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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-28
(54)【発明の名称】フェリチン重鎖１発現のアップレギュレーション
(51)【国際特許分類】
C07K 4/12 20060101AFI20250220BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250220BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250220BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250220BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20250220BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20250220BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20250220BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20250220BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20250220BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20250220BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20250220BHJP
A61K 9/50 20060101ALI20250220BHJP
A61K 9/127 20250101ALI20250220BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20250220BHJP
【ＦＩ】
C07K4/12
C12N5/10 ZNA
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N5/071
A61K38/08
A61P7/06
A61K47/12
A61K47/10
A61K47/46
A61K47/42
A61K9/50
A61K9/127
A61K9/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024546221
(86)(22)【出願日】2023-02-03
(85)【翻訳文提出日】2024-08-27
(86)【国際出願番号】 US2023061975
(87)【国際公開番号】W WO2023150705
(87)【国際公開日】2023-08-10
(31)【優先権主張番号】63/306,978
(32)【優先日】2022-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524289905
【氏名又は名称】エイチビーシー イミュノロジー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】フラムローズ， ボミ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90Y
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB12
4B065BB14
4B065BB19
4B065BB25
4B065BB34
4B065BC03
4B065BC07
4B065BC11
4B065BD16
4B065CA26
4B065CA41
4B065CA44
4C076AA19
4C076AA31
4C076AA64
4C076BB01
4C076BB02
4C076BB29
4C076DD41N
4C076EE23N
4C076EE41N
4C076EE56
4C076FF34
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA17
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA60
4C084NA14
4C084ZA551
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA53
4H045CA52
4H045EA01
4H045EA20
4H045FA70
4H045FA74
4H045GA25
(57)【要約】
本開示は、哺乳動物細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）の発現を増加可能な単離されたオリゴペプチド、ならびにそのオリゴペプチドの製剤に関する。前記製剤は、鉄欠乏および／または貧血に関連する、疾患または状態を処置するために適している。本開示の単離されたオリゴペプチドはＸｍ（Ｒ／Ｄ）ＥＥＳ（Ｇ／Ｄ）（Ｅ／Ｋ）Ｘｎ（コンセンサス番号１）のアミノ酸配列からなり、ｍおよびｎは０～１０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｘｍ（Ｒ／Ｄ）ＥＥＳ（Ｇ／Ｄ）（Ｅ／Ｋ）Ｘｎ（コンセンサス番号１）のアミノ酸配列からなる単離されたオリゴペプチドであって、ｍおよびｎは０～１０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される、単離されたオリゴペプチド。
【請求項2】
ＸｊＲＥＥＳＤＫＰＸｋ（配列番号１８）のアミノ酸配列からなる単離されたオリゴペプチドであって、ｊは０～１０の範囲から選択される整数であり、ｋは０～９の範囲から選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される、単離されたオリゴペプチド。
【請求項3】
ＸｇＲＥＥＳＤＫＰ（ＸｈＸｉ）（配列番号１９）のアミノ酸配列を含み、Ｘｇはプロリンであるかまたは存在せず、ＸｈＸｉはメチオニンおよびチロシンであるかまたは存在しない、請求項２に記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項4】
ＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項5】
ＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項6】
ＲＥＥＳＧＥＬ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項7】
ＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）、ＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）、ＲＥＥＳＧＥＬ（配列番号８）、ＲＥＥＳＧＥ（配列番号１）、ＲＥＥＳＧＥＰ（配列番号２）、ＫＥＥＤＥＥＳＧＥ（配列番号３）、ＫＰＲＥＥＳＧＥ（配列番号４）、またはＬＤＥＥＳＧＥＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項8】
前記オリゴペプチドと接触させた哺乳動物細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加可能である、請求項７に記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項9】
請求項８に記載の単離されたオリゴペプチドと少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、製剤。
【請求項10】
請求項８に記載の単離されたオリゴペプチドと経口送達剤とを含む、製剤。
【請求項11】
前記経口送達剤が吸収促進剤、脂肪酸、酵素阻害剤、ポリエチレングリコール、粘膜付着性ポリマー、細胞透過性ペプチド、またはそれらの組合せを含む、請求項１０に記載の製剤。
【請求項12】
腸溶コーティング、リポソーム、ミクロスフェア、および／またはマイクロ粒子／ナノ粒子をさらに含む、請求項１１に記載の製剤。
【請求項13】
請求項７に記載のオリゴペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項14】
プロモーターと作動可能に組み合わされた請求項１３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載の単離された核酸または請求項１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項16】
請求項９～１２のいずれか一項に記載の製剤を含む、医薬。
【請求項17】
哺乳動物細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法であって、前記哺乳動物細胞と、ＦＴＨ１発現を増加させるために有効な量の請求項９～１２のいずれか一項に記載の製剤とを接触させること
を含む、方法。
【請求項18】
前記哺乳動物細胞が腸上皮細胞、骨格筋細胞、アストロサイト、またはマクロファージである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
接触させることがインビボで行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
フェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）発現を増加させることを必要とする哺乳動物対象においてＦＴＨ１発現を増加させるための方法であって、前記対象に、ＦＴＨ１発現を増加させるために有効な量の請求項９～１２のいずれか一項に記載の製剤を投与すること
を含む、方法。
【請求項21】
血清フェリチン濃度を増加させることを必要とする哺乳動物対象において血清フェリチン濃度を増加させるための方法であって、前記対象に、血清フェリチン濃度を増加させるために有効な量の請求項９～１２のいずれか一項に記載の製剤を投与すること
を含む、方法。
【請求項22】
疾患または状態を処置または予防することを必要とする哺乳動物対象において疾患または状態を処置または予防するための方法であって、前記対象に、前記疾患または状態を処置または予防するために有効な量の請求項９～１２のいずれか一項に記載の製剤を投与すること
を含む、方法。
【請求項23】
前記疾患または状態が鉄欠乏に関連する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記疾患または状態が貧血に関連する、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記疾患または状態がレストレスレッグス症候群である、請求項２２に記載の方法。
【請求項26】
前記製剤が口から投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記製剤が経腸投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記製剤が頬側経路、唇下経路、または舌下経路によって投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記哺乳動物対象がヒト対象である、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記ヒト対象ががんを有しない、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２２年２月４日に出願された米国特許仮出願第６３／３０６，９７８号の優先権および利益を主張し、この米国特許仮出願の内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２２年２月４日に出願された米国特許仮出願第６３／３０６，９７８号の優先権および利益を主張し、この米国特許仮出願の内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
（電子配列表の参照）
電子配列表（１９７７３２０００７４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ；サイズ：１８，６８４バイト；および作成日：２０２３年１月３１日）の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
電子配列表（１９７７３２０００７４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ；サイズ：１８，６８４バイト；および作成日：２０２３年１月３１日）の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0003】
（分野）
本開示は、上皮細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）の発現を増加可能な単離されたオリゴペプチド、ならびにそのオリゴペプチドの製剤に関する。前記製剤は、鉄欠乏および／または貧血に関連する、疾患または状態を処置するために適している。
本開示は、上皮細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）の発現を増加可能な単離されたオリゴペプチド、ならびにそのオリゴペプチドの製剤に関する。前記製剤は、鉄欠乏および／または貧血に関連する、疾患または状態を処置するために適している。
【背景技術】
【0004】
（背景）
ミルク、水または他の飲料と混合したタンパク質粉末は、筋肉量および筋力を増加させることにより活動的な成人が身体の性能を改善することを支援すると報告されている、一般的なダイエタリー・サプリメントである（Ｐａｓｉａｋｏｓら、Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ、４５：１１１～１３１、２０１５）。また、タンパク質サプリメントは、持久力トレーニングおよび損傷からの回復の途中にあるアスリートにとって有益であり得る。さらに、タンパク質サプリメントとしてのサケタンパク質加水分解産物の消費は、鉄欠乏性貧血に罹患している患者において血清ヘモグロビンレベルを増加させることが公知である（Ｂｏｍｉら、Ｊ Ｎｕｔｒ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ、５：４、２０１５）。
しかし、タンパク質粉末は非常に複雑な組成物であり、一部の製造業者に由来するサプリメントは添加糖類または毒性混入物を含み得る。したがって、当該分野において必要とされる物は、望ましい特性を有する単離されたオリゴペプチドおよびそのオリゴペプチドの製剤である。特に、生物活性オリゴペプチドが豊富な製剤が、必要とされる。
ミルク、水または他の飲料と混合したタンパク質粉末は、筋肉量および筋力を増加させることにより活動的な成人が身体の性能を改善することを支援すると報告されている、一般的なダイエタリー・サプリメントである（Ｐａｓｉａｋｏｓら、Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ、４５：１１１～１３１、２０１５）。また、タンパク質サプリメントは、持久力トレーニングおよび損傷からの回復の途中にあるアスリートにとって有益であり得る。さらに、タンパク質サプリメントとしてのサケタンパク質加水分解産物の消費は、鉄欠乏性貧血に罹患している患者において血清ヘモグロビンレベルを増加させることが公知である（Ｂｏｍｉら、Ｊ Ｎｕｔｒ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ、５：４、２０１５）。
しかし、タンパク質粉末は非常に複雑な組成物であり、一部の製造業者に由来するサプリメントは添加糖類または毒性混入物を含み得る。したがって、当該分野において必要とされる物は、望ましい特性を有する単離されたオリゴペプチドおよびそのオリゴペプチドの製剤である。特に、生物活性オリゴペプチドが豊富な製剤が、必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｐａｓｉａｋｏｓら、Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ、４５：１１１～１３１、２０１５
【非特許文献2】Ｂｏｍｉら、Ｊ Ｎｕｔｒ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ、５：４、２０１５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
（概要）
本開示は、上皮細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）の発現を増加可能な単離されたオリゴペプチド、ならびにそのオリゴペプチドの製剤に関する。前記製剤は、鉄欠乏および／または貧血に関連する、疾患または状態を処置するために適している。
本開示は、上皮細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）の発現を増加可能な単離されたオリゴペプチド、ならびにそのオリゴペプチドの製剤に関する。前記製剤は、鉄欠乏および／または貧血に関連する、疾患または状態を処置するために適している。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【発明を実施するための形態】
【0008】
（詳細な説明）
本開示は、上皮細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）の発現を増加可能な単離されたオリゴペプチド、ならびにそのオリゴペプチドの製剤に関する。前記製剤は、鉄欠乏および／または貧血に関連する、疾患または状態を処置するために適している。
本開示は、上皮細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）の発現を増加可能な単離されたオリゴペプチド、ならびにそのオリゴペプチドの製剤に関する。前記製剤は、鉄欠乏および／または貧血に関連する、疾患または状態を処置するために適している。
【0009】
（定義）
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ある）（ａ）」、「または（もしくは）（あるいは）（ｏｒ）」および「その（前記）（上記）（ｔｈｅ）」は、文脈が特に指示しない限りは、複数の指示物を含む。例えば、「（１つの）賦形剤」は１つまたは複数の賦形剤を含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ある）（ａ）」、「または（もしくは）（あるいは）（ｏｒ）」および「その（前記）（上記）（ｔｈｅ）」は、文脈が特に指示しない限りは、複数の指示物を含む。例えば、「（１つの）賦形剤」は１つまたは複数の賦形剤を含む。
【0010】
「含む」と本明細書において記載されている態様および実施形態は「からなる」および／または「から本質的になる」の態様ならびに実施形態を含むことが、理解される。
【0011】
値に関して本明細書において使用される用語「約」とは、その値の９０％から１１０％までを記載する。例えば、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡ発現における約２倍の変化は、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡにおける１．８倍から２．２倍までの変化を含み、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡにおける２．０倍の変化を含む。
【0012】
本明細書において使用される場合、用語「フェリチン重鎖１」および「ＦＴＨ１」とは、「フェリチン重鎖」タンパク質（これは「フェリチンＨサブユニット」としても知られている）をコードする核酸配列を指す。ヒトフェリチン重鎖のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２０２３として示されており、そのｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２０３２として示されており、そのコード配列はヌクレオチド２１０～７６１に広がる。
【0013】
分子（例えば、オリゴペプチド）に関して本明細書において使用される用語「単離された」とは、天然環境または合成環境から取り出されたかもしくは他の方法で精製された、分子を指す。実質的に「単離された」分子は、他の成分を少なくとも７５％含まず、好ましくは少なくとも９０％含まず、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％含まない。例えば、「配列番号１８のアミノ酸配列からなる単離されたオリゴペプチド」は、配列番号１８のアミノ酸配列を含まないペプチドおよびタンパク質を少なくとも少なくとも７５％含まない。
【0014】
ＦＴＨ１ ｍＲＮＡの発現またはレベルに関して本明細書において使用される用語「増加させること」および文法上の同等物は、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡの量をより大きくすることを指す。好ましくは、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡにおける増加は統計的に有意な増加を含み、好ましくは、約２倍～約２００倍、約２倍～２０倍、もしくは約２倍～４倍の増加、好ましくは少なくとも２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍もしくは３．５倍の増加を含む。
【0015】
本明細書において使用される場合、用語「処置すること」および「処置」とは、有益な結果または望ましい結果（臨床結果を含む）を得るためのアプローチを指す。有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、検出可能であるか検出不能であるかに関わらず、１つもしくは複数の症状の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の拡散を防止すること、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的であるか全体的であるかに関わらず）が挙げられるが、それらに限定はされない。したがって、本明細書において使用される用語「処置すること」および「処置」は、兆候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には、個体に対してささやかな効果を有するプロトコルを含む。
【0016】
本明細書において開示されている薬剤（例えば、単離されたオリゴペプチドまたはそのオリゴペプチドの製剤）の「有効量」とは、具体的に記載された目的を実行するために十分な量である。「有効量」は、その記載された目的に関して経験的に決定され得る。薬剤の「有効量」または「十分な量」とは、望ましい生物学的効果（例えば、有益な結果（有益な臨床結果を含む））をもたらすために十分な量である。用語「治療有効量」とは、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において疾患または障害を「処置する」ために有効な薬剤（例えば、単離されたオリゴペプチドまたはそのオリゴペプチドの製剤）の量を指す。薬剤の「有効量」または「十分な量」は、１回または複数回の用量で投与され得る。
【0017】
用語「個体」および「対象」とは哺乳動物を指す。「哺乳動物」としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、農場動物、スポーツ動物、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）ならびにペット（例えば、イヌおよびネコ）が挙げられるが、それらに限定はされない。
【0018】
（Ｉ．単離されたオリゴペプチド）
本開示の単離されたオリゴペプチドはＸｍ（Ｒ／Ｄ）ＥＥＳ（Ｇ／Ｄ）（Ｅ／Ｋ）Ｘｎ（コンセンサス番号１）のアミノ酸配列からなり、ｍおよびｎは０～１０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される。具体的には、一部の実施形態において、ｍおよびｎの整数は各々、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される。したがって、本特許請求されるオリゴペプチドは６残基長～２６残基長である。一部の実施形態において、前記オリゴペプチドは６残基長以上、７残基長以上、８残基長以上、９残基長以上、１０残基長以上、１１残基長以上、１２残基長以上、１３残基長以上、１４残基長以上、１５残基長以上、１６残基長以上、１７残基長以上、１８残基長以上、１９残基長以上、２０残基長以上、２１残基長以上、２２残基長以上、２３残基長以上、２４残基長以上もしくは２５残基長以上であり、および／または前記オリゴペプチドは２６残基長以下、２５残基長以下、２４残基長以下、２３残基長以下、２２残基長以下、２１残基長以下、２０残基長以下、１９残基長以下、１８残基長以下、１７残基長以下、１６残基長以下、１５残基長以下、１４残基長以下、１３残基長以下、１２残基長以下、１１残基長以下、１０残基長以下、９残基長以下、８残基長以下、もしくは７残基長以下であり、その下限はその上限よりも小さい。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＧＥ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＧＥＰ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＫＥＥＤＥＥＳＧＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＫＰＲＥＥＳＧＥ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＬＤＥＥＳＧＥＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＧＥＬ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドは、配列番号１～８のいずれか１つに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本開示の単離されたオリゴペプチドはＸｊＲＥＥＳＤＫＰＸｋ（コンセンサス番号２／配列番号１８）のアミノ酸配列からなり、ｊは０～１０の範囲から選択される整数であり、ｋは０～９の範囲から選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される。したがって、一部の実施形態において、本特許請求されるオリゴペプチドは７残基長～２６残基長である。一部の実施形態において、前記オリゴペプチドは７残基長以上、８残基長以上、９残基長以上、１０残基長以上、１１残基長以上、１２残基長以上、１３残基長以上、１４残基長以上、１５残基長以上、１６残基長以上、１７残基長以上、１８残基長以上、１９残基長以上、２０残基長以上、２１残基長以上、２２残基長以上、２３残基長以上、２４残基長以上もしくは２５残基長以上であり、および／または前記オリゴペプチドは２６残基長以下、２５残基長以下、２４残基長以下、２３残基長以下、２２残基長以下、２１残基長以下、２０残基長以下、１９残基長以下、１８残基長以下、１７残基長以下、１６残基長以下、１５残基長以下、１４残基長以下、１３残基長以下、１２残基長以下、１１残基長以下、１０残基長以下、９残基長以下、もしくは８残基長以下であり、その下限はその上限よりも小さい。一部の実施形態において、前記オリゴペプチドはＸｇＲＥＥＳＤＫＰ（ＸｈＸｉ）（コンセンサス番号３／配列番号１９）のアミノ酸配列を含み、Ｘｇはプロリン（Ｐ）であるかまたは存在せず、ＸｈＸｉはメチオニンおよびチロシン（ＭＹ）であるかまたは存在しない。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）のアミノ酸配列またはＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。
本開示の単離されたオリゴペプチドはＸｍ（Ｒ／Ｄ）ＥＥＳ（Ｇ／Ｄ）（Ｅ／Ｋ）Ｘｎ（コンセンサス番号１）のアミノ酸配列からなり、ｍおよびｎは０～１０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される。具体的には、一部の実施形態において、ｍおよびｎの整数は各々、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される。したがって、本特許請求されるオリゴペプチドは６残基長～２６残基長である。一部の実施形態において、前記オリゴペプチドは６残基長以上、７残基長以上、８残基長以上、９残基長以上、１０残基長以上、１１残基長以上、１２残基長以上、１３残基長以上、１４残基長以上、１５残基長以上、１６残基長以上、１７残基長以上、１８残基長以上、１９残基長以上、２０残基長以上、２１残基長以上、２２残基長以上、２３残基長以上、２４残基長以上もしくは２５残基長以上であり、および／または前記オリゴペプチドは２６残基長以下、２５残基長以下、２４残基長以下、２３残基長以下、２２残基長以下、２１残基長以下、２０残基長以下、１９残基長以下、１８残基長以下、１７残基長以下、１６残基長以下、１５残基長以下、１４残基長以下、１３残基長以下、１２残基長以下、１１残基長以下、１０残基長以下、９残基長以下、８残基長以下、もしくは７残基長以下であり、その下限はその上限よりも小さい。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＧＥ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＧＥＰ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＫＥＥＤＥＥＳＧＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＫＰＲＥＥＳＧＥ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＬＤＥＥＳＧＥＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＧＥＬ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドは、配列番号１～８のいずれか１つに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本開示の単離されたオリゴペプチドはＸｊＲＥＥＳＤＫＰＸｋ（コンセンサス番号２／配列番号１８）のアミノ酸配列からなり、ｊは０～１０の範囲から選択される整数であり、ｋは０～９の範囲から選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される。したがって、一部の実施形態において、本特許請求されるオリゴペプチドは７残基長～２６残基長である。一部の実施形態において、前記オリゴペプチドは７残基長以上、８残基長以上、９残基長以上、１０残基長以上、１１残基長以上、１２残基長以上、１３残基長以上、１４残基長以上、１５残基長以上、１６残基長以上、１７残基長以上、１８残基長以上、１９残基長以上、２０残基長以上、２１残基長以上、２２残基長以上、２３残基長以上、２４残基長以上もしくは２５残基長以上であり、および／または前記オリゴペプチドは２６残基長以下、２５残基長以下、２４残基長以下、２３残基長以下、２２残基長以下、２１残基長以下、２０残基長以下、１９残基長以下、１８残基長以下、１７残基長以下、１６残基長以下、１５残基長以下、１４残基長以下、１３残基長以下、１２残基長以下、１１残基長以下、１０残基長以下、９残基長以下、もしくは８残基長以下であり、その下限はその上限よりも小さい。一部の実施形態において、前記オリゴペプチドはＸｇＲＥＥＳＤＫＰ（ＸｈＸｉ）（コンセンサス番号３／配列番号１９）のアミノ酸配列を含み、Ｘｇはプロリン（Ｐ）であるかまたは存在せず、ＸｈＸｉはメチオニンおよびチロシン（ＭＹ）であるかまたは存在しない。一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドはＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）のアミノ酸配列またはＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。
【0019】
好ましい実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドは、そのオリゴペプチドと接触させた腸上皮細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加可能である。前記オリゴペプチドとの接触の結果としてのＦＴＨ１ ｍＲＮＡの発現における増加は、前記オリゴペプチドと接触させていない腸上皮細胞（例えば、ベースライン）との比較、前記オリゴペプチドの不在以外は同じ条件下で培養された腸上皮細胞との比較、または陰性対照オリゴペプチド（例えば、ほぼ同じ長さであるがコンセンサス番号１を含まないオリゴペプチド）の存在以外は同じ条件下で培養された腸上皮細胞との比較である。一部の実施形態において、前記腸上皮細胞は哺乳動物細胞である。一部の好ましい実施形態において、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である。例示的な実施形態において、前記腸上皮細胞はＨＩＥＣ－６細胞である。他の実施形態において、前記腸上皮細胞は初代ヒト腸上皮細胞である。
【0020】
一部の好ましい実施形態において、前記オリゴペプチドは合成により作製される。例示的な実施形態において、前記オリゴペプチドは、当該分野において公知であるとおりに固相合成によって作製され、高速液体クロマトグラフィーによって精製される。たとえそうであっても、本開示はまた、前記オリゴペプチドをコードする単離された核酸も提供する。前記核酸は、プロモーターと作動可能に組み合わされて、発現カセットまたは発現ベクター中に存在し得る。前記単離された核酸、発現カセットまたは発現ベクターを含む、宿主細胞もまた、前記オリゴペプチドの組換え発現のために提供される。
【0021】
（ＩＩ．製剤）
本開示は、上記の節の少なくとも１種の単離されたオリゴペプチドと、少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤および／または経口送達剤とを含む、製剤を提供する。一部の実施形態において、前記製剤は、腸溶コーティング、リポソーム、ミクロスフェア、またはマイクロ粒子／ナノ粒子をさらに含み得る。例えば、一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドは、腸溶コーティング、リポソーム、ミクロスフェア、またはマイクロ粒子／ナノ粒子内に封入される。しかし、前記製剤のオリゴペプチドは単離されているので、本開示の製剤は魚タンパク質加水分解産物、例えば、サケタンパク質加水分解産物を含まない。
本開示は、上記の節の少なくとも１種の単離されたオリゴペプチドと、少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤および／または経口送達剤とを含む、製剤を提供する。一部の実施形態において、前記製剤は、腸溶コーティング、リポソーム、ミクロスフェア、またはマイクロ粒子／ナノ粒子をさらに含み得る。例えば、一部の実施形態において、前記単離されたオリゴペプチドは、腸溶コーティング、リポソーム、ミクロスフェア、またはマイクロ粒子／ナノ粒子内に封入される。しかし、前記製剤のオリゴペプチドは単離されているので、本開示の製剤は魚タンパク質加水分解産物、例えば、サケタンパク質加水分解産物を含まない。
【0022】
本開示のオリゴペプチドの量（これは、本明細書において開示されている特定の障害または状態の処置において有効である）はその障害または疾患の性質に依存し、その量は、標準の臨床的技術によって決定され得る。さらに、インビトロアッセイまたはインビボアッセイが、最適な投与量範囲を特定するのを支援するために、必要に応じて使用され得る。一部の実施形態において、本開示のオリゴペプチドの用量は、処置されるべき対象の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１．０ｍｇ～約１００ｍｇ、または約１０ｍｇである。一部の実施形態において、オリゴペプチドの用量は０．１ｍｇ／ｋｇ以上、０．５ｍｇ／ｋｇ以上、１．０ｍｇ／ｋｇ以上、５．０ｍｇ／ｋｇ以上、１０ｍｇ／ｋｇ以上、２０ｍｇ／ｋｇ以上、３０ｍｇ／ｋｇ以上、４０ｍｇ／ｋｇ以上、５０ｍｇ／ｋｇ以上、６０ｍｇ／ｋｇ以上、７０ｍｇ／ｋｇ以上、８０ｍｇ／ｋｇ以上、９０ｍｇ／ｋｇ以上、１００ｍｇ／ｋｇ以上、もしくは５００ｍｇ／ｋｇ以上であり、および／または前記オリゴペプチドの用量は１０００ｍｇ／ｋｇ以下、５００ｍｇ／ｋｇ以下、１００ｍｇ／ｋｇ以下、９０ｍｇ／ｋｇ以下、８０ｍｇ／ｋｇ以下、７０ｍｇ／ｋｇ以下、６０ｍｇ／ｋｇ以下、５０ｍｇ／ｋｇ以下、４０ｍｇ／ｋｇ以下、３０ｍｇ／ｋｇ以下、２０ｍｇ／ｋｇ以下、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５．０ｍｇ／ｋｇ以下、１．０ｍｇ／ｋｇ以下、もしくは０．５ｍｇ／ｋｇであり、その下限はその上限よりも小さい。
【0023】
（Ａ．賦形剤）
本開示の薬学的に受容可能な賦形剤としては、例えば、溶媒、増量剤、緩衝剤、張度調整剤、および保存剤（Ｐｒａｍａｎｉｃｋら、Ｐｈａｒｍａ Ｔｉｍｅｓ、４５：６５～７７、２０１３）が挙げられる。一部の実施形態において、前記製剤は、溶媒、増量剤、緩衝剤、および張度調整剤のうちの１つまたは複数として機能する賦形剤を含み得る（例えば、生理食塩水中の塩化ナトリウムは水性媒体および張度調整剤の両方として役立ち得る）。
本開示の薬学的に受容可能な賦形剤としては、例えば、溶媒、増量剤、緩衝剤、張度調整剤、および保存剤（Ｐｒａｍａｎｉｃｋら、Ｐｈａｒｍａ Ｔｉｍｅｓ、４５：６５～７７、２０１３）が挙げられる。一部の実施形態において、前記製剤は、溶媒、増量剤、緩衝剤、および張度調整剤のうちの１つまたは複数として機能する賦形剤を含み得る（例えば、生理食塩水中の塩化ナトリウムは水性媒体および張度調整剤の両方として役立ち得る）。
【0024】
一部の実施形態において、前記製剤は、溶媒として水性媒体を含む。適切な媒体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、およびリンゲル液が挙げられる。一部の実施形態において、前記製剤は等張性である。
【0025】
前記製剤は緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、処理中、保管中、必要に応じて再構成中の活性薬剤の分解を阻害するためにｐＨを制御する。適切な緩衝液としては、例えば、酢酸塩を含む塩、クエン酸塩を含む塩、リン酸塩を含む塩、または硫酸塩を含む塩が挙げられる。他の適切な緩衝液としては、例えば、アミノ酸、例えば、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、およびリジンが挙げられる。前記緩衝剤は、塩酸または水酸化ナトリウムをさらに含み得る。一部の実施形態において、前記緩衝剤は、前記製剤のｐＨを６～９の範囲内で維持する。一部の実施形態において、前記ｐＨは（下限）６、７または８よりも大きい。一部の実施形態において、前記ｐＨは、（上限）９、８、または７よりも小さい。すなわち、前記ｐＨは約６～９の範囲内にあり、前記下限は前記上限よりも小さい。
【0026】
前記製剤は張度調整剤を含み得る。適切な張度調整剤としては、例えば、デキストロース、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセリンおよびマンニトールが挙げられる。
【0027】
前記製剤は増量剤を含み得る。増量剤は、前記医薬製剤が投与前に凍結乾燥される場合に特に有用である。一部の実施形態において、前記増量剤は、凍結乾燥中もしくは噴霧乾燥中および／または保管中に活性薬剤の安定化および分解防止を補助する保護剤である。適切な増量剤は、糖（単糖、二糖、および多糖）、例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコースおよびラフィノースである。
【0028】
前記製剤は保存剤を含み得る。適切な保存剤としては、例えば、抗酸化剤および抗菌剤が挙げられる。しかし、好ましい実施形態において、前記製剤は、滅菌条件下で調製され、単回使用容器中にあり、したがって、保存剤を含むことを必要としない。
【0029】
（Ｂ．経口送達薬剤）
本開示の経口送達薬剤としては、例えば、吸収促進剤、脂肪酸、酵素阻害剤、ポリエチレングリコール、粘膜付着性ポリマー、および細胞透過性ペプチド（Ｄａｎら、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ、７：３０７、２０２０）が挙げられる。
本開示の経口送達薬剤としては、例えば、吸収促進剤、脂肪酸、酵素阻害剤、ポリエチレングリコール、粘膜付着性ポリマー、および細胞透過性ペプチド（Ｄａｎら、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ、７：３０７、２０２０）が挙げられる。
【0030】
治療ペプチドおよび治療タンパク質について一般的に利用される投与経路としては、静脈内（ＩＶ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、および筋肉内（ＩＭ）注射が挙げられる。しかし、経口投与が患者によって好まれ、経口薬は、製造し、流通させ、管理するための価格が典型的にはより安い。残念ながら、治療ペプチドおよび治療タンパク質の経口的に利用可能な剤形の開発は、種々の理由ために複雑になっており、その理由としては、生理条件における安定性の乏しさ、短い生物学的半減期、および小腸において上皮性関門を通る透過性の低さが挙げられるが、それらに限定はされない。したがって、一部の実施形態において、本開示の製剤は、単離されたオリゴペプチドを胃で見出されるタンパク質分解酵素および酸性環境から保護して、その製剤が血流中に吸収された際にその生物活性が保持されるように、設計される（例えば、Ｄａｎら、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ、７：３０７、２０２０を参照のこと）。
【0031】
（ＩＩＩ．使用方法）
本開示の単離されたオリゴペプチドおよび製剤は、哺乳動物細胞によるＦＴＨ１ ｍＲＮＡ発現の発現を増加させるための方法および医薬において用途が見出される。一部の実施形態において、前記哺乳動物細胞は、上皮細胞、例えばヒト上皮細胞である。一部の好ましい実施形態において、本開示の単離されたオリゴペプチドおよび製剤は、血清フェリチン濃度を増加させることを必要とするヒト対象において血清フェリチン濃度を増加させるための方法および医薬において用途が見出される。一部の好ましい実施形態において、本開示の単離されたオリゴペプチドおよび製剤は、疾患または状態を処置または予防することを必要とするヒト対象において疾患または状態を処置または予防するための方法および医薬において用途が見出され、前記疾患または状態は不十分な血清フェリチン濃度に関連する。
本開示の単離されたオリゴペプチドおよび製剤は、哺乳動物細胞によるＦＴＨ１ ｍＲＮＡ発現の発現を増加させるための方法および医薬において用途が見出される。一部の実施形態において、前記哺乳動物細胞は、上皮細胞、例えばヒト上皮細胞である。一部の好ましい実施形態において、本開示の単離されたオリゴペプチドおよび製剤は、血清フェリチン濃度を増加させることを必要とするヒト対象において血清フェリチン濃度を増加させるための方法および医薬において用途が見出される。一部の好ましい実施形態において、本開示の単離されたオリゴペプチドおよび製剤は、疾患または状態を処置または予防することを必要とするヒト対象において疾患または状態を処置または予防するための方法および医薬において用途が見出され、前記疾患または状態は不十分な血清フェリチン濃度に関連する。
【0032】
一部のインビボ実施形態において、前記製剤は口から投与される。例えば、前記製剤は経腸投与され得る。一部の実施形態において、前記製剤は頬側経路、唇下経路、または舌下経路によって投与される。一部の実施形態において、哺乳動物対象（レシピエント）はがんを有しない。特定の実施形態において、前記対象は、前立腺がんを有しないヒト対象である。一部の実施形態において、前記ヒト対象は男性である。他の実施形態において、前記ヒト対象は女性である。
【0033】
（ＦＴＨ１ ｍＲＮＡ発現の増加）
一部の態様において、本開示は、フェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加させることを必要とする哺乳動物対象においてＦＴＨ１ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法および医薬を提供し、それらは、前記対象に、有効量の節Ｉもしくは節ＩＩのオリゴペプチドまたは製剤を投与することを含む。一部の実施形態において、前記哺乳動物対象はヒト対象である。
一部の態様において、本開示は、フェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加させることを必要とする哺乳動物対象においてＦＴＨ１ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法および医薬を提供し、それらは、前記対象に、有効量の節Ｉもしくは節ＩＩのオリゴペプチドまたは製剤を投与することを含む。一部の実施形態において、前記哺乳動物対象はヒト対象である。
【0034】
フェリチンは、広範に発現される高度に保存されたタンパク質であり、２つの種類のオリゴペプチド鎖（フェリチン重鎖およびフェリチン軽鎖）からなる。フェリチン重鎖はＦｅ２＋酸化反応を触媒し、一方、フェリチン軽鎖はＦｅ３＋の貯蔵において重要な役割を果たす。両方の鎖が、鉄ホメオスタシスを維持し鉄過剰を防止するために必須である（Ｔｉａｎら、Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１７：１７９６～１８１２、２０２０）。ＦＴＨ１遺伝子は、フェリチンの重鎖サブユニットをコードする。ＦＴＨ１発現における増加、したがってフェリチンの増加は、鉄吸収およびバイオアベイラビリティにおける増加をもたらす。鉄吸収およびバイオアベイラビリティにおけるこの増加は、不十分な量の鉄から生じる疾患および障害（例えば、鉄欠乏性貧血）を改善するために有益である。
【0035】
一部の実施形態において、哺乳動物細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法は、その哺乳動物細胞と、有効量の前記製剤とを接触させることを含む。一部の実施形態において、前記ＦＴＨ１ ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法は、前記哺乳動物細胞と、有効量の前記製剤とを接触させることを含み、前記増加はベースライン（例えば、接触前）との比較である。一部の実施形態において、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法は、前記哺乳動物細胞と、有効量の前記製剤とを接触させることを含み、前記増加は、前記製剤と接触させていない哺乳動物細胞との比較である。一部の実施形態において、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法は、前記哺乳動物細胞と、有効量の前記製剤とを接触させることを含み、前記増加は、前記オリゴペプチドを欠く対照製剤と接触させた哺乳動物細胞との比較である。一部の実施形態において、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法は、前記哺乳動物細胞と、有効量の前記製剤とを接触させることを含み、前記増加は、陰性対照オリゴペプチドを含む哺乳動物細胞との比較である。
【0036】
一部の実施形態において、前記接触させることはインビボで行われる。したがって、一部の実施形態において、フェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）発現を増加させることを必要とする哺乳動物対象においてＦＴＨ１発現を増加させるための方法および医薬は、前記対象に、ＦＴＨ１発現を増加させるために有効な量の前記製剤を投与することを含み、前記増加はベースライン（例えば、投与前）との比較である。一部の実施形態において、前記方法および医薬は、血清フェリチン濃度を増加させることを必要とする哺乳動物対象において血清フェリチン濃度を増加させることをさらに含む。したがって、一部の実施形態において、血清フェリチン濃度を増加させることを必要とする哺乳動物対象において血清フェリチン濃度を増加させるための方法および医薬は、前記対象に、血清フェリチン濃度を増加させるために有効な量の前記製剤を投与することを含み、前記増加はベースライン（例えば、投与前）との比較である。
【0037】
（鉄欠乏の処置または予防）
一部の態様において、疾患または状態を処置または予防することを必要とする哺乳動物対象において疾患または状態を処置または予防する方法が本明細書において提供されており、前記方法は、前記対象に、前記状態を処置または予防するために有効な量の前記製剤を投与することを含む。一部の実施形態において、前記疾患または状態は鉄欠乏に関連する。
一部の態様において、疾患または状態を処置または予防することを必要とする哺乳動物対象において疾患または状態を処置または予防する方法が本明細書において提供されており、前記方法は、前記対象に、前記状態を処置または予防するために有効な量の前記製剤を投与することを含む。一部の実施形態において、前記疾患または状態は鉄欠乏に関連する。
【0038】
鉄は、ヒトおよび動物の生理機能のために必須である。ヒトおよび動物において不十分な鉄は、多くの疾患ならびに障害（鉄欠乏性貧血および発育不全が挙げられる）を引き起こし得る。鉄欠乏は、ヘモグロビン測定値にしたがって、貧血を伴わない鉄欠乏、および貧血を伴う鉄欠乏（それぞれ、ＩＤＮＡおよびＩＤＡ）、という２つのレベルに分類され得る。貧血を伴わない鉄欠乏（ＩＤＮＡ、別名、非貧血性鉄欠乏）は、通常は潜行性であり、診断および管理にとって難題である（Ｚｈｕら、Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒ、１１：２９８、２０２０）。一部の実施形態において、処置または予防されるべき疾患または状態は、貧血を伴わない鉄欠乏に関連する。他の実施形態において、処置または予防されるべき疾患または状態は、貧血を伴う鉄欠乏に関連する。
【0039】
（貧血の処置または予防）
一部の態様において、疾患または状態を処置または予防することを必要とする哺乳動物対象において疾患または状態を処置または予防する方法が本明細書において提供されており、前記方法は、前記対象に、前記疾患または状態を処置または予防するために有効な量の前記製剤を投与することを含み、前記疾患または状態は貧血に関連する。
一部の態様において、疾患または状態を処置または予防することを必要とする哺乳動物対象において疾患または状態を処置または予防する方法が本明細書において提供されており、前記方法は、前記対象に、前記疾患または状態を処置または予防するために有効な量の前記製剤を投与することを含み、前記疾患または状態は貧血に関連する。
【0040】
別の実施形態において、前記障害は鉄欠乏性貧血である。貧血は、赤血球の欠乏によって特徴付けられる障害である。鉄欠乏性貧血は、不十分な量の鉄によって引き起こされる貧血である。この鉄欠乏は、不十分な鉄摂取量、不十分な鉄吸収、血液損失、またはこれらの組合せから生じ得る。
【0041】
鉄欠乏による貧血は、他の多くの貧血から区別され得る。例えば、鉄欠乏性貧血は、慢性感染性障害、炎症性障害、または悪性障害、例えば、関節炎もしくはがんから生じる貧血とは異なる。
【0042】
（レストレスレッグス症候群の処置または予防）
一部の態様において、疾患または状態を処置または予防することを必要とする哺乳動物対象において疾患または状態を処置または予防する方法が本明細書において提供されており、前記方法は、前記対象に、前記疾患または状態を処置または予防するために有効な量の前記製剤を投与することを含み、前記疾患または状態はレストレスレッグス症候群（restless leg syndrome）（レストレスレッグス症候群（restless legs syndrome）とも呼ばれる）である。
一部の態様において、疾患または状態を処置または予防することを必要とする哺乳動物対象において疾患または状態を処置または予防する方法が本明細書において提供されており、前記方法は、前記対象に、前記疾患または状態を処置または予防するために有効な量の前記製剤を投与することを含み、前記疾患または状態はレストレスレッグス症候群（restless leg syndrome）（レストレスレッグス症候群（restless legs syndrome）とも呼ばれる）である。
【0043】
レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）は一般的な神経障害であり、鉄欠乏がその病因において重要な役割を果たすと考えられている。鉄欠乏はＲＬＳにおいて一般的であり、鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）は、続発性ＲＬＳの周知の原因である。さらに、ＩＤＡは、ＲＬＳを有する患者において頻繁に観察される（Ｚｈｕら、Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｌ、１１：２９８、２０２０）。しかし、ＲＬＳについての治療法は何も知られておらず、ＲＬＳに罹患している個体の一部が神経活性薬または鉄補充によるいくらかの軽減を見出し得るが、どの患者にも作用する薬物は１つも存在しない（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ、２０２０）。
（列挙される実施形態）
１． Ｘｍ（Ｒ／Ｄ）ＥＥＳ（Ｇ／Ｄ）（Ｅ／Ｋ）Ｘｎ（コンセンサス番号１）のアミノ酸配列からなる単離されたオリゴペプチドであって、ｍおよびｎは０～１０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される、単離されたオリゴペプチド。
２． ＸｊＲＥＥＳＤＫＰＸｋ（配列番号１８）のアミノ酸配列からなる単離されたオリゴペプチドであって、ｊは０～１０の範囲から選択される整数であり、ｋは０～９の範囲から選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される、単離されたオリゴペプチド。
３． ＸｇＲＥＥＳＤＫＰ（ＸｈＸｉ）（配列番号１９）のアミノ酸配列を含み、Ｘｇはプロリンであるかまたは存在せず、ＸｈＸｉはメチオニンおよびチロシンであるかまたは存在しない、実施形態２に記載の単離されたオリゴペプチド。
４． ＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の単離されたオリゴペプチド。
５． ＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の単離されたオリゴペプチド。
６． ＲＥＥＳＧＥＬ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離されたオリゴペプチド。
７． ＲＥＥＳＧＥ（配列番号１）、ＲＥＥＳＧＥＰ（配列番号２）、ＫＥＥＤＥＥＳＧＥ（配列番号３）、ＫＰＲＥＥＳＧＥ（配列番号４）、ＬＤＥＥＳＧＥＰ（配列番号５）、ＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）、ＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）、またはＲＥＥＳＧＥＬ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離されたオリゴペプチド。
８． そのオリゴペプチドが、そのオリゴペプチドと接触させた哺乳動物細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加可能であり、必要に応じてその哺乳動物細胞がヒト細胞であり、かつ／あるいは必要に応じてその哺乳動物細胞が腸上皮細胞、骨格筋細胞、アストロサイト、またはマクロファージである、実施形態１～７のいずれか一実施形態に記載の単離されたオリゴペプチド。
９． 実施形態１～８のいずれか一実施形態に記載の単離されたオリゴペプチドと少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、製剤。
１０． 実施形態１～８のいずれか一実施形態に記載の単離されたオリゴペプチドと経口送達剤とを含む、製剤。
１１． 前記経口送達剤が吸収促進剤、脂肪酸、酵素阻害剤、ポリエチレングリコール、粘膜付着性ポリマー、細胞透過性ペプチド、またはそれらの組合せを含む、実施形態１０に記載の製剤。
１２． 腸溶コーティング、リポソーム、ミクロスフェア、および／またはマイクロ粒子／ナノ粒子をさらに含む、実施形態９～１１のいずれか一実施形態に記載の製剤。
１３． 実施形態１～７のいずれか一実施形態に記載のオリゴペプチドをコードする、単離された核酸。
１４． プロモーターと作動可能に組み合わされた実施形態１３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
１５． 実施形態１３に記載の単離された核酸または実施形態１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
１６． 実施形態９～１２のいずれか一実施形態に記載の製剤を含む、医薬。
１７． 哺乳動物細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法であって、
前記哺乳動物細胞と、ＦＴＨ１発現を増加させるために有効な量の実施形態９～１２のいずれか一項に記載の製剤とを接触させること
を含む、方法。
１８． 前記哺乳動物細胞が腸上皮細胞、骨格筋細胞、アストロサイト、またはマクロファージであり、かつ／あるいは必要に応じてその哺乳動物細胞がヒト細胞であり、あるいは必要に応じてその哺乳動物細胞がヒト腸上皮細胞である、実施形態１７に記載の方法。
１９． 接触させることがインビボで行われる、実施形態１７または実施形態１８に記載の方法。
２０． フェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）発現を増加させることを必要とする哺乳動物対象においてＦＴＨ１発現を増加させるための方法であって、
前記対象に、ＦＴＨ１発現を増加させるために有効な量の実施形態９～１２のいずれか一実施形態に記載の製剤を投与すること
を含む、方法。
２１． 血清フェリチン濃度を増加させることを必要とする哺乳動物対象において血清フェリチン濃度を増加させるための方法であって、
前記対象に、血清フェリチン濃度を増加させるために有効な量の実施形態９～１２のいずれか一実施形態に記載の製剤を投与すること
を含む、方法。
２２． 疾患または状態を処置または予防することを必要とする哺乳動物対象において疾患または状態を処置または予防するための方法であって、
前記対象に、前記疾患または状態を処置または予防するために有効な量の実施形態９～１２のいずれか一実施形態に記載の製剤を投与すること
を含む、方法。
２３． 前記疾患または状態が鉄欠乏に関連する、実施形態２２に記載の方法。
２４． 前記疾患または状態が貧血に関連する、実施形態２２または実施形態２３に記載の方法。
２５． 前記疾患または状態がレストレスレッグス症候群である、実施形態２２～２４のいずれか一実施形態に記載の方法。
２６． 前記製剤が口から投与される、実施形態２０～２５のいずれか一実施形態に記載の方法。
２７． 前記製剤が経腸投与される、実施形態２６に記載の方法。
２８． 前記製剤が頬側経路、唇下経路、または舌下経路によって投与される、実施形態２６に記載の方法。
２９． 前記哺乳動物対象がヒト対象である、実施形態２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
３０． 前記ヒト対象ががんを有しない、実施形態２９に記載の方法。
（列挙される実施形態）
１． Ｘｍ（Ｒ／Ｄ）ＥＥＳ（Ｇ／Ｄ）（Ｅ／Ｋ）Ｘｎ（コンセンサス番号１）のアミノ酸配列からなる単離されたオリゴペプチドであって、ｍおよびｎは０～１０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される、単離されたオリゴペプチド。
２． ＸｊＲＥＥＳＤＫＰＸｋ（配列番号１８）のアミノ酸配列からなる単離されたオリゴペプチドであって、ｊは０～１０の範囲から選択される整数であり、ｋは０～９の範囲から選択される整数であり、各Ｘは存在する場合には任意のアミノ酸から独立して選択される、単離されたオリゴペプチド。
３． ＸｇＲＥＥＳＤＫＰ（ＸｈＸｉ）（配列番号１９）のアミノ酸配列を含み、Ｘｇはプロリンであるかまたは存在せず、ＸｈＸｉはメチオニンおよびチロシンであるかまたは存在しない、実施形態２に記載の単離されたオリゴペプチド。
４． ＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の単離されたオリゴペプチド。
５． ＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の単離されたオリゴペプチド。
６． ＲＥＥＳＧＥＬ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離されたオリゴペプチド。
７． ＲＥＥＳＧＥ（配列番号１）、ＲＥＥＳＧＥＰ（配列番号２）、ＫＥＥＤＥＥＳＧＥ（配列番号３）、ＫＰＲＥＥＳＧＥ（配列番号４）、ＬＤＥＥＳＧＥＰ（配列番号５）、ＲＥＥＳＤＫＰＭＹ（配列番号６）、ＰＲＥＥＳＤＫＰ（配列番号７）、またはＲＥＥＳＧＥＬ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離されたオリゴペプチド。
８． そのオリゴペプチドが、そのオリゴペプチドと接触させた哺乳動物細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加可能であり、必要に応じてその哺乳動物細胞がヒト細胞であり、かつ／あるいは必要に応じてその哺乳動物細胞が腸上皮細胞、骨格筋細胞、アストロサイト、またはマクロファージである、実施形態１～７のいずれか一実施形態に記載の単離されたオリゴペプチド。
９． 実施形態１～８のいずれか一実施形態に記載の単離されたオリゴペプチドと少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、製剤。
１０． 実施形態１～８のいずれか一実施形態に記載の単離されたオリゴペプチドと経口送達剤とを含む、製剤。
１１． 前記経口送達剤が吸収促進剤、脂肪酸、酵素阻害剤、ポリエチレングリコール、粘膜付着性ポリマー、細胞透過性ペプチド、またはそれらの組合せを含む、実施形態１０に記載の製剤。
１２． 腸溶コーティング、リポソーム、ミクロスフェア、および／またはマイクロ粒子／ナノ粒子をさらに含む、実施形態９～１１のいずれか一実施形態に記載の製剤。
１３． 実施形態１～７のいずれか一実施形態に記載のオリゴペプチドをコードする、単離された核酸。
１４． プロモーターと作動可能に組み合わされた実施形態１３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
１５． 実施形態１３に記載の単離された核酸または実施形態１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
１６． 実施形態９～１２のいずれか一実施形態に記載の製剤を含む、医薬。
１７． 哺乳動物細胞によるフェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）ｍＲＮＡの発現を増加させるための方法であって、
前記哺乳動物細胞と、ＦＴＨ１発現を増加させるために有効な量の実施形態９～１２のいずれか一項に記載の製剤とを接触させること
を含む、方法。
１８． 前記哺乳動物細胞が腸上皮細胞、骨格筋細胞、アストロサイト、またはマクロファージであり、かつ／あるいは必要に応じてその哺乳動物細胞がヒト細胞であり、あるいは必要に応じてその哺乳動物細胞がヒト腸上皮細胞である、実施形態１７に記載の方法。
１９． 接触させることがインビボで行われる、実施形態１７または実施形態１８に記載の方法。
２０． フェリチン重鎖１（ＦＴＨ１）発現を増加させることを必要とする哺乳動物対象においてＦＴＨ１発現を増加させるための方法であって、
前記対象に、ＦＴＨ１発現を増加させるために有効な量の実施形態９～１２のいずれか一実施形態に記載の製剤を投与すること
を含む、方法。
２１． 血清フェリチン濃度を増加させることを必要とする哺乳動物対象において血清フェリチン濃度を増加させるための方法であって、
前記対象に、血清フェリチン濃度を増加させるために有効な量の実施形態９～１２のいずれか一実施形態に記載の製剤を投与すること
を含む、方法。
２２． 疾患または状態を処置または予防することを必要とする哺乳動物対象において疾患または状態を処置または予防するための方法であって、
前記対象に、前記疾患または状態を処置または予防するために有効な量の実施形態９～１２のいずれか一実施形態に記載の製剤を投与すること
を含む、方法。
２３． 前記疾患または状態が鉄欠乏に関連する、実施形態２２に記載の方法。
２４． 前記疾患または状態が貧血に関連する、実施形態２２または実施形態２３に記載の方法。
２５． 前記疾患または状態がレストレスレッグス症候群である、実施形態２２～２４のいずれか一実施形態に記載の方法。
２６． 前記製剤が口から投与される、実施形態２０～２５のいずれか一実施形態に記載の方法。
２７． 前記製剤が経腸投与される、実施形態２６に記載の方法。
２８． 前記製剤が頬側経路、唇下経路、または舌下経路によって投与される、実施形態２６に記載の方法。
２９． 前記哺乳動物対象がヒト対象である、実施形態２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
３０． 前記ヒト対象ががんを有しない、実施形態２９に記載の方法。
【実施例】
【0044】
（実施例）
略語：ＡＣＴＢ（βアクチン）；ＦＴＨ１（フェリチン重鎖１）；Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオシン）；ＨＳｋＭＣ（ヒト骨格筋）；ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）；ＭＢＭＭ（マウス骨髄由来マクロファージ）；ＲＬＳ（レストレスレッグス症候群）；およびＳＰＨ（サケタンパク質加水分解産物）。
略語：ＡＣＴＢ（βアクチン）；ＦＴＨ１（フェリチン重鎖１）；Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオシン）；ＨＳｋＭＣ（ヒト骨格筋）；ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）；ＭＢＭＭ（マウス骨髄由来マクロファージ）；ＲＬＳ（レストレスレッグス症候群）；およびＳＰＨ（サケタンパク質加水分解産物）。
【0045】
（実施例１）
（生物学的に活性なサケタンパク質加水分解産物の調製）
サケタンパク質加水分解産物（ＳＰＨ）粉末を、記載された（ＵＳ２０２１／０２５２０９９）とおりに切り身にした後のサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）の頭部および背骨の酵素加水分解によって作製した。簡単に述べると、１０００グラムの粉砕した頭部および背骨を１０００ｍｌの水に添加し、その混合物を５０℃に加熱した。１０ｇのエンドペプチダーゼ酵素（ペプシン）を添加し、前記混合物を３０分間撹拌した。その後、１０ｇのエキソペプチダーゼ酵素（カルボキシペプチダーゼ）を添加し、前記混合物を１５分間撹拌した。次に、５グラムのＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（登録商標）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来するエンドプロテアーゼとエキソプロテアーゼのブレンド；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって市販されている）を添加し、その混合物を１０分間撹拌した。その後、前記エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼとで処理したサケタンパク質混合物を８５℃になるまで１５分間加熱して、それらのプロテアーゼを不活化した。濾過後、その加水分解産物画分を従来のエバポレーター中で３０％乾燥物になるまで濃縮し、噴霧乾燥してサケタンパク質加水分解産物粉末を得た。
（生物学的に活性なサケタンパク質加水分解産物の調製）
サケタンパク質加水分解産物（ＳＰＨ）粉末を、記載された（ＵＳ２０２１／０２５２０９９）とおりに切り身にした後のサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）の頭部および背骨の酵素加水分解によって作製した。簡単に述べると、１０００グラムの粉砕した頭部および背骨を１０００ｍｌの水に添加し、その混合物を５０℃に加熱した。１０ｇのエンドペプチダーゼ酵素（ペプシン）を添加し、前記混合物を３０分間撹拌した。その後、１０ｇのエキソペプチダーゼ酵素（カルボキシペプチダーゼ）を添加し、前記混合物を１５分間撹拌した。次に、５グラムのＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（登録商標）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来するエンドプロテアーゼとエキソプロテアーゼのブレンド；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって市販されている）を添加し、その混合物を１０分間撹拌した。その後、前記エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼとで処理したサケタンパク質混合物を８５℃になるまで１５分間加熱して、それらのプロテアーゼを不活化した。濾過後、その加水分解産物画分を従来のエバポレーター中で３０％乾燥物になるまで濃縮し、噴霧乾燥してサケタンパク質加水分解産物粉末を得た。
【0046】
（実施例２）
（サケタンパク質加水分解産物のサイズ排除分画）
クォータナリポンプとオートサンプラーとＲＳ変量波長ＵＶ－Ｖｉｓ検出器と自動化フラクションコレクターを備えたＤｉｏｎｅｘ／Ｔｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、前記サケタンパク質加水分解産物（ＳＰＨ）の分取クロマトグラフィーのために使用した。分離は、ＴＳソフトウェアバージョン７．０を使用して、ＢｉｏＳｅｐ（商標）－ＳＥＣ－ｓ２０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）（３００ｍｍ×７．８ｍｍ内径、１４５Å細孔径）で２５℃にて実行した。
（サケタンパク質加水分解産物のサイズ排除分画）
クォータナリポンプとオートサンプラーとＲＳ変量波長ＵＶ－Ｖｉｓ検出器と自動化フラクションコレクターを備えたＤｉｏｎｅｘ／Ｔｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、前記サケタンパク質加水分解産物（ＳＰＨ）の分取クロマトグラフィーのために使用した。分離は、ＴＳソフトウェアバージョン７．０を使用して、ＢｉｏＳｅｐ（商標）－ＳＥＣ－ｓ２０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）（３００ｍｍ×７．８ｍｍ内径、１４５Å細孔径）で２５℃にて実行した。
【0047】
移動相は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）からなった。流量５ｍｌ／分を４８分間使用してアイソクラティック溶出を実行し、２１４ｎｍ波長にてモニターした。注入体積１ｍｌのＳＰＨ水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を使用し、１２個の画分（Ｆ１～Ｆ１２）を４分から４８分まで収集した。収集した画分を凍結乾燥し、－２０℃にて保管した。
【0048】
（実施例３）
（Ｆ１画分～Ｆ１２画分によるフェリチン重鎖１発現の調節）
ヒト小腸由来の上皮細胞株を、遺伝子発現に対するＳＰＨ画分の効果を評価するために選択した。この細胞型は、ＳＰＨが胃腸の健康調節因子として研究されてきたので選択した。ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手したＨＩＥＣ－６（ＣＲＬ－３２６６（商標））細胞を、１００ｍｍ細胞培養皿上にて、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳと１０ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）と１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子と最終濃度４％のウシ胎児血清とを補充した、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）１血清低減培地において増殖させた。このアッセイのために、ＨＩＥＣ－６細胞を２４ウェルプレート中に細胞密度１×１０５細胞／ｃｍ２にて播種し、加湿５％ ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて維持した。約２４時間後に、前記細胞をＳＰＨ画分Ｆ１～Ｆ１２の各々とともに１２時間インキュベートした。
（Ｆ１画分～Ｆ１２画分によるフェリチン重鎖１発現の調節）
ヒト小腸由来の上皮細胞株を、遺伝子発現に対するＳＰＨ画分の効果を評価するために選択した。この細胞型は、ＳＰＨが胃腸の健康調節因子として研究されてきたので選択した。ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手したＨＩＥＣ－６（ＣＲＬ－３２６６（商標））細胞を、１００ｍｍ細胞培養皿上にて、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳと１０ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）と１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子と最終濃度４％のウシ胎児血清とを補充した、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）１血清低減培地において増殖させた。このアッセイのために、ＨＩＥＣ－６細胞を２４ウェルプレート中に細胞密度１×１０５細胞／ｃｍ２にて播種し、加湿５％ ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて維持した。約２４時間後に、前記細胞をＳＰＨ画分Ｆ１～Ｆ１２の各々とともに１２時間インキュベートした。
【0049】
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルにしたがってＵＰｚｏｌ試薬を前記細胞のペレットに対して使用し、その後、ＤＮＡｓｅ処理（ＤＮＡｓｅ ＴＵＲＢＯ）して、抽出した。ランダムヘキサマーを使用して、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。遺伝子発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。
【0050】
５０ｎｇの逆転写されたＲＮＡに対応する１μｌのｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号４３０４４３７）およびＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を使用してＱｐｃｒ（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）によって増幅した。
【0051】
ＦＴＨ１遺伝子発現を、標準式２－ΔＣｔにしたがって、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン（ＡＣＴＢ）の発現と比較して推定した。使用したＴａｑＭａｎ（商標）プローブＩＤは以下であった：（ｉ）ＦＴＨ１、Ｈｓ０１６９４０１１＿ｓ１；および（ｉｉ）ＡＣＴＢ、Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１。すべての実験は三回実施した。
【0052】
表３－１に示すとおり、ＦＴＨ１遺伝子発現の有意な（＞２倍）アップレギュレーションをＦ２画分およびＦ３画分で観察した。有意ではない（＜２倍）アップレギュレーションをＦ７画分、Ｆ９画分およびＦ１１画分で観察した。
（表３－１．ＦＴＨ１発現に対するＳＰＨ画分でのＨＩＥＣ－６細胞処理の効果）
（表３－１．ＦＴＨ１発現に対するＳＰＨ画分でのＨＩＥＣ－６細胞処理の効果）
【表3-1】
【0053】
（実施例４）
（Ｆ２画分およびＦ３画分の分取逆相クロマトグラフィー）
Ｆ２画分とＦ３画分との混合物の直交型クロマトグラフィー分離を、実施例２に記載したＤｉｏｎｅｘ／Ｔｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して実施した。等重量の画分Ｆ２と画分Ｆ３（１００ｍｇ／ｍｌ）とを含む水溶液の１ｍｌアリコートを、ＢｅｔａＳｉｌ（商標）Ｃ１８カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、２５０ｍｍ×１０ｍｍ内径、１０ミクロン粒子径を使用して２５℃にて分離した。
（Ｆ２画分およびＦ３画分の分取逆相クロマトグラフィー）
Ｆ２画分とＦ３画分との混合物の直交型クロマトグラフィー分離を、実施例２に記載したＤｉｏｎｅｘ／Ｔｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して実施した。等重量の画分Ｆ２と画分Ｆ３（１００ｍｇ／ｍｌ）とを含む水溶液の１ｍｌアリコートを、ＢｅｔａＳｉｌ（商標）Ｃ１８カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、２５０ｍｍ×１０ｍｍ内径、１０ミクロン粒子径を使用して２５℃にて分離した。
【0054】
移動相は水（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）であり、両方とも０．０５％のＴＦＡで酸性化しており、流量は４ｍｌ／分であった。グラジエント溶出を以下のとおりに実行した：０分、０％Ｂ；１０分、０％Ｂ；４５分、４０％Ｂ；５０分、１００％Ｂ；６０分、１００％Ｂ。
【0055】
分離を２１４ｎｍにてモニターし、１２個の画分（ＦＲＰ１２～ＦＲＰ３４）を１２分から３６分まで収集し、実施例３に記載したとおりに、それらのＦＴＨ１調節活性について評価した。
【0056】
２個の早い溶出画分（１８分保持時間および２０分保持時間における）および１個の遅い溶出画分（３０分保持時間における）だけが、表４－１に示すとおり有意なＦＴＨ１遺伝子アップレギュレーションを示した。これらの３個の活性画分をＦＲＰ１８、ＦＲＰ２０およびＦＲＰ３０と呼んだ。
（表４－１．ＦＴＨ１発現に対するＳＰＨ部分画分でのＨＩＥＣ－６細胞処理の効果）
（表４－１．ＦＴＨ１発現に対するＳＰＨ部分画分でのＨＩＥＣ－６細胞処理の効果）
【表4-1】
【0057】
（実施例５）
（ＦＲＰ１８画分、ＦＲＰ２０画分およびＦＲＰ３０画分のＨＰＬＣ－ＨＲＭＳ分析）
生物活性オリゴペプチドを、５０％メタノール中に再溶解した凍結乾燥ＦＲＰ１８、凍結乾燥ＦＲＰ２０および凍結乾燥ＦＲＰ３０の高速液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析（ＨＰＬＣ－ＨＲＭＳ）による分析を使用して同定した。注入体積１０μｌの逆相Ｌｕｎａ（登録商標）Ｏｍｅｇａ Ｐｏｌａｒ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５ｍｍ粒子、１００Å細孔径）を、Ｇ１３４０ＡデガッサとＧ１３１１Ａクォータナリポンプとサーモスタットカラムコンパートメントとフォトダイオードアレイ検出器（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とからなるＡｇｉｌｅｎｔ １２９０クロマトグラフに配置し、このクロマトグラフを、エレクトロスプレーイオン化インターフェースを備えたＢｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒＯＴＯＦ－Ｑ ＩＩ質量分析計に取り付けた。
（ＦＲＰ１８画分、ＦＲＰ２０画分およびＦＲＰ３０画分のＨＰＬＣ－ＨＲＭＳ分析）
生物活性オリゴペプチドを、５０％メタノール中に再溶解した凍結乾燥ＦＲＰ１８、凍結乾燥ＦＲＰ２０および凍結乾燥ＦＲＰ３０の高速液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析（ＨＰＬＣ－ＨＲＭＳ）による分析を使用して同定した。注入体積１０μｌの逆相Ｌｕｎａ（登録商標）Ｏｍｅｇａ Ｐｏｌａｒ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５ｍｍ粒子、１００Å細孔径）を、Ｇ１３４０ＡデガッサとＧ１３１１Ａクォータナリポンプとサーモスタットカラムコンパートメントとフォトダイオードアレイ検出器（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とからなるＡｇｉｌｅｎｔ １２９０クロマトグラフに配置し、このクロマトグラフを、エレクトロスプレーイオン化インターフェースを備えたＢｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒＯＴＯＦ－Ｑ ＩＩ質量分析計に取り付けた。
【0058】
流量は０．５ｍｌ／分で維持した。移動相Ａ（水／アセトニトリル ９５：５（体積／体積））および移動相Ｂ（水／アセトニトリル、５：９５（体積／体積））（両方とも０．１％ギ酸で酸性化した）のグラジエント溶出プロファイルは、以下であった：０分、０％Ｂ；５分、０％ Ｂ；２５分、１００％Ｂ；３５分、１００％Ｂ；３７分、０％Ｂ。
【0059】
自動化ＭＳ／ＭＳスペクトルを、乾燥温度２００℃および乾燥ガスフロー８ｌ／分を使用して正イオンモードで取得した。構造同定は、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．３．０および自動化［Ｍ＋Ｈ］ｎ＋フラグメントマッチング解析を使用した、データベース支援型であった。
【0060】
８種の主要なオリゴペプチドを上記３個の生物活性画分ＦＲＰ１８、ＦＲＰ２０およびＦＲＰ３０から同定した。保持時間、ＭＳ／ＭＳ結果およびオリゴペプチド配列を表５－１に示す。
（表５－１．生物活性オリゴペプチドの同定）
（表５－１．生物活性オリゴペプチドの同定）
【表5-1-1】
【表5-1-2】
【0061】
（実施例６）
（ヒト骨格筋細胞（ＨＳｋＭＣ）に対するオリゴペプチドの効果）
ヒト骨格筋由来の細胞株を、遺伝子発現に対するＳＰＨおよびオリゴペプチドの効果を評価するために選択した。ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手したＨＳｋＭＣ（ＰＣＳ－９５０－０１０）を、１００ｍｍ細胞培養皿において、Ｌ－グルタミン（１０ｍＭ）とデキサメタゾン（１０μＭ）とｒｈ上皮成長因子（５ｎｇ／ｍｌ）とｒｈ ＦＧＦ－ｂ（５ｎｇ／ｍＬ）とｒｈインスリン（２５μｇ／ｍＬ）とウシ胎児血清（４％）とを含むＰｒｉｍａｒｙ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｋｉｔ（ＡＴＣＣ）を補充した、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ）血清低減培地において増殖させた。このアッセイのために、ＨＳｋＭＣ細胞を２４ウェルプレート中に細胞密度１×１０４細胞／ｃｍ２にて播種し、加湿５％ ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて維持した。約２４時間後に、前記細胞をＳＰＨ（１００μＭ）または合成オリゴペプチド（１０μＭ）とともに約１２時間インキュベートした。
（ヒト骨格筋細胞（ＨＳｋＭＣ）に対するオリゴペプチドの効果）
ヒト骨格筋由来の細胞株を、遺伝子発現に対するＳＰＨおよびオリゴペプチドの効果を評価するために選択した。ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手したＨＳｋＭＣ（ＰＣＳ－９５０－０１０）を、１００ｍｍ細胞培養皿において、Ｌ－グルタミン（１０ｍＭ）とデキサメタゾン（１０μＭ）とｒｈ上皮成長因子（５ｎｇ／ｍｌ）とｒｈ ＦＧＦ－ｂ（５ｎｇ／ｍＬ）とｒｈインスリン（２５μｇ／ｍＬ）とウシ胎児血清（４％）とを含むＰｒｉｍａｒｙ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｋｉｔ（ＡＴＣＣ）を補充した、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ）血清低減培地において増殖させた。このアッセイのために、ＨＳｋＭＣ細胞を２４ウェルプレート中に細胞密度１×１０４細胞／ｃｍ２にて播種し、加湿５％ ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて維持した。約２４時間後に、前記細胞をＳＰＨ（１００μＭ）または合成オリゴペプチド（１０μＭ）とともに約１２時間インキュベートした。
【0062】
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルにしたがってＵＰｚｏｌ試薬を前記細胞のペレットに対して使用し、その後、ＤＮＡｓｅ処理（ＤＮＡｓｅ ＴＵＲＢＯ）して、抽出した。ランダムヘキサマーを使用して、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。遺伝子発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。
【0063】
５０ｎｇの逆転写されたＲＮＡに対応する１μｌのｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号４３０４４３７）およびＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を使用してＱｐｃｒ（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）によって増幅した。
【0064】
ＦＴＨ１遺伝子発現を、標準式２－ΔＣｔにしたがって、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン（ＡＣＴＢ）の発現と比較して推定した。使用したＴａｑＭａｎ（商標）プローブＩＤは以下であった：（ｉ）ＦＴＨ１、Ｈｓ０１６９４０１１＿ｓ１；および（ｉｉ）ＡＣＴＢ、Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１。すべての実験は三回実施した。
（表６－１．ＨＳｋＭＣにおけるＦＴＨ１発現に対するオリゴペプチドの効果）
（表６－１．ＨＳｋＭＣにおけるＦＴＨ１発現に対するオリゴペプチドの効果）
【表6-1】
【0065】
表６－１に示すとおり、ＦＴＨ１遺伝子発現の認識可能な（＞２倍）アップレギュレーションを、ＦＴ－００２ペプチド、ＦＴ－００４ペプチド、ＦＴ－００６ペプチド、ＦＴ－００７ペプチド、およびＦＴ－００８ペプチドの存在下で初代ヒト筋細胞をインキュベートした場合に観察した。さらに、ＦＴＨ１遺伝子発現に対する用量依存的効果を、以下の表６－２に示すとおり、漸増するオリゴペプチド濃度でＨＳｋＭＣを処理した場合に観察した。
（表６－２．ＨＳｋＭＣにおけるＦＴＨ１発現に対するオリゴペプチドの用量依存的効果）
（表６－２．ＨＳｋＭＣにおけるＦＴＨ１発現に対するオリゴペプチドの用量依存的効果）
【表6-2】
【0066】
（実施例７）
（ヒトアストロサイトに対するオリゴペプチドの効果）
本実施例は、インビトロでのヒトアストロサイトのヘミン誘導性鉄依存的酸化損傷に対するＳＰＨおよびオリゴペプチドの保護効果の評価を記載する。
（ヒトアストロサイトに対するオリゴペプチドの効果）
本実施例は、インビトロでのヒトアストロサイトのヘミン誘導性鉄依存的酸化損傷に対するＳＰＨおよびオリゴペプチドの保護効果の評価を記載する。
【0067】
不死化ヒトアストロサイト（Ｐ１０２５１－ＩＭ）をＩｎｎｏｐｒｏｔ（Ｓｐａｉｎ）から入手し、その供給業者により推奨される条件下で調製した。９０％コンフルエンシーにて、前記Ｐ１０２５１－ＩＭ細胞を８ｍｌのＤＰＢＳおよび２ｍｌのＴ／Ｅ溶液（Ｉｎｎｏｐｒｏｔの手順にしたがって調製した）でリンスし、その後、エルレンマイヤーフラスコに添加し、前記Ｐ１０２５１－ＩＭ細胞が完全に覆われるように穏やかに振盪した。その後、前記フラスコを３７℃にて２分間インキュベートした。その後、５ｍｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）および前記フラスコからのＴ／Ｅ溶液を５０ｍｌコニカル型遠心管に添加した。前記フラスコをさらに２分間インキュベートし、穏やかにタッピングすることによって前記Ｐ１０２５１－ＩＭ細胞をその表面から外した。その後、前記Ｐ１０２５１－ＩＭ細胞を、５ｍｌのＴＮＳ溶液を含む５０ｍｌコニカル型遠心管に移した。その管を１０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。その後、前記Ｐ１０２５１－ＩＭ細胞を培養培地中に再懸濁し、計数し、ポリＬ‐リジンコーティング済み培養プレート中に１×１０４細胞密度にてプレーティングした。細胞をインビトロで２１日間インキュベートした後、それらの細胞を試験した。
【0068】
コンフルエントなＰ１０２５１－ＩＭ細胞培養物を洗浄し、その後、培地単独で、またはＳＰＨ（１６０μＭ）を補充した培地もしくはオリゴペプチド（１０μＭ）を補充した培地で、３７℃にて２４時間事前処理した。１６０μＭ濃度の市販のコラーゲンペプチド（Ｖｉｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）および滅菌水を陰性対照として使用した。その後、それらのＰ１０２５１－ＩＭ細胞を、１０ｍＭグルコースを含むＭＥＭからなる無血清培地（ＭＥＭ１０）中の３０μＭヘミンで６時間処理した。
【0069】
３０μＭヘミンで事前処理したＰ１０２５１－ＩＭアストロサイト培養物は、広範な細胞損傷を維持した。細胞生存度を、以前に記載された（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｒｅｇａｎ、Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ、２：１８９～１９６、２００５）とおりに乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイを使用して定量した。簡単に述べると、ＳＰＨおよびオリゴペプチドの保護効果の定量は、放出されたＬＤＨの平均パーセンテージを、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で処理した完全溶解対照培養物（培養ＬＤＨの１００％を放出すると考えられる）に対して調整して決定することによって、評価した。
（表７－１．ヘミン誘導性損傷からのヒトアストロサイトの保護）
（表７－１．ヘミン誘導性損傷からのヒトアストロサイトの保護）
【表7-1】
【0070】
その後、Ｌ－フェリチン遺伝子発現およびＨ－フェリチン遺伝子発現を定量した。簡単に述べると、ヘミンとの６時間のインキュベーション後に、前記アストロサイトを溶解し、Ｑｉａｇｅｎ ｌｉｐｉｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔを使用してＲＮＡを抽出した。鉄ホメオスタシスに関与する両方の遺伝子（Ｌ－フェリチンおよびＨ－フェリチン）の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。倍率変化を、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用するΔＣｔ法を使用して、算出した。倍率変化を、対照ウェルにおける発現レベルに対して正規化した。実験は３回実施した。
ｃＤＮＡの増幅のために使用したプライマーは、以下であった：
Ｈ－フェリチンフォワード：ＴＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣ（配列番号１０）；
Ｈ－フェリチンリバース：ＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧ（配列番号１１）；
Ｌ－フェリチンフォワード：ＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＴＣ（配列番号１２；および
Ｌ－フェリチンリバース：ＧＣＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴ（配列番号１３）。
（表７－２．アストロサイトにおけるフェリチン発現に対するオリゴペプチドの効果）
ｃＤＮＡの増幅のために使用したプライマーは、以下であった：
Ｈ－フェリチンフォワード：ＴＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣ（配列番号１０）；
Ｈ－フェリチンリバース：ＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧ（配列番号１１）；
Ｌ－フェリチンフォワード：ＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＴＣ（配列番号１２；および
Ｌ－フェリチンリバース：ＧＣＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴ（配列番号１３）。
（表７－２．アストロサイトにおけるフェリチン発現に対するオリゴペプチドの効果）
【表7-2】
【0071】
フェリチン過剰発現およびフェリチン事前処理は、内皮細胞およびアストロサイトにおいてヘミン誘導性酸化毒性を減少させると報告されていた（Ｂａｌｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６７：１８１４８～１８１５３、１９９２；およびＲｅｇａｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１１３：９８５～９９４、２００２）。今や、アストロサイトのＳＰＨでの事前処理は、ヘミンで損傷したアストロサイトの生存度において小さな改善を生じたことが見出された。さらに、３種すべてのオリゴペプチドＦＴ－００６、ＦＴ－００７、およびＦＴ－００８（１０μＭ）が、ヘミンにより誘導された酸化損傷からのアストロサイトの実質的な予防的保護を提供することが見出された（すなわち、コラーゲン対照についての４８％死亡率と比較して、それぞれ４０％の死亡率、３６％の死亡率、および２９％の死亡率）。さらに、３種すべてのオリゴペプチドは前記Ｈ－フェリチン遺伝子の選択的アップレギュレーションを示し、前記Ｌ－フェリチン遺伝子の発現において変化はほとんどないかまたは全くなかった。具体的には、オリゴペプチドＦＴ－００６、ＦＴ－００７、およびＦＴ－００８は、Ｈ－フェリチン遺伝子発現において、それぞれ、３．０倍、３．３倍、および４．０倍の増加を生じた。これらの結果は、ヘミン誘導性鉄酸化損傷からのアストロサイトの保護は、少なくとも部分的にはＨ－フェリチン遺伝子発現のアップレギュレーションによって生じることを示す。
【0072】
（実施例８）
（マウスマクロファージに対するオリゴペプチドの効果）
本実施例は、通常細胞培養条件、鉄強化細胞培養条件および鉄枯渇細胞培養条件での、マウス骨髄由来マクロファージ（ＭＢＭＭ）におけるＨ－フェリチンタンパク質発現およびＨ－フェリチンｍＲＮＡ発現に対するＳＰＨおよびオリゴペプチドの効果の評価を記載する。
（マウスマクロファージに対するオリゴペプチドの効果）
本実施例は、通常細胞培養条件、鉄強化細胞培養条件および鉄枯渇細胞培養条件での、マウス骨髄由来マクロファージ（ＭＢＭＭ）におけるＨ－フェリチンタンパク質発現およびＨ－フェリチンｍＲＮＡ発現に対するＳＰＨおよびオリゴペプチドの効果の評価を記載する。
【0073】
（細胞培養物）。 ＭＢＭＭ（Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景）をＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｉｃｓ．ｎｅｔから入手し、その供給業者によって推奨された条件下で調製した。単離したＭＢＭＭを１０ｃｍ直径のペトリ皿に播種し、１０％熱非働化処理済みＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ Ｌ－細胞馴化培地（コロニー刺激因子１の供給源）と２ｍＭ Ｌ－グルタミンと５０Ｕ／ｍＬペニシリンと５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンとを補充した、ＲＰＭＩ－ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させた。播種の４日後に、接着性ＭＢＭＭをハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回リンスし、前記培地を７日間取り替えた。その時点で、前記ＭＢＭＭはマクロファージへと完全に分化しており、いつでも下流の実験に適用する状態になっていた。
【0074】
（細胞処理）。 ＳＰＨ（平均分子量約１１００ダルトン）およびオリゴペプチドを滅菌水に溶解して、０．１ｍＭストック溶液を得た。前記ＳＰＨおよびオリゴペプチドを細胞培養培地でさらに希釈して、ペトリ皿１枚当たり最終濃度１６０μＭのＳＰＨおよび最終濃度１０μＭのオリゴペプチドを得た。
【0075】
マウスマクロファージを、鉄－ニトリロ三酢酸溶液（Ｆｅ－ＮＴＡ；ＦｅＣｌ３（１００μＭ）－ＮＴＡ（４００μＭ））の存在下または非存在下で、ＳＰＨまたはオリゴペプチドとともに３７℃にて８時間インキュベートして、細胞鉄濃度を増加させた。マウスマクロファージはまた、メシル酸デスフェリオキサミン（ＤＦＯ；１００μＭ）の存在下または非存在下でも、ＳＰＨまたはオリゴペプチドとともに３７℃にて１６時間インキュベートして、細胞鉄濃度を減少させた。１０μＭ濃度の市販のコラーゲンペプチド（Ｖｉｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）および滅菌水を陰性対照として使用した。
【0076】
（Ｈ－フェリチンの定量）。 マクロファージを冷たい生理食塩水で洗浄し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）と１％ ＩＧＥＰＡＬ Ｃ－６３０（Ｓｉｇｍａ）と１％プロテアーゼインヒビターカクテルＰ８４０（Ｓｉｇｍａ）とを含む４００μｌの溶液で溶解させた。溶解物中のＨ－フェリチン濃度を、マウス組換えＨ－フェリチンサブユニットに対して産生したポリクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡによって決定し、対応する組換えホモポリマーで較正した。前記抗体の特異性および前記抗体の交差反応性の非存在は、記載されている。結果を、表８－１において、細胞溶解物中の（全タンパク質ｍｇ）当たりの（フェリチンｎｇ）として表し、３回の読取りの平均として示した。全タンパク質含有量は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。
【0077】
（遺伝子発現の測定）。 全ＲＮＡを、動物およびヒトの細胞および組織からの全ＲＮＡの精製のためのＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを製造業者の指示にしたがって使用して、マクロファージから抽出した。ＲＴ２ ＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲ Ａｒｒａｙを実行してＲＮＡサンプルの品質を確認し、その後ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲアレイを使用する遺伝子発現分析を行った後で、約２μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡへと転写させた。
【0078】
ｃＤＮＡの増幅のために使用したプライマーは以下であった：
ＨＰＲＴ１フォワード：５’－ＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＧＡＣ－３’（配列番号１４）；
ＨＰＲＴ１リバース：５’－ＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＡ－３’（配列番号１５）；
ＦＴＨ１フォワード：５’－ＧＧＡＧＴＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣ－３’（配列番号１６）；および
ＦＴＨ１リバース：５’－ＧＡＧＡＴＡＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣ－３’（配列番号１７）。
ＨＰＲＴ１フォワード：５’－ＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＧＡＣ－３’（配列番号１４）；
ＨＰＲＴ１リバース：５’－ＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＡ－３’（配列番号１５）；
ＦＴＨ１フォワード：５’－ＧＧＡＧＴＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣ－３’（配列番号１６）；および
ＦＴＨ１リバース：５’－ＧＡＧＡＴＡＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣ－３’（配列番号１７）。
【0079】
これらのプライマーはゲノムＤＮＡを共増幅しない。すべての反応は全反応体積２０μｌにてｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて実施し、ｉＱ（商標）５装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において実行した。ベースライン閾値をＢｉｏ－Ｒａｄ ｉＱ５プログラムによって算出し、その閾値サイクル（Ｃｔ）を使用し、前記Ｆｔｈ１遺伝子についてのＣｔ値をＨｐｒｔ１（ハウスキーピング）遺伝子の発現レベルに対して正規化した。結果を、対照サンプルと比較してｎ倍の差として表８－２に示す。
（表８－１．マウスマクロファージにおけるＨ－フェリチンタンパク質レベル∧に対するオリゴペプチドの効果）
（表８－２．マウスマクロファージにおけるＦＴＨ１レベルに対するオリゴペプチドの効果）
（表８－１．マウスマクロファージにおけるＨ－フェリチンタンパク質レベル∧に対するオリゴペプチドの効果）
【表8-1】
【表8-2】
【0080】
最も活性な３種のオリゴペプチドはＦＴ－００８、ＦＴ－００７、およびＦＴ－００６であった。これらのペプチドの各々でのマウスマクロファージの処置は、正常条件および鉄枯渇条件の両方において、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡ発現レベルおよび細胞内Ｈ－フェリチンタンパク質レベルにおいて実質的な増加をもたらした。前記Ｈ－フェリチンタンパク質の増加は鉄枯渇細胞環境において最も顕著であったが、鉄が豊富な細胞環境においては、ＦＴＨ１ ｍＲＮＡ発現レベルおよびＨ－フェリチンタンパク質レベルの変化はほとんどまたは全く観察しなかった。
【0081】
（実施例９）
（オリゴペプチド処置マウスにおけるフェリチンの濃度および運動の分析）
本実施例は、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）のマウスモデル、ならびに血清および脳脊髄液中のフェリチン濃度に対するオリゴペプチド処置の効果を評価するためのその使用を記載する。このモデルはまた、運動（ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ）に対するオリゴペプチド処置の効果を評価するためにも適している。
（オリゴペプチド処置マウスにおけるフェリチンの濃度および運動の分析）
本実施例は、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）のマウスモデル、ならびに血清および脳脊髄液中のフェリチン濃度に対するオリゴペプチド処置の効果を評価するためのその使用を記載する。このモデルはまた、運動（ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ）に対するオリゴペプチド処置の効果を評価するためにも適している。
【0082】
（動物モデルおよび処置）。 Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、３．５ｍｇ鉄／ｋｇだけを含む鉄欠乏ＩＤ食（ＴＤ ８０３９６、Ｈａｒｌａｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を給餌する。前記ＩＤ食を開始して１か月後に、６－ヒドロキシドーパミン（ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｏｍｅ）（６－ＯＨＤＡ）損傷を両側のＡ１１核において作製する。簡単に述べると、それらの動物に麻酔し、その後、０．０１％アスコルビン酸生理食塩水中０．２％の６－ＯＨＤＡ １μｌを、以前に記載された（Ｑｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、６６：３８３－３８８、２００７；およびＬｕｏら、Ｓｌｅｅｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１２：４１－４６、２０１１）とおりに両側のＡ１１核に定位的に注射する（中外側０．３５ｍｍ、背側／腹側４．５ｍｍ、前後方向－１．９５ｍｍ）。
【0083】
その後、マウスを無作為に以下の種々の処置群に割り当てる（１群当たりｎ＝５匹～１０匹のマウス）：（ｉ）媒体対照，（２）ＳＰＨ，（３）オリゴペプチドＦＴ－００６，（ｉｖ）オリゴペプチドＦＴ－００７、および（ｖ）オリゴペプチドＦＴ－００８。ＦＴ－００２、ＦＴ－００４、およびコンセンサス番号１と整合する他のオリゴペプチドのうちの１つまたは複数を試験するために、追加の群を含め得る。この研究のためのオリゴペプチド用量は、前記マウスの体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ～約１０００ｍｇ、または約１０ｍｇ～約１００ｍｇの範囲内であり得る。１日目の腹腔内注射による初回処置の後、その後の処置はマウス固形飼料で経口投与する。本研究は最長、４週間、８週間または１２週間、継続し得る。
【0084】
（自発運動測定）。 自発運動（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）測定を、Ａｃｃｕ－Ｓｃａｎ Ｄｉｇｉｓｃａｎシステム（Ａｃｕｓｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ、ＵＳＡ）を使用して実行する。コンピュータにより収集するデータとしては、総移動距離（Ｔｏｔａｌ Ｄｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｖｅｌｅｄ）（ｃｍ／６０分）および移動時間（Ｍｏｖｉｎｇ Ｔｉｍｅ）（秒／６０分）が挙げられる。前記測定は、暗室中で９ＡＭから１１ＡＭまで実行する。各マウスを試験チャンバ中に、順応のために３０分間入れ、その後、コンピュータ生成自動分析システムを使用して６０分間記録する。前記自発運動をマウスにおいて測定し、その後、０日目（ベースライン活動レベル）に処置を開始し、その後、本研究の過程を通じて定期的に行う。
【0085】
血液サンプルを、鉄レベルおよびバイオマーカーレベルの分析のために２週間ごとに収集する（尾静脈または頬の穿刺）。本研究の終わりに当たって、マウスを人道的に屠殺する。脊髄組織をすぐに解剖して氷上に配置する。その後、腰髄を分離し、以下のとおり処理する：鉄レベルの評価のためのホモジナイゼーションおよび消化；ＦＴＨ１遺伝子発現の評価のためのＲＮＡ単離；ならびに免疫組織化学解析のための固定。鉄分析およびバイオマーカー分析のために、血液を心臓穿刺によって収集する。骨格筋サンプル、脾臓サンプル、心臓サンプルおよび肝臓サンプルもまた、遺伝子発現の測定および免疫組織化学解析のために屠殺時に収集する。脾臓を半分に分割する：第１の半分は免疫組織化学解析のために瞬間凍結し、第２の半分は、ＥａｓｙＳｅｐ Ｍｏｕｓｅ Ｆ４／８０免疫磁気陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してマクロファージを単離するために処理し、それから遺伝子発現分析のためにＲＮＡを単離する。
【0086】
（腰髄中の鉄測定）。 剖検時に、腰髄を収集し、秤量し、濃塩酸中で消化する。組織鉄濃度（組織１グラム当たりの鉄のマイクログラム）を、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｏｗｎ、ＰＥ、Ｃａｎａｄａ）からのキットをマイクロタイタープレートアッセイのために改変して使用して、分光光度的に決定する。
【0087】
（遺伝子発現）。 ＲＮＡ単離および遺伝子発現分析を、上記の実施例８に記載しているとおりに実施する。
【0088】
（免疫組織化学解析）。 器官サンプルをＯＣＴ化合物中に包埋し、瞬間凍結する。凍結サンプルをクリオスタットにて切片化し、その後、Ｈ－フェリチンおよびＬ－フェリチンについて染色する。切片は、炎症の評価のためにＨ＆Ｅでも染色する。
【0089】
（統計解析）。 データを平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）、または平均±標準偏差（ＳＤ）として示す。媒体で処置したＩＤ＋６ＯＨＤＡ損傷マウスと、オリゴペプチドＦＴ－００６で処置したＩＤ＋６ＯＨＤＡ損傷マウス、オリゴペプチドＦＴ－００７で処置したＩＤ＋６ＯＨＤＡ損傷マウス、およびオリゴペプチドＦＴ－００８で処置したＩＤ＋６ＯＨＤＡ損傷マウスとの間の差を、元データまたは媒体対照に対して正規化した変換データ（対照の％）を使用して解析する。外部フェンスを２標準偏差に設定して、１群当たりの外れ値を解析する。複数の試験について補正するために、正規分布用の一元配置ボンフェローニ多重比較検定およびクラスカル・ウォリスノンパラメトリック検定を少数の動物サンプルのために適用する。＜０．０５のｐ値を有意であると考える。
【0090】
本開示は理解の明確さを目的として例示および例としていくらか詳細に記載されてきたが、特定の変更および改変が上記の教示を考慮して実施され得ることが当業者には明らかである。したがって、上記の実施例は本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって明確に示される。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】