特表 2025-505925 運動性神経細胞直接交差分化用因子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-03-05

(54)【発明の名称】運動性神経細胞直接交差分化用因子

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/10 20060101AFI20250226BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250226BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20250226BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250226BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20250226BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20250226BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20250226BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20250226BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20250226BHJP

   C12N 15/863 20060101ALI20250226BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20250226BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20250226BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20250226BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20250226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250226BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20250226BHJP

   A61K 38/45 20060101ALI20250226BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20250226BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250226BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250226BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20250226BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20250226BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20250226BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20250226BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20250226BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20250226BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20250226BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20250226BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20250226BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20250226BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20250226BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20250226BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20250226BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20250226BHJP

【ＦＩ】

C12N9/10 ZNA

C12N15/12

C12N15/54

C12N15/63 Z

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/869 Z

C12N15/863 Z

C12N5/071

C12N5/077

C12N5/0781

C12N5/078

C12N5/10

A61P25/00

A61K38/45

A61K38/17

A61P43/00 105

A61K48/00

A61K35/12

A61P43/00 111

A61P25/16

A61P9/10

A61P25/14

A61P21/00

A61P25/02

A61P25/08

A61P29/00

A61P25/28

A61K9/10

A61K9/08

A61K9/48

A61K9/06

C07K14/47

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024539031

(86)(22)【出願日】2022-12-29

(85)【翻訳文提出日】2024-07-16

(86)【国際出願番号】 KR2022021615

(87)【国際公開番号】W WO2023128659

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】10-2021-0190556

(32)【優先日】2021-12-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524241637

【氏名又は名称】スタンドアップ セラピューティクス インク

【氏名又は名称原語表記】ＳＴＡＮＤＵＰ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】２Ｆ， ９８ Ｈａｎｎａｍ－ｄａｅｒｏ， Ｙｏｎｇｓａｎ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０４４１８ （ＫＲ）

(71)【出願人】

【識別番号】524241648

【氏名又は名称】ユ、ジュンサン

【氏名又は名称原語表記】ＹＯＯ， Ｊｕｎｓａｎｇ

【住所又は居所原語表記】２Ｆ， ９８ Ｈａｎｎａｍ－ｄａｅｒｏ， Ｙｏｎｇｓａｎ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０４４１８ （ＫＲ）

(71)【出願人】

【識別番号】524241659

【氏名又は名称】シム、ヒョンス

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＩＭ， Ｈｙｕｎ Ｓｏｏ

【住所又は居所原語表記】１００３ｈｏ， １０５ｄｏｎｇ， ４００ Ｃｈｅｏｎｇｇｙｅｃｈｅｏｎ－ｒｏ， Ｊｕｎｇ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０４５７２ （ＫＲ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ユ、ジュンサン

(72)【発明者】

【氏名】シム、ヒョンス

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ユジョン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA91X

4B065AA92X

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA03

4B065BA04

4B065BA05

4B065BB19

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA06

4C076AA11

4C076AA16

4C076AA53

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB14

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB31

4C076CC01

4C076CC09

4C076CC11

4C076CC26

4C076CC29

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084DC25

4C084DC50

4C084MA02

4C084MA16

4C084MA27

4C084MA34

4C084MA37

4C084MA56

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA06

4C084ZA08

4C084ZA16

4C084ZA20

4C084ZA21

4C084ZA22

4C084ZA36

4C084ZB21

4C084ZC02

4C084ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA12

4C087MA02

4C087MA16

4C087MA27

4C087MA34

4C087MA37

4C087MA56

4C087MA63

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA06

4C087ZA08

4C087ZA16

4C087ZA20

4C087ZA21

4C087ZA22

4C087ZA36

4C087ZB21

4C087ZC02

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA21

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は体細胞から運動性神経細胞への直接交差分化のための新規な分化因子およびその用途に関するものだ。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための組成物で、
前記の組成物は、
Ｇｓｔａ４（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｌｐｈａ ４）蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含む組成物。

【請求項2】

前記Ｇｓｔａ４蛋白質は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列またはこれと同一性が７０％以上の配列であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸は、配列番号２または１２の配列を持つことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記の組成物は、 ｉｉ）Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １），Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２），Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ），Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９），ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １），Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３），Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）およびＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される１つ以上の蛋白質；またはこれをコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記の組成物は、ｉｉ）でＨｂ９またはＬｈｘ３またはＮｇｎ２が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記の組成物は、ｉｉ）でＨｂ９およびＬｈｘ３；またはＨｂ９およびＮｇｎ２；またはＬｈｘ３およびＮｇｎ２が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

前記の組成物は、ｉｉ）でＨｂ９、Ｌｈｘ３及びＮｇｎ２が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項8】

前記の組成物は、ｉｉ）でＨｂ９、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＩｓｌ１が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項9】

前記の組成物は、ｉｉ）でＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項10】

Ａｓｃｌ１蛋白質は配列番号１７であり得る、Ａｓｃｌ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１８の配列を持つことができ；
Ｂｒｎ２蛋白質は配列番号１９であり得る、Ｂｒｎ２蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２０の配列を持つことができ；
Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質は配列番号２１であり得る、Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２２の配列を持つことができ；
Ｈｂ９蛋白質は配列番号１３であり得る、Ｈｂ９蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１４の配列を持つことができ；
Ｉｓｌ１蛋白質は配列番号２３であり得る、Ｉｓｌ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２４の配列を持つことができ；
Ｌｈｘ３蛋白質は配列番号１５であり得る、Ｌｈｘ３蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１６の配列を持つことができ；
Ｎｇｎ２蛋白質は配列番号２５であり得る、Ｎｇｎ２蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２６の配列を持つことができ；
ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質は配列番号２７であり得る、ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２８の配列を持つことができることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項11】

直接交差分化のための分化因子発現のためのベクトルとして、
前記の直接交差分化は体細胞から誘導されたモーターニューロンに転換されるものであり、
前記ベクトルは
Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸；及び
プロモーター；を含み、
この時、前記ｉ）とｉｉ）は作動可能に連結されていることを特徴とするベクトル。

【請求項12】

前記ベクトルは、ｉｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される一つ以上の蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする、請求項１１に記載のベクトル。

【請求項13】

前記ｉｉｉ）でＨｂ９及びＬｈｘ３が選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のベクトル。

【請求項14】

直接交差分化のための分化因子発現のためのベクトルとして、
前記の直接交差分化は体細胞から誘導されたモーターニューロンに転換されるものであり、
前記ベクトルは、少なくとも、第１ベクトルおよび第２ベクトルを含むことができ、
前記第１ベクトルは、
Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸；及びｉｉ）プロモーター；を含み、
この時、前記ｉ）とｉｉ）は作動可能に連結されており、
前記第２ベクトルは、
ｉｉｉ）Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１Ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される一つ以上の蛋白質をコーディングする核酸；及びｉｖ）プロモーター；を含み、
この時、前記ｉｉｉ）とｉｖ）は作動可能に接続されており、
前記ｉｉ）とｉｖ）は、互いに同一のプロモーターまたは異なるプロモーターであり、
前記ｉｉｉ）は、１つのベクトルに含まれるか、または２つ以上のベクトルに含まれることができることを特徴とするベクトル。

【請求項15】

前記ベクトルは、エンハンサー、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、終端子（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、内部リボソーム流入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ）、蛍光蛋白質遺伝子，グルタチオン－Ｓ－トランスファラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）クロラムフェニコールアセチルトランスパーラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダゼ、ルシフェラーゼ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、２Ａ自己切断ペプチド（２Ａ ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、抗生剤耐性遺伝子の中から選択される一つ以上をさらに含むことができることを特徴とする、請求項１１ないし１４のいずれかに記載のベクトル。

【請求項16】

前記２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａの中から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１５に記載のベクトル。

【請求項17】

前記ベクトルは、ウイルスベクトルまたは非ウイルスベクトルであることができ、
ウイルスベクトルはレトロウイルス、レンティウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）、バクシニアウイルス、フォックスウイルス、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｏｓｉｓ）、ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、 ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスシンプレクスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、エピゾマル（ｅｐｉｓｏｍａｌ）及び単純包診ウイルスの一つ以上であることを特徴とする、請求項１１ないし１４のいずれかに記載のベクトル。

【請求項18】

直接交差分化のための方法で、
体細胞から誘導されたモーターニューロンに切り替わるものであり、
前記の方法は、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸を含む組成物を体細胞に導入し；を含み、
この時、前記方法は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）が生成されないことを特徴とする方法。

【請求項19】

前記の体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、筋肉細胞、神経細胞、毛髪細胞、毛根細胞、毛包細胞、口腔上皮細胞、尿から抽出した体細胞、胃粘膜細胞、杯状細胞、ガストリン細胞（ｇａｓｔｒｉｎ ｃｅｌｌ／Ｇｃｅｌｌ）、Ｂ細胞、主皮細胞、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、血液細胞，希少突起膠前駆細胞中から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記体細胞は人、犬、猫、馬、羊、ウサギ、豚、マウス、ラクダの中から選ばれる一つの哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記方法は、組成物が導入された体細胞を神経細胞分化のための培養培地として培養する；をさらに含むことができることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記の導入は、電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、自己注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、一時的な細胞圧縮またはスクイジング、陽イオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ，脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ），リン酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｅｃｔｉｏｎ），ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ，ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染， ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染中から選択される一つ以上で遂行できることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

前記の導入により、１週間ないし７週間以内に体細胞が誘導されたモーターニューロンに分化することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項24】

体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための、
Ｇｓｔａ４蛋白質を含む、
神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物。

【請求項25】

前記薬学的組成物は、
Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される一以上の蛋白質をさらに含むことができることを特徴とする、請求項２４に記載の薬学的組成物。

【請求項26】

体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；が導入された体細胞を含む、
神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物。

【請求項27】

前記薬学的組成物は、
Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される１以上の蛋白質をコーディングする核酸；をさらに含むことができることを特徴とする、請求項２６に記載の薬学的組成物。

【請求項28】

体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための分化因子が過剰発現するモーターニューロンを含む神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物であり、
前記のモーターニューロンは、Ｇｓｔａ４、Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）、ＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）の中から選択される一以上の分化因子が過剰発現することを特徴とする薬学的組成物。

【請求項29】

前記の薬学的組成物は許容可能な担体、賦形剤、希釈剤、保存剤の中から選択される一つ以上をさらに含むことができることを特徴とする、請求項２４ないし２８のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項30】

前記の神経系疾患は脊髄損傷、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、ルー・ゲーリック病、毛細血管拡張性運動失調症（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、筋萎縮性側色硬化症、運動神経損傷、外傷による末梢神経損傷、虚血性脳損傷、新生児低酸素性虚血性脳損傷、脳性麻痺、末梢麻痺、中枢麻痺、四肢麻痺、両麻痺、てんかん、神経細胞発達障害、神経痛、難治性てんかん、アルツハイマー病、先天性代謝性神経系疾患及び外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、運動性神経細胞損傷またはこれに誘発される疾患のうち、選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項２４ないし２８のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項31】

前記薬学的組成物は、固形剤、液状剤、カプセル剤、半固体形態の中から選択される一つ以上の形態であることを特徴とする、請求項２４ないし２８のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項32】

神経系疾患を予防または治療する方法として、
前記の方法は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質；または
ｉｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質；及びＡｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１Ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される一つ以上の蛋白質；
を対象に投与し；
を含み、前記の直接交差分化は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）が生成されないことを特徴とする方法。

【請求項33】

神経系疾患を予防または治療する方法として、
前記の方法は、
Ｇｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸を含む組成物；が導入された体細胞を対象に投与し；
を含み、前記の直接交差分化は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）が生成されないことを特徴とする方法。

【請求項34】

神経系疾患を予防または治療する方法として、
前記の方法は、
体細胞にＧｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸を含む組成物；を導入して誘導されたモーターニューロンを対象に投与し；
を含み、前記の直接交差分化は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）が生成されないことを特徴とする方法。

【請求項35】

前記組成物は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される１つ以上の蛋白質；または前記蛋白質をコーディングする核酸；をさらに含むことができることを特徴とする 特徴とする、請求項３３ないし３４のいずれかに記載の方法。

【請求項36】

前記の組成物は、Ｈｂ９およびＬｈｘ３の蛋白質；またはこれをコーディングする核酸；をさらに含むことができることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記の対象は哺乳類であり、
この時，哺乳類はヒト，マウス，イヌ，ネコの中から選ばれる一つであることを特徴とする、請求項３２ないし３４のいずれかに記載の方法。

【請求項38】

前記の神経系疾患は脊髄損傷、パーキンソン病、脳卒中、筋萎縮性脊髄側索硬化症、運動神経損傷、外傷による末梢神経損傷、虚血性脳損傷、新生児低酸素性虚血性脳損傷、脳性麻痺、てんかん，難治性てんかん，アルツハイマー病，先天性代謝性神経系疾患、外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎｊｕｒｙ）、運動性神経細胞損傷またはこれによって誘発される疾患の中から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項３２ないし３４のいずれかに記載の方法。

【請求項39】

前記投与時の部位は筋肉、皮内、皮下、静脈、腹腔、動脈、粘膜、脊髄、骨髄，脊髄腔内，経皮のうち選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項３２ないし３４のいずれかに記載の方法。

【請求項40】

前記投与は、１回に１ｕＬ／ｋｇないし２０ｕＬ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、運動性神経細胞直接交差分化のための新規な分化因子に関するものである。

【0002】

本出願は、前記の新規な分化因子を含む組成物に関するものである。

【0003】

本出願は、前記の組成物を利用した直接交差分化方法に関するものである。

【0004】

本出願は、前記の新規な分化因子の多様な用途に関するものである。

【背景技術】

【0005】

再生医学で幹細胞が多く利用される。 幹細胞は人体を構成するすべての細胞に分化できる万能細胞で、理論的にすべての種類の機能細胞に分化可能であり、無限増殖が可能だ。 幹細胞はその起源によって胚芽幹細胞、成体幹細胞、庭幹細胞および逆分化幹細胞（または誘導万能幹細胞、ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などがある。

【0006】

しかし、幹細胞は種類によって倫理的な問題、安定性の問題、分化効率が低い問題がある。また、逆分化幹細胞は奇形種形成の可能性および低い分化効率の問題点を持っている。

【0007】

幹細胞はこのような多様な問題点が存在するため、再生医学分野では新しい技術を要求している。

【0008】

最近脚光を浴びているのが直接交差分化技術だ。直接交差分化は、誘導万能幹細胞にリプログラミングし、これを再分化して目的の細胞にする過程を経ず、すぐに目的の細胞に転換を誘導するという点で違いを持つ。

【0009】

すなわち、全く異なる細胞タイプを持つ成熟した（分化が終わった）細胞間の転換を誘導する方法である。しかし、従来の直接交差分化方法は効率が低い限界があるため、このような限界を克服できる新しい方法が要求されている実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本出願の一つの課題は、運動性神経細胞直接交差のための新規な分化因子を提供することを目的とする。特に、前記の新規な分化因子は、Ｇｓｔａ４（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａ４）蛋白質またはこれをコーディングする核酸；に関するものである。

【0011】

本出願の他の課題は、前記の新規な分化因子を含む組成物を提供することを目的とする。

【0012】

本出願の他の課題は、前記組成物を利用した直接交差分化方法を提供することを目的とする。

【0013】

本出願のもう一つの課題は、前記の新規な分化因子の多様な用途を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本出願は、前述した前記課題を解決するために、
本出願は一具体例として、体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための組成物で、Ｇｓｔａ４（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｌｐｈａ ４）蛋白質またはこれをコーディングする核酸;を含む組成物を提供する。

【0015】

前記の組成物は、ｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される一つ以上の蛋白質;またはこれをコーディングする核酸;をさらに含むことができる。

【0016】

前記の組成物は、ｉｉ）からＨｂ９及びＬｈｘ３が選択されることを特徴とする組成物。

【0017】

この時、Ａｓｃｌ１蛋白質は配列番号１７であり得、Ａｓｃｌ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１８の配列を持つことができ;
Ｂｒｎ２蛋白質は配列番号１９であり得、Ｂｒｎ２蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２０の配列を持つことができ;
Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質は配列番号２１であり得、Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２２の配列を持つことができ;
Ｈｂ９蛋白質は配列番号１３であり得、Ｈｂ９蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１４の配列を持つことができ;
Ｉｓｌ１蛋白質は配列番号２３であり得、Ｉｓｌ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２４の配列を持つことができ;
Ｌｈｘ３蛋白質は配列番号１５であり得、Ｌｈｘ３蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１６の配列を持つことができ;
Ｎｇｎ２蛋白質は配列番号２５であり得、Ｎｇｎ２蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２６の配列を持つことができ;
ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質は配列番号２７であり得、ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２８の配列を持つことができる。

【0018】

本出願の他の具体例として、直接交差分化のための分化因子発現のためのベクトルとして、前記直接交差分化は体細胞から誘導されたモーターニューロンに転換されるものであり、前記ベクトルは
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸；及びｉｉ）プロモーター；を含み、
この時、前記ｉ）とｉｉ）は作動可能に連結されていることを特徴とするベクトルを提供することができる。

【0019】

前記ベクトルは、ｉｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される一つ以上の蛋白質をコーディングする核酸；をさらに含むことができる。

【0020】

直接交差分化のための分化因子発現のためのベクトルとして、前記直接交差分化は体細胞から誘導されたモーターニューロンに転換されるものであり、前記ベクトルは少なくとも、第１ベクトルおよび第２ベクトルを含むことができ、
前記第１ベクトルは、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸；及びｉｉ）プロモーター；を含み、
この時、前記ｉ）とｉｉ）は作動可能に連結されており、
前記第２ベクトルは、
ｉｉｉ）Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１Ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される一つ以上の蛋白質をコーディングする核酸；及びｉｖ）プロモーター；を含み、
この時、前記ｉｉｉ）とｉｖ）は作動可能に連結されており、
前記ｉｉ）とｉｖ）は、同一のプロモーターまたは異なるプロモーターであり、
前記ｉｉｉ）は、一つのベクトルに含まれるか、または二つ以上のベクトルに含まれることができることを特徴とするベクトルが提供されることができる。

【0021】

前記のベクトルは、ウイルスベクトルまたは非ウイルスベクトルであり得、ウイルスベクトルはレトロウイルス、レンティウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ベクシニアウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｏｓｉｓ）、ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎｎｅｃｉｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、エピゾマル（ｅｐｉｓｏｍａｌ）、単純包診ウイルスの中から選択される一つ以上のであり得る。

【0022】

本出願の他の具体例として、直接交差分化のための方法で、体細胞から誘導されたモーターニューロンに転換されるものであり、前記方法は、Ｇｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸を含む組成物を体細胞に導入すること；を含み、この時、前記方法は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）が生成されないことを特徴とする方法が提供される。

【0023】

前記体細胞は線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、筋肉細胞、神経細胞、毛髪細胞、毛根細胞、毛包細胞、口腔上皮細胞、尿から抽出した体細胞、胃粘膜細胞、杯状細胞、ガストリン細胞（ｇａｓｔｒｉｎ ｃｅｌｌ／Ｇｃｅｌｌ）、Ｂ細胞、主皮細胞、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、血液細胞，希少突起膠前駆細胞中から選択される一つ以上である可能性がある。

【0024】

前記の導入により、１週間ないし７週間以内に体細胞が誘導されたモーターニューロンに分化することができる。

【0025】

本出願の他の具体例として、体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための、Ｇｓｔａ４蛋白質；を含む、神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物が提供されることができる。

【0026】

また、体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための、Ｇｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸；が導入された体細胞を含む、神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物が提供されることができる。

【0027】

前記の薬学的組成物は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される一つ以上の蛋白質をコーディングする核酸；をさらに含むことができる。

【0028】

体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための分化因子が過剰発現されるモーターニューロンを含む神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物が提供されることができる。この時、前記モーターニューロンはＧｓｔａ４、Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）、ＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される一つ以上の分化因子が過剰発現することがある。

【0029】

本出願のもう一つの具体例として、神経系疾患を予防又は治療する方法として、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質；またはｉｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質；及びＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１中から選択される一つ以上の蛋白質；を対象に投与し；
を含み、前記の直接交差分化は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）が生成されないことを特徴とする方法が提供されることができる。

【0030】

神経系疾患を予防または治療する方法として、Ｇｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸を含む組成物；が導入された体細胞を対象に投与する；を含む方法が提供されることができる。

【0031】

神経系疾患を予防または治療する方法として、体細胞にＧｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸を含む組成物；を導入して誘導されたモーターニューロンを対象に投与する；を含む方法が提供されることができる。

【0032】

前記の神経系疾患は脊髄損傷、パーキンソン病、脳卒中、筋萎縮性脊髄側索硬化症、運動神経損傷、外傷による末梢神経損傷、虚血性脳損傷、新生児低酸素性虚血性脳損傷、脳性麻痺、てんかん、難病、アルツハイマー病、先天性代謝性神経系疾患、外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎｊｕｒｙ）、運動性神経細胞損傷またはこれによって誘発される疾患中から選択される一つ以上であることができる。

【発明の効果】

【0033】

本出願によれば、次のような効果が発生する。

【0034】

第一に、本出願によれば、運動性神経細胞直接交差分化のための新規な分化因子を提供できるようになる。 前記の新規な分化因子は、体細胞の運動性神経細胞への効果的な分化を可能にするところ、神経疾患の治療などに 有用となり得る。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】図１は、本実施例で使用したＡＡＶベクトル模式図である。（ａ）は、Ｇｓｔａ４を含むＡＡＶベクトル模式図；（ｂ）は、Ａｓｃｌ１、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３及びＮｇｎ２（Ｎｅｕｒｏｇ２とも呼ばれる）を含むＡＡＶベクトル模式図；（ｃ）は、Ｂｒｎ２、Ｈｂ９（Ｍｎｘ１とも呼ばれる）及びＮｅｕｒｏＤ１を含むＡＡＶベクトル模式図；（ｄ）は、Ｇｓｔａ４及びＭｙｔ１ｌを含むＡＡＶベクトル模式図；（ｅ）は、Ｇｓｔａ４、Ｈｂ９及びＬｈｘ３を含むＡＡＶベクトル模式図；である。

【図2】図２はマウス由来の線維芽細胞に新規な分化因子Ｇｓｔａ４を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化程度を神経細胞マーカー（ＣｈａＴ、Ｍａｐ２）の発現を確認した結果である。（ａ）は免疫蛍光染色法の結果であり、（ｂ）は（ａ）の結果を数値化したものである。

【図3】図３は、ヒト由来の線維芽細胞に従来の分化因子（Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２、ＮｅｕｒｏＤ１）を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化の程度を神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９）の発現変化で確認した結果である。

【図4】図４はマウス由来の線維芽細胞に新規な分化因子Ｇｓｔａ４及び従来の分化因子（Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２、ＮｅｕｒｏＤ１）を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化程度を神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９）の発現変化で確認した結果である。

【図5】図５はマウス由来の線維芽細胞に分化因子を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化程度を免疫蛍光染色法で神経細胞マーカー（ＣｈａＴ、Ｍａｐ２）の発現を確認した結果である。この時使用された分化因子は、Ｇｓｔａ４単独；Ｇｓｔａ４及び従来の分化因子の組み合わせ；である。

【図6】図６は図５の免疫蛍光染色された細胞の数を数値化したグラフである。

【図7】図７はマウス由来の線維芽細胞に分化因子を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化程度を神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２）の発現変化で確認した結果である。この時使用された分化因子は、従来の分化因子単独；Ｇｓｔａ４及び従来の分化因子の組み合わせ；である。

【図8】図８はマウス由来の線維芽細胞に分化因子を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化程度を免疫蛍光染色法で神経細胞マーカー（ＣｈａＴ、Ｍａｐ２）の発現を確認した結果である。この時使用された分化因子は、Ｍｎｘ１及びＬｈｘ３の組み合わせ；とＧｓｔａ４、Ｍｎｘ１及びＬｈｘ３の組み合わせ；を使用した。（ａ）は免疫蛍光染色の結果であり、（ｂ）は（ａ）の結果を数値化したものである。

【図9】図９はマウス由来の線維芽細胞に分化因子を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化程度を神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９）の発現を確認した結果である。この時使用された分化因子は、Ｇｓｔａ４単独；Ｍｎｘ１及びＬｈｘ３組合；Ｇｓｔａ４、Ｍｎｘ１及びＬｈｘ３組合；を使用した。

【図10】図１０はマウス由来の線維芽細胞に分化因子を導入し、運動性神経細胞の直接分化程度を神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２）の発現を確認した結果である。この時使用された分化因子は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２及びＭｙｔ１Ｌの組み合わせ；Ｇｓｔａ４、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２及びＭｙｔ１Ｌの組み合わせ；を使用した。

【図11】図１１は、ヒト由来の線維芽細胞に分化因子を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化の程度を神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９）の発現変化で確認した結果である。 この時使用された分化因子は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の組み合わせ；Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２、ＮｅｕｒｏＤ１及びＧｓｔａ４の組み合わせ；を使用した。

【図12】図１２はマウス性状細胞に分化因子を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化程度を免疫蛍光染色法で神経細胞マーカー（ｖＣｈａＴ、Ｍａｐ２）の発現を確認した結果である。この時使用された分化因子は、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３及びＡｓｃｌ１の組み合わせ；Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ及びＮｇｎ２の組み合わせ（既知のｆａｃｔｏｒｓで記載）；既知のｆａｃｔｏｒｓ及びＧｓｔａ４の組み合わせ；を使用した。

【図13】図１３は、ヒト線維芽細胞に分化因子を導入し、運動性神経細胞への直接交差分化程度を免疫蛍光染色法で神経細胞マーカー（ＮＥＵＮ、Ｍａｐ２）の発現を確認した結果である。

【図14】図１４は脊髄損傷による下半身麻痺モデルであるＳＣＩ（Ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ）マウスモデルの脊髄損傷部位であるＬ５に分化因子を投与（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで表示）して形態学的変化、生理学的分析、行動学的分析などをするための全般的な実験設計図を示したものである。

【図15】図１５は、ＳＣＩマウスモデルに分化因子を投与した後、脊髄損傷部位の形態学的変化を確認するためにクリスタルバイオレット染色法の結果である。この時、ＭｏｃｋはＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）を投与した群；Ｃｏｎｔｒｏｌは従来の分化因子（Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の組み合わせ）を導入したＡＡＶを投与した群；＋Ｇｓｔａ４は前記の従来の分化因子及びＧｓｔａ４を導入したＡＡＶを投与した群；を指す。

【図16】図１６は、ＳＣＩマウスモデルに分化因子を投与した後、運動性神経細胞マーカー（ＣｈａＴ、Ｍａｐ２）の免疫蛍光染色法を確認した結果である。この時、ＭｏｃｋはＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）を投与した群；Ｃｏｎｔｒｏｌは従来の分化因子（Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の組み合わせ）を導入したＡＡＶを投与した群；＋Ｇｓｔａ４は前記の従来の分化因子及びＧｓｔａ４を導入したＡＡＶを投与した群；を指す。

【図17】図１７は図１６内の白い点線でできた四角ボックス部分を確認した結果だ。

【図18】図１８は図１６の免疫蛍光染色の結果を数値化したものだ。

【図19】図１９は、ＳＣＩマウスモデルに分化因子を投与した後、運動性神経細胞の電気生理学的変化を分析した結果である。（ａ）はパッチクランプを行った神経細胞；（ｂ）は活動電位（Ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定した結果；（ｃ）はシナプス前の神経細胞から来る信号を測定した結果；である。この時、Ｓｈａｍは脊髄部位が損傷していない正常群；ｍｏｃｋはＳＣＩマウスモデルにＡＡＶを投与した群；ｃｏｎｔｒｏｌは従来の分化因子（Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１の組み合わせ）を導入したＡＡＶを投与した群；＋Ｇｓｔａ４は前記の従来の分化因子およびＧｓｔａ４を導入したＡＡＶを投与した群；を指す。

【図20】図２０は、ＳＣＩマウスモデルに分化因子を投与した後、脊髄損傷部位（Ｌ５）で下半身麻痺の治療効果をＢＢＢスコア（Ｂａｓｓｏ Ｂｅａｔｉｅ、ａｎｄ Ｂｒｅｓｎａｈａｎ ｓｃｏｒｅ）で分析した結果である。（ａ）は（ｂ）の観察結果を数値化したグラフである。この時、Ｓｈａｍは脊髄部位が損傷していない正常群；ｍｏｃｋはＳＣＩマウスモデルにＡＡＶを投与した群；－Ｇｓｔａ４は従来の分化因子（Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の組み合わせ）を投与した群；＋Ｇｓｔａ４は前記の従来の分化因子及びＧｓｔａ４を投与した群；を指す。

【図21】図２１は、ＳＣＩマウスモデルに分化因子を投与した後、下半身麻痺の治療効果を行動学的分析で確認した結果である。（ａ）はＦｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｅｓｔ；（ｂ）はＳｅｌｆ ｕｒｉｎａｔｉｏｎ；（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を数値化したもの；（ｄ）はＦｏｏｔ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｔｅｓｔ；結果を示す。

【発明の実施のための形態】

【0036】

別に定義されない限り、本出願で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本出願が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を持つ。本出願に記載されたものと類似または同一の方法および物質が本出願の実行または試験で使用できるが、適合した方法および物質が以下に記載される。本出願で言及されたすべての刊行物、特許出願、論文および他の参考文献は全体が参考に含まれる。さらに、物質、方法及び実施には単に例示的であり、制限するものとして意図されない。

【0037】

用語定義
● 直接交差分化（Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ／Ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ－Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）

【0038】

本出願で使われる用語"直接交差分化（Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ／Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）"は、最終的に分化した細胞に分化因子を導入して目的する細胞に転換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）させることを指す。特に、直接交差分化は全く異なる細胞タイプを持つ成熟した細胞間の転換を誘導する。すなわち、体細胞から全能性段階（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔａｔｅ）を経由せずに目的の細胞に転換させることである。用語直接交差分化、直接分化、直接交差は相互交換して使うことができる。

【0039】

● 直接交差分化因子（Ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ－Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）

【0040】

本出願において、用語"直接交差分化因子"とは、前述の直接交差分化に関与する因子を指す。この時、前記の分化因子は遺伝子、化合物、蛋白質、核酸などであることができる。用語'直接交差分化因子（Ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ－Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）'は'分化因子（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）'と相互交換して使用することができる。

【0041】

● 誘導された運動性神経細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ、ｉＭＮ）

【0042】

本出願で用語"誘導された運動性神経細胞"は、直接交差分化によって誘導された運動性神経細胞を指す。前記誘導された運動性神経細胞は、本出願の新規分化因子を利用して体細胞などを直接交差分化させて人為的に製作した運動ニューロンを意味する。用語'誘導された運動性神経細胞'はモーターニューロン、ｉＭＮと相互交換して使用することができる。

【0043】

● 治療
本出願で使用される用語"治療"は、疾患、疾病、症状などを緩和させたり、その進行を抑制することを意味する。前記の治療は、本発明の組成物、直接交差分化因子などによって症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味する。このような治療効果を示す物質を通称して"治療剤（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）"または"薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）"と呼ぶ。特に、遺伝子治療剤は疾病治療などを目的に、人体内に遺伝子を多様な形態と方法で伝達する遺伝物質を意味する。また、細胞治療剤は疾病治療などを目的に、人体内に治療物質を細胞の形で伝達される場合を意味する。

【0044】

● 約（ａｂｏｕｔ）
本出願で使用される用語"薬"は、参照量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量又は長さについて３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％程度に変化する量、水準、値、数、頻度、パーセント、サイズ、量又は長さを意味する。

【0045】

１．直接交差分化のための新規因子：Ｇｓｔａ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｌｐｈａ ４）

【0046】

直接交差分化の特徴

【0047】

直接交差分化は完全に分化した細胞を幹細胞への逆分化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）段階なしに他の系統の細胞に作ることだ。この過程は完全に分化した細胞を幹細胞段階を経ずに他の系統の特定の細胞に転換させる効果を示す。

【0048】

現在まで、直接交差分化は二つの方法論であるＳＤＲ（Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆａｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）、ＰＤＲ（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆａｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）が提示されている。ＳＤＲは、対象細胞に目的する細胞から多く発現する因子を過剰発現させ、目的する細胞への直接交差分化を誘導するものである。ＰＤＲは誘導万能幹細胞のリプログラミング時に使われる因子であるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－Ｍｙｃを利用して不完全な中間段階の細胞タイプ（幹細胞と類似した細胞）に脱分化させた後、培養培地造成を通じて目的の細胞タイプに直接交差分化させることだ。ＰＤＲの場合、様々な細胞タイプに直接交差分化させても、初期に過剰発現させるリプログラミング因子４個（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－Ｍｙｃ）が共通して使われている。

【0049】

公示された直接交差分化因子（ｋｎｏｗｎ Ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ－Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）

【0050】

直接交差分化のために使用されている公知の分化因子として、Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｎｕｒｒ１（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ４ Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｍｅｍｂｅｒ ２）、Ｌｍｘ１ａ（ＬＩＭ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ａｌｐｈａ）、Ｆｏｘａ２（Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｓｏｘ２（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ－ｂｏｘ ２）、Ｆｏｘｇ１（Ｆｏｒｋｈｅａｄ Ｂｏｘ Ｇ１）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、ＨＢ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩｓＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）、ＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）、Ｍｙｔ１ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、ＮｅｕｒｏＤ２（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２）、ｍｉＲ－９（ｍｉｃｒｏＲＮＡ－９）、ｍｉＲ－１２４（ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１２４）、Ｚｉｃ１（Ｚｉｃ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ １）、Ｇａｔａ５（ＧＡＴＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５）、Ｈｎｆ４α（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４ ａｌｐｈａ）、ＨＮＦ１α（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ）、Ｆｏｘａ１（Ｆｏｒｋｈｅａｄ Ｂｏｘ Ａ１）、Ｆｏｘａ３（Ｆｏｒｋｈｅａｄ Ｂｏｘ Ａ３）、Ｔｂｘ５（Ｔ－Ｂｏｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ５）、Ｍｅｆ２ｃ（Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｏｒ ２Ｃ）、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔａｍｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４）、ＰＲＤＭ１６（ＰＲ／ＳＥＴ Ｄｏｍａｉｎ １６）、ＭｙｏＤ（ｍｙｏｂｌａｓｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、Ｋｌｆ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）、ｃ－Ｍｙｃ（ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｙｃ）が知られている（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ２０１２ Ｓｅｐ ２８；４７（６）：８２７－８３８．）。

【0051】

特に、モーターニューロンへの直接交差分化のために使用する分化因子で、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２、ＮｅｕｒｏＤ１などが知られている。

【0052】

従来の直接交差分化因子の問題点
前記の直接交差分化は、誘導万能幹細胞段階を経ずに、全く異なる細胞タイプを持つ、分化が終わった細胞間の転換ができるという長所がある。しかし、現在まで知られている分化因子は単独または組み合わせで使用時に細胞間の転換効率が低かったり、ほとんどないという問題があった。

【0053】

直接交差分化のための新規因子Ｇｓｔａ４概括
本出願は直接交差分化のための新規な因子であるＧｓｔａ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｌｐｈａ ４）を開示する。

【0054】

前記Ｇｓｔａ４は単独で使用しても体細胞をモーターニューロンに効果的に直接交差分化させることができる。さらに、前記Ｇｓｔａ４は従来の直接交差分化因子と共に使用すれば、従来の分化因子だけを使用する場合と比較して、モーターニューロンへの分化効率をより高めることができる。

【0055】

以下、新規の分化因子であるＧｓｔａ４について、さらに具体的に説明する。

【0056】

Ｇｓｔａ４の従来知られていた機能
Ｇｓｔａ４はグルタチオン－Ｓ－トランスファラーゼ（ＧＳＴ、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）に属する酵素だ。 哺乳類の細胞質には８種類のＧＳＴであるアルファ（ａｌｐｈａ）、カッパ（ｋａｐｐａ）、ミュ（ｍｕ）、オメガ（ｏｍｅｇａ）、パイ（ｐｉ）、シグマ（ｓｉｇｍａ）、テタ（ｔｈｅｔａ）およびゼタ（ｚｅｔａ）が生産されると知られている。そのうちアルファは６番染色体にあり、ＧＳＴＡ１、ＧＳＴＡ２、ＧＳＴＡ３、ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＡ５などがある。

【0057】

ＧＴＡ４とも呼ばれるＧｓｔａ４は、前記Ｇｓｔａ４は細胞防御メカニズム、毒素分解、抗がん効果に関与することが知られている。また、活性酸素を減らすことで細胞ストレスを減らすのにも大きな役割をすると知られている。そして、Ｇｓｔａ４の不在はパーキンソン病、アルツハイマーなどの疾患において否定的な関連があると知られている。しかし、細胞間の直接交差分化因子としての機能は報告されていない。

【0058】

Ｇｓｔａ４の新機能
本出願は直接交差分化を可能とする、Ｇｓｔａ４の新規な機能を開示する。 すなわち、直接交差分化のための新規な分化因子としてＧｓｔａ４を開示する。

【0059】

特に、本出願のＧｓｔａ４が体細胞をモーターニューロンに転換（直接交差分化）させる機能を持つということは、既存に報告されたことがなく、本発明者が実験的に確認して発掘したものである。以下に掲げるＧｓｔａ４用語は、新規機能である直接交差分化因子として機能するものと解する。また、以下で便宜上Ｇｓｔａ４と記載する場合、文脈によってＧｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸を指すものと解釈する。

【0060】

Ｇｓｔａ４の形態（１） － Ｇｓｔａ４蛋白質
一様態で、本出願は直接交差分化のためのＧｓｔａ４蛋白質を開示する。

【0061】

前記Ｇｓｔａ４蛋白質は野生型または変異体であることができる。前記の変異体は、野生型のアミノ酸配列のうち１以上が欠失、置換、挿入であり得る。また、前記Ｇｓｔａ４変異体は野生型アミノ酸配列と配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を持つ配列であり得る。この時、配列同一性は５０％ないし９９％であり得る。望ましいことに、Ｇｓｔａ４蛋白質は野生型アミノ酸の配列と７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％以上の配列同一性を持つことができる。

【0062】

任意の実施例として、本出願の直接交差のためのＧｓｔａ４蛋白質は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列であり得る。

【0063】

配列番号１： ｍａａｒｐｋｌｈｙｐ ｎｇｒｇｒｍｅｓｖｒ ｗｖｌａａａｇｖｅｆ ｄｅｅｆｌｅｔｋｅｑ ｌｙｋｌｑｄｇｎｈｌ ｌｆｑｑｖｐｍｖｅｉ ｄｇｍｋｌｖｑｔｒｓ ｉｌｈｙｉａｄｋｈｎ ｌｆｇｋｎｌｋｅｒｔ ｌｉｄｍｙｖｅｇｔｌ ｄｌｌｅｌｌｉｍｈｐ ｆｌｋｐｄｄｑｑｋｅ ｖｖｎｍａｑｋａｉｉ ｒｙｆｐｖｆｅｋｉｌ ｒｇｈｇｑｓｆｌｖｇ ｎｑｌｓｌａｄｖｉｌ ｌｑｔｉｌａｌｅｅｋ ｉｐｎｉｌｓａｆｐｆ ｌｑｅｙｔｖｋｌｓｎ ｉｐｔｉｋｒｆｌｅｐ ｇｓｋｋｋｐｐｐｄｅ ｉｙｖｒｔｖｙｎｉｆ ｒｐ

【0064】

他の実施例として、Ｇｓｔａ４蛋白質は配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％以上の配列同一性を持つ配列であり得る。

【0065】

Ｇｓｔａ４の形態（２）－Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸

【0066】

他の例として、本出願は直接交差分化のためのＧｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸を開示する。前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。

【0067】

前記Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸は、野生型または変異体であり得る。前記の変異体は、野生型の核酸配列のうち１以上が結実、置換、挿入されたものであり得る。また、前記Ｇｓｔａ４変異体は野生型蛋白質をコーディングする核酸配列と配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を持つ配列であり得る。この時、配列同一性は５０％ないし９９％であり得る。好ましくは、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸は、野生型核酸配列と７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％以上の配列同一性である配列を持つことができる。

【0068】

Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸配列は、公知の配列であり得る。

【0069】

前記核酸配列は、イントロンおよびエクソン配列を含むことができる。

【0070】

前記核酸配列は、エクソン配列のみ含むことができる。

【0071】

例えば、前記Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸配列は、イントロンが除外されたＣＤＳ（Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）配列を含むことができる。

【0072】

前記核酸配列は、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングするＤＮＡ配列及びこれに相応する（転写結果物である）ｍＲＮＡ配列であり得る。

【0073】

前記核酸配列は、Ｇｓｔａ４遺伝子のエクソン配列に相当する（転写結果である）ｍＲＮＡ配列であり得る。

【0074】

一具体例では、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸は、Ｇｓｔａ４遺伝子の全長ＤＮＡ配列（ｆｕｌｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である配列番号２を含むことができる。

【0075】

配列番号２： ｇｃｔｔｔｇｔｇｃｇ ｇｃｔｃｃａｇｇｃｃ ｔｃｃｇａｇｔｇｇａ ｃｔｃｃａｇａａａｇ ｃｃｔｇａａａａｇｃ ｔａｔｃａｔｇｇｃａ ｇｃａａｇｇｃｃｃａ ａｇｃｔｃｃａｃｔａ ｔｃｃｃａａｃｇｇａ ａｇａｇｇｃｃｇｇａ ｔｇｇａｇｔｃｃｇｔ ｇａｇａｔｇｇｇｔｔ ｔｔａｇｃｔｇｃｃｇ ｃｃｇｇａｇｔｃｇａ ｇｔｔｔｇａｔｇａａ ｇａａｔｔｔｃｔｇｇ ａａａｃａａａａｇａ ａｃａｇｔｔｇｔａｃ ａａｇｔｔｇｃａｇｇ ａｔｇｇｔａａｃｃａ ｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃ ｃａａｃａａｇｔｇｃ ｃｃａｔｇｇｔｔｇａ ａａｔｔｇａｃｇｇｇ ａｔｇａａｇｔｔｇｇ ｔａｃａｇａｃｃｃｇ ａａｇｃａｔｔｃｔｃ ｃａｃｔａｃａｔａｇ ｃａｇａｃａａｇｃａ ｃａａｔｃｔｃｔｔｔ ｇｇｃａａｇａａｃｃ ｔｃａａｇｇａｇａｇ ａａｃｃｃｔｇａｔｔ ｇａｃａｔｇｔａｃｇ ｔｇｇａｇｇｇｇａｃ ａｃｔｇｇａｔｃｔｇ ｃｔｇｇａａｃｔｇｃ ｔｔａｔｃａｔｇｃａ ｔｃｃｔｔｔｃｔｔａ ａａａｃｃａｇａｔｇ ａｔｃａｇｃａａａａ ｇｇａａｇｔｇｇｔｔ ａａｃａｔｇｇｃｃｃ ａｇａａｇｇｃｔａｔ ａａｔｔａｇａｔａｃ ｔｔｔｃｃｔｇｔｇｔ ｔｔｇａａａａｇａｔ ｔｔｔａａｇｇｇｇｔ ｃａｃｇｇａｃａａａ ｇｃｔｔｔｃｔｔｇｔ ｔｇｇｔａａｔｃａｇ ｃｔｇａｇｃｃｔｔｇ ｃａｇａｔｇｔｇａｔ ｔｔｔａｃｔｃｃａａ ａｃｃａｔｔｔｔａｇ ｃｔｃｔａｇａａｇａ ｇａａａａｔｔｃｃｔ ａａｔａｔｃｃｔｇｔ ｃｔｇｃａｔｔｔｃｃ ｔｔｔｃｃｔｃｃａｇ ｇａａｔａｃａｃａｇ ｔｇａａａｃｔａａｇ ｔａａｔａｔｃｃｃｔ ａｃａａｔｔａａｇａ ｇａｔｔｃｃｔｔｇａ ａｃｃｔｇｇｃａｇｃ ａａｇａａｇａａｇｃ ｃｔｃｃｃｃｃｔｇａ ｔｇａａａｔｔｔａｔ ｇｔｇａｇａａｃｃｇ ｔｃｔａｃａａｃａｔ ｃｔｔｔａｇｇｃｃａ ｔａａａａｃａａｃａ ｃａｔｃｃａｔｇｔｇ ｔｇａｇｔｇａｃａｇ ｔｇｔｇｔｔｃｃｔａ ｇａｇａｔｇｇｔａｔ ｔｇｔｃｔａｃａｇｔ ｃａｔｇｔｃｔｔａａ ｔｇｇａｔｃｃｃａｇ ｃｔｃｔｇｔｃａｔｇ ｇｔｇｃｔａｔｃｔａ ｔｇｔａｔｔａａｇｔ ｔｇｇｇｔｃｃｔａａ ｇｔｔｇｇｇｔｃｔｔ ｔｔｇｔｇｔｃａａｃ ｇａｇａｔｃａｔｃｔ ｃｔｔｃｔａｇａａａ ｔａｔｃａａｃｃｔｔ ｔｔｔｔｇｔｃｃａｇ ｔａａａｔａａｔｔｇ ｔｔａｇｇｇｇａｔｃ ｔｔｔａｔｔｇｇａａ ａａｃｔｔｔｔｔｔｇ ｇａｇａｇｇｃｔｇｇ ｔａｔｔｔａａｇｔｔ ａｇａｔｃｔｇａｔｔ ｇｇｇｃｔａｃｔｃａ ｔｇｔｃｃｔｇｔａｇ ｃｃａｇｔｔｃａｔｃ ｃｔｃａｔａａｔａａ ｇａａｔｇｇｇｃａｇ ｇａｔｃｔｃｔｔｇｔ ｔｃｔｃｔｃｃｔｇａ ｇｔｇｔｃｔｔｔｃｔ ａｃｔｃｔｃｃｔｇａ ｇｃｇｔｃｔｔｔｃｔ ｇｃｔｃｔｃｃｔｔａ ｔｃｃｔｇｔｔｃｔｃ ｔｔａｔｃｃｔｔａｔ ｃｃｃｃｔｃｃａｇｔ ｃｔｃｔｇｃｃｔａａ ｔｔｔｔｔａｇｔｇｔ ｔｔａａｔａａｃａａ ｃｃｇａａｔｇｔｃｔ ａｇｔａａａｔｇａｃ ｔｃｔｃｃｔｃｔｇａ ｇｃｔｇｔａａｔａａ ａｔａａａａｔｇｇｔ ａｇｔａａｔｇａａｔ ｇｃａａｔｃａｇｔａ ｔｔａｇｃｃａａａａ ｔａａａｇａａｔｔｔ ａｔｇａｇｔｃａｔｔ

【0076】

他の具体例で、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸はＣＤＳ配列である配列番号１２を持つことができる。

【0077】

配列番号１２：Ａｔｇｇｃａｇｃａａｇｇｃｃｃａａｇｃｔｃｃａｃｔａｔｃｃｃａａｃｇｇａａｇａｇｇｃｃｇｇａｔｇｇａｇｔｃｃｇｔｇａｇａｔｇｇｇｔｔｔｔａｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇｇａｇｔｃｇａｇｔｔｔｇａｔｇａａｇａａｔｔｔｃｔｇｇａａａｃａａａａｇａａｃａｇｔｔｇｔａｃａａｇｔｔｇｃａｇｇａｔｇｇｔａａｃｃａｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｃａａｃａａｇｔｇｃｃｃａｔｇｇｔｔｇａａａｔｔｇａｃｇｇｇａｔｇａａｇｔｔｇｇｔａｃａｇａｃｃｃｇａａｇｃａｔｔｃｔｃｃａｃｔａｃａｔａｇｃａｇａｃａａｇｃａｃａａｔｃｔｃｔｔｔｇｇｃａａｇａａｃｃｔｃａａｇｇａｇａｇａａｃｃｃｔｇａｔｔｇａｃａｔｇｔａｃｇｔｇｇａｇｇｇｇａｃａｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｔｇｇａａｃｔｇｃｔｔａｔｃａｔｇｃａｔｃｃｔｔｔｃｔｔａａａａｃｃａｇａｔｇａｔｃａｇｃａａａａｇｇａａｇｔｇｇｔｔａａｃａｔｇｇｃｃｃａｇａａｇｇｃｔａｔａａｔｔａｇａｔａｃｔｔｔｃｃｔｇｔｇｔｔｔｇａａａａｇａｔｔｔｔａａｇｇｇｇｔｃａｃｇｇａｃａａａｇｃｔｔｔｃｔｔｇｔｔｇｇｔａａｔｃａｇｃｔｇａｇｃｃｔｔｇｃａｇａｔｇｔｇａｔｔｔｔａｃｔｃｃａａａｃｃａｔｔｔｔａｇｃｔｃｔａｇａａｇａｇａａａａｔｔｃｃｔａａｔａｔｃｃｔｇｔｃｔｇｃａｔｔｔｃｃｔｔｔｃｃｔｃｃａｇｇａａｔａｃａｃａｇｔｇａａａｃｔａａｇｔａａｔａｔｃｃｃｔａｃａａｔｔａａｇａｇａｔｔｃｃｔｔｇａａｃｃｔｇｇｃａｇｃａａｇａａｇａａｇｃｃｔｃｃｃｃｃｔｇａｔｇａａａｔｔｔａｔｇｔｇａｇａａｃｃｇｔｃｔａｃａａｃａｔｃｔｔｔａｇｇｃｃａｔａａ

【0078】

他の実施例として、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸は、配列番号２で表されるＤＮＡ配列と、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％以上の配列同一性の配列を持つことができる。

【0079】

他の実施例として、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸は、配列番号１２で表されるＣＤＳ配列と、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％以上の配列同一性の配列を持つことができる。

【0080】

Ｇｓｔａ４の特徴（１）
本出願の新規な直接交差分化因子であるＧｓｔａ４は、体細胞をモーターニューロンに直接的に転換させることができる。一例として、Ｇｓｔａ４は線維芽細胞をモーターニューロンに転換させる。他の例として、Ｇｓｔａ４は星状細胞をモーターニューロンに転換させる。

【0081】

Ｇｓｔａ４の特徴（２）
従来の分化因子の問題点は、直接交差分化効率が低いか、ほとんどないことにある。これに対し、本出願の新規な分化因子であるＧｓｔａ４は、従来の分化因子に比べて高い直接交差分化効率を持つ。一例として、Ｇｓｔａ４は単独で使用した場合、従来の分化因子に比べて分化効率が約２～１０倍高くなることがある。

【0082】

Ｇｓｔａ４の特徴（３）
Ｇｓｔａ４は、分化効率が低いか、ほとんどない従来の分化因子の分化効率を高めるブースティング機能（ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を持つ。前記ブースティング機能は、従来の分化因子だけを使用する場合と比較して、従来の分化因子をＧｓｔａ４と共に使用すれば、分化効率が顕著に上昇する機能を称する。一例として、Ｇｓｔａ４は従来の分化因子と組み合わせて使用した場合、そうでない場合に比べて直接交差分化効率を約２～１０倍高めることができる。

【0083】

Ｇｓｔａ４の特徴（４）
Ｇｓｔａ４は体細胞からモーターニューロンに直接誘導する効果があるため、運動性神経細胞の損傷によって誘発される神経系疾患の治療に使用できる。また、Ｇｓｔａ４と従来の直接交差分化因子を一緒に使用して神経系疾患の治療効果を向上させることができる。

【0084】

一例として、Ｇｓｔａ４を神経系疾患の治療対象に投与すると、炎症細胞によるスカの減少、活動電位の増加、シナプス前の神経細胞間の信号伝達などが増加することがある。

【0085】

２．Ｇｓｔａ４と組み合わせることができる分化因子
Ｇｓｔａ４と組み合わせ可能な分化因子の概括
本出願の一様態で、前述した直接交差分化のための新規な分化因子であるＧｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸は単独使用だけでなく、公知分化因子（ｋｎｏｗｎ Ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ－Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、ｋｎｏｗｎｅ－ＤＣ ｆａｃｔｏｒ）と共に使用できる。

【0086】

Ｇｓｔａ４を従来の公知の分化因子と共に組み合わせて使用すれば、直接交差分化効率が向上するだけでなく、直接交差分化時に分化に所要される時間が減ることができる。

【0087】

前記公知分化因子は、直接交差分化に関与する因子として知られているものであれば、制限しない。また、従来の分化因子の変異体も含まれることができる。 この時、変異体は野生型のアミノ酸配列または核酸配列のうち一以上が欠失、置換、挿入されたものであり得る。

【0088】

一例として、前記従来の分化因子はＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される一つ以上であり得る。

【0089】

一具現例で、本出願はＧｓｔａ４および一以上の公知分化因子の組み合わせを開示する。

【0090】

以下、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ可能な組み合わせ例についてより具体的に説明する。

【0091】

Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ例（１）
前記Ｇｓｔａ４は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される一つの従来の分化因子と組み合わせて使用することができる。

【0092】

この時、前記の組み合わせは、例えば、Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２（Ｇｓｔａ４及びＢｒｎ２の組み合わせを指す）；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１；Ｇｓｔａ４＋Ｈｂ９；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３；Ｇｓｔａ４＋Ｍｙｔ１Ｌ；Ｇｓｔａ４＋Ｉｓｌ１；Ｇｓｔａ４＋Ｎｇｎ２；Ｇｓｔａ４＋ＮｅｕｒｏＤ１；などから選択できる。

【0093】

Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ例（２）
前記Ｇｓｔａ４は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される二つの従来の分化因子と組み合わせて使用できる。

【0094】

この時、前記の組み合わせは、例えば、Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９（Ｇｓｔａ４、Ｂｒｎ２及びＨＢ９の組み合わせを指す）；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｈｂ９；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｈｂ９；Ｇｓｔａ４＋Ｎｇｎ２＋Ｈｂ９；Ｇｓｔａ４＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋ＮｅｕｒｏＤ１などから選択できる。

【0095】

Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ例（３）
前記Ｇｓｔａ４は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される三つの従来の分化因子と組み合わせて使用できる。

【0096】

この時、前記の組み合わせは、例えば、Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９＋Ａｓｃｌ１（Ｇｓｔａ４、Ｂｒｎ２、Ｈｂ９及びＡｓｃｌ１の組み合わせを指す）；Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｈｂ９＋Ｎｇｎ２；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ｈｂ９＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１；などから選択できる。

【0097】

Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ例（４）
前記Ｇｓｔａ４は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される四つの従来の分化因子と組み合わせて使用できる。

【0098】

この時、前記の組み合わせは、例えば、Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９＋Ａｓｃｌ１＋Ｉｓｌ１（Ｇｓｔａ４、Ｂｒｎ２、Ｈｂ９、Ａｓｃｌ１及びＩｓｌ１の組み合わせを指す）；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｍｙｔ１Ｌ＋Ｈｂ９；Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｈｂ９＋Ｎｇｎ２＋Ｉｓｌ１；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１；Ｇｓｔａ４＋Ｈｂ９＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１；などから選択できる。

【0099】

Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ例（５）
前記Ｇｓｔａ４は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される五つの従来の分化因子と組み合わせることができる。

【0100】

この時、前記の組み合わせは、例えば、 Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９＋Ａｓｃｌ１＋Ｉｓｌ１＋ＮｅｕｒｏＤ１（Ｇｓｔａ４，Ｂｒｎ２，Ｈｂ９，Ａｓｃｌ１，Ｉｓｌ１及びＮｅｕｒｏＤ１の組み合わせを指す）；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｎｇｎ２＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３；Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１＋Ａｓｃｌ１；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｈｂ９＋Ｎｇｎ２＋Ｉｓｌ１＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１＋Ａｓｃｌ１；Ｇｓｔａ４＋Ｈｂ９＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１＋Ａｓｃｌ１；などから選択できる。

【0101】

Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ例（６）
前記Ｇｓｔａ４は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される六つの従来の分化因子と組み合わせることができる。

【0102】

この時、前記の組み合わせは、例えば、Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９＋Ａｓｃｌ１＋Ｉｓｌ１＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｌｈｘ３（Ｇｓｔａ４，Ｂｒｎ２，Ｈｂ９，Ａｓｃｌ１，Ｉｓｌ１，ＮｅｕｒｏＤ１及びＬｈｘ３の組み合わせを指す）；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｎｇｎ２＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３＋Ｍｙｔ１Ｌ；Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｈｂ９＋ＮｅｕｒｏＤ１＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２；などから選択できる。

【0103】

Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ例（７）
前記Ｇｓｔａ４は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される七つの従来の分化因子と組み合わせることができる。

【0104】

この時、前記の組み合わせは例えば、Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２＋Ｍｙｔ１Ｌ＋Ｈｂ９＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１（Ｇｓｔａ４，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１Ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１の組み合わせを指す）；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｍｙｔ１Ｌ＋Ｈｂ９＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｈｂ９＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｍｙｔ１Ｌ＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｍｙｔ１Ｌ＋Ｈｂ９＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｍｙｔ１Ｌ＋Ｈｂ９＋Ｉｓｌ１＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｍｙｔ１Ｌ＋Ｈｂ９＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３＋ＮｅｕｒｏＤ１；Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｍｙｔ１Ｌ＋Ｈｂ９＋Ｉｓｌ１＋Ｌｈｘ３＋Ｎｇｎ２；などから選択できる。

【0105】

Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ例（８）
前記Ｇｓｔａ４は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１の八つの従来の分化因子と組み合わせることができる。

【0106】

Ｇｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ比率
前述したように、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子は多様に組み合わせて使用することができる。

【0107】

この時、直接交差分化のためにＧｓｔａ４と従来の分化因子それぞれを同一の割合で使用することができる。

【0108】

一例として、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子一つを使用する場合、１：１の割合で使用することができる。

【0109】

他の例として、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子二つを使用する場合、１：１：１、２：１：１、２：１：２、１：２：１などの割合で使用することができる。

【0110】

他の例として、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子３つを使用する場合、１：１：１：１の割合で使用することができる。

【0111】

また、直接交差分化のためにＧｓｔａ４と従来の分化因子それぞれを異なる割合で使用することができる。

【0112】

一具体例として、Ｇｓｔａ４、Ｈｂ９及びＬｈｘ３を使用する場合、１：１：１、２：１：１、２：１：２又は１：２：１の割合で使用することができる。

【0113】

３．Ｇｓｔａ４を含む組成物
Ｇｓｔａ４を含む組成物の概括
本出願は、前記のような新規な分化因子であるＧｓｔａ４を必須的に含む組成物を開示する。

【0114】

一例として、前記の組成物はＧｓｔａ４のみ単独で含むことができる。

【0115】

他の例として、前記組成物はＧｓｔａ４及び従来の分化因子を組み合わせて含むことができる。これらの組み合わせの例として、前述の組み合わせ例（１）ないし（８）に記載された例が挙げられる。

【0116】

この時、各分化因子は各蛋白質を構成するアミノ酸配列で組成物に含まれることができる。

【0117】

または、各分化因子は、各蛋白質をコーディングする核酸配列で組成物に含まれることができる。

【0118】

一具体例として、Ｇｓｔａ４蛋白質のアミノ酸配列は配列番号１であることができる、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２または１２の配列を持つことができる。

【0119】

一具体例として、Ａｓｃｌ１蛋白質のアミノ酸配列は配列番号１７であることができる、Ａｓｃｌ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１８の配列を持つことができる。

【0120】

一具体例として、Ｂｒｎ２蛋白質のアミノ酸配列は配列番号１９であることができる、Ｂｒｎ２蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２０の配列を持つことができる。

【0121】

一具体例として、Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質のアミノ酸配列は配列番号２１であることができる、Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２２の配列を持つことができる。

【0122】

一具体例として、Ｈｂ９蛋白質のアミノ酸配列は配列番号１３であることができる、Ｈｂ９蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１４の配列を持つことができる。

【0123】

一具体例として、Ｉｓｌ１蛋白質のアミノ酸配列は配列番号２３であることができる、Ｉｓｌ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２４の配列を持つことができる。

【0124】

一具体例として、Ｌｈｘ３蛋白質のアミノ酸配列は配列番号１５であることができる、Ｌｈｘ３蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１６の配列を持つことができる。

【0125】

一具体例として、Ｎｇｎ２蛋白質は配列番号２５であることができる、Ｎｇｎ２蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２６の配列を持つことができる。

【0126】

一具体例として、ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質のアミノ酸配列は配列番号２７であることができる、ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２８の配列を持つことができる。

【0127】

以下では、前記組成物についてさらに具体的に説明する。

【0128】

組成物の構成例
組成物（１）：Ｇｓｔａ４単独含む
本出願の組成物は、Ｇｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0129】

また、本出願の組成物は、前記蛋白質変異体または前記核酸変異体を含むことができる。

【0130】

組成物（２）： Ｇｓｔａ４＋１個の従来の分化因子を含む
本出願の組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１Ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１中から選択される１つの蛋白質；または前記選択された蛋白質をコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0131】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0132】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0133】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0134】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0135】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ｉｓｌ１蛋白質またはこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0136】

この時、
例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0137】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0138】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質またはこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0139】

組成物（３）：Ｇｓｔａ４＋２個の従来の分化因子を含む

【0140】

本出願の組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される二つの蛋白質；または前記選択された二つの蛋白質をコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0141】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0142】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0143】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0144】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉｉ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0145】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉｉ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0146】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉｉ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0147】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0148】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0149】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0150】

組成物（４）： Ｇｓｔａ４＋３個の従来の分化因子を含む

【0151】

本出願の組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される三つの蛋白質；または前記選択された三つの蛋白質をコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0152】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0153】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0154】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0155】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0156】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0157】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0158】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0159】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0160】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0161】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0162】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0163】

組成物（５）：Ｇｓｔａ４＋４個の従来の分化因子を含む

【0164】

本出願の組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される四つの蛋白質；または前記選択された四つの蛋白質をコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0165】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0166】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0167】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0168】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0169】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0170】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0171】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0172】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0173】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0174】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0175】

組成物（６）：Ｇｓｔａ４＋５個の従来の分化因子を含む

【0176】

本出願の組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される五つの蛋白質；または前記選択された五つの蛋白質をコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0177】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0178】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0179】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0180】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0181】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0182】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0183】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0184】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0185】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0186】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0187】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0188】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0189】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0190】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0191】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0192】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0193】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0194】

組成物（７）：Ｇｓｔａ４＋６個の従来の分化因子を含む

【0195】

本出願の組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される六つの蛋白質；または前記選択された六つの蛋白質をコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0196】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0197】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0198】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0199】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0200】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0201】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0202】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0203】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0204】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0205】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0206】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0207】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0208】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0209】

組成物（８）：Ｇｓｔａ４＋７個の従来の分化因子を含む

【0210】

本出願の組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１中から選択される七つの蛋白質；または前記選択された七つの蛋白質をコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0211】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0212】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0213】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0214】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0215】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0216】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0217】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0218】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0219】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0220】

例えば、組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉ）Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｉｉ）Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｉｖ）Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖ）Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉ）Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
ｖｉｉ）Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｖｉｉｉ）ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0221】

組成物（９）：Ｇｓｔａ４＋８個の従来の分化因子を含む

【0222】

本出願の組成物は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１Ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の蛋白質；又はこれをコーディングする核酸；
を含むことができる。

【0223】

ここで、前述した組成物は蛋白質形態、核酸形態、蛋白質および核酸が混合された形態を含むことができるが、これに制限されない。この時、前記核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡが混合されたものであることができる。

【0224】

一例では、前記組成物は、含まれているすべての因子が蛋白質の形で含まれている可能性がある。

【0225】

他の例では、前記組成物は、含まれているすべての因子が核酸の形で含まれている可能性がある。

【0226】

また、別の例では、前記組成物は、含まれている因子の一部は蛋白質形態で、他の一部は核酸形態で含まれている可能性がある。

【0227】

この時、前記核酸形態はベクトル形態であることができる。この時、前記ベクトルは一個または二個以上のベクトルで構成されることができる。

【0228】

また、前記の組成物はウイルスカプシドを含むことができる。

【0229】

この時、前記の分化因子はウイルスカプシドに含まれて伝達されることができる。

【0230】

一例として、本出願の薬学的組成物は、Ｇｓｔａ４単独遺伝子を含むウイルスカプシドを含むことができる。

【0231】

他の例として，前記組成物はＧｓｔａ４を含むウイルスカプシド；及び
Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１中から選択される１以上を含むウイルスカプシドを一緒に含むことができる。

【0232】

分化因子発現用ベクトル（Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）
一例として、前記組成物は、分化因子発現用ベクトルを含むことができる。この時、前記ベクトルはＧｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸を含むことができる。または、前記Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸の他に、従来の分化因子を暗号化する核酸；をさらに含むことができる。

【0233】

前記ベクトルは、対象細胞内で目的とする分化因子を効果的に発現させる機能を持っており、そのために、プロモーター、エンハンサーなど必要なその他の追加構成をさらに含むことができる。

【0234】

ベクトルの必須構成－Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸
前記ベクトルは、Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸を必須として含む。

【0235】

前記の暗号化する核酸は、Ｇｓｔａ４遺伝子の全長配列または一部配列であり得る。

【0236】

例えば、前記の一部の配列はＧｓｔａ４のエクソン配列であることができる。この時、前記エクソン配列はＧｓｔａ４遺伝子の配列の中でイントロンが除外されたＣＤＳ（Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）配列であり得る。

【0237】

一例として、ベクトルは配列番号２又は配列番号１２のＤＮＡ配列を含むことができる。

【0238】

ベクトルの選択的構成－従来の分化因子を暗号化する核酸
前記ベクトルは、Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸の他に、従来の分化因子を暗号化する核酸を選択的にさらに含むことができる。前記Ｇｓｔａ４および従来の分化因子を暗号化する核酸は、一つのベクトルに含まれるか、または２つ以上のベクトルに含まれることができる。

【0239】

一具現例で、前記ベクトルはＧｓｔａ４と従来の分化因子の組み合わせ例（１）ないし（８）のうち選択された分化因子の暗号化する核酸を含むことができる。

【0240】

例えば、ベクトルは、
ｉ）配列番号２及び配列番号１２の中から選択される配列；及び
ｉｉ）配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、および２８の中から選択される一つの配列；を含むことができる。

【0241】

例えば、発現ベクトルは、
ｉ）配列番号２及び配列番号１２の中から選択される配列；及び
ｉｉ）配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８の中から選択される二つの配列；を含むことができる。

【0242】

例えば、発現ベクトルは、
ｉ）配列番号２及び配列番号１２の中から選択される配列；及び
ｉｉ）配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８の中から選択される三つの配列；を含むことができる。

【0243】

例えば、発現ベクトルは、
ｉ）配列番号２及び配列番号１２の中から選択される配列；及び
ｉｉ）配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８の中から選択される四つの配列；を含むことができる。

【0244】

例えば、発現ベクトルは、
ｉ）配列番号２及び配列番号１２の中から選択される配列；及び
ｉｉ）配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８の中から選択される五つの配列；を含むことができる。

【0245】

例えば、発現ベクトルは、
ｉ）配列番号２及び配列番号１２の中から選択される配列；及び
ｉｉ）配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８の中から選択される六つの配列；を含むことができる。

【0246】

例えば、発現ベクトルは、
ｉ）配列番号２及び配列番号１２の中から選択される配列；及び
ｉｉ）配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８の中から選択される七つの配列；を含むことができる。

【0247】

例えば、発現ベクトルは、
ｉ）配列番号２及び配列番号１２の中から選択される配列；及び
ｉｉ）配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８の配列；を含むことができる。

【0248】

ベクトルの付加構成（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（１）

【0249】

前記ベクトルは、目的蛋白質の必須構成および選択的構成以外に、細胞内で分化因子発現に必要な付加構成を含むことができる。

【0250】

例えば、前記の付加構成は発現調節要素、選別要素などを含むことができる。

【0251】

前記発現調節要素は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、終結者（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、内部リボソーム流入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ）、２Ａ自己切断ペプチド（２Ａ ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）などであり得る。

【0252】

例えば、前記プロモーターはＳＶ４０初期プロモーター、ＬＴＲ（ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、Ａｄ ＭＬＰ（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ）プロモーター、ＨＳＶ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＲＳＶ（ｒｏｕｓｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、Ｕ６プロモーターなどであることができる。

【0253】

例えば、前記２Ａ自己切断ペプチドはＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ等であることができる。前記分化因子発現のためのベクトルは、２Ａ自己切断ペプチドを１個以上含んでいることができる。この時、前記２Ａ自己切断ペプチドは同じトランスクリプト（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）から複数の蛋白質を生成する。そのため、ベクトル内で発現を目的とする二つ以上の異なる蛋白質の間に２Ａ自己切断ペプチドが位置することができる。

【0254】

前記の選別要素は蛍光蛋白質遺伝子、タグ（ｔａｇ）、リポーター遺伝子、抗生剤耐性遺伝子などであることができる。

【0255】

例えば、前記蛍光蛋白質遺伝子はＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ ｇｅｎｅ）、ＹＦＰ遺伝子（ＹＦＰ ｇｅｎｅ）、ＲＦＰ遺伝子（ＲＦＰ ｇｅｎｅ）またはｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ ｇｅｎｅ）などであることができる。

【0256】

例えば、前記タグはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグなどであることができる。

【0257】

例えば、前記リポーター遺伝子はグルタチオン－Ｓ－トランスファラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスファラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼなどであることができる。

【0258】

例えば、前記抗生剤耐性遺伝子はハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ）、ネオマイシン抵抗性遺伝子（ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ）、カナマイシン抵抗性遺伝子（ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ）、ブラスチサイジン抵抗性遺伝子（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ）、ゼオシン抵抗性遺伝子（ｚｅｏｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ）などであることができる。

【0259】

本出願のベクトルは、筆記的構成、選択的構成及び付加構成を含めて目的とする分化因子を効果的に発現させるのに利用できる。

【0260】

一具体例として、本出願の一ベクトルがＧｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸を含む場合、前記ベクトルは配列番号３６の配列からなることができる。

【0261】

一具体例として、発現ベクトルがＧｓｔａ４蛋白質を暗号化するジ核酸及びＭｙｔ１ｌ蛋白質を暗号化する核酸を含む場合、該当ベクトルは配列番号５の配列で行われることができる。

【0262】

他の具体例として、発現ベクトルがＧｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸；ＭＮＸ１蛋白質を暗号化する核酸；及びＬＨＸ３蛋白質を暗号化する核酸；を含む場合、該当ベクトルは配列番号２９の配列で行われることができる。

【0263】

ベクトルの付加構成（２）（ノックイン用構成）

【0264】

他の具現例で、前記発現ベクトルは、分化因子を対象のゲノムにノックインさせるための付加構成（２）を追加で含むことができる。

【0265】

前記のノックイン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）は、分化因子を対象細胞内のゲノム上に挿入することを意味する。このような場合、挿入された分化因子の発現が細胞内で持続するため、対象細胞（例えば、体細胞）のモーターニューロンへの分化効率もさらに高まることができる。

【0266】

一具体例として、前記分化因子は対象細胞ゲノム内のセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）領域にノックインされることができる。

【0267】

前記セーフハーバーは、対象のゲノム内の特定部分に外来（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）分化因子が挿入されても副作用を誘発せず、前記分化因子の発現が持続的になりうる遺伝子座位を称する。

【0268】

例えば、前記セーフハーバーは、対象細胞のゲノム配列のうちＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６などをコーディングする座位領域であることができる。

【0269】

前記の分化因子のノックインは、当業界に知られている方法で行うことができる。

【0270】

一具体例として、前記の方法は遷移因子（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ， ＴＥ）システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどを利用することができる。

【0271】

前記転移因子システムは、誘電体内で位置を移すことができるＤＮＡ断片を利用するものである。

【0272】

例えば、前記転移因子システムは、ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）転移因子、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）転移因子などを含むことができる。

【0273】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ蛋白質およびガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）、ドナーなどで構成されることができる。この時、前記ドナーは発現させようとする（ｉ）分化因子、および（ｉｉ）対象細胞ゲノム内のセーフハーバー遺伝子の一部配列と相同性を持つ配列を含むことができる。この時、前記（ｉｉ）のセーフハーバー遺伝子の一部配列と相同性を持つ配列は、ドナーの両末端でそれぞれ相同性癌（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ）として機能することができる。

【0274】

例えば、前記Ｃａｓ蛋白質及びガイドＲＮＡが複合体を形成し、対象細胞ゲノム内のセーフハーバー遺伝子配列内にＤＳＢ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を引き起こし、この時、前記切断部位に、両端に相同性癌を有する分化因子（ドナー）配列が相同性再組合（ＨＤＲ）によって挿入されることができる。この時、前記二つの相同性癌は切断部位を中心にｕｐｓｔｒｅａｍの一部配列と相同性を持つ配列およびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍの一部配列と相同性を持つ配列である。

【0275】

ベクトルの種類
一例では、前記ベクトルはウイルスベクトルであることができる。

【0276】

一例として、前記ウイルスベクトルはレトロウイルス、レンティウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ベクシニアウイルス、フォックスウイルス、 ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｏｓｉｓ）、ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、エピゾマル（ｅｐｉｓｏｍａｌ）または単純包診ウイルスなどであり得る。好ましくはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。

【0277】

他の例では、前記ベクトルは非ウイルスベクトルであり得る。

【0278】

一例として、前記の非ウイルスベクトルはプラスミド、ファージ、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ－脂質複合体、ＤＮＡ－高分子複合体、ｍＲＮＡ であり得る。

【0279】

４．直接交差分化方法
直接交差分化方法の概括
本発明の他の様態で、前記の分化因子の発現のための組成物を利用して体細胞からモーターニューロンに直接交差分化させる方法を提供する。

【0280】

したがって、本出願はＧｓｔａ４を含む組成物を利用した直接交差分化方法を開示する。

【0281】

前記の組成物を利用すれば、対象細胞が逆分化段階なしに直接交差分化され、特にモーターニューロンに転換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）されることができる。前記の直接交差分化方法は、通常の技術者が公示された方法を適切に選択して行うことができ、所定の目的を達成できるものであれば特に制限されない。

【0282】

一具現例として、前記直接交差分化方法は、組成物（１）ないし（９）のうち選択される一つの組成物を対象細胞に導入することを含む。

【0283】

この時、前記組成物はＧｓｔａ４を必須的に含むことを特徴とし、

【0284】

前記の直接交差分化方法は、対象細胞が誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）に逆分化する効果を示さない。

【0285】

任意の実施例として、本出願の直接交差分化方法は、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸を含むベクトルを対象細胞内に導入する；を含むことができる。

【0286】

任意の実施例で、本出願の直接交差分化方法は
Ｇｓｔａ４蛋白質；又はこれをコーディングする核酸；及び
Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される１つ以上の蛋白質；または前記選択された蛋白質をコーディングする核酸；を含むベクトルを対象細胞内に導入し；を含むことができる。

【0287】

一具現例として、本出願の直接交差分化方法は、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸、Ｌｈｘ３蛋白質をコーディングする核酸、Ｈｂ９蛋白質をコーディングする核酸を含むベクトル；を対象細胞内に導入する；を含むことができる。

【0288】

直接交差分化の対象細胞（出発細胞）
本出願が達成しようとする直接交差分化は、「分化した細胞」に本出願の因子を導入し、目的とする細胞に直接的に転換するものである。

【0289】

本出願の直接交差分化方法に使われる対象細胞である分化された細胞は体細胞であることができる。体細胞は生殖細胞を除いたすべての細胞を意味する。

【0290】

例えば、前記体細胞は線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、筋肉細胞、神経細胞、毛髪細胞、毛根細胞、毛包細胞、口腔上皮細胞、尿から抽出した体細胞、胃粘膜細胞、杯状細胞、ガストリン細胞（ｇａｓｔｒｉｎ ｃｅｌｌ／Ｇｃｅｌｌ）、Ｂ細胞、主皮細胞、星状細胞(astrocyte)、血液細胞、希少突起膠前駆細胞などであり得る。

【0291】

前記体細胞は、人、犬、猫、馬、羊、ウサギ、豚、マウス及びラクダ等の哺乳動物由来のもの又は分離されたものであることができる。

【0292】

一例として、本出願の直接交差分化方法は、
前記の直接交差分化のための分化因子の発現のための組成物を体細胞に導入し；を含む。

【0293】

この時、前記体細胞は組成物導入前の一定期間培養された体細胞であることができる。

【0294】

前記の分化方法は、組成物が導入された体細胞を神経細胞分化のための培養培地でさらに培養する工程をさらに含むことができる。

【0295】

以下では、前記分化方法で用いられる、体細胞培養のための培養培地、神経細胞分化のための培養培地、分化期間（すなわち、組成物を導入した体細胞を培養する期間）、導入方法等について述べる。

【0296】

培養培地
前記培養培地は、目的に応じて体細胞培養のための培養培地または神経細胞分化のための培養培地であることができる。

【0297】

体細胞培養のための培養培地及び神経細胞分化のための培養培地は、当業界に知られている培養培地を利用することができる。また、所定の目的のために培養培地を適切に変更して使用することができる。例えば、本出願の目的である直接交差分化の効率を高めるために、適切に当業界に知られた炭素源、窒素源、微量元素、成長因子などを調節して使用することができる。

【0298】

例えば、培養培地はＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｈａｍ'ｓ Ｆ－１０又はＨａｍ'ｓ Ｆ－１２等であることができる。

【0299】

細胞コンフルエンス、培養期間及び鶏大培養
体細胞の培養において、細胞のコンフルエンスを実験に容易になるように調節して培養することができる。

【0300】

この時、体細胞は組成物導入前の状態または前記の組成物が導入された状態によって適切にコンフルエンスを調節することができる。

【0301】

体細胞の培養は細胞のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が約６０％ないし１００％になるまで培養できる。好ましくは体細胞のコンフルエンスが約８０％ないし１００％になるまで培養できる。

【0302】

また、前記体細胞培養が実験に容易な適正コンフルエンスになるように約１２時間ないし６０時間培養できるが、これに制限しない。

【0303】

前記体細胞培養は、前記適正コンフルエンスのために１回ないし３回継代培養できるが、これに制限しない。

【0304】

分化因子の発現のための組成物の各構成要素の導入順序
前記の直接交差分化方法において、組成物（１）ないし組成物（９）のうち選択される組成物を対象細胞内に導入する順序は特に制限されない。例えば、前記組成物が含む分化因子が二つ以上の場合、これらは対象細胞内に同時に導入されることもあり、順次導入されることもありうる。

【0305】

例えば、本出願の直接交差分化方法は、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸を含む発現ベクトル、Ｌｈｘ３蛋白質をコーディングする核酸を含む発現ベクトル、およびＨｂ９蛋白質をコーディングする核酸を含む発現ベクトル、を同時にまたは順次導入することを含むことができる。

【0306】

分化因子の発現のための組成物を対象細胞に導入する方法

【0307】

前記直接交差分化方法において、前記直接交差分化のための分化因子の発現のための組成物を対象細胞内に導入することは、通常の技術者が公知の技術を適切に選択して行うことができる。

【0308】

例えば、前記組成物を細胞内に導入するために電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、自己注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、一時的な細胞圧縮またはスクイジング、陽イオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ，脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染、ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染等が使用できるが、これに制限されることはない。

【0309】

分化因子の発現のための組成物が導入された体細胞の特徴

【0310】

本出願で提供する分化因子の発現のための組成物が導入された体細胞は、培養期間が経過するにつれて分化因子の発現および神経細胞マーカーの発現が増加している状態にある。

【0311】

前記の神経細胞マーカーはＮＥＵＮ、ＣｈＡＴ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｔｕｊ１、ＩｓＬ１、ＰＡＸ６、Ｏｌｉｇ２、Ｎｋｘ２．２、ＳＭＩ－３２などであることができる。

【0312】

例えば、本出願の分化因子の発現のための組成物が導入された体細胞は、培養期間１日目に比べて３日目にＮＥＵＮ、ＣｈＡＴ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９、Ｓｙｎａｐｓｉｎ中から選択される一つ以上の神経細胞マーカーの発現が増加している可能性がある。

【0313】

分化期間

【0314】

前述した前記の直接交差分化方法を利用して体細胞に分化因子が導入されれば、前記の体細胞が適切な時間が過ぎた後、モーターニューロンに転換される。体細胞がモーターニューロンに転換されるまで、培地造成変更を通じて分化環境を維持できるようにすることができる。前記の適切な時間は、対象細胞によって決定されることができる。

【0315】

例えば、分化因子の発現のための組成物が導入された線維芽細胞は、約７日ないし３０日以内にモーターニューロンに転換できる。

【0316】

他の例を挙げると、分化因子の発現のための組成物が導入された星状細胞は、約７日ないし３０日以内にモーターニューロンに転換することができる。

【0317】

直接交差分化方法の結果物

【0318】

前述した本出願の直接交差分化方法を利用すれば、体細胞が直接交差して誘導されたモーターニューロンを得ることができる。 モーターニューロンは脳と脊髄で起きた運動刺激を筋肉や腺に伝達する神経細胞だ。

【0319】

特に、本出願の直接交差分化因子が体細胞内に導入された誘導されたモーターニューロンは、細胞内の前記分化因子が過剰発現（ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）されている発現特徴を持つ。したがって、このような分化因子の過剰発現環境によって、前記誘導されたモーターニューロンは神経細胞マーカーも過剰発現されている特徴を持つことができる。

【0320】

前記直接交差分化因子は，Ｇｓｔａ４，Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １），Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２），Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ），Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９），ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １），Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３），Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）、ＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）等であることができるが、これに限定しない。

【0321】

例えば、前記の直接交差分化で得られたモーターニューロンでは、Ｇｓｔａ４が過剰発現されている。

【0322】

例えば、前記の直接交差分化で得られたモーターニューロンでは、Ｇｓｔａ４；およびＡｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｎｅｕｒｅｎ（２）、およびＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される一つ以上；の直接交差分化因子が過剰発現されている。

【0323】

また、このような分化因子の過剰発現はモーターニューロン内の神経細胞マーカー蛋白質の発現増加を引き起こす。前記の神経細胞マーカーは、ＮＥＵＮ、ＣｈＡＴ、Ｍａｐ２、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、ＨＢ９、Ｔｕｊ１、ＩｓＬ１、Ｎｏｔｃｈ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ３、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ＰＡＸ６、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＳＯＸ２、等であることができるが、これに限定しない。

【0324】

例えば、前記の直接交差分化で得られたモーターニューロンは、ＣｈＡＴ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９、Ｓｙｎａｐｓｉｎのうち一つ以上の神経細胞マーカーが過剰発現することができる。

【0325】

他の例を挙げると、前記の直接交差分化で得られたモーターニューロンは、誘導されたＴｕｊ１、ＩｓＬ１、ＮＥＵＮのうち一つ以上が過剰発現されることがある。

【0326】

直接交差分化の結果確認
本出願の直接交差分化方法は、選択的にモーターニューロンへの転換を確認する過程を追加で含むことができる。

【0327】

この時、前記確認する過程は当業界に知られた神経細胞マーカーを利用して確認でき、当業界に知られた多様な分子生物学技法を通じて確認できる。 例えば、前記分子生物学技法は免疫蛍光染色法、ウエスタンブラット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ－ＰＣＲ）、酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）等であることができるが、これに限定しない。

【0328】

本出願の直接交差分化方法の特徴（１）
本出願で開示する直接交差分化方法は、誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）が生成されない特徴がある。すなわち、体細胞の逆分化過程による誘導万能幹細胞段階を経ず、体細胞から目的とするモーターニューロンへの転換を直接的に誘導するという点で特徴がある。

【0329】

例えば、体細胞である線維芽細胞または星状細胞にＧｓｔａ４単独；またはＧｓｔａ４と従来の分化因子を一緒に処理すれば、前記線維芽細胞または星状細胞はモーターニューロンに直接分化することができる。

【0330】

本出願の直接交差分化方法の特徴（２）
また、本出願の方法は前述したように誘導万能幹細胞段階を経ないため、対象細胞の奇形種（ｔｅｒａｔｏｍａ）形成の可能性が低い長所がある。すなわち、従来の幹細胞使用の問題点である奇形種の生成確率を顕著に下げた方法であることができる。このような長所は、本出願の方法が神経系疾患の治療のためにさらに有用に使われる可能性があることを示唆する。

【0331】

本出願の直接交差分化方法の特徴（３）
本出願で開示する直接交差分化方法は、従来の分化因子の問題点である分化効率を改善するのに大きく寄与する。特に、線維芽細胞または星状細胞に従来の分化因子だけを処理するより、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子を共に処理すれば、モーターニューロンで直接分化される分化効率を顕著に向上させることができる。

【0332】

５．Ｇｓｔａ４を含む直接交差分化用薬学的組成物
Ｇｓｔａ４を含む直接交差分化用薬学的組成物概括
本出願は他の太陽で、神経疾患の治療のための、前記の組成物（１）ないし（９）のうち選択される一つの組成物を薬学的組成物として開示する。以下で前記薬学的組成物が含むことができる成分及び、治療用途のための具体的な適応症等を開示する。

【0333】

薬学的組成物の有効成分
本出願の薬学的組成物の有効成分は、次のいずれか一つ以上であることができる。

【0334】

（１）本出願の分化因子
（２）本出願の分化因子を含む体細胞
（３）本出願の分化因子を用いて誘導されたモーターニューロン

【0335】

この時、前記の分化因子はＧｓｔａ４単独；またはＧｓｔａ４および従来の分化因子の組み合わせで組成物に含まれることができる。この時、前記従来の分化因子はＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される１以上；である。

【0336】

前記（１）分化因子は蛋白質の形態または核酸の形態であり得る。

【0337】

一例として、本出願の神経系疾患予防または治療のための、薬学的組成物はＧｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸；を含むことができる。

【0338】

他の例として、本出願の神経系疾患予防または治療のための、薬学的組成物はＧｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸；Ｈｂ９蛋白質またはこれをコーディングする核酸；およびＬｈｘ３蛋白質またはこれをコーディングする核酸を含むことができる。

【0339】

また別の例として、本出願の神経系疾患予防または治療のための薬学的組成物は、Ｇｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸；Ｈｂ９蛋白質またはこれをコーディングする核酸；Ｌｈｘ３蛋白質またはこれをコーディングする核酸；およびＮｇｎ２蛋白質またはこれをコーディングする核酸を含むことができる。

【0340】

この時、前記（１）分化因子はウイルスカプシドに含まれて伝達されることができる。一例として、本出願の薬学的組成物は、Ｇｓｔａ４単独遺伝子を含むウイルスカプシドを含むことができる。他の例として、前記の組成物はＧｓｔａ４を含むウイルスカプシド、Ｈｂ９を含むウイルスカプシド、Ｌｈｘ３を含むウイルスカプシドを一緒に含むことができる。本出願の分化因子を含むウイルスカプシドを含む場合、一種の遺伝子治療剤として使用することができる。

【0341】

また、前記（２）分化因子を含む体細胞は、ｉ）分化因子をコーディングする核酸を含むベクトルが導入された体細胞；またはｉｉ）分化因子蛋白質が導入された体細胞であることができる。本出願の分化因子を含む体細胞を有効成分として含む場合、一種の細胞治療剤として使用することができる。細胞治療剤は組織の機能を復元するために自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）「細胞」を有効成分として利用する治療剤を意味する。

【0342】

一例として、本出願の神経系疾患予防または治療のための薬学的組成物は、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸を含むベクトルが導入された体細胞；を含むことができる。本出願の神経系疾患予防または治療のための薬学的組成物は、Ｇｓｔａ４蛋白質が導入された体細胞；を含むことができる。

【0343】

他の例として、本出願の神経系疾患予防または治療のための薬学的組成物は、Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸；Ｈｂ９蛋白質をコーディングする核酸；およびＬｈｘ３蛋白質をコーディングする核酸を含むベクトルが導入された体細胞；を含むことができる。本出願の神経系疾患予防または治療のための薬学的組成物は、Ｇｓｔａ４蛋白質；Ｈｂ９蛋白質；およびＬｈｘ３蛋白質が導入された体細胞；を含むことができる。

【0344】

また、前記（３）分化因子を利用して誘導されたモーターニューロンは、前述した［４．直接交差分化方法］を利用して体細胞が直接交差分化して生成されたモーターニューロンである。本出願の前記誘導された運動ニューロンを有効成分として含む場合、また別の種類の細胞治療剤として使用することができる。

【0345】

薬学的に許容可能な追加（ｅｘｔｒａ）構成要素

【0346】

前記薬学的組成物は、前記有効成分以外に、薬学的に許容可能な追加構成要素をさらに含むことができる。前記薬学的に許容可能な追加構成要素は、担体、賦形剤、希釈剤、保存剤等であることができるが、これに限定しない。

【0347】

例えば、前記の担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、デキストロズ、スクロス（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルティトール、デンプン、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェイト、カルシウムシリケート、セルローズ、メチルセルローズ、蒸留水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、ＨＳＡ（Ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）などである。

【0348】

例えば、前記保存剤は安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等である。

【0349】

前記薬学的組成物を製剤化する場合、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤などをさらに含むことができる。

【0350】

薬学的組成物の製剤化
前記薬学的組成物は、経口用または非経口用に製剤化されることができる。

【0351】

例えば、経口用に製剤化される場合、固形剤、液状剤、カプセル剤、半固体形態などで製造されることができる。

【0352】

他の例として、非経口用に製剤化される場合、注射剤、エアゾール剤等で製造されることがある。好ましくは注射剤として製剤化することができる。

【0353】

薬学的組成物のターゲット疾患

【0354】

前記薬学的組成物は神経系疾患に適用されることができる。特に、前記の薬学的組成物は神経系疾患の治療または予防のために使用できる。本出願の神経系疾患は、神経細胞損傷またはこれによって誘発される疾患であることができる。

【0355】

例えば、前記神経系疾患は脊髄損傷、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、ルー・ゲーリック病、毛細血管拡張性運動失調症（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、筋萎縮性側索硬化症、運動神経損傷、外傷による末梢神経損傷、虚血性脳損傷、新生児低酸素性虚血性脳損傷、脳性麻痺、末梢麻痺、中枢麻痺、四肢麻痺、両麻痺、てんかん、神経細胞発達障害、神経痛、難治性てんかん、アルツハイマー病、先天性代謝性神経系疾患及び外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、運動性神経細胞の損傷またはこれに誘発される疾患などであることができるが、これに制限しない。望ましいことに、前記の神経系疾患は脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、末梢麻痺、中枢麻痺、四肢麻痺、両麻痺の中から選択できる。

【0356】

６．神経系疾患の治療方法
神経系疾患の治療方法の概括
前記の［５．Ｇｓｔａ４を含む直接交差分化用薬学的組成物］を利用した神経系疾患の治療方法を開示する。

【0357】

前述のとおり前記薬学的組成物は、
Ｇｓｔａ４または
Ｇｓｔａ４及びＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１中から選択される１以上；
を含む。

【0358】

本出願の神経系疾患の治療方法は、（ｉ）前記の組成物をそのまま対象（患者）に処理したり、（ｉｉ）前記の組成物を導入した体細胞を対象に処理したり、または（ｉｉｉ）エックスビーボ（Ｅｘ ｖｉｖｏ）から誘導されたモーターニューロンを生成して、これを対象に処理する方法で遂行できる。この時、前記（ｉ）の方法は対象の体内で、すなわち、インビボ（Ｉｎ ｖｉｖｏ）から誘導されたモーターニューロンを生成する効果を持つことができる。

【0359】

治療方法（１）
神経系疾患を治療する方法は、本出願の「薬学的組成物」を神経系疾患の治療または予防が必要な対象に投与して生体内（Ｉｎ ｖｉｖｏ）で誘導されたモーターニューロンが生成される方式を利用することができる。

【0360】

一例として、本出願の神経系疾患を治療する方法は、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸を含む組成物を対象に投与し；を含むことができる。

【0361】

他の例として、本出願の神経系疾患を治療する方法は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１中から選択される一つ以上の蛋白質；
を含む組成物を対象に投与する；を含むことができる。

【0362】

治療方法（２）
神経系疾患を治療する方法は、本出願の薬学的組成物を導入した「体細胞」を対象に投与することを特徴とする。

【0363】

一例として、本出願の神経系疾患を治療する方法は、
Ｇｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸を含む組成物が導入された体細胞を対象に投与し；
を含むことができる。

【0364】

他の例として、本出願の神経系疾患を治療する方法は、
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１Ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１中から選択される一つ以上の蛋白質；又は前記蛋白質をコーディングする核酸；
を含む組成物が導入された体細胞を対象に投与し；
を含むことができる。

【0365】

前述したように、本出願の組成物を導入した体細胞を対象に投与すると、対象の体内で、前記体細胞に導入されている分化因子によって体細胞が直接交差分化してモーターニューロンに転換される。これにより、投与された対象内に前記のモーターニューロンが増殖し、神経系疾患が治療または予防されることができる。

【0366】

治療方法（３）
神経系疾患を治療する方法は、本出願の組成物を分離された体細胞に導入して直接交差分化されたモーターニューロンをエックスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で得た後、前記"モーターニューロン"を神経系疾患の治療または予防が必要な対象に投与する方式を利用することができる。すなわち、本出願の誘導されたモーターニューロンを治療剤の直接的な有効成分として対象に適用する方式である。

【0367】

一例として、本出願の神経系疾患を治療する方法は、
体細胞にＧｓｔａ４蛋白質またはこれをコーディングする核酸を含む組成物を導入して誘導されたモーターニューロンを対象に投与し；
を含むことができる。

【0368】

他の例として、本出願の神経系疾患を治療する方法は、
体細胞に
ｉ）Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１中から選択される１以上の蛋白質；又は前記蛋白質をコーディングする核酸；
を含む組成物を導入し、誘導されたモーターニューロンを対象に投与し；
を含むことができる。

【0369】

投与対象
前記神経系疾患の治療方法の適用対象は、健常者に比べてモーターニューロンの機能が低下した対象またはモーターニューロンの減少によって病気が発生した対象であることができるが、これに制限しない。

【0370】

神経系疾患の治療または予防が必要な対象は哺乳類であることができる。例えば、前記哺乳類は人、犬、馬、猫、マウス、ウサギ、羊、猿などであることができる。

【0371】

以下で説明する投与方法、投与用量、薬学的組成物の濃度、投与周期は投与対象の年齢、体重、一般健康状態、食餌、神経系疾患の発病程度、他の薬の摂取有無，治療期間などを考慮して決定されることがある。

【0372】

投与方法
前記神経系疾患の治療方法の投与は、対象の多様な経路で投与できる。

【0373】

投与は経口投与または非経口投与であることができる。この時、非経口投与は注射投与であることがある。

【0374】

前記の注射投与時の部位は筋肉、皮内、皮下、静脈、腹腔、動脈、粘膜、脊髄、骨髄，脊髄腔内，経皮等であることがあるが，これに制限しない。

【0375】

一例として、前記投与部位が脊髄である場合、Ｌ１（ｌｕｍｂａｒ １）、Ｌ２（ｌｕｍｂａｒ ２），Ｌ３（ｌｕｍｂａｒ ３）、Ｌ４（ｌｕｍｂａｒ ４）、Ｌ５（ｌｕｍｂａｒ ５）、Ｔ１（ｔｈｏｒａｃｉｃ １）、Ｔ２（ｔｈｏｒａｃｉｃ ２）、Ｔ３（ｔｈｏｒａｃｉｃ ３）、Ｔ４（ｔｈｏｒａｃｉｃ ４），Ｔ５（ｔｈｏｒａｃｉｃ ５）、Ｔ６（ｔｈｏｒａｃｉｃ ６）、Ｔ７（ｔｈｏｒａｃｉｃ ７）、Ｃ１（ｃｅｒｖｉｃａｌ １）、Ｃ２（ｃｅｒｖｉｃａｌ ２）、Ｃ３（ｃｅｒｖｉｃａｌ ３）、Ｃ４（ｃｅｒｖｉｃａｌ ４）、Ｃ５（ｃｅｒｖｉｃａｌ ５）等であることがある。

【0376】

他の例として、神経系疾患が発生した部位自体に投与することができる。任意の具体例として、パーキンソン病を発症した脳に直接投与することであり得る。

【0377】

薬学的組成物の濃度

【0378】

前記薬学的組成物の濃度は全体組成物基準で次のように含まれることができる。この時、前記の薬学的組成物は、ベクトルを含む形態、ベクトルから精製されたウイルスを含む形態、ベクトルを含む細胞の形態、蛋白質の形態、蛋白質を含む細胞の形態等であることができるが、これに限定しない。

【0379】

一例として、本出願の薬学的組成物を含むウイルスベクトルをウイルスで精製する場合、組成物全体を基準に次のような濃度で含まれることができる。

【0380】

例えば、前記薬学的組成物全体を基準に１ｘ１０^５ｖｇ（ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ）／ｍＬないし１ｘ１０^２０ｖｇ（ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ）／ｍＬ濃度のウイルスが含まれることがある。

【0381】

例えば、前記薬学的組成物全体を基準に１ｘ１０^５ＧＣ（ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｉｅｓ）／ｍＬないし１ｘ１０^２０ｖｇ（ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｉｅｓ）／ｍＬ濃度のウイルスが含まれることができる。

【0382】

他の例として、前記薬学的組成物全体を基準に１ｘ１０^５ＶＰ（ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ）／ｍＬないし１ｘ１０^２０ＶＰ（ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ）／ｍＬ濃度のウイルスが含まれることがある。

【0383】

投与用量

【0384】

前記薬学的組成物の投与用量は、投与方法、対象等を考慮して適切な用量を考慮することができる。

【0385】

一例として、投与用量は１回に１ｕＬないし２０ｍＬ投与できるが、これに制限しない。

【0386】

具体例として、脊髄投与時に１回に１ｕＬ／ｋｇないし２０ｕＬ／ｋｇ投与することができる。静脈投与時、１回に０．５ｍＬ／ｋｇないし１０ｍＬ／ｋｇ投与できる。

【0387】

投与周期

【0388】

前記の薬学的組成物を対象に投与する周期は、対象の疾患、発病程度などによって投与されることがある。

【0389】

投与回数は一日に１回又は数回投与することもでき、長期間にわたって数回投与することもできる。この時，一定期間間隔をおいて投与することもできる。

【0390】

前記投与間隔は１日ないし６０日等であることがある。この時、連続投与又は非連続投与することができる。

【0391】

治療効果の確認

【0392】

前記の神経系疾患の治療方法を投与対象に適用した後、神経系疾患が緩和または改善または治療された効果を多様な方法で確認することができる。

【0393】

例えば、スカ（ｓｃａｒ）減少、神経細胞マーカー発現変化、ＢＢＢスコア、活動電位、自発的反応などを通じて確認できる。

【0394】

一例として、前記の神経系疾患の治療方法を利用すれば、スカが約２倍ないし５０倍減少することができる。

【0395】

他の例として、前記の神経系疾患の治療方法を利用すると、神経細胞マーカーの発現が約２倍ないし５０倍増加する可能性がある。

【0396】

他の例として、前記の神経系疾患の治療方法を利用すると、ＢＢＢスコアが約２倍ないし５０倍増加する可能性がある。

【0397】

他の例として、前記の神経系疾患の治療方法を利用すれば、活動電位または自発的反応が正常人と類似した様相で現れることがある。

【0398】

７．誘導されたモーターニューロンの用途
誘導された運動ニューロンの用途概括

【0399】

本出願では、前記の直接交差分化方法で得られたモーターニューロンの多様な用途を開示する。以下で前記のモーターニューロンを利用した薬物スクリーニング、生体素材用途などについて説明する。

【0400】

モーターニューロンの用途（１） － 薬物スクリーニング
一例として、本出願の誘導された運動ニューロンを利用した薬物スクリーニング用途が開示される。特に、神経系疾患の予防、治療薬物のスクリーニングに活用できる。

【0401】

前記誘導された運動ニューロンに候補薬物の投与前後に運動ニューロンの反応性を確認する方法などで神経系疾患予防または／および治療のための薬物のスクリーニングに有用に使用できる。

【0402】

モーターニューロンの用途（２） － 人工臓器

【0403】

他の例として、本出願の誘導された運動ニューロンを含む人工臓器が開示される。幹細胞を特定の身体器官に誘導し、体外で臓器と同様に再現するオルガノイド（ｏｒｇａｎｏｉｄ）も人工臓器の一種だ。本出願は誘導万能幹細胞段階を経ないので、幹細胞を利用するオルガノイドに比べて副作用が少ない人工臓器に活用できる。

【0404】

３Ｄバイオプリンティングに本出願のモーターニューロンを適用することができる。３Ｄバイオプリンティングは、生きている細胞を活用したバイオインクを３Ｄプリンティングのように層が積み上げ、神経、角膜、肝臓、皮膚、血管などの人工臓器を作るものだ。したがって、本出願の誘導された運動ニューロンを３Ｄバイオプリンティングして神経系疾患および損傷治療用人工臓器を製作することができる。

【0405】

［発明の可能な具現例］

【0406】

具現例１：Ｇｓｔａ４ 単独
体細胞から運動性神経細胞への直接交差分化のための組成物であって、前記組成物は、
Ｇｓｔａ４（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａ４）蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含み、前記運動性神経細胞は前記体細胞から誘導された（分化した）運動性神経細胞であることを特徴とする組成物。

【0407】

（体細胞が直接交差分化して誘導された運動神経細胞になることを特徴とする組成物。）

【0408】

具現例２：Ｇｓｔａ４＋従来因子１個
具現例１において、
前記の組成物は、
Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）及びＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される一つの蛋白質；または前記蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする組成物。

【0409】

具現例３：Ｇｓｔａ４＋従来因子２個
具現例１において、
前記の組成物は、
Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）及びＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される二つの蛋白質；または前記蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする組成物。

【0410】

具現例４：Ｇｓｔａ４＋従来因子３個
具現例１において、
前記の組成物は、
Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２）及びＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される三つの蛋白質；または前記蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする組成物。

【0411】

具現例５：Ｇｓｔａ４＋従来因子４個
具現例１において、
前記の組成物は、
Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２）及びＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される四つの蛋白質；または前記蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする組成物。

【0412】

具現例６：Ｇｓｔａ４＋従来因子５個
具現例１において、
前記の組成物は、
Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、 Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２）及びＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される五つの蛋白質；または前記蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする組成物。

【0413】

具現例７：Ｇｓｔａ４＋従来因子６個
具現例１において、
前記の組成物は、
Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）及びＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される六つの蛋白質；または前記蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする組成物。

【0414】

具現例８：Ｇｓｔａ４＋従来因子７個
具現例１において、
前記の組成物は、
Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １），Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２）及びＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される七つの蛋白質；または前記蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする組成物。

【0415】

具現例９：Ｇｓｔａ４＋従来因子８個
具現例１において、
前記の組成物は、
Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １），Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２），Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ），Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９），ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １），Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２）及びＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される七つの蛋白質；または前記蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする組成物。

【0416】

具現例１０：組成物の組み合わせ
具現例２において、
前記の組成物は、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；又はＡｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことを特徴とする組成物。

【0417】

具現例１１：組成物の組み合わせ
具現例３において、
前記の組成物は、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことを特徴とする組成物。

【0418】

具現例１２：組成物の組み合わせ
具現例４において、
前記の組成物は、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質またはこれをコーディングする核酸
を含むことを特徴とする組成物。

【0419】

具現例１３：組成物の組み合わせ
具現例５において、
前記の組成物は、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｈｂ９蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことを特徴とする組成物。

【0420】

具現例１４：組成物の組み合わせ
具現例６において、
前記の組成物は、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことを特徴とする組成物。

【0421】

具現例１５：組成物の組み合わせ
具現例７があって、
前記の組成物は、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｂｒｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ａｓｃｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｎｇｎ２蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｉｓｌ１蛋白質又はこれをコーディングする核酸；及び
Ｌｈｘ３蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含むことを特徴とする組成物。

【0422】

具現例１６：Ｇｓｔａ４配列
具現例１において、
前記Ｇｓｔａ４蛋白質は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列またはこれと同一性が７０％以上の配列であることを特徴とする組成物。

【0423】

具現例１７：Ｈｂ９配列
具現例２において、
前記Ｈｂ９蛋白質は、配列番号１４で表示されるアミノ酸配列またはこれと同一性が７０％以上の配列であることを特徴とする組成物。

【0424】

具現例１８：Ｌｈｘ３配列
具現例２において、
前記Ｌｈｘ３蛋白質は、配列番号１５で表示されるアミノ酸配列またはこれと同一性が７０％以上の配列であることを特徴とする組成物。

【0425】

具現例１９：配列限定
具現例１１において、
前記Ｇｓｔａ４蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはこれと同一性が７０％以上の配列であり、
前記Ｈｂ９蛋白質は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列またはこれと同一性が７０％以上の配列であり、
前記Ｌｈｘ３蛋白質は、配列番号１５で表示されるアミノ酸配列またはこれと同一性が７０％以上の配列であることを特徴とする組成物。

【0426】

具現例２０：ベクトル１
体細胞から運動性神経細胞への直接交差分化のためのベクトルとして、前記ベクトルは、
ｉ）具現例１又は１６；及び
ｉｉ）プロモーター；
を含み、
前記ｉ）は、ｉｉ）に作動可能に接続されており、
前記運動性神経細胞は、前記体細胞から誘導された（分化した）運動性神経細胞であることを特徴とするベクトル。

【0427】

具現例２１：ベクトル１の追加構成
具現例２０において、
前記ベクトルは具現例２ないし９の中から選択される一つ；
をさらに含むことができることを特徴とするベクトル。

【0428】

具現例２２：ベクトル２
体細胞から運動性神経細胞への直接交差分化のためのベクトルとして、前記ベクトルは、
ｉ）具現例３又は具現例１１；及び
ｉｉ）プロモーター；
を含み、
前記ｉ）はｉｉ）に作動可能に接続されており、
前記運動性神経細胞は、前記体細胞から誘導された（分化した）運動性神経細胞であることを特徴とするベクトル。

【0429】

具現例２３：ベクトル３
体細胞から運動性神経細胞への直接交差分化のためのベクトルとして、前記ベクトルは二つ以上のベクトルを含むことができ、
この時、二つ以上のベクトルは、少なくとも第一ベクトル及び第二ベクトルを含み、
前記第１ベクトルは、
ｉ）具現例１又は１６；及び
ｉｉ）プロモーター；
を含み、
前記ｉ）はｉｉ）に作動可能に連結されており、
前記第２ベクトルは、
ｉｉｉ）前記ベクトルは、具現例２ないし９の中から選択される一つ以上；及び
ｉｖ）プロモーター；
を含み、
前記ｉｉｉ）は、ｉｖ）に作動可能に接続されており、
この時、前記ｉｉｉ）前記ベクトルは具現例２ないし９の中から選択される一つ以上は個別的なベクトルに含まれることができ、
前記運動性神経細胞は、前記体細胞から誘導された（分化した）運動性神経細胞であることを特徴とするベクトル。

【0430】

具現例２４：ベクトル追加構成
具現例２１ないし具現例２３のいずれか一つの具現例において、
前記ベクトルは選択的に前記ｉｉ）プロモーター以外のプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、終結者（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、内部リボソーム流入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ、ＩＲＥＳ）、蛍光蛋白質遺伝子、グルタチオン－Ｓ－トランスパーラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスパーラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダジェ、ルシファーラーゼ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、２Ａ自己切断ペプチド（２Ａ ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、抗生物質耐性遺伝子のうち、選択される１つ以上をさらに含むことができることを特徴とするベクトル。

【0431】

具現例２５：ベクトル追加構成限定
具現例２４において、
前記２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａの中から選択される一つ以上であることを特徴とするベクトル。

【0432】

具現例２６：ベクトル追加構成限定
具現例２１ないし具現例２３のいずれか一つの具現例において、
前記ベクトルは、ドナー（ｄｏｎｏｒ）、ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）転移因子、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）転移因子の中から選択される一つ以上をさらに含むことができることを特徴とするベクトル。

【0433】

具現例２７：ベクトル種類限定
具現例２１ないし具現例２３のいずれか一つの具現例において、
前記ベクトルはウイルスベクトルで、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ベクシニアウイルス、フォックスウイルス、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｏｓｉｓ）， ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）， ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ），ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスシンプレクスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、エピゾマル（ｅｐｉｓｏｍａｌ）及び単純包診ウイルスの一つ以上であることを特徴とするベクトル。

【0434】

具現例２８：分化方法（１）
体細胞から運動性神経細胞への直接交差分化のための方法で、
前記直接交差分化は、前記体細胞が直接交差分化して誘導された（分化した）運動性神経細胞になるものであり、
前記の方法は、
ａ）具現例１又は具現例１６又は具現例２０を体細胞に導入する；
を含む方法。

【0435】

具現例２９：分化方法（１）
具現例２８において、
前記体細胞に
ｂ）具現例２ないし９、２１の中から選択されるいずれかを導入する；
をさらに含むことができることを特徴とする方法。

【0436】

具現例３０：分化方法（１）
具現例２８又は具現例２９において、
前記導入し；後
体細胞を神経分化のための培地を利用して培養する；
をさらに含むことができることを特徴とする方法。

【0437】

具現例３１：分化方法（２）
体細胞から運動性神経細胞への直接交差分化のための方法で、
前記直接交差分化は、前記体細胞が直接交差分化して誘導された（分化した）運動性神経細胞となるものであり、
前記の方法は、
ａ）培養培地に具現例１又は具現例１６又は具現例２０を混合し；
ｂ）前記混合物を利用して体細胞を培養し；
を含む方法。

【0438】

具現例３２：分化方法（３）
体細胞から運動性神経細胞への直接交差分化のための方法で、
前記直接交差分化は、前記体細胞が直接交差分化して誘導された（分化した）運動性神経細胞になるものであり、
前記の方法は、
具現例１１または具現例１９または具現例２２；を体細胞に導入し；
または
具現例１６、具現例１７及び具現例１８を体細胞に導入し；
を含む方法。

【0439】

具現例３３：導入手段
具現例２８ないし具現例３２の中から選択されるいずれかの具現例において、
前記の導入は、電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、自己注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、一時的な細胞圧縮またはスクイージング、陽イオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ、脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染、ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染のうち、選択されるどれか一つ以上で行われることを特徴とする方法。

【0440】

具現例３４：体細胞種類
具現例２８ないし具現例３２の中から選択されるいずれかの具現例において、
前記の体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、筋肉細胞、神経細胞、毛髪細胞、毛根細胞、毛包細胞、口腔上皮細胞、尿から抽出した体細胞、胃粘膜細胞，杯状細胞、ガストリン細胞（ｇａｓｔｒｉｎ ｃｅｌｌ／Ｇｃｅｌｌ）、Ｂ細胞、主皮細胞、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、血液細胞、希少突起芽前駆橋の中から選択されることを特徴とする。

【0441】

具現例３５：分化期間
具現例２８ないし具現例３２の中から選択されるいずれかの具現例において、
前記の導入により体細胞が１週間から１０週間以内に運動性神経細胞に分化することを特徴とする方法。

【0442】

具現例３６：分化方法特徴
具現例２８ないし具現例３２の中から選択されるいずれかの具現例において、
前記の導入は、前記の体細胞が誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）を生成せず、誘導された運動性神経細胞になることを特徴とする方法。

【0443】

具現例３７：分化方法の収得物 － モーターニューロン（分化因子過剰発現）
直接交差分化因子が過剰発現するモーターニューロンで、
この時、前記直接交差分化因子はＧｓｔａ４，、Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １），Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２），Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ），Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９），ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １），Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３），Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）、ＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）の中から選択される１つ以上であり、
前記モーターニューロンは体細胞から直接交差分化したことを特徴とするモーターニューロン。

【0444】

具現例３８：分化方法の修得物 － モーターニューロン（神経細胞マーカー過剰発現）

【0445】

神経細胞マーカーが過剰発現するモーターニューロンで、
この時、前記神経細胞マーカーは、ＮＥＵＮ、ＣｈＡＴ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｔｕｊ１、ＩｓＬ１，ＰＡＸ６，Ｏｌｉｇ２，Ｎｋｘ２．２，ＳＭＩ－３２の中から選択される１つ以上であり、
前記モーターニューロンは体細胞から直接交差分化したことを特徴とするモーターニューロン。

【0446】

具現例３９：薬学的組成物（１）
具現例１又は１６又は２０を含む
神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物。

【0447】

具現例４０：薬学的組成物（２）
具現例１又は１６又は２０；及び
具現例２ないし９、２１の中から選択される一つ；
を含む神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物。

【0448】

具現例４１：薬学的組成物（３）
具現例３７又は３８を含む
神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物。

【0449】

具現例４２：適応症
具現例３９ないし具現例４１の中から選択されるいずれかの具現例において、
前記神経系疾患は脊髄損傷、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、ルー・ゲーリック病、毛細血管拡張性運動失調症（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、筋萎縮性側索硬化症、運動神経損傷、外傷による末梢神経損傷、虚血性脳損傷、新生児低酸素性虚血性脳損傷、脳性麻痺、末梢麻痺、中枢麻痺、四肢麻痺、両麻痺、てんかん、神経細胞発達障害、神経痛、難治性てんかん、アルツハイマー病、先天性代謝性神経系疾患および外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、運動性神経細胞損傷またはこれによって誘発される疾患のうち、選択される一つ以上であることを特徴とする薬学的組成物。

【0450】

具現例４２：追加構成
具現例３９ないし具現例４１の中から選択されるいずれかの具現例において、
前記の薬学的組成物は許容可能な担体、賦形剤、希釈剤、保存剤の中から選択される一つ以上をさらに含むことができることを特徴とする薬学的組成物。

【0451】

具現例４３：治療方法（１）
神経系疾患を治療する方法で、前記の方法は、
体細胞に具現例３９又は４０；を対象に投与し；
を含み、
この時、前記体細胞は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）を生成せず、誘導された運動性神経細胞になることを特徴とする方法。

【0452】

具現例４４：治療方法（２）
神経系疾患を治療する方法で、前記の方法は、
体細胞に具現例３９又は４０；が導入された体細胞を対象に投与し；
この時、前記体細胞は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）を生成せず、誘導された運動性神経細胞になることを特徴とする方法。

【0453】

具現例４５：治療方法（３）
神経系疾患を治療する方法で、前記の方法は、
具現例４１；を対象に投与し；
を含み、

【0454】

この時、前記対象内体細胞は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）を生成せず、誘導された運動性神経細胞になることを特徴とする方法。

【0455】

具現例４６：対象限定（１）
具現例４３、具現例４４、具現例４５の中から選択されるいずれかの具現例において、
前記対象は哺乳類であることを特徴とする方法。

【0456】

具現例４７：対象限定（２）
具現例４６において、
前記哺乳類はヒト、マウス、イヌ、ネコの中から選ばれる一つであることを特徴とする方法。

【0457】

具現例４８：投与限定
具現例４３、具現例４４、具現例４５の中から選択されるいずれかの具現例において、
前記投与時の部位は筋肉、皮内、皮下、静脈、腹腔、動脈、粘膜、脊髄、骨髄、脊髄腔内、経皮のうち選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする方法。

【0458】

具現例４９：投与用量

【0459】

具現例４３、具現例４４、具現例４５の中から選択されるいずれかの具現例において、
前記投与は１回に１ｕＬ／ｋｇないし２０ｕＬ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする方法。

【0460】

具現例５０：適応症

【0461】

具現例４３、具現例４４、具現例４５の中から選択されるいずれかの具現例において、

【0462】

前記神経系疾患は脊髄損傷、パーキンソン病、脳卒中、筋萎縮性脊髄側索硬化症、運動神経損傷、外傷による末梢神経損傷、虚血性脳損傷、新生児低酸素性虚血性脳損傷、脳性麻痺、てんかん、難治性てんかん、アルツハイマー病、先天性代謝性神経系疾患、外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、運動性神経細胞損傷またはこれに誘発される疾患のうち、選択される一つ以上であることを特徴とする方法。

【0463】

以下、実施例を通じて本出願をさらに詳しく説明しようと思う。

【0464】

これらの実施例は、専ら本出願をより具体的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、本出願の属する技術分野において通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【0465】

実験材料
● ベクトル設計

【0466】

下記で実施するベクトルはＡＡＶベクトル（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＩＮＣ．、ＶＰＫ－４０２）を使用し、分化因子導入のためのＡＡＶベクトルの模式図は図１に図示した。

【0467】

図１（ａ）は配列番号３６；図１（ｂ）は配列番号３；図１（ｃ）は配列番号４；図１（ｄ）は配列番号５；図１（ｅ）は配列番号２９；に該当する。

【0468】

● ＡＡＶ製作

【0469】

ＡＡＶを製作するのに２９３Ｔ ｃｅｌｌｉｎｅを使用した。 ２９３Ｔ細胞はＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ， Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ， ＃１２４３０１１２）の培地に１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ， ＃２６１４００７９）、１％ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ， ＃１５２４００９６）を入れ、３７℃５％ ＣＯ２状態で培養した。 ２９３Ｔ細胞にも１のＡＡＶベクトルとｐＨｅｌｐｅｒ、ｐＲａｐＣａｐをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して４８時間培養した。 その後、ウイルス抽出過程を経て分化因子を含むウイルスを抽出した。

【0470】

● 細胞培養及び細胞内ＡＡＶ導入

【0471】

Ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ （Ｓｉｇｍａ， １０６－０５Ａ）はｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ， １１６－５００）のバッジに１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ，＃２６１４００７９）、１％ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ，＃１５２４００９６）を入れ、３７℃５％ＣＯ_２状態で培養した。

【0472】

Ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓを２４ｗｅｌｌに０．０２５ｘ１０^６個で細胞をｓｅｅｄｉｎｇして準備した。細胞ｓｅｅｄｉｎｇ２４時間後、分化因子を処理した。分化因子処理２４時間後、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍに交換した。また２４時間後、ｎｅｕｒａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ に置き換えた。２日に１回ずつｍｅｄｉｕｍを交替した。１４－１７日目になる日、細胞をＦｉｘａｔｉｏｎを通じて免疫蛍光染色法を行った。

【0473】

Ｍｏｕｓｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ（Ａｂｍ， Ｔ０２８９）はＰｒｉｇｒｏｗ ＩＩＩ ｍｅｄｉｕｍ（Ａｂｍ， ＴＭ００３）の培地に１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ， ＃２６１４００７９）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）を入れ、３７℃５％ ＣＯ_２状態で培養した。

【0474】

Ｍｏｕｓｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅを２４ｗｅｌｌに０．０２５ｘ１０^６個で細胞をｓｅｅｄｉｎｇして準備した。細胞ｓｅｅｄｉｎｇ２４時間後、分化因子を処理した。分化因子処理２４時間後，Ｐｒｉｇｒｏｗ ＩＩＩ ｍｅｄｉｕｍに置き換えた。２４時間後、Ｎｅｕｒａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍに交替した。２日に１回ずつｍｅｄｉｕｍを交替した。１４－１７日目になる日、細胞をＦｉｘａｔｉｏｎを通じて免疫蛍光染色法を行った。

【0475】

Ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓはＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）の培地に１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ，＃２６１４００７９）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）を入れて３７℃５％ ＣＯ_２状態で培養した。

【0476】

Ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓを２４ｗｅｌｌに０．０２５ｘ１０^６Ｏ個で細胞をｓｅｅｄｉｎｇして準備した。細胞ｓｅｅｄｉｎｇ２４時間後、分化因子を処理した。分化因子処理２４時間後，ＤＭＥＭ培地に置き換えた。２４時間後、Ｎｅｕｒａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍに交替した。２日に１回ずつｍｅｄｉｕｍを交替した。１４－１７日目になる日、細胞をＦｉｘａｔｉｏｎを通じて免疫蛍光染色法を行った。

【0477】

ＡＡＶをＳＣＩモデルに導入する際には、マウス脊髄損傷モデルの損傷部位（Ｌｕｍｂａｒ ５）に方位固定装置（Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ、 Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ 社）を用いて微細走査した後、６０日間分析した。

【0478】

● 免疫蛍光カラーリング（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）

【0479】

.細胞Ｆｉｘａｔｉｏｎのために細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で５分ずつ２回ｗａｓｈｉｎｇした。次に４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を入れ、常温で１０分間インキュベーションした。

【0480】

ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎのためにＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを入れて常温で１０分間インキュベーションした。 細胞をＰＢＳで５分ずつ３回ｗａｓｈｉｎｇした。

【0481】

Ｂｌｏｃｋｉｎｇとｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇのために１％ＢＳＡ＋ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を入れて常温で３０分間インキュベーションした。１次アンチボディはＣｈＡＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１０００）、Ｍａｐ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２００）、ＮｅｕＮ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：１００）を使用した。１次アンチボディを１％ＢＳＡ＋ＰＢＳＴに入れて４℃ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔした。ＰＢＳで５分ずつ３回ｗａｓｈｉｎｇした後、２次アンチボディＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８／５９４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１：１０００）を１％ＢＳＡ＋ＰＢＳＴに入れて常温に暗いところで１時間インキュベーションする。ＰＢＳで５分ずつ３回ｗａｓｈｉｎｇ後、ＤＡＰＩ ｓｔａｉｎｉｎｇを行った。

【0482】

● ＲＮＡ抽出（ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）及びｃＤＮＡ合成

【0483】

細胞２ｘ１０^６をｔｒｙｐｓｉｎ（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ）で取り除いた後、１３，０００ｒｐｍで１０秒ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎした。Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ除去後、ｅａｓｙ－ＢｌｕｅＴＭ（ｉＮｔＲＯＮ）１ｍｌ入れ、１０秒間ポートｅｘｉｎｇした後、２００μｌ Ｃｈｏｌｏｒｏｆｏｒｍ添加後、ポートｅｘｉｎｇした。１３，０００ｒｐｍ １０分間ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ後、４００μｌ ｕｐｐｅｒ ｆｌｕｉｄを新しい１．５ｍｌチューブに移した。４００μｌ ２－ｐｒｏｐａｎｏｌ （Ｓｉｇｍａ）入れ、２－３回ｉｎｖｅｒｔｉｎｇした後、ＲＴに１０分間置いておいた。１３，０００ｒｐｍ ５分間ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ後、ｕｐｐｅｒ ｌａｙｅｒを除去した。１ｍｌ ７５％ ＥｔＯＨ （Ｓｉｇｍａ）入れて、２－３ 回ｉｎｖｅｒｔｉｎｇした。１０，０００ｒｐｍ ４℃ ５分間ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ後、ｕｐｐｅｒ ｌａｙｅｒを除去した。ＲＴで５分間ｄｒｙした後、２０μｌ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ入れてＲＮＡ溶かした。最終的に得られたＲＮＡは－７０℃に保管した。

【0484】

【0485】

● Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）

【0486】

ｑＰＣＲ（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ， ＴＯＹＯＢＯ）を利用して行った。ｑＲＴ－ＰＣＲでヒト線維芽細胞から運動性神経細胞への分化を誘導した細胞は、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２及びＨｂ９の発現を確認した。マウス由来の 線維芽細胞から運動性神経細胞への分化を誘導した細胞は、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２及びＨｂ９の発現を確認した。

【0487】

この時使用されたプライマーは、下表のとおりである。

【0488】

【0489】

実施例１：細胞内でＧｓｔａ４の運動性神経細胞への直接交差分化確認
マウス由来の線維芽細胞にＧＳＴＡ４をＡＡＶを用いて導入した。 Ｇｓｔａ４による体細胞からの神経細胞の分化を免疫染色蛍光法とｑＰＣＲで確認した（図２）。 免疫蛍光染色法により、運動性神経細胞マーカーであるＣｈＡＴと成熟した神経細胞のマーカーであるＭａｐ２の発現を確認した。 ｑＰＣＲにより、神経細胞の分化程度をシナプス形成マーカーであるＳｙｎａｐｓｉｎ、成熟した神経細胞マーカーであるＭａｐ２、成熟した神経細胞マーカーであるＨｂ９のそれぞれの発現変化を確認した。

【0490】

Ｇｓｔａ４単独処理した時、ｓｙｎａｐｓｉｎの発現程度が対照群（ｃｏｎｔｒｏｌで表示）に比べて約４倍の発現増加を確認し、Ｍａｐ２は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌで表示）に比べて約５倍の発現増加を確認し、Ｈｂ９は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌで表示）に比べて約２倍の発現増加を確認した。 このような実験結果を通じて、Ｇｓｔａ４単独でも体細胞から神経細胞の効果的な転換が行われることができることを確認した。

【0491】

実施例２：細胞内で告知された分化因子の運動性神経細胞への直接交差分化確認

【0492】

公知の因子の直接交差分化効果を確認するために、ヒト由来の線維芽細胞に従来の分化因子を導入し、運動性神経細胞に直接交差分化程度を確認した（図３）。

【0493】

この時、従来の分化因子は次のように導入した：

【0494】

Ａｓｃｌ１単独投与；Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１ｌ組み合わせ投与（ＡＢＭで表示）；Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３の組み合わせ投与（ＨＩＬで表示）；ＡＢＭ及びＨＩＬの組み合わせ投与；ＡＢＭ、ＨＩＬ、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の組み合わせ（ＨＮＤで表示）。

【0495】

実施例１のＧｓｔａ４単独処理の際、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９の発現増加は対照群に比べてそれぞれ約４、５、２倍程度であることを確認した。 これに対し、Ａｓｃｌ１単独投与；時のＳｙｎａｐｓｉｎ，Ｍａｐ２，Ｈｂ９の発現増加は約１～１．５倍に過ぎなかった。 これにより、公示された因子Ａｓｃｌ１単独投与に比べて、本出願の新規な分化因子であるＧｓｔａ４単独処理時に運動性神経細胞に直接交差分化効率が高いことを示唆する。

【0496】

また、公知の因子三つが組み合わされたＡＢＭ投与；時のＳｙｎａｐｓｉｎ，Ｍａｐ２，Ｈｂ９の発現増加はそれぞれ約２，４，１倍に過ぎなかった。 そして、公示された因子３つが組み合わされたＨＩＬ投与；時、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９の発現増加はそれぞれ約２、１．５、１．５倍に過ぎなかった。 これにより、公示された因子三つの組み合わせ投与をしても、本出願の新規な分化因子であるＧｓｔａ４単独処理に比べて運動性神経細胞に直接交差分化効率が低かったり類似していることを確認することができた。

【0497】

一方、公知の因子六つが組み合わさったＡＢＭ＋ＨＩＬ投与；公知の因子８個が組み合わされたＡＢＭ＋ＨＮＤ投与；時に公知の因子１個投与または３個の組み合わせ投与時に比べては、神経細胞マーカーの発現が増加する様相を確認することができた。 すなわち、六つ以上の因子を組み合わせる場合には有意義な効果を示した。

【0498】

実施例３：Ｇｓｔａ４の組み合わせ使用による直接交差分化確認

【0499】

実施例２で公示された因子だけの神経細胞転換効果を確認した後、本発明のＧｓｔａ４をこれらと共に組み合わせる場合の効果を確認しようとした。

【0500】

このため、マウス由来の線維芽細胞にＡＡＶをＧｓｔａ４及び従来の分化因子を様々な組み合わせで導入し、分化程度をｑＰＣＲで神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ，Ｍａｐ２，Ｈｂ９）の発現を確認した（図４）。

【0501】

その結果、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子を組み合わせた群の神経細胞マーカーの発現が対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌと表記）に比べて約５－１０倍増加することを確認した。実施例２で確認した従来の因子だけを使用した場合と比較すると、本発明のＧｓｔａ４を組み合わせた場合に、各同一マーカーの発現結果（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）がさらに高く現れることが分かった。

【0502】

また、免疫蛍光染色法により、運動性神経細胞マーカーであるＣｈＡＴと成熟した神経細胞のマーカーであるＭａｐ２の発現を確認した（図５、６）。免疫蛍光染色法により、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子を組み合わせた群でＣｈＡＴとＭａｐ２の発現が現れることを確認した。

【0503】

すなわち、図４ないし６を通じて、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子を一緒に使用しても体細胞が運動性神経細胞に効果的に直接交差分化することが分かった。

【0504】

実施例４：細胞内でＧｓｔａ４の有無による従来の分化因子の運動性神経細胞への直接交差分化確認

【0505】

実施例２及び３の結果を確認した後、本発明のＧｓｔａ４を公知の分化因子と組み合わせる場合の効果をより具体的に確認しようとした。

【0506】

従来の分化因子１個ｖｓ従来の分化因子１個＋Ｇｓｔａ４組み合わせの比較
マウス由来の線維芽細胞にＡＡＶでＧｓｔａ４の有無による従来の分化因子を導入し、分化の程度をｑＰＣＲで神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ，Ｍａｐ２）の発現を確認した（図７）。

【0507】

従来の分化因子であるＡｓｃｌ１，Ｂｒｎ２をそれぞれ単独で投与したときより，Ｇｓｔａ４とＡｓｃｌ１の組み合わせ投与（Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１と表示）； Ｇｓｔａ４とＢｒｎ２の組み合わせ投与（Ｇｓｔａ４＋Ｂｒｎ２と表示）の際に神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ，Ｍａｐ２）の発現が約２～５倍増加することを確認した。

【0508】

従来の分化因子２個ｖｓ従来の分化因子２個＋Ｇｓｔａ４組み合わせの比較

【0509】

マウス由来の線維芽細胞にＡＡＶでＧｓｔａ４の有無による従来の分化因子を導入し、分化程度を免疫染色蛍光法で神経細胞マーカー（ＣｈａＴ、Ｍａｐ２）の発現を確認した（図８）。

【0510】

従来分化因子であるＭｎｘ１，Ｌｈｘ３を組み合わせて投与（Ｍｎｘ１＋Ｌｈｘ３と表示）したときより、Ｇｓｔａ４とＭｎｘ１，Ｌｈｘ３を組み合わせて投与（Ｇｓｔａ４＋Ｍｎｘ１＋Ｌｈｘ３と表示）；したときに神経細胞マーカーが免疫染色された細胞の数が約４０倍以上増加したことを確認した。

【0511】

また、ｑＰＣＲにより神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ，Ｍａｐ２）の発現を確認した（図９）。

【0512】

従来分化因子であるＭｎｘ１，Ｌｈｘ３を組み合わせて投与（Ｍｎｘ１＋Ｌｈｘ３と表示）したときより、Ｇｓｔａ４とＭｎｘ１，Ｌｈｘ３を組み合わせて投与（Ｇｓｔａ４＋Ｍｎｘ１＋Ｌｈｘ３と表示）；したときに神経細胞マーカーの発現が約２～４倍増加することを確認した。 また、Ｇｓｔａ４単独投与（Ｇｓｔａ４と表示）したときは、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌと表示）に比べて神経細胞マーカーの発現が約２～４倍増加した。

【0513】

従来の分化因子３個ｖｓ従来の分化因子３個＋Ｇｓｔａ４組み合わせの比較
マウス由来の線維芽細胞にＡＡＶでＧｓｔａ４の有無による従来の分化因子を導入し、分化の程度をｑＰＣＲで神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ，Ｍａｐ２）の発現を確認した（図１０）。

【0514】

従来の分化因子であるＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌを組み合わせて投与（Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｍｙｔ１ｌと表示）したときより、Ｇｓｔａ４とＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌの組み合わせ投与（Ｇｓｔａ４＋Ａｓｃｌ１＋Ｂｒｎ２＋Ｍｙｔ１ｌと表示）；したときに神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ， Ｍａｐ２）の発現が約２～４倍増加することが確認された。

【0515】

従来の噴火因子８個ｖｓ従来の噴火因子８個＋Ｇｓｔａ４組み合わせの比較
ヒト由来の線維芽細胞にＡＡＶでＧｓｔａ４の有無による従来の分化因子を導入し、分化の程度をｑＰＣＲで神経細胞マーカー（Ｓｙｎａｐｓｉｎ、Ｍａｐ２、Ｈｂ９）の発現を確認した（図１１）。

【0516】

従来の分化因子であるＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２、Ｎｇｎ２、ＮｅｕｒｏＤ１を組み合わせて投与（ＡＢＭ＋ＨＩＬ＋Ｎｇｎ２＋ＮｅｕｒｏＤ１（ＨＮＤ）と表示）したときより、Ｇｓｔａ４とＡｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２，ＮｅｕｒｏＤ１を組み合わせて投与（ＡＢＭ＋ＨＮＤ＋Ｇｓｔａ４と表示）神経細胞マーカーの発現が約２～５倍増加することを確認した。また、Ｇｓｔａ４とＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２、ＮｅｕｒｏＤ１を組み合わせて投与した際に対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌと表示）に比べて神経細胞マーカーの発現が約１０～１２倍増加することが分かった。

【0517】

また、ヒト由来の線維芽細胞にＡＡＶでＧｓｔａ４の有無による従来の分化因子を導入し、分化程度を免疫蛍光染色法で神経細胞マーカーの発現（ｖＣｈａＴ、Ｍａｐ２）で確認した（図１３）。

【0518】

従来の分化因子であるＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２、ＮｅｕｒｏＤ１を組み合わせて導入（既知のｆａｃｔｏｒｓと表示）したときは、約１５．５１％の細胞が成熟した神経細胞に分化した。これに対し、前記の既知のｆａｃｔｏｒｓ及びＧｓｔａ４を組み合わせて導入（既知のｆａｃｔｏｒｓ＋Ｇｓｔａ４と表示）した時、約４８．７２％の細胞が成熟した神経細胞に分化することが確認できた。

【0519】

従来の噴火因子４個ｖｓ従来の噴火因子７個ｖｓ従来の噴火因子７個＋Ｇｓｔａ４組み合わせの比較
マウスの星状細胞にＡＡＶでＧｓｔａ４の有無による従来の分化因子を導入し、分化程度を免疫蛍光染色法で神経細胞マーカーの発現（ｖＣｈａＴ、Ｍａｐ２）で確認した（図１２）。

【0520】

従来の分化因子であるＨｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３及びＡｓｃｌ１を組み合わせて投与した時は、神経細胞マーカーが約２０％発現した。 従来の分化因子であるＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２を組み合わせて投与（既存知られているｆａｃｔｏｒｓと表示）した時は神経細胞マーカーが約５０％発現したが、前記既存知られているｆａｃｔｏｒｓとＧｓｔａ４を組み合わせて投与（既存知られているｆａｃｔｏｒｓ＋Ｇｓｔａ４と表示）した時は神経細胞マーカーが約７０％発現された。すなわち、従来の分化因子７個のみ投与したときより、Ｇｓｔａ４と従来の分化因子７個を組み合わせて投与したときにＣｈａＴ及びＭａｐ２の発現が増加したことが分かった。

【0521】

以上の結果を通じて、本出願のＧｓｔａ４は線維芽細胞、性状細胞などの体細胞を直接交差分化して誘導されたモーターニューロンに転換する機能を持つ分化因子であることが分かった。また、Ｇｓｔａ４は従来の直接交差分化因子に比べて分化効率が高く、さらに従来の分化因子とＧｓｔａ４を共に使用する時、分化効率が低い従来の分化因子の分化効率を高めることが分かった。

【0522】

実施例５：生体内で運動性神経細胞への直接交差分化および治療効果の確認
Ｇｓｔａ４の神経細胞分化効能を細胞内で確認した実施例１ないし４の結果を基に、生体内で運動性神経細胞への直接交差分化および治療効果を確認するために図１４の模式図を基に実験を行った。

【0523】

下半身麻痺疾患の動物モデルであるＳＣＩマウスモデルで脊椎神経の損傷部位が改善または治療される効果を形態学的、生理学的、行動学的分析などを通じて確認した。

【0524】

１）ＳＣＩ（Ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ）マウス モデル製作
脊髄損傷による下半身麻痺モデルであるＳＣＩマウスモデル製作のために、ＩＣＲマウスを麻酔し、脊髄のＬｕｍｂａｒ ５部位（以下、Ｌ５と呼ぶ；脊椎Ｔ１３－Ｌ１に該当）を損傷させた。 損傷させた後，最終５週間後の実験に使用した。

【0525】

２）ＳＣＩマウスモデルにＡＡＶ投与

【0526】

ＳＣＩマウスモデルのＬ５部位にマイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，７０５）を利用してＡＡＶ２ｕｌを微細注射した。

【0527】

実施例５－１：脊髄損傷部位の形態学的変化を確認

【0528】

ＳＣＩマウスモデルに従来の分化因子８個（Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２，ＮｅｕｒｏＤ１）を導入した群（Ｃｏｎｔｒｏｌと呼ぶ）；従来の分化因子８個及びＧｓｔａ４を併せて導入した群（＋Ｇｓｔａ４という）；分化因子導入していないＡＡＶを導入した群（Ｍｏｃｋと称する）；それぞれの脊髄損傷部位（Ｌ５）の形態学的変化を観察するためにクリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ， Ｓｉｇｍａ）染色をした（図１５）。

【0529】

図１５を見てみると、直接交差分化を誘導する分化因子のないＭｏｃｋ群は多くの炎症細胞が集まって濃くスカが形成された（赤い点線）。 従来の分化因子８個を導入したＣｏｎｔｒｏｌ群は、Ｍｏｃｋ群に比べて細胞が集まっているスカが減少した。一方、従来の分化因子８個及びＧＳＴＡ４を一緒に導入した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて炎症細胞によるスカ（ｓｃａｒ）が緩和されることを確認した。

【0530】

実施例５－２：運動性神経細胞マーカーの発現変化を確認

【0531】

ＳＣＩマウスモデルに従来の分化因子８個（Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２，ＮｅｕｒｏＤ１）を導入した群（Ｃｏｎｔｒｏｌと呼ぶ）；従来の分化因子８個及びＧｓｔａ４を併せて導入した群（＋Ｇｓｔａ４という）；分化因子導入していないＡＡＶを導入した群（Ｍｏｃｋと称する）；それぞれの脊髄損傷部位（Ｌ５）において、運動性神経細胞マーカーの発現変化を観察するために免疫蛍光染色法を行った（図１６、１７及び１８）。

【0532】

図１６、１７及び１８を見てみると、Ｍｏｃｋ群に比べてＣｏｎｔｒｏｌ群でＣｈａＴとＭａｐ２の発現が約２倍増加した。 一方、従来の分化因子８個及びＧＳＴＡ４を一緒に導入した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べてＣｈａＴとＭａｐ２の発現が約５倍以上増加した。 これはＧｓｔａ４によって、星状細胞から運動性神経細胞への直接交差分化がＣｏｎｔｒｏｌ群に比べて分化効率が高いことを意味する。

【0533】

実施例５－３：電気生理学的分析による下半身麻痺の治療効果の確認

【0534】

脊髄部位に損傷を与えていない正常群（Ｓｈａｍという）； ＳＣＩマウスモデルに従来の分化因子８個（Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２、ＮｅｕｒｏＤ１）を導入したＡＡＶを投与した群（Ｃｏｎｔｒｏｌと呼ぶ）； 従来の分化因子８個及びＧｓｔａ４を併せて導入したＡＡＶを投与した群（＋Ｇｓｔａ４と称する）； ＳＣＩマウスモデルにＡＡＶを導入した群（Ｍｏｃｋと呼ぶ）；それぞれの脊髄損傷部位（Ｌ５）において電気生理学的変化を確認した（図１９）。

【0535】

図１９（ａ）は、Ｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐを遂行した神経細胞の写真である。

【0536】

図１９（ｂ）の活動電位測定結果を見ると、Ｓｈａｍ群で活動電位は２５Ｈｚであるが、ｍｏｃｋ群で２Ｈｚと１／１０以上減少した。 反面、従来の分化因子８個を導入したＣｏｎｔｒｏｌ群は６Ｈｚで活動電位が増加し、従来の分化因子８個およびＧｓｔａ４を共に導入した群では１３ＨｚでＣｏｎｔｒｏｌ群に比べて２倍以上増加した。

【0537】

活動電位の増加は神経細胞が信号を受けた時、信号を伝達できる能力を意味する。 活動電位がないと信号伝達ができない。 また、活動電位は神経細胞の最も代表的な特徴です。 活動電位が発生して増加するということは、神経細胞に分化がうまくいったことを意味する。 したがって、分化因子８個及びＧｓｔａ４を一緒に導入した群が神経細胞に分化が最もよく起きることにより、その組み合わせが神経細胞分化効率が良いことを示す。

【0538】

図１９（ｃ）のシナプス前神経細胞からの信号を測定した結果を見ると、Ｍｏｃｋ群では１Ｈｚ、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では６Ｈｚ、＋Ｇｓｔａ４群では４７Ｈｚであった。

【0539】

シナプス前の神経細胞から来る信号の増加は、神経細胞間の信号伝達が増加することを示す。ＳＣＩによって切れた神経細胞の連結が新しい運動性神経細胞の再生につながったことを示す。
実施例５－４：行動学的分析による直接交差分化確認

【0540】

脊髄部位に損傷を与えていない群（Ｓｈａｍと称する）；ＳＣＩマウスモデルに従来の分化因子８個（Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２，ＮｅｕｒｏＤ１）を導入した群（－Ｇｓｔａ４と称する）；従来の分化因子８個及びＧｓｔａ４を併せて導入した群（＋Ｇｓｔａ４という）；ＳＣＩマウスモデルにＡＡＶを投与した群（Ｍｏｃｋと称する）；それぞれの脊髄損傷部位（Ｌ５）でＢＢＢスコアの変化を確認した（図２０）。

【0541】

図２０のＢＢＢスコア（Ｂａｓｓｏ Ｂｅａｔｔｉｅ， ａｎｄ Ｂｒｅｓｎａｈａｎ ｓｃｏｒｅ）は、伝統的に脊髄損傷モデルで使われる測定方法で、下肢の形、角度、膝の角度、足裏の形及び角度、位置などを総合的に判断して点数を測定する。 最下０点から最大２１点で、正常動物は２１点だ。

【0542】

従来の分化因子８個のみ導入した群（－Ｇｓｔａ４で表示）はＭｏｃｋ群と差がなかった（ＢＢＢスコア約４点）。しかし、従来の分化因子８個及びＧｓｔａ４を併せて導入した群（＋Ｇｓｔａ４と表示）は、ＡＡＶ投与後３週目（ＢＢＢスコア約８点）で－Ｇｓｔａ４群に比べて約２倍以上増加した。

【0543】

また、脊髄部位に損傷を与えていない正常群（Ｓｈａｍ と称する）；ＳＣＩマウスモデルにＡＡＶを導入した群（Ｍｏｃｋと呼ぶ）；従来の分化因子８個及びＧｓｔａ４を併せて導入したＡＡＶを投与した群（Ｇｓｔａ４＋と称する）；従来の分化因子８個のみ導入したＡＡＶを投与した群（Ｃｏｎｔｒｏｌと呼ぶ）；それぞれのＦｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｅｓｔ、Ｓｅｌｆｕｒｉｎａｔｉｏｎ、Ｆｏｏｔ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｔｅｓｔ等の変化も確認した（図２１）。

【0544】

図２１（ａ）のＦｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｅｓｔは、動物モデルを３分間水槽に入れ、下肢が動く回数を測定した。Ｍｏｃｋ群で脊髄損傷のために下肢は動かなかった。しかし、従来の分化因子８個をＧｓｔａ４と共に導入する場合、下肢の動きが約６倍ないし１２倍増加することを確認した。

【0545】

図２１（ｂ）及び（ｃ）は自己尿能力を測定した結果である。 脊髄損傷マウスは自ら尿を排尿することができない。従来の分化因子８個及びＧｓｔａ４を併せて導入した群のＡＡＶを投与後１４日又は１６日に自ら排尿することが確認できた。

【0546】

図２１（ｄ）はＦｏｏｔ ｐｒｉｎｔｉｎｇ テストの結果である。 Ｆｏｏｔ ｐｒｉｎｔｉｎｇはマウスの下肢の足裏に赤いインクをつけ、足裏の形を確認する実験だ。 Ｓｈａｍ君の場合、下肢の足裏が鮮明に写っているが（１１番／２０ｃｍ）、Ｍｏｃｋ君で足の裏の形を確認できなかった（１１番／２０ｃｍ）。これに対し、従来の分化因子８個及びＧｓｔａ４を一緒に導入した群ではマウスの下肢の足裏が（５番／２０ｃｍ）写ることが確認できた。

【0547】

前記の結果を通じて、本出願の発明者が発見した新規な分化因子であるＧｓｔａ４は、体細胞を運動性神経細胞に直接交差分化するのに重要な因子であることが分かった。また、Ｇｓｔａ４は従来の分化因子に比べても分化効率が高く、さらに従来の分化因子とＧｓｔａ４を一緒に使用する場合、従来の分化因子だけを使用する時より分化効率がさらに高くなる。さらに、発明者らは脊髄が損傷した下半身麻痺モデルの治療効果も確認したところ、Ｇｓｔａ４は今後様々な神経系疾患で重要な役割を果たすものと予想される。

【産業上の利用可能性】

【0548】

本出願は体細胞から運動性神経細胞への直接交差分化のための新規な分化因子およびその用途を提供することができる。

【配列リストＦｒｅｅＴｅｘｔ】

【0549】

Ｇｓｔａ４（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｌｐｈａ ４）蛋白質またはこれをコーディングする核酸配列などに関するものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-07-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための組成物で、
前記の組成物は、
Ｇｓｔａ４（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｌｐｈａ ４）蛋白質又はこれをコーディングする核酸；
を含む組成物。

【請求項2】

前記Ｇｓｔａ４蛋白質は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列またはこれと同一性が７０％以上の配列であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記Ｇｓｔａ４蛋白質をコーディングする核酸は、配列番号２または１２の配列を持つことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記の組成物は、 ｉｉ）Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １），Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２），Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ），Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９），ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １），Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３），Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）およびＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）中から選択される１つ以上の蛋白質；またはこれをコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記の組成物は、ｉｉ）でＨｂ９またはＬｈｘ３またはＮｇｎ２が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記の組成物は、ｉｉ）でＨｂ９およびＬｈｘ３；またはＨｂ９およびＮｇｎ２；またはＬｈｘ３およびＮｇｎ２が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

前記の組成物は、ｉｉ）でＨｂ９、Ｌｈｘ３及びＮｇｎ２が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項8】

前記の組成物は、ｉｉ）でＨｂ９、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＩｓｌ１が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項9】

前記の組成物は、ｉｉ）でＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項10】

Ａｓｃｌ１蛋白質は配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有し、Ａｓｃｌ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１８の配列を有し；
Ｂｒｎ２蛋白質は配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有し、Ｂｒｎ２蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２０の配列を有し；
Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有し、Ｍｙｔ１Ｌ蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２２の配列を有し；
Ｈｂ９蛋白質は配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有し、Ｈｂ９蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１４の配列を有し；
Ｉｓｌ１蛋白質は配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有し、Ｉｓｌ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２４の配列を有し；
Ｌｈｘ３蛋白質は配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有し、Ｌｈｘ３蛋白質をコーディングする核酸は配列番号１６の配列を有し；
Ｎｇｎ２蛋白質は配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有し、Ｎｇｎ２蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２６の配列を有し；
ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質は配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有し、ＮｅｕｒｏＤ１蛋白質をコーディングする核酸は配列番号２８の配列を有することを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項11】

直接交差分化のための分化因子発現のためのベクトルとして、
前記の直接交差分化は体細胞から誘導されたモーターニューロンに転換されるものであり、
前記ベクトルは
i) Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸；及び
ii) プロモーター；を含み、
この時、前記ｉ）とｉｉ）は作動可能に連結されていることを特徴とするベクトル。

【請求項12】

前記ベクトルは、ｉｉｉ）Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される一つ以上の蛋白質をコーディングする核酸；
をさらに含むことができることを特徴とする、請求項１１に記載のベクトル。

【請求項13】

前記ｉｉｉ）でＨｂ９及びＬｈｘ３が選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のベクトル。

【請求項14】

直接交差分化のための分化因子発現のためのベクトルとして、
前記の直接交差分化は体細胞から誘導されたモーターニューロンに転換されるものであり、
前記ベクトルは、少なくとも、第１ベクトルおよび第２ベクトルを含むことができ、
前記第１ベクトルは、
i) Ｇｓｔａ４蛋白質を暗号化する核酸；及びｉｉ）プロモーター；を含み、
この時、前記ｉ）とｉｉ）は作動可能に連結されており、
前記第２ベクトルは、
ｉｉｉ）Ａｓｃｌ１，Ｂｒｎ２，Ｍｙｔ１Ｌ，Ｈｂ９，Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３，Ｎｇｎ２及びＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される一つ以上の蛋白質をコーディングする核酸；及びｉｖ）プロモーター；を含み、
この時、前記ｉｉｉ）とｉｖ）は作動可能に接続されており、
前記ｉｉ）とｉｖ）は、互いに同一のプロモーターまたは異なるプロモーターであり、
前記ｉｉｉ）は、１つのベクトルに含まれるか、または２つ以上のベクトルに含まれることができることを特徴とするベクトル。

【請求項15】

前記ベクトルは、エンハンサー、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、終端子（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、内部リボソーム流入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ）、蛍光蛋白質遺伝子，グルタチオン－Ｓ－トランスファラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）クロラムフェニコールアセチルトランスパーラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダゼ、ルシファーラゼ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、２Ａ自己切断ペプチド（２Ａ ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、抗生剤耐性遺伝子の中から選択される一つ以上をさらに含むことができることを特徴とする、請求項１１ないし１４のいずれかに記載のベクトル。

【請求項16】

前記２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａの中から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１５に記載のベクトル。

【請求項17】

前記ベクトルは、ウイルスベクトルまたは非ウイルスベクトルであることができ、
ウイルスベクトルはレトロウイルス、レンティウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）、バクシニアウイルス、フォックスウイルス、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｏｓｉｓ）、ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、 ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスシンプレクスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、エピゾマル（ｅｐｉｓｏｍａｌ）及び単純包診ウイルスの一つ以上であることを特徴とする、請求項１１ないし１４のいずれかに記載のベクトル。

【請求項18】

直接交差分化のための方法で、
体細胞から誘導されたモーターニューロンに切り替わるものであり、
前記の方法は、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸を含む組成物を体細胞に導入し；を含み、
この時、前記方法は誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）が生成されないことを特徴とする方法。

【請求項19】

前記の体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、筋肉細胞、神経細胞、毛髪細胞、毛根細胞、毛包細胞、口腔上皮細胞、尿から抽出した体細胞、胃粘膜細胞、杯状細胞、ガストリン細胞（ｇａｓｔｒｉｎ ｃｅｌｌ／Ｇｃｅｌｌ）、Ｂ細胞、主皮細胞、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、血液細胞，希少突起膠前駆細胞中から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記体細胞は人、犬、猫、馬、羊、ウサギ、豚、マウス、ラクダの中から選ばれる一つの哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記方法は、組成物が導入された体細胞を神経細胞分化のための培養培地として培養する；をさらに含むことができることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記の導入は、電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、自己注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、一時的な細胞圧縮またはスクイジング、陽イオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ，脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ），リン酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｅｃｔｉｏｎ），ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ，ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染， ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染中から選択される一つ以上で遂行できることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

前記の導入により、１週間ないし７週間以内に体細胞が誘導されたモーターニューロンに分化することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項24】

体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための、
Ｇｓｔａ４蛋白質を含む、
神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物。

【請求項25】

前記薬学的組成物は、
Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される一以上の蛋白質をさらに含むことができることを特徴とする、請求項２４に記載の薬学的組成物。

【請求項26】

体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための、
Ｇｓｔａ４蛋白質又はこれをコーディングする核酸；が導入された体細胞を含む、
神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物。

【請求項27】

前記薬学的組成物は、
Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｌ、Ｈｂ９、Ｉｓｌ１、Ｌｈｘ３、Ｎｇｎ２およびＮｅｕｒｏＤ１の中から選択される１以上の蛋白質をコーディングする核酸；をさらに含むことができることを特徴とする、請求項２６に記載の薬学的組成物。

【請求項28】

体細胞から誘導されたモーターニューロンへの直接交差分化のための分化因子が過剰発現するモーターニューロンを含む神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物であり、
前記のモーターニューロンは、Ｇｓｔａ４、Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １）、Ｂｒｎ２（ＰＯＵ Ｃｌａｓｓ ３ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｍｙｔ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）、Ｈｂ９（Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ＨＢ９）、ＩＳＬ１（ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、Ｌｈｘ３（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３）、Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２）、ＮｅｕｒｏＤ１（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）の中から選択される一以上の分化因子が過剰発現することを特徴とする薬学的組成物。

【請求項29】

前記の薬学的組成物は許容可能な担体、賦形剤、希釈剤、保存剤の中から選択される一つ以上をさらに含むことができることを特徴とする、請求項２４ないし２８のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項30】

前記の神経系疾患は脊髄損傷、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、ルー・ゲーリック病、毛細血管拡張性運動失調症（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、筋萎縮性側色硬化症、運動神経損傷、外傷による末梢神経損傷、虚血性脳損傷、新生児低酸素性虚血性脳損傷、脳性麻痺、末梢麻痺、中枢麻痺、四肢麻痺、両麻痺、てんかん、神経細胞発達障害、神経痛、難治性てんかん、アルツハイマー病、先天性代謝性神経系疾患及び外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、運動性神経細胞損傷またはこれに誘発される疾患のうち、選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項２４ないし２８のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項31】

前記薬学的組成物は、固形剤、液状剤、カプセル剤、半固体形態の中から選択される一つ以上の形態であることを特徴とする、請求項２４ないし２８のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項32】

前記薬学的組成物は、筋肉、皮内、皮下、静脈、腹腔、動脈、粘膜、脊髄、骨髄、脊髄腔内、経皮のうち選択されるいずれか一つ以上の部位に投与されることを特徴とする、請求項２４ないし２８のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項33】

前記薬学的組成物は、１回に１ｕＬ／ｋｇないし２０ｕＬ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする、請求項２４ないし２８のいずれかに記載の薬学的組成物。

【国際調査報告】