知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ザイトックス セラピューティクス アクチボラゲットの特許一覧
特表2025-507294ＥＧＦＲ結合ドメインとマスキングドメインとを含む融合タンパク質
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-03-18
(54)【発明の名称】ＥＧＦＲ結合ドメインとマスキングドメインとを含む融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20250311BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250311BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250311BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250311BHJP
C07K 14/195 20060101ALN20250311BHJP
C07K 14/00 20060101ALN20250311BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
A61K45/00
A61P35/00
A61K47/68
C07K14/195
C07K14/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024546086
(86)(22)【出願日】2023-02-06
(85)【翻訳文提出日】2024-09-26
(86)【国際出願番号】 EP2023052882
(87)【国際公開番号】W WO2023148388
(87)【国際公開日】2023-08-10
(31)【優先権主張番号】2250114-2
(32)【優先日】2022-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523140072
【氏名又は名称】ザイトックス セラピューティクス アクチボラゲット
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ストール、ステファン
(72)【発明者】
【氏名】ダールソン レイタオ、チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】レフブロム、ジョン
(72)【発明者】
【氏名】メストレ ボラス、アンナ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC27
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA17
4C084NA06
4C084NA07
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA18
4H045BA19
4H045BA41
4H045BA70
4H045BA71
4H045BA72
4H045CA11
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
ＥＧＦＲ結合ドメインと、マスキングドメインと、マスキングドメインをＥＧＦＲ結合ドメインに連結するリンカーとを含む融合タンパク質が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＥＧＦＲ結合ドメインと、マスキングドメインと、マスキングドメインをＥＧＦＲ結合ドメインに連結するリンカーとを含む融合タンパク質であって、マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み、
互いに独立して、
Ｘ１０が、Ｒ、Ｋ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
Ｘ１２が、Ａまたは置換であり、
Ｘ１３が、Ｅまたは非存在であり、
Ｘ１４が、ＴまたはＳであり、
Ｘ１５が、Ｅまたは置換であり、
Ｘ１６が、Ｉまたは置換であり、
Ｘ１９が、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２０が、Ｐ、置換または非存在であり、
Ｘ２１が、Ｎ、置換または非存在であり、
Ｘ２２が、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２３が、Ｔまたは置換であり、
Ｘ２４が、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＴまたはＹであり、
Ｘ２５が、Ｄ、Ｇ、ＩまたはＷであり、
Ｘ２６が、Ｑまたは置換であり、
Ｘ２８が、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
Ｘ２９が、Ａまたは置換であり、
Ｘ３０が、Ｆまたは置換であり、
Ｘ３１が、ＩまたはＬであり、
Ｘ３３が、Ｋまたは置換であり、かつ
Ｘ３４が、Ｌまたは置換であり、
ただし、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの６つ以下が置換であり、Ｘ１９～Ｘ２２のうちの２つ以下が非存在であり、並びに
ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＮＸ１７Ｘ１８ＱＸ２０Ｘ２１ＡＦＩＸ２５ＳＬＸ２８Ｄを含み、
互いに独立して、
Ｘ２が、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＳであり、
Ｘ３が、Ｗ、Ｄ、ＥまたはＬであり、
Ｘ４が、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、ＤまたはＷであり、
Ｘ６が、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＳであり、
Ｘ７が、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１０が、Ｒ、Ｇ、ＨまたはＫであり、
Ｘ１１が、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳであり、
Ｘ１７が、Ｇ、ＷまたはＡであり、
Ｘ１８が、Ｗ、ＧまたはＡであり、
Ｘ２０が、Ｍ、Ｌ、Ｆ、ＡまたはＥであり、
Ｘ２１が、Ｔ、Ｄ、Ｎ、ＡまたはＱであり、
Ｘ２５が、Ａ、Ｓ、Ｎ、ＧまたはＬであり、かつ
Ｘ２８が、Ｌ、Ｗ、Ｖ、ＦまたはＡである、
融合タンパク質。
【請求項2】
マスキングドメインでは、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの４つ以下が置換であり、ならびに／またはＸ１９～Ｘ２２のうちの１つ以下が非存在である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
マスキングドメインでは、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの２つ以下が置換であり、ならびに／またはＸ１９～Ｘ２２がいずれも非存在でない、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
マスキングドメインでは、Ｘ１０がＲであり、Ｘ１３が非存在であり、Ｘ１４がＴであり、Ｘ２４がＡであり、Ｘ２５がＤであり、Ｘ２８がＷであり、および／またはＸ３１がＩである、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＲＳＸ１２ＴＸ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＡＤＸ２６ＫＷＸ２９Ｘ３０ＩＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＲＳＡＴＥＩＷＷＬＰＮＬＴＡＤＱＫＷＡＦＩＹＫＬＶ（配列番号１）を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ３がＷであり、Ｘ６がＶもしくはＷであり、Ｘ１０がＲもしくはＧであり、Ｘ１７がＷもしくはＧであり、Ｘ１８がＷもしくはＧであり、および／またはＸ２１がＴもしくはＤである、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＸ２ＷＸ４ＡＷＸ７ＥＩＲＸ１１ＬＰＮＬＮＧＷＱＸ２０ＴＡＦＩＸ２５ＳＬＸ２８Ｄを含み、互いに独立して、
Ｘ２が、Ｍ、Ｖ、ＬまたはＩであり、
Ｘ４が、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、ＮまたはＤであり、
Ｘ７が、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１１が、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳであり、
Ｘ２０が、Ｍ、ＬまたはＦであり、
Ｘ２５が、Ａ、ＳまたはＧであり、かつ
Ｘ２８が、ＬまたはＶである、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２がＭであり、Ｘ４がＩ、Ｖ、ＧもしくはＳであり、Ｘ１１がＤ、ＮもしくはＥであり、Ｘ２０がＭであり、Ｘ２５がＡもしくはＳであり、および／またはＸ２８がＬである、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤ（配列番号２）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
Ｆｃ結合領域またはアルブミン結合領域（ＡＢＲ）などの半減期延長領域をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
リンカーがプロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
プロテアーゼ切断可能リンカーが、ＧＦＬＧ（配列番号１１）、グルタミン酸－バリン－シトルリン、ＧＩＬＧＶＰ（配列番号１３）、ＧＰＬＧＩＡＧＱ（配列番号１４）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５）、ＳＧＧＰＧＰＡＧＭＫＧＬＰＧＳ（配列番号１６）、ＰＬＧＬＡＧ（配列番号１７）、ＬＡＬＧＰＧ（配列番号１８）、ＫＲＡＬＧＬＰＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＲＲ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２１）、ＰＭＡＫＫ（配列番号２２）、ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号２３）、ＨＳＳＫＬＱＬ（配列番号２４）およびＲＲＳＳＹＹＳＧ（配列番号２５）からなる群から選択される配列を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、細胞傷害性分子、細胞傷害性ペプチド、細胞傷害性タンパク質または細胞傷害性放射性核種などの細胞傷害剤とを含む治療用コンジュゲート。
【請求項15】
がんに罹患している対象の治療的処置方法に使用するための、請求項１４に記載の治療用コンジュゲート。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、腫瘍細胞上に発現されるＥＧＦＲの選択的標的化に関する。
【背景技術】
【0002】
癌（がん）では、発癌性受容体の過剰発現は一般的であり、腫瘍選択的薬物を設計する機会をもたらす。しかし、多くの場合、これらの受容体はまた、健康な組織内で豊富に発現されることが多いため、安全性および有効性の観点から治療の可能性が制限される。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ－１）は、多くの癌の腫瘍形成に関与するチロシンキナーゼ受容体であり、多くの場合、過剰発現に起因する。この受容体の治療標的化は、その豊富な内因性発現に起因する全身毒性という課題を特徴とする。腫瘍微小環境内では活性が高く、循環中および健康な組織内では活性が低い薬物を設計することは、毒性プロファイルおよび有効性を顕著に改善する可能性を有し、普通であれば全身毒性によって制限される、侵襲性の高い処置を選択することを可能にする。
【発明の概要】
【0003】
アフィボディ分子は、小さな（５８アミノ酸残基、６．５ｋＤａ）３つのヘリカルな親和性タンパク質であり、効率的な組織浸透、高い安定性、機能的ドメインの単純なモジュール性、および原核生物宿主内での産生の容易さのために、抗体に基づく薬物の有望な代替物である。新規な結合特異性は、アフィボディ分子のヘリックス１および２上の表面露出残基のランダム化によって、大きなコンビナトリアルライブラリーから生じる（図１）。一般的な選択プラットフォームにはファージおよび細胞表面提示が含まれ、細胞表面提示は、蛍光支援細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）を使用して結合集団を単離し、密接に関連する親和性を区別する可能性を提供する。グラム陽性スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）上に提示される、１０９バリアントのサイズを有するアフィボディライブラリー（Ｌｏｆｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７，１０１（２３－２４），８２９３－８３０７）は、新規なアフィボディバインダーを生成するために以前に使用されている。該ライブラリーは、配列バイアスを回避するトリヌクレオチドコドンと、終止コドンとを使用して合成された。この系は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＸＭ細胞壁固定配列を利用してアフィボディライブラリーを提示する。アフィボディバリアントを提示する細胞は、可溶性の蛍光標識された目的の標的とともにインキュベートされ、続いて、蛍光シグナルに基づいてＦＡＣＳを使用して選別される。示差的に標識された蛍光アルブミンを使用して細胞表面アフィボディ発現を正規化するために、提示されたタンパク質構築物には２つのアルブミン結合ドメインが含まれて、親和性と蛍光シグナルとの間の線形相関を提供する。結合アフィボディバリアントを提示する細胞を捕捉するために固定化標的を有する磁気ビーズを使用するライブラリーの複雑さを低減するための前濃縮工程として、ＦＡＣＳの前に磁気支援細胞選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＭＡＣＳ）を使用することができる。
【0004】
本開示は、ＥＧＦＲを標的とする、条件付き活性化アフィボディに基づくプロドラッグの開発に基づく。条件付き活性化を達成するために、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）細胞表面提示を使用して、既存のＥＧＦＲ標的化アフィボディ分子の結合界面をマスクする抗イディオタイプアフィボディ分子を選択した（ＺＥＧＦＲ：２３７７、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，３７６（５），１３８８－１４０２；Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ ２０１０，３７（３），６１３－６２２および国際公開第２００７／０６５６３５号を参照）。ＺＥＧＦＲ：２３７７を以下「ＺＥＧＦＲ」と呼ぶ。
【0005】
Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）の表面上でフローサイトメトリー（ＦＣ）において高い結合傾向を示すマスキングドメイン（「ＺＢ０５」）を単離した。ＺＢ０５アフィボディを可溶性単量体として生成し、ＺＥＧＦＲへの結合、および熱安定性に関して特性評価した。ＳＰＲを使用した速度論的評価から、マスキングドメインの有用性にとって好ましい迅速な会合速度および解離速度が観察された。さらに、該タンパク質は、高い熱安定性（Ｔｍ ６４．１°Ｃ）と、単量体アフィボディ分子に見られる一般的な形質である、熱変性後のリフォールディング能力とを示した。
【0006】
ＺＢ０５の様々な残基の結合寄与を変異によって調査した。変異誘発試験の結果から、保持された結合に関していくつかのランダム化された位置の残基の柔軟性および互換性が明らかにされた（図１０を参照）。
【0007】
マスキングドメインとしてのＺＢ０５の可能性をさらに調査するために、ＴＥＶ切断可能リンカーを使用してＺＢ０５をＺＥＧＦＲ－ＡＢＰ（ＡＢＰは「アルブミン結合タンパク質」を意味する）に融合した概念実証プロアフィボディ（ｐｒｏｏｆ－ｏｆ－ｃｏｎｃｅｐｔ ｐｒｏ－ａｆｆｉｂｏｄｙ）（ＰＯＣ－ＰＡ）構築物を設計した。蛍光標識された可溶性ＥＧＦＲの存在下で、ブドウ球菌細胞上の提示されたタンパク質として、ＦＣを使用して、ＥＧＦＲ結合をマスクする能力を最初に分析した。インタクトなタンパク質を提示する細胞ではＥＧＦＲへの結合を観察することはできなかったが、ＴＥＶ－プロテアーゼによって細胞を処理した後、ＥＧＦＲへの結合は回復した。
【0008】
該構築物を可溶性分子として生成し、ＴＥＶプロテアーゼによる切断について評価した。ＴＥＶプロテアーゼとの１時間のインキュベーション後、タンパク質は完全に消化され、ＳＤＳ－ｐａｇｅゲル上に正しいサイズの明確なバンドが示された。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた組換え固定化ＥＧＦＲへの結合は、インタクトなＰＯＣ－ＰＡについてはＺＢ０５によって同様にマスクされ、切断されたＰＯＣ－ＰＡについては回復した。ヒト血清アルブミンを用いて固定化された別個の表面を使用して、インタクトなＰＯＣ－ＰＡおよび切断されたＰＯＣ－ＰＡの等しい注入量を確認した。
【0009】
内因的に発現されるＥＧＦＲへの結合について、それぞれ中程度から高レベルのＥＧＦＲを発現するＨ２９２ヒト粘膜表皮性肺癌細胞およびＡ４３１ヒト扁平上皮癌細胞に対して、インタクトなＰＯＣ－ＰＡおよび切断されたＰＯＣ－ＰＡを試験した。細胞単独に対する結合は、切断されたＰＯＣ－ＰＡだけでなく、インタクトなＰＯＣ－ＰＡでも観察することができた。それにもかかわらず、切断されたＰＯＣ－ＰＡは、両細胞株についてシグナルを増加させ、ＺＥＧＦＲに対する特異性を有しないダミーマスキングドメインとＺＢ０５が交換された構築物ＰＯＣ－ＰＡ－ＤＭに匹敵した。
【0010】
放射性標識を使用して、［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグと、非切断可能リンカー（「ダミーリンカー」）および非マスク対照を有するそのバリアントが、ＥＧＦＲ発現肝細胞に結合せずにインビボでＥＧＦＲ発現マトリプターゼ陽性癌細胞を標的とする能力を評価した。１１１Ｉｎを使用した標識では、ＤＯＴＡ－キレート剤のマレイミド誘導体を全構築物のＣ末端にコンジュゲートした。この部位特異的手法は、放射性標識がＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５融合の分布を反映することを確実にする。さらに、部位特異的標識は、様々な位置に様々な数のコンジュゲートされたキレート剤を有するタンパク質の混合物ではなく、均一に標識されたタンパク質を提供する。放射性標識された構築物はいずれも、高い放射化学的純度を有し、優れた安定性を示した。インビトロ試験では、両細胞株に対する［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識非マスク対照の結合が、非標識ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５融合およびセツキシマブを使用した受容体の飽和によって顕著に減少することが実証され、これは、結合が特異的であったことを示す。［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグおよびダミーリンカーのインビトロ結合は、はるかに低く、主に非特異的であった。これは、抗イディオタイプマスキングドメインの組込みが、インビトロでのＥＧＦＲへのこれらの構築物の結合を効率的に防止することを示唆している。
【0011】
［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグ、ダミーリンカーおよび非マスク対照の最初のインビボ評価では、血中のこれらすべてのタンパク質の濃度が非ＡＢＤ０３５融合１１１Ｉｎ－ＺＥＧＦＲの濃度よりもはるかに高く、腎摂取がはるかに低いことが実証された。この現象は、インビボでマウスアルブミンへのＡＢＤ０３５の結合が存在することを実証している。これにより、該構築物の糸球体濾過と、近位細管内のそれらの再吸収とが防がれる。したがって、非ＡＢＤ０３５融合ＺＥＧＦＲに基づく標的化構築物よりも、該構築物のバイオアベイラビリティは高く、潜在的な腎毒性は低い。この実験から得られた最も重要な観察結果は、肝摂取に関する。肝臓内の非マスク対照の摂取は高く、注射後４および２４時間でそれぞれ１７．２±１および１２．７±１．８％ ＩＤ／ｇであった。これは、肝細胞上のＥＧＦＲの顕著な発現と、マウスＥＧＦＲに対するＺＥＧＦＲの高い親和性とに起因して予測される。該プロドラッグおよびダミーリンカーは、はるかに低い肝摂取を有し、これは、マスキングドメインの組込みがその目的を果たしたことを示す。
【0012】
ＥＧＦＲ発現Ｈ２９２異種移植片を有するマウスを対象とした実験のデータから、全構築物の循環における滞留時間の延長と、［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグおよびダミーリンカーの低い肝摂取とが確認された。重要なことに、Ｈ２９２異種移植片における［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－プロドラッグの摂取は、ＥＧＦＲ陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片よりも顕著に高かった。これは、イメージング（撮像）実験でも確認された。これにより、Ｈ２９２異種移植片における摂取がＥＧＦＲ特異的であったことが実証される。別の興味深い知見は、プロドラッグおよびダミーリンカーでは、腫瘍摂取が同等に高かったことである。
【0013】
［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグの腫瘍摂取に果たすマトリプターゼの役割を解明するために、追加の実験を行った。Ｈ２９２異種移植片およびＡ４３１異種移植片を同時に有するマウスを対象として、腫瘍摂取を比較した。この実験の結果から、マトリプターゼ発現が高いＨ２９２異種移植片における摂取が、マトリプターゼ発現が低いＡ４３１異種移植片における摂取の２倍であることが実証された。同時に、細胞１個当たりのＥＧＦＲ発現は、Ａ４３１細胞ではＨ２９２細胞の３倍である。まとめると、これらのデータは、マトリプターゼが［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグの腫瘍摂取に何らかの役割を果たすことを示唆している。同時に、Ａ４３１異種移植片における摂取は、ＥＧＦＲ陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片における摂取よりも高く、これは、マトリプターゼ非依存性機構も働いていることを示唆している。
【0014】
結論として、データは、マスクされたＥＧＦＲバインダーが非マスクバージョンよりも顕著に低い肝摂取を有し、興味深いことに、マスクされたＥＧＦＲバインダーの腫瘍摂取は、プロテアーゼ切断可能リンカーとは無関係に非マスクバージョンのものと同じレベルであったことを示す。このように、マスキングドメインは、腫瘍対肝臓比を顕著に改善する。
【0015】
したがって、本開示の実施形態の以下の項目化された一覧が提供される。
１．ＥＧＦＲ結合ドメインと、マスキングドメインと、マスキングドメインをＥＧＦＲ結合ドメインに連結するリンカーとを含む融合タンパク質であって、
マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み、
互いに独立して、
Ｘ１０が、Ｒ、Ｋ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
Ｘ１２が、Ａまたは置換であり、
Ｘ１３が、Ｅまたは非存在であり、
Ｘ１４が、ＴまたはＳであり、
Ｘ１５が、Ｅまたは置換であり、
Ｘ１６が、Ｉまたは置換であり、
Ｘ１９が、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２０が、Ｐ、置換または非存在であり、
Ｘ２１が、Ｎ、置換または非存在であり、
Ｘ２２が、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２３が、Ｔまたは置換であり、
Ｘ２４が、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＴまたはＹであり、
Ｘ２５が、Ｄ、Ｇ、ＩまたはＷであり、
Ｘ２６が、Ｑまたは置換であり、
Ｘ２８が、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
Ｘ２９が、Ａまたは置換であり、
Ｘ３０が、Ｆまたは置換であり、
Ｘ３１が、ＩまたはＬであり、
Ｘ３３が、Ｋまたは置換であり、かつ
Ｘ３４が、Ｌまたは置換であり、
ただし、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの６つ以下が置換であり、Ｘ１９～Ｘ２２のうちの２つ以下が非存在であり、並びに
ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＮＸ１７Ｘ１８ＱＸ２０Ｘ２１ＡＦＩＸ２５ＳＬＸ２８Ｄを含み、
互いに独立して、
Ｘ２が、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＳであり、
Ｘ３が、Ｗ、Ｄ、ＥまたはＬであり、
Ｘ４が、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、ＤまたはＷであり、
Ｘ６が、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＳであり、
Ｘ７が、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１０が、Ｒ、Ｇ、ＨまたはＫであり、
Ｘ１１が、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳであり、
Ｘ１７が、Ｇ、ＷまたはＡであり、
Ｘ１８が、Ｗ、ＧまたはＡであり、
Ｘ２０が、Ｍ、Ｌ、Ｆ、ＡまたはＥであり、
Ｘ２１が、Ｔ、Ｄ、Ｎ、ＡまたはＱであり、
Ｘ２５が、Ａ、Ｓ、Ｎ、ＧまたはＬであり、かつ
Ｘ２８が、Ｌ、Ｗ、Ｖ、ＦまたはＡである、
融合タンパク質。
２．マスキングドメインでは、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの４つ以下が置換であり、ならびに／またはＸ１９～Ｘ２２のうちの１つ以下が非存在である、項目１の融合タンパク質。
３．マスキングドメインでは、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの２つ以下が置換であり、ならびに／またはＸ１９～Ｘ２２がいずれも非存在でない、項目２の融合タンパク質。
４．マスキングドメインが、アミノ酸配列Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み、
互いに独立して、
Ｘ５が、Ｙまたは置換であり、
Ｘ６が、Ａまたは置換であり、
Ｘ７が、Ｋまたは置換であり、かつ
Ｘ８が、Ｅまたは置換であり、
ただし、Ｘ５～Ｘ８のうちの２つ以下が置換である、項目１～３のいずれか１つの融合タンパク質。
５．マスキングドメインが、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み、
互いに独立して、
Ｘ１が、Ｖまたは置換であり、
Ｘ２が、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３が、Ａまたは置換であり、
Ｘ４が、Ｋまたは置換であり、
ただし、Ｘ１～Ｘ８のうちの４つ以下が置換である、項目４の融合タンパク質。
６．マスキングドメインでは、Ｘ１～Ｘ８のうちの２つ以下が置換である、項目５の融合タンパク質。
７．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４ＶＸ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４を含み、
互いに独立して、
Ｘ３６が、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３７が、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３８が、Ｐまたは置換であり、
Ｘ３９が、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４０が、Ｑまたは置換であり、
Ｘ４１が、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４２が、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４３が、Ｅまたは置換であり、
Ｘ４４が、Ｌまたは置換であり、
ただし、Ｘ３６～Ｘ４４のうちの４つ以下が置換である、項目１～６のいずれか１つの融合タンパク質。
８．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ４４のうちの２つ以下が置換である、項目１～７のいずれか１つの融合タンパク質。
９．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４ＶＸ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４を含み、
互いに独立して、
Ｘ４５が、Ｌまたは置換であり、
Ｘ４６が、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４７が、Ｅまたは置換であり、
Ｘ４８が、Ａまたは置換であり、
Ｘ４９が、Ｋまたは置換であり、
Ｘ５０が、Ｋまたは置換であり、
Ｘ５１が、Ｌまたは置換であり、
Ｘ５２が、Ｎまたは置換であり、
Ｘ５３が、Ｄまたは置換であり、
Ｘ５４が、Ｓまたは置換であり、
ただし、Ｘ４５～Ｘ５４のうちの５つ以下が置換である、項目７または８の融合タンパク質。
１０．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ５４のうちの７つ以下が置換である、項目９の融合タンパク質。
１１．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ５４のうちの５つ以下が置換である、項目１０の融合タンパク質。
１２．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４ＶＸ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８を含み、
互いに独立して、
Ｘ５５が、Ｑまたは置換であり、
Ｘ５６が、Ａまたは置換であり、
Ｘ５７が、Ｐまたは置換であり、
Ｘ５８が、Ｋまたは置換であり、
ただし、Ｘ５５～Ｘ５８のうちの２つ以下が置換である、項目９～１１のいずれか１つの融合タンパク質。
１３．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ５８のうち７つ以下が置換である、項目１２の融合タンパク質。
１４．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ５８のうち５つ以下が置換である、項目１３の融合タンパク質。
１５．マスキングドメインでは、Ｘ１０がＲである、項目１～１４のいずれか１つの融合タンパク質。
１６．マスキングドメインでは、Ｘ１３が非存在である、項目１～１５のいずれか１つの融合タンパク質。
１７．マスキングドメインでは、Ｘ１４がＴである、項目１～１６のいずれか１つの融合タンパク質。
１８．マスキングドメインでは、Ｘ２４がＡである、項目１～１７のいずれか１つの融合タンパク質。
１９．マスキングドメインでは、Ｘ２５がＤである、項目１～１８のいずれか１つの融合タンパク質。
２０．マスキングドメインでは、Ｘ２８がＷである、項目１～１９のいずれか１つの融合タンパク質。
２１．マスキングドメインでは、Ｘ３１がＩである、項目１～２０のいずれか１つの融合タンパク質。
２２．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＲＳＸ１２ＴＸ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＡＤＸ２６ＫＷＸ２９Ｘ３０ＩＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含む、項目１～２１のいずれか１つの融合タンパク質。
２３．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＲＳＡＴＥＩＷＷＬＰＮＬＴＡＤＱＫＷＡＦＩＹＫＬＶ（配列番号１）を含む、項目１～２２のいずれか１つの融合タンパク質。
２４．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ３がＷである、項目１～２３のいずれか１つの融合タンパク質。
２５．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ６がＶまたはＷである、項目１～２４のいずれか１つの融合タンパク質。
２６．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ１０がＲまたはＧである、項目１～２５のいずれか１つの融合タンパク質。
２７．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ１７がＷまたはＧである、項目１～２６のいずれか１つの融合タンパク質。
２８．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ１８が、ＷまたはＧ、好ましくはＷである、項目１～２７のいずれか１つの融合タンパク質。
２９．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２１が、ＴまたはＤ、好ましくはＴである、項目１～２８のいずれか１つの融合タンパク質。
３０．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＸ２ＷＸ４ＡＷＸ７ＥＩＲＸ１１ＬＰＮＬＮＧＷＱＸ２０ＴＡＦＩＸ２５ＳＬＸ２８Ｄを含み、
互いに独立して、
Ｘ２が、Ｍ、Ｖ、ＬまたはＩであり、
Ｘ４が、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、ＮまたはＤであり、
Ｘ７が、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１１が、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳであり、
Ｘ２０が、Ｍ、ＬまたはＦであり、
Ｘ２５が、Ａ、ＳまたはＧであり、かつ
Ｘ２８が、ＬまたはＶである、項目１～２９のいずれか１つの融合タンパク質。
３１．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２がＭである、項目１～３０のいずれか１つの融合タンパク質。
３２．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ４が、Ｉ、Ｖ、ＧまたはＳである、項目１～３１のいずれか１つの融合タンパク質。
３３．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ１１が、Ｄ、ＮまたはＥである、項目１～３２のいずれか１つの融合タンパク質。
３４．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２０がＭである、項目１～３３のいずれか１つの融合タンパク質。
３５．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２５がＡまたはＳである、項目１～３４のいずれか１つの融合タンパク質。
３６．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２８がＬである、項目１～３５のいずれか１つの融合タンパク質。
３７．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２がＭであり、Ｘ２０がＭであり、Ｘ２８がＬである、項目１～３６のいずれか１つの融合タンパク質。
３８．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤ（配列番号２）を含む、項目１～３７のいずれか１つの融合タンパク質。
３９．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤ（配列番号３）を含む、項目１～３８のいずれか１つの融合タンパク質。
４０．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号４）を含む、項目１～３９のいずれか１つの融合タンパク質。
４１．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号５）を含む、項目１～４０のいずれか１つの融合タンパク質。
４２．Ｆｃ結合領域またはアルブミン結合領域（ＡＢＲ）などの半減期延長領域をさらに含む、項目１～４１のいずれか１つの融合タンパク質。
４３．以下から選択されるアミノ酸配列を含むアルブミン結合領域（ＡＢＲ）をさらに含む、項目１～４２のいずれか１つの融合タンパク質
ａ）ＬＡＸ３ＡＫＸ６Ｘ７ＡＸ９Ｘ１０ ＥＬＤＸ１４ＹＧＶＳＤＸ２０ ＹＫＸ２３ＬＩＸ２６Ｘ２７ＡＫＴ ＶＥＧＶＸ３５ＡＬＸ３８Ｘ３９Ｘ４０ ＩＬＸ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６（ここで、互いに独立して、
Ｘ３が、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され、
Ｘ６が、Ｅ、Ｓ、ＶおよびＣから選択され、
Ｘ７が、Ａ、ＬおよびＳから選択され、
Ｘ９が、ＬおよびＮから選択され、
Ｘ１０が、Ａ、ＳおよびＲから選択され、
Ｘ１４が、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され、
Ｘ２０が、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ２３が、Ｎ、ＤおよびＲから選択され、
Ｘ２６が、Ｎ、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ２７が、ＮおよびＫから選択され、
Ｘ３５が、ＫおよびＥから選択され、
Ｘ３８が、ＩおよびＫから選択され、
Ｘ３９が、Ｄ、ＥおよびＬから選択され、
Ｘ４０が、Ａ、ＥおよびＨから選択され、
Ｘ４３が、ＡおよびＫから選択され、
Ｘ４４が、Ａ、ＳおよびＥから選択され、
Ｘ４５が、Ｌまたは非存在であり、
Ｘ４６が、Ｐまたは非存在である）
ならびにｂ）ａ）で定義された配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
４４．ＡＢＲが、アミノ酸配列ＬＡＸ３ＡＫＸ６Ｘ７ＡＸ９Ｘ１０ ＥＬＤＸ１４ＹＧＶＳＤＸ２０ ＹＫＸ２３ＬＩＸ２６Ｘ２７ＡＫＴ ＶＥＧＶＸ３５ＡＬＸ３８Ｘ３９Ｘ４０ ＩＬＡＡＬＰを含み、互いに独立して、
Ｘ３が、ＥおよびＳから選択され、
Ｘ６が、ＥおよびＶから選択され、
Ｘ７が、ＡおよびＬから選択され、
Ｘ９が、ＬおよびＮから選択され、
Ｘ１０が、ＡおよびＲから選択され、
Ｘ１４が、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから、好ましくはＡ、ＳおよびＫから選択され、
Ｘ２０が、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ２３が、Ｎ、ＤおよびＲから選択され、
Ｘ２６が、ＮおよびＤから選択され、
Ｘ２７が、ＮおよびＫから選択され、
Ｘ３５が、ＫおよびＥから選択され、
Ｘ３８が、ＩおよびＫから選択され、
Ｘ３９が、ＤおよびＬから選択され、
Ｘ４０が、Ａ、ＥおよびＨから選択され、
Ｘ４５が、Ｌまたは非存在であり、
Ｘ４６が、Ｐまたは非存在である、項目４３の融合タンパク質。
４５．ＡＢＲが、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４３による治療用コンジュゲート：
ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩＮＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥＡＬＫＬＨ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号６）；
ＬＡＥＡＫＥＡＡＮＡ ＥＬＤＳＹＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩＤＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥＡＬＫＤＡ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号７）；
ＧＬＡＥＡＫＥＡＡＮ ＡＥＬＤＳＹＧＶＳＤ ＦＹＫＲＬＩＤＫＡＫ ＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤ ＡＩＬＡＡＬＰ（配列番号８）；
ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＮＬＩＮＮＡＫＴ ＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号９）；
および
ＬＡＥＡＫＶＬＡＬＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＤＬＩＤＫＡＫＴ ＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号１０）。
４６．半減期延長領域が、ＥＧＦＲ結合ドメインのＣ末端側に位置する、項目４２～４５のいずれか１つの融合タンパク質。
４７．リンカーがプロテアーゼ切断可能リンカーである、項目１～４６のいずれか１つの融合タンパク質。
４８．プロテアーゼ切断可能リンカーが、ＧＦＬＧ（配列番号１１）、グルタミン酸－バリン－シトルリン、ＧＩＬＧＶＰ（配列番号１３）、ＧＰＬＧＩＡＧＱ（配列番号１４）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５）、ＳＧＧＰＧＰＡＧＭＫＧＬＰＧＳ（配列番号１６）、ＰＬＧＬＡＧ（配列番号１７）、ＬＡＬＧＰＧ（配列番号１８）、ＫＲＡＬＧＬＰＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＲＲ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２１）、ＰＭＡＫＫ（配列番号２２）、ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号２３）、ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号３８）、ＨＳＳＫＬＱＬ（配列番号２４）およびＲＲＳＳＹＹＳＧ（配列番号２５）からなる群から選択される配列を含む、項目４７の融合タンパク質。
４９．リンカーの長さが、少なくとも１２アミノ酸残基、例えば、１２～６０アミノ酸残基、例えば、２０～５０アミノ酸残基である、項目１～４８のいずれか１つの融合タンパク質。
５０．リンカーが、システイン（Ｃ）残基を含まない、項目１～４９のいずれか１つの融合タンパク質。
５１．マスキングドメインが、システイン（Ｃ）残基を含まない、項目１～５０のいずれか１つの融合タンパク質。
５２．ＥＧＦＲ結合ドメインが、システイン（Ｃ）残基を含まない、項目１～５１のいずれか１つの融合タンパク質。
５３．マスキングドメインが、ＥＧＦＲ結合ドメインのＮ末端側に位置する、項目１～５２のいずれか１つの融合タンパク質。
５４．項目１～５３のいずれか１つの融合タンパク質と、細胞傷害性分子、細胞傷害性ペプチド、細胞傷害性タンパク質または細胞傷害性放射性核種などの細胞傷害剤とを含む治療用コンジュゲート。
５５．細胞傷害剤が、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ；１８６Ｒｅ；１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１４９Ｔｂ、１６１Ｔｂ、４７Ｓｃ；２２５Ａｃ；２１２Ｐｂ；２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２２７Ｔｈ、２２３Ｒａ；５８ｍＣｏ、１３１Ｉ、７６Ａｓ、７７Ａｓおよび２１１Ａｔからなる群から選択される細胞傷害性放射性核種である、項目５４による治療用コンジュゲート。
５６．細胞傷害剤が、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、デュオカルマイシン（ＤＵＯ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、パクリタキセル（ＰＴＸ）、メルタンシン（ＤＭ１）、エムタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン（ＤＭ４）、ソラブタンシン（ＤＭ４）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）およびカリケアマイシンからなる群から選択される細胞傷害性分子である、項目５４による治療用コンジュゲート。
５７．細胞傷害剤が、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）およびデボウガニン（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）からなる群から選択されるタンパク質系毒素である、項目５４による治療用コンジュゲート。
５８．治療的処置方法に使用するための、項目５４～５７のいずれか１つによる治療用コンジュゲート。
５９．治療的処置方法が、ＥＧＦＲを過剰発現する癌などの癌（がん）に罹患している対象の処置方法である、項目５８による使用のための治療用コンジュゲート。
６０．癌（がん）が、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、結腸および直腸癌、頭頸部癌、胃食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｏｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、腎癌ならびに膵癌からなる群から選択される、項目５９による使用のための治療用コンジュゲート。
１．ＥＧＦＲ結合ドメインと、マスキングドメインと、マスキングドメインをＥＧＦＲ結合ドメインに連結するリンカーとを含む融合タンパク質であって、
マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み、
互いに独立して、
Ｘ１０が、Ｒ、Ｋ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
Ｘ１２が、Ａまたは置換であり、
Ｘ１３が、Ｅまたは非存在であり、
Ｘ１４が、ＴまたはＳであり、
Ｘ１５が、Ｅまたは置換であり、
Ｘ１６が、Ｉまたは置換であり、
Ｘ１９が、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２０が、Ｐ、置換または非存在であり、
Ｘ２１が、Ｎ、置換または非存在であり、
Ｘ２２が、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２３が、Ｔまたは置換であり、
Ｘ２４が、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＴまたはＹであり、
Ｘ２５が、Ｄ、Ｇ、ＩまたはＷであり、
Ｘ２６が、Ｑまたは置換であり、
Ｘ２８が、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
Ｘ２９が、Ａまたは置換であり、
Ｘ３０が、Ｆまたは置換であり、
Ｘ３１が、ＩまたはＬであり、
Ｘ３３が、Ｋまたは置換であり、かつ
Ｘ３４が、Ｌまたは置換であり、
ただし、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの６つ以下が置換であり、Ｘ１９～Ｘ２２のうちの２つ以下が非存在であり、並びに
ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＮＸ１７Ｘ１８ＱＸ２０Ｘ２１ＡＦＩＸ２５ＳＬＸ２８Ｄを含み、
互いに独立して、
Ｘ２が、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＳであり、
Ｘ３が、Ｗ、Ｄ、ＥまたはＬであり、
Ｘ４が、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、ＤまたはＷであり、
Ｘ６が、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＳであり、
Ｘ７が、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１０が、Ｒ、Ｇ、ＨまたはＫであり、
Ｘ１１が、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳであり、
Ｘ１７が、Ｇ、ＷまたはＡであり、
Ｘ１８が、Ｗ、ＧまたはＡであり、
Ｘ２０が、Ｍ、Ｌ、Ｆ、ＡまたはＥであり、
Ｘ２１が、Ｔ、Ｄ、Ｎ、ＡまたはＱであり、
Ｘ２５が、Ａ、Ｓ、Ｎ、ＧまたはＬであり、かつ
Ｘ２８が、Ｌ、Ｗ、Ｖ、ＦまたはＡである、
融合タンパク質。
２．マスキングドメインでは、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの４つ以下が置換であり、ならびに／またはＸ１９～Ｘ２２のうちの１つ以下が非存在である、項目１の融合タンパク質。
３．マスキングドメインでは、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの２つ以下が置換であり、ならびに／またはＸ１９～Ｘ２２がいずれも非存在でない、項目２の融合タンパク質。
４．マスキングドメインが、アミノ酸配列Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み、
互いに独立して、
Ｘ５が、Ｙまたは置換であり、
Ｘ６が、Ａまたは置換であり、
Ｘ７が、Ｋまたは置換であり、かつ
Ｘ８が、Ｅまたは置換であり、
ただし、Ｘ５～Ｘ８のうちの２つ以下が置換である、項目１～３のいずれか１つの融合タンパク質。
５．マスキングドメインが、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み、
互いに独立して、
Ｘ１が、Ｖまたは置換であり、
Ｘ２が、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３が、Ａまたは置換であり、
Ｘ４が、Ｋまたは置換であり、
ただし、Ｘ１～Ｘ８のうちの４つ以下が置換である、項目４の融合タンパク質。
６．マスキングドメインでは、Ｘ１～Ｘ８のうちの２つ以下が置換である、項目５の融合タンパク質。
７．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４ＶＸ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４を含み、
互いに独立して、
Ｘ３６が、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３７が、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３８が、Ｐまたは置換であり、
Ｘ３９が、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４０が、Ｑまたは置換であり、
Ｘ４１が、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４２が、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４３が、Ｅまたは置換であり、
Ｘ４４が、Ｌまたは置換であり、
ただし、Ｘ３６～Ｘ４４のうちの４つ以下が置換である、項目１～６のいずれか１つの融合タンパク質。
８．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ４４のうちの２つ以下が置換である、項目１～７のいずれか１つの融合タンパク質。
９．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４ＶＸ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４を含み、
互いに独立して、
Ｘ４５が、Ｌまたは置換であり、
Ｘ４６が、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４７が、Ｅまたは置換であり、
Ｘ４８が、Ａまたは置換であり、
Ｘ４９が、Ｋまたは置換であり、
Ｘ５０が、Ｋまたは置換であり、
Ｘ５１が、Ｌまたは置換であり、
Ｘ５２が、Ｎまたは置換であり、
Ｘ５３が、Ｄまたは置換であり、
Ｘ５４が、Ｓまたは置換であり、
ただし、Ｘ４５～Ｘ５４のうちの５つ以下が置換である、項目７または８の融合タンパク質。
１０．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ５４のうちの７つ以下が置換である、項目９の融合タンパク質。
１１．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ５４のうちの５つ以下が置換である、項目１０の融合タンパク質。
１２．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４ＶＸ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８を含み、
互いに独立して、
Ｘ５５が、Ｑまたは置換であり、
Ｘ５６が、Ａまたは置換であり、
Ｘ５７が、Ｐまたは置換であり、
Ｘ５８が、Ｋまたは置換であり、
ただし、Ｘ５５～Ｘ５８のうちの２つ以下が置換である、項目９～１１のいずれか１つの融合タンパク質。
１３．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ５８のうち７つ以下が置換である、項目１２の融合タンパク質。
１４．マスキングドメインでは、Ｘ３６～Ｘ５８のうち５つ以下が置換である、項目１３の融合タンパク質。
１５．マスキングドメインでは、Ｘ１０がＲである、項目１～１４のいずれか１つの融合タンパク質。
１６．マスキングドメインでは、Ｘ１３が非存在である、項目１～１５のいずれか１つの融合タンパク質。
１７．マスキングドメインでは、Ｘ１４がＴである、項目１～１６のいずれか１つの融合タンパク質。
１８．マスキングドメインでは、Ｘ２４がＡである、項目１～１７のいずれか１つの融合タンパク質。
１９．マスキングドメインでは、Ｘ２５がＤである、項目１～１８のいずれか１つの融合タンパク質。
２０．マスキングドメインでは、Ｘ２８がＷである、項目１～１９のいずれか１つの融合タンパク質。
２１．マスキングドメインでは、Ｘ３１がＩである、項目１～２０のいずれか１つの融合タンパク質。
２２．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＲＳＸ１２ＴＸ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＡＤＸ２６ＫＷＸ２９Ｘ３０ＩＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含む、項目１～２１のいずれか１つの融合タンパク質。
２３．マスキングドメインが、アミノ酸配列ＩＲＳＡＴＥＩＷＷＬＰＮＬＴＡＤＱＫＷＡＦＩＹＫＬＶ（配列番号１）を含む、項目１～２２のいずれか１つの融合タンパク質。
２４．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ３がＷである、項目１～２３のいずれか１つの融合タンパク質。
２５．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ６がＶまたはＷである、項目１～２４のいずれか１つの融合タンパク質。
２６．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ１０がＲまたはＧである、項目１～２５のいずれか１つの融合タンパク質。
２７．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ１７がＷまたはＧである、項目１～２６のいずれか１つの融合タンパク質。
２８．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ１８が、ＷまたはＧ、好ましくはＷである、項目１～２７のいずれか１つの融合タンパク質。
２９．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２１が、ＴまたはＤ、好ましくはＴである、項目１～２８のいずれか１つの融合タンパク質。
３０．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＸ２ＷＸ４ＡＷＸ７ＥＩＲＸ１１ＬＰＮＬＮＧＷＱＸ２０ＴＡＦＩＸ２５ＳＬＸ２８Ｄを含み、
互いに独立して、
Ｘ２が、Ｍ、Ｖ、ＬまたはＩであり、
Ｘ４が、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、ＮまたはＤであり、
Ｘ７が、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１１が、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳであり、
Ｘ２０が、Ｍ、ＬまたはＦであり、
Ｘ２５が、Ａ、ＳまたはＧであり、かつ
Ｘ２８が、ＬまたはＶである、項目１～２９のいずれか１つの融合タンパク質。
３１．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２がＭである、項目１～３０のいずれか１つの融合タンパク質。
３２．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ４が、Ｉ、Ｖ、ＧまたはＳである、項目１～３１のいずれか１つの融合タンパク質。
３３．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ１１が、Ｄ、ＮまたはＥである、項目１～３２のいずれか１つの融合タンパク質。
３４．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２０がＭである、項目１～３３のいずれか１つの融合タンパク質。
３５．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２５がＡまたはＳである、項目１～３４のいずれか１つの融合タンパク質。
３６．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２８がＬである、項目１～３５のいずれか１つの融合タンパク質。
３７．ＥＧＦＲ結合ドメインでは、Ｘ２がＭであり、Ｘ２０がＭであり、Ｘ２８がＬである、項目１～３６のいずれか１つの融合タンパク質。
３８．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤ（配列番号２）を含む、項目１～３７のいずれか１つの融合タンパク質。
３９．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤ（配列番号３）を含む、項目１～３８のいずれか１つの融合タンパク質。
４０．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号４）を含む、項目１～３９のいずれか１つの融合タンパク質。
４１．ＥＧＦＲ結合ドメインが、アミノ酸配列ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号５）を含む、項目１～４０のいずれか１つの融合タンパク質。
４２．Ｆｃ結合領域またはアルブミン結合領域（ＡＢＲ）などの半減期延長領域をさらに含む、項目１～４１のいずれか１つの融合タンパク質。
４３．以下から選択されるアミノ酸配列を含むアルブミン結合領域（ＡＢＲ）をさらに含む、項目１～４２のいずれか１つの融合タンパク質
ａ）ＬＡＸ３ＡＫＸ６Ｘ７ＡＸ９Ｘ１０ ＥＬＤＸ１４ＹＧＶＳＤＸ２０ ＹＫＸ２３ＬＩＸ２６Ｘ２７ＡＫＴ ＶＥＧＶＸ３５ＡＬＸ３８Ｘ３９Ｘ４０ ＩＬＸ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６（ここで、互いに独立して、
Ｘ３が、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され、
Ｘ６が、Ｅ、Ｓ、ＶおよびＣから選択され、
Ｘ７が、Ａ、ＬおよびＳから選択され、
Ｘ９が、ＬおよびＮから選択され、
Ｘ１０が、Ａ、ＳおよびＲから選択され、
Ｘ１４が、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され、
Ｘ２０が、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ２３が、Ｎ、ＤおよびＲから選択され、
Ｘ２６が、Ｎ、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ２７が、ＮおよびＫから選択され、
Ｘ３５が、ＫおよびＥから選択され、
Ｘ３８が、ＩおよびＫから選択され、
Ｘ３９が、Ｄ、ＥおよびＬから選択され、
Ｘ４０が、Ａ、ＥおよびＨから選択され、
Ｘ４３が、ＡおよびＫから選択され、
Ｘ４４が、Ａ、ＳおよびＥから選択され、
Ｘ４５が、Ｌまたは非存在であり、
Ｘ４６が、Ｐまたは非存在である）
ならびにｂ）ａ）で定義された配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
４４．ＡＢＲが、アミノ酸配列ＬＡＸ３ＡＫＸ６Ｘ７ＡＸ９Ｘ１０ ＥＬＤＸ１４ＹＧＶＳＤＸ２０ ＹＫＸ２３ＬＩＸ２６Ｘ２７ＡＫＴ ＶＥＧＶＸ３５ＡＬＸ３８Ｘ３９Ｘ４０ ＩＬＡＡＬＰを含み、互いに独立して、
Ｘ３が、ＥおよびＳから選択され、
Ｘ６が、ＥおよびＶから選択され、
Ｘ７が、ＡおよびＬから選択され、
Ｘ９が、ＬおよびＮから選択され、
Ｘ１０が、ＡおよびＲから選択され、
Ｘ１４が、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから、好ましくはＡ、ＳおよびＫから選択され、
Ｘ２０が、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ２３が、Ｎ、ＤおよびＲから選択され、
Ｘ２６が、ＮおよびＤから選択され、
Ｘ２７が、ＮおよびＫから選択され、
Ｘ３５が、ＫおよびＥから選択され、
Ｘ３８が、ＩおよびＫから選択され、
Ｘ３９が、ＤおよびＬから選択され、
Ｘ４０が、Ａ、ＥおよびＨから選択され、
Ｘ４５が、Ｌまたは非存在であり、
Ｘ４６が、Ｐまたは非存在である、項目４３の融合タンパク質。
４５．ＡＢＲが、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４３による治療用コンジュゲート：
ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩＮＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥＡＬＫＬＨ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号６）；
ＬＡＥＡＫＥＡＡＮＡ ＥＬＤＳＹＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩＤＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥＡＬＫＤＡ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号７）；
ＧＬＡＥＡＫＥＡＡＮ ＡＥＬＤＳＹＧＶＳＤ ＦＹＫＲＬＩＤＫＡＫ ＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤ ＡＩＬＡＡＬＰ（配列番号８）；
ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＮＬＩＮＮＡＫＴ ＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号９）；
および
ＬＡＥＡＫＶＬＡＬＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＤＬＩＤＫＡＫＴ ＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号１０）。
４６．半減期延長領域が、ＥＧＦＲ結合ドメインのＣ末端側に位置する、項目４２～４５のいずれか１つの融合タンパク質。
４７．リンカーがプロテアーゼ切断可能リンカーである、項目１～４６のいずれか１つの融合タンパク質。
４８．プロテアーゼ切断可能リンカーが、ＧＦＬＧ（配列番号１１）、グルタミン酸－バリン－シトルリン、ＧＩＬＧＶＰ（配列番号１３）、ＧＰＬＧＩＡＧＱ（配列番号１４）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５）、ＳＧＧＰＧＰＡＧＭＫＧＬＰＧＳ（配列番号１６）、ＰＬＧＬＡＧ（配列番号１７）、ＬＡＬＧＰＧ（配列番号１８）、ＫＲＡＬＧＬＰＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＲＲ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２１）、ＰＭＡＫＫ（配列番号２２）、ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号２３）、ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号３８）、ＨＳＳＫＬＱＬ（配列番号２４）およびＲＲＳＳＹＹＳＧ（配列番号２５）からなる群から選択される配列を含む、項目４７の融合タンパク質。
４９．リンカーの長さが、少なくとも１２アミノ酸残基、例えば、１２～６０アミノ酸残基、例えば、２０～５０アミノ酸残基である、項目１～４８のいずれか１つの融合タンパク質。
５０．リンカーが、システイン（Ｃ）残基を含まない、項目１～４９のいずれか１つの融合タンパク質。
５１．マスキングドメインが、システイン（Ｃ）残基を含まない、項目１～５０のいずれか１つの融合タンパク質。
５２．ＥＧＦＲ結合ドメインが、システイン（Ｃ）残基を含まない、項目１～５１のいずれか１つの融合タンパク質。
５３．マスキングドメインが、ＥＧＦＲ結合ドメインのＮ末端側に位置する、項目１～５２のいずれか１つの融合タンパク質。
５４．項目１～５３のいずれか１つの融合タンパク質と、細胞傷害性分子、細胞傷害性ペプチド、細胞傷害性タンパク質または細胞傷害性放射性核種などの細胞傷害剤とを含む治療用コンジュゲート。
５５．細胞傷害剤が、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ；１８６Ｒｅ；１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１４９Ｔｂ、１６１Ｔｂ、４７Ｓｃ；２２５Ａｃ；２１２Ｐｂ；２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２２７Ｔｈ、２２３Ｒａ；５８ｍＣｏ、１３１Ｉ、７６Ａｓ、７７Ａｓおよび２１１Ａｔからなる群から選択される細胞傷害性放射性核種である、項目５４による治療用コンジュゲート。
５６．細胞傷害剤が、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、デュオカルマイシン（ＤＵＯ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、パクリタキセル（ＰＴＸ）、メルタンシン（ＤＭ１）、エムタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン（ＤＭ４）、ソラブタンシン（ＤＭ４）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）およびカリケアマイシンからなる群から選択される細胞傷害性分子である、項目５４による治療用コンジュゲート。
５７．細胞傷害剤が、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）およびデボウガニン（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）からなる群から選択されるタンパク質系毒素である、項目５４による治療用コンジュゲート。
５８．治療的処置方法に使用するための、項目５４～５７のいずれか１つによる治療用コンジュゲート。
５９．治療的処置方法が、ＥＧＦＲを過剰発現する癌などの癌（がん）に罹患している対象の処置方法である、項目５８による使用のための治療用コンジュゲート。
６０．癌（がん）が、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、結腸および直腸癌、頭頸部癌、胃食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｏｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、腎癌ならびに膵癌からなる群から選択される、項目５９による使用のための治療用コンジュゲート。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】アフィボディ分子の概略図である。アフィボディ分子は、ブドウ球菌提示ライブラリーにおいてランダム化された１４個の表面露出アミノ酸位置を示す。
【0017】
【図2】概念実証プロアフィボディ（ＰＯＣ－ＰＡ）構築物の概略図である。ＰＯＣ－ＰＡ構築物は、ＥＧＦＲ結合アフィボディ分子に対する特異性を有する抗イディオタイプマスキングドメインと、ＴＥＶプロテアーゼ切断可能リンカーと、ＥＧＦＲ結合アフィボディドメインと、アルブミン結合タンパク質とを含む。
【0018】
【図3】ＺＢ０５アフィボディマスキングドメインの特性評価を示す：（Ａ）ＺＢ０５の熱変性後のリフォールディング能力を示す融解曲線（ＶＴＭ）（左）および円二色性分光法（右）；（Ｂ）Ｂ０５と固定化ＺＥＧＦＲ（左）および陰性対照ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（右）との結合相互作用を示すＳＰＲセンサーグラム。
【0019】
【図4】可溶性単量体として生成したＰＯＣ－ＰＡの特性評価を示す：（Ａ）ＨＳＡ親和性精製後の純度と、ＴＥＶ－プロテアーゼのサイズと、ＴＥＶ－プロテアーゼによる処理後の切断生成物のサイズとを示すＳＤＳ－ｐａｇｅ；ならびに（Ｂ）ＳＰＲを使用した、固定化ヒトＥＧＦＲへのＰＯＣ－ＰＡのプロテアーゼ依存性結合（上）および固定化ＨＳＡへの影響を受けていない結合（下）の分析。
【0020】
【図5】インタクトなＰＯＣ－ＰＡ、およびＴＥＶプロテアーゼによって予め切断したＰＯＣ－ＰＡに関するＨ２９２細胞およびＡ４３１細胞上のＥＧＦＲ結合のフローサイトメトリー分析を示す。ダミーマスキングドメイン（ＺＥ０１）を有する対照構築物（ＰＯＣ－ＰＡ－ＤＭ）を比較のために含めた。
【0021】
【図6】（Ａ）Ａ４３１細胞および（Ｂ）Ｈ２９２細胞における［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグ、ダミーリンカーおよび非マスク対照の結合特異性を示す。標識を有しない１００倍モル過剰の非マスク対照を用いて、事前飽和の有無にかかわらず放射性標識化合物とともに細胞を室温でインキュベートした。Ｙ軸は、各ウェルに添加した総活性のパーセンテージとしての細胞の測定した総活性に対応する。アスタリスク（＊）は、有意差（ｐ＜０．０５、ｔ検定）に対応する。
【0022】
【図7】インビトロでのＨ２９２細胞およびＡ４３１細胞への［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識非マスク対照結合の比較を示す。それぞれ遮断されたまたは遮断されていない、放射性標識または抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブを欠く１００倍モル過剰の同じ化合物を用いて、事前飽和の有無にかかわらず、放射性標識化合物（１．６４×１０６ ＣＰＭ）とともに細胞を室温でインキュベートした。ディッシュの追加のセットを使用して、実験時にディッシュごとに細胞数を計数した。
【0023】
【図8】（Ａ）ｐ．ｉ．４時間および（Ｂ）ｐ．ｉ．４８時間でのＨ２９２（ＥＧＦＲ陽性）異種移植片およびＲａｍｏｓ（ＥＧＦＲ陰性）異種移植片における［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－プロドラッグ摂取の比較（ｔ検定）を示す；（Ｃ）ｐ．ｉ．４８時間での同じ動物異種移植片におけるＨ２９２（ＥＧＦＲ陽性、マトリプターゼ高レベル）およびＡ４３１（ＥＧＦＲ陽性、マトリプターゼ低レベル）における摂取の比較（ｔ検定）を示す。記号（×）は、Ｈ２９２異種移植片における摂取を示す；記号（＋）は、Ｒａｍｏｓ異種移植片における摂取を示す；記号（●）は、Ａ４３１異種移植片における摂取を示す。
【0024】
【図9】（Ａ）ｐ．ｉ．４時間および（Ｃ）ｐ．ｉ．４８時間での、ＥＧＦＲ陽性Ｈ２９２異種移植片を有するＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識非マスク対照（左）およびプロドラッグ（右）を使用したマイクロ単一光子放出型コンピュータ断層撮影（Ｍｉｃｒｏ－Ｓｉｎｇｌｅ－Ｐｈｏｔｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）／コンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ）撮像を示す。（Ｂ）ｐ．ｉ．４時間および（Ｄ）ｐ．ｉ．４８時間での、ＥＧＦＲ陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片を有するＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグを使用したマイクロ単一光子放出型コンピュータ断層撮影（Ｍｉｃｒｏ－Ｓｉｎｇｌｅ－Ｐｈｏｔｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）／コンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ）撮像を示す。Ｔの矢印は腫瘍を指し示す。Ｌの矢印は肝臓を指し示す。
【0025】
【図10】ＺＥＧＦＲへの結合を保持するＺＢ０５足場の各ランダム化された位置で許容される置換を示す表である。非結合集団内の対応するバリアントについて少なくとも５０％の枯渇を有するナイーブライブラリーと比較して、結合集団内の２倍濃縮から、結合を保持した許容される置換を決定した。ＺＢ０５配列のランダム化された位置は、矢印によってマークされている。
【0026】
【図11】合計２５３個の異なるバリアントを含有するＺＢ０５変異誘発ライブラリーの代表的なＦＡＣＳ選別（左）、および結合集団のフローサイトメトリー分析（右）を示す。
【0027】
【図12】例１で調製および試験した概念実証プロアフィボディ（ＰＯＣ－ＰＡ）の完全なアミノ酸配列を示す。マスキングドメインＺＢ０５では、ＺＥＧＦＲへの結合に特に関連する部分配列（配列番号１）は灰色で強調されている。ＴＥＶ切断可能リンカーでは、ＴＥＶによって認識される部分配列は灰色で強調されている。ＺＥＧＦＲ（すなわち、ＥＧＦＲ結合ドメイン）では、ＥＧＦＲへの結合に特に関連する部分配列（配列番号２）は灰色で強調されている。
【0028】
【図13】例２で使用した（概念実証）プロドラッグの完全なアミノ酸配列を示す。マスキングドメインＺＢ０５では、ＺＥＧＦＲへの結合に特に関連する部分配列（配列番号１）は灰色で強調されている。マトリプターゼ切断可能リンカーでは、マトリプターゼによって認識される部分配列（配列番号２１）は灰色で強調されている。ＺＥＧＦＲ（すなわち、ＥＧＦＲ結合ドメイン）では、ＥＧＦＲへの結合に特に関連する部分配列（配列番号２）は灰色で強調されている。
【0029】
【図14】以下の例３に記載されるＰＡの切断後のＳＤＳ－ｐａｇｅゲルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本開示の第１の態様として、ＥＧＦＲ結合ドメインと、マスキングドメインと、マスキングドメインをＥＧＦＲ結合ドメインに連結するリンカーとを含む融合タンパク質が提供される。
【0031】
マスキングドメインは、ＥＧＦＲ結合ドメインに結合し、それによって、特定の条件下でＥＧＦＲへの結合を制限する。
【0032】
マスキングドメインは、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み、
互いに独立して、
Ｘ１０は、Ｒ、Ｋ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
Ｘ１２は、Ａまたは置換であり、
Ｘ１３は、Ｅまたは非存在であり、
Ｘ１４は、ＴまたはＳであり、
Ｘ１５は、Ｅまたは置換であり、
Ｘ１６は、Ｉまたは置換であり、
Ｘ１９は、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２０は、Ｐ、置換または非存在であり、
Ｘ２１は、Ｎ、置換または非存在であり、
Ｘ２２は、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２３は、Ｔまたは置換であり、
Ｘ２４は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＴまたはＹであり、
Ｘ２５は、Ｄ、Ｇ、ＩまたはＷであり、
Ｘ２６は、Ｑまたは置換であり、
Ｘ２８は、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
Ｘ２９は、Ａまたは置換であり、
Ｘ３０は、Ｆまたは置換であり、
Ｘ３１は、ＩまたはＬであり、
Ｘ３３は、Ｋまたは置換であり、
Ｘ３４は、Ｌまたは置換である。
互いに独立して、
Ｘ１０は、Ｒ、Ｋ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
Ｘ１２は、Ａまたは置換であり、
Ｘ１３は、Ｅまたは非存在であり、
Ｘ１４は、ＴまたはＳであり、
Ｘ１５は、Ｅまたは置換であり、
Ｘ１６は、Ｉまたは置換であり、
Ｘ１９は、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２０は、Ｐ、置換または非存在であり、
Ｘ２１は、Ｎ、置換または非存在であり、
Ｘ２２は、Ｌ、置換または非存在であり、
Ｘ２３は、Ｔまたは置換であり、
Ｘ２４は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＴまたはＹであり、
Ｘ２５は、Ｄ、Ｇ、ＩまたはＷであり、
Ｘ２６は、Ｑまたは置換であり、
Ｘ２８は、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
Ｘ２９は、Ａまたは置換であり、
Ｘ３０は、Ｆまたは置換であり、
Ｘ３１は、ＩまたはＬであり、
Ｘ３３は、Ｋまたは置換であり、
Ｘ３４は、Ｌまたは置換である。
【0033】
位置Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のアミノ酸残基は、ＥＧＦＲ結合ドメインと能動的に相互作用する結合部位の一部を形成するとは考えられていない。したがって、これらの位置では、（ＺＢ０５と比較して）置換および場合によっては（Ｘ１９～Ｘ２２）さらには欠失が許容される。ただし、三次元構造は、それらの全部または大部分が置換または（Ｘ１９～Ｘ２２の場合）欠失された場合に結合能力が失われる程度に調整されると考えられる。したがって、第１の態様の融合タンパク質では、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの６つ以下は置換であり得、Ｘ１９～Ｘ２２のうちの２つ以下は非存在であり得る。
【0034】
マスキングドメインの一実施形態では、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの４つ以下は置換である。好ましくは、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３およびＸ３４のうちの２つ以下は置換である。
【0035】
代替的または相補的な実施形態では、Ｘ１９～Ｘ２２のうちの１つ以下は非存在である。好ましくは、Ｘ１９～Ｘ２２はいずれも非存在でない。
【0036】
一実施形態では、マスキングドメインは、Ｎ末端にさらなるアミノ酸残基（Ｘ５～Ｘ８）を含む。したがって、マスキングドメインは、アミノ酸配列Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み得、
互いに独立して、
Ｘ５は、Ｙまたは置換であり、
Ｘ６は、Ａまたは置換であり、
Ｘ７は、Ｋまたは置換であり、
Ｘ８は、Ｅまたは置換であり、
ただし、Ｘ５～Ｘ８のうちの２つ以下は置換である。
互いに独立して、
Ｘ５は、Ｙまたは置換であり、
Ｘ６は、Ａまたは置換であり、
Ｘ７は、Ｋまたは置換であり、
Ｘ８は、Ｅまたは置換であり、
ただし、Ｘ５～Ｘ８のうちの２つ以下は置換である。
【0037】
一実施形態では、マスキングドメインは、Ｎ末端にさらに別のアミノ酸残基（Ｘ１～Ｘ４）を含む。したがって、マスキングドメインは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み得、
互いに独立して、
Ｘ１は、Ｖまたは置換であり、
Ｘ２は、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３は、Ａまたは置換であり、
Ｘ４は、Ｋまたは置換であり、
ただし、Ｘ１～Ｘ８のうちの４つ以下、例えば、２つ以下は置換である。
互いに独立して、
Ｘ１は、Ｖまたは置換であり、
Ｘ２は、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３は、Ａまたは置換であり、
Ｘ４は、Ｋまたは置換であり、
ただし、Ｘ１～Ｘ８のうちの４つ以下、例えば、２つ以下は置換である。
【0038】
一実施形態では、マスキングドメインは、Ｃ末端にさらなるアミノ酸残基（Ｘ３６～Ｘ４４）を含む。したがって、マスキングドメインは、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４ＶＸ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４を含み得、
互いに独立して、
Ｘ３６は、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３７は、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３８は、Ｐまたは置換であり、
Ｘ３９は、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４０は、Ｑまたは置換であり、
Ｘ４１は、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４２は、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４３は、Ｅまたは置換であり、
Ｘ４４は、Ｌまたは置換であり、
ただし、Ｘ３６～Ｘ４４のうちの４つ以下、例えば、２つ以下は置換である。
互いに独立して、
Ｘ３６は、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３７は、Ｄまたは置換であり、
Ｘ３８は、Ｐまたは置換であり、
Ｘ３９は、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４０は、Ｑまたは置換であり、
Ｘ４１は、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４２は、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４３は、Ｅまたは置換であり、
Ｘ４４は、Ｌまたは置換であり、
ただし、Ｘ３６～Ｘ４４のうちの４つ以下、例えば、２つ以下は置換である。
【0039】
一実施形態では、マスキングドメインは、Ｃ末端にさらに別のアミノ酸残基（Ｘ４５～Ｘ５４）を含む。したがって、マスキングドメインは、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４ＶＸ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４を含み得、
互いに独立して、
Ｘ４５は、Ｌまたは置換であり、
Ｘ４６は、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４７は、Ｅまたは置換であり、
Ｘ４８は、Ａまたは置換であり、
Ｘ４９は、Ｋまたは置換であり、
Ｘ５０は、Ｋまたは置換であり、
Ｘ５１は、Ｌまたは置換であり、
Ｘ５２は、Ｎまたは置換であり、
Ｘ５３は、Ｄまたは置換であり、
Ｘ５４は、Ｓまたは置換であり、
ただし、Ｘ４５～Ｘ５４のうちの５つ以下、例えば、３つ以下は置換である。
互いに独立して、
Ｘ４５は、Ｌまたは置換であり、
Ｘ４６は、Ｓまたは置換であり、
Ｘ４７は、Ｅまたは置換であり、
Ｘ４８は、Ａまたは置換であり、
Ｘ４９は、Ｋまたは置換であり、
Ｘ５０は、Ｋまたは置換であり、
Ｘ５１は、Ｌまたは置換であり、
Ｘ５２は、Ｎまたは置換であり、
Ｘ５３は、Ｄまたは置換であり、
Ｘ５４は、Ｓまたは置換であり、
ただし、Ｘ４５～Ｘ５４のうちの５つ以下、例えば、３つ以下は置換である。
【0040】
マスキングドメインの一実施形態では、Ｘ３６～Ｘ５４のうちの７つ以下、例えば、５つ以下は置換である。
【0041】
マスキングドメインは、Ｃ末端で別の４つ（Ｘ５５～Ｘ５８）のアミノ酸残基にさらに伸長され得る。したがって、マスキングドメインは、アミノ酸配列ＩＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＫＸ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＹＸ３３Ｘ３４ＶＸ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８を含み得、
互いに独立して、
Ｘ５５は、Ｑまたは置換であり、
Ｘ５６は、Ａまたは置換であり、
Ｘ５７は、Ｐまたは置換であり、
Ｘ５８は、Ｋまたは置換であり、
ただし、Ｘ５５～Ｘ５８のうちの２つ以下は置換である。
互いに独立して、
Ｘ５５は、Ｑまたは置換であり、
Ｘ５６は、Ａまたは置換であり、
Ｘ５７は、Ｐまたは置換であり、
Ｘ５８は、Ｋまたは置換であり、
ただし、Ｘ５５～Ｘ５８のうちの２つ以下は置換である。
【0042】
マスキングドメインの一実施形態では、Ｘ３６～Ｘ５８のうちの７つ以下、例えば、５つ以下は置換である。
【0043】
マスキングドメインの好ましい実施形態では、
Ｘ１０はＲであり、
Ｘ１３は非存在であり、
Ｘ１４はＴであり、
Ｘ２４はＡであり、
Ｘ２５はＤであり、
Ｘ２８はＷであり、および／または
Ｘ３１はＩである。
Ｘ１０はＲであり、
Ｘ１３は非存在であり、
Ｘ１４はＴであり、
Ｘ２４はＡであり、
Ｘ２５はＤであり、
Ｘ２８はＷであり、および／または
Ｘ３１はＩである。
【0044】
したがって、マスキングドメインは、アミノ酸配列ＩＲＳＸ１２ＴＸ１５Ｘ１６ＷＷＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＡＤＸ２６ＫＷＸ２９Ｘ３０ＩＹＸ３３Ｘ３４Ｖを含み得る。
【0045】
一実施形態では、マスキングドメインは、システイン（Ｃ）残基を含まない。
【0046】
一実施形態では、マスキングドメインは、ＺＢ０５と同様に、アミノ酸配列ＩＲＳＡＴＥＩＷＷＬＰＮＬＴＡＤＱＫＷＡＦＩＹＫＬＶ（配列番号１）を含む。
【0047】
一実施形態では、マスキングドメインは、ＺＢ０５の配列であるアミノ酸配列ＶＤＡＫＹＡＫＥＩＲＳＡＴＥＩＷＷＬＰＮＬＴＡＤＱＫＷＡＦＩＹＫＬＶＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（配列番号２６）を含む。
【0048】
第１の態様の融合タンパク質のＥＧＦＲ結合ドメインは、アミノ酸配列ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＮＸ１７Ｘ１８ＱＸ２０Ｘ２１ＡＦＩＸ２５ＳＬＸ２８Ｄを含み、
互いに独立して、
Ｘ２は、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＳであり、
Ｘ３は、Ｗ、Ｄ、ＥまたはＬであり、
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、ＤまたはＷであり、
Ｘ６は、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＳであり、
Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１０は、Ｒ、Ｇ、ＨまたはＫであり、
Ｘ１１は、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳであり、
Ｘ１７は、Ｇ、ＷまたはＡであり、
Ｘ１８は、Ｗ、ＧまたはＡであり、
Ｘ２０は、Ｍ、Ｌ、Ｆ、ＡまたはＥであり、
Ｘ２１は、Ｔ、Ｄ、Ｎ、ＡまたはＱであり、
Ｘ２５は、Ａ、Ｓ、Ｎ、ＧまたはＬであり、
Ｘ２８は、Ｌ、Ｗ、Ｖ、ＦまたはＡである。
互いに独立して、
Ｘ２は、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＳであり、
Ｘ３は、Ｗ、Ｄ、ＥまたはＬであり、
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、ＤまたはＷであり、
Ｘ６は、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＳであり、
Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１０は、Ｒ、Ｇ、ＨまたはＫであり、
Ｘ１１は、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳであり、
Ｘ１７は、Ｇ、ＷまたはＡであり、
Ｘ１８は、Ｗ、ＧまたはＡであり、
Ｘ２０は、Ｍ、Ｌ、Ｆ、ＡまたはＥであり、
Ｘ２１は、Ｔ、Ｄ、Ｎ、ＡまたはＱであり、
Ｘ２５は、Ａ、Ｓ、Ｎ、ＧまたはＬであり、
Ｘ２８は、Ｌ、Ｗ、Ｖ、ＦまたはＡである。
【0049】
このアミノ酸配列（および以下に提示される実施形態）の背後にある理論的根拠は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０６５６３５号に説明されている。
【0050】
ＥＧＦＲ結合ドメインの好ましい実施形態では、
Ｘ３はＷであり、
Ｘ６は、ＶもしくはＷであり、
Ｘ１０は、ＲもしくはＧであり、
Ｘ１７は、ＷもしくはＧであり、
Ｘ１８は、ＷもしくはＧ、好ましくはＷであり、および／または
Ｘ２１は、ＴもしくはＤ、好ましくはＴである。
Ｘ３はＷであり、
Ｘ６は、ＶもしくはＷであり、
Ｘ１０は、ＲもしくはＧであり、
Ｘ１７は、ＷもしくはＧであり、
Ｘ１８は、ＷもしくはＧ、好ましくはＷであり、および／または
Ｘ２１は、ＴもしくはＤ、好ましくはＴである。
【0051】
一実施形態では、ＥＧＦＲ結合ドメインは、アミノ酸配列ＥＸ２ＷＸ４ＡＷＸ７ＥＩＲＸ１１ＬＰＮＬＮＧＷＱＸ２０ＴＡＦＩＸ２５ＳＬＸ２８Ｄを含み、
互いに独立して、
Ｘ２は、Ｍ、Ｖ、ＬまたはＩ、好ましくはＭであり、
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、ＮまたはＤ、好ましくはＩ、Ｖ、ＧまたはＳであり、
Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１１は、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳ、好ましくはＤ、ＮまたはＥであり、
Ｘ２０は、Ｍ、ＬまたはＦ、好ましくはＭであり、
Ｘ２５は、Ａ、ＳまたはＧ、好ましくはＡまたはＳであり、
Ｘ２８は、ＬまたはＶ、好ましくはＬである。
互いに独立して、
Ｘ２は、Ｍ、Ｖ、ＬまたはＩ、好ましくはＭであり、
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、ＮまたはＤ、好ましくはＩ、Ｖ、ＧまたはＳであり、
Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＫであり、
Ｘ１１は、Ｄ、Ｎ、Ｅ、ＹまたはＳ、好ましくはＤ、ＮまたはＥであり、
Ｘ２０は、Ｍ、ＬまたはＦ、好ましくはＭであり、
Ｘ２５は、Ａ、ＳまたはＧ、好ましくはＡまたはＳであり、
Ｘ２８は、ＬまたはＶ、好ましくはＬである。
【0052】
ＥＧＦＲ結合ドメインの好ましい実施形態では、Ｘ２はＭであり、Ｘ２０はＭであり、Ｘ２８はＬである。
【0053】
特に好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ結合ドメインは、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
（ｉ）ＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤ（配列番号２）；および
（ｉｉ）（ｉ）で定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
（ｉ）ＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤ（配列番号２）；および
（ｉｉ）（ｉ）で定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【0054】
任意で、ＥＧＦＲ結合ドメインが以下から選択されるアミノ酸配列を含むように、追加のＮ末端アミノ酸残基が存在する：
（ｉｉｉ）ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤ（配列番号３）；および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）で定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
（ｉｉｉ）ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤ（配列番号３）；および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）で定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【0055】
任意で、ＥＧＦＲ結合ドメインが以下から選択されるアミノ酸配列を含むように、追加のＣ末端アミノ酸残基が存在する：
（ｖ）ＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号４）；および
（ｖｉ）（ｖ）で定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
（ｖ）ＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号４）；および
（ｖｉ）（ｖ）で定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【0056】
一実施形態では、ＥＧＦＲ結合ドメインが以下から選択されるアミノ酸配列を含むように、Ｎ末端およびＣ末端に追加のアミノ酸残基が存在する：
（ｖｉｉ）ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号５）；および
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）で定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
（ｖｉｉ）ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＷＩＡＷＥＥＩＲＤＬＰＮＬＮＧＷＱＭＴＡＦＩＡＳＬＬＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号５）；および
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）で定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【0057】
配列（ｖｉｉ）は、以下の例のセクションで使用されるＥＧＦＲ結合アフィボディ（ＺＥＧＦＲとも呼ばれる）の配列である。
【0058】
一実施形態では、ＥＧＦＲ結合ドメインは、システイン（Ｃ）残基を含まない。
【0059】
第１の態様の融合タンパク質の一実施形態では、マスキングドメインは、ＥＧＦＲ結合ドメインのＮ末端側に位置する。したがって、この実施形態では、リンカーは、マスキングドメインのＣ末端をＥＧＦＲ結合ドメインのＮ末端に連結している。
【0060】
第１の態様の融合タンパク質の一実施形態では、リンカーはプロテアーゼ切断可能リンカーである。好ましくは、そのようなリンカーは、以下のプロテアーゼ、すなわち、カテプシンＢ；ＭＭＰ－２；ＭＭＰ－９；ＭＭＰ－７；ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子；マトリプターゼ；および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のうちの１つ以上によって切断可能である。これらのプロテアーゼは、腫瘍微小環境に見出される。
【0061】
上記のプロテアーゼは、以下に列挙される切断部位を認識する
【0062】
カテプシンＢ
ＧＦＬＧ（配列番号１１；参考文献［１］を参照）；および
グルタミン酸－バリン－シトルリン（参考文献［２］を参照）。
ＧＦＬＧ（配列番号１１；参考文献［１］を参照）；および
グルタミン酸－バリン－シトルリン（参考文献［２］を参照）。
【0063】
ＭＭＰ－２／－９
ＧＩＬＧＶＰ（配列番号１３；参考文献［１］を参照）；
ＧＰＬＧＩＡＧＱ（配列番号１４；参考文献［１］を参照）；
ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５；参考文献［３］を参照）；
ＳＧＧＰＧＰＡＧＭＫＧＬＰＧＳ（配列番号１６；参考文献［４］を参照）；
ＰＬＧＬＡＧ（配列番号１７；参考文献［５］を参照）；および
ＬＡＬＧＰＧ（配列番号１８；参考文献［５］を参照）。
ＧＩＬＧＶＰ（配列番号１３；参考文献［１］を参照）；
ＧＰＬＧＩＡＧＱ（配列番号１４；参考文献［１］を参照）；
ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５；参考文献［３］を参照）；
ＳＧＧＰＧＰＡＧＭＫＧＬＰＧＳ（配列番号１６；参考文献［４］を参照）；
ＰＬＧＬＡＧ（配列番号１７；参考文献［５］を参照）；および
ＬＡＬＧＰＧ（配列番号１８；参考文献［５］を参照）。
【0064】
ＭＭＰ－７：
ＫＲＡＬＧＬＰＧ（配列番号１９；参考文献［１］を参照）
ＫＲＡＬＧＬＰＧ（配列番号１９；参考文献［１］を参照）
【0065】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子
ＧＧＧＲＲ（配列番号２０；参考文献［１］を参照）；および
ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２１；参考文献［６］を参照）。
ＧＧＧＲＲ（配列番号２０；参考文献［１］を参照）；および
ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２１；参考文献［６］を参照）。
【0066】
マトリプターゼ
ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２１；参考文献［３］および［８］を参照）；
ＰＭＡＫＫ（配列番号２２；参考文献［３］を参照）；
ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号２３；参考文献［３］を参照）；ならびに
ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号３８；参考文献［７］を参照）。
ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２１；参考文献［３］および［８］を参照）；
ＰＭＡＫＫ（配列番号２２；参考文献［３］を参照）；
ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号２３；参考文献［３］を参照）；ならびに
ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号３８；参考文献［７］を参照）。
【0067】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）
ＨＳＳＫＬＱＬ（配列番号２４；参考文献［１］を参照）；および
ＲＲＳＳＹＹＳＧ（配列番号２５；参考文献［１］を参照）。
ＨＳＳＫＬＱＬ（配列番号２４；参考文献［１］を参照）；および
ＲＲＳＳＹＹＳＧ（配列番号２５；参考文献［１］を参照）。
【0068】
その結果、プロテアーゼ切断可能リンカーの一実施形態は、上に列挙したこれらの切断部位配列のうちの少なくとも１つを含む。
【0069】
参考文献（プロテアーゼおよび切断部位）
【0070】
マスキング配列とＥＧＦＲ結合配列とを互いに結合させるために、リンカーの長さは、典型的には少なくとも１２アミノ酸残基、例えば、少なくとも２０アミノ酸残基である。最大長は、例えば、５０または６０アミノ酸残基であり得る。
【0071】
一実施形態では、リンカーは、システイン（Ｃ）残基を含まない。
【0072】
第１の態様の融合タンパク質は、Ｆｃ結合領域またはアルブミン結合領域（ＡＢＲ）などの半減期延長領域をさらに含み得る。半減期延長領域は、例えば、ＥＧＦＲ結合ドメインのＣ末端側に位置し得る。
【0073】
あるいは、半減期延長基は、融合タンパク質による一部ではなく、別の方法で融合タンパク質に接続される。この代替的な実施形態では、融合タンパク質および半減期延長基は、さらなる部分または基を含み得る構築物を一緒に形成する。
【0074】
タンパク質の様々な半減期延長戦略は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎによる総説論文（ＥＸＰＥＲＴ ＯＰＩＮＩＯＮ ＯＮ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＴＨＥＲＡＰＹ，２０１６ ＶＯＬ．１６，ＮＯ．７，９０３－９１５）に記載されている。
【0075】
一実施形態では、第１の態様の融合タンパク質は、以下から選択されるアミノ酸配列を含むＡＢＲを含む
ａ）ＬＡＸ３ＡＫＸ６Ｘ７ＡＸ９Ｘ１０ ＥＬＤＸ１４ＹＧＶＳＤＸ２０ ＹＫＸ２３ＬＩＸ２６Ｘ２７ＡＫＴ ＶＥＧＶＸ３５ＡＬＸ３８Ｘ３９Ｘ４０ ＩＬＸ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６（ここで、互いに独立して、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され、
Ｘ６は、Ｅ、Ｓ、ＶおよびＣから選択され、
Ｘ７は、Ａ、ＬおよびＳから選択され、
Ｘ９は、ＬおよびＮから選択され、
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され、
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され、
Ｘ２０は、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ２３は、Ｎ、ＤおよびＲから選択され、
Ｘ２６は、Ｎ、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ２７は、ＮおよびＫから選択され、
Ｘ３５は、ＫおよびＥから選択され、
Ｘ３８は、ＩおよびＫから選択され、
Ｘ３９は、Ｄ、ＥおよびＬから選択され、
Ｘ４０は、Ａ、ＥおよびＨから選択され、
Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され、
Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され、
Ｘ４５は、Ｌまたは非存在であり、
Ｘ４６は、Ｐまたは非存在である）
ならびにｂ）ａ）で定義された配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
ａ）ＬＡＸ３ＡＫＸ６Ｘ７ＡＸ９Ｘ１０ ＥＬＤＸ１４ＹＧＶＳＤＸ２０ ＹＫＸ２３ＬＩＸ２６Ｘ２７ＡＫＴ ＶＥＧＶＸ３５ＡＬＸ３８Ｘ３９Ｘ４０ ＩＬＸ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６（ここで、互いに独立して、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され、
Ｘ６は、Ｅ、Ｓ、ＶおよびＣから選択され、
Ｘ７は、Ａ、ＬおよびＳから選択され、
Ｘ９は、ＬおよびＮから選択され、
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され、
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され、
Ｘ２０は、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ２３は、Ｎ、ＤおよびＲから選択され、
Ｘ２６は、Ｎ、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ２７は、ＮおよびＫから選択され、
Ｘ３５は、ＫおよびＥから選択され、
Ｘ３８は、ＩおよびＫから選択され、
Ｘ３９は、Ｄ、ＥおよびＬから選択され、
Ｘ４０は、Ａ、ＥおよびＨから選択され、
Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され、
Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され、
Ｘ４５は、Ｌまたは非存在であり、
Ｘ４６は、Ｐまたは非存在である）
ならびにｂ）ａ）で定義された配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【0076】
このＡＢＲ配列（および以下に記載される実施形態）の背後にある理論的根拠は、国際公開第２０２１／１８０７２７号に説明されている。
【0077】
ＡＢＲは、アミノ酸配列ＬＡＸ３ＡＫＸ６Ｘ７ＡＸ９Ｘ１０ ＥＬＤＸ１４ＹＧＶＳＤＸ２０ ＹＫＸ２３ＬＩＸ２６Ｘ２７ＡＫＴ ＶＥＧＶＸ３５ＡＬＸ３８Ｘ３９Ｘ４０ ＩＬＡＡＬＰを好ましくは含み、互いに独立して、
Ｘ３は、ＥおよびＳから選択され、
Ｘ６は、ＥおよびＶから選択され、
Ｘ７は、ＡおよびＬから選択され、
Ｘ９は、ＬおよびＮから選択され、
Ｘ１０は、ＡおよびＲから選択され、
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから、好ましくはＡ、ＳおよびＫから選択され、
Ｘ２０は、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ２３は、Ｎ、ＤおよびＲから選択され、
Ｘ２６は、ＮおよびＤから選択され、
Ｘ２７は、ＮおよびＫから選択され、
Ｘ３５は、ＫおよびＥから選択され、
Ｘ３８は、ＩおよびＫから選択され、
Ｘ３９は、ＤおよびＬから選択され、
Ｘ４０は、Ａ、ＥおよびＨから選択され、
Ｘ４５は、Ｌまたは非存在であり、
Ｘ４６は、Ｐまたは非存在である。
Ｘ３は、ＥおよびＳから選択され、
Ｘ６は、ＥおよびＶから選択され、
Ｘ７は、ＡおよびＬから選択され、
Ｘ９は、ＬおよびＮから選択され、
Ｘ１０は、ＡおよびＲから選択され、
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから、好ましくはＡ、ＳおよびＫから選択され、
Ｘ２０は、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ２３は、Ｎ、ＤおよびＲから選択され、
Ｘ２６は、ＮおよびＤから選択され、
Ｘ２７は、ＮおよびＫから選択され、
Ｘ３５は、ＫおよびＥから選択され、
Ｘ３８は、ＩおよびＫから選択され、
Ｘ３９は、ＤおよびＬから選択され、
Ｘ４０は、Ａ、ＥおよびＨから選択され、
Ｘ４５は、Ｌまたは非存在であり、
Ｘ４６は、Ｐまたは非存在である。
【0078】
ＡＢＲの一実施形態は、システイン（Ｃ）残基を含まない。
【0079】
一実施形態では、ＡＢＲは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：
ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩＮＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥＡＬＫＬＨ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号６、ＡＢＤ０３５）；
ＬＡＥＡＫＥＡＡＮＡ ＥＬＤＳＹＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩＤＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥＡＬＫＤＡ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号７）；
ＧＬＡＥＡＫＥＡＡＮ ＡＥＬＤＳＹＧＶＳＤ ＦＹＫＲＬＩＤＫＡＫ ＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤ ＡＩＬＡＡＬＰ（配列番号８、国際公開第２０１２００４３８４号のＰＥＰ０７９１４）；
ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＮＬＩＮＮＡＫＴ ＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号９、ＡＢＤｗｔ）；
および
ＬＡＥＡＫＶＬＡＬＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＤＬＩＤＫＡＫＴ ＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号１０）。
ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩＮＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥＡＬＫＬＨ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号６、ＡＢＤ０３５）；
ＬＡＥＡＫＥＡＡＮＡ ＥＬＤＳＹＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩＤＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥＡＬＫＤＡ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号７）；
ＧＬＡＥＡＫＥＡＡＮ ＡＥＬＤＳＹＧＶＳＤ ＦＹＫＲＬＩＤＫＡＫ ＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤ ＡＩＬＡＡＬＰ（配列番号８、国際公開第２０１２００４３８４号のＰＥＰ０７９１４）；
ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＮＬＩＮＮＡＫＴ ＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号９、ＡＢＤｗｔ）；
および
ＬＡＥＡＫＶＬＡＬＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＤＬＩＤＫＡＫＴ ＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥ ＩＬＡＡＬＰ（配列番号１０）。
【0080】
本開示の第２の態様として、第１の態様の融合タンパク質と、細胞傷害性分子、細胞傷害性ペプチド、細胞傷害性タンパク質または細胞傷害性放射性核種などの細胞傷害剤とを含む治療用コンジュゲートが提供される。細胞傷害性ペプチドまたは細胞傷害性タンパク質の場合、治療用コンジュゲート全体は融合タンパク質であり得る。
【0081】
細胞傷害性分子は、例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、デュオカルマイシン（ＤＵＯ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、パクリタキセル（ＰＴＸ）、メルタンシン（ＤＭ１）、エムタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン（ＤＭ４）、ソラブタンシン（ＤＭ４）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）またはカリケアマイシンであり得る。
【0082】
一実施形態では、細胞傷害性分子は、ＤＭ１、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦまたはＤＭ４である（Ｔａｒｃｓａ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｖｏｌｕｍｅ ３７，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０２０，Ｐａｇｅｓ １３－２２、およびＫｈｏｎｇｏｒｚｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；１８（１）Ｊａｎｕａｒｙ ２０２０による概説を参照）。
【0083】
細胞傷害性タンパク質の例には、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）およびその操作されたバリアント、例えば、ＰＥ３８、ジフテリア毒素（ＤＴ）およびデボウガニンがある（Ａｎｔｉｇｎａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；２０２０ Ｓｅｐ １７；１０（９）：１３３１を参照）。
【0084】
細胞傷害性タンパク質の他の例には、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢおよびＯＸ４０などの免疫調節標的に対する標的化ドメインがある（Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０２１ Ｏｃｔ １５；２７（２０）：５４５７－５４６４による概説を参照）。
【0085】
細胞傷害性放射性核種は、例えば、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ；１８６Ｒｅ；１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１４９Ｔｂ、１６１Ｔｂ、４７Ｓｃ；２２５Ａｃ；２１２Ｐｂ；２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２２７Ｔｈ、２２３Ｒａ；５８ｍＣｏ、１３１Ｉ、７６Ａｓ、７７Ａｓおよび２１１Ａｔからなる群から選択されてもよい。
【0086】
好ましい細胞傷害性放射性核種は、１７７Ｌｕ、９０Ｙおよび１８８Ｒｅである（Ｒｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）；２０２１ Ｎｏｖ ７；１３（２１）：５５７０による概説を参照）。
【0087】
１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ；１８６Ｒｅ；１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１４９Ｔｂ、１６１Ｔｂ、４７Ｓｃ；２２５Ａｃ；２１２Ｐｂ；２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２２７Ｔｈ、２２３Ｒａおよび５８ｍＣｏは、キレート剤に基づくコンジュゲーションによって融合タンパク質に結合され得る放射性金属である。キレート剤は、好ましくは、任意でチオール反応性リンカーを介して、融合タンパク質のシステイン残基に共有結合している。融合タンパク質のアミノ酸残基のアミンへの結合も可能であるが、一般にあまり好ましくない。
【0088】
キレート剤は、ＤＯＴＡおよびその誘導体（例えば、ＤＯＴＡのマレイミド誘導体）、架橋巨大環キレート剤ならびに立体的に制限された非環式キレート剤からなる群から選択され得る。
【0089】
１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、１４９Ｔｂ、１６１Ｔｂ、４７Ｓｃ；２２５Ａｃ；２１２Ｐｂ；２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２２７Ｔｈおよび５８ｍＣｏに特に適したキレート剤は、ＤＯＴＡおよびその誘導体ＤＯＴＡＧＡである。
【0090】
６７Ｃｕおよび６４Ｃｕでは、ＣＢ－ＴＥ２Ａなどの架橋キレート剤が良好な選択肢である。
【0091】
１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅでは、システイン含有ペプチドまたはメルカプトアセチル含有ペプチドに基づくキレート剤が好ましい。
【0092】
１３１Ｉ、７６Ａｓ、７７Ａｓおよび２１１Ａｔは、共有結合コンジュゲーションによって融合タンパク質に結合され得る非金属放射性核種である。
【0093】
放射ヨウ素標識は、融合タンパク質のシステイン（Ｃ）残基に結合することができる（（４－ヒドロキシフェニル）エチル）マレイミド（ＨＰＥＭ）を使用して達成され得る。Ａｓ（ＩＩＩ）形態の７６Ａｓおよび７７Ａｓ（および７４Ａｓ）は、融合タンパク質のシステイン（Ｃ）残基の（新たに）還元されたチオール基に直接カップリングされ得る。
【0094】
２１１Ａｔのカップリングでは、Ｎ－［４－（トリ－ｎ－ブチルスタンニル）フェネチル］－マレイミドをリンカーとして使用することができる。そのような場合、２１１Ａｔは、４－アスタト－フェネチル－マレイミド（ＡｔＰＥＭ）を形成するアスタトデスタニル化によってリンカーに最初にカップリングされ、これが次いで、融合タンパク質のシステイン（Ｃ）残基にカップリングされ得る。
【0095】
その結果、細胞傷害性放射性核種は、融合タンパク質のシステイン（Ｃ）残基を介して融合タンパク質に好ましくは連結される。交差／副反応を回避するために、そのような場合の融合タンパク質は、１つのシステイン（Ｃ）残基のみを好ましくは含む。
【0096】
細胞傷害性放射性核種を融合タンパク質に連結するシステイン（Ｃ）残基は、末端位置に配置されてもよい。好ましくは、システイン（Ｃ）残基は、融合タンパク質のＣ末端残基である。一実施形態では、このシステイン（Ｃ）残基は、ＡＢＲのＣ末端から伸長するアミノ酸配列のＣ末端残基である。そのようなアミノ酸配列は、例えば、ＥＥＥＣ（配列番号３３）またはＧＳＳＣ（配列番号３４）であり得る。
【0097】
操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージ）の養子移入は、近年、ヒトに対する癌処置では、ずば抜けた可能性を示している。ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入は、難治性および再発性Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者に完全かつ持続的な寛解をもたらした。ＣＡＲの細胞外部分は、腫瘍抗原（ＴＡ）に対する親和性タンパク質を含む。親和性タンパク質は、膜貫通ドメインおよび細胞内刺激ドメインに典型的に融合される。癌細胞上のＴＡに細胞が結合すると、内因性下流シグナル伝達分子が動員されてシグナル伝達し、Ｔ細胞活性化と、癌細胞の殺傷とをもたらす。しかし、Ｂ細胞悪性腫瘍について観察された並外れた応答にもかかわらず、患者における操作されたＴ細胞の強力な細胞殺傷および極めて長い血清循環時間（おそらく生涯にわたる）は、健康な器官における毒性と、長期の副作用とを制御することに関する課題をもたらし得る。したがって、この処置は、好都合なＴＡ発現プロファイルを有する癌に対して主に使用される。このため、ＣＡＲ Ｔ細胞の活性を制御するための戦略に、かなりの尽力が集中している（Ｋｒｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）２０２１ Ｄｅｃ ３０；１４（１）：１８３による概説も参照）。
【0098】
第１の態様の融合タンパク質は、プロテアーゼ活性化ＣＡＲ免疫細胞に使用され得る。そのようなＣＡＲ免疫細胞は、プロテアーゼ含有腫瘍では、優先的に活性である可能性を有する。あるいは、規定された時間枠の最中の細胞の活性化のために、ＣＡＲ免疫細胞の注入とともに、対応するプロテアーゼを同時投与することができる。処置が完了した後、プロテアーゼは患者において利用可能ではなく、該細胞は不活性のままである。両戦略は、毒性と長期の副作用とを低減し、さらに多くの癌形態に対して該処置を利用可能にする可能性を有する。
【0099】
したがって、第２の態様の変形例では、第１の態様の融合タンパク質は、細胞療法に使用するために細胞の表面上に発現される。上記の説明から、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージ、特にＴ細胞またはＮＫ細胞であり得ることになる。
【0100】
本開示の第３の態様として、治療的処置方法に使用するための、第２の態様の治療用コンジュゲートが提供される。
【0101】
治療的処置方法は、典型的には、ＥＧＦＲを過剰発現する癌などの癌に罹患している対象の処置方法である。ＥＧＦＲを過剰発現する癌の例には、肺癌（特に非小細胞肺癌）、前立腺癌、乳癌、結腸および直腸癌、頭頸部癌、胃食道癌、肝癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、腎癌ならびに膵癌がある。
【0102】
一実施形態では、処置方法は、腫瘍内のＥＧＦＲ発現の程度を定量する診断工程、および腫瘍内のＥＧＦＲの過剰発現の場合には治療用コンジュゲートの投与を含む。
【0103】
ＥＧＦＲ発現の程度の定量は、例えば、撮像に基づくことによって、例えば、第１の態様の融合タンパク質を含む造影剤を使用することによってもよい。そのような造影剤では、融合タンパク質は、撮像に適した放射性核種にカップリングされ得る。撮像に使用される場合、融合タンパク質は、半減期延長領域を典型的に含まない。
【0104】
放射性核種を含む造影剤の投与に続いて、患者は、ＥＧＦＲ発現を検出、可視化および／または定量するために走査される。走査は、典型的には、断層撮影、好ましくは陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）である。後者の場合、ＣＺＴに基づくカメラ技術が使用され得る。
【0105】
一実施形態では、撮像に適した放射性核種は、１８Ｆ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、６８Ｇａ、４４Ｓｃ、６１Ｃｕ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、５５Ｃｏ、４１Ｔｉ、６６Ｇａ、８６Ｙ、１１０ｍＩｎ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎおよび６７Ｇａからなる群から選択される。好ましい群は、１８Ｆ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎからなる。別の好ましい群は、１８Ｆ、６８Ｇａおよび１１１Ｉｎからなる。
【0106】
１８Ｆによる放射性標識では、接合団（１８Ｆへの共有結合を形成する）が融合タンパク質にカップリングされ得る。得られる構造の例には、Ｎ－（２－（４－［１８Ｆ］－フルオロベンズアミド）エチル）マレイミド（［１８Ｆ］ＦＢＥＭ）、４－［１８Ｆ］－フルオロベンズアルデヒド（［１８Ｆ］－ＦＢＡ）、および［１８Ｆ］－フルオロフェニルオキサジアゾールメチルスルホン（［１８Ｆ］－ＦＰＯＳ）がある。別の選択肢には、トリアザキレート剤と組み合わせた［１８Ｆ］一フッ化アルミニウムがある。
【0107】
１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉおよび７６Ｂｒによる放射性標識の場合にも、接合団が使用されてもよい。得られる構造の例には、ヨード－／ブロモ－ベンゾアート、およびヨード－／ブロモ－ヒドロキシフェニルエチルメアレイミド（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ ｍｅａｌｅｉｍｉｄｅ）がある。
【0108】
６８Ｇａ、６７Ｇａ、６６Ｇａ、４４Ｓｃ、５５Ｃｏ、４１Ｔｉ、８６Ｙ、１１０ｍＩｎおよび１１１Ｉｎによる放射性標識では、キレート剤をＨＢＰにカップリングすることが好ましい。キレート剤の例には、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡＧＡおよびＤＯＴＡＧＡならびにそれらの誘導体がある。
【0109】
６１Ｃｕおよび６４Ｃｕでは、ＣＢ－ＴＥ２Ａなどの架橋キレート剤が良好な選択肢である。
【0110】
９９ｍＴｃによる放射性標識では、ヘキサヒスチジン（Ｈ６）、およびシステイン含有ペプチドまたはメルカプトアセチル含有ペプチドに基づくキレート剤などの様々なキレート剤を使用することができる。
【0111】
１８Ｆ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、６８Ｇａ、４４Ｓｃ、６１Ｃｕ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、５５Ｃｏ、４１Ｔｉ、６６Ｇａ、８６Ｙまたは１１０ｍＩｎの場合、走査技術は、好ましくはＰＥＴである。
【0112】
１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎまたは６７Ｇａの場合、走査技術は、例えば、ＣＺＴに基づくカメラを使用するＳＰＥＣＴを含むことが好ましい。
【0113】
放射性核種は、融合タンパク質の末端、例えば、融合タンパク質のＣ末端に好ましくはカップリングされる。
【0114】
一実施形態では、融合タンパク質は、放射性核種のためのキレート剤を形成する伸長部を含む。一例として、キレート剤形成部分は、９９ｍＴｃに結合することができる配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３５）を含み得る。ＨＨＨＨＨＨの代替例はＨＥＨＥＨＥ（配列番号３０）である。
【0115】
本開示の第４の態様として、第２の態様の治療用コンジュゲートを投与する工程を含む、癌に罹患している対象の処置方法が提供される。
【0116】
本開示の第５の態様として、第２の態様の治療用コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
【0117】
組成物は、例えば、静脈内投与に適合させられ得る。したがって、組成物は水性であってよい。水性組成物は、好ましくは緩衝され、例えば、リン酸緩衝される。一例として、組成物は、リン酸緩衝生理食塩水に基づいてもよい。水性組成物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み得る。ＨＳＡは、フリーラジカルを捕捉し、治療用コンジュゲートへの放射線分解損傷を防止する。ＨＳＡの量は、１０～１５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、５０～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７５ｍｇ／ｍｌであり得る。
【実施例】
【0118】
例１
材料および方法
細菌培養およびライブラリー発現
材料および方法
細菌培養およびライブラリー発現
【0119】
１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＢ２培地（１％カゼイン加水分解物、２．５％酵母抽出物、０．５％Ｄ－グルコース、２．５％ＮａＣｌ、０．０８％Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝７．４）中で、Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）細胞を一晩増殖させた。バインダーの単離には、表面に１０９の異なるアフィボディバリアントを発現するコンビナトリアルなＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）ライブラリーを使用した。
【0120】
標的ビオチン化
【0121】
ＺＥＧＦＲ－Ｈｉｓ６－ＣｙｓをＩＭＡＣによって精製し、製造業者の推奨に従ってＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化した。製造業者の推奨に従ってＢｉｏｔｉｎ－ＸＸ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して、ＥＧＦＲ（Ｈｉｓタグ）（中国Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）をビオチン化した。２８０ｎｍでの吸光度を使用してタンパク質濃度を決定した。
【0122】
ＭＡＣＳを使用したＺＥＧＦＲに対するライブラリー選択
【0123】
ストレプトアビジンをコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）（５００μＬ）を８００μＬのＰＢＳ－Ｐ（０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ ＮＦ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ、ｐＨ７．４；ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡを補充したリン酸緩衝生理食塩水）を用いて２回洗浄し、穏やかに回転させながら室温で１時間にわたって１５０ｎＭのビオチン化ＺＥＧＦＲとインキュベートした。その後、２ｍＭのＥＤＴＡ（ＰＢＳＰ－Ｅ）を補充したＰＢＳ－Ｐを用いて、ＺＥＧＦＲをコーティングした磁気ビーズを洗浄した。１０倍のライブラリーカバレッジに対応する数の細胞（１０１０細胞）をＰＢＳＰ－Ｅを用いて洗浄し、ペレットをＰＢＳＰ－Ｅに再懸濁して５・１０８細胞／ｍＬの最終濃度にした。ＺＥＧＦＲをコーティングした磁気ビーズ１．２５ｍｇとともに、穏やかに回転させながら、細胞を室温で１時間、続いて氷上で５分間インキュベートした。チューブを磁気ラック上に４分間置いてビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズを３０ｍＬの氷冷ＰＢＳ－Ｐに再懸濁した。ビーズの捕捉および洗浄を３回繰り返した。最後に、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充した５０ｍＬのＢ２培地に細胞を再懸濁した。培養物を３７°Ｃおよび１５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。磁気選別の前および後に採取した試料の段階希釈を使用して、集団サイズを計算した。最後に、ＰＢＳ－Ｐ中の２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＨＳＡコンジュゲートおよび３３．３ｎＭストレプトアビジンＲ－フィコエリトリンコンジュゲート（ＳＡＰＥ）とともにライブラリーをインキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ－Ｐを用いて２回洗浄し、３００μＬの氷冷ＰＢＳ－Ｐに再懸濁した。Ｇａｌｌｉｏｓ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して細胞を分析した。検出に使用したレーザープロトコルは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＨＳＡの検出についてはＦＬ６－６６０／２０ｎｍ、ＳＡＰＥの検出についてはＦＬ２－５７５／２０ｎｍであった。
【0124】
ＦＡＣＳを使用したＺＥＧＦＲに対するライブラリー選択
【0125】
続いて、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＭＡＣＳ選択からのアウトプット細胞（ライブラリーサイズ≒１０５細胞）を選別した。新しいライブラリーサイズの１００倍のカバレッジを一晩培養に使用した。細胞を氷冷ＰＢＳ－Ｐを用いて２回洗浄し、１５０ｎＭの濃度でＰＢＳ－Ｐに懸濁したビオチン化ＺＥＧＦＲと混合した。試料を穏やかに回転させながら室温で１時間インキュベートした。その後、氷冷ＰＢＳ－Ｐを使用して細胞を２回洗浄した。ＦＡＣＳによって細胞ライブラリーを可視化し、選別するために、ＰＢＳ－Ｐ上の２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＨＳＡコンジュゲートおよび３３．３ｎＭ ＳＡＰＥとともに細胞をインキュベートした。最後に、細胞を氷冷ＰＢＳ－Ｐを用いて２回洗浄し、３００μＬの氷冷ＰＢＳ－Ｐに再懸濁した。続いて、Ａｓｔｒｉｏｓ ＦＣ細胞選別機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、細胞を選別した。検出に使用したレーザープロトコルは、ＳＡＰＥの検出については５６１－５８５／４０ ｈｅｉｇｈｔ－ｌｏｇであり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＨＳＡの検出については６４０－６７１／３０ ｈｅｉｇｈｔ－ｌｏｇであった。合計１０６個の細胞を１．５ｍＬのＢ２培地に分取し、穏やかに回転させながら３７°Ｃで１時間インキュベートした。その後、細胞を１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＢ２培地と最終容量３ｍＬまで混合し、穏やかに回転させながら３７°Ｃで一晩インキュベートした。最後に、ライブラリーをＦＣによって試験し、グリセロールストックとして等分して、さらなる実験のために－８０°Ｃで保存した。
【0126】
アフィボディ候補の選択および生成
【0127】
１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充した寒天プレート上にライブラリーを播種し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＴＳＢ－Ｙ培地（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で単一コロニーを一晩増殖させることによって、個々のアフィボディ候補を選択した。細胞をＦＣによって分析し、シーケンシングのために送付した（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ Ｓｅｑｌａｂ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。制限クローニングによって、選択された候補アフィボディのコード配列をｐＥＴｂ２６＋細菌発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ，ＵＳＡ）にクローニングした。標準的な熱ショック処理によって、先にクローニングしたプラスミドによって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１＊細胞を形質転換した。形質転換からの単一コロニーを接種し、５０ｎｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した１０ｍＬのＴＳＢ－Ｙ培地中で一晩増殖させた。１６時間後、一晩培養物を、５０ｎｇ／ｍＬのカナマイシンを補充したＴＳＢ－Ｙで１：１００に希釈して、最終容量を１００ｍＬにした。培養物をＯＤ６００≒１で１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを用いて誘導し、２７°Ｃおよび２００ｒｐｍで一晩インキュベートした。１６時間後、細胞を５０００×ｇで８分間の遠心分離によって採取し、－２０°Ｃで保存した。１．５分間の超音波処理（１ｓ ＯＮ／１ｓ ＯＦＦ）、続いて４°Ｃおよび１００００ｘｇで２０分間の遠心分離によって、細胞を溶解した。上清を濾過し（０．４５μｍ）、目的のタンパク質を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して精製した。この目的のために、ＰＤ－１０カラムを３ｍｌのＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎで充填した。製造業者の推奨に従って（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）および溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）を使用した。最後に、製造業者の推奨に従って（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）ＰＤ－１０脱塩カラムを使用して、緩衝液をＰＢＳに変更した。質量分析（ＭＳ）（４８００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）およびＳＤＳ－ｐａｇｅゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）によって、精製したタンパク質を分析した。
【0128】
円二色性を使用したＺＢ０５の二次構造、熱安定性およびリフォールディング能力の評価
【0129】
１ｍｍの光路長を有するＣｈｉｒａｓｃａｎ分光偏光計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＵＫ）を使用して円二色性分光法を行って、０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で構築物のアルファ－ヘリカル含有量、熱安定性、およびリフォールディング能力を分析した。２０°Ｃから９５°Ｃに加熱（５°Ｃ／分）した際の２２１ｎｍでの楕円率の変化を測定することによって、熱安定性を評価した。Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ Ｓｉｇｍｏｉｄａｌモデル（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７、ＵＳＡ）を使用したカーブフィッティングによって、可変温度測定値（ＶＴＭ）から取得したデータにより融解温度（Ｔｍ）を近似した。熱変性の前および後に２０°Ｃで１９５～２６０ｎｍの範囲の波長での測定から得られたスペクトルを比較することによって、リフォールディング能力を評価した。
【0130】
表面プラズモン共鳴による親和性スクリーニング
【0131】
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ ＳＰＲ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、可溶性ＺＢ０５アフィボディマスキング候補およびＰＯＣ－ＰＡ分子について標的結合を測定した。製造業者の推奨に従って（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、デキストランＣＭ－５センサーチップ上に、アミンカップリングによって約６７６ＲＵのＺＥＧＦＲと１０００ＲＵのＨＳＡとを固定化した。ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４を補充したリン酸緩衝生理食塩水）をランニング緩衝液として使用した。分析物ＺＢ０５およびＺＥＧＦＲを５つの異なる濃度（２００、１００、５０、２５および１２．５ｍＭ）で１５０秒間注入し、続いて１５０秒間解離させた。インタクトなＰＯＣ－ＰＡおよび切断されたＰＯＣ－ＰＡを１００ｎＭの濃度で１５０秒間注入し、続いて１５０秒間解離させた。実験は、２５°Ｃ、流速１００μＬ／分で行った。チップは、１０ｍＭ ＨＣｌを３０秒間注入することによって再生させた。Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１動態モデルを使用してＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアによって、結合動態を分析した。
【0132】
ＺＢ０５マスキング候補の変異誘発試験、および結合分析
【0133】
ＺＢ０５配列内の各ランダム化された位置をシステインを除く各アミノ酸に個別に変異させ、合計２５３個の配列を生成した。各配列のオリゴを合成し、プールした（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）。ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用して、Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）提示ベクターｐＳＣ２に、プールしたオリゴをクローニングした。得られたプラスミドを増幅のためにＳｔｅｌｌａｒ（商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）に形質転換し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して抽出した。続いて、標準的なエレクトロポレーションプロトコルに従って、エレクトロコンピテントＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００細胞に増幅ベクターを形質転換した。
【0134】
１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＢ２培地中で、Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）細胞を一晩増殖させた。１６時間後、細胞をＰＢＳ－Ｐを用いて２回洗浄し、１５０ｎＭの濃度でＰＢＳ－Ｐに再懸濁したビオチン化ＺＥＧＦＲと混合した。試料を穏やかに回転させながら室温で１時間インキュベートした。その後、氷冷ＰＢＳ－Ｐを使用して細胞を２回洗浄した。ＦＡＣＳによってライブラリーを可視化し、選別するために、ＰＢＳ－Ｐ中の２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＨＳＡコンジュゲートおよび３３．３ｎＭ ＳＡＰＥとともに細胞をインキュベートした。最後に、細胞を氷冷ＰＢＳ－Ｐを用いて２回洗浄し、３００μＬの氷冷ＰＢＳ－Ｐに再懸濁した。続いて、Ａｓｔｒｉｏｓ ＦＣ細胞選別機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、結合および非結合について細胞を選別した。検出に使用したレーザープロトコルは、ＳＡＰＥの検出については５６１－５８５／４０ ｈｅｉｇｈｔ－ｌｏｇであり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＨＳＡの検出については６４０－６７１／３０ ｈｅｉｇｈｔ－ｌｏｇであった。集団当たり合計１０６個の細胞を１．５ｍＬのＢ２培地に分取し、穏やかに回転させながら３７°Ｃで１時間インキュベートした。その後、細胞を１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＢ２培地と最終容量３ｍＬまで混合し、穏やかに回転させながら３７°Ｃで一晩インキュベートした。最後に、選別された結合集団および非結合集団、ならびにナイーブライブラリーをＦＣを使用して試験し、次世代シーケンシングに使用した。
【0135】
変異誘発試験からのライブラリーのディープシーケンシング
【0136】
１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＢ２培地中で、Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）細胞を一晩増殖させた。Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、製造業者の指示に従って（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）各ライブラリー集団からプラスミドを精製した。ＴｒｕｅＳｅｑアダプターおよび特異的インデックス（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＵＳＡ）を含有するプライマーを用いてプラスミドをＰＣＲ増幅することによって、ディープシーケンシングのために試料を調製した。ＭｉＳｅｑ ３００サイクル機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＵＳＡ）を使用して、Ｓｃｉｌｉｆｅｌａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）でシーケンシングを行った。Ｇｅｎｅｉｏｕｓバージョン２０２０．１．１（Ｇｅｎｅｉｏｕｓ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）によって、アウトプットＦＡＳＴＱファイルを分析した。ＮＧＳを使用して、変異ＺＢ０５バリアントの結合集団および非結合集団、ならびにナイーブ変異誘発ライブラリーをシーケンシングした。ナイーブライブラリーの各位置におけるアミノ酸の出現率に対してデータを正規化した。非結合集団内の対応するバリアントについて少なくとも５０％の枯渇を有するナイーブライブラリーと比較して、結合集団内の２倍濃縮から、ＺＥＧＦＲへの結合を保持した許容される置換を決定した。
【0137】
ブドウ球菌提示ベクターへのＰＯＣ－ＰＡサブクローニング
【0138】
ＴＥＶプロテアーゼ基質配列によって分離され、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）に連結されたｐＳＣ２ベクターへの制限クローニングによって、ＥＧＦＲ結合アフィボディ分子ＺＥＧＦＲと抗イディオタイプアフィボディ分子ＺＢ０５とをコードする遺伝子をクローニングした。ＴＥＶプロテアーゼ基質は、リンカーの長さを伸長するために、Ｇ４Ｓリピートが隣接する配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号３６）からなった（ＴＥＶプロテアーゼ基質を含むリンカーの正確な配列を図１２に示す）。抗ＺＨＥＲ２アフィボディマスキングドメイン（ＥＧＦＲと結合しない「ＺＥ０１」）を含有する構築物をｐＳＣ２にクローニングして、対照として使用した。得られたプラスミドをプラスミド増幅のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０に形質転換し、続いて、標準的なエレクトロポレーションプロトコルに従ってエレクトロコンピテントＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００細胞に形質転換した（Ｌｏｆｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，１０２（３），７３６－７４７）。
【0139】
ＰＯＣ－ＰＡプロドラッグの完全なアミノ酸を図１２に示す。
【0140】
Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）細胞表面上のＴＥＶプロテアーゼによるＰＯＣ－ＰＡ活性化
【0141】
以前に記載された標準的なプロトコルに従って、様々なプロドラッグ構築物を提示するＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）細胞を一晩増殖させた。約１０７個の細菌細胞（１０μＬの一晩培養物）を８００μＬの１×ＰＢＳ－Ｐを用いて２回洗浄し、４°Ｃおよび６０００ｒｐｍで６分間遠心分離することによってペレット化した。細胞を、５単位のＴＥＶプロテアーゼを補充したアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８）、またはアッセイ緩衝液のみ（対照）のいずれかに再懸濁し、３０°Ｃで１時間インキュベートした。細菌細胞をＰＢＳ－Ｐを用いて３回洗浄し、穏やかに回転させながら３７°Ｃで４５分間、５０ｎＭビオチン化ＥＧＦＲ受容体を補充した１００μＬのＰＢＳ－Ｐ、またはＰＢＳ－Ｐのみの中でインキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ－Ｐを用いて２回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＨＳＡおよびストレプトアビジンＲ－フィコエリトリンコンジュゲートとともにインキュベートして、ＦＣによって分析した。
【0142】
ＴＥＶプロテアーゼによる可溶性ＰＯＣ－ＰＡ活性化
【0143】
様々なプロドラッグ構築物をｐＥＴ２６ｂ＋発現ベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１＊細胞内で産生させた。自動精製システム（ＡＫＴＡ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してタンパク質を精製した。この目的のために、製造業者の指示に従って、１０ｍＬのＨＳＡ－セファロース、１×ＴＳＴ ｐＨ８、５ｍＭ、ＮＨ４Ａｃ ｐＨ５．５、および０．５Ｍ ＨＡｃを充填したＰＤ－１０脱塩カラムを使用した。タンパク質を凍結乾燥し、－２０°Ｃで保存した。３３μｇのＴＥＶを補充したアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８）に、ＰＯＣ－ＰＡ（ＺＢ０５－ＴＥＶ基質－ＺＥＧＦＲ－ＡＢＰ）タンパク質を３０°Ｃで１時間再懸濁した。製造業者の推奨に従って（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）ＰＤ－１０脱塩カラムを使用して、緩衝液をＰＢＳ－０．１％ＢＳＡに変更した。
【0144】
哺乳動物細胞培養
【0145】
Ｈ２９２（ヒト粘膜表皮性肺癌）細胞株およびＡ４３１（ヒト扁平細胞皮膚癌）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ，Ｓｗｅｄｅｎ経由）細胞株を細胞傷害性アッセイに使用した。１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．，ＵＳＡ）と、ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰＥＳＴ、Ｂｉｏｋｒｏｍ Ｋｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の混合物とを補充したロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地（Ｆｌｏｗ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＫ）（Ｈ２９２用）、ならびに１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地（Ｆｌｏｗ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＵＫ）（Ａ４３１用）中で細胞を培養した。５％ＣＯ２雰囲気中、３７°Ｃで細胞を増殖させた。
【0146】
Ｈ２９２細胞およびＡ４３１細胞上のＥＧＦＲ結合のフローサイトメトリー分析
【0147】
製造業者の推奨に従って（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）、上記のようにＡ４３１細胞およびＨ２９２細胞を培養した。トリプシン処理細胞（５・１０５）を再懸濁し、５００μＬのＰＢＳ－０．１％ＢＳＡ中で洗浄した。細胞を、１００ｎＭのＰＯＣ－ＰＡを補充した１００μＬのＰＢＳ－０．１％ＢＳＡ（先にＴＥＶプロテアーゼを用いてまたは用いずに処理した）中、室温で１時間インキュベートした。細胞をもう一度洗浄し、ＰＢＳ－０．１％ＢＳＡ中の２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＨＳＡとともに氷上で４５分間インキュベートした。最終洗浄工程後、細胞を３００μＬのＰＢＳ－０．１％ＢＳＡに再懸濁し、Ｇａｌｌｉｏｓ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用してＦＣによって分析した。
【0148】
結果
１４個の表面露出残基のランダム化によるブドウ球菌提示を使用して、ＺＥＧＦＲの結合表面に対する特異性を有する、ＺＢ０５と示される抗イディオタイプアフィボディマスキングドメインを首尾よく生成した（図１）。マスキングドメインの目的は、ＥＧＦＲ標的化アフィボディの結合を遮断することである。ＴＥＶ－プロテアーゼ切断可能リンカーおよびアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）を介してＥＧＦＲ結合アフィボディ分子ＺＥＧＦＲのＮ末端に融合したマスキングドメインからなる概念実証プロアフィボディ（ＰＯＣ－ＰＡ）分子を構築した（図２および図１２）。ＴＥＶプロテアーゼの基質配列を選択して初期特性評価を容易にし、精製タグおよび特性評価ツールとしてＡＢＰを含めた（ただし、治療用途では、ＡＢＰは半減期延長効果を有する）。
１４個の表面露出残基のランダム化によるブドウ球菌提示を使用して、ＺＥＧＦＲの結合表面に対する特異性を有する、ＺＢ０５と示される抗イディオタイプアフィボディマスキングドメインを首尾よく生成した（図１）。マスキングドメインの目的は、ＥＧＦＲ標的化アフィボディの結合を遮断することである。ＴＥＶ－プロテアーゼ切断可能リンカーおよびアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）を介してＥＧＦＲ結合アフィボディ分子ＺＥＧＦＲのＮ末端に融合したマスキングドメインからなる概念実証プロアフィボディ（ＰＯＣ－ＰＡ）分子を構築した（図２および図１２）。ＴＥＶプロテアーゼの基質配列を選択して初期特性評価を容易にし、精製タグおよび特性評価ツールとしてＡＢＰを含めた（ただし、治療用途では、ＡＢＰは半減期延長効果を有する）。
【0149】
アフィボディマスキング候補の単離
【0150】
１０９個というアフィボディバリアントの理論サイズを有するナイーブコンビナトリアルＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）ライブラリーを使用して、ＥＧＦＲ結合アフィボディ分子ＺＥＧＦＲの結合表面に対する親和性を有する抗イディオタイプアフィボディを単離した。磁気支援細胞選別（ＭＡＣＳ）を最初に２回使用して、数回のＦＡＣＳの前にライブラリーの複雑さを低減した。２回目のＭＡＣＳ選択ラウンド後の推定最大細胞多様性は、４．８・１０５バリアントであった。バインダーのライブラリーをさらに濃縮するために、３回のＦＡＣＳ選択を行った。ＦＡＣＳの１回目では、０．４２％ゲートを使用して、２回目のＭＡＣＳのアウトプットから細胞を選別し、ライブラリーＦ１Ａを作成した。ＦＡＣＳの２回目では、３．０２％ゲートを使用してＦ１Ａを選別し、Ｆ２Ａ１を得た。最後に、集団の１２．７７％を包含するゲートを用いてＦ２Ａライブラリーに対して３回目のＦＡＣＳを行い、ライブラリーＦ３Ａ１．２を得た。各選択ラウンドからのアウトプットをフローサイトメトリー（ＦＣ）によって分析して、ＺＥＧＦＲへの結合の濃縮を確認した。陰性対照を使用してストレプトアビジンバインダーの可能性を排除した（データは示さず）。選別されたアウトプットのフローサイトメトリー分析から分かるように、各選択ラウンド後に推定バインダーの数が増加した。
【0151】
個々のマスキングドメイン候補の親和性試験
【0152】
３０を超えるシーケンシングされた候補（反復性および固有の両方）について、ＦＣによって、ＺＥＧＦＲへの結合を分析した。これらの候補のうちの１つ（ＺＢ０５）は、ＺＥＧＦＲに対する高い結合傾向を示すことが見出され、ＥＧＦＲを標的とするプロアフィボディの構築のための抗イディオタイプマスキングドメイン候補としてＺＢ０５を選択した。ＺＢ０５の配列を図１０に示す。
【0153】
ＺＢ０５マスキング候補の変異誘発試験、および結合分析
【0154】
各ランダム化された位置におけるアミノ酸の結合寄与と、任意の他のアミノ酸への置換がＺＥＧＦＲへの結合にどのように影響を及ぼすかとを評価するために、ＺＢ０５マスキングドメインの変異誘発試験を行った。ＺＢ０５の元の配列およびランダム化された位置を図１０に示す。ＦＡＣＳを使用して、２５３個の異なるＺＢ０５バリアントを含有する変異誘発ライブラリーの結合集団および非結合集団を選別した。ライブラリーの代表的な選別、および結合集団のその後のフローサイトメトリー分析を図１１に示す。ＮＧＳを使用して、結合集団および非結合集団、ならびにナイーブ変異誘発ライブラリーをシーケンシングした。結果を図１０に要約する。位置１３は、元のＺＢ０５配列では欠失しているにもかかわらず、変異誘発ライブラリーに含まれていた。データから、結合に重要であると思われる位置を識別することができる。これらには、任意の他のアミノ酸への置換が結合を無効にした位置９、１１、１７、１８、２７、３２および３５のアミノ酸が含まれる。位置１４および３１では柔軟性が制限されており、それぞれトレオニンからセリン、およびイソロイシンからロイシンへの置換が可能である。位置１３は、元のＺＢ０５配列では欠失しており、グルタミン酸への置換のみを可能にする。非結合集団の４０％が、欠失した位置にアミノ酸を含有し、結合集団ではわずか０．６％であったことから、欠失は結合に有益であると思われる。位置１３にアミノ酸を挿入すると、ヘリックス１上の位置１４、１７および１８に、高い見かけの結合寄与を有するアミノ酸の空間的位置がシフトすることから、これは驚くべきことではない。残りの位置（１０、２４、２５および２８）は、結合を保持するいくつかの異なるアミノ酸置換によって高度に可変である。
【0155】
抗イディオタイプマスキングドメインＺＢ０５の生成および特性評価
【0156】
ＺＢ０５マスキング候補をｐＥＴ２６ｂ＋ベクターにクローニングし、Ｃ末端Ｈｉｓタグを含有する、７．６ｋＤａの予測分子量を有する可溶性単量体として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１＊細胞内で産生させた。タンパク質をＩＭＡＣによって精製し、続いて、質量分析（ＭＳ）およびＳＤＳ－ｐａｇｅを用いて分析して、それぞれ質量同一性を確認し、純度を評価した（データは示さず）。円二色性分光法を使用して、二次構造を調査し、熱安定性およびリフォールディング能力を決定した。可変温度測定値（ＶＴＭ）の結果を図３に示す。融解温度（Ｔｍ）は６４．１°Ｃと計算された。タンパク質は、予測されるアルファ－らせん二次構造含量を示し、熱変性後に完全にリフォールディングすることができた（図３Ａ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくバイオセンサーアッセイを行って、ＺＥＧＦＲに対するＺＢ０５の結合親和性を試験した。固定化ＺＥＧＦＲを含むセンサーチップ上に、５つの濃度のＺＢ０５を注入した。ＨＳＡを固定化して、非特異的結合についてスクリーニングした。結果から、陰性対照表面への非特異的結合を伴わない、ＺＥＧＦＲへのＺＢ０５の結合が確認される（図３Ｂ）。
【0157】
Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）細胞表面上のＰＯＣ－ＰＡ活性の分析
【0158】
概念実証プロアフィボディ（ＰＯＣ－ＰＡ）を生成するために、ＺＢ０５配列およびＺＥＧＦＲ配列の両方を、ＴＥＶ基質コード配列およびＣ末端アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）を有するリンカーを含有するブドウ球菌提示ベクターにサブクローニングした。ＥＧＦＲ結合ＺＥＧＦＲ分子とマスキングＺＢ０５アフィボディ分子との間の相互作用の初期分析を容易にするために、ＴＥＶ－プロテアーゼを選択した。後の実験では、プロテアーゼ基質配列を容易に交換して、任意のプロテアーゼ特異性に対応することができた。ＰＯＣ－ＰＡ（ＺＢ０５－ＴＥＶ基質－ＺＥＧＦＲ－ＡＢＰ）をブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）上に提示し、ＴＥＶ－プロテアーゼによる処理の前および後にＦＣを使用して組換えヒトＥＧＦＲへの結合を分析した。この特定の実験ではインタクトなＰＯＣ－ＰＡについてＥＧＦＲへの結合を検出することができなかったため（データは示さず）、結果から、ＺＥＧＦＲとその標的との結合相互作用を妨げるＺＢ０５のマスキング能力が実証された。ただし、ＴＥＶ－プロテアーゼによる処理後、ＥＧＦＲへのＺＥＧＦＲの結合は回復した（データは示さず）。全体として、結果から、プロテアーゼ切断が、ＰＯＣ－ＰＡが溶液中のＥＧＦＲに結合するための要件であることが実証された。さらに、抗ＺＨＥＲ２アフィボディマスキングドメインとＺＥＧＦＲ結合ドメイン（ＰＯＣ－ＰＡ－ＤＭ）とからなる別の構築物を同じ条件で評価して、ＺＢ０５によるマスキングがＺＥＧＦＲに対する特異性によって付与され、立体障害または非特異的相互作用に起因しないことを検証した（データは示さず）。この結果は、ＰＯＣ－ＰＡの２つのドメイン間の相互作用が、ＺＥＧＦＲに対するＺＢ０５の特異的な抗イディオタイプ結合に起因することを示している。
【0159】
可溶性ＰＯＣ－ＰＡの生成、およびＴＥＶ切断の評価
【0160】
精製したタンパク質をＭＳ（データは示さず）およびＳＤＳ－ｐａｇｅゲルの両方によって分析して、試料のサイズおよび純度をそれぞれ確認した（図４Ａ）。タンパク質試料をＴＥＶプロテアーゼとのインキュベーションの前および後に分析し、これにより、２つの生成物、ＺＢ０５マスキングドメイン（８１４６Ｄａ）、およびＡＢＰに融合したＺＥＧＦＲ結合ドメイン（３０５３１Ｄａ）へのプロドラッグの切断を確認した（図４Ａ）。ＳＰＲを使用して、固定化されたＥＧＦＲおよびＨＳＡへのインタクトなＰＯＣ－ＰＡおよび切断されたＰＯＣ－ＰＡの両方の結合を分析した。センサーグラムを図４Ｂに示す。結果は、この特定の実験設定ではインタクトなＰＯＣ－ＰＡのＥＧＦＲとの相互作用を妨げる、ＺＢ０５のマスキング能力を実証している。ＴＥＶ－プロテアーゼによる切断後、ＰＯＣ－ＰＡは、ＥＧＦＲに高い親和性で結合することができた。ＨＳＡへのＡＢＰの結合は、ＺＢ０５の存在によって、またはＴＥＶ－プロテアーゼによる処理によって影響を受けなかった。結果は、ＦＣから得られた結果を裏付け、これにより、ＺＢ０５のマスキング能力が確認される。
【0161】
フローサイトメトリーを使用したＨ２９２細胞およびＡ４３１細胞上のＰＯＣ－ＰＡのＥＧＦＲ結合分析
【0162】
インタクトなＰＯＣ－ＰＡ、およびＴＥＶ－プロテアーゼによって予め切断したＰＯＣ－ＰＡの両方について、それぞれ中程度のＥＧＦＲ発現および高いＥＧＦＲ発現を有する２つのヒト癌細胞株Ｈ２９２（ヒト粘膜表皮性肺癌）およびＡ４３１（ヒト扁平上皮癌）上の天然ＥＧＦＲへのＰＯＣ－ＰＡの結合を分析した（図５）。ＥＧＦＲ特異的アフィボディの結合能力に対する立体障害の影響を評価するために、ダミー（非ＺＥＧＦＲ結合）マスキングアフィボディドメイン（ＺＥ０１）を有する構築物ＰＯＣ－ＰＡ－ＤＭを含めた。切断されたＰＯＣ－ＰＡのシグナルは、両細胞株ではＰＯＣ－ＰＡ－ＤＭのシグナルと重複し、インタクトな切断されていないＰＯＣ－ＰＡとは顕著に異なり、これは、ＺＢ０５マスキングドメインによるＥＧＦＲ結合の特異的遮断と、プロテアーゼ媒介性活性化がＺＢ０５の除去によってＥＧＦＲ結合を改善することとを示す。ただし、図５はまた、切断されていないＰＯＣ－ＰＡが癌細胞上のＥＧＦＲにうまく結合することを実証しており、ＥＧＦＲ結合ドメインをマスキングドメインに連結するリンカーの切断が、治療用途では必ずしも必要とされないことを示している。
【0163】
例２（ＺＥＧＦＲに基づくプロドラッグの生体内分布）
このインビボ生体内分布試験で使用したプロドラッグと例１で使用したＰＯＣ－ＰＡプロドラッグとの間にはいくつかの相違がある：
・リンカーでは、ＴＥＶ－基質配列がマトリプターゼ－基質配列に置き換えられる；
・ＡＢＰの代わりにＡＢＤ０３５がアルブミン結合領域（ＡＢＲ）に使用される（ＡＢＤ０３５の方が、高い親和性を有する小さなドメインである）；
・Ｃ末端に、トリグルタミル（ＥＥＥ）リンカー、続いて、放射性金属キレート剤のコンジュゲーションのためのシステイン（配列番号３３）が付加される（トリグルタミル（ＥＥＥ）リンカーは親水性を増加させる）；
・Ｎ末端ＨＥＨＥＨＥ－タグが付加される；および
・ＺＥＧＦＲをＡＢＲに連結するスペーサーは、ＶＤＬＱＡＣ（配列番号２８）の代わりにＧＧＧＧＳ（配列番号３２）である。
このインビボ生体内分布試験で使用したプロドラッグと例１で使用したＰＯＣ－ＰＡプロドラッグとの間にはいくつかの相違がある：
・リンカーでは、ＴＥＶ－基質配列がマトリプターゼ－基質配列に置き換えられる；
・ＡＢＰの代わりにＡＢＤ０３５がアルブミン結合領域（ＡＢＲ）に使用される（ＡＢＤ０３５の方が、高い親和性を有する小さなドメインである）；
・Ｃ末端に、トリグルタミル（ＥＥＥ）リンカー、続いて、放射性金属キレート剤のコンジュゲーションのためのシステイン（配列番号３３）が付加される（トリグルタミル（ＥＥＥ）リンカーは親水性を増加させる）；
・Ｎ末端ＨＥＨＥＨＥ－タグが付加される；および
・ＺＥＧＦＲをＡＢＲに連結するスペーサーは、ＶＤＬＱＡＣ（配列番号２８）の代わりにＧＧＧＧＳ（配列番号３２）である。
【0164】
例２のプロドラッグの完全なアミノ酸配列（配列番号１２）を図１３に示す。
【0165】
材料および方法
細胞培養
細胞培養
【0166】
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ，Ｂｏｒａｓ，Ｓｗｅｄｅｎ経由）から、ヒト類表皮癌細胞株Ａ４３１（ＥＧＦＲ陽性、マトリプターゼ低発現）、肺粘膜類表皮癌（ｌｕｎｇ ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株Ｈ２９２（ＥＧＦＲ陽性、マトリプターゼ高発現）およびリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓ（ＥＧＦＲ陰性）を入手した。それらを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、およびペニシリン１００ＩＵ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとの混合物を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。加湿インキュベーター内、３７°Ｃ、５％ＣＯ２雰囲気で細胞を増殖させた。
【0167】
標識化およびインビトロ安定性
【0168】
Ｃｕｒｉｕｍ Ｐｈａｒｍａ（Ｃｕｒｉｕｍ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂ．Ｖ．，Ｐｅｔｔｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から塩化インジウム［１１１Ｉｎ］ＩｎＣｌ３を購入した。緩衝液を高品質Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中で調製し、Ｃｈｅｌｅｘ １００樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して金属汚染物から一晩かけて精製し、０．２μｍ濾過した。３つの化合物を－２０°Ｃで０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．０中で保存した。
【0169】
化合物（８８～９７μＬの０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．０中２１～２５μｇ）を［１１１Ｉｎ］ＩｎＣｌ３（４０μＬの０．０５Ｍ ＨＣｌ中３０ＭＢｑ）と混合することによって放射性標識を行った。混合物を十分にボルテックスし、８０°Ｃで６０分間インキュベートした。インキュベーション後、５００倍モル過剰のＥＤＴＡ（１６μＬの０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．０中１６０μｇ）を添加し、混合物を８０°Ｃで１０分間インキュベートした。次いで、予め平衡化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて溶出したＮＡＰ－５サイズ排除カラムを使用して、反応混合物を精製した。０．２Ｍクエン酸、ｐＨ２．０を用いて溶出したｉＴＬＣを用いて、化合物の放射化学的収率および放射化学的純度を決定した。この系では、［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識化合物は適用点に留まり、遊離［１１１Ｉｎ］Ｉｎは溶媒フロントとともに移動する。ストリップ間の活性の分布を、Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＲ－３５ ＢＩＯ Ｐｌｕｓ、Ｅｌｙｓｉａ－Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｂｉｅｔｉｇｈｅｉｍ－Ｂｉｓｓｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定し、ＡＩＤＡ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｅｌｙｓｉａ－Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｂｉｅｔｉｇｈｅｉｍ－Ｂｉｓｓｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。
【0170】
１０００倍モル過剰のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の存在下、ＰＢＳ中でインビトロ安定性を評価した。精製後、標識化合物（１～１．６μｇ、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中５０μＬ）の試料をＥＤＴＡ（２０μｇ、ＰＢＳ中２μＬ）と混合し、室温で最大４８時間インキュベートした。試料をｉＴＬＣ分析のために１時間、４時間、２４時間および４８時間の時点で採取した。
【0171】
インビトロでのＥＧＦＲ発現細胞における結合特異性
【0172】
以前に記載された方法（Ｗａｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００８；２３（４）：４３５－４２）に従って、インビトロ結合特異性試験を行った。要約すると、実験の１日前に、１０６細胞／ウェルの密度で、ＥＧＦＲ陽性Ａ４３１細胞およびＨ２９２細胞を６ウェルプレートに播種した。実験日の最中に、放射性標識化合物（１０ｎＭ）の溶液を細胞プレートに添加した。遮断のために、放射性標識化合物の１５分前に１０００ｎＭの非標識ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＤＯＴＡを添加して、室温で一連の（ｎ＝３）ウェル内で受容体を飽和させた。同じ容量の培養培地を別の一連のディッシュに添加して、容量を補った。細胞を３７°Ｃで６０分間インキュベートした。その後、培地を除去し、細胞を１ｍＬのＰＢＳ洗浄を用いて洗浄した。次いで、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ溶液によって剥離し、回収した。自動化γ－分光計（２４８０ Ｗｉｚａｒｄ；Ｗａｌｌａｃ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、細胞関連活性を測定した。
【0173】
追加のインビトロ結合実験を行って、インビトロでのＨ２９２およびＡ４３１におけるＥＧＦＲ発現レベルを比較した。上記のように、放射性標識ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＤＯＴＡ（１０ｎＭ）（遮断なし）、およびセツキシマブ（１０００ｎＭ）または非標識ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＤＯＴＡ（１０００ｎＭ）（遮断あり）とともに細胞をインキュベートした。同じ量の放射能（１．６４×１０６カウント毎分（ＣＰＭ））を各細胞培養ディッシュに添加した。さらに、各細胞株について追加の培養ディッシュ（ｎ＝３）内の細胞を計数した。非遮断細胞のＣＰＭ／１０６細胞から、セツキシマブによって遮断したＣＰＭ／１０６細胞を引いたものとして、特異的細胞結合活性を計算した。
【0174】
動物試験
【0175】
動物実験は、Ｌｏｃａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｕｐｐｓａｌａによって承認された。
【0176】
Ｓｃａｎｂｕｒ Ａ／Ｓ（Ｋａｒｌｓｌｕｎｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から雌のＮＭＲＩマウスおよびＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスが供給され、実験手順の開始前に１週間の適応期間を設けた。
【0177】
ＮＭＲＩマウスにおける生体内分布
【0178】
結合部位のマスキングが肝摂取を防ぐかどうかを試験するために、雌のＮＭＲＩマウス２４匹を対象として、注射の４時間後および２４時間後に生体内分布試験を行った。各時点について、マウス４匹の群に等モル量（１３３ｐｍｏｌ）のそれぞれの化合物：３μｇの［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグ、３μｇの［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識ダミーリンカー、または１．８μｇの［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識非マスク対照を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した（マウス１匹当たり１００μＬの１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中４０ｋＢｑ）。プロドラッグでは、リンカー（ＺＢ０５をＺＥＧＦＲに連結する）は、Ｇ４Ｓの反復によって両側に伸長された配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２１）に基づくものであった（このリンカーの正確な配列を図１３に示す）。したがって、このリンカーの全長は３９アミノ酸残基であった。ＬＳＧＲＳＤＮＨは、例えば、マトリプターゼによって認識されるため、プロテアーゼ切断可能である。その非切断可能なバリアント（すなわち、「ダミーリンカー」）では、リンカーは、代わりに、ＧＧＧＧＳ（配列番号３２）の３回のリピートによって両側に伸長されたＧＧＧＳ（配列番号３７）の２回のリピートであった。したがって、非切断可能リンカーの全長も３９アミノ酸残基であった。
【0179】
マウスを麻酔溶液（体重１グラム当たり３０μｌの溶液、ケタミン１０ｍｇ／ｍＬおよびキシラジン１ｍｇ／ｍＬ）の過剰投与によって安楽死させ、心臓穿刺によって殺処分した。血液、唾液腺、肺、肝臓、脾臓、膵臓、小腸、大腸、腎臓、筋肉、骨を採取し、秤量した。消化管（その内容物を含む）および残りの屠体も採取した。自動化γ－分光計（２４８０ Ｗｉｚａｒｄ；Ｗａｌｌａｃ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、臓器の活性、および注入溶液の標準を測定した。試料全体当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ）として計算した消化管（その内容物を含む）および残りの屠体を除いて、試料重量１グラム当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として摂取値を計算した。
【0180】
移植
【0181】
Ｈ２９２腫瘍移植のために、雌のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの右後肢に、Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１混合した１００μＬの培養培地中の１０×１０６個のＨ２９２細胞を皮下注射した。移植の１３～１６日後に実験を行った。Ｒａｍｏｓ移植のために、雌のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの左後肢に、１００μＬの培養培地中の５×１０６個のＲａｍｏｓを皮下注射した。移植の１３～１５日後に実験を行った。Ａ４３１腫瘍移植のために、雌のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの左後肢に、１００μＬの培養培地中の１０×１０６個のＡ４３１細胞を皮下注射した。移植の１６日後に実験を行った。平均動物体重は、Ｈ２９２群では１７．６±１．３ｇ、Ｒａｍｏｓ群では１８．６±１．３ｇ、Ａ４３１群では１７．３±１．８ｇであった。平均腫瘍重量は、Ｈ２９２異種移植片については０．３８±０．２３ｇ、Ｒａｍｏｓ異種移植片については０．１９±０．１１ｇ、Ａ４３１異種移植片については０．１１±０．０６ｇであった。
【0182】
３つの化合物の生体内分布を経時的に評価するために、Ｈ２９２異種移植片を有するマウス２４匹を６群に無作為化した（ｎ＝４）。各２群に、１３３ｐｍｏｌの［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグ、［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識ダミーリンカーまたは［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識非マスク対照（マウス１匹当たり１００μＬの１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中４０ｋＢｑ）をそれぞれｉ．ｖ．注射した。臓器および腫瘍を注射の４時間後および４８時間後に採取し、秤量し、上記のように活性について測定した。
【0183】
ＥＧＦＲ結合のインビボ特異性（Ｈ２９２対Ｒａｍｏｓ ４時間および４８時間）
【0184】
インビボ特異性を評価するために、ＥＧＦＲ陽性Ｈ２９２異種移植片を有するマウス８匹、およびＥＧＦＲ陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片を有するマウス８匹に、１３３ｐｍｏｌの［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグを注射した。臓器および腫瘍をｐ．ｉ．４時間およびｐ．ｉ．４８時間で採取し、秤量し、上記のように活性について測定した。
【0185】
マトリプターゼ機能のインビボ試験（同一動物におけるＨ２９２およびＡ４３１、４８時間）
【0186】
プロドラッグの腫瘍摂取とマトリプターゼレベルとの関係を試験するために、右後肢にＨ２９２異種移植片（ＥＧＦＲ陽性、マトリプターゼ高発現）を、左後肢にＡ４３１異種移植片（ＥＧＦＲ陽性、マトリプターゼ低発現）を有するマウス５匹に、１３３ｐｍｏｌの［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグ（マウス１匹当たり１００μＬの１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中４０ｋＢｑ）をｉ．ｖ．注射した。マウスをｐ．ｉ．４８時間で安楽死させ、臓器、肝臓の半分、ならびにＡ４３１異種移植片およびＨ２９２異種移植片の一部を採取し、秤量し、上記のように活性について測定した。肝臓の別の半分、ならびに部分的にＡ４３１異種移植片およびＨ２９２異種移植片を採取し、ホルマリン固定し、組織病理学的検査のためにパラフィンに包埋した。
【0187】
撮像（イメージング）（Ｈ２９２およびＲａｍｏｓ、４時間４８時間）
【0188】
ＥＧＦＲ発現を撮像するために、ｎａｎｏＳｃａｎ ＳＰＥＣＴ／ＣＴ（Ｍｅｄｉｓｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して、全身ＳＰＥＣＴ／ＣＴ走査を行った。Ｈ２９２異種移植片を有するマウス１匹に、［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグ（１４．７μｇ、１．９ＭＢｑ）をｉ．ｖ．注射した。対照として、Ｈ２９２異種移植片を有するマウス１匹に、［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識非マスク対照（８．８μｇ、１．１ＭＢｑ）をｉ．ｖ．注射した。インビボ特異性を明らかにするために、Ｒａｍｏｓ異種移植片を有するマウス１匹に、［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグ（１１．２μｇ、２．９ＭＢｑ）をｉ．ｖ．注射した。ｐ．ｉ．４時間およびｐ．ｉ．４８時間でマウスを撮像した。［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識化合物の撮像、および画像再構成は、以前に記載されたように行った（Ｒｉｎｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０２０ Ｆｅｂ １５；２１（４）：１３１２）。
【0189】
統計分析
【0190】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン９．０．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、統計分析を行った。対応のない両側ｔ検定を使用して、インビトロおよびインビボのデータを分析した。ｐ値＜０．０５を統計学的有意差と考えた。
【0191】
結果
標識および安定性
標識および安定性
【0192】
１０％～２１％の範囲の放射化学的収率で、インジウム－１１１を用いた３つの化合物の放射性標識を行った。サイズ排除カラム後の精製により、９７％を超える純度が得られた（表１）。過剰のＥＤＴＡとのインキュベーション中に活性の放出は観察されなかった（表２）。
【0193】
【表1】
【0194】
【表2】
【0195】
インビトロ試験
【0196】
Ａ４３１細胞株およびＨ２９２細胞株を用いて結合特異性試験を行った。両細胞株はＥＧＦＲを過剰発現する。両細胞株について、遮断群の非マスク対照では、活性の有意な（ｐ＜０．０５、ｔ検定）低下が観察された。これにより、Ａ４３１細胞およびＨ２９２細胞への非マスク対照のＥＧＦＲ媒介性結合が確認された。Ａ４３１細胞株では、遮断群と非遮断群との間でプロドラッグまたはダミーリンカーについて有意差は観察されなかった（図６Ａ）。しかし、Ｈ２９２細胞株では、遮断群と非遮断群との間で、プロドラッグまたはダミーリンカーについて、小さいが有意な（ｐ＜０．０５、ｔ検定）差が観察された（図６Ｂ）。Ａ４３１細胞への［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識非マスク対照の特異的結合はＨ２９２細胞の３倍であり（図７）、これは、この細胞株によるＥＧＦＲ発現も３倍であることを示唆している。
【0197】
ＮＭＲＩマウスにおける生体内分布
【0198】
ＮＭＲＩマウスにおける３つの化合物の生体内分布に関するデータを表３に示す。血液中の活性濃度は、３つの化合物いずれでも、ｐ．ｉ．４時間で１５％ＩＤ／ｇ超、およびｐ．ｉ ２４時間で６％ＩＤ／ｇ超であった。比較のために、非ＡＢＤ０３５融合１１１Ｉｎ－ＺＥＧＦＲの血中濃度は、４時間および２４時間の時点でそれぞれ０．３４±０．０２および０．１２±０．０３％ＩＤ／ｇであった（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．２０１０ Ｍａｒ；３７（３）：６１３－２２）。これは、ＡＢＤ０３５への融合が循環時間の延長をもたらすことを示している。［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグおよびダミーリンカーの生体内分布は、ｐ．ｉ．４時間での小さいが有意な（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）異なる腎摂取、ならびにｐ．ｉ．２４時間での唾液腺摂取および肝摂取の有意差を除いて、極めて類似していた。［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグおよびダミーリンカーはいずれも、ｐ．ｉ．４時間およびｐ．ｉ．２４時間で非マスク対照よりも有意に低い肝摂取を有した。
【0199】
【表3-1】
【表3-2】
【0200】
Ｈ２９２異種移植片を有するＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおける生体内分布
【0201】
経時的な腫瘍摂取を評価するために、Ｈ２９２異種移植片を有するマウスに［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識化合物を注射した。ｐ．ｉ．４時間およびｐ．ｉ．４８時間での生体内分布に関するデータを表４に示す。３つの化合物について、両時点で等しいレベル（ｐ＞０．３、ｔ検定）の腫瘍摂取が観察された。［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグおよびダミーリンカーは、ｐ．ｉ．４時間およびｐ．ｉ．４８時間の両時点で、［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識非マスク対照よりも有意に（ｐ＜０．０５、ｔ検定）高い血液活性、肺、腎臓および筋肉などの臓器内での高い摂取、ならびに有意に（ｐ＜０．０５、ｔ検定）低い肝摂取を有した。
【0202】
【表4-1】
【表4-2】
【0203】
インビボ特異性
【0204】
インビボＥＧＦＲ結合特異性を決定するために、ｐ．ｉ．４時間およびｐ．ｉ．４８時間で、Ｈ２９２異種移植片およびＲａｍｏｓ異種移植片を有するマウスを対象として生体内分布を比較した。両時点で、ＥＧＦＲ陽性Ｈ２９２異種移植片は、ＥＧＦＲ陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片よりも有意に（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）高いプロドラッグ摂取を有する（図８Ａ、図８Ｂ）。Ｈ２９２異種移植片における摂取は、１０±２％ＩＤ／ｇおよび１３±２％ＩＤ／ｇであったが、Ｒａｍｏｓ異種移植片における摂取は、それぞれｐ．ｉ．４時間およびｐ．ｉ．４８時間で３±１％ＩＤ／ｇおよび２±０％ＩＤ／ｇであった。
【0205】
マトリプターゼの存在下でのプロドラッグの摂取を評価するために、ｐ．ｉ．４８時間で、Ｈ２９２異種移植片およびＡ４３１異種移植片の両方を有するマウスを対象として生体内分布を比較した。マトリプターゼ陽性Ｈ２９２異種移植片における摂取（１１±２％ＩＤ／ｇ）は、マトリプターゼ陰性Ａ４３１異種移植片（６±１％ＩＤ／ｇ）よりも有意に（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）高かった（図８Ｃ）。
【0206】
撮像（イメージング）
【0207】
Ｈ２９２異種移植片における［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグおよび非マスク対照（図９Ａ、図９Ｃ）、ならびにＲａｍｏｓ異種移植片における［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグ（図９Ｂ、図９Ｄ）の実験的ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮像によって、生体内分布データを確認した。撮像により、ｐ．ｉ．４時間およびｐ．ｉ．４８時間で［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグおよび非マスク対照の両方を含むＥＧＦＲ発現Ｈ２９２異種移植片を明確に可視化することが可能になったが、Ｒａｍｏｓ異種移植片は、いずれの時点でも［１１１Ｉｎ］Ｉｎ－標識プロドラッグの注射後に可視ではなかった。
【0208】
例３（ＺＥＧＦＲに基づくプロドラッグの生体内分布）
マトリプターゼによる切断効率を改善するために、４つの新しいプロアフィボディ（ＰＡ）バリアントを設計した。Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ社によって開発された新しいプロテアーゼ認識配列（ＭＳＧＲＳＡＮＡ、配列番号３８、「ＺＷ」）をＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）１、ＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）２、ＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）３およびＰＡ－ＺＷ３に使用し、上記で使用した元のＬＳＧＲＳＤＮＨ配列を置き換えた：
マトリプターゼによる切断効率を改善するために、４つの新しいプロアフィボディ（ＰＡ）バリアントを設計した。Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ社によって開発された新しいプロテアーゼ認識配列（ＭＳＧＲＳＡＮＡ、配列番号３８、「ＺＷ」）をＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）１、ＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）２、ＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）３およびＰＡ－ＺＷ３に使用し、上記で使用した元のＬＳＧＲＳＤＮＨ配列を置き換えた：
【0209】
ＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）１：（ＨＥ）３－ＺＢ０５－（Ｇ４Ｓ）－（ＺＷ）－（Ｇ４Ｓ）－ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＥＥＥＣ；
ＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）２：（ＨＥ）３－ＺＢ０５－（Ｇ４Ｓ）２－（ＺＷ）－（Ｇ４Ｓ）２－ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＥＥＥＣ；
ＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）３：（ＨＥ）３－ＺＢ０５－（Ｇ４Ｓ）３－（ＺＷ）－（Ｇ４Ｓ）３－ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＥＥＥＣ；および
ＰＡ－ＺＷ３：（ＨＥ）３－ＺＢ０５－ＺＷ３－ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＥＥＥＣ。
ＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）２：（ＨＥ）３－ＺＢ０５－（Ｇ４Ｓ）２－（ＺＷ）－（Ｇ４Ｓ）２－ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＥＥＥＣ；
ＰＡ－ＺＷ－（Ｇ４Ｓ）３：（ＨＥ）３－ＺＢ０５－（Ｇ４Ｓ）３－（ＺＷ）－（Ｇ４Ｓ）３－ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＥＥＥＣ；および
ＰＡ－ＺＷ３：（ＨＥ）３－ＺＢ０５－ＺＷ３－ＺＥＧＦＲ－ＡＢＤ０３５－ＥＥＥＣ。
【0210】
したがって、新しいＰＡでは、ＺＢ０５とＺＥＧＦＲとを相互接続するリンカーは、１～３つのＧ４Ｓ配列に隣接する単一のＺＷ配列、または３つのＺＷ基質配列のコンカテマーを含有する。
【0211】
新しいバリアントを生成し、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、凍結乾燥し、ＰＢＳに溶解した。各バリアントについて４つの同一の試料を調製した。各試料には、５０ｕＬのＰＢＳの総容量中、１０ｕＭのＰＡタンパク質および２０ｎＭの組換えヒトマトリプターゼ（ｃａｔ．Ｎｒ．３９４６－ＳＥＢ）を含有させた。試料を３７°Ｃで１、３、５または２４時間インキュベートした後、－２０°Ｃで凍結した。試料調製に使用したのと同じストック由来のインタクト（ｉｎｔ．）な非切断タンパク質を含む凍結試料を解凍し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
【0212】
図１４に示すように、ＺＷ基質配列を有するバリアントでは、効率的なマトリプターゼ切断が観察された。単一のＺＷ配列を有するバリアントのほぼ完全な切断は、５時間後に見ることができる。ＺＷ３配列を含有するコンカテマーの完全な切断は、わずか１時間後に見ることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】