特表 2025-506567 末梢Ｔ細胞リンパ腫の治療のためのバイオマーカー及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-03-11

(54)【発明の名称】末梢Ｔ細胞リンパ腫の治療のためのバイオマーカー及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20250304BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 38/15 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 31/18 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 31/706 20060101ALI20250304BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250304BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20250304BHJP

   C12Q 1/6874 20180101ALN20250304BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20250304BHJP

   C12Q 1/00 20060101ALN20250304BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68

A61K45/00

A61K38/15

A61K31/18

A61K39/395 T

A61K31/519

A61K31/706

A61P35/00

A61P35/02

C12Q1/6874 Z

C12Q1/02

C12Q1/00 C

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024569053

(86)(22)【出願日】2023-02-08

(85)【翻訳文提出日】2024-09-11

(86)【国際出願番号】 US2023012625

(87)【国際公開番号】W WO2023154349

(87)【国際公開日】2023-08-17

(31)【優先権主張番号】63/307,905

(32)【優先日】2022-02-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508221224

【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ネブラスカ

(71)【出願人】

【識別番号】524296888

【氏名又は名称】ザ ガバメント オブ ザ ユーエスエイ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】イクバル ジャヴィード

(72)【発明者】

【氏名】チャン ウィン シー．

(72)【発明者】

【氏名】ライト ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】スタウト ルイス エム．

【テーマコード（参考）】

4B063

4C084

4C085

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ08

4B063QQ12

4B063QQ53

4B063QR32

4B063QR40

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA17

4C084BA01

4C084BA16

4C084BA26

4C084BA27

4C084BA28

4C084CA04

4C084CA59

4C084DA27

4C084NA14

4C084ZB072

4C084ZB212

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC202

4C084ZC412

4C085AA14

4C085AA26

4C085BB01

4C085CC23

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB07

4C086EA16

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C206AA01

4C206AA02

4C206JA13

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZB26

(57)【要約】

本開示は、末梢Ｔ細胞リンパ腫を遺伝的にサブタイプ決定する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含む、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）のサブタイプを識別する方法：
対象からの試料を核酸単離に供すること、
前記試料から遺伝子発現プロファイルを得ること、及び
前記遺伝子発現プロファイル内の特定の遺伝子の存在に基づいて、ＰＴＣＬのサブタイプを特定すること。

【請求項2】

ＰＴＣＬサブタイプ血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＫ－ ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ）、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、又は不確定（indeterminate）、ここで、不確定が、前記試料が少なくとも２つの前記ＰＴＣＬサブタイプの特徴を含むことを示す、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記遺伝子発現プロファイルが、ＡＣＨＥ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＲＲＤＣ４、ＣＯＬ４Ａ４、ＥＦＮＢ２、ＦＣＡＭＲ、ＧＪＡ４、ＧＮＡ１４、ＩＥＲ３ＩＰ１、ＩＳＧ１５、ＭＳＲ１、ＯＬＦＭ１、ＰＡＰＬＮ、Ｓ１ＰＲ３、ＳＯＸ８、ＴＭＥＭ２０６、ＴＵＢＢ２Ｂ、及びＶＡＮＧＬ２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＩＴＬとして特定される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記遺伝子発現プロファイルが、ＢＡＴＦ３、Ｃ９ｏｒｆ８９、ＣＤ２８、ＤＵＳＰ２、ＩＣＭＴ、ＬＧＡＬＳ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＰＲＫＣＱ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＲＡＴ１、及びＺＮＦ１０１のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ－ ＡＬＣＬとして特定される、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記遺伝子発現プロファイルが、ＡＴＰ８Ｂ４、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ５、ＣＴＳＷ、ＦＡＭ１０２Ａ、ＦＡＳＬＧ、ＧＺＭＢ、ＫＬＲＣ２、ＫＬＲＣ３、ＫＬＲＣ４、ＰＲＦ１、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＥＢＥＲ、ＬＭＰ１、及びＴＮＦＲＳＦ２５のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＥＮＫＴＬとして特定される、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記遺伝子発現プロファイルが、ＡＲＳＧ、ＣＣＮＥ１、ＤＯＫ５、ＦＧＦ１８、ＭＹＣＮ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＳＭＣＥ１、ＮＵＣＢ２、ＳＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ１０、ＳＰＰＬ２Ａ、ＳＴＯＭ、ＴＩＡＭ２、ＵＳＴ、ＨＢＺ、及びＺＣＣＨＣ１２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＴＬＬとして特定される、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

前記遺伝子発現プロファイルが、ＡＬＫ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＡ１、ＣＣＲ４、ＤＭＢＸ１、ＧＡＬＮＴ２、ＧＡＳ１、ＧＡＴＡ３、ＨＴＲＡ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＦＫＦＢ３、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ、ＴＩＡＭ２、ＴＭＥＭ１５８、及びＺＡＤＨ２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬとして特定される、請求項２に記載の方法。

【請求項8】

前記遺伝子発現プロファイルが、ＣＡＳＰ２、ＥＺＨ２、ＦＬＪ３７４５３、ＩＦＩ３０、ＩＦＮＧ、ＬＡＧＥ３、ＬＡＰ３、ＮＲ１Ｈ３、ＰＬＡ２Ｇ７、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３１Ａ２、ＴＣＮ２、ＴＭＥＭ１７６Ｂ、ＷＡＲＳ、ＴＢＸ２１、ＣＸＣＲ３、ＧＡＴＡ３及びＣＣＲ４のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＰＴＣＬ－ＮＯＳとして特定される、請求項２に記載の方法。

【請求項9】

前記試料が、前記対象からの生検標本である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋組織を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記試料が、新鮮な凍結組織を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記対象に有効量のサブタイプ特異的治療を提供することを更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記サブタイプ特異的治療が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、抗葉酸剤、アキル化剤、プロテソーム阻害剤、抗体－薬物コンジュゲート、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）３阻害剤、ＳＴＡＴ５阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）阻害剤、ｃＭＥＴ阻害剤、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）阻害剤、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）阻害剤、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）経路阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、低メチル化剤、抗分化抗原群５２（ＣＤ５２）抗体、免疫調整薬、抗誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）抗体、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）阻害剤、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤、Ｂ細胞リンパ腫２阻害剤、抗インターロイキン２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５）抗体、カルシニューリン阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）阻害剤、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ロミデプシン、ベリノスタット、パノビノスタット、又はこれらの組み合わせを含み、
前記抗葉酸剤が、プララトレキサートを含み、
前記アキル化剤が、ベンダムスチンを含み、
プロテオソーム阻害剤が、ボルテゾミブを含み、
前記抗体－薬物コンジュゲートが、ブレンツキシマブベドチンを含み、
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、デュベリシブ、テナリシブ、又はこれらの組み合わせを含み、
前記ＪＡＫ阻害剤が、ルキソリチニブを含み、
前記ＡＬＫ阻害剤が、クリゾチニブを含み、
前記ｍＴＯＲ経路阻害剤が、エベロリムスを含み、
前記低メチル化剤が、５－アザシチジンを含み、
前記抗ＣＤ５２抗体が、アレムツズマブを含み、
ＩｍｉＤが、レナリドミドを含み、
前記ＣＣＲ４阻害剤が、モガムリズマブを含み、
前記ＩＤＨ阻害剤が、エナシデニブを含み、
ＢＣＬ２阻害剤が、ベネトクラクスを含み、
前記抗ＣＤ２５抗体が、カミダンルマブテシリンを含み、
前記カルシニューリン阻害剤が、シクロスポリンＡを含み、
前記ＳＹＫ阻害剤が、セルデュラチニブを含み、
前記二重特異性抗体が、ＡＦＭ１３を含み、
前記キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞が、ＣＤ３０、ＣＤ７、又は両方を含み、
あるいは、これらの組み合わせである、
請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

ＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記サブタイプ特異的治療が、ロミデプシン、ベリノスタット、ブレンツキシマブベドチン、デュベリシブ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

ＡＩＴＬの前記サブタイプ特異的治療が、ロミデプシン、５－Ａｚａ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤、カルシニューリン阻害剤、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

ＡＬＫ－ ＡＬＣＬの前記サブタイプ特異的治療が、ブレンツキシマブベドチンを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項18】

ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬの前記サブタイプ特異的治療が、ＡＬＫ阻害剤、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）阻害剤、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項19】

ＡＴＬＬの前記サブタイプ特異的治療が、ＮＯＴＣＨ阻害剤、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）阻害剤、ｃＭＥＴ阻害剤、モガムリズマブ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

ＥＮＫＴＬの前記サブタイプ特異的治療が、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）阻害剤を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項21】

対象からの試料において末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）のサブタイプを特定するための診断キットであって、
特定のＰＴＣＬサブタイプを示す遺伝子シグネチャを表す遺伝子の１つ又は組み合わせの存在を検出するための手段の少なくとも１つと、使用説明書と
を含む、前記診断キット。

【請求項22】

ＰＴＣＬサブタイプ血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＫ－ ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ）、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、又は不確定、ここで、不確定が、前記試料が少なくとも２つの前記ＰＴＣＬサブタイプの特徴を含むことを示す、請求項２１に記載のキット。

【請求項23】

前記遺伝子シグネチャが、ＡＣＨＥ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＲＲＤＣ４、ＣＯＬ４Ａ４、ＥＦＮＢ２、ＦＣＡＭＲ、ＧＪＡ４、ＧＮＡ１４、ＩＥＲ３ＩＰ１、ＩＳＧ１５、ＭＳＲ１、ＯＬＦＭ１、ＰＡＰＬＮ、Ｓ１ＰＲ３、ＳＯＸ８、ＴＭＥＭ２０６、ＴＵＢＢ２Ｂ、及びＶＡＮＧＬ２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＩＴＬを示す、請求項２２に記載のキット。

【請求項24】

前記遺伝子シグネチャが、ＢＡＴＦ３、Ｃ９ｏｒｆ８９、ＣＤ２８、ＤＵＳＰ２、ＩＣＭＴ、ＬＧＡＬＳ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＰＲＫＣＱ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＲＡＴ１、及びＺＮＦ１０１のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ－ ＡＬＣＬを示す、請求項２２に記載のキット。

【請求項25】

前記遺伝子シグネチャが、ＡＴＰ８Ｂ４、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ５、ＣＴＳＷ、ＦＡＭ１０２Ａ、ＦＡＳＬＧ、ＧＺＭＢ、ＫＬＲＣ２、ＫＬＲＣ３、ＫＬＲＣ４、ＰＲＦ１、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＥＢＥＲ、ＬＭＰ１、及びＴＮＦＲＳＦ２５のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＥＮＫＴＬを示す、請求項２２に記載のキット。

【請求項26】

前記遺伝子シグネチャが、ＡＲＳＧ、ＣＣＮＥ１、ＤＯＫ５、ＦＧＦ１８、ＭＹＣＮ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＳＭＣＥ１、ＮＵＣＢ２、ＳＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ１０、ＳＰＰＬ２Ａ、ＳＴＯＭ、ＴＩＡＭ２、ＵＳＴ、ＴＡＸ、及びＺＣＣＨＣ１２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＴＬＬを示す、請求項２２に記載のキット。

【請求項27】

前記遺伝子シグネチャが、ＡＬＫ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＡ１、ＣＣＲ４、ＤＭＢＸ１、ＧＡＬＮＴ２、ＧＡＳ１、ＧＡＴＡ３、ＨＴＲＡ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＦＫＦＢ３、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ、ＴＩＡＭ２、ＴＭＥＭ１５８、及びＺＡＤＨ２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬを示す、請求項２２に記載のキット。

【請求項28】

前記遺伝子シグネチャが、ＣＡＳＰ２、ＥＺＨ２、ＦＬＪ３７４５３、ＩＦＩ３０、ＩＦＮＧ、ＬＡＧＥ３、ＬＡＰ３、ＮＲ１Ｈ３、ＰＬＡ２Ｇ７、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３１Ａ２、ＴＣＮ２、ＴＭＥＭ１７６Ｂ、及びＷＡＲＳのうちのいずれか１つ以上を含む場合、前記ＰＴＣＬサブタイプがＰＴＣＬ－ＮＯＳを示す、請求項２２に記載のキット。

【請求項29】

以下を含む、試料において末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）の特定のサブタイプを特定する方法：
試料から遺伝子発現プロファイルを得ること、
前記遺伝子発現プロファイルを、特定のＰＴＣＬサブタイプに関連する遺伝子シグネチャと比較することであって、ＰＴＣＬの各サブタイプが、固有の遺伝子シグネチャを含む、こと、及び
前記試料内のＰＴＣＬのサブタイプを、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＫ－ ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ）、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、又は不確定のいずれかとして特定することであって、ここで、不確定が、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルが少なくとも２つの前記ＰＴＣＬサブタイプの前記固有の遺伝子シグネチャからの遺伝子を含むことを示す、こと。

【請求項30】

ＡＩＴＬの前記遺伝子シグネチャが、ＡＣＨＥ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＲＲＤＣ４、ＣＯＬ４Ａ４、ＥＦＮＢ２、ＦＣＡＭＲ、ＧＪＡ４、ＧＮＡ１４、ＩＥＲ３ＩＰ１、ＩＳＧ１５、ＭＳＲ１、ＯＬＦＭ１、ＰＡＰＬＮ、Ｓ１ＰＲ３、ＳＯＸ８、ＴＭＥＭ２０６、ＴＵＢＢ２Ｂ、及びＶＡＮＧＬ２のうちのいずれか１つ以上を含み、
ＡＬＫ－ ＡＬＣＬの前記遺伝子シグネチャが、ＢＡＴＦ３、Ｃ９ｏｒｆ８９、ＣＤ２８、ＤＵＳＰ２、ＩＣＭＴ、ＬＧＡＬＳ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＰＲＫＣＱ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＲＡＴ１、及びＺＮＦ１０１のうちのいずれか１つ以上を含み、
ＥＮＫＴＬの前記遺伝子シグネチャが、ＡＴＰ８Ｂ４、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ５、ＣＴＳＷ、ＦＡＭ１０２Ａ、ＦＡＳＬＧ、ＧＺＭＢ、ＫＬＲＣ２、ＫＬＲＣ３、ＫＬＲＣ４、ＰＲＦ１、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＥＢＥＲ、ＬＭＰ１、及びＴＮＦＲＳＦ２５のうちのいずれか１つ以上を含み、
ＡＴＬＬの前記遺伝子シグネチャが、ＡＲＳＧ、ＣＣＮＥ１、ＤＯＫ５、ＦＧＦ１８、ＭＹＣＮ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＳＭＣＥ１、ＮＵＣＢ２、ＳＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ１０、ＳＰＰＬ２Ａ、ＳＴＯＭ、ＴＩＡＭ２、ＵＳＴ、ＴＡＸ、及びＺＣＣＨＣ１２のうちのいずれか１つ以上を含み、
ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬの前記遺伝子シグネチャが、ＡＬＫ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＡ１、ＣＣＲ４、ＤＭＢＸ１、ＧＡＬＮＴ２、ＧＡＳ１、ＧＡＴＡ３、ＨＴＲＡ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＦＫＦＢ３、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ、ＴＩＡＭ２、ＴＭＥＭ１５８、及びＺＡＤＨ２のうちのいずれか１つ以上を含み、
ＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記遺伝子シグネチャが、ＣＡＳＰ２、ＥＺＨ２、ＦＬＪ３７４５３、ＩＦＩ３０、ＩＦＮＧ、ＬＡＧＥ３、ＬＡＰ３、ＮＲ１Ｈ３、ＰＬＡ２Ｇ７、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３１Ａ２、ＴＣＮ２、ＴＭＥＭ１７６Ｂ、及びＷＡＲＳのうちのいずれか１つ以上を含み、
あるいは、これらの組み合わせである、
請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ＰＴＣＬのサブタイプを特定することが以下を含む、請求項２９又は３０に記載の方法：
一連の少なくとも４つのバイナリ予測子であって、
第１のバイナリ予測子が、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＡＩＴＬ又はＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含み、
第２のバイナリ予測子が、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＡＬＣＬ又はＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含み、
第３のバイナリ予測子が、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＡＴＬＬ又はＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含み、
第４のバイナリ予測子が、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＥＮＫＴＬ又はＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含む、
一連の少なくとも４つのバイナリ予測子、ならびに
前記バイナリ予測子からの結果に基づいて、標本の前記ＰＴＣＬサブタイプを割り当てること。

【請求項32】

前記第１のバイナリ予測子において、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＡＩＴＬの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合、ならびに
前記第２、第３、及び第４のバイナリ予測子において、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合
に、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＩＴＬとして特定される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記第２のバイナリ予測子において、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＡＬＣＬの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合、ならびに
前記第１、第３、及び第４のバイナリ予測子において、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合
に、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＣＬとして特定される、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

以下を更に含む、請求項３３に記載の方法：
前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ又はＡＬＫ－ ＡＬＣＬの前記遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含む、第５のバイナリ予測子、及び
前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合に、前記ＰＴＣＬサブタイプをＡＬＫ＋ ＡＬＣＬとして特定すること、又は
前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＡＬＫ－ ＡＬＣＬの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合に、前記ＰＴＣＬサブタイプをＡＬＫ－ ＡＬＣＬとして特定すること。

【請求項35】

前記第３のバイナリ予測子において、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＡＴＬＬの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合、ならびに
前記第１、第２、及び第４のバイナリ予測子において、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合
に、前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＴＬＬとして特定される、請求項３１に記載の方法。

【請求項36】

前記第４のバイナリ予測子において、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＥＮＫＴＬの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合、ならびに
前記第１、第２、及び第３のバイナリ予測子において、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合
に、前記ＰＴＣＬサブタイプがＥＮＫＴＬとして特定される、請求項３１に記載の方法。

【請求項37】

前記第１、第２、第３、及び第４のバイナリ予測子において、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳとより一致している場合に、前記ＰＴＣＬサブタイプがＰＴＣＬ－ＮＯＳとして特定される、請求項３１に記載の方法。

【請求項38】

前記バイナリ予測子の少なくとも２つがＰＴＣＬ－ＮＯＳとより一致していない場合に、前記ＰＴＣＬサブタイプが、不確定として特定される、請求項３１に記載の方法。

【請求項39】

不確定として特定された試料が、追加のバイナリ予測子を受け、前記追加のバイナリ予測子が、
ＰＴＣＬ－ＮＯＳとより一致していなかった前記ＰＴＣＬサブタイプの１つを含む第１の潜在的サブタイプと、ＰＴＣＬ－ＮＯＳとより一致していなかった少なくとも１つの他のＰＴＣＬサブタイプを含む第２の潜在的サブタイプと
を含み、
前記方法が、
前記試料の前記遺伝子発現プロファイルが前記第１の潜在的サブタイプ又は前記第２の潜在的サブタイプの遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定すること、及び
前記試料の前記遺伝子発現プロファイルが前記第１の潜在的サブタイプの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合に、前記ＰＴＣＬサブタイプを前記第１の潜在的サブタイプとして特定すること、又は
前記試料の前記遺伝子発現プロファイルが前記第２の潜在的サブタイプの前記遺伝子シグネチャとより一致している場合に、前記ＰＴＣＬサブタイプを前記第２の潜在的サブタイプとして特定すること
を更に含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＣＬとして特定された場合に、前記方法が、
請求項３４に記載の第５のバイナリ予測子を使用して、前記ＡＬＣＬサブタイプをＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ又はＡＬＫ－ ＡＬＣＬのいずれかとして決定すること
を更に含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

ＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例として特定された試料が、ＧＡＴＡ３高サブグループ及びＴＢＸ２１高サブグループへと更に分離される、請求項３７に記載の方法。

【請求項42】

ＥＮＫＴＬとして特定された試料が、ＮＫ又はガンマ／デルタＴ細胞系統へと細分される、請求項３６に記載の方法。

【請求項43】

以下を含む、末梢Ｔ細胞リンパ腫を治療する方法：
対象の試料から遺伝子発現プロファイルを得ること、
前記遺伝子発現プロファイルを、特定のＰＴＣＬサブタイプに関連する遺伝子シグネチャと比較することであって、ＰＴＣＬの各サブタイプが、固有の遺伝子シグネチャを含む、こと、
前記試料内のＰＴＣＬの前記サブタイプを、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＫ－ ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ）、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、又は不確定のいずれかとして特定することであって、ここで、不確定が、前記試料の前記遺伝子発現プロファイルが少なくとも２つの前記ＰＴＣＬサブタイプの前記固有の遺伝子シグネチャからの遺伝子を含むことを示す、こと、及び
有効量の治療剤を前記対象に投与することであって、前記治療剤が、特定された前記ＰＴＣＬサブタイプを治療するように構成されている、こと。

【請求項44】

前記治療剤が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、抗葉酸剤、アキル化剤、プロテソーム阻害剤、抗体－薬物コンジュゲート、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）３阻害剤、ＳＴＡＴ５阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）阻害剤、ｃＭＥＴ阻害剤、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）阻害剤、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）阻害剤、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）経路阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、低メチル化剤、抗分化抗原群５２（ＣＤ５２）抗体、免疫調整薬、抗誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）抗体、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）阻害剤、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤、Ｂ細胞リンパ腫２阻害剤、抗インターロイキン２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５）抗体、カルシニューリン阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）阻害剤、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、又はこれらの組み合わせを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ロミデプシン、ベリノスタット、パノビノスタット、又はこれらの組み合わせを含み、
前記抗葉酸剤が、プララトレキサートを含み、
前記アキル化剤が、ベンダムスチンを含み、
プロテオソーム阻害剤が、ボルテゾミブを含み、
前記抗体－薬物コンジュゲートが、ブレンツキシマブベドチンを含み、
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、デュベリシブ、テナリシブ、又はこれらの組み合わせを含み、
前記ＪＡＫ阻害剤が、ルキソリチニブを含み、
前記ＡＬＫ阻害剤が、クリゾチニブを含み、
前記ｍＴＯＲ経路阻害剤が、エベロリムスを含み、
前記低メチル化剤が、５－アザシチジン（５－Ａｚａ）を含み、
前記抗ＣＤ５２抗体が、アレムツズマブを含み、
ＩｍｉＤが、レナリドミドを含み、
前記ＣＣＲ４阻害剤が、モガムリズマブを含み、
前記ＩＤＨ阻害剤が、エナシデニブを含み、
ＢＣＬ２阻害剤が、ベネトクラクスを含み、
前記抗ＣＤ２５抗体が、カミダンルマブテシリンを含み、
前記カルシニューリン阻害剤が、シクロスポリンＡを含み、
前記ＳＹＫ阻害剤が、セルデュラチニブを含み、
前記二重特異性抗体が、ＡＦＭ１３を含み、
前記キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞が、ＣＤ３０、ＣＤ７、又は両方を含み、
あるいは、これらの組み合わせである、
請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

ＰＴＣＬサブタイプがＰＴＣＬ－ＮＯＳとして特定されている場合、前記治療剤が、ロミデプシン、ベリノスタット、ブレンツキシマブベドチン、デュベリシブ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項47】

前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＩＴＬとして特定されている場合、前記治療剤が、ロミデプシン、５－Ａｚａ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤、カルシニューリン阻害剤、又はこれらの組み合わせを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項48】

前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＴＬＬとして特定されている場合、前記治療剤が、ＮＯＴＣＨ阻害剤、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）阻害剤、ｃＭＥＴ阻害剤、モガムリズマブを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項49】

前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ－ ＡＬＣＬとして特定されている場合、前記治療剤がブレンツキシマブベドチンを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項50】

前記ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬとして特定されている場合、前記治療剤が、ＡＬＫ阻害剤、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）阻害剤、又はこれらの組み合わせを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項51】

前記ＰＴＣＬサブタイプがＥＮＫＴＬとして特定されている場合、前記治療剤が血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）阻害剤を含む、請求項４３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２２年２月８日に出願された米国特許仮出願第６３／３０７，９０５号からの優先権の利益を主張する国際出願であり、その内容全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載され特許請求される本発明の日付時点での当業者に既知の最新技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示は、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。

【0003】

本特許開示は、著作権保護の対象となる、材料を含む。著作権所有者は、米国特許商標局の特許ファイル又は記録に表れているような特許文書又は特許開示をいかなる者がファクシミリ複製することにも異議はないが、それ以外では、あらゆる全ての著作権を留保する。

【0004】

政府の権益
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって授与されたＵ０１ ＣＡ１５７５８１及びＵＨ３ ＣＡ２０６１２７に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0005】

技術分野
本明細書に開示される主題は、末梢Ｔ細胞リンパ腫（peripheral T-cell lymphoma、ＰＴＣＬ）の診断、予後、及び／又は治療のための方法に関する。加えて、本明細書に開示される主題は、ＰＴＣＬの診断、予後、及び／又は治療のためのキット及び試薬に関する。更に、本明細書に開示される主題は、ソフトウェア及び分析システムを使用した、ＰＴＣＬの診断、予後、及び／又は治療のためのバイオマーカーのセットの特定方法に関する。

【背景技術】

【0006】

序論
Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞系統に由来する悪性腫瘍は、西洋諸国において全ての非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の１０％を構成し、アジアにおいて、より優勢である。末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、全ての非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の最大２０％を構成する異種がんである。Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）の分類は、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）を含む末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）のいくつかの特徴的なサブタイプ、及び鼻型の結節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）を含む大部分がＮＫ細胞に由来するエンティティを認識している。ほとんどが結節外腫瘍である、更に稀なＰＴＣＬが存在する。大部分のサブタイプについての多様な形態及び決定的な診断マーカーの欠如は、これらの疾患の診断及び分類を困難なものにし、それらの調査を妨げている。現在の免疫表現型マーカー及び分子マーカーでは、ＰＴＣＬ症例の約３０％～５０％が分類不可能であり、ＰＴＣＬ非特定型（PTCL not otherwise specified、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）として分類される。いくつかの再発性遺伝子異常がＰＴＣＬにおいて報告されているが、ＡＬＫ（１）ＡＬＣＬにおけるｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）を除き、特定のＰＴＣＬサブタイプの診断となる特異的な遺伝子異常はない。ＰＴＣＬを有する患者は、一般に、現在の標準治療では予後不良であり、ＰＴＣＬ患者の転帰の改善は、過去２０年間で達成されていない。したがって、ＰＴＣＬ及びそのサブタイプの正確な診断は、各個々の患者のための最も適切かつ有効な治療の選択を確実にするために必要とされる。特に、日常的な臨床適用のための商業的アッセイの作成は、ＰＴＣＬ患者の診断、治療、及び転帰を改善する。

【発明の概要】

【0007】

第１の態様では、本発明は、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）のサブタイプを識別する方法を含む。実施形態では、本方法は、対象からの試料を核酸単離に供することと、試料から遺伝子発現プロファイルを得ることと、遺伝子発現プロファイル内の特定の遺伝子の存在に基づいて、ＰＴＣＬのサブタイプを特定することと、を含む。特定の実施形態では、ＰＴＣＬサブタイプ血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＫ－ ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ）、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、又は不確定（indeterminate）、ここで、不確定は、試料が少なくとも２つのＰＴＣＬサブタイプの特徴を含むことを示す。

【0008】

遺伝子発現プロファイルが、ＡＣＨＥ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＲＲＤＣ４、ＣＯＬ４Ａ４、ＥＦＮＢ２、ＦＣＡＭＲ、ＧＪＡ４、ＧＮＡ１４、ＩＥＲ３ＩＰ１、ＩＳＧ１５、ＭＳＲ１、ＯＬＦＭ１、ＰＡＰＬＮ、Ｓ１ＰＲ３、ＳＯＸ８、ＴＭＥＭ２０６、ＴＵＢＢ２Ｂ、及びＶＡＮＧＬ２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＡＩＴＬとして特定され得る。遺伝子発現プロファイルが、ＢＡＴＦ３、Ｃ９ｏｒｆ８９、ＣＤ２８、ＤＵＳＰ２、ＩＣＭＴ、ＬＧＡＬＳ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＰＲＫＣＱ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＲＡＴ１、及びＺＮＦ１０１のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ－ ＡＬＣＬとして特定され得る。実施形態では、遺伝子発現プロファイルが、ＡＴＰ８Ｂ４、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ５、ＣＴＳＷ、ＦＡＭ１０２Ａ、ＦＡＳＬＧ、ＧＺＭＢ、ＫＬＲＣ２、ＫＬＲＣ３、ＫＬＲＣ４、ＰＲＦ１、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＥＢＥＲ、ＬＭＰ１、及びＴＮＦＲＳＦ２５のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＥＮＫＴＬとして特定され得る。遺伝子発現プロファイルが、ＡＲＳＧ、ＣＣＮＥ１、ＤＯＫ５、ＦＧＦ１８、ＭＹＣＮ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＳＭＣＥ１、ＮＵＣＢ２、ＳＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ１０、ＳＰＰＬ２Ａ、ＳＴＯＭ、ＴＩＡＭ２、ＵＳＴ、ＨＢＺ、及びＺＣＣＨＣ１２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＡＴＬＬとして特定され得る。

【0009】

遺伝子発現プロファイルが、ＡＬＫ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＡ１、ＣＣＲ４、ＤＭＢＸ１、ＧＡＬＮＴ２、ＧＡＳ１、ＧＡＴＡ３、ＨＴＲＡ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＦＫＦＢ３、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ、ＴＩＡＭ２、ＴＭＥＭ１５８、及びＺＡＤＨ２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬとして特定される、請求項２に記載の方法。特定の実施形態では、遺伝子発現プロファイルが、ＣＡＳＰ２、ＥＺＨ２、ＦＬＪ３７４５３、ＩＦＩ３０、ＩＦＮＧ、ＬＡＧＥ３、ＬＡＰ３、ＮＲ１Ｈ３、ＰＬＡ２Ｇ７、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３１Ａ２、ＴＣＮ２、ＴＭＥＭ１７６Ｂ、ＷＡＲＳ、ＴＢＸ２１、ＣＸＣＲ３、ＧＡＴＡ３及びＣＣＲ４のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＰＴＣＬ－ＮＯＳとして特定される。

【0010】

実施形態では、試料は、対象からの生検標本である。試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織を含み得る。特定の実施形態では、試料は、新鮮な凍結組織を含む。

【0011】

本方法は、対象に有効量のサブタイプ特異的治療を提供することを更に含み得る。実施形態では、サブタイプ特異的治療は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、抗葉酸剤、アキル化剤、プロテソーム阻害剤、抗体－薬物コンジュゲート、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）３阻害剤、ＳＴＡＴ５阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）阻害剤、ｃＭＥＴ阻害剤、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）阻害剤、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）阻害剤、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）経路阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、低メチル化剤、抗分化抗原群５２（ＣＤ５２）抗体、免疫調整薬、抗誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）抗体、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）阻害剤、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤、Ｂ細胞リンパ腫２阻害剤、抗インターロイキン２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５）抗体、カルシニューリン阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）阻害剤、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、又はこれらの組み合わせを含む。実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ロミデプシン、ベリノスタット、パノビノスタット、又はこれらの組み合わせを含み、抗葉酸剤は、プララトレキサートを含み、アキル化剤は、ベンダムスチンを含み、プロテオソーム阻害剤は、ボルテゾミブを含み、抗体－薬物コンジュゲートは、ブレンツキシマブベドチンを含み、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、デュベリシブ、テナリシブ、又はこれらの組み合わせを含み、ＪＡＫ阻害剤は、ルキソリチニブを含み、ＡＬＫ阻害剤は、クリゾチニブを含み、ｍＴＯＲ経路阻害剤は、エベロリムスを含み、低メチル化剤は、５－アザシチジンを含み、抗ＣＤ５２抗体は、アレムツズマブを含み、ＩｍｉＤは、レナリドミドを含み、ＣＣＲ４阻害剤は、モガムリズマブを含み、ＩＤＨ阻害剤は、エナシデニブを含み、ＢＣＬ２阻害剤は、ベネトクラクスを含み、抗ＣＤ２５抗体は、カミダンルマブテシリンを含み、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンＡを含み、ＳＹＫ阻害剤は、セルデュラチニブを含み、二重特異性抗体は、ＡＦＭ１３を含み、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞が、ＣＤ３０、ＣＤ７、又は両方を含み、あるいは、これらの組み合わせ。

【0012】

ＰＴＣＬ－ＮＯＳのサブタイプ特異的治療は、ロミデプシン、ベリノスタット、ブレンツキシマブベドチン、デュベリシブ、又はこれらの組み合わせを含み得る。ＡＩＴＬのサブタイプ特異的治療は、ロミデプシン、５－Ａｚａ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤、カルシニューリン阻害剤、又はこれらの組み合わせを含み得る。ＡＬＫ－ ＡＬＣＬのサブタイプ特異的治療は、ブレンツキシマブベドチンを含み得る。ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬのサブタイプ特異的治療は、ＡＬＫ阻害剤、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）阻害剤、又はこれらの組み合わせを含み得る。ＡＴＬＬのサブタイプ特異的治療は、ＮＯＴＣＨ阻害剤、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）阻害剤、ｃＭＥＴ阻害剤、モガムリズマブ、又はこれらの組み合わせを含み得る。ＥＮＫＴＬのサブタイプ特異的治療は、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）阻害剤を含み得る。

【0013】

本発明の別の態様は、対象からの試料において末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）のサブタイプを特定するための診断キットであって、キットが、特定のＰＴＣＬサブタイプを示す遺伝子シグネチャを表す遺伝子の１つ又は組み合わせの存在を検出するための手段の少なくとも１つと、使用説明書と、を含む、診断キットを含む。実施形態における、ＰＴＣＬサブタイプ血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＫ－ ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ）、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、又は不確定、ここで、不確定は、試料が少なくとも２つのＰＴＣＬサブタイプの特徴を含むことを示す。遺伝子シグネチャが、ＡＣＨＥ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＲＲＤＣ４、ＣＯＬ４Ａ４、ＥＦＮＢ２、ＦＣＡＭＲ、ＧＪＡ４、ＧＮＡ１４、ＩＥＲ３ＩＰ１、ＩＳＧ１５、ＭＳＲ１、ＯＬＦＭ１、ＰＡＰＬＮ、Ｓ１ＰＲ３、ＳＯＸ８、ＴＭＥＭ２０６、ＴＵＢＢ２Ｂ、及びＶＡＮＧＬ２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＡＩＴＬを示し得る。遺伝子シグネチャが、ＢＡＴＦ３、Ｃ９ｏｒｆ８９、ＣＤ２８、ＤＵＳＰ２、ＩＣＭＴ、ＬＧＡＬＳ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＰＲＫＣＱ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＲＡＴ１、及びＺＮＦ１０１のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ－ ＡＬＣＬを示し得る。実施形態では、遺伝子シグネチャが、ＡＴＰ８Ｂ４、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ５、ＣＴＳＷ、ＦＡＭ１０２Ａ、ＦＡＳＬＧ、ＧＺＭＢ、ＫＬＲＣ２、ＫＬＲＣ３、ＫＬＲＣ４、ＰＲＦ１、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＥＢＥＲ、ＬＭＰ１、及びＴＮＦＲＳＦ２５のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＥＮＫＴＬを示し得る。遺伝子シグネチャが、ＡＲＳＧ、ＣＣＮＥ１、ＤＯＫ５、ＦＧＦ１８、ＭＹＣＮ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＳＭＣＥ１、ＮＵＣＢ２、ＳＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ１０、ＳＰＰＬ２Ａ、ＳＴＯＭ、ＴＩＡＭ２、ＵＳＴ、ＴＡＸ、及びＺＣＣＨＣ１２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＡＴＬＬを示し得る。遺伝子シグネチャが、ＡＬＫ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＡ１、ＣＣＲ４、ＤＭＢＸ１、ＧＡＬＮＴ２、ＧＡＳ１、ＧＡＴＡ３、ＨＴＲＡ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＦＫＦＢ３、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ、ＴＩＡＭ２、ＴＭＥＭ１５８、及びＺＡＤＨ２のうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬを示し得る。遺伝子シグネチャが、ＣＡＳＰ２、ＥＺＨ２、ＦＬＪ３７４５３、ＩＦＩ３０、ＩＦＮＧ、ＬＡＧＥ３、ＬＡＰ３、ＮＲ１Ｈ３、ＰＬＡ２Ｇ７、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３１Ａ２、ＴＣＮ２、ＴＭＥＭ１７６Ｂ、及びＷＡＲＳのうちのいずれか１つ以上を含む場合、ＰＴＣＬサブタイプがＰＴＣＬ－ＮＯＳを示し得る。

【0014】

別の態様は、以下を含む、試料において末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）の特定のサブタイプを特定する方法を含む：試料から遺伝子発現プロファイルを得ること、遺伝子発現プロファイルを、特定のＰＴＣＬサブタイプに関連する遺伝子シグネチャと比較することであって、ＰＴＣＬの各サブタイプが、固有の遺伝子シグネチャを含む、こと、及び、試料内のＰＴＣＬのサブタイプを、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＫ－ ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ）、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、又は不確定のいずれかとして特定することであって、ここで、不確定が、試料の遺伝子発現プロファイルが少なくとも２つのＰＴＣＬサブタイプの固有の遺伝子シグネチャからの遺伝子を含むことを示す、こと。

【0015】

実施形態では、ＡＩＴＬの遺伝子シグネチャは、ＡＣＨＥ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＲＲＤＣ４、ＣＯＬ４Ａ４、ＥＦＮＢ２、ＦＣＡＭＲ、ＧＪＡ４、ＧＮＡ１４、ＩＥＲ３ＩＰ１、ＩＳＧ１５、ＭＳＲ１、ＯＬＦＭ１、ＰＡＰＬＮ、Ｓ１ＰＲ３、ＳＯＸ８、ＴＭＥＭ２０６、ＴＵＢＢ２Ｂ、及びＶＡＮＧＬ２のうちのいずれか１つ以上を含み、ＡＬＫ－ ＡＬＣＬの遺伝子シグネチャは、ＢＡＴＦ３、Ｃ９ｏｒｆ８９、ＣＤ２８、ＤＵＳＰ２、ＩＣＭＴ、ＬＧＡＬＳ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＰＲＫＣＱ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＲＡＴ１、及びＺＮＦ１０１のうちのいずれか１つ以上を含み、ＥＮＫＴＬの遺伝子シグネチャが、ＡＴＰ８Ｂ４、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ５、ＣＴＳＷ、ＦＡＭ１０２Ａ、ＦＡＳＬＧ、ＧＺＭＢ、ＫＬＲＣ２、ＫＬＲＣ３、ＫＬＲＣ４、ＰＲＦ１、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＥＢＥＲ、ＬＭＰ１、及びＴＮＦＲＳＦ２５のうちのいずれか１つ以上を含み、ＡＴＬＬの遺伝子シグネチャが、ＡＲＳＧ、ＣＣＮＥ１、ＤＯＫ５、ＦＧＦ１８、ＭＹＣＮ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＳＭＣＥ１、ＮＵＣＢ２、ＳＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ１０、ＳＰＰＬ２Ａ、ＳＴＯＭ、ＴＩＡＭ２、ＵＳＴ、ＴＡＸ、及びＺＣＣＨＣ１２のうちのいずれか１つ以上を含み、ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬの遺伝子シグネチャが、ＡＬＫ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＡ１、ＣＣＲ４、ＤＭＢＸ１、ＧＡＬＮＴ２、ＧＡＳ１、ＧＡＴＡ３、ＨＴＲＡ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＦＫＦＢ３、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ、ＴＩＡＭ２、ＴＭＥＭ１５８、及びＺＡＤＨ２のうちのいずれか１つ以上を含み、ＰＴＣＬ－ＮＯＳの遺伝子シグネチャが、ＣＡＳＰ２、ＥＺＨ２、ＦＬＪ３７４５３、ＩＦＩ３０、ＩＦＮＧ、ＬＡＧＥ３、ＬＡＰ３、ＮＲ１Ｈ３、ＰＬＡ２Ｇ７、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３１Ａ２、ＴＣＮ２、ＴＭＥＭ１７６Ｂ、及びＷＡＲＳのうちのいずれか１つ以上を含み、あるいは、これらの組み合わせ。

【0016】

実施形態では、ＰＴＣＬのサブタイプを特定することは、以下を含む：
一連の少なくとも４つのバイナリ予測子であって、
第１のバイナリ予測子が、試料の遺伝子発現プロファイルがＡＩＴＬ又はＰＴＣＬ－ＮＯＳの遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含み、
第２のバイナリ予測子が、試料の遺伝子発現プロファイルがＡＬＣＬ又はＰＴＣＬ－ＮＯＳの遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含み、
第３のバイナリ予測子が、試料の遺伝子発現プロファイルがＡＴＬＬ又はＰＴＣＬ－ＮＯＳの遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含み、
第４のバイナリ予測子が、試料の遺伝子発現プロファイルがＥＮＫＴＬ又はＰＴＣＬ－ＮＯＳの遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含む、
一連の少なくとも４つのバイナリ予測子、ならびに
バイナリ予測子からの結果に基づいて、標本のＰＴＣＬサブタイプを割り当てることと。第１のバイナリ予測子において、試料の遺伝子発現プロファイルがＡＩＴＬの遺伝子シグネチャとより一致している場合、ならびに第２、第３、及び第４のバイナリ予測子において、試料の遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳの遺伝子シグネチャとより一致している場合に、ＰＴＣＬサブタイプはＡＩＴＬとして特定され得る。第２のバイナリ予測子において、試料の遺伝子発現プロファイルがＡＬＣＬの遺伝子シグネチャとより一致している場合、ならびに第１、第３、及び第４のバイナリ予測子において、試料の遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳの遺伝子シグネチャとより一致している場合に、ＰＴＣＬサブタイプはＡＬＣＬとして特定され得る。一実施形態では、本方法は以下を更に含む：
試料の遺伝子発現プロファイルがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ又はＡＬＫ－ ＡＬＣＬの遺伝子シグネチャとより一致しているかどうかを決定することを含む、第５のバイナリ予測子、及び
試料の遺伝子発現プロファイルがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬの遺伝子シグネチャとより一致している場合に、ＰＴＣＬサブタイプをＡＬＫ＋ ＡＬＣＬとして特定すること、又は
試料の遺伝子発現プロファイルがＡＬＫ－ ＡＬＣＬの遺伝子シグネチャとより一致している場合に、ＰＴＣＬサブタイプをＡＬＫ－ ＡＬＣＬとして特定すること。

【0017】

一実施形態では、第３のバイナリ予測子において、試料の遺伝子発現プロファイルがＡＴＬＬの遺伝子シグネチャとより一致している場合、ならびに第１、第２、及び第４のバイナリ予測子において、試料の遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳの遺伝子シグネチャとより一致している場合に、ＰＴＣＬサブタイプはＡＴＬＬとして特定される。第４のバイナリ予測子において、試料の遺伝子発現プロファイルがＥＮＫＴＬの遺伝子シグネチャとより一致している場合、ならびに第１、第２、及び第３のバイナリ予測子において、試料の遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳの遺伝子シグネチャとより一致している場合に、ＰＴＣＬサブタイプはＥＮＫＴＬとして特定され得る。第１、第２、第３、及び第４のバイナリ予測子において、試料の遺伝子発現プロファイルがＰＴＣＬ－ＮＯＳとより一致している場合に、ＰＴＣＬサブタイプはＰＴＣＬ－ＮＯＳとして特定され得る。

【0018】

バイナリ予測子の少なくとも２つが、ＰＴＣＬ－ＮＯＳとより一致していない場合に、ＰＴＣＬサブタイプは不確定として特定され得る。一実施形態では、不確定として特定された試料は、追加のバイナリ予測子を受け、追加のバイナリ予測子は、ＰＴＣＬ－ＮＯＳとより一致していなかったＰＴＣＬサブタイプの１つを含む第１の潜在的サブタイプと、ＰＴＣＬ－ＮＯＳとより一致していなかった少なくとも１つの他のＰＴＣＬサブタイプを含む第２の潜在的サブタイプと、を含む。そのような実施形態では、本方法は、試料の遺伝子発現プロファイルが、第１の潜在的サブタイプ又は第２の潜在的サブタイプの遺伝子発現プロファイルとより一致しているかどうかを決定すること、及び試料の遺伝子発現プロファイルが、第１の潜在的サブタイプの遺伝子シグネチャとより一致している場合に、ＰＴＣＬサブタイプを第１の潜在的サブタイプとして特定すること、又は試料の遺伝子発現プロファイルが、第２の潜在的サブタイプの遺伝子シグネチャとより一致している場合に、ＰＴＣＬサブタイプを第２の潜在的サブタイプとして特定すること、を更に含み得る。ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＣＬとして特定された場合に、本方法は、本明細書に開示される第５のバイナリ予測子を使用して、ＡＬＣＬサブタイプをＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ又はＡＬＫ－ ＡＬＣＬのいずれかとして決定することを更に含み得る。

【0019】

実施形態では、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例として特定された試料は、ＧＡＴＡ３高サブグループ及びＴＢＸ２１高サブグループへと更に分離される。ＥＮＫＴＬとして特定された試料が、ＮＫ又はガンマ／デルタＴ細胞系統へと細分され得る。

【0020】

別の態様は、末梢Ｔ細胞リンパ腫を治療する方法を含む。実施形態では、本方法は、対象の試料から遺伝子発現プロファイルを得ることと、遺伝子発現プロファイルを、特定のＰＴＣＬサブタイプに関連する遺伝子シグネチャと比較することであって、ＰＴＣＬの各サブタイプが、固有の遺伝子シグネチャを含む、ことと、試料内のＰＴＣＬのサブタイプを、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＫ－ ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ）、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、又は不確定のいずれかとして特定することであって、ここで、不確定が、試料の遺伝子発現プロファイルが少なくとも２つのＰＴＣＬサブタイプの固有の遺伝子シグネチャからの遺伝子を含むことを示す、ことと、有効量の治療剤を対象に投与することであって、治療剤が、特定されたＰＴＣＬサブタイプを治療するように構成されている、ことと、を含む。実施形態では、治療剤は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、抗葉酸剤、アキル化剤、プロテソーム阻害剤、抗体－薬物コンジュゲート、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）３阻害剤、ＳＴＡＴ５阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）阻害剤、ｃＭＥＴ阻害剤、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）阻害剤、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）阻害剤、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）経路阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、低メチル化剤、抗分化抗原群５２（ＣＤ５２）抗体、免疫調整薬、抗誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）抗体、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）阻害剤、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤、Ｂ細胞リンパ腫２阻害剤、抗インターロイキン２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５）抗体、カルシニューリン阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）阻害剤、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、又はこれらの組み合わせを含む。

【0021】

一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ロミデプシン、ベリノスタット、パノビノスタット、又はこれらの組み合わせを含み、抗葉酸剤は、プララトレキサートを含み、アキル化剤は、ベンダムスチンを含み、プロテオソーム阻害剤は、ボルテゾミブを含み、抗体－薬物コンジュゲートは、ブレンツキシマブベドチンを含み、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、デュベリシブ、テナリシブ、又はこれらの組み合わせを含み、ＪＡＫ阻害剤は、ルキソリチニブを含み、ＡＬＫ阻害剤は、クリゾチニブを含み、ｍＴＯＲ経路阻害剤は、エベロリムスを含み、低メチル化剤は、５－アザシチジン（５－Ａｚａ）を含み、抗ＣＤ５２抗体は、アレムツズマブを含み、ＩｍｉＤは、レナリドミドを含み、ＣＣＲ４阻害剤は、モガムリズマブを含み、ＩＤＨ阻害剤は、エナシデニブを含み、ＢＣＬ２阻害剤は、ベネトクラクスを含み、抗ＣＤ２５抗体は、カミダンルマブテシリンを含み、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンＡを含み、ＳＹＫ阻害剤は、セルデュラチニブを含み、二重特異性抗体は、ＡＦＭ１３を含み、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞は、ＣＤ３０、ＣＤ７、又は両方を含み、あるいは、これらの組み合わせ。

【0022】

実施形態では、ＰＴＣＬサブタイプがＰＴＣＬ－ＮＯＳとして特定されている場合、治療剤は、ロミデプシン、ベリノスタット、ブレンツキシマブベドチン、デュベリシブ、又はこれらの組み合わせを含む。ＰＴＣＬサブタイプがＡＩＴＬとして特定されている場合、治療剤は、ロミデプシン、５－Ａｚａ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤、カルシニューリン阻害剤、又はこれらの組み合わせを含み得る。ＰＴＣＬサブタイプがＡＴＬＬとして特定されている場合、治療剤は、ＮＯＴＣＨ阻害剤、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）阻害剤、ｃＭＥＴ阻害剤、モガムリズマブを含み得る。実施形態では、ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ－ ＡＬＣＬとして特定されている場合、治療剤は、ブレンツキシマブベドチンを含む。ＰＴＣＬサブタイプがＡＬＫ＋ ＡＬＣＬとして特定されている場合、治療剤は、ＡＬＫ阻害剤、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）阻害剤、又はこれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、ＰＴＣＬサブタイプがＥＮＫＴＬとして特定されている場合、治療剤は、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）阻害剤を含む。

【図面の簡単な説明】

【0023】

特許又は出願ファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴うこの特許又は特許出願刊行物のコピーは、申請及び必要な料金の支払い後、特許庁によって提供される。本明細書に記載される図面は、Ａｍａｄｏｒ Ｃ，Ｂｏｕｓｋａ Ａ，Ｗｒｉｇｈｔ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｏｕｔｉｎｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０２２；４０（３６）：４２６１－４２７５．ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２１．０２７０７に対応し、その全体が参照により組み込まれる。

【0024】

本発明の特定の特徴は、特に添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が使用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。

【図1】ＰＴＣＬサブグループの分子診断シグネチャを示す。複合共変量予測モデルを使用して、主要なＰＴＣＬエンティティについて固有の遺伝子発現シグネチャを特定した（詳細については、参考文献番号１０、１１を参照されたい）。各々の列は、ＰＴＣＬ患者を表し、各々の行は、分類子の固有の遺伝子を表す。

【図2】ＰＴＣＬ－ＮＯＳ内の２つの主要な分子サブグループを示す。（Ａ）ＧＡＴＡ３及びＴＢＸ２１サブタイプについてのベイズ予測子を導出した。分類精度のために、一つ抜き交差検証を使用した。症例の約１８％は、明確に定義されなかった（ＵＣ、分類不能）。（Ｂ）ＧＡＴＡ３及びＴＢＸ２１サブグループの全生存期間（ＯＳ）分析は、臨床転帰において有意差を示した（Ｐ＝．０１）（参考文献番号１０）。

【図3】モデルにおけるエラー率対遺伝子数を示す。Ｙ軸は、５００個のシミュレーションされたデータセットの平均相互検証エラー率を示し、利用可能な候補遺伝子の数を示すプラットフォームの変化の影響を近似するために、Ｘ軸の関数として、ノイズが加えられている。それぞれのカラーの線は、異なる診断的区別を表す（図の凡例を参照されたい）。左から右への曲線の急な低下が存在し、１５～２０個の遺伝子で各曲線が平坦化している。これらの結果は、この数の遺伝子が、各々の診断的区別を行うのに十分であり、追加の遺伝子がエラー率を更に減少させないことを実証する。

【図4】独立した検証コホートにおけるＬｙｍｐｈ２Ｃｘアッセイの性能を示す。（Ａ）Ｌｙｍｐｈ２Ｃｘアッセイは、６７名の患者の遺伝子発現ヒートマップの形態で示される。５個のハウスキーピング遺伝子を含む、モデルに寄与する２０個の遺伝子を左側に示す。アッセイについて起始細胞の割り当てを示し、ゴールドスタンダード法と比較し、新鮮な凍結組織からの遺伝子発現に対して以前に公開されているアルゴリズム及び３つの免疫組織化学に基づくアルゴリズム^{２０、２３}を使用する。（Ｂ）２つの独立した研究所（MoCha、ＣＬＣ）からの検証コホートにおけるＬｙｍｐｈ２Ｃｘスコアの比較。水平及び垂直の薄い灰色の線は、ＧＣＢ、未分類、及びＡＢＣサブタイプの間の閾値を表す。Ｒ２は、０．９９６であり、最良適合線の傾きは、１．０１５である。ＭｏＣｈａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）、ＣＬＣ、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃａｎｃｅｒ，ＢＣ Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｃｙ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）。

【図5】（Ａ）ＤＬＢＣＬにおける６６７個の診断及び予後遺伝子についてのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇデータとＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータとの間の相関の分布を示すヒストグラム。（Ｂ）「学術的」ＰＴＣＬシグネチャ中に存在する遺伝子。４０個の遺伝子の大部分は、十分に相関しており、相関中央値は、０．７６である。

【図6】カットポイントを含むサブタイプの線形予測子を開発するために、検証セットとは独立したＦＦ試料からのＵ１３３アレイデータを使用したアッセイ開発を示す。訓練セットでは、複製物試料を使用して、遺伝子重み及び加法的シフトを調整して、プラットフォームの差を説明し、ＦＦＰＥ標本／ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析と可能な限り近似してＦＦ予測子スコアを模倣し、検証のためのロック態様を確立する。本提案に従う第ＩＩ相試験も示される。

【図7】変動性（Ｙ軸）対シグナル強度（Ｘ軸）を示す。それぞれのカラーの線は、異なるＬｙｍｐｈｏｍａ／Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＬＬＭＰＰ）施設からのデータを表す。線の重複は、施設間の優れた再現性を示し、最小シグナル強度で、ある程度の変動性を有する。

【図8】ＡＬＣＬ及びＰＴＣＬ－ＮＯＳの下位分類のための例示的な免疫組織化学的染色を示す。ＡＬＣＬは、ＣＤ３０＋又はＡＬＫ＋として下位分類することができ、ＧＡＴＡ３及びＴＢＸ２１は、ＰＴＣＬ－ＮＯＳの２つのサブグループを表す。

【図9】ＤＮＡ／ＲＮＡ単離のための異なるプロトコルを使用して様々な時間に収集されたＦＦＰＥ組織からのＲＮＡ収量のヒストグラム比較を提供する。ＳＴＯＲＭプロトコル、修正ＳＴＯＲＭプロトコル、又はＱｕｉａｇｅｎプロトコルのいずれかを使用して、ＲＮＡ単離を行った。より古いブロックからのＲＮＡの回収は概して、より低かったが、これは、より新しいキットを使用しても差がなかった。

【図10A】様々なプロトコルを使用してＦＦＰＥ及び新鮮な凍結試料から単離されたＲＮＡの代表的なゲル画像を含む。示された年に、組織を収集した。

【図10B】様々な年数の試料から、より大きなＲＮＡ分子（長さが２００塩基対を超える）を単離する際の異なるプロトコルの有効性を比較するヒストグラムを提供する。

【図11】図１と比較して、診断シグネチャリストに追加された追加の遺伝子を伴う、精緻化された遺伝子シグネチャを示す（参考文献１０から修正されている）。

【図12】ＰＴＣＬ分子分類子を提供する。図１２Ａは、ＰＴＣＬの分子診断の研究設計及び概略図を提供する。ＰＴＣＬ下位分類のための分子分類子は、訓練コホートとして指定された新鮮な凍結（ＦＦ）組織（ｎ＝１０９）を用いたＰＴＣＬからのＨＧ－Ｕ１３３ｐｌｕｓ２．０アレイデータを使用して導出された。この分子分類子は、ハウスキーピング遺伝子及びＴ細胞生物学に関与する他の遺伝子を含む４４２個の別個の遺伝子を有していた。このトランスクリプトームシグネチャを、対応するマッチしたＦＦＰＥ試料を使用するｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ，Ｉｎｃ）のために考慮した。ＦＦデータとＦＦＰＥデータとの間で高い相関を示した転写産物を選択した。下位分類のための最小数の転写産物を有するように、かつＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームを用いてＦＦ予測子スコアを模倣するように、アルゴリズムを更に精緻化した（詳細についてはＭ＆Ｍを参照されたい）。最終診断モデルは、１５３個の転写産物（９９個の診断、５個のウイルス及び１６個のハウスキーピング、並びに３３個のＴ細胞生物学関連）をもたらし、病理学及び他の補助的方法によって厳密に特性決定されたＰＴＣＬ症例の独立コホートにおいて検証された。分類アルゴリズムは、図１７に詳述されるように、１つのエンティティを別のエンティティから区別するための一連のいくつかのバイナリ予測子に基づいていた。図１２Ｂは、訓練コホート及び検証コホートにおける最終的なｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分類子のヒートマップを提供する。特定のＰＴＣＬサブタイプにおいて一般的に発現されるＥＢＶ及びＨＴＬＶ－１ウイルス転写産物が示され、正規化のために使用され、ＰＴＣＬサブタイプ間で変動しないハウスキーピング遺伝子が、比較のために示される。図１２Ｃは、１０５個の訓練コホート症例のうち８９個及び１４０個の検証症例のうち６６個についての全生存期間のカプラン・マイヤー曲線を、利用可能な転帰データとともに示す。図１２Ｄは、訓練コホートに含まれるＰＴＣＬサブタイプのＯＳのカプラン・マイヤー曲線を示す（ＨＧ－Ｕ１３３ｐｌｕｓ２．０アレイによる分子分類）。図１２Ｅは、検証コホートに含まれるＰＴＣＬエンティティのＯＳのカプラン・マイヤー曲線を示す（病理分類）。

【図13】ＡＩＴＬ分類を示す。図１３Ａは、訓練及び検証ＡＩＴＬにおける５個のＴＦＨ関連遺伝子の平均発現に対するＡＩＴＬ診断スコアの散布図を提供する。図１３Ｂは、ＡＩＴＬにおけるＥＢＥＲ及びＥＢＮＡ１転写産物発現の箱ひげ図を提供する（訓練／検証コホート）。図１３Ｃは、ＣＤ２０ ｍＲＮＡ発現による組み合わせコホートにおけるＡＩＴＬのＯＳのカプラン・マイヤー曲線を提供する。実線は、分子分類によってＡＩＴＬとして分類された症例である（ｐ＝０．０２）。点線は、病理によるＡＩＴＬである（ｐ＝０．０６）。代表的な低発現ＡＩＴＬ症例及び高発現ＡＩＴＬ症例におけるＣＤ２０発現（４００倍）。図１３Ｄは、利用可能な配列決定データを有する症例の変異状態を示す。ＡＩＴＬ－ＰＴＣＬ－ＮＯＳ中間であった症例、又はＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分類子でＡＩＴＬとして分類されなかった症例は、アスタリスクで示される。図１３Ｅは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）でプロファイリングされたＡＩＴＬ及びＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例におけるＡＩＴＬ分類診断スコアのバイオリンプロット及びドットプロットを提供する。ＡＩＴＬとＰＴＣＬ－ＮＯＳとの間で不一致であった症例は、赤色に着色され、中間ＡＩＴＬ症例は、灰色に着色されている。図１３Ｆは、検証コホートにおけるｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分類による不一致を示すＡＩＴＬのヒートマップを提供する。一致したケースの平均シグネチャが示されている。中間とラベル付けされた症例については、コンセンサス病理検査によってＡＩＴＬと診断された症例が左側にあり、ＰＴＣＬ－ＮＯＳと診断された中間症例が右側にある。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によってＡＩＴＬとして分類された２つのＰＴＣＬ－ＮＯＳ。図Ｇ～Ｉは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームによってＡＩＴＬとして分類されたＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例においてみられるＢＣＬ６及びＩＣＯＳ（４００倍；Ｇ、Ｈ＆Ｉ；Ｂ、ＢＣＬ－６及びＣ、ＩＣＯＳ）の局所発現の一例を提供する。

【図14】ＡＬＣＬ分類を示す。図１４Ａは、ＡＬＣＬ分類スコア対ＰＴＣＬ－ＮＯＳのバイオリンプロット及び散布図を提供する。図１４Ｂは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームでのＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ対ＡＬＫ陰性ＡＬＣＬを示す。ＡＬＣＬとＰＴＣＬ－ＮＯＳとの間、又はＡＬＫ陰性とＡＬＫ陽性との間で不一致であった症例は、赤色に着色されている。図１４Ｃは、検証コホートにおけるｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分類による不一致を示すＡＬＫ陰性及びＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ症例のヒートマップを提供する。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイによってＡＬＫ陽性ＡＬＣＬとして分類された代表的なＡＬＫ陰性ＡＬＣＬ症例のＨ及びＥ及びＣＤ３０及びＡＬＫ免疫染色が示される（４００倍）。図１４Ｄは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分類による訓練及び検証コホートにおけるＡＬＣＬのＯＳのカプラン・マイヤー曲線を提供する。図１４Ｅは、ＡＬＣＬ及びＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例におけるＣＤ３０及び細胞傷害性転写産物発現のヒートマップを提供する。不一致の症例を、赤色の線で示す。

【図15】ＡＴＬＬ及びＥＮＫＴＣＬ分類を示す。図１５Ａは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）でプロファイリングされたＡＴＬＬ及びＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例におけるＡＴＬＬ分類スコアのバイオリンプロット及びドットプロットを提供する。図１５Ｂは、検証コホートにおけるｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分類によって不一致のＡＴＬＬ症例のヒートマップを提供する。ＰＴＣＬ－ＮＯＳとして診断されたがｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によってＡＴＬＬに分類された症例についてのＨ＆Ｅ及びＣＤ４染色（下パネル）。図１５Ｃは、訓練及び検証ＡＴＬＬ症例におけるＨＴＬＶ－１特異的転写産物ＨＢＺ対ＡＴＬＬスコアの発現の散布図を提供する。実線の当てはめ線は、訓練データを表し、破線は、検証データを表す。図１５Ｄは、ＡＴＬＬ及びＰＴＣＬ－ＮＯＳ検証コホートにおけるＨＢＺ及びＴＡＸ発現のヒートマップを提供する。不一致の症例は、赤色のアスタリスクによって示される。図１５Ｅは、ｑＰＣＲ対ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によって測定されたＨＢＺ発現の散布図を提供する。図１５Ｆ～Ｇは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）での訓練及び検証コホートにおいてプロファイリングされたＥＮＫＴＣＬ及びＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例における、ＥＮＫＴＣＬ分類スコア（Ｆ）又はＥＢＥＲスコア（Ｇ）のバイオリンプロット及びドットプロットを提供する。不一致の症例は赤色である。図１５Ｈは、訓練コホート及び検証コホートにおけるＥＮＫＴＣＬ及びＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例におけるＣＤ３ガンマ及びデルタ並びにＥＢＶ転写産物の発現のヒートマップを提供する。図１５Ｉは、検証コホートにおける平均シグネチャと比較した、ＥＮＫＴＣＬ不一致症例における関連シグネチャの発現のヒートマップを提供する。

【図16】ＰＴＣＬ－ＮＯＳ下位分類を示す。図１６Ａは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）での訓練及び検証コホートにおいてプロファイリングされたＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例におけるＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３分類スコアのバイオリンプロット及びドットプロットを提供する。図１６Ｂは、利用可能な配列決定データを有するＰＴＣＬ－ＮＯＳコホートの変異状態を示す。図１６Ｃ訓練（上）及び検証（下）症例におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、及び細胞傷害性遺伝子の発現のヒートマップを提供する。図１６Ｄは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによってＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１として分類された症例における細胞傷害性遺伝子対ＣＤ２０の平均発現の散布図を提供する。図１６Ｅは、ＧＡＴＡ３を示す１つの代表的なＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３症例（左）、及びＴＢＸ２１及びＣＤ８発現を示す１つのＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１症例（右）についてのＨ＆Ｅ及びＩＨＣ染色を提供する。図１６Ｆは、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３又はＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１ ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇとして分類された訓練及び検証コホートの組み合わせにおける利用可能な転帰データを有するＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例の全生存期間のＫＭ曲線を示す。

【図17】ＰＴＣＬ下位分類のためのアルゴリズム設計の概略図を提供する。６個のペアワイズサブモデルを組み合わせて、分類のための最終予測子を生成する。ステージ１：最初に４つのカテゴリー（ＡＩＴＬ、ＡＬＣＬ、ＥＮＫＴＣＬ、又はＡＴＬＬ）が、ＰＴＣＬ－ＮＯＳから区別される。続いて、ＥＢＶ－ウイルス転写産物（ＥＢＥＲ）を、ＥＮＫＴＣＬ分類子（対ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）に加え、最後にＡＬＣＬをＡＬＫ－ ＡＬＣＬ対ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬに下位分類する。ステージ２：第２のステージでは、ＰＴＣＬ－ＮＯＳとみなされた試料が、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３又はＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１サブタイプに区別される。４個の予測子のうち１個より多くが、非ＰＴＣＬ－ＮＯＳ診断（例えば、ＡＬＣＬ及びＡＩＴＬ）をもたらした場合、それらのタイプ間の追加の一対一予測子を適用して、モデルに含まれるように選択されたいずれかのタイプに特徴的な全ての遺伝子を使用して、タイ状態を破る（例えば、ＡＬＣＬ対ＡＩＴＬ）。

【図18A】新鮮な凍結組織から抽出された同じＲＮＡについて、ｎＣｏｕｎｔｅｒ４４２遺伝子アッセイ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ，Ｉｎｃ）によって測定されたｌｏｇ２（カウント） 対 ＨＧ－Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ）によって測定された対応する転写産物についてのｌｏｇ２（プローブ強度）値の散布図を提供する。

【図18B】２つのプラットフォーム（ｎＣｏｕｎｔｅｒ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ，Ｉｎｃ対ＨＧ－Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ）によってプロファイリングされた１０症例についての各ｍＲＮＡ転写産物の相関値のヒストグラムを提供する。

【図18C】Ｑｉａｇｅｎ（Ｑ）又はＳｔｏｒｍキット（Ｓ）によって抽出されたＲＮＡを比較するゲル画像を提供する。

【図18D】Ｑｉａｇｅｎ（Ｑ）又はＳｔｏｒｍキット（Ｓ）によって抽出されたＲＮＡにおける２００塩基より大きなＲＮＡの％を比較する棒グラフを提供する。

【図18E】対応する生検からＱｉａｇｅｎ又はＳｔｏｒｍキットを使用して抽出された新鮮な凍結（ＦＦ）又はＦＦＰＥからのＲＮＡのｎＣｏｕｎｔｅｒ分析によって生成されたｌｏｇ２（カウント）を比較する散布図及びヒストグラムを提供する。ボックス内の数字は、相関係数を表す。

【図18F】対応する生検からのＦＦ又はＦＦＰＥ組織から抽出されたＲＮＡのｎＣｏｕｎｔｅｒ分析によって生成されたｌｏｇ２（カウント数）の散布図を提供する。

【図19A】両方のプラットフォームをプロファイリングした１００症例について、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ，Ｉｎｃ）によって分析されたＦＦＰＥ ＲＮＡ及びＨＧ－Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ）によって分析されたＦＦ ＲＮＡについての各ｍＲＮＡ転写産物についての相関値のヒストグラムを提供する。

【図19B】両方のプラットフォームをプロファイリングした１００症例について、ｎＣｏｕｎｔｅｒによって分析されたＦＦＰＥ ＲＮＡ及びＨＧ－Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２によって分析されたＦＦ ＲＮＡについての分類子における各ｍＲＮＡ転写産物についての相関値のヒストグラムを提供する。

【図19C】最終的にはｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォーム分類モデルに使用される、元々の、しかし拡張された分類子遺伝子リスト（Ｃ）及び低減された分類子遺伝子リスト（Ｄ）を示す、訓練コホートに含まれる症例からのＦＦ ＲＮＡからのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２データのヒートマップを提供する。ＰＴＣＬサブタイプ間で変化しないハウスキーピング遺伝子を、比較のために示す。

【図19D】最終的にはｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォーム分類モデルに使用される、元々の、しかし拡張された分類子遺伝子リスト（Ｃ）及び低減された分類子遺伝子リスト（Ｄ）を示す、訓練コホートに含まれる症例からのＦＦ ＲＮＡからのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２データのヒートマップを提供する。ＰＴＣＬサブタイプ間で変化しないハウスキーピング遺伝子を、比較のために示す。

【図19E】訓練及び検証症例の試行において、ｎＣｏｕｎｔｅｒによってＦＦＰＥ組織において分析されたハウスキーピング及びモデル遺伝子の分散の箱ひげ図及びドットプロットを提供する。

【図19F】ＨＧ－Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイによって分析されたＦＦ ＲＮＡ（上）又はｎＣｏｕｎｔｅｒによって分析されたＦＦＰＥ ＲＮＡ（下）を使用した、ＧＡＴＡ３又はＴＢＸ２１として分類されたＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例の全生存期間のカプラン・マイヤー曲線を提供する。

【図20】３つの異なる場所（ＵＮＭＣ，Ｉｎｓｉｇｈｔ．Ｉｎｃ、及びＣＯＨ）でＵＮＭＣ（初期設計）で生成されたモデルスコア（ＦＦＰＥ ＲＮＡ） 対 最終診断モデル試行でのモデルスコアの比較を示す。症例をＰＴＣＬエンティティとして分類するための閾値は、緑色でラベル付けされている。薄い緑色の線は、中間ＡＩＴＬ／ＰＴＣＬ－ＮＯＳスコアの閾値を示す。赤線は、直交回帰の結果を示し、これを等対角線（diagonal ofequal）モデルを示す灰色の線と比較することができる。^＊１５３個のＣｏｄｅＳｅｔを含有する低減された遺伝子設計を使用したｎＣｏｕｎｔｅｒパネル。^＊＊４４２個のＣｏｄｅＳｅｔを含有する初期設計を使用したｎＣｏｕｎｔｅｒパネル。全ての症例は、ＵＮＭＣで元々の４４２個のＣｏｄｅＳｅｔ設計に対して試行され、他の場所で最終の１５３個のＣｏｄｅＳｅｔ設計に対して試行され、一方で、７個の試料は、１５３個の最終設計ＣｏｄｅＳｅｔパネルを使用して、ＵＮＭＣでも繰り返された。全てのスコアは、最終モデルを使用して生成された。

【図21】ｎＣｏｕｎｔｅｒでの訓練及び検証コホートにおいてプロファイリングされた全てのＰＴＣＬ症例における分類スコアのバイオリンプロット及びドットプロットを提供する。ｘ軸は、既知の診断である。ｎＣｏｕｎｔｅｒ分類が、予想される診断と一致しなかった症例は、それらがどのように分類されたかに従って着色されており、一方、一致した症例は、灰色である。

【図22】強いＥＢＥＲ及び細胞傷害性（ＴＩＡ－１及びパーフォリン）マーカー発現を有する結節性ＥＮＫＴＬ症例の１つについてのＨ＆Ｅ及びＩＨＣ染色を示す。

【図23A】ＡＩＴＬ、ＰＴＣＬ－ＴＦＨ、及びＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３、及び反応性過形成におけるＴＦＨ、ＡＩＴＬ、ＧＡＴＡ３及びＴＢＸ２１シグネチャ発現のヒートマップを提供する。

【図23B】示されたエンティティにおけるＴＦＨ特異的遺伝子の平均発現の箱ひげ図を提供する。

【図24】訓練コホートにおけるゴールドスタンダード診断と精緻化された診断シグネチャとの間の一致を示す。ＡＩＴＬ、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、ＡＬＣＬ、未分化大細胞リンパ腫、ＡＴＬＬ、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、ＥＮＫＴＣＬ、結節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ、末梢Ｔ細胞リンパ腫非特定型、ＦＦＰＥ、ホルマリン固定パラフィン包埋組織、ＦＦ、新鮮な凍結組織。^＊ボーダーラインの症例は、不一致とみなされなかった。^＃新鮮な凍結ＧＥＰに基づく、病理診断及び分子診断の組み合わせ。

【図25】検証コホートにおけるゴールドスタンダード診断と精緻化された診断シグネチャとの間の一致を示す。転写分類子は、症例の８５％（１１９／１４０）において３名の専門血液病理学者によって与えられた病理診断と一致し、６％（８／１４０）において分子シグネチャとの「ボーダーラインの関連」を示した。全体として、１２７／１４０の症例（緑色）が、コンセンサス病理検査と分子診断との間で一致するとみなされる。分類子は、再検査でその後の臨床病理学的情報と一致した、ＡＴＬＬとして分子的に分類された２症例のＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例（水色）において、病理診断を改善した。「不一致」であった残りの１１症例のうち、４症例は、全体的なトランスクリプトームシグネチャ及び形態学的特徴に基づく病理診断を超える改善を提供し得る分子分類（黄色）を有していた。ＡＩＴＬ、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、ＡＬＣＬ、未分化大細胞リンパ腫、ＡＴＬＬ、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、ＥＮＫＴＣＬ、結節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ、末梢Ｔ細胞リンパ腫非特定型。^＊ボーダーラインの症例は、不一致とみなされなかった。^＋再検査でその後の臨床病理学的情報と一致した、ＡＴＬＬとして分子的に分類されたＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例。^＋＋再検査でＴＦＨマーカー発現を示した、ＡＩＴＬとして分子的に分類されたＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例。^＋＋＋全体的なトランスクリプトームシグネチャに基づいてＡＬＫ陽性様ＡＬＣＬを表し得るＡＬＫ－ＡＬＣＬ症例。

【発明を実施するための形態】

【0025】

例示的態様の説明
本明細書に開示される主題の１つ以上の実施形態の詳細が、本明細書に提供される。しかしながら、本明細書に開示される主題が様々な形態で具現化され得ることが、理解されるべきである。本文書に記載される実施形態及び他の実施形態に対する修正は、本明細書に提供される情報を検討した後に当業者に明らかになるであろう。本文書で提供される情報、特に説明される例示的な実施形態の特定の詳細は、主に理解を明確にするために提供され、限定するものとして解釈されるべきではない。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。

【0026】

本明細書で使用される用語は、当業者によって十分に理解されると考えられるが、本明細書に開示される主題の説明を容易にするために、特定の定義が示される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書に開示される主題が属する技術分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

【0027】

本明細書に記載の方法、デバイス、及び材料と同様又は同等の任意の方法、デバイス、及び材料が、本明細書に開示される主題の実施又は試験に使用され得るが、代表的な方法、デバイス、及び材料を、以下に記載する。

【0028】

特定の場合に、本明細書に開示されるヌクレオチド及びポリペプチドは、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）及びＳＷＩＳＳＰＲＯＴなどの公的に利用可能なデータベースに含まれる。そのような公的に利用可能なデータベースに含まれるそのようなヌクレオチド及びポリペプチドに関連する配列及び他の情報を含む情報は、参照により明示的に組み込まれる。別段の指示がない限り、又は明らかでない限り、そのような公的に利用可能なデータベースへの言及は、本出願の出願日時点でのデータベースの最新バージョンへの言及である。

【0029】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本主題が属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書の開示全体を通して言及される全ての特許、特許出願、公開された出願及び刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、データベース、ウェブサイト並びに他の公開された資料は、別段の記載がない限り、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書中の用語について複数の定義が存在する場合、このセクションにおける定義が優先する。ＵＲＬ又は他のそのような識別子若しくはアドレスに対して参照が行われる場合、そのような識別子は、変化する可能性があり、インターネット上の特定の情報が行き交う可能性があるが、同等の情報をインターネットを検索することによって見つけることができることが理解される。それらへの言及は、そのような情報の利用可能性及び公的な普及を証明する。

【0030】

本明細書に記載の方法、デバイス、及び材料と同様又は同等の任意の方法、デバイス、及び材料が、本明細書に開示される主題の実施又は試験に使用され得るが、代表的な方法、デバイス、及び材料を、以下に記載する。

【0031】

長年にわたる特許法の慣習に従って、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、「１つ以上」を指す。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及は、複数のそのようなセルを含むなどである。

【0032】

「実質的に」という用語は、意図した目的に悪影響を与えない記述語からの逸脱を可能にする。記述用語は、「実質的に」という語が明確に列挙されていなくても、「実質的に」という用語によって変更されることが理解される。したがって、例えば、句「ここで、レバーは垂直に延在する」は、レバーがその機能を実行するのに正確な垂直配置が必要でない限り、「ここで、レバーは実質的に垂直に延在する」を意味する。

【0033】

「含む（comprising）」及び「含む（including）」及び「有する（having）」及び「含む（involving）」（並びに同様に「含む（comprises）」、「含む（includes）」、「有する（has）」、及び「含む（involves）」）などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、用語の各々は、「含む（comprising）」の一般的な米国特許法の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも以下（at least the following）」を意味する非限定用語（open term）であると解釈され、追加の特徴、限定、態様などを除外しないとも解釈される。よって、例えば、「ステップａ、ｂ、及びｃを含むプロセス」は、プロセスが少なくともステップａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。「ａ」又は「ａｎ」という用語が使用されている場合は常に、そのような解釈が文脈上無意味でない限り、「１つ以上」と理解される。

【0034】

別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件などの特性などを表す全ての数は、全ての場合において「約」という用語によって修正されるものとして理解されるべきである。したがって、そうではないと示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本明細書に開示される主題によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。

【0035】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、質量、重量、時間、体積、濃度又はパーセンテージの値又は量に言及する場合、特定の量からいくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％、及びいくつかの実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示された方法を実施するのに適切である。

【0036】

本明細書で使用される場合、範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表すことができる。本明細書に開示される多くの値が存在すること、及び各値はまた、その値自体に加えて「約」その特定の値として本明細書に開示されることも理解される。例えば、「１０」という値が開示される場合、「約１０」もまた開示される。２つの特定の単位の間の各単位も開示されることも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。

【0037】

本明細書で使用される場合、「生物学的試料」は、対象から得られる生物学的材料の試料を指す。実施形態では、対象は、ヒト対象を含む。生物学的試料の例としては、組織、組織試料、細胞試料、流体試料、又はこれらの組み合わせが挙げられる。生物学的試料は、例えば、組織生検、例えば、吸引生検、ブラシ生検、表面生検、針生検、パンチ生検、切除生検、直視下生検、切開生検及び内視鏡下生検の形態で得ることができる。「生物学的試料」は、限定されないが、例えば、血液、血漿、血清、腫瘍生検、尿、糞便、痰、脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸管、及び尿生殖路、涙、唾液、乳、細胞、腫瘍、臓器を含む、対象から単離された組織又は流体の試料、また、インビトロ細胞培養物の構成成分の試料を指し得る。生物学的試料の非限定的な例としては、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、新鮮な凍結（ＦＦ）試料、又は他の調製試料型が挙げられる。

【0038】

当業者は、対象由来の生物学的試料が、種々の従来技術によって得られ得ることを認識する。本明細書に記載される方法は、典型的には、がんを有することが疑われる対象又はがんに罹患している対象などの対象から生物学的試料を得ることを伴う。本明細書中で使用される場合、「生物学的試料を得る」という語句は、対象から生物学的試料を直接的又は間接的に獲得するための任意のプロセスを指す。例えば、生物学的試料は、対象から組織又は流体試料（例えば、組織生検、採血、骨髄試料、脊椎穿刺）を入手することによって（例えば、ポイントオブケア施設、例えば、診療所、病院、研究所施設において）得ることができる。あるいは、生物学的試料は、対象から直接試料を入手した１人以上の人から（例えば、研究所施設で）生物学的試料を受け取ることによって得ることができる。生物学的試料は、例えば、対象由来の組織（例えば、組織生検、血液）、細胞（例えば、造血幹細胞、白血球、若しくは網状赤血球などの造血細胞、幹細胞、若しくは形質細胞、がん細胞）、小胞、生体分子凝集体、又は血小板であり得る。

【0039】

ある実施形態では、試料は、原発性又は転移性腫瘍の切除、生検、又はコア針生検からの試料である。加えて、細針吸引試料が使用される。試料は、パラフィン包埋組織又は凍結組織のいずれかであり得る。

【0040】

実施形態では、生物学的試料は、生検組織であってもよく、生検組織は、がん細胞であるか、又はがん細胞であることが疑われる少なくとも１つの細胞を含有する。「生検組織」という用語は、試料が、がん性組織を含有するかどうかを決定するか、又はがん性である組織を検査する目的のために対象から取り出される組織の試料を指し得る。いくつかの実施形態では、生検組織は、ある対象が、がんを有することが疑われるため、得られる。次いで、生検組織は、がんの有無について検査される。他の実施形態では、ある対象が、がんを有することが知られているため、生検組織が得られ、次いで、生検組織は、がんのステージ及び／又は治療選択肢を示すマーカーについて検査される。

【0041】

本明細書で使用される場合、「診断する」とは、対象において疾患を検出し、特定することを指す。この用語はまた、疾患（例えば、ＰＴＣＬ）を有することが知られている患者における疾患状態（進行、退縮、安定化、治療に対する応答など）を評価すること（assessing）又は評価すること（evaluating）も包含し得る。

【0042】

本明細書で使用される場合、「予後」という用語は、がんの存在（例えば、本発明の診断方法によって決定されるような）が、対象の将来の健康（例えば、予測される罹患率又は死亡率、がんになる可能性、及び転移のリスク）に及ぼす影響に関する情報を提供することを指す。言い換えれば、「予後」という用語は、がんの予想される経過及び転帰の予測、又はがんからの回復の可能性の予測を提供することを指す。「予後」という用語は、当該技術分野において認識されており、特に、疾患寛解、疾患再燃、腫瘍再発、転移、及び死亡の可能性に関して、疾患又は疾患進行の起こり得る経過についての予測を包含する。「良好な予後」は、がんに罹患した患者が、療法後にがんを有していないままである可能性を指し得る。「予後不良」は、治療後の根底にあるがんの再燃又は再発の可能性、転移を発生する可能性、及び／又は死亡の可能性を指し得る。特定の実施形態では、予後を評価するための時間枠は、例えば、１年未満、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１５年、２０年、又はそれより長い。

【0043】

本明細書で使用される「治療する」、「治療」又は「治療すること」という用語は、患者の状態（例えば、１つ以上の症状）の改善、状態の進行の遅延などを含む、疾患に罹患した患者に利益を与える任意の種類の治療を指す。

【0044】

本発明の態様は、それを必要とする患者におけるがんの治療のための方法に関する。がんの治療は、本明細書で使用される場合、がん転移を含むがんの進行を部分的又は完全に阻害、遅延、若しくは予防すること、がんの再発を阻害、遅延、若しくは予防すること、又は哺乳動物、例えば、ヒトにおけるがんの発症若しくは発生を予防すること（化学予防）を指し得る。がんを治療することは、腫瘍発生、腫瘍成長、増殖、血管新生、及び／又は転移を停止又は低減することによって示され得る。

【0045】

本発明の態様はまた、対象におけるがんについての診断情報を提供することを含む。例えば、本発明の態様は、がんを有することが疑われる対象、又はがんを有するリスクがある対象に診断情報を提供することを含み得る。「がんを有することが疑われる対象」という用語は、がんを示す１つ以上の症状（例えば、顕著なしこり若しくは塊）を呈するか、又はがんについてスクリーニングされている（例えば、日常的な身体検査中に）対象を指し得る。がんを有することが疑われる対象はまた、１つ以上のリスク因子を有し得る。がんを有することが疑われる対象は、一般に、がんについて検査されていない。しかしながら、「がんを有することが疑われる対象」は、初期の診断を受けたが、がんのステージが不明である個体を包含する。この用語は更に、かつてがんを有していた人々（例えば、寛解期の個体）を含む。本明細書で使用される場合、「がんのリスクがある対象」という用語は、特定のがんを発生する１つ以上のリスク因子を有する対象を指す。リスク因子としては、限定されないが、性別、年齢、遺伝的素因、環境曝露、以前のがんの発生、既存の非がん疾患、及び生活様式が挙げられる。

【0046】

「有効量」という語句は、患者の状態の改善をもたらす治療剤の量を指す。特定の実施形態では、有効量は、生存率を少なくとも１年間増加させる。有効量は、疾患が実質的に進行しない治療開始後の生存年数によって測定することができる。実施形態では、有効量は、少なくとも１年の無増悪生存期間（ＰＦＳ）を生じさせるのに十分な量であり得る。有効量は、１年より長いＰＦＳを誘導するのに十分なものであり得る。実施形態では、有効量は、１年のＰＦＳ、２年のＰＦＳ、３年のＰＦＳ、４年のＰＦＳ、又は５年のＰＦＳを生じさせるのに十分な投薬量である。実施形態では、治療剤は、抗がん剤である。

【0047】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的を指す。本明細書に開示される方法の対象は、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、又は両生類などの脊椎動物であり得る。したがって、本明細書に開示される方法の対象は、ヒト又は非ヒトであり得る。したがって、獣医学的治療用途が、本明細書に開示される主題に従って提供される。

【0048】

「対象」は、ヒト及び非ヒト霊長類などの哺乳動物、及びアムールトラなど絶滅の危機にさらされていることに起因して重要な哺乳動物；ヒトによる消費のために農場で飼育された動物などの経済的に重要な動物；並びに／又はペットとして、若しくは動物園で飼育されている動物などのヒトにとって社会的に重要な動物を指し得る。このような動物の例としては、限定されないが、ネコ及びイヌなどの肉食動物；ブタ（pig）、ブタ（hog）、及びイノシシを含む、ブタ；反芻動物及び／又は有蹄動物、例えばウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダ；ウサギ、モルモット、及びげっ歯類が挙げられる。絶滅の危機にさらされており、及び／又は動物園で飼育されている種類の鳥類、並びに家禽、より具体的には、家畜化された家禽、すなわち、例えば、ヒトにとっても経済的に重要であるようなシチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどの治療を含む、鳥類の治療も提供される。したがって、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競走馬を含む）、家禽などを含むが、これらに限定されない家畜の治療も提供される。

【0049】

実施形態では、対象は、がんを保有すると以前に診断されており、おそらく既にがんの治療を受けている。代替的な実施形態では、対象は、がんを保有すると以前に診断されていない。本発明は、がんのリスクがある全ての患者に有用であり得る。各々の種類のがんは、彼ら自身のリスク因子のセットを有するが、がんを発生するリスクは、年齢、性別、人種並びに個人及び家族の病歴とともに増加する。他のリスク因子は、生活様式の選択に大きく関連し、一方、特定の感染、職業曝露及びいくつかの環境因子もまた、がんの発生に関連し得る。

【0050】

本明細書中で使用される場合、「投与すること」及び「投与」という用語は、薬学的調製物を対象に提供する任意の方法を指す。このような方法は当業者に周知であり、限定されないが、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、点眼投与、口腔内投与、脳内投与、直腸投与、並びに静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与などの注射液を含む非経口投与が挙げられる。投与は、連続的又は断続的であり得る。調製物は、治療的に投与することができる。すなわち、目的の既存の状態を治療するために投与される。調製物は、予防的に投与することができる。すなわち、目的の状態の予防のために投与される。

【0051】

本明細書に開示される主題は、対象からの生物学的試料中の１つ以上のバイオマーカーの存在又は量を決定することによる、対象におけるがんの診断、予後、又は治療のための方法に関する。実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫である。がんは、ＰＴＣＬであり得る。

【0052】

ある実施形態では、本方法は、対象から生物学的試料を得ることであって、生物学的試料は、がん細胞であるか、又はがん細胞であることが疑われる少なくとも１つの細胞を含む、ことと、生物学的試料からの遺伝子の発現レベルを測定又は決定することと、生物学的試料中の発現レベルを対照試料と比較することと、測定するステップに基づき、診断、予後、又は予測情報を提供することと、を含む。

【0053】

実施形態では、遺伝子のヌクレオチド又はタンパク質のレベルなどの測定値を、対照と比較することができ、対照のものと異なる場合、対象は、がんを有する及び／又は発生する可能性の増加、がんを有するか、又は発生する可能性の減少、所与の治療に応答する可能性の増加、又は所与の治療に応答する可能性の減少を有し得る。「対照のものと異なる」試料又は対象は、正常、未治療、又は異常な状態の対照試料からの試料とは統計的に異なるレベルで検出される分析物又は診断若しくは治療指標（例えば、マーカー）のレベルを有すると理解される。統計的有意性の決定は、当業者の能力の範囲内であり、例えば、陽性又は陰性の結果を構成する平均からの標準偏差の数である。例えば、対照試料は、１つ以上の非がん性細胞、又はがんと診断されていない患者からの生物学的試料を含み得る。

【0054】

実施形態では、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルなどの測定値を閾値と比較して、対象が、がんを有するかどうかを決定し、がんの種類又はサブタイプを診断し、患者の予後を提供し、特定の治療レジメンを決定し、又はこれらの組み合わせを行うことができる。「閾値」という用語は、バイオマーカーについての複数の生物学的試料に由来する値を指すことができ、その閾値を超えることは、がんを有する及び／又は発生する可能性の増加、又は所与の治療に応答する可能性の増加に関連する。

【0055】

本発明の方法の特定の実施形態によれば、遺伝子によってコードされる遺伝子産物（例えば、ポリペプチド又は核酸）の存在又は量は、対象に由来する試料（例えば、対象から得られる腫瘍又は血液試料から得られる組織又は細胞の試料）において検出される。試料は、一連の検出の前又は検出中に、様々な処理ステップに供することができる。

【0056】

本発明の目的のために、「遺伝子」という用語は、当該技術分野で理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、「遺伝子」という用語は、当該技術分野において様々な意味を有し、それらのうちのいくつかは、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）及び／又はイントロン配列を含み、それらのうちの他のものは、コード配列に限定されることが当業者によって理解されるだろう。「遺伝子」の定義は、タンパク質をコードしないが、むしろｔＲＮＡなどの機能的ＲＮＡ分子をコードする核酸への言及を含むことが更に理解されるであろう。明確にするために、本願発明者らは、本出願において使用される場合、「遺伝子」という用語が、一般に、タンパク質をコードする核酸の一部を指すことに留意する。この用語は、任意選択的に調節配列を包含することができる。この定義は、「遺伝子」という用語の非タンパク質コード発現単位への適用を排除することを意図するものではなく、むしろ、ほとんどの場合、本明細書で使用されるその用語がタンパク質コード核酸を指すことを明確にすることを意図するものである。

【0057】

遺伝子産物又は発現産物は、一般に、遺伝子から転写されたＲＮＡ、又は遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされるポリペプチドである。

【0058】

遺伝子の発現は、当該技術分野で公知の種々の技術によって測定することができる。特定の技術は、遺伝子によってコードされるポリペプチドに結合する抗体ではなく、遺伝子の一部又は全部に対応するポリヌクレオチドを利用することができる。適切な技術としては、限定されないが、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、並びに種々の核酸増幅技術（例えば、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、及びリガーゼ連鎖反応）が挙げられる。

【0059】

いくつかの実施形態では、本出願は、生物学的試料中の１つ以上のバイオマーカーの存在又は量に基づいて、異なるサブグループＰＴＣＬを特定する方法を提供する。ＰＴＣＬの非限定的なサブグループとしては、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ、ＡＩＴＬ、ＡＬＣＬ、ＡＬＫ（－）ＡＬＣＬ、ＥＮＫＴＬ、ＮＫ及びγδ－Ｔ－ＰＴＣＬが挙げられる。実施形態では、ＰＴＣＬ－ＮＯＳは、転写因子ＧＡＴＡ３又はＴＢＸ２１及びこれらの標的遺伝子のいずれかの高い発現によって特徴付けられる２つの主要な分子サブタイプの１つへと更に細分することができる。

【0060】

特定の実施形態では、バイオマーカーは、ＰＴＣＬの異なるサブタイプに固有に存在する遺伝子シグネチャを含む。ＰＴＣＬの各サブタイプについての遺伝子シグネチャは、以下の表１に列挙される遺伝子のうちの１つ以上を含み得る。

【0061】

（表１）例示的なＰＴＣＬサブタイプ遺伝子シグネチャ

【0062】

いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーは、ＧＡＴＡ、ＴＢＸ２１、又はこれらの関連する標的遺伝子を含む。１つ以上のバイオマーカーは、ＮＫ又はガンマ／デルタＴ細胞系統を含み得る。特定の実施形態では、ＮＫ系統は、ＥＢＶウイルス転写（ＥＢＥＲ及びＬＭＰ１）を含む。実施形態では、ＡＴＬＬサブタイプについての遺伝子シグネチャは、ＨＴＬＶ－１ウイルス転写産物発現（ＴＡＸ、ＨＢＺ、又はこれらの組み合わせ）を更に含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、本出願は、遺伝子の特定のパネルの発現プロファイルを決定することによる、対象におけるがんの診断、予後、及び／又は治療の方法を提供する。

【0064】

いくつかの実施形態では、本出願は、ＰＴＣＬの特定のサブグループと診断された対象の生存期間を予測する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子の特定のパネルのプロファイルの発現を検出することに関する。

【0065】

更に、本明細書に開示される主題のいくつかの実施形態では、対象におけるＰＴＣＬの特定のサブグループのための治療のための方法が提供される。実施形態では、治療方法は、対象に有効量の抗がん剤を投与することを含む。抗がん剤は、対象のＰＴＣＬサブタイプに応じて変化し得る。実施形態では、治療は、対象のＰＴＣＬサブタイプを特異的に標的とするように最適化される。そのような剤の非限定的な例は、化学療法、免疫療法、毒素療法、放射線療法、又はこれらの組み合わせを含む。抗がん剤は、プララトレキサート、ロミデプシン、ベリノスタット、ブレンツキシマブベドチン、デュベリシブ、デシタビン及び関連化合物、ＥＺＨ１／２阻害剤、現在知られているか、若しくはその後に発見される他のＰＴＣＬサブタイプ特異的治療、又はこれらの組み合わせを含み得る。

【0066】

加えて、本明細書に開示される主題は、ＰＴＣＬの診断、予後、及び／又は治療のためのキット及び試薬に関する。いくつかの実施形態では、キットは、遺伝子の特定のパネルの発現プロファイルを検出する手段を含む。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上のプローブを含む。

【0067】

更に、本明細書に開示される主題は、ソフトウェア及び分析システムを使用した、ＰＴＣＬの診断、予後、及び／又は治療のためのセットバイオマーカーの特定方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される主題は、いくつかの遺伝子の発現レベルを比較することによって、ＰＴＣＬをサブタイプ決定する方法を提供する。

【0068】

実施形態は、単一反応において多数の核酸を分析するための方法論を使用する。実施形態では、方法又はキットは、次世代配列決定（ＮＧＳ）などのハイスループット核酸配列決定技術を使用する。実施形態では、標的化されたＲＮＡ配列パネルは、ＮＧＳプラットフォーム上で与えられ得る。そのようなＮＧＳ技術の非限定的な例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）からの機器及びプロトコルが挙げられる。なお他の実施形態では、特定の多重ＰＣＲベースのプラットフォームが使用される。実施形態は、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｏｄａｐｌｅｘ（Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）又は同様のプラットフォームなどのかなりの数の分析物を収容するように構成されたｑＰＣＲベースのプラットフォームを使用する。実施形態は、従来のリアルタイムＰＣＲプラットフォームを使用することができる。代替の実施形態は、限定されないが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ａｋｎｏｎｎｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡ）、Ｂｉｏｆｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ，ＵＳＡ）又は類似のプラットフォームを含む、様々な発現マイクロアレイベースのプラットフォームのいずれかを利用する。いくつかの実施形態は、非アレイプラットフォーム及びプロトコルを使用する。特定の非アレイ実施形態では、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイが利用される。他の非アレイ実施形態は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）からのプラットフォーム及びプロトコルを使用する。本明細書で提供される例は、単に例示的なものであり、決して限定するものとみなされるべきではない。実施形態は、様々な分子診断プラットフォームのいずれかを使用する。

【0069】

特定の実施形態は、多数の遺伝子の発現レベルを同時に比較するのに好都合なデバイスであるＤＮＡチップを使用する。ＤＮＡチップベースの発現プロファイリングは、例えば、「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｍａｒｋ Ｓｃｈｅｎａ，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００）などに開示されている方法によって行うことができる。

【0070】

ＤＮＡチップは、いくつかの遺伝子を検出するための固定化された高密度プローブを含む。したがって、多くの遺伝子の発現レベルを、１回の分析によって同時に推定することができる。すなわち、ＤＮＡチップを用いて標本の発現プロファイルを決定することができる。

【0071】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される主題は、ＰＴＣＬなどのがんの異なるサブタイプに特異的なバイオマーカーを特定する方法に関する。実施形態は、生物学的試料のＧＥＰ分析に基づいて診断アルゴリズムを実行するステップを含む。特定の実施形態は、サブグループ分類のための段階的バイナリモデルアルゴリズムを使用する。実施形態は、診断の正確さを著しく損なうことなく、がんサブグループ分類子における遺伝子の数を実質的に低減する方法を提供する。実施形態では、遺伝子の総数を、５０個未満まで低減する。特定の実施形態では、遺伝子の総数は、２５個未満である。遺伝子の総数を、１５～２０個（両端を含む）まで低減することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子の総数を、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、約３０個まで低減する。本方法は、これらの様々な分子ＰＴＣＬエンティティにおける潜在的な治療標的を含む別個の発がん経路を特定することを更に含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される主題は、対象において精緻化された診断及び予後バイオマーカーを使用して、ＰＴＣＬサブタイプを区別する方法を提供する。

【0073】

本明細書に記載される方法はまた、がんの治療を選択するためにも有用である。例えば、ある実施形態は、がん試料を提供すること、又は対象からがん試料を得ること（例えば、単離すること）と、ＰＴＣＬシグネチャにおける遺伝子の発現、活性、又は産物のうちの少なくとも１つを測定することと、測定するステップに基づいて治療を選択することと、を含み得る。実施形態は、測定されたレベルを、対照試料又は閾値のレベルと比較するステップを更に含み得る。

【0074】

本発明の態様はまた、キット、例えば、がんを治療及び／又は診断するためのキットを包含する。

【0075】

ある実施形態では、キットは、例えば、阻害剤などの本明細書に記載の１つ以上の組成物を含み得る。

【0076】

例えば、キットは、ＰＴＣＬシグネチャにおける遺伝子、又は試料における他のタンパク質のレベルの検出に有用な１つ以上の試薬を含み得る。１つ以上の試薬は、固体支持体に固定化され得る。固体支持構造の組成物の非限定的な例は、プラスチック、ボール紙、ガラス、プレキシガラス、スズ、紙、又はこれらの組み合わせを含む。固体支持体はまた、ディップスティック、スプーン、薬匙、濾紙又はスワブを含み得る。

【0077】

試薬は、生物学的試料中のがん又は腫瘍細胞（例えば、ｓｃＦｖ又はモノクローナル抗体）を検出することができる標識された化合物又は剤；試料中の遺伝子発現の量を決定するための手段；及び試料中の遺伝子発現の量を、対照試料又は閾値などの標準と比較するための手段を含み得る。標準は、いくつかの実施形態では、非がん細胞又はその細胞抽出物である。化合物又は剤は、好適な容器に包装することができる。キットは、キットを使用して試料中のがんを検出するための説明書を更に含み得る。

【0078】

実施形態では、キットはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡを増幅させるためのプライマー及び／又はプライマーを試験するための対照試料を含み得る。例えば、対照試料は、プライマーにハイブリダイズする核酸を含み得る。

【0079】

キットはまた、試料収集装置、例えば、生物学的流体又は腫瘍生検を収集するために使用されるデバイスを含み得る。

【0080】

ある実施形態では、キットは、１つ以上の試薬を含有する容器と、任意選択的に、（ｂ）情報資料と、を含み得る。情報材料は、本明細書に記載される方法及び／又は診断目的のための剤の使用に関する説明的であり、指導的であり、マーケティング又は他の材料であり得る。ある実施形態では、キットは、１つ以上の抗がん治療薬も含む。

【0081】

キットの情報資料は、その形態において限定されない。一実施形態では、情報資料は、キットの構成要素の製造、例えば、分子量、濃度、有効期限、バッチ又は製造場所の情報などについての情報を含み得る。一実施形態では、情報資料は、キットの構成要素を使用する方法に関する。情報は、様々な形式で提供することができ、印刷されたテキスト、コンピュータ読み取り可能な資料、ビデオ録音、若しくは音声録音、又は実質的な資料へのリンク若しくはアドレスを提供する情報を含む。

【0082】

キットは、溶媒若しくは緩衝液、安定剤、又は保存剤などの他の成分を含み得る。任意選択的に、キットは、任意の形態、例えば、液体、乾燥形態又は凍結乾燥形態、好ましくは、実質的に純粋及び／又は滅菌で提供することができる治療剤を含み得る。剤が溶液で提供される場合、液体溶液は、好ましくは水溶液である。剤が乾燥形態として提供される場合、再構成は一般に、適切な溶媒の添加による。溶媒、例えば、無菌水又は緩衝液は、任意にキットにおいて提供することができる。

【0083】

他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していない。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。

【0084】

本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の例に更に記載される。

【実施例】

【0085】

実施例は、本発明のより完全な理解を促進するために以下に提供される。以下の実施例は、本発明を作製及び実施する例示的な様式を例示する。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例に開示されている特定の実施形態に限定されず、代わりの方法を使用して同様の結果を得ることができるため、例示のみを目的としている。

【0086】

実施例１
本研究の包括的な目標は、発現マイクロアレイにより分析された新鮮な凍結標本を使用して元々開発された「学術的な」ＰＴＣＬ診断及び予後遺伝子発現（ＧＥ）シグネチャを、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームで分析されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本に適用可能な最適化されたロックダウンシグネチャに移行させることである。この提案の２つの目的（目的１．低減された転写産物のセットを特定し、既存の「学術的な」診断及び予後ＰＴＣＬシグネチャを複製することができる新しいモデルを作製すること、目的２．ＦＦＰＥ標本の分析のためのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームでの精緻化された診断及び予後ＰＴＣＬ遺伝子シグネチャセットの適用可能性を確認すること）は、本提案の直後に続く第ＩＩ相試験において行われ、アッセイの分析及び臨床性能、及び臨床有用性の完全な評価及び検証を含む、更なる商業的試験開発のための候補としての最適化されたＦＦＰＥ／ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイの実現可能性を決定する。

【0087】

特定の目的
第Ｉ相： 末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）診断及び予後のための「学術的な」遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）シグネチャの最適化、並びに商業的アッセイ開発のための最適化されたシグネチャの実現可能性の初期の評価。
目標。 本研究の包括的な目標は、発現マイクロアレイにより分析された新鮮な凍結（ＦＦ）標本を使用して元々開発された「学術的な」ＰＴＣＬ診断／予後ＧＥＰシグネチャを、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームで分析されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本に適用可能な最適化されたロックダウンシグネチャに移行させることである。この努力は、２つの目的に分割され、それぞれの特定の活動を以下に詳述する。これらの第Ｉ相試験は、更なる商業的な試験開発（ＣＬＩＡ認定研究所におけるその提供、及び新しいか、又は既存のＰＴＣＬ療法のためのインビトロ診断（ＩＶＤ）キット及びコンパニオン診断（ＣＤｘ）アッセイとしてのその更なる開発を含む）のための候補として最適化されたＦＦＰＥ標本／ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイの実現可能性を決定するのに役立ち、これは、第Ｉ相の目的が満たされた場合、これは、アッセイの分析及び臨床性能、並びに臨床有用性の完全な評価及び検証を含む第ＩＩ相フォローアップ試験において行われる。

【0088】

目的１： 低減された転写産物のセットを特定し、既存の「学術的な」診断及び予後ＰＴＣＬシグネチャを複製することができる新しいモデルを作製すること。
１ａ． 各ＰＴＣＬエンティティの最適な区別のために必要とされる低減された転写産物のセットを特定する。成果物： 新鮮な凍結（ＦＦ）標本／発現アレイプラットフォームからＦＦＰＥ標本／ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームに移行することが可能な元々のＰＴＣＬサブタイプ決定シグネチャからのそれらの遺伝子転写産物の特定。これらの研究は、アレイを使用して以前に特性決定された同じ症例からのＦＦ試料からのデータと比較して、ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームで約６０個のＦＦＰＥ標本からのＲＮＡにおけるコードセットの性能を決定する。

【0089】

１ｂ．ＰＴＣＬエンティティを区別するためにＦＦＰＥ組織に適用することができる診断及び予後シグネチャを精緻化する。成果物： 元々の「学術的な」ＰＴＣＬシグネチャを可能な限り１に近い一致で再現することができる単一の作業最小遺伝子セットの特定。ＦＦ／マイクロアレイからＦＦＰＥ／ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームへと十分に移行させるために目的１ａで示される転写産物を、約１２０のＰＴＣＬ症例の訓練セットに使用して、臨床的関連性の診断及び予後ＰＴＣＬサブタイプを区別することが可能な最小数の遺伝子から構成される分類モデル及びアルゴリズムを開発する。

【0090】

目的２： ＦＦＰＥ標本の分析のためのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ ｐｌａｔｆｏｒｍで精緻化された診断及び予後ＰＴＣＬ遺伝子シグネチャセットの適用可能性を確認する。
２ａ．ロックダウン診断及び予後ＰＴＣＬ遺伝子シグネチャを作成し、研究所間の再現性を評価する。成果物： 初期の検証コホート及び研究所間の研究結果に基づく最適化されたＰＴＣＬシグネチャのロックダウン。約１００のＰＴＣＬ ＦＦＰＥ症例を、ＵＮＭＣ、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ、及びコンサルティング商業ＣＬＩＡラボとともにＨｅａｌｔｈＣｈａｒｔ、Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌａｂｓでの分子診断研究所において独立して、精緻化された診断及び予後遺伝子シグネチャを使用してサブタイプ決定し、その結果を、マッチした標本から以前に得られたＦＦ／マイクロアレイゴールドスタンダードサブタイプ決定と比較する。研究所間のアッセイ再現性を評価し、アッセイアルゴリズムを終了させ、最終アッセイＳＯＰを導出する。

【0091】

２ｂ．第ＩＩ相のアッセイ移行のための「ロックされた」診断／予後シグネチャを検証する。成果物： 第ＩＩ相の開発への前進のためのロックダウンシグネチャの適合性を確認する検証コホート結果。約３０のＦＦＰＥ症例のＰＴＣＬ検証コホートの分析を、世界中の複数の独立した研究所において、ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームで実施して、第ＩＩ相のアッセイ開発への前進のための最適化されたサブタイプ決定シグネチャ、アルゴリズム、及びＳＯＰの適合性を確認する。

【0092】

Ａ．化学的及び臨床的有意性
末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、治療課題を有する不均一エンティティである：ＰＴＣＬは、非ホジキンリンパ腫の最大２０％を構成する^１、２。Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）は、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、及び結節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＬ）を含むいくつかのＰＴＣＬサブタイプを認識する^３。ＰＴＣＬの診断は、専門の血液病理学者にとってさえ困難であり^４、ＰＴＣＬの３０～５０％は、現在の免疫表現型及び分子マーカーを用いて、分類不可能であり、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）として分類される^３。ＡＬＫ（＋）ＡＬＣＬ（ｃｏ－ＰＩ，Ｄｒ．Ｓｔｅｖｅ Ｍｏｒｒｉｓによって特性決定されたもの）^５及びＤＵＳＰ２２再配列を有するＡＬＫ（－）ＡＬＣＬを除き、ＰＴＣＬを有する患者は、ＣＨＯＰ様化学療法又はより集中的なレジメンにより、予後不良である^{４、６、７}。実際、５年無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、過去２０年間にわたって２０～２５％しか残っていない^８～１２。しかしながら、特定の患者群を標的とした新たな療法が試験され始め、いくつかは目覚ましい結果を示した（表２を参照されたい）^{１３～１６}。したがって、正確なＰＴＣＬ分類は、治療試験及び診療所における患者のための最良の治療を選択する際の両方に不可欠である^１７（例えば、Ｃｅｌｇｅｎｅ及びＳｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓからのサポートの手紙を参照されたい）。

【0093】

（表２）サブタイプによる応答を有する新規治療剤の第ＩＩ相試験（参考文献番号１３から適合させたもの）。

【0094】

ＰＴＣＬ診断の改善には、新しいアプローチが必要である：本願発明者らは、広範な遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）研究を行い、ＰＴＣＬの主要なサブタイプを分類することができる強固な分子シグネチャを定義した^{１０～１２}。本願発明者らはまた、いくつかのＰＴＣＬ－ＮＯＳを代わりに別個のエンティティに再分類することができた（ＡＩＴＬとして１５％、ＡＬＣＬとして１０％、及びγδ－ＰＴＣＬとして９％）。重要なことに、本願発明者らはまた、豊富な異なるシグナル伝達経路及び異なる予後を示す、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ内の２つの新しい主要なサブグループを特定した。更に、本願発明者らは、ＡＩＴＬ患者の生存期間を予測する発現シグネチャを特定した^{１０、１１、１８}。

【0095】

Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ^１９、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ^{２０、２１}、及び定量的ヌクレアーゼ保護アッセイ（ｑＮＰＡ；ＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）^２２を含むＦＦＰＥ標本についてのＬＬＭＰＰによって試験されるいくつかのプラットフォームの中で、ＦＤＡが認可したＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムは、標本の取り扱い、酵素反応の必要性の欠如、及びｍＲＮＡ発現の直接定量化に関して優れており、同時に高い精度及び感度も提供した^２３。注目すべきことに、ＬＬＭＰＰは、本明細書に記載されるものと同様のアプローチを利用して、ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームでのＤＬＢＣＬ分類のためのＬｙｍｐｈ２Ｃｘ発現ベースのアッセイを確立した^{２０、２１}。このアッセイは、その後、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによって独占的に認可され、現在、インビトロ診断（ＩＶＤ）コンパニオン診断（ＣＤｘ）試験として、Ｃｅｌｇｅｎｅと協力して開発中であり（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇに対して、事前に、また、開発及び規制のマイルストーン、及び商業的支払いで４５００万ドルまでの価値がある）、ＤＬＢＣＬを有する患者のための治療としてのレナリドミドの開発を支援した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍ／ｃｏｍｐａｎｙ／ｃｏｒｐ＿ｐｒｅｓｓ＿ｒｅｌｅａｓｅ？ｉｄ＝１１６）。

【0096】

革新
このアプローチは、現在定義されているＰＴＣＬサブタイプ並びに以前に認識可能ではなかった新しいエンティティの診断のより高い精度及び正確さを提供する、高含有量であり、定量的であり、再現可能な分子アッセイの作成によるＰＴＣＬの診断、予後判定及び管理のための診療を変えるものであろう。

【0097】

本願発明者らは、研究診断シグネチャ及び予後シグネチャを、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に適用可能なプラットフォームに変換し、初期にＣＬＩＡ研究所設定において、後にＩＶＤキットとしてシグネチャを検証し、広範な臨床的使用を可能にすることを提案する。

【0098】

臨床試験における新規剤は、異なるＰＴＣＬサブタイプにおける応答率の差を示すため（例えば、表２を参照されたい）、標準化され、検証されたアッセイを使用して、実験的試行において分子シグネチャを評価することが重要である。本明細書で開発される分子アッセイは、Ｌｙｍｐｈ２Ｃｘアッセイが、ＤＬＢＣＬの個別化療法を導くのに役立つように、ＰＴＣＬのための精密医療の実施をはるかに容易にするだろう^{２０、２３}。

【0099】

要約すると、本願発明者らは、日常的に入手可能な試料において臨床的に関連するＰＴＣＬサブタイプを信頼性高く特定し、最適な個別化治療を可能にし、正確な患者層別化による新規剤の試験を容易にする分子診断／予後アッセイを開発し、検証する。

【0100】

Ｂ．予備研究
Ｂ．１．アッセイ開発のための標本コホート： 本願発明者らは、病理学的データ及び臨床データを有する１，０００を超えるＦＦＰＥ症例^４及び３００を超える新鮮な凍結（ＦＦ）アーカイブＰＴＣＬ組織へのアクセスを有する^{１０～１２}。本願発明者らの元々のＧＥＰ研究に使用されたＦＦ試料に対応するＦＦＰＥブロックは、本明細書において実施される初期アッセイの精緻化及び最適化のために利用される。本願発明者らは、この第Ｉ相の提案の一部として実施される初期の検証試験のために、また、その後の第ＩＩ相試験の間に、複数の欧州及びアジアの共同研究者（サポートのバイオス／レター（ｂｉｏｓ／ｌｅｔｔｅｒｓ）を参照されたい）から必要に応じて追加の遡及的に収集されたＰＴＣＬ試料を得る。これらの組織及びデータリソースは、前例のないものであり、最先端の技術及び洗練されたバイオインフォマティクス分析と組み合わせて、本願発明者らがシグネチャを更に最適化し、臨床適用のためのＰＴＣＬアッセイを検証することを可能にする。

【0101】

Ｂ．２．ＰＴＣＬの強固な診断及び予後シグネチャ： ＰＴＣＬアッセイの学術的態様の開発中に、Ｄｒｓ．Ｃｈａｎ及びＩｑｂａｌ、並びに拡張されたＬＬＭＰＰ研究者は、ＨＧ Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２（Ｕ１３３）マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））を使用して、１６０個の新鮮な凍結ＰＴＣＬ組織生検に対する遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）を完了した^{１１、１２}。次いで、これらの知見を、はるかに大きな一連の症例（ｎ＝３７２）を使用して精緻化した^１０。図１は、ＰＴＣＬの主要なクラスの特徴的な遺伝子発現プロファイルを示す。この研究は、（ａ）標準化された操作手順を使用するいくつかの施設からの新鮮な凍結組織のＧＥＰ分析に基づく診断アルゴリズムの成功した性能、（ｂ）複雑なエンティティにおけるサブグループ分類に、段階的なバイナリモデルアルゴリズムを使用することができること、（ｃ）診断の正確さを著しく損なうことなく、サブグループ分類子における遺伝子の数を実質的に減少させることができること（例えば、ＡＩＴＬについての２００を超える遺伝子から２２個の遺伝子まで）^１０、並びに（ｄ）潜在的な治療標的を含む異なる発がん経路が、これらの様々な分子ＰＴＣＬエンティティにおいて特定することができることを明確に示した。

【0102】

いくつかの追加の注目すべき知見には、以下のものが含まれていた。（ｉ）ＡＬＫ（－）ＡＬＣＬは、別個のエンティティであり（後にゲノムデータ及び変異データの両方によって独立してサポートされた知見である）^{２４～２７}、ＰＴＣＬ－ＮＯＳの１１％を、このエンティティとして再分類することができ、これは抗ＣＤ３０療法であるブレンツキシマブベドチンに対して非常に応答性である（表２）。（ｉｉ）ＥＮＫＴＬは、ＮＫ及びγδ－Ｔ細胞サブタイプへと細分することができ^{１０、１２}、ＰＴＣＬ－ＮＯＳの約９％を、γδ－ＰＴＣＬ（活性化ＳＴＡＴ５Ｂ変異及びＪＡＫ阻害剤に対する感度を含有するサブタイプ^２８）として再分類することができる^１０。同様に重要なことに、ＡｕｒｏｒａキナーゼＡ又はＮＯＴＣＨ１阻害のいずれかが、ＮＫ－リンパ腫細胞株において顕著な細胞傷害性を誘導することが示された^１２。（ｉｉｉ）ＡＩＴＬ予後は、腫瘍微小環境（すなわち、Ｂ細胞、樹状細胞、及び単球細胞含有量）に非常に依存し、最も好ましいシグネチャを有する患者四分位数は、５５％の５年全生存期間（ＯＳ）を有していたが、最も好ましくない四分位数のＯＳは、わずか１５％であった^{１０、１１}。

【0103】

Ｂ．３．ＰＴＣＬ－ＮＯＳ内の異なるサブグループの特定： ＰＴＣＬ－ＮＯＳは、現在の組織病理学的方法で診断されたＰＴＣＬの最大の部分であり^４、現在、転写因子ＧＡＴＡ３（約３３％）又はＴＢＸ２１（約４９％）のいずれかの高発現、及びそれらの標的遺伝子の多く^１０によって特徴付けられる２つの主要な分子サブタイプに分けることができる（図２Ａ）。ＧＡＴＡ３の高発現を有する症例は、より不良な臨床転帰を示す（図２Ｂ）^１０。

【0104】

Ｂ．４．変異分析は分子分類を交差検証する。９０を超えるＰＴＣＬ症例の本願発明者らの変異分析は、（ＰＴＣＬ－ＮＯＳから）ＧＥＰ分類又は再分類されたＡＩＴＬにおけるＩＤＨ２^Ｒ１７２変異の排他的な存在^{２９、３０}、並びにＣＤ２８及びＲＨＯＡ^Ｇ１７Ｖ変異の優先的な発生を示した^３１。対照的に、ＪＡＫ１及びＳＴＡＴ３変異は、ＡＬＫ（－）ＡＬＣＬにおいてより優勢であり^２６、ＳＴＡＴ５Ｂ変異は、γδ－ＰＴＣＬにおいて頻繁である^２８。これらの観察は、分子分類の妥当性を裏付けるものであり、これらの変異は、分子分類子の性能を評価するための独立したマーカーを提供する。

【0105】

Ｂ．５．ＦＦＰＥ組織におけるＧＥＰシグネチャ： ＦＦＰＥ組織は、ＧＥＰアッセイに十分な品質のＲＮＡを産生しない可能性があるという懸念が生じている。本願発明者らは、発現アレイを用いてＦＦＰＥ組織から得られたＧＥＰシグネチャが、ＤＬＢＣＬを強固に下位分類することができることを示した^１９。加えて、本願発明者らは、２つの非アレイプラットフォームである定量的ヌクレアーゼ保護アッセイ（ＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）^{２２、３２}及びｎＣｏｕｎｔｅｒ技術^{２０、２３、３３}（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を評価し、アーカイブＤＬＢＣＬ ＦＦＰＥ標本においてシグネチャを測定する実現可能性を示した。更に、産業ｃｏ－ＰＩであるＤｒ．ＭｏｒｒｉｓとＢｒｉａｎ Ｚ．Ｒｉｎｇ，ＰｈＤは、現在の提案における主要な産業生物情報学者であり、ＲＮＡ－ｓｅｑを用いてトリプルネガティブ乳がんＦＦＰＥ標本のＧＥＰを行い、それぞれが臨床管理に関連する６個の分子ＴＮＢＣサブタイプを特定する市販のＩｎｓｉｇｈｔ ＴＮＢＣｔｙｐｅ（商標）１０１遺伝子アッセイを開発した^３４。

【0106】

Ｂ．６．遺伝子シグネチャは、より小さいパネルへと精緻化することができる： Ｄｒｓ．Ｃｈａｎ，Ｉｑｂａｌ及び共同研究者らは、彼らの以前のアレイ研究から、ＰＴＣＬ診断及び予後の最も強力な予測子として３４５個の遺伝子を選定した^{１０～１２}。ここで、本願発明者らは、この遺伝子リストを更に精緻化して、より小さな遺伝子数を有する分類子を構築する。図３は、１５～２０個のより小さなパネルを使用して、２つのＰＴＣＬサブタイプを区別する際にエラー率に有意な変化がないことを示す計算を示す。

【0107】

Ｂ．７．ＦＦＰＥ組織をプロファイリングするためのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓプラットフォーム： 本願発明者らは、ＦＦ標本由来のシグネチャを、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒシステム：「Ｌｙｍｐｈ２Ｃｘ」シグネチャを使用して、ＤＬＢＣＬ分類のためのＦＦＰＥ組織に対して１５遺伝子セットまで減少させることができ^{２０、２３}（図４Ａ）、このアッセイを複数の研究所で高い再現性で実施することができたことを示した（図４Ｂ）。Ｌｙｍｐｈ２Ｃｘアッセイは、近年、ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬについてのＲ－ＣＨＯＰ＋レナリドミドを試験する現在の第ＩＩＩ相のＲＯＢＵＳＴ試験（Ｃｅｌｇｅｎｅ；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＩＤ：ＮＣＴ０２２８５０６２）において、ＦＤＡ評価のためのＣＤｘとして選択した。Ｄｒｓ．Ｃｈａｎ，Ｉｑｂａｌ及びそのＬＬＭＰＰ同僚によるＬｙｍｐｈ２Ｃｘの開発は、標準化され、検証された臨床診断及び予後シグネチャの作成を確実にするために、本明細書で提案されるアッセイのために複製される。成功の可能性は、本願発明者らの分子診断コンサルティング会社であるＩｎｓｉｇｈｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（以下に記載されるように、目的２ａにおいて行われる検証研究に参加する）とともに、企業パートナーであるＨｅａｌｔｈＣｈａｒｔ ＬＬＣにおけるコア能力及び強みを活用することによって、更に増強される。

【0108】

Ｃ．アプローチ／特定の目的
技術用語／統計的考察に関する注記： 本文全体で、転写産物は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３アレイでは「プローブセット」、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームでは「コードセット」と称される。「訓練セット」は、Ｕ１３３アレイで分析されたＦＦ標本からの対応するＧＥＰデータが利用可能である症例から構成される。「検証セット」は、ロックダウンされたアルゴリズムが評価される、非重複症例から構成される。これらのセットに含まれる症例の最終的な数、並びにこのプロジェクトにおける全ての他の統計計画及び分析は、１９９３年以来、薬学及び生物工学部門において広範に研究されてきた生物統計会社であるＷｕ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｉｎｃ．によって行われる（ｗｗｗ．ｗｕｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ．ｃｏｍ；レターを参照されたい）。

【0109】

目的１： 低減された転写産物のセットを特定し、既存の「学術的な」診断及び予後ＰＴＣＬシグネチャを複製することができる新しいモデルを作製すること。
概要。 この第Ｉ相のＳＴＴＲ提案の包括的な目標は、発現アレイにより分析された新鮮な凍結標本を使用して開発された学術的なＰＴＣＬ診断／予後ＧＥＰシグネチャを、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームにより分析されたＦＦＰＥ標本に適用可能な最適化されたロックダウンシグネチャに移行させることである。現在のシグネチャ^１０は、必要とされるものよりも大きく、臨床アッセイ開発にとって非実用的かつ非経済的であろう。したがって、本願発明者らの初期の研究（目的１）は、ＤＬＢＣＬについてのＬｙｍｐｈ２Ｃｘアッセイを開発するために成功裏に使用された同じ線形モデル方法論を使用して、診断セットを可能な限り最小の遺伝子に減少させる^２０。しかしながら、これに加えて、本願発明者らは、最小限の遺伝子を使用して強固なモデルを作成する際の成功を確実にするのを助けるために、相補的な手法（例えば、本願発明者らが以前に使用したような重心ベースのモデル）を探索する^３４。

【0110】

成果物： 最適化された商業的に適用可能なＰＴＣＬ分類モデルの導出のために使用される、低減された遺伝子セットの作成。

【0111】

目的１ａ： 各ＰＴＣＬエンティティの最適な区別のために必要とされる低減された転写産物のセットを特定する。
ＦＦＰＥ標本についての分析前考察： 本願発明者らは、同じ症例からのＦＦＰＥ組織（ｎ＝８８）を分析するために、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇコードセットを使用して得られたデータに対して、ＤＬＢＣＬについてＵ１３３アレイを使用して特定された６６７個の診断及び予後遺伝子の性能を以前に比較した。図５Ａは、これらの転写産物におけるコードセット対プローブセットの間の相関を示す。ほとんどの遺伝子は、０．７５の相関中央値と非常によく相関しているが、いくつかは、非常に不十分にしか機能しない。本願発明者らは、このＤＬＢＣＬ遺伝子セット及び本願発明者らの学術的なＰＴＣＬシグネチャの両方に存在する４０個の遺伝子の相関を具体的に調べ、この２つのプラットフォーム間で０．７６の相関を観察した（図５Ｂ）。本願発明者らは、本願発明者らのＰＴＣＬシグネチャにおける残りの遺伝子についても同様の相関が当てはまると予想し、バイナリモデルにおける各サブタイプの区別には、わずか約１５～２０個の遺伝子で十分であると仮定すると（図３）、本願発明者らのマイクロアレイ研究^{１０～１２}において特定された３４５個の遺伝子からの十分な数の転写産物を得て、遺伝子数が著しく減少したモデルを構築するはずである。

【0112】

パワー計算： これらの研究は、アレイを使用して以前に特性決定された対応するＦＦ試料からのデータと比較して、ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームでのＦＦＰＥ標本からのＲＮＡにおけるコードセットの性能を決定することのみを求めるため、目的１ａについてのマッチしたＦＦ及びＦＦＰＥ ＰＴＣＬ症例の必要数は、比較的少ない。本願発明者らは、標本とプラットフォームタイプとの間の相関が０．８０である性能の良い転写産物の相関を、９５％の確率で０．６８～０．８８の間に拘束し、また、相関が０．４である性能の悪い転写産物の相関を０．１５５～０．６０に拘束して、性能の良い転写産物と性能の悪い転写産物とを容易に区別できるようにするためには、６０個の試料で十分であると予想する。この試料サイズはまた、典型的な試料について、不適切な調整に起因するエラーが、ＦＦ標本モデリングとＦＦＰＥ標本モデリングとの間のノイズに起因するエラーの５分の１未満であるように、適切なスケーリング及び付加的な調整を可能にする。

【0113】

目的１ｂ： ＰＴＣＬエンティティを区別するためにＦＦＰＥ組織に適用することができる診断及び予後シグネチャを精緻化する。
ＦＦＰＥ組織／ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイ内の遺伝子シグネチャ予測子の反復発生のための方法： 本願発明者らの元々のＦＦ ＲＮＡ ＰＴＣＬシグネチャは、試料をＰＴＣＬ分子サブタイプに分割するカットポイントのセットとともに、各遺伝子の区別能に基づく個々の重みを有する発現値の線形結合から構成されるモデルスコアからなる^{１０～１２}。本願発明者らは、Ｕ１３３アレイで分析されたＦＦ ＰＴＣＬ標本及びＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームで分析されたマッチしたＦＦＰＥ組織を用いて「訓練セット」を生成する。この訓練セットは、ＦＦ組織ベースのモデルにおいて使用される任意の所与のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットと、ＦＦＰＥ標本での対応するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇコードセットとの間の相関を正確に推定する。この分析は、プラットフォームの変化が、発現推定値にノイズを導入する程度を示し、したがって、特定の遺伝子がモデルにおける予測能力の減少を示すために重みを下げられるべき程度、又は完全に排除されるべき程度を示す。第２に、重み付けされたスコアが生成されると、訓練セットを使用して、適切なカットポイントを決定するために最終モデルスコアのセンタリング及びダイナミックレンジの変化を推定する。これにより、ＦＦＰＥ試料／ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイでのモデルの平均及びＳＤを推定し、その結果を、マッチした試料についてのＦＦ標本／アレイモデルの平均及びＳＤと比較することによって、容易に達成されるはずである。これらの目標を満たすために、必要とされる訓練セットは、１２０症例であると推定される（図６）。

【0114】

ＰＴＣＬサブタイプ分類及び予後判定のためのアルゴリズム開発： サブタイプ分類のための詳細な方法論は、Ｂ細胞リンパ腫^{２０、２３、３５～４０}及びＰＴＣＬ^{１０～１２}について本願発明者らのチームによって以前に記載されている。簡単に説明すると、現在の研究では、一連の４個のバイナリ予測子を使用して、ＰＴＣＬ－ＮＯＳから４個の個々のサブタイプＡＩＴＬ、ＡＬＣＬ、ＡＴＬＬ及びＥＮＫＴＬを区別する。これらの予測子についての結果に基づいて、本願発明者らは、標本を６個の可能なカテゴリー（ＡＩＴＬ、ＡＬＣＬ、ＡＴＬＬ、ＥＮＫＴＬ、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ、又は不確定）のうちの１つに分類する（表３）。「不確定」試料は、十分に定義されたＰＴＣＬサブタイプのうちの２つ以上の特徴を有し、本願発明者らの以前の研究に基づいて^{１０～１２}、不確定症例は、試料の非常に小さな割合（１～２％）であるはずである。次いで、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例は、ＧＡＴＡ３高サブグループ及びＴＢＸ２１高サブグループへと分離され、ＥＮＫＴＬはまた、ＮＫ及びガンマ／デルタＴ細胞系統へと細分される。以前に定義されたＡＩＴＬ予後サブグループ^{１０、１１}は、診断シグネチャについて記載された方法論を用いて変換される。本願発明者らは、十分に機能するコードセットを特定し、モデルスコアを最良に再現するようにそれぞれの重みを調整して、患者を、最大の生存期間区別を示すサブグループに分割する。予後モデルが強固であることを確実にするために、本願発明者らは、０．０５未満の片側ｐ値で生存期間を区別することを示すことができる場合にのみ、ロックダウン及び検証に進む。

【0115】

（表３）サブタイプ分析のための段階的バイナリ分類スキーム。

【0116】

－試料サイズの考察： プロジェクトのこの段階のために、本願発明者らは、追加の新しい試料を収集して、対になったＦＦ及びＦＦＰＥ標本の総数を１２０症例まで上げることを提案する（２０例のＡＩＴＬ、１０例のＡＬＫ（＋）ＡＬＣＬ、１０例のＡＬＫ（－）ＡＬＣＬ、２０例のＡＴＬＬ、２０例のＥＮＫＴＬ、２０例のＧＡＴＡ３ ＰＴＣＬ及び２０例のＴＢＸ２１ ＰＴＣＬ）。この患者数を用いて、本願発明者らは、十分に測定された遺伝子（ｒ＞０．８）のプラットフォームの変化によって導入されるノイズを、９５％の信頼度でその真の値の１２％以内まで推定することができるはずである。本願発明者らのＦＦＰＥモデルスコアをそれらの凍結対応物に対して９５％の信頼度で正規化するために必要なスケーリング及び平均シフトの推定値は、推定モデル閾値とそれらの最適化値との間の差が、プラットフォームの変化に起因する個々の試料の予測ノイズの２０％未満であることを示唆する。更に、各バイナリ区別についての各サブタイプの２０個の試料はまた、推定モデルカットポイントとそれらの最適化値との間の差が、９５％の信頼度で、個々の試料の変動性のわずか１２％であるように、本願発明者らのモデルスコアをそれらの凍結対応物に対して正規化することを可能にする。シミュレーションは、この程度の不正確さによって、９５％の信頼度で、無限数の試料に基づいて同様のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇモデルが使用される場合に、それらがどのように予測されるかとは異なって予測される試料が最大４％であることを示唆する。

【0117】

潜在的な問題及び代替的なアプローチ： 再分類： 不一致を説明することができるＦＦ組織とＦＦＰＥ組織との間の形態学的差異について、不一致の症例を再検査する^{１０、２０、２３}。分子分類は、特定のサブタイプにおいて固有であるか、又は濃縮された体細胞変異及び／又はＤＮＡコピー数変化の分析によって、交差検証される^{１０～１２、２４～３１}。臨床転帰は、予後シグネチャの検証として役立つ。分類モデル： 考慮されるであろう多くの追加の分類モデルが存在する（例えば、類似の発現に基づく市販の診断アッセイを開発するのに成功しつつ、本願発明者らが以前に使用した重心に基づくモデル^{３４、４１}）。しかしながら、本願発明者らのＰＴＣＬシグネチャは、線形モデルを使用して、ＦＦ組織において試験され、検証されており、本願発明者らは、他の研究^{１８、４２}において示されているように、ＦＦＰＥ組織における同じモデルの強固性を予測する。モデルにおける遺伝子の数： 現在の「学術的」シグネチャは、３４５個の遺伝子を含有する。本願発明者らの予備的なバイオインフォマティクス研究は、シグネチャ全体について合計５０～６０個、又はおそらくそれより少ない転写産物の減少が容易に可能であることを示唆する。注目すべきことに、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームは、１回の試験で最大８００個の転写産物をアッセイすることができる。

【0118】

特定の目的２： ＦＦＰＥ標本の分析のためのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームに対する精緻化された診断及び予後ＰＴＣＬ遺伝子シグネチャセットの適用可能性を確認する。
概要： 目的２の包括的な目標は、精緻化された診断及び予後シグネチャが、強固であり、再現可能であり、第ＩＩ相の商業的開発への移行の準備ができていることを示すことである。ＬＬＭＰＰコンソーシアムは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームで試行される凍結材料の試料交換中の低い研究所間変動性を示しており（図７）、このことは、ＳＯＰを開発し、試験場所全体にわたって再現性のある結果を得る能力を示している。ここで、本願発明者らは、アッセイを商業的に前進させるために、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームでＦＦＰＥ標本を用いて本願発明者らのＰＴＣＬシグネチャの再現性を確認するために同様の研究を行う。

【0119】

成果物： 訓練コホート及び研究所間の研究結果に基づく最適化されたＰＴＣＬシグネチャのロックダウン（目的２ａ）、第ＩＩ相の開発への前進のためのロックダウンシグネチャの適合性を確認する検証コホート結果（目的２ｂ）。

【0120】

目的２ａ： ロックダウン診断及び予後ＰＴＣＬ遺伝子シグネチャを作成し、研究所間の再現性を評価する。
本願発明者らは、訓練セットと同じサブタイプ分布を有する一連の非重複のＰＴＣＬ症例（約１００）を使用して、本願発明者らの精緻化された診断及び予後シグネチャを評価する。代表的なＦＦＰＥブロックからの連続スクロールは、本発明者らの訓練セット研究（目的１ｂ）から作成された作業「ロックダウン」標準操作手順（ＳＯＰ）を使用して、盲検で評価される。アッセイは、ＵＮＭＣ（Ｄｒ．Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｇｒｅｉｎｅｒ）、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ（Ｄｒ．Ｒａｊｕ Ｐｉｌｌａｉ）、及びコンサルティング商業ＣＬＩＡラボとともにＨｅａｌｔｈＣｈａｒｔ、Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌａｂｓ（Ｄｒｓ．Ｓｔｅｖｅ Ｍｏｒｒｉｓ及びＤａｖｅ Ｈｏｕｔ－ｗｗｗ．ｉｎｓｉｇｈｔｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｃｏｍ；レターを参照されたい）の診断研究所で行われる。

【0121】

統計的考察： 本願発明者らは、ＬＬＭＰＰによって行われた初期の研究^{１０～１２}の一部であった試料の一部を再分析する（しかし、目的１において研究された症例とは別個である）。比較的少数の標本（約１００）では、所望の統計的基準でＦＦＰＥモデルの全ての単一の性能パラメータを決定的に確認することはできない（第Ｉ相の資金供給に固有の制限に起因する）。むしろ、本願発明者らは、ＦＦ／アレイアッセイからＦＦＰＥ／ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームへのＡＢＣ ＤＬＢＣＬ対ＧＣＢ ＤＬＢＣＬサブタイプ決定シグネチャの最適化及び移行に関与する以前のＬＬＭＰＰ研究^{２０、２１}を模倣しようと試み、サブタイプ決定の全体的な忠実性を確認するために、訓練及び検証セットのために適度な数を使用した（それぞれ５１症例及び６８症例）。このアプローチは、Ｌｙｍｐｈ２Ｃｘアッセイのフォローアップ研究において成功したことがわかっている。コールは、ゴールドスタンダードＦＦ／アレイアッセイと比較して、４９回の反復生検の９６％及び８３個のＦＦＰＥ標本の１００％で一致しており、決定的なことに、誤分類（ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬをＧＣＢ－ＤＬＢＣＬに、又はその逆）は観察されなかった^２１。ＰＴＣＬにおけるＦＦＰＥ組織モデルの予測能力を推定するために、本願発明者らは、交差検証ステップの一部としてモデルにおける全ての重み及び閾値の選択を含む、一つ抜き交差検証を用いてその性能を評価する。

【0122】

分析計画： ＦＦ／マイクロアレイ診断は、ゴールドスタンダードであると考えられ、正確さ、精度、感度及び特異性は、アレイ結果との比較に基づく。アッセイ結果は、Ｄｒｓ．Ｇｅｏｒｇｅ Ｗｒｉｇｈｔ（ＮＣＩ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ）及びＢｒｉａｎ Ｒｉｎｇ（ＨｅａｌｔｈＣｈａｒｔ ＬＬＣ）に提供され、そこで、症例の分類を独立して決定する。再現性分析のために、本願発明者らは、３つの研究所の場所からの最終的予測分類、及びカットポイントからのそれらの距離に対するモデルスコア間の一致を比較して、予測再現性のより正確な推定値を提供する。本願発明者らの以前の経験に基づいて、本願発明者らは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇでのモデルが、場所間で非常に再現可能であり、一般に０．９９を超える相関を有することを見出している^{２０、２１}。したがって、本願発明者らは、高い目標値を設定し、１００個の試料が、各々のモデルについて９９％のパワーでこの基準を達成するのに十分であるはずと推定する。

【0123】

目的２ｂ： 第ＩＩ相のアッセイ移行のための「ロックされた」診断／予後シグネチャを検証する。
目的２ｂの目標は、ロックされたアッセイが、アーカイブ材料を使用して複数の施設の研究所で臨床的に容易に適用され得ることを示すこと、また、必要な場合、アッセイの最終的なトラブルシューティングを提供して、第ＩＩ相の開発のためのその準備を確実にすることである。アーカイブＦＦＰＥ ＰＴＣＬ標本のコホート（約１００～１２０症例、各々の診断及び予後サブタイプの２０症例を含むため）が、世界中の研究所から選択される（治験調整医師からのレターを参照されたい）。これらの症例では、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイ研究が実施されていないため、直接的な比較は実行可能ではなく、ロックされた態様及びＳＯＰを使用して、複数の研究所にわたる再現性、信頼性、及び問題解決（必要な場合）の運用面の方により重点が置かれる。加えて、将来の通常の検査のためにＳＯＰを精緻化するために留意される、異なる研究所全体での品質管理測定値に重点が置かれる。

【0124】

実施例２
アッセイを開発し、最適化するための適切な標本を得るための計画
本願発明者らは、本願発明者らの以前のＧＥＰ研究から約７０のＰＴＣＬ症例を集めた^１０。代表的な腫瘍切片を切断し、代表的かつ適切な組織の存在を確認し、ＰＴＣＬ症例の診断を検証する必要があるため、予備選択は重要なステップである。これらの症例は、Ｄｒｓ．Ｃｈａｎ及びＡｍａｄｏｒによって組織された病理検査を受けている。これらは、コンセンサス初期診断及び分子シグネチャ診断を伴う症例を含んでいた。これらのうち、本願発明者らは、ＡＩＴＬ（ｎ＝１８）、ＡＬＣＬ（ｎ＝１５）、ＥＮＫＴＬ（ｎ＝４）、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ（ｎ＝３０）のコンセンサス診断を有している。ＧＡＴＡ３サブグループとＴＢＸ２１サブグループとの間を区別するのに役立ち得る染色を含む、特性決定又は下位分類のために現在使用されている追加の免疫染色を、症例に対して行った（図８）。本願発明者らは、ＰＴＣＬ－ＮＯＳをＧＡＴＡ３及びＴＢＸ２１サブグループへと下位分類することができる、免疫組織化学に基づくアルゴリズムを開発した。本願発明者らは、このＩＨＣアルゴリズムを精緻化し続け、開発された場合に遺伝子シグネチャ診断を用いて、その症例を交差検証する。

【0125】

ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織からのＤＮＡ／ＲＮＡの単離の最適化：
組織標本は、一般にホルマリン（ホルムアルデヒド）による固定化によって調製されるため、生体分子の架橋及び付加物を生じさせ、ハイブリダイゼーション手順を伴う分子分析からのシグナルを減少させる。一般に、市販のキット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ ＦＦＰＥキット）を使用するＦＦＰＴＥ組織からのＤＮＡ／ＲＮＡの単離は、Ｔｒｉｓ緩衝液中、高温（＞８０℃）で数時間加熱することを伴い、これによりＲＮＡ及びＤＮＡを損傷する。本願発明者らは、以前の研究^２６において、ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイのためのＤＮＡ／ＲＮＡの単離のためにこれらのキットを日常的に使用しており、良好な成功を収めている。本願発明者らは、本願発明者らの遡及的シリーズからのいくつかのＦＦＰＥ症例が１０年を超えると予想しているため、本願発明者らの分析アッセイは、ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイのための反応混合物内の全ＲＮＡ含有量の少なくとも４０％が２００ｂｐ長を超えることを必要とする。したがって、本願発明者らは、より低い温度及びより短いインキュベーション時間でＲＮＡ及びＤＮＡからホルムアルデヒド付加物を除去する水溶性二官能性触媒（アントラニレート及びホスファニレート）法を試験した（Ｋａｒｍａｋｅｒ ｅｔ．ａｌ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ．２０１５；７（９）：７５２－７５８）、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｅｌｌｄａｔａｓｃｉ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＲＮＡｓｔｏｒｍ／で入手可能。このプロトコルの有用性を試験するために、本願発明者らは、１９８８～２０１７（非必須症例）の代表的なＦＦＰＥブロックの１０μｍスクロール（２×）を使用し、Ｑｉａｇｅｎ ＦＦＰＥ単離キットと比較した。これらのキットからの総ＲＮＡ収量は、これらの症例において同様の範囲であったが、より古いブロックは、比較的より低い収量を示した（図９）。

【0126】

ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ－２２００を使用したＲＮＡ分子のサイズ分布の分析は、Ｓｔｒｏｍキットが、より古い（１０年を超える）症例で、Ｑｉａｇｅｎ Ｋｉｔよりも比較的良好な（より大きいサイズの）ＲＮＡ分子を生じたことを示し、一方で、２０１４年のＦＦＰＥブロックからの症例では、より穏やかな改善があった（図１０Ａ及び１０Ｂ）。したがって、優先事項は、初期段階におけるｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイについて、２０１０年以降の症例を使用することである。結論として、Ｑｉａｇｅｎキットからの単離手順は、最近の症例（５年未満）に対しては実行可能な方法であり得るが、一方、１０年を超える症例が、特にＥＮＫＴＬのような稀なエンティティにおいて最適化のために必要とされる場合、Ｓｔｏｒｍキット単離が、ＲＮＡ／ＤＮＡの単離のための有効な代替法であり得る。

【0127】

複数分析物アッセイのための、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＰｒｏｂｅセットからのＧＥＰデータの、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇからのｎＣｏｕｎｔｅｒコードセットへの変換：
本願発明者らの主な目的は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ技術を使用して、新鮮な凍結組織からのＧＥＰシグネチャをＦＦＰＥ組織に変換することである。コードセット設計は高価であり、バイオインフォマティクス的に困難であるため、本願発明者らは、本願発明者らの以前の研究から本願発明者らの遺伝子発現シグネチャを精緻化し、各診断シグネチャにおいて、より多くの遺伝子を数で少なくとも１０％追加し、したがって、コードセットの一部が、診断シグネチャの正確さを変化させることなくＦＦＰＥ ＲＮＡにおいて最適に機能しない場合にはシグネチャの精緻化に利用可能な十分な数の遺伝子を有している（図１１）。コードセットは、ｎＤｅｓｉｇｎ（商標）Ｇａｔｅｗａｙを使用して、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇからのバイオインフォマティクス担当者とともに、遺伝子リストの守秘義務についての契約ＵＮｅＭＥｄの下で設計された。この設計は、ＮＫとガンマデルタサブグループ（ｎ＝５０）とを区別するために、ハウスキーピング遺伝子（ｎ＝５０）、ＡＩＴＬ診断（ｎ＝５０）、予後（ｎ＝４９）、及びＰＴＣＬ－ＮＯＳサブグループ（ｎ＝５０）コードセット、並びにＡＬＣＬを分類するためのコードセット（ＡＬＫ＋ＡＬＣＬ対ＡＬＫ－ＡＬＣＬを含む、ｎ＝１００）を含む合計４１６のコードセットを含む。本願発明者らは、これらの遺伝子についてのこれらのコードセットを受け取り、数週間でＦＦＰＥ症例に対するアッセイを開始する。本願発明者らは、いくつかのＲＮＡは、固定化後の研究に不適切であり、特に、より少ないシグネチャが使用される場合には、除外される必要があると予想する。したがって、本願発明者らは、ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームを使用してシグナル強度を比較するために、１０個の新鮮な凍結ＲＮＡ及び対応するＦＦＰＥＴに対して初期アッセイを行い、０．８以上の相関を有する転写産物のみを更なる評価のために選択する。

【0128】

本明細書に開示される主題は、本発明の特徴、利益、及び利点の更なる説明によって、並びに本明細書に添付され、参照により本明細書に組み込まれる補遺に記載されるような具体的であるが非限定的な例によって更に説明される。

【0129】

本明細書及び補遺に言及されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0130】

本明細書に開示される主題の様々な詳細は、本明細書に開示される主題の範囲から逸脱することなく変更され得ることが理解されるであろう。更に、前述の説明は、例示のみを目的としており、限定を目的としていない。

【0131】

参考文献
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【0132】

実施例３
日常的な臨床診療における末梢Ｔ細胞リンパ腫エンティティの正確な診断のための遺伝子発現シグネチャ
要約
目的
末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、多数の診断及び治療の課題を有する不均一な臨床病理学的エンティティを含む。本願発明者らは、以前に、一般的なＰＴＣＬエンティティを区別する強固なトランスクリプトームシグネチャを定義し、２つの新規な生物学的及び予後ＰＴＣＬ－ＮＯＳサブタイプ（ＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１及びＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３）を特定した。本願発明者らは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）組織を使用して、遺伝子発現に基づく下位分類を統合して、ＰＴＣＬ診断における正確さ及び精度を改善することを目的とした。

【0133】

方法
本願発明者らは、遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）データを有する十分に特性決定されたＰＴＣＬ訓練コホート（ｎ＝１０５）を集め、ＨＧ－Ｕ１３３ｐｌｕｓ２プラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ）で新鮮な凍結（ＦＦ）組織を使用して診断シグネチャを導出し、その後、デジタルＧＥＰプラットフォーム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ，Ｉｎｃ）において、マッチしたＦＦＰＥ組織を使用して検証した。統計的フィルタリングアプローチを適用してトランスクリプトームシグネチャを精緻化し、次いで、厳密な病理検査及び補助アッセイにより別のＰＴＣＬコホート（ｎ＝１４０）において検証した。

【0134】

結果
訓練コホートでは、ＦＦＰＥ組織における精緻化されたトランスクリプトーム分類子は、ＦＦにより導出された診断モデルと比較して、ＰＴＣＬ下位分類について高い感度（８０％を超える）、特異性（９５％を超える）、及び正確さ（９４％を超える）を示し、３つの独立した研究所間で高い再現性を示した。検証コホートでは、転写分類子は、症例の８５％（ｎ＝１１９）において、３名の専門血液病理学者によって与えられた病理診断と一致し、６％（ｎ＝８）で分子シグネチャとの「ボーダーラインの関連」を示し、８％（ｎ＝１１）で不一致であった。分類子は、臨床所見によって検証された２つの症例において、病理診断を改善した。不一致であった１１症例のうち、４例は、全体的なトランスクリプトーム及び形態学的特徴に基づく病理診断を超える改善を提供し得る分子分類を有していた。分子下位分類は、ウイルス病因因子及び転座パートナーを含むＰＴＣＬサブタイプの包括的な分子特性決定を提供した。

【0135】

結論
本願発明者らは、従来の病理診断よりも高い精度及び均一性を有する臨床診療への転換を容易にする、ＰＴＣＬ下位分類のための新規トランスクリプトームアプローチを開発した。

【0136】

内容の概要
主要な目的
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を使用して、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）の分類のためのデジタル遺伝子発現シグネチャの役割を評価すること、及び日常的な臨床診療に適用可能な非常に正確かつ再現可能な診断アッセイを開発すること。

【0137】

生成された知識
転写産物のデジタル定量化を使用して、本願発明者らは、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ内の２つの新規な生物学的及び診断サブグループを含む、ＷＨＯ分類に従って共通のＰＴＣＬサブタイプを区別することができる、強固なトランスクリプトームシグネチャを定義した。本願発明者らは、分類アルゴリズムを精緻化し、独立したＰＴＣＬコホートにおいて検証された強固な診断アッセイのためのアッセイ手順を標準化した。このアッセイは、施設間で再現性があり、高い分類精度を示した。

【0138】

関連性
デジタルトランスクリプトームアッセイは、ＦＦＰＥ組織からｍＲＮＡを使用してＰＴＣＬの強固な分子分類をもたらし、これにより、従来の病理よりも正確かつ均一な診断を提供する臨床試験への変換を容易にする。この分子アッセイはまた、調査研究及び臨床試験のための症例のより良好な層別化を容易にする。

【0139】

序論
末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の約１０～１５％に相当し^１、専門血液病理学者であっても、診断には多くの課題がある^２～４。Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）の分類は、２５を超える異なるＰＴＣＬのサブタイプを定義しており、地理的変動を伴う最も頻繁なエンティティとして、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ種（ＡＴＬＬ）、及び鼻型の結節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＣＬ）を有する^５。しかしながら、ＰＴＣＬの３０％は、ＷＨＯ分類における特定のエンティティのいずれにも分類することができず、これらは、ＰＴＣＬ非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）として分類される^６、７。腫瘍を定義する異常、例えば、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ）におけるＡＬＫ遺伝子を伴う転座^８、ＡＴＬＬにおけるヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ－１）感染^９、ＥＮＫＴＣＬにおけるＥＢＶ陽性、及びＡＩＴＬにおけるＩＤＨ２^Ｒ１７２変異は、ＰＴＣＬにおいて一般的に稀である。ＰＴＣＬは、一般に、現在の療法では予後不良であり^２、より集中的なレジメンが優れていることは証明されていない^１０。しかしながら、新規な標的化療法が現在試験されており、いくつかの注目すべき結果が得られている^{１１、１２}。

【0140】

多くの機能的サブセット及び機能的可塑性を有するＴ細胞生物学の複雑さに起因して、Ｂ細胞リンパ腫と比較して、ＰＴＣＬの下位分類は、より困難である。遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）は、新規の生物学的サブタイプの描写及びいくつかのＢ－ＮＨＬにおける発がん経路の特定に役立ってきた^{１３～１８}。ＰＴＣＬにおける同様のアプローチは、共通のＰＴＣＬエンティティについての強固な分子分類子をもたらし、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ内の２つの生物学的及び診断サブグループ（ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３及びＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１）を特定した^{１９～２１}。しかしながら、これらの研究は、トランスクリプトームワイドアレイを用いて新鮮な凍結（ＦＦ）試料に対して行われたものであり、したがって、その適用は、日常的な臨床診療に限定されている^{２２、２３}。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料は、日常的な診断において広く使用されているが、ホルマリン固定は、ＲＮＡ及びＤＮＡのフラグメント化、架橋、及び化学修飾を引き起こす^２４。したがって、本願発明者らの非常に正確なＲＮＡベースのＰＴＣＬ診断シグネチャをＦＦＰＥ組織に効果的に変換することは困難であるが、広範な臨床適用を有するアッセイを実施するために必須である^２５。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫^{２６～２８}におけるように、ＲＮＡのデジタル定量化を使用して、本願発明者らは、新鮮な凍結ＲＮＡからの本願発明者らのＰＴＣＬ診断シグネチャを、主要なＰＴＣＬエンティティにわたる正確な診断のための単一の技術的プラットフォームに統合した^{１９～２１}。本願発明者らは、「訓練」ＰＴＣＬコホート（ｎ＝１０５）を使用し、「独立」ＰＴＣＬコホート（ｎ＝１４０）において、及びＰＴＣＬ下位分類のための単一プラットフォーム上で調査された十分に特性決定された最大数の症例の中で検証した。いくつかのウイルス転写産物を加えて診断の正確さを改善し、本願発明者らは、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３及びＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１の新規な分子生物学的サブタイプを含むＰＴＣＬエンティティを区別する際に高い感度、特異性、及び正確さを達成した診断アルゴリズムを報告する^{２０、２１}。

【0141】

材料及び方法
患者情報
本願発明者らは、複数の施設からの２４９の診断ＰＴＣＬ症例を含んでおり、これを、不良なＲＮＡ品質を有する４症例を除外した後、マッチしたＦＦ及びＦＦＰＥ試料を有する以前に生成されたＧＥＰ^{１９～２１}を有する訓練コホート（１０５症例）と、以前に分析されていない検証コホート（１４０症例）とに分けた（表４及び５並びに図１２Ａ）。症例の基本的な臨床的特徴及び病理学的特徴を表６に示す。ＰＴＣＬ症例の包含基準及び除外基準は、補足のセクションにおいて詳述される。

【0142】

（表４）訓練コホートにおけるＰＴＣＬ診断アルゴリズムの性能。

【0143】

（表５）検証コホートにおけるＰＴＣＬ診断アルゴリズムの性能。

【0144】

（表６）訓練及び検証コホート症例並びに除外症例における特徴。

ＡＩＴＬ、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、ＡＬＣＬ、未分化大細胞リンパ腫、ＡＴＬＬ、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、ＥＮＫＴＣＬ、結節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ、末梢Ｔ細胞リンパ腫非特定型、ＰＴＣＬ－ＴＦＨ、ＴＦＨ表現型を伴う末梢Ｔ細胞リンパ腫、ＲＨ、反応性過形成、ＮＡ：利用可能ではない。

【0145】

ＰＴＣＬコホートの組織病理学／免疫形態学的特徴
ＰＴＣＬ症例は、現在のＷＨＯ分類に従って中心的に検査され、診断された^６。検証コホートは、３名の血液病理学者（ＣＡ、ＤＤＷ、ＷＣＣ）によって、必要に応じて包括的な免疫染色パネル及びＴＣＲｇ遺伝子再配列分析を用いて徹底的に再評価された。診断に関して全員一致の同意があった場合に、コンセンサス診断に達した。

【0146】

ＰＴＣＬ下位分類のためのＲＮＡ抽出及びデジタル遺伝子発現
ＲＮＡ抽出プロトコル、品質管理手段、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）アッセイ、データ処理、交差検証、及び再現性評価についての詳細は、補足セクション及び図１２Ａにある。データ分析及び正規化は、プロトコルが必要に応じて患者試料を処理するのに適するように、バッチではなく個別に試料を処理するように設計された。クラス予測は、各試料についての最終分類コールのために組み合わされた一連のバイナリ比較に基づいていた（図１２Ａ及び図１７）。詳細な材料及び方法が本明細書で提供される。

【0147】

生存分析
生存データを、Ｒにおける生存期間（survival）、サーブマイナー（survminer）、及びコインパッケージ（coin package）を使用して分析し、本明細書に詳述した。

【0148】

結果
「訓練」コホート及び「検証」コホートにおける患者の特徴
訓練コホート（ｎ＝１０５）は、ＦＦにおいて以前に生成したＧＥＰデータ^{１９～２１}及びマッチしたＦＦＰＥ組織を有しており、これを使用してｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームのための分類子遺伝子を選択した。新鮮した凍結トランスクリプトームデータを有していないＰＴＣＬ「検証」コホート（ｎ＝１４０）は、現在のＷＨＯ診断基準^６を使用して、３名の専門血液病理学者によって厳密に診断された（図１２Ａ並びに表４及び５）。注目すべきことに、ＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例は、結節性ＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨ症例の除外についてＴ_ＦＨマーカーを用いて評価され、その後、最近公開されたＩＨＣアルゴリズム^２９を用いてＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３及びＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１に下位分類された。

【0149】

訓練コホート及び検証コホートの臨床病理学的特徴を表６に要約している。検証コホートと訓練コホートとの間で性別、年齢、及びＯＳに有意差はなかった（図１２Ｃ）。生存者についてのフォローアップの中央値は、利用可能な生存データを有する患者について３．５年（０．０１～２４年の範囲）であった。ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ症例は、公開された研究と一致して、他のエンティティよりも優れた転帰を示した（図１２Ｄ～Ｅ）^２、２１。

【0150】

ＦＦＰＥ組織のためのトランスクリプトームシグネチャの開発
ＦＦＰＥ組織ブロックを、十分な腫瘍組織の存在に基づいて選択し、ＲＮＡ品質を補足Ｓ１に示されるように評価した。２つのプラットフォーム（ＨＧ－Ｕ１３３ｐｌｕｓ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ）対ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームの間で評価されたトランスクリプトームシグネチャは、シグネチャ特異的遺伝子の大部分（約６０％）において高い相関（相関係数ｒ＞０．４）を明らかにした（図１９Ａ～Ｂ）。本願発明者らは、再帰的フィルタリング分析を行い、（３つの転写産物を除く）ピアソン相関を使用して相関係数≦０．４を有する転写産物を除外して、ＰＴＣＬサブタイプ当たり１１～２０個の診断用転写産物及び１６個のハウスキーピング遺伝子を生成した（図１９Ｃ～Ｄ）。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）でのこれらの良好に機能する転写産物の使用は、訓練コホート（ｎ＝１０５）における新鮮な凍結ＲＮＡ（ＨＧ－Ｕ１３３ｐｌｕｓ ２）又はマッチしたＦＦＰＥ ＲＮＡ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標），Ｉｎｃ）のいずれにおいても、分類の正確さ、感度、特異性に影響を及ぼさなかった。ＦＦＰＥ試料を用いた分子下位分類は、様々なＰＴＣＬサブタイプにわたって、５％未満のエラー率でＦＦゴールドスタンダードと非常に同等であった。

【0151】

精緻化されたシグネチャを使用するＰＴＣＬ分類の正確さ及び研究所間の再現性
低減された転写産物シグネチャは、ＨＧ－Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２プラットフォームデータにおける分類の正確さを保持した^{１９～２１}（図１９Ｃ～Ｄ）。したがって、低減された診断転写産物は、訓練セットにおけるｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）アッセイとのその後の比較のための「ゴールドスタンダード」とみなされた（図１２Ｂ、左パネル）。ＦＦＰＥ訓練コホートの分類は、症例の９０％（１０５例のうちの９５例）においてｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）で反復発生された（表４、５及び図２４）。本願発明者らは、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３とＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１との間の予後の差を観察したが（図１９Ｆ）、試料の数が少なすぎて統計的有意差に達しなかった。本願発明者らは、診断転写産物のより大きなパネルからより小さなパネルに移行したため、異なるＰＴＣＬサブタイプからの７症例を、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームで、元々のより大きなパネルに対して低減された転写産物セットを用いて再評価した。それらは、一致した結果を示し、同様の診断の正確さを維持していた（図２０）。再現性を評価するために２つの追加のＣＬＩＡ場所でアッセイを行った場合、本願発明者らは、研究した２４のＰＴＣＬ症例及び観察者間の全てについて、元々の場所での場合と高度に一致した結果及び同じ分類を観察した（図２０）。

【0152】

異なるＰＴＣＬエンティティ及び検証コホートにわたる精緻化された診断アルゴリズム
診断性能を評価するために、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームを用いて得られた分子分類を、独立した検証コホート（ｎ＝１４０）におけるコンセンサス病理診断と比較した。このコホートは、訓練コホートと同様の臨床転帰及びＰＴＣＬサブタイプの分布を有していた（図１２Ａ、Ｃ）。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームを用いて得られた分類は、専門の病理学者によって行われた診断と非常に類似しており、検証症例において９１％の全体的な一致（１４０例のうち１２７例、９５％信頼区間（ＣＩ）０．８５～０．９５）があり、以下に示されるように困難なＰＴＣＬ症例の分類を精緻化した（表４、５及び図２５；図１２Ｂ、右パネル；図２１）。

【0153】

ＡＩＴＬ： 診断シグネチャの平均発現は、汎Ｔ－_ＦＨ遺伝子発現シグネチャと有意に相関していた（すなわち、６個の転写産物はＷＨＯにおいてＴ_ＦＨマーカーとして定義された^６）（図１３Ａ～Ｂ）。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によって訓練コホート及び検証コホートにおいてＡＩＴＬとして分子的に分類された症例は、ＡＩＴＬと一般的に関連する免疫形態学的特徴を示した。以前の研究と一致して、ＣＤ２０の高発現は、より良好なＯＳと関連付けられ^{２０、２１、３０}、これは、免疫組織科学を使用して検証された（図１３Ｃ）。ＡＩＴＬ変異スペクトル（すなわち、ＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＲＨＯＡ^ＧＩ７Ｖ、及びＩＤＨ２^Ｒ１７２）は、利用可能な配列決定データを有する症例の８９％において見られた（図１３Ｄ）。

【0154】

ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームを使用して、ＡＩＴＬは、訓練コホートにおいて８３％の一致（２０／２４）及び検証コホートにおいて７４％（１４／１９）で分類されたが、一方で、残りの症例（訓練において３例、検証において５例）は、ＡＩＴＬとＰＴＣＬ－ＮＯＳとの間の「ボーダーラインモデルスコア」を示した（表４及び５；図１３Ｅ；図２１）。これらの症例は、「閾値又はカットポイント」に基づくＡＩＴＬ分子診断を誤った。再検査により、これらの症例は、古典的ＡＩＴＬ免疫形態学的特徴を有することが確認され、変異分析は、図１３Ｄに示されるように、その診断を裏付けており、ＴＥＴ２、ＲＨＯＡ^Ｇ１７Ｖ、及びＩＤＨ２^Ｒ１７２を含む古典的ＡＩＴＬ変異スペクトルを有していた。これらの症例は、他のＰＴＣＬよりも比較的高いレベルで、ＡＩＴＬよりもわずかに低いＡＩＴＬ診断シグネチャ発現、及びＴ_ＦＨシグネチャのより高い発現を示した。（図１３Ａ、Ｆ）。予想通り、３つの濾胞性Ｔ細胞リンパ腫症例は、全てＡＩＴＬとして分類された。２つのＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例は、ＡＩＴＬとして分子的に分類された。これらの症例は、Ｔ_ＦＨマーカーＢＣＬ６及びＩＣＯＳの限局性陽性を示したが（図１３Ｇ～Ｉ）、結節性ＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨの基準は満たされなかった。これらの２つの症例（図１３Ｆ）は、大部分の他のＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例よりも高いＡＩＴＬシグネチャ遺伝子及びＴ_ＦＨｍＲＮＡシグネチャを明確に発現したが、ＡＩＴＬに一般的に見られる遺伝子における変異（ＴＥＴ２、ＩＤＨ２^Ｒ１７２、ＲＨＯＡ^Ｇ１７Ｖ、ＤＮＭＴ３Ａ）は存在しなかった。これらの２つの症例は、実施された免疫染色によって分類されなかったＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨを表し得る。

【0155】

ＡＬＣＬサブタイプ： ＡＬＣＬ対他のＰＴＣＬの初期分析は、検証コホートにおいて８３％（３０／３６、９５％ＣＩ：０．６７～０．９４）の一致を示し、これは、精緻化されたシグネチャを使用して、訓練コホートと同等であった（２６／２９、９０％、９５％ＣＩ：０．７３～０．９８）（図１４Ａ）。検証コホート（表４及び５、図１４Ｂ）は、ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬにおいて９０％（１８／２０）の一致を示し、ＡＬＫ－ ＡＬＣＬにおいて７５％（１２／１６）の一致を示した。興味深いことに、２つのＡＬＫ－ ＡＬＣＬは、高いＡＬＫ＋ ＡＬＣＬシグネチャのために、ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬとして分類されたが、ＡＬＫ ｍＲＮＡ発現は低く（図１４Ｃ）、ＩＨＣは、ＡＬＫタンパク質発現を検出しなかった。予想通り、ＡＬＫ状態によってＡＬＣＬに分類された症例は、ＡＬＫ陽性症例がより良好なＯＳを有することを示した（図１４Ｄ）。注目すべきことに、ＩＨＣによる強いＣＤ３０陽性を有する症例を含むＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例のいずれも、ＡＬＣＬに誤って分類されなかった。しかしながら、４つのＡＬＣＬ（２つのＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ及び２つのＡＬＫ－ ＡＬＣＬ）は、比較的低いＡＬＣＬシグネチャ発現を示したが、２つのＡＬＫ＋ ＡＬＣＬは、高いＡＬＫシグネチャを有していた（図１４Ｃ）。低いＡＬＣＬシグネチャを有する２つのＡＬＫ－ ＡＬＣＬ症例は、ＣＤ３０ ｍＲＮＡを発現せず、これらの症例を分類できなかったことは、不十分なＲＮＡ品質又は低い腫瘍含有量に起因し得る（図１４Ｅ）。これらの知見は、低い診断シグネチャを有する時折現れる症例が、注意深く診断されるべきであることを示唆する。

【0156】

ＡＴＬＬ： ＡＴＬＬ分子シグネチャは、訓練コホートにおいてＡＴＬＬ症例の１００％を検出し（７／７、９５％ＣＩ：０．５９～１）、検証コホート症例の８３％を検出した（１０／１２、９５％ＣＩ：０．５２～０．９８）。（図１５Ａ）。不一致を示す２症例は、ＡＴＬＬ診断シグネチャの境界的な発現を有していたが、両方ともＨＴＬＶ１ ｍＲＮＡ発現について陽性であることが確認された（すなわち、ｑＰＣＲによってＨＢＺ）が、一方では、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によって測定されたＨＢＺの発現は、他のＡＴＬＬよりも低かった（図１５Ｂ～Ｃ）。２つのＨＴＬＶ１転写産物（ＨＺＢ及びＴＡＸ１）のうち、ＨＺＢは、ＴＡＸと比較して、ＡＴＬＬ症例においてより高いレベルで一貫して発現され、ＡＴＬＬシグネチャとの正の相関を示し（図１５Ｄ～Ｅ）、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定されたＨＢＺ発現との有意な相関を示した（図１５Ｆ）。興味深いことに、検証コホートからの２つのＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例は、ＡＴＬＬとして分子的に分類された（図１５Ａ）。ＨＺＢ特異的ｑＰＣＲを用いたこれらの症例の再評価により、ＨＢＺの発現が確認され（図１５Ｅ）、その後の臨床チャートの検査により、ＨＴＬＶ１についての血清学的陽性及びＡＴＬＬと適合する臨床所見が示されたが、これは最初の診断時には不明であった。形態学的に、これらの症例は、ＣＤ４陽性単形性Ｔ細胞リンパ腫からなり、適切な病歴、血液検査、及び血清学的検査が存在しない場合には、ＰＴＣＬ－ＮＯＳと誤って診断された^７（図１５Ｂ）。したがって、これら２つの症例は、ＡＴＬＬとして再分類された。

【0157】

ＥＮＫＴＣＬ： ＥＮＫＴＣＬ分子分類子は、訓練コホートにおいてＥＮＫＴＣＬ症例の９０％（９／１０）、検証コホートにおいて９５％（２１／２２）を特定することができた（表４及び５、図１５Ｆ～Ｇ）。症例のサブセットは、他の症例と比較してＣＤ３γ及びＣＤ３δの発現が上昇しており（図１５Ｈ）、Ｔ系統に由来し得る。２つの症例は、現在のＷＨＯ分類に従って「原発性ＥＢＶ陽性結節性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫」と診断された。これらの症例は、ＥＮＫＴＣＬに似ているが、主に結節性所見を有し、両方とも分子アッセイによってＥＮＫＴＣＬとして分類された（図２２）。１つの分子的に分類されたＥＮＴＫＣＬ症例は、ＡＬＣＬ及びＥＮＫＴＣＬシグネチャの両方を固有に示したが、ＥＢＶ転写産物の強い発現を示した（図１４Ｉ）。

【0158】

２つの新規なＰＴＣＬ－ＮＯＳサブタイプ（ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３及びＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１）の精緻化及び検証。
訓練コホートにおけるＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例のうち、本願発明者らは、低減された数の転写産物（ｎ＝１９）を用いて、８７％の一致を有する２つの新規分子サブグループ（すなわち、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３又はＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１）を分離した。検証における残りのＰＴＣＬ－ＮＯＳグループのうち、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームを用いて、４０％（２１／５２）がＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３サブタイプとして、５２％（２７／５２）がＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１サブタイプとして分類された（表４及び５、図１６Ａ）。この分類は、本願発明者らのＩＨＣアルゴリズム分類との良好な一致を示した（全体的な一致：８０％）。本願発明者らのトランスクリプトームシグネチャ分類を更に検証するために、本願発明者らは、これらの２つのグループにおける配列決定データを比較した。本願発明者らは、ＴＥＴ２変異などの遺伝子変化がＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１サブタイプにおいて頻繁であったのに対して、ＴＰ５３変異は、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３サブグループにおいて濃縮されたことを観察し、これは、本願発明者らの以前の知見^３１と一致していた（図１６Ｂ）。

【0159】

本願発明者らの以前の観察^{２１、２９}と一致して、細胞傷害性転写産物を発現する症例は、ＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１サブタイプにおいて有意に濃縮され（図１６Ｃ）、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３サブタイプよりもＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１サブタイプにおいて、より頻繁な細胞傷害性免疫表現型によって検証された（５２％対１６％、ｐ＝０．０１３、図１６Ｃ）。平均細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞シグネチャと汎Ｂ細胞ＣＤ２０転写産物との間に逆相関が認められた（図１６Ｄ）。本願発明者らの以前の観察^２９と一致して、ＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１症例は、細胞傷害性表現型にかかわらず、濃縮された炎症性バックグラウンドを頻繁に有していた（図１６Ｅ）。ＰＴＣＬ－ＮＯＳの臨床転帰は、限られた数の症例においてのみ利用可能であったため、組み合わせコホートは、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３対ＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１として分類された症例に関連するＯＳが劣っている傾向があった（ＯＳ中央値：０．５７対１．４年、図１６Ｆ）。

【0160】

検証コホートから除外されたＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨ症例の評価
ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームを使用してＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨ（ｎ＝１２）症例を分析し、２例（１７％）のみがＡＩＴＬ分子シグネチャとの有意な関連を示したが、４例はＡＩＴＬとＰＴＣＬ－ＮＯＳとの間のボーダーラインスコアを有し、６例はＰＴＣＬ－ＮＯＳとの明確な関連を示し、ＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１症例（ｎ＝３）又はＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３（ｎ＝３）に類似していた。本願発明者らがＴ_ＦＨシグネチャを具体的に調べた場合、高いＡＩＴＬシグネチャを有するＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨ症例はまた、その残りよりも高いＴ_ＦＨシグネチャを示した（図２３Ａ～Ｂ）。本願発明者らはまた、１０症例の反応性過形成を含み、それらのうちのいずれも、アッセイに含まれるＰＴＣＬのサブタイプについての診断シグネチャの発現を示さなかった。

【0161】

考察
ＰＴＣＬの診断は、リンパ腫の中で最も困難なものの１つであり、より多くの場合、結論が出ないか、一貫性がないか、又は不正確な診断が得られる^{１９～２１、３２、３３}。近年、新規の治療アプローチが、ＣＤ３０＋ＰＴＣＬ、特にＡＬＣＬに対するブレンツキシマブ－ベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ－Ｖｅｄｏｔｉｎ、ＢＶ）^３４、ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬにおけるクリゾチニブ^{３５、３６}、ＡＴＬＬにおけるモガムリズマブ^３７、ＡＩＴＬ又はＴ_ＦＨ－ＰＴＣＬにおけるＨＤＡＣｉ及び脱メチル化剤^３８、並びにおそらくＩＤＨ２変異体ＡＩＴＬにおけるエナシデニブ^３９を含む、ＰＴＣＬのサブグループにおいて著しい利益を示した。したがって、正確な診断は、患者の治療及び新薬の臨床試験において重要な場合がある^{４０～４２}。本願発明者らは、ＰＴＣＬに対して広範なＧＥＰ研究を行い、ＲＮＡベースの分子診断シグネチャ及び生存の予測因子を構築し、重要な発がん機構を詳細に説明した^{１９～２１}。これらの知見のいくつかは、改訂された２０１６年のＷＨＯ分類に含まれている^６。この分子情報を、臨床用途に適したプラットフォームに変換するために^２５、本願発明者らは、このデジタル定量化技術がＦＦＰＥ材料に典型的な分解ＲＮＡに対してより耐性があるため、新鮮な凍結組織からのＧＥＰデータとよく相関するｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームを使用して、ＰＴＣＬにおけるＦＦＰＥ組織からのＲＮＡを特定するための系統的分析を行った。加えて、本願発明者らは、訓練セットにおいて以前のＧＥＰ由来の診断と同等に機能した最小数の転写産物を有する診断トランスクリプトームシグネチャを開発した^{１３～１５}。分析前評価では、より古い標本のＲＮＡ収量及び質（すなわち、ＤＶ_２００＞５０％）は、ＲＮＡｓｔｏｒｍ（商標）キットを使用して改善された。しかしながら、最近取得されたＦＦＰＥ組織では、他の単離方法も良好な品質のＲＮＡを提供し得る。加えて、このアッセイは、制限されたＲＮＡ量（最小必要量２００ｎｇ）を用いて行うことができ、これは通常、組織のサイズに応じて、数枚の未染色スライドから得られる。しかしながら、本願発明者らは、コア針生検から抽出されたＲＮＡを使用しても十分な分類を有することができ、これは研究試料の約１０％に相当した。３つのＣＬＩＡ認定研究所にわたる変動性及び再現性の研究所間比較もまた、非常によく相関した。

【0162】

本願発明者らは、検証のための症例に関するＧＥＰデータを有していないため、本願発明者らは、広範なＩＨＣ研究及び厳密な検査の後に確実な病理診断を有する症例のみを含めた。所見は、訓練セットの所見と非常に類似しており（図１２）、高い感度、特異性、及び正確さを維持していた。いくつかの場合では、シグネチャスコアは、カットオフポイントのすぐ外側にあり、これらは、「ボーダーライン」の症例と考えられた。分子アッセイが遡及的分析で正確な診断を行った少数の症例は、心強い。しかしながら、明白な不一致も観察された。このことは、部分的には、腫瘍含有量及び腫瘍の不均一性などの技術的理由に起因し得るが、いくつかは、最近報告されたＡＬＫ陽性様ＡＬＣＬを表し得るいくつかのＡＬＫ－ＡＬＣＬ症例における強いＡＬＫシグネチャなどの、まだ知られていない生物学に関連し得る^４３。同様に、２つのＰＴＣＬ－ＮＯＳは、ＡＩＴＬ及びＴ_ＦＨトランスクリプトミクスシグネチャとの有意な関連を示し、これは、検査すると、Ｔ_ＦＨマーカー（ＢＣＬ６、ＩＣＯＳ）の限局性発現を示した。強いＴ_ＦＨ発現シグネチャは、これらの症例がＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨにより類似しているが、少なくとも２つのＴ_ＦＨマーカーの強い発現の現在の基準を満たさなかったことを示し得る。これらの場合、分子アッセイは、ＰＴＣＬ－ＮＯＳとＡＩＴＬとの間の複雑かつ重複する生物学、及びそれらの境界があまり明確でないことを明らかにした。本願発明者らはまた、ＥＢＶ及びＨＴＬＶ１転写産物の添加が、それぞれＥＮＴＫＣＬ及びＡＴＬＬにおける分子アッセイの診断性能を増強することを見出した。このアプローチの１つの重要な寄与は、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３及びＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１症例の強固な定義であり、これらは、最近の遺伝的知見によって裏付けられるように、異なる生物学及び予後を有する^３１。ＩＨＣパネルを使用してＧＥＰ分類をシミュレーションすることは可能であるが、染色を最適化し、解釈することは困難である可能性があり、これは、施設間の実質的な変動性を引き起こす可能性がある。ここで報告されたアッセイは、研究所間で非常に再現性があり、したがって、大きな利点を示す。

【0163】

診断シグネチャを最初に定義したＧＥＰ研究は、ＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨの暫定エンティティの定義が正式に本研究に含まれなかった以前に実施された。しかしながら、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）アッセイで探索された１２のＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨ症例は、より高い平均ＡＩＴＬ及びＴ_ＦＨシグネチャを示し、個々のシグネチャは、Ｄｏｂａｙらによる研究^４４と同様に、ＡＩＴＬ又はＰＴＣＬサブタイプの分子シグネチャと重複した。これらの探索的研究は、ＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨが現在定義されているような単一のエンティティである可能性は低く、それがいかに最良に特性決定されるべきかを決定するために更なる評価を必要とすることを示した。同様に、本願発明者らの以前のＧＥＰ研究^{２０、２１}は、ＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１サブグループ内の細胞傷害性ＰＴＣＬバリアントを示した。その観察と一致して、本願発明者らは、ＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１における症例の２５％が細胞傷害性シグネチャを有することを見出し、ＩＨＣによってＣＤ８＋表現型との関連を検証した。研究された少数の症例に起因して、このグループの症例についての強固なシグネチャを開発するために更なる調査が必要である。

【0164】

要約すると、本願発明者らは、ＰＴＣＬ診断シグネチャを臨床的に適用可能なアッセイに変換するためのアプローチを記載し、これは、本願発明者らが、ＰＴＣＬの診断的に困難な分野における一般的及び学術的な病理学者にとって有用なツールであると想定する。加えて、本願発明者らは、それが調査研究のための症例のより良好な定義を容易にし、臨床試験のためのより均一なコホートを確実にすることができると考える。ＰＴＣＬ分類は、発展しつつある領域であり、基礎となる生物学及び利用可能な技術の我々の理解が向上するにつれて、分類を臨床的に関連性のあるものにするために修正が行われる。

【0165】

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２９．Ａｍａｄｏｒ Ｃ，Ｇｒｅｉｎｅｒ ＴＣ，Ｈｅａｖｉｃａｎ ＴＢ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ－ＮＯＳ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｂｌｏｏｄ．２０１９；１３４（２４）：２１５９－２１７０。
３０．Ａｄｖａｎｉ ＲＨ，Ａｎｓｅｌｌ ＳＭ，Ｌｅｃｈｏｗｉｃｚ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ（ＣＥＯＰ）Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｐｒａｌａｔｒｅｘａｔｅ（Ｐ）ａｓ ｆｒｏｎｔ ｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＰＴＣＬ）：ｆｉｎａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｔｒｉａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０１６；１７２（４）：５３５－５４４。
３１．Ｈｅａｖｉｃａｎ ＴＢ，Ｂｏｕｓｋａ Ａ，Ｙｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｒｉｖｅｒｓ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１９；１３３（１５）：１６６４－１６７６。
３２．Ｍａｕｒａ Ｆ，Ａｇｎｅｌｌｉ Ｌ，Ｌｅｏｎｇａｍｏｒｎｌｅｒｔ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｄａｔａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１９。
３３．Ｐｉｃｃａｌｕｇａ ＰＰ，Ｆｕｌｉｇｎｉ Ｆ，Ｄｅ Ｌｅｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｄａｌ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｃｃｕｒａｃｙ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１３；３１（２４）：３０１９－３０２５。
３４．Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｗｅｙｄｅｎ Ｃ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍ，Ｗｈｉｓｓｔｏｃｋ Ｊ，Ｐｒｉｎｃｅ ＨＭ．Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ ｉｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１９；１２（１）：５－１９。
３５．Ａｎｄｒａｏｓ Ｅ，Ｄｉｇｎａｃ Ｊ，Ｍｅｇｇｅｔｔｏ Ｆ．ＮＰＭ－ＡＬＫ：Ａ Ｄｒｉｖｅｒ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０２１；１３（１）。
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３７．Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ ＡＪ，Ｌｕｎｎｉｎｇ ＭＡ，Ｈｏｒｗｉｔｚ ＳＭ．Ｈｏｗ Ｉ ｔｒｅａｔ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（１７）：２６３６－２６４４。
３８．Ｌｏｐｅｚ ＡＴ，Ｂａｔｅｓ Ｓ，Ｇｅｓｋｉｎ Ｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＨＤＡＣ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１８；１９（６）：８０５－８１９。
３９．ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２２７３７３９。
４０．Ｉｓｈｉｄａ Ｔ，Ｊｏｈ Ｔ，Ｕｉｋｅ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ－ＣＣＲ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＫＷ－０７６１）ｆｏｒ ｒｅｌａｐｓｅｄ ａｄｕｌｔ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｌｙｍｐｈｏｍａ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２；３０（８）：８３７－８４２。
４１．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ＯＡ，Ｂｈａｇａｔ Ｇ，Ｇａｎａｐａｔｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｎｇｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇｍｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｆｒｏｍ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１４；２０（２０）：５２４０－５２５４。
４２．Ｉｑｂａｌ Ｊ，Ｗｉｌｃｏｘ Ｒ，Ｎａｕｓｈａｄ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：Ｈｏｗ ｃａｎ ｔｈｅｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｆｏｒｍ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ？Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．２０１６；３０（２）：８９－１００。
４３．Ｙｅｕｎｇ ＫＨＲＡ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｖ，Ｃｈｏｉ Ｗ，ｅｔ ａｌ．ＡＬＫ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ Ｌａｒｇｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ Ｅｎｃｏｍｐａｓｓ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎ ＡＬＫ－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｌｉｋｅ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ Ｆａｖｏｒａｂｌｅ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０２１；１３８ ２４０３。
４４．Ｄｏｂａｙ ＭＰ，Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ Ｆ，Ｍｉｓｓｉａｇｌｉａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｎｏｄａｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｏｆ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｏｒｉｇｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１７；１０２（４）：ｅ１４８－ｅ１５１。

【0166】

材料及び方法
患者情報
本願発明者らは、複数の施設からの２４９の診断ＰＴＣＬ症例を含め、これを、不良なＲＮＡ品質を有する４症例を除外した後、次いで、１０５症例の訓練コホート及び１４０症例の検証コホートに分けた（表４及び５／図１２Ａ）。２つのコホートの基本的な臨床的特徴及び病理学的特徴を表６に示す。訓練コホートは、ＨＧ－Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ１３－１５（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ；アクセッション番号ＧＳＥ１９０６９）でのＦＦ組織からのＲＮＡを使用して、以前のＧＥＰ研究^１～３において以前に評価された９１症例の「ブリッジングセット」を含んでおり、入手可能な対応するＦＦＰＥ試料を有していた。加えて、以前のＧＥＰ研究^１～３には含まれなかった利用可能なＨＧ－Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０データを有する９例の新規ＰＴＣＬ、及び確定診断を有する５例の十分に特性決定された古典的なＥＮＫＴＣＬ症例もまた、訓練セットに含まれていた。訓練コホートは、２４例のＡＩＴＬ、１４例のＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ、１５例のＡＬＫ－ ＡＬＣＬ、７例のＡＴＬＬ、１０例のＥＮＫＴＣＬ、及び３５例のＰＴＣＬ－ＮＯＳ（１５例のＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３及び２０例のＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１）からなっていた。これらを使用して、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォーム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ）でのＦＦＰＥにおいても、ＦＦ組織で診断的であると以前に特定されたどのＲＮＡ転写産物が良好に機能したかを特定した。

【0167】

別個の検証コホートは、ＧＥＰでは以前に分析されていないが、適切なＦＦＰＥ組織が利用可能な、独立した一連の１４０のＰＴＣＬ症例からなっていた。このセットは、１９例のＡＩＴＬ、２０例のＡＬＫ＋ ＡＬＣＬ、１６例のＡＬＫ－ ＡＬＣＬ、１２例のＡＴＬＬ、２２例のＥＮＫＴＣＬ、及び５１例のＰＴＣＬ－ＮＯＳを含んでいた。本願発明者らは、最初に検証のために１５２のＰＴＣＬ症例を集めたが、それらがＴ濾胞ヘルパー（Ｔ_ＦＨ）表現型を有するＰＴＣＬとして病理学的に再分類されたため、１２例をこのコホートから除外した。これらの１２例のＰＴＣＬ－Ｔ_ＦＨ症例及び１０例の追加の反応性リンパ節症を、比較のためにＮａｎｏＳｔｒｉｎｇベースのアッセイで分析した。研究プロトコルは、ＵＮＭＣ及びＣＯＨ－ＭＣ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認された。

【0168】

ＰＴＣＬコホートの形態学的特徴及び免疫表現型的特徴。
全ての症例は、現在のＷＨＯ分類^４に従って中心的に検査され、診断された。検証コホートにおける症例は、Ｔ細胞リンパ腫診断における専門知識を有する３名の血液病理学者（ＣＡ、ＤＷ、ＷＣＣ）によるコンセンサス会議において厳密な病理学的検査を受けた、ＦＦ ＧＥＰデータを有さない症例の新しいコホートからなっていた。診断に関して全員一致の同意があった場合に、コンセンサス診断に達した。病理学的評価は、必要に応じて、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＴＦＨマーカー（ＰＤ１、ＩＣＯＳ、ＣＤ１０、ＣＸＣＬ１３、及びＢＣＬ６）、ＣＤ４、ＣＤ８、細胞傷害性マーカー（ＴＩＡ１、グランザイムＢ、及びパーフォリン）、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、及びＥＢＥＲインサイチュハイブリダイゼーションを含むＢ細胞及びＴ細胞の免疫染色の一部又は全体のパネルを含んでいた。２つ以上のＴＦＨマーカーの強い発現を有するＰＴＣＬ－ＮＯＳの症例は、ＴＦＨ表現型を有する結節性ＰＴＣＬとして再分類された。ＰＴＣＬ－ＮＯＳ症例は、１名の血液病理学者（ＣＡ）によって、ＧＡＴＡ３、ＴＢＸ２１、ＣＣＲ４、及びＣＸＣＲ３に対する抗体を使用する最近公開されたＩＨＣアルゴリズムを使用して、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３及びＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１に下位分類された^５。４３例のＡＩＴＬ症例のうち、４０例は典型的なＡＩＴＬ形態を有したが、３例はトランスクリプトーム分析のためにＡＩＴＬとともにグループ化されたＴ－ＦＬであった。検証シリーズにおけるＡＴＬＬ症例は、ＡＴＬＬにおけるＨＴＬＶ－１ウイルスの存在について以前に確立された試験^{４、６、７}に従って、ＦＦＰＥ抽出されたＲＮＡに基づくｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｔａｑ ｍａｎプローブ）を使用して、ＨＺＢウイルス転写産物により陽性シグナル（ＣＴ値）を有さなければならない。検証コホートにおけるＥＮＫＴＣＬ症例は、ゲノムＤＮＡ中のＬＭＰ１／ＥＢＮＡ１の存在について、ＥＢＥＲインサイチュハイブリダイゼーション又はＰＣＲのいずれかを用いて確認した。３２例のＥＮＫＴＣＬ症例のうち、３０例は、鼻病変を有し、典型的なＥＮＫＴＣＬであり、２例は、主に結節性病変を有していたが、それ以外は鼻ＥＮＫＴＣＬ症例と同様の表現型特徴を有していた。これら２つの症例における鼻病変に関する詳細な情報は入手可能ではなかった。２つの症例は、現在のＷＨＯ分類における原発性結節性ＥＢＶ陽性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫を表し得るが、トランスクリプトーム分析のためにＥＮＫ／ＴＣＬとともにグループ分けされた。

【0169】

ＦＦＰＥ組織からのＲＮＡ抽出及びｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）システムを用いたデジタル遺伝子発現
厚さ１０～２０μｍのＦＦＰＥスクロールをブロックから１ｃｍ２の表面積に切断し、抽出まで－２０℃で保存した。ＦＦＰＥスクロールが利用できなかった少数の場合については、未染色スライドから組織を掻き取った。全ＲＮＡの脱パラフィン化及び抽出を、２つの市販のキットである（ａ）Ｑｉａｇｅｎ ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又は（ｂ）ＲＮＡＳｔｏｒｍＴＭ ＲＮＡ単離キット（Ｃｅｌｌ Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＤ５０１）^８を使用して、製造業者の指示に従って行った。ＲＮＡ品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔａｐｅ－Ｓｔａｔｉｏｎを使用して評価し、ＲＮＡ完全性分析（ＲＩＮ）値^９を使用して、また、ＲＮＡ断片サイズ＞２００塩基ＤＶ_２００ ^１０によって推定した。Ｑｕｂｉｔを使用してＲＮＡを定量し、２００ｎｇの全ＲＮＡ（ＤＶ２００：＞３５％）を、ハイブリダイゼーションのために使用し、より分解した試料のために、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ，Ｉｎｃの推奨（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０２１／０７／ＭＡＮ－１００５０－０５－Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ－４８ ＲＮＡ－ｆｒｏｍ－ＦＦＰＥ－Ｓａｍｐｌｅｓ．ｐｄｆ）に従って、追加のＲＮＡを使用した。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎで、６５℃で一晩（１６～１８時間）、全ＲＮＡをカスタムコードセット（以下参照）にハイブリダイズさせ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）デジタルアナライザー上で「高５０分解能」設定でＧＥＰデータを取得した。標準ＱＣ（ｎＳｏｌｖｅｒ（商標）分析ソフトウェア、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供されるような）を使用し、陽性スパイクイン対照の合計がそのカートリッジの総陽性スパイクインの幾何平均の０．３～３倍の範囲外である任意の試料にフラグを立てた。シグナルカウント値は、所与の試料についての各遺伝子についてのカウントを、その試料中のハウスキーピング遺伝子についてのカウントの幾何平均で割ることによって正規化した。次いで、正規化されたカウントをｌｏｇ２変換して、全てのその後の分析において利用される遺伝子シグナル値を得た。ハウスキーピング遺伝子の幾何平均が１０以下であった試料は、研究から除外した。

【0170】

ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰＴＣＬサブタイプ決定アッセイのためのコードセット設計
新鮮な凍結ＲＮＡに由来するＧＥＰを有するＰＴＣＬ症例（ｎ＝１０５）の訓練コホートを使用して、対応するＦＦＰＥ組織を使用するｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームのための分類子遺伝子を選択した。本願発明者らは、初期のＦＦ ＧＥＰデータ（ＨＧ－Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ）を再分析して、ＰＴＣＬサブタイプに特異的な２８７個の分類子転写産物、ＰＴＣＬにおいて一貫した発現を有する５０個のハウスキーピング遺伝子、Ｔ細胞分化に関連する余分な遺伝子セットを含む診断転写産物シグネチャを生成した。遺伝子は、（１）ＰＴＣＬサブタイプ（すなわち、ＡＩＴＬ、ＡＬＣＬ、ＥＮＫＴＣＬ、ＡＴＬＬ）のうちの１つ、（２）ＡＬＫ＋ ＡＬＣＬとＡＬＫ－ ＡＬＣＬとの間で差次的に発現される、又は（３）ＰＴＣＬ－ＮＯＳのＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１サブグループとＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３サブグループを区別するために、特徴的に差次的に発現される（正又は負のいずれか）ように選択された。５０個のハウスキーピング遺伝子を、ＦＦ ＧＥＰデータにおいてＰＴＣＬにわたって最も低い分散を有するものの中から選択した。したがって、これらの分類子転写産物は、分類のための最も有益かつ強固な要素であるように設計され、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）コードセットは、コードセット設計のための標準的なｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）化学を使用して、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇバイオインフォマティクスチームにより設計された。各々の捕捉された転写産物に対応するバーコードを撮像し、ハイブリダイゼーション後に計数し、したがって、各捕捉されたＲＮＡのデジタル定量化を提供した（遺伝子のカスタムコードセットに関する詳細は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｕｓｔｏｍ－ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／ｃｕｓｔｏｍ－ＣｏｄｅＳｅｔｓで見ることができる）。

【0171】

反復するコードセット計及び製造（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｉｎｃ）に関連するコストを最小限に抑えるために、本願発明者らは、ブリッジングコホートからの試料を使用して、診断マーカーの初期セットをキュレーションし、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームに基づいて最良の性能を示したＥＢＶ及びＨＴＬＶ－１からの９３個の遺伝子及び５個のサブタイプ特異的ウイルス転写産物のセットを定義した。以下の基準のセットを使用して、この評価を行った。（ａ）ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｌｏｇ２シグナル値とそれらの対応するＨＧ－Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０シグナル強度（ＳＩ）値との間の相関、（ｂ）ＰＴＣＬサブタイプ対他のＰＴＣＬサブタイプにおけるそれらの試料についての正規化されたｌｏｇ変換ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＳＩ値の間のＴ統計量、（ｃ）全ての試料についてのＰＴＣＬサブタイプ及び他のＰＴＣＬサブタイプにおける試料についてのＨＧ－Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０シグナル値の間のＴ統計量^１、並びに（ｄ）Ｉｑｂａｌ ｅｔ ａｌ．２０１４^１からのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇシグナル値とそのサブタイプについてのモデルスコアとの間の相関。このキュレーションされたリストが、各区別について正及び負の両方の関連遺伝子を含むように注意を払った。加えて、ハウスキーピング遺伝子は、１６まで低減し、ブリッジングコホートにおいて最も低い分散であった。本願発明者らはまた、Ｔ細胞リンパ腫生物学に重要であるとして文献から特定された４０個の他の遺伝子を加えた。これにより、最終的に１５３個の遺伝子コードセットが得られ、これを今後の全ての分析で使用した。

【0172】

訓練コホートにおける下位分類の予測
線形判別分析、ラッソ回帰、サポートベクターマシン、及びランダムフォレストを含む複数の予測方法を、いくつかの異なる予測アーキテクチャを利用する交差検証様式で訓練セットに適用した（データは示さず）。最良の交差検証された予測正確さを有する方法は、以下に記載され、図１２Ａ及び図１７に示されるように構造化された一連のバイナリ線形予測子に基づいていた。

【0173】

所与のクラス及び選択された遺伝子ｉの対について、以下：

を計算し、式中、μ_１ｉ及びμ_２ｉは、クラス１及びクラス２におけるその遺伝子の平均発現値を表し、σ_ｉ ^２は、プールされたグループ内分散推定値である。次に、各試料ｊについて、セット１とセット２との間の区別の重み付けされたスコアを以下：

のように計算し、式中、ｘｉｊは、試料ｊ上の遺伝子ｉについての正規化されたシグナル値であり、合計は、特定の区別のために選択された全ての遺伝子にわたる。

【0174】

次いで、本願発明者らは、このスコアとクラス１又はクラス２におけるメンバーシップとの間の関係に基づいてＲＯＣ曲線をプロットし、感度及び特異度の平均が最大化される点を特定した。この点より上のスコアを有する試料をクラス１と特定し、この点より下のスコアを有する試料をクラス２と特定した。この規則の例外は、ＡＩＴＬサブタイプ分類に対して行われ、ＡＩＴＬモデルスコアとＰＴＣＬ－ＮＯＳモデルスコアとの間に重複領域が存在した。この領域にスコアを有する試料については、その試料がＡＩＴＬであるかどうかは不確定であった。この領域を定義するために、本願発明者らは、感度＋２^＊特異性を最大化した下限カットポイント、及び特異性＋２^＊感度を最大化した上限カットポイントを考慮した。上限カットポイントより上の試料をＡＩＴＬと呼び、下限カットポイントより下の試料を非ＡＩＴＬと呼び、２つのカットポイントの間の試料をボーダーラインＡＩＴＬと呼んだ。

【0175】

個々の試料のサブタイプを予測するために、本願発明者らは、最初に６つの予測因子を実行し、これらのうちの４つを、ＰＴＣＬ－ＮＯＳを、以下の４つのカテゴリー（ＡＩＴＬ、ＡＬＣＬ、ＥＮＫＴＣＬ、又はＡＴＬＬ）のうちの１つの症例から区別するように訓練した。本願発明者らは、ＥＮＫＴＣＬ予測子が、細胞傷害性マーカー発現を有するＰＴＣＬ－ＮＯＳをＥＮＫＴＣＬとして特定する傾向があることを見出したので、本願発明者らは更に、ウイルス転写産物ＥＢＥＲに基づいてＰＴＣＬ－ＮＯＳとＥＮＫＴＣＬとの間の分類子を生成した。ＥＮＫＴＣＬとして予測される試料について、本願発明者らは、多重遺伝子ＥＮＫＴＣＬ及び単一ＥＢＥＲ分類子の両方が分子診断と一致することを必要とした。ＡＬＫ－ ＡＬＣＬをＡＬＫ＋ ＡＬＣＬから区別する最終予測子も生成した。第１に、ＡＬＫ陽性に従ってＡＬＣＬ試料を分割し、第２に、ＡＬＣＬの特徴のいくつかを共有するが均一にＡＬＫ（－）であるＥＮＫＴＣＬ試料を区別するために使用した。予測子の初期セットが全て、試料がＰＴＣＬ－ＮＯＳであると結論付けられた場合、ＰＴＣＬ－ＧＡＴＡ３をＰＴＣＬ－ＴＢＸ２１から区別する最終予測子が適用された。４個の予測子のうち１個より多くが、非ＰＴＣＬ－ＮＯＳ診断（例えば、ＡＬＣＬ及びＡＩＴＬの両方）をもたらした場合、それらのタイプ間の追加の一対一予測子を適用して、モデルに含まれるように選択されたいずれかのタイプに特徴的な全ての遺伝子を使用して、タイ状態を破った（例えば、ＡＬＣＬ対ＡＩＴＬ）。

【0176】

ＦＦＰＥ ＲＮＡの分析前評価
ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームで良好に機能する転写産物を特定するために、本願発明者らは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォーム及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ－Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２アレイの両方によってプロファイリングされた１０個の新鮮な凍結ＲＮＡ試料中の各転写産物についてのシグナル強度を相関させた。転写産物の８６．５％より多く及び６５％より多くが、それぞれ、２つのプラットフォーム間で、０．４を超える相関又は０．６を超える相関を示し、これらを更なる分析のために選択した（図１８Ａ～Ｂ）。加えて、ＲＮＡｓｔｏｒｍＴＭ法を使用してＦＦＰＥ試料から単離されたＲＮＡは、別の市販のキットと比較して、より長い転写産物（＞２００塩基）を生成し（図１８Ｃ～Ｄ）、新鮮な凍結ＲＮＡ転写プロファイルとのより高い相関係数をもたらした（図１８Ｅ）。したがって、ＲＮＡｓｔｏｒｍＴＭ単離キットを、その後の試料についてのこのアッセイのための標準的な操作手順において使用した。本願発明者らは、ＦＦＰＥ標本当たり少なくとも２００ｎｇ～１ｕｇの全ＲＮＡを単離することができ、５０％を超えるＲＮＡがＤＶ２００＞５０％を示した。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ，Ｉｎｃ）で実行したＦＦ ＲＮＡと対応するＦＦＰＥ ＲＮＡとの間に高い相関があった（図１８Ｆ）。

【0177】

場所間の再現性及び元の遺伝子セット（ｎ＝４４２）と精緻化された遺伝子セット（ｎ＝１５３）との間の調整
異なる施設でのアッセイの再現性をチェックするために、本願発明者らは、訓練セットから２４個の試料を選択し、２つの異なる施設（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ及びＩｎｓｉｇｈｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）で、それらを１５３遺伝子アレイで再分析した。これらの試料のうちの７つを、１つの追加の訓練試料とともに、低減された遺伝子セットアレイでの元の場所（ＵＮＭＣ）でも再試行し、合計５５個の複製物試料を得た。本願発明者らは、予測子スコアのいくつかについて、これらが、４４２遺伝子アレイで試行されたモデルと１５３遺伝子アレイで試行されたモデルとの間の系統的バイアスであるように思われることを観察した（図２０を参照されたい）。これを補正するために、本願発明者らは、１５３遺伝子アレイ（μ１５３及びσσ１５３によって示される）及び４４２遺伝子アレイ（μ４４２及びσσ４４２によって示される）で複製された試料についてスコアの平均及び標準偏差を計算した。これらの値を使用して、本願発明者らは、以下の式に従って、１５３遺伝子アレイ（特に、検証セットにおけるもの）によって生成されたスコアを、４４２遺伝子アレイのスコアに一致するように調整した。

予測モデルを生成するため、又はこの調整を定義するために、検証試料を使用しなかったことに留意されたい。

【0178】

統計分析
ベースラインの患者特徴を、χ２検定及びｔ検定を用いて群間で比較した。カプラン・マイヤー法を使用して、全生存期間の分布を推定した。全生存（ＯＳ）時間は、診断から死亡日又は最後の接触日までの時間として計算した。最後の接触時に生存していた患者を、全生存期間分析について、打ち切りとして処理した。「近似」分布^１１を使用して、コインＲパッケージで実行されるような順列ベースのログランク検定を使用して、群間の転帰の差を評価した。両側ｐ＜．０５を有意とみなした。

【0179】

本方法で引用されている参考文献
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１１．Ｈｏｔｈｏｒｎ Ｔ，Ｈｏｒｎｉｋ Ｋ，ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｅｌ ＭＡ，Ｚｅｉｌｅｉｓ Ａ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ａ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｓ：Ｔｈｅ ｃｏｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ．２０３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．２００８；２８（８）：１－２３。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図18F】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図19F】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図24】

【図25】

【国際調査報告】