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▶ ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-04-10
(54)【発明の名称】ＣＤ２７７と腫瘍抗原に対する二重特異性抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20250403BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20250403BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250403BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250403BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20250403BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250403BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250403BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/62 Z
A61K47/65
A61P35/00
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 U
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024550555
(86)(22)【出願日】2023-02-26
(85)【翻訳文提出日】2024-10-25
(86)【国際出願番号】 EP2023054762
(87)【国際公開番号】W WO2023161457
(87)【国際公開日】2023-08-31
(31)【優先権主張番号】22159045
(32)【優先日】2022-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】22162761
(32)【優先日】2022-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】23157433
(32)【優先日】2023-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】503385923
【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】バウマン クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】キューンケル クラウス ペーター
(72)【発明者】
【氏名】オーベルク ハンス ハインリヒ
(72)【発明者】
【氏名】パイップ マティーアス
(72)【発明者】
【氏名】ヴェシュ ダニエラ
(72)【発明者】
【氏名】クマール サンディープ
(72)【発明者】
【氏名】パナヴァス タダス
(72)【発明者】
【氏名】ザバルト ニコラス
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA94
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF34
4C085AA13
4C085AA14
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＣＤ２７７およびヒト腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体に関する。本発明はまた、前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、前記抗体を産生する方法、疾患の治療における前記抗体の使用方法およびその治療的使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含み、前記第１の結合部分は完全長の二価抗体であり、前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなり、前記単鎖Ｆｖ抗体の各々は、第１の結合部分の各Ｃ末端にペプチドリンカーによって連結されていることを特徴とする、二重特異性抗体。
【請求項2】
前記単鎖Ｆｖ抗体の各々は、可変軽鎖のＮ末端が第１の結合部分の各Ｃ末端にペプチドリンカーによって連結されていることを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
第１の結合部分に、重鎖ＣＤＲ配列として、配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
配列番号４４のＣＤＲＨ２が、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号１１０で交換されていることを特徴とする、請求項３に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
配列番号６のＣＤＲＬ１が、配列番号７５、配列番号１２１、配列番号１３３、配列番号１４０または配列番号１４１で交換されていることを特徴とする、請求項３または４に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
重鎖ＣＤＲ配列として、配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３、ならびにｂ）軽鎖ＣＤＲ配列として、
ｂ１） 配列番号７５のＣＤＲＬ１、配列番号７６のＣＤＲＬ２、および配列番号７７のＣＤＲＬ３、
ｂ２） 配列番号７９のＣＤＲＬ１、配列番号８０のＣＤＲＬ２、および配列番号８１のＣＤＲＬ３、
ｂ３） 配列番号８３のＣＤＲＬ１、配列番号８４のＣＤＲＬ２、および配列番号８５のＣＤＲＬ３、
ｂ４） 配列番号８７のＣＤＲＬ１、配列番号８８のＣＤＲＬ２、および配列番号８９のＣＤＲＬ３、
ｂ５） 配列番号１１７のＣＤＲＬ１、配列番号１１８のＣＤＲＬ２、および配列番号１１９のＣＤＲＬ３、
ｂ６） 配列番号１２１のＣＤＲＬ１、配列番号１２２のＣＤＲＬ２、および配列番号１２３のＣＤＲＬ３、
ｂ７） 配列番号１２５のＣＤＲＬ１、配列番号１２６のＣＤＲＬ２、および配列番号１２７のＣＤＲＬ３、
ｂ８） 配列番号１２９のＣＤＲＬ１、配列番号１３０のＣＤＲＬ２、および配列番号１３１のＣＤＲＬ３、
ｂ９） 配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号１３４のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１０） 配列番号１３７のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３９のＣＤＲＬ３、
ｂ１１） 配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３９のＣＤＲＬ３、
ｂ１２） 配列番号１４０のＣＤＲＬ１、配列番号１３４のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１３） 配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号１３４のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１４） 配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１５） 配列番号１５１のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ１６） 配列番号１５２のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ１７） 配列番号１５３のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ１８） 配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号１５６のＣＤＲＬ３、
ｂ１９） 配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号１５７のＣＤＲＬ３、
ｂ２０） 配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号１５８のＣＤＲＬ３、
ｂ２１） 配列番号１５４のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ２２） 配列番号１５５のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３。
からなる群より選択されるＣＤＲセット
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体、
【請求項7】
前記腫瘍抗原が、ＣＬＤＮ１８．２、ＦＯＬＲ１、ＳＴＥＡＰ１、およびＤＬＬ３からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１～６の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項8】
前記第２の結合部分について、可変軽鎖および重鎖ＣＤＲが、以下のものであることを特徴とする、請求項７に記載の二重特異性抗体：ａ） 配列番号１１のＣＤＲＬ１、配列番号１２のＣＤＲＬ２、および配列番号１３のＣＤＲＬ３、および重鎖可変領域ＣＤＲが腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ１に対する配列番号１５のＣＤＲＨ１、配列番号１６のＣＤＲＨ２、および配列番号１７のＣＤＲＨ３、
ｂ） 配列番号１９のＣＤＲＬ１、配列番号２０のＣＤＲＬ２、および配列番号２１のＣＤＲＬ３、および重鎖可変領域ＣＤＲが腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１に対する配列番号２３のＣＤＲＨ１、配列番号２４のＣＤＲＨ２、配列番号２５のＣＤＲＨ３、
ｃ） 配列番号２７のＣＤＲＬ１、配列番号２８のＣＤＲＬ２、および配列番号２９のＣＤＲＬ３、および重鎖可変領域ＣＤＲが腫瘍抗原としてのＤＬＬ３の配列番号３１のＣＤＲＨ１、配列番号３２のＣＤＲＨ２、配列番号３３のＣＤＲＨ３、
ｄ） 配列番号３５のＣＤＲＬ１、配列番号３６のＣＤＲＬ２、および配列番号３７のＣＤＲＬ３、および重鎖可変領域ＣＤＲが腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２の配列番号３９のＣＤＲＨ１、配列番号４０のＣＤＲＨ２、配列番号４１のＣＤＲＨ３。
【請求項9】
第１の結合部分について可変重鎖が配列番号４２であり、可変軽鎖が配列番号５、配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
前記第２の結合部分について、可変軽鎖が配列番号１０であり、可変重鎖が配列番号１４であることを特徴とする、請求項９に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
抗体の第１の結合部分が、ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体であることを特徴とする、請求項１～１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
前記ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー１－ＶＬ－ペプチドリンカー２－ＶＨの並びで前記Ｃ末端に結合していることを特徴とする、請求項１～１１の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
前記第１のペプチドリンカーが５～２５個のアミノ酸からなり、前記第２のペプチドリンカーが１０～２５個のアミノ酸からなることを特徴とする、請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項14】
腫瘍疾患の治療に使用するための、請求項１～１３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項15】
結腸癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌からなる群から選択される腫瘍疾患の治療に使用するための、請求項１～１３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項16】
請求項１～１３の何れか一項に記載の二重特異性抗体を含む、医薬組成物。
【請求項17】
請求項１～１３の何れか一項に記載の二重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体における癌の治療方法。
【請求項18】
請求項１～１３の何れか一項に記載の二重特異性抗体をコードする組換え核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本特許出願とともに電子的に提出された配列表（名称：Evo-PCT sequence list.xml）の内容は、明細書の一部である。
【0002】
本発明は、ブチロフィリン３ファミリーメンバーＣＤ２７７（ＢＴＮ３Ａ）とヒト腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体に関する。本発明はまた、前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、前記抗体を産生する方法、疾患の治療における前記抗体の使用方法およびその治療的使用に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞は末梢血中のγδＴ細胞の主要なサブセットであり、約６０％～９５％を占める。大規模なメタゲノムデータセットのバイオインフォマティクス解析により、腫瘍内のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の相対的な存在量を決定し、これを患者の転帰と相関させた。腫瘍浸潤γδＴリンパ球（γδ ＴＩＬ）は、数は少ないものの、すべての腫瘍組織で認められた。重要なことは、さまざまな癌において、γδＴＩＬの相対量と免疫チェックポイント療法に対する良好な反応性との間に相関関係があることが示されたことである。（Gentles, A.J. et al.; Nat.Med.2015, 1-12; Tosolini, M.; et al.; Oncoimmunology 2017, 6, 1-10）。ｉｎ ｖｉｖｏ刺激、あるいはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の養子Ｔ細胞移入に基づく癌治療法は、過去数十年にわたり試験されてきたが、一貫した臨床的有効性を提供することはできなかった。γδキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞やγδＴ細胞エンゲイジャーなどのさらなるコンセプトは、現在前臨床評価中である（Kuenkele KP., et al.; Cells 2020, 9, 829）。
【0004】
ブチロフィリン３ファミリーメンバーＢＴＮ３Ａ（ＣＤ２７７； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｏ００４８１ （ＢＴ３Ａ１＿ＨＵＭＡＮ））は、２つの細胞外イムノグロブリン（Ｉｇ）様ドメインと細胞内Ｂ３０．２ドメインを持つ膜貫通型レセプターである。ＣＤ２７７は、Ｔ細胞の活性化と適応免疫応答において役割を果たし、活性化Ｔ細胞の増殖を制御し、活性化Ｔ細胞によるサイトカインとＩＦＮγの放出を制御し、イソペンテニルピロリン酸のような高レベルのリン酸化代謝物を特徴とする感染細胞や形質転換細胞に対するＴ細胞の応答を媒介する（Afrache, H., et al., Immunogenetics 64, 781-794 (2012)）。
【0005】
(E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate)HMBPPは、イソプレノイド合成のための原核生物の非メバロネート／２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－ホスフェート／１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－ホスフェート（ＭＥＰ）経路の必須中間生成物である。ＢＴＮ３Ａは、ＴＬＲがＬＰＳやＤＮＡなどの保存された病原体構造を認識するのと同様に、この病原体由来の分子を認識するように絶妙に調整されている（O’Neill, L.A.J.; et al.;Nat.Rev. Immunol.2013, 13, 453-460; Gu, S.et al.; Front.Immunol.2014, 5, 688; Vavassori, S. et al.; Nat.Immunol.2013, 14, 908-916）。ＢＴＮ３Ａ１の細胞内ドメインＢ３０．２は、細菌の代謝産物ＨＭＢＰＰと直接相互作用する（Rhodes, D.A.et al.; J. Immunol.2015, 194, 2390-2398; Harly, C.; et al. Blood 2012, 120, 2269-2279; Sandstrom, A.; et al.; Immunity 2014, 40, 490-500）。ＢＴＮ３Ａ１とＨＭＢＰＰの相互作用により、ＢＴＮ３Ａ１はγδＴＣＲを含む免疫学的シナプスの構成要素に結合し、その後Ｖδ２ Ｔ細胞が活性化される。ブチロフィリン３Ａ１は、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のプレニルピロリン酸刺激に必須な役割を果たしている（Wang H. et al. J Immunol 2013; 191:1029-1042; Sandstrom A. et al.; Immunity Volume 40, Issue 4, 17 April 2014, Pages 490-500, Janssen O. et al., J Immunol 1991; 146; 35-39）。
【0006】
ＣＤ２７７はあらゆる腫瘍に不可欠な化合物である（Liang, F. et al., Febs Open Bio 2021 11, 2586-2599; Ghigo, C. et al., J Immunother Cancer 2020 8, A3-A3)。Payne KK. et al.; Science 369, 942-949 (2020）は、ＢＴＮ３Ａ１がαβＴ細胞とγδＴ細胞を調整することにより、抗腫瘍応答を支配していることを記述している。Ｄｅ Bruinら(De Bruin RCG. et al.; Oncoimmunology 2018, VOL.7, NO.1, e1375641)は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞とＥＧＦＲの両方を標的とする二重特異性ナノボディアプローチについて述べており、これはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのマウス異種移植モデルの両方でＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞の活性化とそれに続く腫瘍細胞の溶解を誘導し、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解能を実証している。
【0007】
Palakodetiら（Palakodeti A. et al.; JBC ２８７巻３９号３２７８０－３２７９０頁、２０１２年）は、ＣＤ２７７特異的抗体によるヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞応答の調節について述べている。ＷＯ２０１２０８０７６９およびＷＯ２０２００２５７０３は、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体およびその使用に関する。ＢＴＮ３Ａ１アゴニストは、Ｗ０２０１２０８０７６９；ＷＯ２０１０１０６０５１（ＵＳ２０１５０３５３６４３）；ＷＯ２０１１０１４４３８；ＷＯ２０１７１４４６６８；ＷＯ２０１９２１１３７０、ＷＯ２０１１／０１４４３８、およびＷ０２０１２０８０３５１にも記載されている。
【0008】
ＷＯ２０１２０８０３５１およびＷＯ２０１２０８０７６９は、抗Ｃ２７７抗体（７．２および２０．１）に言及している。可能性のある抗体形式としてｓｃＦｖが挙げられている。当技術分野におけるアゴニスト抗Ｃ２７７抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化する。De Gassart A. et al., in Science Translational Medicine 13, (2021), (https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abj0835)によると、末梢血中のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化は、枯渇ではなく、輸送と遊走の結果として、循環Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の一過性の低下を引き起こす。枯渇の関連性は、発明者たちによって初めて認識された。
【0009】
Imbert C.およびOlive D.(A. Birbrair (ed.), Tumor Microenvironment, Advances in Experimental Medicine and Biology 1273 (https://doi.org/10.1007/978-3-030-49270-0_5) および Imbert C. et al.(Advances in Experimental Medicine and Biology, (2020), Springer, Vol. 1273, 91-104)は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化のためにＣＤ２７７と腫瘍抗原の両方を標的とする二重特異性抗体を示唆している。ＷＯ２０２００２５７０３では、二重特異性分子ｍＡｂ ｘ ｍＡｂ、ｍＡｂ ｘ Ｆａｂ、Ｆａｂ ｘ Ｆ（ａｂ´）２またはリガンド ｘ Ｆａｂ融合タンパク質のフォーマットとして、抗ＣＤ２７７抗体のＶＨとＶＬを含むＦａｂまたはｓｃＦｖを含む片腕を含む二重特異性抗体などの多重特異性抗体も提案されている。
【0010】
二重特異性抗体は、多くの様々な形式が知られている（例えば、Brinkmann U.とKontermann E.による総説;MAbs.2017 Feb-Mar; 9(2):182-212;BrinkmannとKontermannの図２参照）。２０１９年には、ｂｓＡｂの作製と開発に２０以上の異なる商業化された技術プラットフォームが利用できるようになった（総説：Lanrijn AF et al; Nature Reviews; https://doi.org/10.1038/s41573-019-0028-1）。二重特異性抗体フォーマットは、Coloma M. J. and Morrison S. L., Nat.Biotechnol.15:159-163 (1997)に記載されている； また、Ulrich Brinkmann & Roland E. Kontermann (2017), The making of bispecific antibodies, mAbs, 9:2, 182-212, DOI:10.1080/19420862.2016.1268307も参照。これらの二重特異性分子は、マスターまたは親モジュールと呼ばれるＩｇＧ抗体と、重鎖のＣ末端に結合した特異性の異なるｓｃＦｖから構成される（ＩｇＧ－ＨＣ－ｓｃＦｖ、「モリソン型二重特異性抗体」；図１参照）。
【0011】
ＷＯ２０１０１１２１９３（ＵＳ００９３８２３２３；ＥＰ２４１４３９１Ｂ１）は、第一抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる全長抗体；ならびに１つ以上のさらなる抗原に結合する１つ以上の単鎖Ｆｖフラグメントを含む多重特異性抗体に関し、前記単鎖Ｆｖ断片は、前記全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端のペプチドコネクターを介して前記全長抗体に融合している。
【0012】
Presti et al.(Presti, E. L. et al., Frontiers in immunology 2017, 8, 975－11) は、抗体を用いてγδ Ｔ細胞を癌細胞にリダイレクトできると述べている。これは、例えば、一方の結合部位が腫瘍特異的細胞表面分子（例えば、ＥｐＣＡＭやＨＥＲ２／ｎｅｕ）を認識し、他方の結合部位がＣＤ３やＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲのＶγ９鎖を標的とする二重特異性抗体を使用することで達成できる。このような二重特異性抗体は、前臨床モデルで有効性が実証されている(Hoh A, et al. Liver Int (2013) 33:127－36. doi:10.1111/liv.12011; Oberg HH, et al.; Cell Immunol (2015) 296:41－9)。
【0013】
ＷＯ２０１８０４１８２７には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）で武装したアデノウイルスが記載されており、ＢｉＴＥ中の結合ドメインの１つはＢＴＮ３Ａ１のような非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的であり、結合ドメインの１つは腫瘍抗原に特異的である、例えば、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、糖鎖抗原Ｌｅｙ、Ｌｅｘ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ－カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３などである。ＷＯ２０１２０８０７６９は、抗ＣＤ２７７抗体（例えばｍＡｂ ７．２、ｍＡｂ ２０．１）に関する。一般的には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆａｂ´、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディなどの抗体断片が挙げられる。
【0014】
ＷＯ２０２００６０４０６は、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫または急性骨髄性白血病の治療に使用するための、ヒトＣＤ１ｄと結合可能な第１の結合部分と、γδＴ細胞上のＴ細胞受容体のＶγ９鎖と結合可能な第２の結合部分とを含む抗体を記載している。
【0015】
腫瘍抗原は、例えば腫瘍と正常組織または細胞株におけるそれぞれのｍＲＮＡレベルまたはタンパク質発現レベルを比較する研究や、腫瘍と正常細胞の表面上の抗原密度を比較する研究など、様々な研究から知られている。 (Woell, S. et al.,Int. J. Cancer 134, 731-739 (2014); Herlyn, M. et al., PNAS 76, 1438-1442 (1979); Rusnak, D. W. et al., Cell Prolif 580-594 (2007); Karhemo, P.-.R. et al., Frontiers in pharmacology 3, 192 (2012); Imai, K. et al., Clin Cancer Res 14, 6487-6495 (2008); Coto-Llerena, M. et al, Frontiers Oncol 10, 979 (2020); Moreaux J., Biochem Biophys Res Commun 14, 148-155 (2012); Owen, D. H. et al., J Hematol Oncol 12, 61 (2019); Wu, M. et al, Cancer Epidemiology Biomarkers Prev Publ Am Assoc Cancer Res Cosponsored Am Soc Prev Oncol 8, 775-82 (1999); Tarn, C. et al., Proc National Acad Sci 105, 8387-8392 (2008))。Ｃｌａｕｄｉｎ１８（ＣＬＤ１８）分子(UniProtKB - P56856 (CLD18_HUMAN))は、分子量約２７，９／２７，７２ｋＤの膜貫通タンパク質である。Ｃｌａｕｄｉｎは、上皮や内皮のタイトジャンクションに存在する膜タンパク質である。タイトジャンクションは、隣接する細胞間の膜内粒子の相互連結した鎖のネットワークを組織する。タイトジャンクションでは、ＯｃｃｌｕｄｉｎとＣｌａｕｄｉｎｓが最も顕著な膜貫通タンパク質成分である。その強い細胞間接着特性により、細胞膜は溶質の細胞外輸送を防止・制御する第一のバリアを作り、細胞極性を維持するために膜脂質やタンパク質の横方向への拡散を制限する。タイトジャンクション形成タンパク質は、上皮組織の構造形成に決定的に関与している。このようなタンパク質は、構造の整った上皮ではほとんど抗体にアクセスできないが、腫瘍細胞上では露出することが想定される。Ｃｌａｕｄｉｎ１８およびそのスプライスバリアントであるＣｌａｕｄｉｎ１８．２に対する抗体は、例えばＷＯ２００７０５９９９７、ＷＯ２００８１４５３３８、ＵＳ２０１５０３７４７８９、ＷＯ２０１３１７４４０３、およびＵＳ９７７０４８７（ＵＳ１０３１４８９０；ＥＰ２９５８９４５；ＩＭＡＢ３６２）に記載されている。ＷＯ２０２１０２４０２０には、癌治療のための抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体と免疫チェックポイント阻害剤の併用療法が記載されている。
【0016】
ＳＴＥＡＰ－１(six-transmembrane epithelial antigen of prostate- 1)は３３９アミノ酸からなる細胞表面タンパク質で、正常組織では前立腺細胞に主に発現している。ＳＴＥＡＰ－１タンパク質の発現は、前立腺癌の様々な状態において高レベルで維持されており、ＳＴＥＡＰ－１は肺癌や結腸癌などの他のヒト癌においても高発現している。正常組織および癌組織におけるＳＴＥＡＰ－１の発現プロファイルから、免疫療法の標的としての可能性が示唆された。ＷＯ２００８／０５２１８７には、抗ＳＴＥＡＰ－１抗体とその免疫コンジュゲートが報告されている。ＳＴＥＡＰ－１ｘＣＤ３二重特異性抗体は、ＷＯ２０１４１６５８１８およびＷＯ２０１７０５５３８８に記載されている。
【0017】
ＦＯＬＲ１は、卵巣癌、肺癌、乳癌、腎癌、大腸癌、子宮内膜癌など、様々な起源の上皮性腫瘍細胞に発現している。１０．１５１７／１７４２５２４７．２０１２．６９４８６３．Ｅｐｕｂ ２０１２．ＷＯ２０１２１１９０７７にはＦＯＬＲ１に対する抗体が記載されている。ＦＯＬＲ１とＣＤ３を標的とする二重特異性抗体は、ＷＯ２０１６／０７９０７６およびＷＯ２０２１２５５１４３に記載されている。
【0018】
ＤＬＬ３は、ＳＣＬＣやＬＣＮＥＣを含む高悪性度の肺神経内分泌腫瘍に選択的に発現している。ＤＬＬ３の発現増加は、ＳＣＬＣおよびＬＣＮＥＣ患者由来の異種移植腫瘍で観察され、原発腫瘍でも確認された。Saunders et al ., Sci Translational Medicine 7(302):302ral36 (2015)を参照。ＤＬＬ３の発現増加は、前立腺神経内分泌癌を含む肺外神経内分泌癌でも観察されている(Puca et al., Sci TranslMed 11(484): pii: eaav0891 (2019))。ＤＬＬ３はこのような腫瘍細胞の表面に発現しているが、正常組織では発現していない。ＷＯ２０２１００７３７１は抗ＤＬＬ３抗体に関するもので、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体が提案されている。ＷＯ２０１９１９５４０９は、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６および腫瘍抗原に結合する多重特異性タンパク質について言及している。
【発明の概要】
【0019】
当技術分野におけるアゴニスト抗Ｃ２７７抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化する。当技術分野におけるアゴニスト抗Ｃ２７７抗体は、循環Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の一過性の減少を誘導するが、これはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の枯渇ではなく、循環から癌組織を含む組織への輸送の結果であると説明されている。
【0020】
しかしながら、本発明者らは、腫瘍細胞の非存在下において、当技術分野におけるアゴニスト的抗Ｃ２７７抗体によるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のこのような活性化が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の自己排除を誘導することを認識した。本発明者らは、ＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する二重特異性抗体（以下、「二重特異性抗ＣＤ２７７抗体」とも称する）であって、ヒト腫瘍抗原（以下、「腫瘍抗原」とも称する）に特異的に結合し、後述するような性質を有する二重特異性抗体が、当該腫瘍抗原を有するヒト腫瘍細胞に対して優れた殺傷効果を示すとともに、非腫瘍細胞の溶解に関して高い安全性を示し、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の自己排除を誘導しないことを見出した。
【0021】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体を含むことを特徴とし、前記第１の結合部分は完全長の二価抗体であり、前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなり、前記単鎖Ｆｖ抗体の各々は、第１の結合部分の各Ｃ末端にペプチドリンカーによって連結されていることを特徴とする。
【0022】
一実施形態では、前記各単鎖Ｆｖ抗体は、可変軽鎖のそのＮ末端と第１の結合部分の各Ｃ末端とがペプチドリンカーによって連結されている。
【0023】
一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、第１の結合部分に、重鎖ＣＤＲ配列として配列番号２のＣＤＲＨ１配列番号３のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３を含むことを特徴とする。
【0024】
一実施形態において、本発明による抗体は、ＣＤＲＨ２（配列番号４４）におけるＮ５ＳおよびＫ１０Ｎ（Ｎ５３Ｓ、Ｋ５８Ｎ（Ｋａｂａｔ）、またはＮ１８５Ｓ－Ｋ１９０Ｎとも呼ばれる）の置換を含むことを特徴とする。
【0025】
一実施形態において、本発明による抗体は、前記ＣＤＲＨ２置換に加えて、ＣＤＲＬ１のＬ８Ｖ（Ｌ３１Ｖとも呼ばれる）の置換を含むことを特徴とする（配列番号７５）。一実施形態において、本発明による抗体は、ＣＤＲＬ１（配列番号１４０）において付加的置換Ｌ８ＶおよびＨ１Ｒを含むことを特徴とする。
【0026】
一実施形態において、本発明による二重特異性抗体は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含むことを特徴とし、前記第１の結合部分は完全長の二価抗体であり、第１の結合部分において、重鎖ＣＤＲ配列として、配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３を含むことを特徴とし、前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなり、前記単鎖Ｆｖ抗体の各々は、前記第１の結合部分の各Ｃ末端にペプチドリンカーによって連結される。
【0027】
一実施形態において、本発明による二重特異性抗体は、ＣＤＲＨ２が配列番号６８、配列番号７２、または配列番号１１０であることを特徴とする。
【0028】
一実施形態において、本発明による二重特異性抗体は、ＣＤＲＬ１が配列番号７５、配列番号１２１、配列番号１３３、配列番号１４０または配列番号１４１であることを特徴とする。
【0029】
一実施形態では、本発明による抗体は、ＣＤＲＨ２（配列番号４４）のＮ５ＳとＫ１０Ｎの置換を含むことを特徴とする。
【0030】
一実施形態において、本発明による抗体は、前記ＣＤＲＨ２置換に加えて、ＣＤＲＬ１のＬ８Ｖの置換を含むことを特徴とする（配列番号７５）。一実施形態において、本発明による抗体は、ＣＤＲＬ１（配列番号１４０）において付加的置換Ｌ８ＶおよびＨ１Ｒを含むことを特徴とする。
【0031】
一実施形態では、本発明による抗体の第１の結合部分は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体である。
【0032】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体を含むことを特徴とし、重鎖ＣＤＲ配列として、配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）および
ｂ） 軽鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲセット：
ｂ１） 配列番号７５のＣＤＲＬ１、配列番号７６のＣＤＲＬ２、および配列番号７７のＣＤＲＬ３、
ｂ２） 配列番号７９のＣＤＲＬ１、配列番号８０のＣＤＲＬ２、および配列番号８１のＣＤＲＬ３、
ｂ３） 配列番号８３のＣＤＲＬ１、配列番号８４のＣＤＲＬ２、および配列番号８５のＣＤＲＬ３、
ｂ４） 配列番号８７のＣＤＲＬ１、配列番号８８のＣＤＲＬ２、および配列番号８９のＣＤＲＬ３、
ｂ５） 配列番号１１７のＣＤＲＬ１、配列番号１１８のＣＤＲＬ２、および配列番号１１９のＣＤＲＬ３、
ｂ６） 配列番号１２１のＣＤＲＬ１、配列番号１２２のＣＤＲＬ２、および配列番号１２３のＣＤＲＬ３、
ｂ７） 配列番号１２５のＣＤＲＬ１、配列番号１２６のＣＤＲＬ２、および配列番号１２７のＣＤＲＬ３、
ｂ８） 配列番号１２９のＣＤＲＬ１、配列番号１３０のＣＤＲＬ２、および配列番号１３１のＣＤＲＬ３、
ｂ９） 配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号１３４のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１０） 配列番号１３７のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３９のＣＤＲＬ３、
ｂ１１）配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３９のＣＤＲＬ３、
ｂ１２） 配列番号１４０のＣＤＲＬ１、配列番号１３４のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１３） 配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号１３４のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１４） 配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１５） 配列番号１５１のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ１６） 配列番号１５２のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ１７） 配列番号１５３のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ１８） 配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号１５６のＣＤＲＬ３、
ｂ１９） 配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号１５７のＣＤＲＬ３、
ｂ２０） 配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号１５８のＣＤＲＬ３、
ｂ２１） 配列番号１５４のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ２２） 配列番号１５５のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３
を含むことを特徴とし、
ｃ）前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなり、各々が第１の結合部分の各Ｃ末端に連結されている。
ｂ） 軽鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲセット：
ｂ１） 配列番号７５のＣＤＲＬ１、配列番号７６のＣＤＲＬ２、および配列番号７７のＣＤＲＬ３、
ｂ２） 配列番号７９のＣＤＲＬ１、配列番号８０のＣＤＲＬ２、および配列番号８１のＣＤＲＬ３、
ｂ３） 配列番号８３のＣＤＲＬ１、配列番号８４のＣＤＲＬ２、および配列番号８５のＣＤＲＬ３、
ｂ４） 配列番号８７のＣＤＲＬ１、配列番号８８のＣＤＲＬ２、および配列番号８９のＣＤＲＬ３、
ｂ５） 配列番号１１７のＣＤＲＬ１、配列番号１１８のＣＤＲＬ２、および配列番号１１９のＣＤＲＬ３、
ｂ６） 配列番号１２１のＣＤＲＬ１、配列番号１２２のＣＤＲＬ２、および配列番号１２３のＣＤＲＬ３、
ｂ７） 配列番号１２５のＣＤＲＬ１、配列番号１２６のＣＤＲＬ２、および配列番号１２７のＣＤＲＬ３、
ｂ８） 配列番号１２９のＣＤＲＬ１、配列番号１３０のＣＤＲＬ２、および配列番号１３１のＣＤＲＬ３、
ｂ９） 配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号１３４のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１０） 配列番号１３７のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３９のＣＤＲＬ３、
ｂ１１）配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３９のＣＤＲＬ３、
ｂ１２） 配列番号１４０のＣＤＲＬ１、配列番号１３４のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１３） 配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号１３４のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１４） 配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３、
ｂ１５） 配列番号１５１のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ１６） 配列番号１５２のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ１７） 配列番号１５３のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ１８） 配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号１５６のＣＤＲＬ３、
ｂ１９） 配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号１５７のＣＤＲＬ３、
ｂ２０） 配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号１５８のＣＤＲＬ３、
ｂ２１） 配列番号１５４のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ｂ２２） 配列番号１５５のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３
を含むことを特徴とし、
ｃ）前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなり、各々が第１の結合部分の各Ｃ末端に連結されている。
【0033】
一実施形態において、本発明による二重特異性抗体は、第１の結合部分について、可変重鎖が配列番号４２であり、可変軽鎖が配列番号５、配列番号６５、配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６からなる群より選択されることを特徴とする。
【0034】
一実施形態において、本発明による二重特異性抗体は、前記可変鎖のヒト化バージョンを含むことを特徴とする。
【0035】
一実施形態において、本発明による二重特異性抗体は、前記腫瘍抗原が、ＣＬＤＮ１８．２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５６８５６－２、ＣＬＤ１８＿ＨＵＭＡＮ）、ＦＯＬＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１５３２８、ＦＯＬＲ１＿ＨＵＭＡＮ）、ＳＴＥＡＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＵＨＥ８、ＳＴＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ）、またはＤＬＬ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＹＪ７、ＤＬＬ３＿ＨＵＭＡＮ）からなる群から選択されることを特徴とする。さらに有用な腫瘍抗原は、例えばMiddleburgら, Cancers (2021) 13, 287, pp 4-6に記載されている。
【0036】
一実施形態において、本発明による抗体は、第１の結合部分が、表３の化合物ＥｖＢ＃２１～１３６について示されるＣＤＲの組み合わせ、または表３の化合物ＥｖＢ＃２１～１３６について示される可変軽鎖および可変重鎖の組み合わせからなる群から選択される重鎖および軽鎖ＣＤＲの組み合わせを含み、前記第２の結合部分が、腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなることを特徴とする。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体はヒト化されていることを特徴とする。
【0037】
一実施形態において、本発明による抗体は、腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ１に対して、第２の結合部分が、軽鎖ＣＤＲとして、配列番号１１のＣＤＲＬ１、配列番号１２のＣＤＲＬ２、および配列番号１３のＣＤＲＬ３、並びに重鎖ＣＤＲとして、配列番号１５のＣＤＲＨ１、配列番号１６のＣＤＲＨ２、および配列番号１７のＣＤＲＨ３を含むことを特徴とする（ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット）。
【0038】
一実施形態では、本発明による抗体は、腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１に対して、第２の結合部分に、ＣＤＲとして、配列番号１９のＣＤＲＬ１、配列番号２０のＣＤＲＬ２、および配列番号２１のＣＤＲＬ３、並びに配列番号２３のＣＤＲＨ１、配列番号２４のＣＤＲＨ２、および配列番号２５のＣＤＲＨ３を含む（ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット）。
【0039】
一実施形態では、本発明による抗体は、腫瘍抗原としてのＤＬＬ３に対して、第２の結合部分に、ＣＤＲとして、配列番号２７のＣＤＲＬ１、配列番号２８のＣＤＲＬ２、および配列番号２９のＣＤＲＬ３、並びに配列番号３１のＣＤＲＨ１、配列番号３２のＣＤＲＨ２、および配列番号３３のＣＤＲＨ３を含む（ＤＬＬ３ ＣＤＲセット）。
【0040】
一実施形態では、本発明による抗体は、腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２に対して、第２の結合部分が、ＣＤＲとして、配列番号３５のＣＤＲＬ１、配列番号３６のＣＤＲＬ２、および配列番号３７のＣＤＲＬ３、並びに配列番号３９のＣＤＲＨ１、配列番号４０のＣＤＲＨ２、および配列番号４１のＣＤＲＨ３を含む（ＣＬＤＮ１８．２ ＣＤＲセット）。
【0041】
一実施形態において、本発明による抗体は、第２の結合部分に、腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ－１に対する配列番号１０および配列番号１４の重鎖および軽鎖可変領域の組み合わせを含むことを特徴とする。
【0042】
一実施形態において、本発明による抗体は、第２の結合部分に、腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１に対する配列番号１８および配列番号２２の重鎖および軽鎖可変領域の組み合わせを含むことを特徴とする。
【0043】
一実施形態では、本発明による抗体は、第２の結合部分に、腫瘍抗原としてのＤＬＬ３－４に対する配列番号２６および配列番号３０の重鎖および軽鎖可変領域の組み合わせを含むことを特徴とする。
【0044】
一実施形態において、本発明による抗体は、第２の結合部分に、腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ １８．２に対する配列番号３４および配列番号３８の重鎖および軽鎖可変領域の組み合わせを含むことを特徴とする。
【0045】
一実施形態において、本発明による抗体は、以下の特徴を有する：
ａ） 前記二重特異性抗体は、重鎖として配列番号９４の重鎖を含み、軽鎖として配列番号９３の軽鎖を含む参照抗体による溶解と比較して、第１の腫瘍抗原を有する細胞株の溶解ついて、０．００１～０．２のＥＣ５０比を示す、
ｂ） 前記二重特異性抗体は、前記腫瘍抗原を持たない第２の細胞株の溶解について、前記参照抗体による溶解と比較して、５～１０００のＥＣ５０比を示す、
すべては活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の存在下、Ｅ／Ｔ比５：１、１２．５ＩＵ／ｍＬ インターロイキン－２の存在下、同条件の同じアッセイで測定した。
ａ） 前記二重特異性抗体は、重鎖として配列番号９４の重鎖を含み、軽鎖として配列番号９３の軽鎖を含む参照抗体による溶解と比較して、第１の腫瘍抗原を有する細胞株の溶解ついて、０．００１～０．２のＥＣ５０比を示す、
ｂ） 前記二重特異性抗体は、前記腫瘍抗原を持たない第２の細胞株の溶解について、前記参照抗体による溶解と比較して、５～１０００のＥＣ５０比を示す、
すべては活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の存在下、Ｅ／Ｔ比５：１、１２．５ＩＵ／ｍＬ インターロイキン－２の存在下、同条件の同じアッセイで測定した。
【0046】
一実施形態では、二重特異性抗体はＭａｂ－ｓｃＦｖ形式である。
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分および腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分を含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖ形式の二重特異性抗体を含むことを特徴とし、以下のことを特徴とする：
ａ）前記第１の結合部分は完全長の二価抗体である、
ｂ）前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合し、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、以下からなる群から選択されるＣＤＲセットを含む：
ｂ１） 配列番号１１のＣＤＲＬ１、配列番号１２のＣＤＲＬ２、および配列番号１３のＣＤＲＬ３、並びに腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ１に対する配列番号１５のＣＤＲＨ１、配列番号１６のＣＤＲＨ２、および配列番号１７のＣＤＲＨ３（ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット）、
ｂ２） 配列番号１９のＣＤＲＬ１、配列番号２０のＣＤＲＬ２、および配列番号２１のＣＤＲＬ３、並びに腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１に対する配列番号２３のＣＤＲＨ１、配列番号２４のＣＤＲＨ２、および配列番号２５のＣＤＲＨ３（ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット）、
ｂ３） 配列番号２７のＣＤＲＬ１、配列番号２８のＣＤＲＬ２、および配列番号２９のＣＤＲＬ３、並びに腫瘍抗原としてのＤＬＬ３に対する配列番号３１のＣＤＲＨ１、配列番号３２のＣＤＲＨ２、および配列番号３３のＣＤＲＨ３（ＤＬＬ３ ＣＤＲセット）、
ｂ４） 配列番号３５のＣＤＲＬ１、配列番号３６のＣＤＲＬ２、および配列番号３７のＣＤＲＬ３、並びに腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２に対する配列番号３９のＣＤＲＨ１、配列番号４０のＣＤＲＨ２、および配列番号４１のＣＤＲＨ３（ＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセット）、
ｃ） 前記二重特異性抗体は、重鎖として配列番号９４の重鎖を含み、軽鎖として配列番号９３の軽鎖を含む参照抗体による溶解と比較して、第１の腫瘍抗原を有する細胞株の溶解ついて、０．００１～０．２のＥＣ５０比を示す、
ｄ） 前記二重特異性抗体は、前記腫瘍抗原を持たない第２の細胞株の溶解について、前記参照抗体による溶解と比較して、５～１０００のＥＣ５０比を示す、
すべては活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の存在下、Ｅ／Ｔ比５：１、１２．５ＩＵ／ｍＬインターロイキン－２の存在下、同条件の同じアッセイで測定した。
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分および腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分を含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖ形式の二重特異性抗体を含むことを特徴とし、以下のことを特徴とする：
ａ）前記第１の結合部分は完全長の二価抗体である、
ｂ）前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合し、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、以下からなる群から選択されるＣＤＲセットを含む：
ｂ１） 配列番号１１のＣＤＲＬ１、配列番号１２のＣＤＲＬ２、および配列番号１３のＣＤＲＬ３、並びに腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ１に対する配列番号１５のＣＤＲＨ１、配列番号１６のＣＤＲＨ２、および配列番号１７のＣＤＲＨ３（ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット）、
ｂ２） 配列番号１９のＣＤＲＬ１、配列番号２０のＣＤＲＬ２、および配列番号２１のＣＤＲＬ３、並びに腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１に対する配列番号２３のＣＤＲＨ１、配列番号２４のＣＤＲＨ２、および配列番号２５のＣＤＲＨ３（ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット）、
ｂ３） 配列番号２７のＣＤＲＬ１、配列番号２８のＣＤＲＬ２、および配列番号２９のＣＤＲＬ３、並びに腫瘍抗原としてのＤＬＬ３に対する配列番号３１のＣＤＲＨ１、配列番号３２のＣＤＲＨ２、および配列番号３３のＣＤＲＨ３（ＤＬＬ３ ＣＤＲセット）、
ｂ４） 配列番号３５のＣＤＲＬ１、配列番号３６のＣＤＲＬ２、および配列番号３７のＣＤＲＬ３、並びに腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２に対する配列番号３９のＣＤＲＨ１、配列番号４０のＣＤＲＨ２、および配列番号４１のＣＤＲＨ３（ＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセット）、
ｃ） 前記二重特異性抗体は、重鎖として配列番号９４の重鎖を含み、軽鎖として配列番号９３の軽鎖を含む参照抗体による溶解と比較して、第１の腫瘍抗原を有する細胞株の溶解ついて、０．００１～０．２のＥＣ５０比を示す、
ｄ） 前記二重特異性抗体は、前記腫瘍抗原を持たない第２の細胞株の溶解について、前記参照抗体による溶解と比較して、５～１０００のＥＣ５０比を示す、
すべては活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の存在下、Ｅ／Ｔ比５：１、１２．５ＩＵ／ｍＬインターロイキン－２の存在下、同条件の同じアッセイで測定した。
【0047】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、以下のことを特徴とする：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット１）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４７のＣＤＲＨ１、配列番号４８のＣＤＲＨ２、および配列番号４９のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２）、
ｂ３） 配列番号５１のＣＤＲＨ１、配列番号５２のＣＤＲＨ２、および配列番号５３のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット３）、
ｂ４） 配列番号５５のＣＤＲＨ１、配列番号５６のＣＤＲＨ２、および配列番号５７のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット４）、
ｂ５）配列番号５９のＣＤＲＨ１、配列番号６０のＣＤＲＨ２、および配列番号６１のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット５）、
ｂ６） 配列番号６３のＣＤＲＨ１、配列番号６４のＣＤＲＨ２、および配列番号６５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット６）、
ｂ７） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号６９のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット７）、
ｂ８） 配列番号７１のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号７３のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット８）、
ｂ１０） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１０６のＣＤＲＨ２、および配列番号１０７のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１０）、
ｂ１１） 配列番号１０９のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号１１１のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１１）、
ｂ１２） 配列番号１１３のＣＤＲＨ１、配列番号１１４のＣＤＲＨ２、および配列番号１１５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１２）、
ｂ１３） 配列番号５９のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１４）、
ｂ１４） 配列番号５９のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１５）、
ｂ１５） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ１６） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ１７） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット１）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４７のＣＤＲＨ１、配列番号４８のＣＤＲＨ２、および配列番号４９のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２）、
ｂ３） 配列番号５１のＣＤＲＨ１、配列番号５２のＣＤＲＨ２、および配列番号５３のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット３）、
ｂ４） 配列番号５５のＣＤＲＨ１、配列番号５６のＣＤＲＨ２、および配列番号５７のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット４）、
ｂ５）配列番号５９のＣＤＲＨ１、配列番号６０のＣＤＲＨ２、および配列番号６１のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット５）、
ｂ６） 配列番号６３のＣＤＲＨ１、配列番号６４のＣＤＲＨ２、および配列番号６５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット６）、
ｂ７） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号６９のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット７）、
ｂ８） 配列番号７１のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号７３のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット８）、
ｂ１０） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１０６のＣＤＲＨ２、および配列番号１０７のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１０）、
ｂ１１） 配列番号１０９のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号１１１のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１１）、
ｂ１２） 配列番号１１３のＣＤＲＨ１、配列番号１１４のＣＤＲＨ２、および配列番号１１５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１２）、
ｂ１３） 配列番号５９のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１４）、
ｂ１４） 配列番号５９のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１５）、
ｂ１５） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ１６） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ１７） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0048】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、以下のことを特徴とする：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１２１のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット２）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４）配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ５） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット７）、
ｂ６） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ７） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１２１のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット２）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４）配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ５） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット７）、
ｂ６） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ７） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0049】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、以下のことを特徴とする：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号８３のＣＤＲＬ１、配列番号８４のＣＤＲＬ２、および配列番号８５のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット３）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２、配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット９）、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号８３のＣＤＲＬ１、配列番号８４のＣＤＲＬ２、および配列番号８５のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット３）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２、配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット９）、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0050】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、以下のことを特徴とする：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット４）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ５） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ６） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット７）、
ｂ７） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２３）、
ｂ８） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号１０６のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２４）、
ｂ９） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２５）、
ｂ１０） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１４のＣＤＲＨ２、および配列番号１１５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２６）、
ｂ１１） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２７）、
ｂ１２） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３ （ＣＤＲＨセット１９）
ｂ１３） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット４）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ５） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ６） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット７）、
ｂ７） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２３）、
ｂ８） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号１０６のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２４）、
ｂ９） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２５）、
ｂ１０） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１４のＣＤＲＨ２、および配列番号１１５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２６）、
ｂ１１） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２７）、
ｂ１２） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３ （ＣＤＲＨセット１９）
ｂ１３） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0051】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、以下のことを特徴とする：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号７５のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット５）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ５） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット７）、ｂ２） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ６） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号７５のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット５）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ５） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット７）、ｂ２） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ６） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0052】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、以下のことを特徴とする：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１４０のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット６）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ１） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ２） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２３）、
ｂ３） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ４） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１４０のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット６）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ１） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ２） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２３）、
ｂ３） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ４） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0053】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、以下のことを特徴とする：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット７）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ５） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット７）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ５） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0054】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット８）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ５） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２３）、
ｂ６） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ７） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含むことを特徴とし、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１４１のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２、および配列番号８のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット８）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ２） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ３） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）、
ｂ４） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ５） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２３）、
ｂ６） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ７） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）
を含むことを特徴とし、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0055】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であって、以下を特徴とする二重特異性抗体を含む：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３９のＣＤＲＬ３（ＣＤＲセット１２）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ２） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２３）、
ｂ３） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ４） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）、並びに
ｂ５） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ６） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ７） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号１３３のＣＤＲＬ１、配列番号１３８のＣＤＲＬ２、および配列番号１３９のＣＤＲＬ３（ＣＤＲセット１２）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２０）、
ｂ２） 配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２３）、
ｂ３） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１８）、
ｂ４） 配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１９）、並びに
ｂ５） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号４４のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット１）、
ｂ６） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号７２のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２１）、
ｂ７） 配列番号４３のＣＤＲＨ１、配列番号１１０のＣＤＲＨ２、および配列番号４５のＣＤＲＨ３（ＣＤＲＨセット２２）
を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0056】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、以下のことを特徴とする：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号８７のＣＤＲＬ１、配列番号８８のＣＤＲＬ２、および配列番号８９のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット９）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号８７のＣＤＲＬ１、配列番号８８のＣＤＲＬ２、および配列番号８９のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット９）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0057】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、以下のことを特徴とする：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号７９のＣＤＲＬ１、配列番号８０のＣＤＲＬ２、および配列番号８１のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット１０）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号７９のＣＤＲＬ１、配列番号８０のＣＤＲＬ２、および配列番号８１のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット１０）、並びに
ｂ） 重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0058】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であって、以下を特徴とする二重特異性抗体を含む：
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号７５のＣＤＲＬ１、配列番号７６のＣＤＲＬ２、および配列番号７７のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット１１）、並びに
ｂ）重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９） ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２） ＣＤＲＨセット１２を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
ａ） 前記第１の結合部分は、全長二価抗体であり、
軽鎖ＣＤＲ配列として、配列番号７５のＣＤＲＬ１、配列番号７６のＣＤＲＬ２、および配列番号７７のＣＤＲＬ３（ＣＤＲＬセット１１）、並びに
ｂ）重鎖ＣＤＲ配列として、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列：
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９） ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２） ＣＤＲＨセット１２を含み、
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなる。
【0059】
一実施形態において、本発明は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの本発明による二重特異性抗体を含み、第１の結合部分が、軽鎖ＣＤＲ配列としてＣＤＲＬ１セット１、およびｂ）重鎖ＣＤＲ配列として、
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、およびｂ８）ＣＤＲＨセット８、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とし、
さらに第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、およびｂ８）ＣＤＲＨセット８、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とし、
さらに第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
【0060】
一実施形態において、本発明は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの本発明による二重特異性抗体を含み、第１の結合部分が、軽鎖ＣＤＲ配列としてＣＤＲＬ１セット２を含み、重鎖ＣＤＲ配列として、
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とし、
さらに第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とし、
さらに第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
【0061】
一実施形態において、本発明は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの本発明による二重特異性抗体を含み、第１の結合部分が、軽鎖ＣＤＲ配列としてＣＤＲＬ１セット３を含み、重鎖ＣＤＲ配列として、
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、およびｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とし、
さらに第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、およびｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とし、
さらに第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
【0062】
一実施形態において、本発明は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの本発明による二重特異性抗体を含み、第１の結合部分が、軽鎖ＣＤＲ配列としてＣＤＲＬ１セット４を含み、重鎖ＣＤＲ配列として、
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とし、
さらに第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とし、
さらに第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
【0063】
一実施形態において、本発明は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの本発明による二重特異性抗体を含み、第１の結合部分が、軽鎖ＣＤＲ配列としてＣＤＲＬ１セット５を含み、重鎖ＣＤＲ配列として、ｂ１）ＣＤＲＨセット１、ｂ２）ＣＤＲＨセット２、ｂ３）ＣＤＲＨセット３、ｂ４）ＣＤＲＨセット４、ｂ５）ＣＤＲＨセット５、ｂ６）ＣＤＲＨセット６、ｂ７）ＣＤＲＨセット７、ｂ８）ＣＤＲＨセット８、およびｂ９）ＣＤＲＨセット９、ｂ１０）ＣＤＲＨセット１０、ｂ１１）ＣＤＲＨセット１１、ｂ１２）ＣＤＲＨセット１２からなる群から選択されるＣＤＲセットを含むことを特徴とし、
および、第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
および、第２の結合部分は、重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、ＦＯＬＲ１ ＣＤＲセット、ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲセット、ＤＬＬ３ ＣＤＲセット、およびＣＬＤＮ １８．２ ＣＤＲセットからなる群から選択されるＣＤＲセットを含む。
【0064】
本発明の１つの実施形態は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの本発明による二重特異性抗体であり、第１の結合部分がヒト化抗体であることを特徴とする。
【0065】
一実施形態において、本発明は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、第１の結合部分が、
可変重鎖として、配列番号４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、及び７０からなる群から選択される可変重鎖、または前記配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそれらのヒト化バージョン、および
軽鎖配列として、以下からなる群より選択される配列：
ａ） 配列番号５、
ｂ） 配列番号７４、
ｃ） 配列番号７８、
ｄ） 配列番号８２、
ｅ） 配列番号８６、
または前記配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそれらのヒト化バージョンを含むことを特徴とし、
並びに、第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなり、前記単鎖Ｆｖ抗体の各々は、第１の結合部分の各Ｃ末端にペプチドリンカーによって連結される。
可変重鎖として、配列番号４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、及び７０からなる群から選択される可変重鎖、または前記配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそれらのヒト化バージョン、および
軽鎖配列として、以下からなる群より選択される配列：
ａ） 配列番号５、
ｂ） 配列番号７４、
ｃ） 配列番号７８、
ｄ） 配列番号８２、
ｅ） 配列番号８６、
または前記配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそれらのヒト化バージョンを含むことを特徴とし、
並びに、第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなり、前記単鎖Ｆｖ抗体の各々は、第１の結合部分の各Ｃ末端にペプチドリンカーによって連結される。
【0066】
一実施形態において、第２の結合部分は、重鎖および軽鎖可変領域として、以下からなる群から選択されるセットを含む：
ｅ） 腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ－１について配列番号１０および配列番号１４、
ｆ） 腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１について配列番号１８および配列番号２２、
ｇ） 腫瘍抗原としてのＤＬＬ３－４について配列番号２６および配列番号３０、並びに
ｈ） 腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２について配列番号３４および配列番号３８。
ｅ） 腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ－１について配列番号１０および配列番号１４、
ｆ） 腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１について配列番号１８および配列番号２２、
ｇ） 腫瘍抗原としてのＤＬＬ３－４について配列番号２６および配列番号３０、並びに
ｈ） 腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２について配列番号３４および配列番号３８。
【0067】
一実施形態において、本発明は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、第１の結合部分が、可変重鎖として、配列番号１の可変重鎖、または前記配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそのヒト化バージョン、および軽鎖配列として、
ａ） 配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６、
または前記配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそれらのヒト化バージョンからなる群から選択される配列を含むことを特徴とし、
並びに、第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなり、前記単鎖Ｆｖ抗体の各々は、第１の結合部分の各Ｃ末端にペプチドリンカーによって連結される。
ａ） 配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６、
または前記配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそれらのヒト化バージョンからなる群から選択される配列を含むことを特徴とし、
並びに、第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなり、前記単鎖Ｆｖ抗体の各々は、第１の結合部分の各Ｃ末端にペプチドリンカーによって連結される。
【0068】
一実施形態において、第２の結合部分は、重鎖および軽鎖可変領域として、以下からなる群から選択されるセットを含む：
ｅ） 腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ－１について配列番号１０および配列番号１４、
ｆ） 腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１について配列番号１８および配列番号２２、
ｇ） 腫瘍抗原としてのＤＬＬ３－４について配列番号２６および配列番号３０、並びに
ｈ） 腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２について配列番号３４および配列番号３８。
ｅ） 腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ－１について配列番号１０および配列番号１４、
ｆ） 腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１について配列番号１８および配列番号２２、
ｇ） 腫瘍抗原としてのＤＬＬ３－４について配列番号２６および配列番号３０、並びに
ｈ） 腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２について配列番号３４および配列番号３８。
【0069】
一実施形態において、本発明は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの本発明による二重特異性抗体を含み、以下を特徴とする：
第１の結合部分が、表３に記載される群から選択される可変軽鎖及び可変重鎖セットを含む、および、第２の結合部分が以下からなる群より選択される可変軽鎖および可変重鎖セットを含む：
ａ） 腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ１について配列番号１０および配列番号１４、
ｂ） 腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１について配列番号１８および配列番号２２、
ｃ） 腫瘍抗原としてのＤＬＬ３について配列番号２６および配列番号３０、並びに
ｄ） 腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２について配列番号３４および配列番号３８。
第１の結合部分が、表３に記載される群から選択される可変軽鎖及び可変重鎖セットを含む、および、第２の結合部分が以下からなる群より選択される可変軽鎖および可変重鎖セットを含む：
ａ） 腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ１について配列番号１０および配列番号１４、
ｂ） 腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１について配列番号１８および配列番号２２、
ｃ） 腫瘍抗原としてのＤＬＬ３について配列番号２６および配列番号３０、並びに
ｄ） 腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２について配列番号３４および配列番号３８。
【0070】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分および腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分を含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖ形式の二重特異性抗体を含むことを特徴とし、以下のことを特徴とする：
ａ）前記第１の結合部分は完全長の二価抗体である、
ｂ）前記第２の結合部分は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）であり、前記腫瘍抗原に特異的に結合し、重鎖および軽鎖可変領域として、以下からなる群から選択されるセットを含む：
ｂ１）腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ１について配列番号１０および配列番号１４、
ｂ２）腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１について配列番号１８および配列番号２２、
ｂ３）腫瘍抗原としてのＤＬＬ３について配配列番号２６および配列番号３０、並びに
ｂ４）腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２について配列番号３４および配列番号３８。
ａ）前記第１の結合部分は完全長の二価抗体である、
ｂ）前記第２の結合部分は、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）であり、前記腫瘍抗原に特異的に結合し、重鎖および軽鎖可変領域として、以下からなる群から選択されるセットを含む：
ｂ１）腫瘍抗原としてのＦＯＬＲ１について配列番号１０および配列番号１４、
ｂ２）腫瘍抗原としてのＳＴＥＡＰ１について配列番号１８および配列番号２２、
ｂ３）腫瘍抗原としてのＤＬＬ３について配配列番号２６および配列番号３０、並びに
ｂ４）腫瘍抗原としてのＣＬＤＮ１８．２について配列番号３４および配列番号３８。
【0071】
ａ） 前記二重特異性抗体は、重鎖として配列番号９４の重鎖を含み、軽鎖として配列番号９３の軽鎖を含む参照抗体による溶解と比較して、第１の腫瘍抗原を有する細胞株の溶解ついて、０．００１～０．２のＥＣ５０比を示す、
ｂ） 前記二重特異性抗体は、前記腫瘍抗原を持たない第２の細胞株の溶解について、前記参照抗体による溶解と比較して、５～１０００のＥＣ５０比を示す、
すべては活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の存在下、Ｅ／Ｔ比５：１、１２．５ＩＵ／ｍＬインターロイキン－２の存在下、同条件の同じアッセイで測定した。
ｂ） 前記二重特異性抗体は、前記腫瘍抗原を持たない第２の細胞株の溶解について、前記参照抗体による溶解と比較して、５～１０００のＥＣ５０比を示す、
すべては活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の存在下、Ｅ／Ｔ比５：１、１２．５ＩＵ／ｍＬインターロイキン－２の存在下、同条件の同じアッセイで測定した。
【0072】
一実施形態において、本発明による抗体は、前記第１の結合部分がＣＤＲグラフト化抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする。一実施形態では、ヒトＶＨフレームワーク（ＦＲＨ）は、ＩＧＨＶ１－４６＊０１（Ｘ９２３４３）またはＩＧＨＶ４－３４＊０１（ＡＢ０１９４３９）である。一実施形態では、ヒトＶＬフレームワーク（ＦＲＬ）は、ＩＧＫＶ３－１１＊０１ Ｖ－ＫＡＰＰＡ（Ｘ０１６６８）またはＩＧＫＶ１－１２＊０１ Ｖ－ＫＡＰＰＡ（Ｖ０１５７７）のものである；ＩＭＧＴレパートリーを参照のこと。一実施形態では、ヒトＶＨ／ＶＬフレームワークの組み合わせは、ＩＧＨＶ１－４６＊０１とＩＧＫＶ３－１１＊０１、ＩＧＨＶ１－４６＊０１とＩＧＫＶ１－１２＊０１、ＩＧＨＶ４－３４＊０１とＩＧＫＶ３－１１＊０１、ＩＧＨＶ４－３４＊０１とＩＧＫＶ１－１２＊０１である。本発明によれば、フレームワーク配列は４つの部分（ＦＲＨ１－４およびＦＲＬ１－４）からなる。
【0073】
一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ２７７に特異的かつアゴニスト的に結合する第１の結合部分と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、
ａ）前記第１の結合部分は、完全長二価抗体であり、ＦＲＬ１－ＣＤＲＬ１－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４の形式の可変軽鎖を含み、ここでＦＲＬ１は配列番号１４２であり、ＦＲＬ２は配列番号１４３であり、ＦＲＬ３は配列番号１４４または１４５であり、ＦＲＬ４は配列番号１４６であり、ＦＲＨ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４のフォーマットの可変重鎖であり、ここで、ＦＲＨ１は、配列番号１４７である、ＦＲＨ２は配列番号１４８であり、ＦＲＨ３は配列番号１４９であり、そしてＦＲＨ４は配列番号１５０であり、表６または７のセットから選択されるＣＤＲＨ／ＣＤＲＬセットと組み合わされ、並びに
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなることを特徴とする。
ａ）前記第１の結合部分は、完全長二価抗体であり、ＦＲＬ１－ＣＤＲＬ１－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４の形式の可変軽鎖を含み、ここでＦＲＬ１は配列番号１４２であり、ＦＲＬ２は配列番号１４３であり、ＦＲＬ３は配列番号１４４または１４５であり、ＦＲＬ４は配列番号１４６であり、ＦＲＨ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４のフォーマットの可変重鎖であり、ここで、ＦＲＨ１は、配列番号１４７である、ＦＲＨ２は配列番号１４８であり、ＦＲＨ３は配列番号１４９であり、そしてＦＲＨ４は配列番号１５０であり、表６または７のセットから選択されるＣＤＲＨ／ＣＤＲＬセットと組み合わされ、並びに
ｃ） 前記第２の結合部分は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなることを特徴とする。
【0074】
一実施形態において、本発明による抗体は、ヒト化抗体であり、ＦＲＬ１－ＣＤＲＬ１－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４の配列からなる可変軽鎖とＦＲＨ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４の配列からなる可変重鎖とを含むか、またはＦＲＬ１－ＣＤＲＬ１－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３ａ－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４の配列からなる可変軽鎖とＦＲＨ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４の配列からなる可変重鎖、および表６または７のセットから選択されるＣＤＲＨ／ＣＤＲＬセットとを含むことを特徴とする。
【0075】
一実施形態において、本発明は、前記第２の結合部分が、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体からなることを特徴とする。一実施形態では、前記第２の結合部分が、前記腫瘍抗原に特異的に結合する２つの同一の単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）からなり、各々はそのＮ末端によって第１の結合部分の各Ｃ末端に連結される。したがって、第１の結合部分（全長の単一特異性抗ＣＤ２７７抗体である）のＦｃ部分の各Ｃ末端には、１つのｓｃＦｖのみが連結されている。本明細書では、第１の結合部分として全長二価抗体、および第２の結合部分として前記２つのｓｃＦｖからなる前記二重特異性抗体のフォーマットを「Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマット」と命名する。例示的なＭａｂ－ｓｃＦｖのフォーマットを図１ａに示す。
【0076】
一実施形態において、前記ｓｃＦｖの各々は、第１のペプチドリンカー（リンカー１）によって第１の結合部分のＣ末端の各々に化学的に連結される。
【0077】
一実施形態本発明は、前記ｓｃＦｖが、ペプチドリンカー１－ＶＬ－ペプチドリンカー２－ＶＨ）の方向で前記Ｃ末端に結合していることを特徴とする、本発明による二重特異性抗体を含む。
【0078】
一実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号９７、９８、９９、１００、および１０１のペプチドからなる群より選択される。
【0079】
一実施形態において、本発明は、前記第１のペプチドリンカーが５～２５個、一実施形態では１０～２５個のアミノ酸からなることを特徴とする、本発明による二重特異性抗体を含む。
【0080】
一実施形態において、本発明は、前記第２のペプチドリンカーが１０～２５個のアミノ酸からなることを特徴とする、本発明による二重特異性抗体を含む。
【0081】
一実施形態では、前記二重特異性抗体は、前記第２の細胞株において、バックグラウンド溶解の１０倍以上、一実施形態では５倍以上、一実施形態では２倍以上の有意な溶解を誘導しない。
【0082】
本発明の一実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記第１の細胞株の溶解に対して、前記参照抗体による溶解と比較して、一実施形態において０．２以下、一実施形態において０．００１～０．２、一実施形態において０．００５～０．２、一実施形態において０．０１～０．２のＥＣ５０比を示す。
【0083】
一実施形態では、前記二重特異性抗体は、前記第２の細胞株の溶解について、前記参照抗体による溶解と比較して、５以上、１０以上、５～１０００、一実施形態では５～２０００、一実施形態では５～５０００、一実施形態では１０～１０００、一実施形態では１０～２０００、一実施形態では１０～５０００のＥＣ５０比を示す。
【0084】
本発明によるＥＣ５０比とは、細胞溶解について測定されたＥＣ５０値の比を意味する。例示的な方法を実施例６で説明する。
【0085】
一実施形態では、前記第２の腫瘍抗原陰性細胞株は、腫瘍抗原が不活性化された前記第１の細胞株（ノックアウト細胞株）である。
【0086】
一実施形態において、本発明は、前記抗体が参照抗体と比較して０．５以上、０．８以上、または０．９以上のＥｍａｘを誘導することを特徴とする、本発明による二重特異性抗体を含む。一実施形態では、前記二重特異性抗体は、前記第１の腫瘍抗原陽性細胞株の溶解について、前記参照抗体のＥｍａｘと比較して、０．５～１．５、一実施形態では０．８～１．５、一実施形態では０．９～１．５のＥｍａｘ比を示す。
【0087】
参照抗体は、全長２価の単一特異性でアゴニスティックな抗ＣＤ２７７抗体であり、重鎖として配列番号９４の重鎖、軽鎖として配列番号９３の軽鎖を含む。参照抗体は、配列番号１の可変重鎖と、配列番号５の可変軽鎖と、配列番号２、３、４、６、７、８のＣＤＲを含む。
【0088】
一実施形態において、本発明は、前記腫瘍抗原が、本発明の二重特異性抗体を非内在化する腫瘍抗原であることを特徴とする、本発明による二重特異性抗体を含む。
【0089】
本発明のさらなる実施形態は、本発明による二重特異性抗体をコードする組換え核酸配列である。
【0090】
本発明のさらなる実施形態は、本発明による二重特異性抗体をコードする組換え核酸配列を含むベクターである。
【0091】
本発明のさらなる実施形態は、本発明による二重特異性抗体をコードする組換え核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞である。
【0092】
一実施形態では、本発明は、腫瘍疾患の治療に使用するための、本発明による二重特異性抗体を含む。
【0093】
一実施形態において、本発明は、腫瘍疾患の治療における使用のための、本発明による二重特異性抗体を含む。
【0094】
一実施形態では、腫瘍疾患は、結腸癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌からなる群から選択される。
【0095】
本発明のさらなる実施形態は、本発明による前記二重特異性抗体を含む医薬組成物である。
【0096】
一実施形態において、本発明は、有効量の本発明による二重特異性抗体または前記二重特異性抗体を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法を含む。
【0097】
本発明によるＣＤ２７７ Ｍａｂｓとその特性は、表３および５にさらに記載されている。一実施形態では、ＣＤ２７７ Ｍａｂは、第１および第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ２７７ Ｍａｂは、第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、第２の結合部分は腫瘍抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ分子であり、抗体はＭａｂ－ｓｃＦｖフォーマットである。
【図面の簡単な説明】
【0098】
【図1a】本発明による二重特異性抗体の構造の一実施形態。
【図1b】ＢＴＮ３Ａアゴニスト（配列番号９４および９３のＨＣおよびＬＣ、「第２の二重特異性抗体」）と腫瘍抗原に対する二重特異性抗体は、同じ配列の単一特異性ＢＴＮ３Ａ抗体と比較して、腫瘍抗原を有する細胞に対して増強された効力を示すが、腫瘍抗原陰性細胞に対しては、同じＢＴＮ３Ａ抗体配列の単一特異性ＢＴＮ３Ａ抗体と同じ力価で結合している（下図参照）。このような「第２の」二重特異性抗体は、依然として循環中および正常組織中のＶγ９Ｖδ２細胞を非特異的に活性化する。それどころか、本発明の二重特異性抗体は、ＢＴＮ３Ａアゴニストに対する「第２の」二重特異性抗体と比較して、腫瘍抗原陽性細胞では依然として強い効力を示すが、腫瘍抗原陰性細胞ではあまり効力を示さない。従って、予期せぬことに、本発明の二重特異性抗体は治療における副作用が少ない。
【図2】ＦＯＬＲ１＋およびＦＯＬＲ１－腫瘍細胞に対するＥｖＢ＃５の活性。１０．０００ Ｏｖｃａｒ－３（ＦＯＬＲ１＋）または ＮＣＩ－Ｈ１６９３（ＦＯＬＲ１－）細胞を完全培地（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１０％ ウシ胎児血清を補充した ＲＰＭＩ １６４０）で培養した。腫瘍細胞を一晩接着させた後、細胞をさらに完全培地で培養し、表示濃度の抗体と短期活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を１０ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２中、Ｅ／Ｔ比５：１で添加した。腫瘍細胞自体の自然溶解の対照として、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞も抗体も添加せず、１２．５ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２を添加した培地で、追加ウェル中の腫瘍細胞を培養した（「ＳＬ」、自然溶解対照）。最大溶解の対照として、１２．５ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２を添加した培地中で、Ｅ／Ｔ比５：１で短期活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を追加ウェル中の腫瘍細胞と培養したが、最大溶解を達成するためにＴｒｉｔｏｎ－Ｘ洗剤を添加した（「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００」対照）。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞による腫瘍細胞のバックグラウンド溶解の対照として、追加ウェル中の腫瘍細胞を、１２．５ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２添加培地中、Ｅ／Ｔ比５：１で短期活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と培養したが、抗体は添加しなかった（「培地対照」）。その後、セルインデックス（ＣＩ）を９０時間にわたって３分ごとに測定した。時点ｔｘにおける腫瘍細胞の溶解度は、以下の式で計算した：腫瘍細胞溶解（ｔｘ）＝（ＣＩ（ｔｘ）－培地対照（ｔｘ））／（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００－培地対照（ｔｘ））＊１００曲線フィッティングは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用い、シグモイド用量反応関数を用いて行い、参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（ｔｘ）のベストフィット値（Ｔｏｐ値）を得た。参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（「Ｔｏｐ」）に対する腫瘍細胞溶解率％は、以下の式で算出した：「腫瘍細胞溶解率％（ｔｘ）＝腫瘍細胞溶解率（ｔｘ）／Ｔｏｐ＊１００」。図２ａはＦＯＬＲ１＋ Ｏｖｃａｒ－３腫瘍細胞の腫瘍細胞溶解率、図２ｂはＮＣＩ－Ｈ１６９３ ＷＴ（ＦＯＬＲ１－）細胞の腫瘍細胞溶解率±２４時間時点のＳＤである。異なるコンストラクトのＥＣ５０値を示す。本発明による二重特異性抗体は、０．１２ ｎＭの濃度でＯｖｃａｒ－３細胞を５０％殺傷した。２４時間時点のバックグラウンド溶解±ＳＤは培地対照で示す。図２ｃは、本発明によるｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体と逆フォーマットの二重特異性抗体についての、Ｏｖｃａｒ－３細胞の腫瘍細胞溶解％の比較である。（ＥｖＢ＃１：抗腫瘍抗原抗体の２つのｓｃＦｖを連結した配列番号１と５のＶＨ／ＶＬ結合の全長２価抗体、ＥｖＢ＃８：ＶＨ／ＶＬとして配列番号１と５を結合した２つのｓｃＦｖを連結した同抗腫瘍抗原抗体を結合したＶＨ／ＶＬ結合の全長２価抗体。両方のフォーマットを図２ｄに示す）。
【図3】溶解効率の統計的解析。統計解析の結果、濃度０．１ｎＭでは、二重特異性抗体ＥｖＢ＃５は、活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の存在下、ＦＯＬＲ１を有する細胞株Ｏｖｃａｒ－３に、Ｅ／Ｔ比５：１で４８％の溶解を誘導する（図３ａ）。一方、当該二重特異性抗体は、ＦＯＬＲ１を有しないＮＣＩ－Ｈ１６９３には、同じアッセイおよび同じ条件下で、バックグラウンド溶解（「培地対照」）を有意に上回る溶解を誘導しない（図３ｂ）。差の有意性は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェアを用いた対応のないｔ検定により決定し、有意性の程度を示した：ｎｓ Ｐ＞０．０５、＊ Ｐ≦０．０５、＊＊ Ｐ≦０．０１、＊＊＊ Ｐ≦０．００１。したがって、本発明による二重特異性抗体は、ＦＯＬＲ１＋ Ｏｖｃａｒ－３細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害性を増強し、ＦＯＬＲ１－ ＮＣＩ－Ｈ１６９３細胞に対する細胞傷害性は増強しないが、参照抗体（「Ｒｅｆ．Ａｂ」）は、ＦＯＬＲ１＋ Ｏｖｃａｒ－３細胞に対するＶγ９Ｖδ２ γδ Ｔ細胞の細胞傷害性を増強しない。
【図4】ＮＣＩ－Ｈ１６９３ｓｇＮＴ（ＷＴ対照）および抗原１をノックアウトしたＮＣＩ－Ｈ１６９３ｓｇＮＴ（クローン２７）に対するＥｖＢ＃２の活性。１０．０００個のＮＣＩ－Ｈ１６９３ｓｇＮＴ（ＷＴ対照）またはクローン２７細胞を完全培地で培養した。腫瘍細胞を一晩接着させた後、細胞を追加完全培地で培養し、指定濃度の抗体と短期活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を１２．５ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２中、Ｅ／Ｔ比５：１で添加した。腫瘍細胞自体の自然溶解の対照として、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞も抗体も添加せず、１２．５ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２を添加した培地で、追加ウェル中の腫瘍細胞を培養した（「ＳＬ」、自然溶解対照）。最大溶解の対照として、１２．５ ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２を添加した培地中で、Ｅ／Ｔ比５：１で短期活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を追加ウェル中の腫瘍細胞と培養したが、最大溶解を達成するためにＴｒｉｔｏｎ－Ｘ洗剤を添加した（「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００」対照）。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞による腫瘍細胞のバックグラウンド溶解の対照として、追加ウェル中の腫瘍細胞を、１２．５ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２添加培地中、Ｅ／Ｔ比５：１で短期活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と培養したが、抗体は添加しなかった（「培地対照」）。その後、セルインデックス（ＣＩ）を９０時間にわたって３分ごとに測定した。時点ｔｘにおける腫瘍細胞の溶解度は、以下の式で計算した：腫瘍細胞溶解（ｔｘ）＝（ＣＩ（ｔｘ）－培地対照（ｔｘ））／（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００－培地対照（ｔｘ））＊１００曲線フィッティングは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用い、シグモイド用量反応関数を用いて行い、参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（ｔｘ）のベストフィット値（Ｔｏｐ値）を得た。参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（「Ｔｏｐ」）に対する腫瘍細胞溶解率％は、以下の式で算出した：腫瘍細胞溶解率（ｔｘ）＝腫瘍細胞溶解率（ｔｘ）／Ｔｏｐ＊１００図４ａは抗原１＋ ＮＣＩ－Ｈ１６９３ ｓｇＮＴ腫瘍細胞の腫瘍細胞溶解率、図４ｂは２４時間時点における抗原１－クローン２７細胞の腫瘍細胞溶解率±ＳＤを示す。異なるコンストラクトのＥＣ５０値を示す。本発明による二重特異性抗体は、０．０１２ ｎＭの濃度でＮＣＩ－Ｈ１６９３ ｓｇＮＴ細胞を５０％殺傷した。２４時間時点のバックグラウンド溶解±ＳＤは培地対照で示す。
【図5】溶解効率の統計的解析。統計解析によると、二重特異性抗体ＥｖＢ＃２は０．０１ｎＭの濃度で、活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の存在下、抗原１を持つ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１６９３ ｓｇＮＴをＥ／Ｔ比５：１で６１％溶解させた（図５ａ）。一方、前記二重特異性抗体は、前記腫瘍抗原を持たないＮＣＩ－Ｈ１６９３ ｋｏ細胞（クローン２７）において、同じアッセイおよび同じ条件下でバックグラウンド溶解を有意に上回る溶解を誘導しない（図５ｂ）。差の有意性は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェアを用いた対応のないｔ検定により決定し、有意性の程度を示した：ｎｓ Ｐ＞０．０５、＊ Ｐ≦０．０５、＊＊ Ｐ≦０．０１、＊＊＊ Ｐ≦０．００１。したがって、本発明による二重特異性抗体は、ＮＣＩ－Ｈ１６９３ｓｇＮＴに対するＶδ２＋ γδ Ｔ細胞傷害性を増強し、ｋｏ細胞に対しては増強しない。一方で、参照抗体（「参照抗体」）は、腫瘍抗原１を有するＮＣＩ－Ｈ１６９３ｓｇＮＴ細胞に対すＶδ２＋ γδ Ｔ細胞傷害性を増強しない。
【図6】ＳＴＥＡＰ１＋およびＳＴＥＡＰ１－腫瘍細胞に対するＥｖＢ＃３の活性。１０．０００個のＵＭＵＣ－３（ＳＴＥＡＰ１＋）細胞またはＯｖｃａｒ－３（ＳＴＥＡＰ１－）細胞 を完全培地で培養した。腫瘍細胞を一晩接着させた後、細胞をさらに完全培地で培養し、表示濃度の抗体と短期活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を１０ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２中、Ｅ／Ｔ比５：１で添加した。腫瘍細胞自体の自然溶解の対照として、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞も抗体も添加せず、１２．５ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２を添加した培地で、追加ウェル中の腫瘍細胞を培養した（「ＳＬ」、自然溶解対照）。最大溶解の対照として、１２．５ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２を添加した培地中で、Ｅ／Ｔ比５：１で短期活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を追加ウェル中の腫瘍細胞と培養したが、最大溶解を達成するためにＴｒｉｔｏｎ－Ｘ洗剤を添加した（「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００」対照）。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞による腫瘍細胞のバックグラウンド溶解の対照として、追加ウェル中の腫瘍細胞を、１２．５ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２添加培地中、Ｅ／Ｔ比５：１で短期活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と培養したが、抗体は添加しなかった（「培地対照」）。その後、セルインデックス（ＣＩ）を９０時間にわたって３分ごとに測定した。時点ｔｘにおける腫瘍細胞の溶解度は、以下の式で計算した：腫瘍細胞溶解（ｔｘ）＝（ＣＩ（ｔｘ）－培地対照（ｔｘ））／（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００－培地対照（ｔｘ））＊１００曲線フィッティングは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用い、シグモイド用量反応関数を用いて行い、参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（ｔｘ）のベストフィット値（Ｔｏｐ値）を得た。参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（「Ｔｏｐ」）に対する腫瘍細胞溶解率％は、以下の式で算出した：腫瘍細胞溶解率（ｔｘ）＝腫瘍細胞溶解率（ｔｘ）／Ｔｏｐ＊１００図６ａはＳＴＥＡＰ１＋ ＵＭＵＣ－３腫瘍細胞の腫瘍細胞溶解率、図６ｂは２４時間時点（ｔｘ）におけるＳＴＥＡＰ１－ Ｏｖｃａｒ－３腫瘍細胞の腫瘍細胞溶解率±ＳＤを示す。異なるコンストラクトのＥＣ５０値を示す。本発明による二重特異性抗体は、０．１７ ｎＭの濃度でＵＭＵＣ－３細胞を５０％殺傷した。２４時間時点のバックグラウンド溶解±ＳＤは培地対照で示す。
【図7】分子のクローニングと腫瘍アンカーカセットの交換。
【図8】ＦＯＬＲ１＋Ｏｖｃａｒ－３およびＦＯＬ１Ｒ－腫瘍細胞の細胞溶解率を示す（図２の説明を参照）。ＢＴＮ３Ａアゴニスト抗体：参照抗体、ＥｖＢ＃５：ＣＤＲ変異のない二重特異性抗体、ＥｖＢ＃４７およびＥｖＢ＃５２：変異のある二重特異性抗体、例えば表２参照）。
【図9a】Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒アッセイ。腫瘍抗原陽性細胞非存在下でのＶδ２ Ｔ細胞の脱顆粒は、細胞表面上のＣＤ１０７ａレベルのＦＡＣＳ分析によってモニターされた。抗体はｉ．ｖ．投与後の一次分布コンパートメントにおけるより高い薬物濃度を反映するため、有効濃度の１０倍の濃度で適用された。上段は、参照抗体２０．１で活性化した４つの異なるドナーのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の有意な脱顆粒を、抗体なしの培地存在下でのＣＤ１０７ａ表面レベルと比較して示している。下のパネルは、抗体なしの培地存在下でのＣＤ１０７ａ表面レベルと比較した場合、本発明の抗体存在下での４つの異なるドナーからのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の有意な脱顆粒を示さない。
【図9b】Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞自己除去アッセイ。腫瘍抗原陽性細胞がない場合のＶδ２ Ｔ細胞の自己排除は、死細胞をＳｙｔｏｘＧｒｅｅｎで染色した後、ＦＡＣＳ分析でモニターした。抗体はｉ．ｖ．投与後の一次分布コンパートメントにおけるより高い薬物濃度を反映するため、有効濃度の１０倍の濃度で適用された。上段は、参照抗体２０．１による活性化で、４つの異なるドナーのＶδ２ Ｔ細胞が、抗体を含まない培地存在下で死滅した割合と比較して有意に死滅したことを示している。下側のパネルは、本発明の抗体存在下、４つの異なるドナーから採取したＶδ２ Ｔ細胞を有意に殺さないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【0099】
本発明者らは、Ｉｍｂｅｒｔ Ｃ．ら、ＷＯ２０１２０８０３５１およびＷＯ２０１２０８０７６９に記載のアゴニスト性マウス抗ＣＤ２７７抗体（親抗体、２０．１）、ならびに当該抗ＣＤ２７７抗体からなる二重特異性抗体、および当該二重特異性抗体における例示的な腫瘍抗原に対する抗体について、腫瘍抗原陽性細胞および陰性細胞に対する細胞溶解を検討した。図９に示すように、前記Ｍａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体は、それぞれの単一特異性抗ＣＤ２７７抗体よりも優れた腫瘍細胞溶解作用を示す。
【0100】
驚くべきことに、本発明者らは、さらに、ＣＤＲ重鎖ＣＤＲＨ２（配列番号４４）に２つの点変異（Ｎ５３Ｓ、Ｋ５８Ｎ、またはＣＤＲＨ２で数えるとＮ５ＳおよびＫ１０Ｎとも呼ばれる）を有する前記親抗ＣＤ２７７抗体を含むＭａｂ－ｓｃＦｖ形式の二重特異性抗体が、これらの変異のない親抗体と抗腫瘍抗原抗体からなる二重特異性抗体と比較して、腫瘍抗原陽性細胞の高い溶解を提供するが、腫瘍抗原陰性細胞の溶解は減少することを見出した。この驚くべき効果は、抗ＣＤ２７７抗体部分の軽鎖ＣＤＲＬ１（例えば 配列番号７５、１４０、１４１）の付加的な点変異（Ｌ３１Ｖ、ＣＤＲＬ１で数えるとＬ８Ｖ）によってさらに改善される。したがって、本発明はこのような二重特異性抗体およびそのヒト化バージョンを提供する。
【0101】
一実施形態において、本発明による抗体は、前記ＣＤＲＨ２置換に加えて、ＣＤＲＬ１におけるＬ８Ｖの置換を含むことを特徴とする。一実施形態において、本発明による抗体は、ＣＤＲＬ１におけるＬ８ＶおよびＨ１Ｒの付加的置換を含むことを特徴とする。
【0102】
本明細書で使用する場合、本発明による「活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞」という用語は、アミノビスホスホネート（ｎ－ＢＰ）ゾレドロン酸による刺激および組換えＩＬ２（ｒＩＬ２）の添加によってＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞が活性化されることを意味する；実施例３を参照のこと。
【0103】
用語「第１の結合部分」は全長抗体を指す。本明細書で使用する「全長抗体」という用語は、２本の同一の軽鎖（Ｌ鎖）と２本の同一の重鎖（Ｈ鎖）からなるヘテロ４量体の糖タンパク質を指す。全長抗体は単一特異性の二価抗体で、可変ドメインと定常ドメイン、Ｆｃ部分を含む。通常、各軽鎖は重鎖と１つの共有結合ジスルフィド結合で結合しているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間ではジスルフィド結合の数は異なる。重鎖と軽鎖はそれぞれ、鎖内に規則的な間隔でジスルフィド橋を持つ。各重鎖の一端には可変ドメイン（ＶＨ）があり、その後に多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を持ち、他端に定常ドメインを持つ。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。全長抗体は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から構成され、ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略される。「全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から構成され、ＶＬ－ＣＬと略される。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（ｋａｐｐａ）またはλ（ｌａｍｂｄａ）である。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の界面を形成していると考えられている［Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， １８６：６５１－６６３ （１９８５）； Ｎｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：４５９２－４５９６（１９８５）。］脊椎動物のどの種の抗体の軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、ｋａｐｐａとｌａｍｂｄａと呼ばれる明確に異なる２つのタイプのいずれかに分類することができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、完全長抗体を、異なる「クラス」に割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、そしてこれらのいくつかは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ミューと呼ばれる。
【0104】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在する可能性のある天然由来の変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一の抗原部位に向けられる。
【0105】
「ヒト化抗体またはそのヒト化バージョン」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親イムノグロブリンと比較して異なる特異性を有するイムノグロブリンのＣＤＲを構成するように改変された抗体を指す。一実施形態では、ヒト抗体のフレームワーク領域にマウスＣＤＲを移植し、「ヒト化抗体またはバージョン 」を調製する。例えば、Riechmann, L ., et al., Nature 332 (1988) 323-327;およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。一実施形態では、ヒトフレームワークは、ＩＧＨＶ１－４６＊０１（Ｘ９２３４３）またはＩＧＨＶ４－３４＊０１（ＡＢ０１９４３９）、ＩＧＫＶ３－１１＊０１ Ｖ－ＫＡＰＰＡ（Ｘ０１６６８）またはＩＧＫＶ１－１２＊０１ Ｖ－ＫＡＰＰＡ（Ｖ０１５７７）である。本発明に包含される一実施形態では、定常領域は、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生成するために、元の抗体のものから付加的に修飾または変更されている。
【0106】
本明細書で使用する「可変ドメイン」という用語は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントを含む抗体領域を指す。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖と軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、大部分がβシート構造をとり、３つのＣＤＲによって連結され、βシート構造をつなぐループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接して保持され、もう一方の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９８７）を参照）。定常ドメインは、抗体と抗原の結合には直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。
【0107】
本明細書で使用する「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。Ｆｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ領域であってもよいし、バリアントＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は異なるかもしれないが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、一Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、または位置Ｐｒｏ２３０のアミノ酸残基から、Ｆｃ領域のカルボキシル末端まで伸長するように定義される（本明細書では、Ｋａｂａｔら（上掲）による番号付けシステムを使用する）。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、任意でＣＨ４ドメインＩｇＥを含む。
【0108】
本明細書において「Ｆｃ領域鎖」とは、Ｆｃ領域の２本のポリペプチド鎖のうちの１本を意味する。
【0109】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常、おおよそ位置２３１のアミノ酸残基からおおよそ位置３４０のアミノ酸残基まで伸びている。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対になっていないという点でユニークである。むしろ、２本のＮ－結合分岐型糖鎖が、インタクトのネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在している。糖鎖がドメインとドメインのペアリングの代わりとなり、ＣＨ２ドメインの安定化に役立っているのではないかと推測されている。Burton, Mol.Immunol .22:161-206 (1985)。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列ＣＨ２ドメインまたはバリアントＣＨ２ドメインであり得る。
【0110】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（ＩｇＧのおおよそ位置３４１のアミノ酸残基からおおよそ位置４４７のアミノ酸残基まで）のＣ末端の残基のストレッチを含む。本明細書におけるＣＨ３領域は、ネイティブ配列のＣＨ３ドメインまたはバリアントＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖に「突起」が導入され、他方の鎖に対応する「空洞」が導入されたＣＨ３ドメイン；米国特許第５，８２１，３３３号参照）であってもよい。
【0111】
「ヒンジ領域」とは、一般に、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６、または約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０まで伸びる領域と定義される（Burton, Mol.Immunol .22:161-206 (1985)）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ－Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。本明細書におけるヒンジ領域は、ネイティブ配列のヒンジ領域であってもよいし、バリアントヒンジ領域であってもよい。バリアントヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、一般に、ポリペプチド鎖あたり少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、そのため、バリアントヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本明細書において好ましいヒンジ領域は、ネイティブ配列のヒトヒンジ領域、例えばネイティブ配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【0112】
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも一つの「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれる。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と結合していることを必要とし、このような抗体エフェクター機能を評価するために当技術分野で知られている様々なアッセイを用いて評価することができる。
【0113】
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」とは、自然界に存在するＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によってネイティブ配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば約１個から約１０個のアミノ酸置換、好ましくはネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１個から約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性を有し、最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の配列同一性を有し、より好ましくは、それと少なくとも約９５％の配列同一性を有する。
【0114】
ＩｇＧ４サブクラスの抗体はＦｃ受容体（ＦｃｙＲＩＩＩａ）との結合が減少しているが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示している。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、およびＨｉｓ４３５は、変化した場合、Ｆｅ受容体結合を低下させる残基である(Shields, R.L.ら, J. Biol.Chem.276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J.9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434)。一実施形態では、本発明による抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して減少したＦｃγＲ結合を有し、全長抗体は、ＩｇＧ４サブクラス、またはＳ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５および／もしくはＤ２６５に変異を有するＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２サブクラスであり、かつ／もしくはＰＶＡ２３６変異を含む。一実施形態では、完全長抗体における変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅおよび／またはＰＶＡ２３６である。別の実施形態では、完全長抗体の変異はＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ１ Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。
【0115】
さらなる実施形態において、本発明による抗体は、前記全長抗体がヒトＩｇＧ１サブクラス、または変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする。さらなる実施形態において、本発明による抗体は、前記全長抗体がヒトＩｇＧ４サブクラス、または追加変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする。一実施形態は、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域におけるＳ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）、Ｌ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）およびＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）、またはＳ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）およびＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）の変異を含む。
【0116】
「第２の結合部分」という用語は、一本鎖Ｆｖ分子を指す。第１の結合部分のＦｃ部分のＣ末端には、それぞれ同一の一本鎖Ｆｖ分子が接続されている。したがって、第２の結合部分は２つの単鎖Ｆｖ分子を含む。
【0117】
本明細書において、「単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）」という用語は、軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインが、そのＣ末端から重鎖（ＶＨ）の可変ドメインのＮ末端までポリペプチド鎖で連結されている分子を指す。あるいは、ｓｃＦｖは、ＶＨのＣ末端がＶＬのＮ末端にポリペプチド鎖で連結されたポリペプチド鎖を含む。
【0118】
本発明で使用される用語「ペプチドリンカー」または「リンカー」は、好ましくは合成由来のアミノ酸配列を有するペプチドを示す。本発明によるペプチドリンカーは、単鎖ＦａｂまたはｓｃＦｖ断片を全長抗体のＣ末端に融合させるために使用される。好ましくは、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長、好ましくは５～３０アミノ酸長、より好ましくは１０～２０アミノ酸長のアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施形態では、前記ペプチドコネクターは、（ＧｘＳ）ｎまたは（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリン、および（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５または６、およびｍ＝０、１、２または３）または（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４または５、およびｍ＝０、１、２または３）であり、好ましくはｘ＝４、ｎ＝２または３であり、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝３である。一実施形態では、前記ペプチドコネクターは（Ｇ４Ｓ）３である。有用なペプチドリンカーは 配列番号９７－１０１にも記載されている。
【0119】
可変領域は、直接連結してもよいし、典型的には、機能的抗原結合部分の形成を可能にするリンカーペプチドを介して連結してもよい。典型的なペプチドリンカーはおおよそを含み、本明細書に記載されているか、または当該技術分野で知られている。
【0120】
ｓｃＦｖ分子は、例えばReiterら(Nat.Biotechnol.14, 1239-1245 (1996)）に記載のように、重鎖と軽鎖の可変ドメイン間のジスルフィド橋によってさらに安定化される。したがって、一実施形態において、本発明のＴ細胞活性化二重特異的抗原結合分子は、重鎖可変ドメインのアミノ酸および軽鎖可変ドメインのアミノ酸がシステインで置換され、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間にジスルフィド橋が形成され得るｓｃＦｖ分子を含む。具体的な実施形態では、軽鎖可変ドメインの位置４４のアミノ酸と重鎖可変ドメインの位置１００のアミノ酸がシステインで置換されている（Ｋａｂａｔ番号付け）。
【0121】
当技術分野で知られているように、ｓｃＦｖはまた、ＣＤＲ配列の変異によっても安定化され得るが、これは（Miller et al, Protein Eng Des Sel.2010 Jul;23(7):549-57; Igawa et al, MAbs.2011 May-Jun;3(3):243-5; Perchiacca & Tessier, Annu Rev Chem Biomol Eng.2012;3 :263- 86）に記載されているとおりである。
【0122】
一実施形態では、ｓｃＦｖは生産収率を向上させるために単鎖Ｆａｂ断片に置き換えることができる。「Ｆａｂ断片」とは、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に以下のいずれかの順序を有する：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１またはｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ；および前記リンカーが少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片ａ） ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ） ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ） ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１およびｄ） ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。用語「Ｎ末端」はＮ末端の最後のアミノ酸を示し、用語「Ｃ末端」はＣ末端の最後のアミノ酸を示す。
【0123】
本明細書に記載の抗原結合構築物は二重特異性であり、一般的な実施形態では、それぞれ２つの異なる抗原に特異的に結合できる少なくとも２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む。第１の結合部分は完全長の二価抗体で、第２の結合部分はＦｃ部分を含まない２つの一価抗体断片からなる。好ましい実施形態では、２つの一価抗体断片はｓｃＦｖ形式（すなわち、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインからなる抗原結合ドメイン）である。一実施形態では、前記ｓｃＦｖ分子はヒトである。別の実施形態では、前記第１および第２の結合部分はヒト化されている。
【0124】
好ましいＭａｂ－ｓｃＦｖフォーマットを示す例示的な重鎖（図１ａも参照）を配列番号１０２（ＤＬＬ３）および配列番号１０３（ＣＬＤＮ１８．２）に示す。
【0125】
「特異的結合」または「選択的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であり、不要または非特異的な相互作用から識別できることを意味する。抗原結合部分が特定の抗原決定基と結合する能力は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定することができる（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析）。一実施形態では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、ＳＰＲで測定した抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満、好ましくは５％未満である。
【0126】
本発明について用語「ＥＣ５０比」とは、本発明による二重特異性抗体の値を分子（上）とし、参照抗体の値を分母（下）とする比を意味する。
【0127】
一実施形態では、前記第２の腫瘍抗原陰性細胞株は、腫瘍抗原が不活性化された前記第１の細胞株である（ノックアウト細胞株；ｋｏ細胞株）。
【0128】
一実施形態では、前記二重特異性抗体は、前記第１の腫瘍抗原陽性細胞株の溶解について、前記参照抗体のＥｍａｘと比較して０．５～１．５のＥｍａｘ比を示す。溶血は、腫瘍細胞のインピーダンスをモニターすることによって測定される（実施例６参照）。
【0129】
本明細書で使用する場合、「前記腫瘍抗原を持たないヒト細胞の溶解を誘導しない」という用語は、１２．５ＩＵ／ｍＬインターロイキン－２の存在下、Ｅ／Ｔ比５：１の活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の存在下で測定した、本発明の抗体による腫瘍細胞の溶解であって、バックグラウンドの溶解と有意差のない（ｐ値＞０．０５）溶解を指す 。バックグラウンド溶解は、同じアッセイで同じ条件で測定されるが、抗体は添加されない（「培地対照」）。
【0130】
本明細書で使用する「ＣＤ２７７結合」とは、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、および／またはＢＴＮ３Ａ３への結合を意味する。
【0131】
「親和性」とは、解離定数（ｋＤ）で表される分子（例えばＣＤ２７７）と結合パートナー（例えば抗ＣＤ２７７抗体）の単一の結合部位間の相互作用の強さを指し、解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆとｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比が同じである限り、異なる速度定数で構成されていてもよい。親和性は、本明細書に記載されているものを含め、当技術分野で周知の確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特別な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【0132】
本明細書で使用する「親和性成熟抗体」とは、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の改変があり、その結果、それらの改変を持たない親抗体に比べて抗ＣＤ２７７抗体の親和性が低下している抗体を指す。親和性が低下した好ましい成熟抗体は、ＣＤ２７７に対してナノモルからマイクロモルの範囲の親和性を有する。親和性成熟抗体はアラニンスキャンによって（Tiller KE et al; Front.Immunol., 04 September 2017 https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00986）または当技術分野で公知の他の手順 （参照、例えばTabasinezhada M. et al; Immunology Letters Volume 212, August 2019, Pages 106-113; 1.Georgiev, I. S. et al. J Immunol 192, 1100－1106 (2014))によって産生することができる。
【0133】
本明細書で使用する場合、「アゴニスト」および「アゴニスティック」という用語は、直接的または間接的に、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の生物学的活性または活性化を実質的に誘導、促進、または増強する（γδＴＣＲに対する免疫学的シナプスの形成を促進することによって）ことが可能な分子を指すか、または記述する。任意で、「アゴニストＣＤ２７７抗体」とは、ＣＤ２７７の結合および活性化により、上記のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を達成する活性を有する抗体である。好ましくは、アゴニストはヒトおよびカニクイザルＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を活性化できる分子である。さらに好ましくは、アゴニストはＣＤ２７７に対する抗体であり、当該抗体は抗体２０．１よりも５倍低いアゴニスト活性を有する。このような抗体のアゴニスト活性は、実施例６に記載したアッセイで決定することができる。
【0134】
「腫瘍抗原に対する特異的結合」とは、その結合が腫瘍抗原に対して選択的であり、不要または非特異的な相互作用から識別できることを意味する。本発明による二重特異性抗体（または第２の結合部分）が特定の腫瘍抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または当業者に周知の他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析）（Liljeblad et al, Glyco J 17, 323-329 (2000)）、および従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定される腫瘍抗原への本発明による二重特異性抗体（または第２の結合部分）の結合の約１０％未満である。
【0135】
本明細書において、本発明による「ＣＤ２７７に特異的に結合するアゴニスト抗体」という用語は、そのような抗体がＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化することを意味する。一実施形態では、無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定される腫瘍抗原への本発明による二重特異性抗体（または第２の結合部分）の結合の約１０％未満である。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、実施例６に記載されるような細胞溶解アッセイにおいて、前記それぞれの腫瘍抗原を有する腫瘍細胞の非存在下で、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を、５ｎＭ以下、一実施形態では２０ｎＭ以下の濃度で活性化しない。
【0136】
本明細書において「腫瘍抗原ノックアウト細胞株またはノックアウト細胞株」とは、それぞれの腫瘍抗原を野生型バージョンで保有し、それぞれの腫瘍抗原遺伝子が不活性化された腫瘍細胞株を指す。本発明によれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、前記遺伝子の遺伝子変異体を導入し、前記抗原発現を不活性化することができる。
【0137】
「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む、腫瘍細胞の表面に提示される抗原を意味する。好ましい実施形態では、腫瘍抗原はＣｌａｕｄｉｎ１８．２、ＦＯＬＲ１、ＳＴＥＡＰ、またはＤＬＬ３である。さらに有用な腫瘍抗原は、例えばMiddleburgら, Cancers (2021) 13, 287, pp 4-6に記載されている。ＦＯＬＲ１のような一部の腫瘍抗原は、葉酸 (Cheung et al., Oncotarget, 7 (32), 2016, pp 52553-32574) や治療用抗体(Paulos et al., Molecular Pharmacology, 66 (6), 2004, pp 1406-1414)のような天然のリガンドと結合した後に内在化する。
【0138】
したがって、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のリクルートに関する利用可能性が減少し、本発明による二重特異性抗体が共に内在化され、その逆で細胞表面のＣＤ２７７受容体が枯渇する可能性がある。このような場合、受容体は免疫細胞のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体と接触して免疫学的シナプスを形成することができなくなる。したがって、本発明によれば、本発明による二重特異性抗体は、それぞれの抗体の結合後に内在化されない腫瘍抗原に結合するか、または細胞表面での（共）内在化後に残存する腫瘍抗原およびＣＤ２７７レベルがＶｇ９Ｖｄ２ Ｔ細胞の活性化を誘発するのに十分な程度にのみ結合することが好ましい。
【0139】
好ましくは、本発明による腫瘍抗原は、抗原を有する腫瘍細胞および抗原陰性の細胞の両方を、それぞれの二重特異性抗体または参照抗体で８時間処理したものから選択される。次に、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を加え、実施例６に記載したように、表面に露出して活性化されたＣＤ２７７による腫瘍細胞溶解率を測定する。Ｅｍａｘ値は曲線フィッティングにより求め、二重特異性抗体対参照抗体のＥｍａｘ比を各細胞株についてそれぞれ算出する。抗原を有する腫瘍細胞上のＥｍａｘ比は、腫瘍抗原を有さない細胞上のＥｍａｘ比の半分以下であってはならず、腫瘍抗原の存在が、抗原を有する腫瘍細胞上の二重特異性抗体によるＣＤ２７７の共内在化による活性の５０％以上の喪失につながらないことを示している。
【0140】
本明細書で使用する場合、「Ｅｍａｘ」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、抗体またはその抗原結合部分の任意の濃度によって誘導される応答であって、最大応答であるものを指す。
【0141】
本明細書で使用する場合、「ＥＣ５０」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで反応を誘導する抗体またはその抗原結合部分の濃度を指し、これは最大反応の５０％、すなわち最大反応とベースラインの中間である。
【0142】
本明細書で使用する「ＫＤまたはＫＤ」という用語は、抗体と抗原との結合反応の平衡解離定数を意味する。
【0143】
本発明による抗体は組換え体によって産生される。したがって、本発明の一実施形態は、本発明による抗体をコードする核酸であり、さらなる実施形態は、本発明による抗体をコードする前記核酸を含む細胞である。組換え生産の方法は、当該技術分野において広く知られており、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質の発現と、それに続く抗体の単離、および通常薬学的に許容される純度までの精製を含む。本発明の抗体を宿主細胞で発現させるには、それぞれの修飾軽鎖および重鎖をコードする核酸を標準的な方法で発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、または大腸菌細胞のような適切な原核生物または真核生物の宿主細胞で行われ、抗体は細胞（溶解後の上清または細胞）から回収される。抗体の組換え生産のための一般的な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr.Purif.17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr.Purif.8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.の総説に記載されている。
【0144】
本発明による二重特異性抗体は、例えばプロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培養液から好適に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡとＲＮＡは、通常の手順で容易に単離され、塩基配列が決定される。
【0145】
本出願で使用する「宿主細胞」という用語は、本発明による抗体を生成するように操作できるあらゆる種類の細胞系を示す。一実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞とＣＨＯ細胞が宿主細胞として使用される。
【0146】
本発明の一態様は、本発明による抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む医薬組成物の製造方法である。別の態様において、本発明は、医薬担体とともに製剤化された、本発明による抗体を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【0147】
本発明の一実施形態は、癌（腫瘍疾患）の治療に使用するための本発明による二重特異性抗体である。
【0148】
本発明の別の態様は、癌の治療に使用するための医薬組成物である。
【0149】
本発明の別の態様は、癌の治療のための医薬の製造のための本発明による抗体の使用である。
【0150】
本発明の別の態様は、個体における癌の治療方法であって、本発明による二重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む方法である。
【0151】
本発明の別の態様は、本発明による抗体を含む医薬組成物である。
【0152】
本明細書で使用される「医薬担体」には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌・抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。
【0153】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変化する。特定の投与経路で本発明の化合物を投与するためには、化合物を不活性化を防ぐ物質でコーティングするか、または化合物を共投与することが必要な場合がある。例えば、化合物は、適切な担体、例えばリポソーム、希釈剤などに入れて対象に投与することができる。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水や水性緩衝液が含まれる。医薬担体には、無菌水溶液または分散液、および無菌注射液または分散液を即座に調製するための無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体の使用は、当技術分野で知られている。
【0154】
本明細書で使用される癌という用語は、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、消化器系癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、ホジキン病などの増殖性疾患を指す。
【0155】
ある態様では、前記癌（腫瘍疾患）は、結腸癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、および乳癌からなる群から選択される。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【表1-14】
【0156】
配列表には、各ＶＨまたはＶＬの後のそれぞれのＣＤＲが記載されている。いくつかのＶＨとＶＬは、１つ以上の同一のＣＤＲを含む：
配列番号２は４３、５９、６３、７１、１０９と同じ。
配列番号４は配列番号４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、１０７、１１１、１１５と同じ。
配列番号７は配列番号８０、８４、８８、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４と同じ。
配列番号８は配列番号１１９、８９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９と同じ。
配列番号４４は配列番号６４と同じ。
配列番号４７は単独配列。
配列番号５１は配列番号５４と同じ。
配列番号６７は単独配列。
配列番号７５は配列番号７９、８７と同じ。
配列番号１０５は配列番号１１３と同じ。
配列番号１３８は単独配列。
配列番号２は４３、５９、６３、７１、１０９と同じ。
配列番号４は配列番号４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、１０７、１１１、１１５と同じ。
配列番号７は配列番号８０、８４、８８、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４と同じ。
配列番号８は配列番号１１９、８９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９と同じ。
配列番号４４は配列番号６４と同じ。
配列番号４７は単独配列。
配列番号５１は配列番号５４と同じ。
配列番号６７は単独配列。
配列番号７５は配列番号７９、８７と同じ。
配列番号１０５は配列番号１１３と同じ。
配列番号１３８は単独配列。
【0157】
材料と方法
細胞培養、トランスフェクション、抗体産生、精製：ＣＨＯ－Ｓ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、コーニング社製三角フラスコ（１２５ｍｌ、コーニング社製）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、１２０ｒｐｍの一定振とうを行った。細胞は、１％（ｖ／ｖ） ＧｌｕｔａＭＡＸ １００ｘ と １％（ｖ／ｖ） ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００ｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＣＤ ＣＨＯ増殖培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。１日おきに、細胞を０．３ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に調整し、指数関数的増殖を維持した。トランスフェクションの１日前に、細胞を２ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で播種し、トランスフェクション当日に４ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの所望の密度になるようにした。トランスフェクションは、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸTM ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｕｎｉｔ（ＭａｘＣｙｔｅ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を使用して生産者の指示書に従って実施した。ＭａｘＣｙｔｅプロセッシングアセンブリーＯＣ－４００と、ＣＨＯ－Ｓ細胞でのタンパク質生産用に最適化されたトランスフェクションプロトコルを使用した。遠心分離により８×１０８細胞の総量を採取し、８×１０７個の細胞を１０等分した。４ｍｌのエレクトロポレーション（ＥＰ）バッファーで２回洗浄した後、細胞をＥＰバッファーに再懸濁し、８×１０７細胞／４００μｌの密度にした。重鎖：軽鎖の比率が１：１、または表面抗原発現用の単一ベクターで、合計３００μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡを添加した。エレクトロポレーション後、ＣＨＯ－Ｓ細胞を余分な緩衝液や培地を加えることなく培養フラスコに直接播種し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。トランスフェクション後の培養条件は、タンパク質産生と表面マーカーの一過性発現で異なっていた：
細胞培養、トランスフェクション、抗体産生、精製：ＣＨＯ－Ｓ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、コーニング社製三角フラスコ（１２５ｍｌ、コーニング社製）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、１２０ｒｐｍの一定振とうを行った。細胞は、１％（ｖ／ｖ） ＧｌｕｔａＭＡＸ １００ｘ と １％（ｖ／ｖ） ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００ｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＣＤ ＣＨＯ増殖培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。１日おきに、細胞を０．３ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度に調整し、指数関数的増殖を維持した。トランスフェクションの１日前に、細胞を２ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で播種し、トランスフェクション当日に４ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの所望の密度になるようにした。トランスフェクションは、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸTM ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｕｎｉｔ（ＭａｘＣｙｔｅ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を使用して生産者の指示書に従って実施した。ＭａｘＣｙｔｅプロセッシングアセンブリーＯＣ－４００と、ＣＨＯ－Ｓ細胞でのタンパク質生産用に最適化されたトランスフェクションプロトコルを使用した。遠心分離により８×１０８細胞の総量を採取し、８×１０７個の細胞を１０等分した。４ｍｌのエレクトロポレーション（ＥＰ）バッファーで２回洗浄した後、細胞をＥＰバッファーに再懸濁し、８×１０７細胞／４００μｌの密度にした。重鎖：軽鎖の比率が１：１、または表面抗原発現用の単一ベクターで、合計３００μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡを添加した。エレクトロポレーション後、ＣＨＯ－Ｓ細胞を余分な緩衝液や培地を加えることなく培養フラスコに直接播種し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。トランスフェクション後の培養条件は、タンパク質産生と表面マーカーの一過性発現で異なっていた：
【0158】
表面レセプター発現：細胞をＣＤ ＣＨＯ増殖培地で４８時間培養した後、ＦＡＣＳ分析に使用した。
【0159】
抗体産生：１５０ｍｌの生産培地を加えた（CD OptiCHOTM + 1 % (v/v) GlutaMAX 100x + 1 % (v/v) HT Supplement 100x + 1 % (v/v) PluronicTMF-68 100x, すべて Gibco（登録商標）/Thermo Fisher Scientific)。トランスフェクションの１日後、１ｍＭの酪酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific）を添加し、細胞に３．５％（ｖ／ｖ）のMaxCyte Feed Stock(28 ml Yeastolate Stock Solution 0.5 % + 140 ml CHO CD Efficient Feed A Stock Solution + 7 ml GlutaMAX 100x + 24.8 ml Glucose (450 g/l) Stock Solution, Gibco（登録商標）/Thermo Fisher Scientific）を与えた。残りの生産サイクル（１４日間または細胞生存率が５０％以下になるまで）は、培養温度を３２℃に下げた。生産期間中、細胞密度と生存率を１日おきに測定し、生産が停止されるまでＭａｘＣｙｔｅ Ｆｅｅｄ Ｓｔｏｃｋ（上記参照）を毎日細胞に与えた。遠心分離によって上清を回収し、細胞残屑を除去するために濾過した（最終容量は約２００ｍｌ）。第一段階として、CaptureSelectTMCH1 -XL (Hu) Affinity Matrix(Thermo Fisher Scientific）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行った。簡単に言うと、１ｍｌのビーズを加え、４℃で一晩かけてゆっくりと撹拌した。ビーズを１０ｍｌのＰＢＳで３回、グラビティフローカラムで洗浄した。タンパク質を５ｍｌの０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出し、直ちに１ｍｌのＴｒｉｓ／ＨＣＬ ｐＨ８．０を加えて中和した。溶出画分を２ｌのＰＢＳに対して４℃で合計３回透析した。次に、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、流速１ｍｌ／分でサイズ排除クロマトグラフィー(AKTA Pure 25, GE Healthcare Life Science)を行い（ＰＢＳ緩衝液）、単量体抗体を分離した。抗体調製物は標準的な手順でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ゲルはクマシーブルーで染色した。精製タンパク質のタンパク質濃度は、製造業者の条件に従ってＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で分析した。
【0160】
フローサイトメトリー：個々の染色反応には０．５ｘ１０６個の細胞を用いた。細胞を１ｍｌのＰＢＡ（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で１回洗浄する。細胞ペレットを、ＰＢＡで希釈した５０μｇ／ｍｌ濃度の精製組換えタンパク質５０μｌで再懸濁する。細胞を氷上で３０分間インキュベートする。細胞を１ｍｌのＰＢＡで２回洗浄する。その後、細胞ペレットを２５μｌの１：２０希釈抗ヒト－ＩｇＧＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｃａｔ ｎｏ．：１０９－０９６－０９８）に懸濁し、暗所にて氷上で３０分間インキュベートする。その後、細胞を１ｍｌのＰＢＡで２回洗浄する。細胞は最終的に５００μｌのＰＢＡに再懸濁され、直ちにＮａｖｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析される。
【実施例】
【0161】
実施例１二重特異性抗体のクローニング（図５）
二重特異性ＣＤ２７７抗体は以下の手順に従って作製される：
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ分子の産生用発現ベクターは、標準的手順により設計した (Kellner, CS.et al.; Methods Mol Biol, 2018.1827: p. 381-397)。ｐＳＥＣ－Ｔａｇ２－Ｈｙｇｒｏ－Ｃを哺乳類発現ベクター作製のバックボーンとして使用した。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ抗体誘導体は、Coloma, M.J. et al.; Nat Biotechnol, 1997. 15(2): p. 159-63によって最初に報告されたＩｇＧ－ｓｃＦｖのプロトタイプを基に、改良されたフォーマットで設計された。
二重特異性ＣＤ２７７抗体は以下の手順に従って作製される：
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ分子の産生用発現ベクターは、標準的手順により設計した (Kellner, CS.et al.; Methods Mol Biol, 2018.1827: p. 381-397)。ｐＳＥＣ－Ｔａｇ２－Ｈｙｇｒｏ－Ｃを哺乳類発現ベクター作製のバックボーンとして使用した。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ抗体誘導体は、Coloma, M.J. et al.; Nat Biotechnol, 1997. 15(2): p. 159-63によって最初に報告されたＩｇＧ－ｓｃＦｖのプロトタイプを基に、改良されたフォーマットで設計された。
【0162】
軽鎖：軽鎖の設計は、Kellner, CS.ら（上掲）の記述に従って実現した。軽鎖発現カセットのために、分泌リーダー配列（L1; Haryadi, RS. et al; PLoS One, 2015.10(2): p. e0116878）をＶＬ－領域の５´末端に付加した。ヒトＣ－ｋａｐｐａ領域を３´末端で融合し、完全なｋａｐｐａ軽鎖コード配列を形成した。翻訳の最適な開始を可能にするため、開始コドンの上流に最小限のＫｏｚａｋ配列を加えた。５´末端と３´末端にそれぞれＮｈｅＩとＰｍｅＩの制限部位を導入した。ベクターバックボーンへのクローニングは標準的な手順に従って行った。
【0163】
重鎖誘導体：重鎖誘導体は、Ｆｃレセプター相互作用を防ぐために、下部ヒンジ領域にＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸交換を有するＩｇＧ１重鎖をコードしている（Lund, JG. et al.; J Immunol, 1991.147(8): p. 2657-62)。ＶＨ領域の５´末端に重鎖分泌リーダーを付加した（H7; Haryadi, RS. et al; PLoS One, 2015.10(2): p. e0116878）。開始コドンの上流に最小限のＫｏｚａｋ配列を付加し、最適な翻訳開始を可能にした。ＩｇＧ重鎖の停止コドンを除去し、１５アミノ酸のフレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）３（配列番号９７）をコードする配列を導入した。ＤＮＡレベルのフレキシブル・リンカー（ＧＳ）の最後の２つのコドンは、ＢａｍＨＩ制限部位に続いてＰｍｅＩ制限部位を持つ。それぞれのｓｃＦｖ断片は、ＢａｍＨＩ－ＰｍｅＩクローニングカセットとしてＶＬ－（Ｇ４Ｓ）４－ＶＨフォーマットでデザインされた。最終的な発現構築物のクローニングは、標準的な手順に従って行った。
重鎖誘導体では、アミノ酸組成に影響を与えない追加的な制限部位を導入し、モジュール設計と分子の特定部分の交換を可能にした：
ＮｈｅＩ－ＰｐｕＭＩ：ＶＨ領域の交換。
ＰｐｕＭＩ－ＢｓｒＧＩ：ＣＨ２ドメインにおけるサイレンシング変異の交換。
ＢｓｒＧＩ－ＢａｍＨＩ：リンカー配列の交換。
ＢａｍＨＩ－ＰｍｅＩ：ｓｃＦｖ断片の交換。
重鎖誘導体では、アミノ酸組成に影響を与えない追加的な制限部位を導入し、モジュール設計と分子の特定部分の交換を可能にした：
ＮｈｅＩ－ＰｐｕＭＩ：ＶＨ領域の交換。
ＰｐｕＭＩ－ＢｓｒＧＩ：ＣＨ２ドメインにおけるサイレンシング変異の交換。
ＢｓｒＧＩ－ＢａｍＨＩ：リンカー配列の交換。
ＢａｍＨＩ－ＰｍｅＩ：ｓｃＦｖ断片の交換。
【表2-1】
【0164】
【表2-2】
【0165】
【表2-3】
【0166】
実施例２：ヒト化二重特異性抗体の作製
抗体の親和性成熟は、免疫反応において段階的に進行する。生殖細胞系列と比較してＣＤＲ領域にさらなる変異を蓄積し、厳格な選択過程を経ることにより、１９８８年にＲａｊｅｗｓｋｙと共同研究者らによって記載されたように(Allen, D., et al.; EMBO J, 1988. 7(7): p. 1995-2001., Kocks, C. and K. Rajewsky, Proc Natl Acad Sci U S A, 1988. 85(21): p. 8206-10.)抗体親和性は段階的に増加する可能性がある。したがって、軽鎖および重鎖可変領域内の生殖細胞系列の構成を段階的に復元することにより、本発明のヒト化抗体を作製することができる。
抗体の親和性成熟は、免疫反応において段階的に進行する。生殖細胞系列と比較してＣＤＲ領域にさらなる変異を蓄積し、厳格な選択過程を経ることにより、１９８８年にＲａｊｅｗｓｋｙと共同研究者らによって記載されたように(Allen, D., et al.; EMBO J, 1988. 7(7): p. 1995-2001., Kocks, C. and K. Rajewsky, Proc Natl Acad Sci U S A, 1988. 85(21): p. 8206-10.)抗体親和性は段階的に増加する可能性がある。したがって、軽鎖および重鎖可変領域内の生殖細胞系列の構成を段階的に復元することにより、本発明のヒト化抗体を作製することができる。
【0167】
ヒト化の方法
マウスモノクローナル抗体のヒト化は、標準的なＣＤＲグラフト技術を用いて行われた。この方法の原理は、マウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むヒト抗体を再形成することで、ヒトで治療薬として使用する際の免疫原性を低減することを目的としている。ＣＤＲグラフトによるヒト化では、マウス抗体の抗原結合残基をヒト化抗体にも保持する必要があるため、これらの残基の同定がプロトコールにおいて重要な役割を果たすことは明らかである。ヒト化プロセスを導き、親であるマウスの残基を保存するか、ヒト生殖細胞系列の残基で置換するかを決定するために、ＢＴＮ３Ａ１を抗原とするマウスモノクローナル抗体ｓｃＦｖの４Ｆ９Ｌ Ｘ線構造が用いられた。
マウスモノクローナル抗体のヒト化は、標準的なＣＤＲグラフト技術を用いて行われた。この方法の原理は、マウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むヒト抗体を再形成することで、ヒトで治療薬として使用する際の免疫原性を低減することを目的としている。ＣＤＲグラフトによるヒト化では、マウス抗体の抗原結合残基をヒト化抗体にも保持する必要があるため、これらの残基の同定がプロトコールにおいて重要な役割を果たすことは明らかである。ヒト化プロセスを導き、親であるマウスの残基を保存するか、ヒト生殖細胞系列の残基で置換するかを決定するために、ＢＴＮ３Ａ１を抗原とするマウスモノクローナル抗体ｓｃＦｖの４Ｆ９Ｌ Ｘ線構造が用いられた。
【0168】
使用されたＣＤＲ移植プロトコールは、英国ケンブリッジにあるMedical Research CouncilのGreg Winter氏らによって開拓されたアプローチを現代風にアレンジしたものである。ＣＤＲの定義はカバット命名法に基づいている。マウスモノクローナル抗体マウスＣＤＲ領域が移植されるヒトフレームワークアクセプター領域の選択は、免疫グロブリンＶ領域配列の解析を容易にするためにＮＣＢＩで開発されたIgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)を用いて、ＩＭＧＴマウスおよびヒトＶ遺伝子データベースを、マウスモノクローナル抗体マウス可変領域配列を入力として検索することによって達成された。適用される戦略は、個々のヒト抗体配列に見られる特異的な体細胞変異を含まない天然のヒト生殖細胞系列配列を使用することである。
【0169】
軽鎖のバックミューテーション：親抗体の第１の結合部分から軽鎖の可変領域をマウスの生殖細胞系列レパートリー（ＩＭＧＴデータベース）と比較し、最も近い相同性を示す生殖細胞系列遺伝子を同定した。これにより、ＩＧＫＶ１５－１０３＊０１とＩＧＫＪ２＊０１［Ｆ］遺伝子が同定され、親ＶＬ領域にアライメントされた。生殖細胞系列とは異なる６つのアミノ酸残基が同定された。親抗体の結晶構造中に同定された残基を図示することにより、表面に露出し、抗原相互作用に直接寄与すると考えられるアミノ酸残基が同定された。個々のアミノ酸またはアミノ酸のクラスターを生殖細胞配置に変換し、発現構築物の生成に使用した。
【0170】
重鎖のバックミューテーション：同様の戦略を、重鎖可変領域の潜在的なアミノ酸位置を特定するために適用した。ＩＧＨＶ１Ｓ８１＊０２［Ｆ］ｖ－遺伝子が最も近い一致遺伝子として同定された。ＣＤＲ３領域は高度に変異しているようで、対応する遺伝子セグメントの同定が困難であったため、ＤおよびＪセグメントは同定されなかった。ＶＬ領域を生殖細胞系列にリセットするために適用された戦略と同様に、重鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域の変異は、段階的に生殖細胞系列の構成に戻された（単一変異またはクラスター）。ＣＤＲ３の残基を同定するためには、生殖細胞系列の遺伝子セグメントを同定することができなかったため、別の戦略が適用された。ここで、ＣＤＲ３領域の表面露出残基は、２０．１とＢＮＴ３Ａ残基の共結晶構造の解析により同定された（Payne, KK et al.; Science, 2020.369(6506): p. 942-949）。これらの残基のうち３つは潜在的な接触残基として記載されており（Payne, KK et al.;上掲）、したがってアラニンに変換された。アラニン交換が選択されたのは、アラニンスキャニングが抗体／抗原相互作用を破壊することによってエピトープ結合に重要な残基を同定することが報告されているからである（Parhami-Seren, BM. et al; J Immunol, 2001.167(9): p. 5129-35）。個々のアミノ酸またはアミノ酸のクラスターを生殖細胞配置に変換し、発現構築物の生成に使用した。
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【0171】
本発明による二重特異性抗体の重および軽可変鎖セットは、表の１行の２つの鎖として定義される。「Ｒ１６２Ｓ」とは、位置１６２のアミノ酸Ｒがアミノ酸Ｓで置換されていることを意味し、「Ｎ１８５Ｓ」とは、位置１８５のアスパラギンがセリンで置換されていることを意味する。Ｎ１８５ＳとＫ１９０Ｎは太字で、配列番号４４には下線が引かれている。Ｌ３１Ｖは太字で、配列番号７５には下線が引かれている。可変鎖の他のアミノ酸のカウントは、Ｎ１８５とＬ３１から始めることができる。
【0172】
実施例３：活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞株の作製と特徴づけ。
拡大γδＴ細胞株を作製するために、健康な成人血液ドナーの白血球濃縮液（ＬＲＳ）から１０６細胞／ｍＬを、５０ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加した完全培地中、６ウェルプレートで培養し、Ｖγ９Ｖδ２発現γδＴ細胞の選択的な伸長を誘導する２．５μＭアミノビスホスホネート（ｎ－ＢＰ）ゾレドロン酸（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）で刺激した。安静時、最初に刺激されたγδＴ細胞はごく少量のＩＬ－２しか産生しないため、５０ＩＵ／ｍＬ（１５ｐｇ／ｍＬ）のｒＩＬ２を１日おきに添加した（Ｏｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１４）。２週間後、９４％以上の純度でＶδ２鎖を発現するγδＴ細胞の選択的拡大が観察された。Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ２５の発現がわずかに亢進し(Pechhold et al. J Immunol Baltim Md 1950 152, 4984-92 (1994))、活性化マーカーＣＤ６９の発現が強く亢進することで示された。さらに、増加したＶδ２ Ｔ細胞集団は、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＡ－）またはエフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ２７－ ＣＤ４５ＲＡ－）の表現型を示し、これらの拡大したγδＴ細胞の活性化を示した。
拡大γδＴ細胞株を作製するために、健康な成人血液ドナーの白血球濃縮液（ＬＲＳ）から１０６細胞／ｍＬを、５０ＩＵ／ｍＬ ｒＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加した完全培地中、６ウェルプレートで培養し、Ｖγ９Ｖδ２発現γδＴ細胞の選択的な伸長を誘導する２．５μＭアミノビスホスホネート（ｎ－ＢＰ）ゾレドロン酸（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）で刺激した。安静時、最初に刺激されたγδＴ細胞はごく少量のＩＬ－２しか産生しないため、５０ＩＵ／ｍＬ（１５ｐｇ／ｍＬ）のｒＩＬ２を１日おきに添加した（Ｏｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１４）。２週間後、９４％以上の純度でＶδ２鎖を発現するγδＴ細胞の選択的拡大が観察された。Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ２５の発現がわずかに亢進し(Pechhold et al. J Immunol Baltim Md 1950 152, 4984-92 (1994))、活性化マーカーＣＤ６９の発現が強く亢進することで示された。さらに、増加したＶδ２ Ｔ細胞集団は、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＡ－）またはエフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ２７－ ＣＤ４５ＲＡ－）の表現型を示し、これらの拡大したγδＴ細胞の活性化を示した。
【0173】
実施例４：腫瘍細胞株の選択
多様な抗体コンストラクトを試験するために、それぞれの腫瘍抗原を発現する異なる腫瘍細胞株のパネルが、抗原発現レベルに関する公表情報またはＦＡＣＳ分析に基づいて選択された。簡単に説明すると、表面染色のために、３～５ｘ１０５個の細胞を洗浄バッファー（１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で２回洗浄した。その後、製造元に概説された手順に従って、フルオロクロム結合抗体または非結合抗体、アイソタイプコントロールで２５分間染色し、２回洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液中の１％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で再懸濁するか、２段階目の抗体で染色した。二段階目の抗体でインキュベートした後、細胞を２回洗浄し、１％ＰＦＡ緩衝液に再懸濁した。全サンプルはＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、Ｄｉｖａ ９およびＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。文献とＦＡＣＳ解析の結果を表４にまとめた。
多様な抗体コンストラクトを試験するために、それぞれの腫瘍抗原を発現する異なる腫瘍細胞株のパネルが、抗原発現レベルに関する公表情報またはＦＡＣＳ分析に基づいて選択された。簡単に説明すると、表面染色のために、３～５ｘ１０５個の細胞を洗浄バッファー（１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で２回洗浄した。その後、製造元に概説された手順に従って、フルオロクロム結合抗体または非結合抗体、アイソタイプコントロールで２５分間染色し、２回洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液中の１％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で再懸濁するか、２段階目の抗体で染色した。二段階目の抗体でインキュベートした後、細胞を２回洗浄し、１％ＰＦＡ緩衝液に再懸濁した。全サンプルはＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、Ｄｉｖａ ９およびＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。文献とＦＡＣＳ解析の結果を表４にまとめた。
【表4】
【0174】
実施例５：ノックアウト腫瘍細胞株の作製
ＲＮＰトランスフェクションによる腫瘍抗原ＫＯ細胞の作製：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、それぞれのｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを等モル濃度（１００μＭ）で組み合わせ、９５℃で５分間アニーリングし、室温で再アニーティングすることで調製した。その後、ｇＲＮＡと組換え Ｓ．ｐ． Ｃａｓ９タンパク質をＰＢＳ中で結合させ、室温で１５分間インキュベートすることにより、ＲＮＰを調製した 。ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ Ｋｉｔ Ｓ （Ｌｏｎｚａ； ＃ Ｖ４ＸＣ－２０３２）と４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ ｕｎｉｔ （Ｌｏｎｚａ）を用いて、製造者の説明書とプログラムＦＥ－１３２に従って、ＲＮＰを親細胞にエレクトロポレーションした。モノクローナル細胞はその後、ＦＡＣＳソーティング（ＢＤ Ａｒｉａ）によって作製され、拡大され、フローサイトメトリー染色とアンプリコンシークエンシング（ＮＧＳ）によって検証された。
ＲＮＰトランスフェクションによる腫瘍抗原ＫＯ細胞の作製：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、それぞれのｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを等モル濃度（１００μＭ）で組み合わせ、９５℃で５分間アニーリングし、室温で再アニーティングすることで調製した。その後、ｇＲＮＡと組換え Ｓ．ｐ． Ｃａｓ９タンパク質をＰＢＳ中で結合させ、室温で１５分間インキュベートすることにより、ＲＮＰを調製した 。ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ Ｋｉｔ Ｓ （Ｌｏｎｚａ； ＃ Ｖ４ＸＣ－２０３２）と４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ ｕｎｉｔ （Ｌｏｎｚａ）を用いて、製造者の説明書とプログラムＦＥ－１３２に従って、ＲＮＰを親細胞にエレクトロポレーションした。モノクローナル細胞はその後、ＦＡＣＳソーティング（ＢＤ Ａｒｉａ）によって作製され、拡大され、フローサイトメトリー染色とアンプリコンシークエンシング（ＮＧＳ）によって検証された。
【0175】
レンチウイルストランスフェクションによる腫瘍抗原ＫＯ細胞の作製：親細胞をまずＣａｓ９－ｐ２Ａ－Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ－レンチウイルスで形質転換し、Ｃａｓ９の安定発現を達成するためにＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎで選択した。その後、それぞれのガイドＲＮＡをＣＲＯＰ－ｓｅｑ－Ｇｕｉｄｅ－Ｐｕｒｏプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃ ８６７０８）にクローニングし、レンチウイルスを作製した。その後、ブラスチジンで選択したＣａｓ－９発現細胞を前記レンチウイルスで形質転換し、細胞をピューロマイシンで選択し、拡大し、フローサイトメトリー染色とアンプリコン・シークエンシング（ＮＧＳ）で検証した。コントロールとして、ノンターゲット ガイドＲＮＡ（「ｓｇＮＴ」）を用いて同じトランスフェクションプロトコルを適用し 、それぞれのｓｇＮＴ細胞株を作製した。ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞の作製に適したガイドＲＮＡ配列は配列番号９６である。
【0176】
実施例６：細胞溶解アッセイ
ＯＶＣＡＲ－３（卵巣癌）、ＮＣＩ－Ｈ１６９３（ＮＳＣＬＣ）、またはＵＭ－ＵＣ－３（膀胱癌）などの腫瘍細胞株に対する細胞傷害性は、他（Ｏｂｅｒｇら、２０１４年および２０２０年）に記載されているように、三重複でＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＴＣＡ， Ｘ－Ｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ， ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて測定した。簡単に説明すると、完全培地ＲＰＭＩ １６４０（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１０％のウシ胎仔血清を補充）に７．５～１０×１０３個の付着性腫瘍細胞／ウェルを９６ウェルマイクロＥ－プレートに加え、５分ごとに電子センサーで腫瘍細胞のインピーダンスを最大２４～４０時間モニターした。測定された腫瘍細胞のインピーダンスは、セルインデックス（「ＣＩ」）と呼ばれる任意の単位で表され、形態学的変化（付着、拡散など）、細胞増殖、細胞溶解などの細胞パラメーターの変化を反映する。異なるウェルにおける腫瘍細胞の初期接着はわずかに異なることがあるため、腫瘍癌細胞が直線成長期に達した後、ＣＩを１に正規化することができる。２４～４０時間後に直線的増殖速度に達した時点で、Ｅ／Ｔ比５：１の活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球、および１２．５ＩＵ／ｍＬのｒＩＬ－２、および指示濃度の各種抗体構築物、または各種対照を含む培地を添加した（「実験開始」、ｔ＝０ｈ）。対照として、腫瘍細胞を最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で数ウェル処理し、完全溶解の陽性対照とし、他の数ウェルでは活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球（上記と同じ条件）で処理し、バックグラウンド溶解の対照とした。接着した腫瘍細胞の溶解は、異なるタイムポイントで少なくとも３分間、正規化ＣＩを測定することによってモニターされた。
ＯＶＣＡＲ－３（卵巣癌）、ＮＣＩ－Ｈ１６９３（ＮＳＣＬＣ）、またはＵＭ－ＵＣ－３（膀胱癌）などの腫瘍細胞株に対する細胞傷害性は、他（Ｏｂｅｒｇら、２０１４年および２０２０年）に記載されているように、三重複でＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＴＣＡ， Ｘ－Ｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ， ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて測定した。簡単に説明すると、完全培地ＲＰＭＩ １６４０（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１０％のウシ胎仔血清を補充）に７．５～１０×１０３個の付着性腫瘍細胞／ウェルを９６ウェルマイクロＥ－プレートに加え、５分ごとに電子センサーで腫瘍細胞のインピーダンスを最大２４～４０時間モニターした。測定された腫瘍細胞のインピーダンスは、セルインデックス（「ＣＩ」）と呼ばれる任意の単位で表され、形態学的変化（付着、拡散など）、細胞増殖、細胞溶解などの細胞パラメーターの変化を反映する。異なるウェルにおける腫瘍細胞の初期接着はわずかに異なることがあるため、腫瘍癌細胞が直線成長期に達した後、ＣＩを１に正規化することができる。２４～４０時間後に直線的増殖速度に達した時点で、Ｅ／Ｔ比５：１の活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球、および１２．５ＩＵ／ｍＬのｒＩＬ－２、および指示濃度の各種抗体構築物、または各種対照を含む培地を添加した（「実験開始」、ｔ＝０ｈ）。対照として、腫瘍細胞を最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で数ウェル処理し、完全溶解の陽性対照とし、他の数ウェルでは活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球（上記と同じ条件）で処理し、バックグラウンド溶解の対照とした。接着した腫瘍細胞の溶解は、異なるタイムポイントで少なくとも３分間、正規化ＣＩを測定することによってモニターされた。
【0177】
ＲＴＣＡソフトウェア（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、生データファイルをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍにエクスポートし、さらなる評価を行った。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００サンプルおよび抗体無添加のＶγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の平均ＣＩは、実験開始後の指示された時点で計算され、それぞれ完全溶解（「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００」）およびバックグラウンド溶解（「培地対照」）と定義された。抗体構築物によって誘導された腫瘍細胞溶解は、腫瘍細胞と同じ時点（「ｔｘ」）で各サンプルについて計算した：
溶解（ｔｘ）＝（ＣＩ（ｔｘ）－培地対照（ｔｘ））／（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００－培地対照（ｔｘ））＊１００
曲線フィッティングは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用い、シグモイド用量反応関数を用いて行い、参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（ｔｘ）のベストフィット値（Ｔｏｐ値）を得た。参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（「Ｔｏｐ」）に対する腫瘍細胞溶解率％は、以下の式で算出した：
腫瘍細胞溶解率（ｔｘ）＝腫瘍細胞溶解率（ｔｘ）／Ｔｏｐ＊１００
Oberg, H.H.; et al.; Front.Immunol.2014, 5, 643 および Oberg, H.H.; et al.; Methods Enzymol.2020, 631, 429-441.
結果を図４、６、８に示す。
溶解（ｔｘ）＝（ＣＩ（ｔｘ）－培地対照（ｔｘ））／（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００－培地対照（ｔｘ））＊１００
曲線フィッティングは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用い、シグモイド用量反応関数を用いて行い、参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（ｔｘ）のベストフィット値（Ｔｏｐ値）を得た。参照抗体で達成された最大腫瘍細胞溶解（「Ｔｏｐ」）に対する腫瘍細胞溶解率％は、以下の式で算出した：
腫瘍細胞溶解率（ｔｘ）＝腫瘍細胞溶解率（ｔｘ）／Ｔｏｐ＊１００
Oberg, H.H.; et al.; Front.Immunol.2014, 5, 643 および Oberg, H.H.; et al.; Methods Enzymol.2020, 631, 429-441.
結果を図４、６、８に示す。
【0178】
実施例７：ＳＰＲアッセイ
ＳＰＲアッセイは最新の技術に従って行われた。参照抗体の結果を表５に示す。つまり、組換えＣＤ２７７は、Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングキットのプロトコールに従って、共有結合ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによってＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５光センサーチップの表面に固定化された。抗体サンプルは連続希釈で分析対象として適用され、同一の標的分子表面に結合するすべての抗体を標準化して比較することができる。速度論的分析データは、１：１ラングミュア曲線フィッティングモデルと平均ラングミュアオン速度、オフ速度、ＫＤ値に基づいている：表５参照。
ＳＰＲアッセイは最新の技術に従って行われた。参照抗体の結果を表５に示す。つまり、組換えＣＤ２７７は、Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングキットのプロトコールに従って、共有結合ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによってＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５光センサーチップの表面に固定化された。抗体サンプルは連続希釈で分析対象として適用され、同一の標的分子表面に結合するすべての抗体を標準化して比較することができる。速度論的分析データは、１：１ラングミュア曲線フィッティングモデルと平均ラングミュアオン速度、オフ速度、ＫＤ値に基づいている：表５参照。
【表5】
【0179】
実施例８：脱顆粒および細胞死アッセイ
原則：γδＴ細胞などの細胞傷害性Ｔ細胞は、分泌性リソソームにグランザイム、パーフォリン、グラニュライシンなどの細胞傷害性メディエーターを貯蔵する。ＬＡＭＰ－１（ＣＤ１０７ａ）やＬＡＭＰ－２（ＣＤ１０７ｂ）などのリソソーム関連膜糖タンパク質（ＬＡＭＰ）は、分泌リソソームの脂質二重膜に埋め込まれている。Ｔ細胞の活性化後、分泌型リソソームは細胞膜に向かって移動し、細胞膜と融合することができる。融合後、ＬＡＭＰはＴ細胞の細胞表面に一過性に発現し、分泌性リソソームは顆粒内容物を脱顆粒する。
原則：γδＴ細胞などの細胞傷害性Ｔ細胞は、分泌性リソソームにグランザイム、パーフォリン、グラニュライシンなどの細胞傷害性メディエーターを貯蔵する。ＬＡＭＰ－１（ＣＤ１０７ａ）やＬＡＭＰ－２（ＣＤ１０７ｂ）などのリソソーム関連膜糖タンパク質（ＬＡＭＰ）は、分泌リソソームの脂質二重膜に埋め込まれている。Ｔ細胞の活性化後、分泌型リソソームは細胞膜に向かって移動し、細胞膜と融合することができる。融合後、ＬＡＭＰはＴ細胞の細胞表面に一過性に発現し、分泌性リソソームは顆粒内容物を脱顆粒する。
【0180】
方法：短期活性化γδＴ細胞は、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％子牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、通常の条件下（５％ ＣＯ２、加湿、３７℃）で培養した。１２．５Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を添加したγδＴ細胞を、培地、３００ｎＭピロリン酸ブロモヒドリン、異なる濃度のコンストラクト、またはコントロールコンストラクトＡＶ＃７５とともに、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ， Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）で６時間培養した。ＣＤ１０７アッセイには、０．５μｇ／ｍＬ ＰＥ標識抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂクローンＨ４Ａ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および０．５μｇ／ｍＬ ＰＥ標識抗ＣＤ１０７ｂ ｍＡｂクローンＨ４Ｂ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または適切なアイソタイプコントロールを９６ウェルマイクロタイタープレートに直接添加し、一方、３μＭの分泌阻害剤モネンシンを細胞培養の３時間後に添加した。さらに３時間後、γδＴ細胞を洗浄し、ＰｅｒＣＰ標識抗ＣＤ４５ ｍＡｂ（クローン２Ｄ１， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡｌｅｘａＦ７００標識抗ＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＳＫ７， Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ５１０標識抗ＣＤ８ ｍＡｂ（クローンＳＫ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ＴＣＲ γδ ｍＡｂ（クローン１１Ｆ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＡＰＣ－Ｖｉｏ７７０標識抗Ｖδ２（クローンＲＥＡ ７７１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を添加し、洗浄後、フローサイトメトリー（ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を分析する前に、ＰＢＳでＳＹＴＯＸTM Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（１：４０００， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＃ Ｓ３４８６０）を２０分かけて添加した。４つの異なるドナーのγδ Ｔ細胞についての結果を図９に示す。
【表6】
【表7-1】
【表7-2】
【図1A】
【図1B】
【図2A-B】
【図2C-D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】