特表 2025-507234 自己複製ＲＮＡ及びその使用配列表 本出願は、電子形態の配列表とともに出願される。配列表の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-03-18

(54)【発明の名称】自己複製ＲＮＡ及びその使用配列表 本出願は、電子形態の配列表とともに出願される。配列表の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/50 20060101AFI20250311BHJP

   C12N 15/40 20060101ALI20250311BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250311BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20250311BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20250311BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20250311BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20250311BHJP

   A61K 9/127 20250101ALI20250311BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20250311BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20250311BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20250311BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20250311BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250311BHJP

【ＦＩ】

C12N15/50 ZNA

C12N15/40

C12N15/63 Z

A61K39/215

A61P11/00

A61P31/14

A61P37/04

A61K9/127

A61K9/107

A61K9/51

A61K9/14

A61K31/711

A61K48/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023547567

(86)(22)【出願日】2022-02-07

(85)【翻訳文提出日】2023-08-04

(86)【国際出願番号】 IB2022051021

(87)【国際公開番号】W WO2023148527

(87)【国際公開日】2023-08-10

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523296092

【氏名又は名称】セキラス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100203208

【弁理士】

【氏名又は名称】小笠原 洋平

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】アレン，ピラダ

(72)【発明者】

【氏名】デ・ソウザ，イヴナ

(72)【発明者】

【氏名】ウェン，インシア

(72)【発明者】

【氏名】チャン，チェン

(72)【発明者】

【氏名】イ，チャングン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA17

4C076AA19

4C076AA29

4C076AA65

4C076BB11

4C076CC06

4C076CC07

4C076CC35

4C084AA13

4C084MA22

4C084MA24

4C084MA38

4C084MA43

4C084MA55

4C084NA14

4C084ZA59

4C084ZB02

4C084ZB09

4C084ZB33

4C085AA03

4C085BA71

4C085DD62

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA22

4C086MA24

4C086MA38

4C086MA43

4C086MA55

4C086NA14

4C086ZA59

4C086ZB02

4C086ZB09

4C086ZB33

(57)【要約】

本開示は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の抗原をコードする自己複製ＲＮＡ及びその使用に関する。具体的には、本開示は、サブゲノムプロモーターに作動可能に結合した抗原をコードするヌクレオチド配列を含む自己複製ＲＮＡ又はモノシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来であり、抗原は、スパイク（Ｓ）タンパク質又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

サブゲノムプロモーターに作動可能に結合した抗原をコードするヌクレオチド配列を含む自己複製ＲＮＡであって、前記抗原が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来である、自己複製ＲＮＡ。

【請求項2】

サブゲノムプロモーターに作動可能に結合した抗原をコードするヌクレオチド配列を含むモノシストロン性自己複製ＲＮＡであって、前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来である、モノシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項3】

前記抗原が、スパイク（Ｓ）タンパク質又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である、請求項１又は２に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項4】

前記Ｓタンパク質が、配列番号１に示される配列によってコードされる、請求項３に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項5】

前記Ｓタンパク質が、変異Ｓタンパク質である、請求項３に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項6】

前記変異Ｓタンパク質が、
（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含む、かつ／又は
（ｉｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠く、かつ／又は
（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含む、かつ／又は
（ｉｖ）配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含む、請求項５に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項7】

前記変異Ｓタンパク質が、配列番号２～７及び／又は配列番号１９～２３のうちのいずれか１つに示される配列によってコードされる、請求項５又は６に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項8】

前記Ｎタンパク質が、配列番号８に示される配列によってコードされる、請求項３に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項9】

ＳＧプロモーターが、配列番号９に示される配列によってコードされる、請求項１～８のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項10】

前記自己複製ＲＮＡが、アルファウイルス由来である、請求項１～９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項11】

前記アルファウイルスが、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項12】

前記ＲＮＡが、配列番号１０～１７のうちのいずれか１つに示される配列によってコードされる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡを含む、免疫原性組成物。

【請求項14】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の複数の自己複製ＲＮＡを含み、各自己複製ＲＮＡが、異なるポリペプチド抗原配列をコードする、請求項１３に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

請求項１３又は１４に記載の免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。

【請求項16】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリマー微粒子、又は水中油型エマルジョンを更に含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

前記自己複製ＲＮＡが、ＬＮＰ、ポリマー微粒子、又は水中油型エマルジョンにカプセル化、結合、又は吸着している、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項18】

ワクチンとしての使用のための、請求項１３若しくは１４に記載の免疫原性組成物、又は請求項１５～１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項19】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）、急性呼吸器疾患症候群（ＡＲＤＳ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される疾患若しくは状態の治療又は予防又は進行を遅延することにおける使用のための、請求項１３若しくは１４に記載の免疫原性組成物、又は請求項１５～１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項20】

対象において疾患若しくは状態を治療する、又は予防する、又は進行を遅延する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１３若しくは１４に記載の免疫原性組成物、又は請求項１５～１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

【請求項21】

疾患若しくは状態を治療する、又は予防する、又は進行を遅延することを必要とする対象においてそれを実施するための医薬品の製造における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ、又は請求項１３又は１４に記載の免疫原性組成物、又は請求項１５～１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。

【請求項22】

前記疾患又は状態が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、ＡＲＤＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法、又は請求項２１に記載の使用。

【請求項23】

対象において免疫応答を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１３若しくは１４に記載の免疫原性組成物、又は請求項１５～１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

【請求項24】

前記免疫応答が、液性及び／又は細胞媒介性免疫応答である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

免疫応答を誘導することを必要とする対象においてそれを実施するための医薬品の製造における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ、又は請求項１３若しくは１４に記載の免疫原性組成物、又は請求項１５～１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。

【請求項26】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。

【請求項27】

前記ポリヌクレオチドが、組換えＤＮＡである、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項28】

前記組換えＤＮＡが、プラスミドである、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項29】

前記プラスミドが、配列番号１０～１７のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の抗原をコードする自己複製ＲＮＡ及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

２０１９年後半に、中国でヒトにおいて新規重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が特定され、重度感染性コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となっている。２０１９年１２月以降、このウイルスの世界的な拡散は、すべての国に広がっており、世界保健機関（ＷＨＯ）は、２０２０年３月１１日にアウトブレイクをパンデミックと宣言した。このウイルスによるヒト感染は、高い伝染率で広範な臨床スペクトルを示す。世界の感染数及び死亡率は上昇し続け、感染数は５４００万人を超え、３５００万人が回復、これまでに１３０万人超が死亡した。

【0003】

ワクチンは、この感染性疾患を予防する重要な健康介入である。このパンデミックでは、複数のワクチンの前例のない開発が見られ、これまでに２００を超えるワクチンが開発され、３０を超えるワクチンが臨床試験、複数のワクチンがフェーズ３にあった。ハムスターチャレンジモデルにおける組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶタンパク質の早期研究は、このアプローチが免疫原性及び保護的であることを実証したので、開発されたワクチンの大部分は、免疫系を喚起してＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質（又はＳタンパク質）を認識しようと試みている。

【0004】

しかしながら、現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する承認された治療及び／又は予防ワクチンはない。よって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する具体的かつ効率的なワクチンを開発する必要性が残る。また、そのようなワクチンは、特にパンデミック中に、十分な量で、インフルエンザワクチンの製造に使用される現在の卵ベースの技法よりも迅速に産生することができることが望ましい。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗原に対する自己複製ＲＮＡの発明者らの特定に基づく。

【0006】

本発明者らの発見は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する自己複製ＲＮＡの基礎を提供する。本発明者らによる発見はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対するモノシストロン性自己複製ＲＮＡの基礎を提供する。更に、本発明者らによる発見は、対象における疾患若しくは障害（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療する、又は予防する、又は進行を遅延する方法の基礎を提供する。

【0007】

したがって、本開示は、サブゲノム（ＳＧ）プロモーターに作動可能に結合した抗原をコードするヌクレオチド配列を含む自己複製ＲＮＡを提供し、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来である。

【0008】

本開示はまた、ＳＧプロモーターに作動可能に結合した抗原をコードするヌクレオチド配列を含むモノシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来である。

【0009】

一例では、抗原は、スパイク（Ｓ）タンパク質又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である。一例では、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質又はＳタンパク質である。

【0010】

一例では、抗原は、Ｓタンパク質である。例えば、Ｓタンパク質は、配列番号１に示される配列によってコードされる。

【0011】

別の例では、Ｓタンパク質は、変異Ｓタンパク質である。

【0012】

一例では、変異Ｓタンパク質は、受容体結合ドメインに変異を含む。例えば、変異は、Ｓ４３８Ｆ、Ｎ４３９Ｋ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４４１Ｉ、Ｋ４４４Ｒ、Ｖ４４５Ａ、Ｖ４４５Ｉ、Ｇ４４６Ｖ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ４５０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｐ、Ｌ４５５Ｆ、Ｋ４５８Ｎ、Ｎ４６０Ｔ、Ｄ４６７Ｖ、Ｉ４６８Ｆ、Ｉ４６８Ｔ、Ｉ４６８Ｖ、Ｅ４７１Ｏ、Ｉ４７２Ｖ、Ａ４７５Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｉ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｒ、Ｔ４７８Ｉ、Ｐ４７９Ｌ、Ｐ４７９Ｌ、Ｐ４７９Ｓ、Ｎ４８１Ｄ、Ｎ４８１Ｈ、Ｖ４８３Ｆ、Ｖ４８３Ａ、Ｅ４８４Ｄ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｏ、Ｇ４８５Ｓ、Ｙ４８９Ｈ、Ｙ４８９Ｄ、Ｙ４８９Ｆ、Ｙ４８９Ｃ、Ｙ４８９Ｎ、Ｆ４９０Ｌ、Ｆ４９０Ｓ、Ｐ４９１Ｒ、Ｑ４９３Ｌ、Ｓ４９４Ｐ、Ｙ４９５Ｎ、Ｔ５００Ｎ、Ｎ５０１Ｓ、及びＹ５０５Ｈ、Ｙ５０８Ｈからなる群から選択される。一例では、変異Ｓタンパク質は、Ｎ４３９Ｋ、Ｎ４３９Ｌ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｉ、Ｖ４８３Ａ、及びＥ４８４Ｄからなる群から選択される受容体結合ドメインに変異を含む。

【0013】

一例では、変異Ｓタンパク質は、Ｐ３３７Ｓ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｃ、Ｇ３３９Ｄ、Ｅ３４０Ｋ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４４Ｓ、Ｔ３４５Ｓ、Ｒ３４６Ｋ、Ａ３４８Ｓ、Ａ３４８Ｔ、Ｗ３５３Ｒ、Ｎ３５４Ｄ、Ｎ３５４Ｋ、Ｎ３５４Ｓ、Ｓ３５９Ｎ、Ｄ３６４Ｙ、Ｖ３６７Ｆ、Ｓ３７３Ｌ、Ｖ３８２Ｌ、Ｐ３８４Ｌ、Ｐ３８４Ｓ、Ｔ３８５Ａ、Ｔ３９３Ｐ、Ｖ３９５Ｉ、Ｆ４００Ｃ、Ｒ４０３Ｋ、Ｒ４０３Ｓ、Ｄ４０５Ｖ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４１４Ｅ、Ｑ４１４Ｋ、Ｑ４１４Ｐ、Ｑ４１４Ｒ、Ｔ４１５Ｓ、Ｋ４１７Ｒ、Ｋ４１７Ｎ、Ｉ４１８Ｖ、Ｙ４２１Ｓ、Ｙ４２３Ｃ、Ｙ４２３Ｆ、Ｙ４２３Ｓ、Ｄ４２７Ｙ、Ｒ５０９Ｋ、Ｖ５１０Ｌ、Ｖ５１１Ｅ、Ｖ５１２Ｌ、Ｌ５１８Ｉ、Ｈ５１９Ｏ、Ａ５２０Ｓ、Ａ５２０Ｖ、Ｐ５２１Ｒ、Ｐ５２１Ｓ、Ａ５２２Ｐ、Ａ５２２Ｓ、及びＤ６１４Ｇからなる群から選択される変異を含む。

【0014】

一例では、変異Ｓタンパク質は、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｔ９５Ｉ、Ｙ１４４Ｓ、Ｙ１４５Ｎ、Ｄ２１５Ｇ、Ｐ３３７Ｓ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｃ、Ｇ３３９Ｄ、Ｅ３４０Ｋ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４４Ｓ、Ｔ３４５Ｓ、Ｒ３４６Ｋ、Ａ３４８Ｓ、Ａ３４８Ｔ、Ｗ３５３Ｒ、Ｎ３５４Ｄ、Ｎ３５４Ｋ、Ｎ３５４Ｓ、Ｓ３５９Ｎ、Ｄ３６４Ｙ、Ｖ３６７Ｆ、Ｓ３７３Ｌ、Ｖ３８２Ｌ、Ｐ３８４Ｌ、Ｐ３８４Ｓ、Ｔ３８５Ａ、Ｔ３９３Ｐ、Ｖ３９５Ｉ、Ｆ４００Ｃ、Ｒ４０３Ｋ、Ｒ４０３Ｓ、Ｄ４０５Ｖ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４１４Ｅ、Ｑ４１４Ｋ、Ｑ４１４Ｐ、Ｑ４１４Ｒ、Ｔ４１５Ｓ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｒ、Ｉ４１８Ｖ、Ｙ４２１Ｓ、Ｙ４２３Ｃ、Ｙ４２３Ｆ、Ｙ４２３Ｓ、Ｄ４２７Ｙ、Ｓ４３８Ｆ、Ｎ４３９Ｋ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４４１Ｉ、Ｋ４４４Ｒ、Ｖ４４５Ａ、Ｖ４４５Ｉ、Ｇ４４６Ｖ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ４５０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｐ、Ｌ４５５Ｆ、Ｋ４５８Ｎ、Ｎ４６０Ｔ、Ｄ４６７Ｖ、Ｉ４６８Ｆ、Ｉ４６８Ｔ、Ｉ４６８Ｖ、Ｅ４７１Ｏ、Ｉ４７２Ｖ、Ａ４７５Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｉ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｒ、Ｔ４７８Ｉ、Ｔ４７８Ｋ、Ｐ４７９Ｌ、Ｐ４７９Ｓ、Ｎ４８１Ｄ、Ｎ４８１Ｈ、Ｖ４８３Ｆ、Ｖ４８３Ａ、Ｅ４８４Ｄ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｏ、Ｇ４８５Ｓ、Ｙ４８９Ｈ、Ｙ４８９Ｄ、Ｙ４８９Ｆ、Ｙ４８９Ｃ、Ｙ４８９Ｎ、Ｆ４９０Ｌ、Ｆ４９０Ｓ、Ｐ４９１Ｒ、Ｑ４９３Ｌ、Ｓ４９４Ｐ、Ｙ４９５Ｎ、Ｔ５００Ｎ、Ｎ５０１Ｓ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｙ５０８Ｈ、Ｒ５０９Ｋ、Ｖ５１０Ｌ、Ｖ５１１Ｅ、Ｖ５１２Ｌ、Ｌ５１８Ｉ、Ｈ５１９Ｏ、Ａ５２０Ｓ、Ａ５２０Ｖ、Ｐ５２１Ｒ、Ｐ５２１Ｓ、Ａ５２２Ｐ、Ａ５２２Ｓ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８０Ｈ、Ｐ６８１Ｈ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、及びＤ９５０Ｎからなる群から選択される変異を含む。

【0015】

一例では、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ／又は（ｉｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠き、かつ／又は（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含み、（ｉｖ）配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0016】

一例では、Ｓタンパク質は、Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号２に示される配列によってコードされる。

【0017】

一例では、Ｓタンパク質は、Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠く。

【0018】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号７に示される配列によってコードされる。

【0019】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0020】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠く。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号５に示される配列によってコードされる。

【0021】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号４に示される配列によってコードされる。

【0022】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号３に示される配列によってコードされる。

【0023】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠き、（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号６に示される配列によってコードされる。

【0024】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠き、（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0025】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠き、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含む。

【0026】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠き、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0027】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠き、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含み、（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0028】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含み、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0029】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠き、（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含み、（ｉｖ）配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0030】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド５０１に対応する残基でＮからＹへの変異を含む。

【0031】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失を含む。

【0032】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド１４４に対応する１つの残基の欠失を含む。

【0033】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失を含み、（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド１４４に対応する１つの残基の欠失を含み、（ｉｖ）配列番号１８のヌクレオチド５０１に対応する残基でＮからＹへの変異を含み、（ｖ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号１９に示される配列によってコードされる。

【0034】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含む。

【0035】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド４１７に対応する残基でＫからＮへの変異を含む。

【0036】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド４８４に対応する残基でＥからＫへの変異を含む。

【0037】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含み、（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド４１７に対応する残基でＫからＮへの変異を含み、（ｉｖ）配列番号１８のヌクレオチド４８４に対応する残基でＥからＫへの変異を含み、（ｖ）配列番号１８のヌクレオチド５０１に対応する残基でＮからＹへの変異を含み、（ｖｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号２０に示される配列によってコードされる。

【0038】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つ残基の欠失を含み、（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含み、（ｉｖ）配列番号１８のヌクレオチド４１７に対応する残基でＫからＮへの変異を含み、（ｖ）配列番号１８のヌクレオチド４８４に対応する残基でＥからＫへの変異を含み、（ｖｉ）配列番号１８のヌクレオチド５０１に対応する残基でＮからＹへの変異を含み、（ｖｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号２１に示される配列によってコードされる。

【0039】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド５７０に対応する残基でＡからＤへの変異を含む。

【0040】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド６８０に対応する残基でＰからＨへの変異を含む。

【0041】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド７１６に対応する残基でＴからＩへの変異を含む。

【0042】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つ残基の欠失を含み、（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド１４４に対応する１つの残基の欠失を含み、（ｉｖ）配列番号１８のヌクレオチド５０１に対応する残基でＮからＹへの変異を含み、（ｖ）配列番号１８のヌクレオチド５７０に対応する残基でＡからＤへの変異を含み、（ｖｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含み、（ｖｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６８０に対応する残基でＰからＨへの変異を含み、（ｖｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド７１６に対応する残基でＴからＩへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号２２に示される配列によってコードされる。

【0043】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド１８に対応する残基でＬからＦへの変異を含む。

【0044】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド８０に対応する残基でＤからＡへの変異を含む。

【0045】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド２１５に対応する残基でＤからＧへの変異を含む。

【0046】

一例では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のヌクレオチド７０１に対応する残基でＡからＶへの変異を含む。

【0047】

一例では、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、（ｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド１８に対応する残基でＬからＦへの変異を含み、（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド８０に対応する残基でＤからＡへの変異を含み、（ｉｖ）配列番号１８のヌクレオチド２１５に対応する残基でＤからＧへの変異を含み、（ｖ）配列番号１８のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含み、（ｖｉ）配列番号１８のヌクレオチド４１７に対応する残基でＫからＮへの変異を含み、（ｖｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド４８４に対応する残基でＥからＫへの変異を含み、（ｖｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド５０１に対応する残基でＮからＹへの変異を含み、（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含み、（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド７０１に対応する残基でＡからＶへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号２３に示される配列によってコードされる。

【0048】

一例では、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でフリン切断部位を欠き、配列番号１８のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基でＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ／又は（ｉｉ）Ｓ２’部位でフリン切断部位を欠き、かつ／又は（ｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６１４に対応する残基でＤからＧへの変異を含み、かつ／又は（ｉｖ）配列番号１８のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間で２つのプロリン残基の挿入を含み、かつ／又は（ｖ）配列番号１８のヌクレオチド５０１に対応する残基でＮからＹへの変異を含み、かつ／又は（ｖｉ）配列番号１８のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失を含み、かつ／又は（ｖｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド１４４に対応する１つの残基の欠失を含み、かつ／又は（ｖｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含み、かつ／又は（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド４１７に対応する残基でＫからＮへの変異を含み、かつ／又は（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド４８４に対応する残基でＥからＫへの変異を含み、かつ／又は（ｘｉ）配列番号１８のヌクレオチド５７０に対応する残基でＡからＤへの変異を含み、かつ／又は（ｘｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド６８０に対応する残基でＰからＨへの変異を含み、かつ／又は（ｘｉｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド７１６に対応する残基でＴからＩへの変異を含み、かつ／又は（ｘｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド１８に対応する残基でＬからＦへの変異を含み、かつ／又は（ｘｘ）配列番号１８のヌクレオチド８０に対応する残基でＤからＡへの変異を含み、かつ／又は（ｘｘｉ）配列番号１８のヌクレオチド２１５に対応する残基でＤからＧへの変異を含み、かつ／又は（ｘｘｉｉ）配列番号１８のヌクレオチド７０１に対応する残基でＡからＶへの変異を含む。

【0049】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号２～７のうちのいずれか１つに示される配列によってコードされる。

【0050】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号２に示される配列によってコードされる。

【0051】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号３に示される配列によってコードされる。

【0052】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号４に示される配列によってコードされる。

【0053】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号５に示される配列によってコードされる。

【0054】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号６に示される配列によってコードされる。

【0055】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号７に示される配列によってコードされる。

【0056】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号２～７及び／又は１９～２３のうちのいずれか１つに示される配列によってコードされる。

【0057】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号１９～２３のうちのいずれか１つに示される配列によってコードされる。

【0058】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号１９に示される配列によってコードされる。

【0059】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号２０に示される配列によってコードされる。

【0060】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号２１に示される配列によってコードされる。

【0061】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号２２に示される配列によってコードされる。

【0062】

一例では、変異Ｓタンパク質は、配列番号２３に示される配列によってコードされる。

【0063】

一例では、抗原は、Ｎタンパク質である。例えば、Ｎタンパク質は、配列番号８に示される配列によってコードされる。

【0064】

一例では、ＳＧプロモーターは、天然ＳＧプロモーターである。例えば、天然ＳＧプロモーターは、由来し、かつ／又は基づく、ＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルス）に天然であるプロモーターである。一例では、天然ＳＧプロモーターは、天然アルファウイルスＳＧプロモーターである。

【0065】

一例では、天然ＳＧプロモーターは、最小ＳＧプロモーターである。例えば、最小ＳＧプロモーターは、転写の開始に必要な最小配列である。一例では、最小天然ＳＧプロモーターは、４９ヌクレオチド長である。一例では、最小限の天然ＳＧプロモーターは、配列番号９に示される配列を含むか又はそれからなる配列によってコードされる。

【0066】

一例では、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルス由来である。例えば、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0067】

一例では、自己複製ＲＮＡは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）由来である。

【0068】

一例では、自己複製ＲＮＡは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）由来である。

【0069】

一例では、自己複製ＲＮＡは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）由来である。

【0070】

一例では、本開示は、配列番号１０～１７のうちのいずれか１つに示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0071】

一例では、本開示は、配列番号１０（Ｃｏ５）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0072】

一例では、本開示は、配列番号１１（Ｃｏ６）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0073】

一例では、本開示は、配列番号１２（Ｃｏ１６）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0074】

一例では、本開示は、配列番号１３（Ｃｏ１７）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0075】

一例では、本開示は、配列番号１４（Ｃｏ４８）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0076】

一例では、本開示は、配列番号１５（Ｃｏ４９）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0077】

一例では、本開示は、配列番号１６（Ｃｏ５８）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0078】

一例では、本開示は、配列番号１７（Ｃｏ５９）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0079】

一例では、本開示は、配列番号２４（Ｃｏ７７）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0080】

一例では、本開示は、配列番号２５（Ｃｏ７８）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0081】

一例では、本開示は、配列番号２６（Ｃｏ７９）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0082】

一例では、本開示は、配列番号２７（Ｃｏ８０）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0083】

一例では、本開示は、配列番号２８（Ｃｏ８１）に示される配列によってコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。

【0084】

本開示はまた、本開示の自己複製ＲＮＡを含む免疫原性組成物を提供する。例えば、本開示の組成物は、投与されるとき、対象において免疫応答を誘導することができる。例えば、組成物の投与は、液性及び／又は細胞媒介性免疫応答を誘導する。一例では、組成物は、対象において液性免疫応答を誘導する。例えば、液性免疫応答は、抗体媒介性免疫応答である。別の例では、組成物は、細胞媒介性免疫応答を誘導する。例えば、細胞媒介性免疫応答は、抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞の活性化が含む。

【0085】

一例では、免疫原性組成物は、複数の自己複製ＲＮＡを含み、各自己複製ＲＮＡは、異なるポリペプチド抗原配列をコードする。例えば、異なるポリペプチド抗原配列は、同じウイルスの株由来である（例えば、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来の抗原をコードする）。一例では、異なるポリペプチド抗原配列は、同じウイルスの異なる株由来である（例えば、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来の抗原をコードする）。一例では、異なるポリペプチド抗原配列は、異なるウイルス由来である（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の抗原及び無関係のウイルス、例えば、インフルエンザ由来の抗原をコードする）。

【0086】

本開示はまた、本開示の免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。本開示における使用に好適な薬学的に許容される担体は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0087】

一例では、薬学的組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリマー微粒子、及び水中油型エマルジョンを更に含む。例えば、自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰ、ポリマー微粒子、及び水中油型エマルジョンにカプセル化、結合、又は吸着している。

【0088】

一例では、薬学的組成物は、ＬＮＰを更に含む。例えば、自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰにカプセル化される。別の例では、自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰに結合している。更なる例では、自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰに吸着している。

【0089】

一例では、薬学的組成物は、ポリマー微粒子を更に含む。例えば、自己複製ＲＮＡは、ポリマー微粒子にカプセル化される。別の例では、自己複製ＲＮＡは、ポリマー微粒子に結合している。更なる例では、自己複製ＲＮＡは、ポリマー微粒子に吸着している。

【0090】

一例では、薬学的組成物は、水中油型エマルジョンを更に含む。例えば、自己複製ＲＮＡは、水中油型エマルジョンにカプセル化される。別の例では、自己複製ＲＮＡは、水中油型エマルジョンに結合している。更なる例では、自己複製ＲＮＡは、水中油型エマルジョンに吸着している。更なる例では、自己複製ＲＮＡは、水中油型エマルジョンに再懸濁される。

【0091】

本開示はまた、ワクチンとしての使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0092】

本開示は更に、本開示の自己複製ＲＮＡワクチンをコードするポリヌクレオチドを提供する。例えば、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。一例では、本開示は、本開示の自己複製ＲＮＡワクチンをコードするＤＮＡを提供する。

【0093】

本開示は、ＳＡＲＳ－２－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、ＡＲＤＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される疾患若しくは状態の治療又は予防又は進行の遅延における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を更に提供する。例えば、本開示は、ＳＡＲＳ－２－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、ＡＲＤＳ、及びそれらの組み合わせの治療における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。一例では、本開示は、ＳＡＲＳ－２－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、ＡＲＤＳ、及びそれらの組み合わせの予防における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の例では、本開示は、ＳＡＲＳ－２－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、ＡＲＤＳ、及びそれらの組み合わせの進行の遅延における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0094】

一例では、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療又は予防又は進行の遅延における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。例えば、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の例では、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。更なる例では、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の進行の遅延における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0095】

一例では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療又は予防又は進行の遅延における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。例えば、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の例では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。更なる例では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の進行の遅延における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0096】

一例では、本開示は、ＡＲＤＳの治療又は予防又は進行の遅延における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。例えば、本開示は、ＡＲＤＳの治療における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の例では、本開示は、ＡＲＤＳの予防における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。更なる例では、本開示は、ＡＲＤＳの進行の遅延における使用のための本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0097】

本開示は、対象において疾患若しくは状態を治療する、又は予防する、又は進行を遅延する方法であって、それを必要とする対象に、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。一例では、本開示は、対象において疾患又は状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。別の例では、本開示は、対象において疾患又は状態を予防する方法であって、それを必要とする対象に、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。更なる例では、本開示は、対象において疾患又は状態の進行を遅延する方法であって、それを必要とする対象に、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0098】

一例では、疾患若しくは状態を治療する、又は予防する、又は進行を遅延することを必要とする対象においてそれを実施するための医薬品の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡの使用を提供する。例えば、疾患又は状態を治療することを必要とする対象においてそれを実施するための医薬品の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡの使用を提供する。別の例では、疾患又は状態を予防することを必要とする対象においてそれを実施するための医薬品の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡの使用を提供する。更なる例では、疾患又は状態の進行を遅延することを必要とする対象においてそれを実施するための医薬品の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡの使用を提供する。

【0099】

一例では、対象は、疾患又は状態に罹患している。一例では、対象は、疾患又は状態に罹患していると診断されている。一例では、対象は、疾患又は状態のための治療を受けている。

【0100】

一例では、疾患又は状態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、ＡＲＤＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一例では、疾患又は状態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である。別の例では、疾患又は状態は、ＣＯＶＩＤ－１９である。更なる例では、疾患又は状態は、ＡＲＤＳである。一例では、ＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症及び／又はＣＯＶＩＤ－１９と関連している。例えば、疾患又は状態は、ＡＲＤＳである。一例では、ＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症と関連している。別の例では、疾患又は状態は、ＡＲＤＳである。一例では、ＡＲＤＳは、ＣＯＶＩＤ－１９と関連している。

【0101】

本明細書に記載される任意の方法の一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの発症前又は後に投与される。本明細書に記載される任意の方法の一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの発症前に投与される。本明細書に記載される任意の方法の一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの発症後に投与される。

【0102】

本明細書に記載される任意の方法の一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの検出後に投与される。本明細書に記載される任意の方法の一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出後に投与される。別の例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出後であるが、ＣＯＶＩＤ－１９の発症前に投与される。本明細書に記載される任意の方法の更なる例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＣＯＶＩＤ－１９の検出後に投与される。本明細書に記載される任意の方法の一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＣＯＶＩＤ－１９の検出後であるが、ＡＲＤＳの発症前に投与される。本明細書に記載される任意の方法の別の例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＡＲＤＳの検出後に投与される。

【0103】

一例では、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９又はＡＲＤＳを発症するリスクがある。例えば、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９を発症するリスクがある。更なる例では、対象は、ＡＲＤＳを発症するリスクがある。

【0104】

一例では、本開示の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳのうちの１つ以上の症状の重症度を低減するか又はその発症を予防するのに十分な量で投与される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの症状は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0105】

本開示は、対象おいて免疫応答を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0106】

本開示はまた、免疫応答を誘導することを必要とする対象においてそれを実施するための医薬品の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物の使用を提供する。

【0107】

一例では、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物は、液性及び／又は細胞媒介性免疫応答を誘導する。一例では、組成物は、対象において液性免疫応答を誘導する。例えば、液性免疫応答は、抗体媒介性免疫応答である。例えば、中和抗体の産生である。別の例では、組成物は、細胞媒介性免疫応答を誘導する。例えば、細胞媒介性免疫応答は、抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞の活性化が含む。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞である。一例では、Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞である。別の例では、Ｔ細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞である。更なる例では、Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞である。

【0108】

一例では、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物の投与は、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する。

【0109】

一例では、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物の投与は、ＣＤ８ Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する。

【0110】

一例では、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物の投与は、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する。

【0111】

一例では、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔｈ０、Ｔｈ１、及び／又はＴｈ２応答である。例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔｈ０応答である。別の例では、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔｈ１応答である。更なる例では、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔｈ２応答である。一例では、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔｈ０及びＴｈ１応答である。別の例では、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔｈ０及びＴｈ２応答である。更なる例では、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔｈ１及びＴｈ２応答である。別の例では、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔｈ０、Ｔｈ１、及びＴｈ２応答である。

【0112】

一例では、Ｔｈ０応答サイトカインは、インターロイキン２（ＩＬ２＋）及び／若しくは腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ＋）を発現し、かつ／又はインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ－）、ＩＬ５－、及び／若しくはＩＬ１３－について陰性である。例えば、サイトカインは、ＩＬ２＋である。別の例では、サイトカインは、ＴＮＦａ＋である。一例では、サイトカインは、ＩＦＮｇ－である。別の例では、サイトカインは、ＩＬ５－である。更なる例では、サイトカインは、ＩＬ１３－である。

【0113】

一例では、Ｔｈ１応答サイトカインは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ＋）を発現し、かつ／又はＩＬ５－及び／若しくはＩＬ１３－について陰性である。例えば、サイトカインは、ＩＦＮｇ＋である。別の例では、サイトカインは、ＩＬ５－である。更なる例では、サイトカインは、ＩＬ１３－である。

【0114】

一例では、Ｔｈ２応答サイトカインは、ＩＬ５＋及び／若しくはＩＬ１３＋を発現し、かつ／又はＩＦＮｇについて陰性である。例えば、サイトカインは、ＩＬ５＋である。更なる例では、サイトカインは、ＩＬ１３＋である。例えば、サイトカインは、ＩＦＮｇ－である。

【0115】

本開示はまた、本開示の自己複製ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。例えば、ポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡである。一例では、組換えＤＮＡは、プラスミドである。一例では、プラスミドは、配列番号１０～１７のうちのいずれか１つに示される配列を含む。

【0116】

本開示はまた、対象において疾患若しくは障害（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳ）の治療又は予防又は進行を遅延することにおける使用のための説明書とともに包装された、任意に送達システム及び／又は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤中の、本開示の少なくとも１つの自己複製ＲＮＡを含むキットを提供する。

【0117】

本開示はまた、疾患又は障害（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳ）に罹患しているか、又はそのリスクがある対象に、ＲＮＡを投与するための説明書とともに包装された、任意に送達システム及び／又は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤中の、本開示の少なくとも１つの自己複製ＲＮＡを含むキットを提供する。

【0118】

一例では、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物は、バイアルで供給される。別の例では、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物は、シリンジで供給される。

【図面の簡単な説明】

【0119】

【図1】Ｃｏ１６によって誘導される抗原特異的Ｔ細胞を示す一連のグラフ表現である。（Ａ）Ｓ１特異的ＣＤ４ Ｔ細胞、（Ｂ）Ｓ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞、（Ｃ）Ｓ２特異的ＣＤ４ Ｔ細胞、（Ｄ）Ｓ２特異的ＣＤ８ Ｔ細胞、及び（Ｅ）Ｎ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞について、誘導される正味（抗原特異的）サイトカイン産生ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞％を示す。

【図2】（Ａ）参照Ｗｈｕａｎ配列、（Ｂ）アルファバリアント（Ｂ．１．１．７、ＵＫ株）、（Ｃ）ベータバリアント（Ｂ．１．３５１、南アフリカ株）、（Ｄ）ガンマバリアント（Ｐ．１、ブラジル株）、及び（Ｅ）デルタバリアント（Ｂ．１．６１７．２、インド株）に対する構築物の中和能力を示す一連のグラフ表現である。

【図3】すべての構築物が（Ａ）参照Ｗｈｕａｎ配列、（Ｂ）アルファバリアント（Ｂ．１．１．７、ＵＫ株）、（Ｃ）ベータバリアント（Ｂ．１．３５１、南アフリカ株）、（Ｄ）ガンマバリアント（Ｐ．１、ブラジル株）、及び（Ｅ）デルタバリアント（Ｂ．１．６１７．２、インド株）に対して高用量及び低用量で総Ｉｇ応答を生成したことを示す一連のグラフ表現である。

【図4】すべての構築物がすべてのバリアントＢ細胞受容体特異的プローブと反応したＳ特異的Ｂ細胞を生成したことを示すグラフ表現である。非特異的対照（すなわち、ベイト及び陰性対照ＨＡ Ｈ１なし）は、低レベルのバックグラウンド結合を示した。

【図5】すべての構築物がＳ１及びＳ２エピトープと反応する抗原特異的（Ａ）ＣＤ４及び（Ｂ）ＣＤ８ Ｔ細胞を誘導したことを示す一連のグラフ表現である。

【表1-1】

【表1-2】

【発明を実施するための形態】

【0120】

一般
本明細書全体を通して、特に具体的に記載されないか、又は特に文脈が要求しない限り、単一のステップ、組成物、ステップの群、又は組成物の群への言及は、それらのステップ、組成物、ステップの群、又は組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。

【0121】

当業者は、本開示が、具体的に記載されるもの以外の変形及び修飾を受けやすいことを理解するであろう。本開示は、すべてのそのような変形及び修飾を含むことを理解されたい。本開示はまた、個別に又は集合的に、本明細書において言及又は指示されるステップ、特徴、組成物、及び化合物のすべて、並びに当該ステップ又は特徴のうちの任意及びすべての組み合わせ又は任意の２つ以上を含む。

【0122】

本開示は、例示のみの目的を意図する、本明細書に記載される特定の例によって範囲において限定されるべきではない。機能的に等価な産物、組成物、及び方法は、明らかに本開示の範囲内である。

【0123】

本明細書における本開示の任意の例は、特に明記されない限り、本開示の任意の他の例に準用するものとする。別の言い方をすれば、本開示の任意の具体的な例は、本開示の任意の他の具体的な例と組み合わされ得る（相互に排他的な場合を除く）。

【0124】

具体的な特徴若しくは特徴の群又は方法若しくは方法ステップを開示する本開示の任意の例は、具体的な特徴若しくは特徴の群又は方法若しくは方法ステップを否定するための明示的な支持を提供すると解釈されるであろう。

【0125】

特に具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学）によって一般に理解されるものと同じ意味を有すると解釈されるものとする。

【0126】

特に示されない限り、本開示で利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技法は、当業者に周知の、標準的な手順である。そのような技法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ （ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６），ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｌ ｕｐｄａｔｅｓ ｕｎｔｉｌ ｐｒｅｓｅｎｔ），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｌ ｕｐｄａｔｅｓ ｕｎｔｉｌ ｐｒｅｓｅｎｔ）などの、ソースにおいて文献全体を通して記載及び説明される。

【0127】

「及び／又は」という用語、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ若しくはＹ」のいずれかを意味することが理解され、両方の意味又はいずれかの意味の明示的な支持を提供すると解釈されるものとする。

【0128】

本明細書全体を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という語、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、記載された要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されるであろう。

【0129】

本明細書で使用される場合、「～に由来する」という用語は、特定の整数が特定のソースから得られ得るが、必ずしもそのソースから直接得られるとは限らないことを示すと解釈されるものとする。同様に、「～に基づく」という用語は、特定の整数が特定のソースから開発又は使用され得るが、必ずしもそのソースから直接開発又は使用されるとは限らないことを示すと解釈されるものとする。

【0130】

選択された定義
本明細書で使用される場合、「自己複製ＲＮＡ」という用語は、異種ＲＮＡ及びタンパク質の発現を可能にするように操作されたＲＮＡウイルスに基づく構築物を指す。自己複製ＲＮＡ（例えば、裸のＲＮＡの形態）は、宿主細胞において増幅し、宿主細胞における所望の遺伝子産物の発現をもたらすことができる。

【0131】

本明細書で使用される場合、自己複製ＲＮＡに関して「モノシストロン性」という用語は、１つのポリペプチドをコードするＲＮＡを指す。

【0132】

本明細書で使用される「裸の」という用語は、脂質、ポリマー、及びタンパク質などの、他の巨大分子を実質的に含まない核酸を指す。自己複製ＲＮＡなどの、「裸の」核酸は、細胞取り込みを改善するために他の巨大分子とともに製剤化されない。したがって、裸の核酸は、ＬＮＰ、リポソーム、ポリマー微粒子、又は水中油型エマルジョンにカプセル化、吸収、又は結合していない。

【0133】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」という用語は、ホスホジエステルバックボーンに共有結合した一連の連続したヌクレオチド（又は塩基）を意味すると理解されるであろう。従来、配列は、特に指定されない限り、５’末端から３’末端まで提示される。

【0134】

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、細胞及び／又は液性免疫応答を誘導、誘発、増強、又はブーストする１つ以上のエピトープを含有する分子又は構造を指す。抗原は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫、植物などの病原体由来、又は腫瘍由来のタンパク質及びペプチドを含むことができる。

【0135】

本明細書で使用される場合、「～に作動可能に結合した」という用語は、核酸の発現が要素によって制御又は調節されるように、核酸に対してサブゲノムプロモーターを配置することを意味する。

【0136】

本明細書で使用される場合、「サブゲノムプロモーター」（ＳＧ、「ジャンクション領域」プロモーターとしても知られる）という用語は、異種ヌクレオチド配列の発現を指示し、タンパク質発現を調節するプロモーターを指す。

【0137】

「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合によって結合した一連の連続したアミノ酸を意味すると理解されるであろう。例えば、タンパク質は、単一のポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合によって結合した一連の連続したアミノ酸、又は互いに共有結合若しくは非共有結合した一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むと解釈されるものとする。一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合又はジスルフィド結合を使用して共有結合することができる。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。

【0138】

「組換え」という用語は、人工遺伝子組換えの産物を意味することが理解される。

【0139】

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、又は「状態」という用語は、正常な機能の破壊又は干渉を指し、任意の特定の状態に限定されるものではなく、疾患又は障害を含む。

【0140】

本明細書で使用される場合、疾患又は状態を発症する「リスクがある」対象は、検出可能な疾患又は疾患の症状を有していても、有していなくてもよく、本開示による治療の前に検出可能な疾患又は疾患の症状を示していても、有していなくてもよい。「リスクがある」とは、対象が、当該技術分野で既知であり、かつ／又は本明細書に記載される、疾患又は状態の発症と相関する測定可能なパラメータである、１つ以上のリスク因子を有することを示す。

【0141】

本明細書で使用される場合、「治療すること」、「治療する」、又は「治療」という用語は、本明細書に記載されるＲＮＡ又は組成物を投与して、それによって特定の疾患又は状態の少なくとも１つの症状を低減又は排除することを含む。

【0142】

本明細書で使用される場合、「予防すること」、「予防する」、又は「予防」という用語は、個体における特定の疾患又は状態の発生又は再発に関する予防を提供することを含む。個体は、疾患を発症する素因又はリスクがあるが、まだ疾患と診断されていない場合がある。

【0143】

本明細書で使用される場合、「～の進行を遅延すること」という用語は、個体における疾患若しくは状態及び／又は疾患若しくは状態の少なくとも１つの症状の進行を低減又は遅延することを含む。

【0144】

「有効量」は、所望の結果を達成するために、必要な投与量及び期間で、少なくとも有効な量を指す。例えば、所望の結果は、治療的又は予防的結果であり得る。有効量は、１回以上の投与で提供することができる。本開示のいくつかの例では、「有効量」という用語は、本明細書で以前に記載される疾患又は状態の治療を行うために必要な量を意味する。本開示のいくつかの例では、「有効量」という用語は、本明細書で以前に記載される疾患又は状態に関連する変化を行うために必要な量を意味する。有効量は、治療される疾患若しくは状態又は改変される因子に応じて、また、体重、年齢、人種的背景、性別、健康及び／又は身体状態、並びに治療される哺乳動物に関連する他の因子に応じて変動し得る。典型的には、有効量は、医療従事者によって日常的な試験及び実験を通して決定することができる比較的広い範囲（例えば、「投与量」範囲）内に該当するであろう。したがって、この用語は、本開示をＲＮＡの特定の量、例えば、重量又は数に限定すると解釈されるものではない。有効量は、単回用量で、又は治療期間にわたって１回若しくは数回繰り返される用量で投与することができる。

【0145】

「治療有効量」は、少なくとも特定の疾患又は状態の測定可能な改善をもたらすために必要な最小濃度である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する本開示のＲＮＡの能力などの因子に従って変動し得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果がＲＮＡの任意の毒性又は有害効果を上回るものである。

【0146】

本明細書で使用される場合、「予防有効量」という用語は、本明細書に記載される疾患又は障害の１つ以上の検出可能な症状の発症を予防又は阻害又は遅延するのに十分な量の本開示のＲＮＡを意味すると解釈されるものとする。

【0147】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト、例えば、哺乳動物を含む任意の動物を意味すると解釈されるものとする。例示的な対象としては、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、対象は、ヒトである。

【0148】

自己複製ＲＮＡ
本開示は、自己複製ＲＮＡ（レプリコンとしても知られる）を提供する。例えば、本開示は、モノシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0149】

当業者は、本開示の自己複製ＲＮＡが、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡに基づくことを理解するであろう。ＲＮＡは、陽性（＋）鎖であるべきであり、ひいては介在する複製ステップ（例えば、逆転写）を必要とせずに、細胞への送達後に直接翻訳することができる。ＲＮＡの翻訳は、レプリカーゼ複合体（すなわち、ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ）を形成するために組み合わせる非構造タンパク質（ＮＳＰ）の産生をもたらす。次いで、複合体は、元のＲＮＡを増幅し、アンチセンス及びセンス転写物の両方を産生し、その後翻訳及び転写され得る複数の娘ＲＮＡの産生をもたらし、全体的なタンパク質発現を増強する。

【0150】

一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに天然サブゲノムプロモーターを含む。

【0151】

一例では、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスの１つ以上の非構造タンパク質を含む。例えば、ＲＮＡは、ウイルスレプリカーゼ（又はウイルスポリメラーゼ）、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、及び他の非構造ウイルスタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を含む。例えば、自己複製ＲＮＡは、ウイルスレプリカーゼ（又はウイルスポリメラーゼ）を含む。

【0152】

本開示における使用に好適なＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ ＵＴＲ）、及び／又はコード若しくは翻訳配列も含み得ることは、当業者には明らかであろう。加えて、ＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終端ヌクレオチド、ステムループ（例えば、ヒストンステムループ）、３’テーリング配列（例えば、ポリアデニル化シグナル又は１つ以上のポリＡテール）を含み得る。別の例では、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスの５’末端ＵＴＲ及び３’末端ＵＴＲを含む。当業者には、５’及び３’ＵＴＲという用語は、５’及び３’保存配列要素（ＣＳＥ）という用語も包含することが明らかであろう。一例では、自己複製ＲＮＡは、５’末端ＣＳＥ及び３’末端ＣＳＥを含む。

【0153】

本開示の自己複製ＲＮＡは、感染性ウイルス粒子の産生を誘導することはできない。例えば、本開示の自己複製ＲＮＡは、ウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードするウイルス遺伝子を含まない。

【0154】

一例では、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスに由来するか、又は基づく。好適なアルファウイルスは、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0155】

別の例では、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルス、例えば、陽性鎖ＲＮＡウイルス以外のウイルスに由来するか、又は基づく。本開示における使用に好適な陽性鎖ＲＮＡウイルスは、当業者には明らかであり、例えば、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、又はコロナウイルスを含む。

【0156】

アルファウイルス
一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスに由来する（又は基づく）。

【0157】

アルファウイルスは、トガウイルス科における唯一の属であり、陽性センス一本鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。当業者は、アルファウイルスゲノムが、非構造的及び構造的な、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことを理解するであろう。第１のＯＲＦは、ウイルスＲＮＡの転写及び複製に必要な４つの非構造タンパク質（ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、及びＮＳＰ４）をコードする。第２は、ヘテロダイマーとして会合する、３つの構造タンパク質：コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、並びにエンベロープタンパク質Ｐ６２及びＥ１をコードする。ウイルス膜アンカー表面糖タンパク質は、膜融合を通した受容体認識及び標的細胞への侵入の原因である。

【0158】

一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、ウイルスレプリカーゼ（又はウイルスポリメラーゼ）を含む。例えば、ウイルスレプリカーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ、例えば、アルファウイルスタンパク質ＮＳＰ４である。

【0159】

一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質（例えば、カプシド及び／又はエンベロープ糖タンパク質）をコードしない。例えば、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオン（すなわち、感染性ウイルス粒子）を産生することができない。

【0160】

一例では、自己複製ＲＮＡは、天然アルファウイルスＳＧプロモーターを含む。例えば、天然アルファウイルスＳＧプロモーターは、最小ＳＧプロモーター（すなわち、転写の開始に必要な最小配列）であり、配列番号９に示される配列を含む。

【0161】

当業者は、本開示における使用に好適なアルファウイルスを認識しているであろう。例示的なアルファウイルスとしては、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ、例えば、トリニダードロバ、ＴＣ８３ＣＲ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ロスリバーウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ウイルス、エバーグレーズウイルス、ムカンボウイルス、バーマ森林ウイルス、ミデルバーグウイルス、ピクスナウイルス、オニョンニョンウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、バンバンキウイルス、キジラガチウイルス、ハイランドＪウイルス、フォートモーガンウイルス、ヌドゥムウイルス、及びバギークリークウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。「アルファウイルス」という用語はまた、キメラアルファウイルス（例えば、Ｐｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１９）：１０３９４－４０３によって記載される）を含み得、それらは２つ以上のアルファウイルス由来のゲノム配列を含有する。

【0162】

サブゲノムプロモーター
本開示は、ＳＧプロモーターに作動可能に結合した抗原をコードするヌクレオチド配列を含む自己複製ＲＮＡを提供する。

【0163】

本開示における使用に好適なＳＧプロモーター（「ジャンクション領域」プロモーターとしても知られる）は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0164】

一例では、ＳＧプロモーターは、アルファウイルスＳＧプロモーターに由来するか、又は基づく。例えば、ＳＧプロモーターは、天然アルファウイルスＳＧプロモーターである。一例では、天然ＳＧプロモーターは、最小ＳＧプロモーターである。例えば、最小ＳＧプロモーターは、転写の開始に必要な最小配列である。

【0165】

５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）
一例では、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスの５’－ＵＴＲを含む。

【0166】

本明細書で使用される場合、「５’－非翻訳領域」又は「５’－ＵＴＲ」という用語は、翻訳開始配列（ＡＵＧ）の５’末端に位置するｍＲＮＡの非コード領域を指す。

【0167】

一例では、５’ＵＴＲは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）又はその修飾形態の５’ＵＴＲである。例えば、５’ＵＴＲは、配列番号２９に示される配列を含む。

【0168】

一例では、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）、ＧＣリッチ要素、ステムループ、及びそれらの組み合わせを含む。

【0169】

マイクロＲＮＡ結合部位
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ結合部位」という用語は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と相互作用、会合、又は結合するｍｉＲＮＡのすべて又は１つの領域に十分な相補性を有するポリクレオチド内（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ転写物内）の配列を指す。

【0170】

本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」という用語は、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲに結合し、（例えば、翻訳を阻害することによって）遺伝子発現を下方調節する１９～２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡを指す。本開示の５’ＵＴＲ中のマイクロＲＮＡ結合部位の存在は、５’－ＵＴＲの翻訳を阻害するように機能することができる。

【0171】

本開示における使用のための好適なｍｉＲＮＡは、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0172】

一例では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、組織特異的マイクロＲＮＡ又は生物学的プロセスを調節するものの結合部位を含む。例えば、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－ｉｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）のｍｉＲＮＡ。例えば、血管新生（ｍｉＲ－１３２）などの生物学的プロセスを調節するマイクロＲＮＡ。更なる例示的なｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、米国特許出願第１４／０４３，９２７号に開示されている。

【0173】

ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）
本明細書で使用される場合、「ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）」又は「ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）」という用語は、アデオニシン（Ａ）及びウリジン（Ｕ）のストレッチを含むヌクレオチド配列の領域を指す。例示的なＡＲＥとしては、例えば、細胞質ｍｙｃ（ｃ－ｍｙｃ）、筋芽細胞決定タンパク質１（ｍｙｏＤ）、ｃ－Ｊｕｎ、ミオゲニン、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0174】

一例では、ＡＲＥは、ヒト抗原Ｒ又は「ＨｕＲ」（Ｅｌａｖｌ１としても知られる）特異的結合部位を含む。ＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させるＡＲＥに結合することが知られている。

【0175】

ＧＣリッチ要素
本明細書で使用される場合、「ＧＣリッチ要素」という用語は、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）と比較して多量のグアニン（Ｇ）及び／又はシトシン（Ｃ）を有するヌクレオチド配列を指す。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）中のＧＣリッチ要素の存在は、ｍＲＮＡを安定させることができる。

【0176】

一例では、ＧＣリッチ要素は、３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又は１３、又は１４、又は１５、又は１６、又は１７、又は１８、又は１９、又は２０、又は２１、又は２２、又は２３、又は２４、又は２５、又は２６、又は２７、又は２８、又は２９、又は３０ヌクレオチド長の配列を含む。

【0177】

一例では、ＧＣリッチ要素は、３０％～４０％、又は４０％～５０％、又は５０％～６０％、又は６０％～７０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、３０％～４０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、４０％～５０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、５０％～６０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、６０％～７０％のシトシンを含む。

【0178】

一例では、ＧＣリッチ要素は、３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、３０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、４０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、５０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、６０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、６０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチ要素は、７０％のシトシンを含む。

【0179】

一例では、ＧＣリッチ要素は、少なくとも５０％のシトシンである。

【0180】

一例では、ＧＣリッチ要素は、少なくとも６０％のシトシンである。

【0181】

一例では、ＧＣリッチ要素は、少なくとも７０％のシトシンである。

【0182】

一例では、ＧＣリッチ要素は、ヌクレオチド配列ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣを含む。別の例では、ＧＣリッチ要素は、ヌクレオチド配列ＣＣＣＣＧＧＣを含む。更なる例では、ＧＣリッチ要素は、ヌクレオチド配列ＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧを含む。

【0183】

一例では、ＧＣリッチ要素は、配列番号３１～３３に示されるヌクレオチド配列を含む。一例では、ＧＣリッチ要素は、配列番号３１に示されるヌクレオチド配列を含む。別の例では、ＧＣリッチ要素は、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を含む。更なる例では、ＧＣリッチ要素は、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0184】

ステムループ
本明細書で使用される場合、「ステムループ」という用語は、ステムループを形成する２つの隣接した完全又は部分的逆相補性配列の分子内塩基対合を含むヌクレオチド配列を指す。ステムループは、一本鎖ＤＮＡ中又は、より一般的には、ＲＮＡ中に発生し得る。ステムループはまた、通常、連続した配列内のステム及び末端ループからなるヘアピン又はヘアピンループと称することができ、ステムは、ループをステムループ構造に構築する短い配列によって分離された２つの隣接した完全又は部分的逆相補性配列によって形成される。

【0185】

対合ステムループの安定性は、長さ、それが含有するミスマッチ又はバルジの数、及び対合領域のヌクレオチド組成によって決定される。

【0186】

一例では、ステムループのループは、３～１０ヌクレオチド長である。例えば、ステムループのループは、３～８、又は３～７、又は３～６、又は４～５ヌクレオチド長である。

【0187】

一例では、ステムループのループは、４ヌクレオチド長である。

【0188】

一例では、ステムループは、ヒストンステムループである。例えば、ヒストンステムループは、配列番号３４に設定されたヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる。

【0189】

Ｋｏｚａｋコンセンサス配列
本明細書で使用される場合、「Ｋｏｚａｋコンセンサス配列」という用語は、リボソームによって認識される開始コドン（翻訳開始コドンとも称される）を含有することによって遺伝子の翻訳を促進する真核生物遺伝子において特定されたヌクレオチド配列を指す。

【0190】

例示的なＫｏｚａｋコンセンサス配列は、当該技術分野で既知であり、かつ／又は本明細書に記載される。一例では、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３５に示される。別の例では、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３６に示される。一例では、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、ＡＣＣＡＴＧＧである。別の例では、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、ＡＣＣＡＴＧである。

【0191】

３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）
一例では、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスの３’－ＵＴＲを含む。

【0192】

本明細書で使用される場合、「３’－ＵＴＲ」という用語は、翻訳終結コドン（すなわち、終止コドン）の３’末端に位置するｍＲＮＡの領域を指す。

【0193】

一例では、３’ＵＴＲは、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）又はその修飾形態の３’ＵＴＲである。例えば、３’ＵＴＲは、配列番号３０に示される配列を含む。

【0194】

一例では、本開示の３’－ＵＴＲは、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）、ＧＣリッチ要素、三重ヘリックス、ステムループ、１つ以上の停止コドン、又はそれらの組み合わせを更に含む。

【0195】

終止コドン
本明細書で使用される場合、「停止コドン」という用語は、リボソームによるタンパク質合成の停止をシグナル伝達するｍＲＮＡ内のトリヌクレオチド配列を指す。

【0196】

一例では、本開示のポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲの５’末端で少なくとも１つの終止コドンを含む。例えば、終止コドンは、ＵＡＧ、ＵＡＡ、及びＵＧＡから選択される。

【0197】

一例では、ポリヌクレオチドは、配列ＵＧＡＵＧＡを含む２つの連続した終止コドンを含む。

【0198】

一例では、ポリヌクレオチドは、配列ＵＡＡＵＡＧを含む２つの連続した終止コドンを含む。

【0199】

３’テーリング配列
本開示のＲＮＡは、３’ＵＴＲの３’末端に位置する１つ以上の３’テーリング配列を含む。

【0200】

本明細書に記載されるように、「３’テーリング配列」又は「３’テーリング配列」という用語は、ｍＲＮＡの３’末端に位置するｍＲＮＡ又はヌクレオチド配列（例えば、ポリＡ配列）の３’末端への非コードヌクレオチドの付加を誘導するヌクレオチド配列（例えば、ポリアデニル化シグナル）を指す。当業者は、ｍＲＮＡにおける３’テーリング配列及び／又は３’テーリング配列の産物が、ｍＲＮＡを安定させ、かつ／又はｍＲＮＡの分解を防止するように機能することを理解するであろう。

【0201】

本明細書で使用される場合、本開示のポリＡ又はポリＣ配列に関する「中断リンカー」という用語は、ポリＡ又はポリＣ配列中の連続したアデノシン又はシトシンヌクレオチドのストレッチに結合し、これを中断する、単一ヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指す。例えば、ポリＡ配列中の中断リンカーは、アデノシンヌクレオチド以外のヌクレオチドからなるか、又はそれを含む単一ヌクレオチド又はヌクレオチド配列である。例えば、ポリＣ配列中の中断リンカーは、シトシンヌクレオチド以外のヌクレオチドからなるか、又はそれを含む単一ヌクレオチド又はヌクレオチド配列である。

【0202】

一例では、１つ以上の３’テーリング配列は、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、Ｇ四重鎖、ポリＣ配列、ステムループ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0203】

ポリＡ配列
本明細書で使用される場合、「ポリＡ配列」という用語は、ｍＲＮＡの３’末端に位置するアデニン（Ａ）のヌクレオチド配列を指す。本開示の文脈では、ポリＡ配列は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ（例えば、ベクターの転写によってｍＲＮＡを生成するための鋳型として機能するＤＮＡプラスミド）内に位置し得る。

【0204】

本開示における使用のための好適なポリＡ配列は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。一例では、ポリＡ配列は、任意の長さ（例えば、１０～３００）の連続した（すなわち、相次ぐ）アデノシンヌクレオチドを含む。例えば、ポリＡ配列は、３６個の連続したアデノシンヌクレオチドを含む。一例では、ポリＡ配列は、配列番号３７に示される配列を含む。

【0205】

一例では、ポリＡ配列は、１つ以上の中断リンカーによって分離された連続したアデノシンヌクレオチドを含む。一例では、ポリＡ配列は、中断リンカーを含まない連続したアデノシンヌクレオチドを含む。

【0206】

ポリアデニル化シグナル
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化シグナル」という用語は、ポリアデニル化を誘導するヌクレオチド配列を指す。ポリアデニル化は、典型的には、ＲＮＡへの（例えば、成熟ｍＲＮＡを生成するための未熟ｍＲＮＡへの）ポリＡ配列の付加であると理解される。ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端でヌクレオチド配列内に位置し得る。

【0207】

本開示における使用のための好適なポリアデニル化シグナルは、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0208】

一例では、ポリアデニル化シグナルは、アデニン及びウラシル／チミジンヌクレオチドからなるヘキサマーを含む。一例では、ヘキサマー配列は、ＡＡＵＡＡＡを含むか、又はこれからなる。

【0209】

一例では、３’テーリング配列は、ポリアデニル化シグナルを含むが、ポリＡ配列を含まない。

【0210】

Ｇ四重鎖
本明細書で使用される場合、「Ｇ四重鎖」又は「Ｇ４」という用語は、４本鎖二次構造を形成するグアニン残基が豊富なヌクレオチド配列を指す。例えば、Ｇ四重鎖は、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方においてＧリッチ配列によって形成された４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。

【0211】

一例では、３’テーリング配列は、ポリＡ配列及びＧ四重鎖を含む。例えば、３’テーリング配列は、ポリＡ－Ｇカルテットを産生するためにＧ四重鎖に結合したポリＡ配列を含む。

【0212】

ポリＣ配列
本明細書で使用される場合、「ポリＣ配列」という用語は、ｍＲＮＡの３’末端に位置するシトシン（Ｃ）のヌクレオチド配列を指す。本開示の文脈では、ポリＣ配列は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ（例えば、ベクターの転写によってｍＲＮＡを生成するための鋳型として機能するＤＮＡプラスミド）内に位置し得る。

【0213】

本開示における使用のための好適なポリＣ配列は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0214】

一例では、１つ以上の３’テーリング配列は、各々１０～３００個の連続したシトシンヌクレオチドを含む、１つ以上のポリＣ配列を含む。例えば、１つ以上のポリＣ配列は、各々１０～２０、又は２０～３０、又は３０～４０、又は４０～５０、又は５０～６０、又は６０～７０、又は７０～８０、又は８０～９０、又は９０～１００、又は１００～１２５、又は１２５～１５０、又は１５０～１７５、又は１７５～２００、又は２００～２２５、又は２２５～２５０、又は２５０～２７５、又は２７５～３００個の連続したシトシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＣ配列は、各々１０、又は２０、又は３０、又は４０、又は５０、又は６０、又は７０、又は８０、又は９０、又は１００、又は１２５、又は１７５、又は２００、又は２２５、又は２５０、又は２７５、又は３００個の連続したシトシンヌクレオチドを含む。

【0215】

一例では、１つ以上のポリＣ配列は、中断リンカーによって分離される。例えば、１つ以上の３’テーリング配列を含む第４のヌクレオチド配列は、５’から３’への順序で、連続したシトシンヌクレオチド、中断リンカー、及び更なる連続したシトシンヌクレオチドを含む。

【0216】

一例では、中断リンカーは、１０～５０、又は５０～１００、又は１００～１５０ヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又は１３、又は１４、又は１５、又は１６、又は１７、又は１８、又は１９、又は２０、又は２５、又は３０、又は３５、又は４０、又は４５、又は５０、又は５５、又は６０、又は６５、又は７０、又は７５、又は８０、又は８５、又は９０、又は９５、又は１００、又は１１０、又は１２０、又は１３０、又は１４０、又は１５０ヌクレオチド長である。

【0217】

５’キャップ
一例では、自己複製ＲＮＡは、５’末端キャップ構造を含む。

【0218】

本明細書で使用される場合、「５’キャップ構造」という用語は、核輸出に関与するｍＲＮＡの５’末端での構造を指し、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合する。５’キャップ構造は、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を通してｍＲＮＡを安定させて、成熟ｍＲＮＡを形成することが知られている。したがって、本開示のｍＲＮＡにおける５’キャップ構造の存在は、５’キャップを含まないｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡの安定性を更に増加させることができる。

【0219】

例示的な５’キャップ構造としては、例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）、Ｎ７，２’－０－ジメチル－グアノシン（ｍＣＡＰ）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、キャップ１、及びキャップ２が挙げられる。

【0220】

典型的には、内因性ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドに結合した（５）’－ｐｐｐ－（５）’－三リン酸結合を通してグアノシンで５’キャップされる。次いで、グアノシンキャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０構造）を生成する７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）にメチル化することができ、Ｎは、ｍＲＮＡの第１及び第２の５’末端ヌクレオチドを表す。キャップ０構造は、更に２’－Ｏ－メチル化して、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び／又は７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）を産生することができる。

【0221】

一例では、本開示のポリヌクレオチドは、内因性キャップを含む。

【0222】

本明細書で使用される場合、「内因性キャップ」という用語は、細胞において合成された５’キャップを指す。例えば、内因性キャップは、天然５’キャップ又は野生型５’キャップである。例えば、内因性キャップは、キャップ０、キャップ１、又はキャップ２構造である。

【0223】

一例では、本開示のポリヌクレオチドは、内因性キャップの類似体（キャップ類似体とも称される）を含む。

【0224】

本明細書で使用される場合、内因性キャップ又は「キャップ類似体」の文脈における「その類似体」という用語は、合成５’キャップを指す。キャップ類似体を使用して、インビトロ転写反応において５’キャップｍＲＮＡを産生することができる。キャップ類似体は、ヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチド）に化学的に（すなわち、非酵素的に）又は酵素的に合成及び／又は結合し得る。例示的なキャップ類似体は、市販されており、例えば、３″－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ、Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ａ、Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ、ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ａ、ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を含む。一例では、キャップ類似体は、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（すなわち、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ））である。

【0225】

一例では、５’キャップ構造は、非加水分解性キャップ構造である。非加水分解性キャップ構造は、ｍＲＮＡのデキャッピングを防止し、ｍＲＮＡの半減期を増加させることができる。

【0226】

一例では、非加水分解性キャップ構造は、α－チオ－グアノシンヌクレオチド、α－メチル－ホスホネート、セレノ－ホスフェート、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む。一例では、修飾ヌクレオチドは、α－ホスホロチエート結合を通してｍＲＮＡの５’末端に結合している。修飾ヌクレオチドをｍＲＮＡの５’末端に結合する方法は、当業者には明らかであろう。例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用する。

【0227】

抗原
本開示の自己複製ＲＮＡは、抗原（例えば、病原性抗原）をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、抗原は、対象において免疫応答を誘導することができる。

【0228】

一例では、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0229】

産生の方法
本開示の自己複製ＲＮＡの産生に好適な方法は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0230】

一例では、自己複製ＲＮＡは、プラスミドＤＮＡを使用して産生される。当業者は、プラスミドＤＮＡが比較的安定であることを理解するであろう。簡潔には、有能な細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞は、本開示の自己複製ＲＮＡをコードするＤＮＡプラスミドで形質転換される。個々の細菌コロニーは、単離され、得られたプラスミドＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物において増幅される。

【0231】

一例では、プラスミドＤＮＡは、発酵後に単離される。例えば、プラスミドＤＮＡは、市販のキット（例えば、Ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡキット）、又は当業者に知られる他の日常的な方法を使用して単離される。単離後、プラスミドＤＮＡは、制限消化によって（すなわち、制限酵素を使用して）線状化される。制限酵素は、例えば、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を含む、当該技術分野で既知の方法を使用して除去される。

【0232】

一例では、ｍＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を使用して、線状化ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって作製される。インビトロ転写後、ＤＮＡ鋳型は、ＤＮａｓｅ消化によって除去される。当業者は、合成ｍＲＮＡキャッピングが、ｍＲＮＡ処理を補正し、ｍＲＮＡの安定化に寄与するために行われることを理解するであろう。一例では、ｍＲＮＡは、酵素的に５’キャップされる。例えば、５’キャップは、キャップ０構造又はキャップ１構造である。一例では、５’キャップは、キャップ０構造であり、例えば、５’－キャップ（すなわち、キャップ０）は、５’－５’三リン酸架橋を介してｍＲＮＡの残部に接続した反転７－メチルグアノシンからなる。一例では、５’キャップは、キャップ１構造であり、例えば、５’－キャップ（すなわち、キャップ１）は、開始ヌクレオチドの２’Ｏ位置の追加のメチル化を有するキャップ０からなる。

【0233】

一例では、ｍＲＮＡは、精製される。ｍＲＮＡを精製するための様々な方法は、当業者には明らかであろう。例えば、ｍＲＮＡは、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）沈殿を使用して精製される。別の例では、ｍＲＮＡは、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して精製される。精製後、ｍＲＮＡは、例えば、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁される。

【0234】

組成物
本開示は、本開示の自己複製ＲＮＡを含む免疫原性組成物を提供する。

【0235】

本開示はまた、本開示の免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。

【0236】

本開示の自己複製ＲＮＡが、裸のＲＮＡとして、又は細胞への侵入を促進する脂質、ポリマー、若しくは他の送達システムと組み合わせて存在し得ることは、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0237】

送達システム
一例では、本開示の薬学的組成物は、ＬＮＰ、ポリマー微粒子、及び水中油型エマルジョンを更に含む。例えば、自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰ、ポリマー微粒子、又は水中油型エマルジョンにカプセル化、結合、又は吸着している。

【0238】

脂質ナノ粒子
一例では、本開示の薬学的組成物は、ＬＮＰを更に含む。

【0239】

「脂質ナノ粒子」という用語は、水性体積が、非水性コア及び固体脂質ナノ粒子を有する両親媒性脂質二重層（例えば、単一、単層、又は複数、多層）ミセル様脂質ナノ粒子によってカプセル化され、固体脂質ナノ粒子が、脂質二重層を欠く、リポソーム又は小胞を含むがこれらに限定されない、任意の脂質組成物を指すことが明らかであろう。

【0240】

本開示における使用に好適な脂質ナノ粒子は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。脂質は、アニオン性、カチオン性、又は双性イオン性親水性ヘッド基を有することができる。

【0241】

一例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、ステロール構造脂質、及び／又は中性脂質を含む。一例では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を更に含む。一例では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含まない。

【0242】

一例では、ＬＮＰは、ＰＥＧ脂質を含む。例えば、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0243】

一例では、ＬＮＰは、構造脂質を含む。例えば、構造脂質は、コレステロールフェコステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、及びアルファ－トコフェロール、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0244】

一例では、ＬＮＰは、中性脂質を含む。本開示における使用のための例示的なリン脂質（アニオン性又は双性イオン性）としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルグリセロールが挙げられる。例えば、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリン、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0245】

一例では、ＬＮＰは、カチオン性脂質を含む。例示的なカチオン性脂質としては、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，５－ビス（（９ｚ，１２ｚ）－オクタデカ－９，１２，ジエン－１－イルオキシル）ベンジル－４－（ジメチルアミノ）ブトノエート（ＬＫＹ７５０）が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、リン脂質は、２，５－ビス（（９ｚ，１２ｚ）－オクタデカ－９，１２，ジエン－１－イルオキシル）ベンジル－４－（ジメチルアミノ）ブトノエート（ＬＫＹ７５０）である。例示的な双性イオン性脂質としては、アシル双性イオン性脂質及びエーテル双性イオン性脂質、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、及びドデシルホスホコリンが挙げられるが、これらに限定されない。脂質は、飽和又は不飽和であり得る。

【0246】

ポリマー微粒子
一例では、本開示の薬学的組成物は、ポリマー微粒子を更に含む。

【0247】

当業者は、様々なポリマーが、本開示の自己複製ＲＮＡをカプセル化又は吸着する微粒子を形成することができることを認識しているであろう。実質的に非毒性のポリマーの使用は、粒子が安全であることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、粒子が長期持続を回避するために送達後に代謝することができることを意味することが明らかであろう。有用なポリマーはまた、薬学的グレード製剤の調製において補助するために、滅菌可能である。

【0248】

例示的な非毒性及び生分解性ポリマーとしては、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来のポリカーボネート、ポリビニル－ピロリジノン又はポリエステル－アミド、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0249】

水中油型カチオン性エマルジョン
一例では、本開示の薬学的組成物は、水中油型カチオン性エマルジョンを更に含む。

【0250】

水中油型エマルジョンにおける使用に好適な油は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。例えば、エマルジョンは、例えば、動物（例えば、魚）又は植物源（例えば、堅果、種子、穀物）に由来する１つ以上の油を含む。当業者は、生体適合性及び生分解性油が優先的に使用されることを認識するであろう。例示的な動物油（すなわち、魚油）としては、タラ肝油、サメ肝油、及びクジラ油が挙げられる。例示的な植物油としては、ピーナッツ油、ココナッツ油、オリーブ油、大豆油、ホホバ油、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油、トウモロコシ油が挙げられる。

【0251】

油に加えて、水中油型エマルジョンはまた、エマルジョンの形成及び安定化を促進するカチオン性脂質を含む。好適なカチオン性脂質は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。例示的なカチオン性脂質としては、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシル－アンモニウム（ＤＤＡ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチル－アンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル［Ｃ１６：０］トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、及びジステアロイルイルルチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0252】

いくつかの例では、水中油型エマルジョンはまた、非イオン性界面活性剤及び／又は双性イオン性界面活性剤を含む。当業者は、本開示における使用に好適な界面活性剤を認識しているであろう。例示的な界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０）、並びにエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0253】

薬学的に許容される担体
好適には、本開示の自己複製ＲＮＡの対象への投与のための組成物又は方法において、自己複製ＲＮＡは、当該技術分野で理解されるように、薬学的に許容される担体と組み合わされる。したがって、本開示の一例は、薬学的に許容される担体と組み合わされた本開示の自己複製ＲＮＡ（及び任意の送達システム）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。

【0254】

一般的に、「担体」とは、任意の対象、例えば、ヒトに安全に投与され得る固体若しくは液体充填剤、結合剤、希釈剤、カプセル化物質、乳化剤、湿潤剤、溶媒、懸濁剤、コーティング、又は潤滑剤を意味する。特定の投与経路に応じて、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）に記載されるように、当該技術分野で知られる、様々な許容される担体が使用され得る。

【0255】

本開示の自己複製ＲＮＡは、予防的若しくは治療的処理のための、非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経口、若しくは局所（ｌｏｃａｌ）投与、筋肉内投与、エアロゾル投与、又は経皮投与に有用である。一例では、自己複製ＲＮＡは、筋肉内、皮下、又は静脈内など、非経口的に投与される。例えば、自己複製ＲＮＡは、筋肉内に投与される。

【0256】

投与される自己複製ＲＮＡの製剤化は、選択される投与経路及び製剤（例えば、溶液、エマルジョン、カプセル）に従って変動するであろう。投与される自己複製ＲＮＡを含む適切な薬学的組成物は、生理学的に許容される担体中で調製することができる。溶液又はエマルジョンについて、好適な担体としては、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水性又はアルコール性／水溶液、エマルジョン、又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が挙げられる。当業者には、水、緩衝水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液、及びグリシンを含む、様々な適切な水性担体が知られている。静脈内ビヒクルは、添加剤、防腐剤、又は流体、栄養素、若しくは電解質補充剤を含むことができる（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０を参照されたい）。組成物は、任意に、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、並びに毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び乳酸ナトリウムなどの生理学的条件に近似するために必要な薬学的に許容される補助物質を含有することができる。自己複製ＲＮＡは、液体段階で保存することができ、又は保存のために凍結乾燥し、当該技術分野公知の凍結乾燥及び再構成技法に従って使用前に好適な担体中で再構成することができる。

【0257】

選択された培地中の活性成分の最適濃度は、当業者に知られている手順に従って、経験的に決定することができ、所望の最終薬学的製剤に依存するであろう。

【0258】

製剤化時に、本開示の組成物は、投与製剤と適合性の方法で、かつ治療的／予防的に有効な量で投与されるであろう。本開示の分子の投与のための投与量範囲は、所望の効果を生成するのに十分な大きさのものである。例えば、組成物は、有効量の自己複製ＲＮＡを含む。一例では、組成物は、治療有効量の自己複製ＲＮＡを含む。別の例では、組成物は、予防有効量の自己複製ＲＮＡを含む。

【0259】

投与量は、有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきではない。一般に、投与量は、患者における年齢、状態、性別、及び疾患の程度で変動し、当業者によって決定され得る。投与量は、任意の合併症の事象において個々の医師によって調整され得る。

【0260】

投与量は、１日１回以上の用量投与で、１日又は数日にわたって、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇで変動することができる。

【0261】

いくつかの例では、自己複製ＲＮＡは、後続（維持用量）よりも高い初期（又は負荷）用量で投与される。例えば、自己複製ＲＮＡは、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの初期用量で投与される。次いで、自己複製ＲＮＡは、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの維持用量で投与される。維持用量は、７～３５日毎、例えば、７日又は１４日又は２８日毎に投与され得る。

【0262】

いくつかの例では、用量漸増レジームが使用され、自己複製ＲＮＡは、後続の用量で使用されるよりも低い用量で初期に投与される。この投与量レジームは、対象が初期に有害事象に罹患している場合に有用である。

【0263】

治療に適切に応答していない対象の場合では、１週間に複数回の用量が投与され得る。代替的に、又は加えて、増加する用量が投与され得る。

【0264】

対象は、結合タンパク質の少なくとも約２回の曝露、例えば、約２～６０回の曝露、より具体的には約２～４０回の曝露、最も具体的には約２～２０回の曝露などの、２回以上の曝露又は用量のセットを与えられることによって、自己複製ＲＮＡで再治療され得る。

【0265】

一例では、対象は、０日目に自己複製ＲＮＡの第１の用量で治療され、続いて２１日目に自己複製ＲＮＡの第２の用量で治療される。例えば、第１及び第２の用量は、２１日（又は３週間）あけて投与される。

【0266】

別の例では、対象は、０日目に自己複製ＲＮＡの第１の用量で治療され、続いて２８日目に自己複製ＲＮＡの第２の用量で治療される。例えば、第１及び第２の用量は、２８日（又は４週間）あけて投与される。

【0267】

一例では、任意の再治療は、疾患の徴候又は症状が戻ったときに与えられ得る。

【0268】

別の例では、任意の再治療は、定義された間隔で与えられ得る。例えば、後続の曝露は、例えば、約２４～２８週間又は４８～５６週間以上などの、様々な間隔で投与され得る。例えば、そのような曝露は、各々約２４～２６週間又は約３８～４２週間又は約５０～５４週間の間隔で投与される。

【0269】

治療に適切に応答していない対象の場合では、１週間に複数回の用量が投与され得る。代替的に、又は加えて、増加する用量が投与され得る。

【0270】

別の例では、有害反応を経験している対象について、初期（又は負荷）用量は、１週間の数日にかけて、又は多数の連続した日数にかけて分割され得る。

【0271】

本開示の方法による自己複製ＲＮＡの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的又は予防的であるか、及び当業者に既知の他の因子に応じて、連続的又は断続的であり得る。自己複製ＲＮＡの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であり得るか、又は、例えば、状態の発症中若しくは後のいずれかで、一連の間隔をあけた用量であり得る。

【0272】

スクリーニングアッセイ
本開示の自己複製ＲＮＡを選択するための好適な方法は、当業者に利用可能である。アッセイは、例えば、血清学及び免疫応答を含む、ＲＮＡの効率及び有効性を評価するために実施され得る。

【0273】

抗原発現
一例では、自己複製ＲＮＡは、目的の遺伝子の発現について評価される。

【0274】

例えば、抗原発現は、目的の遺伝子に対する抗体を使用して検出される。一例では、抗原発現について陽性の細胞の数は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定される。別の例では、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、ＦＡＣＳを使用して決定される。更なる例では、ＲＮＡの単位質量当たりの特定の効力値又はトランスフェクション成功確率が計算される。

【0275】

マイクロ中和アッセイ
一例では、自己複製ＲＮＡ（裸及び／又は製剤化）は、抗体応答について評価される。例えば、自己複製ＲＮＡは、マイクロ中和アッセイを使用して評価される。マイクロ中和アッセイを実施する方法は、当業者には明らかであろう。一例では、マイクロ中和アッセイは、短い形態のアッセイである。一例について、ウイルス蛍光フォーカスベースのマイクロ中和アッセイが実施される。別の例では、マイクロ中和アッセイは、長い形態のアッセイである。

【0276】

抗原特異的Ｔ細胞応答
一例では、自己複製ＲＮＡは、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するその能力について評価される。抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導を評価する方法は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。

【0277】

例えば、抗原特異的Ｔ細胞検出は、脾臓培養物で行われる。簡潔には、脾臓細胞培養物は、Ｔ細胞培地において確立され、細胞培養物は、抗原ペプチドで刺激されているか、又は刺激されていないかのいずれかである。一例では、抗原特異的Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーを使用して決定される。

【0278】

中和アッセイ
本開示の自己複製ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ＲＢＤに結合するそれらの能力についてインビトロでスクリーニングされ得、Ｓタンパク質ＲＢＤのＡＣＥ２への結合を中和する。好適なアッセイは、当業者には明らかであり、例えば、Ｖｅｒｏマイクロ中和アッセイ、ｓＶＮＴアッセイ、又は偽ウイルス中和アッセイ（例えば、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を使用する）を含む。

【0279】

一例では、中和アッセイは、Ｖｅｒｏマイクロ中和アッセイである。簡潔には、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２野生型ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞（すなわち、アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞から単離されたＶｅｒｏ系統）において継代される。試験タンパク質の２倍段階希釈物を、１時間にわたって１００ ＴＣＩＤ_５０（すなわち、組織培養感染性用量中央値）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とインキュベートし、残留ウイルス感染性を、Ｖｅｒｏ細胞において評価し、例えば、５日目に、ウイルス性細胞障害効果を読み取る。中和抗体力価は、前述のように、Ｒｅｅｄ／Ｍｕｅｎｃｈ法を使用して計算される（Ｈｏｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ ２００４）。

【0280】

一例では、中和アッセイは、代理中和試験（ｓＶＮＴ）である。簡潔には、プレートのウェルは、炭酸塩－重炭酸塩コーティング緩衝液（例えば、ｐＨ９．６）中のｈＡＣＥ２タンパク質でコーティングされる。試験タンパク質と予めインキュベートされたＨＲＰコンジュゲートＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＨＲＰコンジュゲートＳＡＲＳ－ＣｏＶ－ＲＢＤは、異なる濃度でｈＡＣＥ２に添加され、例えば、室温で１時間インキュベートされる。非結合ＨＲＰコンジュゲート抗原は、洗浄によって除去される。比色シグナルは、ＨＲＰと発色基質、例えば、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）との酵素反応で展開される。一例では、４５０ｎｍ及び５７０ｎｍでの吸光度読み取り値が取得される。

【0281】

一例では、中和は、偽ウイルス中和アッセイである。簡潔には、ＳＡＲＳ－２－スパイクタンパク質で偽型化されたＨＩＶレポーターウイルスは、ＳＡＲＳ－２－ＣＯＶ－２スパイクプラスミドの、ウイルスバックボーンプラスミド（例えば、ｐＤＲ－ＮＬ Δｅｎｖ ＦＬＵＣ）と一緒に、例えば、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞への共トランスフェクションによって産生される。偽ウイルスは、トランスフェクション後に採取され、濾過によって清澄化される。相対ルシフェラーゼ単位感染用量（ＲＬＵ）として報告される、ウイルスストック力価は、ウイルス感染の読み出しとしてルシフェラーゼ活性を測定するＨｅｌａ－ｈＡＣＥ２細胞における限界希釈感染によって計算される。

【0282】

治療又は予防の方法
本開示は、ワクチンとして本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を使用する方法を提供する。

【0283】

本開示はまた、対象において疾患若しくは状態を治療する、又は予防する、又は進行を遅延する方法であって、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。例えば、疾患又は状態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、ＡＲＤＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0284】

コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）
本開示は、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を治療する、又は予防する、又は進行を遅延する方法を提供する。

【0285】

本開示はまた、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療する、又は予防する、又は進行を遅延する方法を提供する。本開示のいくつかの例では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有するが、臨床的に診断されたＣＯＶＩＤ－１９を有さない。

【0286】

ＣＯＶＩＤ－１９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる感染性疾患である。一般的な症状には、発熱、咳、疲労、息切れ、並びに嗅覚及び味覚の喪失が含まれる。症例の大部分は軽度の症状をもたらすが、一部はＡＲＤＳに進行する。曝露から症状の発症までの時間は、典型的には約５日であるが、２～１４日の範囲であり得る。現在、ＣＯＶＩＤ－１９のためのワクチンも特定の抗ウイルス治療もなく、管理は、症状の治療、支持療法、隔離、及び実験的措置を含む。

【0287】

よって、いくつかの例では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する。一例では、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９、例えば、重度ＣＯＶＩＤ－１９を有する。特に、重度ＣＯＶＩＤ－１９は、多くの場合ＡＲＤＳを引き起こす。本開示の方法は、重度ＣＯＶＩＤ－１９に罹患している対象においてＡＲＤＳを治療する、又は予防する、又は進行を遅延するために使用することができる。

【0288】

急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）
本開示は、例えば、対象においてＡＲＤＳを治療する、又は予防する、又は進行を遅延する方法を提供する。

【0289】

ＡＲＤＳは、両側肺浸潤、重度低酸素血症、及び肺胞－毛細血管バリアの破壊（すなわち、肺血管漏出）を特徴とする生命を脅かす状態であり、非心原性肺浮腫を引き起こす。現在、有効な薬理学的療法はない。

【0290】

インフルエンザ及びコロナウイルス感染症を含む、感染性病因は、ＡＲＤＳの主な原因である。したがって、本開示の一例では、ＡＲＤＳは、コロナウイルス感染症と関連している。例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ感染症である。一例では、ＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症と関連している。

【0291】

ＡＲＤＳは、以下を含む、ベルリン定義に従って分類される：
（１）呼吸器症状の臨床的発作又は発症から１週間以内の提示、
（２）連続気道陽圧（ＣＰＡＰ）又は呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）の少なくとも５ｃｍでの３００ｍｍＨｇ以下のＰａＯ２／ＦｉＯ２比によって決定される、急性低酸素性呼吸不全であって、ＰａＯ２が、動脈血中の酸素の分圧であり、ＦｉＯ２が、吸入酸素の画分である、急性低酸素性呼吸不全、
（３）浸出、凝固、又は無気肺によって完全に説明されない肺レントゲン写真上の両側の影、及び
（４）心不全又は体液過負荷によって完全に説明されない浮腫／呼吸不全。

【0292】

一例では、対象は、ＡＲＤＳを有するか、又はこれに罹患している（すなわち、対象は、ＡＲＤＳのベルリン定義を満たす）。例えば、対象は、治療を必要としている（すなわち、それを必要としている）。

【0293】

一例では、対象は、ＡＲＤＳに関連する症状を有するか、又はこれに罹患している。ＡＲＤＳに関連する症状、及びＡＲＤＳを発症するリスクのある対象を特定する方法は、当業者には明らかであり、かつ／又は本明細書に記載される。例えば、対象は、以下の症状のうちの１つ以上又はすべてを有する：
ａ）毎分３０回を超える呼吸頻度、
ｂ）室内気で９３％以下の酸素飽和度（ＳｐＯ_２）、
ｃ）３００ｍｍＨｇ未満の吸入酸素の画分に対する動脈酸素分圧の比（ＰａＯ_２／ＦｉＯ_２）、
ｄ）２１８未満のＳｐＯ_２／ＦｉＯ_２比、及び
ｅ）５０％を超える量のレントゲン写真の肺浸潤。

【0294】

現在、ＡＲＤＳは、関連する増加した死亡率によって、軽度、中等度、又は重度として分類される。ＡＲＤＳの重症度は、以下のようにベルリン定義に従って分類することができる：
（ｉ）軽度ＡＲＤＳ：少なくとも５ｃｍのＣＰＡＰ又はＰＥＥＰ上の２００～３００ｍｍＨｇのＰａＯ_２／ＦｉＯ_２、
（ｉｉ）中等度ＡＲＤＳ：少なくとも５ｃｍのＰＥＥＰ上の１００～２００ｍｍＨｇのＰａＯ_２／ＦｉＯ_２、及び
（ｉｉｉ）重度ＡＲＤＳ：少なくとも５ｃｍのＰＥＥＰ上の１００ｍｍＨｇ以下のＰａＯ_２／ＦｉＯ_２。

【0295】

一例では、ＡＲＤＳは、軽度ＡＲＤＳである。別の例では、ＡＲＤＳは、中等度ＡＲＤＳである。更なる例では、ＡＲＤＳは、重度ＡＲＤＳである。

【0296】

本開示の方法は、既存のＡＲＤＳの治療に加えて、ＡＲＤＳの発症を予防するために使用することができる。よって、一例では、対象は、ＡＲＤＳを有さない。

【0297】

キット
本開示の別の例は、上述のような疾患若しくは障害の治療又は予防又は進行を遅延することに有用な、本開示の自己複製ＲＮＡを含有するキットを提供する。

【0298】

一例では、キットは、（ａ）任意に送達システム及び／又は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤中の自己複製ＲＮＡを含む容器と、（ｂ）対象において疾患又は障害（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９又はＡＲＤＳ）を治療する、又は予防する、又は進行を遅延するための説明書を有する添付文書と、を含む。

【0299】

本開示のこの例によれば、添付文書は、容器上にあるか、又は容器に関連付けられている。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、本開示の疾患又は障害に有効である組成物を保持又は含有し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、自己複製ＲＮＡである。ラベル又は添付文書は、組成物が、治療に適した対象、例えば、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染症、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳを発症しているか、又は発症しやすい対象を治療するために使用されることを示し、投与量及び治療の間隔、並びに任意の他の医薬品に関する特定のガイダンスが提供される。キットは、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、及び／又はデキストロース溶液などの、薬学的に許容される希釈剤緩衝液を含む追加の容器を更に含み得る。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含み得る。

【0300】

本開示は、以下の非限定的な実施例を含む。

【実施例】

【0301】

実施例１：自己複製ＲＮＡの生成
自己複製ＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型を、ＤＮＡプラスミドで形質転換された有能なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞において産生した。個々の細菌コロニーを単離し、得られたプラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ培養物中で増幅した。発酵後、プラスミドＤＮＡをＭａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡキットを使用して単離し、制限消化によって線状化した。次いで、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を使用して、制限酵素を除去した。

【0302】

ｍＲＮＡを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、線状化ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって作製した。その後、ＤＮａｓｅ消化によってＤＮＡ鋳型を除去した。酵素キャッピングをキャップ０で実施して、機能的ｍＲＮＡを提供した。得られたｍＲＮＡを精製し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。

【0303】

自己複製ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０からのスパイク（Ｓ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）抗原を用いて調製した。以下の構築物を調製した：
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ｗｔ）（Ｃｏ５）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｎ（ｗｔ）（Ｃｏ６）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ）（Ｃｏ１６）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ及び９８６Ｐ／９８７Ｐ）（Ｃｏ１７）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（Ｄ６１４Ｇ）（Ｃｏ４８）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ及びＤ６１４Ｇ）（Ｃｏ４９）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ及びＳ２’）（Ｃｏ５８）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ、Ｓ２’及びＤ６１４Ｇ）（Ｃｏ５９）

【0304】

実施例２：自己複製ＲＮＡのインビトロ特徴分析
実施例１で産生された自己複製ＲＮＡを、目的の遺伝子の発現について評価した。

【0305】

非製剤化（裸の）又はＬＮＰ製剤化自己増幅ｍＲＮＡ構築物の２倍段階希釈物を、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株にエレクトロポレート又はトランスフェクトした。１７～１９時間後、細胞を採取し、抗Ｓ又は抗Ｎ抗体を使用して、Ｓ又はＮ抗原発現のいずれかについて染色した。抗原発現について陽性の細胞数及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳによって測定した。データを分析して、特定の効力値（ＲＮＡの質量単位当たりのトランスフェクション成功確率）を計算した。

【0306】

非製剤化ＲＮＡ及びＬＮＰのインビトロ活性及び効力を、Ｓ及びＮ発現に基づいてＦＡＣによって決定し、以下の表１に示す：

【表2】

【0307】

抗体応答
抗体応答を評価するために、血清を試験終了時（すなわち、第１の４２日後、又は最後の、第２のワクチン用量の２１日後）に収集し、マイクロ中和アッセイ（表２）及びＡＣＥ２結合（表３）によって試験した。

【0308】

すべての血清学的アッセイについて、血清を、受容体破壊酵素（ＲＤＥ）としても知られるＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅノイラミニダーゼ（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で、同じように処理し、ＰＢＳで１：１０の開始希釈物に希釈した。Ｈ５Ｎ１ウイルスに対するヒツジ血清（ＦＤＡ／ＣＢＥＲ Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ ｌｏｔ ｎｕ．Ｈ５－Ａｇ－１１１５）を陽性対照血清３アッセイとして使用した。

【0309】

マイクロ中和アッセイ
ウイルス蛍光フォーカスベースマイクロ中和（ＦＦＡ ＭＮ）アッセイを、社内で開発されたプロトコルを使用して行った。ＲＤＥ処理された試験マウス試料及び陽性対照血清を、熱不活性化し、ＰＢＳで１：４０の開始希釈物に希釈し、中和培地（１％ＢＳＡ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＢＳＡ－３０）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）で補足された、最小必須培地Ｄ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯで構成される）中和培地中でＵ－Ｂｏｔｔｏｍ ９６ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を使用して４倍段階希釈した。ウイルスを、中和培地中で約１，０００～１，５００蛍光フォーカス形成単位（ＦＦＵ）／ウェル（２０，０００～３０，０００ＦＦＵ／ｍＬ）に希釈し、希釈された血清に対して１：１の比で添加した。

【0310】

３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベーション後、ＭＤＣＫ ３３０１６－ＰＦ細胞を含有するプレート（Ｈａｌｆ Ａｒｅａ ９６ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、この混合物に接種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩１６～１８時間にわたってインキュベートした。ＭＤＣＫ ３３０１６－ＰＦ細胞は、細胞増殖培地（１０％ＨｙＣｌｏｎｅ胎仔ウシ血清－ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補足された、Ｄ－ＭＥＭで構成される）中で６～８時間早く３．０Ｅ４／ウェル（３．０Ｅ６／プレート）として播種されていた。一晩のインキュベーション後、及び免疫染色前に、細胞をアセトン及びメタノールの低温混合物で固定した。

【0311】

このウイルスを、０．０５％トゥイーン－２０（Ｓｉｇｍａ）及び２％ＢＳＡ（画分Ｖ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、２９６０、１１９４Ｃ１７５）を含有するＰＢＳ緩衝液に希釈されたスパイク（Ｓ）タンパク質に特異的なモノクローナル抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１１００１）の室温での別個の１時間のインキュベーションを使用して視覚化した。Ｓタンパク質を、４８２及び５３６ｎｍの励起及び発光波長でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）蛍光フィルターセットを使用して、ＣＴＬイムノスポットアナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）によって定量化した。蛍光フォーカスを、カスタム分析モジュールを使用して、ソフトウェアＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ７．０．１２．１プロフェッショナルアナライザーＤＣの使用によって列挙した。データをこのソフトウェアによってＥｘｃｅｌデータ分析スプレッドシートに連続して記録し、次いで６０％フォーカス低減エンドポイントを（各プレートについて）ウイルス対照ウェルの平均フォーカス数から計算し、６０％フォーカス低減中和力価を（各試料について）６０％エンドポイントの直上及び直下のウェル間の線状補間によって計算した。

【表3】

【0312】

ＡＣＥ２結合の阻害
ＡＣＥ２結合の阻害も評価した。結果を表３に示す。

【表4】

【0313】

ＡＣＥ２結合の阻害はまた、いずれの生ウイルス又は細胞も使用する必要なく中和抗体を検出する代理ウイルス中和試験（ｓＶＮＴ）を使用して評価した。ウイルススパイク（Ｓ）タンパク質及び宿主細胞受容体ＡＣＥ２由来の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）タンパク質を使用して、この試験は、ＥＬＩＳＡプレートにおける直接的なタンパク質－タンパク質相互作用によるウイルス－宿主相互作用をよく模倣するように設計されている。高度に特異的な相互作用は、次いで、中和され、すなわち、従来のＶＮＴと同じ方法で、動物血清中の特異的ＮＡｂによってブロックされる。

【0314】

結果を表３Ａに示す。

【表5】

【0315】

Ｓ及びＮタンパク質抗体
Ｎタンパク質に特異的な抗体も、ＥＬＩＳＡによって評価した。 結果を表４に示す。Ｓタンパク質に特異的な抗体も、ＥＬＩＳＡによって評価した。結果を表５に示す。

【表6】

【表7】

【0316】

偽ウイルス中和
ｓＶＮＴアッセイに加えて、偽ウイルス中和アッセイを使用して中和能力を評価した。偽ウイルスアッセイは、ウイルスの細胞への侵入を防止する構築物の能力を実証するために使用される。結果を表６に示す。

【表8】

【0317】

細胞媒介性免疫応答
自己複製ＲＮＡ Ｃｏ５、Ｃｏ６、Ｃｏ１６（Ｓ（ＱＱＡＡ））、及びＣｏ１７（Ｓ（ＱＱＡＡ、ＰＰ）を、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するそれらの能力について評価した。

【0318】

抗原特異的Ｔ細胞検出を脾臓培養物に実施した。簡潔には、脾臓細胞を解離溶液（ａｕｔｏＭＡＣＳリンス溶液でのＭＡＣＳ ＢＳＡストック１：２０）中で解離し、４Ｅ７細胞／ｍｌで濃縮した。簡潔には、脾臓細胞培養物を、ＲＰＭＩ、ＮＥＡＡ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、及びβＭＥを含有するＴ細胞培地中の９６ウェルプレートにおいて確立し、３７℃／５％ＣＯ_２で培養した。抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５３２９４）及び抗ＣＤ１０７ａ（クローン＃１Ｄ４Ｂ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１２１６１８）を各ウェルに添加した。細胞培養物は、刺激又は非刺激のいずれかであった。培養物Ｎ ｐｅｐ ｍｉｘ（ＣｏＶ－２全長Ｎタンパク質のアミノ酸残基１～４１９に及ぶ）、Ｓ ｐｅｐ ｍｉｘ １（ＣｏＶ－２全長Ｓタンパク質のアミノ酸残基１～６４３に及ぶ）、Ｓ ｐｅｐ ｍｉｘ ２（ＣｏＶ－２全長Ｓタンパク質のアミノ酸残基６３３～１２７３に及ぶ）を刺激するために、ＣｏＶ－１ Ｓペプチド（ＣＹＧＶＳＡＴＫＬ）又はＣｏＶ－２ Ｓペプチド（ＣＹＧＶＳＰＴＫＬ）を添加した。２時間の刺激後、ゴルジプラグ（ブレフェルジンＡ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５５０２９を含む）を各ウェルに添加した。細胞を３７℃で合計６時間インキュベートし、その後、細胞を４℃に移し、一晩保存した。

【0319】

抗原特異的Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリーを使用して決定した。簡潔には、Ｆｃブロック混合物（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５３１４２）を各ウェルに添加し、続いて細胞外染色（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ ｐｌｕｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６６３８５）、ＩＣＯＳ ＢＶ７１１（クローンＣ３９８．４Ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１３５４８）、ＣＤ４４ ＢＵＶ３９５（クローンＩＭ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃７４０２１５）、ＣＤ３ ＢＶ７８６（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６４３７９）、ＣＤ４ ＡＰＣ－Ｈ７（クローンＧＫ１．５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６０１８１）、ＣＤ８ ＡＦ７００（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５７９５９）、及び染色緩衝剤を含む）を添加した。細胞を、製造業者のプロトコルに従ってＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃０１－２２２－４２）で染色し、４℃で３０分間インキュベートし、光から保護した。細胞を、染色緩衝液で洗浄し、遠心分離し、染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターを使用してデータを取得した。

【0320】

抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を、Ｎ及びＳ構築物の両方に観察した。ｓａ－ｍＲＮＡワクチンによって誘発されたＣＤ４ Ｔ細胞は、ほとんどがＴｈ０（ＩＬ２＋及び／又はＴＮＦａ＋、ＩＦＮｇ－、ＩＬ５－、ＩＬ１３－）及びＴｈ１（ＩＦＮｇ＋、ＩＬ５－、ＩＬ１３－）であり、Ｔｈ２（ＩＬ５＋及び／又はＩＬ１３＋、ＩＦＮｇ－）はほとんど又は全くなかった（図１）。同様の頻度のＳ１及びＳ２反応性ＣＤ４ Ｔ細胞が見出されたが、ＣＤ８ Ｔ細胞については、Ｓ１反応性Ｔ細胞が、広範なサイトカイン表現型、３倍、２倍、及び単一のサイトカイン産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞でＳ２反応性Ｔ細胞に対して優勢であった。

【0321】

ＩｇＧサブクラス
生成された免疫応答のタイプ、すなわち、Ｔｈ１対Ｔｈ２タイプの応答を特徴分析するために、Ｓ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ ＩｇＧサブクラスをＥＬＩＳＡによって評価した。ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ応答との間にはほとんど差が観察されなかった（表７）。

【表9】

【0322】

実施例５：自己複製ＲＮＡでの免疫化の保護効果
免疫化の保護効果を評価するために、ハムスターを、１日目及び２２日目に３μｇのＲＮＡ／ハムスター又は０．３μｇのＲＮＡ／ハムスターの用量のＣｏ１６で免疫化した。すべての動物に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳウイルスで第２の免疫化の２８日後に鼻腔内でチャレンジし、４日後に屠殺し、肺及び鼻甲介で測定された感染性ウイルスについて肺及び鼻甲介を収集した。

【0323】

ハムスターでは、３．０及び０．３μｇの用量は、中和力価ＧＭＴをそれぞれ３９４及び２７０として上昇させた。

【0324】

ウイルス感染からの肺の保護を評価するために、肺からの平均ウイルス回収を、Ｃｏ１６で免疫化されたハムスター及びＰＢＳによって免疫化された対照ハムスターについて比較した。対照ハムスターからのウイルス力価は５，０１１，８７２ ＴＣＩＤ５０／ｇｒ．であったが、ワクチン接種されたハムスターからの平均ウイルス回収は、アッセイの定量限界を下回り、＜２０ ＴＣＩＤ５０／ｇｒ．、研究に含まれるすべてのワクチンで下気道の完全な保護を実証した。

【0325】

上気道の保護を評価するために、鼻甲介からのウイルス回収を、１２０，２２６，４４３ ＴＣＩＤ５０／ｇｒ．の対照ハムスターからの平均ウイルス回収で測定した。ウイルス力価は、それぞれ３．０及び０．３μｇの用量でＣｏ１６で免疫化されたハムスターについて、１０^４～１０^５倍、１，９９５及び９，１２０ ＴＣＩＤ５０／ｇｒ．に低減した。これらの結果は、ｓａ－ｍＲＮＡ Ｓが上気道におけるウイルス感染を有意に低減したことを実証した。

【0326】

実施例６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への自己複製ＲＮＡでの二重投与
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ及びＮ抗原は、免疫学的に交差反応しない。前臨床動物モデルにおける抗体免疫応答を評価するために、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μｇの用量で０日目に、２１日目に第２の用量で免疫化した。動物を４２日目に屠殺し、血清を得て、中和抗体、及びＳタンパク質のＡＣＥ２受容体への結合を阻害する抗体について試験した。

【0327】

以下の第１～第２の用量組み合わせを評価した：
・ＰＢＳ－Ｃｏ６（Ｎ）
・ＰＢＳ－Ｃｏ１６（Ｓ、ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ）
・Ｃｏ６－Ｃｏ６
・Ｃｏ６－Ｃｏ１６
・Ｃｏ６－ＰＢＳ
・Ｃｏ１６－Ｃｏ１６
・Ｃｏ１６－Ｃｏ６
・Ｃｏ１６－ＰＢＳ

【0328】

Ｓ及びＮタンパク質抗体
Ｓ及びＮタンパク質に特異的な抗体を、４２日目にＥＬＩＳＡによって評価した。結果を表８に示す。

【表10】

【0329】

相同プライム／ブーストは、抗Ｓ応答に関しては異種プライムブーストよりも効果的であったが、異種プライムブーストは、抗Ｎ応答に関しては相同プライムブーストよりも効果的であった。加えて、Ｓ（すなわち、Ｃｏ１６）によるブーストは、ＰＢＳによるブーストと比較して、抗Ｎ応答を増加させる。

【0330】

ブーストの不在では、抗Ｓ抗体は、２１日目から４２日目まで増加した（データ図示せず）。

【0331】

ＡＣＥ２結合の阻害
ＡＣＥ２結合の阻害も評価した。結果を表９に示す。

【表11】

【0332】

マイクロ中和アッセイ
ＷＴウイルス中和も評価した。結果を表１０に示す。

【表12】

【0333】

細胞媒介性免疫応答
抗原特異的Ｔ細胞応答も評価した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を、相同及び異種抗原の両方でのワクチン接種後に観察した。

【0334】

実施例６：自己複製ＲＮＡバリアントの生成
自己複製ＲＮＡを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株、すなわち、ＵＫアルファ株（Ｂ．１．１．７）、南アフリカベータ株（Ｂ．１．３５１）由来のスパイク（Ｓ）抗原を使用して調製した。以下の構築物を調製した：
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ）（Ｃｏ１６）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ及びＤ６１４Ｇ）（Ｃｏ４９）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ、Ｓ２’（Ｒ８１５Ｎ）及びＤ６１４Ｇ）（Ｃｏ５９）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ、Δ６９－７０、ΔＹ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ）（Ｃｏ７７）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ、Δ２４２－２４４、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ）（Ｃｏ７８）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ、Δ６９－７０、Δ２４２－２４４、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ）（Ｃｏ７９）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ、Δ６９－７０、ΔＹ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８０Ｈ、Ｔ７１６Ｉ）（Ｃｏ８０）
・ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ）（Ｃｏ８１）

【0335】

ＬＮＰ製剤化ＲＮＡのインビトロ活性及び効力を、上述のように決定し、以下の表１１に示す：

【表13】

【0336】

表１２に示されるように、すべての構築物は、インビトロ活性及び効力を有する。

【表14】

【0337】

中和アッセイ
構築物の中和能力を決定するために、マイクロ中和アッセイを、参照Ｗｈｕａｎ配列、並びにアルファバリアント（Ｂ．１．１．７、ＵＫ株）、ベータバリアント（Ｂ．１．３５１、南アフリカ株）、ガンマバリアント（Ｐ．１、ブラジル株）、及びデルタバリアント（Ｂ．１．６１７．２、インド株）に対して行った。

【0338】

図２に示されるように、すべての構築物は、すべての株に対して免疫応答を生成した。

【0339】

ＡＣＥ２結合の阻害
ＡＣＥ２結合の阻害も評価した。結果を表１３に示す。すべての構築物は、４２日目にＡＣＥ２結合を阻害した。

【表15】

【0340】

ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
図３に示されるように、すべての構築物は、高用量及び低用量で総Ｉｇ応答を生成した。すべての構築物は、高度に交差反応的な応答を生成した。

【0341】

細胞媒介性免疫応答
バリアント構築物によって誘導されたＢ細胞の頻度を特徴分析した。

【0342】

図４及び表１４に示されるように、すべての構築物は、すべてのバリアントＢ細胞受容体特異的プローブと反応したＳ特異的Ｂ細胞を生成した。非特異的対照（すなわち、ベイト及び陰性対照ＨＡ Ｈ１なし）は、低レベルのバックグラウンド結合を示した。

【0343】

抗原特異的Ｔ細胞応答を、上述のようにフローサイトメトリーを使用して決定した。ペプチドプール（上述のような）は、バリアント株ではなく、元のＣｏＶ－２株とマッチした。すべての構築物は、Ｓ１及びＳ２エピトープと反応する抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を誘導した（図５及び表１４）。ＣＤ４ Ｔ細胞は、ほとんどがＴｈ０（ＩＬ２＋及び／又はＴＮＦａ＋、ＩＦＮｇ－、ＩＬ５－、ＩＬ１３－）及びＴｈ１（ＩＦＮｇ＋、ＩＬ５－、ＩＬ１３－）であり、Ｔｈ２（ＩＬ５＋及び／又はＩＬ１３＋、ＩＦＮｇ－）はほとんど又は全くなかった。

【表16】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【配列表】

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【国際調査報告】