優れており、少なくとも３日間、レポーターを発現し続けた。
【図3】ポリ無水物ナノ粒子が少なくとも２日間の室温安定性を与えることを示す。ｘｒＲＮＡ ｍＲＮＡを粒子に添加した。次いで、５ｍｇの粒子を、水中で３時間インキュベーションすることによって分解し、ＲＮＡを脂質トランスフェクション試薬に添加し、次いで、ＨＥＬＡ細胞に添加した。細胞を４８時間後に検査した。
【図4】ｍＲＮＡがポリ無水物ナノ粒子中に存続することを示す。ｍＫＡＴＥに隣接するｘｒＲＮＡを含有するナノ粒子（ナノ）を４時間溶解させるか、又は室温で２６時間保持し、次いで、水中に４時間溶解させた。ナノ粒子に含まれないｍＲＮＡ（裸）を同様の条件に供した。ＲＮＡを逆転写し、次いで、４０サイクルでＰＣＲによって増幅した。明らかに、ナノ粒子は、ｍＲＮＡにある程度の熱安定性を与える。
【図5】コポリマーによるｍＲＮＡ送達の増強を示す。Ａ５４９細胞を、ウマＨＡ ｍＲＮＡ（０．５μｇ）を使用して、脂質若しくはコポリマー又はＨ３Ｎ８ウイルスでトランスフェクションした。次いで、ＨＡに対して染色し、続いて、抗マウスＤｙｌｉｇｈｔ ５５５（赤色）で染色した。脂質は、ｍＲＮＡトランスフェクションのためにＭｉｒｕｓ Ｂｉｏからの最適化されたリポソームであった。コポリマーは、より多くの細胞をトランスフェクションしただけでなく、赤色がより深く現れたことは、おそらくより多くのタンパク質が翻訳されたことを意味する。コポリマーにおけるいくつかの細胞損失は、細胞の上部で３７℃でゲル化し、染色前にゲルを除去することに起因する。トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）はこの損失を被ることはない。脂質の陰性対照（図示せず）もまた、コポリマー陰性と同様であった。各々について試験された１２ウェルの両方の送達方法について、１つの代表的なウェルを示す。矢印は、ＨＡ陽性細胞を示す。
【図6】室温でのポリ無水物中での熱安定性を示す。ＲＳＶ Ｆ ｍＲＮＡを作製し、スペルミジンとともに凍結乾燥した。８０μｇを閉じたマイクロチューブ中で、室温で保持し、一方、１００μｇをポリ無水物中に２０：８０で包み込み、同様に保持した。４か月後、ｍＲＮＡを、製造業者の指示に従ってリポソームに添加し、ＨＥＬＡ細胞上に置くか、又は３ｍｍのポリ無水物を粉砕し、一晩ＨＥＬＡ細胞に添加した。次いで、細胞をＲＳＶタンパク質に対して細胞内染色し、続いて、抗ヤギＡｌｅｘ ５５５で染色した。ｑＲＴ－ＰＣＲの結果はまた、ポリ無水物結合ｍＲＮＡのみが、非常に長い間の保存後に無傷であったことを裏付けた。
【図7】トランスフェクションされた細胞における細胞外小胞（ＥＶ）中のｍＲＮＡを示す。Ａ５４９／Ｔ７ポリメラーゼ細胞を、ＤＥＡデキストランを使用して、ｍＫＡＴＥ／ＴＰＡＶ（５μｇ）をトランスフェクションした。次いで、細胞に１０％のグリセロールでショックを与え、培地を除去した。３日後、上清を２回の遠心分離及び０．２μＭの濾過によって採取した。１００μｌのＥＶをＨＥＬＡ細胞（Ｔ７なし）に１時間添加した後、洗浄し、培地を交換した。細胞は、４８時間後に開花し始め、７２時間後により高い強度になった。
【図8】電子顕微鏡によって検査されたＥＶを示す。ＥＶを超遠心分離（図示せず）又は市販のキットによって精製した。次いで、それらを走査型電子顕微鏡に供した。
【図9】ＤＥＡデキストラントランスフェクション後に細胞から採取されたＥＶを示す。Ａ５４９ Ｔ７細胞を、ＤＥＡデキストラン担体中、空又はＴＰＡＶ ｍＫＡＴＥ ＰＣＲ産物で、グリセロールショックでトランスフェクションした。上清を除去し、無血清培地中で３日間、細胞にＥＶを作製させた。これらを採取し、スピンダウンし、ナノサイト顕微鏡で検査した。左側の空のトランスフェクションは、均一ではない小さなＥＶサイズを有する。右側は、ＴＰＡＶ ＰＣＲ産物を有し、Ｔ７ポリメラーゼを介してｍＲＮＡを転写した細胞は、ｍＲＮＡ＋ＥＶの典型的なサイズのより大きなＥＶを有した。右側のものの濃度は、合計３０ｍｌで１０９個／ｍｌであった。ＥＶ及びその内容物が非常に安定しているため、これらは、４℃で１週間後に観察された。
【図10】自己切断カセットの使用を示す。自己切断ペプチドを使用する多シストロン性システムは、両方のコード配列の高い発現をもたらした。
【図11】Ｔ７ ＢＨＫ細胞において発現された追加のｍＲＮＡ構築物の比較を示す。トランスフェクションの１８時間後のトランスフェクションされた１ｍｇのＤＮＡを示す。３’ｘｒＲＮＡを有するＳＣＮＭＶ及びＴＰＡＶは、ｍＣｈｅｒｒｙの最も好ましい発現をもたらした。
【図12】Ｈ３Ｎ８由来のｒＨＡで１回（ｒＨＡ／１用量）又は２回（ｒＨＡ／２用量）、ＥＶ中の正しい（ｍＲＮＡ／１用量）若しくは逆方向（逆ｍＲＮＡ）のＨ３Ｎ８ ＨＡ、又はリポソーム中のβ－アクチン（ＵＴＲ）キャップ及びテールが付いたＨ３Ｎ８ ＨＡ（ＨＫ ｍＲＮＡ／１用量）についてのＴＰＡＶカセット上のＡｌｕｍ又はｍＲＮＡで、ワクチン接種されたマウスの血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価を示す。
【図13】裸ｍＲＮＡトランスフェクションを示す。Ｔ７を有しないＡ５４９細胞を、Ｒｉｂｏｊｕｉｃｅリポソームを使用して、偽（左）、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するブタカセット（中央）、又はｍＣｈｅｒｒｙを発現する市販のｍＲＮＡ（修飾Ｕ／Ｃ、Ａｒｃｏキャップ、及びテールが付いた）（右）でトランスフェクションした。トランスフェクションの１８時間後に細胞を検査した。明視野画像上でのｍＣｈｅｒｒｙを示す。
【図14】ポリ無水物ナノ粒子中のｍＲＮＡの安定性を示す。ポリ無水物に配置されたｍＲＮＡ構築物は、３７℃で７日後に熱による分解に対する耐性を示した。従来のＩＶＴ生成ｍＲＮＡは、このレベルの熱安定性を有しなかった。
【図15A】環状ＲＮＡ構築を示す。図１５Ａは、環化され、次いで線状ＲＮＡを分解するＲＮＡｓｅ Ｒで消化された２つの構築物を示すゲルの画像である。図１５Ｂは、ＲＮＡｓｅ Ｒが線形ＲＮＡを分解することを実証する対照を示すゲルの画像である。
【図15B】環状ＲＮＡ構築を示す。図１５Ａは、環化され、次いで線状ＲＮＡを分解するＲＮＡｓｅ Ｒで消化された２つの構築物を示すゲルの画像である。図１５Ｂは、ＲＮＡｓｅ Ｒが線形ＲＮＡを分解することを実証する対照を示すゲルの画像である。
【図16A】ＴＰＡＶ単発現システムを示す。図１６Ａは、Ｔ７プロモーター、ＴＰＡＶ由来の５’ＵＴＲ、ｍＫＡＴＥ２レポーター遺伝子に隣接するクローニング部位（ＢａｍＨＩ及びＸｈｏ）、及びＴＰＡＶ由来の３’ＵＴＲを含むＴＰＡＶ ｍＲＮＡカセット（配列番号１）を示す。図１６Ｂは、配列番号１と同じであるが、（ｍＫＡＴＥではなく）ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子の後ろ及び３’ＵＴＲの前のＸｈｏクローニング部位間にＲＮＡタンパク質結合ドメイン、並びにＴ７ポリメラーゼターミネーターを有するＴＰＡＶ ｍＲＮＡカセット（配列番号２）を示す。
【図16B】ＴＰＡＶ単発現システムを示す。図１６Ａは、Ｔ７プロモーター、ＴＰＡＶ由来の５’ＵＴＲ、ｍＫＡＴＥ２レポーター遺伝子に隣接するクローニング部位（ＢａｍＨＩ及びＸｈｏ）、及びＴＰＡＶ由来の３’ＵＴＲを含むＴＰＡＶ ｍＲＮＡカセット（配列番号１）を示す。図１６Ｂは、配列番号１と同じであるが、（ｍＫＡＴＥではなく）ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子の後ろ及び３’ＵＴＲの前のＸｈｏクローニング部位間にＲＮＡタンパク質結合ドメイン、並びにＴ７ポリメラーゼターミネーターを有するＴＰＡＶ ｍＲＮＡカセット（配列番号２）を示す。
【図17】レッドクローバー壊疽モザイクウイルス（ＲＣＮＭＶ）を使用するｘｒＲＮＡを有するｍＲＮＡカセット（配列番号３）を示す。カセットは、Ｔ７プロモーター、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子に隣接するクローニング部位、ＲＣＮＭＶ由来の３’ＵＴＲ ｘｒＲＮＡ配列、及びＴ７ポリメラーゼターミネーターを含む。
【図18】ｘｒＲＮＡリーダー、５’ＴＰＡＶ ＵＴＲ、３’ＴＰＡＶ ＵＴＲ ｍＲＮＡカセット（配列番号１７）を示す。カセットは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ジカウイルス由来のｘｒＲＮＡ、５’ＵＴＲ ＴＰＡＶ、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子のＣＤＳ、ＲＮＡタンパク質結合ドメイン、ＴＰＡＶ ３’ＵＴＲ、Ｔ７ポリメラーゼターミネーター、及びクローニング部位（ＡＡＧＣＴ、ＣＴＣＧＡＧ、及びＣＡＴＡＴＧ）を含む。
【図19】ｘｒＲＮＡ、コオロギ麻痺ウイルスＩＲＥＳ、３’ＵＴＲ ＴＰＡＶ ｍＲＮＡ発現カセット（配列番号１８）を示す。カセットは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ジカウイルス由来のｘｒＲＮＡ、ＩＲＥＳ、ＡＴＧｌｅｓｓ ＣＤＳレポーター、ＲＮＡタンパク質結合ドメイン、３’ＵＴＲ ＴＰＡＶ、及びＴ７ポリメラーゼターミネーターを含む。
【図20】ｘｒＲＮＡ、ＴＲＩＭＶ、３’ＴＰＡＶ ＵＴＲ ｍＲＮＡカセット（配列番号１９）を示す。カセットは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ジカウイルス由来のｘｒＲＮＡ、ＴＲＩＭＶ ５’ＩＲＥＳ、ＣＤＳレポーター、ＲＮＡタンパク質結合ドメイン、３’ＵＴＲ ＴＰＡＶ、及びＴ７ポリメラーゼ終結ターミネーターを含む。
【図21A】トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）に基づくｍＲＮＡカセットを示す。図２１Ａは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ジカウイルス由来のＴ７エンハンサーｘｒＲＮＡ、ＣＤＳレポーター、ＲＮＡタンパク質結合ドメイン、ＴＢＳＶ ３’ＵＴＲ、Ｔ７ポリメラーゼターミネーター、及びクローニング部位（ＡＡＧＣＴ、ＣＴＣＧＡＧ、及びＣＡＴＡＴＧ）を含むカセット（配列番号２０）を示す。図２１Ｂは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ジカウイルス由来のｘｒＲＮＡ、ＴＢＳＶ ５’ＵＴＲ、ＣＤＳレポーター、ＴＢＳＶ ３’ＵＴＲ、及びＴ７ポリメラーゼターミネーターを含むカセット（配列番号２１）を示す。
【図21B】トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）に基づくｍＲＮＡカセットを示す。図２１Ａは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ジカウイルス由来のＴ７エンハンサーｘｒＲＮＡ、ＣＤＳレポーター、ＲＮＡタンパク質結合ドメイン、ＴＢＳＶ ３’ＵＴＲ、Ｔ７ポリメラーゼターミネーター、及びクローニング部位（ＡＡＧＣＴ、ＣＴＣＧＡＧ、及びＣＡＴＡＴＧ）を含むカセット（配列番号２０）を示す。図２１Ｂは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ジカウイルス由来のｘｒＲＮＡ、ＴＢＳＶ ５’ＵＴＲ、ＣＤＳレポーター、ＴＢＳＶ ３’ＵＴＲ、及びＴ７ポリメラーゼターミネーターを含むカセット（配列番号２１）を示す。
【図22A】ＴＰＡＶ／ヘッドｘｒＲＮＡカセット及びＴＰＡＶ／テールｘｒＲＮＡカセットを示す。図２２Ａは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、レッドクローバー壊疽モザイクウイルス（ＲＣＮＭＶ）由来のｘｒＲＮＡ、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子、ＴＰＡＶ由来の３’ＵＴＲを含むＴＰＡＶ／ヘッドｘｒＲＮＡカセット（配列番号２２）を示す。図２２Ｂは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ＲＣＮＭＶ由来の５’ＵＴＲ、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子、ＲＣＮＭＶ由来のｘｒＲＮＡ、及びＴＰＡＶ由来の３’ＵＴＲを含むＴＰＡＶ／テールｘｒＲＮＡカセット（配列番号２３）を示す。
【図22B】ＴＰＡＶ／ヘッドｘｒＲＮＡカセット及びＴＰＡＶ／テールｘｒＲＮＡカセットを示す。図２２Ａは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、レッドクローバー壊疽モザイクウイルス（ＲＣＮＭＶ）由来のｘｒＲＮＡ、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子、ＴＰＡＶ由来の３’ＵＴＲを含むＴＰＡＶ／ヘッドｘｒＲＮＡカセット（配列番号２２）を示す。図２２Ｂは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ＲＣＮＭＶ由来の５’ＵＴＲ、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子、ＲＣＮＭＶ由来のｘｒＲＮＡ、及びＴＰＡＶ由来の３’ＵＴＲを含むＴＰＡＶ／テールｘｒＲＮＡカセット（配列番号２３）を示す。
【図23】ＲＣＮＭＶに基づくｍＲＮＡカセット（配列番号２４）を示す。カセットは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ＲＣＮＭＶ由来の５’ＵＴＲ、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子、及びＲＣＮＭＶ由来の３’ＵＴＲを含む。
【発明を実施するための形態】
【0018】
配列の簡単な説明
配列番号１～５及び１７～２４は、ｍＲＮＡ発現カセットの配列である。
配列番号１～５及び１７～２４は、ｍＲＮＡ発現カセットの配列である。
【0019】
配列番号６は、ジカウイルスｘｒＲＮＡ配列である。
【0020】
配列番号７は、ＴＰＡＶ ５’ＵＴＲ配列である。
【0021】
配列番号８及び１３は、ＴＰＡＶ ３’ＵＴＲ配列である。
【0022】
配列番号９は、ポリオウイルスＩＲＥＳ配列である。
【0023】
配列番号１０は、コオロギ麻痺ウイルスＩＲＥＳ配列である。
【0024】
配列番号１１は、ＲＮＡタンパク質結合ドメイン配列である。
【0025】
配列番号１２は、コムギモザイクウイルス（ＴＲＩＭＶ）ＩＲＥＳ配列である。
【0026】
配列番号１４は、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）５’ＵＴＲ配列である。
【0027】
配列番号１５及び１６は、ＴＢＳＶ ３’ＵＴＲ配列である。
【0028】
配列番号２５及び３６は、レッドクローバー壊疽モザイクウイルス（ＲＣＮＭＶ）ｘｒＲＮＡ配列である。
【0029】
配列番号２６及び３７は、ＲＣＮＭＶ ５’ＵＴＲ配列である。
【0030】
配列番号２７及び３８は、ＲＣＮＭＶ ３’ＵＴＲ配列である。
【0031】
配列番号２８は、スイートクローバー壊疽モザイクウイルス（ＳＣＮＭＶ）５’ＵＴＲ配列である。
【0032】
配列番号２９は、豚熱ウイルス５’ＵＴＲ配列である。
【0033】
配列番号３０は、Ｃ型肝炎ウイルス３’ＵＴＲ配列である。
【0034】
配列番号３１は、ジャガイモ葉巻ウイルスｘｒＲＮＡ配列である。
【0035】
配列番号３２は、ウシウイルス性下痢ウイルス５’ＵＴＲ配列である。
【0036】
配列番号３３は、ケシモザイクウイルス（ＯＰＭＶ）５’ＵＴＲ配列である。
【0037】
配列番号３４は、ＣＨＯＰヒトｍＲＮＡ配列である。
【0038】
配列番号３５は、ジカウイルス３’ＵＴＲ配列である。
（発明を実施するための形態）
（発明を実施するための形態）
【0039】
本開示をより容易に理解し得るように、まず、特定の用語を定義する。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示の実施形態が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の、修正された、又は同等の多くの方法及び材料は、過度の実験なしに本開示の実施形態の実施において使用され得、好ましい材料及び方法が本明細書に記載される。本開示の実施形態の説明及び特許請求において、以下の用語は、以下に示される定義に従って使用される。
【0040】
本明細書で使用される全ての用語が、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、いかなる方法又は範囲でも限定することを意図するものではないことを理解されたい。例えば、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の指示物を含み得る。同様に、「又は」という単語は、別途文脈が明確に示さない限り、「及び」を含むことが意図される。「又は」という単語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。更に、全ての単位、接頭辞、及び記号は、そのＳＩの認められた形式で表示され得る。
【0041】
本明細書内で列挙される数値範囲は、範囲を定義する数を含み、定義された範囲内の各整数を含む。本開示を通して、本開示の様々な態様が、範囲形式で提示される。範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔のためであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の全ての可能な部分範囲、分数及び個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６、及び小数及び分数、例えば、１．２、３．８、１ １／２、及び４ ３／４が具体的に開示されるとみなされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
【0042】
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、質量、体積、時間、及び温度を含むがこれらに限定されない、任意の定量化可能な変数に関して、典型的な測定技術及び装置を介して生じ得る数値量の変化を指す。更に、現実世界で使用される固体及び液体の取り扱い手順を考慮すると、組成物を作製するか、又は方法などを実施するなどのために使用される成分の製造、供給源、又は純度の違いによる可能性が高いある特定の不注意なエラー及び変動がある。「約」という用語はまた、これらの変形を包含する。「約」という用語によって修飾されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲は、数量の同等物を含む。
【0043】
本開示の方法及び組成物は、本開示の構成要素及び成分並びに本明細書に記載の他の成分を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」とは、方法、システム、装置、及び組成物が、追加のステップ、構成要素、又は成分を含み得るが、追加のステップ、構成要素、又は成分が、特許請求される方法、システム、装置、及び組成物の基本的及び新規の特徴を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。
【0044】
本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達の段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達の段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、又はブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び寄生虫が含まれるが、これらに限定されない。
【0045】
本明細書で使用される場合、「生体適合性」という用語は、免疫システムによる損傷、毒性、又は拒絶反応のリスクがほとんどないか、又は全くない生細胞、組織、臓器、又はシステムとの適合を意味する。
【0046】
本明細書で使用される場合、「生分解性」という用語は、生物の作用によって無害な産物に分解されることができることを意味する。
【0047】
本明細書で使用される場合、「保存（された）」という用語は、それぞれ、比較される２つ以上の配列の同じ位置で変化しないポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基を指す。比較的保存されたヌクレオチド又はアミノ酸は、配列の他の場所に現れるヌクレオチド又はアミノ酸よりも関連性の高い配列の中で保存されているヌクレオチド又はアミノ酸である。
【0048】
いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、又は約９９％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、又は約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチド又はポリペプチドの全長に適用され得るか、又はその部分、領域又は特徴に適用され得る。
【0049】
本明細書で使用される場合、「環状」という用語は、連続ループの存在を指す。環状分子は、円形である必要はなく、サブユニットの切れ目のない鎖を形成ために結合しているだけである。本開示のＲＮＡポリヌクレオチドなどの環状分子は、単一単位若しくは多量体であり得るか、又は複合体若しくは高次構造の１つ以上の構成要素を含み得る。
【0050】
本明細書で使用される場合、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、貨物、又はペイロードを送達する行為又は方法を指す。
【0051】
本明細書で使用される場合、「送達剤」は、少なくとも部分的に、ＲＮＡポリヌクレオチドの標的細胞へのインビボ送達を促進する任意の物質を指す。
【0052】
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」は、ラジオグラフィー、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む当技術分野で既知の方法によって容易に検出される別の実体に結合されるか、組み込まれるか、又は会合する１つ以上のマーカー、シグナル、又は部分を指す。検出可能な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、酵素、染料、金属イオン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びハプテンなどのリガンド、量子ドットなどが挙げられる。検出可能な標識は、本明細書に開示のペプチド又はタンパク質における任意の位置に位置し得る。それらは、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質内にあり得るか、又はＮ末端若しくはＣ末端に位置し得る。
【0053】
本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、より小さな断片又は構成要素に分割することを意味する。ポリペプチド又はタンパク質を指す場合、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
【0054】
本明細書で使用される場合、「遠位」という用語は、中心から離れて、又は目的の点若しくは領域から離れた位置にあることを意味する。
【0055】
本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物の処理（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端処理による）、（３）ポリペプチド又はタンパク質へのＲＮＡの翻訳、及び（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。
【0056】
本明細書で使用される場合、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチド及び送達剤を含む。
【0057】
本明細書で使用される場合、「断片」は、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含み得る。
【0058】
本明細書で使用される場合、「機能的」生体分子は、それが特徴付けられる特性及び／又は活性を示す形態の生体分子である。
【0059】
「異種」という用語は、自然界で一緒に見出されない２つの生物学的構成要素を指す。構成要素は、宿主細胞、遺伝子、又はプロモーターなどの調節領域であり得る。異種の構成要素は、自然界で一緒には見出されないが、遺伝子に対して異種のプロモーターが遺伝子に作動可能に連結されている場合のように、それらは一緒に機能し得る。別の例は、コード配列が、同じポリヌクレオチド上の５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲなどの非翻訳領域に対して異種である場合である。
【0060】
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、又は微生物）内ではなく、人工環境、例えば、試験管又は反応容器、細胞培養、ペトリ皿などにおいて生じる事象を指す。
【0061】
本明細書で使用される場合、「インビトロ合成」という用語は、ｍＲＮＡの無細胞合成方法を指す。
【0062】
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、若しくは微生物、又はその細胞若しくは組織）内で生じる事象を指す。
【0063】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、それが関連付けられた構成要素のうちの少なくともいくつかから分離された物質又は実体を指す（自然界又は実験環境のいずれでも）。単離された物質は、それらが関連していた物質を参照して、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／又は実体は、それらが最初に関連していた他の構成要素の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の構成要素を実質的に含まない場合、「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物が、それが形成又は検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的な分離には、例えば、本開示の化合物が濃縮された組成物が含まれ得る。実質的な分離には、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、又は少なくとも約９９重量％の本開示の化合物又はその塩を含有する組成物が含まれ得る。化合物及びそれらの塩を単離するための方法は、当技術分野では日常的である。
【0064】
「多重クローニング部位」（ＭＣＳ）は、ベクター又は核酸構築物への核酸断片のクローニングを目的として、少なくとも１つの独自の制限部位、及びより典型的には、独自の制限部位の群を含むヌクレオチド配列を指す。
【0065】
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」は、人工的な補助なしで天然に存在することを意味する。
【0066】
本明細書で使用される場合、「非ヒト脊椎動物」は、野生及び家畜種を含む、ホモサピエンスを除く全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ水牛、及びヤクなどの哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0067】
「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡ）で終わるヌクレオチドの連続ストレッチであり、ポリペプチドをコードする。
【0068】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という語句は、２つ以上の分子、構築物、転写産物、実体、部分などの間の機能的接続を指す。
【0069】
本明細書で使用される場合、「パラトープ」は、抗体の抗原結合部位を指す。
【0070】
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしでヒト及び動物の組織に接触して使用するのに好適である、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために用いられる。
【0071】
「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の化合物以外の、患者において実質的に非毒性及び非炎症性である特性を有する任意の成分を指す。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料（色素）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、成膜剤若しくはコーティング剤、香味剤、芳香剤料、滑剤（流量増強剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤若しくは分散剤、甘味剤、及び水和水が挙げられ得る。賦形剤の例としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、アルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、事前ゼラチン化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0072】
「ポリＡテール」は、複数の連続したアデノシン一リン酸を含有する３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリＡテールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。例えば、ポリＡテールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含有する。関連する生物学的状況（例えば、細胞内、インビボ）では、ポリ（Ａ）テールは、例えば、細胞質において、ｍＲＮＡを酵素分解から保護するように機能し、転写終結、ｍＲＮＡの核からの輸送、及び翻訳を補助する。
【0073】
本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害、及び／若しくは状態の発病を部分的又は完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び／若しくは状態の１つ以上の症状、特徴、若しくは臨床兆候の発病を部分的又は完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び／若しくは状態の１つ以上の症状、特徴、若しくは兆候の発病を部分的又は完全に遅延させること、感染、特定の疾患、障害、及び／若しくは状態からの進行を部分的又は完全に遅延させること、及び／又は感染、疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病理を発症するリスクを減少させることを指す。
【0074】
本明細書で使用される場合、「近位」という用語は、中心又は目的の点若しくは領域に近接した位置にあることを意味する。
【0075】
本明細書で使用される場合、「精製する」、「精製（された）」、「精製」は、望ましくない構成要素、物質の汚染、混合物、又は不完全性から実質的に純粋又は明確にすることを意味する。
【0076】
本明細書で使用される場合、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間、及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いに対する類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算が、当技術分野で理解されているように保存的置換を考慮に入れることを除いて、同一性パーセントの計算と同じ方法で実施され得る。
【0077】
本明細書で使用される場合、「安定した」は、反応混合物からの有用な純度の単離に耐えるのに十分に堅牢であり、好ましくは有効な治療剤に製剤化することができる化合物を指す。
【0078】
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、本開示による組成物が、例えば、実験目的、診断目的、予防目的、及び／又は治療目的で投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）が挙げられる。
【0079】
「治療剤」という用語は、対象に投与された場合、治療、診断、及び／又は予防効果を有し、かつ／又は所望の生物学的及び／若しくは薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
【0080】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び／又は状態に罹患しているか、又はそれを罹患しやすい対象に投与された場合、感染、疾患、障害、及び／又は状態を治療し、その症状を改善し、診断し、予防し、及び／又はその発病を遅延させるのに十分である送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。
【0081】
核酸／ポリヌクレオチド
本明細書で提供される組成物は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（１つ以上の）リボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、ヌクレオチド（ヌクレオチドモノマー）のポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称される。したがって、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。
本明細書で提供される組成物は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（１つ以上の）リボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、ヌクレオチド（ヌクレオチドモノマー）のポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称される。したがって、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。
【0082】
核酸は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リボ配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含む）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、又はそれらのキメラ若しくは組み合わせであり得るか、又はそれらを含み得る。
【0083】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）ポリペプチド（アミノ酸の天然に存在する、非天然の、又は修飾ポリマー）をコードする任意のポリヌクレオチドを指し、インビトロ、インビボ、インサイチュ、又はエクスビボで、翻訳して、コードされたポリペプチドを産生し得る。当業者は、別途明記されない限り、本出願に記載のポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列の「Ｔ」を列挙するが、配列がＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を表す場合、「Ｔ」は「Ｕ」に置き換えられることを理解するであろう。したがって、特定の配列特定番号によって特定されるＤＮＡによってコードされるＲＮＡポリヌクレオチドのいずれも、ＤＮＡによってコードされる対応するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列もまた含み得、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」は、「Ｕ」で置換される。
【0084】
ｍＲＮＡ分子の基本構成要素は、典型的には、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡテールを含む。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、それらの機能的及び／又は構造的設計特徴において野生型ｍＲＮＡと区別され得る。
【0085】
ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも２つのポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、又は９～１０個のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１００又は少なくとも２００個のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、１～１０、５～１５、１０～２０、１５～２５、２０～３０、２５～３５、３０～４０、３５～４５、４０～５０、１～５０、１～１００、２～５０、又は２～１００個のポリペプチドをコードする。
【0086】
ある特定の実施形態では、少なくとも２つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドによって互いに分離される。ピコルナウイルスで最初に発見された自己切断ペプチドは、１９～２２アミノ酸長のペプチドであり、通常、ピコルナウイルスファミリーのいくつかのメンバーにおける２つのタンパク質間に見出される。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、１つ以上の２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドは、Ｆ２Ａペプチド（口蹄疫ウイルス２Ａペプチド）、Ｅ２Ａペプチド（ウマ鼻炎ウイルス２Ａペプチド）、Ｐ２Ａペプチド（ブタテスコウイルス１ ２Ａペプチド）、及びＴ２Ａペプチド（トセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ）から選択される。
【0087】
本開示のポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、コドン最適化される。コドン最適化の方法は、当技術分野で既知であり、本明細書で提供されるように使用され得る。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、適切な折り畳みを確実にするために、標的生物及び宿主生物のコドン頻度を一致させるか、ｍＲＮＡの安定性を高めるか、若しくは二次構造を低減させるために、ＧＣ含有量を偏らせるか、遺伝子構築若しくは発現を損なう可能性のあるタンデム反復コドン又は塩基ランを最小限に抑えるか、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズするか、タンパク質輸送配列を挿入又は除去するか、コードされたタンパク質（例えば、グリコシル化部位）の翻訳後修飾部位を除去又は追加するか、タンパク質ドメインを追加、除去、又はシャッフルするか、制限部位を挿入又は削除するか、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修正するか、タンパク質の様々なドメインを適切に折り畳ませるために翻訳速度を調整するか、又はポリヌクレオチド内の問題の二次構造を低減又は排除するために使用され得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当技術分野で既知であり、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのサービス、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ Ｃａｌｉｆ．）、及び／又は独自の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
【0088】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２００～３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、又は２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。
【0089】
「５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）」は、ポリペプチドをコードしない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されたｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（すなわち、５’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
【0090】
「３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）」は、ポリペプチドをコードしない終止コドン（すなわち、翻訳の終結を示すｍＲＮＡ転写産物のコドン）からすぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
【0091】
植物ウイルスに由来する３’キャップ非依存性翻訳エンハンサー及び／又は内部リボソーム進入部位を含むＵＴＲが提供される。５’末端のエキソヌクレアーゼ遮断構造、及び３’末端のウイルス由来の二次構造も提供される。ＵＴＲ要素は、キャッピングの費用を回避し、翻訳効率を高め、ＲＮＡ安定性を増強させる。
【0092】
ＵＴＲは、キャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）を含み得る。植物細胞における非キャップｍＲＮＡに効率的な翻訳を付与する、植物ウイルス３’ＵＴＲの５’領域における多数の小さい（約１００～１５０ｎｔ）ウイルス由来のＣＩＴＥが特徴付けられている。
【0093】
ある特定の実施形態では、ＣＩＴＥは、パニクムモザイクウイルス様ＣＩＴＥ（ＰＴＥ）である。薄いスズメノヒエ無症候性ウイルス（ＴＰＡＶ）ゲノムにおけるパニクムモザイクウイルス様３’ＣＩＴＥは、哺乳動物細胞における非キャップｍＲＮＡの非常に効率的な翻訳を促進する。ＰＴＥは、植物と動物との間で３Ｄ構造が十分に保存されている翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合することによって機能する。ＰＴＥは、ｅＩＦ４Ｅに強く結合する（Ｋｄ＜１００ｎＭ）ｍ７Ｇを欠く唯一の既知のＲＮＡ構造であるため、これは新規である。ｅＩＦ４Ｅは、ｅＩＦ４Ｆとして知られるｅＩＦ４Ｅ／ｅＩＦ４Ｇ／ｅＩＦ４Ａヘテロ三量体の一部分であり、ｅＩＦ４Ｆは、ｍＲＮＡの５’キャップにリボソームを動員するための鍵である。（ｅＩＦ４Ｅを介した）ｅＩＦ４Ｆへの結合に加えて、ＰＴＥ塩基は、おそらくｅＩＦ４Ｆがリボソームを５’末端に動員することを可能にするために、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに対合する。これは、ｍＲＮＡを環化し、細胞ｍＲＮＡ上の５’キャップ－ｅＩＦ４Ｆ－ＰＡＢＰ－ポリ（Ａ）テール相互作用の構造と同様の構造を形成する。したがって、５’キャップの必要性を排除することに加えて、ＰＴＥ媒介性翻訳は、ポリ（Ａ）テールを必要としない。代わりに、ＰＴＥ（又は任意のタイプの３’ＣＩＴＥ）を保有するウイルスは、３’から５への’エキソヌクレアーゼ活性を遮断するために、ＣＩＴＥの下流のウイルス構造に依存する。
【0094】
ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、天然のＴＰＡＶ５’及び３’末端を含む。この構築物は、哺乳動物細胞における実質的な発現を提供し、ウイルスは、細胞に進入すると、そのキャップのない非ポリアデニル化ＲＮＡゲノムの急速な分解を防ぐために、天然の安定性要素を有する必要がある。３’ＣＩＴＥの下流の３’末端では、ＴＰＡＶファミリー（トンブスウイルス科）の全てのウイルスは、膨らんだステムループを有し、膨らんだ塩基は末端ＧＣＣＣと対合し、これらの塩基は３つの同軸に積み重ねられたヘリックスの中央に埋められ、エキソヌクレアーゼから３’末端を隠す可能性が高い。
【0095】
ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、トンブスウイルス科のウイルスに由来する。トンブスウイルス科の好適なウイルスの例としては、フクジュソウモザイクウイルス、アンゲロニア花割れウイルス、リンゴルテオウイルス１、リンゴ関連ルテオウイルス、アーティチョーク斑紋クリンクルウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、インゲンマメ葉巻ウイルス、ビートブラックスコーチウイルス（Ｂｅｅｔ ｂｌａｃｋ ｓｃｏｒｃｈ ｖｉｒｕｓ）、カリブラコア斑紋ウイルス、カルダミン退緑斑紋ウイルス、カーネーションイタリアン輪紋ウイルス、カーネーション斑紋ウイルス、カーネーション輪紋ウイルス、ニンジン斑紋模倣ウイルス、ニンジン斑紋ウイルス、チェリー関連ルテオウイルス、クレマチス退緑斑紋ウイルス、カモガヤ微斑モザイクウイルス、ササゲ斑紋ウイルス、キュウリブルガリア潜在ウイルス、キュウリ葉斑点ウイルス、キュウリ壊疽ウイルス、シンビジウム輪紋ウイルス、ナス斑紋クリンクルウイルス、エルダーベリーアウレウスウイルス１、エルダーベリー潜在ウイルス、エチオピアタバコブッシートップウイルス、フルクラエア壊疽条斑ウイルス、ガリンソガモザイクウイルス（Ｇａｌｉｎｓｏｇａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ブドウアルジェリア潜在ウイルス、アメリカホドイモロゼットウイルス（Ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ ｒｏｓｅｔｔｅ ｖｉｒｕｓ）、ハベル川ウイルス、ハイビスカス退緑輪紋ウイルス、スイカズラ輪紋ウイルス、イクセリジウム黄色斑紋ウイルス２（Ｉｘｅｒｉｄｉｕｍ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ２）、ハナショウブ壊疽輪点ウイルス、ジャスミンウイルスＨ、ジョンソングラス退緑条斑モザイクウイルス、リーキ白色条斑ウイルス、リモニウム奇形花ウイルス、トウモロコシ退緑斑紋ウイルス、トウモロコシ壊疽条斑ウイルス、トウモロコシ白線モザイクウイルス、メロン壊疽斑点ウイルス、トウガラシモロッコウイルス、ネッカー川ウイルス、ネクタリンステムピッティング関連ウイルス、ヌーツカルパン葉脈透化ウイルス、エンバク退緑矮化ウイルス、オリーブ潜在ウイルス１、オリーブ微斑モザイクウイルス、ケシモザイクウイルス、パニクムモザイクウイルス、オミナエシ微斑ウイルス、エンドウひだ葉モザイクウイルス２、エンドウ茎壊疽ウイルス、テンジクアオイ退緑リングパターンウイルス（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｒｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ ｖｉｒｕｓ）、ペラルゴニウムフラワーブレイクウイルス、テンジクアオイ葉巻ウイルス、テンジクアオイラインパターンウイルス（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｌｉｎｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｖｉｒｕｓ）、テンジクアオイ壊疽斑点ウイルス、テンジクアオイ輪紋ウイルス、ペチュニアアステロイドモザイクウイルス、ジャガイモ壊疽ウイルス、ポトス潜在ウイルス、レッドクローバー壊疽モザイクウイルス、ハマナス葉変形ウイルス、ローズスプリング萎縮関連ウイルス、サワロウイルス、シクテウォーターボーンウイルス（Ｓｉｔｋｅ ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ ｖｉｒｕｓ）、ダイズ萎縮ウイルス、ダイズ黄色斑紋モザイクウイルス、スイートクローバー壊疽モザイクウイルス、薄いスズメノヒエ無症候性ウイルス、タバコブッシートップウイルス、タバコ斑紋ウイルス、タバコ壊疽ウイルスＡ、タバコ壊疽ウイルスＤ、トマトブッシースタントウイルス、Ｔｒａｌｅｓｐｅｖｉｒｕｓ ｇｏｍｐｈｏｌｏｂｉｉ、Ｔｒａｌｅｓｐｅｖｉｒｕｓ ｌｅｓｐｅｄｅｚａｅ、カブクリンクルウイルス、及びヤム球形ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ＵＴＲは、ＩＲＥＳを含み得る。ある特定の実施形態では、ＩＲＥＳは、遺伝子間領域内部リボソーム進入部位（ＩＧＲ ＩＲＥＳ）である。これらの比較的コンパクトな（≦２００ｎｔ）構造は、無脊椎動物に感染するジシストロウイルス（ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）のゲノムにおける第２のＯＲＦの翻訳の極めて効率的な内部開始を可能にする。それらは、ピコルナ及びヘパシウイルスのＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型ＩＲＥＳの５００ｎｔ超のＩＲＥＳよりもはるかに小さく、キャップされたｍＲＮＡ上の５’ＵＴＲでのみ生じ、通常は特定の細胞周期段階又はストレス条件下でのみ機能する宿主「ＩＲＥＳ」よりも強い可能性が高い。ＩＧＲ ＩＲＥＳのＸ線結晶構造により、構造の３’部分が、ｍＲＮＡ中のコドンに対合したｔＲＮＡ塩基のアンチコドンステムループを模倣することが明らかとなる。これにより、ＩＧＲ ＩＲＥＳは、８０Ｓリボソームを「即時伸長」に「だまし」、下流のＲＮＡ配列を翻訳することができ、すなわち、この翻訳は、開始因子及び開始コドンを必要としない。これは、リボソームの事前開始複合体の形成を遮断するＰＫＲなどの宿主の先天性免疫機構が、ＩＧＲ ＩＲＥＳ媒介性翻訳に影響を及ぼさないという点で重要な利点を提供する。
【0096】
本開示に従って使用され得るＩＧＲ ＩＲＥＳ配列の例としては、コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、アブラムシ致死性麻痺ウイルス、ムギクビレアブラムシウイルス（ＲｈＰＶ）、及び他のジシストロウイルス由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0097】
ＵＴＲは、ＲＮＡポリヌクレオチドをエキソヌクレオチド分解から更に保護する要素を含み得る。
【0098】
ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、多くの植物ウイルスゲノムの３’末端に存在するｔＲＮＡ様構造（ＴＬＳ）を含む。これらの多機能性疑似ノット構造は、非鋳型化された方法でプレｔＲＮＡの３’末端にＣＣＡを付加する宿主ＣＴＰ：ＡＴＰヌクレオチジルトランスフェラーゼと相互作用し、したがって、無傷の３’末端を確実にするためのテロメラーゼとして機能する。宿主ｔＲＮＡ合成酵素は、ｔＲＮＡ上で行う場合と同様に３’末端をアミノアシル化し、エキソヌクレアーゼを更に遮断する。ＴＬＳは、翻訳を増強することも知られている。
【0099】
ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、フラビウイルス（例えば、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス）の３’末端に存在する安定したステムループ構造を含む。
【0100】
ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、ｘｒＲＮＡ配列を含む。これらの短い（５０～７０ｎｔ）が、複雑なＲＮＡ構造は、脱キャップ後のｍＲＮＡのターンオーバーのための一次ヌクレアーゼである宿主エキソヌクレアーゼＸｒｎ Ｉを遮断及び隔離するように進化している。Ｘｒｎ Ｉはまた、それが立ち往生するｘｒＲＮＡ構造に到達するまで、ある特定のＲＮＡウイルスゲノムを５’から３’方向に分解し、ゲノムの３’部分（通常は３’ＵＴＲ）を無傷のままにする。ｘｒＲＮＡは、フラビウイルスの３’ＵＴＲに存在し、様々なプロウイルス調節及び免疫抑制機能を果たす非コードの短いフラビウイルスＲＮＡ（ｓｆＲＮＡ）を生成する。
【0101】
好適なフラビウイルスの例としては、アポイウイルス、アロアウイルス（Ａｒｏａ ｖｉｒｕｓ）、バガザウイルス（Ｂａｇａｚａ ｖｉｒｕｓ）、バンジウイルス、ブブイウイルス（Ｂｏｕｂｏｕｉ ｖｉｒｕｓ）、ブカラサコウモリウイルス、カシパコアウイルス（Ｃａｃｉｐａｃｏｒｅ ｖｉｒｕｓ）、キャリー島ウイルス（Ｃａｒｅｙ Ｉｓｌａｎｄ ｖｉｒｕｓ）、カウボーンリッジウイルス、ダカールコウモリウイルス、デングウイルス、エッジヒルウイルス、エンテベコウモリウイルス（Ｅｎｔｅｂｂｅ ｂａｔ ｖｉｒｕｓ）、ガジェットガリーウイルス（Ｇａｄｇｅｔｓ Ｇｕｌｌｙ ｖｉｒｕｓ）、イルヘウスウイルス、イスラエル七面鳥髄膜脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス群、ジュグラウイルス（Ｊｕｇｒａ ｖｉｒｕｓ）、ジュティアパウイルス（Ｊｕｔｉａｐａ ｖｉｒｕｓ）、カダムウイルス（Ｋａｄａｍ ｖｉｒｕｓ）、ケドゥグウイルス（Ｋｅｄｏｕｇｏｕ ｖｉｒｕｓ）、ココベラウイルス、クタンゴウイルス（Ｋｏｕｔａｎｇｏ ｖｉｒｕｓ）、キャサヌール森林病ウイルス、ランガットウイルス、ルーピングイルウイルス、ミーバンウイルス（Ｍｅａｂａｎ ｖｉｒｕｓ）、モドックウイルス、モドックウイルス群、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス、蚊媒介性ウイルス（ｍｏｓｑｕｉｔｏ－ｂｏｒｎｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）、マレーバレー脳炎ウイルス、ウンタヤウイルス、ウンタヤウイルス群、オムスク出血熱ウイルス、プノンペンコウモリウイルス、ポワッサンウイルス、リオブラボーウイルス、リオブラボーウイルス群、ロイヤルファームウイルス（Ｒｏｙａｌ Ｆａｒｍ ｖｉｒｕｓ）、サボヤウイルス（Ｓａｂｏｙａ ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス、サルビエハウイルス（Ｓａｌ Ｖｉｅｊａ ｖｉｒｕｓ）、サンペルリタウイルス（Ｓａｎ Ｐｅｒｌｉｔａ ｖｉｒｕｓ）、ソーマレスリーフウイルス（Ｓａｕｍａｒｅｚ Ｒｅｅｆ ｖｉｒｕｓ）、海上ダニ媒介性ウイルス群（Ｓｅａｂｏｒｎｅ ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ）、セピクウイルス（Ｓｅｐｉｋ ｖｉｒｕｓ）、テンブスウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、チュレニーウイルス（Ｔｙｕｌｅｎｉｙ ｖｉｒｕｓ）、ウガンダＳウイルス、ウスツウイルス、ヴェセルスブロンウイルス、ウエストナイルウイルス、ヤウンデウイルス、黄熱ウイルス、ヨコセウイルス（Ｙｏｋｏｓｅ ｖｉｒｕｓ）、及びジカウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【0102】
いくつかの実施形態では、ｘｒＲＮＡは、５’ＵＴＲの５’末端、ＩＲＥＳのすぐ上流、又は３’ＣＩＴＥに相補的なステムループに位置する。４０Ｓサブユニットは開始コドンへの最適な走査のために非構造化５’ＵＴＲを好むため、その構造のために、ｘｒＲＮＡは、５’末端でリボソームの進入及び走査を遮断することが可能である。これは、リボソームがＩＲＥＳで直接進入して走査しないため、ＩＧＲ ＩＲＥＳを有する構築物にとっては問題ではないが、ＣＩＴＥ媒介性翻訳は、５’末端からのリボソーム走査を必要とする。ウイルスタンパク質をコードするサブゲノムｍＲＮＡの５’ＵＴＲであると予測される部位でのｘｒＲＮＡ構造は既知であり、それらのｘｒＲＮＡは、翻訳のためのリボソームの進入を遮断しないことが予想される。植物及び動物ウイルスのｘｒＲＮＡ構造の類似性、並びに酵母Ｘｒｎ Ｉが植物及び動物ウイルスｘｒＲＮＡによって遮断されるという事実を考慮すると、ｘｒＲＮＡは、任意の分野の生物において機能すると予測される。
【0103】
ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【0104】
本開示のＲＮＡポリヌクレオチドは、５’キャップを含み得る。ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、非キャップである（すなわち、５’キャップを含有しない）。ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核輸出に関与し、ｍＲＮＡの安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、成熟した環状ｍＲＮＡ種を形成するために、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して、細胞内のｍＲＮＡの安定性及び翻訳能力を担う。キャップは更に、ｍＲＮＡスプライシング中の５’近位イントロンの除去を補助する。
【0105】
内因性ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡの末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’ｐｐｐ－５’三リン酸結合を生成する５’末端キャップされていてもよい。したがって、この５’－グアニレートキャップをメチル化して、Ｎ７－メチル－グアニレート残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／又は前末端転写ヌクレオチドのリボース糖はまた、任意選択で、２’－Ｏ－メチル化され得る。グアニレートキャップ構造の加水分解及び切断を介した５’脱キャップは、分解のためにｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的にし得る。
【0106】
５’キャップ構造は、国際特許公開第２００８／０１６４７３号及び同第２０１１／０１５３４７号に記載されているものを含み、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0107】
本開示のＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリＡテールを含み得る。ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ポリアデニル化である（すなわち、ポリＡテールを含まない）。ＲＮＡ処理中、アデノシンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）は、通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に付加され、分子の安定性を増加させる。転写の直後に、転写産物の３’末端を切断して３’ヒドロキシルを遊離させる。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデノシンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と称されるプロセスは、１００～２５０残基の長さのポリＡテールを付加する。
【0108】
本開示のＲＮＡポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを含み得る。ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを含まない。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリン又はピリミジン）又はその誘導体（「核酸塩基」とも称される）と組み合わせて、糖分子（例えば、ペントース又はリボース）又はその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を有するヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、例えば、化学的、酵素的、又は組換え的などの任意の有用な方法によって合成され、１つ以上の修飾又は非天然ヌクレオシドを含み得る。
【0109】
ポリペプチド
ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オーソログ、パラログ、断片、並びに前述の他の等価物、バリアント、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であってもよく、又は二量体、三量体若しくは四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、抗体などの単鎖ポリペプチド又は多本鎖ポリペプチドを含み得、互いに会合又は連結され得る。最も一般的には、ジスルフィド結合は、多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語はまた、少なくとも１つのアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オーソログ、パラログ、断片、並びに前述の他の等価物、バリアント、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であってもよく、又は二量体、三量体若しくは四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、抗体などの単鎖ポリペプチド又は多本鎖ポリペプチドを含み得、互いに会合又は連結され得る。最も一般的には、ジスルフィド結合は、多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語はまた、少なくとも１つのアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
【0110】
「ポリペプチドバリアント」は、天然配列又は参照配列に対してそのアミノ酸配列が異なる分子である。アミノ酸配列バリアントは、天然配列又は参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置で、置換、欠失、挿入、又は前述の任意の２つ若しくは３つの組み合わせを有し得る。通常、バリアントは、天然配列又は参照配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、天然配列又は参照配列と少なくとも８０％の同一性又は少なくとも９０％の同一性を共有する。
【0111】
「オーソログ」は、種形成によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を指す。通常、オーソログは進化の過程で同じ機能を保持する。オーソログの特定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測にとって重要である。
【0112】
「類似体」は、１つ以上のアミノ酸変化、例えば、親ポリペプチド又は開始ポリペプチドの特性のうちの１つ以上を依然として維持する、アミノ酸残基の置換、付加、又は欠失によって異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
【0113】
本開示は、バリアント及び誘導体を含む、ポリヌクレオチド又はポリペプチドベースのいくつかのタイプの組成物を提供する。これらには、例えば、置換、挿入、欠失、及び共有結合のバリアント及び誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は、「バリアント」という用語と同義であり、概して、参照分子又は出発分子に対して任意の方法で修飾及び／又は変更された分子を指す。
【0114】
したがって、参照配列、特に本明細書に開示のポリペプチド配列に関する置換、挿入、及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含有するペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグ又は１つ以上のリジンなどのアミノ酸が、ペプチド配列（例えば、Ｎ末端又はＣ末端）に付加され得る。配列タグは、ペプチド検出、精製、又は局在化のために使用され得る。リジンは、ペプチド溶解度を増加させるため、又はビオチン化を可能にするために使用され得る。代替的に、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ酸末端領域に位置するアミノ酸残基は、任意選択で、欠失され、切断された配列を提供し得る。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基又はＮ末端残基）は、代替的に、例えば、可溶性であるか、又は固体支持体に連結されたより大きな配列の一部分としての配列の発現など、配列の使用に応じて欠失され得る。
【0115】
「置換バリアント」は、ポリペプチドを指す場合、天然又は開始配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なるアミノ酸が同じ位置のその場所に挿入されているものである。置換は、分子において１つのアミノ酸のみが置換されている単一であってもよく、２つ以上（例えば、３、４、又は５個）のアミノ酸が同じ分子において置換されている複数であってもよい。
【0116】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸を、同様のサイズ、電荷、又は極性の異なるアミノ酸で置換することを指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基を別の非極性残基に置換することが挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、及びグリシンとセリンとの間など、一方の極性（親水性）残基を別方の極性（親水性）残基に置換することが挙げられる。加えて、リジン、アルギニン、又はヒスチジンなどの塩基性残基を別のものに置換すること、又はアスパラギン酸又はグルタミン酸などの一方の酸性残基を別方の酸性残基に置換することは、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例としては、システイン、グルタミン、グルタミン酸若しくはリジンなどの極性（親水性）残基に対するイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の置換、及び／又は非極性残基に対する極性残基の置換が挙げられる。
【0117】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す場合の「特徴」は、それぞれ、分子の異なるアミノ酸配列ベース又はヌクレオチドベースの構成要素として定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面兆候、局所配座形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、及びそれらの任意の組み合わせ（複数可）を含む。
【0118】
ポリペプチドを指す場合に本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、１つ以上の特定可能な構造的又は機能的特徴又は特性（例えば、結合能力、タンパク質－タンパク質相互作用のための部位として機能する）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【0119】
ポリペプチドを指す場合に本明細書で使用される場合、「部位」という用語は、アミノ酸ベースの実施形態に関するものとして、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。ポリヌクレオチドを指す場合に本明細書で使用される場合、「部位」という用語は、ヌクレオチドベースの実施形態に関するものとして、「ヌクレオチド」と同義的に使用される。部位は、ポリペプチドベース又はポリヌクレオチドベースの分子内で修飾、操作、変更、誘導体化又は変化され得るペプチド若しくはポリペプチド又はポリヌクレオチド内の位置を表す。
【0120】
本明細書で使用される場合、「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」又は「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す場合、それぞれ、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの末端を指す。そのような末端は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの最初又は最後の部位のみに限定されず、末端領域に追加のアミノ酸又はヌクレオチドを含んでもよい。ポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端される）及びＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸によって終端される）の両方を有するものとして特徴付けられ得る。タンパク質は、いくつかの場合では、ジスルフィド結合又は非共有結合力によってまとめられた複数のポリペプチド鎖で構成される（多量体、オリゴマー）。これらのタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有する。代替的に、ポリペプチドの末端は、場合によっては、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドベースの部分で開始又は終了するように修飾され得る。
【0121】
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質も、目的のポリペプチドの範囲内であると考えられる。例えば、本明細書で提供されるのは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸、又は１００アミノ酸超の長さを有する参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列よりも短いが、そうでなければ同一である少なくとも１つのアミノ酸残基を意味する）である。別の例では、本明細書に記載の配列のうちのいずれかと４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である２０、３０、４０、５０、又は１００個の（連続した）アミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を、本開示に従って利用し得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で提供される、又は本明細書で参照される配列のうちのいずれかに示される２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の変異を含む。別の例では、本明細書に記載の配列のうちのいずれかと８０％超、９０％、９５％、又は１００％同一である２０、３０、４０、５０、又は１００アミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質であって、タンパク質が、本明細書に記載の配列のうちのいずれかと８０％未満、７５％、７０％、６５％～６０％同一である５、１０、１５、２０、２５、又は３０アミノ酸のストレッチを有するタンパク質を、本開示に従って利用し得る。
【0122】
本開示のポリペプチド又はポリヌクレオチド分子は、ある特定の程度の配列類似性又は同一性を、参照分子（例えば、参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチド）、例えば、当技術分野で説明される分子（例えば、操作又は設計された分子又は野生型分子）と共有し得る。当技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列間の関係を指す。当技術分野で、同一性はまた、２つ以上のアミノ酸残基又は核酸残基のストリング間の一致の数によって決定される、２つの配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性は、特定の数学モデル又はコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって対処されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上のより小さな配列の間の同一一致のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列に適用される「同一性％」は、配列をアラインメントさせ、必要に応じてギャップを導入して最大同一性パーセントを達成した後、第２の配列のアミノ酸配列又は核酸配列における残基と同一である、候補アミノ酸又は核酸配列における残基（アミノ酸残基又は核酸残基）のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されたギャップ及びペナルティにより値が異なる場合がある。概して、特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載され、当業者に既知の配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される、その特定の参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアラインメントのためのツールとしては、ＢＬＡＳＴスイートのツールが挙げられる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）．”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。別の一般的な局所アラインメント技術は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づく（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアラインメント技術は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）。最近では、その称するところではＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアラインメント方法よりも速くヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアラインメントを生成するとされる高速最適グローバル配列アラインメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）が開発された。他のツールは、本明細書に、具体的に、以下の「同一性」の定義に記載される。
【0123】
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間、及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一致する残基のアラインメントによって決定される類似性又は同一性の閾値レベルを共有するポリマー分子（例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）及び／又はポリペプチド分子）は、相同と称される。相同性は、分子間の関係を説明する定性的用語であり、定量的類似性又は同一性に基づき得る。類似性又は同一性は、２つの比較された配列間の配列一致の程度を定義する定量的用語である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一又は類似である場合、お互いに対して「相同」であるとみなす。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列）間の比較を指す。２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも２０個のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は更には９９％である場合、相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の一意に指定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４～５個の一意に指定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。少なくとも２０個のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチに対して、タンパク質が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％同一である場合、２つのタンパク質配列は相同であるとみなされる。
【0124】
相同性は、比較された配列が共通の起源からの進化において分岐したことを意味する。「相同体」という用語は、共通の祖先配列からの子孫による第２のアミノ酸配列又は核酸配列に関連する第１のアミノ酸配列又は核酸配列（例えば、遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質配列）を指す。「相同体」という用語は、種形成の事象によって分離された遺伝子及び／若しくはタンパク質間の関係、又は遺伝子複製の事象によって分離された遺伝子及び／若しくはタンパク質間の関係に適用され得る。「オーソログ」は、種形成によって共通の祖先遺伝子（又はタンパク質）から進化した異なる種の遺伝子（又はタンパク質）である。典型的には、オーソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラログ」は、ゲノム内の複製によって関連付けられる遺伝子（又はタンパク質）である。オーソログは進化の過程で同じ機能を保持するが、パラログは元の機能と関連していても新しい機能を進化させる。
【0125】
「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間、及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリ核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列をアラインメントさせることによって実施され得る（例えば、最適なアラインメントのために第１の核酸配列及び第２の核酸配列の一方又は両方にギャップが導入され得、比較目的のために非対応配列が無視され得る）。ある特定の実施形態では、比較目的のためにアラインメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置で、ヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められている場合、したがって、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に記載の方法などの方法を使用して決定され得、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）のアルゴリズムを使用して決定され得る。代替的に、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して決定され得る。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法としてはＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されず、これは、参照により本明細書に組み込まれる。同一性を決定するための技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに体系化される。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。
【0126】
ポリペプチドは、抗原ポリペプチドであり得る。ある特定の実施形態では、抗原ポリペプチドは、ウイルス又は細菌抗原である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、脳炎ウイルス、パピローマウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルスＢ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎、ロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルス、バンナウイルス、ヒトエンテロウイルス、ハンタウイルス、ウエストナイルウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、日本脳炎ウイルス、豚水疱疹ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｅｘａｎｔｈｅｒｎａｖｉｒｕｓ）、及び東部ウマ脳炎の株である。
【0127】
ある特定の実施形態では、ウイルスは、インフルエンザＡ若しくはインフルエンザＢの株、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、インフルエンザＡ又はインフルエンザＢの株は、トリ、ブタ、ウマ、イヌ、ヒト、又は非ヒト霊長類に関連する。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、血球凝集素タンパク質又はその断片をコードする。いくつかの実施形態では、血球凝集素タンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、又はそれらの断片である。
【0128】
いくつかの実施形態では、組成物は、インフルエンザウイルスから得られる、ＨＡタンパク質又はその免疫原性断片（例えば、Ｈ１～Ｈ１８のうちの少なくとも１つ）、ＮＰタンパク質又はその免疫原性断片、ＮＡタンパク質又はその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質又はその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質又はその免疫原性断片、ＮＳ１タンパク質又はその免疫原性断片、及びＮＳ２タンパク質又はその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
【0129】
本開示は、各々が単一の抗原ポリペプチドをコードする複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物、及び２つ以上の抗原ポリペプチドをコードする単一のＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物（例えば、融合ポリペプチドとして）を包含する。したがって、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、第２の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、を含む組成物は、（ａ）第１の抗原ポリペプチドをコードする第１のＲＮＡポリヌクレオチドと、第２の抗原ポリペプチドをコードする第２のＲＮＡポリヌクレオチドと、を含む組成物、並びに（ｂ）第１及び第２の抗原ポリペプチドをコードする単一のＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物（例えば、融合ポリペプチドとして）を包含する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、各々は、異なる抗原ポリペプチドをコードする、オープンリーディングフレームを有する２～１０個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）以上のＲＮＡポリヌクレオチド（又は２～１０個以上の異なる抗原ポリペプチドをコードする単一のＲＮＡポリヌクレオチド）を含む。
【0130】
単一のＲＮＡポリヌクレオチドは、２つのポリペプチドをコードし得る。ある特定の実施形態では、２つのポリペプチドは、抗体の軽鎖及び重鎖を含む。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷の抗体及び抗体断片の両方を包含する。典型的には、無傷の「抗体」は、特定の抗原に特異的に結合する免疫グロブリンである。抗体は、ヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＤのうちのいずれかを含む、任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る。典型的には、無傷の抗体は、四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を画定する。「可変軽鎖」（ＶＬ）及び「可変重鎖」（ＶＨ）という用語は、それぞれ、軽鎖及び重鎖上のこれらの対応する領域を指す。各可変領域は、超可変（ＨＶ）及びフレームワーク（ＦＲ）領域に更に細分化され得る。超可変領域は、相補性決定領域と称される超可変性配列の３つの領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含み、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ２、及びＦＲ４）によって分離され、フレームワーク領域は、ベータシート構造を形成し、ＨＶ領域を所定の位置に保持するための足場として機能する。各重鎖及び軽鎖のＣ末端は、軽鎖のための１つのドメイン（ＣＬ）及び重鎖のための３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）からなる定常領域を画定する。免疫グロブリンの軽鎖は、アイソタイプカッパ及びラムダに更に分類され得る。
【0131】
いくつかの実施形態では、「無傷の抗体」又は「完全に組み立てられた抗体」という用語は、天然に産生された抗体で生じるように、任意選択でジスルフィド結合によって会合される、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含有する抗体を参照して使用される。いくつかの実施形態では、本開示による抗体は、抗体断片である。
【0132】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域などの、無傷の抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、トリアボディ、テトラボディ、線状抗体；単鎖抗体分子、並びに抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。例えば、抗体断片は、単離断片、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、並びに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。多くの実施形態では、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含有し、いくつかの実施形態では、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、かつ／又は抗原への結合に対して親抗体と競合する。抗体の抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0133】
当技術分野で既知の任意の抗体を使用することができ、標準的な方法を使用して所望の抗原に対して抗体を産生することができる。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体混合物若しくはカクテル、ヒト若しくはヒト化抗体、キメラ抗体、又は二重特異性抗体であり得る。
【0134】
例示的な抗体としては、抗ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、抗リシルオキシダーゼ様２（ＬＯＸＬ２）、抗Ｆｌｔ－１、抗ＴＮＦ－α、抗インターロイキン－２Ｒα受容体（ＣＤ２５）、抗ＴＧＦβ、抗Ｂ細胞活性化因子、抗アルファ－４インテグリン、抗ＢＡＧＥ、抗β－カテニン／ｍ、抗Ｂｃｒ－ａｂｌ、抗Ｃ５、抗ＣＡ１２５、抗ＣＡＭＥＬ、抗ＣＡＰ－１、抗ＣＡＳＰ－８、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２５、抗ＣＤＣ２７／ｍ、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ８０、抗ＣＤＫ４／ｍ、抗ＣＥＡ、抗ＣＴ、抗ＣＴＬ４、抗Ｃｙｐ－Ｂ、抗ＤＡＭ、抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥＬＦ２Ｍ、抗ＥＭＭＰＲＩＮ、抗ＥｐＣａｍ、抗ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、抗ＨＥＲ２、抗Ｇ２５０、抗ＧＡＧＥ、抗ＧｎＴ－Ｖ、抗Ｇｐ１００、抗ＨＡＧＥ、抗ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、抗ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、抗ＩＧＦ－１Ｒ、抗ＩＬ－２Ｒ、抗ＩＬ－５、抗ＭＣ１Ｒ、抗ミオシン／ｍ、抗ＭＵＣ１、抗ＭＵＭ－１、抗ＭＵＭ－２、抗ＭＵＭ－３、抗プロテイナーゼ－３、抗ｐ１９０マイナーｂｃｒ－ａｂｌ、抗Ｐｍｌ／ＲＡＲα、抗ＰＲＡＭＳ、抗ＰＳＡ、抗ＰＳＭ、抗ＰＳＭＡ、抗ＲＡＧＥ、抗ＲＡＮＫＬ、抗ＲＵ１又はＲＵ２、抗ＳＡＧＥ、抗ＳＡＲＴ－１又はＳＡＲＴ－３、抗サバイビン、抗ＴＥＬ／ＡＭＬ１、抗ＴＰＩ／ｍ、抗ＴＲＰ－１、抗ＴＲＰ－２、抗ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、及び抗ＶＥＧＦ又は抗ＶＥＧＦ受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0135】
治療用及び予防用組成物
本明細書では、ヒト及び他の動物における感染性疾患の予防、治療、又は診断のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬が提供される。組成物は、治療剤又は予防剤として使用され得る。それらは、感染性疾患を予防及び／又は治療するために医薬において使用され得る。
本明細書では、ヒト及び他の動物における感染性疾患の予防、治療、又は診断のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬が提供される。組成物は、治療剤又は予防剤として使用され得る。それらは、感染性疾患を予防及び／又は治療するために医薬において使用され得る。
【0136】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチドを含有する組成物は、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）に投与され得、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されて、抗原ポリペプチドを産生する。
【0137】
組成物は、細胞、組織、又は生物におけるポリペプチド（例えば、抗原又は免疫原）の翻訳のために誘導され得る。いくつかの実施形態では、そのような翻訳は、インビボで生じるが、そのような翻訳は、エクスビボで、培養で、又はインビトロで生じてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織、又は生物は、抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つの翻訳可能領域を有するＲＮＡポリヌクレオチドを含有する有効量の組成物と接触する。
【0138】
「有効量」の組成物は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチド及び他の構成要素の物理的特徴、及び他の決定基に基づいて提供される。概して、有効量の組成物は、細胞における抗原産生の機能として、免疫応答の誘導又は増強を提供する。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクションの増加（ＲＮＡでトランスフェクションされた細胞の割合）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増加によって実証されるように）、又は宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。
【0139】
いくつかの実施形態では、本開示による組成物（ポリヌクレオチドそれらのコードされたポリペプチドを含む）は、感染性疾患の治療に使用され得る。
【0140】
組成物は、予防的又は治療的に、活性免疫スキームの一部分として、健康な個体に、又はインキュベーション段階中若しくは症状の発病後の活性感染中の感染の早期に投与され得る。いくつかの実施形態では、細胞、組織、又は対象に提供される本開示の組成物の量は、免疫予防に有効な量であり得る。
【0141】
組成物は、他の予防用又は治療用化合物とともに投与され得る。非限定的な例として、予防用又は治療用化合物は、アジュバント又はブースターであり得る。本明細書で使用される場合、ワクチンなどの予防用組成物を指す場合、「ブースター」という用語は、予防用（ワクチン）組成物の追加投与を指す。ブースター（又はブースターワクチン）は、予防用組成物の早期投与後に投与され得る。予防用組成物の初回投与とブースターとの間の投与の時間は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、１８か月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、又は９９年超であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、予防用組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、又は１年であり得るが、これらに限定されない。
【0142】
いくつかの実施形態では、組成物は、筋肉内、皮膚内、又は鼻腔内投与され得る
【0143】
組成物は、感染の有病率又は満たされていない医療ニーズの程度若しくはレベルに応じて、様々な状況で利用され得る。非限定的な例として、組成物は、様々な感染性疾患を治療及び／又は予防するために利用され得る。
【0144】
任意選択で、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた医薬組成物が本明細書で提供される。
【0145】
組成物は、単独で、又は１つ以上の他の構成要素と併せて、製剤化又は投与され得る。例えば、組成物（例えば、ワクチン組成物）は、アジュバントを含むがこれらに限定されない他の構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない（それらはアジュバントフリーである）。
【0146】
組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化又は投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、治療活性物質、予防活性物質、又は両方の組み合わせなどの少なくとも１つの追加の活性物質を含む。組成物は、滅菌、パイロジェンフリー、又は滅菌及びパイロジェンフリーの両方であり得る。ワクチン組成物などの薬学的薬剤の製剤及び／又は製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において見出され得る。
【0147】
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、又は対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という用語は、概して、ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を指す。
【0148】
本明細書に記載の組成物の製剤は、薬理学の分野で既知の、又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。概して、そのような調製方法は、活性成分（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）を、賦形剤及び／又は１つ以上の他の副成分と会合させるステップと、次いで、必要に応じて及び／又は望ましい場合、産物を所望の単回若しくは複数回用量単位に分割、成形、及び／又は包装するステップと、を含む。
【0149】
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／又は任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の独自性、大きさ、及び／又は状態に応じて、更には組成物が投与される経路に応じて変動するであろう。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【0150】
組成物は、１つ以上の賦形剤を使用して、安定性を増加させ、細胞トランスフェクションを増加させ、持続若しくは遅延放出（例えば、デポ製剤から）を可能にし、生体内分布（例えば、特定の組織又は細胞型を標的とする）を変化させ、インビボでコードされたタンパク質の翻訳を増加させ、及び／又はインビボでコードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルを変化させるように製剤化され得る。従来の賦形剤は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散剤又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、及び保存剤を含む。
【0151】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象における感染（例えば、ウイルス感染）を予防する方法として使用され得、方法は、当該対象に、本明細書で提供される少なくとも１つの組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象における感染（例えば、ウイルス感染）を治療する方法として使用され得、方法は、当該対象に、本明細書で提供される少なくとも１つの組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象における感染（例えば、ウイルス感染）の発生を低減させる方法として使用され得、方法は、当該対象に、本明細書で提供される少なくとも１つの組成物を投与することを含む。来る実施形態では、本開示の組成物は、感染した第１の対象から感染していない第２の対象への拡散を阻害する方法として使用され得、方法は、当該第１の対象砂当該第２の対象の少なくとも１つに、本明細書で提供される少なくとも１つの組成物を投与することを含む。
【0152】
対象における免疫応答を誘発する方法が提供される。方法は、少なくとも１つの抗原ポリペプチド又はその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む、対象に投与すること、それによって対象に免疫応答を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡポリヌクレオチドのエクソソーム媒介性送達を含み得る。
【0153】
予防有効用量は、臨床的に許容されるレベルでウイルスによる感染を予防する治療有効用量である。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、ワクチンの添付文書に記載されている用量である。
【0154】
エクソソーム組成物
ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、エクソソームによって封入され得る。「エクソソーム」、「微小胞」、及び「細胞外小胞」という用語は、本明細書では互換的に使用される。それらは、概して、３０～２００ｎｍのもの、例えば、５０～１００ｎｍのサイズの範囲にある細胞外小胞を指す。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、２０～３００ｎｍのサイズ、例えば、３０～２５０ｎｍのサイズ、例えば、５０～２００ｎｍのサイズの範囲にあり得る。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、エクソソームによって封入され得る。「エクソソーム」、「微小胞」、及び「細胞外小胞」という用語は、本明細書では互換的に使用される。それらは、概して、３０～２００ｎｍのもの、例えば、５０～１００ｎｍのサイズの範囲にある細胞外小胞を指す。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、２０～３００ｎｍのサイズ、例えば、３０～２５０ｎｍのサイズ、例えば、５０～２００ｎｍのサイズの範囲にあり得る。
【0155】
「エクソソームによって封入された」という語句、又はその文法的変形は、本明細書では、脂質二重層がＲＮＡポリヌクレオチドを取り囲むエクソソームを指すために、「エクソソーム組成物」という語句と互換的に使用される。
【0156】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＲＮＡポリヌクレオチドを細胞に送達する際の使用のためのエクソソームを提供する。本開示はまた、エクソソームを含む医薬組成物を提供する。
【0157】
エクソソームは、細胞への送達のためのＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、送達は、エクスビボで実施され得る。いくつかの実施形態では、送達は、インビボで実施され得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、注射に好適な形態である。
【0158】
ＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソームを産生する方法が提供され、方法は、ＲＮＡポリヌクレオチドを発現するポリヌクレオチド構築物で細胞を形質転換することと、細胞を増殖培地中で培養することであって、ＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソームが、細胞外の増殖培地中に放出される、培養することと、細胞を増殖培地から除去することと、増殖培地からＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソームを採取することと、を含む。ある特定の実施形態では、採取は、超遠心分離によるものである。細胞は、Ａ５４９細胞であり得る。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現し、ポリヌクレオチド構築物は、Ｔ７プロモーターを含む。
【0159】
採取され得、他の細胞を直接トランスフェクションするために使用され得るか、又はポリ無水物ナノ粒子にパッケージ化され得る、ＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソーム。
【0160】
ポリ無水物ポリマー
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、ナノ粒子中に製剤化される。従来のｍＲＮＡワクチン接種、特に最先端の臨床試験（すなわち、Ｍｏｄｅｒｎａ又はＣｕｒｅＶａｃ）におけるものは、ワクチンのｓｕｂＱ／ＩＭ注射後の細胞のリポソームトランスフェクションに基づく。次いで、ｍＲＮＡは、注射部位の近くで局所細胞をトランスフェクションするか、又は注射部位に動員された抗原提示細胞をトランスフェクションする（リポソームワクチンは、局所的ではなく肝臓で発現することが知られている）。リポソームは、許容細胞をトランスフェクションする前にＲＮＡｓｅｓから保護する必要があり、その後、タンパク質になる任意の機会を得るために細胞にエンドサイトーシスされる必要があり、エンドソームからの脱出の真の機構は知られていないが、なんらかの輸出孔であると推定される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、ナノ粒子中に製剤化される。従来のｍＲＮＡワクチン接種、特に最先端の臨床試験（すなわち、Ｍｏｄｅｒｎａ又はＣｕｒｅＶａｃ）におけるものは、ワクチンのｓｕｂＱ／ＩＭ注射後の細胞のリポソームトランスフェクションに基づく。次いで、ｍＲＮＡは、注射部位の近くで局所細胞をトランスフェクションするか、又は注射部位に動員された抗原提示細胞をトランスフェクションする（リポソームワクチンは、局所的ではなく肝臓で発現することが知られている）。リポソームは、許容細胞をトランスフェクションする前にＲＮＡｓｅｓから保護する必要があり、その後、タンパク質になる任意の機会を得るために細胞にエンドサイトーシスされる必要があり、エンドソームからの脱出の真の機構は知られていないが、なんらかの輸出孔であると推定される。
【0161】
本開示は、トランスフェクション効率を増強するか、棚上及び体内での熱分解からよりよく保護するか、又はワクチン接種後に後続の免疫プロファイルを増加させる、リポソーム媒介性ビヒクルの代替物を提供する。
【0162】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、ポリ無水物粒子中に製剤化される。
【0163】
「ポリ無水物粒子」及び「ポリ無水物ナノスフェア」という用語は、両方とも、本明細書に記載のポリ無水物ポリマーから作製された微粒子及びナノ粒子を指す。粒子のポリ無水物ポリマーは、典型的には、無水物オリゴマー（縮合プレポリマー）のランダム混合物などのコポリマーである。ポリ無水物粒子は「ＰＡ粒子」と略され得、これは微粒子又はナノ粒子であり得る。ナノ粒子は、ポリ無水物ナノスフェア（ＰＡＮＳ）とも称され得る。
【0164】
「アルキル」という基は、任意選択で不飽和であり、任意選択で本明細書に記載の官能基で置換された直鎖又は分岐炭化水素ラジカル又はジラジカルを指す。アルキル基は、１～約２０個の炭素原子を含有し得る。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、３－ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、又はデシルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、アルキルは、好ましくは、（Ｃ１－Ｃ６）アルキルである。別の実施形態では、アルキルは、好ましくは、（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである。
【0165】
アルキル基が不飽和である実施形態では、アルキルは、アルケニル基又はアルキニル基である。アルケニルは、例えば、ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、又は５－ヘキセニルであり得る。アルケニルは、非置換又は置換であり得る。アルキニルは、例えば、エチニル、１－プロピニル、２－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、３－ブチニル、１－ヘキシニル、２－ヘキシニル、３－ヘキシニル、１－オクチニルなどであり得る。アルキニルは、非置換又は置換であり得る。
【0166】
「アリール」という用語は、親芳香族環系に由来する芳香族炭化水素を指す。アリールは、親環系の飽和又は不飽和炭素原子で別の基に連結され得る。アリール基は、６～約１４個の炭素原子を有し得る。アリール基は、単一の環（例えば、フェニル）又は複数の縮合（縮合）環を有し得、少なくとも１つの環は芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、又はアントリル）である。典型的なアリール基としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどに由来するラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。アリールは、本明細書に記載のように、非置換又は置換であり得る。
【0167】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを指す。同様に、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を指す。
【0168】
「置換（された）」という用語は、「置換（された）」を使用した表現で示された基上の１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５個、いくつかの実施形態では１、２、又は３個、及び他の実施形態では１又は２個）の水素原子が、以下に記載の置換基からの選択、又は当業者に既知の好適な基で置き換えられることを示すことを意図しており、ただし、示されや置換原子の通常の価を超えないこと、及び置換が安定した化合物をもたらすことを条件とする。好適な置換基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、アシルアミノ、ニトロ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、及びシアノが挙げられる。好適な置換基はまた、例えば、－Ｘ、－Ｒ、－ＯＲ、－ＳＲ、－ＮＲ２、－ＮＲ３、＝ＮＲ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－ＯＣＮ、－ＳＣＮ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、－ＮＣＳ、－ＮＯ、－ＮＯ２、＝Ｎ２、－Ｎ３、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ、－ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、－Ｃ（Ｓ）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｃ（Ｓ）ＯＲ、－Ｃ（Ｏ）ＳＲ、－Ｃ（Ｓ）ＳＲ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、－Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、－Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲが挙げられ、各Ｘは独立して、ハロゲン（「ハロ」）：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、各Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、複素環、若しくは保護基、又はそれらのカチオン若しくはアニオンである。当業者によって容易に理解されるように、置換基がケト（すなわち、＝Ｏ）又はチオキソ（すなわち、＝Ｓ）などである場合、したがって、置換された原子上の２つの水素原子が置き換えられる。
【0169】
１つ以上の置換基を含有する上記基のうちのいずれかの場合、そのような基は、立体的に実施不可能であり、及び／又は合成的に実現不可能である任意の置換又は置換パターンを当然含まないことを理解されたい。加えて、本開示の化合物には、これらの化合物の置換から生じる全ての立体化学異性体が含まれる。
【0170】
「二塩基酸」という用語は、２つのカルボン酸（－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）基を含有する任意の基を指す。二塩基酸は、脂肪族ジカルボン酸又は芳香族ジカルボン酸であり得る。脂肪族ジカルボン酸は、２つ（又はそれ以上）のカルボン酸基で置換されている任意のアルキル基である。芳香族ジカルボン酸は、少なくとも１つのアリール基及び２つ（又はそれ以上）のカルボン酸を含有する任意の化合物である。２つのカルボン酸基は、同じアリール基上にあり得るか、又はそれらは、異なるアリール基上にあり得る。２つのカルボン酸基が異なるアリール基上にある場合、アリール基は、単結合によって連結され得、したがって、他の基、例えば、アルキル基によって連結され得る。アリール基を連結するアルキル基は、任意選択で置換され得、任意選択で炭素と本明細書で定義される他の基との間で中断され得る。
【0171】
「ポリマー」という用語は、１つ以上の繰り返し化学官能基によってともに共有結合された１つ以上の繰り返しモノマー残基単位の分子を指す。この用語は、直鎖、分岐、星、ランダム、ブロック、グラフトなどの全てのポリマー形態を含む。単一のモノマーから形成されたホモポリマー、２つ以上のモノマーから形成されたコポリマー、３つ以上のポリマーから形成されたテルポリマー、及び３つ超のモノマーから形成された他のポリマーを含む。ポリマーの異なる形態はまた、１つ超繰り返す共有結合官能基を有し得る。
【0172】
「ポリ無水物」という用語は、得られるポリマーの繰り返し単位が無水物（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－）基によって連結されるように、カルボン酸又はカルボン酸誘導体の縮合に由来するポリマーを指す。ポリ無水物は、本明細書に記載のように、二塩基酸を縮合させることによって、又は無水物プレポリマーを縮合させることによって調製され得る。
【0173】
「カルボン酸無水物」という用語は、無水物（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－）基を含有する化合物を指す。カルボン酸無水物は、典型的には、１分子当たり１つの無水物基のみを含有する。カルボン酸無水物は、２つのカルボン酸の縮合によって形成され得る。本明細書に記載の方法と併せて使用され得るカルボン酸無水物としては、ビス－アルキルカルボン酸無水物、ビス－アリールカルボン酸無水物、及び混合無水物が挙げられる。例としては、無水酢酸、トリフルオロ酢酸無水物、及び安息香酸無水物が挙げられるが、これらに限定されない。酢酸及び安息香酸の縮合生成物である酢酸安息香酸無水物などの混合無水物も用いられ得る。
【0174】
本明細書で使用される場合、「アシル」基は、別の基への結合点で、カルボニルラジカルで終端する（Ｃ１－Ｃ４）アルキル基などの基である。「アシルオキシ」基は、別の基への結合点で、カルボキシルラジカルで終端する（Ｃ１－Ｃ４）アルキル基などの置換基である。
【0175】
「アシル化された」という用語は、ヒドロキシル基のアシルオキシ基への変換を指す。アシル化は、ヒドロキシル基又はヒドロキシル含有基をカルボン酸無水物と接触させることによって行われ得る。
【0176】
本明細書で使用される場合、「プレポリマー」は、ポリマー（例えば、長鎖ポリ無水物）に変換され得るモノマー、オリゴマー、又はそれらの混合物である。二塩基酸プレポリマーは、典型的には、その末端カルボキシ基上でアシル化される。プレポリマーは、例えば、ビス（カルボン酸アセチルエステル）、又はその無水オリゴマーであり得る。いくつかの実施形態では、プレポリマーは、１，ω－（４－アセトキシカルボニルフェノキシ）アルカン、又はその無水物オリゴマーであり得る。１，ω－（４－アセトキシカルボニルフェノキシ）アルカンのフェノキシ基は、オルト、メタ、又はパラ置換パターンを有し得る。
【0177】
本明細書で使用される場合、「ホモポリマー」は、１つのタイプのモノマーの繰り返し単位からなるポリマーである。「コポリマー」は、２つ以上の異なるタイプのモノマーの繰り返し単位からなるポリマーである。ランダムコポリマーでは、繰り返し単位の構成は、ランダムである。
【0178】
本開示の粒子を調製するために使用されるポリ無水物は、本明細書に記載のように、又は当業者に既知の方法によって調製され得る。ポリ無水物の調製のための方法のいくつもの例を以下に提供する。ポリ無水物を調製するために、広範囲の好適な二塩基酸が用いられ得る。二塩基酸は、任意選択で、約１～約５個の－Ｐｈ－、－Ｏ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、及び／又は－Ｎ（Ｒ）－基によって中断されている、二塩基酸置換直鎖又は分岐鎖アルカンであり得、式中、Ｒは、Ｈ、フェニル、ベンジル、又は（Ｃ１－Ｃ６）アルキルである。一実施形態では、二塩基酸のアルカンは、Ｃ２－Ｃ１２（アルキル）であり得る。別の実施形態では、アルカンは、Ｃ４－Ｃ８（アルキル）であり得る。加えて、二塩基酸のアルカン基は、任意選択で、約１～約１２個の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－基、例えば、ポリ（エチレングリコール）セグメントによって中断され得る。アルカン基はまた、任意選択で、１、２、又は３個の（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ１－Ｃ６）アルケニル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、若しくはオキソ基、又はそれらの組み合わせで置換され得る。
【0179】
一実施形態では、プレポリマーは、スキーム１に示されるように調製され得、
「有機基」は、２つのカルボン酸部分を連結することができる任意の有機基であり、Ｒは、アルキル又はアリールであり、ｎは、１～約１２である。好適な有機基の例としては、Ｃ２－Ｃ１２（アルキル）基、－ＰｈＯ－Ｃ２－Ｃ１２（アルキル）－ＯＰｈ－基、及び３，６－ジオキサオクタン基などの１～約１２個のＰＥＧ単位を有するＰＥＧ基が挙げられるが、これらに限定されない。モル過剰のカルボン酸無水物が用いられ得る。約２～約３０モル当量のカルボン酸無水物が使用され得る。代替的に、約５～約２０モル当量のカルボン酸無水物が使用され得る。一実施形態では、６モル当量のカルボン酸無水物が用いられる。別の実施形態では、１８モル当量のカルボン酸無水物が用いられる。カルボン酸無水物は、例えば、無水酢酸、トリフルオロ酢酸無水物、安息香酸無水物、それらの組み合わせ、及び／又はそれらの誘導体であり得る。
【化1】
【0180】
プレポリマーはまた、スキーム２に示されるよう調製され得、
式中、ｎは、１～約１２である。安息香酸無水物などであるがこれらに限定されない、他のカルボン酸無水物は、プレポリマーの末端基を形成するために使用され得る。中央の脂肪族基は、任意選択で、本明細書に記載のように置換又は中断され得る。
【化2】
【0181】
二塩基酸はまた、１，ω－ビス（カルボキシ）アルカンであり得る。当業者によって認識されるように、１，ω－ビス（カルボキシ）アルカンの代替命名法は、対応するビス（カルボキシ）アルカンと比較して、アルカン部分に２つの追加の炭素を有する１，ω－アルカン二酸である。
【0182】
プレポリマーはまた、スキーム３に示されるよう調製され得、
式中、ｎは、１～約１２である。無水酢酸以外のカルボン酸無水物を使用して、プレポリマーの末端基を形成し得る。中央の脂肪族基、アリール基、又は両方は、任意選択で、任意の組み合わせで置換され得る。中央の脂肪族基はまた、例えば、ポリ（エチレングリコール）鎖を有するように、酸素によって中断され得る。
【化3】
【0183】
したがって、二塩基酸は、各々カルボキシ基で置換された２つのアリール基であり得、アリール基は、直鎖又は分岐鎖アルカンによって連結され、任意選択で、約１～約５個の－Ｐｈ－、－Ｏ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、及び／又は－Ｎ（Ｒ）－基によって中断され、式中、Ｒは、Ｈ、フェニル、ベンジル、又は（Ｃ１－Ｃ６）アルキルである。いくつかの実施形態では、アリール基の一方又は両方は省略され得、カルボキシ基はアルキル鎖によって連結される。一実施形態では、アルカンは、Ｃ２－Ｃ１２（アルキル）であり得る。別の実施形態では、アルカンは、Ｃ４－Ｃ８（アルキル）であり得る。別の実施形態では、アルカンは、１つ以上のＰＥＧ基であり得る。加えて、カルボン酸置換アリール基を連結するアルカン基は、任意選択で、１～約１２個の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－基、例えば、ポリ（エチレングリコール）セグメントによって中断され得る。カルボン酸置換アリール基を連結するアルカン基はまた、任意選択で、１、２、又は３個の（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ１－Ｃ６）アルケニル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、若しくはオキソ基、又はそれらの組み合わせで置換され得る。
【0184】
二塩基酸は、１，ω－ビス（４－カルボキシフェノキシ）アルカンであり得る。一実施形態では、アルカンは、（Ｃ２－Ｃ１０）アルカンである。別の実施形態では、アルカンは、Ｃ４－Ｃ８（アルキル）であり得る。ある特定の具体的な実施形態では、アルカンは、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、及びそれらの分岐異性体であり得る。一実施形態では、二塩基酸は、１，６－ビス（４－カルボキシフェノキシ）ヘキサンである。別の実施形態では、二塩基酸は、１，６－ビス（カルボキシ）オクタンである。別の実施形態では、二塩基酸は、１，８－ビス（カルボキシフェノキシ）－３，６－ジオキサオクタンであり得る。これらの二塩基酸のうちのいずれかの混合物は、本明細書に記載のマイクロ波促進方法と併せて使用され得る。
【0185】
ポリ無水物は、当技術分野で既知の縮合方法によって、又はプレポリマーを重合させるのに十分な量のマイクロ波照射でプレポリマーを照射することによって調製され得る。十分な量のマイクロ波放射は、典型的には、約１～約３０分間、１１００ワットに設定された従来のマイクロ波オーブンによって生成され得る。より多くの場合、十分な量のマイクロ波放射を約１～約２０分で生成し得る。得られたポリ無水物は、反応に使用されるプレポリマー組成物の性質に応じて、ホモポリマー又はコポリマーであり得る。
【0186】
ポリ無水物はまた、二塩基酸からインサイチュでプレポリマーを形成することによっても調製され得る。二塩基酸は、カルボン酸無水物の存在下で二塩基酸を照射することによってプレポリマーに変換され得る。プレポリマーは、例えば、（ａ）カルボン酸無水物と、（ｂ）芳香族ジカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、又はそれらの混合物との混合物を、プレポリマーを形成するのに有効なマイクロ波放射の量で照射することによって調製され得る。１つの好適なカルボン酸無水物は、無水酢酸である。他の好適なカルボン酸無水物としては、例えば、トリフルオロ酢酸無水物及び安息香酸無水物が挙げられる。
【0187】
本明細書に記載の方法に従って調製されたポリ無水物の末端基は、典型的には、末端アシル基を有する。ポリ無水物のいくつかの加水分解が、反応中又はポリ無水物の単離中に生じる可能性がある。したがって、そのようなポリ無水物のいくつかの末端基は、カルボン酸基であり得る。したがって、本開示の方法は、アシル基、カルボン酸基、又はそれらの組み合わせで終端するポリ無水物の調製を含む。
【0188】
ポリ無水物は、例えば、スキーム４に示されるように調製され得、
式中、「有機基」は、２つのカルボン酸部分を連結する任意の有機基であり、Ｒは、アルキル又はアリールであり、ｎは、１～約１２であり、ｍは、約５～約２００である。
【化4】
【0189】
ポリ無水物はまた、スキーム５に示されるように調製され得、
式中、ｎは、１～約１２であり、ｍは、約５～約２００である。他の実施形態では、ｍは、約１０～約１００、又は約１０～約５０であり得る。当業者によって理解されるように、ｍの値は、典型的には、ｎの値よりも大きい。アセテート以外の末端基が使用され得、中央の脂肪族基は、本明細書に記載のように、任意選択で置換されるか、任意選択で中断されるか（例えば、ＰＥＧ基について）、又は両方であり得る。
【化5】
【0190】
ポリ無水物はまた、スキーム６に示されるように調製され得、
式中、ｎは、１～約１２であり、ｍは、約５～約１００である。他の実施形態では、ｍは、約１０～約５０、又は約１５～約３５であり得る。アセテート以外の末端基が使用され得、中央の脂肪族基、アリール基、又は両方は、任意選択で、任意の組み合わせで置換され得る。中央の脂肪族基はまた、任意選択で、例えば、ポリ（エチレングリコール）鎖を有するように、酸素によって中断され得る。
【化6】
【0191】
ポリ無水物微粒子又はナノ粒子を調製するための方法は、１つ以上の二塩基酸を照射することであって、１つ以上の二塩基酸が、芳香族ジカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、又はそれらの混合物を含み、１つ以上の二塩基酸をアシル化して少なくとも１つのプレポリマーを得るための、カルボン酸無水物の存在下でのマイクロ波放射を用いる、照射することと、当該プレポリマーを重合させて、ホモポリマー又はコポリマーとしてポリ無水物を得るためにプレポリマーをマイクロ波放射を用いて照射することと、を含む。
【0192】
プレポリマーは、両方の酸部分でアシル化されたジカルボン酸（「二塩基酸」）から構成され得る。プレポリマーは、単一のアシル化二塩基酸単位（モノマー）であり得るか、又は最大約１２個の縮合二塩基酸単位を有し得る。異なる二塩基酸の混合物が用いられ得る。二塩基酸の混合物は、ランダムコポリマーを得ることができる。１つ以上の二塩基酸は、任意選択で、約１～約５個の－Ｐｈ－、－Ｏ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、及び／又は－Ｎ（Ｒ）－基によって中断されている、二塩基酸置換Ｃ２－Ｃ１２直鎖又は分岐鎖アルカンを含み得、式中、Ｒは、Ｈ、フェニル、ベンジル、又は（Ｃ１－Ｃ６）アルキルである。１つ以上の二塩基酸はまた、任意選択で、約１～約１２個の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－基によって中断され得る。１つ以上の二塩基酸はまた、任意選択で、１、２、又は３個のトリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ１－Ｃ６）アルケニル、若しくはオキソ基、又はそれらの組み合わせで置換され得る。
【0193】
少なくとも１つの二塩基酸は、１，ω－ビス（カルボキシ）アルカンであり得る。少なくとも１つの二塩基酸はまた、１，ω－ビス（４－カルボキシフェノキシ）アルカンであり得る。アルカンは、例えば、（Ｃ３－Ｃ８）アルカンであり得る。アルカンの具体例としては、ヘキサン及びオクタンが挙げられる。二塩基酸は、１，６－ビス（４－カルボキシフェノキシ）ヘキサンであり得る。代替的に、二塩基酸は、１，６－ビス（カルボキシ）オクタン（セバシン酸）であり得る。少なくとも１つのプレポリマーはまた、ビス（カルボン酸アセチルエステル）、又はその無水物オリゴマーを含み得る。少なくとも１つのプレポリマーはまた、１，ω－（４－アセトキシカルボニルフェノキシル）アルカン、又はその無水物オリゴマー、又は１，８－ビス（カルボキシフェノキシ）－３，６－ジオキサオクタン、又はその無水物オリゴマーを含み得る。
【0194】
カルボン酸無水物は、ビス－アルキルカルボン酸無水物、ビス－アリールカルボン酸無水物、アルキル－アリールカルボン酸無水物、又はそれらの混合物であり得る。カルボン酸無水物は、例えば、無水酢酸、トリフルオロ酢酸無水物、又は安息香酸無水物であり得る。モル過剰のカルボン酸無水物が用いられ得る。過剰な無水カルボン酸は、プレポリマーが形成された後に除去され得る。
【0195】
様々な実施形態では、本明細書に記載の微粒子及び／又はナノ粒子のポリマーは、ポリ－セバシン酸無水物（ＳＡ）、ポリ－１，６－ビス－（ｐ－カルボキシフェノキシ）ヘキサン（ＣＰＨ）無水物、又はポリ－１，８－ビス（カルボキシフェノキシ）－３，６－ジオキサオクタン（ＣＰＴＥＧ）無水物であり得る。他の実施形態では、本明細書に記載の微粒子及び／又はナノ粒子のポリマーは、セバシン酸無水物（ＳＡ）及び１，６－ビス－（ｐ－カルボキシフェノキシ）ヘキサン（ＣＰＨ）無水物のコポリマー、又は１，８－ビス（カルボキシフェノキシ）－３，６－ジオキサオクタン（ＣＰＴＥＧ）無水物及び１，６－ビス－（ｐ－カルボキシフェノキシ）ヘキサン（ＣＰＨ）無水物のコポリマーであり得る。ＳＡ対ＣＰＨ、又はＣＰＴＥＧ対ＣＰＨの比は、約１：１９～約１９：１の任意の整数であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＰＴＥＧ対ＣＰＨの比は、約２０：８０である。ＳＡ：ＣＰＨコポリマーの構造の例は、以下のとおりである：
各ブロック（単一又は二重括弧で示される）は、約１０，０００～約２５，０００ｇ／ｍｏｌ、又は約１５，０００～約２０，０００ｇ／ｍｏｌなどの約５，０００～約５０，０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有するポリマーを提供するのに十分ないくつもの繰り返し単位を含む。無水物コポリマーは、ブロックコポリマー若しくはランダムコポリマー、又はそれらの組み合わせであり得る。ＣＰＴＥＧ：ＣＰＨコポリマーはまた、各ブロックが、約１０，０００～約２５，０００ｇ／ｍｏｌ、又は約１５，０００～約２０，０００ｇ／ｍｏｌなどの約５，０００～約５０，０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有するポリマーを提供するのに十分ないくつもの繰り返し単位を含み得るポリマーを形成するように調製され得る。
【化7】
【0196】
本明細書に記載のポリ無水物粒子は、有効量のＲＮＡポリヌクレオチドを担持し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソームが、ポリ無水物ポリマーに封入され得る。
【0197】
投与様式
組成物は、治療上有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらには、皮内、筋肉内、鼻腔内、及び／又は皮下投与が含まれるがこれらに限定されない。本開示は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び一般的な状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象ごとに異なるであろう。ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、典型的には、投薬単位形態で製剤化される。しかしながら、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する特定の治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、又は適切な画像化用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食生活；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排泄速度；治療期間；用いられる特定の化合物と組み合わせて又はそれと同時に使用される薬物；並びに医学技術分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存するであろう。
組成物は、治療上有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらには、皮内、筋肉内、鼻腔内、及び／又は皮下投与が含まれるがこれらに限定されない。本開示は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び一般的な状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象ごとに異なるであろう。ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、典型的には、投薬単位形態で製剤化される。しかしながら、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する特定の治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、又は適切な画像化用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食生活；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排泄速度；治療期間；用いられる特定の化合物と組み合わせて又はそれと同時に使用される薬物；並びに医学技術分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存するであろう。
【0198】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、所望の治療効果、診断効果、予防効果、又は画像化効果を得るために、１日当たり、１日１回以上、１週間当たり、１か月当たりなど、対象の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ，を送達するのに十分な投薬量レベルで投与され得る（例えば、国際公開第２０１３／０７８１９９号に記載されている単位用量の範囲を参照されたく、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日ごと、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、２か月ごと、３か月ごと、６か月ごとなどで送達され得る。いくつかの実施形態では、所望の投薬量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、又はそれ以上の投与）を使用して送達され得る。複数回の投与が用いられる場合、本明細書に記載のものなどの分割投与レジメンが使用され得る。ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．０１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ～約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇ、又は約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬量レベルで投与され得る。
【0199】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．７５０ｍｇ／ｋｇ、又は０．０２５ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬量レベルで１回又は２回（以上）投与され得る。
【0200】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、２回（例えば、０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３か月後、０日目及び６か月後、０日目及び９か月後、０日目及び１２か月後、０日目及び１８か月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後、又は０日目及び１０年後）、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、又は１．０ｍｇの総用量、又はその総用量を送達するのに十分な投薬量レベルで、投与され得る。より高い及びより低い投薬量及び投与頻度は、本開示に包含される。例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、３回又は４回投与され得る。
【0201】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、２回（例えば、０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３か月後、０日目及び６か月後、０日目及び９か月後、０日目及び１２か月後、０日目及び１８か月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後、又は０日目及び１０年後）、０．０１０ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．１００ｍｇ、又は０．４００ｍｇの総用量、又はその総用量を送達するのに十分な投薬量レベルで、投与され得る。
【0202】
本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物は、鼻腔内、気管内、又は注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、鼻腔内、及び皮下）などの本明細書に記載の剤形に製剤化され得る。
【0203】
実施形態
以下の番号付き実施形態はまた、本開示の一部分を形成する。
以下の番号付き実施形態はまた、本開示の一部分を形成する。
【0204】
１．５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と、を含むＲＮＡポリヌクレオチドであって、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はエキソリボヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ（ｘｒＲＮＡ）要素を含む、ＲＮＡポリヌクレオチド。
【0205】
２．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、ｘｒＲＮＡ要素を含む、実施形態１のＲＮＡポリヌクレオチド。
【0206】
３．ｘｒＲＮＡ要素が、配列番号６、２５、３１、又は３６を含む、実施形態１又は実施形態２のＲＮＡポリヌクレオチド。
【0207】
４．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス様キャップ非依存性翻訳エンハンサーを含む、実施形態１～３のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0208】
５．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、薄いスズメノヒエ（Ｔｈｉｎ ｐａｓｐａｌｕｍ）無症候性ウイルス（ＴＰＡＶ）、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）、スイートクローバー壊疽モザイクウイルス（ＳＣＮＭＶ）、レッドクローバー壊疽モザイクウイルス（ＲＣＮＭＶ）、又はケシモザイクウイルス（ＯＰＭＶ）に由来する、実施形態１～４のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0209】
６．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、実施形態１～５のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0210】
７．５’ＵＴＲが、配列番号７、１４、２６、２８、２９、３２、３３、又は３７を含み、３’ＵＴＲが、配列番号８、１３、１５、１６、２７、３０、３５、又は３８を含む、実施形態１～６のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0211】
９．ＲＮＡポリヌクレオチドが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、実施形態１～７のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0212】
９．ＩＲＥＳが、配列番号９、１０、１２、又は３４を含む、実施形態１～８のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0213】
１０．ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＲＮＡタンパク質結合ドメインを含む、実施形態１～９のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0214】
１１．ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’キャップ構造又はポリＡテールを含まない、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0215】
１２．ＲＮＡポリヌクレオチドが、修飾ヌクレオシドを含まない、実施形態１～１１のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0216】
１３．少なくとも１つのポリペプチドが、抗原ポリペプチドを含む、実施形態１～１２のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0217】
１４．抗原ポリペプチドが、インフルエンザウイルス又はコロナウイルスに由来する、実施形態１３のＲＮＡポリヌクレオチド。
【0218】
１５．少なくとも１つのポリペプチドが、抗体の軽鎖及び重鎖を含む、実施形態１～１２のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0219】
１６．ＲＮＡポリヌクレオチドが、環状ＲＮＡポリヌクレオチドである、実施形態１～１５のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド。
【0220】
１７．ポリ無水物ポリマーと、実施形態１～１６のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチドと、を含む、ポリ無水物組成物であって、ポリ無水物ポリマーが、ＲＮＡポリヌクレオチドを封入する、ポリ無水物組成物。
【0221】
１８．ポリ無水物ポリマーが、１，８－ビス（カルボキシフェノキシ）－３，６－ジオキサオクタン（ＣＰＴＥＧ）及び１，６－ビス－（ｐ－カルボキシフェノキシ）ヘキサン（ＣＰＨ）のコポリマーを含む、実施形態１７の組成物。
【0222】
１９．ＣＰＴＥＧ：ＣＰＨ比が、約２０：８０～約５０：５０である、実施形態１８の組成物。
【0223】
２０．ＲＮＡポリヌクレオチドを送達するためのエクソソームであって、エクソソームが、５’ＵＴＲを含むＲＮＡポリヌクレオチドと、少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列と、３’ＵＴＲと、を含み、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はｘｒＲＮＡ要素を含む、エクソソソーム。
【0224】
２１．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、ｘｒＲＮＡ要素を含む、実施形態２０のエクソソーム。
【0225】
２２．ｘｒＲＮＡが、配列番号６、２５、３１、又は３６を含む、実施形態２０又は実施形態２１のエクソソーム。
【0226】
２３．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス様キャップ非依存性翻訳エンハンサーを含む、実施形態２０～２２のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0227】
２４．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、ＴＰＡＶ、ＴＢＳＶ、ＳＣＮＭＶ、ＲＣＮＭＶ、又はＯＰＭＶ由来である、実施形態２０～２３のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0228】
２５．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、実施形態２０～２４のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0229】
２６．５’ＵＴＲが、配列番号７、１４、２６、２８、２９、３２、３３、又は３７を含み、３’ＵＴＲが、配列番号８、１３、１５、１６、２７、３０、３５、又は３８を含む、実施形態２０～２５のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0230】
２８．ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＩＲＥＳを含む、実施形態２０～２６のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0231】
２９．ＩＲＥＳが、配列番号９、１０、１２、又は３４を含む、実施形態２０～２７のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0232】
３０．ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＲＮＡタンパク質結合ドメインを含む、実施形態２０～２８のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0233】
３１．ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’キャップ構造又はポリＡテールを含まない、実施形態２０～２９のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0234】
３２．ＲＮＡポリヌクレオチドが、修飾ヌクレオシドを含まない、実施形態２０～３０のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0235】
３３．少なくとも１つのポリペプチドが、抗原ポリペプチドを含む、実施形態２０～３１のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0236】
３４．抗原ポリペプチドが、インフルエンザウイルス又はコロナウイルスに由来する、実施形態３３のエクソソーム。
【0237】
３５．少なくとも１つのポリペプチドが、抗体の軽鎖及び重鎖を含む、実施形態２０～３４のうちのいずれか１つのエクソソーム。
【0238】
３６．ポリ無水物ポリマーと、実施形態２０～３５のうちのいずれか１つのエクソソームと、を含む、ポリ無水物組成物であって、ポリ無水物ポリマーが、エクソソームを封入する、ポリ無水物組成物。
【0239】
３７．ポリ無水物ポリマーが、ＣＰＴＥＧ及びＣＰＨのコポリマーを含む、実施形態３６の組成物。
【0240】
３８．ＣＰＴＥＧ：ＣＰＨ比が、約２０：８０～約５０：５０である、実施形態３７の組成物。
【0241】
３９．実施形態１～１６のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【0242】
４０．５’ＵＴＲと、ポリペプチドをコードする配列を挿入するための異種多重クローニング部位と、３’ＵＴＲと、を含むＲＮＡポリヌクレオチドであって、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はｘｒＲＮＡ要素を含む、ＲＮＡポリヌクレオチド。
【0243】
４１．実施形態１～１６又は４０のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチド。
【0244】
４２．対象における目的のポリペプチドを産生する方法であって、方法が、実施形態１～１６のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド、実施形態１７～１９又は３６～３９のうちのいずれか１つの組成物、又は実施形態２０～３５のうちのいずれか１つのエクソソームを対象に投与することを含む、方法。
【0245】
４３．対象にＲＮＡポリヌクレオチドを送達する方法であって、方法が、実施形態１～１６のうちのいずれか１つのＲＮＡポリヌクレオチド、実施形態１７～１９又は３６～３９のうちのいずれか１つの組成物、又は実施形態２０～３５のうちのいずれか１つのエクソソームを対象に投与することを含む、方法。
【0246】
４４．対象において免疫応答を誘導する方法であって、方法が、対象において抗原特異的免疫応答を産生するのに有効な量のＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物を、対象に投与することを含み、ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲと、少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードする配列と、３’ＵＴＲと、を含み、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はｘｒＲＮＡ要素を含む、方法。
【0247】
４５．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、ｘｒＲＮＡ要素を含む、実施形態４４の方法。
【0248】
４６．ｘｒＲＮＡ要素が、配列番号６、２５、３１、又は３６を含む、実施形態４４又は実施形態４５の方法。
【0249】
４７．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス様キャップ非依存性翻訳エンハンサーを含む、実施形態４４～４６のうちのいずれか１つの方法。
【0250】
４８．５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲが、ＴＰＡＶ、ＴＢＳＶ、ＳＣＮＭＶ、ＲＣＮＭＶ、又はＯＰＭＶ由来である、実施形態４４～４７のうちのいずれか１つの方法。
【0251】
４９．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、実施形態４４～４８のうちのいずれか１つの方法。
【0252】
５０．５’ＵＴＲが、配列番号７、１４、２６、２８、２９、３２、３３、又は３７を含み、３’ＵＴＲが、配列番号８、１３、１５、１６、２７、３０、３５、又は３８を含む、実施形態４４～４９のうちのいずれか１つの方法。
【0253】
５１．ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＩＲＥＳを含む、実施形態４４～５０のうちのいずれか１つの方法。
【0254】
５２．ＩＲＥＳが、配列番号９、１０、１２、又は３４を含む、実施形態４４～５１のうちのいずれか１つの方法。
【0255】
５３．ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＲＮＡタンパク質結合ドメインを含む、実施形態４４～５２のうちのいずれか１つの方法。
【0256】
５４．ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’キャップ構造又はポリＡテールを含まない、実施形態４４～５３のうちのいずれか１つの方法。
【0257】
５５．ＲＮＡポリヌクレオチドが、修飾ヌクレオシドを含まない、実施形態４４～５４のうちのいずれか１つの方法。
【0258】
５６．抗原ポリペプチドが、インフルエンザウイルス又はコロナウイルスに由来する、実施形態４４～５５のうちのいずれか１つの方法。
【0259】
５７．組成物が、薬学的に許容される賦形剤を含む、実施形態４４～５６のうちのいずれか１つの方法。
【0260】
５８．組成物が、エクソソームを含む、実施形態４４～５７のうちのいずれか１つの方法。
【0261】
５９．組成物が、ポリ無水物ポリマーを含む、実施形態４４～５８のうちのいずれか１つの方法。
【0262】
６０．ポリ無水物ポリマーが、ＣＰＴＥＧ及びＣＰＨのコポリマーを含む、実施形態５９の方法。
【0263】
６１．ＣＰＴＥＧ：ＣＰＨ比が、約２０：８０～約５０：５０である、実施形態６０の方法。
【0264】
６２．組成物が、対象に、筋肉内、鼻腔内、又は皮内投与される、実施形態４４～６１のうちのいずれか１つの方法。
【0265】
６３．組成物が、対象に鼻腔内投与される、実施形態４４～６２のうちのいずれか１つの方法。
【0266】
６４．対象が、ヒトである、実施形態４４～６３のうちのいずれか１つの方法。
【0267】
６５．抗体を対象に送達する方法であって、方法が、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物を対象に投与することを含み、ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲと、抗体の軽鎖をコードする配列と、抗体の重鎖をコードする配列と、少なくとも１つのＩＲＥＳと、３’ＵＴＲと、を含み、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はｘｒＲＮＡ要素を含む、方法。
【0268】
６６．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、ｘｒＲＮＡ要素を含む、実施形態６５の方法。
【0269】
６７．ｘｒＲＮＡ要素が、配列番号６、２５、３１、又は３６を含む、実施形態６５又は実施形態６６の方法。
【0270】
６８．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、パニクムモザイクウイルス様キャップ非依存性翻訳エンハンサーを含む、実施形態６５～６７のうちのいずれか１つの方法。
【0271】
６９．５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲが、ＴＰＡＶ、ＴＢＳＶ、ＳＣＮＭＶ、ＲＣＮＭＶ、又はＯＰＭＶ由来である、実施形態６５～６８のうちのいずれか１つの方法。
【0272】
７０．５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、実施形態６５～６９のうちのいずれか１つの方法。
【0273】
７１．５’ＵＴＲが、配列番号７、１４、２６、２８、２９、３２、３３、又は３７を含み、３’ＵＴＲが、配列番号８、１３、１５、１６、２７、３０、３５、又は３８を含む、実施形態６５～７０のうちのいずれか１つの方法。
【0274】
７２．ＲＮＡポリヌクレオチドが、２つのＩＲＥＳを含み、ＩＲＥＳが、配列番号９及び配列番号１０を含む、実施形態６５～７１のうちのいずれか１つの方法。
【0275】
７３．ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＲＮＡタンパク質結合ドメインを含む、実施形態６５～７２のうちのいずれか１つの方法。
【0276】
７４．ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’キャップ構造又はポリＡテールを含まない、実施形態６５～７３のうちのいずれか１つの方法。
【0277】
７５．ＲＮＡポリヌクレオチドが、修飾ヌクレオシドを含まない、実施形態６５～７４のうちのいずれか１つの方法。
【0278】
７６．組成物が、薬学的に許容される賦形剤を含む、実施形態６５～７５のうちのいずれか１つの方法。
【0279】
７７．組成物が、エクソソームを含む、実施形態６５～７６のうちのいずれか１つの方法。
【0280】
７８．組成物が、ポリ無水物ポリマーを含む、実施形態６５～７７のうちのいずれか１つの方法。
【0281】
７９．ポリ無水物ポリマーが、ＣＰＴＥＧ及びＣＰＨのコポリマーを含む、実施形態７８の方法。
【0282】
８０．ＣＰＴＥＧ：ＣＰＨ比が、約２０：８０～約５０：５０である、実施形態７９の方法。
【0283】
８１．組成物が、対象に、筋肉内、鼻腔内、又は皮内投与される、実施形態６５～８０のうちのいずれか１つの方法。
【0284】
８２．対象が、ヒトである、実施形態６５～８１のうちのいずれか１つの方法。
【0285】
８３．ＲＮＡポリヌクレオチドの送達のためのエクソソームを産生するための方法であって、方法が、ＲＮＡポリヌクレオチドを発現するポリヌクレオチド構築物で細胞を形質転換することであって、ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲと、少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列と、３’ＵＴＲと、を含み、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲが、キャップ非依存性翻訳エンハンサー又はｘｒＲＮＡ要素を含む、形質転換することと、細胞を増殖培地中で培養することであって、ＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソームが、細胞外の増殖培地中に放出される、培養することと、細胞を増殖培地から除去することと、増殖培地からＲＮＡポリヌクレオチドを含むエクソソームを採取することと、を含む、方法。
【0286】
８４．採取することが、超遠心分離によるものである、実施形態８３の方法。
【0287】
８５．細胞が、Ａ５４９細胞である、実施形態８３又は実施形態８４の方法。
【0288】
８６．ポリヌクレオチド構築物が、プロモーターを含む、実施形態８３～８５のうちのいずれか１つの方法。
【0289】
８７．プロモーターが、Ｔ７プロモーターであり、細胞が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現する、実施形態８６の方法。
【0290】
本明細書に記載の全ての刊行物及び特許出願は、本開示が関係する技術分野の当業者の技術レベルを示すものである。全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたときと同じ程度に、本明細書において参照により組み込まれる。
【0291】
以下の実施例は、限定ではなく、例示として提供される。
【実施例】
【0292】
実施例１：代替ｍＲＮＡ発現カセット
宿主エンドヌクレアーゼからのいくらか保護を与える非翻訳領域をコード領域に隣接させることによってｍＲＮＡを安定化するように機能する一連の発現カセットを試験した。ＭｏｄｅｒｎａワクチンｍＲＮＡ上のものと同様であるが、キャップ化又はテール化を伴わない、ベータ－アクチン（細胞内に豊富なハウスキーピングタンパク質）非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接する蛍光レポーターの発現は、細胞内Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって連続的に転写されない限り、一過性であった（２４時間未満）。対照的に、蛍光レポータータンパク質は、エキソヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ構造（ｘｒＲＮＡ）、並びにレポーター遺伝子のコード領域に隣接する薄いスズメノヒエ無症候性ウイルス（ＴＰＡＶ）及びアブラムシ致死性麻痺ウイルス（ＡＬＰＶ）のＵＴＲを使用する場合、細胞内に持続し、これらのＵＴＲに隣接するｍＲＮＡが持続し、キャップ及びポリ（Ａ）テールを欠いているにもかかわらず、効率的に翻訳されたことを示唆している。
宿主エンドヌクレアーゼからのいくらか保護を与える非翻訳領域をコード領域に隣接させることによってｍＲＮＡを安定化するように機能する一連の発現カセットを試験した。ＭｏｄｅｒｎａワクチンｍＲＮＡ上のものと同様であるが、キャップ化又はテール化を伴わない、ベータ－アクチン（細胞内に豊富なハウスキーピングタンパク質）非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接する蛍光レポーターの発現は、細胞内Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって連続的に転写されない限り、一過性であった（２４時間未満）。対照的に、蛍光レポータータンパク質は、エキソヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ構造（ｘｒＲＮＡ）、並びにレポーター遺伝子のコード領域に隣接する薄いスズメノヒエ無症候性ウイルス（ＴＰＡＶ）及びアブラムシ致死性麻痺ウイルス（ＡＬＰＶ）のＵＴＲを使用する場合、細胞内に持続し、これらのＵＴＲに隣接するｍＲＮＡが持続し、キャップ及びポリ（Ａ）テールを欠いているにもかかわらず、効率的に翻訳されたことを示唆している。
【0293】
ｍＲＮＡワクチンの目的は、タンパク質に対して長寿命の抗体応答を開始するように、細胞内でタンパク質（抗原）を発現させることである。これらの代替発現カセットは、「ハウスキーピング遺伝子」ＵＴＲ＋キャップ＋テール化を含有する従来のｍＲＮＡ構築物よりも優れているようである。これまでに試験された最も好ましい発現カセットは、ＴＰＡＶ由来のＵＴＲを含有するカセットである。
【0294】
具体的な方法論については、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現キットを使用してインビトロ転写（ＩＶＴ）発現ｍＲＮＡを生成し、フェノール／クロロホルム及びエタノール／塩精製によってｍＲＮＡを採取した。１μｇのｍＲＮＡを、Ｍｉｒｕｓ ＢｉｏｔｅｃｈのｍＲＮＡトランスフェクション試薬を使用して細胞にトランスフェクションした。Ｔ７プロモーター、５’及び３’ＵＴＲ、並びにレポーターコード領域を含有するＰＣＲ断片のみを使用した同様のトランスフェクションも、Ｔ７ポリメラーゼを構成的に発現するＡ５４９細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅによってトランスフェクションした。
【0295】
【0296】
実施例２：熱安定性ポリ無水物ナノ粒子
ｍＲＮＡのポリ無水物ナノ粒子への組み込み
ｍＲＮＡを、ｘｒＲＮＡ発現カセットを使用して、（２０：８０のＣＰＴＥＧ：ＣＰＨ製剤に基づく）ポリ無水物ナノ粒子に成功裏に組み込んだ。ＣＰＴＥＧは、具体的には、１，８－ビス－（ｐ－カルボキシフェノキシ）－３，６－ジオキサオクタンであり、一方、ＣＰＨは、１，６－ビス－（ｐ－カルボキシフェノキシ）－ヘキサンであり、これは、放出動態並びに水及び酸素からの保護を変化させるために異なる比率でブレンドされ得る。具体的には、８００μｇのｍＲＮＡを、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｔ７メガキットを使用して、従来のＩＶＴ発現によって生成した。ＲＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出、塩及びグリコーゲン担体によって精製した。ＲＮＡペレットを、０．１％のスペルミン（Ｓｉｇｍａ）を含む純水中に再懸濁した。次いで、ＲＮＡを凍結乾燥させ、２０：８０のＣＰＴＥＧ／ＣＰＨに封入した。次いで、ｍＲＮＡ含有ナノ粒子（５ｍｇ）を水中に溶解させ、ＲＮＡを逆転写に供し、次いで、ｍＫＡＴＥプライマーを使用してＰＣＲし、産物を見出した。ＲＮＡのいくつかをまたリポフェクタミンとブレンドし、Ａ５４９細胞上に配置し、２４時間後に細胞における蛍光タンパク質が見出された。同じアプローチを繰り返したが、室温でナノ粒子を省略し、同様の所見が得られた。図３は、ナノ粒子から抽出されたｍＲＮＡが依然として細胞にトランスフェクションすることができることを示す。図４は、ナノ粒子から抽出されたｍＲＮＡが、室温での熱分解から保護される可能性が高いことを示す。比較のために、Ｍｏｄｅｒｎａ及びＰｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮｔｅｃｈワクチンの両方のｍＲＮＡは、分解する前に約４時間の室温貯蔵寿命を有する。
ｍＲＮＡのポリ無水物ナノ粒子への組み込み
ｍＲＮＡを、ｘｒＲＮＡ発現カセットを使用して、（２０：８０のＣＰＴＥＧ：ＣＰＨ製剤に基づく）ポリ無水物ナノ粒子に成功裏に組み込んだ。ＣＰＴＥＧは、具体的には、１，８－ビス－（ｐ－カルボキシフェノキシ）－３，６－ジオキサオクタンであり、一方、ＣＰＨは、１，６－ビス－（ｐ－カルボキシフェノキシ）－ヘキサンであり、これは、放出動態並びに水及び酸素からの保護を変化させるために異なる比率でブレンドされ得る。具体的には、８００μｇのｍＲＮＡを、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｔ７メガキットを使用して、従来のＩＶＴ発現によって生成した。ＲＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出、塩及びグリコーゲン担体によって精製した。ＲＮＡペレットを、０．１％のスペルミン（Ｓｉｇｍａ）を含む純水中に再懸濁した。次いで、ＲＮＡを凍結乾燥させ、２０：８０のＣＰＴＥＧ／ＣＰＨに封入した。次いで、ｍＲＮＡ含有ナノ粒子（５ｍｇ）を水中に溶解させ、ＲＮＡを逆転写に供し、次いで、ｍＫＡＴＥプライマーを使用してＰＣＲし、産物を見出した。ＲＮＡのいくつかをまたリポフェクタミンとブレンドし、Ａ５４９細胞上に配置し、２４時間後に細胞における蛍光タンパク質が見出された。同じアプローチを繰り返したが、室温でナノ粒子を省略し、同様の所見が得られた。図３は、ナノ粒子から抽出されたｍＲＮＡが依然として細胞にトランスフェクションすることができることを示す。図４は、ナノ粒子から抽出されたｍＲＮＡが、室温での熱分解から保護される可能性が高いことを示す。比較のために、Ｍｏｄｅｒｎａ及びＰｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮｔｅｃｈワクチンの両方のｍＲＮＡは、分解する前に約４時間の室温貯蔵寿命を有する。
【0297】
コポリマー中のｍＲＮＡトランスフェクションは、脂質トランスフェクションよりも高いトランスフェクション効率をもたらす
コポリマーが、ｍＲＮＡを細胞に最適に送達するように設計された脂質と同等に細胞をトランスフェクションできるかどうかを試験した。コポリマーは、脂質に対して、ウマＨＡ ｍＲＮＡの送達が増強されて、細胞内へ送達することが可能であった（図５）。
コポリマーが、ｍＲＮＡを細胞に最適に送達するように設計された脂質と同等に細胞をトランスフェクションできるかどうかを試験した。コポリマーは、脂質に対して、ウマＨＡ ｍＲＮＡの送達が増強されて、細胞内へ送達することが可能であった（図５）。
【0298】
ポリ無水物担体中のｍＲＮＡは熱安定性であり、棚に保管されてから数か月後にトランスフェクションすることができる
ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする４０μｇのｍＲＮＡの製剤を、１つはポリ無水物２０：８０中に、１つはポリ無水物なしで、４か月間棚に置いた。ポリ無水物中の１つだけが安定であった（図６）。より高いトランスフェクション効率を得ることができるが、ｍＲＮＡを２０：８０から素早く取り戻すことは、はるかにゆっくりと溶解するように設計されているため困難である可能性がある。同様の研究が、ｍＲＮＡ及びＲＮＡウイルスを用いて３７℃で行われ、ポリ無水物材料中のみ安定であることが見出された。
ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする４０μｇのｍＲＮＡの製剤を、１つはポリ無水物２０：８０中に、１つはポリ無水物なしで、４か月間棚に置いた。ポリ無水物中の１つだけが安定であった（図６）。より高いトランスフェクション効率を得ることができるが、ｍＲＮＡを２０：８０から素早く取り戻すことは、はるかにゆっくりと溶解するように設計されているため困難である可能性がある。同様の研究が、ｍＲＮＡ及びＲＮＡウイルスを用いて３７℃で行われ、ポリ無水物材料中のみ安定であることが見出された。
【0299】
実施例３：細胞外小胞
ＴＰＡＶ／ｍＫＡＴＥ発現カセットを、重複するオリゴによって商業的に合成されたプラスミドからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、５’ＵＴＲの前にＴ７プロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’）を含む。ＰＣＲ産物（５μｇ）を、Ｔ７ポリメラーゼを連続的に発現するように以前に操作したＡ５４９細胞（Ａ５４９－Ｔ７細胞）にＤＥＡデキストラン及び１０％のグリセロールショックによってトランスフェクションした。トランスフェクション試薬をすすぎ、２時間後に血清なしで標準培地と交換した。３日後、上清を採取し、３０００ｇで遠心分離し、０．２μｍのフィルターで２回濾過し、４０ｍｌのうち１００μｌを、Ｔ７ポリメラーゼを含まないＨＥＬＡ細胞を含有する６ウェルプレートに戻した。細胞を４日間観察し、２日後にｍＫＡＴＥの蛍光を観察した（図７）。赤色蛍光の明るさと蛍光細胞の数は、全期間にわたって増加した。
ＴＰＡＶ／ｍＫＡＴＥ発現カセットを、重複するオリゴによって商業的に合成されたプラスミドからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、５’ＵＴＲの前にＴ７プロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’）を含む。ＰＣＲ産物（５μｇ）を、Ｔ７ポリメラーゼを連続的に発現するように以前に操作したＡ５４９細胞（Ａ５４９－Ｔ７細胞）にＤＥＡデキストラン及び１０％のグリセロールショックによってトランスフェクションした。トランスフェクション試薬をすすぎ、２時間後に血清なしで標準培地と交換した。３日後、上清を採取し、３０００ｇで遠心分離し、０．２μｍのフィルターで２回濾過し、４０ｍｌのうち１００μｌを、Ｔ７ポリメラーゼを含まないＨＥＬＡ細胞を含有する６ウェルプレートに戻した。細胞を４日間観察し、２日後にｍＫＡＴＥの蛍光を観察した（図７）。赤色蛍光の明るさと蛍光細胞の数は、全期間にわたって増加した。
【0300】
高速超遠心分離を使用してＥＶをスピンダウンし、最終産物を１００μｌの水中に希釈した。次いで、それを５００倍希釈し、走査型電子顕微鏡によって画像化した。同時に、ＥＶは、ナノサイト粒子イメージャによって画像化された（図８）。ｍＫＡＴＥ ｍＲＮＡは、市販のキットによって採取されたＥＶから検出され、転写産物が組み込まれており、４℃で保存された事前に浄化された細胞培養上清からＥＶが採取される前の１週間、分解から保護されていることを示唆している（図９）。
【0301】
実施例４：ＲＮＡタンパク質結合ドメイン
脂質膜又はＭＶＰタンパク質のいずれかを標的とするＲＮＡタンパク質結合ドメイン（配列番号１１）を組み込む追加のＴＰＡＶ及びｘｒＲＮＡシステムを開発した。これらは、エクソソームへのｍＲＮＡの組み込みを増強する。発現カセットの末端にＴ７終止配列を含めることで、切断して線状プラスミドをトランスフェクションする必要がなく、未切断のＤＮＡプラスミドを転写のために細胞内にトランスフェクションすることができることを確実にする。ＭＶＰタンパク質結合ドメインの使用はまた、Ｔ７ポリメラーゼを介して転写を受けた細胞の溶解後のＲＮＡの捕捉のためにカラム上に固定化されたタンパク質の組換えバージョンを使用したＲＮＡの捕捉を可能にする。
脂質膜又はＭＶＰタンパク質のいずれかを標的とするＲＮＡタンパク質結合ドメイン（配列番号１１）を組み込む追加のＴＰＡＶ及びｘｒＲＮＡシステムを開発した。これらは、エクソソームへのｍＲＮＡの組み込みを増強する。発現カセットの末端にＴ７終止配列を含めることで、切断して線状プラスミドをトランスフェクションする必要がなく、未切断のＤＮＡプラスミドを転写のために細胞内にトランスフェクションすることができることを確実にする。ＭＶＰタンパク質結合ドメインの使用はまた、Ｔ７ポリメラーゼを介して転写を受けた細胞の溶解後のＲＮＡの捕捉のためにカラム上に固定化されたタンパク質の組換えバージョンを使用したＲＮＡの捕捉を可能にする。
【0302】
実施例５：二重発現システム
ポリオウイルス由来のＩＲＥＳ配列及びコオロギ麻痺ウイルス由来の別のＩＲＥＳを組み込んだ二重発現システムを開発した。このシステムは、２つのタンパク質の二重発現を可能にする。ワクチンのための２つのタンパク質の発現が可能である。多重クローニング部位を有する重鎖及び軽鎖抗体配列の包含はまた、抗体がＣＤＲ３領域によってクローニングされ、フレーム内で抗体とライゲーションされることを可能にする（１つは軽鎖用であり、１つは重鎖用である）。次いで、これは、体内で作製及び分泌される治療用抗体の生成のために、ワクチン接種された動物／ヒトにおける標的細胞内での完全な重鎖及び軽鎖の二重発現を可能にする。
ポリオウイルス由来のＩＲＥＳ配列及びコオロギ麻痺ウイルス由来の別のＩＲＥＳを組み込んだ二重発現システムを開発した。このシステムは、２つのタンパク質の二重発現を可能にする。ワクチンのための２つのタンパク質の発現が可能である。多重クローニング部位を有する重鎖及び軽鎖抗体配列の包含はまた、抗体がＣＤＲ３領域によってクローニングされ、フレーム内で抗体とライゲーションされることを可能にする（１つは軽鎖用であり、１つは重鎖用である）。次いで、これは、体内で作製及び分泌される治療用抗体の生成のために、ワクチン接種された動物／ヒトにおける標的細胞内での完全な重鎖及び軽鎖の二重発現を可能にする。
【0303】
重鎖抗体の下流生成のためにコオロギ麻痺ウイルスＩＲＥＳを使用し、軽鎖抗体のためにＴＰＡＶ／ｘｒＲＮＡシステムを使用して上流を使用するシステムも開発された。目的は、インビボで治療薬の抗体を作製するために、このｍＲＮＡを使用することである。
【0304】
実施例６：追加の発現システム
いくつもの新しい発現システムが試験のために開発された。第１のシステムは、他のコードと併せてコオロギ麻痺ウイルスＩＲＥＳ（配列番号１８）を使用する。第２のコードは、他のコードと併せてコムギモザイクウイルス（ＴＲＩＭＶ）ＩＲＥＳ（配列番号１９）を使用する。トマトブッシースタントウイルス（配列番号２０及び２１）由来の両方又は単一のＵＴＲのいずれかを使用する２つの追加のシステムを開発した。
いくつもの新しい発現システムが試験のために開発された。第１のシステムは、他のコードと併せてコオロギ麻痺ウイルスＩＲＥＳ（配列番号１８）を使用する。第２のコードは、他のコードと併せてコムギモザイクウイルス（ＴＲＩＭＶ）ＩＲＥＳ（配列番号１９）を使用する。トマトブッシースタントウイルス（配列番号２０及び２１）由来の両方又は単一のＵＴＲのいずれかを使用する２つの追加のシステムを開発した。
【0305】
実施例７：自己切断カセット
自己切断ペプチドを使用する多シストロン性システムを試験した。ｍＲＮＡ構築物上の２つのコード配列の間に配置された二重２Ａ、ＴＡ２ペプチドの使用は、両方のタンパク質のほぼ１：１の発現レベルを可能にした（図１０）。これは、コード配列間のＩＲＥＳの従来の使用が多くの場合下流遺伝子の発現不良につながるため、珍しい。したがって、ｍＲＮＡ構築物は、同じｍＲＮＡ構築物から１、２個、又はそれ以上のタンパク質を作製するように設計され得る。二重ペプチドは、タンパク質のより多くが融合ではなく別々のタンパク質であることを保証する。このシステムは、同じＡＰＣ内に２つ以上のｆｌｕタンパク質を発現し、複数のｍＲＮＡ構築物に対して製造コストを削減するための選択肢である。
自己切断ペプチドを使用する多シストロン性システムを試験した。ｍＲＮＡ構築物上の２つのコード配列の間に配置された二重２Ａ、ＴＡ２ペプチドの使用は、両方のタンパク質のほぼ１：１の発現レベルを可能にした（図１０）。これは、コード配列間のＩＲＥＳの従来の使用が多くの場合下流遺伝子の発現不良につながるため、珍しい。したがって、ｍＲＮＡ構築物は、同じｍＲＮＡ構築物から１、２個、又はそれ以上のタンパク質を作製するように設計され得る。二重ペプチドは、タンパク質のより多くが融合ではなく別々のタンパク質であることを保証する。このシステムは、同じＡＰＣ内に２つ以上のｆｌｕタンパク質を発現し、複数のｍＲＮＡ構築物に対して製造コストを削減するための選択肢である。
【0306】
実施例８：追加のｍＲＮＡ構築物の比較
追加のｍＲＮＡ構築物をＴ７ ＢＨＫ細胞で発現させた。様々な構築物からの発現レベルは、レポータータンパク質の高レベルの発現を示した。試験したものの中で、３’ｘｒＲＮＡを有するＳＣＮＭＶ及びＴＰＡＶは、ｍＣｈｅｒｒｙ（図１１）及びＥＶへの組み込みのためのｍＲＮＡ（図示せず）の最も好ましいタンパク質発現をもたらした。これらのデータは、高レベルの発現を確実にするために、個々のＵＴＲを目的の遺伝子に調整する能力を実証する。
追加のｍＲＮＡ構築物をＴ７ ＢＨＫ細胞で発現させた。様々な構築物からの発現レベルは、レポータータンパク質の高レベルの発現を示した。試験したものの中で、３’ｘｒＲＮＡを有するＳＣＮＭＶ及びＴＰＡＶは、ｍＣｈｅｒｒｙ（図１１）及びＥＶへの組み込みのためのｍＲＮＡ（図示せず）の最も好ましいタンパク質発現をもたらした。これらのデータは、高レベルの発現を確実にするために、個々のＵＴＲを目的の遺伝子に調整する能力を実証する。
【0307】
ｍＲＮＡ構築物は、５’ＵＴＲのｘｒＲＮＡの前に１０ｂｐのリーダーを有し、したがって、示されるより低い発現は、５’末端ですぐ開始するｘｒＲＮＡで遮断されることよりもむしろ、転写産物へのアクセスを得るｘｒＲＮＡ由来であり得る。将来の研究は、３’ｘｒＲＮＡ ＵＴＲと比較するために５’ｘｒＲＮＡを最適化する。
【0308】
追加のｍＲＮＡ構築物を表１に要約する。
【表1】
【0309】
実施例９：ｍＲＮＡワクチン接種
マウスに、Ｈ３Ｎ８由来のｒＨＡで１回又は２回、ＥＶ中の正しい若しくは逆方向のＨ３Ｎ８ ＨＡ、又はリポソーム中のβ－アクチン（ＵＴＲ）キャップ及びテールが付いたＨ３Ｎ８ ＨＡについてのＴＰＡＶカセット上のＡｌｕｍ又はｍＲＮＡで、ワクチン接種した。血球凝集阻害（ＨＡＩ）を評価した（図１２）。ｍＲＮＡワクチンは、中和抗体を誘発する点でＦｌｕ ＨＡタンパク質より優れた。これらのデータは、ｍＲＮＡ構築物がｆｌｕチャレンジからの保護をもたらし得ることを強く示す。
マウスに、Ｈ３Ｎ８由来のｒＨＡで１回又は２回、ＥＶ中の正しい若しくは逆方向のＨ３Ｎ８ ＨＡ、又はリポソーム中のβ－アクチン（ＵＴＲ）キャップ及びテールが付いたＨ３Ｎ８ ＨＡについてのＴＰＡＶカセット上のＡｌｕｍ又はｍＲＮＡで、ワクチン接種した。血球凝集阻害（ＨＡＩ）を評価した（図１２）。ｍＲＮＡワクチンは、中和抗体を誘発する点でＦｌｕ ＨＡタンパク質より優れた。これらのデータは、ｍＲＮＡ構築物がｆｌｕチャレンジからの保護をもたらし得ることを強く示す。
【0310】
実施例１０：裸ｍＲＮＡトランスフェクション
Ｔ７を有しないＡ５４９細胞を、Ｒｉｂｏｊｕｉｃｅリポソームを使用して、偽、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するブタカセット、又はｍＣｈｅｒｒｙを発現する市販のｍＲＮＡ（修飾Ｕ／Ｃ、Ａｒｃｏキャップ、及びテールが付いた）でトランスフェクションした。修飾塩基、５’キャップ、及びポリ（Ａ）テールを使用した市販のｍＲＮＡと比較したｍＲＮＡの実際の発現（図１３）。これらのデータは、本開示のｍＲＮＡ構築物が、動物に注射された場合に、したがって免疫応答を誘発するはずである高レベルでそれらの遺伝子を発現するはずであることを示唆する。
Ｔ７を有しないＡ５４９細胞を、Ｒｉｂｏｊｕｉｃｅリポソームを使用して、偽、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するブタカセット、又はｍＣｈｅｒｒｙを発現する市販のｍＲＮＡ（修飾Ｕ／Ｃ、Ａｒｃｏキャップ、及びテールが付いた）でトランスフェクションした。修飾塩基、５’キャップ、及びポリ（Ａ）テールを使用した市販のｍＲＮＡと比較したｍＲＮＡの実際の発現（図１３）。これらのデータは、本開示のｍＲＮＡ構築物が、動物に注射された場合に、したがって免疫応答を誘発するはずである高レベルでそれらの遺伝子を発現するはずであることを示唆する。
【0311】
実施例１１：ポリ無水物ナノ粒子中のｍＲＮＡの安定性
熱安定性アッセイは、ポリ無水物に配置されたｍＲＮＡ構築物が、３７℃で７日後に熱からの分解に対する耐性を示すことを実証した（図１４）。従来のＩＶＴ生成ｍＲＮＡは、このレベルの熱安定性を有していなかった。したがって、ｍＲＮＡは、ポリ無水物ナノ粒子又はロッド内に配置された場合、室温で安定であるはずである。
熱安定性アッセイは、ポリ無水物に配置されたｍＲＮＡ構築物が、３７℃で７日後に熱からの分解に対する耐性を示すことを実証した（図１４）。従来のＩＶＴ生成ｍＲＮＡは、このレベルの熱安定性を有していなかった。したがって、ｍＲＮＡは、ポリ無水物ナノ粒子又はロッド内に配置された場合、室温で安定であるはずである。
【0312】
実施例１２：環状ＲＮＡ構築物
５’三リン酸を除去し、単一のリン酸基をキナーゼで付加することにより、本開示のｍＲＮＡ構築物をＲＮＡリガーゼ１で環化することができる（図１５）。環状ＲＮＡを使用することは、修飾塩基を含む必要性を更に緩和し、また、線状ｓｓＲＮＡ（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２と同様にｄｓＲＮＡではない）のみをライゲーションするＴ４ ＲＮＡリガーゼ１を使用することによって、ｄｓＲＮＡ及び短いＲＮＡ産物の消化を可能にする。これにより、ｄｓＲＮＡ及び短い産物を除去するための製造プロセスのステップをスキップすることができる。
５’三リン酸を除去し、単一のリン酸基をキナーゼで付加することにより、本開示のｍＲＮＡ構築物をＲＮＡリガーゼ１で環化することができる（図１５）。環状ＲＮＡを使用することは、修飾塩基を含む必要性を更に緩和し、また、線状ｓｓＲＮＡ（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２と同様にｄｓＲＮＡではない）のみをライゲーションするＴ４ ＲＮＡリガーゼ１を使用することによって、ｄｓＲＮＡ及び短いＲＮＡ産物の消化を可能にする。これにより、ｄｓＲＮＡ及び短い産物を除去するための製造プロセスのステップをスキップすることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【配列表】
【国際調査報告】