2025-511152 Ｓｉｇｌｅｃ－７を標的とする二重特異性ナチュラルキラーエンゲージャー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-04-15

(54)【発明の名称】Ｓｉｇｌｅｃ－７を標的とする二重特異性ナチュラルキラーエンゲージャー

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20250408BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250408BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250408BHJP

   A61K 40/15 20250101ALI20250408BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250408BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20250408BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20250408BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250408BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20250408BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20250408BHJP

   A61K 40/33 20250101ALI20250408BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C12N15/13

C12N15/62 Z

A61K40/15

A61K35/17

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P37/04

A61K39/395 T

A61K39/39

A61K45/00

A61P43/00 121

A61P43/00 111

A61K48/00

A61P43/00 105

A61P37/06

A61P31/12

A61P31/04

A61K40/33

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024557970

(86)(22)【出願日】2023-03-31

(85)【翻訳文提出日】2024-11-26

(86)【国際出願番号】 US2023065217

(87)【国際公開番号】W WO2023192992

(87)【国際公開日】2023-10-05

(31)【優先権主張番号】63/325,887

(32)【優先日】2022-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/375,784

(32)【優先日】2022-09-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/490,156

(32)【優先日】2023-03-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516142001

【氏名又は名称】ザ ウィスター インスティテュート オブ アナトミー アンド バイオロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド ウェイナー

(72)【発明者】

【氏名】デビバシャ ボルドロイ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA23

4C084MA38

4C084MA41

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB081

4C084ZB082

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZC412

4C084ZC75

4C085AA14

4C085AA38

4C085BB01

4C085BB11

4C085CC03

4C085DD62

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4C085EE03

4C085EE06

4C085FF24

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB44

4C087BB65

4C087MA02

4C087MA23

4C087MA38

4C087MA41

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB08

4C087ZB09

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZC41

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045EA29

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ－７への結合を介してナチュラルキラー細胞を活性化するのに特異的なナチュラルキラーエンゲージャー、及びそれをコードする核酸分子、ならびにそれを使用して疾患若しくは障害を治療又は予防する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

目的の標的細胞に特異的に結合する抗体又はその断片に連結された、Ｓｉｇｌｅｃ７に特異的に結合する抗体又はその断片を含む、二重特異性ナチュラルキラー細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）。

【請求項2】

前記目的の標的細胞が腫瘍細胞である、請求項１に記載のＮＫＣＥ。

【請求項3】

腫瘍抗原に特異的に結合する抗体又はその断片に連結された、シアル酸結合受容体に特異的に結合する抗体又はその断片を含む、請求項２に記載のＮＫＣＥ。

【請求項4】

前記腫瘍抗原が卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）又はインターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）である、請求項２に記載のＮＫＣＥ。

【請求項5】

Ｓｉｇｌｅｃ７に特異的に結合する前記抗体又はその断片が、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＮＫＣＥ：
ａ）配列番号１～３、配列番号１７～１９、配列番号３３～３５、配列番号４９～５１、配列番号６５～６７、及び配列番号８１～８３からなる群から選択されるＣＤＲ配列を含む可変重鎖配列；
ｂ）配列番号９～１１、配列番号２５～２７、配列番号４１～４３、配列番号５７～５９、配列番号７３～７５、及び配列番号８９～９１からなる群から選択されるＣＤＲ配列を含む可変軽鎖配列；
ｃ）配列番号４、配列番号２０、配列番号３６、配列番号５２、配列番号６８、及び配列番号８４のうちの１つ又はそれ以上の可変重鎖配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｄ）配列番号１２、配列番号２８、配列番号４４、配列番号６０、配列番号７６、及び配列番号９２のうちの１つ又はそれ以上の可変軽鎖配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｅ）配列番号４、配列番号２０、配列番号３６、配列番号５２、配列番号６８、及び配列番号８４からなる群から選択される可変重鎖配列の全長配列の少なくとも８０％を含む断片；及び
ｆ）配列番号１２、配列番号２８、配列番号４４、配列番号６０、配列番号７６、及び配列番号９２からなる群から選択される可変軽鎖配列の全長配列の少なくとも８０％を含む断片。

【請求項6】

Ｓｉｇｌｅｃ７に特異的に結合する前記抗体又はその断片が、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＮＫＣＥ：
ａ）配列番号１～３のＣＤＲ配列を含む可変重鎖配列及び配列番号９～１１のＣＤＲ配列を含む可変軽鎖配列；
ｂ）配列番号１７～１９のＣＤＲ配列を含む可変重鎖配列及び配列番号２５～２７のＣＤＲ配列を含む可変軽鎖配列；
ｃ）配列番号３３～３５のＣＤＲ配列を含む可変重鎖配列及び配列番号４１～４３のＣＤＲ配列を含む可変軽鎖配列；
ｄ）配列番号４９～５１のＣＤＲ配列を含む可変重鎖配列及び配列番号５７～５９のＣＤＲ配列を含む可変軽鎖配列；
ｅ）配列番号６５～６７のＣＤＲ配列を含む可変重鎖配列及び配列番号７３～７５のＣＤＲ配列を含む可変軽鎖配列；及び
ｆ）配列番号８１～８３のＣＤＲ配列を含む可変重鎖配列及び配列番号８９～９１のＣＤＲ配列を含む可変軽鎖配列。

【請求項7】

配列番号９８、配列番号１００、及び配列番号１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＮＫＣＥ。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか１項に記載のＮＫＣＥを含む組成物。

【請求項9】

医薬的に許容し得る賦形剤及びアジュバントからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤をさらに含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項11】

前記ＮＫＣＥを含む送達ビヒクルを含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項12】

前記送達ビヒクルが脂質ナノ粒子である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

請求項１～７のいずれか１項に記載のＮＫＣＥ又はその断片をコードする１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を含む、核酸分子又は核酸分子の組み合わせ。

【請求項14】

前記核酸分子が以下を含む、請求項１３に記載の核酸分子：
ａ）可変重鎖配列をコードする配列番号５～７を含む第１のヌクレオチド配列、及び可変軽鎖配列をコードする配列番号１３～１５を含む第２のヌクレオチド配列；
ｂ）可変重鎖配列をコードする配列番号２１～２３を含む第１のヌクレオチド配列、及び可変軽鎖配列をコードする配列番号２９～３１を含む第２のヌクレオチド配列；
ｃ）可変重鎖配列をコードする配列番号３７～３９を含む第１のヌクレオチド配列、及び可変軽鎖配列をコードする配列番号４５～４７を含む第２のヌクレオチド配列；
ｄ）可変重鎖配列をコードする配列番号５３～５５を含む第１のヌクレオチド配列、及び可変軽鎖配列をコードする配列番号６１～６３を含む第２のヌクレオチド配列；
ｅ）可変重鎖配列をコードする配列番号６９～７１を含む第１のヌクレオチド配列、及び可変軽鎖配列をコードする配列番号７７～７９を含む第２のヌクレオチド配列；及び
ｆ）可変重鎖配列をコードする配列番号８５～８７を含む第１のヌクレオチド配列、及び可変軽鎖配列をコードする配列番号９３～９５を含む第２のヌクレオチド配列。

【請求項15】

前記ＮＫＣＥをコードする少なくとも２つの核酸分子の組み合わせを含む、請求項１３に記載の核酸分子。

【請求項16】

前記ＮＫＣＥをコードする４つの核酸分子の組み合わせを含む、請求項１３に記載の核酸分子。

【請求項17】

前記ＮＫＣＥをコードする単一の核酸分子を含む、請求項１３に記載の核酸分子。

【請求項18】

配列番号９８、配列番号１００、及び配列番号１０２からなる群から選択されるＮＫＣＥをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の核酸分子。

【請求項19】

前記核酸分子が配列番号９７、配列番号９９、及び配列番号１０１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の核酸分子。

【請求項20】

前記核酸分子が、ＲＮＡ分子とＤＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項21】

請求項１３～２０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組成物。

【請求項22】

ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記核酸分子を含む送達ビヒクルを含む、請求項２１記載の組成物。

【請求項24】

前記送達ビヒクルが脂質ナノ粒子である、請求項２３記載の組成物。

【請求項25】

医薬的に許容し得る賦形剤及びアジュバントからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の組成物

【請求項26】

それを必要とする被験体における疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載のＮＫＣＥ又は請求項８～１２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。

【請求項27】

請求項２６記載の方法であって、前記疾患又は障害が、細菌感染に関連する疾患又は障害、ウイルス感染に関連する疾患又は障害、自己免疫疾患又は障害、癌、又は癌に関連する疾患又は障害からなる群から選択される方法。

【請求項28】

請求項２７に記載の方法であって、前記癌が、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、精巣癌、皮膚癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される方法。

【請求項29】

それを必要とする被験体のナチュラルキラー細胞機能を上昇させる方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載のＮＫＣＥ又は請求項８～１２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。

【請求項30】

それを必要とする被験体の標的細胞又は粒子にナチュラルキラー細胞を誘導する方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載のＮＫＣＥ又は請求項８～１２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。

【請求項31】

請求項３０に記載の方法であって、前記標的細胞が、腫瘍細胞、病原体の細胞若しくは粒子、細菌細胞、ウイルス感染細胞、及び自己免疫疾患若しくは障害に関連する抗原を発現する細胞からなる群から選択される方法。

【請求項32】

請求項３１に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、精巣癌、皮膚癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される癌由来である方法。

【請求項33】

それを必要とする被験体における疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項２１～２５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。

【請求項34】

請求項３３に記載の方法であって、前記疾患若しくは障害が、細菌感染に関連する疾患若しくは障害、ウイルス感染に関連する疾患若しくは障害、自己免疫疾患若しくは障害、癌、又は癌に関連する疾患若しくは障害からなる群から選択される方法。

【請求項35】

請求項３４に記載の方法であって、前記癌が、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、精巣癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される方法。

【請求項36】

それを必要とする被験体においてナチュラルキラー細胞機能を上昇させる方法であって、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項２１～２５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。

【請求項37】

それを必要とする被験体の標的細胞又は粒子にナチュラルキラー細胞を誘導する方法であって、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項２１～２５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。

【請求項39】

請求項３８に記載の方法であって、前記標的細胞が、腫瘍細胞、病原体の細胞又は粒子、細菌細胞、ウイルス感染細胞、及び自己免疫疾患若しくは障害に関連する抗原を発現する細胞からなる群から選択される方法。

【請求項40】

請求項３８に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、精巣癌、皮膚癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される癌由来である方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２２年３月３１日に出願された米国仮出願第６３／３２５，８８７号、２０２２年９月１５日に出願された米国仮出願第６３／３７５，７８４号、及び２０２３年３月１４日に出願された米国仮出願第６３／４９０，１５６号に対する優先権を主張する。これらの出願は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

卵巣癌（ＯＣ）は、最も致命的な婦人科悪性腫瘍である。これは、女性の癌による死亡の５番目の主要な要因であり、女性生殖器系の癌による死亡数の最も多い原因である。アメリカ癌協会（American Cancer Society）によると、２０２１年に新たに卵巣癌と診断された女性は２１，４１０人、ＯＣが原因で死亡した女性は１３，７７０人と推定されている（Kurnit et al., 2021, Obstet Gynecol 137: 108-21; www_cancer_org）。ＯＣは非常に不均一な癌で、腫瘍の９０％が上皮由来である。上皮性卵巣癌（ＥＯＣ）の最も一般的なサブタイプは、症例の約７０～８０％を占める高悪性度漿液性癌である。一方、低悪性度漿液性（＜５％）、類内膜（１０％）、明細胞（１０％）、及び粘液性（３％）は、それほど一般的ではないサブタイプである（Barnes et al., 2021, Genome Med 13: 140）。

【0003】

手術と化学療法は、ＯＣの主要な治療法である（Yang et al., 2020, Front Immunol 11: 577869）。残念ながら、これらの治療法は部分的にしか成功しておらず、多くの患者が最初の治療後数年以内に化学療法抵抗性を発症し、こうして病気の再発に直面している（Yang et al., 2020, Front Immunol 11: 577869）。ＯＣの死亡率が高いのは、自覚症状や一次検出のための侵襲性の低い技術が乏しいことが原因であることが多いため、早期発見率が低いことにも関連している。そのため、ＯＣは依然として、改善された新しい治療法がkwnt必要な分野である（Banno et al., 2014, Biomed Res Int 2014: 232817）。卵巣腫瘍細胞と腫瘍微小環境の間には密接な相互作用があるため、腫瘍細胞を標的とするだけでなく、この微小環境で抗腫瘍機能を維持できる治療法の開発が重要である（CSSOCR, 2016）。研究が拡大している分野は、ＯＣに対する免疫ベースの治療法である。このような研究には、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）－工学作成Ｔ細胞が含まれる（Yang et al., 2020, Front Immunol 11: 577869）。特に、ＣＡＲ療法の開発における主な障害は、腫瘍細胞の表面に限定された特定の発現を有する標的を見つけることであり、腫瘍組織外の標的を見つけることではない（Perales-Puchalt et al., 2017, Clin Cancer Res 23: 441-53）。卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）は、卵巣顆粒膜細胞で選択的に発現し、卵巣内皮では低いレベルの発現が報告されているそのような標的の１つである。ＦＳＨＲは漿液性卵巣癌症例の５０～７０％で発現しており、免疫療法の重要な潜在的標的となっている（Perales-Puchalt et al., 2017, Clin Cancer Res 23: 441-53）。

【0004】

ｍＡｂは、特定の癌の診断、分類、治療、モニタリングにおける重要なツールである。例としては、乳癌の分類及び治療のための様々な形態の抗ＨＥＲ２抗体（Hayes et al., 2007, N Engl J Med 357: 1496-506; Pegram et al., 1998, J Clin Oncol 16: 2659-71）、リンパ腫の治療のための抗ＣＤ２０抗体（Maloney et al., 1997, Blood 90: 2188-95）、ＯＣの追跡調査のための抗ＣＡ１２５抗体（Bast et al., 1983, N Engl J Med 309: 883-7）、及び前立腺癌の検出のための抗ＰＳＡ抗体（Siddall et al., 1986, Clin Chem 32: 2040-3）が挙げられる。抗体治療の分野で最近重要な領域となっているのは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの研究である（Perales-Puchalt et al., 2019, Mol Ther 27: 314-25）。これらは、Ｔ細胞と腫瘍細胞の両方に同時に結合して、特定の腫瘍細胞に対するＴ細胞の細胞溶解機能を促進する能力を備えた新しいクラスの免疫療法である（Hipp et al., 2017, Leukemia 31: 2278）。

【0005】

ＯＣの場合、特に高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）や卵巣癌肉腫（ＯＣＳ）などの極めて悪性度の高い卵巣腫瘍では、治療の選択肢が限られている。これらの腫瘍は既存のＩＣＩ療法に対する反応が悪く、しばしば免疫学的に「冷たい」腫瘍と呼ばれる（Wu et al., 2021, Front Immunol 12: 672502）。従って、Ｔ細胞アプローチだけでは、困難なＯＣ症例の治療に十分な効果が得られない可能性がある。免疫系の追加のエフェクター成分を関与させることが重要になる場合がある。この点で、ＮＫなどの生来のメカニズムとＯＣ腫瘍の影響を関連付ける研究は限られており、ＯＣに対する特定の標的化方法は報告されていない（Hoogstad-van Evert et al., 2020, Gynecol Oncol 157: 810-6）。

【0006】

皮膚癌は、ヒトの癌の中で最も一般的で危険なものの１つである。そのさまざまなサブタイプの中でも、メラニン細胞から発生する黒色腫は特に深刻な疾患である。ＦＤＡが承認した新しい免疫療法である免疫チェックポイント阻害（ＣＰＩ）は、黒色腫の治療に革命をもたらし治療成績を改善した。しかし、黒色腫の４０～５０％は免疫学的に冷たく、Ｔ細胞浸潤が乏しく、ＣＰＩへの応答が乏しい傾向がある。このため、追加のアプローチが必要である。

【0007】

当該技術分野では、悪影響を最小限に抑えながら、癌、自己免疫疾患、及び感染症を効果的に治療できる免疫療法が依然として必要とされている。本発明は、この満たされていないニーズを満たすものである。

【発明の概要】

【0008】

１つの実施態様において、本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ－７に特異的に結合する抗体又はその断片と、抗原に特異的に結合する抗体又はその断片とを含む、二重特異性ナチュラルキラーエンゲージャー（ＮＫＣＥ）又はその断片を提供する。

【0009】

１つの実施態様において、抗原は腫瘍抗原である。１つの実施態様において、腫瘍抗原は、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）又はインターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ－１３Ｒアルファ２）である。

【0010】

１つの実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥのＳｉｇｌｅｃ－７結合アームは、配列番号１～３、配列番号１７～１９、配列番号３３～３５、配列番号４９～５１、配列番号６５～６７、又は配列番号８１～８３のＣＤＲ配列を含む可変重鎖配列を含む。

【0011】

１つの実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥのＳｉｇｌｅｃ－７結合アームは、配列番号９～１１、配列番号２５～２７、配列番号４１～４３、配列番号５７～５９、配列番号７３～７５、又は配列番号８９～９１のＣＤＲ配列を含む可変重鎖配列を含む。

【0012】

１つの実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥのＳｉｇｌｅｃ－７結合アームは、配列番号４、配列番号２０、配列番号３６、配列番号５２、配列番号６８、又は配列番号８４の可変重鎖配列を含む。

【0013】

１つの実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥのＳｉｇｌｅｃ－７結合アームは、配列番号１２、配列番号２８、配列番号４４、配列番号６０、配列番号７６、又は配列番号９２の可変軽鎖配列を含む。

【0014】

１つの実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥは、配列番号９８、配列番号１００、又は配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。

【0015】

１つの実施態様において、本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ－７に特異的に結合する抗体又はその断片と、抗原に特異的に結合する抗体又はその断片とを含む、二重特異性ナチュラルキラーエンゲージャー（ＮＫＣＥ）又はその断片をコードする核酸分子に関する。

【0016】

１つの実施態様において、核酸分子は、配列番号５～７、配列番号２１～２３、配列番号３７～３９、配列番号５３～５５、配列番号６９～７１、又は配列番号８５～８７の配列をコードする重鎖ＣＤＲを含む。１つの実施態様において、核酸分子は、配列番号１３～１５、配列番号２９～３１、配列番号４５～４７、配列番号６１～６３、配列番号７７～７９、又は配列番号９３～９５の配列をコードする軽鎖ＣＤＲを含む。

【0017】

１つの実施態様において、核酸分子は、配列番号８、配列番号２４、配列番号４０、配列番号５６、配列番号７２、若しくは配列番号８８の可変重鎖配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号１６、配列番号３２、配列番号４８、配列番号６４、配列番号８０、若しくは配列番号９６の可変軽鎖配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号８、配列番号２４、配列番号４０、配列番号５６、配列番号７２、若しくは配列番号８８の可変重鎖配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列；配列番号１６、配列番号３２、配列番号４８、配列番号６４、配列番号８０、若しくは配列番号９６の可変軽鎖配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列；配列番号８、配列番号２４、配列番号４０、配列番号５６、配列番号７２、若しくは配列番号８８の可変重鎖配列の全長配列の少なくとも８０％を含む断片；又は配列番号１６、配列番号３２、配列番号４８、配列番号６４、配列番号８０、若しくは配列番号９６の可変軽鎖配列の全長の少なくとも８０％を含む断片、又はこれらの組み合わせを含む。

【0018】

１つの実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥをコードする核酸分子は、配列番号９７、配列番号９９、又は配列番号１０１のヌクレオチド配列を含む。

【0019】

１つの実施態様において、本発明は、本発明の核酸分子を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体の疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。

【0020】

１つの実施態様において、疾患若しくは障害は、細菌感染症に関連する疾患若しくは障害、ウイルス感染症に関連する疾患若しくは障害、自己免疫疾患若しくは障害、癌、又は癌に関連する疾患若しくは障害からなる群から選択される。

【0021】

１つの実施態様において、癌は、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、精巣癌、皮膚癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される。

【0022】

１つの実施態様において、本発明は、本発明の核酸分子を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体のナチュラルキラー細胞機能を上昇させる方法を提供する。

【0023】

１つの実施態様において、本発明は、本発明の核酸分子を被験体に投与することを含む、ナチュラルキラー細胞を、それを必要とする被験体の標的細胞又は粒子に誘導する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A-1I】図１Ａ～図１Ｉは、抗ヒトＦＳＨＲ抗体の生成を示す一連の画像を示す。（図１Ａ）ＦＳＨＲ構造の描写。（図１Ｂ）ｐＢＭＮ－Ｉ－ＧＦＰ発現ベクターへのクローニング戦略。（図１Ｃ）マウス免疫計画。（図１Ｄ）異なる用量のＦＳＨホルモンに対するＫ５６２及びＫ５６２－ＦＳＨＲのｃＡＭＰ応答。（図１Ｅ）１μｇ／ｍｌのＦＳＨを使用してＫ５６２及びＫ５６２－ＦＳＨＲ細胞を刺激してから２０分後のホスホ－ホスホ－ｐ４４／４２（Ｅｒｋ１／２）及びｐ４４／４２（Ｅｒｋ１／２）のウエスタンブロット。分散分析。^＊＊＊ｐ＜０．００１。（図１Ｆ）ＤＤＡＰ（最も強力なダウン選択抗体クローン）で染色、又は一次抗体なしで二次ＡＰＣ標識抗体でl染色したＣａＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、及びＴＯＶ－２１Ｇのフローサイトメトリープロット。（図１Ｇ）ＴＯＶ－２１Ｇ親又はＦＳＨＲのクリスパーをＤＤＡＰで染色した後のフローサイトメトリープロット。（図１Ｈ）ＤＤＡＰで染色、又は一次抗体なしで二次ＡＰＣ標識抗体で染色したＫ５６２、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ、及びＫ５６２－ＬＨＣＧＲ２１Ｇのフローサイトメトリープロット。（図１Ｉ）ＤＤＡＰで染色したＡ２０（ＧＦＰ－）／Ａ２０－Ｆｈｓｒ（ＧＦＰ＋）及びＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａ対ＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａ－Ｆｓｈｒ細胞のフローサイトメトリープロット（両方の細胞株はマウスＦＳＨＲをトランスフェクションされた）。

【図2A-2I】図２Ａ～図２Ｉは、免疫組織化学及び免疫細胞化学で、ＤＤＡＰがＦＳＨＲに結合し、抗体依存性細胞毒性を誘発することを示す一連の画像である。（図２Ａ）ＤＤＡＰで染色したＫ５６２、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ、ＯＶＣＡＲ３、及びＴＯＶ－２１Ｇ細胞株由来の腫瘍の凍結切片の免疫組織化学画像。４０倍、スケールバー５０μｍ。（図２Ｂ）ヒトＦＳＨＲでトランスフェクションし、マウス抗ヒトＦＳＨＲ抗体又はＤＤＡＰ抗体で染色した後、二次抗マウスＩｇＧで染色した２９３Ｔ細胞の免疫蛍光画像。（図２Ｃ）マウスＦＳＨＲでトランスフェクションし、マウス抗マウスＦＳＨＲ抗体又はＤＤＡＰ抗体で染色した後、二次抗マウスＩｇＧで染色した２９３Ｔ細胞の免疫蛍光画像。（図２Ｄ）ｐＶａｘ１空ベクターでトランスフェクションし、ＤＤＡＰ抗体で染色した後、二次抗マウスＩｇＧで染色した２９３Ｔ細胞の免疫蛍光画像。Ｂ～Ｄ：スケールバー１０μｍ。（図２Ｅ）ＤＤＡＰ抗体で実施したアイソタイプＥＬＩＳＡの吸光度値。（図２Ｆ）Ｋ５６２－ＦＳＨＲに対するＤＤＡＰ又は無関係なマウスＩｇＧ２ａ（Ｃ１．１８．４）のＡＤＣＣによる細胞毒性。（図２Ｇ）Ｋ５６２に対するＤＤＡＰ又は無関係なマウスＩｇＧ２ａ（Ｃ１．１８．４）のＡＤＣＣによる細胞毒性。（図２Ｈ）ＯＶＣＡＲ３細胞に対するＤＤＡＰ又は無関係なマウスＩｇＧ２ａ（Ｃ１．１８．４）のＡＤＣＣによる細胞毒性。ｔ検定、分散分析。^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない。（図２Ｉ）異なる濃度（１０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ）のＤＤＡＰ抗ＦＳＨＲ抗体又は培地のみで、ＰＢＭＣとＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を共培養した結果得られたインビトロ細胞毒性。適度な用量依存性な殺傷が観察されたが、３１．２５ｎｇ／ｍｌでは殺菌効力は完全に失われた。

【図3A-3I】図３Ａ～図３Ｉは、ＦＳＨＲ ＴＣＥの生成、発現、及び抗腫瘍活性を示す一連の画像を示す。（図３Ａ）ＦＳＨＲとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関与するＴＣＥの図。ＧＳ、グリシン－セリン；ＶＨ、重鎖可変領域；ＶＬ、軽鎖可変領域。（図３Ｂ）ＤＤＡＰ－ＴＣＥをコードするＤＮＡ構築物の概略図。（図３Ｃ）Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした後のＤＤＡＰ－ＴＣＥ又はｐＶａｘ１空ベクターのインビトロ発現のウェスタンブロット。（図３Ｄ）ＤＤＡＰ－ＴＣＥの結合特異性は、ＦＳＨＲの自然発現を欠くＫ５６２細胞を使用して実証された。ＦＳＨＲを発現しないＫ５６２細胞では、ＤＤＡＰ－ＴＣＥの結合は観察されなかった。（図３Ｅ）ＦＳＨＲを過剰発現するＫ５６２細胞へのＤＤＡＰ－ＴＣＥの結合。（図３Ｆ）追加のＦＳＨＲ発現細胞ＣａＯＶ３を使用して証明されたＦＳＨＲへのＤＤＡＰ－ＴＣＥの結合。ｐＶａｘ１及び二次抗体単独と比較したＤＤＡＰ－ＴＣＥのピークのシフトは、それがＦＳＨＲに結合していることを示す。（図３Ｇ）ＦＳＨＲの過剰発現のためにＦＳＨＲをコードするｐＢＭＮ－Ｉ－ＧＦＰプラスミドを形質導入したＯＶＣＡＲ３細胞を使用して証明されたＦＳＨＲへのＤＤＡＰ－ＴＣＥの結合。空のベクター及び二次抗体単独の対照と比較して、ＦＳＨＲを過剰発現するＯＶＣＡＲ３細胞では、ピークの顕著なシフトがある。（図３Ｈ）ＤＤＡＰ－ＴＣＥ及び空ベクター対照による一次ヒトＴ細胞のフロー染色。（図３Ｉ）２つの異なる濃度（３１．２５ｎｇ／ｍｌ及び７．８１ｎｇ／ｍｌ）のインビトロで生成されたＤＤＡＰ－ＴＣＥ又は培地単独の存在下の、ＰＢＭＣ（エフェクター細胞、Ｅ）とＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞（標的細胞、Ｔ）の共培養から生じるインビトロ細胞毒性。ＤＤＡＰ－ＴＣＥによって誘発される非常に強力な殺傷が観察されたが、この濃度ではＦＳＨＲ抗体だけではＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞の殺傷を誘発できできなかったことは、設計されたＴＣＥの効力が強化されていることを示す。

【図4A-4L】図４Ａ～図４Ｌは、抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体クローンが標的卵巣癌細胞の特異的殺傷を誘発することを示す一連の画像を示す。非標的ヒト細胞、（図４Ａ及び図４Ｂ）Ａ５４９肺腺癌細胞、（図４Ｃ及び図４Ｄ）ＨａＣａＴヒトケラチン生成細胞、（図４Ｅ及び図４Ｆ）ＧＭＯ５３８９ヒト線維芽細胞］、並びに標的ヒト卵巣癌細胞、（図４Ｇ及び図４Ｈ）ＯＶＩＳＥ細胞、（図４Ｉ及び図４Ｊ）ＯＶＣＡＲ８細胞、（図４Ｋ及び図４Ｌ）ＳＫＯＶ３細胞における、ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７抗Ｓｉｇｌｅｃ７クローンの細胞毒性作用の評価。インビトロ細胞毒性は、Agilent Technologies, USA製のxCELLigenceリアルタイム細胞分析装置（ＲＴＣＡ）を使用してインピーダンスに基づいて測定した。電気伝導率は、xCELLigenceデバイスによって１５分ごとに単位のない細胞指数（ＣＩ）パラメータに変換され、画像は１時間間隔でキャプチャーされる。生成されたデータは、エフェクター（Ｅ）細胞（ＰＢＭＣ）と抗体が標的（Ｔ）細胞に添加された時点で正規化される（すべてＥ：Ｔ＝５：１）。データは、ＲＴＣＡ／ＲＴＣＡＰｒｏソフトウェアを使用して分析された。Ａ５４９、ＨａＣａＴ、及びＧＭＯ５３８９細胞では非特異的な殺傷は得られなかったが、ＯＶＩＳＥ、ＯＶＣＡＲ８、及びＳＫＯＶ３標的ＯＣ細胞では強力な殺傷が観察された。ＤＢ－Ｓ７－２の特異的殺傷作用が最も高いことがわかった。矢印は、抗体とエフェクター細胞が標的細胞に添加された時点を示す。示されている画像は、エフェクター細胞と抗体を添加してから３日後の死滅を示す。

【図5A-5J】図５Ａ～図５Ｊは、インビトロのヒトＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂの設計、発現、及び機能性を示すシリーズを示す。（図５Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂをコードする二重プラスミドＤＮＡ構築物の概略図。（図５Ｂ）Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現したＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂのウェスタンブロット分析。数字は分子量（ｋＤａ）を示す。（図５Ｃ）ヒトＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂをトランスフェクションしたＥｘｐｉ２９３Ｆ上清中のヒトＩｇＧの、ＥＬＩＳＡによる定量。（図５Ｄ及び図５Ｅ）ＯＶＣＡＲ８細胞、（図５Ｆ）ＴＯＶ－２１Ｇ細胞、（図５Ｇ）ＯＶＩＳＥ細胞、及び（図５Ｈ）ＰＥＯ－４細胞における完全ヒトＳｉｇｌｅｃ７組み換え抗体によって誘発されるインビトロ細胞毒性。すべての組み換え抗体は、ＢＲＣＡ２変異細胞及びＰＡＲＰｉ耐性ＰＥＯ－４細胞を含む前述のヒト卵巣癌細胞のパネルを効果的に殺傷した。ＤＢ－Ｓ７－２組み換え抗体は、最も高い殺傷作用を示すことが分かる。ＤＢ－Ｓ７－２の殺傷能力は、さらに２つの卵巣癌細胞［（図５Ｉ）ＣａＯＶ３細胞及び（図５Ｊ）ＯＶＣＡＲ３細胞］で確認された。矢印は、抗体とエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）が標的細胞に添加された時点を示す（Ｅ：Ｔ＝５：１）。（図５Ｄ）に示される画像は、ヒトＰＢＭＣと抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体を３日間添加した後のＯＶＣＡＲ８標的ＯＣ細胞の死滅を示す。

【図6A-6G】図６Ａ～図６Ｇは、Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂが体内で発現し、卵巣癌攻撃投与モデルで癌の進行を遅らせ、ＦｃγＲの阻害がＳｉｇｌｅｃ７を介するＮＫ細胞毒性を上昇させることを示す一連の画像を示す。（図６Ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウスへのヒトＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂ投与の概略図。マウスのＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を、最初に抗マウスＣＤ４抗体及び抗マウスＣＤ８抗体（両方ともInVivoMab製）を使用して枯渇させた。次に、マウスに５０μｇの重鎖＋５０μｇの軽鎖ヒトＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂを電気穿孔した。マウス血清を、示された時点で収集した。（図６Ｂ）ＤＮＡ注入及び電気穿孔の１４日後にＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７ＤＭＡｂで電気穿孔したマウス血清又は投薬未経験血清からのヒトＩｇＧのウエスタンブロット。（図６Ｃ）ＤＮＡ注入及び電気穿孔の１４日後に空ベクター、ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７ ＤＭＡｂで電気穿孔したマウス血清、又は投薬未経験血清を、無関係な抗体対照及び二次抗体対照のみとともに用いて、ヒトＮＫ細胞を染色。Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂで免疫したマウスの１４日目の血清は陽性で強いＮＫ細胞染色を示したが、空ベクター対照、無関係な抗体対照、又は投薬未経験血清の場合は染色は観察されなかった。（図６Ｄ）ＯＶＩＳＥＯＣ細胞を攻撃投与したＮＳＧマウスへのＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂ電気穿孔の概略図（図６Ｅ）。Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂ又は空ベクターで処理したＮＳＧマウスに移植されたＯＶＩＳＥ腫瘍の増殖曲線（１群あたりｎ＝５匹のマウス）。（図６Ｆ）Ｆｃブロックの存在下又は非存在下の、ＤＢ－Ｓ７－２ヒト抗体によるＯＶＣＡＲ３細胞の殺傷のxCELLigenceリアルタイム分析（図６Ｇ）。Ｆｃブロックにより、ＯＶＩＳＥ細胞におけるＳｉｇｌｅｃ７を介するＮＫ毒性が強化された。画像は、Ｆｃブロックの存在下又は非存在下の、ＯＶＩＳＥ細胞にエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ＝５：１）とＤＢ－Ｓ７－２抗体を添加した２日後にキャプチャーされた。

【図7A-7H】図７Ａ～図７Ｈは、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの生成と発現、及びＦＳＨＲ標的化二重特異性Ｔ細胞及びＮＫ細胞エンゲージャーのサイトカイン分泌プロフィールと特異性分析を示す一連の画像を示す。（図７Ａ）ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥをコードするＤＮＡ構築物の概略図。ＧＳ：グリシン－セリン、ＳｃＦＶ：単鎖可変断片。（図７Ｂ）ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした後のＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ又はｐＶａｘ１空ベクターのインビトロ発現のウェスタンブロット。（図７Ｃ）二次抗体のみ、ＤＤＡＰ－ＴＣＥ、市販のＳｉｇｌｅｃ７抗体、ＤＢ－Ｓ７－２抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体、及びＤＤＡＰ－ＮＫＣＥで染色したＳｉｇｌｅｃ７過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリープロット。（図７Ｄ）二次抗体のみ、非ＦＳＨＲ標的化ＴＣＥ（ＩＬ１３受容体アルファ２ｘＣＤ３）、及びＤＤＡＰ－ＮＫＣＥで染色したＦＳＨＲ過剰発現Ｋ５６２細胞のフローサイトメトリープロット。（図７Ｅ）Ｓｉｇｌｅｃ７を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＤＤＡＰ－ＮＫＣＥのＩＦＡ分析。二次抗体のみによる染色は陰性対照として機能した。固定細胞の高分解能共焦点画像は、Leica TCS SP8 WLL走査型レーザー共焦点顕微鏡とLeica LAS-Xソフトウェア（Leica Microsystems,Inc., BuffaloGrove, IL）を使用して取得した。画像の後処理には、デコンボリューション（deconvolution）用のHuygensソフトウェア（Scientific Volume Imaging, Laapersveld, Hilversum, The Netherlands）へのインポートが含まれていた。固定細胞調製物は、６３×／１．４０油浸対物レンズ、２倍ズーム、及び１ＡＵのピンホールを使用して取得した。細胞は、ＤＡＰＩ（核）、ＧＦＰ（Ｓｉｇｌｅｃ７）、テキサスレッド（ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ）で標識し、ＨｙＤ検出器で順番に取得し、シグナルを最大化し、クロストークを最小にした。スケールバーは２０．０ミクロンに相当する。（図７Ｆ）ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲとヒトＰＢＭＣＳの共培養におけるＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ存在下のサイトカイン（ｓＦａｓ及びグラニュライシン）の分泌プロフィール（Ｅ：Ｔ＝５：１）。サイトカイン分泌プロフィールの分析に使用した上清は、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を標的としてエフェクター細胞とＮＫＣＥを添加した４８時間後に収集した。２元配置分散分析；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（図７Ｇ）ＦＳＨＲ陰性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴ細胞及びＮＫ細胞エンゲージャーを標的とするＦＳＨＲの特異性分析。（図７Ｈ）エフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ；Ｅ：Ｔ＝５：１）及びＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ／ＤＤＡＰ－ＴＣＥを添加後３日間にわたってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に細胞毒性が誘発されていないことを示す画像。

【図8A-8J】図８Ａ～図８Ｊは、ＦＳＨＲ標的化二重特異性Ｔ細胞及びＮＫ細胞エンゲージャーがインビトロ及びインビボで卵巣癌の細胞毒性を誘発したことを示す一連の画像を示す。ＤＤＡＰ－ＴＣＥ／ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの存在下及び非存在下の、ＰＢＭＣと（図８Ａ及び図８Ｂ）ＯＶＩＳＥ細胞、（図８Ｃ及び図８Ｄ）ＣａＯＶ３細胞、（図８Ｅ）ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞、（図８Ｆ）ＰＥＯ－４細胞、及び（図８Ｇ）Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ－ＦＳＨＲ細胞の共培養から生じるインビトロ細胞毒性である。リアルタイムのインビトロ細胞毒性分析はxCELLigenceによって実施された。Ｅ：Ｔは１０：１（図８Ａ～図８Ｄ）及び５：１（図８Ｅ～図８Ｇ）である。示されている画像（図８Ｂ及び図８Ｄ）は、標的細胞にヒトＰＢＭＣ及び二重特異性抗体を添加の３日後にキャプチャーされたものである。（図８Ｈ）抗Ｆａｓ抗体の存在下及び非存在下のＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの殺傷効率の比較。抗Ｆａｓ抗体の存在下では、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥは標的ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞の殺傷を減少させた。赤線：Ｅ＋Ｔ（腫瘍細胞とエフェクター細胞としてのＰＢＭＣのみ）、灰色線：腫瘍細胞、ＰＢＭＣ、及び抗Ｆａｓ抗体、赤紫線：腫瘍細胞、ＰＢＭＣ、及びＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ、並びに紫線：抗Ｆａｓ抗体の存在下の腫瘍細胞、ＰＢＭＣ、及びＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ。（図８Ｉ）ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲを攻撃投与したＮＳＧマウスモデルにおける腫瘍進行に対する二重特異性抗体の効果を評価するための腫瘍試験の概略図。（図８Ｊ）ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ／ＤＤＡＰ－ＴＣＥ又は空ベクターで処理したＮＳＧマウスに移植されたＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ腫瘍の平均増殖曲線（１群あたりｎ＝５匹のマウス）。２元配置分散分析；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図9A-9D】図９Ａ～図９Ｄは、抗ヒトＦＳＨＲ抗体のスクリーニングを示す一連の画像を示す。（図９Ａ）Ｋ５６２及びＫ５６２－ＦＳＨＲを使用するスクリーニングプロセスにおける潜在的な結果を表すフローサイトメトリープロットの概略図。（図９Ｂ）ヒトＦＳＨＲ又は空ベクターで免疫したマウスの血清（１：１０００希釈）及び抗マウスＩｇＧ ＡＰＣで染色したＫ５６２（ＧＦＰ－）／Ｋ５６２－Ｆｈｓｒ（ＧＦＰ＋）細胞のフローサイトメトリープロット。（図９Ｃ）ハイブリドーマからのＦＳＨＲ結合抗体をＫ５６２－ＦＳＨＲ／Ｋ５６２のフロープロット及び平均蛍光強度の倍数として検出するためのフローサイトメトリースクリーニング出力戦略の代表例。（図９Ｄ）倍数ＭＦＩＫ５６２－ＦＳＨＲ／Ｋ５６２として測定されたハイブリドーマ上清のＦＳＨＲへの結合を示すウォーターフォールプロット（Waterfall plot）。最初のスクリーニング実験の後、上位２０クローン（赤いバーの左側）を使用して実験を進めた。

【図10A-10C】図１０Ａ～図１０Ｃは、抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体がヒトＳｉｇｌｅｃ７に効率的に結合することを示す一連の画像を示す。（図１０Ａ）ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７抗Ｓｉｇｌｅｃ７クローン及びアイソタイプ対照（抗Ｓｉｇｌｅｃ３）で染色した、Ｓｉｇｌｅｃ７過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリープロット。（図１０Ｂ）ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７抗Ｓｉｇｌｅｃ７クローン及び抗Ｓｉｇｌｅｃ９Ａｂ（KB, Biolegend）で染色した、Ｓｉｇｌｅｃ９過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリープロット。（図１０Ｃ）Ｓｉｇｌｅｃ７過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７抗Ｓｉｇｌｅｃ７クローンのＩＦＡ分析。固定細胞の高分解能共焦点画像はLeica TCS SP8 WLL走査型レーザー共焦点顕微鏡とLeica LAS-Xソフトウェア（Leica Microsystems, Inc., Buffalo Grove, IL）を使用してキャプチャーされた。画像の後処理には、デコンボリューション用のHuygensソフトウェア（Scientific Volume Imaging, Laapersveld, Hilversum, The Netherlands）へのインポートが含まれた。固定細胞調製物は、６３×／１．４０油浸対物レンズ、２倍ズーム、１ＡＵのピンホールを使用して取得した。細胞は、ＤＡＰＩ（核）、ＧＦＰ（Ｓｉｇｌｅｃ７）、テキサスレッド（抗Ｓｉｇｌｅｃ７）で標識され、ＨｙＤ検出器で順番に取得され、シグナルを最大化し、クロストークを最小にした。スケールバーは２０．０ミクロンに相当する。

【図11A-11C】図１１Ａ～図１１Ｃは、Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂで免疫されたマウスの血清中のヒトＩｇＧの定量を示す一連の画像を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞が枯渇している）を、５０μｇの重鎖＋５０μｇの軽鎖ヒトＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂで電気穿孔した。マウスの血清をさまざまな時点で収集した。（図１１Ａ）ＤＢ－Ｓ７－１ ＤＭＡｂ、（図１１Ｂ）ＤＢ－Ｓ７－２ ＤＭＡｂ、及び（図１１Ｃ）ＤＢ－Ｓ７－７ＤＭＡｂで電気穿孔されたマウス血清から、ＥＬＩＳＡによって定量されたヒトＩｇＧの発現レベル（１群あたりｎ＝５匹のマウス）。

【図12】図１２は、免疫細胞に対するＦｃγＲブロッキングと、Ｓｉｇｌｅｃ７を介する毒性に対するその効果の概略図である。

【図13A-13D】図１３Ａ～図１３Ｄは、精製免疫細胞の存在下で、ＦＳＨＲ標的化二重特異性Ｔ細胞及びＮＫ細胞エンゲージャーは卵巣癌細胞毒性を誘発し、ＦＳＨＲを標的としないＮＫＣＥによる細胞殺傷はないことを示す一連の画像を示す。（図１３Ａ）ＤＤＡＰ－ＴＣＥの存在下でＴ細胞とＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞の共培養、（図１３Ｂ）ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの存在下でＮＫ細胞とＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞の共培養から生じるインビトロ細胞毒性。リアルタイムのインビトロ細胞毒性分析はxCELLigenceによって実施された；Ｅ：Ｔ＝５：１（図１３Ｂ）。ＦＳＨＲを過剰発現するＯＶＣＡＲ３細胞では、ヒトＰＢＭＣ存在下の、（図１３Ｃ）ＦＳＨＲを標的としないＴＣＥ（ＩＬ１３Ｒα２－ＴＣＥ）及び（図１３Ｄ）ＦＳＨＲを標的としないＮＫＣＥ（ＩＬ１３Ｒα２－ＮＫＣＥ）によって、毒性は誘発されなかった。矢印はエフェクター細胞とＴＣＥ／ＮＫＣＥが添加された時間を示す。

【図14】図１４は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方を関与（engage）させてＫｕｒａｍｏｃｈｉ－ＦＳＨＲ細胞を標的とするための組み合わせ試験を示す画像である。ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥとＤＤＡＰ－ＴＣＥを最適量未満で組み合わせて、組み合わせ効果を評価した。この組み合わせは、ＦＳＨＲ発現Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ細胞に対して相乗効果を示した；緑の線：ＤＤＡＰ－ＴＣＥとＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの両方が添加された。ＰＢＭＣｓはエフェクター細胞として添加された；Ｅ：Ｔ＝５：１。矢印は、エフェクター細胞、及びＤＤＡＰ－ＴＣＥ／ＮＫＣＥ／両方が添加された時点を示す。

【図15】図１５は、ＩＬ－１３Ｒａ２を標的とするＴ細胞エンゲージャーの開発を示す画像である。

【図16】図１６は、ＩＬ－１３Ｒａ２を標的とするＴ細胞エンゲージャーによるＧＢＭの処理を示す画像である。

【図17】図１７は、ＩＬ１３Ｒａ２とＳｉｇｌｅｃ７を標的とする二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャーの設計を示す画像である。

【図18】図１８は、ＩＬ１３Ｒａ２－ＮＫＣＥがＯＶＣＡＲ細胞及びＯＶＩＳＥ細胞（ＩＬ１３Ｒａ２を発現しない卵巣癌細胞）の殺傷を誘発しなかったことを示す画像である。

【図19】図１９は、ヒト黒色腫細胞株上のＩＬ－１３Ｒａ２の発現を示す画像である。

【図20】図２０は、ＩＬ１３Ｒａ２－ＮＫＣＥによる黒色腫細胞の細胞毒性を示す画像である。

【図21A-21C】図２１Ａ～図２１Ｃは、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂの設計とインビトロ発現を示す。（図２１Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂをコードする二重プラスミドＤＮＡ構築物の概略図。（図２１Ｂ）ウェスタンブロットによるＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂの発現分析。数字は分子量（ｋＤａ）を示す。（図２１Ｃ）抗Ｓｉｇｌｅｃ７をトランスフェクションしたＥｘｐｉ２９３Ｆ上清中のヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡによる定量。

【図22A-22E】図２２Ａ～図２２Ｅは、インビトロのヒトＳｉｇｌｅｃ７ ＭＡｂの結合特性解析を示す。（図２２Ａ）ＥＬＩＳＡで分析した、組み換えヒトＳｉｇｌｅｃ７へのＳｉｇｌｅｃ７ ＭＡｂの結合。ヒトＳｉｇｌｅｃ７へのＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７の用量依存的な結合が観察されたが、無関係な対照の場合は結合が見られなかった。（図２２Ｂ）フローサイトメトリーで分析した、Ｓｉｇｌｅｃ７発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのヒトＳｉｇｌｅｃ７ ＭＡｂの結合。二次抗体対照のみ又は無関係なＭＡｂの場合は結合が観察されない。市販のＳｉｇｌｅｃ－７Ａｂ（F023-420、BD Pharmingen）及びＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂであるＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．３では結合があり、最も高い結合がＤＢ７．２で観察された。（図２２Ｃ）ヒトＮＫ細胞及びＴ細胞へのＤＢ７．２抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体の結合を示す代表的なフロープロット。ＤＢ７．２は主にＮＫ細胞に結合する。陽性対照（市販の蛍光色素結合マウス抗ヒトＳｉｇｌｅｃ－７抗体）及び陰性対照（０μｇ／ｍｌのＤＢ７．２又は二次抗体なし）が示されている（図２２Ｄ）。複数のドナー（ｎ＝４）のＰＢＭＣにおいて分析したさまざまな免疫集団へのＤＢ７．２抗Ｓｉｇｌｅｃ－７の結合の概要プロット。（図２２Ｅ）ＣＤ５６ｄｉｍ及びＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞サブセット（ｎ＝４）へのＤＢ７．２抗Ｓｉｇｌｅｃ－７Ａｂの結合分析。

【図23】図２３は、Ｓｉｇｌｅｃ－７結合のフローサイトメトリー分析に使用されるゲーティング戦略を示す。ＮＤの代表的な例を示す。最初に最も安定した取得が選択された。次に、単核細胞から生きた単一細胞のみが分析されるように、前方散乱高さ（ＦＳＣ－Ｈ）対前方散乱面積（ＦＳＣ－Ａ）プロットと側方散乱面積（ＳＳＣ－Ａ）対ＦＳＣ－Ａプロットを使用して、ダブレットを除外し、シングルレットの小型リンパ球に注目した。死細胞は、生存マーカーであるアクアブルー（Aqua Blue）が陰性でＣＤ４５が陽性の細胞をゲーティングすることによって除外された。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球はＣＤ３＋細胞内でゲーティングされ、ＮＫ細胞はＣＤ１９－ＣＤ３－集団内のＣＤ５６及びＣＤ１６発現によって特定された。

【図24A-24D】図２４Ａ～図２４Ｄは、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＤＭＡｂのヒトＳｉｇｌｅｃ－７タンパク質への結合を示す。（図２４Ａ）ウエスタンブロットで分析したＤＢ７．２ Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＤＭＡｂのヒトＳｉｇｌｅｃ－７への結合。ｐＶａｘ１の場合、無関係なタンパク質では結合はない。（図２４Ｂ）ＤＢ７．２のヒトＳｉｇｌｅｃ－７タンパク質に対するＳＰＲ分析。ＤＢ７．２の強い結合がＫＤ値４４ｐＭで観察された。（図２４Ｃ）無関係なａｂのＳｉｇｌｅｃ－７への結合も（図２４Ｄ）ＤＢ７．２の無関係なタンパク質への結合も観察されず、これはＤＢ７．２がヒトＳｉｇｌｅｃ－７に特異性があることを示す。

【図25A-25I】図２５Ａ～図２５Ｉは、ヒトＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂによって誘発されるインビトロ細胞毒性を示す。非標的（図２５Ａ及びＢ）ＨａＣａＴヒトケラチン生成細胞及び標的ＯＣ細胞［（図２５Ｃ及びＤ）ＯＶＣＡＲ１０、（図２５Ｅ）ＯＶＩＳＥ、（図２５Ｆ）ＰＥＯ－４、及び（図２５Ｇ）ＴＯＶ－２１Ｇ細胞］におけるヒトＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂによって誘発されるインビトロ細胞毒性を示す。インビトロ細胞毒性は、xCELLigenceリアルタイム細胞分析装置（ＲＴＣＡ）（Agilent Technologies, USA）を使用して、インピーダンスに基づいて測定された。電気伝導率は、xCELLigenceデバイスによって１５分ごとに細胞指数（ＣＩ）に変換される。ＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７はＨａＣａＴ細胞の殺傷を誘発しなかった。処理２日後にキャプチャーされた画像に示されるように、抗体なしの対照及びＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７処理ウェルでは殺傷が観察されず、オフターゲット毒性作用がないことを示している。３つのＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂはすべて、ＢＲＣＡ２変異及びＰＡＲＰｉ耐性ＰＥＯ－４細胞を含む前述のヒトＯＣ細胞パネルを効果的に殺傷した。ＤＢ７．２ ＭＡｂが最も高い殺傷力を発揮することが分かった。ＤＢ７．２の殺傷能力は、さらに２つの添加ＯＣ細胞で確認された；（図２５Ｈ）ＣａＯＶ３細胞及び（図２５Ｉ）ＯＶＣＡＲ３細胞。矢印は、抗体及びエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）が標的細胞に添加された時点を示す；Ｅ：Ｔ＝５：１／１０：１。赤：抗体なし（エフェクター細胞＋標的細胞のみ）、緑：ＤＢ７．１（エフェクター細胞＋標的細胞＋ＤＢ７．１）、青：ＤＢ７．２（エフェクター細胞＋標的細胞＋ＤＢ７．２）、及び黄色：ＤＢ７．７（エフェクター細胞＋標的細胞＋ＤＢ７．７）。

【図26A-26C】図２６Ａ～図２６Ｃは、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭａｂのＦｃＲ結合の除去を示す。（図２６Ａ）免疫細胞に対するＦｃＲブロッキングとＳｉｇｌｅｃ－７を介する細胞殺傷に対するその効果の概略図。（図２６Ｂ）Ｆｃブロックの存在下又は非存在下でのＤＢ７．２ヒトＭＡｂによるＯＶＣＡＲ３細胞の殺傷のxCELLigenceリアルタイム分析。（図２６Ｃ）Ｆｃブロックは、ＯＶＩＳＥ細胞におけるＤＢ７．２ Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂを介するＮＫ毒性を維持した。画像は、Ｆｃブロックの存在下又は非存在下で、エフェクター細胞（Ｅ：Ｔ＝５：１）とＤＢ７．２ ＭＡｂをＯＶＩＳＥ細胞に添加した２日後にキャプチャーされた。

【図27A-27I】図２７Ａ～図２７Ｉは、ＦｃＲ結合の除去によってＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂの殺傷能力が維持され、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂと抗ＰＤ１の組み合わせによってＯＣ細胞殺傷が強化されたことを示す。（図２７Ａ）ＤＢ７．２とＤＢ７．２＿ＴＭ ＭｏｄによるＯＶＩＳＥ細胞殺傷の比較。ＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄは、Ｆｃドメインに３重残基修飾（“ＴＭ”；Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）を含み、ＦｃＲとＣ１ｑの結合を除去するＤＢ７．２ＤＭＡｂの変異体である。ＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄの殺傷効力はＯＶＩＳＥ細胞で維持された。赤：Ａｂなし（エフェクター細胞＋標的細胞のみ）、濃い青：ＤＢ７．２（エフェクター細胞＋標的細胞＋ＤＢ７．２）、薄い青（エフェクター細胞＋標的細胞＋ＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄ）。（図２７Ｂ）ＯＶＩＳＥ細胞を標的として、エフェクター細胞とＤＢ７．２／ＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄを使用して処理した２４時間後の画像。ＯＶＩＳＥ細胞とヒトＰＢＭＣの共培養７２時間後の（図２７Ｃ）ＤＢ７．２及び（図２７Ｄ）ＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄの細胞指数対処理用量の曲線。ＰＥＯ４細胞とヒトＰＢＭＣの共培養７２時間後の（図２７Ｅ）ＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄ及び（図２７Ｆ）抗ＰＤ１（ペンブロリズマブ）の細胞指数対処理用量曲線。ヒトＰＢＭＣ存在下の（図２７Ｇ）、ＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄ、（図２７Ｈ）抗ＰＤ１（ペンブロリズマブ）、及び（図２７Ｉ）個別処理とＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄと抗ＰＤ１の組み合わせによる標的ＰＥＯ４細胞の殺傷（Ｅ：Ｔ＝５：１）。前記組み合わせにより、個別のＣＰＩ処理と比較して殺傷が強化された。

【図28A-28E】図２８Ａ～図２８Ｅは、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＤＮＡ送達ＭＡｂがインビボで発現し、卵巣癌攻撃投与モデルで癌の進行を遅らせることを示す。（図２８Ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウスへのヒトＳｉｇｌｅｃ－７ ＤＮＡ送達ＭＡｂ投与の概略図。マウスのＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を、まず抗マウスＣＤ４及び抗マウスＣＤ８（両方ともInVivoMab製）抗体を使用して枯渇させた。次に、マウスに５０μｇの重鎖＋５０μｇの軽鎖ヒトＳｉｇｌｅｃ－７ ＤＭＡｂを電気穿孔した。マウス血清を、示された時点で収集した。（図２８Ｂ）ＤＮＡ注入及び電気穿孔の１４日後に、空ベクター、ＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７を電気穿孔したマウス血清、又は投薬未経験血清で、無関係な対照及び二次Ａｂ対照のみとともに、ヒトＮＫ細胞を染色。Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂで免疫したマウスの１４日目の血清は、陽性で強いＮＫ細胞染色を示したが、空ベクター対照、無関係なＭＡｂ、又は投薬未経験血清の場合は染色は観察されなかった。（図２８Ｃ）ＯＶＩＳＥ細胞を攻撃投与したＮＳＧ－Ｋマウスへの、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＤＮＡ送達ＭＡｂ電気穿孔の概略図。（図２８Ｄ）ＤＢ７．２又は空ベクターで処理したＮＳＧ－Ｋマウスに移植されたＯＶＩＳＥ腫瘍の増殖曲線（１群あたりｎ＝５匹のマウス）。（図２８Ｅ）空ベクター対照と比較したＤＢ７．２処理マウスの生存率の利点。ＤＢ７．２処理群は、ｐＶａｘ１対照群と比較して、腫瘍負荷が大幅に軽減され、生存率が向上した。

【図29A-29B】図２９Ａ及び図２９Ｂは、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＤＭＡｂが、ＯＶＩＳＥ攻撃投与マウスモデルで腫瘍増殖に影響を与えたことを示す。（図２９Ａ）ＤＢ７．２ＤＭＡｂ又はｐＶａｘ１空ベクターで処理されたＮＳＧ－Ｋマウスに移植されたＯＶＩＳＥ腫瘍の個々の増殖曲線（１群あたりｎ＝５匹のマウス）。（図２９Ｂ）３７日目の、ＤＢ７．２ＤＭＡｂ又はｐＶａｘ１で処理した卵巣腫瘍担持マウスの代表的な画像。

【図30A-30K】図３０Ａ～図３０Ｋは、ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１：ＦＳＨＲ標的化二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャーの生成、発現、結合、及び特異性分析を示す。（図３０Ａ）ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥをコードするＤＮＡ構築物の概略図；ＧＳ：グリシン－セリン、ＳｃＦＶ：単鎖可変断片。（図３０Ｂ）ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞へのトランスフェクション後のＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥ又はｐＶａｘ１空ベクターのインビトロ発現のウェスタンブロット。（図３０Ｃ）二次抗体のみ、ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥ、Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体（F023-420／ＤＢ７．２）、及びＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥで染色したＳｉｇｌｅｃ－７過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリープロット。（図３０Ｄ）二次抗体のみ、非ＦＳＨＲ標的化Ｔ細胞エンゲージャー（ＩＬ１３受容体アルファ２ｘＣＤ３）、Ｄ２２ＡＰ１１－ＴＣＥ（ＦＳＨＲｘＣＤ３）、及びＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥで染色したＦＳＨＲ過剰発現Ｋ５６２細胞のフローサイトメトリープロット。（図３０Ｅ）Ｓｉｇｌｅｃ－７過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥのＩＦＡ。二次抗体のみによる染色は陰性対照として機能した。固定細胞の高分解能共焦点画像は、Leica TCS SP8 WLL走査型レーザー共焦点顕微鏡とLeica LAS-Xソフトウェア（Leica Microsystems, Inc., Buffalo Grove, IL）を使用してキャプチャーされた。画像の後処理には、デコンボリューション用のHuygensソフトウェア（Scientific Volume Imaging, Laapersveld, Hilversum, The Netherlands）へのインポートを含んでいた。固定細胞調製物は、６３Ｘ／１．４０油浸対物レンズ、２倍ズーム、及び１ＡＵのピンホールを使用して取得された。細胞は、ＤＡＰＩ（核）、ＧＦＰ（Ｓｉｇｌｅｃ－７）、テキサスレッド（ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥ）で標識され、ＨｙＤ検出器で順番に取得して、シグナルを最大化し、クロストークを最小にした。スケールバーは２０．０ミクロンに相当する。xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを使用して、ＦＳＨＲ陰性（図３０Ｆ及びＧ）ＨＥＫ２９３Ｔ、（図３０Ｈ）ＧＭ０５３８９、（図３０Ｉ及びＪ）ＡＧＳ、及び（図３０Ｋ）ＷＭ３７４３細胞における、ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥの特異性分析。これらのＦＳＨＲ非発現細胞のいずれにおいても、細胞殺傷は観察されなかった。画像は、エフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ；Ｅ：Ｔ＝１０：１）及びＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１を３日間添加後の、ＨＥＫ２９３Ｔ（Ｇ）及びＡＧＳ（Ｊ）細胞において細胞毒性が誘発されていないことを示す。赤：抗体なし（エフェクター細胞＋標的細胞のみ）；紫：ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１（エフェクター細胞＋標的細胞＋ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥ）。

【図31A-31I】図３１Ａ～図３１Ｉは、ＦＳＨＲ標的化ＮＫ細胞エンゲージャーを示す；ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥは、インビトロで卵巣癌の細胞毒性を誘発した。（図３１ＡとＢ）ＯＶＩＳＥ細胞、及び（図３１Ｃ）ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞、（図３１ＤとＥ）ＣａＯＶ３細胞、（図３１Ｆ）Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ－ＦＳＨＲ細胞、及び（図３１Ｇ）ＰＥＯ－４細胞において、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥによって誘発されたインビトロ細胞毒性。リアルタイムのインビトロ細胞毒性分析はxCELLigenceによって実施された。Ｅ：Ｔは１０：１（ＡとＢ、ＦとＧ）及び５：１（Ｃ～Ｅ）である。示されている画像（ＢとＥ）は、標的細胞にヒトＰＢＭＣとＮＫＣＥを添加してから３日後にキャプチャーされた。（図３１Ｈ）ヒトＰＢＭＣｓ存在下でＦＳＨＲ発現ＯＶＩＳＥ細胞において、ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥによって誘発される用量依存性細胞溶解（Ｅ：Ｔ＝５：１）。ＩＣ５０値は１４２．８７ｐＭで得られ、ＮＫＣＥの有効性を示す。（図３１Ｉ）ＯＶＣＡＲ３細胞におけるＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥの細胞指数対用量曲線。ＩＣ５０値は２３６．６ｐＭで得られ、その高い効力を確認した。

【図32A-32D】図３２Ａ～図３２Ｄは、ＦＳＨＲ標的化二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャーの特異性分析を示す。（図３２Ａ）ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥの存在下の、ＮＫ細胞とＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞の共培養から生じるインビトロ細胞毒性。（図３２Ｂ）抗Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂによるＡＧＳ（ＦＳＨＲ陰性）細胞の殺傷（ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥはこの細胞株の殺傷を誘発しなかったことから、二重特異性エンゲージャープローチの特異性を示している）。無関係なＮＫＣＥ（ＤＢ７．２ｘＩＬ１３Ｒα２ＮＫＣＥは、ヒトＰＢＭＣの存在下で、（図３２Ｃ）ＦＳＨＲ過剰発現ＯＶＣＡＲ３細胞及び（図３２Ｄ）ＯＶＩＳＥ細胞において毒性を誘発しなかった。リアルタイムのインビトロ細胞毒性分析はxCELLigenceによって実施された；Ｅ：Ｔ＝５：１。矢印は、エフェクター細胞とＮＫＣＥが添加された時間を示す。

【図33A-33C】図３３Ａ～図３３Ｃは、ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥが、標的ＦＳＨＲを過剰発現するＯＶＳＥ細胞において用量依存性細胞毒性を誘発したことを示す。ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥは、３人の異なる健康なヒトドナー（図３３Ａ）ＮＤ５７８、（図３３Ｂ）ＮＤ５０２、（図３３Ｃ）ＮＤ６０９から得たヒトＰＢＭＣの存在下で、異なる濃度（１２０、６０、３０、１５、７．５、３．７５、及び１．８７５ｎｇ／ｍｌ）で分析すると、ＯＶＩＳＥ－ＦＳＨＲ細胞において用量依存性殺傷を誘発した。赤い線は、抗体なし（エフェクター細胞と標的細胞のみ）を示す。インビトロ細胞毒性は、xCELLigenceリアルタイム細胞分析装置を使用してインピーダンスに基づいて測定された。Ｅ：Ｔ＝５：１；矢印は、エフェクター細胞とＮＫＣＥが標的ＯＶＩＳＥ－ＦＳＨＲ細胞に添加された時間を示す。

【図34】図３４は、ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥが、標的ＯＶＣＡＲ３細胞において用量依存性の細胞毒性を誘発したことを示す。ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥは、ヒトＰＢＭＣの存在下で、異なる濃度（１２０、６０、３０、１５、７．５、３．７５、及び１．８７５ｎｇ／ｍｌ）で分析すると、ＯＶＣＡＲ３細胞において用量依存性な細胞死を誘発した。赤い線は、抗体なし（エフェクター細胞と標的細胞のみ）を示す。インビトロ細胞毒性は、xCELLigenceリアルタイム細胞分析装置を使用してインピーダンスに基づいて測定された。Ｅ：Ｔ＝１０：１、矢印は、エフェクター細胞とＮＫＣＥが標的ＯＶＣＡＲ３細胞に添加された時間を示す。

【図35A-35E】図３５Ａ～図３５Ｅは、ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥがサイトカイン／細胞毒性分子の分泌を引き起こし、インビボで卵巣腫瘍の増殖に影響を与えたことを示す。（図３５Ａ）ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞は、ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥの存在下及び非存在下でヒトＰＢＭＣと共培養された。（図３５Ｂ）上清は７２時間後に収集され、サイトカイン／細胞毒性分子の分泌プロフィールが分析された。（図３５Ｃ）ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲを攻撃投与されたＮＳＧ－Ｋマウスモデルにおける腫瘍の進行に対するＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥの効果を評価するための腫瘍試験の概略図。（図３５Ｄ）ＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥ又は空ベクターで処理したＮＳＧ－Ｋマウスに移植されたＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ腫瘍の平均増殖曲線（１群あたりｎ＝５匹のマウス）。（図３５Ｅ）空ベクター対照と比較したＤＢ７．２ｘＤ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥマウスの生存率の利点。２元配置分散分析；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【発明を実施するための形態】

【0025】

詳細な説明
本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ７とＦＳＨＲ（ＤＤＡＰ ＮＫＣＥ）の両方を同時に標的とする、新しいクラスの二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）の開発に関する。別の実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥは、Ｓｉｇｌｅｃ７とＩＬ１３Ｒａ２の両方を同時に標的とする。

【0026】

１つの態様において、本発明は、ＮＫＣＥ、その断片、その変種、又はそれをコードする核酸分子を投与することにより、免疫応答を増大又は強化、すなわち、より効果的な免疫応答を生成するために使用することができる組成物に関する。１つの実施態様において、ＮＫＣＥはＳｉｇｌｅｃ－７を標的とする。

【0027】

１つの態様において、本発明は、シアル酸受容体抗体、又はその断片、又はその変種と、腫瘍抗原への結合に特異的な抗体、又はその断片、又はその変種との組み合わせを含むＮＫＣＥに関する。いくつかの実施態様において、本発明は、シアル酸受容体抗体、又はその断片、又はその変種と、腫瘍抗原への結合に特異的な抗体、又はその断片、又はその変種との組み合わせを含むＮＫＣＥをコードする核酸分子に関する。

【0028】

１つの態様において、本発明は、それを必要とする被験体における疾患又は障害を治療する方法であって、被験体にＮＫＣＥ、その断片、その変種、又はこれらをコードする核酸分子を投与することを含む方法に関する。１つの実施態様において、疾患又は障害は癌である。１つの実施態様において、疾患又は障害は感染症である。

【0029】

１つの実施態様において、本発明は、治療を必要とする被験体における癌又はそれに関連する疾患もしくは障害の治療方法に関し、被験体に、シアル酸受容体抗体、又はその断片、又はその変種と、腫瘍抗原、ウイルス糖タンパク質、ＭＨＣ結合抗体断片への結合に特異的な抗体、又はその断片、又はその変種との組み合わせを含むＮＫＣＥ、又はこれらをコードする核酸分子を投与することを含む。

【0030】

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書で説明されているものと同様又は同等の方法及び材料はいずれも本発明の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び材料について説明する。

【0031】

本明細書で使用される以下の各用語は、このセクションで関連付けられている意味を有する。

【0032】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の１つ又はそれ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として「ある要素」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。

【0033】

量、時間的持続などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」は、開示された方法を実施するために適切な変動として、指定された値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、又は±０．１％の変動を包含することを意味する。

【0034】

「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥクラスの抗体、又はこれらの断片若しくは誘導体を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、並びに単鎖抗体、及びこれらの誘導体を含む。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、又は所望のエピトープに対する十分な結合特異性を示すこれらの混合物、又はこれらから誘導された配列であり得る。

【0035】

「抗原」は、宿主内で免疫応答を生成する能力を有するタンパク質を指す。抗原は抗体によって認識され結合され得る。抗原は、体内又は外部環境から発生し得る。

【0036】

「ＣＤＲ」は、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義され、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域である。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖ＣＤＲ（又はＣＤＲ領域）と３つの軽鎖ＣＤＲ（又はＣＤＲ領域）がある。従って、ここで使用される「ＣＤＲ」は、３つの重鎖ＣＤＲすべて、又は３つの軽鎖ＣＤＲすべて（又は、適切な場合は、すべての重鎖ＣＤＲとすべての軽鎖ＣＤＲの両方）を指す。抗体の構造とタンパク質の折り畳みにより、他の残基が抗原結合領域の一部であると見なされ、熟練した技術者によってそのように理解される可能性がある。例えば、Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883を参照。

【0037】

「抗体断片」又は「抗体の断片」は、本明細書で互換的に使用される場合、抗原結合部位又は可変領域を含む完全な抗体の一部を指す。この部分は、完全な抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＨ４）を含まない。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つのみの軽鎖可変ドメインを含む単鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含む単鎖ポリペプチド、１つのみの重鎖可変領域を含む単鎖ポリペプチド、及び重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む単鎖ポリペプチドが含まれる。

【0038】

本明細書で使用される「アジュバント」は、抗原の免疫原性を上昇させるために本明細書に記載されたワクチンに添加される任意の分子を意味する。

【0039】

本明細書で使用される「コード配列」又は「コード核酸」は、本明細書に記載された抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ分子）を指す場合がある。コード配列は、ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む場合もある。コード配列には、核酸が投与される個体又は哺乳動物の細胞内での発現を誘発することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に作動可能に連結された開始シグナル及び終止シグナルがさらに含まれていてもよい。コード配列には、シグナルペプチドをコードする配列がさらに含まれていてもよい。

【0040】

本明細書で使用されている「相補体」又は「相補的」とは、核酸が、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の間にワトソン・クリック（例えば、Ａ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）又はフーグスティーン（Hoogsteen）塩基対合を有することを意味し得る。

【0041】

「疾患」とは、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善しない場合は動物の健康が悪化し続ける動物の健康状態である。

【0042】

対照的に、動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持できるが、動物の健康状態が障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。障害を治療せずに放置しても、必ずしも動物の健康状態がさらに悪化するわけではない。

【0043】

疾患又は障害の兆候又は症状の重症度、患者がそのような兆候又は症状を経験する頻度、又はその両方が軽減された場合、疾患又は障害は「緩和」される。

【0044】

「コードする」とは、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドの特定の配列が、特定のヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）又は特定のアミノ酸配列と、そこから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスで、他のポリマーや高分子を合成するためのテンプレートとして機能するという固有の特性を指す。従って、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写と翻訳によって細胞又は他の生物学的システムでタンパク質が産生される場合、遺伝子はタンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一で、通常は配列リストで提供されるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又はその他の産物をコードしていると言える。

【0045】

化合物の「有効量」とは、化合物が投与される被験体又はシステムに効果をもたらすのに十分な化合物の量である。

【0046】

「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素を含む。発現のための他の要素は、宿主細胞又はインビトロ発現システムによって供給することができる。発現ベクターには、当該技術分野で知られているすべてのものが含まれ、例えば、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸の又はリポソームに含まれるもの）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。

【0047】

本明細書で使用される「フィードバック機構」とは、ソフトウェア又はハードウェア（又はファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスを指す場合があり、このプロセスは、所望の組織のインピーダンス（エネルギーパルスの送達前、送達中、及び／又は送達後）を受信して現在の値（好ましくは電流）と比較し、送達されるエネルギーパルスを調整して、プリセット値を達成する。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実行されてもよい。

【0048】

「断片」とは、機能する、すなわち所望の標的に結合し全長抗体と同じ意図された効果を有することができる抗体のポリペプチド断片を意味し得る。抗体の断片は、Ｎ末端及び／又はＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸が欠落していることを除いて全長と１００％同一であり、いずれの場合も１位にシグナルペプチド及び／又はメチオニンが有っても無くてもよい。断片は、特定の全長抗体の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の割合を含み、異種シグナルペプチドは除外される。断片は、抗体と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性があるポリペプチドの断片を含み、さらに、同一性パーセントの計算には含まれないＮ末端メチオニン又は異種シグナルペプチドを含む。断片は、さらにＮ末端メチオニン及び／又はシグナルペプチド、例えば免疫グロブリンシグナルペプチド、例えばＩｇＥ又はＩｇＧシグナルペプチドを含み得る。Ｎ末端メチオニン及び／又はシグナルペプチドは、抗体の断片に連結され得る。

【0049】

抗体をコードする核酸配列の断片は、５’末端及び／又は３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドが欠落していることを除いて全長と１００％同一であり、いずれの場合も１位にシグナルペプチド及び／又はメチオニンが有っても無くてもよい。断片は、特定の全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み、添加されたいかなる異種シグナルペプチドも除外される。断片は、抗体と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性があるポリペプチドをコードする断片を含むことができ、さらに任意選択的に、同一性パーセントの計算には含まれないＮ末端メチオニン又は異種シグナルペプチドをコードする配列を含む。断片は、さらにＮ末端メチオニン及び／又はシグナルペプチド（例えばＩｇＥ又はＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチド）のコード配列を含み得る。Ｎ末端メチオニン及び／又はシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結されていてもよい。

【0050】

本明細書で使用される「遺伝子構築物」とは、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。遺伝子構築物はまた、ＲＮＡを転写するＤＮＡ分子を指すこともある。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞内での発現を誘発することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に作動可能に連結された開始シグナル及び終止シグナルを含む。本明細書で使用される「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞内に存在するとコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結された必要な調節要素を含む遺伝子構築物を指す。

【0051】

「相同的」とは、２つのポリペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す。比較される２つの配列の両方の位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンで占められている場合、その位置で分子は相同的である。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列が共有する、一致する、又は相同的な位置の数を、比較される位置の数で割った値に１００を掛けた数の関数である。例えば、２つの配列の１０の位置のうち６つが一致又は相同的である場合、２つの配列は６０％相同的である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有している。通常、２つの配列が最大の相同性を与えるように整列されているときに比較が行われる。

【0052】

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈でここで使用される「同一の」又は「同一性」とは、配列が特定の領域にわたって特定のパーセントの残基が同じであることを意味する。パーセントは、２つの配列を最適に整列させ、特定の領域で２つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を算出し、一致した位置の数を指定領域内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセントを算出することで計算できる。２つの配列の長さが異なる場合、又は整列によって１つ又はそれ以上のずれた末端が生成され、特定された比較領域が１つの配列のみを含む場合、その１つの配列の残基は計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等と見なすことができる。同一性は用手的に行うことも、ＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ２．０などのコンピューター配列アルゴリズムを使用して行うこともできる。

【0053】

「単離された」とは、自然の状態から変更又は取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物に自然に存在する核酸又はペプチドは「単離」されていないが、同じ核酸又はペプチドがその自然状態の共存物質から部分的又は完全に分離されている場合は「単離」されている。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形で存在することができ、又は例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。

【0054】

本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基について以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを指す。

【0055】

他に明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンでイントロンを含む可能性がある限り、イントロンを含むことがある。

【0056】

本明細書で使用される「インピーダンス」は、フィードバックメカニズムについて説明するときに使用され、オームの法則に従って電流値に変換できるため、プリセット電流との比較が可能になる。

【0057】

本明細書で使用される「免疫応答」は、１つ又はそれ以上の核酸及び／又はペプチドの導入に応答して、宿主の免疫システム（例えば、哺乳類の免疫システム）が活性化されることを意味する。免疫応答は、細胞応答若しくは体液性応答、又はその両方の形態をとることができる。

【0058】

「患者」、「被験体」、「個体」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、本明細書に記載の方法に適応可能な、インビトロ又はインサイチューの任意の動物又はその細胞を指す。いくつかの実施態様において、患者、被験体、又は個体はヒトである。

【0059】

組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ.ｃ.）、静脈内（ｉ.ｖ.）、筋肉内（ｉ.ｍ.）、又は皮内注射、又は注入技術が含まれる。

【0060】

本明細書で使用される「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２つのヌクレオチドが共有結合していることを意味し得る。一本鎖の記載は、相補鎖の配列も規定する。従って、核酸には、記載された一本鎖の相補鎖も含む。核酸の多くの変種は、特定の核酸と同じ目的で使用することができる。従って、核酸はまた、実質的に同一の核酸及びその相補体も含む。一本鎖は、厳密性ハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズできるプローブを提供する。従って、核酸は、厳密性ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも含む。

【0061】

核酸は一本鎖又は二本鎖であるか、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部を含むことができる。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、又はハイブリッドであり、核酸には、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。核酸は、化学合成法又は組み換え法によって得られる。

【0062】

ここで使用される「作動可能に連結された」とは、遺伝子の発現が、遺伝子が空間的に接続されたプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に配置され得る。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子内でそのプロモーターとそれが制御する遺伝子の間の距離とほぼ同じである。当該技術分野で知られているように、この距離の変化は、プロモーター機能の損失なしに調整することができる。

【0063】

ここで使用される「ペプチド」、「タンパク質」、又は「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列を意味し、天然、合成、又は天然と合成の修飾物又は組み合わせであり得る。

【0064】

ここで使用される「プロモーター」は、細胞内の核酸の発現を付与、活性化、又は強化することができる合成又は天然由来の分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに強化し、及び／又は発現の空間的発現及び／又は時間的発現を変更するために、１つ又はそれ以上の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れた位置にある遠位エンハンサー又はリプレッサー要素も含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、動物などの供給源から得ることができる。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、若しくは器官に関して、又は発現が起こる発達段階に関して、又は生理学的ストレス、病原体、金属イオン、又は誘発剤などの外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を構成的に又は差別的に制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、又はＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶＩＥプロモーターが含まれる。

【0065】

本明細書で使用される用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。場合によっては、この配列はコアプロモーター配列であり、他の場合には、この配列は遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列及び他の調節要素も含む。プロモーター／調節配列は、例えば組織特異的な方法で遺伝子産物を発現するものであってもよい。

【0066】

「構成性」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、細胞のほとんど又はすべての生理学的条件下で細胞内で遺伝子産物が生成されるヌクレオチド配列である。

【0067】

「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、プロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ、実質的に細胞内で遺伝子産物が生成されるヌクレオチド配列である。

【0068】

「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子をコードするか又は遺伝子によって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、細胞内で遺伝子産物が生成されるヌクレオチド配列である。

【0069】

「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本明細書では互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端に連結できるアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、通常、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質が生成された細胞からのタンパク質の分泌を促進する可能性がある。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質の残りの部分（成熟タンパク質と呼ばれることが多い）から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に連結されている。

【0070】

本明細書で使用される「厳密性ハイブリダイゼーション条件」とは、核酸の複雑な混合物などにおいて、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）にハイブリダイズする条件を意味し得る。厳密性条件は配列に依存し、状況によって異なる。厳密性条件は、規定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５～１０℃低くなるように選択することができる。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される）で標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）である場合がある。厳密性条件とは、ｐＨ７．０～８．３で塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、例えば約０．０１～１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）の場合は少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドを超える）の場合は少なくとも約６０℃である条件である。厳密性条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することでも達成できる。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍になる。例示的な厳密性ハイブリダイゼーション条件は以下を含む：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、又は５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２ｘＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄。

【0071】

ここで使用される「被験体」及び「患者」は、互換的に、限定されるものではないが、哺乳類（例えば、牛、豚、ラクダ、ラマ、馬、ヤギ、ウサギ、羊、ハムスター、モルモット、猫、犬、ネズミ、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーなどのサル）、及びヒト）を含むあらゆる脊椎動物を指す。いくつかの実施態様において、被験体はヒト又は非ヒトであり得る。被験体又は患者は他の形態の治療を受けている可能性がある。

【0072】

本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であること、又は２つの配列が厳密性ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。

【0073】

本明細書で使用される「実質的に同一」とは、第１及び第２の配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個、又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたって、又は核酸に関しては、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であることを意味し得る。

【0074】

本明細書で使用される「合成抗体」は、本明細書に記載される組換え核酸配列によってコードされ、被験体内で生成される抗体を指す。

【0075】

本明細書で使用される「治療」又は「治療する」は、疾患を予防、抑制、制圧、又は完全に排除する手段によって、被験体を疾患から防御することを意味し得る。疾患を予防することは、疾患の発症前に被験体に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患の抑制には、疾患の誘発後であるが臨床的に現れる前に、本発明のワクチンを被験体に投与することを含む。疾患の制圧には、疾患の臨床的出現後に、本発明のワクチンを被験体に投与することを含む。

【0076】

「治療的」治療とは、疾患又は障害の兆候又は症状を示す被験体に、これらの兆候又は症状の頻度又は重症度を軽減又は排除する目的で施される処置である。

【0077】

本明細書で使用されている「疾患又は障害を治療する」とは、患者が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの兆候又は症状の頻度若しくは重症度、又はその両方を軽減することを意味する。

【0078】

本明細書で使用される「治療有効量」という語句は、疾患又は障害を予防又は治療（発症の遅延又は予防、進行の予防、抑制、減少、又は回復）するのに十分又は有効な量を指し、そのような疾患及び障害の兆候及び／又は症状の緩和を含む。

【0079】

本明細書で使用される用語としての疾患又は障害を「治療する」とは、被験体が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの兆候又は症状の頻度又は重症度を軽減することを意味する。

【0080】

本明細書で核酸に関して使用される「変種」とは、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部又は断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列又はその一部の相補体、（ｉｉｉ）参照核酸又はその相補体と実質的に同一の核酸、又は（ｉｖ）参照核酸、その相補体、又はこれらと実質的に同一の配列に、厳密性条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。

【0081】

変種は、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチド又はポリペプチドとしてさらに定義することができる。「生物学的活性」の代表的な例には、特定の抗体に結合する能力、又は免疫応答を促進する能力が含まれる。変種はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味することもできる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度と分布）を有する異なるアミノ酸に置き換えることは、当該技術分野において、通常軽微な変化を伴うものとして認識されている。これらの軽微な変化は、当該技術分野で理解されているように、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することによって、部分的に同定することができる。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性及び電荷の考慮に基づく。当該技術分野では、同様のハイドロパシー指数のアミノ酸を置換しても、タンパク質の機能を保持できることが知られている。１つの態様において、ハイドロパシー指数が±２のアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、タンパク質が生物学的機能を保持することになる置換を明らかにするためにも使用することができる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性を考慮すると、そのペプチドの最大局所平均親水性を計算することができ、これは抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、当該技術分野で理解されているように、例えば免疫原性などの生物学的活性を保持するペプチドが得られる可能性がある。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性指数と親水性値は両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この観察と一致して、生物学的機能と互換性のあるアミノ酸置換は、アミノ酸の相対的な類似性、特に疎水性、親水性、電荷、サイズ、及びその他の特性によって明らかにされるこれらのアミノ酸の側鎖の類似性に依存すると理解される。

【0082】

変種は、完全な遺伝子配列又はその断片の全長にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列又はその断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であり得る。変種は、アミノ酸配列又はその断片の全長にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の全長又はその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0083】

「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。限定されるものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む多数のベクターが当該技術分野で知られている。従って「ベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミド又はウイルスが含まれる。この用語には、例えばポリリジン化合物、リポソームなどの、核酸の細胞への移入を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物も含まれると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれる。

【0084】

範囲：本開示全体を介して、本発明のさまざまな側面を範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１から６などの範囲の記述は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの部分範囲、及びその範囲内の個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などを具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。

【0085】

説明
本明細書では、シアル酸結合受容体、その断片、その変種に特異的に結合するドメインと、さらに、目的の標的細胞によって発現される抗原に特異的に結合するドメインとを含むＮＫＣＥと、それをコードする核酸分子とが提供される。１つの実施態様において、シアル酸結合受容体は、シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）ポリペプチド又はセレクチンポリペプチドである。１つの実施態様において、ＮＫＣＥは、ＮＫ細胞に直接関与するＳｉｇｌｅｃ－７への結合に特異的であり、病原細胞の殺傷及び除去を指示することができる。

【0086】

１つの実施態様において、本発明は、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子を含む免疫原性組成物を提供する。本発明の免疫原性組成物は、限定されるものではないが、癌及び感染症を含む疾患又は障害から防御するために使用することができる。いくつかの実施態様において、本発明の免疫原性組成物は、癌細胞、自己免疫細胞、又は感染した標的細胞上の糖タンパク質の細胞特異的標的化に使用することができる。

【0087】

従って、いくつかの実施態様において、本発明は、シアル酸結合受容体、その断片、その変種体に特異的に結合するドメインと、さらに、目的の標的細胞によって発現される抗原に特異的に結合するドメインとを含む１つ又はそれ以上のＮＫＣＥをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。

【0088】

いくつかの実施態様において、本発明は、被験体に、本発明の二重特異性シアル酸結合受容体抗体又はそれをコードする核酸分子を投与することを含む、疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。

【0089】

いくつかの実施態様において、本発明は、被験体に、シアル酸結合受容体、その断片、その変種に特異的に結合するドメインを含み、さらに癌抗原又はそれをコードする核酸分子に特異的に結合するドメインを含む二重特異性シアル酸結合受容体抗体、その断片、又はその変種、又はそれをコードする核酸分子を投与することを含む、癌を治療又は予防する方法を提供する。

【0090】

抗体組成物
いくつかの実施態様において、本発明は、シアル酸結合受容体への結合に特異的なドメインを含む少なくとも１つのＮＫＣＥを含む組成物に関する。１つの実施態様において、シアル酸結合受容体は、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチド又はセレクチンポリペプチドである。１つの実施態様において、ＳｉｇｌｅｃはＳｉｇｌｅｃ７である。

【0091】

１つの実施態様において、本発明は、少なくとも１つのＳｉｇｌｅｃ７結合ドメイン又はその断片を含むＮＫＣＥを含む組成物に関する。１つの実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥのＳｉｌｇｅｃ－７結合ドメイン又はその断片は、配列番号４、配列番号２０、配列番号３６、配列番号５２、配列番号６８、又は配列番号８４の可変重鎖配列を含む。１つの実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥのＳｉｌｇｅｃ－７結合ドメイン又はその断片は、配列番号１２、配列番号２８、配列番号４４、配列番号６０、配列番号７６、又は配列番号９２の可変軽鎖配列を含む。１つの実施態様において、二重特異性ＮＫＣＥ又はその断片は、配列番号９８、配列番号１００、又は配列番号１０２の配列を含む。

【0092】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアミノ酸配列の変種は、定義されたアミノ酸配列と比較した場合、指定された領域にわたって、少なくとも約６０％の同一性、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアミノ酸配列の変種は、配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号９８、配列番号１００、又は配列番号１０２の少なくとも１つのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約６０％の同一性、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性を含む。

【0093】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアミノ酸配列の断片は、定義されたアミノ酸配列の全長配列の、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアミノ酸配列の断片は、配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号９８、配列番号１００、又は配列番号１０２の少なくとも１つの全長配列の、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含む。

【0094】

本明細書で使用される「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのタンパク質（糖タンパク質を含む）を指す。抗体又は免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、２つの同一の軽鎖ポリペプチドと２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む四量体である場合がある。２つの重鎖はジスルフィド結合によって互いに結合しており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に結合している。各全長Ｉｇ分子には、特定の標的又は抗原に対する結合部位が少なくとも２つ含まれている。

【0095】

シアル酸結合受容体抗体、又はその抗原結合断片は、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル融合タンパク質、その抗体又は断片、キメラ化又はキメラ融合タンパク質、その抗体又は断片、ヒト化融合タンパク質、その抗体又は断片、脱免疫ヒト化融合タンパク質、その抗体又は断片、完全ヒューマン融合タンパク質、その抗体又は断片、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ダイアボディ又はその抗原結合断片、ミニボディ又はその抗原結合断片、トリアボディ又はその抗原結合断片、ドメイン融合タンパク質、その抗体又は断片、ラクダ融合タンパク質、その抗体又は断片、ヒトコブラクダ融合タンパク質、その抗体又は断片、ファージ表示融合タンパク質、その抗体又は断片、又は反復バックボーンアレイ（例えば、反復抗原表示）で特定される抗体又はその抗原結合断片が含まれる。

【0096】

免疫系は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含むいくつかの異なるクラスのＩｇ分子（アイソタイプ）を生成し、それぞれは、存在する特定のクラスの重鎖ポリペプチドによって区別される：ＩｇＡにはアルファ（ａ）、ＩｇＤにはデルタ（δ）、ＩｇＥにはイプシロン（ε）、ＩｇＧにはガンマ（γ）、及びＩｇＭにはミュー（μ）。ＩｇＧには、少なくとも５つの異なるγ重鎖ポリペプチド（アイソタイプ）がある。対照的に、軽鎖ポリペプチドは、カッパ（κ）鎖とラムダ（λ）鎖と呼ばれる２つのアイソタイプのみである。抗体アイソタイプの独特の特徴は、重鎖の定常ドメインの配列によって規定される。

【0097】

ＩｇＧ分子は、ジスルフィド結合によって結合された２つの軽鎖（κ型又はλ型）と２つの重鎖（γ型）を含む。ＩｇＧ軽鎖のκ型とλ型にはそれぞれ、可変領域（「Ｖ_Ｌ領域」、「Ｖ_κ領域」、又は「Ｖ_λ領域」とさまざまに呼ばれる）と呼ばれる比較的変化しやすいアミノ酸配列のドメインと、定常領域（ＣＬ領域）と呼ばれる比較的保存されたアミノ酸配列のドメインが含まれている。同様に、各ＩｇＧ重鎖には、可変領域（Ｖ_Ｈ領域）と１つ又はそれ以上の保存領域が含まれている。完全なＩｇＧ重鎖には、３つの定常ドメイン（「Ｃ_Ｈ１領域」、「Ｃ_Ｈ２領域」、及び「Ｃ_Ｈ３領域」）とヒンジ領域が含まれている。各Ｖ_Ｌ領域又はＶ_Ｈ領域内では、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）とも呼ばれる超可変領域が、比較的保存されたフレームワーク領域（「ＦＲ」）の間に散在している。一般に、軽鎖又は重鎖ポリペプチドの可変領域には、ポリペプチドに沿って次の順序で配置された４つのＦＲと３つのＣＤＲが含まれている。ＮＨ_２－ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－ＣＯＯＨ。ＣＤＲとＦＲが一緒になってＩｇＧ結合部位の３次元構造を決定し、従ってＩｇＧ分子が結合する特定の標的タンパク質又は抗原を決定する。各ＩｇＧ分子は二量体であり、２つの抗原分子に結合できる。二量体ＩｇＧをプロテアーゼであるパパインで切断すると、２つの同じ抗原結合断片（「Ｆａｂ」）と「Ｆｃ」断片又はＦｃドメインが生成される。これは、容易に結晶化されるため、このように呼ばれている。

【0098】

本開示全体を通して使用される「抗体」という用語は、さらに、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている任意のさまざまな方法によって生成される、完全な又は無傷の抗体（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ）分子を指す。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化又はキメラ抗体、ヒト化抗体、脱免疫ヒト抗体、及び完全ヒト抗体が含まれる。抗体は、さまざまな種、例えばヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、チンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、及びマウスなどの哺乳動物などで、作製又は誘導することができる。抗体は、精製抗体又は組み換え抗体であり得る。

【0099】

本明細書で使用されている「エピトープ」という用語は、抗体が結合するタンパク質上の部位を指す。「重複エピトープ」には、少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ）の共通アミノ酸残基が含まれる。

【0100】

１つの実施態様において、本発明の抗体は、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチドに特異的に結合する。本明細書で使用される「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成する２つの分子を指す。通常、結合定数（Ｋ_ａ）が１０^６Ｍ^－１より高い場合、結合は特異的であると見なされる。従って、抗体は、少なくとも１０^６Ｍ^－１（又はそれ以上）（例えば、少なくとも１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、又は１０^１５Ｍ^－１、又はそれ以上（又はそれ以上））のＫ_ａで標的に特異的に結合できる。

【0101】

１つの実施態様において、本発明のＮＫＣＥは、Ｓｉｇｌｅｃ－７に特異的に結合するドメインを含む。

【0102】

抗体がタンパク質抗原に結合するかどうか、及び／又はタンパク質抗原に対する抗体の親和性を決定する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、タンパク質抗原に対する抗体の結合は、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴法（例えば、BIAcore system; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのさまざまな技術を使用して検出及び／又は定量することができる。例えば、Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocols," Humana Press (ISBN: 1588290921)；Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide," W.H. Freeman and Co., NY；Borrebaek (1995) "Antibody Engineering," 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford；Johne et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160: 191-198；Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19- 26；及び Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11 :620-627を参照されたい）。また、米国特許第６，３５５，２４５号も参照されたい。

【0103】

抗体の免疫特異的結合及び交差反応性を分析するために使用することができる免疫測定法には、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降測定法、免疫拡散測定法、凝集測定法、補体結合測定法、免疫放射測定測定法、蛍光免疫測定法、及びプロテインＡ免疫測定法などの技術を使用する競合測定法及び非競合測定法が含まれる。このような測定法は日常的方法であり、当該技術分野でよく知られている。

【0104】

抗体は、抗体とその標的又はエピトープとの相互作用の動力学的パラメータを特徴付けるために、当該技術分野で知られている任意の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの測定法を使用して測定法することもできる。限定されるものではないが、BIAcore機器（Biacore AB; Uppsala, Sweden）；ｌＡｓｙｓ機器（Affinity Sensors; Franklin, Massachusetts）；ＩＢＩＳシステム（Windsor Scientific Limited; Berks, UK）、ＳＰＲ－ＣＥＬＬＩＡシステム（Nippon Laser and Electronics Lab; Hokkaido, Japan）、及びＳＰＲ検出器Spreeta（Texas Instruments; Dallas, Texas）を含む市販されている任意のＳＰＲ機器を、本明細書に記載の方法に使用することができる。例えば、Mullett et al. (2000) Methods 22: 77-91；Dong et al. (2002) Reviews in Mol Biotech 82: 303-323；Fivash et al. (1998) Curr Opin Biotechnol 9: 97-101；及び Rich et al. (2000) Curr Opin Biotechnol 11:54-61を参照されたい。

【0105】

抗体及びその断片は、いくつかの実施態様において「キメラ」であり得る。キメラ抗体及びその抗原結合断片は、２つ以上の異なる種（例えば、マウスとヒト）に由来する部分を含む。キメラ抗体は、所望の特異性を有するマウス可変領域をヒト定常ドメイン遺伝子セグメントにスプライスして産生することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。このようにして、非ヒト抗体を改変して、ヒトの臨床応用（例えば、ヒト被験体における補体関連疾患の治療又は予防方法）にさらに適したものにすることができる。

【0106】

本開示のモノクローナル抗体には、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態が含まれる。ヒト化又はＣＤＲ移植されたｍＡｂは、マウス抗体ほど急速に循環から除去されず、通常は、有害な免疫反応を誘発しないため、ヒトの治療薬として特に有用である。ヒト化抗体を調製する方法は、一般に当該技術分野でよく知られている。例えば、ヒト化は、基本的にWinterと共同研究者らの方法（例えば、Jones et al. (1986) Nature 321 :522-525；Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327；及び Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536を参照）に従って、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることによって実行することができる。また、例えば、Staelens et al. (2006) Mol Immunol 43:1243-1257も参照されたい。いくつかの実施態様において、非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、レシピエント抗体の超可変（ＣＤＲ）領域残基が、所望の特異性、親和性、及び結合能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基に置き換えられたヒト抗体（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基も、対応する非ヒト残基に置き換えられる（いわゆる「逆変異」）。さらに、ファージ表示ライブラリを使用して、抗体配列内の選択された位置のアミノ酸を変化させることができる。ヒト化抗体の特性も、ヒトフレームワークの選択によって影響を受ける。さらに、ヒト化抗体及びキメラ抗体は、例えば親和性又はエフェクター機能などの抗体特性をさらに改善するために、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含むように改変することができる。

【0107】

完全ヒト抗体も本開示に提供される。用語「ヒト抗体」には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域（存在する場合）を有する抗体が含まれる。ヒト抗体には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボの体細胞突然変異によって導入された突然変異）が含まれる場合がある。しかし「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体（すなわち、ヒト化抗体）を含まない。完全ヒト抗体又はヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子を有する（可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、結合（Ｊ）、及び定常（Ｃ）エクソンを有する）トランスジェニックマウスから、又はヒト細胞から得られる場合がある。例えば、現在では、免疫付与により、内因性免疫グロブリン産生がなくてもヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である（例えば、Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551：Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258；Bruggemann et al. (1993) Year in Immunol. 7:33；及び Duchosal et al. (1992) Nature 355:258を参照）。トランスジェニックマウス株は、再構成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子配列を含むように操作することができる。ヒト配列は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の両方をコードし、マウス内で正しく機能し、再構成されてヒトと同様の幅広い抗体レパートリーを提供する。トランスジェニックマウスは、標的タンパク質で免疫される（多様な特定の抗体及びこれらをコードするＲＮＡを作成するため）。そのような抗体の抗体鎖成分をコードする核酸は、次に、動物から表示ベクターにクローニングされ得る。通常、重鎖及び軽鎖配列をコードする核酸の別々の集団がクローニングされ、次に、ベクターへの挿入時に別々の集団が組み合わされ、その結果、ベクターの任意のコピーは、重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせを受け取る。ベクターは抗体鎖を発現するように計画されており、従って、抗体鎖はベクターを含む表示パッケージの外表面に組み立てられ、表示されることができる。例えば、抗体鎖はファージの外表面からのファージコートタンパク質との融合タンパク質として発現され得る。次に、表示パッケージは標的に結合する抗体の表示についてスクリーニングされ得る。

【0108】

従って、いくつかの実施態様において、本開示は、本明細書に記載のマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ又はそれ以上を含む、例えばヒト化、脱免疫、又は霊長類化抗体を提供し、マウスモノクローナル抗体の対応物がその抗原に結合する能力（例えば、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％、あるいは１００％を超える能力）を保持する。

【0109】

さらに、ヒト抗体はファージ表示ライブラリから得ることができる（Hoogenboom et al. (1991) J. Mol. Biol. 227:381；Marks et al. (1991) J. Mol. Biol, 222:581-597；及び Vaughan et al. (1996) Nature Biotech 14:309 (1996)）。合成ヒト抗体Ｖ領域のランダムな組み合わせを使用する合成ファージライブラリを作成することができる。抗原の選択により、Ｖ領域が本質的にヒトに非常に類似した完全ヒト抗体を作成することができる。例えば、米国特許第６，７９４，１３２号、第６，６８０，２０９号、第４，６３４，６６６号、及びOstberg et al. (1983), Hybridoma 2:361- 367を参照されたい。これらの各文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0110】

ヒト抗体の生成については、Mendez et al. (1998) Nature Genetics 15: 146-156 及び Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495も参照されたい。これらの文献の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒト抗体については、米国特許第５，９３９，５９８号、第６，６７３，９８６号、第６，１１４，５９８号、第６，０７５，１８１号、第６，１６２，９６３号、第６，１５０，５８４号、第６，７１３，６１０、及び第６，６５７，１０３号、ならびに米国特許出願公開番号２００３－０２２９９０５Ａ１、２００４－００１０８１０Ａ１、ＵＳ２００４－００９３６２２Ａ１、２００６－００４０３６３Ａ１、２００５－００５４０５５Ａ１、２００５－００７６３９５Ａ１、及び２００５－０２８７６３０Ａ１でさらに考察及び詳述されている。また、国際公開番号ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、及びＷＯ９８／２４８９３、並びに欧州特許番号ＥＰ０４６３１５１Ｂ１も参照されたい。上記の各特許、出願、及び参考文献の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0111】

代替アプローチとして、GenPharm International, Inc.を含む他の企業は、「ミニローカス」アプローチを利用している。ミニローカスアプローチでは、Ｉｇローカスの一部（個々の遺伝子）を含めることで、外因性Ｉｇローカスを模倣する。従って、１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子、１つ又はそれ以上のＤＨ遺伝子、１つ又はそれ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域、及び第２の定常領域（好ましくは、γ定常領域）が、動物に挿入するための構成物に形成される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，６２５，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、及び第５，８１４，３１８号、第５，５９１，６６９号、第５，６１２，２０５号、第５，７２１，３６７号、第５，７８９，２１５号、第５，６４３，７６３号、第５，５６９，８２５号、第５，８７７，３９７号、第６，３００，１２９号、第５，８７４，２９９号、第６，２５５，４５８号、及び第７，０４１，８７１号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。また、欧州特許第０５４６０７３Ｂｌ号、国際特許公開ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９２／２２６４５号、ＷＯ９２／２２６４７号、ＷＯ９２／２２６７０号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／００５６９号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９６／１４４３６号、ＷＯ９７／１３８５２号、及びＷＯ９８／２４８８４号も参照されたい。これらの各特許の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 6287；Chen et al. (1993) Int. Immunol. 5: 647；Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-4；Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 1 17；Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-859；Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591 ；Tuaillon et al. (1995) J. Immunol. 154: 6453- 65；Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845；及び Tuaillon et al. (2000) Eur. J. Immunol. 10: 2998-3005を参照されたい。これらの各文献の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0112】

いくつかの実施態様において、脱免疫抗体又はその抗原結合断片が提供される。脱免疫抗体又はその抗原結合断片は、抗体又はその抗原結合断片が特定の種（例えば、ヒト）に対して非免疫原性又は低免疫原性になるように改変された抗体である。脱免疫は、当業者に公知のさまざまな技術のいずれかを使用して、融合タンパク質、抗体、又はその断片を改変することによって達成することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０４／１０８１５８及びＷＯ００／３４３１７を参照）。例えば、融合タンパク質、抗体、又はその断片は、融合タンパク質、抗体、又はその断片のアミノ酸配列内の潜在的なＴ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープを特定し、例えば組換え技術を使用して、融合タンパク質、抗体、又はその断片から潜在的なＴ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープの１つ又はそれ以上を除去することによって脱免疫することができる。次に、改変された抗体又はその抗原結合断片を任意選択的に生成し、試験して、例えば結合親和性などの１つ又はそれ以上の所望の生物学的活性を保持しているが、免疫原性が低下した抗体又はその抗原結合断片を特定することができる。潜在的なＴ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープを同定する方法は、当該技術分野で公知の技術、例えば、計算方法（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０６９２３２を参照）、インビトロ又はインシリコ（in silico）技術、及び生物学的測定法又は物理的方法（例えば、ペプチドのＭＨＣ分子への結合の決定、融合タンパク質、抗体、若しくはその断片を受け取る種のＴ細胞受容体へのペプチド：ＭＨＣ複合体の結合の決定、抗体又はその抗原結合断片を受け取る種のＭＨＣ分子を有するトランスジェニック動物を使用するタンパク質又はそのペプチド部分の試験、又は融合タンパク質、抗体、若しくはその断片を受け取る種の免疫系細胞で再構成されたトランスジェニック動物を使用する試験など）を使用して実行することができる。様々な実施態様において、本明細書に記載の脱免疫抗体には、脱免疫抗原結合断片、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２、モノクローナル抗体、マウス抗体、工学作成抗体（例えば、キメラ抗体、単鎖抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び人工的に選択された抗体など）、合成抗体、及び半合成抗体が含まれる。

【0113】

いくつかの実施態様において、本開示は二重特異性抗体も提供する。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。例えば、１つの実施態様において、本発明のＮＫＣＥは、Ｓｉｇｌｅｃタンパク質又はポリペプチドに対する結合特異性を有する１つのドメインと、代替タンパク質又はポリペプチドに対する結合特異性を有する１つのドメインとを含む。１つの実施態様において、本発明のＮＫＣＥは、Ｓｉｇｌｅｃタンパク質又はポリペプチドに対する結合特異性を有する１つのドメインと、代替Ｓｉｇｌｅｃタンパク質又はポリペプチドに対する結合特異性を有する１つのドメインとを含む。

【0114】

ＮＫＣＥの製造方法は、当業者の知識の範囲内である。従来、二重特異性抗体の組み換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいており、ここで、２つの重鎖／軽鎖対は異なる特異性を有する（Milstein and Cuello (1983) Nature 305:537- 539）。所望の結合特異性（抗体抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。重鎖可変領域の融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に共トランスフェクションされる。二重特異性抗体を生成するための現在知られている例示的な方法の詳細については、例えば、Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121 :210；ＰＣＴ公開番号WO 96/27011；Brennan et al. (1985) Science 229:81；Shalaby et al, J Exp Med (1992) 175:217-225；Kostelny et al. (1992) J Immunol 148(5): 1547-1553；Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448；Gruber et al. (1994) J Immunol 152:5368；及び Tutt et al. (1991) J Immunol 147:60を参照されたい。二重特異性抗体にはまた、架橋抗体又はヘテロ結合抗体も含まれる。ヘテロ結合抗体は、任意の便利な架橋方法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当該技術分野で公知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、多数の架橋技術とともに開示されている。

【0115】

組み換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体断片を作製及び単離するためのさまざまな技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して作製されている。例えば、Kostelny et al. (1992) J Immunol 148(5): 1547-1553を参照。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結することができる。抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次に再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成することができる。この方法は、抗体ホモダイマーの作製にも利用できる。Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448に記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作成するための代替メカニズムを提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対合するように強制され、こうして２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ダイマーを使用して二重特異性抗体断片を作成する別の戦略も報告されている。例えば、Gruber et al. (1994) J Immunol 152:5368を参照されたい。あるいは、抗体は、例えば、Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062に記載されているように「線形抗体」であってもよい。簡単に説明すると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性又は単一特異性であり得る。

【0116】

３価以上の抗体（例えば、三重特異性抗体）も考慮され、例えばTutt et al. (1991) J Immunol 147:60に記載されている。

【0117】

本開示はまた、Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25(11): 1290-1297に記載されている二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－ｌｇ）分子などの多重特異性抗体の変種も含む。ＤＶＤ－ｌｇ分子は、２つの異なる親抗体からの２つの異なる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、組換えＤＮＡ技術によって直接、又は短いリンカーを介してタンデムに連結され、次に軽鎖定常ドメインが続くように設計される。同様に、重鎖はタンデムに連結された２つの異なる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続く定常ドメインＣＨ１及びＦｃ領域とを含む。２つの親抗体からＤＶＤ－Ｉｇ分子を作成する方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／０２４１８８及びＷＯ０７／０２４７１５にさらに記載される。

【0118】

本開示はまた、ラクダ科又はヒトコブラクダの抗体（例えば、Camelus bactrianus、Calelus dromaderius、又はlama paccoss由来の抗体）も提供する。このような抗体は、ほとんどの哺乳動物からの典型的な２鎖（断片）又は４鎖（全抗体）抗体とは異なり、一般に軽鎖を欠く。米国特許第５，７５９，８０８号；Stijlemans et al. (2004) J Biol Chem 279: 1256-1261；Dumoulin et al. (2003) Nature 424:783-788；及び Pleschberger et al. (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448を参照されたい。

【0119】

ラクダ科抗体及び抗体断片の工学作成ライブラリは、例えばAblynx (Ghent, Belgium)から市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラクダ科抗体のアミノ酸配列は組み換え的に改変して、ヒト配列により厳密に類似した配列を得ることができる。すなわち、ナノボディを「ヒト化」して、抗体の潜在的な免疫原性をさらに低減することができる。

【0120】

いくつかの実施態様において、本開示はまた、本明細書に記載のペプチド、タンパク質、又は抗体の変種である抗体又はその抗原結合断片も提供する。いくつかの実施態様において、このような変異ペプチド、タンパク質、又は抗体は、親ペプチド、タンパク質、又は抗体の結合能力若しくは阻害能力を維持する。既知のタンパク質、ペプチド、又は抗体の変種を調製する方法は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施態様において、このような変種は、少なくとも単一のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は他の改変を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の融合タンパク質、抗体、若しくはその断片は、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上）のアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸の置換、欠失、又は付加）を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の融合タンパク質、抗体、又はその断片は、ＣＤＲにアミノ酸修飾を含まない。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の融合タンパク質、抗体、又はその断片は、ＣＤＲに１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０）のアミノ酸修飾を含む。

【0121】

本明細書で使用される用語「抗体断片」、「抗原結合断片」、「抗原結合断片」、又は類似の用語は、抗原に結合する能力を保持する抗体の断片を指し、ここで、抗原結合断片には、元の抗体の一部ではない追加の組成物（例えば、異なるフレームワーク領域又は変異）と元の抗体からの断片が任意選択的に含まれてもよい。例としては、限定されるものではないが、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ’）_２断片が含まれる。ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖの由来となる抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方を含む単一のポリペプチド鎖である。さらに、補体成分タンパク質に結合するダイアボディ（Poljak (1994) Structure 2(12): 1121-1123; Hudson et al. (1999) J. Immunol. Methods 23(1-2): 177-189、これらのそれぞれの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ミニボディ、トリアボディ（Schoonooghe et al. (2009) BMC Biotechnol 9:70）、及びドメイン抗体（「重鎖免疫グロブリン」とも呼ばれる、又はラクダ科、Holt et al. (2003) Trends Biotechnol 21(1 1):484-490）（これらのそれぞれの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を組成物に組み込み、本明細書に記載の方法で使用することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の抗原結合断片のいずれかは、抗体に関連する断片を指す場合、「その抗原結合断片」又は同等の用語に含まれる場合があり、そのような断片が実際に抗体に由来するものであるか、同じエピトープ若しくは重複エピトープ若しくは抗体のエピトープに含まれるエピトープに結合する抗原結合断片であるかは関係ない。その抗原結合断片には、元の抗体と同じ又は重複する抗原に結合する抗原結合断片が含まれ、ここで、抗原結合断片には元の抗体の断片である部分（例えば、１つ又はそれ以上のＣＤＲ、１つ又はそれ以上の可変領域など）が含まれる。

【0122】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の抗体は、親抗体と比較して安定性又は半減期が変化している変更又は変異した配列を含む。これには、例えば、インビトロ又はインビボでの親和性の向上若しくはクリアランス時間の延長のために安定性又は半減期が増加するか、又は親和性の低下若しくは除去の迅速化のために安定性又は半減期が減少することが含まれる。さらに、本明細書に記載の抗体は、例えば、グリコシル化パターンの変化（例えば、１つ又はそれ以上の糖成分の添加、１つ又はそれ以上の糖成分の喪失、又は１つ又はそれ以上の糖成分の組成の変化）を含む翻訳後修飾の変化をもたらす１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０）のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を含むことができる。

【0123】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の抗体は、低減された（例えば、又は全くない）エフェクター機能を含む。変更されたエフェクター機能には、例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、アポトーシス、１つ又はそれ以上のＦｃ受容体への結合、及び炎症誘発反応の１つ又はそれ以上の以下の活性の変調が含まれる。変調とは、変更された定常領域を含む対象抗体によって示されるエフェクター機能活性が、変更されていない定常領域の活性と比較して、増加、減少、又は排除されることを指す。特定の実施態様において、変調には、活性が除去されるか完全に存在しない状況が含まれる。

【0124】

変更されたエフェクター機能を有するか又はエフェクター機能のない抗体は、変種定常領域、Ｆｃ、又は重鎖領域を有する抗体を工学作成若しくは製造することによって生成することができ、組み換えＤＮＡ技術及び／又は細胞培養及び発現条件を使用して、変更された機能及び／又は活性を有する抗体を製造することができる。例えば、組み換えＤＮＡ技術を使用して、エフェクター機能を含む抗体機能に影響を及ぼす領域（例えば、Ｆｃ領域又は定常領域など）に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を組み込むことができる。あるいは、例えばグリコシル化パターンなどの翻訳後修飾の変更は、抗体が生成される細胞培養及び発現条件を操作することによって達成することができる。抗体のＦｃ領域に１つ又はそれ以上の置換、付加、又は欠失を導入する適切な方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Harlow and Lane (1988), 前述；Borrebaek (1992), 前述；Johne et al. (1993), 前述；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／５３３０１及び米国特許第７，７０４，４９７号に記載されている標準的なＤＮＡ変異誘発技術が含まれる。

【0125】

核酸分子
本明細書では、本発明のＮＫＣＥ抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドはまた、コード配列の５’末端に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする配列も含む。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドはまた、リンカー配列をコードする配列も含む。

【0126】

１つの実施態様において、核酸分子は、配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、又は配列番号９２のうち少なくとも１つを含むＳｉｇｌｅｃ－７結合アームを含むＮＫＣＥをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0127】

１つの実施態様において、核酸分子は、配列番号９８、配列番号１００、又は配列番号１０２のＮＫＣＥをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0128】

１つの実施態様において、核酸分子は、Ｓｉｇｌｅｃ－７結合アームを含むＮＫＣＥをコードする配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、又は配列番号９６のヌクレオチド配列を含む。

【0129】

１つの実施態様において、核酸分子は、二重特異性ＮＫＣＥをコードする配列番号９７、配列番号９９、又は配列番号１０１のヌクレオチド配列を含む。

【0130】

１つの実施態様において、核酸分子は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９９、又は配列番号１０１のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列に対応するＲＮＡ分子を含む。

【0131】

１つの実施態様において、核酸分子は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９９、又は配列番号１０１のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ分子を含む。

【0132】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のヌクレオチド配列の変種は、定義されたヌクレオチド配列と比較した場合、指定された領域にわたって、少なくとも約６０％の同一性、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のヌクレオチド配列の変種は、配列番号８，配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９９、又は配列番号１０１のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約６０％の同一性、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性を含む。

【0133】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のヌクレオチド配列の断片は、定義されたヌクレオチド配列の全長配列の、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のヌクレオチド配列の断片は、配列番号８，配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９９、又は配列番号１０１の全長配列の、少なくとも約６０％の同一性、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性を含む。

【0134】

単離された核酸は、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡを含む任意のタイプの核酸を含むことができる。１つの実施態様において、組成物は、ＮＫＣＥ又はその機能性断片をコードする単離されたＲＮＡ分子を含む。

【0135】

本発明の核酸分子は、安定性を改善するために修飾することができる。修飾は、本発明の核酸分子の安定性、機能性、及び／又は特異性を高めるために、及び免疫刺激特性を最小限に抑えるために加えることができる。例えば、安定性を上昇させるために、３’残基は分解に対して安定化することができ、例えば、これらは、プリンヌクレオチド、特にアデノシン又はグアノシンヌクレオチドからなるように選択してもよい。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば２’－デオキシチミジンによるウリジンの置換は許容され、分子の機能に影響を与えない。

【0136】

本発明の１つの実施態様において、核酸分子は少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類似体を含み得る。例えば、末端は修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことによって安定化することができる。

【0137】

ヌクレオチド類似体の非限定的な例には、糖修飾及び／又は骨格修飾骨格リボヌクレオチド（すなわち、リン酸－糖骨格への修飾を含む）が挙げられる。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素又は硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように修飾され得る。例示的な骨格修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに結合しているリン酸エステル基が、例えばホスホチオエート基の修飾された基によって置換されている。

【0138】

他の修飾の例は、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然核酸塩基の代わりに少なくとも１つの非天然核酸塩基を含むリボヌクレオチドである。塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を阻害するように修飾されてもよい。例示的な修飾核酸塩基には、限定されるものではないが、５位で修飾されたウリジン及び／又はシチジン、例えば５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシン及び／又はグアノシン、例えば８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７－デアザアデノシン；Ｏ－アルキル化及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６－メチルアデノシンが適している。上記の修飾は組み合わせることもできる。

【0139】

いくつかの例では、核酸分子は、以下の化学修飾（１つ又はそれ以上のヌクレオチドの２’－Ｈ、２’－Ｏ－メチル、又は２’－ＯＨ修飾）の少なくとも１つを含む。いくつかの実施態様において、本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼに対する耐性が強化されている可能性がある。ヌクレアーゼ耐性を上昇させるために、核酸分子には、例えば、２’－修飾リボース単位及び／又はホスホロチオエート結合を含めることができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾又は置換することができる。ヌクレアーゼ耐性を上昇させるために、本発明の核酸分子には、２’－Ｏ－メチル、２’－フッ素、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－アミノ、及び／又はホスホロチオエート結合を含めることができる。ロックされた核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、例えば２’－４’－エチレン架橋核酸、及び特定の核酸塩基修飾、例えば２－アミノ－Ａ、２－チオ（例えば２－チオ－Ｕ）、Ｇ－クランプ修飾などを含めると、標的への結合親和性も高めることができる。

【0140】

１つの実施態様において、核酸分子は、２’－修飾ヌクレオチド、例えば、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。１つの実施態様において、核酸分子は、少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、及びいくつかの実施態様において、核酸分子のヌクレオチドのすべてが２’－Ｏ－メチル修飾を含む。

【0141】

本明細書で論じる核酸剤には、本来は修飾されていないＲＮＡ及びＤＮＡ、並びに、例えば有効性を向上させるために修飾されたＲＮＡ及びＤＮＡ、及びヌクレオシド代用物のポリマーが含まれる。非修飾ＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち糖、塩基、及びリン酸部分が、自然に存在するものと、例えば人体に自然に存在するものと同じか又は本質的に同じである分子を指す。当該技術分野では、稀で又は珍しいが自然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと呼んでおり、例えばLimbach et al. (Nucleic Acids Res., 1994, 22:2183-2196)を参照されたい。このような稀で又は珍しいＲＮＡは、しばしば修飾ＲＮＡと呼ばれ、通常は転写後修飾の結果であり、本明細書で使用されている用語「非修飾ＲＮＡ」の範囲内である。本明細書で使用されている修飾ＲＮＡとは、核酸の成分の１つ又はそれ以上、すなわち糖、塩基、及びリン酸部分が、自然界に存在するものと異なり、例えば人体に存在するものと異なる分子を指す。これらは「修飾ＲＮＡ」と呼ばれているが、修飾されているため、厳密に言えばＲＮＡではない分子も当然含まれる。ヌクレオシド代用物は、リボリン酸骨格が非リボリン酸構築物に置き換えられた分子であり、これにより塩基が正しい空間関係で提示され、ハイブリダイゼーションがリボリン酸骨格で見られるものと実質的に類似したものになる（例えば、リボリン酸骨格の非荷電模倣物）。

【0142】

本発明の核酸の修飾は、リン酸基、糖基、骨格、Ｎ末端、Ｃ末端、又は核酸塩基の１つ又はそれ以上に存在し得る。

【0143】

本発明はまた、本発明の単離核酸が挿入されたベクターも含む。当該技術分野には、本発明に有用な適切なベクターが豊富に存在する。

【0144】

従って、別の態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列又は本発明の構築物を含むベクターに関する。ベクターの選択は、次に導入される宿主細胞に依存する。いくつかの実施態様において、本発明のベクターは発現ベクターである。適切な宿主細胞には、多種多様な原核生物及び真核生物の宿主細胞が含まれる。特定の実施態様において、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター、及び哺乳動物細胞ベクターからなる群から選択される。原核生物及び／又は真核生物ベクターベースのシステムは、本発明でポリヌクレオチド又はその同族ポリペプチドを生成するために使用することができる。そのようなシステムの多くは、市販されており、広く入手可能である。

【0145】

いくつかの実施態様において、タンパク質をコードする合成核酸の発現は、通常、タンパク質又はその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。使用されるベクターは、真核細胞への複製及び任意選択的に組み込みに適している。典型的なベクターには、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターが含まれる。

【0146】

組換え核酸配列構築物は、１つ又はそれ以上の転写終結領域を含むことができる。転写終結領域は、効率的な終結を提供するためにコード配列の下流にあってもよい。転写終結領域は、上記のプロモーターと同じ遺伝子から取得することも、１つ又はそれ以上の異なる遺伝子から取得することもできる。

【0147】

組換え核酸配列構築物は、１つ又はそれ以上の開始コドンを含むことができる。開始コドンは、コード配列の上流にあってもよい。開始コドンは、コード配列とインフレームにあってもよい。開始コドンは、効率的な翻訳開始に必要な１つ又はそれ以上のシグナル、例えば、限定されるものではないが、リボソーム結合部位と関連付けることができる。

【0148】

組換え核酸配列構築物は、１つ又はそれ以上の終止コドン又は停止コドンを含むことができる。終止コドンは、コーディング配列の下流にあってもよい。終止コドンは、コーディング配列とインフレームにあってもよい。終止コドンは、効率的な翻訳終了に必要な１つ又はそれ以上のシグナルと関連付けることができる。

【0149】

組換え核酸配列構築物は、１つ又はそれ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、転写物の効率的なポリアデニル化に必要な１つ又はそれ以上のシグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、コーディング配列の下流に配置することができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、又はヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Invitrogen, San Diego, CA）からのポリアデニル化シグナルであってもよい。

【0150】

組み換え核酸配列構築物は、１つ又はそれ以上のリーダー配列を含むことができる。リーダー配列は、シグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチド、限定されるものではないが、例えばＩｇＧシグナルペプチド及びＩｇＥシグナルペプチドであり得る。

【0151】

本発明のベクターは、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して、核酸免疫に使用することもできる。遺伝子送達の方法は、当該技術分野で公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号を参照されたい。

【0152】

本発明の単離された核酸は、多くのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば核酸は、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシーケンシングベクターが含まれる。

【0153】

さらに、ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 及びその他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物で機能する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ又はそれ以上の選択マーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号）。

【0154】

さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、Sambrook et al. (2012), and in Ausubel et al. (1997)、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれる。一般に、適切なベクターには、少なくとも１つの生物において機能する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカーが含まれてい（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号を参照）。

【0155】

例として、核酸配列が導入されるベクターはプラスミドでもよく、これは、細胞に導入されたときに、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか又は組み込まれない。本発明のヌクレオチド配列又は本発明の遺伝子構築物を挿入することができるベクターの例示的な非限定的な例としては、真核細胞での発現のためのテトオン誘導性ベクター（tet-on inducible vector）が挙げられる。

【0156】

ベクターは、当業者に公知の従来の方法によって得ることができる（Sambrooketal., 2012）。特定の実施態様において、ベクターは、動物細胞を形質転換するのに有用なベクターである。

【0157】

１つの実施態様において、組換え発現ベクターは、本明細書の他の箇所で説明されている本発明のペプチド又はタンパク質をコードする核酸分子も含み得る。

【0158】

哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多数のウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該技術分野で知られている技術を使用してベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージ化され得る。次に、組み換えウイルスを単離し、インビボ又はインビトロで対象の細胞に送達することができる。当該技術分野では、多数のレトロウイルス系が知られている。いくつかの実施態様において、アデノウイルスベクターが使用される。当該技術分野では、多数のアデノウイルスベクターが知られている。１つの実施態様において、レンチウイルスベクターが使用される。

【0159】

例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、トランス遺伝子の長期にわたる安定した統合と娘細胞でのその増殖を可能にするため、長期の遺伝子移入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルス由来のベクターに比べて、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できるという追加の利点がある。これらはまた、免疫原性が低いという追加の利点もある。１つの実施態様において、組成物にはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のベクターが含まれる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、さまざまな疾患の治療のための強力な遺伝子送達ツールとなっている。ＡＡＶベクターは病原性がなく、免疫原性が最小限で、有糸分裂後の細胞に安定して効率的に形質導入できるなど、遺伝子治療に理想的な多くの特徴を備えている。ＡＡＶベクターに含まれる特定の遺伝子の発現は、ＡＡＶ血清型、プロモーター、及び送達方法の適切な組み合わせを選択することで、１つ又はそれ以上の種類の細胞に特異的に標的化できる。

【0160】

いくつかの実施態様において、ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクションされた細胞又は本発明によって生成されたウイルスに感染した細胞における転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする方法で、トランス遺伝子に作動可能に連結された従来の制御要素も含む。ここで使用される「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は離れた場所で作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列；スプライシングシグナルやポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡ処理シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を上昇させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を上昇させる配列；及び必要に応じて、コードされた生成物の分泌を上昇させる配列を含む。未変性の、構成性、誘導性、及び／又は組織特異的なプロモーターを含む多数の発現制御配列が当該技術分野で知られており、利用することができる。

【0161】

プロモーターは、遺伝子又はポリヌクレオチド配列に自然に関連付けられているものであり、コーディングセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得することができる。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれることがある。同様に、エンハンサーはポリヌクレオチド配列に自然に関連付けられているものであり、その配列の下流又は上流に位置する。あるいは、コーディングポリヌクレオチドセグメントを、その自然環境では通常ポリヌクレオチド配列に関連付けられないプロモーターを指す組換え又は異種プロモーターの制御下に配置することによって、特定の利点が得られる。組換え又は異種エンハンサーはまた、その自然環境では通常ポリヌクレオチド配列に関連付けられないエンハンサーも指す。このようなプロモーター又はエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、他の原核生物、ウイルス、又は真核生物細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「自然に存在する」ものではないプロモーター又はエンハンサー、すなわち、異なる転写調節領域の異なる要素、及び／又は発現を変化させる突然変異が含まれる可能性がある。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、本明細書に開示された組成物に関連して、組み換えクローニング及び／又はＰＣＲを含む核酸増幅技術を使用して配列を生成することもできる（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核器官内の配列の転写及び／又は発現を指示する制御配列も使用することができると考えられる。

【0162】

当然、発現のために選択された細胞タイプ、器官、及び生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することが重要になるであろう。分子生物学の分野の当業者は、一般に、タンパク質発現のためにプロモーター、エンハンサー、及び細胞タイプの組み合わせを使用する方法を知っている。例えば、Sambrook et al. (2012) を参照されたい。使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導的であり、及び／又は適切な条件下で、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を誘導するのに有用であり、これは組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模生産に有利である。プロモーターは異種又は内因性であり得る。

【0163】

組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子も含み得る。適切な選択マーカー遺伝子は、特定の薬物に対する耐性を付与するＧ４１８及びヒグロマイシンなどのタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、又は免疫グロブリン若しくはその一部、例えばＩｇＧなどの免疫グロブリンのＦｃ部分をコードする遺伝子である。選択マーカーは、目的の核酸とは別のベクターに導入され得る。

【0164】

追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域にあるが、最近、いくつかのプロモーターが開始部位の下流にも機能要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の間隔は柔軟性が高いことが多いため、要素が反転したり、互いに対して移動したりしても、プロモーターの機能は保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーター要素間の間隔を５０ｂｐまで広げると、活性が低下し始める。プロモーターによっては、個々の要素が協力して、又は独立して機能して転写を活性化できるようである。

【0165】

適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、これに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強力な構成性プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）である。しかし、他の構成性プロモーター配列も使用することができ、これらには、限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されるものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが含まれる。さらに、本発明は構成性プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として考慮されている。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれる場合に、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、発現が望まれない場合は発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、限定されるものではないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、テトラサイクリンプロモーターなどが含まれる。

【0166】

ベクター上に存在するエンハンサー配列も、そこに含まれる遺伝子の発現を制御する。通常、エンハンサーはタンパク質因子と結合して遺伝子の転写を促進する。エンハンサーは、制御する遺伝子の上流又は下流に位置し得る。エンハンサーは、特定の細胞又は組織タイプでの転写を促進するために組織特異的であってもよい。１つの実施態様において、本発明のベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写を促進する１つ又はそれ以上のエンハンサーを含む。

【0167】

タンパク質阻害剤の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクション又は感染させようとする細胞集団から、発現細胞を同定及び選択しやすくするための選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれか、又はその両方も含み得る。他の態様において、選択マーカーは別のＤＮＡ片に載せられ、共トランスフェクション操作で使用される。選択マーカー及びレポーター遺伝子は両方とも、宿主細胞での発現を可能にするために適切な調節配列に隣接され得る。有用な選択マーカーには、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。

【0168】

レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクションされた細胞を特定し、調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、受容生物若しくは組織には存在しないか又は受容生物若しくは組織によって発現されず、その発現が酵素活性などの容易に検出可能な特性によって現れるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡが受容細胞に導入された後、適切な時点で測定される。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。適切な発現システムはよく知られており、既知の技術を使用して調製するか、又は市販されている。一般に、レポーター遺伝子の発現レベルが最も高い最小限の５’フランキング領域を有する構築物がプロモーターとして特定される。このようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結されており、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。

【0169】

細胞に遺伝子を導入して発現させる方法は、当該技術分野で公知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野の任意の方法によって、例えば哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞などの宿主細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。

【0170】

ペプチド又はタンパク質を宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、微量注入法などが含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を生成する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) を参照されたい。

【0171】

目的のペプチド又はタンパク質を宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えばヒト細胞に挿入するための最も広く使用される方法である。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどから得ることができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び第５，５８５，３６２号を参照されたい。

【0172】

ペプチド又はタンパク質を宿主細胞に導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースのシステムが含まれる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとして使用される例示的なコロイドシステムは、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

【0173】

非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。核酸を宿主細胞に導入するために（インビトロ、エクスビボ、又はインビボ）、脂質製剤の使用が考慮される。別の態様において、核酸は脂質と関連している可能性がある。脂質と関連している核酸は、リポソームの水性内部に封入されるか、リポソームの脂質二重層内に散在するか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と関連している連結分子を介してリポソームに付着するか、リポソームに閉じ込められるか、リポソームと複合体化されるか、脂質を含む溶液に分散されるか、脂質と混合されるか、脂質と組み合わされるか、脂質中に懸濁液として含まれるか、ミセル又は脂質ナノ粒子に含まれるか、又は他の方法で脂質と関連している可能性がある。脂質、脂質／ＤＮＡ、又は脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、これらは二重層構造内、ミセルとして、又は「崩壊した」構造で存在してもよい。また、単に溶液中に散在しているだけの場合もあり、サイズや形状が均一でない凝集体を形成する場合もある。脂質は脂肪性物質であり、天然脂質又は合成脂質であり得る。例えば、脂質には、細胞質に天然に存在する脂肪滴のほか、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。

【0174】

使用に適した脂質は、市販の供給元から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Sigma, St. Louis, MO から入手できる；ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）は、K & K Laboratories (Plainview, NY) から入手できる；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は Calbiochem-Behring から入手できる；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及びその他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL) から入手できる。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質の保存溶液は、約－２０℃で保存できる。クロロホルムはメタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、密閉された脂質二重層又は凝集体の生成によって形成されるさまざまな単層及び多層脂質ビヒクルを含む一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重膜と内部水性媒体を備えた小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されると自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再配置を起こし、脂質二重層の間に水と溶解した溶質を閉じ込める（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかし、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も含まれる。例えば、脂質はミセル構造をとったり、脂質分子の不均一な凝集体として存在したりする。リポフェクタミン－核酸複合体も考慮される。

【0175】

ＳｃＦｖ抗体
１つの実施態様において、抗体断片はｓｃＦｖ断片を含む。１つの実施態様において、ＳｃＦｖ抗体断片は、ＣＨ１領域とＣＬ領域のないＦａｂ断片に関する。従って、１つの実施態様において、ｓｃＦｖ抗体断片はＶＨとＶＬを含むＦａｂ断片に関連する。１つの実施態様において、ｓｃＦｖ抗体断片はＶＨとＶＬの間にリンカーを含む。１つの実施態様において、ｓｃＦｖ抗体断片は、ＶＨ、ＶＬ、並びに、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。１つの実施態様において、本発明のｓｃＦｖ抗体断片は、親ＭＡｂと比較して、発現、安定性、半減期、抗原結合、重鎖－軽鎖対合、組織浸透、又はこれらの組み合わせが修飾されている。

【0176】

１つの実施態様において、本発明のｓｃＦｖ抗体断片は、親ＭＡｂよりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、又は５０倍を超える高い発現を有する。

【0177】

１つの実施態様において、本発明のｓｃＦｖ抗体断片は、親ＭＡｂよりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍の、又は５０倍を超える抗原結合性を有する。

【0178】

１つの実施態様において、本発明のｓｃＦｖ抗体断片は、親ＭＡｂよりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍の、又は５０倍を超える長い半減期を有する。

【0179】

１つの実施態様において、本発明のｓｃＦｖ抗体断片は、親ＭＡｂよりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍の、又は５０倍を超える高い安定性を有する。

【0180】

１つの実施態様において、本発明のｓｃＦｖ抗体断片は、親ＭＡｂよりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍の、又は５０倍を超える組織浸透性を有する。

【0181】

１つの実施態様において、本発明のｓｃＦｖ抗体断片は、親ＭＡｂよりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍の、又は５０倍を超える重鎖－軽鎖対合を有する。

【0182】

送達ビヒクル
１つの実施態様において、本発明は、本明細書に記載のＮＫＣＥ、その断片、又はそれをコードする核酸分子を含む送達ビヒクルを含む組成物を提供する。１つの実施態様において、ＮＫＣＥをコードする核酸分子はｍＲＮＡ分子を含む。

【0183】

例示的な送達ビヒクルは、限定されるものではないが、ミクロスフェア、微粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、リポソーム、及びミセルを含む。例えば、いくつかの実施態様において、送達ビヒクルは、本発明のＮＫＣＥ又はその断片をコードする核酸分子をロードした脂質ナノ粒子である。１つの実施態様において、ＮＫＣＥをコードする核酸分子はｍＲＮＡ分子を含む。

【0184】

いくつかの実施態様において、送達ビヒクルは、その積荷の制御放出、遅延放出、又は連続放出を提供する。いくつかの実施態様において、送達ビヒクルは、送達ビヒクルを治療部位に標的化する標的化部分を含む。

【0185】

場合によっては、コード性ｍＲＮＡを送達してタンパク質を発現させることは、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、又はウイルスベクターを使用する方法に比べて多くの利点がある。ｍＲＮＡトランスフェクション中、所望のタンパク質のコード配列は細胞に送達される唯一の物質であるため、プラスミド骨格、ウイルス遺伝子、及びウイルスタンパク質に関連するすべての副作用を回避することができる。さらに重要なことは、ＤＮＡベース及びウイルスベースのベクターとは異なり、ｍＲＮＡはゲノムに組み込まれるリスクがなく、ｍＲＮＡ送達後すぐにタンパク質の生成が開始されることである。例えば、コード性ｍＲＮＡのインビボ注入後１５～３０分以内に、高レベルの循環タンパク質が測定されている。特定の実施態様において、タンパク質ではなくｍＲＮＡを使用することにも多くの利点がある。循環中のタンパク質の半減期は短いことが多いため、タンパク質治療には頻繁な投与が必要であるが、ｍＲＮＡは数日間にわたる継続的なタンパク質生成のテンプレートを提供する。タンパク質の精製は問題が多く、有害作用を引き起こす凝集体やその他の不純物が含む可能性がある（Kromminga and Schellekens, 2005, Ann NY Acad Sci 1050:257-265）。

【0186】

宿主細胞内のｍＲＮＡ配列の存在を確認するために、さまざまな測定法を実施することができる。このような測定法には、当業者に公知の「分子生物学的」測定法、例えば、ノーザンブロッティングやＲＴ－ＰＣＲ、「生化学的」測定法、例えば免疫原性手段（ＥＬＩＳＡやウエスタンブロット）による、又は本発明の範囲内の薬剤を同定するための本明細書に記載の測定法による、特定のペプチドの有無の検出などが含まれる。

【0187】

ＣＡＲ分子
１つの実施態様において、本発明は、本発明のＮＫＣＥを含む結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。１つの実施態様において、ＣＡＲは抗原結合ドメインを含む。１つの実施態様において、抗原結合ドメインは標的ドメインであり、ここで、標的ドメインは、ＣＡＲを発現する細胞をシアル酸結合受容体を発現する細胞又は粒子に誘導する。

【0188】

様々な実施態様において、ＣＡＲは、「第１世代」、「第２世代」、「第３世代」、「第４世代」、又は「第５世代」のＣＡＲであり得る（例えば、Sadelain et al., Cancer Discov. 3(4):388-398 (2013); Jensen et al., Immunol. Rev. 257:127-133 (2014); Sharpe et al., Dis. Model Mech. 8(4):337-350 (2015); Brentjens et al., Clin. Cancer Res. 13:5426-5435 (2007); Gade et al., Cancer Res. 65:9080-9088 (2005); Maher et al., Nat. Biotechnol. 20:70-75 (2002); Kershaw et al., J. Immunol. 173:2143-2150 (2004); Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol. (2009); Hollyman et al., J. Immunother. 32:169-180 (2009) 参照）。

【0189】

本発明で使用される「第１世代」ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、例えばＴ細胞受容体鎖の細胞質／細胞内ドメインに融合された膜貫通ドメインに融合された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。「第１世代」ＣＡＲは、通常、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）からのシグナルの主要な伝達物質であるＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインを有する。「第１世代」ＣＡＲは、ＨＬＡ媒介抗原提示とは無関係に、単一の融合分子内のＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを介して、新規抗原認識を提供し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を活性化することができる。

【0190】

本発明で使用される「第２世代」ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、例えば、Ｔ細胞を活性化できる細胞内シグナル伝達ドメインと、Ｔ細胞の効力及び持続性を上昇させるように計画された共刺激ドメインと融合した単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む（Cancer Discov. 3:388-398 (2013)）。従って、ＣＡＲ設計では、生理学的には２つの別個の複合体であるＴＣＲヘテロダイマーとＣＤ３複合体が担う２つの機能である抗原認識とシグナル伝達を組み合わせることができる。「第２世代」ＣＡＲには、細胞に追加のシグナルを提供するために、ＣＡＲの細胞質テールに、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０などのさまざまな共刺激分子の細胞内ドメインが含まれる。

【0191】

「第２世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８又は４－１ＢＢドメインによる共刺激と、例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる活性化の両方を提供する。前臨床研究では、「第２世代」ＣＡＲがＴ細胞の抗腫瘍活性を改善できることが示されている。例えば、「第２世代」ＣＡＲ改変Ｔ細胞の強力な有効性は、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の患者におけるＣＤ１９分子を標的とする臨床試験で証明された（Davila et al., Oncoimmunol. 1(9):1577-1583 (2012)）。

【0192】

「第３世代」ＣＡＲは、ＣＤ２８及び４－１ＢＢドメインの両方を含むことによる複数の共刺激と、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含むことによる活性化を提供する。

【0193】

「第４世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８又は４－１ＢＢドメインによる共刺激、及び構成性又は誘導性ケモカイン成分に加えて、例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる活性化を提供する。

【0194】

「第５世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８又は４－１ＢＢドメインによる共刺激、及び例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、構成性又は誘導性ケモカイン成分、及びサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（例えばＩＬ－２Ｒβ）による活性化を提供する。

【0195】

さまざまな実施態様において、ＣＡＲは、多価ＣＡＲシステム（例えば二重ＣＡＲ又は「タンデムＣＡＲ」システム）に含めることができる。多価ＣＡＲシステムには、複数のＣＡＲを含むシステム又は細胞、及び複数の抗原を標的とする二価／二重特異性ＣＡＲを含むシステム又は細胞が含まれる。

【0196】

本明細書に開示される実施態様において、ＣＡＲは一般的に、上記のように、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。特定の非限定的な実施態様において、抗原結合ドメインは、シアル酸結合受容体への結合に特異的な二重特異性シアル酸結合受容体抗体又はその変種である。

【0197】

基質
１つの実施態様において、本発明は、ＮＫＣＥ、その断片、又はそれをコードする核酸分子を含む足場、基質、又はデバイスを提供する。例えば、いくつかの実施態様において、本発明は、モジュレーターを含む組織工学足場（限定されるものではないが、ヒドロゲル、電気スピン足場、ポリマーマトリックスなどを含む）を提供する。特定の実施態様において、ＮＫＣＥ、その断片、又はそれをコードする核酸分子は、足場、基質、又はデバイスの表面に沿ってコーティングされてもよい。特定の実施態様において、ＮＫＣＥ、その断片、又はそれをコードする核酸分子は、足場、基質、又はデバイス内に封入される。

【0198】

医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載の組成物の１つ又はそれ以上を含む医薬組成物も提供する。製剤は、従来の賦形剤、すなわち治療部位への投与に適した医薬的に許容し得る有機又は無機の担体物質と混合して使用することができる。医薬組成物は滅菌され、必要に応じて補助剤、例えば滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝剤に影響を与える塩、着色剤、及び／又は芳香物質などと混合することができる。また、必要に応じて他の活性剤、例えば他の鎮痛剤と組み合わせることもできる。

【0199】

本発明の組成物の投与は、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、又は腹腔内注射、又は点滴、又は他の許容し得る全身的方法によって行うことができる。

【0200】

本明細書で使用される「追加成分」には、限定されるものではないが、以下の１つ又はそれ以上が含まれる：賦形剤、界面活性剤。分散剤、不活性希釈剤、造粒剤及び崩壊剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、防腐剤、ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物、水性ビヒクルと溶媒、油性ビヒクルと溶媒、懸濁剤、分散剤又は湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、緩衝剤、塩、増粘剤、充填剤、乳化剤、抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤、安定剤、及び医薬的に許容し得るポリマー又は疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれ得る他の「追加成分」は、当該技術分野で公知であり、例えば、Genaro, ed., 1985, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0201】

本発明の組成物は、組成物の総重量の約０．００５％～２．０％の防腐剤を含んでもよい。防腐剤は、環境中の汚染物質に曝された場合に腐敗を防止するために使用される。本発明に従って有用な防腐剤の例には、限定されるものではないが、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミドウレア、及びこれらの組み合わせの群から選択されるものが含まれる。

【0202】

１つの実施態様において、組成物は、抗酸化剤と、組成物の１つ又はそれ以上の成分の分解を抑制するキレート剤とを含む。一部の化合物の抗酸化剤の例としては、ＢＨＴ、ＢＨＡ、アルファトコフェロール、及びアスコルビン酸がある。キレート剤の例としては、エデト酸塩（例えば、エデト酸二ナトリウム）及びクエン酸がある。キレート剤は、製剤の保存期間に悪影響を及ぼす可能性がある組成物中の金属イオンをキレート化するのに有用である。ＢＨＴ及びエデト酸二ナトリウムは、いくつかの化合物に対してそれぞれ抗酸化剤及びキレート剤となり得るが、当業者に知られているように、他の適切かつ同等の抗酸化剤及びキレート剤を代わりに使用してもよい。

【0203】

液体懸濁液は、水性又は油性ビヒクル中の本発明の化合物又は他の組成物の懸濁液を達成するために、従来の方法を使用して調製することができる。水性ビヒクルには、例えば、水及び等張生理食塩水が含まれる。油性ビヒクルには、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油（例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、又はココナッツ油、分留植物油）、及び鉱油（例えば流動パラフィン）が含まれる。液体懸濁物はさらに、限定されるものではないが、懸濁剤、分散剤又は湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、防腐剤、緩衝剤、塩、香味剤、着色剤、及び甘味料を含む１つ又はそれ以上の追加成分を含むことができる。油性懸濁液は、さらに増粘剤を含むことができる。既知の懸濁剤には、限定されるものではないが、ソルビトールシロップ、水素添加食用油脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、及びセルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれる。既知の分散剤又は湿潤剤には、限定されるものではないが、レシチンなどの天然リン脂質、脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸とヘキシトールから得られる部分エステルとの、又は脂肪酸とヘキシトール無水物から得られる部分エステルとのアルキレンオキシドの縮合生成物（それぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。既知の乳化剤には、限定されるものではないが、レシチン及びアカシアが含まれる。既知の防腐剤には、限定されるものではないが、メチル、エチル、又はｎ－プロピルパラヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸、及びソルビン酸が含まれる。

【0204】

経口投与には、錠剤、糖衣錠、液剤、点滴剤、坐薬、又はカプセル、カプレット、及びジェルカプセルが特に適している。経口投与に適したその他の製剤には、限定されるものではないが、粉末又は顆粒製剤、水性又は油性懸濁液、水性又は油性溶液、ペースト、ゲル、歯磨き粉、うがい薬、コーティング剤、口腔洗浄剤、チューインガム、ワニス、シーラント、口腔及び歯の「溶解ストリップ」、又は乳剤が含まれる。経口使用を意図した組成物は、当該技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、錠剤の製造に適した不活性で非毒性の医薬賦形剤からなる群から選択される１つ又はそれ以上の薬剤を含有してもよい。そのような賦形剤には、例えば、ラクトースなどの不活性希釈剤、コーンスターチなどの造粒及び崩壊剤、デンプンなどの結合剤、及びステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤が含まれる。

【0205】

錠剤はコーティングされていないか、又は既知の方法を使用してコーティングされて、被験体の胃腸管内での崩壊を遅らせ、それによって有効成分の持続放出及び吸収を実現することができる。例として、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの物質を使用して錠剤をコーティングすることができる。さらに例として、錠剤は、米国特許第４，２５６，１０８号、第４，１６０，４５２号、及び第４，２６５，８７４号に記載された方法を使用してコーティングすることにより、浸透圧制御放出錠剤を形成することができる。錠剤は、医薬的にエレガントで口当たりの良い製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、防腐剤、又はこれらの組み合わせをさらに含むことができる。

【0206】

有効成分を含むハードカプセルは、ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物を使用して製造することができる。このようなハードカプセルは有効成分を含み、さらに、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又はカオリンなどの不活性固体希釈剤を含む追加成分を含むことができる。

【0207】

有効成分を含むソフトゼラチンカプセルは、ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物を使用して製造することができる。このようなソフトカプセルは、水又は油性媒体（例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、又はオリーブ油）と混合することができる有効成分を含む。

【0208】

経口投与の場合、本発明の組成物は、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤、又は湿潤剤などの医薬的に許容し得る賦形剤を用いる従来の手段で調製された錠剤又はカプセルの形態であってもよい。所望であれば、錠剤は、Colorcon, West Point, Pa. から入手可能なOPADRY（商標）フィルムコーティングシステム（例えば、OPADRY（商標）OYタイプ、OYCタイプ、有機腸溶性OY-Pタイプ、水性腸溶性OY-Aタイプ、OY-PMタイプ、及びOPADRY（商標）White、32K18400）などの適切な方法及びコーティング材料を使用してコーティングすることができる。

【0209】

経口投与用の液体製剤は、溶液、シロップ、又は懸濁液の形態であり得る。液体製剤は、従来の方法で、医薬的に許容し得る添加物、例えば懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、又は水素添加食用油脂）、乳化剤（例えば、レシチン、アカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、又はエチルアルコール）、及び防腐剤（例えば、メチル若しくはプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸又はソルビン酸）を使用して調製することができる。経口投与に適した本発明の医薬組成物の液体製剤は、液体形態で、又は使用前に水又は他の適切なビヒクルで復元することを意図した乾燥製品の形態で、調製、包装、及び販売され得る。

【0210】

有効成分を含む錠剤は、例えば、有効成分を圧縮又は成形することにより、任意選択的に１つ又はそれ以上の添加成分とともに製造され得る。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒製剤などの自由流動形態の有効成分を、任意選択的に結合剤、滑沢剤、賦形剤、界面活性剤、及び分散剤の１つ又はそれ以上と混合し、適切な装置で圧縮することにより製造され得る。成形錠剤は、有効成分、医薬的に許容し得る担体、及び混合物を湿らせるために少なくとも十分な液体の混合物を、適切な装置で成形することにより製造され得る。錠剤の製造に使用される医薬的に許容し得る賦形剤には、限定されるものではないが、不活性希釈剤、造粒剤及び崩壊剤、結合剤、及び滑沢剤が含まれる。既知の分散剤には、限定されるものではないが、ジャガイモデンプン及びデンプングリコール酸ナトリウムが含まれる。既知の界面活性剤には、限定されるものではないが、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。既知の希釈剤には、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、及びリン酸ナトリウムが含まれる。既知の造粒剤及び崩壊剤には、限定されるものではないが、コーンスターチ及びアルギン酸が含まれる。既知の結合剤には、限定されるものではないが、ゼラチン、アカシア、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれる。既知の滑沢剤には、限定されるものではないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカ、及びタルクが含まれる。

【0211】

非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、有効成分と、滅菌水又は滅菌等張生理食塩水などの医薬的に許容し得る担体とを組み合わせたものである。このような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で製造、包装、又は販売することができる。注射用製剤は、アンプル又は防腐剤を含む複数回投与容器などの単位剤形で製造、包装、又は販売することができる。非経口投与用の製剤には、限定されるものではないが、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中の乳剤、ペースト、及び移植可能な持続放出又は生分解性製剤が含まれる。このような製剤は、限定されるものではないが、懸濁剤、安定剤、又は分散剤を含む１つ又はそれ以上の追加成分をさらに含んでもよい。非経口投与用製剤の１つの実施態様において、有効成分は、復元された組成物の非経口投与前に、適切なビヒクル（例えば、滅菌発熱物質フリー水）で復元するための乾燥（すなわち、粉末又は顆粒）形態で提供される。

【0212】

医薬組成物は、滅菌された注射用水性又は油性懸濁液若しくは溶液の形態で調製、包装、又は販売されてもよい。この懸濁液又は溶液は、既知の技術に従って調製することができ、有効成分に加えて、本明細書に記載される分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤などの追加成分を含んでもよい。このような滅菌された注射用製剤は、例えば水又は１，３－ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒を使用して調製されてもよい。その他の許容し得る希釈剤及び溶媒には、限定されるものではないが、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、合成モノグリセリド又はジグリセリドなどの固定油が含まれる。有用なその他の非経口投与可能な製剤には、有効成分を微結晶形態、リポソーム製剤、又は生分解性ポリマー系の成分として含むものが含まれる。持続放出又は移植用の組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩などの医薬的に許容し得るポリマー又は疎水性材料を含み得る。

【0213】

賦形剤及び組成物の他の成分
組成物はさらに、医薬的に許容し得る賦形剤を含み得る。医薬的に許容し得る賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、又は希釈剤などの機能性分子であり得る。医薬的に許容し得る賦形剤はトランスフェクション促進剤でもよく、これは界面活性剤を含んでよく、界面活性剤は、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子、又はその他の既知のトランスフェクション促進剤を含んでよい。

【0214】

トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含む）、又は脂質である。トランスフェクション促進剤はポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、組成物中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在することができる。トランスフェクション促進剤はまた、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞も含んでよく、そしてヒアルロン酸も組成物と併用して投与され得る。組成物はまた、トランスフェクション促進剤、例えば、脂質、ＤＮＡ－リポソーム混合物（例えば、ＷＯ９３２４６４０を参照）としてリポソーム（レシチンリポソーム又は当該技術分野で公知の他のリポソームを含む）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子、又は他の既知のトランスフェクション促進剤も含み得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含む）、又は脂質である。組成物中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、又は０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。

【0215】

医薬的に許容し得る賦形剤は、本発明のチェックポイント阻害抗体に加えてアジュバントであってもよい。追加のアジュバントは、代替プラスミドで発現されるか、又は組成物中の上記プラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であってもよい。アジュバントは、以下からなる群から選択される：アルファインターフェロン（ＩＦＮ－α）、β－インターフェロン（ＩＦＮ－β）、γ－インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナル配列が削除され、任意選択的にＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ－１５を含む）。アジュバントは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＰＤ－１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、又はこれらの組み合わせであり得る。

【0216】

本発明の抗体に加えてアジュバントとして有用であり得る他の遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が挙げられる：ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１８の変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ－７、ＩＬ－２２、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びこれらの機能性断片。

【0217】

組成物は、１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０２１，５７９号に記載されている遺伝子促進剤をさらに含み得る。この特許出願は、参照により完全に組み入れられる。

【0218】

組成物は、約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、又は好ましくは約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、又はより好ましくは約１ミリグラム～約２ミリグラムの量のＤＮＡを含み得る。いくつかの好ましい実施態様において、本発明による組成物は、約５ナノグラム～約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施態様において、組成物は、約１０ナノグラム～約８００マイクログラムのＤＮＡを含むことができる。いくつかの好ましい実施態様において、組成物は、約０．１マイクログラム～約５００マイクログラムのＤＮＡを含むことができる。いくつかの好ましい実施態様において、組成物は、約１マイクログラム～約３５０マイクログラムのＤＮＡを含むことができる。いくつかの好ましい実施態様において、組成物は、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラム、約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、約１ミリグラム～約２ミリグラム、約５ナノグラム～約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム～約８００マイクログラム、約０．１～約５００マイクログラム、約１～約３５０マイクログラム、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラムのＤＮＡを含むことができる。

【0219】

組成物は、使用される投与方法に応じて調製することができる。注射用医薬組成物は、無菌、発熱物質フリー、微粒子フリーとすることができる。等張性製剤又は等張性溶液が使用可能である。等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが挙げられる。組成物は、血管収縮剤を含むことができる。等張性溶液としては、リン酸緩衝化生理食塩水が挙げられる。組成物は、ゼラチン及びアルブミンを含む安定剤をさらに含むことができる。安定剤は、ＬＧＳ又はポリカチオン又はポリアニオンを含む製剤を、室温又は周囲温度で長期間安定にすることができる。

【0220】

工学作成免疫細胞を使用する送達方法
１つの実施態様において、本発明は、二重特異性シアル酸結合受容体抗体を標的細胞に送達する方法を提供し、二重特異性シアル酸結合受容体抗体を発現する工学作成免疫細胞を提供する。１つの実施態様において、この免疫細胞は、本発明の二重特異性シアル酸結合受容体抗体の内因性分泌のために工学作成される。

【0221】

様々な実施態様において、本発明は、腫瘍細胞を標的とする二重特異性抗シアル酸結合受容体抗体の発現又は内因性分泌のために工学作成された免疫細胞を含む組成物に関する。本発明の二重特異性シアル酸結合受容体抗体の発現又は分泌のために工学作成され得る免疫細胞の例としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はマクロファージが挙げられる。いくつかの実施態様において、免疫細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。従って、いくつかの実施態様において、本発明は本発明の二重特異性シアル酸結合受容体抗体の発現又は送達のためのＣＡＲ Ｔ細胞の使用に関する。

【0222】

投与方法
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能又は活性を上昇させる方法を提供する。これは、例えば、標準的なＮＫ細胞又はＴ細胞ベースの細胞毒性測定法で測定することができ、ここで、Ｓｉｇｌｅｃ陽性リンパ球によるシアル酸リガンド陽性細胞の殺傷を刺激する治療化合物の能力が測定される。１つの実施態様において、抗体調製物は、Ｓｉｇｌｅｃ制限リンパ球の細胞毒性の少なくとも１０％の強化、任意選択的にリンパ球細胞毒性の少なくとも４０％又は５０％の強化、又は任意選択的にＮＫ細胞毒性において、及び記載された細胞毒性測定法に関して、少なくとも７０％の強化を引き起こす。１つの実施態様において、抗体調製物は、Ｓｉｇｌｅｃ制限リンパ球によるサイトカイン放出の少なくとも１０％の強化、任意選択的にサイトカイン放出の少なくとも４０％又は５０％の強化、又は任意選択的にサイトカイン放出において、及び記載された細胞毒性測定法に関して、少なくとも７０％の強化を引き起こす。１つの実施態様において、抗体調製物は、Ｓｉｇｌｅｃ制限リンパ球による細胞毒性マーカー（例えば、ＣＤ１０７及び／又はＣＤ１３７）の細胞表面発現の少なくとも１０％の強化、任意選択的に少なくとも４０％又は５０％の強化、又は任意選択的に細胞毒性マーカー（例えば、ＣＤ１０７及び／又はＣＤ１３７）の細胞表面発現の少なくとも７０％の強化を引き起こす。

【0223】

本発明は、被験体における免疫応答を上昇させる方法にも関する。免疫応答の上昇は、被験体における疾患の治療及び／又は予防に使用することができる。この方法には、本明細書に開示されたワクチンを被験体に投与することを含み得る。ワクチンを投与された被験体は、抗原のみを投与された被験体と比較して、免疫応答が上昇又は強化される可能性がある。いくつかの実施態様において、免疫応答は、約０．５倍～約１５倍、約０．５倍～約１０倍、又は約０．５倍～約８倍上昇され得る。あるいは、ワクチンを投与された被験体における免疫応答は、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、又は少なくとも約１５．０倍上昇され得る。

【0224】

さらに別の代替実施態様において、ワクチンを投与された被験体における免疫応答は、約５０％～約１５００％、約５０％～約１０００％、又は約５０％～約８００％上昇され得る。別の実施態様において、ワクチンを投与された被験体における免疫応答は、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１０００％、少なくとも約１０５０％、少なくとも約１１００％、少なくとも約１１５０％、少なくとも約１２００％、少なくとも約１２５０％、少なくとも約１３００％、少なくとも約１３５０％、少なくとも約１４５０％、又は少なくとも約１５００％上昇され得る。

【0225】

ワクチンの投与量は、１μｇ～１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／回、及び２０μｇ～１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／回とすることができる。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１日ごとに投与することができる。効果的な治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回とすることができる。

【0226】

ワクチン
１つの実施態様において、本発明は、シアル酸受容体抗体、又はその断片、又はその変種と、腫瘍抗原への結合に特異的な抗体との組み合わせを含む二重特異性抗体を、又はシアル酸受容体抗体、又はその断片、又はその変種と、腫瘍抗原への結合に特異的な抗体との組み合わせを含む二重特異性抗体をコードする核酸分子の投与に関する。免疫原性組成物は、腫瘍抗原を発現する標的細胞の殺傷を上昇させるために使用することができる。

【0227】

免疫原性組成物は、ＤＮＡワクチン、ペプチドワクチン、又はＤＮＡとペプチドワクチンの組み合わせであり得る。ＤＮＡワクチンは、腫瘍抗原をコードする核酸配列を含み得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、これらの変種、これらの断片、又はこれらの組み合わせであり得る。核酸配列はまた、本発明の二重特異性抗体をコードする配列にペプチド結合によって連結されるリンカー、リーダー、又はタグ配列をコードする追加の配列も含み得る。

【0228】

ワクチンによって誘発される腫瘍細胞殺傷には、ワクチンを投与された被験体における標的腫瘍抗原を発現する細胞の殺傷レベルが、ワクチンを投与されなかった被験体と比較して、上昇していることが含まれる。ワクチンを投与された被験体における腫瘍細胞殺傷レベルは、ワクチンを投与されなかった被験体と比較して、約１．５倍～約１６倍、約２倍～約１２倍、又は約３倍～約１０倍上昇し得る。ワクチンを投与された被験体における腫瘍細胞殺傷レベルは、ワクチンを投与されなかった被験体と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、又は少なくとも約１６．０倍上昇し得る。

【0229】

本発明のワクチンは、ワクチン自体が病気や死亡を引き起こさないように安全であること、標的抗原を発現する細胞の存在に起因する病気に対して防御的であること、投与が容易であること、副作用が少ないこと、生物学的安定性があること、及び投与量あたりのコストが低いことなどの、有効なワクチンに求められる特徴を有することができる。

【0230】

いくつかの実施態様において、ＮＫＣＥは病原体関連抗原又はウイルス抗原に向けられており、これを使用してＮＫ細胞を病原体又はウイルスに感染した細胞に向けることができる。いくつかの実施態様において、抗原は、限定されるものではないが、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルス、ジカウイルス、エボラウイルス、日本脳炎ウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＨＨＶ－４）、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ－２）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）、ＪＣウイルス、アルボウイルス、エンテロウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、ポリオウイルス、及び水痘帯状疱疹ウイルスの抗原を含む。いくつかの実施態様において、抗原は、細菌抗原を含み、これには、限定されるものではないが、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）、B群溶血性連鎖球菌（Streptococcus agalactiae）、及び大腸菌（Escherichia coli）の抗原が含まれる。いくつかの実施態様において、抗原は、真菌又は原生動物の抗原を含み、これには、限定されるものではないが、カンジダ症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、及びトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）の抗原が含まれる。

【0231】

自己抗原
本発明のＮＫＣＥは、自己抗原に結合することに特異的であり得る。いくつかの実施態様において、自己抗原は、自己免疫疾患又は障害に関連する抗原である。いくつかの実施態様において、自己抗原は腫瘍抗原である。

【0232】

従って、いくつかの実施態様において、本発明は、ナチュラルキラー細胞を腫瘍細胞に誘導するための組成物を含む。いくつかの実施態様において、腫瘍細胞は、本発明のＮＫＣＥによって標的とされる抗原を発現する。非限定例として、１つの実施態様において、本発明は、ナチュラルキラー細胞をＦＳＨＲを発現する腫瘍細胞に誘導する二重特異性ＦＳＨＲ－Ｓｉｇｌｅｃ７ＮＫＣＥを提供する。ＦＳＨＲを発現する腫瘍細胞の例には、限定されるものではないが、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、精巣癌、子宮内膜癌、及び甲状腺癌の腫瘍細胞が含まれる。

【0233】

１つの実施態様において、本発明のＮＫＣＥが標的とする抗原は、腫瘍関連表面抗原である。腫瘍関連表面抗原の具体例は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤＣＰ１、Ｄｅｒｌｉｎ１、テネイシン、フリズルド１－１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、ＰＤＧＦＲ－アルファ（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ－β、（ＣＤ１４０ｂ）エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍ１－８、及びＴｉｅ２である。さらなる例としては、Ａ３３、ＣＡＭＰＡＴＨ－１（ＣＤｗ５２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ｄｅ２－７ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、Ｅｐ－ＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ－２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（黒色腫関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ－１、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、及びＴＡＧ－７２が含まれ得る。

【0234】

本発明の文脈において、「腫瘍抗原」又は「過剰増殖性疾患抗原」又は「過剰増殖性疾患に関連する抗原」は、癌などの特定の過剰増殖性疾患に共通する抗原を指す。本明細書で論じられる抗原は、単に例として挙げられている。このリストは限定的であることを意図したものではなく、さらなる例が当業者には容易に明らかであろう。

【0235】

腫瘍抗原は、本発明のＮＫＣＥによって標的とされ得る腫瘍細胞によって生成されるタンパク質である。本発明のＮＫＣＥの抗原結合部分の選択は、治療される癌の特定のタイプに依存する。腫瘍抗原は当該技術分野で公知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、及びメソテリンが含まれる。

【0236】

１つの実施態様において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ又はそれ以上の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能できる多数のタンパク質を発現する。これらの分子には、限定されるものではないが、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、及びＧＰ１００、並びに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの組織特異的抗原が含まれる。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子のグループに属する。さらに別の標的抗原のグループは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に固有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原のその他の候補である。これらの抗原の一部（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、モノクローナル抗体による受動免疫療法の標的として使用されてきたが、成功は限定的であった。

【0237】

本発明で言及されている腫瘍抗原の種類は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。ＴＳＡは腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞には存在しない。ＴＡＡ関連抗原は腫瘍細胞に特有ではなく、抗原に対する免疫学的寛容状態を誘発できない条件下では正常細胞にも発現する。腫瘍での抗原の発現は、免疫系が抗原に反応できる条件下で発生し得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟で反応できない胎児の発育中に正常細胞で発現する抗原である場合もあれば、正常細胞では通常極めて低レベルで存在するが、腫瘍細胞では非常に高いレベルで発現する抗原である場合もある。

【0238】

ＴＳＡ又はＴＡＡ抗原の非限定的な例としては以下が含まれる：分化抗原、例えばＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、及び腫瘍特異的多系統抗原、例えばＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５；過剰発現胚抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現癌遺伝子及び変異腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原、例えばＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；及びウイルス抗原、例えばエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７。その他の大きなタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ｂｅｔａ－Ｃａｔｅｎｉｎ、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファフェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９などがある。ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが含まれる。

【0239】

１つの実施態様において、本発明は、抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗ＦＳＨＲＮＫＣＥを提供する。
１つの実施態様において、本発明は、抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗ＩＬ１３Ｒａ２ＮＫＣＥを提供する。

【0240】

組み合わせワクチン
１つの実施態様において、本発明は、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子をＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤と組み合わせて投与することに関する。腫瘍に対する免疫応答を上昇させるために、免疫原性組成物を使用することができる。

【0241】

いくつかの実施態様において、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子は、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤の投与と同時に投与される。

【0242】

いくつかの実施態様において、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子は、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤の投与前に投与される。

【0243】

いくつかの実施態様において、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子は、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤の投与後に投与される。

【0244】

いくつかの実施態様において、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子は、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤の投与の約１、２、５、１０、３０、又は６０分又は数時間前、例えば約２、４、６、１０、１２、２４、又は３６時間前、又は例えば約２、４、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６日、又はそれ以上前に投与される。従って、いくつかの実施態様において、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤は、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子を以前に投与された被験体に投与される。

【0245】

いくつかの実施態様において、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子は、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤の投与の約１、２、５、１０、３０、又は６０分又は数時間後、例えば約２、４、６、１０、１２、２４、又は３６時間後、又は例えば約２、４、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６日、又はそれ以上後に投与される。従って、いくつかの実施態様において、Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体又はそれをコードする核酸分子は、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤を以前に投与された被験体に投与される。

【0246】

いくつかの実施態様において、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子とＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤との組み合わせは、１つ又はそれ以上の追加の抗癌剤の投与前に投与される。

【0247】

いくつかの実施態様において、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子とＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤との組み合わせは、１つ又はそれ以上の追加の抗癌剤の投与後に投与される。

【0248】

いくつかの実施態様において、本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子とＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤との組み合わせは、１つ又はそれ以上の追加の抗癌剤の投与と同時に投与される。

【0249】

本発明のＮＫＣＥ又はそれをコードする核酸分子とＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤又は１つ又はそれ以上の追加の抗癌剤の投与間の時間の長さは、数分、例えば約１、２、５、１０、３０、若しくは６０分、又は数時間、例えば約２、４、６、１０、１２、２４、若しくは３６時間、又は例えば約２、４、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６日間、又はそれ以上であってもよい。

【0250】

本発明の１つ又はそれ以上のＮＫＣＥ、又はそれをコードする核酸分子、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤、又は追加の抗癌剤は、医薬的に許容し得る担体中で投与することができる。「担体」とは、本発明の抗体とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、液体、例えば水及び油でもよく、石油、動物、植物、又は合成起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用して、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を調製することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に粒子状物質を含まない。これらは、従来のよく知られた滅菌技術（例えば濾過）によって滅菌することができる。粉末、カプセル、錠剤などの固形経口調製物の場合、適切な担体及び添加物には、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などが含まれる。固形経口調製物はまた、主要な吸収部位を調節するために、糖などの物質でコーティングしたり、腸溶性コーティングしたりすることもできる。非経口投与の場合、担体は無菌水を含み、及び溶解性又は保存性を上昇させるために他の賦形剤を加えることもできる。注射用懸濁液又は溶液も、水性担体を適切な添加物とともに使用して調製することができる。他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む適切なビヒクル及び配合物は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, See especially pp. 958-989 に記載されている。

【0251】

組成物には、生理学的条件に近づけるために必要な医薬的に許容し得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤、着色剤などが含まれていてもよい。医薬製剤中の本発明のＮＫＣＥ、又はそれをコードする核酸分子、及びＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤の濃度は、約０．５重量％未満から、通常は少なくとも約１重量％から最大１５重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、又は５０重量％まで変化し、選択された特定の投与方法に応じて、主に必要な用量、流体量、粘度などに基づいて選択されてもよい。固形形態を含む医薬組成物は、約０．１ｍｇ～約２０００ｍｇ、例えば約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、又は約１０００ｍｇの有効成分を含有し得る。

【0252】

本発明の治療組成物は、治療組成物自体が病気や死亡を引き起こさないような安全性、投与の容易さ、副作用の少なさ、生物学的安定性、及び投与量あたりの低コストなどの、有効な治療薬に求められる特徴を有することができる。

【0253】

ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤
いくつかの実施態様において、本発明は、本発明の二重特異性ＮＫＣＥとＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤との組み合わせを提供する。さまざまな実施態様において、組成物は、ＰＤ－（Ｌ）１軸中に１つ又はそれ以上の遺伝子又はタンパク質の阻害剤を含む。様々な実施態様において、本発明は、ＰＤ－（Ｌ）１軸中の１つ又はそれ以上の遺伝子又はタンパク質のレベル又は活性を低下させる組成物及び方法を含む。

【0254】

当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、ＰＤ－（Ｌ）１軸における１つ又はそれ以上の遺伝子又はタンパク質のレベル又は活性の低下には、転写、翻訳、又はその両方を含むバイオマーカーの発現の低下が含まれることを理解するであろう。当業者はまた、本発明の教示を理解すれば、ＰＤ－（Ｌ）１軸における１つ又はそれ以上の遺伝子又はタンパク質のレベル又は活性の低下には、ポリペプチド量の減少、ｍＲＮＡ量の減少、転写の減少、翻訳の減少、又はこれらの組み合わせが含まれ、ＰＤ－（Ｌ）１軸における１つ又はそれ以上の遺伝子又はタンパク質の任意の活性の低下も含まれることを理解するであろう。

【0255】

例示的なＰＤ－（Ｌ）１軸の阻害剤には、限定されるものではないが、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、抗体、抗体の断片、融合タンパク質、アプタマー、ペプチド、及び小分子が含まれる。

【0256】

当業者であれば、本明細書に提供された開示に基づいて、細胞内の１つ又はそれ以上のＰＤ－（Ｌ）１軸タンパク質のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルを低下させる１つの方法は、ＰＤ－（Ｌ）１軸タンパク質をコードする核酸の発現を低下又は阻害することであることを理解するであろう。従って、細胞内のＰＤ－（Ｌ）１軸タンパク質のタンパク質レベルは、例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、又はリボザイムなどの遺伝子発現を阻害又は低下させる分子又は化合物を使用して低下させることができる。しかし、本発明はこれらの例に限定されない。

【0257】

１つの実施態様において、ＰＤ－（Ｌ）１軸タンパク質のレベル又は活性を低下させるためにＲＮＡｉが使用される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を多様な生物及び細胞タイプに導入すると、相補的なｍＲＮＡが分解される現象である。細胞内では、長いｄｓＲＮＡは、ダイサーと知られているリボヌクレアーゼによって、２１～２５ヌクレオチドの短い低分子干渉ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ）に切断される。次に、ｓｉＲＮＡはタンパク質成分とともにＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み立てられ、その過程でほどけていく。次に、活性化されたＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖とｍＲＮＡ間の塩基対対合相互作用によって相補転写物に結合する。結合したｍＲＮＡは切断され、ｍＲＮＡの配列特異的分解によって遺伝子サイレンシングが起きる。ｓｉＲＮＡの化学修飾は、静脈内全身送達に役立つ。ｓｉＲＮＡを最適化するには、全体的なＧ／Ｃ含有量、末端のＣ／Ｔ含有量、Ｔｍ、及び３’オーバーハングのヌクレオチド含有量を考慮する必要がある。従って、本発明はまた、ＲＮＡｉ技術を使用して１つ又はそれ以上のＰＤ－（Ｌ）１軸タンパク質のレベルを低下させる方法も含む。

【0258】

いくつかの実施態様において、本発明は、プロモーター／調節配列を含む核酸に作動可能に連結されたタンパク質、抗体、ｓｉＲＮＡ、又はアンチセンス分子などの阻害剤をコードする単離核酸を含み、その結果、核酸は好ましくは、核酸によってコードされる阻害剤の発現を指示することができる。従って、本発明は、細胞に外因性ＤＮＡを導入し、同時に細胞内で外因性ＤＮＡを発現させるための発現ベクター及び方法を包含する。

【0259】

阻害剤の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクション又は感染させようとする細胞集団から発現細胞を特定及び選択することを容易にするために、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれか、又はその両方を含むこともできる。他の実施態様において、選択マーカーは、別のＤＮＡ片上に保持され、共トランスフェクション操作で使用されてもよい。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞内での発現を可能にするために、適切な調節配列で挟まれてもよい。有用な選択マーカーは当業界で知られており、例えば、ネオマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。

【0260】

本発明の阻害剤が小分子である場合、当業者に公知の標準的な方法を使用して、小分子拮抗薬を得ることができる。このような方法には、化学的有機合成又は生物学的手段が含まれる。生物学的手段には、当業界で周知の方法を使用する生物供給源からの精製、組み換え合成、及びインビトロ翻訳システムが含まれる。

【0261】

様々な疾患及び状態の治療に潜在的に有用な分子的に多様な化合物のコンビナトリアルライブラリは、ライブラリの作成方法と同様に当業界でよく知られている。この方法は、固相合成、溶液法、単一化合物の並列合成、化学混合物の合成、剛性コア構造、柔軟な線形配列、デコンボリューション戦略、タグ付け技術、及びリード発見のための偏りのない分子ランドスケープとリード開発のための偏りのある構造の生成を含む、当業者に周知されている様々な技術を使用することができる。

【0262】

小規模ライブラリ合成の一般的な方法では、活性化されたコア分子が多数の構成要素と凝縮され、共有結合したコア－構成要素アンサンブルの組み合わせライブラリが得られる。コアの形状と剛性によって、形状空間における構成要素の方向が決まる。ライブラリは、コア、結合、又は構成要素を変更して、特徴付けられた生物学的構造を標的にすることでバイアスをかけることができ（「指向型ライブラリー（focused libraries）」）、又は柔軟なコアを使用して少ない構造バイアスで合成することができる。

【0263】

本発明の別の態様において、ＰＤ－（Ｌ）１軸の１つ又はそれ以上のタンパク質は、タンパク質を不活性化及び／又は隔離することによって阻害することができる。このように、ＰＤ－（Ｌ）１軸の１つ又はそれ以上のタンパク質の効果を阻害することは、トランスドミナントネガティブ変異体を使用することによって達成することができる。

【0264】

１つの実施態様において、ＰＤ－（Ｌ）１軸の１つ又はそれ以上のタンパク質に特異的な抗体を使用することができる。当業者であれば理解できるように、目的の抗原を認識して結合できる任意の抗体が本発明において有用である。抗体の作製方法及び使用方法は、当該技術分野で周知されている。例えば、本発明で有用なポリクローナル抗体は、当該技術分野で周知されている標準的な免疫学的技術に従って、ウサギを免疫することによって生成される。このような技術には、マルトース結合タンパク質又はグルタチオン（ＧＳＨ）タグポリペプチド部分などの別のタンパク質の一部、及び／又は目的の抗原タンパク質が免疫原性となるような部分（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合した目的の抗原）と、それぞれの抗原性タンパク質アミノ酸残基を含む部分とを含むキメラタンパク質で動物を免疫することが含まれる。キメラタンパク質は、マーカータンパク質をコードする適切な核酸を、限定されるものではないが、ｐＭＡＬ－２やｐＣＭＸなどのこの目的に適したプラスミドベクターにクローニングすることによって生成される。

【0265】

抗ＰＤ－（Ｌ）１軸抗体の例には、限定されるものではないが、ニボルマブ（OPDIVO（登録商標））、ペンブロリムマブ（KEYTRUDA（登録商標））、シンチリマブ、セミプリマブ（LIBTAYO（登録商標））、トリポリバマブ、ティスレリズマブ、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、ドストラリマブ、ジェノリムズマブ、若しくはセトレリマブが含まれるか、又はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体（ＰＤ－Ｌ１抗体）は、エンバフォリマブ、アテゾリズマブ（TECENTRIQ（登録商標））、デュルバルマブ（IMFINZI（登録商標））、アベルマブ（BAVENCIO（登録商標））、ＲＥＧＮ２８１０、ピディリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＴＳＲ－０４２、ＳＨＲ－１２１０）である。

【0266】

組成物の送達方法
本発明は、必要とする被験体に組成物を送達する方法にも関する。送達方法には、被験体に組成物を投与することが含まれる。いくつかの実施態様において、本発明は、本発明のＮＫＣＥ、又はその断片、又はそれをコードする核酸分子の投与に関する。いくつかの実施態様において、核酸分子はＤＮＡ分子である。いくつかの実施態様において、核酸分子はＲＮＡ分子である。いくつかの実施態様において、核酸分子はｍＲＮＡ分子である。

【0267】

投与には、限定されるものではないが、抗体の静脈内送達、ＤＮＡ注入、リポソーム媒介送達、及びナノ粒子促進送達が含まれる。

【0268】

組成物の送達を受ける哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、乳牛、食用牛、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、及びニワトリであり得る。

【0269】

組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入、頬内投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、関節内、又はこれらの組み合わせを含む、さまざまな経路で投与することができる。獣医学的使用の場合、組成物は、通常の獣医診療に従って、適切に許容し得る製剤として投与することができる。獣医師は、特定の動物に最も適した投与計画及び投与経路を容易に決定することができる。

【0270】

治療方法
１つの実施態様において、本発明は、ＮＫ細胞の機能又は活性の増大から利益を得るであろう疾患又は障害の治療又は予防の方法を提供する。本発明の組成物及び方法を使用して治療することができる例示的な疾患及び障害には、限定されるものではないが、癌及び感染症が含まれる。

【0271】

以下は、開示された方法及び組成物によって診断又は治療することができる癌の非限定的な例である：急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、虫垂癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳及び脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様/横紋筋肉腫様腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、脳星細胞腫／悪性神経膠腫、脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児視覚経路腫瘍、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣芽腫、上衣腫、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー、頭蓋外癌、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、肝外癌、眼癌、息肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、妊娠癌、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視覚経路神経膠腫、視床下部腫瘍、眼内（眼）癌、眼内悪性黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、ランゲルハンス細胞癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、真菌症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病（myelogenous leukemia）、骨髄性白血病（myeloid leukemia）、骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌（oral cancer）、口腔癌（oral cavity cancer）、中咽頭癌、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、卵巣、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、中間分化の松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系癌、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂及び尿管癌、染色体１５のｎｕｔ遺伝子に関連する呼吸器癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（黒色腫）、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽腫、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、移行細胞癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視経路及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍。

【0272】

１つの実施態様において、組成物は、高レベルのシアル酸を有する癌を治療するために使用される。高レベルのシアル酸に関連する癌には、限定されるものではないが、卵巣癌、黒色腫、腎細胞癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、及び口腔癌が含まれる。

【0273】

癌治療
１つの実施態様において、本発明は、癌を治療又は予防する方法、又は腫瘍の増殖又は転移を治療及び予防する方法を提供する。本発明に例示される関連する態様は、個体における過形成細胞又は腫瘍細胞の転移を予防し、予防を補助し、及び／又は軽減する方法を提供する。

【0274】

１つの実施態様において、組成物は、限定されるものではないが、卵巣癌、黒色腫、腎細胞癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、及び口腔癌を含む、高レベルのシアル酸を有する癌の治療に使用される。

【0275】

本発明の１つの態様は、治療を必要とする個体における転移を阻害する方法を提供し、この方法は、治療対象となる癌に特異的な本発明の多価抗体をコードする核酸分子の有効量を個体に投与することを含む。本発明はさらに、治療を必要とする個体における転移を阻害する方法を提供し、この方法は、治療対象となる癌に特異的な本発明の多価抗体をコードする核酸分子の有効な転移阻害量を個体に投与することを含む。

【0276】

治療を必要とする個体における癌の治療又は予防、又は腫瘍の転移の治療及び予防のいくつかの実施態様において、抗腫瘍剤などの第２の薬剤が個体に投与される。いくつかの実施態様において、第２の薬剤は、プラスミノーゲン拮抗薬又はアデノシンデアミナーゼ拮抗薬などの第２の転移阻害剤を含む。他の実施態様において、第２の薬剤は血管新生阻害剤である。

【0277】

本発明の組成物は、ヒト及び動物の癌を予防、軽減、最小化、制御、及び／又は軽減するために使用することができる。本発明の組成物はまた、原発性腫瘍の増殖速度を遅らせるためにも使用することができる。本発明の組成物は、治療を必要とする被験体に投与すると、癌細胞の拡散を止めるために使用することができる。従って、本発明の多価抗体をコードする核酸分子の有効量（多価抗体は治療する癌に特異的である）は、１つ又はそれ以上の薬剤又は他の医薬品との併用療法の一部として投与することができる。併用療法の一部として使用する場合、本発明の組成物によってもたらされる転移の減少及び原発性腫瘍の増殖の低下により、患者の治療に使用されているあらゆる薬剤又は薬物療法をより効果的かつ効率的に使用することが可能になる。さらに、本発明の組成物による転移の制御により、被験体は病気を１つの場所に集中させる能力が高まる。

【0278】

１つの実施態様において、本発明は、本発明の組成物による治療の前、治療と同時、又は治療後に、手術、化学療法、化学療法剤、放射線療法、若しくはホルモン療法、又はこれらの組み合わせなどの癌に対する補完療法で被験体を治療することを含む、癌転移を治療する方法を提供する。

【0279】

化学療法剤には、細胞毒性剤（例えば、５－フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、オキソルビシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シタラビンＵＳＰ、シクロホスファミド、エストラムシンリン酸ナトリウム、アルトレタミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、インターフェロンアルファ２ａ組換え体、パクリタキセル、テニポシド、ストレプトゾシン）、細胞毒性アルキル化剤（例えば、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、エチルスルホン酸）、アルキル化剤（例えば、アサレー、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、ビスルファン、カルボキシフタラトプラチナ、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロラムブシル、クロロゾトシン、シスプラチナ、クロメソン、シアノモルフォリノドキソルビシン、シクロジゾン、シクロホスファミド、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドパン、ヘプスルファム、ヒカントン、イホスファミド、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド、ナイトロジェンマスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、ストレプトゾトシン、テロキシロン、テトラプラチン、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、及びヨシ８６４）、抗有糸分裂剤（例えば、アロコルヒチン、ハリコンドリンＭ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、メイタンシン、リゾキシン、パクリタキセル誘導体、パクリタキセル、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩）、植物アルカロイド（アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ、イダルビシン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ミトラマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ＶＰ－１６－２１３、ＶＭ－２６、ナベルビン、及びタキソテール）、生物学的製剤（例えば、アルファインターフェロン、ＢＣＧ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、インターロイキン２）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、カンプトテシン誘導体、及びモルフォリノドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ミトキサントロン、アモナフィド、ｍ－ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、メノガリル、Ｎ，Ｎ－ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール、ルビダゾン、ＶＭ－２６、及びＶＰ－１６）、及び合成阻害剤（例えば、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ｏ，ｐ’－ＤＤＤ、ダカルバジン、ＣＣＮＵ、ＢＣＮＵ、シス－ジアミンジクロロプラチナム、ミトキサントロン、ＣＢＤＣＡ、レバミゾール、ヘキサメチルメラミン、オールトランスレチノイン酸、グリアデル、及びポルフィマーナトリウム）が含まれる。

【0280】

抗増殖剤は、細胞の増殖を減少させる化合物である。抗増殖剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、酵素、生物学的応答修飾剤、雑多な薬剤、ホルモン及び拮抗剤、アンドロゲン阻害剤（例えば、フルタミド及び酢酸ロイプロリド）、抗エストロゲン剤（例えば、クエン酸タモキシフェン及びその類似体、トレミフェン、ドロロキシフェン、及びロロキシフェン）が含まれる。特定の抗増殖剤のさらなる例には、限定されるものではないが、レバミゾール、硝酸ガリウム、グラニセトロン、サルグラモスチムストロンチウム－８９塩化物、フィルグラスチム、ピロカルピン、デクスラゾキサン、及びオンダンセトロンが含まれる。

【0281】

本発明の化合物は、単独で、又は細胞毒性／抗腫瘍剤及び抗血管新生剤を含む他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。細胞毒性／抗腫瘍剤は、癌細胞を攻撃して殺傷する薬剤として定義される。一部の細胞毒性／抗腫瘍剤はアルキル化剤であり、腫瘍細胞内の遺伝物質をアルキル化する。例としては、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、ダカバジンがある。その他の細胞毒性／抗腫瘍剤は、腫瘍細胞の代謝拮抗剤であり、例としては、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトピリン、アザチオプライム、及びプロカルバジンがある。その他の細胞毒性／抗腫瘍剤としては、抗生物質、例えばドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、及びダウノマイシンがある。これらの化合物については、多数のリポソーム製剤が市販されている。さらにその他の細胞毒性／抗腫瘍剤としては、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）がある。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びエトポシドが含まれる。その他の細胞毒性／抗腫瘍剤としては、タキソール及びその誘導体、Ｌ－アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ－２６、イホスファミド、ミトキサントロン、及びビンデシンが含まれる。

【0282】

抗血管新生剤は、当業者によく知られている。本発明の方法及び組成物で使用するのに適した抗血管新生剤としては、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマー、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。血管新生の他の既知の阻害剤としては、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（アルファ及びベータを含む）、インターロイキン１２、レチノイン酸、ならびにメタロプロテイナーゼ－１及び－２の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－１及び－２）が含まれる。抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含む小分子も使用することができる。

【0283】

本発明の組成物と組み合わせて使用することができる他の抗癌剤には、限定されるものではないが、以下が含まれる：アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビスサントレン、ジメシル酸ビスナフィド、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルストロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、ドロモスタノロンプロピオン酸エステル、デュアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、エトポシドリン酸エステル、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキンＩＩ（組み換えインターロイキンＩＩすなわちｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ、インターフェロンアルファｎ１、インターフェロンアルファｎ３、インターフェロンベータ－Ｉａ、インターフェロンガンマ－Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メトゥレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスパー、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルホサートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、トリシリビンリン酸エステル、トリメトレキサート、トリメトレキサートグルクロン酸エステル、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシン、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシン。その他の抗癌剤には、限定されるものではないが、以下が含まれる：２０－エピ－１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、５－エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ－ＴＫ拮抗薬、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミフォスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラフォリド、血管新生阻害剤、拮抗薬Ｄ、拮抗薬Ｇ、アンタレリクス、抗背側形成タンパク質－１、抗アンドロゲン、前立腺癌、抗エストロゲン、抗新生物薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アフィジコリングリシネート、アポトーシス遺伝子調節薬、アポトーシス制御薬、アプリン酸、ａｒａ－ＣＤＰ－ＤＬ－ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗薬、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラクタム誘導体、ベータアレチン、ベータクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カンプトテシン誘導体、カナリア痘ＩＬ－２、カペシタビン、カルボキサミドアミノトリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔＭ３、ＣＡＲＮ７００、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリックス、クロリン、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス－ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クランベシジン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、キュラシンＡ、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクホスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシホスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジコン、ジデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ－５－アザシチジン、ジヒドロタキソール（９－）、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲン作動薬、エストロゲン拮抗薬、エタニダゾール、エトポシドリン酸、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン、フォルフェニメクス、フォルメスタン、ホストリエシン、フォテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリクス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫刺激ペプチド、インスリン様成長因子－１受容体阻害剤、インターフェロン作動薬、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール（４－）、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン－Ｎトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病抑制因子、白血球アルファインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミゾール、リアロゾール、直鎖ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリライシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、不一致二本鎖ＲＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、マイトトキシン線維芽細胞増殖因子サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多発性腫瘍抑制因子１に基づく療法、マスタード抗癌剤、マイカペルオキシドＢ、結核菌細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ－アセチルジナリン、Ｎ－置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素調節剤、ニトロキシド抗酸化剤、ニトルリン、Ｏ６－ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導剤、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、パーフルブロン、パーホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニル酢酸、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニル、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、白金錯体、白金化合物、白金トリアミン錯体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビスアクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡベースの免疫調節剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類由来タンパク質キナーゼＣ阻害剤、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン複合体、ｒａｆ拮抗薬、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質転移酵素阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ－ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲｅ１８６エチドロン酸、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチナミド、ログレチミド、ロヒツカイン、ロムルチド、ロキニメクス、ルビジノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴール、サントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ１模倣物、セムスチン、老化誘導阻害剤１、センスオリゴヌクレ
オチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達調節剤、単鎖抗原結合タンパク質、シゾフラン、ソブゾキサン、ボロカプテートナトリウム、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォス酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スティピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、超活性血管作動性腸管ペプチド拮抗薬、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブスチン、チオコラリン、トロンボポエチン、トロンボポエチン模倣物、チマルファシン、チモポエチン受容体作動薬、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプルプリン、チラパザミン、二塩化チタノセン、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来増殖阻害因子、ウロキナーゼ受容体拮抗薬、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクターシステム、赤血球遺伝子治療、ベラレゾール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、及びジノスタチンスティマラマーが含まれる。１つの実施態様において、抗癌剤は、５－フルオロウラシル、タキソール、又はロイコボリンである。

【0284】

本発明は、以下の実施例でさらに説明される。これらの実施例は、本発明の例示的な実施態様を示すが、例示のみを目的としていることを理解されたい。上記の説明及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明をさまざまな用途及び条件に適合させるために、本発明にさまざまな変更及び修正を加えることができる。従って、本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明のさまざまな修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。このような修正も、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。

【0285】

実験例
本発明は、以下の実験例を参照してさらに詳細に説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、他に明記されない限り、限定を意図するものではない。従って、本発明は、決して以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含するものと解釈されるべきである。

【0286】

さらなる説明がなくても、当業者であれば、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明を実施及び利用し、請求された方法を実施できると考えられる。従って、以下の実施例は、開示の残りの部分をいかなる形でも制限するものと解釈されるべきではない。

【0287】

実施例１：先天性免疫及び獲得免疫を介するＦＳＨＲを標的とする卵巣癌の免疫療法
ＦＳＨＲに対するモノクローナル抗体が開発され、これらの試薬の中で最も強力なものに注目した実験が計画された。抗ＦＳＨＲ抗体は、複数のＦＳＨＲを発現する卵巣漿液性及び明細胞腺癌細胞に結合し、その特異性を確立した。これをツールとして利用して、ＦＳＨＲを標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＤＤＡＰ ＴＣＥ）を開発し、卵巣癌（ＯＣ）の治療のための治療モデルにおいてこの二重特異性エンゲージャーを評価する実験が計画された。ヒトＰＢＭＣの存在下のＤＤＡＰ ＴＣＥは、ＦＳＨＲ陽性卵巣腫瘍株の殺傷に対して極めて特異性が高かった。免疫系の先天性構成要素を関与させることは、潜在的に腫瘍の制御を強化する可能性があると考えられる。ＯＣがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の攻撃を受けやすいことを示唆する証拠が増えているため、ヒトＮＫ細胞に存在する阻害性受容体であるヒトＳｉｇｌｅｃ７に対する抗体が開発され、ＮＫ細胞へのこれらの結合が証明された。これらを使用して、Ｓｉｇｌｅｃ７とＦＳＨＲの両方（ＤＤＡＰ ＮＫＣＥ）を同時に標的とする新しいクラスの二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）を作成する実験が計画された。このＮＫＣＥは、インビトロ及びインビボアッセイでＦＳＨＲ陽性ＯＣ標的を強力に殺傷した。これらの試験は、ＯＣの主要なサブセットに対してＦＳＨＲを標的とすることの有用性、ＦＳＨＲとＣＤ３に注目した二重特異性ツールが非常に免疫力が高いこと、ＯＣ又はヒト腫瘍、及び多様なＯＣ集団に対する二重特異性エンゲージャーによるＮＫ細胞活性化の新しい標的に対するＳｉｇｌｅｃ７抗体のインビボの影響を初めて証明している。Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方を関与させる組み合わせ試験は、ＯＣの治療のための新しいツールとして興味深いと思われる。

【0288】

方法と材料についてここで説明する。

【0289】

細胞株と動物
ＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａ－Ｆｓｈｒ、ＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａ、ＯＶＣＡＲ３、ＣａＯＶ３、ＴＯＶ－２１Ｇ、及びＳＫＯＶ３細胞は、J.R. Conejo-Garcia (Department of Immunology, Moffitt Cancer Center, Tampa, Florida) から提供された。ＯＶＩＳＥ、ＯＶＣＡＲ８、ＯＶＣＡＲ１０、ＰＥＯ－４、及びＫｕｒａｍｏｃｈｉ細胞は、R. Zhang (The Wistar Institute) から提供された。ＨａＣａＴヒトケラチン生成細胞は、M. Herlyn (The Wistar Institute) から提供された。ヒト胎児腎臓２９３Ｔ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、及びマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２．０／０は、ＡＴＣＣから入手した。２９３Ｔ細胞はＳｉｇｌｅｃ７を発現するように、レトロウイルスで形質導入した。ＯＶＣＡＲ３細胞とＫｕｒａｍｏｃｈｉ細胞は、既に説明されているように(Perales-Puchalt et al., 2019, JCI Insight 4)、ＦＳＨＲを発現するようにヒトＦＳＨＲをレトロウイルスで形質導入した。Ｋ５６２とＡ２０もＡＴＣＣから購入し、それぞれヒト及びマウスＦＳＨＲを発現するように、レトロウイルスで形質導入した。発現ベクターｐＢＭＮ－Ｉ－ＧＦＰ（Nolan Lab製）はAddgeneから購入した。

【0290】

トランスジェニックＨ２Ｌ２マウスはHarbor Biomedから入手した。Ｂａｌｂ／ｃマウスは The Jackson Laboratory から購入した。ＮＳＧマウスは The Wistar Institute Animal Facility から購入した。

【0291】

マウスの免疫、ハイブリドーマの生成、及びＤＮＡにコードされたｍＡｂの生成
ヒトＦＳＨＲ（Uniprot P23945）は、マウスでの発現用にＲＮＡとコドンを最適化し、改変されたｐＶａｘ１ベクター（Genscript）にクローニングした。ＦＳＨＲハイブリドーマの生成のために、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、３０μｌの水に再懸濁した２５μｇのＤＮＡを前脛骨筋に注入し、続いてCELLECTRAデバイス（Inovio Pharmaceuticals）で電気穿孔して免疫しした。５０％ポリエチレングリコール１５００（Roche）を使用して、マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２．０／０を脾臓細胞と融合してハイブリドーマを生成した。

【0292】

ヒトＳｉｇｌｅｃ７に対するいくつかのヒト化抗体がＨ２Ｌ２マウスで生成された。これらのｍＡｂはＳｉｇｌｅｃ７に結合し、ＮＫ細胞を染色することができた。これらのハイブリドーマは配列決定され、インビトロ発現のツールとしてＳｉｇｌｅｃ７ ＤＮＡでコードされたモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）の開発に使用された（Patel et al., 2018, Cell Rep 25: 1982-93 e4）。最終的なヒトＩｇＧ１ ＨＣ及びＬＣは、記載されているように（Patel et al., 2018, Cell Rep 25: 1982-93 e4）、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルの制御下で、ｐＶａｘ１プラスミド発現ベクターに挿入された。次に、プラスミドをExpifectamine 293 発現キット（Thermo Fisher Scientific）を使用してＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、組み換え抗体を生成した。組み換え抗体の純度と見かけの分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって評価された。

【0293】

ＦＳＨＲｘＣＤ３ ＴＣＥ及びＦＳＨＲｘＳｉｇｌｅｃ７ ＮＫＣＥの設計
ＦＳＨＲ ＭＡｂ（ＤＤＡＰ）のコドン最適化ｓｃＦｖに続いてＩｇＥリーダー配列を追加した改変ＵＣＨＴ１抗ヒトＣＤ３抗体のｓｃＦｖをコード化することにより、ＦＳＨＲｘＣＤ３ ＤＮＡでコードされた二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）を設計するように、実験を組み立てた。Ｓｉｇｌｅｃ７ ＭＡｂ（ＤＢ－Ｓ７－２）のコドン最適化ｓｃＦｖを、次に強化性最適化ＩｇＥリーダー配列を追加されたＦＳＨＲ抗体（ＤＤＡＰ）のｓｃＦｖをコード化することにより、ＦＳＨＲｘＳｉｇｌｅｃ７ナチュラルキラー細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）を設計した。両方の構築物を、改変ｐＶａｘ１発現ベクターにサブクローニングした（Perales-Puchalt et al., 2019, Mol Ther 27: 314-25）。ＦＳＨＲｘＣＤ３ ＴＣＥ及びＦＳＨＲｘＳｉｇｌｅｃ７ ＮＫＣＥは、以下、それぞれＤＤＡＰ－ＴＣＥ及びＤＤＡＰ－ＮＫＣＥと表記する。

【0294】

フローサイトメトリー
細胞の染色にはBD LSRIIフローサイトメーターを使用した。Ｓｉｇｌｅｃ７／ＦＳＨＲを安定発現している細胞の選別には、BD FACS Aria セルソーター（BD Biosciences）を使用した。使用した抗ヒト抗体は、直接蛍光色素が結合したものである。使用した抗体は、抗Ｓｉｇｌｅｃ７（F023-420、BD Pharmingen）、抗Ｓｉｇｌｅｃ３（６Ｃ５／２、R&D Systems）、抗Ｓｉｇｌｅｃ９（KB, Biolegend）である。非結合一次抗体には、ＰＥ－二次抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（Invitrogen）、ＰＥ／ＡＦ６４７－二次抗ヒトＦ（ａｂ’）_２（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc）、及びＡＰＣ－二次抗マウスＩｇＧ（Ｐｏｌｙ４０５３、BioLegend）を使用した。死細胞を分析から除外するために、Live/Dead Violet生存率キット（Invitrogen）を使用した。

【0295】

酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ＤＤＡＰのアイソタイプ型判定には、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中のＤＤＡＰで一晩コーティングした。次に、プレートをブロッキングし、以下のＨＲＰ結合抗体を加えた：抗マウスＩｇＡ、抗マウスＩｇＭ、抗マウスＩｇＧ１、抗マウスＩｇＧ２ａ、抗マウスＩｇＧ２ｂ、抗マウスＩｇＧ３、抗マウスカッパ軽鎖（すべてBethyl製）。

【0296】

Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂをトランスフェクションしたｅｘｐｉ２９３Ｆ並びにＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂを電気穿孔したマウス血清中のヒトＩｇＧの定量のため、MaxiSorpプレートを１０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Bethyl）で４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、５％ミルクを含むＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳに０．０５％ツイーン２０を含む）で室温で２時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、０．２％ツイーン２０を含有するＰＢＳに１％ＮＣＳで希釈した試料を加え、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Bethyl）の１：１０，０００希釈液で室温で１時間インキュベートした。プレートをSigmaFast ＯＰＤで５～１０分間発色させ、ＯＤ４５０シグナルを測定した。

【0297】

サイクリックＡＭＰの測定
２５，０００個のＫ５６２又はＫ５６２－ｈＦＳＨＲ細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞を温かいＰＢＳで２回洗浄し、次にＤＤＡＰ抗体有り又は無しで０．５ｍＭのＩＢＭＸ（Cayman chemicals）を含む１００μｌの無血清ＲＰＭＩに再懸濁した。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＦＳＨ（５０ｎｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳを加えた。１時間後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解し、製造業者の説明書（Cell Signaling）に従ってサイクリックＡＭＰの測定を実施した。

【0298】

免疫ブロッティング
タンパク質抽出、変性、及びウェスタンブロッティングを、前述のとおりに実施した（Tesoneetal., 2016）。膜を、以下の抗体を用いてブロットした：抗ホスホ－ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（＃９１０１、Cell Signaling）、抗ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（クローン１３７Ｆ５、Cell Signaling）、抗ＬＨＣＧＲ（クローン８Ｇ９Ａ２、Abcam）、及び抗β－アクチン（Ａ５４４１、Sigma-Aldrich）。画像を、ImageQuantLAS 4000（GE Healthcare Life Sciences）でキャプチャーした。

【0299】

ルシフェラーゼ発現の測定によるインビトロ細胞毒性分析
ウェルあたり１０，０００個のＯＶＣＡＲ３細胞を９６ウェルプレートに播種し、１８時間後、一次末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加えた。４時間の共インキュベーション後、細胞を７ＡＡＤ（Invitrogen）、アネキシンＶ（Biolegend）、及び抗ヒトＣＤ４５（Biolegend）で染色し、次に、既に説明したようにフローサイトメトリーベースの細胞毒性測定法を実施した（Perales-Puchalt et al., 2017, Clin Cancer Res 23: 441-53）。ホタルルシフェラーゼでＫ５６２及びＫ５６２－ＦＳＨＲを安定的にトランスフェクションする実験を実施した。ルシフェラーゼを発現する２０，０００個のＫ５６２及びＫ５６２－ＦＳＨＲを９６ウェルプレートに播種し、ＰＢＭＣと５時間共インキュベートした。インキュベーション後、細胞を溶解し、CytoTox Glo（Promega）を使用して、前述のとおりルシフェラーゼ発現を測定した（Zhang et al., 2009, Cancer Res 69: 6506-14）。細胞毒性は、（最大生存率対照－個々のウェル）／（最大生存率対照－最大死亡対照）×１００として計算され、パーセント又は対照（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照Ｃ１．１８．４を含むＰＢＭＣ）に対する相対値として計算された。

【0300】

xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを使用するインビトロ細胞毒性分析
xCELLigenceリアルタイム細胞分析装置（ＲＴＣＡ）（Agilent Technologies, USA）を使用して、インピーダンスに基づいてインビトロ細胞毒性測定法を実施した。インピーダンスは、細胞指数と呼ばれる任意の単位で表される（Durdagi et al., 2021, Mol Ther 30:963-974）。標的細胞は、xCELLigenceＲＴＣＡ装置の使い捨て無菌９６ウェルＥプレートに、ウェルあたり１×１０^４～２×１０^４細胞の最終細胞濃度で播種した。実験中、装置をＣＯ_２インキュベーター内に配置し、制御ユニットに接続されたケーブルによって制御した。９６ウェルＥプレートはxCELLigenceＲＴＣＡ装置に配置し、１８～２４時間インキュベートした。次に、エフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ；Ｅ（エフェクター）：Ｔ（標的）比＝５：１／１０：１）及び処理物（抗体／ＴＣＥ／ＮＫＣＥ）を添加した。リアルタイム分析は３～７日間実施した。電気伝導率は、xCELLigence装置によって１５分ごとに単位のない細胞指数（ＣＩ）パラメータに変換し、画像は１時間間隔でキャプチャーした。生成されたデータは、エフェクター細胞と抗体／ＴＣＥ／ＮＫＣＥを標的細胞に添加した時点に基づいて正規化し、ＲＴＣＡ／ＲＴＣＡ Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。

【0301】

免疫組織化学及び免疫細胞化学
マウスの腫瘍をＯＣＴ（TissueTek）で凍結し、凍結切片を切断した。２９３Ｔをポリ－Ｌ－リジンでコーティングされたカバースライド（Sigma）上で増殖させ、ヒト又はマウスのＦＳＨＲ発現ベクターを使用してトランスフェクションした。次に、スライドを４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．５％トリトンＸ－１００で透過処理した。切片を５％の正常ヤギ血清を使用してブロッキングし、ＤＤＡＰ抗体で染色し、次にヒト又はマウスＩｇＧに特異的なＡＦ６４７結合二次抗体（Invitrogen）で染色した。スライドは、Leica TCS SP-5共焦点顕微鏡とLeica LAS-Xソフトウェア（免疫組織化学）、又はNikon ECLIPSE 80i顕微鏡とNIS-Element Imaging（免疫組織化学）を使用して表示した。

【0302】

ウェスタンブロット分析
Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂのインビトロ及びインビボ発現を実証するために、抗体をコードするＤＮＡをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした後に収集した上清、又はＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂで免疫したマウスから収集した血清を、熱不活化し、還元し、Odyssey タンパク質分子量（ＬＩ－ＣＯＲ）とともにロードした。電気泳動後、試料をiBlot-2システム（Thermo Fisher Scientific）を介してポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、Odyssey ブロッキング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用してブロッキングした。重鎖と軽鎖は、ヤギ抗ヒト二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して検出した。二重特異性Ｔ細胞及びＮＫ細胞エンゲージャーの発現は、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc）とそれに続くロバ抗ヤギ抗体（ＬＩＣＯＲ）を使用して検出した。

【0303】

免疫蛍光（ＩＦＡ）分析：
Ｓｉｇｌｅｃ７を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２ウェルチャンバースライドに播種し、細胞を一晩接着させた。細胞をＰＢＳ中の０．５％トリトン１００を使用して透過処理し、続いて５％ヤギ血清を使用してブロッキングした。次に、一次抗体（二重特異性）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に、スライドをヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ（テキサスレッド結合）二次抗体とともにインキュベートした。核染色は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して実施した。試料をFluoroshield封入剤（Invitrogen）を使用してガラススライドにマウントし、Leica TCS SP8 WLL走査型レーザー共焦点顕微鏡を使用して観察した。

【0304】

サイトカイン分泌プロフィール分析：
ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ（標的）細胞を１×１０^４細胞／ウェルの密度で播種した。一晩インキュベートした後、ＰＢＭＣ（エフェクター細胞；Ｅ：Ｔ＝５：１）とＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ又はｐＶａｘ１を標的細胞に加えた。４８時間後、上清を収集し、製造業者のプロトコールに従ってLEGENDplex（商標）ヒトＣＤ８／ＮＫＰａｎｅｌ（１３重）多重ビーズベースの測定法（Biolegend）で分泌されたサイトカインを分析した。

【0305】

腫瘍の攻撃投与：
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ－γ（ＮＳＧ）マウスに、ＯＶＩＳＥ細胞とＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を攻撃投与した。０．８×１０^６個のＯＶＩＳＥ細胞（ＰＢＳ及びマトリゲル中；１：１）を右脇腹に皮下注射した。腫瘍移植の７日後、腫瘍が触知できるようになった時点で、マウスをｐＶａｘ１（１００μｇ）又はＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂ（５０μｇＨＣ＋５０μｇＬＣ）で処理した。発現ベクターを投与した同じ日に、７×１０^６個のＰＢＭＣを各マウスの腹腔内に注入した。マウスに１週間空けて３回接種した。腫瘍の大きさをノギス測定により定期的に追跡した。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の兆候が現れた時点でマウスを安楽死させた。腫瘍の体積（Ｖ）は、Ｖ＝［（長さ×幅^２）］／２という式で計算した。幅は測定値の小さい方である。

【0306】

ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ攻撃投与モデルでは、ＮＳＧマウスの右脇腹に、ＦＳＨＲを発現する３×１０^６個のＯＶＣＡＲ３又はＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を皮下注射した。腫瘍が触知可能になった３日後、マウスにｐＶａｘ１（１００μｇ）又はＤＤＡＰ－ＴＣＥ（１００μｇ）又はＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ（１００μｇ）を接種した。発現ベクターを投与した同じ日に、１０×１０^６個のＰＢＭＣを各マウスの腹腔内に注射した。マウスは１週間空けて２回接種し、それ以降は上記と同じ操作を続けた。動物実験は、ウィスター研究所の動物実験委員会（the Institutional Animal Care and Use Committee at The Wistar Institute）によって承認された。健康なドナーからのヒトＰＢＭＣは、ペンシルバニア大学のヒト免疫学コア（Human Immunology Core）から提供された。

【0307】

統計解析
すべての統計解析は、Graph Pad Prismを使用して実施した。ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なした。実験群の平均値間の差は、３つ以上の定量的変数が測定された対応のない両側スチューデントｔ検定又は一元配置分散分析を使用して計算した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。各時点の腫瘍サイズの比較は、フィッシャーの最小有意差（ＬＳＤ）検定を用いる２元配置分散分析を使用して行った。

【0308】

ここで、結果を説明する。

【0309】

抗ヒトＦＳＨＲ抗体の生成とフローサイトメトリースクリーニング
卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）は、卵巣癌（Perales-Puchalt et al., 2017, Clin Cancer Res 23: 441-53）、前立腺癌（Mariani et al., 2006, J Urol 175: 2072-7）、及び癌の８０％の新生血管（Radu et al., 2010, N Engl J Med 363: 1621-30）に存在する腫瘍関連抗原である。ＦＳＨＲは、７つの膜貫通ドメインを有するＧタンパク質共役型受容体である（Fan and Hendrickson, 2005, Nature 433: 269-77）。この複雑な構造は、従来の抗原タンパク質アプローチにとって難しい課題となる。直接のインビボ免疫化のために、ヒトＦＳＨＲのコドン最適化配列を生成した（図１Ａ）。ＦＳＨＲ ｃＤＮＡを、ｐＢＭＮ－Ｉ－ＧＦＰ発現ベクターにサブクローニングし（図１Ｂ）、ＤＮＡ注入とそれに続くインビボ電気穿孔によってマウスに接種した。マウスを２週間ごとに免疫し、各免疫の１週間後に抗体レベルの分析のために血清を採取した（図１Ｃ）。

【0310】

細胞膜に発現された未変性のＦＳＨＲに結合する抗ＦＳＨＲ抗体を検出するために、安定的に形質導入されたＫ５６２細胞が生成してヒトＦＳＨＲ（Ｋ５６２－ＦＳＨＲ）が過剰発現させた。組み換えＦＳＨＲの正しい折り畳みと機能を実証するために、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に対するＫ５６２－ＦＳＨＲ細胞の応答を試験する実験を行った。Ｋ５６２－ＦＳＨＲは、ＦＳＨ刺激によりサイクリックＡＭＰの産生とＥＲＫリン酸化を増加させたが、親Ｋ５６２では応答が見られなかった（図１Ｄ及び図１Ｅ）。

【0311】

免疫血清のＦＳＨＲへの結合能力を追跡するために、Ｋ５６２（ＧＦＰ－）細胞とＫ５６２－ＦＳＨＲ（ＧＦＰ＋）細胞を等しい比率で混合し、１：１０００まで希釈した血清を加え、続いて抗マウスＩｇＧ ＡＰＣ結合二次抗体を加え（図９Ａ及び９Ｂ）、野生型Ｋ５６２と比較してＫ５６２－ＦＳＨＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）倍数を測定した。１：１０００希釈血清がＭＦＩの２０倍を超えた場合、前回の免疫から３週間後に、ＦＳＨＲ過剰発現Ａ２０細胞で追加免疫することにより最後の免疫を行った。追加免疫されたマウスを、記載されているように（Bordoloi et al., 2021, ACS Pharmacol Transl Sci 4: 1349-61; Choi et al., 2020, Hum Vaccin Immunother 16: 907-18）、４日後にハイブリドーマ生成のために殺処分した。

【0312】

融合から２週間後、１５枚の９６ウェルプレートからの上清をフローサイトメトリーでスクリーニングして、潜在的なハイブリドーマを分析した（図９Ｃ）。ＭＦＩ倍数に基づく上位２０クローンを、さらなる分析のために増殖させた（図９Ｄ）。高い結合特異性に基づいて、非常に強力なクローンが選択された。

【0313】

抗ＦＳＨＲ抗体は高い特異性でＦＳＨＲに結合する
ＤＤＡＰは、ＦＳＨＲを自発的に発現する卵巣癌細胞株に結合する（Perales-Puchalt et al., 2017, Clin Cancer Res 23: 441-53; Zhang et al., 2009, Cancer Res 69: 6506-14）。細胞株（ＣＡＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、及びＴＯＶ－２１Ｇ）はすべて、ＤＤＡＰ染色によってＦＳＨＲの予想される発現を示した（図１Ｆ）。ＤＤＡＰによって誘発されたシグナルがＦＳＨＲに対応していることをさらに確認するために、ＴＯＶ－２１Ｇ細胞株におけるＦＳＨＲのクリスパーによる欠失を実施した。ＤＤＡＰ抗体によるフローサイトメトリー染色は、ＦＳＨＲノックアウト後のＴＯＶ－２１Ｇ細胞株への結合が存在しないことが示した（図１Ｇ）。ＦＳＨＲの相同タンパク質であるＬＨＣＧＲ（配列相同性は、ＥＣＤで約４６％及び７ＴＭＤで約７２％）（Ulloa-Aguirre et al., 2018, Front Endocrinol (Lausanne) 9: 707）でトランスフェクションしたＫ５６２細胞が、フローサイトメトリー分析で交差反応を示さなかった（図１Ｈ）ため、前記クローンはＦＳＨＲに対して極めて特異的であった。マウス疾患モデルは新しい治療法のインビボ有効性や安全性を研究するために重要であるため、ＤＤＡＰがマウスＦＳＨＲにも結合できるかどうかをさらに試験するための実験を行った。マウスＦＳＨＲはマウス腫瘍株Ａ２０及びＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａで発現され、トランスフェクション細胞と非トランスフェクション細胞へのＤＤＡＰの結合が、再度フローサイトメトリーによって試験された。ＤＤＡＰはヒトＦＳＨＲと同様にマウスＦＳＨＲにうまく結合することが観察された（図１Ｉ）。

【0314】

ＦＳＨＲ^＋腫瘍細胞を検出するための抗ＦＳＨＲ抗体
生物学的試料からのタンパク質の免疫組織化学検出は、腫瘍やその他の標本からのタンパク質発現を判定し、予後又は治療目的でこれらをより適切に分類するための一般的な方法である。ＤＤＡＰが免疫組織化学でＦＳＨＲを検出するかどうかを調べるために、ＮＳＧ免疫不全マウスで固形腫瘍を生成した。腫瘍を生成するために、５００万個のＫ５６２、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ、ＯＶＣＡＲ－３、又はＴＯＶ－２１Ｇを、５０％ＰＢＳ／マトリゲル（Corning）中でＮＳＧマウスの腋窩に注入した。ＤＤＡＰは凍結腫瘍切片からＦＨＳＲを検出した（図２Ａ）。さらに、この抗体は免疫細胞化学分析でＦＳＨＲを染色するのに有用である。ヒト又はマウスのＦＳＨＲ形質導入２９３Ｔ細胞をＤＤＡＰで染色した。ＤＤＡＰは、ポリクローナル抗ヒト抗体と同様にヒト及びマウスのＦＳＨＲの両方に結合できたが、この活性を確認する模擬トランスフェクション２９３Ｔ細胞には結合できなかった（図２Ｂ～Ｄ）。

【0315】

抗ＦＳＨＲ抗体は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発する
ＤＤＡＰのアイソタイプを決定するために、ＥＬＩＳＡを実施し、ＤＤＡＰが、ＡＤＣＣを誘発できるアイソタイプであるＩｇＧ２ａ（図２Ｅ）であることが分かった（Akiyama et al., 1984, Cancer Res 44: 5127-31）。Ｋ５６２を用いてＡＤＣＣ能力を、ＦＳＨＲ有り又は無しで試験した。ＤＤＡＰは、Ｋ５６２－ＦＳＨＲに対してＰＢＭＣの細胞毒性を上昇させることができたが、Ｋ５６２に対しては上昇させることができなかった（図２Ｆ及びＧ）。未改変のＦＳＨＲ^＋卵巣癌細胞株に対するＡＤＣＣを誘発する能力を調べるために、ＤＤＡＰ又は無関係なＩｇＧ２ａ抗体の存在下で、ＯＶＣＡＲ３細胞をＰＢＭＣと共培養した。卵巣癌細胞におけるＦＳＨＲの生理的発現レベルは、抗体の用量を増加させてＤＤＡＰ媒介細胞毒性の標的となるのに十分であることが分かった（図２Ｈ）。ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞の殺傷活性もxCelligence測定法で評価され、ＦＳＨＲ過剰発現ＯＶＣＡＲ３細胞の用量依存的殺傷を誘導することが分かった（図２Ｉ）。従って、ＤＤＡＰは、標的のＦＳＨＲ^＋細胞に対して中程度の活性で選択的に細胞毒性を誘発するために使用することができる。

【0316】

ＤＤＡＰ－ＴＣＥの生成、発現、及び細胞毒性
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、モノクローナル技術の分野における最近の重要な進歩を表している。ＤＤＡＰ抗ＦＳＨＲ抗体は初期レベルのＡＤＣＣを示したため、この可能性を向上させるための実験が計画された。ＦＳＨＲを標的とするＴＣＥ（ＤＤＡＰ－ＴＣＥ）が計画された（Gary et al., 2021, iScience 24: 102699; Patel et al., 2018, Cell Rep 25: 1982-93 e4; Perales-Puchalt et al., 2019, Mol Ther 27: 314-25）。実験は、ＦＳＨＲ ｍＡｂのｓｃＦｖを遺伝的に最適化し、抗ＣＤ３（改変ＵＣＨＴ１）をコードする最適化された配列のｓｃＦｖと融合するように計画された（図３Ａ及びＢ）。ＤＤＡＰ－ＴＣＥは、ＤＮＡをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションすると、インビトロで効率的に発現された（図３Ｃ）。この新しい二重特異性抗体は、天然のＦＳＨＲ発現を持たないＫ５６２細胞への非特異的結合を示さず（図３Ｄ）、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ細胞への結合を維持した（図３Ｅ）。ＦＳＨＲへの結合は、ＣａＯＶ３（図３Ｆ）及びＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞（図３Ｇ）でさらに確認された。ＤＤＡＰ－ＴＣＥ二重特異性抗体のＣＤ３結合は、ヒト一次Ｔ細胞を用いて確認された（図３Ｈ）。インビトロで発現したこの新しい二重特異性抗体の機能性を判定するために、ＤＤＡＰ－ＴＣＥ上清又はＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲＯＣ細胞を含む培地のみを、インビトロでヒトＰＢＭＣと共培養し、腫瘍細胞クリアランスに対するリアルタイムxCELLigenceベースの殺傷測定法を使用して定量的に分析した。免疫細胞＋ＤＤＡＰ－ＴＣＥとのインキュベーションは、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞に対する非常に強力な細胞毒性作用をもたらした。ＤＤＡＰ－ＴＣＥ又はエフェクター細胞が存在しない場合、細胞毒性は見られなかった（図３Ｉ）。

【0317】

抗ヒトＳｉｇｌｅｃ７抗体の生成とスクリーニング
細胞株で発現されるヒトＳｉｇｌｅｃ７と特異的に反応するｍＡｂを産生するハイブリドーマを生成しスクリーニングした。Ｓｉｇｌｅｃ７を標的とする３つのｍＡｂを配列決定し、さらに詳しく調べた。ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７は強い細胞結合を示したが、抗Ｓｉｇｌｅｃ３（６Ｃ５／２、R&D Systems）の場合は結合が見られなかった（図１０Ａ）。これら３つの抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体の特異性を実証するために、これらをＳｉｇｌｅｃ９を過剰発現している２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ－Ｓｉｇｌｅｃ９）への結合について確認した。Ｓｉｇｌｅｃ－９もＳｉｇｌｅｃ－３／ＣＤ－３３関連Ｓｉｇｌｅｃに属し、Ｓｉｇｌｅｃ７と相同性（８４％の類似性）を示す（Angata and Varki, 2000, J Biol Chem 275: 22127-35）。市販の抗Ｓｉｇｌｅｃ９抗体（クローンK8, Biolegend）は、予想どおり２９３Ｔ－Ｓｉｇｌｅｃ９細胞への結合を示したが、ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体クローンでは結合が見られず、抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体の特異性が確認された（図１０Ｂ）。抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体のヒトＳｉｇｌｅｃ７への結合をさらに視覚化するために、２９３Ｔ－Ｓｉｇｌｅｃ７固定細胞の高分解能共焦点イメージングを実施した。細胞を、ＤＡＰＩ（核）、ＧＦＰ（Ｓｉｇｌｅｃ７）、及びテキサスレッド（抗Ｓｉｇｌｅｃ７）で標識した。図１０Ｃに示されるように、ＤＢ－Ｓ７－２はＳｉｇｌｅｃ７に強く結合した；ＤＢ－Ｓ７－１とＤＢ－Ｓ７－７もヒトＳｉｇｌｅｃ７への結合を示したが、二次抗体対照のみでは結合は観察されなかった。

【0318】

ヒト抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体の細胞毒性試験
抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体がＮＫ細胞の活性化によって細胞毒性を誘発する能力を確認するために、xCELLigenceリアルタイム細胞分析装置を使用してインピーダンスに基づくインビトロ細胞毒性測定法を実施した。標的細胞（Ａ５４９、ＨａＣａＴ、ＧＭＯ５３８９、ＯＶＩＳＥ、ＯＶＣＡＲ８、及びＳＫＯＶ３）をxCELLigenceＲＴＣＡデバイスに配置し、１８～２４時間インキュベートした後、ヒトＰＢＭＣと抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体を加えた。Ａ５４９（肺腺癌細胞）、ＨａＣａＴ（ヒトケラチン生成細胞）、及びＧＭＯ５３８９（ヒト線維芽細胞）のリアルタイム解析は、エフェクター細胞と抗体の添加後３日まで培養した場合、抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７の存在によって細胞毒性が誘発されないことが示された（図４Ａ、４Ｃ、及び４Ｅ）。エフェクター細胞と抗体を標的細胞に加えてから３日後にキャプチャーされた画像では、抗体なしの対照ウェルと比較して、抗体の存在下では殺傷が見られない（図４Ｂ、４Ｄ、及び４Ｆ）。さまざまなヒトＯＣ細胞で細胞毒性を評価すると、ＤＢ－Ｓ７－２は顕著な腫瘍細胞殺傷を誘発することができる。ＯＶＩＳＥ細胞及びＳＫＯＶ３細胞の場合、抗体及びエフェクター細胞による処理から２４時間以内に殺傷が観察されたのに対し、ＯＶＣＡＲ８細胞の場合、ＤＢ－Ｓ７－２による殺傷は約３０時間後に現れる。ＤＢ－Ｓ７－１及びＤＢ－Ｓ７－７もＯＶＩＳＥ、ＯＶＣＡＲ８、及びＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌細胞の殺傷を誘発できたが、これらの試薬による殺傷作用はＤＢ－Ｓ７－２ほど強力ではなかった（図４Ｇ、４Ｉ、及び４Ｋ）。画像に示されるように、エフェクター細胞を添加してＤＢ－Ｓ７－２で処理してから３日後、処理されたウェルに付着した腫瘍細胞は観察されなかった。クローンＤＢ－Ｓ７－１及びＤＢ－Ｓ７－７の場合、対照ウェルと比較して同様に殺傷が観察された（図４Ｈ、４Ｊ、及び４Ｌ）。

【0319】

Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂのインビトロ発現と腫瘍細胞殺傷
抗Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂをインビボで迅速に評価するために、直接送達用のＤＮＡベクターとして発現カセットを開発した。実験は、ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７の重鎖と軽鎖のコドンとＲＮＡ最適化配列をｐＶａｘ１プラスミド発現ベクターに、二重プラスミドとしてコードするように計画した（図５Ａ）。抗体発現は、合成ヒトＳｉｇｌｅｃ７ ＤＮＡベクターをｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの５日後にウェスタンブロット分析によって、インビトロで試験した。ヒトＳｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂをトランスフェクションしたＥｘｐｉ２９３Ｆ上清中の重鎖及び軽鎖抗体に対応するバンドは明確に特定できたが、空の因子をトランスフェクションした対照ウェルでは特定できなかった（図５Ｂ）。ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７は、それぞれインビトロで７．５μｇ／ｍｌ、４．２９７μｇ／ｍｌ、及び７．８２４μｇ／ｍｌで発現された（図５Ｃ）。生成された完全ヒト組み換え抗体は、次にＯＣ細胞（ＯＶＣＡＲ１０（図５Ｄ及びＥ）、ＴＯＶ－２１Ｇ細胞（図５Ｆ）、ＯＶＩＳＥ細胞（図５Ｇ）、及びＰＥＯ－４細胞（図５Ｈ）細胞）における殺傷誘発能力についてさらに評価された。３つのクローンすべてがＯＣ細胞の殺傷を誘発していたが、クローンＤＢ－Ｓ７－２が最も高い効力を示した。ＤＢ－Ｓ７－２によって誘発される細胞毒性はまた、２つの追加のＯＣ株（ＣａＯＶ３細胞（図５Ｉ）及びＯＶＣＡＲ３細胞（図５Ｊ））でも評価された。ＤＢ－Ｓ７－２は、両方のＯＣ細胞でも効果的な殺傷能力を保持しており、この抗Ｓｉｇｌｅｃ７ｍＡｂクローンの効力の高さを示している。

【0320】

Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＮＡ送達ＭＡｂのインビボ発現と卵巣癌攻撃投与モデルにおける腫瘍進行への影響
インビトロ発現を確認した後、ＤＭＡｂクローンＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７のインビボ発現を試験した。これらの試験では、抗Ｓｉｇｌｅｃ７クローンごとに５０μｇ＋５０μｇ（ＨＣ＋ＬＣ）を、ＥＰを使用してＤＮＡを直接注入する方法（Duperret et al., 2018, Cancer Res 78: 6363-70; Patel et al., 2018, Cell Rep 25: 1982-93 e4）で説明されているように注入し、マウスの前脛骨筋へのトランスフェクション効率を高めた（図６Ａ）。ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７ Ｓｉｇｌｅｃ７ ＤＭＡｂを注入したマウスの血清中のヒトＩｇＧの存在は有意であったが、対照（データは示していない）や事前採血したマウスの血清では有意ではなかった（図６Ｂ、図１１）。ＤＢ－Ｓ７－１ ＤＭＡｂは最も高いインビボ発現を示し、マウス血清で５０μｇ／ｍｌという高いレベルを示した（図１１）。さらに、ヒトＮＫ細胞は、ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７ＤＭＡｂで免疫したマウスから得た１４日目の血清（ＤＭＡｂは１４日目に最も高い発現を示した）と空ベクター対照で染色された。３つの群すべてからの１４日目の血清はヒトＮＫ細胞を陽性染色したが、ｐＶａｘ１又は無関係な抗体対照の場合は染色は観察されなかった（図６Ｃ）。

【0321】

インビボのＳｉｇｌｅｃ７ ＤＮＡ送達の抗腫瘍作用を判定するために、次にＮＯＤ／ＳＣＩＤ－γ（ＮＳＧ）マウスにＯＶＩＳＥヒト卵巣癌細胞株（０．８×１０^６個の細胞／マウス）を攻撃投与した。腫瘍が平均サイズ５０ｍｍ^３を超えたときに、５０μｇ＋５０μｇ（ＨＣ＋ＬＣ）のＤＢ－Ｓ７－１若しくはＤＢ－Ｓ７－２ ＤＭＡｂ又はｐＶａｘ１空ベクターを電気穿孔法で筋肉内に送達した（図６Ｄ）。特に、ＤＢ－Ｓ７－１及びＤＢ－Ｓ７－２Ｓｉｇｌｅｃ７（図６Ｅ）ＤＭＡｂを投与された群は、空ベクター対照と比較して顕著な腫瘍負荷の減少／腫瘍増殖の遅延を示し、インビボでＳｉｇｌｅｃ７抗体が卵巣腫瘍の増殖に影響を与える可能性があることを示した。

【0322】

Ｆｃブロッキングは抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体による殺傷効率を強化した
Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、主に顆粒球、マクロファージ、ＮＫ細胞などのリンパ系細胞及び骨髄系細胞の表面に発現している。しかし、これらは各細胞タイプに固有に割り当てられている；ＦｃγＲＩＩｂはＢ細胞によってのみ発現され、ＦｃγＲＩＩＩａはＮＫ細胞によってのみ発現されるが、さまざまなＦｃγＲの組み合わせはさまざまな他の免疫細胞によって発現され、バランスの取れた抗体媒介細胞応答を可能にする（Bournazos et al., 2020, Nat Rev Immunol 20: 633-43; Romain et al., 2014, Blood 124: 3241-9; van der Poel and Carroll, 2017, Nat Immunol 18: 874-5）。未変性のヒトｍＡｂと同様に、ＤＢ－Ｓ７－２抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体は、免疫細胞上に存在するＳｉｇｌｅｃ７に結合する可変ドメインを一方の端に発現し、それによって抗原と他の糖タンパク質との相互作用を潜在的に阻害する。しかし、抗体のもう一方の端には、さまざまなＦｃ受容体に結合して免疫系の固有のアームと関与する定常Ｆｃ領域がある（Sanseviero, 2019, J Clin Med 8）。抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体が、ＦｃγＲとの連結によってＦａｂ領域だけでなくＦｃ領域を介して免疫細胞に結合すると、Ｓｉｇｌｅｃ７を介する細胞毒性が妨げられ、１つの免疫細胞が別の免疫細胞に再標的化される可能性がある（図１２）。Ｆｃブロッカー（Biolegend）を使用して免疫細胞上に存在するＦｃγＲをブロックすることにより、この問題を予備的に評価するための実験が計画された。図６Ｆに示されるように、免疫細胞上のＦｃγＲをブロッキングした後、ＦｃγＲをブロッキングしなかった場合と比較して、殺傷作用の強化が観察された。ＦｃγＲブロックを行った場合、ＯＶＣＡＲ３細胞の殺傷はより早い時点で発生することが観察された。図６Ｇに示される画像は、ＯＶＩＳＥ細胞でＦｃγＲをブロックすると殺傷作用が強化されることを示す。ＦｃγＲブロッキングは、より多くの免疫細胞がＳｉｇｌｅｃ７介在シグナル伝達を介してＯＣ細胞を標的とする細胞傷害に関与できるようにすることで、免疫細胞に介在される抗体依存性細胞毒性の質と量の両方を向上させるようである。

【0323】

ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ ＤＮＡでコードされた二重特異性ＮＫエンゲージャーの生成と発現
ＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）は、免疫腫瘍学の分野で有望な自然免疫様式として浮上している。現在、ＮＫ細胞上のＣＤ１６及び目的の腫瘍抗原を特異的に標的とする能力を有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）組換え試薬の開発が、臨床での使用について評価中である（Gleason et al., 2014, Blood 123: 3016-26; Ibarlucea-Benitez et al., 2021, Proc Natl Acad Sci U S A 118）。上記の予備データに基づくと、Ｓｉｇｌｅｃ７を標的とする二重活性化ＮＫＣＥの潜在的な関与は、腫瘍標的化のための追加の免疫ツールを提供する可能性があり、従ってＯＣにおける有望な治療戦略となる可能性がある。

【0324】

従って、潜在的なＦｃ媒介作用を排除し、ＮＫ細胞をより直接的に関与させ、標的化の可能性を向上させるために、Ｓｉｇｌｅｃ７ベースの二重特異性ＮＫＣＥを開発するための実験が計画された。これは、２つの連結された抗体結合断片（ｓｃＦｖ）として構築され、こうして、１つが標的の腫瘍抗原ＦＳＨＲと関与し、一方、２つ目がＮＫ細胞に高度に発現しているＳｉｇｌｅｃ７への結合を介して自然免疫系に関与する。ＤＢ－Ｓ７－２抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体のｓｃＦｖがコードする最適化された配列と、抗ＦＳＨＲ（クローンＤＤＡＰ）のｓｃＦｖをコードする最適化された配列（図７Ａ）とを、ＧＳ（グリシン－セリン）柔軟性リンカーを使用して融合した（Perales-Puchalt et al., 2019, Mol Ther 27: 314-25）。このＤＤＡＰ－ＮＫＣＥは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションで試験されたように、約５５ＫＤａの分子としてインビトロで効率的に発現された（図７Ｂ）。ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの結合は、それぞれＳｉｇｌｅｃ７又はＦＳＨＲを過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ（図７Ｃ）又はＫ５６２（図７Ｄ）細胞のフロー染色によって、両方の細胞標的に結合することが確認された。この新しい二重特異性ＮＫＣＥのヒトＳｉｇｌｅｃ７への結合を視覚化するために、２９３Ｔ－Ｓｉｇｌｅｃ７固定細胞の高分解能共焦点イメージングを実施した。細胞をＤＡＰＩ（核）、ＧＦＰ（Ｓｉｇｌｅｃ７）、及びテキサスレッド（ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ）で標識した。ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥは、ヒトＳｉｇｌｅｃ７を発現するＧＦＰ＋細胞に明確な表面結合を示すことが観察されている（図７Ｅ）。

【0325】

ＦＳＨＲを標的とする新しいＮＫ細胞エンゲージャーのサイトカイン分泌プロフィール
サイトカインは、リンパ球の増殖、生存、分化、及び活性化の促進に関与している（Romain et al., 2014, Blood 124: 3241-9）。サイトカイン産生はＮＫ細胞機能の重要な構成要素であるため（Gleason et al., 2012, Mol Cancer Ther 11: 2674-84）、新しいＤＤＡＰ－ＮＫＣＥのサイトカイン分泌プロフィールを調べるための実験を計画した。Gauthierのグループが最近実施した研究は、ヒトＮＫ細胞上に存在する他の２つの受容体であるＮＫｐ４６とＣＤ１６を標的とするＣＤ２０－ＮＫ細胞エンゲージャーが、ほとんど検出できないサイトカイン放出を誘発するが、高い抗腫瘍能を示し、このようなＮＫＣＥの重要なプロフィールを証明していることを報告した（Gauthier et al., 2019, Cell 177: 1701-13 e16）。ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ処理群では、空ベクター対照群と比較して、ｓＦａｓとグラニュリシン（Granulysin）の産生増加が観察された（図７Ｆ）。ＦＳＨＲと主にＮＫ免疫細胞を関与させるＤＤＡＰ－ＮＫＣＥには、炎症性サイトカインの誘導が減少していることを示しており、これは臨床開発において重要である可能性があり、他のＮＫＣＥとは異なるこれらの免疫プロフィールは、Ｓｉｇｌｅｃ７ＮＫ二重特異性エンゲージャーの独自性を確認している。

【0326】

ＦＳＨＲを標的とする新しい二重特異性Ｔ細胞及びＮＫ細胞エンゲージャーは、複数の卵巣腫瘍株で強力な殺傷を誘発し、インビボで腫瘍負荷を減少させた
ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの機能性を判断するために、xCELLigenceリアルタイム殺傷測定法を実施し、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥがヒト卵巣腫瘍株のパネルの殺傷を誘発する可能性を評価した。インビボで送達されたＤＤＡＰ－ＮＫＣＥは、インビトロの腫瘍殺傷誘発についてＤＤＡＰ－ＴＣＥと比較された。エフェクター細胞（ＰＢＭＣ／Ｔ／ＮＫ細胞）及びＴＣＥ／ＮＫＣＥは、標的ＯＣ細胞の播種の１日後に添加された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、対照（ＦＳＨＲ陰性細胞株）として使用された（Urbanska et al., 2015, Cancer Immunol Res 3: 1130-7）。注目すべきことに、ＦＳＨＲ陰性２９３Ｔ細胞における非特異的なオフ標的殺傷は観察されなかった（図７Ｇ及びＨ）。ＤＤＡＰ－ＴＣＥとＤＤＡＰ－ＮＫＣＥは、それぞれ精製ヒトＴ細胞とＮＫ細胞のみの存在下でＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を効果的に殺傷した（図１３Ａと１３Ｂ）。ＦＳＨＲを発現するさまざまな卵巣腫瘍細胞をさらに評価したところ、Ｔ細胞とＮＫ細胞の供給源としてヒトＰＢＭＣが存在する場合、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥは、ＯＶＩＳＥ（図８ＡとＢ）、ＣａＯＶ３（図８ＣとＤ）、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ（図８Ｅ）、ＰＥＯ－４細胞（図８Ｆ）、及びＫｕｒａｍｏｃｈｉ－ＦＳＨＲ細胞（図８Ｇ）を非常に効率的に殺傷することが証明された。重要なことは、ＫｕｒａｍｏｃｈｉとＰＥＯ－４はＢＲＣＡ２変異を有し、後者はまたＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性も示す（Sakai et al., 2009, Cancer Res 69: 6381-6）が、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥによる殺傷からは逃れられないことである。同様に、ＤＤＡＰ－ＴＣＥは、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ二重特異性抗体として強力な殺傷作用を発揮することがわかった。しかし、ＰＥＯ－４細胞では両方の有効性が変化する。これらの違いは、さらに進展しており、さらなる調査を必要とする潜在的に補完的である重要な意味を示唆しる。さらに、ＦＳＨＲを標的としないＮＫＣＥ（ＩＬ１３Ｒα２－ＮＫＣＥ）及びＴＣＥ（ＩＬ１３Ｒα２－ＴＣＥ）は、ＦＳＨＲ発現ＯＶＣＡＲ３細胞において毒性を誘発しなかった（図１３Ｃ及び１３Ｄ）。さらに、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥのｓＦａｓ媒介殺傷を実証するために、この新規ＮＫＣＥの殺傷作用が抗Ｆａｓ抗体の存在下と非存在下で比較された。Ｆａｓ（ＣＤ９５、アポトーシス抗原１）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの死滅受容体サブファミリーのメンバーである。Ｆａｓ／ＦａｓＬ結合は、外因性アポトーシス経路を誘導することが知られている。抗Ｆａｓ抗体の存在下では、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥによるＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞の殺傷が減少することが観察された。これは、Ｆａｓの関与によるＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの新しい殺傷メカニズムを示唆している。

【0327】

ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ及びＤＤＡＰ－ＴＣＥのインビボ抗腫瘍作用をさらに評価するために、ＮＳＧマウスにＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を攻撃投与した。ＮＳＧマウスにＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を投与し、腫瘍移植の４日後に、ＤＤＡＰ－ＴＣＥ、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ、又は空ベクターを１週間空けて２回投与した。４日目に、マウスにヒトＰＢＭＣも接種し、腫瘍体積を定期的に測定した（図８Ｈ）。両方の二重特異性抗体を用いる処理により、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ腫瘍担持マウスの腫瘍負荷が大幅に減少したが、対照処理群ではそのような影響は見られず（図８Ｉ）、これは、このアプローチの潜在的な相乗作用を裏付けている（図１４）。

【0328】

卵巣癌免疫療法のためにＦＳＨＲを工学操作して自然免疫又は獲得免疫を関与させる
ＯＣ治療法の分野では重要な進歩が見られるものの、再発性ＯＣは依然として予後が極めて悪く、致死率の高い癌種の前兆となる（Izar et al., 2020, Nat Med 26: 1271-9; Kurnit et al., 2021, Obstet Gynecol 137: 108-21; Hamanishi et al., 2016, Int Immunol 28: 339-48)。卵巣癌細胞は癌特異的抗原を発現し、これらは、免疫療法後に抗腫瘍免疫応答を誘発することができるため、ＯＣが免疫療法による治療に良好に反応すると考えられる理由は複数あるが、ＯＣ患者における免疫療法奏効率は依然としてかなり控えめである（Coleman, 2016, Nat Rev Clin Oncol 13: 71-2）。特に、標的化療法の開発における主な障害は、健康な組織ではなく腫瘍細胞の表面に限定された特異的発現を有する標的を見つけることである（Perales-Puchalt et al., 2017, Clin Cancer Res 23: 441-53）。ＦＳＨＲは、卵巣顆粒膜細胞で選択的に発現するそのような標的の１つである（Perales-Puchalt et al., 2017, Clin Cancer Res 23: 441-53）ため、ＯＣにおける潜在的な標的としての検討を研究するための実験が計画された。卵胞刺激ホルモンは、ＦＳＨＲとの結合を介して機能する、重要な卵巣上皮細胞増殖誘導因子である。ＦＳＨＲの過剰発現は、発癌経路のアップレギュレーションとＥＯＣ増殖の増加の原因となる。従って、ＦＳＨＲは、ＯＣに対してＴ細胞を誘導するための重要な治療標的として利用できる可能性がある（Perales-Puchalt et al., 2017, Clin Cancer Res 23: 441-53）。最近、免疫適格マウスモデルにおいて、免疫によるＦＳＨＲ標的化の腫瘍の影響、耐容性、安全性の可能性が報告された（Perales-Puchalt et al., 2019, JCI Insight 4）。最適化されたＤＮＡ配列を注入し、次に電気穿孔法を行うと、強力な免疫細胞性及び体液性応答を誘発できる天然構造のタンパク質の過剰発現が付与される（Tebas et al., 2017, N Engl J Med; Yan et al., 2013, Cancer Immunol Res 1: 179-89）。ここでは、実験を拡張して抗ＦＳＨＲモノクローナル抗体を生成し、この試薬を使用して新しい生物製剤を開発した。ここで提示された結果は、強力な抗ＦＳＨＲ抗体の生成と特性解析、及びＯＣの免疫療法のツールとしてのその応用を示す。いくつかの個別のクローン（クローンＤＤＡＰを含む）が、その効力と反応性に基づいて添加試験のために選択された。ＭＡｂは、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、及び免疫細胞化学を含む複数の方法による試料内のＦＳＨＲ発現の検出をサポートする。これにより、その潜在的な影響が臨床にまで広がり、個別化医療アプローチのための患者試料のＦＳＨＲ状態を判断するのに役立つ可能性がある。

【0329】

癌治療のための抗体技術の分野における最近の重要なツールは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャープローチである。これらのほとんどは前臨床及び初期臨床研究段階であるが、承認済みの癌二重特異性製品ビーリンサイト（Blincynto）（ブリナツモマブ（blinatumomab））があり、それは、Ｂ細胞上のＣＤ１９を標的とし、連結された抗ＣＤ３結合を介してＴ細胞を関与させる急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療薬として使用されている（Sheridan, 2021, Nat Biotechnol 39: 251-4）。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、腫瘍細胞を殺傷するためにＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞の両方を方向修正することができ、Ｔ細胞による内因性抗原特異的ＴＣＲ認識とは無関係である（Dao et al., 2015, Nat Biotechnol 33: 1079-86）。高い抗腫瘍効力を示すにもかかわらず、いくつかの要因（腫瘍抗原の特異性、腫瘍外活性、特異的サイトカイン放出の問題、及び短い処理半減期を含む）により、これらのツールの進捗率は期待よりも遅くなっている（Perales-Puchalt et al., 2019, Mol Ther 27: 314-25）。ＤＤＡＰ抗ＦＳＨＲクローンの特異性に基づいて、これは研究の重要な標的になる可能性があると考えられた。ＯＣモデルでこれらの新しい潜在的ツールを迅速に評価するために、ＤＮＡの直接インビボ送達が使用された。ＤＤＡＰ－ＴＣＥは、ＦＳＨＲとＣＤ３末端の両方に結合し、ヒトＰＢＭＣの存在下でナノグラムレベル（７．８１ｎｇ／ｍｌ）で強力な殺傷作用が観察された。このＤＤＡＰ－ＴＣＥは、ＤＤＡＰ親抗体よりも特異的腫瘍殺傷力が顕著に優れていた。

【0330】

ＨＧＳＯＣやＯＣＳなどの一部の悪性度の高いＯＣタイプは「冷たい」腫瘍（"Cold" tumor）と呼ばれ、治療アプローチが限られており、ＴＩＬ浸潤が低いため反応性が低く、致死率が高くなる（Wu et al., 2021, Front Immunol 12: 672502）。従って、Ｔ細胞アプローチやＮＫなどの自然エフェクター細胞は、研究の重要なツールとなる可能性がある（Hoogstad-van Evert et al., 2020, Gynecol Oncol 157: 810-6）。ＮＫ細胞は、腫瘍免疫監視の第一線の防御として機能する（Wiernik et al., 2013, Clin Cancer Res 19: 3844-55）。最近の限られたデータでは、ＯＣがＮＫ細胞の攻撃に応答する可能性があることが示唆されている（Hoogstad-van Evert et al., 2020, Gynecol Oncol 157: 810-6）。初期のＮＫ二重特異性研究は、ＮＫ細胞関連受容体に注目してきた。ＮＫ細胞は、自然細胞毒性の調節に関連するＮＫＧ２Ｄ及び自然細胞毒性受容体の関与を介して、免疫標的を見つることができる。さらに、特定のＩｇアイソタイプに強力に結合する活性化受容体ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）は、局所腫瘍環境に抗体が輸送された結果として、ＮＫ駆動型ＡＤＣＣを促進する（Wiernik et al., 2013, Clin Cancer Res 19: 3844-55）。従って、ＮＫ細胞によって誘発される免疫応答は、ＮＫ細胞上に存在する受容体間の相互作用、その部位での腫瘍の直接認識、又はＮＫ細胞を関与させる標的細胞リガンドに対する宿主の体液性応答に依存する（Wiernik et al., 2013, Clin Cancer Res 19: 3844-55）。

【0331】

前述のように、ＮＫ細胞は腫瘍細胞を溶解できるため、腫瘍の免疫監視において役割を果たすが、腫瘍細胞はしばしば免疫回避戦略を利用してこの免疫機能から逃れる。免疫回避に関連する最近の重要な領域は、ＮＫ攻撃に対する免疫静的デコイとして、表面のシアル酸グリコシル化の増加を示す腫瘍を介するものである。ＮＫ細胞はＳｉｇｌｅｃ７を表示し、これは、腫瘍関連を介してヒトＮＫ細胞の表面で関与すると、ＮＫを介する標的殺傷を阻害することができる（Prescher et al., 2017, J Med Chem 60: 941-56）。Ｓｉｇｌｅｃは最近、糖免疫チェックポイントとして指定されているが、この研究の多くは初期段階である。癌細胞で過剰発現しているシアル化グリカンリガンドとの相互作用を介して、阻害性Ｓｉｇｌｅｃは防御的な抗腫瘍免疫に影響を与える可能性がある（Hong et al., 2021, ACS Cent Sci 7: 1338-46）。従って、Ｓｉｇｌｅｃ７を標的とすることは、ＯＣにおける抗腫瘍免疫応答を強化する有望な治療戦略となる（Ibarlucea-Benitez et al., 2021, Proc Natl Acad Sci U S A 118）。これを実現するために、トランスジェニックヒト化マウスを使用するＳｉｇｌｅｃ７に対するいくつかのヒト様抗体が開発され（Bordoloi et al., 2021, ACS Pharmacol Transl Sci 4: 1349-61; Perales-Puchalt et al., 2019, Mol Ther 27: 314-25）、これらは、ヒトＶ遺伝子系統に由来するＶ領域のため、研究と迅速な応用という利点を提供する（Tu and Zheng, 2016, Methods Mol Biol 1371: 157-76）。いくつかの重要なクローンが開発され、組み換えヒトＳｉｇｌｅｃ７（Ｓｉｇｌｅｃ７は細胞及びヒトＮＫ細胞で発現される）に高い結合性を有する３つの非常に強力なクローン（ＤＢ－Ｓ７－１、ＤＢ－Ｓ７－２、及びＤＢ－Ｓ７－７）を使って実験を進めるように計画された。抗体は、細胞標的を非特異的に殺傷することなく、標的ＯＣ細胞の特異的殺傷を促進する腫瘍標的細胞の存在下で、ＮＫ細胞の機能を駆動することができることが観察された。これらは、さらなる評価のための重要なツールである。

【0332】

ここでは、ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥのさらなる特性解析を示す。これは、Ｓｉｇｌｅｃ７ベースの二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャーの最初の報告であると考えられる。最も高い効力を示したＤＢ－Ｓ７－２の配列を使用して、この新しい二重特異性ヒトＮＫＣＥを設計し、抗ＦＳＨＲと関連させた。このＤＤＡＰ－ＮＫＣＥは、ヒト卵巣腫瘍細胞のパネルを使用して評価したところ、腫瘍特異的細胞の殺傷において非常に強力であった。標的にはＢＲＣＡ遺伝子に変異を有する細胞株や、化学療法又はポリＡＤＰリボースポリメラーゼ阻害剤（ＰＡＲＰｉ）に耐性を示す細胞株が含まれた。散発性の高悪性度漿液性ＯＣ及びＢＲＣＡ関連ＯＣの場合に素晴らしい活性を示すにもかかわらず、残念ながら、古典的な化学療法と同様に、多くの患者が最終的にＰＡＲＰｉ治療に対する抵抗性を獲得すると報告されおり（Franzese et al., 2019, Cancer Treat Rev 73: 1-9; Liu et al., 2014, Gynecol Oncol 133: 362-9; McMullen et al., 2020, Cancers (Basel) 12; Yang et al., 2020, Front Immunol 11: 577869）、このようなＯＣ腫瘍を標的とする新しいアプローチが重要であることをサポートしている。ＦＳＨＲ標的化を使用して、ＤＤＡＰ－ＴＣＥとＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの両方（二重特異性Ｔ細胞及びＮＫ細胞エンゲージャー）によって示された高い効力は有望である。特に、ＦＳＨＲを標的とするＮＫとＴ細胞エンゲージャーの両方が、卵巣腫瘍担持マウスモデルにおいて、インビボの腫瘍負荷／腫瘍進行を軽減する効力が同等であることが見いだされた。

【0333】

ＦＳＨＲ標的化二重特異性抗体であるＤＤＡＰ－ＴＣＥとＤＤＡＰ－ＮＫＣＥの両方に違いが見られた。どちらもインビトロ及びインビボで腫瘍に影響を与える非常に強力なアプローチである。ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥは、サイトカイン産生表現型が減少した状態で強力な殺傷力を発揮する。これらの試験は、ＯＣの主要サブセットに対するＦＳＨＲを標的とする有用性、ＦＳＨＲとＣＤ３に注目した二重特異性ツールが非常に免疫力が高いこと、Ｓｉｇｌｅｃ７ｍＡｂがＮＫ細胞を関与させて活性化すること、そして最後にＳｉｇｌｅｃ７ ＮＫＣＥがＯＣを標的とする強力なツールであり、インビボで腫瘍の増殖に影響を与える可能性があること、及びこれら２つのアプローチを組み合わせることでさらなる利点が得られる可能性があることを、初めて証明している。ここで提示された結果は、二重特異性エンゲージャーによるＮＫ細胞活性化の新しい標的を初めて示しており、多様なＯＣ集団がこれらの治療法の潜在的目標であると考えられる。これらはＯＣの研究と診断に直接応用することができる。ＦＳＨＲを発現する卵巣癌やその他の癌に対するこれらのアプローチの応用の進展のために、これらの重要なツールをさらに調査するためのさらなる努力が必要である。ＳｉｇｌｅｃＮＫＣＥは、他の固形腫瘍及び液性腫瘍標的との関連で、さらに研究する必要がある。

【0334】

実施例２：二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャーを標的とする設計されたＩＬ１３Ｒａ２とＳｉｇｌｅｃ７を標的とする（ＩＬ１３Ｒａ２－ＮＫＣＥ）
図１７は、二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャーを標的とする設計されたＩＬ１３Ｒａ２とＳｉｇｌｅｃ７を標的とする（ＩＬ１３Ｒａ２－ＮＫＣＥ）の概略図を示す。ＩＬ１３Ｒａ２－ＮＫＣＥは、抗原陽性黒色腫細胞を殺傷する強力な活性を示した（図２０）。

【0335】

実施例３：Ｓｉｇｌｅｃ－７糖免疫チェックポイントＭＡｂとＮＫ細胞エンゲージャー生物製剤は、卵巣癌に対する強力な抗腫瘍免疫を誘導する
ＨＧＳＣや卵巣癌肉腫（ＯＣＳ）などの侵襲型ＯＣは、組織浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤が少なく、治療応答が悪いことから「冷たい」腫瘍と呼ばれる（Wu et al., 2021, Front Immunol 12, 672502, Hoogstad-van Evert et al., 2020, Gynecol Oncol 157, 810-816）。従って、追加の手段で免疫反応に関与することは、冷たい腫瘍の免疫標的化にとって非常に重要である（Pugh-Toole et al., 2022, Curr Treat Options Oncol 23, 210-226）。ＮＫ細胞は腫瘍免疫監視の第一防衛線として機能するため、自然免疫エフェクターシステムを考慮することは重要である（Wiernik et al., 2013, Clin Cancer Res 19, 3844-3855）。腫瘍は、ＭＨＣダウンモジュレーションやＴ細胞枯渇プログラムのアップレギュレーションなどの複数のメカニズムを介してＴ細胞応答を回避する（Vinay et al., 2015, Semin Cancer Biol 35 Suppl, S185-S198）。同様に、癌は宿主システムを利用して免疫回避戦略（ＮＫ活性化受容体の可溶性リガンドの放出、阻害性サイトカインの放出、ＨＬＡ分子のアップレギュレーションを含む）により、ＮＫ細胞の監視機能を回避し、こうしてＮＫ免疫機能から逃れることができる（Sabry et al., 2013, Front Immunol 4, 408）。しかし、ＮＫの非応答性は、追加のＮＫ制御経路によっても媒介される可能性がある。最近の研究では、多くの腫瘍がその表面のシアル酸レベルの増加を示すことが特定されており、これはおそらくＮＫ細胞への負のシグナルとして機能し、腫瘍がＮＫ免疫監視を回避できるようにするものと考えられる（Dobie et al., 2021, Br J Cancer 124, 76-90）。このような超シアル化腫瘍に対するＮＫ活性化を強化するためのアプローチの１つは、Ｓｉｇｌｅｃ－７のリガンドを発現する標的細胞の脱シアル化である（Jandus et al., 2014, J Clin Invest 124, 1810-1820）。ＮＫ細胞は、異なるシアログリカン決定因子の受容体／センサーであるＳｉｇｌｅｃ－７を表示し、これは、腫瘍との関連を介してヒトＮＫ細胞の表面で関与すると、ＮＫを介する標的殺傷を阻害することができる（Prescher et al., 2017, J Med Chem 60, 941-956; Fong et al., 2018, Proc Natl Acad Sci U S A 115, 10410-10415; Meril et al., 2020, Mol Carcinog 59, 713-723）。これらは、シアログリカン腫瘍シールドによる制御性の負のシグナルを示す可能性がある。ごく最近の研究では、一部のＳｉｇｌｅｃが、ＭＨＣに依存しない方法でＮＫを介する抗腫瘍免疫を阻害する糖免疫チェックポイント分子として機能する可能性があることが示唆されている（Hong et al., 2021, ACS Cent Sci 7, 1338-1346）。この研究では、腫瘍免疫調節のためにＳｉｇｌｅｃ７を標的とするモノクローナル抗体と誘導体の使用が検討され、そのような糖－ＣＰＩ機能を確認し、おそらく克服して、腫瘍制御に影響を与える能力を改善した。

【0336】

これらの研究の焦点は、攻撃的な治療が困難な表現型のヒトＯＣ（１９）に対する抗腫瘍免疫応答であった。このグループは、トランスジェニックヒト化マウスモデルを用いて、Ｓｉｇｌｅｃ－７に対するいくつかの抗体を開発した（Bordoloi et al., 2022, JCI Insight 7; Perales-Puchalt et al., 2019, JCI Insight 4; Bordoloi et al., 2021, Genes Cancer 12, 51-64）。本試験では、３つの非常に強力なＳｉｇｌｅｃ－７結合クローンに注目した。これらの抗体はヒトＩｇＧ１として工学作成され、免疫細胞への結合が試験された。ＮＫ細胞に対する抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体の強い染色が観察され、明るいＮＫサブセットと暗いＮＫサブセットの両方が含まれ、これはバルクのエフェクターＮＫ集団への結合能があることを示唆している。さらに、発現によりＮＫ細胞が活性化され、活性化されたこれらの細胞がいくつかの腫瘍株に存在する場合、以前は難治性であったＯＣ標的に対してＮＫ媒介殺傷が起こる可能性がある。これらのヒトＳｉｇｌｅｃ－７抗体は、多様なＯＣ腫瘍標的細胞の存在下でＮＫ免疫機能を駆動し、標的ＯＣ細胞の特異的殺傷を促進する。重要なことは、このアプローチが腫瘍変異に比較的寛容なはずであるということである。ＯＣ株は、特にＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＫＴ２、ＴＰ５３、ＳＰＯＰ、ＳＴＡＴ３、ＭＴＯＲ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＢＲＡＦを含む複数の遺伝子変異を用いて試験され（表１）、すべての変異がＮＫ細胞標的の抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体活性化の標的であることが観察された。

【表1-1】

【表1-2】

【0337】

これらのＭａｂはＰＤ－１ ＣＰＩと組み合わせて試験された。この二重治療は相乗効果があることが分かった。しかし、Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体の効力は、試験された抗ＰＤ１抗体ペンブロリズマブの１０倍であることが観察され、この複合ＮＫ Ｔ細胞抗枯渇パネルの潜在的価値を示唆している。次に、ヒトＰＢＭＣを移植したヒト化ＮＳＧマウスモデルが使用され、ＤＮＡでコードされたＤＢ７．２ Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂの単回投与により、ＯＶＩＳＥヒト卵巣腫瘍を有するマウスの腫瘍が著しく抑制され、生存期間の中央値が上昇することが観察された。数か月にわたって移植片対宿主病を発症するというＮＳＧモデルの限界（Wunderlich et al., 2014, Blood 123, e134-144）のため、抗Ｓｉｇｌｅｃ－７は単回投与のみであったが、それでも非常に効果的であった。これは、現在のＣＰＩ（Hirsch et al., 2022, Nat Med 28, 2236-2237）が利用されているように、長期間にわたって複数回投与すると追加のメリットが得られる可能性が高いことを示唆している。注目すべきは、これは、ＯＣ又は任意のヒト腫瘍を標的とするＳｉｇｌｅｃ－７標的化ＭＡｂ単独及び抗ＰＤ１（ＮＫ細胞及びＴ細胞ＣＰＩ）との組み合わせの影響を初めて証明したものであり、このような組み合わせの潜在的な付加価値についてさらに研究する必要があること、又はＣＰＩ難治性腫瘍を検討する必要があることを示唆している。これらの研究は、現在の免疫療法戦略を強化する可能性のある新しい非Ｔ細胞ＣＰＩアプローチの可能性をサポートする腫瘍治療に重要な意味を有する。

【0338】

次に、標的化ＯＣ療法についてＮＫ細胞のＳｉｇｌｅｃ－７の結合と活性化の効力を評価した。理論に拘束されるものではないが、Ｓｉｇｌｅｃ－７への結合によりＮＫ細胞が直接関与し、ＮＫ細胞が効率的に細胞標的に引き寄せられる可能性があるという仮説を立てた。ＦＳＨＲを標的とするＭＡｂと強力な抗Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂとの二重特異性融合体を作成することにより、新しいタイプのＮＫ細胞エンゲージャーを開発した。ＮＫＣＥは、免疫腫瘍学の分野で興味深い自然免疫概念として浮上してきた。現在、臨床に導入されている二重特異性抗体が１つある；ＡＭＬ及びＣＤ３３＋悪性腫瘍に対して、ＣＤ１６ａ－ＩＬ－１５／ＣＤ３３が関与するＧＴＢ－３５５０である（Gleason et al., et al., 2014, Blood 123, 3016-3026; Ibarlucea-Benitez et al., 2021, Proc Natl Acad Sci U S A 118; Demaria et al., 2021, Eur J Immunol 51, 1934-1942）。前臨床研究されているその他のＮＫ標的には、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、及びＮＫｐ４６がある。本来は腫瘍シアログリカンクロークによって悪影響を受けるであろうＮＫ細胞の結合と活性化の抗Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂについて示された表現型は、Ｓｉｇｌｅｃ－７が特異的腫瘍－ＮＫ活性化と関与のための独自の免疫ツールとなり得ることを示唆している。ここで開発された二重特異性抗体ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１は、ＮＫ細胞と卵巣癌細胞の両方への強力な結合を示した。これは、多様なＯＣ表現型に対する殺傷作用（ｐＭレベル）を示す。これは、免疫エンゲージャーとしてのＳｉｇｌｅｃファミリーのメンバーの開発の、又はＳｉｇｌｅｃ－７二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャーの開発に対するこのようなアプローチの使用の最初の報告である。このＮＫＣＥは、さまざまなヒト卵巣腫瘍株のパネルを使用して評価したところ、標的細胞に特異的で、腫瘍細胞の殺傷力が強力であった。ＦＳＨＲ陰性細胞は殺傷されなかったため、標的におけるＦＳＨＲ発現はＮＫ殺傷活性の必須要件であった。興味深いことに、ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１はサイトカインと細胞毒性分子の産生を減少させ、これは、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の潜在的リスクが限定された殺傷ツールを研究することが重要であることを示唆している（Pinto et al., 2022, Trends Immunol 43, 932-946）。

【0339】

これらの研究中に、ＯＣ療法にとって特に問題となる変異を発現するＯＣ細胞に注目された。これには、ＰＡＲＰｉ耐性ＯＣ細胞と多様な薬剤標的に対する耐性を示すＯＣが含まれており、薬剤標的には、具体的にはＨＤＡＣ（ダシノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット）、ＰＩ３Ｋ（ダクトリシブ、ブパルリシブ）、ｍＴＯＲＣ（オミパリシブ）、Ｗｅｅ１（ＣＨＥＫ１）、ＴＯＰ１（ガリビスコキナゾール、ミトキサントロン、イリノテカン）、ＤＮＡアルキル化剤（オキサリプラチン、シスプラチン）、及び微小管安定剤（ドセタキセル）（表１）が含まれる（Ai et al., 2021, Oncogene 40, 2496-2508; Diaz Osterman et al., 2019, Elife 8; Estep et al., 2007, PLoS One 2, e1279; Kapoor et al., 2018, Biochim Biophys Acta Mol Cell Res 1865, 392-405; Ayestaran et al., 2020, Patterns (N Y) 1, 100065）。これらの研究には、ＯＣ癌患者コホートにおける主要なリスクであるＢＲＣＡ（ＢＲＣＡ１及び２）変異を含むＯＣ株が含まれていた。ＨＧＳＣの約５０％は、生殖細胞系列若しくは体細胞変異又は経路メンバーのエピジェネティックサイレンシングを介して、破壊されたＢＲＣＡ経路を示す（Vaughan et al., 2011, Nat Rev Cancer 11, 719-725）。ＰＡＲＰ阻害はＤＮＡ損傷修復の重要な経路であるため、ＰＡＲＰｉはＢＲＣＡ１／２の破壊的変異を伴う腫瘍の治療に大きな期待が寄せられている。しかし、ＰＡＲＰｉに対する耐性は、耐性ＯＣ患者の治療において問題になると報告されている（Noordermeer et al., 2019, Trends Cell Biol 29, 820-834）。ＮＫＣＰＩとして使用してのＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂ並びに二重特異性Ｓｉｇｌｅｃ－７ＮＫエンゲージャーをインビトロ及びインビボで使用して、ＦＳＨＲ＋腫瘍を殺傷する効力と一貫性は、反応の乏しいＯＣを治療するための追加のツールをもたらす可能性を示唆している。

【0340】

要約すると、この研究では、ＮＫ細胞を関与させて活性化し、ＯＣに対するＰＤ－１免疫療法をさらに補完できる強力なＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂについて説明しており、これが、この場合ＮＫ細胞に対する追加クラスのＣＰＩである可能性を表している。さらに、データは、Ｓｉｇｌｅｃ－７は新しいＮＫＣＥを構築するのに使用でき、インビトロ及びインビボで顕著な抗腫瘍応答を引き起こす受容体陽性ＯＣを標的とする強力なツールとして機能することができることを示す。これらの研究はＯＣの追加のツールを設計するために重要であるが、追加の困難な癌に対するこのような生物学的製剤の有用性を調べるには、他の研究が必要である。

【0341】

材料と方法について以下に説明する。

【0342】

細胞と動物
実験に使用された細胞株には、ＯＶＣＡＲ３、ＣａＯＶ３、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＩＳＥ、ＯＶＣＡＲ１０、ＰＥＯ－４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ細胞、ＨａＣａＴヒトケラチン生成細胞、ＷＭ３７４３黒色腫細胞、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、ＡＧＳ胃癌、及びＧＭ０５３８９ヒト線維芽細胞が含まれる。２９３Ｔ細胞は、Ｓｉｇｌｅｃ－７を発現するようにレトロウイルスで形質導入された。ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＩＳＥ、及びＫｕｒａｍｏｃｈｉ細胞は、既に記載されているように（４６）、レトロウイルスでヒトＦＳＨＲを形質導入してＦＳＨＲを発現した。Ｋ５６２細胞はＡＴＣＣから購入し、レトロウイルスで形質導入してＦＳＨＲを発現した。

【0343】

ＤＮＡにコードされたＭＡｂの生成
ヒトＳｉｇｌｅｃ－７に対するいくつかのヒト化抗体が生成された。これらのＭＡｂはＳｉｇｌｅｃ－７に結合し、ＮＫ細胞を染色することができた。ここで、これらのハイブリドーマは配列決定され、インビトロ発現のツールとしてＳｉｇｌｅｃ－７ ＤＮＡでコードされたモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）の開発に使用された（Patel et al., 2018, Cell Rep 25, 1982-1993 e1984）。最終的なヒトＩｇＧ１ ＨＣ及びＬＣは、記載されているように、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルの制御下で、ｐＶａｘ１プラスミド発現ベクターに挿入された（Patel et al., 2018, Cell Rep 25, 1982-1993 e1984）。次に、プラスミドをExpifectamine 29３ 発現キット（Thermo Fisher Scientific）を使用してＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、組み換え抗体を生成した。組み換え抗体の純度と見かけの分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって評価された。

【0344】

ＦＳＨＲｘＳｉｇｌｅｃ７ ＮＫＣＥの設計
ＦＳＨＲｘＳｉｇｌｅｃ７ナチュラルキラー細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）は、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂ（ＤＢ－Ｓ７－２）のコドン最適化ｓｃＦｖをコード化し、続いて、強化性最適化ＩｇＥリーダー配列を添加されたＦＳＨＲ抗体（Ｄ２ＡＰ１１）のｓｃＦｖをコード化して設計された。両方の構築物は、改変されたｐＶａｘ１発現ベクターにサブクローニングされた（Perales-Puchalt et al., 2019, JCI Insight 4）。ＦＳＨＲｘＳｉｇｌｅｃ７ ＮＫＣＥはＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１と指定されている。

【0345】

フローサイトメトリー
細胞の染色にはBD LSRIIフローサイトメーターを使用した。Ｓｉｇｌｅｃ－７／ＦＳＨＲを安定的に発現する細胞の選別には、BD FACS Ariaセルソーター（BD Biosciences）を使用した。使用した抗ヒト抗体は、直接蛍光色素が結合されていた。使用した抗体：抗Ｓｉｇｌｅｃ－７（F023-420、BD Pharmingen）、抗Ｓｉｇｌｅｃ３（６Ｃ５／２、R&D Systems）。非結合一次抗体には、ＰＥ－二次抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（Invitrogen）及びＰＥ／ＡＦ６４７－二次抗ヒトＦ（ａｂ’）_２（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc）が使用された。死細胞を分析から除外するために、Live/Dead Violet生存率キット（Invitrogen）を使用した。ＰＢＭＣの蛍光サイトメトリー染色には、以下の抗体を使用した：BiolegendのＣＤ６９ ＰＥ－Ｃｙ５（クローンＦＮ５０）、ＰＤ－１ ＢＶ４２１（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）、ＣＣＲ７ ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｇ０４３Ｈ７）、ＣＤ１９ ＢＶ７８５（クローンＨＩＢ１９）、ＣＤ２７ ＢＶ６５０（クローン０３２３）、ＣＤ５６ ＢＶ５７０（クローンＨＣＤ５６）、ＣＤ１６ ＢＶ７１１（クローン３Ｇ８）、ＣＤ２１ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＢＵ３２）、及びＳｉｇｌｅｃ－７（クローン６－４３４）；BD BiosciencesのＣＤ１１ｃ ＢＵＶ３９５（クローンＢ－ｌｙ６）、ＣＸＣＲ５ ＢＶ７５０（クローンＲＦ８Ｂ２）、ＣＤ３ ＢＵＶ８０５（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４５ ＡＦ７００（クローンＨＩ３０）、ＣＤ１２７ ＰＥ－ＣＦ５９４（クローンＨＩＬ－７ＲＭ２１）、ＣＤ２５ ＢＵＶ７３７（クローン２Ａ３）、ＣＤ８ ＢＵＶ４９６（クローンＲＰＡ－Ｔ８）、ＨＬＡ－ＤＲ ＢＶ６０５（クローンＧ４６－６）、ＣＤ３８ ＢＵＶ６６１（クローンＨＩＴ２）、ＣＤ１４ ＢＶ４８０（クローンＭＰ９）、ＣＤ４５ＲＡ ＢＵＶ５６３（ＨＩ１００）、ＣＤ４ ＢＢ７９０（クローンＳＫ３）、ＣＤ１５ ＦＩＴＣ（クローンＨＩ９８）、ＣＤ１０３ ＢＢ７００（クローンＢｅｒ－ＡＣＴ８）、ＣＤ１６１ ＡＰＣ（クローンＤＸ１２）。簡単に説明すると、凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、１０Ｕ／ｍｌ ＤＮＡｓｅＩ（Roche Life Sciences）を含む完全Ｒ１０培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ）で３７℃、５％ＣＯ２で２時間静置した。細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）緩衝液で希釈した０、１、又は１０μｇ／ｍｌのＤＢ７．２ Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体とともに２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈したマウス抗ヒトＩｇＧＦａｂ二次抗体ＰＥ（Invitrogen）とともに２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、ケモカイン受容体ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ５で、３７℃、５％ＣＯ２で１０分間、予備染色した。次に、Live/Dead Fixable Aqua（Invitrogen）を使用して細胞を１０分間染色し、次に、等量の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）緩衝液（０．１％アジ化ナトリウムと１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）とブリリアント染色緩衝液（BD Biosciences）とで希釈した直接結合したモノクローナル抗体のパネルとHuman Trustain FcX（Biolegend）とともに２０分間インキュベートした。染色された細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）を含むＰＢＳで固定した。試料はFACS Symphony A5サイトメーターを使用して取得し、Flowjoソフトウェア１０．８．１（Tree Star Inc.）により分析した。

【0346】

酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂ及びＳｉｇｌｅｃ－７ ＤＭＡｂを電気穿孔されたマウス血清中のヒトＩｇＧの定量化のために、MaxiSorpプレートを１０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Bethyl）で４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ中の０．０５％ツイーン２０）中の５％ミルクで室温で２時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、０．２％ツイーン２０を含むＰＢＳ中の１％ＮＣＳで希釈した試料を加え、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Bethyl）の１：１０，０００希釈液で室温で１時間インキュベートした。プレートをSigmaFast ＯＰＤで５～１０分間発色させ、ＯＤ４５０シグナルを測定した。

【0347】

xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを使用したインビトロ細胞毒性分析
インビトロ細胞毒性測定を、xCELLigenceリアルタイム細胞分析装置（ＲＴＣＡ）（Agilent Technologies, USA）を使用してインピーダンスに基づいて実施した。インピーダンスは、細胞指数と呼ばれる任意の単位で表される。標的細胞を、xCELLigenceＲＴＣＡデバイスの使い捨て無菌９６ウェルＥプレートに、ウェルあたり１×１０^４～２×１０^４個の細胞の最終細胞濃度で播種した。実験中、この装置はＣＯ_２インキュベーター内に置き、対照ユニットに接続されたケーブルによって制御した。９６ウェルＥプレートはxCELLigenceＲＴＣＡデバイス内に置き、１８～２４時間インキュベートした。次に、エフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ／ＮＫ、Ｅ（エフェクター）：Ｔ（標的）比＝５：１／１０：１）と治療物（Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂ／ＮＫＣＥ）を添加した。リアルタイム分析を３～７日間実施した。電気伝導率はxCELLigenceデバイスによって１５分ごとに単位のない細胞指数（ＣＩ）パラメータに変換し、画像は１時間間隔でキャプチャーした。生成されたデータは、エフェクター細胞とＭＡｂ／ＮＫＣＥが標的細胞に添加された時点に基づいて正規化し、ＲＴＣＡ／ＲＴＣＡ Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。

【0348】

ウェスタンブロット分析
Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂのインビトロ及びインビボ発現を実証するために、抗体をコードするＤＮＡでＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞をトランスフェクションした後に収集した上清、又はＳｉｇｌｅｃ－７ ＤＭＡｂで免疫したマウスから収集した血清を、熱不活化し、還元し、Odyssey タンパク質分子量（ＬＩ－ＣＯＲ）をロードした。電気泳動後、試料をｉＢｌｏｔ－２システム（Thermo Fisher Scientific）を介してポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、Odysseyブロッキング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用してブロッキングした。重鎖と軽鎖は、ヤギ抗ヒト二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して検出された。二重特異性Ｔ細胞及びＮＫ細胞エンゲージャーの発現を、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc）を使用して、次にロバ抗ヤギ抗体（ＬＩＣＯＲ）を使用して検出した。

【0349】

免疫蛍光（ＩＦＡ）分析
Ｓｉｇｌｅｃ－７を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２ウェルチャンバースライドに播種し、細胞を一晩接着させた。細胞をＰＢＳ中の０．５％トリトン１００を使用して透過処理し、続いて５％ヤギ血清を使用してブロッキングした。次に、二重特異性ＮＫＣＥを添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に、スライドをヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ（テキサスレッド結合）二次抗体とともにインキュベートした。核染色を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して実施した。試料をFluoroshield封入剤（Invitrogen）を使用してガラススライドにマウントし、Leica TCS SP8 WLL走査型レーザー共焦点顕微鏡を使用して観察した。

【0350】

腫瘍の攻撃投与
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ－γ（ＮＳＧ）マウスにＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を攻撃投与した。ＮＳＧマウスの右脇腹に、３×１０^６個のＦＳＨＲ発現ＯＶＣＡＲ３細胞又はＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を皮下注射した。３日後、腫瘍が触知可能になった時点で、マウスにｐＶａｘ１（１００μｇ）又はＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ（１００μｇ）を接種した。発現ベクターを投与した同じ日に、１０×１０^６個のＰＢＭＣを各マウスの腹腔内に注射した。マウスにＤＮＡを１週間空けて２回接種し、腫瘍サイズを定期的に追跡した。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の兆候が現れた時点でマウスを安楽死させた。腫瘍体積（Ｖ）を、式Ｖ＝［（長さ×幅^２）］／２に従って計算した（幅は測定値の小さい方である）。Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＤＭＡｂ攻撃投与のために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ－γ（ＮＳＧ）マウスにＯＶＩＳＥ細胞（０．８×１０^６個）を攻撃投与した。１０日後、腫瘍が触知可能になった時点で、マウスにＤＢ７．２ ＤＭＡｂ（５０μｇ＋５０μｇ；ＨＣ＋ＬＣ）又はｐＶａｘ１（１００μｇ）を接種し、続いて、各マウスに１０×１０^６個のＰＢＭＣを腹腔内注射した。以後、同じ操作を行った。動物実験は、ウィスター研究所の動物実験委員会（the Institutional Animal Care and Use Committee at The Wistar Institute）によって承認された。

【0351】

統計解析
すべての統計解析は、Graph Pad Prismを使用して行った。ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なした。実験群の平均間の差は、３つ以上の定量的変数が測定された対応のない両側スチューデントｔ検定又は一元配置分散分析を使用して計算した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。各時点の腫瘍サイズの比較は、フィッシャーの最小有意差（ＬＳＤ）検定を用いる２元配置分散分析を使用して行った。次に、実験結果について説明する。

【0352】

Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂのインビトロ発現と特異性評価
ＮＫ細胞活性化戦略としてＳｉｇｌｅｃ－７阻害の可能性を評価するために、ヒトＳｉｇｌｅｃ－７に特異的なＭＡｂが最近生成され、その生物学的活性がインビトロで研究された。ここでは、強力なＳｉｇｌｅｃ－７結合剤のコドンとＲＮＡが最適化された抗体発現カセットを生成し、ヒトＩｇＧ１の発現に最適化されたＤＮＡベクターに組み立てた。これらのＨＣとＬＣの個々の組み合わせは、それぞれＤＢ７．１（ＤＢ－Ｓ７－１）、ＤＢ７．２（ＤＢ－Ｓ７－２）、及びＤＢ７．７（ＤＢ－Ｓ７－７）と指定される（図２１Ａ）。発現は、インビトロで合成ヒトＳｉｇｌｅｃ－７ ＤＮＡベクターでｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションして、ウェスタンブロット分析によって試験した。これらの試験では、トランスフェクションされたＥｘｐｉ２９３Ｆ上清中に発現した抗体の重鎖と軽鎖に対応するバンドが特定されたが、空のベクターをトランスフェクションした対照ウェルにはバンドがなかった（図２１Ｂ）。ＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７のインビトロ発現は、ＥＬＩＳＡ定量によってさらに確認された（図２１Ｃ）。ＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７ Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂは、組み換えヒトＳｉｇｌｅｃ－７に特異的かつ用量依存性に結合することがＥＬＩＳＡによって分析された（図２２Ａ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＳｉｇｌｅｃ－７発現のために安定に形質導入され、これらの細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ－Ｓｉｇｌｅｃ７細胞）はＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂによる結合の評価に使用された。図２２Ｂに示されるように、ＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７はＨＥＫ２９３Ｔ－Ｓｉｇｌｅｃ－７細胞への特異的結合を示した。最も強力な結合剤ＤＢ７．２は、複数のドナー（ｎ＝４）からのＰＢＭＣ中の結合についてさらに分析された（図２３）。ＤＢ７．２は主にヒトＮＫ細胞に結合したが（約９０％）、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の場合は低レベルの結合が観察された（図２２Ｃ及びＤ）。ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（ＴＨ１）、ＴＨ２、及びＴＨ１７細胞の自然対応物と考えられる自然リンパ球（ＩＬＣ）へのＤＢ７．２の結合（約９％）が観察された（Eberl et al., 2015, Science 348, aaa6566）。さらに、ＤＢ７．２は粘膜関連不変Ｔ（ＭＡＩＴ）細胞への２５％を超える結合率を示し、これは粘膜バリアにおける微生物感染に対する免疫防御に重要な役割を果たし、炎症やウイルス感染の生来のセンサーとして機能する（Parrot et al., 2020, Sci Immunol 5; Legoux et al., 2020, Immunity 53, 710-723）。Ｓｉｇｌｅｃ－７を発現するマイナーＴ細胞集団の追加の試験は、今後の研究にとって重要である。興味深いことに、ＤＢ７．２ ＭＡｂはＣＤ５６_ｄｉｍとＣＤ５６_{ｂｒｉｇｈｔ}の両方のＮＫ細胞サブセットを染色し、ヒトＮＫ集団の大部分に結合する能力があることを示唆している（図２２Ｅ）。ＤＢ７．２はまた、ウェスタンブロット（図２４Ａ）で並びに表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析でその結合を分析すると、ヒトＳｉｇｌｅｃ７タンパク質への強い結合も示した。ＤＢ７．２抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体は、抗Ｓｉｇｌｅｃ７の指定濃度の力価測定を使用して決定されたＫＤ値が４４ｐＭで、センサーグラム上の最大ポイントは組み換えヒトＳｉｇｌｅｃ７タンパク質の飽和を示す。高い親和性に加えて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法では、ＤＢ７．２（Ｋ_ｏｆｆ：１０_－Ｍ）の高い特異性も観察された（図２４Ｂ～Ｄ）。

【0353】

Ｓｉｇｌｅｃ７ ＭＡｂはインビトロで標的卵巣癌細胞の強力かつ特異的殺傷を誘発した
Ｓｉｇｌｅｃ７遺伝子最適化ＭＡｂが、ヒト癌細胞株に対してヒト末梢血ＮＫ細胞を活性化する能力を評価するために、ＨａＣａＴ（ヒトケラチン生成細胞）をＳｉｇｌｅｃ７陰性対照として使用して、多様なヒト卵巣癌細胞パネルを組み立てた（表１）（Bordoloi et al., 2022, JCI Insight 7）。重要なのは、ＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７が、ＨａＣａＴ細胞の殺傷を誘発しなかったことである（図２５Ａ及びＢ）。次に、ＭＡｂが明確なヒトＯＣ細胞（ＯＶＩＳＥ、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＣＡＲ３、ＣａＯＶ３、ＯＶＣＡＲ１０、及びＰＥＯ－４）の殺傷を誘発する能力を、ヒトＰＢＭＣ／ＮＫ細胞の存在下で、さまざまな疾患表現型及び変異（表１）を用いて調べた。３つのクローンすべてが４つのＯＣ標的すべての殺傷を誘発したが（図２５Ｃ～Ｇ）、クローンＤＢ７．２はこれらの測定法で最も高い効力を示した。ＤＢ７．２は、さらに２つのＯＣ株、ＣａＯＶ３（図２５Ｈ）とＯＶＣＡＲ３（図２５Ｉ）細胞に対して強化された殺傷誘発を示した。Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂ活性がＦｃ受容体結合に依存しないことを確認するために、（図２６Ａ）ＤＢ７．２の効力はＦｃ阻害の存在下で維持されることが分かった（図２６Ｂ及びＣ）。次に、抗体のＦｃ残基の修飾を行って、Ｆｃ関与と潜在的なオフ標的作用を排除した。Ｆｃドメインに複数の残基修飾（「ＴＭ」、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）を含むＤＢ７．２の変種を設計して、ＦｃＲと補体（Ｃ１ｑ）の結合を排除し（Oganesyan et al., 2008, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700-704; Parzych et al., 2022, Nat Commun 13, 5886）、これをＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄと命名した。ＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄの殺菌効力はＯＶＩＳＥ細胞で維持された（図２７Ａ）。２４時間後に、ヒトＰＢＭＣｓの存在下でＯＶＩＳＥ細胞にＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄを添加すると、標的細胞が強力に殺傷されたが、対照細胞（図２７Ｂ）標的に対しては効果がなかった。ＤＢ７．２とＤＢ７．２＿ＴＭ Ｍｏｄは、ＯＶＩＳＥ細胞でそれぞれ８２．６７ｎＭと１９２ｎＭという同等のＩＣ５０値を示した（図２７ＣとＤ）。まとめると、これらの試験は、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂの免疫殺傷の活性化に対する特異性とＯＣ細胞を標的とする能力を示している。

【0354】

xCELLigence測定法を使用すると、抗ＰＤ－１とＤＢ７．２ ＭＡｂの組み合わせはＯＣ殺傷の強化を証明する
ＯＣは、既存の免疫チェックポイント阻害療法に対する応答が中程度で、客観的奏効率（ＯＲＲ）が約８～９％の癌のサブセットの１つである。チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）を投与されているＯＣ患者は、持続的な応答がまれであると報告しており、これまでのところＯＣの管理に対してＦＤＡ承認のＣＰＩはない（Farkkila et al., 2020, Nat Commun 11, 2543）。しかし、免疫療法に対するＥＯＣ患者の応答を最適化するために組み合わせ方法が重要であることが判明する可能性があることを示す証拠がある。理論に拘束されるものではないが、Ｔ細胞活性化ＰＤ－１とＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂによるＮＫ細胞の活性化を組み合わせると、相乗的に腫瘍をより効率的に標的化できるという仮説を立てた。Ｔ細胞とＮＫ免疫経路関与についてＰＤ－１の同時標的化に関するこの仮説を検定するために、ＯＣ腫瘍を標的とするxCELLigence測定法で、ＤＢ７．２と抗ＰＤ１（ペンブロリズマブ）の抗体組み合わせを試験した。ＤＢ７．２は、ＢＲＣＡ２変異細胞とＰＡＲＰｉ耐性ＰＥＯ４細胞の両方に対して、ＥＣ５０が６８．８７ｎＭ（図２７Ｅ及びＧ）で殺傷をシミュレートする能力を示したが、抗ＰＤ１を標的とするＰＥＯ４細胞は、xCELLigenceベースのインビトロ殺傷測定法で１０倍低いＥＣ５０の６８０ｎＭ（図２７Ｆ及びＨ）を有した。抗ＰＤ－１とＤＢ７．２の組み合わせは、ヒトＰＢＭＣの存在下でＰＥＯ４細胞殺傷のさらなる強化を示した（図２７Ｉ）。これらのデータは、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂと抗ＰＤ１の組み合わせ（ＮＫ及びＴ細胞ＣＰＩ）が抗腫瘍免疫を強化することを示す。

【0355】

Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂのインビボ発現は、卵巣癌攻撃投与モデルで腫瘍の進行を低下させる
次に、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂクローンのインビボ発現を、ＤＮＡ送達インビボアプローチを用いて調べた。そのために、マウスにＭＡｂのＤＮＡ発現カセット（Patel et al., 2018, Cell Rep 25, 1982-1993 e1984）を、各抗Ｓｉｇｌｅｃ－７クローン（ＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７）について２プラスミドシステムで５０μｇ＋５０μｇ（ＨＣ＋ＬＣ）の用量で空ベクター対照（ｐＶａｘ１）とともに注入して、インビボでのｍＡｂの生物学的抗体産生を可能にした。注射は、既に記載されているように（Parzych et al., 2022, Nat Commun 13, 5886; Patel et al., 2018, Cell Rep 25, 1982-1993 e1984）、０日目にマウスの前脛骨筋に実施した（図２８Ａ）。ＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７ Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂを注射したマウスの血清中にヒトＩｇＧの存在が観察されたが、対照動物又は事前採血したマウスの血清では発現は検出されなかった。インビボで生成された抗体の特異性を確認するために、ＤＢ７．１、ＤＢ７．２、及びＤＢ７．７のいずれかを接種したマウスから得た１４日目の血清と、空のベクターを投与した対照動物の血清を使用して、ヒトＮＫ細胞を染色した。３つの群すべての１４日目の血清はヒトＮＫ細胞を陽性染色したが、ｐＶａｘ１又は無関係な抗体対照の場合には染色は観察されなかった（図２８Ｂ）。動物におけるＳｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂ送達の潜在的な抗腫瘍効力を調べるために、ＮＳＧ－Ｋ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ－γ－ＭＨＣＩ／ＩＩダブルノックアウト変異体）マウス腫瘍攻撃投与モデルを使用し、ＯＶＩＳＥヒト卵巣癌細胞（０．８×１０^６個の細胞／マウス）を注入して、腫瘍の増殖を前向き試験で追跡した。腫瘍の平均サイズが５０ｍｍ^３を超えたとき、記載されているように（Parzych et al., 2022, Nat Commun 13, 5886; Patel et al., 2018, Cell Rep 25, 1982-1993 e1984）、マウス１匹あたり１，０００万個のヒトＰＢＭＣとともに、５０μｇ＋５０μｇ（ＨＣ＋ＬＣ）のＤＢ７．２又はｐＶａｘ１ベクター対照が筋肉内に投与された（図２８Ｃ）。ＤＢ７．２ Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂを投与されているマウスは、ベクター対照と比較して、腫瘍負荷の大幅な減少／腫瘍増殖の遅延を示した（図２８Ｄ、図２９）。特に、Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂは、腫瘍担持マウスの平均生存率を大幅に向上させた（図２８Ｅ）。これらのデータは、ヒト卵巣癌の直接治療のためのＳｉｇｌｅｃ－７抗体の可能性を示す最初のインビボデータを提供している。

【0356】

ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＤＮＡでコードされた二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャーの生成と発現
ＮＫエンゲージャーは、腫瘍細胞を標的とする上で重要な新たな関心点である（Gleason et al., et al., 2014, Blood 123, 3016-3026; Ibarlucea-Benitez et al., 2021, Proc Natl Acad Sci U S A 118; Demaria et al., 2021, Eur J Immunol 51, 1934-1942）。上記のように、ＯＣに対するＮＫ活性を強化する抗Ｓｉｇｌｅｃ－７ ＭＡｂの効力に基づいて、この標的の可能性は新しい標的化ＮＫＣＥアプローチであると考えられた。理論に拘束されるものではないが、このアプローチはＮＫ細胞の特異的標的化を可能にするだけでなく、負のＴＭＥシグナルの受信を阻止し、新しいＮＫＣＥをもたらすという仮説を立てた。従って、ＮＫ細胞特異的Ｓｉｇｌｅｃ－７の関与を使用して腫瘍の標的化を強化するために、ＮＫＣＥを、最近報告されたように（Bordoloi et al., 2022, JCI Insight 7）ＯＣ抗原ＦＳＨＲに結合するように構成された、抗Ｓｉｇｌｅｃ－７ＦＶに連結された２つの連結抗体結合断片（ｓｃＦＶ）の形式で構築された。
ＧＳ（グリシン－セリン）柔軟性リンカー（Perales-Puchalt et al., 2019, JCI Insight 4; Pratik et al., 2022, Molecular therapy Oncolytics）を取り込んでいる抗ＦＳＨＲのｓｃＦＶ（クローンＤ２ＡＰ１１）（Bordoloi et al., 2022, JCI Insight 7）（図３０Ａ）とともに、ＤＢ７．２抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体のｓｃＦＶをコードするＮＫＣＥ融合配列が設計された。インビトロ分析は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションを介するように、ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥが効率的に発現されたことを示し、予想された約５５ＫＤａ分子の生成が観察された（図３０Ｂ）。このＮＫＣＥは、それぞれＳｉｇｌｅｃ－７又はＦＳＨＲ過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ（図３０Ｃ）細胞又はＫ５６２（図３０Ｄ）細胞でフロー染色することにより、両方の細胞標的に結合する。ヒトＳｉｇｌｅｃ－７への結合を視覚化するために、２９３Ｔ－Ｓｉｇｌｅｃ－７固定細胞の高分解能共焦点イメージングを実施した。細胞は、ＤＡＰＩ（核）、ＧＦＰ（Ｓｉｇｌｅｃ－７）、及びテキサスレッド（ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１）で標識された。ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥは、ヒトＳｉｇｌｅｃ－７を発現するＧＦＰ＋細胞への明確な表面結合を示したが、二次抗体対照では結合は示されなかった（図３０Ｅ）。

【0357】

ＦＳＨＲを標的とする新しいＮＫ細胞エンゲージャーは、複数の卵巣腫瘍株で強力な殺傷作用を誘発し、インビボで腫瘍負荷を減少させる
次に、xCelligenceＲＴＣＡ測定フォーマットを使用して、インビトロの腫瘍殺傷の誘発について、ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）を評価した。エフェクター細胞は、ＰＢＭＣとＮＫ細胞を直接試験することを含む。ＮＫＣＥを、標的ＯＣ細胞のプレーティングの翌日に添加した。対照として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Urbanska et al., 2015, Cancer Immunol Res 3, 1130-1137）、ＡＧＳヒト胃癌細胞、ＧＭ０５３８９ヒト線維芽細胞、及びＷＭ３７４３ヒト黒色腫細胞を含む、４つのＦＳＨＲ陰性細胞株を試験した。無関係な癌細胞を含むこれらのＦＳＨＲ陰性細胞（図３０Ｆ～Ｋ）に対して、オフ標的殺傷は観察されなかった。図３０Ｇ及びＪに示されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＡＧＳ細胞は、ヒトＰＭＢＣ存在下のＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥによる３日間の処理を通して、健全かつ接着性のままであった。対照的に、複数のＦＳＨＲ発現卵巣腫瘍株ＯＶＩＳＥ、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ、ＣａＯＶ３、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ－ＦＳＨＲ、及びＰＥＯ－４（図３１Ａ～Ｇ）は、ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥ存在下でヒトＰＢＭＣによって効率的に殺傷された。追加の特異性対照として、精製されたヒトＮＫ細胞をエフェクター細胞として直接使用した。ヒトＮＫ細胞と共インキュベートされたＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥも、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を効果的に殺傷した（図３２Ａ）。この二重特異性エンゲージングアプローチの特異性は、ＦＳＨＲ陰性ＡＧＳ細胞で確認された。ここで、抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体はＡＧＳ細胞を殺傷したが（図３２Ｂ）、ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥはそうではなかった（図３０Ｉ）。さらなる特異性対照として、ＦＳＨＲを標的としないＮＫＣＥ（ＩＬ１３Ｒα２－ＮＫＣＥ）が開発され、これは、ＯＶＣＡＲ３を過剰発現するＦＳＨＲ又はＯＶＩＳＥ細胞に対して毒性をもたらさないことが観察された（図３２Ｃ及びＤ）。ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥは、ＯＶＩＳＥ－ＦＳＨＲ（３人の異なるヒトドナーからのＰＢＭＣｓを使用した別々の実験）とＯＶＣＡＲ３細胞の両方で濃度依存的な細胞溶解を誘発し、ＥＣ５０値がそれぞれ１４２．８７ｐＭと２３６．６ｐＭを示し、このエンゲージャーツールが新しいＮＫＣＥとして病原性細胞を標的化する顕著な効力を裏付けている（図３１Ｈ及びＩ、図３３及び図３４）。ＯＣ－ＮＫＣＥのサイトカイン／細胞毒性分子分泌プロフィールを調べた。ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞とヒトＰＢＭＣ及びＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥの共培養（図３５Ａ）では、特異的免疫活性化の一環として可溶性Ｆａｓ（ｓＦａｓ）及びグランザイムＡの産生が強化され、抗体なし対照又は空ベクター対照群と比較してＩＬ－１０レベルの低下が観察され（図３５Ｂ）、よりエフェクターベースの活性化を裏付けている。ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥのインビボ抗腫瘍作用を直接評価するために、ＮＳＧＫマウスにＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を攻撃投与した。ＮＳＧ－Ｋマウスに３００万個のＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を投与し、腫瘍移植の７日後に、これらを核酸でコードされたＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１（１００μｇ）又は空ベクターｐＶａｘ１（１００μｇ）を使用して、２週間空けて２回、インビボ発現のために処理した。７日目には、これらに１，０００万個のヒトＰＢＭＣも接種し、腫瘍の体積を定期的に測定した（図３５Ｃ）。ＮＫＣＥによる治療により、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ腫瘍担持マウスの腫瘍負荷が顕著に減少したが、対照処理群ではそのような影響は見られなかった（図３５Ｄ）。さらに、ＤＢ７．２×Ｄ２ＡＰ１１ ＮＫＣＥ治療により生存率が向上し（図３５Ｅ）、このアプローチのさらなる試験がサポートしていた。

【0358】

実施例４：Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体クローンの配列（ＣＤＲ配列には下線が引かれている）

【0359】

ＤＢ－Ｓ７－１重鎖
配列番号４

【化1】

【0360】

ＤＢ－Ｓ７－１重鎖
配列番号８

【化2】

【0361】

ＤＢ－Ｓ７－１軽鎖
配列番号１２

【化3】

【0362】

ＤＢ－Ｓ７－１軽鎖
配列番号１６

【化4】

【0363】

ＤＢ－Ｓ７－２重鎖
配列番号２０

【化5】

【0364】

ＤＢ－Ｓ７－２重鎖
配列番号２４

【化6】

【0365】

ＤＢ－Ｓ７－２軽鎖
配列番号２８

【化7】

【0366】

ＤＢ－Ｓ７－２軽鎖
配列番号３２

【化8】

【0367】

ＤＢ－Ｓ７－３重鎖
配列番号３６

【化9】

【0368】

ＤＢ－Ｓ７－３重鎖
配列番号４０

【化10】

【0369】

ＤＢ－Ｓ７－３軽鎖
配列番号４４

【化11】

【0370】

ＤＢ－Ｓ７－３軽鎖
配列番号４８

【化12】

【0371】

ＤＢ－Ｓ７－６重鎖
配列番号５２

【化13】

【0372】

ＤＢ－Ｓ７－６重鎖
配列番号５６

【化14】

【0373】

ＤＢ－Ｓ７－６軽鎖
配列番号６０

【化15】

【0374】

ＤＢ－Ｓ７－６軽鎖
配列番号６４

【化16】

【0375】

ＤＢ－Ｓ７－７重鎖
配列番号６８

【化17】

【0376】

ＤＢ－Ｓ７－７重鎖
配列番号７２

【化18】

【0377】

ＤＢ－Ｓ７－７軽鎖
配列番号７６

【化19】

【0378】

ＤＢ－Ｓ７－７軽鎖
配列番号８０

【化20】

【0379】

ＤＢ－Ｓ７－８重鎖
配列番号８４

【化21】

【0380】

ＤＢ－Ｓ７－８重鎖
配列番号８８

【化22】

【0381】

ＤＢ－Ｓ７－８軽鎖
配列番号９２

【化23】

【0382】

ＤＢ－Ｓ７－８軽鎖
配列番号９６

【化24】

【表2】

【0383】

ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ（ヌクレオチド配列）
配列番号９７

【化25】

【0384】

ＤＤＡＰ－ＮＫＣＥ（タンパク質配列）
配列番号９８

【化26】

【0385】

ＩＬ１３Ｒａ２－Ｓｉｇｌｅｃ７ＮＫ細胞エンゲージャー（核酸配列）（ｈｉｓタグなし）
配列番号９９

【化27】

【0386】

ＩＬ１３Ｒａ２－Ｓｉｇｌｅｃ７ＮＫ細胞エンゲージャー（タンパク質配列）（Ｈｉｓタグなし）
配列番号１００

【化28】

【0387】

ＩＬ１３Ｒａ２－Ｓｉｇｌｅｃ７ＮＫ細胞エンゲージャー（核酸配列）（Ｈｉｓタグ）
配列番号１０１

【化29】

【0388】

ＩＬ１３Ｒａ２－Ｓｉｇｌｅｃ７ＮＫ細胞エンゲージャー（タンパク質配列）（Ｈｉｓタグ）
配列番号１０２

【化30】

【0389】

本明細書で引用した各特許、特許出願、及び刊行物の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は特定の実施態様を参照して開示されているが、本発明の他の実施態様及び変形が、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の請求項は、そのような実施態様及び同等の変形をすべて含むものと解釈されるものとする。

【図1A-1E】

【図1F-1I】

【図2A-2D】

【図2E-2F】

【図2G-2I】

【図3A-3C】

【図3D-3E】

【図3F-3G】

【図3H-3I】

【図4A-4B】

【図4C-4D】

【図4E-4F】

【図4G-4H】

【図4I-4J】

【図4K-4L】

【図5A-5C】

【図5D-5F】

【図5G-5J】

【図6A-6B】

【図6C】

【図6D-6E】

【図6F-6G】

【図7A-7B】

【図7C-7D】

【図7E-7F】

【図7G-7H】

【図8A-8D】

【図8E-8G】

【図8H-8I】

【図8J】

【図9A-9D】

【図10A-10B】

【図10C】

【図11A-11C】

【図12】

【図13A-13D】

【図14】

【図15】

【図16A-16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A-21C】

【図22A-22E】

【図23】

【図24A-24D】

【図25A-25I】

【図26A-26C】

【図27A-27I】

【図28A-28E】

【図29A-29B】

【図30A-30K】

【図31A-30I】

【図32A-32D】

【図33A-33C】

【図34】

【図35A-35E】

【配列表】

2025511152000001.xml

【国際調査報告】