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特表2025-505795修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを有する組換えアデノ随伴ウイルス

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-28

(54)【発明の名称】修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを有する組換えアデノ随伴ウイルス

(51)【国際特許分類】

C07K 14/015 20060101AFI20250220BHJP

C07K 7/06 20060101ALI20250220BHJP

C07K 7/08 20060101ALI20250220BHJP

C12N 15/35 20060101ALI20250220BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20250220BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20250220BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20250220BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20250220BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20250220BHJP

C12N 7/01 20060101ALI20250220BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20250220BHJP

A61P 27/02 20060101ALI20250220BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20250220BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20250220BHJP

【ＦＩ】

C07K14/015 ZNA

C07K7/06

C07K7/08

C12N15/35

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N7/01

A61K35/76

A61P27/02

A61K48/00

A61K39/395 N

A61K39/395 D

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024548574

(86)(22)【出願日】2023-02-16

(85)【翻訳文提出日】2024-10-16

(86)【国際出願番号】 CN2023076389

(87)【国際公開番号】W WO2023155828

(87)【国際公開日】2023-08-24

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2022/076619

(32)【優先日】2022-02-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524102051

【氏名又は名称】スカイライン、セラピューティクス、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＫＹＬＩＮＥＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町洋

(74)【代理人】

【識別番号】100219988

【弁理士】

【氏名又は名称】中島伸吾

(72)【発明者】

【氏名】イェンチュン、シュー

(72)【発明者】

【氏名】チンチャオ、ホウ

(72)【発明者】

【氏名】ホーピン、リー

(72)【発明者】

【氏名】レン、チオンチオン

(72)【発明者】

【氏名】シアオ、ルーメイ

(72)【発明者】

【氏名】ウー、ピン

(72)【発明者】

【氏名】リー、ペイルー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA60

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA331

4C085AA13

4C085BB11

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA33

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA18

4H045CA01

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、治療のための遺伝子産物を送達するための修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド及び修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含む新規の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に関する。本発明はまた、本発明のｒＡＡＶを含む医薬組成物、及び網膜疾患の処置を必要とする対象の眼に本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物を投与することを含む網膜疾患を処置する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、ループＩＶに挿入されたペプチドを含み、前記挿入されたペプチドが、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
に示されるアミノ酸配列であって、式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択され、
前記スペーサー１及び２は、Ａ、Ｌ及びＧから選択される１個以上、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～３個のアミノ酸を独立して含む、アミノ酸配列
を含む、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド。

【請求項2】

前記挿入されたペプチドが、式ＩＩ：
Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｙ４－Ｙ５（ＩＩ）
に示されるアミノ酸配列であって、式中、
スペーサー１は、アミノ酸Ｙ１、Ｙ２及びＹ３からなり、
スペーサー２は、アミノ酸Ｙ４及びＹ５からなり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択される、アミノ酸配列
を含む、請求項１に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項3】

Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７が、配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）、配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）、配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）及び配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）から選択されるアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項4】

前記挿入されたペプチドが、配列番号１０（ＡＡＡＧＫＧＰＴＴＫＡＡ）、配列番号１１（ＡＡＡＬＡＥＰＳＲＰＡＡ）、配列番号１２（ＡＬＡＬＧＰＰＳＫＰＡＡ）及び配列番号１３（ＡＡＧＮＳＰＴＧＲＮＡＡ）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項5】

前記親ＡＡＶカプシドポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１３８～７３５、若しくは配列番号１のアミノ酸２０３～７３５を含むＡＡＶ２カプシドポリペプチド、又は全長、アミノ酸１３８～７３５、若しくはアミノ酸２０３～７３５にわたって配列番号１と少なくとも９０％同一であるそのバリアントである、請求項１～４のいずれか一項に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項6】

前記ペプチドが、配列番号１の５８７位及び５８８位に対応する位置の間に挿入されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項7】

配列番号２、３、４及び５から選択されるアミノ酸配列、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項10】

請求項８に記載のポリヌクレオチド又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項11】

請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、又は請求項１０に記載の宿主細胞を含むｒＡＡＶをパッケージングするためのシステム又はキット。

【請求項12】

修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドと遺伝子産物をコードするゲノムとを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、ループＩＶに挿入されたペプチドを含み、前記挿入されたペプチドは、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
に示されるアミノ酸配列であって、式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択され、
前記スペーサー１及び２は、Ａ、Ｌ及びＧから選択される１個以上のアミノ酸を独立して含む、アミノ酸配列
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項13】

【請求項14】

Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７が、配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）、配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）、配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）及び配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）から選択されるアミノ酸配列である、請求項１２又は１３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項15】

前記挿入されたペプチドが、配列番号１０（ＡＡＡＧＫＧＰＴＴＫＡＡ）、配列番号１１（ＡＡＡＬＡＥＰＳＲＰＡＡ）、配列番号１２（ＡＬＡＬＧＰＰＳＫＰＡＡ）及び配列番号１３（ＡＡＧＮＳＰＴＧＲＮＡＡ）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項16】

前記親ＡＡＶカプシドポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１３８～７３５、若しくは配列番号１のアミノ酸２０３～７３５を含むＡＡＶ２カプシドポリペプチド、又は全長、アミノ酸１３８～７３５、若しくはアミノ酸２０３～７３５にわたって配列番号１と少なくとも９０％同一であるそのバリアントである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項17】

前記ペプチドが、配列番号１の５８７位及び５８８位に対応する位置の間に挿入されている、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項18】

前記修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドが、配列番号２、３、４及び５から選択されるアミノ酸配列、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項19】

請求項１２～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物。

【請求項20】

請求項１２～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ又は請求項１９に記載の医薬組成物を、網膜疾患の処置を必要とする対象の眼に投与することを含む、網膜疾患を処置する方法。

【請求項21】

網膜疾患の処置に使用するための、請求項１２～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ又は請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項22】

網膜疾患を処置するための医薬品の調製における、請求項１２～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ又は請求項１９に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子治療に関する。特に、本発明は、治療のための遺伝子産物を送達するための修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド及び修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含む新規の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、遺伝子治療がますます注目されている。改良された遺伝子導入技術は、遺伝子治療の開発に大いに役立つ。

【0003】

遺伝子治療は、当初、機能喪失変異などの先天性遺伝エラーを修正するために、患者の細胞に外来遺伝子を導入することに関連していた。現在承認されている遺伝子治療プロトコルのほとんどは、患者において欠損している遺伝子の機能的コピーを患者の体細胞に導入することを伴っている。しかしながら、最近、遺伝子治療は、遺伝子治療を必要とする生物に新しい遺伝情報を導入することによる疾患表現型の修正として広く定義されている。

【0004】

ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療では、移入された遺伝子（導入遺伝子）は、筋肉造血幹細胞、動脈壁、神経系、肺、及び眼などのレシピエント生物の器官、組織、及び細胞にｉｎｓｉｔｕで導入される。

【0005】

眼にｉｎｓｉｔｕで導入遺伝子を導入することによるインビボ遺伝子治療は、眼疾患（失明を引き起こすものなど）の処置に使用されてきた。そのような疾患の例は、網膜色素変性症、黄斑症、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症、早期発症型重症網膜ジストロフィー、全色盲、網膜眼瞼裂症、眼白皮症、眼白皮症、緑内障、シュタルガルト病、無脈絡膜（ｃｈｏｒｏｉｄ－ｆｒｅｅ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（Ｗｅｔ－ＡＭＤを含む）、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡＴ）、色盲、及び角膜を冒すリソソーム蓄積症（ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＶ及びＭＰＳＶＩＩなど）である。

【0006】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科のメンバーである。それは単純な一本鎖ＤＮＡウイルスであり、複製のためにヘルパーウイルス（アデノウイルスなど）を必要とする。野生型ＡＡＶのゲノムは、約４．７キロベース（ｋｂ）を含み、ＤＮＡ複製の開始中にプライマーとして機能するヘアピン構造に折り畳まれ得る中断されたパリンドローム配列を有する２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列の間にｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子を含む。ｃａｐ遺伝子はウイルスカプシドタンパク質をコードし、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶの複製及び組み込みに関与している。ＡＡＶは多種の細胞に感染することができ、ウイルスＤＮＡはｒｅｐ産物の存在下でヒト１９番染色体に組み込まれ得る。

【0007】

臨床開発中のｒＡＡＶ遺伝子治療の大部分は、脳及び眼を含むＣＮＳに焦点を当てている。臨床試験においてベクターとして現在使用されているカプシド血清型は十数種ほどあり、最も多いのは眼疾患のためのＡＡＶ２ベースのプラットフォームである。

【0008】

特に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された初のｒＡＡＶ遺伝子治療薬であるルクスターナは、ＲＰＥ６５遺伝子変異によって引き起こされる遺伝型の視力喪失を有する患者をＡＡＶ２を使用して処置する。しかしながら、より新しい修飾されたより効率的なカプシドがますます必要とされている。

【0009】

新しい特性及び特徴を得るために、新規のＡＡＶカプシドの操作が絶えず追求されてきた。合理的な設計アプローチに対する主な制限は、ＡＡＶ細胞表面結合、内在化、輸送、脱外被及び遺伝子発現に関する知識が不十分であることに関連している。

【0010】

いくつかの修飾ＡＡＶカプシドが開発されているが（例えば、国際公開第２０１２１４５６０１Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１６１３４３７５Ａ１号パンフレット及び国際公開第２０１８０２２９０５Ａ２号パンフレットを参照されたい）、疾患を処置するための産物をコードするポリヌクレオチドのｉｎｓｉｔｕ送達のための遺伝子療法など、眼疾患のための遺伝子療法を改善するための新規な修飾ＡＡＶカプシドを開発する必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

第１の態様では、本発明は、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、ループＩＶに挿入されたペプチドを含む修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドであって、挿入されたペプチドが、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択される］
に示されるアミノ酸配列を含む、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを提供する。

【0012】

本発明はさらに、本発明の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及び該ポリヌクレオチド、又は該ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0013】

第２の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞を含むｒＡＡＶをパッケージングするためのシステム又はキットを提供する。

【0014】

第３の態様では、本発明は、本発明の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドと遺伝子産物をコードするゲノムとを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。

【0015】

第４の態様では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む医薬組成物を提供する。

【0016】

本発明は、ｒＡＡＶ又は本発明の医薬組成物を、網膜疾患の処置を必要とする対象の眼に投与することを含む、網膜疾患を処置する方法を提供する。

【0017】

網膜疾患の処置に使用するための本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物が提供される。

【0018】

本発明は、網膜疾患を処置するための医薬品の調製における本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物の使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】ｒＡＡＶを調製するためのヘルパープラスミドを示す。

【図1B】ｒＡＡＶを調製するためのパッケージングプラスミドを示す。

【図1C】ｒＡＡＶを調製するための導入遺伝子プラスミドを示す。

【図1D】ｒＡＡＶを調製するための導入遺伝子プラスミドを示す。

【図2】様々なＭＯＩでＧＦＰをコードするゲノムを含むｒＡＡＶで形質導入された網膜細胞の蛍光顕微鏡法を示す。

【図3】二価Ｎｂ２４及び様々なカプシドポリペプチドをコードするゲノムを含むｒＡＡＶで形質導入された網膜細胞におけるＮｂ２４の発現を示し、Ｙ軸は濃度の「ｌｇ」値を示し、「０」点は「１」の濃度を表す。

【図4】レーザー誘起脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおける研究のワークフローを示す。

【図5】Ｎｂ２４の検出のためのＥＬＩＳＡの機構を示す。

【図6】眼組織におけるＮｂ２４レベルを示す。

【図7】末梢組織及び血清中のＮｂ２４レベルを示す。

【図8】ビヒクルで処置したサルの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＲ）の眼底写真（ＦＰ）及び眼底写真（ＦＦＡ）画像を示す。

【図9】Ｅｙｌｅａ（登録商標）で処置したサルの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＲ）の眼底写真（ＦＰ）及び眼底写真（ＦＦＡ）画像を示す。

【図10】ＡＡＶ．ＬＡＥ－Ｎｂ２４で処置したサルの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＲ）の眼底写真（ＦＰ）及び眼底写真（ＦＦＡ）画像を示す。

【図11】ＡＡＶ．ＲＨ１０－Ｎｂ２４で処置したサルの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＲ）の眼底写真（ＦＰ）及び眼底写真（ＦＦＡ）画像を示す。

【図12】ＡＡＶ．ＬＧＰ－Ｎｂ２４で処置したサルの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＲ）の眼底写真（ＦＰ）及び眼底写真（ＦＦＡ）画像を示す。

【図13】ＡＡＶ．７ｍ８－Ｎｂ２４で処置したサルの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＲ）の眼底写真（ＦＰ）及び眼底写真（ＦＦＡ）画像を示す。

【図14】ＡＡＶ．ＧＫＧ－Ｎｂ２４で処置したサルの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＲ）の眼底写真（ＦＰ）及び眼底写真（ＦＦＡ）画像を示す。

【図15】ＡＡＶ．ＮＳＰ－Ｎｂ２４で処置したサルの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＲ）の眼底写真（ＦＰ）及び眼底写真（ＦＦＡ）画像を示す。

【図16】ＡＡＶ９－Ｎｂ２４で処置したサルの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＲ）の眼底写真（ＦＰ）及び眼底写真（ＦＦＡ）画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

１．定義
別段の指示がない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、当業者にとっての意味と同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内である微生物学及び組換えＤＮＡ技術の従来の技術を用いる。

【0021】

「網膜細胞」という用語は、本明細書では、網膜に含まれる任意の細胞型、例えば網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、並びに桿体及び錐体を含む光受容体細胞、ミュラーグリア細胞、並びに網膜色素上皮を指すことができる。

【0022】

「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルス自体又はその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、別途要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ並びに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。略語「ｒＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶベクター（又は「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる組換えアデノ随伴ウイルスを指す。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ－６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ－７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ－８）、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指すなどである。

【0023】

ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、並びに天然末端反復配列（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で公知である。そのような配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ－１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ－１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ－２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ－２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ－３）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ－４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ－４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ－５）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ－７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ－８）、及びＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ－８）を参照されたい；その開示は、ＡＡＶ核酸及びアミノ酸配列を教示するために参照により本明細書に組み込まれる。

【0024】

本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般的に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般に２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子及びｒＡＡＶベクタープラスミド（導入遺伝子プラスミドとも呼ばれる）の両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。

【0025】

「ＡＡＶウイルス」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（典型的には野生型ＡＡＶのすべてのカプシドタンパク質による）及びカプシド化ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは典型的には「ｒＡＡＶベクター粒子」又は単に「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ｒＡＡＶ粒子の産生は、そのようなベクターがｒＡＡＶ粒子内に含まれることから、ｒＡＡＶベクターの産生を必然的に含む。

【0026】

「パッケージング」は、ＡＡＶ粒子の集合及びカプセル化をもたらす一連の細胞内事象を指す。

【0027】

ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製及びカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と呼ばれる。ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含むプラスミド又は他の発現ベクターは、本明細書では「パッケージングプラスミド」又は「パッケージングベクター」と呼ばれる。

【0028】

ｃａｐ遺伝子は、およそ１：１：１０の比で６０量体の正二十面体カプシドに自己集合する３つの構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。これらの３つのタンパク質は、同じオープンリーディングフレームから転写され、Ｃ末端ドメインを共有するが、選択的開始コドン及び選択的スプライシングに起因して異なるＮ末端を有する（ＥｓｔｈｅｒＪ．Ｌｅｅら、Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ：ＲａｔｉｏｎａｌＤｅｓｉｇｎＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＣａｐｓｉｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｍｅｄＥｎｇ．２０１８；７：５８－６３）。例えば、野生型ＡＡＶ２カプシドは、配列番号１のＶＰ１、配列番号１のアミノ酸１３８～７３５のＶＰ２、及び配列番号１のアミノ酸２０３～７３５のＶＰ３を含み得る。

【0029】

ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（例えば野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製及びパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びポックスウイルス、例えばワクシニアを含む、ＡＡＶのための多種のそのようなヘルパーウイルスが当該技術分野で公知である。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物及び鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペスウイルス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、並びにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらはＡＴＣＣなどの寄託機関からも入手可能である。

【0030】

「ヘルパーウイルス機能」とは、（本明細書に記載される複製及びパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶの複製及びパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにコードされる機能を指す。本明細書に記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、又は例えば、必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をトランスで産生細胞に提供することを含む、いくつかの方法で提供され得る。例えば、本明細書で「ヘルパープラスミド」と呼ばれるプラスミド、又は１つ以上のアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む他の発現ベクターが、ｒＡＡＶベクターと共にプロデューサー細胞にトランスフェクトされる。

【0031】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は天然に存在しない核酸セグメントを含有するように修飾された一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド構築物が本発明のコード配列を発現するのに必要な制御配列を含む場合、ポリヌクレオチド構築物は「発現カセット」を含む。

【0032】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に、核酸分子（例えば、１００塩基長及び最大３０キロベースの長さ）並びにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡの断片若しくは分子の配列と相補的（アンチセンス）又は同一（センス）である配列を指す。この用語はまた、転写又は非転写のいずれかであるＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指すことができる。

【0033】

「外因性ポリヌクレオチド」という用語は、それが配置されている宿主に由来しないヌクレオチド配列を指す。それは、宿主のＤＮＡと同一であっても異種であってもよい。一例は、ベクターに挿入された目的の配列である。そのような外因性ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを含む多種の供給源に由来し得る。外因性ポリヌクレオチドはまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を包含する。

【0034】

「異種」とは、比較されている実体の残りのものとは遺伝子型的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる種に由来するプラスミド又はベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。その天然のコード配列から除去され、天然には連結されていないコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされた異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常コードされない遺伝子産物である。

【0035】

ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドと特定のパーセント「配列同一性」を有し、これは、アラインメントされたとき、２つの配列を比較したときに塩基又はアミノ酸のそのパーセンテージが同じであることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法及びコンピュータプログラムを使用して配列をアラインメントさせることができる。別のアラインメントアルゴリズムは、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全子会社である米国ウィスコンシン州マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで入手可能なＦＡＳＴＡである。

【0036】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、ポリヌクレオチドの発現のために提供される追加のヌクレオチド、例えば制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドセグメントを指す。

【0037】

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。

【0038】

「制御配列」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要又は有益なすべての要素を含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して天然であっても外来であってもよく、又は互いに天然であっても外来であってもよい。そのような制御配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサー、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモーター並びに転写及び翻訳の終結のためのシグナルを含む。

【0039】

例えば、制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために宿主細胞によって認識されるヌクレオチド配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンであり得る。プロモーターには、変異型プロモーター、切断型プロモーター及びハイブリッドプロモーターも含まれ、宿主細胞と相同又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

【0040】

本明細書で使用される場合、本明細書で「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に配置され、それによって制御配列がポリペプチドコード配列の発現を指示する構成を指す。

【0041】

「遺伝子」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。

【0042】

「遺伝子産物」は、特定の遺伝子の発現から生じる分子である。遺伝子産物には、例えば、ポリペプチド、アプタマー、干渉ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが含まれる。

【0043】

「低分子干渉ＲＮＡ」又は「小分子干渉ＲＮＡ」又はｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子（「標的遺伝子」）を標的とするヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖である。「ＲＮＡ二重鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対合によって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、遺伝子を「標的とする」。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖の長さは３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１又は１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、二重鎖の長さは１９～２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖部分はヘアピン構造の一部であり得る。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二重鎖を形成する２つの配列の間に位置決めされたループ部分を含み得る。ループの長さは様々であり得る。いくつかの実施形態では、ループは５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造はまた、３’又は５’オーバーハング部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、０、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長の３’又は５’オーバーハングである。

【0044】

「ショートヘアピンＲＮＡ」、又はｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡを発現させることができるポリヌクレオチド構築物である。

【0045】

本明細書で使用される「組換え」という用語は、ＤＮＡ組換え（クローニング）方法を使用して生成された核酸、ベクター、ポリペプチド、又はタンパク質を指し、天然又は野生型の核酸、ベクター、ポリペプチド、又はタンパク質と区別可能である。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸のポリマーを指し、全長タンパク質及びその断片を含む。

【0046】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を指し、それらはｒＡＡＶベクターのレシピエントとして使用され得るか、又は使用されていた。この用語は、形質導入された元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列で形質導入された細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶発的な、又は意図的な変異のために、元の親と形態又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一ではない場合があることが理解される。

【0047】

本明細書で使用される「薬学的に許容され得る」という用語は、生理学的に忍容性であり、典型的には、ヒトに投与した場合に毒性又はアレルギー若しくは同様の有害反応、例えば胃の不調、めまいなどを引き起こさない分子実体及び組成物を指す。

【0048】

本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト、ヒト以外の霊長類、例えばチンパンジー並びに他の類人猿及びサル種；農用動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ；家畜哺乳類、例えばイヌ及びネコ；マウス、ラット及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物を含むが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。したがって、成人及び新生児の対象、並びに胎児は、男性であろうと女性であろうと、網羅されることが意図されている。

【0049】

「遺伝子改変」及び「遺伝子修飾」（及びその文法上の変形）という用語は、有糸分裂又は減数分裂
以外によって遺伝的要素（例えば、ポリヌクレオチド）が細胞に導入されるプロセスを指すために本明細書において互換的に使用される。要素は、細胞に対して異種であってもよく、又は細胞内に既に存在する要素の追加のコピー若しくは改良されたバージョンであってもよい。遺伝子改変は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、又はポリヌクレオチド－リポソーム複合体との接触などの当該技術分野で公知の任意のプロセスを介して組換えプラスミド又は他のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることによって行われ得る。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルス又はウイルスベクターによる形質導入又は感染によって達成され得る。一般に、遺伝要素は、細胞内の染色体又はミニ染色体に導入されるが、細胞及びその子孫の表現型及び／又は遺伝子型を変化させる任意の改変がこの用語に含まれる。

【0050】

細胞は、インビトロでの細胞の長期培養中にその機能を果たすために配列が利用可能である場合、遺伝子配列によって「安定に」改変、形質導入、遺伝子修飾、又は形質転換されていると言われる。一般に、そのような細胞は、改変された細胞の子孫にも継承可能な遺伝子修飾が導入されるという点で「遺伝的に」改変されている（遺伝子修飾されている）。

【0051】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、又は標識成分とのコンジュゲーション。ポリペプチド、例えば、抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチドなどは、遺伝子産物を哺乳動物対象に送達することに関連して議論される場合、及びその組成物は、それぞれのインタクトなポリペプチド、又はその任意の断片若しくは遺伝子操作された誘導体を指し、これはインタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持する。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、及び哺乳動物対象への遺伝子産物の送達に使用するための他のそのような核酸（レシピエント細胞に送達される「導入遺伝子」と呼ばれ得る）への言及には、所望の生化学的機能を有するインタクトなポリペプチド又は任意の断片若しくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドが含まれる。

【0052】

「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞又は他の物質は、物質又は類似の物質が天然に存在するか又は最初に調製される場合にも存在し得る他の成分の少なくともいくつかを欠く物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、それを供給源混合物から濃縮するために精製技術を使用することによって調製され得る。濃縮は、溶液の体積当たりの重量などの絶対的な基準で測定することができ、又は供給源混合物中に存在する第２の潜在的な干渉物質に関して測定することができる。本開示の実施形態の濃縮度の増加は、ますます単離されている。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞又は他の物質は、いくつかの実施形態では、精製されており、例えば、約８０％～約９０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、又は少なくとも約９９％以上純粋である。

【0053】

本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患又はその症候を完全に又は部分的に予防するという点で予防的であり得、且つ／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用の部分的若しくは完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、以下を含む：（ａ）疾患に罹患しやすい可能性があるか、又は疾患を獲得するリスクがあるが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において疾患が発生するのを予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること；（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすこと。

【0054】

本明細書で使用される場合、「ＥＤ５０」という用語は、薬剤の有効用量の中央値、すなわち最大応答の５０％をもたらすことができる用量を意味する。組換えウイルス（例えばｒＡＡＶ）を用いて細胞内に発現される導入遺伝子を送達するために、ＥＤ５０は、導入遺伝子の最大発現の５０％が達成されるＭＯＩとして発現され得る。

【0055】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載値又は介在値は、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。

【0056】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「修飾ＡＡＶカプシド」への言及は、複数のそのようなカプシドを含む。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙、又は「否定的な」限定の使用に関連して、「もっぱら」、「のみ」などの排他的な用語を使用するための先行詞としての役割を果たすことを意図している。

【0057】

２．修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド及びコードポリヌクレオチド
本発明は、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、ループＩＶに挿入されたペプチドを含む修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドであって、挿入されたペプチドが、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択される］
に示されるアミノ酸配列を含む、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを提供する。

【0058】

いくつかの実施形態では、スペーサー１及びスペーサー２は、１個以上のアミノ酸を独立して、含む。いくつかの実施形態では、スペーサー１及びスペーサー２は、１～１０個のアミノ酸を独立して、含む。いくつかの実施形態では、スペーサー１及びスペーサー２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を独立して、含む。いくつかの実施形態では、スペーサー１及びスペーサー２は、１～３個のアミノ酸を独立して含む。いくつかの実施形態では、スペーサー１及びスペーサー２は、１～３個のアミノ酸から独立してなる。

【0059】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択され、
スペーサー１及びスペーサー２は、Ａ、Ｌ及びＧから選択される１個以上のアミノ酸を独立して含む］
に示されるアミノ酸配列を含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択され、
スペーサー１及びスペーサー２は、Ａ、Ｌ及びＧから選択される１～１０個のアミノ酸を独立して含む］
に示されるアミノ酸配列を含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択され、
スペーサー１及びスペーサー２は、Ａ、Ｌ及びＧから選択される１～３個のアミノ酸を独立して含む］
に示されるアミノ酸配列を含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７は、配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）、配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）、配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）及び配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）から選択されるアミノ酸配列である。

【0063】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、式ＩＩ：
Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｙ４－Ｙ５（ＩＩ）
［式中、スペーサー１は、アミノ酸Ｙ１、Ｙ２及びＹ３からなり、スペーサー２は、アミノ酸Ｙ４及びＹ５からなり、Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択される］に示されるアミノ酸配列を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。

【0065】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２はＡであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。

【0066】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、配列番号１０、１１、１２及び１３から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0067】

【0068】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、存在する場合、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、存在する場合、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、存在する場合、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、存在する場合、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。

【0069】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。

【0070】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。

【0071】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、配列番号１０、１１、１２及び１３から選択されるアミノ酸配列からなる。

【0072】

いくつかの実施形態では、親ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ＡＡＶ２カプシドポリペプチドＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３である。いくつかの実施形態では、親ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１３８～７３５、又は配列番号１のアミノ酸２０３～７３５又はそのバリアントを含むＡＡＶ２カプシドポリペプチドである。いくつかの実施形態では、バリアントは、全長、アミノ酸１３８～７３５、又はアミノ酸２０３～７３５にわたって配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％又は９９．８％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換及び／又は付加を含む。好ましくは、アミノ酸の挿入は、本発明の挿入されたペプチドとは異なる部位で行われ、より好ましくはループＩＶでは行われない。好ましくは、アミノ酸の置換は、保存された置換である。いくつかの実施形態では、親ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１３８～７３５、又は配列番号１のアミノ酸２０３～７３５からなる。

【0073】

ＡＡＶ２カプシドポリペプチドの場合、ループＩＶは配列番号１の５７０位～６１１位に対応する。したがって、換言すれば、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、配列番号１の５７０位～６１１位に対応する領域に挿入された上記で定義されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１の５８７位及び５８８位に対応する親カプシドポリペプチドの位置の間に挿入される。

【0074】

いくつかの実施形態では、本発明の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２、３、４及び５から選択されるアミノ酸配列、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７を含む。いくつかの実施形態では、本発明の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２、３、４及び５から選択されるアミノ酸配列、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７からなる。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２、３、４又は５のバリアントを含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、バリアントは、全長にわたって配列番号２、３、４若しくは５、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％若しくは９９．８％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号２、３、４若しくは５と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換及び／又は付加を含む。好ましくは、アミノ酸の挿入は、本発明の挿入されたペプチドとは異なる部位（配列番号１０、１１、１２及び１３）で行われ、より好ましくはループＩＶで行われない。好ましくは、アミノ酸の置換は、保存された置換である。

【0075】

いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号１４、１５、１６及び１７から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号１４、１５、１６又は１７のバリアントによってコードされる。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％又は９９．８％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上のヌクレオチドの置換及び／又は付加を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と比較して、３ｎ（ｎは整数であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上である）ヌクレオチドの挿入及び／又は欠失を含む。好ましくは、ヌクレオチドの挿入は、本発明の挿入されたペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０、１１、１２及び１３）とは異なる部位で行われ、より好ましくはループＩＶをコードするヌクレオチド配列では行われない。好ましくは、バリアントは縮重バリアントであるか、又はヌクレオチドの置換はアミノ酸の保存された置換をもたらす。

【0076】

本発明はさらに、本発明の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0077】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、１５、１６及び１７から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、１５、１６及び１７から選択されるヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％又は９９．８％同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％又は９９．８％同一のヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上のヌクレオチドの置換及び／又は付加を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と比較して、３ｎ（ｎは整数であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上である）ヌクレオチドの挿入及び／又は欠失を含む。好ましくは、ヌクレオチドの挿入は、本発明の挿入されたペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０、１１、１２及び１３）とは異なる部位で行われ、より好ましくはループＩＶをコードするヌクレオチド配列では行われない。好ましくは、ポリヌクレオチドは配列番号１４、１５、１６若しくは１７の縮重バリアントを含むか、又はヌクレオチドの置換はアミノ酸の保存された置換をもたらす。好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、１５、１６若しくは１７の縮重バリアントからなり、又はヌクレオチドの置換はアミノ酸の保存された置換をもたらす。

【0078】

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0079】

本発明の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、眼、特に網膜細胞へのＡＡＶの改善された形質導入を可能にする。

【0080】

３．ｒＡＡＶのパッケージング
ｒＡＡＶを、ｉ）所望の遺伝子産物をコードするｒＡＡＶのゲノムを含む導入遺伝子プラスミド、ｉｉ）ＲＥＰ及び／又はＣＡＰタンパク質をコードするパッケージングプラスミド、並びにｉｉｉ）ヘルパープラスミド（例えば、ＣｒｏｓｓｏｎＳＭら、Ｈｅｌｐｅｒ－ｆｒｅｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＧｒａｄｅＡＡＶａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＩｏｄｉｘａｎｏｌＤｅｎｓｉｔｙＧｒａｄｉｅｎｔＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎＭｏｌＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎＤｅｖ．２０１８；１０：１－７を参照されたい）を含む３つのプラスミドを含む系でパッケージングすることが当該技術分野で公知である。ｒＡＡＶの産生方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号明細書にも記載されている。

【0081】

本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを宿主細胞に導入することを含む、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするための方法を提供する。

【0082】

いくつかの実施形態では、ベクターは、本発明のポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されている発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本発明のベクターはさらに、プロモーターに作動可能に連結されたｒｅｐ遺伝子を含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、宿主細胞はさらに、ヘルパープラスミド、及び／又はｒＡＡＶベクターを含む。本発明のｒＡＡＶを生成するために本発明の宿主細胞が使用される場合、それを「パッケージング細胞」と呼ぶ。

【0084】

本発明のポリヌクレオチド又はベクターは、限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介性トランスフェクションなどを含む定義された技術を使用して、安定に又は一過性に宿主細胞に導入することができる。安定な形質転換のために、対象核酸は、典型的には、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーに作動可能に連結される。

【0085】

宿主細胞は、例えば、マウス細胞及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）を含む哺乳動物細胞などの多種の細胞である。適切な哺乳動物細胞には、初代細胞及び細胞株が含まれるが、これらに限定されず、適切な細胞株には、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞などが含まれるが、これらに限定されない。適切な宿主細胞の非限定的な例には、例えば、ＨｅＬａ細胞（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが含まれる。ＡＡＶを産生する細菌細胞、例えばＳｆ９細胞もまた、本発明の宿主細胞を調製するために使用することができる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号明細書；米国特許出願第１２／２９７，９５８号明細書を参照されたい）。

【0086】

本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞を含むｒＡＡＶをパッケージングするためのシステム又はキットを提供する。いくつかの実施形態では、システム又はキットはさらに、ヘルパープラスミド及び／又はｒＡＡＶベクターを含む。

【0087】

４．組換えＡＡＶ
本発明は、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドと遺伝子産物をコードするゲノムとを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、ループＩＶに挿入されたペプチドを含み、挿入されたペプチドは、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択される］
に示されるアミノ酸配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。

【0088】

【0089】

【0090】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択され、
スペーサー１及びスペーサー２は、Ａ、Ｌ及びＧから選択される１～１０個のアミノ酸を独立して含む］
に示されるアミノ酸配列を含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択され、
スペーサー１及びスペーサー２は、Ａ、Ｌ及びＧから選択される１～３個のアミノ酸を独立して含む］
に示されるアミノ酸配列を含む。

【0092】

【0093】

【0094】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、存在する場合、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、存在する場合、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、存在する場合、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１～Ｙ５の各々は、存在する場合、Ａ、Ｌ及びＧから独立して選択される。

【0095】

【0096】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）－Ｙ４－Ｙ５のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｙ１はＡであり、Ｙ２は、Ａ又はＬであり、Ｙ３は、Ａ又はＧであり、Ｙ４はＡであり、Ｙ５はＡである。

【0097】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、配列番号１０（ＡＡＡＧＫＧＰＴＴＫＡＡ）、配列番号１１（ＡＡＡＬＡＥＰＳＲＰＡＡ）、配列番号１２（ＡＬＡＬＧＰＰＳＫＰＡＡ）及び配列番号１３（ＡＡＧＮＳＰＴＧＲＮＡＡ）から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0098】

【0099】

【0100】

【0101】

【0102】

いくつかの実施形態では、挿入されたペプチドは、配列番号１０（ＡＡＡＧＫＧＰＴＴＫＡＡ）、配列番号１１（ＡＡＡＬＡＥＰＳＲＰＡＡ）、配列番号１２（ＡＬＡＬＧＰＰＳＫＰＡＡ）及び配列番号１３（ＡＡＧＮＳＰＴＧＲＮＡＡ）から選択されるアミノ酸配列からなる。

【0103】

【0104】

いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、配列番号１の５７０位～６１１位に対応する領域に挿入された上記で定義されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１の５８７位及び５８８位に対応する親カプシドポリペプチドの位置の間に挿入される。

【0105】

いくつかの実施形態では、本発明の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２、３、４及び５から選択されるアミノ酸配列、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７を含む。いくつかの実施形態では、本発明の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２、３、４及び５から選択されるアミノ酸配列、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７からなる。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２、３、４又は５のバリアントを含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、バリアントは、全長にわたって配列番号２、３、４若しくは５、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％若しくは９９．８％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号２、３、４若しくは５と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換及び／又は付加を含む。好ましくは、アミノ酸の挿入は、本発明の挿入されたペプチドとは異なる部位（配列番号１０、１１、１２又は１３）で行われ、より好ましくはループＩＶで行われない。好ましくは、アミノ酸の置換は、保存された置換である。

【0106】

いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号１４、１５、１６及び１７から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号１４、１５、１６又は１７のバリアントによってコードされる。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％又は９９．８％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上のヌクレオチドの置換及び／又は付加を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１４、１５、１６若しくは１７と比較して、３ｎ（ｎは整数であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上である）ヌクレオチドの挿入及び／又は欠失を含む。好ましくは、ヌクレオチドの挿入は、本発明の挿入されたペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０、１１、１２又は１３）とは異なる部位で行われ、より好ましくはループＩＶをコードするヌクレオチド配列では行われない。好ましくは、バリアントは縮重バリアントであるか、又はヌクレオチドの置換はアミノ酸の保存された置換をもたらす。

【0107】

いくつかの実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、好ましくは硝子体内注射によって投与した場合、親ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むＡＡＶと比較して、網膜細胞に対する改善された感染性を示す。

【0108】

本発明のｒＡＡＶのゲノムは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物はアプタマーである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物はポリペプチドである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は部位特異的ヌクレアーゼである。

【0109】

遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、適切なＲＮＡｉには、細胞内アポトーシス又は血管新生因子のレベルを低下させるＲＮＡｉが含まれる。例えば、ＲＮＡｉは、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、及びＢａｄ遺伝子産物（例えば、米国特許第７，８４６，７３０号明細書を参照されたい）を含む、細胞においてアポトーシスを誘導又は促進する遺伝子産物のレベルを低下させるｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであり得る。干渉ＲＮＡはまた、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２に対するｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡなどの抗血管新生産物であり得る。

【0110】

遺伝子産物がアプタマーである場合、アプタマーの例示的な標的には、例えば、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦが含まれる。

【0111】

遺伝子産物がポリペプチドである場合、ポリペプチドは通常、棒状又は円錐形の光受容体細胞、網膜ガングリオン細胞、ミュラー細胞（ｍｕｌｌｅｒｃｅｌｌｓ）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞又は、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞機能を増強する。機能性ペプチド。例示的なポリペプチドには、神経保護ポリペプチド（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ４、ＮＧＦ及びＮＴＮ）；抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体）；ＶＥＧＦ結合抗体；ｓｃＦｖ及びナノボディなどのＶＥＧＦ結合抗体断片；エンドスタチン；タムスタチン；アンジオスタチン；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）；可溶性Ｔｉｅ－２受容体など；メタロプロテイナーゼ－３の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－３）；光反応性オプシン（オプシン）、例えばロドプシン；抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘ１）などが含まれる。適切なポリペプチドには、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；線維芽細胞成長因子２；ニューロトロフィン（ＮＴＮ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；神経成長因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）；供給源神経栄養因子（ＢＤＮＦ；例えば、図１１に示されるアミノ酸配列の約２００アミノ酸～２４７アミノ酸を含む連続セグメント（配列番号１１）は、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は１００％のアミノ酸配列アミノ酸配列ポリペプチド；上皮成長因子；ロドプシン；Ｘ結合型アポトーシスタンパク質阻害剤；及び音波因子（Ｓｏｎｉｃ）ヘッジホッグ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0112】

いくつかの実施形態では、目的の遺伝子産物は、網膜疾患に関連する遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、遺伝子は疾患で高度に発現される。

【0113】

欠陥対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、欠陥対立遺伝子をコードするタンパク質の機能的コピーとのドナーＤＮＡの相同組換えを刺激することもできる。したがって、例えば、本発明のｒＡＡＶを使用して、欠陥対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼを送達するために使用することができ、欠陥対立遺伝子の機能的コピーを送達するために使用することができ、機能的コピー修復を引き起こし、それによって機能的網膜タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的エンドヌクレアーゼ及び欠陥対立遺伝子の機能的コピーは、別々のｒＡＡＶによって送達される。

【0114】

部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。

【0115】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物はＶＥＧＦに対する抗体である。例えば、Ｎｏｖａｍａｂは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する「Ｎｂ２４」と呼ばれるＶＥＧＦに対するナノボディを同定した。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、配列番号２４を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、（Ｇ_４Ｓ）_２リンカーなどのリンカーによって連結された２つのＮｂ２４を含む二価Ｎｂ２４である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶのゲノムは、ＩＴＲ、例えば配列番号２０に隣接する二価Ｎｂ２４をコードする発現カセットを含む。

【0116】

本発明のｒＡＡＶは、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して改善された網膜細胞への形質導入、遺伝子産物の発現増強、炎症応答の減少、所望の安全性及び／又は眼疾患に及ぼす堅牢な治療効果を提供する。

【0117】

５．医薬組成物及び医療用途
本発明は、ａ）本発明のｒＡＡＶと、ｂ）薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤又は緩衝剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤又は緩衝剤は、ヒトにおける使用に適している。

【0118】

そのような賦形剤、担体、希釈剤及び緩衝剤には、異常な毒性なしに投与することができる任意の薬剤が含まれる。薬学的に許容され得る賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールなどの液体が含まれるが、これらに限定されない。その中には、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩などの薬学的に許容され得る塩が含まれ得る。さらに、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのようなビヒクル中に存在してもよい。多種多様な薬学的に許容され得る賦形剤が当該技術分野で公知であり、本明細書で詳細に議論する必要はない。薬学的に許容され得る賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，」２０ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；ＨＣＡｎｓｅｌら、７ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ編ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（１９９９）；及びＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）ＡＨＫｉｂｂｅら、３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒ．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｓｏｃを含む様々な出版物で詳細に説明されている。

【0119】

本発明はさらに、本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物を眼に投与することを含む、対象の眼、特に網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。網膜細胞への遺伝子産物の送達は、網膜疾患の処置を提供することができる。網膜細胞は、光受容体、網膜ガングリオン細胞、ミュラー細胞（ｍｕｌｌｅｒｃｅｌｌｓ）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、又は網膜色素上皮細胞であり得る。場合によっては、網膜細胞は、桿体又は錐体などの光受容細胞である。

【0120】

本発明は、網膜疾患を処置する方法であって、網膜疾患の処置を必要とする対象に有効量の本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ又は医薬組成物は、眼内注射又は硝子体内注射によって投与される。ｒＡＡＶ又は医薬組成物は、単回投与又は複数回投与（例えば、２、３、４回以上の用量）スキームによって投与される。複数回投与スキームの場合、ｒＡＡＶ又は医薬組成物は、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために、毎日、毎週、毎月、毎年などの異なる間隔で投与することができる。

【0121】

本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物を眼に投与することを含む、対象の眼、特に網膜細胞への遺伝子産物の送達に使用するための、本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物も提供される。網膜細胞への遺伝子産物の送達は、網膜疾患の処置を提供することができる。網膜細胞は、光受容体、網膜ガングリオン細胞、ミュラー細胞（ｍｕｌｌｅｒｃｅｌｌｓ）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、又は網膜色素上皮細胞であり得る。場合によっては、網膜細胞は、桿体又は錐体などの光受容細胞である。

【0122】

網膜疾患の処置に使用するための、本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物も提供される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ又は医薬組成物は、眼内注射又は硝子体内注射によって投与される。ｒＡＡＶ又は医薬組成物は、単回投与又は複数回投与（例えば、２、３、４回以上の用量）スキームによって投与される。複数回投与スキームの場合、ｒＡＡＶ又は医薬組成物は、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために、毎日、毎週、毎月、毎年などの異なる間隔で投与することができる。

【0123】

本発明は、遺伝子産物を対象の眼、特に網膜細胞に送達するための医薬品の調製における本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物の使用を提供する。

【0124】

本発明は、網膜疾患の処置を必要とする対象において網膜疾患を処置するための医薬品の調製における本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物の使用を提供する。

【0125】

本発明のｒＡＡＶ又は医薬組成物によって処置することができる眼症には、急性黄斑変性症；ベーチェット病；脈絡膜新生血管；糖尿病性ブドウ膜炎；ヒストプラズマ症；黄斑変性、例えば急性黄斑変性、非滲出型加齢黄斑変性及び滲出型加齢黄斑変性；浮腫、例えば黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫及び糖尿病性黄斑浮腫；多巣性脈絡膜炎；後眼部又は位置に影響を及ぼす眼外傷；眼腫瘍；網膜障害、例えば、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、網膜炎の網膜炎（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓｏｆｔｈｅｒｅｔｉｎｉｔｉ）、交感性眼炎；ヴォークト－小柳－原田（ＶＫＨ）症候群；びまん性眼色素沈着；眼のレーザー処置によって引き起こされる又は影響を受ける後眼部症状；光線力学療法によって引き起こされる又は影響を受ける後眼部症状；光凝固、放射線網膜症；網膜前膜障害；網膜静脈分岐；前部虚血性視神経症；非網膜糖尿病性網膜機能障害；網膜瘻（網膜分離）；網膜色素変性；緑内障；アッシャー症候群；錐体－桿体細胞ジストロフィー；シュタルガルト病（眼底の黄色斑）；遺伝性黄斑変性；脈絡網膜変性；レーバー先天性黒内障；先天性静止夜盲症；無脈絡膜；バービー症候群（バルデー・ビードル症候群）；黄斑毛細血管拡張；レーバー遺伝性視神経症；未熟児網膜症；全色盲、赤色盲、緑色盲及び青色盲を含む色覚異常が含まれるが、これらに限定されない。

【実施例】

【0126】

以下の実施例は、本出願に対する限定ではなく、例示のみを目的として提供される。

【0127】

実施例１：修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むｒＡＶＶベクターの調製
ｒＡＡＶベクターは、ＣｒｏｓｓｏｎＳＭら、２０１８に記載されている方法と同様の方法で、異なるパッケージングプラスミド及び導入遺伝子プラスミドを使用して調製した。簡潔には、無血清ウイルス産生培地ＯＰＭ－２９３ＣＤ０５（ＳｈａｎｇｈａｉＯＰＭＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｏ．Ｌｔｄ．カタログ番号：８１０７５－００１）の３Ｅ６個の２９３ＶＰＣ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：Ａ３５３４７）を、ポリエチレンイミンを使用して、以下のヘルパープラスミド、ｒｅｐ／ｃａｐをコードするパッケージングプラスミド、及び導入遺伝子プラスミドで三重にトランスフェクトした：
－ヘルパープラスミド（ＣｒｏｓｓｏｎＳｍらに記載されているようなＡｄＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡＲＮＡヘルパー遺伝子を含む「ｐＨｅｌｐｅｒ」、そのマップを図１Ａに示す）；
－パッケージングプラスミド、そのマップは図１Ｂに示されており、この中で「ＡＡＶ２Ｃａｐ」は、表１に列挙されているカプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である（第２列）；
－ＧＦＰをコードする配列番号１９のｒＡＡＶゲノム又は抗ＶＥＧＦ抗体である二価Ｎｂ２４をコードする配列番号２０のｒＡＡＶゲノムを含む導入遺伝子プラスミドであって（図１Ｃ及び図１Ｄをそれぞれ参照されたい）、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ方法論を使用して要素を組み立てた（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉＤＮＡＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒＭｉｘ，ＮＥＢ，カタログ番号Ｅ２６２１）。

【0128】

配列番号１、１８又は２２のカプシドポリペプチドをコードするパッケージングプラスミドをＧｅｎｓｃｒｉｐｔＩｎｃ．（中国江西省南京）で合成し、配列番号２、３、４、５又は２１のカプシドをコードするパッケージングプラスミドを、配列番号１をコードするパッキングプラスミドから出発して、配列番号１４、１５、１６、１７又は２６の１７６２位～１７９７位のヌクレオチド配列を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ方法論（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉＤＮＡＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒＭｉｘ，ＮＥＢ，カタログ番号Ｅ２６２１）を使用して配列番号２５の１７６１位及び１７６２位の間に挿入することによって構築した。

【0129】

３７℃で７２時間インキュベートした後、細胞を採取し、イオジキサノール勾配（ＣｒｏｓｓｏｎＳＭらを参照されたい）によってウイルス粒子を精製した。

【0130】

ｒＡＡＶをｄｄＰＣＲによって力価について試験したところ、すべて１０^１３ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬのレベルであった。特に、製造業者の指示に従って、Ｂｉｏ－ＲａｄのＱＸＤｘＡｕｔｏＤＧｄｄＰＣＲＳｙｓｔｅｍ及びＱＸＤｘＵｎｉｖｅｒｓａｌＫｉｔｆｏｒＡｕｔｏＤＧｄｄＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用いてｄｄＰＣＲを行った。ｄｄＰＣＲ用のプライマーは以下の通りである。

【0131】

ＧＦＰの増幅の場合：
ＧＦＰ－ＦＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡ
ＧＦＰ－ＲＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣ
ＧＦＰ－Ｐ５’－６－ＦＡＭ－ＣＣＧＡＣＡＡＧＣ－ＺＥＮ－ＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡ－ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱ－３’

【0132】

Ｎｂ２４の増幅の場合：
ｑＰＣＲ－ＡＭＤ－２４－５－ＦＧＡＧＴＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧ
ｑＰＣＲ－ＡＭＤ－２４－５－ＲＧＣＧＴＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧ
ｑＰＣＲ－ＡＭＤ－２４－５－ＰＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＣ

【0133】

調製したｒＡＡＶを表１に列挙した。

【0134】

【表1】

【0135】

実施例２．網膜細胞修飾ＡＡＶカプシドにおけるｒＡＡＶのインビトロ試験
この実施例は、実施例１で調製したｒＡＡＶに含まれるＧＦＰマーカーの発現を検証するために行ったものであり、試験結果は、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むｒＡＡＶで形質導入された網膜細胞におけるＧＦＰマーカーの発現増強を示す。

【0136】

ヒト網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ１９細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－２３０２）を９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）１６５３０５）に播種した。実施例１で調製したＡＡＶ２－ＧＦＰ及びＡＡＶ．ＬＧＰ－ＧＦＰを、様々なＭＯＩ（８００、４，０００、２０，０００、及び１００，０００）で、細胞を播種した４時間後にＡＲＰＥ１９細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ_２中で７２時間インキュベートした後、培養培地をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号１００１００７２）に交換し、次いで、形質導入された細胞を、自動蛍光顕微鏡（Ａｇｉｌｅｎｔ社）、４８５／２０励起、５０８／２０発光フィルター設定でＧＦＰタンパク質について検出した。

【0137】

修飾ＡＡＶ２カプシドを有するｒＡＡＶは、野生型ＡＡＶ２カプシドを有するｒＡＡＶと比較して、形質導入率の向上を示した。図２に示すように、ＡＡＶ．ＬＧＰ－ＧＦＰを形質導入された細胞は、ＡＡＶ２－ＧＦＰを形質導入された細胞よりもはるかに強い蛍光シグナルを示す。特に、ＡＡＶ２－ＧＦＰの場合、蛍光シグナルは少なくとも４，０００のＭＯＩで観察され得るが、ＡＡＶ．ＬＧＰ－ＧＦＰの場合、蛍光シグナルは８００のＭＯＩで観察され得る；４，０００のＭＯＩでＡＡＶ．ＬＧＰ－ＧＦＰを形質導入された細胞は、１００，０００のＭＯＩでＡＡＶ２－ＧＦＰを形質導入された細胞と同等の蛍光シグナルを示す。

【0138】

実施例３．網膜細胞におけるｒＡＡＶのインビトロ試験
この実施例は、実施例１で調製したｒＡＡＶに含まれる目的のポリペプチドの発現を検証するために行ったものであり、野生型カプシドポリペプチドを含むｒＡＡＶと比較して、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むｒＡＡＶで形質導入した網膜細胞では、目的のポリペプチドの発現増強が示された。

【0139】

ＡＲＰＥ１９細胞に、実施例１で調製した二価Ｎｂ２４をコードするｒＡＡＶを、実施例２に記載した様々なＭＯＩ（１００，０００、３０，０００、１０，０００、３，０００、１，０００、３００、１００及び３０）で形質導入した。ｒＡＡＶを添加した７２時間後、培養培地をピペッティングによって回収し、次いで、直接抗ＶＥＧＦＥＬＩＳＡによって細胞培養培地中のＮｂ２４発現について検出した。

【0140】

簡単に記載すると、ＶＥＧＦポリペプチド（ヒトＶＥＧＦＡ１６５Ａ、Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号２９３－ＶＥ／ＣＦ）をＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）３６９０）に４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ社、３７５３６）中３％ＢＳＡでブロッキングした後、二価Ｎｂ２４を含有する採取した細胞培養培地をプレートに添加し、次いで、これを１時間（ＲＴ）インキュベートした。各抗体添加後、１時間のインキュベーション（ＲＴ）を行いながら、抗Ｎｂ２４抗体（ヤギ抗Ｎｂ２４ポリクローナル、Ｎｏｖａｍｂ社）及び抗ヤギＨＲＰ抗体（ロバ抗ヤギＩｇＧＨＲＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号３４０２８）を順次添加した。ＨＲＰ発色のためにＴＭＢ溶液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号３４０２８）を添加し、次いで、停止緩衝液（スルホ酸、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ社、カタログ番号Ｐ０２１５）を添加することによって停止させた。細胞培養培地中の二価Ｎｂ２４発現レベルを計算するために、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３ｘマルチモードマイクロプレートリーダ、分子デバイス）で吸光度ＯＤ４５０を測定した。Ｎｂ２４の発現レベルを、一連の濃度で組換え二価Ｎｂ２４タンパク質を用いて調製した標準曲線に基づいて計算し、図３に示し、ｒＡＡＶのＥＤ５０値（５０％最大発現のＭＯＩ）をＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍを用いて計算し、表２に示した。

【0141】

【表2】

【0142】

図３によれば、ＡＡＶ．ＬＧＰ－Ｎｂ２４は二価Ｎｂ２４の最も高い発現を達成し、ＡＡＶ．ＮＳＰ－Ｎｂ２４はＡＡＶ２－Ｎｂ２４（野生型）よりも高く、ＡＡＶ．７ｍ８－Ｎｂ２４（参照）に匹敵する二価Ｎｂ２４の発現を示し、ＡＡＶ．ＧＫＧ－Ｎｂ２４及びＡＡＶ．ＬＡＥ－Ｎｂ２４はＡＡＶ２－Ｎｂ２４に匹敵するＮｂ２４の発現を達成した。表２によれば、ＡＡＶ．ＬＧＰ－Ｎｂ２４は最も低いＥＤ５０を示し、ＡＡＶ．ＮＳＰ－Ｎｂ２４のＥＤ５０はＡＡＶ２－Ｎｂ２４及びＡＡＶ．７ｍ８－Ｎｂ２４に匹敵する。

【0143】

本発明の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むｒＡＡＶは、野生型カプシドポリペプチド又は参照カプシドポリペプチドを含むｒＡＡＶと比較して、ｒＡＡＶによってコードされるポリペプチド（二価Ｎｂ２４）の発現増強を達成することが実証された。

【0144】

実施例４．修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むｒＡＡＶのインビボ治療効果
本実施例は、修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むｒＡＡＶによって達成されるレーザー誘起脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおける導入遺伝子の発現及び治療有効性を検証するために行った。

【0145】

この研究は、ＣＲＯ社（ＪＯＩＮＮＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、中国）によって行われた。簡単に記載すると、眼ナイーブカニクイザルを血清ＡＡＶ中和抗体（Ｎａｂ）スクリーニングにより選択した（Ｎａｂレベルが最も低い２０匹のサル）。選択したサルを、モデリングのためにレーザーで処置した（Ｐｅｎｎｅｓｉら、Ａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆａｇｅｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＭｏｌＡｓｐｅｃｔｓＭｅｄ，２０１２．３３（４）：ｐ．４８７－５０９）。

【0146】

製剤緩衝液（ｄＰＢＳ＋２００ｍＭＮａＣｌ＋０．００５％ＰＦ６８（ｄＰＢＳ及びＰＦ６８は、それぞれカタログ番号１００１００７２及び２４０４００３２の下でＴｈｅｒｍｏ社から購入した））中の実施例１で調製した二価Ｎｂ２４をコードするｒＡＡＶ（表１に列挙）を、表３に記載のようにサルの眼に投与した。

【0147】

【表3】

【0148】

この研究は、図４に従って行った。簡単に記載すると、試験した物品を１日目にサルに硝子体内注射し、眼を０日目、２２日目、２９日目及び４３日目に画像化し、サルを１５日目にモデル化し、サルの血清を３日目、７日目、１４日目、２２日目、２９日目及び４３日目に回収した。サル＃２９１～３０９を４３日目に屠殺し、それらの組織（網膜、脈絡膜、強膜、視神経、硝子体、房水、毛様体、虹彩、角膜及び水晶体を含む眼組織；並びに脳、心臓、肝臓、腎臓、肺、骨格筋及び脾臓を含む末梢組織）を別々に回収した。サル＃３１０に２回目の用量のＡＡＶ９－Ｎｂ２４を４４日目に投与し、その眼を５１日目にさらに画像化した。

【0149】

組織からの二価Ｎｂ２４を含むサンプルを、３０ｍｇの組織及び６０μＬの溶解緩衝液（Ｔ－ＰＥＲ（商標）組織タンパク質抽出試薬、Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号７８５１０）をプロテイナーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤ミニ錠剤、Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号Ａ３２９５９）と混合し、ホモジナイザー（２０１０Ｇｅｎｏ／Ｇｒｉｎｄｅｒ（登録商標）－自動組織ホモジナイザー及び細胞溶解装置、ＳｐｅｘＳａｍｐｌｅＰｒｐ）を用いて１，５００ｒｐｍで２分間、３０秒間隔で混合物をホモジナイズし、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収することによって調製した。サンプル中の総タンパク質含有量は、ＢＣＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、カタログ番号２３２３５）を用いて決定した。

【0150】

組織及び血清中のＮｂ２４レベルをＥＬＩＳＡによって検出した（図５を参照されたい）。簡単に記載すると、ヒトＶＥＧＦＡ１６５Ａ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ２９３－ＶＥ／ＣＦ）をＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングし、ブロッキング緩衝液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）Ｔ２０（ＴＢＳ）ＢｌｏｃｋｉｎｇＢｕｆｆｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号３７５３６）でブロッキングした後、等しい含有量の総タンパク質を含む組織及び血清からのサンプルをプレートに添加し、続いて１時間のインキュベーション（ＲＴ）を行った。各抗体添加後、１時間のインキュベーション（ＲＴ）を行いながら、抗Ｎｂ２４抗体（ヤギ抗Ｎｂ２４ポリクローナル、Ｎｏｖａｍｂ社）及び抗ヤギＨＲＰ抗体（ロバ抗ヤギＩｇＧＨＲＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号３４０２８）を順次添加した。ＨＲＰ発色のためにＴＭＢ溶液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号３４０２８）を添加し、次いで、停止緩衝液（スルホ酸、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ社、カタログ番号Ｐ０２１５）を添加することによって停止させた。実施例３に記載したように、サンプル中の二価Ｎｂ２４発現レベルを計算するために吸光度ＯＤ４５０を測定した。

【0151】

眼組織における二価Ｎｂ２４の発現が図６に示されており、これは、ＡＡＶ．ＬＧＰ－Ｎｂ２４の投与が、ＣＮＶが発生する網膜及び脈絡膜を含む眼区画全体にわたって、参照（ＡＡＶ．７ｍ８－Ｎｂ２４）と比較して少なくとも同等であり、さらに高い二価Ｎｂ２４の発現を達成したことを示している。図７に示されるように、Ｎｂ２４は末梢組織において発現されず（図７Ａ～Ｇ）、血清では有意に発現しなかった（図７Ｈ）。

【0152】

眼底フルオレセイン蛍光眼底造影（ＦＦＡ）を、ＲＮＶのフルオレセイン漏出の評価のための主要なインビボエンドポイントとして使用した（Ｌｉら、２０１８及びＣａｏら、２０１８）。スリットランプ顕微鏡法及びカラー眼底写真を実施して、処置に対する眼の反応も記録した。画像を図８～１６に示した。Ｅｙｌｅａ（登録商標）（２ｍｇ／眼）（図９）の臨床用量と比較して、ＡＡＶ２．ＬＡＥ－Ｎｂ２４（図１０）、ＡＡＶ．ＲＨ１０－Ｎｂ２４（図１１）及びＡＡＶ２．ＬＧＰ－Ｎｂ２４（図１２）は、レーザー誘起ＮＨＰＣＮＶモデルにおいて部分的又は堅牢な治療有効性を提供し、その中でもＡＡＶ２．ＬＧＰ－Ｎｂ２４は非常に堅牢な治療有効性を提供した。参照ｒＡＡＶ（ＡＡＶ．７ｍ８－Ｎｂ２４）は、処置された４つの眼のうち３つ（図１３を参照されたい）において明らかな眼炎症反応（前眼房における重度のフルオレセイン漏出によって証明される）を引き起こしたが、これは、ＡＡＶ．ＧＫＧ－Ｎｂ２４、ＡＡＶ．ＬＡＥ－Ｎｂ２４、ＡＡＶ．ＬＧＰ－Ｎｂ２４、及びＡＡＶ．ＮＳＰ－Ｎｂ２４のいずれかで処置されたサルでは生じなかった。ＡＡＶ９－Ｎｂ２４は、網膜下注射の７～１４日後に広範囲の脈絡膜漏出を誘発した（図１６を参照されたい）。

【0153】

修飾カプシドポリペプチドを含むｒＡＡＶは、優れた眼形質導入、堅牢な導入遺伝子発現（網膜血管新生の堅牢な閉塞を意味する眼及び周囲組織における高レベルの二価Ｎｂ２４によって証明される）、安全性（末梢Ｎｂ２４発現の最小化によって証明される）、及び治療効果（網膜における漏出の減少によって証明される）を達成したことが分かる。

【0154】

配列
配列番号１のカプシドＡＡＶ２

【化1】

配列番号１の５８７位と５８８位との間に配列番号１０を挿入することによって得られた配列番号２のカプシドＡＡＶ２＿ＧＫＧ

【化2】

配列番号１の５８７位と５８８位との間に配列番号１１を挿入することによって得られた配列番号３のカプシドＡＡＶ２＿ＬＡＥ

【化3】

配列番号１の５８７位と５８８位との間に配列番号１２を挿入することによって得られた配列番号４のカプシドＡＡＶ２＿ＬＧＰ

【化4】

配列番号１の５８７位と５８８位との間に配列番号１３を挿入することによって得られた配列番号５のカプシドＡＡＶ２＿ＮＳＰ

【化5】

配列番号６の挿入されたペプチド＿ＧＫＧ
ＧＫＧＰＴＴＫ
配列番号７の挿入されたペプチド＿ＬＡＥ
ＬＡＥＰＳＲＰ
配列番号８の挿入されたペプチド＿ＬＧＰ
ＬＧＰＰＳＫＰ
配列番号９挿入されたペプチド＿ＮＳＰ
ＮＳＰＴＧＲＮ
配列番号１０の挿入されたペプチド＿ＧＫＧｆｕｌｌ
ＡＡＡＧＫＧＰＴＴＫＡＡ
配列番号１１の挿入されたペプチド＿ＬＡＥｆｕｌｌ
ＡＡＡＬＡＥＰＳＲＰＡＡ
配列番号１２の挿入されたペプチド＿ＬＧＰｆｕｌｌ
ＡＬＡＬＧＰＰＳＫＰＡＡ
配列番号１３の挿入されたペプチド＿ＮＳＰｆｕｌｌ
ＡＡＧＮＳＰＴＧＲＮＡＡ
配列番号１４のコード配列＿ＡＡＶ２＿ＧＫＧ

【化6】

配列番号１５のコード配列＿ＡＡＶ２＿ＬＡＥ

【化7】

配列番号１６のコード配列＿ＡＡＶ２＿ＬＧＰ

【化8】

配列番号１７のコード配列＿ＡＡＶ２＿ＮＳＰ

【化9】

配列番号１８のＡＡＶ９カプシド

【化10】

配列番号１９のＧＦＰをコードするｒＡＡＶゲノム

【化11】

配列番号２０の二価Ｎｂ２４構築物をコードするｒＡＡＶゲノム

【化12】

【化13】

配列番号２１のＡＡＶ２＿７ｍ８アミノ酸配列

【化14】

配列番号２２のＡＡＶ＿ＲＨ１０アミノ酸配列

【化15】

配列番号２３のＡＡＶ２ＲＥＰをコードするヌクレオチド配列

【化16】

配列番号２４（Ｎｂアミノ酸配列）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＤＤＰＤＶＧＷＦＲＱＡＰＧＮＥＣＥＬＶＳＴＩＳＫＤＧＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＹＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＳＮＰＩＡＰＩＲＴＣＬＧＷＹＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２５のコード配列ＡＡＶ２カプシド

【化17】

配列番号２６のコード配列ＡＡＶ２＿７ｍ８

【化18】

配列番号２７のコード配列ＡＡＶ＿ＲＨ１０

【化19】

【図1A-1B】

【図1C-1D】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A-6F】

【図6G-6J】

【図7A-7G】

【図7H】

【図8A-8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A-13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A-15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【配列表】

2025505795000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2025-02-12

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、ループＩＶに挿入されたペプチドを含み、前記挿入されたペプチドが、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
に示されるアミノ酸配列であって、式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択され、
前記スペーサー１及び２は、Ａ、Ｌ及びＧから選択される１個以上、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～３個のアミノ酸を独立して含む、アミノ酸配列を含む、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド。

【請求項2】

【請求項3】

Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７が、配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）、配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）、配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）及び配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）から選択されるアミノ酸配列である、請求項１に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項4】

【請求項5】

前記親ＡＡＶカプシドポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１３８～７３５、若しくは配列番号１のアミノ酸２０３～７３５を含むＡＡＶ２カプシドポリペプチド、又は全長、アミノ酸１３８～７３５、若しくはアミノ酸２０３～７３５にわたって配列番号１と少なくとも９０％同一であるそのバリアントである、請求項１に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項6】

前記ペプチドが、配列番号１の５８７位及び５８８位に対応する位置の間に挿入されている、請求項１に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項7】

配列番号２、３、４及び５から選択されるアミノ酸配列、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７を含む、請求項１に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項8】

請求項１に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項10】

請求項８に記載のポリヌクレオチド又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項11】

請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶをパッケージングするためのシステム又はキット。

【請求項12】

修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドと遺伝子産物をコードするゲノムとを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドは、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、ループＩＶに挿入されたペプチドを含み、前記挿入されたペプチドは、式Ｉ：
スペーサー１－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－スペーサー２（Ｉ）
に示されるアミノ酸配列であって、式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｌ及びＮから選択され、
Ｘ２は、Ｋ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、
Ｘ３は、Ｇ、Ｅ及びＰから選択され、
Ｘ４は、Ｐ及びＴから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ及びＧから選択され、
Ｘ６は、Ｔ、Ｒ及びＫから選択され、
Ｘ７は、Ｋ、Ｐ及びＮから選択され、
前記スペーサー１及び２は、Ａ、Ｌ及びＧから選択される１個以上のアミノ酸を独立して含む、アミノ酸配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項13】

【請求項14】

Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７が、配列番号６（ＧＫＧＰＴＴＫ）、配列番号７（ＬＡＥＰＳＲＰ）、配列番号８（ＬＧＰＰＳＫＰ）及び配列番号９（ＮＳＰＴＧＲＮ）から選択されるアミノ酸配列である、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項15】

【請求項16】

【請求項17】

前記ペプチドが、配列番号１の５８７位及び５８８位に対応する位置の間に挿入されている、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項18】

前記修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドが、配列番号２、３、４及び５から選択されるアミノ酸配列、配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸１３８～７４７、又は配列番号２、３、４若しくは５のアミノ酸２０３～７４７を含む、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項19】

請求項１２に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物。

【請求項20】