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▶ ツインピッグ バイオラブ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-04-16
(54)【発明の名称】ＩＴＧＢ２媒介薬物伝達システム
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20250408BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250408BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250408BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20250408BHJP
A61K 31/537 20060101ALI20250408BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20250408BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20250408BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20250408BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20250408BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20250408BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20250408BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20250408BHJP
C07K 14/52 20060101ALN20250408BHJP
C07K 14/575 20060101ALN20250408BHJP
C12N 7/00 20060101ALN20250408BHJP
C07K 16/46 20060101ALN20250408BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
A61K45/00
A61P35/00
A61K47/54
A61K31/537
A61K38/07
A61K38/10
G01N33/53 D
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C07K16/28 ZNA
C12N15/115 Z
C07K14/52
C07K14/575
C12N7/00
C07K16/46
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024559502
(86)(22)【出願日】2023-04-06
(85)【翻訳文提出日】2024-12-09
(86)【国際出願番号】 KR2023004678
(87)【国際公開番号】W WO2023195805
(87)【国際公開日】2023-10-12
(31)【優先権主張番号】10-2022-0043200
(32)【優先日】2022-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0043573
(32)【優先日】2022-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522189872
【氏名又は名称】ツインピッグ バイオラブ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｔｗｉｎｐｉｇ Ｂｉｏｌａｂ，Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】べ，ヒョンス
(72)【発明者】
【氏名】ハン，イク－ファン
(72)【発明者】
【氏名】カン，ムンキュ
(72)【発明者】
【氏名】リ，ヒキョン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ジョンユン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，イルソプ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ジュウォン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ホンソ
(72)【発明者】
【氏名】シン，ジン ソン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B065
4C076
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045CB01
2G045DA36
2G045FB03
4B065AA95X
4B065BD25
4B065BD35
4B065BD39
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA17
4C084BA10
4C084BA16
4C084BA18
4C084BA23
4C084DA32
4C084DC50
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB22
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086ZB26
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA54
4H045BA71
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
(57)【要約】
本発明は、Ｍ２腫瘍関連マクロファージのＩＴＧＢ２に特異的に結合する薬物伝達システムに関するものであって、本発明のＩＴＧＢ２（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ２）に特異的に結合するＩＴＧＢ２結合部分を含む薬物伝達システムは、Ｍ２腫瘍関連マクロファージにのみ選択的に（または特異的に）作用することによって、薬物副作用は、軽減され、薬物の薬効は増大させることができる効果を有するため、細胞死誘導剤、抗癌剤、造影剤などの薬物送達システムとして有用に用いられることができる。
【選択図】図１７
【選択図】図１７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＴＧＢ２結合部分；およびこれと結合された薬物を含む、薬物伝達システム。
【請求項2】
ＩＴＧＢ２結合部分は、ＩＴＧＢ２と特異的に結合する小分子、ウィルス、抗体、抗体断片、アプタマー、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、リガンド、サイトカインの一部領域であるペプチドまたはリガンドの一部領域のペプチドである、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項3】
ＩＴＧＢ２結合部分は、ＣＤ１８が拡張された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に特異的に結合する、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項4】
ＩＴＧＢ２は、配列番号７または８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項5】
ＩＴＧＢ２結合部分は、ＩＴＧＢ２の４４９～６１７のアミノ酸に結合する、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項6】
ＩＴＧＢ２結合部分は、配列番号１または２のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の薬物伝達システム。
【請求項7】
配列番号５または６のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項５に記載の薬物伝達システム。
【請求項8】
ＩＴＧＢ２結合部分は、ＩＴＧＢ２の４４９～６１７のアミノ酸に結合する、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項9】
ＩＴＧＢ２結合部分は、ＩＴＧＢ２の７３２～７４８のアミノ酸、５０４～５０８のアミノ酸、５３４～５４６のアミノ酸、４４９～６１７のアミノ酸、または２３～７００のアミノ酸に結合する、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項10】
ＩＴＧＢ２結合部分は、抗－ＣＤ１８抗体またはその免疫学的活性を有する断片を含む、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項11】
免疫学的活性を有する断片は、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）、Ｆｖ、単鎖抗体、Ｆｖ二量体、相補性決定領域断片、ヒト化抗体、キメラ抗体およびジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１０に記載の薬物伝達システム。
【請求項12】
薬物は、化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体、エフェクター、プロドラッグ、毒素、ペプチドまたは放射性核種である、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項13】
薬物は、免疫原性細胞死誘導剤、プロアポトシース（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）ペプチド、マイクロチューブリン（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎ）構造形成抑制剤、有糸分裂（ｍｅｉｏｓｉｓ）抑制剤、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）抑制剤、ＤＮＡインターカレーター（ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）、毒素（ｔｏｘｉｎ）または抗癌剤である、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項14】
プロアポトシースペプチドは、ＫＬＡ、アルファ－ディフェンシン－１（ａｌｐｈａ－ｄｅｆｅｎｓｉｎ－１）、ＢＭＡＰ－２８、Ｂｒｅｖｅｎｉｎ－２Ｒ、ブフォリンＩＩｂ（Ｂｕｆｏｒｉｎ ＩＩｂ）、セクロピンＡ－マガイニン２（ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ－Ｍａｇａｉｎｉｎ ２、ＣＡ－ＭＡ－２）、セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）、セクロピンＢ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ）、クリソフィシン－１（ｃｈｒｙｓｏｐｈｓｉｎ－１）、Ｄ－Ｋ６Ｌ９、ゴメシン（Ｇｏｍｅｓｉｎ）、ラクトフェリシンＢ（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ Ｂ）、ＬＬＬ２７、ＬＴＸ－３１５、マガイニン２（Ｍａｇａｉｎｉｎ ２）、マガイニンＩＩ－ボンベシン結合体（Ｍａｇａｉｎｉｎ ＩＩ－ｂｏｍｂｅｓｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＭＧ２Ｂ）、パルダキシン（Ｐａｒｄａｘｉｎ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の薬物伝達システム。
【請求項15】
免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、抗－ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャンネルアゴニスト、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、強心配糖体（ｃａｒｄｉａｃ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ＬＶ－ｔＳＭＡＣ、Ｍｅａｓｌｅｓウィルス、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の薬物伝達システム。
【請求項16】
抗癌剤は、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン、７－Ｅｔｈｙｌ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、マスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ：ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ：ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ：ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｄｏｔｅｃａｎ）、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、トリプラチンテトラナイトレート（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、イキサベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、メルタンシン）、ＤＭ４、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１３に記載の薬物伝達システム。
【請求項17】
薬物をＭ２腫瘍関連マクロファージに特異的に伝達する、請求項１に記載の薬物伝達システム。
【請求項18】
メリチン、その変異体またはこれらの類似体を含むＩＴＧＢ２結合部分；およびこれと結合された薬物を含むペプチド－薬物複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＰＤＣ）。
【請求項19】
ＩＴＧＢ２の４６６～５６５のアミノ酸と結合する、請求項１８に記載のペプチド－薬物複合体。
【請求項20】
ＩＴＧＢ２のＬＥＵ（５２８）、ＴＨＲ（５３８）、ＬＥＵ（５５６）、ＣＹＳ（５５７）、ＰＨＥ（５５８）、ＧＬＵ（４６６）、ＩＬＥ（４６９）、ＣＹＳ（４７０）またはＡＲＧ（４７１）と結合する、請求項１８に記載のペプチド－薬物複合体。
【請求項21】
ＩＴＧＢ２に結合する抗体またはその免疫学的活性を有する断片；およびこれと結合された薬物を含む抗体－薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）。
【請求項22】
ＩＴＧＢ２の７３２～７４８のアミノ酸を含むエピトープ、５０４～５０８のアミノ酸を含むエピトープ、５３４～５４６のアミノ酸を含むエピトープ、４４９～６１７のアミノ酸を含むエピトープ、または２３～７００のアミノ酸を含むエピトープに結合する、請求項２１に記載の抗体－薬物複合体。
【請求項23】
抗体－薬物複合体リンカーをさらに含む、請求項２１に記載の抗体－薬物複合体。
【請求項24】
ＡＤＣリンカーは、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ）またはＮ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）である、請求項２３に記載の抗体－薬物複合体。
【請求項25】
請求項１に記載の薬物伝達システム、請求項１８に記載のペプチド－薬物複合体または請求項２１に記載の抗体－薬物複合体を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項26】
Ｍ０マクロファージおよびＭ１マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２の発現が上方制御された患者を対象に投与するものである、請求項２５に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項27】
ＩＴＧＢ２（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ２）に候補物質を処理する段階；およびＩＴＧＢ２と結合する候補物質を選別する段階を含む、薬物をＭ２腫瘍関連マクロファージに特異的に伝達する物質をスクリーニングする方法。
【請求項28】
拡張された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＣＤ１８に特異的に結合する候補物質を選別する、請求項２７に記載の薬物をＭ２腫瘍関連マクロファージに特異的に伝達する物質をスクリーニングする方法。
【請求項29】
分離された試料においてＩＴＧＢ２の発現量を確認する段階を含むＭ２マクロファージを標的化する抗癌剤に対する反応性を有する患者を選別する方法。
【請求項30】
Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２の発現量がＭ０マクロファージおよびＭ１マクロファージに比べて高い場合、Ｍ２マクロファージを標的化する抗癌剤に対する反応性を有する患者として判別する段階をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
請求項１に記載の薬物伝達システム、請求項１８に記載のペプチド－薬物複合体または請求項２１に記載の抗体－薬物複合体を薬学的に有効な量で癌に罹患したオブジェクトに投与する段階を含む、癌の治療方法。
【請求項32】
癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に用いるための、薬物伝達システムの用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＩＴＧＢ２に特異的に結合する薬物伝達システムに関するものである。
【背景技術】
【0002】
既存の抗癌治療は、癌細胞を直接攻撃したり、癌細胞を攻撃する体内の免疫細胞の活性を強化させる方向で研究されてきた。しかし、このような抗癌剤は、癌細胞以外の他の正常な細胞もまた攻撃し、脱毛、吐き気、嘔吐などの多くの副作用をもたらし、免疫細胞の過度な増加による付加的な反応をもたらす。既存の化学的療法や放射線療法に比べて副作用を最小化することができる抗癌免疫療法は、体内の免疫システムを用いて癌を治療する方法であり、このような抗癌免疫療法の中には、治療用免疫細胞であるＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ含む）、樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ）、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ）などを体外で活性化させた後に体内に直接注入する細胞療法と癌抗原と免疫活性化物質を体内に注入することによって、体内に存在する免疫細胞を直接活性化することによって抗癌効能を高める抗癌ワクチンに対する方法などが活発に進められている。しかし、このような細胞治療剤や癌ワクチンは、主に血液癌関連の疾患に主に用いられており、固形癌ではほとんどがその治療効能が極めて低いという短所を有している。このような理由のうちの一つは、固形癌の周囲で免疫機能を抑制する微小環境要因に起因する。実際、腫瘍微小環境において、免疫細胞の機能を低下させる細胞（ＭＤＳＣ：ｍｙｅｏｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ、Ｔｒｅｇ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、ＴＡＭ：ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃａｉｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）や免疫抑制誘発サイトカイン、代謝物などが活発に作用することによって、免疫活性化物質と治療用免疫細胞の活性を急激に低下させるものである。したがって、腫瘍細胞および免疫細胞に直接的な影響なしに腫瘍細胞の周囲の微小環境のみを調節して腫瘍細胞への影響分を供給し、腫瘍細胞周囲の血管新生などを遮断し、抗癌効果を有する治療剤の開発が重要となっている。腫瘍微小環境は、悪性細胞の増殖および生存、血管新生、転移、異常な適応免疫、ホルモン、および化学療法剤に対する反応減少に寄与し、治療目標として大いに考慮されている。
【0003】
腫瘍周囲の微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）は、内皮細胞、炎症性細胞および線維芽細胞から構成されており、１９７０年代に腫瘍関連マクロファージ（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＴＡＭ）が腫瘍の成長において重要な役割を果たすことが明らかになった。腫瘍関連マクロファージは、癌の成長、転移などの全般的な腫瘍微小環境と関連し、重要な役割を担っており、腫瘍抑制Ｍ１型マクロファージまたは腫瘍支持Ｍ２型マクロファージの二つの表現型に分類される。Ｍ１型マクロファージは、抗原を提示する強力な能力を有し、一般にインターフェロン－γ、リポ多糖（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αによって活性化され、炎症誘発性作用および殺菌作用をする。Ｍ２型マクロファージは、多様な細胞外マトリックス成分、血管新生および走化性因子を放出することによって、免疫抑制、腫瘍形成および血管形成を促進するものとして知られている。一般に、ＩＬ－４とＩＬ－１３によって誘導され、アルギナーゼ－１、ｍａｎｎｏｓｅ（ＭＭＲ、ＣＤ２０６）、スカベンジャー受容体（ＳＲ－Ａ、ＣＤ２０４）、ＣＤ１６３、ＩＬ－１０などのようなマーカーを発現することにより、Ｍ１型腫瘍関連マクロファージと区別される。腫瘍周囲に存在する腫瘍関連マクロファージは、腫瘍細胞の成長、転移と密接に関連しており、癌患者において、多数のＭ２型腫瘍関連マクロファージが腫瘍周囲に存在すると、患者の予後および生存率が良くないことが報告されている。Ｍ２型マクロファージは、癌の成長を促進するＩＬ－１０、ＴＧＦβおよびＣＣＬ１８のようなサイトカインを生成し、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージの表面に存在するＰＤＬ１およびＢ７－１／２のような受容体は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を抑制することが報告されている。Ｍ２型腫瘍関連マクロファージが多量に存在する微小環境では、腫瘍の成長、分化および転移が活発になされるので、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージを標的とする標的治療剤の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、Ｍ２マクロファージを標的化する薬物伝達システムを提供することである。
【0005】
また、本発明の目的は、癌の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【0006】
また、本発明の目的は、薬物をＭ２腫瘍関連マクロファージに特異的に伝達する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【0007】
また、本発明の目的は、Ｍ２マクロファージを標的化する抗癌剤に対する反応性を有する患者を選別する方法を提供することである。
【0008】
また、本発明の目的は、癌の治療方法を提供することである。
【0009】
併せて、本発明の目的は、薬物伝達システムを癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に用いるための用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達成するために、本発明は、ＩＴＧＢ２結合部分；およびこれと結合された薬物を含む薬物伝達システムを提供する。
【0011】
また、本発明は、癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0012】
また、本発明は、薬物をＭ２腫瘍関連マクロファージに特異的に伝達する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【0013】
また、本発明は、Ｍ２マクロファージを標的化する抗癌剤に対する反応性を有する患者を選別する方法を提供する。
【0014】
また、本発明は、本発明の薬物伝達システムを薬学的に有効な量で癌に罹患したオブジェクトに投与する段階を含む癌の治療方法を提供する。
【0015】
併せて、本発明は、本発明の薬物伝達システムを癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に用いるための用途を提供する。
【発明の効果】
【0016】
本発明では、ＩＴＧＢ２がＭ２マクロファージ媒介癌に特異的なマーカーであることを確認し、本発明のＩＴＧＢ２（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ２）に特異的に結合するＩＴＧＢ２結合部分を含む薬物伝達システムは、Ｍ２腫瘍関連マクロファージにのみ選択的に（または特異的に）作用することによって、薬物副作用は軽減され、薬物の薬効は増大され得る効果を有するので、細胞死誘導剤、抗癌剤、造影剤などの薬物送達システムとして有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1a】ＴＡＭｐｅｐのＭ２マクロファージに対する親和度をフローサイトメトリーにより確認した図である。
【図1b】ＴＡＭｐｅｐのＭ２マクロファージに対する親和度を定量化したグラフである（＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ｔｈｅ Ｍ０．）。
【図2a】Ｍ２／Ｍ０およびＭ１／Ｍ０の比率のベンダイアグラム解析によりＭ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐと結合するタンパク質を識別した図である。
【図2b】Ｍ２／Ｍ０の比率のスキャッタープロット（ｓｃａｔｔｅｒ ｐｌｏｔｓ）分析によりＭ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐと結合するタンパク質を識別した図である。
【図2c】Ｍ１／Ｍ０の比率のスキャッタープロット分析によりＭ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐと結合するタンパク質を識別した図である。
【図2d】Ｍ２／Ｍ１の比率のスキャッタープロット分析によりＭ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐと結合するタンパク質を識別した図である。
【図3】Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージにおいて、それぞれ抽出した細胞膜タンパク質とＴＡＭｐｅｐ８２６－ビオチンを反応させて得たＬＣ－ＭＳクロマトグラムデータを示す図である。
【図4】ＬＣ－ＭＳ／ＭＳプロテオミックスを用いてＴＡＭｐｅｐ８２６のターゲットタンパク質を同定した図である。
【図5】Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ条件を示す図である。
【図6】Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２ｍＲＮＡ発現を確認した図である。
【図7】Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２タンパク質発現を確認した図である。
【図8】免疫蛍光分析によりＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２タンパク質の発現を確認した図である。
【図9】Ｍ２マクロファージの細胞膜において、ＩＴＧＢ２の発現を確認した図である。
【図10】Ｍ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐ８２６およびＩＴＧＢ２の相互作用をプルダウンアッセイ（Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）で確認した図である。
【図11】免疫蛍光分析によりＭ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐ８２６およびＩＴＧＢ２の相互作用を確認した図である。
【図12】ＴＢ５１１とＩＴＧＢ２の結合部位をドッキングシミュレーションで確認した図である。
【図13】ＴＢ５１１とＩＴＧＢ２の結合部位をドッキングシミュレーションで確認した図である。
【図14】本発明のＩＴＧＢ２結合ＡＤＣ作製に用いられた抗－ＣＤ１８抗体がＣＤ１８のＭ２ＴＡＭにおける活性型構造（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｏｐｅｎ ｆｏｒｍ）に特異的に結合することを示す模式図である。
【図15】センサーチップ表面にＩＴＧＢ２を固定化して確認した図である。
【図16】抗－ＩＴＧＢ２抗体とＩＴＧＢ２タンパク質の結合力をＳＰＲで確認した図である。
【図17】Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡとＩＴＧＢ２タンパク質の結合力をＳＰＲで確認した図である。
【図18】Ｍ２マクロファージにおいて、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９により確立したＩＴＧＢ２発現抑制細胞モデルにおけるＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現を確認した図である。
【図19】Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２発現抑制によるＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡの細胞死滅の減少効果を確認した図である。
【図20】Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２発現抑制によるＴＢ５１１（ＴＡＭｐｅｐ８２６－ｄＫＬＡ）の細胞死滅誘導減少効果を確認した図である。
【図21】Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２抗体によるＴＢ５１１の細胞死滅誘導減少効果を確認した図である。
【図22】乳癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。
【図23】乳癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。
【図24】肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。
【図25】肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。
【図26】肺癌３ＤオルガノイドにおけるＭ－ＤＭ１の効果を確認した図である。
【図27】抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。
【図28】抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。
【図29】抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。
【図30】抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。
【図31】乳癌３ＤオルガノイドにおけるＣＤ１８－ＤＭ１の効果を確認した図である。
【図32】乳癌３ＤオルガノイドにおけるＣＤ１８－ＭＭＡＥの効果を確認した図である。
【図33】肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。
【図34】肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。
【図35】抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。
【図36】抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。
【図37】抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。
【図38】抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、添付された図面を参照して本発明の具現例でもって本発明を詳細に説明する。但し、下記の具現例は、本発明に対する例示として提示されるものであり、当業者に周知著名な技術または構成に対する具体的な説明が本発明の要旨を不要に曖昧にするおそれがあると判断された場合には、その詳細な説明を省略することができ、これによって本発明が制限されるものではない。本発明は後述する特許請求の範囲の記載およびそれより解釈される均等範疇内で多様な変形及び応用が可能である。
【0019】
また、本明細書にて使用される用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、本発明の好ましい実施例を適切に表現するために使用された用語であって、これは使用者、運用者の意図または本発明が属する分野の慣例などによって異なり得る。したがって、本用語に対する定義は、本明細書の全般にわたった内容に基づいて下されるべきである。明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とした時、これは特に相反する記載がない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
【0020】
本発明にて使用される全ての技術用語は、特に断りがない限り、本発明の関連分野における通常の当業者が一般に理解されることと同様の意味で使用される。また、本明細書には好適な方法または試料が記載されるが、これと類似または同等のものも本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、本発明に組み込まれる。
【0021】
本明細書の全般を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字および３文字のコードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（α－アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）などのような他のアミノ酸に対して一般的に許容される３文字のコードが使用される。また、本発明において、略語として言及されたアミノ酸は、次のようにＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に基づいて記載された：
アラニン：Ａ、アルギニン：Ｒ、アスパラギン：Ｎ、アスパラギン酸：Ｄ、システイン：Ｃ、グルタミン酸：Ｅ、グルタミン：Ｑ、グリシン：Ｇ、ヒスチジン：Ｈ、イソロイシン：Ｉ、ロイシン：Ｌ、リジン：Ｋ、メチオニン：Ｍ、フェニルアラニン：Ｆ、プロリン：Ｐ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、トリプトファン：Ｗ、チロシン：Ｙおよびバリン：Ｖ。
アラニン：Ａ、アルギニン：Ｒ、アスパラギン：Ｎ、アスパラギン酸：Ｄ、システイン：Ｃ、グルタミン酸：Ｅ、グルタミン：Ｑ、グリシン：Ｇ、ヒスチジン：Ｈ、イソロイシン：Ｉ、ロイシン：Ｌ、リジン：Ｋ、メチオニン：Ｍ、フェニルアラニン：Ｆ、プロリン：Ｐ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、トリプトファン：Ｗ、チロシン：Ｙおよびバリン：Ｖ。
【0022】
一側面において、本発明は、ＩＴＧＢ２（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ２）結合部分；およびこれと結合された薬物を含む薬物伝達システムに関するものである。
【0023】
一具現例において、ＩＴＧＢ２は、配列番号７または８のアミノ酸配列を含むことができる。
【0024】
一具現例において、ＩＴＧＢ２結合部分は、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの細胞膜に存在するＩＴＧＢ２タンパク質に特異的に結合することができ、ＩＴＧＢ２と特異的に結合する小分子、ウィルス、抗体、抗体断片、アプタマー、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、リガンド、サイトカインの一部領域であるペプチドまたはリガンドの一部領域であるペプチドを含むことができる。
【0025】
一具現例において、前記結合部分に半減期または安定性を増加させるための 特定の目的のために設計された標的化配列、タグ、標識された残基またはアミノ酸配列をさらに含むことができる。
【0026】
一具現例において、前記ＩＴＧＢ２結合部分は、ＣＤ１８が拡張された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に特異的に結合することができる。
【0027】
一具現例において、ＩＴＧＢ２結合部分は、ＩＴＧＢ２の４４９～６１７のアミノ酸と結合することができる。
【0028】
一具現例において、前記ＩＴＧＢ２結合部分は、ＩＴＧＢ２の４６６～５６５のアミノ酸と結合することができる。
【0029】
一具現例において、前記ＩＴＧＢ２結合部分は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体を含むことができ、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むことができる。
【0030】
一具現例において、前記薬物伝達システムは、配列番号３～６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むことができる。
【0031】
一具現例において、前記薬物伝達システムは、ペプチド－薬物複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＰＤＣ）であってもよく、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡであってもよく、配列番号６のアミノ酸配列を含むＴＢ５１１であってもよく、マレイミド－修飾されたメリチンに薬物ＤＭ１がコンジュゲートされたＭ－ＤＭ１であってもよい。
【0032】
一具現例において、ＴＢ５１１は、ＩＴＧＢ２の４６６～５６５のアミノ酸と結合することができ、ＴＢ５１１のＬＥＵ（６）は、ＩＴＧＢ２のＬＥＵ（５２８）、ＴＨＲ（５３８）、ＬＥＵ（５５６）、ＣＹＳ（５５７）およびＰＨＥ（５５８）部位と結合（ｂｉｎｄｉｎ）することができ、ＴＢ５１１のＴＲＰ（１２）は、ＩＴＧＢ２のＧＬＵ（４６６）、ＩＬＥ（４６９）、ＣＹＳ（４７０）およびＡＲＧ（４７１）と結合することができる。
【0033】
一具現例において、前記ＩＴＧＢ２結合部分は、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）の７３２～７４８のアミノ酸を含むエピトープ（配列番号９）、５０４～５０８のアミノ酸を含むエピトープ、５３４～５４６のアミノ酸を含むエピトープ、４４９～６１７のアミノ酸を含むエピトープ、または２３～７００（Ｇｌｎ２３－Ａｓｎ７００）のアミノ酸を含むエピトープに結合することができる。
【0034】
一具現例において、前記ＩＴＧＢ２結合部分は、前記エピトープに結合する抗体またはその免疫学的活性を有する断片であってもよい。
【0035】
一具現例において、前記免疫学的活性を有する断片は、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）、Ｆｖ、単鎖抗体、Ｆｖ二量体、相補性決定領域断片、ヒト化抗体、キメラ抗体およびジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）からなる群から選択されるいずれか一つであってもよい。
【0036】
一具現例において、前記薬物伝達システムは、抗体－薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）であってもよい。
【0037】
一具現例において、薬物伝達システムのＩＴＧＢ２結合部分と薬物は、リンカーを媒介に共有結合するか、またはリンカーの媒介なしに非共有結合することができる。
【0038】
一具現例において、薬物伝達システムのＩＴＧＢ２結合部分と薬物は、リンカーを媒介に連結／結合されることができ、リンカーは、ペプチドやリガンド、抗体、抗体断片などのタンパク質のアミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）、カルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）またはスルフドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）やアプタマーなどの核酸のリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ、ヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を介して結合することができる作用基を有する任意のリンカーを用いることができる。
【0039】
一具現例において、前記リンカーは、薬物に応じて適切なものを選択して用いることができる。例えば、薬物に、アルデヒド反応基を有するリンカーを連結し、薬物伝達システムのＩＴＧＢ２結合部分である抗体（細胞標的化領域）のＮ末端のアミノ基に結合させることができる。
【0040】
このようなリンカーの作用基は、イソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）、アシルアジド（ａｃｙｌ ａｚｉｄｅ）、ＮＨＳエステル（ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）、スルホニルクロリド（ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、グリオキサール（ｇｌｙｏｘａｌ）、エポキシド（ｅｐｏｘｉｄｅ）、オキシラン（ｏｘｉｒａｎｅ）、カーボネート（ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、アリールハライド（ａｒｙｌｈａｌｉｄｅ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ）、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、アンハイドリド（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、フルオロフェニルエステル（ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ヒドロキシメチルホスフィン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ハロアセチル（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌ）、ピリジルジスルフィド（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、チオスルホネート（ｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、またはビニルスルホン（ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）などであってもよい。リンカーは、プロテアーゼによって切断可能であるか、酸や塩基条件で切断可能であるか、または高温や光照射によって切断可能であるか、または還元または酸化条件で切断可能なリンカーであってもよく、またはこのような条件で切断可能でないリンカーであってもよい。切断可能なリンカーとしては、例えば、酸性条件で切断されるヒドラゾン（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）リンカー、プロテアーゼによって切断されるペプチドリンカー、還元条件で切断されるジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）作用基を有するリンカーなどが挙げられ、切断可能でないリンカーとしては、ＭＣＣ（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）リンカー、ＭＣ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）リンカー、またはその誘導体としてスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）リンカーやスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ－ｓＭＣＣ）が挙げられる。
【0041】
また、リンカーは、自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒ）または切断後のトレースレスリンカー（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｌｉｎｋｅｒ）であってもよい。自己犠牲リンカーは、例えば、発明の名称が「Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」である米国特許第９０８９６１４号に開示されたリンカー、名称が「ＳＥＬＦ－ＩＭＭＯＬＡＴＩＶＥ ＬＩＮＫＥＲＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＭＡＮＤＥＬＩＣ ＡＣＩＤ ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ、ＤＲＵＧ－ＬＩＧＡＮＤ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＥＤ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」である国際公開第ＷＯ２０１５０３８４２６号に開示されたリンカーが挙げられており、切断後のトレースレスリンカーとしては、フェニルヒドラジドリンカー、アリール－トリアゼンリンカー、文献［Ｂｌａｎｅｙ、ｅｔ ａｌ．、「Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、」Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．１０２：２６０７－２０２４（２００２）］に開示されたリンカーなどであってもよい。
【0042】
当業界では、前記例示したところのリンカー以外にも本発明に適用可能な数多くのリンカーが相当の数の文献を通じて公知されている。そのような文献として、具体的には、文献［Ｃａｓｔａｎｅｄａ、ｅｔ ａｌ、「Ａｃｉｄ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｔｈｉｏｍａｌｅａｍｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ、」Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．４９：８１８７－８１８９（２０１３）］、文献［Ｌｙｏｎ、ｅｔ ａｌ、「Ｓｅｌｆ－ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（１０）：１０５９－１０６２（２０１４）］、文献［Ｄａｗｓｏｎ、ｅｔ ａｌ 「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ、」Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４、２６６、７７６－７７９］、文献［Ｄａｗｓｏｎ、ｅｔ ａｌ 「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｉｏｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ、」Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１９９７、１１９、４３２５－４３２９］文献［ＨａｃｋｅｎＧ、ｅｔ ａｌ 「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｃｏｐｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９、９６、１００６８－１００７３］、文献［Ｗｕ、ｅｔ ａｌ 「Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｆｒｅｅ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ、」Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２００６、４５、４１１６－４１２５］、文献［Ｇｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ 「Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」ｉｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ、１９８８、ｐｐ １９９－２１８］、文献［Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ ａｎｄ Ｎｏｂｌｅ、Ｒ（１９９０）「Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ９－ｆｌｕｏｒｏｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３５：１６１－２１４］などであるが、米国特許第６８８４８６９号明細書、米国特許第７４９８２９８号明細書、米国特許第８２８８３５２号明細書、米国特許第８６０９１０５号明細書、米国特許第８６９７６８８号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０１２７２３９号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０２８９１９号明細書、米国特許出願公開第２０１４／２８６９７０号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０３０９２５６号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０３７３６０号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０２９４８５１号明細書、国際公開第２０１５／０５７６９９号、国際公開第２０１４／０８０２５１号、国際公開第２０１４／１９７８５４号、国際公開第２０１４／１４５０９０号、国際公開第２０１４／１７７０４２号などを参照することができる。
【0043】
本発明における薬物伝達システムのＩＴＧＢ２結合部分と薬物は、生体適合性高分子を媒介にまたはキャリアを介して結合されることもできる。生体適合性高分子は、生体組織または血液と接触し、組織を壊死させたり、血液を凝固させない組織適合性（ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）および抗血栓性（ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）を有する高分子を意味する。
【0044】
前記生体適合性高分子としての合成重合体は、ポリエステル、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）、ポリ（α－ヒドロキシアシッド）、ポリ（β－ヒドロキシアシッド）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－バレレート；ＰＨＢＶ）、ポリ（３－ヒドロキシプロプリオネート；ＰＨＰ）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート；ＰＨＨ）、ポリ（４－ヒドロキシアシッド）、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）、ポリ（４－ヒドロキシバレレート）、ポリ（４－ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（エステルアミド）、ポリカプロラクトン、ポリラクタイド、ポリグリコライド、ポリ（ラクタイド－ｃｏ－グリコライド；ＰＬＧＡ）、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリド、ポリ（グリコール酸－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、ポリホスホエステル、ポリホスホエステルウレタン、ポリ（アミノ酸）、ポリシアノアクリレート、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（タイロシンカーボネート）、ポリカーボネート、ポリ（タイロシンアリレート）、ポリアルキレンオキサレート、ポリホスファゼン、ＰＨＡ－ＰＥＧ、エチレンビニルアルコールコポリマー（ＥＶＯＨ）、ポリウレタン、シリコーン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイソブチレンとエチレン－アルファオレフィン共重合体、スチレン－イソブチレン－スチレントリブロック共重合体、アクリル重合体および共重合体、ビニルハライド重合体および共重合体、ポリビニルクロリド、ポリビニルエーテル、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニリデンハライド、ポリビニリデンフルオライド、ポリビニリデンクロリド、ポリフルオロアルケン、ポリパーフルオロアルケン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン、ポリビニルアロマティックス、ポリスチレン、ポリビニルエステル、ポリビニルアセテート、エチレン－メチルメタクリレート共重合体、アクリロニトリル－スチレン共重合体、ＡＢＳ樹脂とエチレン－ビニルアセテート共重合体、ポリアミド、アルキド樹脂、ポリオキシメチレン、ポリイミド、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリル酸－ｃｏ－マレイン酸またはポリアミノアミンであり、天然重合体は、キトサン、デキストラン、セルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギネート、イヌリン、澱粉またはグリコゲンである。
【0045】
ＩＴＧＢ２結合部分と薬物の結合に用いられるリンカーは、標的細胞の外で安定的であるため、切断されず、標的細胞内の酸性条件であるエンドソームやリゾソームでも切断されないリンカーであることが好ましい。このようなリンカーは、標的細胞の外で安定的であるため、切断されないことによって薬物が細胞内に移動されるようにし、酸性条件であるエンドソームやリゾゾームで切断されないことによって、エンドソームやリゾソームで細胞質へ移動されるようにすることができる。
【0046】
本発明の薬物伝達システムにおいて、薬物は、ＩＴＧＢ２結合部分に非共有結合することもできる。例えば、核酸にインターカレーション（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）されて効果を発揮する、抗癌剤の１種であるドキソルビシンのようなインターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ ａｇｅｎｔｓ）は、薬物伝達システムの細胞標的化領域としてアプタマーを使用する場合にアプタマーに非共有的にインターカレーション（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）方式で結合され得る。アプタマーは、オリゴヌクレオチド分子であるため、ヌクレオチド塩基の塩基スタッキング（ｂａｓｅ ｓｔａｃｋｉｎｇ）があり、この塩基スタッキング間に薬物がインターカレーション（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）方式で結合できるようになる。
【0047】
一具現例において、前記ＩＴＧＢ２結合部分にＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体、エフェクター、薬物、プロドラッグ、毒素、ペプチドまたは伝達分子がさらにコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）され得る（Ｓｈｏａｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １３：１３９１、ｐｐ．１－３２（２０２１）参照）。
【0048】
本発明における薬物伝達システムにおいて、薬物は、それが細胞内に移動して効果を発揮することができる薬物であれば、特に制限されない。そのような薬物は、細胞毒性抗癌剤などの任意の低分子化合物からなる薬物、組換えタンパク質、ｓｉＲＮＡなどの任意のバイオ医薬品であってもよい。また、薬物は、効能面において、抗炎症剤、鎮痛剤、抗関節炎剤、鎮痙剤、抗憂鬱症剤、抗精神病薬、神経安定剤、抗不安剤、麻薬拮抗剤、抗パーキンソン病薬、コリン性アゴニスト、抗癌剤、血管新生抑制剤、免疫抑制剤、免疫促進剤、抗ウイルス剤、抗生剤、食欲抑制剤、鎮痛剤、抗コリン剤、抗ヒスタミン剤、抗片頭痛剤、ホルモン剤、冠状血管、血管拡張剤、避姙薬、抗血栓剤、利尿剤、抗高血圧剤、心血管疾患治療剤、造影剤などの診断剤などであってもよい。
【0049】
一具現例において、前記薬物は、化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体、エフェクター、プロドラッグ、毒素、ペプチドまたは放射性核種であってもよい。
【0050】
一具現例において、前記薬物は、免疫原性細胞死誘導剤、プロアポトシース（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）ペプチド、マイクロチューブリン（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎ）構造形成抑制剤、有糸分裂（ｍｅｉｏｓｉｓ）抑制剤、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）抑制剤、ＤＮＡインターカレーター（ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）、毒素（ｔｏｘｉｎ）または抗癌剤であってもよい。
【0051】
一具現例において、前記プロアポトシースペプチドは、ＫＬＡ、アルファ－ディフェンシン－１（ａｌｐｈａ－ｄｅｆｅｎｓｉｎ－１）、ＢＭＡＰ－２８、Ｂｒｅｖｅｎｉｎ－２Ｒ、ブフォリンＩＩｂ（Ｂｕｆｏｒｉｎ ＩＩｂ）、セクロピンＡ－マガイニン２（ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ－Ｍａｇａｉｎｉｎ ２、ＣＡ－ＭＡ－２）、セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）、セクロピンＢ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ）、クリソフィシン－１（ｃｈｒｙｓｏｐｈｓｉｎ－１）、Ｄ－Ｋ６Ｌ９、ゴメシン（Ｇｏｍｅｓｉｎ）、ラクトフェリシンＢ（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ Ｂ）、ＬＬＬ２７、ＬＴＸ－３１５、マガイニン２（Ｍａｇａｉｎｉｎ ２）、マガイニンＩＩ－ボンベシン結合体（Ｍａｇａｉｎｉｎ ＩＩ－ｂｏｍｂｅｓｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＭＧ２Ｂ）、パルダキシン（Ｐａｒｄａｘｉｎ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択されることができる。
【0052】
一具現例において、前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、抗－ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャンネルアゴニスト、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、強心配糖体（ｃａｒｄｉａｃ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ＬＶ－ｔＳＭＡＣ、Ｍｅａｓｌｅｓウィルス、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択されることができる。
【0053】
一具現例において、前記抗癌剤は、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン、７－Ｅｔｈｙｌ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、マスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ：ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ：ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ：ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｄｏｔｅｃａｎ）、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、トリプラチンテトラナイトレート（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、イキサベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、メルタンシン）、ＤＭ４、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）およびこれらの誘導体からなる群から選択されることができ、ＤＭ１またはＭＭＡＥであってもよい。
【0054】
本発明において、薬物は、好ましくは、細胞毒性抗癌剤である。細胞毒性抗癌剤は、代謝拮抗剤（Ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）、微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎ）標的化剤（Ｔｕｂｕｌｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒおよびＴｕｂｕｌｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）、アルキル化剤（Ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、有糸分裂抑制剤（Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）、ＤＮＡ切断剤（ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｇｅｎｔ）、ＤＮＡ架橋剤（ＤＮＡ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ ａｇｅｎｔ）、ＤＮＡインターカレーター剤（ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ ａｇｅｎｔｓ）、ＤＮＡトポイソメラーゼ抑制剤（ＤＮＡ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）などに大別することができるが、代謝拮抗剤としては、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などの葉酸（Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ）誘導体、クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）などのプリン（Ｐｕｒｉｎｅ）誘導体、アザシチジン（Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）などのピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）誘導体、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）などが当業界に公知されており、微小管標的化剤としては、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ドラスタチンなどのアウリスタチン系の薬物、メイタンシン（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）などが当業界に公知されており、アルキル化剤としては、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）、トレオスルファン（Ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）などのアルキルスルホネート（Ａｌｋｙｌ Ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）製剤、ベンダムスチン（Ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）などのナイトロジェンマスタード（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｕｓｔａｒｄ）誘導体、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ヘプタプラチン（Ｈｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）などのプラチナ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）製剤などが当業界に公知されている。また、有糸分裂抑制剤（Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）としては、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）などのタキサン（Ｔａｘａｎｅ）製剤、ビンフルニン（Ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）などのビンカアルカロイド（Ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｉｄｓ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）などのポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）誘導体などが当業界に公知されており、ＤＮＡ切断剤（ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｇｅｎｔ）としては、カリケアミシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）などが公知されており、ＤＮＡ架橋剤（ＤＮＡ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ ａｇｅｎｔ）としては、ＰＢＤ二量体などが公知されている。また、ＤＮＡインターカレーターとしては、ドキソルビシンなどが当業界に公知されており、ＤＮＡトポイソメラーゼ抑制剤としては、ＳＮ－２８などが当業界に公知されている。
【0055】
また、薬物は、遺伝子、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、リボザイム、ウィルス粒子、免疫調節剤、タンパク質、造影剤などであってもよい。より具体的に薬物は、網膜芽細胞腫腫瘍サプレッサー遺伝子の変異体であるＲｂ９４をコードする遺伝子、腫瘍細胞でのみアポトシースを誘導するアポプチンをコードする遺伝子であってもよく、治療標的となるＨＥＲ－２などに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列：５’－ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＣＴ－３’）であってもよく、ＭＲＩ造影剤であるＧｄ－ＤＴＰＡ物質などの診断造影剤であってもよい。
【0056】
本発明の薬物伝達システムと薬物の複合体は、薬剤学的に許容される担体を含んで当業界に公知された通常の方法により投与経路に従って経口用剤形または非経口用剤形の薬剤学的組成物で製造されることができる。ここで「薬学的に許容可能な担体」は、生物体を刺激することなく、投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を指す。液状溶液で製剤化する組成物において、許容される薬学的担体としては、滅菌および生体に適するものとして、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射用液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分中、１成分以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。
【0057】
一具現例において、本発明の薬物伝達システムは、前記薬物をＭ２腫瘍関連マクロファージに特異的に伝達することができる。
【0058】
本発明において、ＩＴＧＢ２結合部分は、標的細胞であるＭ２腫瘍関連マクロファージのＩＴＧＢ２との結合により選択的な結合を可能にすることによって、標的機能を提供する。このＩＴＧＢ２結合部分は、標的細胞の表面に存在するＩＴＧＢ２と特異的に結合し、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を誘導することによって、これと結合する薬物の細胞内への移動を可能にする。
【0059】
本発明において、抗体、アプタマー、特定の細胞から分泌され、標的細胞である他の細胞の表面受容体に作用することによって、細胞間におけるシグナル伝達の役割をするホルモン（例えば、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ）、サイトカインやケモカイン（例えば、ＩＬ１３）、標的細胞表面受容体と結合するＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）などの生体分子であるリガンド、受容体との特異的結合能を保有したこれら因子の一部領域であるペプチドなどがこのようなＩＴＧＢ２結合部分として用いられることができる。代表的に抗体またはアプタマーが用いられることができ、ＩＴＧＢ２結合部分としての抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のみならず、多重特異的抗体（すなわち、２つ以上の抗原または２つ以上のエピトープを認識する抗体であって、二重特異的抗体などをさす）であるか、ＩＴＧＢ２と特異的に結合することができる能力を保有する限り、抗体の断片、化学的に修飾された抗体、キメラ抗体（ヒトとマウスのキメラ抗体、ヒトとサルキメラ抗体など）、免疫原性を低下させたヒト化抗体やヒト抗体などの任意の抗体であってもよい。また、抗体断片、化学的修飾された抗体の多様な形態が当業界に公知されており、例えば、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）、Ｆｖ、単鎖抗体、Ｆｖ二量体、相補性決定領域断片、ヒト化抗体、キメラ抗体およびジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）などや抗体をタンパク質切断酵素、いわゆる、パパイン、ペプシンで処理して得られた抗体断片などが挙げられる。
【0060】
抗体の製造方法、天然抗体に人為的な変形を加えて標的抗原に対する特異性を向上させるか、または免疫原性を改善させた抗体などと関連しては、当業界に公知された多様な文献、例えば、米国特許第４４４４８８７号明細書、米国特許第４７１６１１１号明細書、米国特許第５５４５８０６号明細書、米国特許第５８１４３１８号明細書、国際公開第９８／４６６４５号、国際公開第９８／５０４３３号、国際公開第９８／２４８９３号、国際公開第９８／１６６５４号、国際公開第９６／３４０９６号、国際公開第９６／３３７３５号、文献［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９４、７（６）：８０５－８１４］、文献［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４、９１：９６９－９７３］などを参照することができる。
【0061】
細胞標的化領域としてのアプタマーは、単鎖ＤＮＡアプタマーまたは単鎖ＲＮＡアプタマーであってもよい。アプタマーは、抗体と同様に標的抗原など の標的分子に特異的に結合することができる核酸リガンドを意味するが、標的分子と特異的に結合することができれば、アプタマーは、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーであってもよい。このような標的分子と特異的に結合することができるアプタマーの製造、選別方法などは、いずれも当業界に公知されている。アプタマーの選別のための具体的な方法や適切な試薬、材料などの使用については、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６７：２７５－３０１、１９９６］、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３１８：１９３－２１４、２０００］などを参照することができる。アプタマーは、生体内半減期向上のために、糖、フォスフェートおよび／または塩基で修飾されたものであってもよい。これらの糖、フォスフェートおよび／または塩基で修飾されたヌクレオチドは、当業界にその製造方法を含んで具体的に公知されている。例えば、糖で修飾されたヌクレオチドは、その糖のヒドロキシル基（ＯＨ ｇｒｏｕｐ）がハロゲン基、脂肪族基、エーテル基、アミン基などで修飾されたもの、糖であるリボースまたはデオキシリボース自体がこれを代替できる糖類似体α－アノマー糖（α－ａｎｏｍｅｒｉｃ ｓｕｇａｒｓ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅｓ）またはリキソース（ｌｙｘｏｓｅｓ）のようなエピマー糖（ｅｐｉｍｅｒｉｃ ｓｕｇａｒｓ）、ピラノース糖（ｐｙｒａｎｏｓｅ ｓｕｇａｒｓ）、フラノース糖（ｆｕｒａｎｏｓｅ ｓｕｇａｒｓ）などで置換されたものが挙げられる。また、例えば、フォスフェートにおける修飾は、フォスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（ｔｈｉｏａｔｅ）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（ａｍｉｄａｔｅ）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）への修飾されたものなどが挙げられる。ここで、前記ＲまたはＲ’は、Ｈまたは置換または非置換のアルキルなどであり、フォスフェートで修飾される場合、その連結基は－Ｏ－、－Ｎ－、－Ｓ－または－Ｃ－となり、このような連結基を介して隣接ヌクレオチドが互いに結合するようになる。
【0062】
本発明における薬物伝達システムは、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの細胞膜に発現されたＩＴＧＢ２、特に、Ｍ２ＴＡＭにおける活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）に特異的に直接結合するため、薬物効果が非選択的に示される副作用なしに標的分子であるＩＴＧＢ２が発現され、活性化されたＭ２腫瘍関連マクロファージについてのみ選択的に薬物効果が示されることを可能にする。
【0063】
一側面において、本発明は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体を含むＩＴＧＢ２結合部分；およびこれと結合された薬物を含むペプチド－薬物複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＰＤＣ）に関するものである。
【0064】
一具現例において、前記ＰＤＣは、ＩＴＧＢ２の４６６～５６５のアミノ酸と結合することができ、ＩＴＧＢ２のＬＥＵ（５２８）、ＴＨＲ（５３８）、ＬＥＵ（５５６）、ＣＹＳ（５５７）、ＰＨＥ（５５８）、ＧＬＵ（４６６）、ＩＬＥ（４６９）、ＣＹＳ（４７０）またはＡＲＧ（４７１）と結合することができる。
【0065】
一具現例において、前記ＰＤＣは、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡであってもよく、配列番号６のアミノ酸配列を含むＴＢ５１１であってもよく、マレイミド－修飾されたメリチンに薬物ＤＭ１がコンジュゲートされたＭ－ＤＭ１であってもよい。
【0066】
一具現例において、ＴＢ５１１は、ＩＴＧＢ２の４６６～５６５のアミノ酸と結合することができ、ＴＢ５１１のＬＥＵ（６）は、ＩＴＧＢ２のＬＥＵ（５２８）、ＴＨＲ（５３８）、ＬＥＵ（５５６）、ＣＹＳ（５５７）およびＰＨＥ（５５８）部位と結合（ｂｉｎｄｉｎ）することができ、ＴＢ５１１のＴＲＰ（１２）は、ＩＴＧＢ２のＧＬＵ（４６６）、ＩＬＥ（４６９）、ＣＹＳ（４７０）およびＡＲＧ（４７１）と結合することができる。
【0067】
一側面において、本発明は、ＩＴＧＢ２に結合する抗体またはその免疫学的活性を有する断片；およびこれと結合された薬物を含む抗体－薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）に関するものである。
【0068】
一具現例において、前記ＡＤＣは、ＩＴＧＢ２の７３２～７４８のアミノ酸を含むエピトープ、５０４～５０８のアミノ酸を含むエピトープ、５３４～５４６のアミノ酸を含むエピトープ、４４９～６１７のアミノ酸を含むエピトープ、または２３～７００のアミノ酸を含むエピトープに結合することができる。
【0069】
一具現例において、前記ＡＤＣは、抗体－薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）リンカーをさらに含むことができ、ＡＤＣリンカーは、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ）またはＮ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）であってもよい。
【0070】
一具現例において、前記抗体－薬物複合体は、ＡＤＣリンカーを介して抗－ＣＤ１８抗体またはその免疫学的活性を有する断片が薬物と複合体を形成することができる。
【0071】
前記抗体は、全（ｗｈｏｌｅ）抗体形態のみならず、抗体分子の機能的な断片を含む。全抗体は、２個の全長軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）および２個の全長重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で連結されている。抗体分子の機能的な断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、抗体断片の例としては、（ｉ）軽鎖の可変領域（ＶＬ）および重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の不変領域（ＣＬ）および重鎖の第一不変領域（ＣＨ１）からなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一な抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ＥＳ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６（１９８９）］；（ｖ）分離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２個の連結されたＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが抗原結合部位を形成するように結合させるペプチドリンカーにより結合された単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）二重特異的な単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｉｘ）遺伝子融合により作製された多価または多特異的な断片であるジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）ＷＯ９４／１３８０４）などを含む。
【0072】
本発明の抗体またはその免疫学的活性を有する断片は、動物に由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびこれらの免疫学的活性を有する断片からなる群から選択されるものであってもよい。前記抗体は、組換え的または合成的に生産されたものであってもよい。
【0073】
所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物に由来の抗体は、一般的に治療目的でヒトに投与した際、免疫拒否反応が起こり得、このような免疫拒否反応を抑制すべくキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝光学的方法を用いて抗－アイソタイプ（ａｎｔｉ－ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因となる動物に由来の抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換するものである。キメラ抗体は、動物に由来の抗体に比べて抗－アイソタイプ反応において、相当部分が改善されたが、依然として動物に由来のアミノ酸が可変領域に存在しているため、潜在的な抗－イディオタイプ（ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を内包している。このような副作用を改善すべく開発されたものがヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これはキメラ抗体の可変領域中、抗原の結合に重要な役割をするＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して作製される。
【0074】
ヒト化抗体を作製するためのＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において、最も重要なことは、動物に由来の抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れられる最適化されたヒト抗体を選定することであり、これのために抗体データベースの活用、結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかし、最適化されたヒト抗体骨格に動物に由来の抗体のＣＤＲ部位を移植しても動物に由来の抗体の骨格に位置しながら抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸が存在する場合があるため、抗原結合が保存できない場合が相当の数存在するため、抗原結合力を復元するためのさらなる抗体工学技術の適用は必須であるといえる。
【0075】
前記抗体またはその免疫学的活性を有する断片は、生体から分離された（生体に存在しない）ものまたは非自然的に生産（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）されたものであってもよく、いわゆる、合成的または組換え的に生産されたものであってもよい。
【0076】
本発明において、「抗体」とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味するものであって、その種類は、特に制限されず、自然的または非自然的（いわゆる、合成的または組換え的）に得られる。抗体は、生体外だけでなく、生体内でも非常に安定して半減期が長いことから、大量発現および生産に有利である。また、抗体は、本質的にダイマー（ｄｉｍｅｒ）構造を有するので、アビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）が非常に高い。完全な抗体は、２個の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）型を有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）型を有する。
本発明において、用語「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片を全部含む意味として解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を全部含む意味として解釈される。
本発明において、用語「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片を全部含む意味として解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を全部含む意味として解釈される。
【0077】
本発明において、用語「可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）または可変部位（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ」は、抗原と特異的に結合する機能を行いながら、配列上の多くの変異を示す抗体分子の部分を意味し、可変領域には、相補性決定領域であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が存在する。前記ＣＤＲ間には、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）部分が存在し、ＣＤＲ環を支持する役割をする。前記「相補性決定領域」は、抗原の認識に関与する環状の部位であって、この部位の配列が変化するにつれて抗体の抗原に対する特異性が決定される。
【0078】
本発明において、用語「ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ」は、遺伝子組換えを通じて抗体の可変領域のみを発現させて作った単鎖抗体を指し、抗体のＶＨ領域とＶＬ領域を短いペプチド鎖で連結した単鎖形態の抗体を指す。前記用語「ｓｃＦｖ」は、特に明示されていなかったり、文脈上、異に理解されるものでなければ、抗原結合断片をはじめとするｓｃＦｖ断片を含むものとする。これは、通常の技術者にとって自明なことである。
【0079】
本発明において、用語「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原または抗原決定部位に結合するにおいて、主要な接触残基を提供することができる。
【0080】
本発明において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常公知されている意味と同一のものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用し、免疫学的反応をすることを意味する。
【0081】
本発明において、用語「抗原結合断片」は、免疫グロブリン全体構造に対するその断片であって、抗原が結合することができる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記抗原結合断片中、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の第一不変領域（ＣＨ１）を有する構造として１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変部位のみを有する最小の抗体片でＦｖ断片を生成する組換え技術は、当業界に広く公知されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合により重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合により連結されるか、またはＣ－末端にて直に連結されているため、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。前記リンカーは、１～１００個または２～５０個の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよく、当業界に適切な配列が知られている。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すると、Ｆａｂを得ることができ、ペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる）、遺伝子組換え技術を通じて作製することができる。
【0082】
本発明において、用語「ヒンジ領域（ｈｕｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１およびＣＨ２領域間に存在しており、抗体内抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能をする領域を意味する。いわゆる、前記ヒンジは、ヒト抗体に由来するものであってもよく、具体的には、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、いわゆる、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するものであってもよい。
【0083】
本発明の抗体またはその免疫学的活性を有する断片は、当該技術分野に公知された任意の方法により製造されることができる。本発明の抗体またはその免疫学的活性を有する断片のポリペプチド配列をコーディングした後、所望の場合、宿主細胞内にクローニングされ、発現および検定される核酸形成に用いられる。これのための多様な方法が文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に記載されている。
【0084】
本発明の抗体またはその免疫学的活性を有する断片をコードする核酸は、タンパク質発現のために、発現ベクターに挿入されることができる。発現ベクターは、通常調節または制御（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）配列、選別マーカー、任意の融合パートナー、および／または追加的要素と作動可能に連結された、すなわち、機能的関係におかれたタンパク質を含む。適切な状態で、核酸で形質転換された宿主細胞、好ましくは、本発明の抗体またはその免疫学的活性を有する断片をコードする核酸含有発現ベクターを培養し、タンパク質発現を誘導する方法により本発明による抗体またはその免疫学的活性を有する断片が生産されることができる。哺乳類細胞、バクテリア、昆虫細胞、および酵母を含む多様な適切な宿主細胞が使用されることができるが、これに制限されるものではない。外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野に公知されており、用いられる宿主細胞によって異なり得る。好ましくは、生産コストが低廉で、産業的利用価値の高い大腸菌を宿主細胞とし、本発明による抗体またはその免疫学的活性を有する断片を生産する。
【0085】
一側面において、本発明は、本発明のＩＴＧＢ２に結合する抗体またはその免疫学的活性を有する断片を抗原結合ドメインとして含むキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）に関するものである。
【0086】
一側面において、本発明は、前記キメラ抗原受容体を暗号化する遺伝子を含む組換えベクターに関するものである。
【0087】
一側面において、本発明は、前記組換えベクターで形質転換されたキメラ抗原受容体発現細胞に関するものである。
【0088】
一具現例において、キメラ抗原受容体発現細胞は、キメラ抗原受容体発現マクロファージ（ＣＡＲ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、キメラ抗原受容体発現Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、キメラ抗原受容体発現－ガンマ－デルタＴ（ＣＡＲ－Ｇａｍｍａ－ｄｅｌｔａ Ｔ）細胞またはナチュラルキラー（ＣＡＲ－ＮＫ）細胞であってもよい。
【0089】
本発明において、用語「ＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」は、免疫エフェクター細胞に特定の抗原に対する特異性を付与することができる、自然的に存在しない受容体を意味する。通常、前記ＣＡＲは、Ｔ細胞に単クローン抗体の特異性を移植するために用いられる受容体を指す。ＣＡＲは、大概、細胞外ドメイン（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、膜透過性ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）および細胞内ドメイン（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）から構成される。
【0090】
前記細胞外ドメインは、抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと連結された形態で、自然的または合成されたものに由来するものであってもよい。自然的に存在するものに由来する場合、膜結合または膜透過性タンパク質に由来するものであってもよく、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータチェーン、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４またはＣＤ８などの多様なタンパク質の膜透過性領域に由来の部分であってもよい。このような膜貫通ドメインの配列は、膜透過性タンパク質の膜透過性領域部分を公知している通常の技術分野に公知された文献などから得ることができるが、これらに制限されるものではない。
【0091】
また、前記膜貫通ドメインが合成されたものである場合、これはロイシンおよびバリンのような疎水性アミノ酸残基を主に含むことができ、その例として、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）が合成された膜貫通ドメインに存在することができるが、これに制限されるものではない。このような膜貫通ドメインに対する配列情報は、合成された膜貫通ドメインに対する通常の技術分野に公知された文献から得ることができるが、これに制限されるものではない。
【0092】
本発明のＣＡＲにおいて、前記細胞内ドメインは、細胞内に存在するＣＡＲのドメインの一部であって、膜貫通ドメインと連結された形態である。本発明の前記細胞内ドメインは、ＣＡＲの抗原結合部位に抗原が結合すると、Ｔ細胞活性化、好ましくは、Ｔ細胞増殖をもたらすことが特徴である、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外に存在する抗原結合部位に抗体が結合すると、Ｔ細胞活性化をもたらすことができるシグナルを伝達する部分であれば、特にその種類に制限されず、多様な種類の細胞内シグナル伝達ドメインが用いられることができ、その例として、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）またはＩＴＡＭであってもよく、前記ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータ（ξ、ｚｅｔａ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄまたはＦｃεＲＩγに由来するものを含むが、これらに制限されるものではない。
【0093】
ＣＡＲは、Ｔ－細胞シグナル化分子の細胞質ドメインにヒンジおよび膜貫通領域を介してカップリングされる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体の単鎖断片可変部（ｓｃＦｖ）を含む。ほとんどの通常のリンパ球活性化部分は、Ｔ－細胞触発（例えば、ＣＤ３ζ）部分を有するタンデム（ｔａｎｄｅｍ）において、Ｔ－細胞共刺激（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２７）ドメインを含む。ＣＡＲ－媒介養子免疫療法は、ＣＡＲ－移植された細胞が非－ＨＬＡ－制限方式で標的腫瘍細胞上のＴＡＡを直接認識するようになる。
【0094】
本発明において、用語「キメラ抗原受容体発現Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味する。前記キメラ抗原受容体発現Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞は、i）ＨＬＡ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）に非依存的な方式で癌抗原を認知するため、細胞表面にＨＬＡ発現を減少させ、抗癌剤の作用を回避する癌を治療することができる利点があり、ii）ＨＬＡタイプと無関係なため、患者のＨＬＡタイプに関係なく、治療に用いることができ、iii）短時間内に多くの量の癌特異的Ｔ細胞を作り出すことができるため、優れた抗癌効果を示すことができる利点を有する。
【0095】
前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞、ＴＨ細胞）、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（細胞毒性Ｔ細胞、ＣＴＬ）、記憶Ｔ細胞、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）ナチュラルキラーＴ細胞などがあり、本発明において、ＣＡＲが導入されるＴ細胞は、好ましくは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞であるが、これらに制限されるものではない。
【0096】
一具現例において、本発明は、ＩＴＧＢ２に結合する抗体またはその免疫学的活性を有する断片を含むＴ細胞エンゲージャー（Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）に関するものである。
【0097】
一具現例において、前記Ｔ細胞エンゲージャーは、例えば、二重－特異的 Ｔ－細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）であってもよい。前記ＢｉＴＥは、人工二重特異的モノクローナル抗体の部類であって、約５５キロダルトンの単一のペプチド鎖上に４個の異なる遺伝子からアミノ酸配列または異なる抗体の２個の単鎖可変部断片（ｓｃＦｖ）から構成される融合タンパク質である。ｓｃＦｖ中の一つは、ＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、もう一つは、腫瘍特異的な分子を通じて腫瘍細胞に結合する。他の二重特異的抗体と類似に、そして通常のモノクローナル抗体とは異なり、ＢｉＴＥは、Ｔ細胞と腫瘍細胞の間で連結を形成する。これはパーフォリンおよびグランザイムのようなタンパク質を生産することによって、ＭＨＣ Ｉまたは共刺激分子の存在とは独立してＴ細胞が腫瘍細胞上で細胞毒性活性を発揮するようにする。これらのタンパク質は、腫瘍細胞に侵入し、細胞の細胞死滅を開始する。
【0098】
一側面において、本発明は、本発明の薬物伝達システム、ペプチド－薬物複合体または抗体－薬物複合体を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学的組成物に関するものである。
【0099】
一具現例において、本発明の薬物伝達システム、ペプチド－薬物複合体または抗体－薬物複合体を有効成分として含む免疫抗癌剤に関するものである。
【0100】
一具現例において、前記癌は、Ｍ２腫瘍関連マクロファージ媒介癌であってもよい。
【0101】
一具現例において、前記組成物は、Ｍ０マクロファージおよびＭ１マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにおけるＩＴＧＢ２の発現が上方制御された患者を対象に投与されることができる。
【0102】
一具現例において、癌は、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳癌、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ、ＴＮＢＣ）、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、子宮頸部癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、卵管癌、肛門癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓または尿管癌、腎細胞癌、腎臓骨盤癌、中枢神経系腫瘍、一次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫および下垂体腺腫からなる群から選択されるいずれか一つであってもよく、抗癌剤耐性癌であってもよい。
【0103】
本発明の薬学的組成物は、単独の療法で用いられることができるが、他の通常の生物学的療法、化学療法または放射療法と共に用いられることもでき、このような並行療法を実施する場合には、より効果的に癌を治療することができる。本発明を癌の予防および治療に用いる場合、前記組成物と共に用いられることができる化学療法剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）およびメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを含む。本発明の組成物と共に用いられることができる放射療法は、Ｘ－線照射およびγ－線照射などである。
【0104】
本発明において、用語「予防」とは、本発明による組成物の投与により癌の発生、拡散および再発を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味する。
【0105】
本発明の組成物の治療的に有効な量は、多様な要素、例えば、投与方法、目的部位、患者の状態などによって異なり得る。したがって、人体に使用時の投与量は、安全性および効率性を共に考慮し、適正量で決定されるべきである。動物実験を通じて決定した有効量からヒトに使用される量を推定することも可能である。有効な量を決定する際に、考慮すべきこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ、ｅｄｓ．、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ ｅｄ．（２００１）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記述されている。
【0106】
本発明における薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明にて使される用語、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を引き起こさない程度の量を意味し、有効用量レベルは患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与方法、投与時間、投与経路および排出率、治療期間、配合または同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野で公知の要素によって決定されることができる。本発明の組成物は、個別の治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単回または複数回投与することができる。前記した要素を全て考慮して、副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
【0107】
本発明における薬学的組成物は、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。本発明にて使用される用語、「薬学的に許容可能な」とは、前記組成物に露出される正常な細胞やヒトに毒性のない特性を示すことを意味する。前記担体は、組成物を生体内送達に適したものであれば、特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分中、１成分以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法によりまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を用いて各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【0108】
一具現例において、前記薬学組成物は、経口型剤形、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液および噴霧剤を含む群から選択される一つ以上の剤形であってもよい。
【0109】
本発明における組成物はまた、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、組成物を生体内送達に適したものであれば、特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分中、１成分以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用製剤、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに当分野の適正な方法によりまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を用いて各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【0110】
本発明における組成物にさらに同一または類似する機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。本発明における組成物は、組成物の総重量に対して前記タンパク質を０．０００１～１０重量％、好ましくは０．００１～１重量％を含む。
【0111】
本発明における薬学的組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、このとき、薬剤学的に許容可能な添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファ化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトールおよびタルクなどが用いられることができる。本発明による薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記組成物に対して０．１重量部～９０重量部含まれることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【0112】
本発明における組成物は、目的とする方法に従って、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）するか、経口投与することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。本発明による組成物の一日の投与量は、０．０００１～１０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０００１～５ｍｇ／ｍｌであり、一日に１回～数回に分けて投与することがより好ましい。
【0113】
本発明における組成物の経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内服液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単純な希釈剤である水、液体パラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが共に含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。
【0114】
一側面において、本発明は、ＩＴＧＢ２（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ２）に候補物質を処理する段階；およびＩＴＧＢ２と結合する候補物質を選別する段階を含む、薬物をＭ２腫瘍関連マクロファージに特異的に伝達する物質をスクリーニングする方法に関するものである。
【0115】
一具現例において、前記方法は、拡張された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＣＤ１８に特異的に結合する候補物質を選別することができる。
【0116】
一側面において、本発明は、分離された試料においてＩＴＧＢ２の発現量を確認する段階を含むＭ２マクロファージを標的化する抗癌剤に対する反応性を有する患者を選別する方法に関するものである。
【0117】
一具現例において、前記方法は、Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２の発現量がＭ０マクロファージおよびＭ１マクロファージに比べて高い場合、Ｍ２マクロファージを標的化する抗癌剤に対する反応性を有する患者として判別する段階をさらに含むことができる。
【0118】
一側面において、本発明は、ＩＴＧＢ２遺伝子または前記遺伝子から発現されたタンパク質を含む固形癌診断用マーカーに関するものである。
【0119】
一側面において、本発明は、ＩＴＧＢ２の発現量をｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで測定する製剤を含む、固形癌診断用組成物に関するものである。
【0120】
一具現例において、ｍＲＮＡレベルで測定する製剤は、前記遺伝子の核酸配列、前記核酸配列に相補的な核酸配列、前記核酸配列および相補的な配列の断片を特異的に認識するプライマー対、プローブ、またはプライマー対およびプローブであってもよく、前記測定は、重合酵素連鎖反応、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、逆転写重合酵素連鎖反応、競争的重合酵素連鎖反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ保護アッセイ（ＲＮａｓｅ、Ｓ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ）、ｉｎ ｓｉｔｕ交雑法、核酸マイクロアレイ、ノーザンブロット、ＤＮＡチップ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲまたはｄｄＰＣＲからなる群から選択される一つ以上の方法により行われることができる。
【0121】
一具現例において、タンパク質レベルで測定する製剤は、前記遺伝子のタンパク質全長またはその断片を特異的に認識する抗体、抗体断片、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｄｉｔｙ ｍｕｌｔｉｍｅｒ）またはペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）であってもよく、前記測定は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体結合分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ、質量分析またはタンパク質マイクロアレイからなる群から選択される一つ以上の方法により行うことができる。
【0122】
本発明において、使用された用語「検出」または「測定」は、検出または測定された対象の濃度を定量することを意味する。
【0123】
本発明において、使用された用語「プライマー」は、短い遊離３末端水酸化基（ｆｒｅｅ ３ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列に相補的なテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成することができ、テンプレート鎖複製のための開始時点として機能をする短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液および温度で重合反応（すなわち、ＤＮＡ重合酵素または逆転写酵素）のための試薬および異なる４種類のヌクレオシドトリフォスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開示することができる。
【0124】
本発明において、使用された用語「プローブ」とは、ｍＲＮＡと特異的結合をなすことができる短くて数個の塩基ないし長くて数百個の塩基に該当するＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、ラベルリングされているので、特定のｍＲＮＡの存在有無を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブ、単鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で作製することができる。本発明では、前記ＩＴＧＢ２と相補的なプローブを用いて混成化を実施し、混成化可否を通じて前記遺伝子発現程度を診断することができる。適当なプローブの選択および混成化条件は、通常の技術分野に公知されたものを基に修飾することができるため、本発明では、これについて特に限定されない。
【0125】
本発明のプライマーまたはプローブは、ホスホロアミダイト固体支持体方法、またはその他の広く公知された方法を用いて、化学的に合成することができる。このような核酸配列はまた、当該分野に公知された多くの手段を用いて修飾させることができる。このような修飾の非－制限的な例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチドのうちの一つ以上の同族体への置換およびヌクレオチド間の修飾、例えば、荷電しない連結体（例：メチルホスホネート、ホスフォトリエステル、ホスホロアミダート、カルバメートなど）または荷電した連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への修飾がある。
【0126】
本発明において、プローブをｃＤＮＡ分子と混成化させる適合する条件は、最適化手続きにより一連の過程で決定されることができる。このような手続きは、研究室で使用するためのプロトコルを樹立するために当業者によって一連の過程で実施される。例えば、温度、成分の濃度、混成化および洗浄時間、緩衝液成分およびこれらのｐＨおよびイオン強度などの条件は、プローブの長さおよびＧＣ量およびターゲットヌクレオチド配列などの多様な因子に依存する。混成化のための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎＧ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）；およびＭ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）にて確認することができる。例えば、前記ストリンジェンシー条件の中から高いストリンジェンシー条件は、０．５ Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、６５℃条件で混成化し、０．１ ｘ ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｌｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ）／０．１％のＳＤＳにおいて、６８℃条件で洗浄することを意味する。または、高いストリンジェンシー条件は、６ｘＳＳＣ／０．０５％のナトリウムパイロフォスフェートにおいて、４８℃の条件で洗浄することを意味する。低いストリンジェンシー条件は、例えば、０．２ｘＳＳＣ／０．１％のＳＤＳにおいて、４２℃条件で洗浄することを意味する。
【0127】
一側面において、本発明は、本発明の免疫抗癌剤を処理した試料において、ＩＴＧＢ２の発現量を確認する段階を含む、Ｍ２マクロファージを標的化する免疫抗癌剤に対する反応性予測または予後診断方法に関するものである。
【0128】
一具現例において、免疫抗癌剤処理後の試料において、ＩＴＧＢ２タンパク質の発現量が減少した場合、免疫抗癌剤に対する反応性が良いものと判断する段階をさらに含むことができる。
【0129】
一具現例において、前記試料は、血液、血清、血漿、羊水、唾液、腹水、骨髄、涙液、胆汁、肺洗浄液、脳脊髄液、胸水、滑液、リンパ、精液、尿、または組織生検または細胞からタンパク質を抽出した溶液であってもよい。
【0130】
一側面において、本発明は、対象から分離された試料において、ＩＴＧＢ２の発現量を確認する段階；対照群とＩＴＧＢ２の発現量を比較する段階；およびＩＴＧＢ２が対照群に比べて、過発現された対象を分類する段階を含む、癌の診断に必要な情報を提供する方法に関するものである。
【0131】
一具現例において、ＩＴＧＢ２が対照群に比べて過発現された対象を癌に罹患した可能性が高いものと判断する段階をさらに含むことができる。
【0132】
一側面において、本発明は、本発明の薬物伝達システムを薬学的に有効な量で癌に罹患したオブジェクトに投与する段階を含む癌の治療方法に関するものである。
【0133】
一具現例において、前記オブジェクトは、Ｍ０マクロファージおよびＭ１マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２の発現が上方制御された患者であってもよい。
【0134】
一側面において、本発明は、本発明の薬物伝達システムを癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に用いるための用途に関するものである。
【0135】
下記の実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。しかし、下記実施例は、本発明の内容を具体化するためのものに過ぎず、これにより本発明が限定されるものではない。
【0136】
実施例１．Ｍ２腫瘍関連マクロファージ（Ｍ２ＴＡＭ）標的化ペプチドの合成
下記表１のメリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）およびＴＡＭｐｅｐ８２６をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）に合成依頼して供給を受け、その後、実験にてＤ－ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌで溶かし、用いられた。
下記表１のメリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）およびＴＡＭｐｅｐ８２６をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）に合成依頼して供給を受け、その後、実験にてＤ－ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌで溶かし、用いられた。
【0137】
【表1】
【0138】
実施例２．Ｍ２ＴＡＭ標的化の分析
２－１．メリチンのＭ２ＴＡＭに対する親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）の確認
前記実施例１にて作製したメリチンがＭ２腫瘍関連マクロファージ（Ｍ２ＴＡＭ）に特異的に結合するか否かを確認するため、ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１をＭ０、Ｍ１、およびＭ２マクロファージに分化させ、ＦＩＴＣコンジュゲートされたメリチンを処理し、フローサイトメトリーにより確認した。具体的に、ＴＨＰ－１細胞は、１００ｎＭのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）を３７℃で２４時間処理し（Ｍ０マクロファージ）、分化されたＭ０マクロファージを１００ｎＭのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γと３７℃で７２時間培養し、Ｍ１マクロファージ（Ｍ１）に分化させ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４およびＩＬ－１３と３７℃で７２時間培養し、Ｍ２マクロファージ（Ｍ２）に分化させた。分化された細胞にＦＩＴＣコンジュゲートされたメリチン５０ｎＭを１時間処理し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で細胞を検出し、ＦｌｏｗＪｏｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
２－１．メリチンのＭ２ＴＡＭに対する親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）の確認
前記実施例１にて作製したメリチンがＭ２腫瘍関連マクロファージ（Ｍ２ＴＡＭ）に特異的に結合するか否かを確認するため、ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１をＭ０、Ｍ１、およびＭ２マクロファージに分化させ、ＦＩＴＣコンジュゲートされたメリチンを処理し、フローサイトメトリーにより確認した。具体的に、ＴＨＰ－１細胞は、１００ｎＭのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）を３７℃で２４時間処理し（Ｍ０マクロファージ）、分化されたＭ０マクロファージを１００ｎＭのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γと３７℃で７２時間培養し、Ｍ１マクロファージ（Ｍ１）に分化させ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４およびＩＬ－１３と３７℃で７２時間培養し、Ｍ２マクロファージ（Ｍ２）に分化させた。分化された細胞にＦＩＴＣコンジュゲートされたメリチン５０ｎＭを１時間処理し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で細胞を検出し、ＦｌｏｗＪｏｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【0139】
その結果、ＦＩＴＣ陽性細胞は、Ｍ０およびＭ２マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにおいて、著しく増加した（図１ａおよびｂ）。これを通じて、メリチンがＭ２マクロファージに優先的に結合することが確認された。
【0140】
２－２．メリチンのＭ２ＴＡＭ結合標的タンパク質の識別
Ｍ２マクロファージのあるタンパク質がメリチンとＭ２マクロファージの特異的結合に関連しているか否かを確認するため、ビオチン－コンジュゲートされたメリチン（メリチン－ｂｉｏｔｉｎ）を合成した。ＴＨＰ－１細胞（５ Х １０６ ｃｅｌｌｓ）をＭ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージに分化させた後、スクレーパーを用いて細胞を集めて、遠心分離（３００ Х ｇ、５分）を通じて細胞を洗浄し、細胞膜タンパク質抽出キット（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマクロファージの細胞膜タンパク質を得た。メリチンにビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）が結合されたメリチン－ビオチン（２００μｇ）と常温（２０～２４℃）で１時間反応させた後、ストレプトアビジン・レジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｒｅｓｉｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてメリチンと結合したタンパク質を得た。塩を除去するため、１００％のメタノール、０．１％のギ酸および８０％のＣＡＮをそれぞれ１００μｌずつ１８ Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ－Ｃｏｌｕｍｎに添加して用意し、用意したカラムに試料をロードし、５０μｌの０．１％のギ酸を添加し、不要な物質を除去した。その後、８０％のＣＡＮ １００μｌを添加し、ペプチドを溶離させた。脱塩が終わると、Ｓｐｅｅｄ－ｖａｃで乾燥させ、溶液を全部除去し、下記表２の条件でＵＰＬＣ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＭａｘＱｕａｎｔおよびＭＰＰ（Ｍａｓｓ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）を用いてＭ０マクロファージに比べてＭ１およびＭ２マクロファージにおいて、上方制御されたタンパク質に対してデータを分析した。データを分析するために、各指標別にＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを用いて分析し、データベースは、Ｕｎｉｐｒｏｔのｈｕｍａｎ ｄａｔａｂａｓｅを用いて、ＬＦＱ（Ｌａｂｅｌ－Ｆｒｅｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により進めた。Ｍｏｄｉｆｉｃａｉｔｏｎは、Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ）、Ｃａｒｂａｍｙｌ（Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（Ｃ）を追加し、Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｏｐｔｉｏｎは、ｎｏｎｅとした。
Ｍ２マクロファージのあるタンパク質がメリチンとＭ２マクロファージの特異的結合に関連しているか否かを確認するため、ビオチン－コンジュゲートされたメリチン（メリチン－ｂｉｏｔｉｎ）を合成した。ＴＨＰ－１細胞（５ Х １０６ ｃｅｌｌｓ）をＭ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージに分化させた後、スクレーパーを用いて細胞を集めて、遠心分離（３００ Х ｇ、５分）を通じて細胞を洗浄し、細胞膜タンパク質抽出キット（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマクロファージの細胞膜タンパク質を得た。メリチンにビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）が結合されたメリチン－ビオチン（２００μｇ）と常温（２０～２４℃）で１時間反応させた後、ストレプトアビジン・レジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｒｅｓｉｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてメリチンと結合したタンパク質を得た。塩を除去するため、１００％のメタノール、０．１％のギ酸および８０％のＣＡＮをそれぞれ１００μｌずつ１８ Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ－Ｃｏｌｕｍｎに添加して用意し、用意したカラムに試料をロードし、５０μｌの０．１％のギ酸を添加し、不要な物質を除去した。その後、８０％のＣＡＮ １００μｌを添加し、ペプチドを溶離させた。脱塩が終わると、Ｓｐｅｅｄ－ｖａｃで乾燥させ、溶液を全部除去し、下記表２の条件でＵＰＬＣ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＭａｘＱｕａｎｔおよびＭＰＰ（Ｍａｓｓ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）を用いてＭ０マクロファージに比べてＭ１およびＭ２マクロファージにおいて、上方制御されたタンパク質に対してデータを分析した。データを分析するために、各指標別にＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを用いて分析し、データベースは、Ｕｎｉｐｒｏｔのｈｕｍａｎ ｄａｔａｂａｓｅを用いて、ＬＦＱ（Ｌａｂｅｌ－Ｆｒｅｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により進めた。Ｍｏｄｉｆｉｃａｉｔｏｎは、Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ）、Ｃａｒｂａｍｙｌ（Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（Ｃ）を追加し、Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｏｐｔｉｏｎは、ｎｏｎｅとした。
【0141】
【表2】
【0142】
その結果、Ｍ２／Ｍ０にて５３個のタンパク質が、Ｍ１／Ｍ０にて１２３個のタンパク質が上方制御された（図２ａ）。Ｍ２マクロファージよりもより多くの上方制御されたタンパク質がＭ１マクロファージと相互作用したが、細胞膜に存在するタンパク質はその限りでない。膜タンパク質中、ＩＴＧＢ２がＭ２マクロファージにおいて、上方制御されることが示された（図２ｂ）。また、Ｍ１マクロファージのマーカーとして知られたＩＬ－１０およびＣＸＣＬ１０のようなサイトカインがＭ１マクロファージにおいて、上方制御された（図２ｖ）。また、タンパク質がＭ１に比べてＭ２にて上方制御されたタンパク質が確認されたが、膜タンパク質中、ＩＴＧＢ２のみがＭ２マクロファージにおいて、上方制御されることが確認された（図２ｄ）。これを通じて、メリチンがＭ２マクロファージの膜タンパク質ＩＴＧＢ２と相互作用し、結合することが確認された。
【0143】
２－３．ＴＡＭｐｅｐ８２６のＭ２ＴＡＭ結合標的タンパク質の識別
前記実施例２－２からみられるように、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージからそれぞれ抽出した細胞膜タンパク質とＴＡＭｐｅｐ８２６－ビオチンを反応させて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓを通じてターゲットタンパク質を確認した。
前記実施例２－２からみられるように、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージからそれぞれ抽出した細胞膜タンパク質とＴＡＭｐｅｐ８２６－ビオチンを反応させて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓを通じてターゲットタンパク質を確認した。
【0144】
その結果，細胞膜タンパク質中、ＩＴＧＢ２がＭ０およびＭ１マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにおいて、より高いレベルで発現されることが示され（図４）、ＴＡＭｐｅｐ８２６のＭ２マクロファージ結合標的タンパク質として選別された。
【0145】
実施例３．Ｍ２マクロファージのＩＴＧＢ２発現の確認
３－１．ＩＴＧＢ２ｍＲＮＡ発現の確認
Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭｓにおいて、ＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現レベルを評価するために、リアルタイム重合酵素連鎖反応を行った。具体的には、Ｍ０、Ｍ１またはＭ２マクロファージに分化された細胞において、ｅａｓｙ－ＢＬＵＥ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いてｃＤＮＡで合成した。ＡｃｔｉｎまたはＩＴＧＢ２遺伝子のプライマー（表３）を用い、図５の条件でｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ－ｒａｄ）を進め、Ａｃｔｉｎに比べて各遺伝子の発現量を相対定量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により比較および分析した。
３－１．ＩＴＧＢ２ｍＲＮＡ発現の確認
Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭｓにおいて、ＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現レベルを評価するために、リアルタイム重合酵素連鎖反応を行った。具体的には、Ｍ０、Ｍ１またはＭ２マクロファージに分化された細胞において、ｅａｓｙ－ＢＬＵＥ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いてｃＤＮＡで合成した。ＡｃｔｉｎまたはＩＴＧＢ２遺伝子のプライマー（表３）を用い、図５の条件でｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ－ｒａｄ）を進め、Ａｃｔｉｎに比べて各遺伝子の発現量を相対定量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により比較および分析した。
【0146】
【表3】
【0147】
その結果、ＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現は、Ｍ０およびＭ１に比べてＭ２マクロファージおよびＴＡＭにおいて、有意に増加したことが示された（図６）。
【0148】
３－２．ＩＴＧＢ２タンパク質発現の確認
Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭｓにおいて、ＩＴＧＢ２のタンパク質発現レベルを評価するために、ウェスタンブロット解析を行った。具体的には、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージに分化されたそれぞれの細胞において、Ｐｒｏｐｒｅｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉＮｔＲＯＮ）を用いてタンパク質を抽出し、電気泳動法によりメンブレンにタンパク質をトランスファーした。メンブレンを５％のＢＳＡに浸してブロックした後、１次抗体（ＩＴＧＢ２）を２４時間４℃で処理し、２次抗体を１時間常温で処理した後、Ｄ－Ｐｌｕｓ（商標出願）ＥＣＬ Ｐｉｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｏｎｉｎｇ ＬＳ）を処理し、Ｄａｖｉｎｃｈ－Ｃｈｅｍｉ（商標出願）ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｔｏｘｉａ）でタンパク質バンド写真を撮影した。
Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭｓにおいて、ＩＴＧＢ２のタンパク質発現レベルを評価するために、ウェスタンブロット解析を行った。具体的には、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージに分化されたそれぞれの細胞において、Ｐｒｏｐｒｅｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉＮｔＲＯＮ）を用いてタンパク質を抽出し、電気泳動法によりメンブレンにタンパク質をトランスファーした。メンブレンを５％のＢＳＡに浸してブロックした後、１次抗体（ＩＴＧＢ２）を２４時間４℃で処理し、２次抗体を１時間常温で処理した後、Ｄ－Ｐｌｕｓ（商標出願）ＥＣＬ Ｐｉｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｏｎｉｎｇ ＬＳ）を処理し、Ｄａｖｉｎｃｈ－Ｃｈｅｍｉ（商標出願）ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｔｏｘｉａ）でタンパク質バンド写真を撮影した。
【0149】
その結果、ＩＴＧＢ２のタンパク質発現は、Ｍ０およびＭ１に比べてＭ２マクロファージおよびＴＡＭにおいて、有意に増加したことが示された（図７）。
【0150】
３－３．免疫蛍光法によるＩＴＧＢ２タンパク質発現の確認
Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭｓにおいて、ＩＴＧＢ２のタンパク質発現レベルを評価するために、免疫蛍光分析を行った。具体的には、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージに分化されたそれぞれの細胞を４％のホルマリンで固定させた後、ＰＢＳで洗浄し、５％のＢＳＡに浸してブロックした後、１次抗体（ＩＴＧＢ２）を２４時間４℃で処理し、２次抗体を２時間常温で処理し、染色を行った。染色した細胞は、ＤＡＰＩ ｍｏｕｎｔｉｎｇ後、ＬＳＭ８００（Ｚｅｉｓｓ）で蛍光写真を撮影した。
Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭｓにおいて、ＩＴＧＢ２のタンパク質発現レベルを評価するために、免疫蛍光分析を行った。具体的には、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージに分化されたそれぞれの細胞を４％のホルマリンで固定させた後、ＰＢＳで洗浄し、５％のＢＳＡに浸してブロックした後、１次抗体（ＩＴＧＢ２）を２４時間４℃で処理し、２次抗体を２時間常温で処理し、染色を行った。染色した細胞は、ＤＡＰＩ ｍｏｕｎｔｉｎｇ後、ＬＳＭ８００（Ｚｅｉｓｓ）で蛍光写真を撮影した。
【0151】
その結果、ＩＴＧＢ２のタンパク質は、Ｍ０およびＭ１に比べてＭ２マクロファージおよびＴＡＭにて高い発現レベルを示した（図８）。
【0152】
実施例４．Ｍ２ＴＡＭ標的化ペプチドとＩＴＧＢ２の相互作用の確認
４－１．Ｍ２マクロファージ細胞膜におけるＩＴＧＢ２の発現の確認
ＩＴＧＢ２がＭ２マクロファージの細胞膜にて発現されるか否かを確認するため、Ｍ２マクロファージから細胞膜タンパク質およびサイトゾル（ｃｙｔｏｓｏｌ）タンパク質をそれぞれ分離抽出し、ビオチン化されたＴＡＭｐｅｐ８２６と反応させてＩＴＧＢ２の発現をウェスタンブロット解析により評価した。その結果、ＩＴＧＢ２タンパク質は、Ｍ２マクロファージの細胞膜にて発現されることが示された（図９）。
４－１．Ｍ２マクロファージ細胞膜におけるＩＴＧＢ２の発現の確認
ＩＴＧＢ２がＭ２マクロファージの細胞膜にて発現されるか否かを確認するため、Ｍ２マクロファージから細胞膜タンパク質およびサイトゾル（ｃｙｔｏｓｏｌ）タンパク質をそれぞれ分離抽出し、ビオチン化されたＴＡＭｐｅｐ８２６と反応させてＩＴＧＢ２の発現をウェスタンブロット解析により評価した。その結果、ＩＴＧＢ２タンパク質は、Ｍ２マクロファージの細胞膜にて発現されることが示された（図９）。
【0153】
４－２．ＴＡＭｐｅｐ８２６およびＩＴＧＢ２の相互作用の確認
Ｍ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐ８２６がＩＴＧＢ２と相互作用するか否かを確認するために、ＴＡＭｐｅｐ８２６およびビオチン化されたＴＡＭｐｅｐ８２６の競争的な反応を通じてＩＴＧＢ２の発現を評価した。具体的には、Ｍ２マクロファージに分化された細胞をスクレーパーで集めて、遠心分離（３００ Х ｇ、５分）により細胞を洗浄し、細胞膜タンパク質抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、マクロファージの細胞膜タンパク質を得た。ＴＡＭｐｅｐ８２６またはｓｃｒａｍｂｌｅペプチドを濃度別（０．００１、０．０１、０．１、１および１０μｇ）に１時間前処理した後、タンパク質にビオチンが結合されたＴＡＭｐｅｐ８２６（２００μｇ）と常温（２０～２４℃）で１時間反応させた後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標出願）Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＴＡＭｐｅｐ８２６と結合したタンパク質を得た。タンパク質をウェスタンブロット解析し、ＩＴＧＢ２の発現を確認した。
Ｍ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐ８２６がＩＴＧＢ２と相互作用するか否かを確認するために、ＴＡＭｐｅｐ８２６およびビオチン化されたＴＡＭｐｅｐ８２６の競争的な反応を通じてＩＴＧＢ２の発現を評価した。具体的には、Ｍ２マクロファージに分化された細胞をスクレーパーで集めて、遠心分離（３００ Х ｇ、５分）により細胞を洗浄し、細胞膜タンパク質抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、マクロファージの細胞膜タンパク質を得た。ＴＡＭｐｅｐ８２６またはｓｃｒａｍｂｌｅペプチドを濃度別（０．００１、０．０１、０．１、１および１０μｇ）に１時間前処理した後、タンパク質にビオチンが結合されたＴＡＭｐｅｐ８２６（２００μｇ）と常温（２０～２４℃）で１時間反応させた後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標出願）Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＴＡＭｐｅｐ８２６と結合したタンパク質を得た。タンパク質をウェスタンブロット解析し、ＩＴＧＢ２の発現を確認した。
【0154】
その結果、ｓｃｒａｍｂｌｅｄペプチドを前処理したとき、ビオチン化されたＴＡＭｐｅｐ８２６と結合されたＩＴＧＢ２の発現は、影響がないことが示されたのに対し、ＴＡＭｐｅｐ８２６で前処理したときは、濃度によってＩＴＧＢ２発現が抑制されることが示された（図１０）。このことから、ＴＡＭｐｅｐ８２６がＭ２マクロファージの細胞膜にてＩＴＧＢ２と相互作用することを確認することができた。
【0155】
４－３．免疫蛍光法を用いたＴＡＭｐｅｐ８２６およびＩＴＧＢ２の相互作用の確認
Ｍ２マクロファージの細胞膜にて、ＩＴＧＢ２およびＴＡＭｐｅｐ８２６がｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎするか否かを確認するために、ＦＩＴＣが結合されたＴＡＭｐｅｐ８２６を用いて免疫蛍光分析を行った。その結果、ＴＡＭｐｅｐ８２６とＩＴＧＢ２は、Ｍ２マクロファージの細胞膜に集中的に分布されていることが示された（図１１）。
Ｍ２マクロファージの細胞膜にて、ＩＴＧＢ２およびＴＡＭｐｅｐ８２６がｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎするか否かを確認するために、ＦＩＴＣが結合されたＴＡＭｐｅｐ８２６を用いて免疫蛍光分析を行った。その結果、ＴＡＭｐｅｐ８２６とＩＴＧＢ２は、Ｍ２マクロファージの細胞膜に集中的に分布されていることが示された（図１１）。
【0156】
４－４．ＴＢ５１１とＩＴＧＢ２の結合部位の確認
ＣＤ１８（ＩＴＧＢ２）のシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）ｒｉｃｈ部分の配列を基に（ｕｎｉｐｏｒｔ＿ｐ０５１０７、Ｃｙｓｔｅｉｎ－ｒｉｃｈ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ ｒｅｇｉｏｎ：４４９－６１７）、ｔｒＲｏｓｅｔｔａアルゴリズム（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて、３次構造（ｔｅｒｉｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を構成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｙａｎｇｌａｂ．ｎａｎｋａｉ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｔｒＲｏｓｅｔｔａ／）。その後、ＴＢ５１１とＣＤ１８のドッキングシミュレーション（Ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は、ｔｒＲｏｓｅｔｔａで作ったＣＤ１８ ＰＤＢファイルとＴＢ５１１のアミノ酸配列を有し、ＣＡＢＳ－ｄｏｃｋ ｓｅｒｖｅｒを通じて行われた（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｏｍｐ．ｃｈｅｍ．ｕｗ．ｅｄｕ．ｐｌ／ＣＡＢＳｄｏｃｋ／）。ドッキングシミュレーションの結果、作られた１０個のモデルのうち、ＴＢ５１１配列のアラニン置換の結果を基に代表モデルを選定した（図１２）。
ＣＤ１８（ＩＴＧＢ２）のシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）ｒｉｃｈ部分の配列を基に（ｕｎｉｐｏｒｔ＿ｐ０５１０７、Ｃｙｓｔｅｉｎ－ｒｉｃｈ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ ｒｅｇｉｏｎ：４４９－６１７）、ｔｒＲｏｓｅｔｔａアルゴリズム（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて、３次構造（ｔｅｒｉｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を構成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｙａｎｇｌａｂ．ｎａｎｋａｉ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｔｒＲｏｓｅｔｔａ／）。その後、ＴＢ５１１とＣＤ１８のドッキングシミュレーション（Ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は、ｔｒＲｏｓｅｔｔａで作ったＣＤ１８ ＰＤＢファイルとＴＢ５１１のアミノ酸配列を有し、ＣＡＢＳ－ｄｏｃｋ ｓｅｒｖｅｒを通じて行われた（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｏｍｐ．ｃｈｅｍ．ｕｗ．ｅｄｕ．ｐｌ／ＣＡＢＳｄｏｃｋ／）。ドッキングシミュレーションの結果、作られた１０個のモデルのうち、ＴＢ５１１配列のアラニン置換の結果を基に代表モデルを選定した（図１２）。
【0157】
その結果、ＴＢ５１１のＬＥＵ（６）は、ＣＤ１８のＬＥＵ（５２８）、ＴＨＲ（５３８）、ＬＥＵ（５５６）、ＣＹＳ（５５７）およびＰＨＥ（５５８）部位と結合（ｂｉｎｄｉｎ）することが予測され、ＴＢ５１１のＴＲＰ（１２）は、ＣＤ１８のＧＬＵ（４６６）、ＩＬＥ（４６９）、ＣＹＳ（４７０）およびＡＲＧ（４７１）と結合することが予測された。また、ＴＢ５１１のＬＥＵ（６）およびＴＲＰ（１２）をそれぞれアラニンで置換し、ＣＤ１８との結合をシミュレーションすると、２つの部位全部ＣＤ１８のどの配列とも結合しないことが示された。したがって、ＴＢ５１１のＬＥＵ（６）およびＴＲＰ（１２）は、ＴＢ５１１とＣＤ１８間のドッキングにおいて核心的な部分であり、ＴＢ５１１は、ＣＤ１８の４６６～５６５に結合することが予測され得る（図１３）。
【0158】
実施例５．ＩＴＧＢ２結合部分の合成
５－１．ＩＴＧＢ２結合ＰＤＣ（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の合成
下記表４のＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡおよびＴＢ５１１ペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）に合成依頼して供給を受け、その後、実験にてＤ－ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌで溶かし、用いられた。ｄＫＬＡは、ペプチド間アミド結合を通じて連結しており、メリチンまたはＴＡＭｐｅｐ８２６とｄＫＬＡ間の相互作用および折り畳みを最小化するため、真ん中に４個のグリシンおよび１個のセリンで構成されたリンカーを配置し、両端を区分し、ＫＬＡは、体内の分解を最小化するために、Ｌ型でないＤ型異性体を用いた。また、Ｍ－ＤＭ１を作製するために、２５ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）に溶かしたマレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）－修飾されたメリチン（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＢｅｉｊｉｎＧ、Ｃｈｉｎａ）（１００μＭ、１ｍＬ、０．１ｍｍｏＬ）にＤＭ１（Ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）（１．１当量、ＤＭＦ中１０ｍＭ）およびＤＭＦ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を添加し、３７℃で１時間反応させた後、生成物ををＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）で限外濾過により３回濾過することによって、マレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）－修飾されたメリチンＭのＮ－末端にＤＭ１を結合させてＰＤＣを作製し、Ｍ－ＤＭ１として命名した。作製したＭ－ＤＭ１は、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（２．７μｍ、３ × ５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）にて逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を５μＬ、０．５ｍＬ／分の速度で注入し、特性を分析した。
５－１．ＩＴＧＢ２結合ＰＤＣ（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の合成
下記表４のＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡおよびＴＢ５１１ペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）に合成依頼して供給を受け、その後、実験にてＤ－ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌで溶かし、用いられた。ｄＫＬＡは、ペプチド間アミド結合を通じて連結しており、メリチンまたはＴＡＭｐｅｐ８２６とｄＫＬＡ間の相互作用および折り畳みを最小化するため、真ん中に４個のグリシンおよび１個のセリンで構成されたリンカーを配置し、両端を区分し、ＫＬＡは、体内の分解を最小化するために、Ｌ型でないＤ型異性体を用いた。また、Ｍ－ＤＭ１を作製するために、２５ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）に溶かしたマレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）－修飾されたメリチン（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＢｅｉｊｉｎＧ、Ｃｈｉｎａ）（１００μＭ、１ｍＬ、０．１ｍｍｏＬ）にＤＭ１（Ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）（１．１当量、ＤＭＦ中１０ｍＭ）およびＤＭＦ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を添加し、３７℃で１時間反応させた後、生成物ををＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）で限外濾過により３回濾過することによって、マレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）－修飾されたメリチンＭのＮ－末端にＤＭ１を結合させてＰＤＣを作製し、Ｍ－ＤＭ１として命名した。作製したＭ－ＤＭ１は、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（２．７μｍ、３ × ５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）にて逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を５μＬ、０．５ｍＬ／分の速度で注入し、特性を分析した。
【0159】
【表4】
【0160】
５－２．ＩＴＧＢ２結合ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の合成
５－２－１．抗－ＣＤ１８抗体およびＤＭ１のＡＤＣの作製
マクロファージ－１抗原（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－１ ａｎｔｉｇｅｎ、Ｍａｃ－１）のうちの一つである、ＣＤ１８のＭ２ＴＡＭにおける活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に特異的に結合する抗体（図１４）を作製するために、抗－ＣＤ１８抗体を分泌するハイブリドーマ（ＭＭ１８／２．ａ．８）細胞の培養液を集めて、２，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上澄み液を得た後、タンパク質Ｇ－セファロースカラムクロマトグラフィー方法により精製した。ＰＢＳで予め平衡化させたタンパク質Ｇ－セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）に抗体溶液をゆっくりと通過させ、カラムをペリスタルティックポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｔｉｃ ｐｕｍｐ）に連結し、ＰＢＳで十分に洗浄した。洗浄完了後、０．２Ｍのグリシン（ｇｌｙｃｉｎ）－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で抗体を溶出した。このとき、予め用意した１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）を含むチューブに前記溶出液を緩衝させた。この抗体をＰＢＳに透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）した後、用いた。ＢＣＡタンパク質分析キット（ＢＣＡ（商標出願）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製された抗体量を測定し、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ分析を通じて、抗体の結合能を確認した。精製した抗－ＣＤ１８抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、抗－ＣＤ１８抗体（１ｍｇ／ｍｌ、６．６７μＭ）にＤＭＳＯに溶かしたＳＭＣＣ－ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、１２０μＭ）（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を１：１８の 比率で混ぜ、常温で４～２０時間反応させた。未反応のＤＭ１を除去するため、１０ＫＤａ ｃｕｔｏｆｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒを用いて、ＣＤ１８－ＤＭ１をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙを用いて、抗－ＣＤ１８抗体（２８０ｎｍ）に結合されたＤＭ１（２５２ｎｍ）の量を測定し、ＤＭ１と抗－ＣＤ１８抗体の比率（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を計算し、ＤＡＲ値は、５．８として示された。このように作製された抗－ＣＤ１８抗体とＤＭ１が結合されたＡＤＣをＣＤ１８－ＤＭ１として命名した。
５－２－１．抗－ＣＤ１８抗体およびＤＭ１のＡＤＣの作製
マクロファージ－１抗原（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－１ ａｎｔｉｇｅｎ、Ｍａｃ－１）のうちの一つである、ＣＤ１８のＭ２ＴＡＭにおける活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に特異的に結合する抗体（図１４）を作製するために、抗－ＣＤ１８抗体を分泌するハイブリドーマ（ＭＭ１８／２．ａ．８）細胞の培養液を集めて、２，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上澄み液を得た後、タンパク質Ｇ－セファロースカラムクロマトグラフィー方法により精製した。ＰＢＳで予め平衡化させたタンパク質Ｇ－セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）に抗体溶液をゆっくりと通過させ、カラムをペリスタルティックポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｔｉｃ ｐｕｍｐ）に連結し、ＰＢＳで十分に洗浄した。洗浄完了後、０．２Ｍのグリシン（ｇｌｙｃｉｎ）－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で抗体を溶出した。このとき、予め用意した１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）を含むチューブに前記溶出液を緩衝させた。この抗体をＰＢＳに透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）した後、用いた。ＢＣＡタンパク質分析キット（ＢＣＡ（商標出願）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製された抗体量を測定し、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ分析を通じて、抗体の結合能を確認した。精製した抗－ＣＤ１８抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、抗－ＣＤ１８抗体（１ｍｇ／ｍｌ、６．６７μＭ）にＤＭＳＯに溶かしたＳＭＣＣ－ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、１２０μＭ）（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を１：１８の 比率で混ぜ、常温で４～２０時間反応させた。未反応のＤＭ１を除去するため、１０ＫＤａ ｃｕｔｏｆｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒを用いて、ＣＤ１８－ＤＭ１をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙを用いて、抗－ＣＤ１８抗体（２８０ｎｍ）に結合されたＤＭ１（２５２ｎｍ）の量を測定し、ＤＭ１と抗－ＣＤ１８抗体の比率（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を計算し、ＤＡＲ値は、５．８として示された。このように作製された抗－ＣＤ１８抗体とＤＭ１が結合されたＡＤＣをＣＤ１８－ＤＭ１として命名した。
【0161】
５－２－２．抗－ＣＤ１８抗体およびＭＭＡＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）のＡＤＣの作製
前記実施例にて精製した抗－ＣＤ１８抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、ＣＤ１８抗体の二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を部分的に還元するために、抗－ＣＤ１８抗体（１ｍｇ／ｍｌ、６．６７μＭ）に１ｍＭ ＤＴＴ（６６．７μＭ）を１：１０の比率で混ぜ、３７℃で１～２時間反応させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。部分的に還元された抗－ＣＤ１８抗体（１ｍｇ／ｍｌ、６．６７μＭ）に１０ｍＭ Ｓｕｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を１：２０～１：４０の比率で混ぜ、４℃で１２時間反応させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙを用いて抗－ＣＤ１８抗体（２８０ｎｍ）に結合されたｖｃ－ＭＭＡＥ（２４８ｎｍ）の量を測定し、ｖｃ－ＭＭＡＥと抗－ＣＤ１８抗体の比率（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を計算し、ＤＡＲ値は、２．８～５．４として示された。このように作製された抗－ＣＤ１８抗体とＭＭＡＥが結合されたＡＤＣをＣＤ１８－ＭＭＡＥとして命名した。
前記実施例にて精製した抗－ＣＤ１８抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、ＣＤ１８抗体の二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を部分的に還元するために、抗－ＣＤ１８抗体（１ｍｇ／ｍｌ、６．６７μＭ）に１ｍＭ ＤＴＴ（６６．７μＭ）を１：１０の比率で混ぜ、３７℃で１～２時間反応させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。部分的に還元された抗－ＣＤ１８抗体（１ｍｇ／ｍｌ、６．６７μＭ）に１０ｍＭ Ｓｕｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を１：２０～１：４０の比率で混ぜ、４℃で１２時間反応させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙを用いて抗－ＣＤ１８抗体（２８０ｎｍ）に結合されたｖｃ－ＭＭＡＥ（２４８ｎｍ）の量を測定し、ｖｃ－ＭＭＡＥと抗－ＣＤ１８抗体の比率（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を計算し、ＤＡＲ値は、２．８～５．４として示された。このように作製された抗－ＣＤ１８抗体とＭＭＡＥが結合されたＡＤＣをＣＤ１８－ＭＭＡＥとして命名した。
【0162】
実施例６．ＩＴＧＢ２結合ＰＤＣのＭ２ＴＡＭ結合の確認
ＩＴＧＢ２およびＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡの結合力を確認するために、ＩＴＧＢ２タンパク質を金薄膜センサーチップ上にコーティングした後、陽性対照群としてＩＴＧＢ２抗体およびＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡをそれぞれ流し、反射光を測定し、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）分析を行った。具体的には、センサーチップ表面にＩＴＧＢ２を固定させた後、アミンカップリング（ａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を用いて下記表５の条件で固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を行った（図１５）。その後、ＩＴＧＢ２がコーティングされたセンサチップに多様な濃度のＩＴＧＢ２抗体およびＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡを流し、結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）および解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）区間を観察し、センサーグラムを通じて下記表６の分子間結合速度定数分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｖｏｌｕａｔｉｏｎ）条件で分子間結合速度定数（ｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒａｒｍｅｔｅｒ）を計算した。
ＩＴＧＢ２およびＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡの結合力を確認するために、ＩＴＧＢ２タンパク質を金薄膜センサーチップ上にコーティングした後、陽性対照群としてＩＴＧＢ２抗体およびＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡをそれぞれ流し、反射光を測定し、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）分析を行った。具体的には、センサーチップ表面にＩＴＧＢ２を固定させた後、アミンカップリング（ａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を用いて下記表５の条件で固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を行った（図１５）。その後、ＩＴＧＢ２がコーティングされたセンサチップに多様な濃度のＩＴＧＢ２抗体およびＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡを流し、結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）および解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）区間を観察し、センサーグラムを通じて下記表６の分子間結合速度定数分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｖｏｌｕａｔｉｏｎ）条件で分子間結合速度定数（ｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒａｒｍｅｔｅｒ）を計算した。
【0163】
【表5】
【0164】
【表6】
【0165】
その結果、陽性対照群であるＩＴＧＢ２抗体の二つの分子間の結合力を評価する解離速度定数（ｋｄ；ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）を結合速度定数（ｋａ；ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）に分けて得る平衡解離定数（ＫＤ；ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）が１．１４－８で、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡの平衡解離定数は、７．８６－８で示された（図１６および１７）。したがって、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡがＩＴＧＢ２と結合力を有していることが確認された。
【0166】
実施例７．ＰＤＣのＩＴＧＢ２によるＭ２ＴＡＭ細胞死滅効果の確認
７－１．ＩＴＧＢ２の発現抑制細胞モデルの作製
Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２を通じて細胞死滅を誘導するか否かを確認することに使用するための細胞モデルとして、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９を用い、Ｍ２マクロファージにてＩＴＧＢ２の発現が抑制された細胞モデルを作製した。具体的には、Ｍ２マクロファージに分化された細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で培養した。Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標出願）Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＣａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とｇＲＮＡ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；ＩＴＧＢ２；表７）をＣａｓ９ Ｐｌｕｓ（商標出願）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に混ぜ、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標出願）ＲｅａｇｅｎｔをＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に希釈した後、全部混ぜて５～１０分間反応させた後、Ｍ２マクロファージに分化された細胞に添加し、３７℃で２～３日間培養した。その後、ＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現レベルを確認した。
７－１．ＩＴＧＢ２の発現抑制細胞モデルの作製
Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２を通じて細胞死滅を誘導するか否かを確認することに使用するための細胞モデルとして、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９を用い、Ｍ２マクロファージにてＩＴＧＢ２の発現が抑制された細胞モデルを作製した。具体的には、Ｍ２マクロファージに分化された細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で培養した。Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標出願）Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＣａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とｇＲＮＡ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；ＩＴＧＢ２；表７）をＣａｓ９ Ｐｌｕｓ（商標出願）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に混ぜ、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標出願）ＲｅａｇｅｎｔをＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に希釈した後、全部混ぜて５～１０分間反応させた後、Ｍ２マクロファージに分化された細胞に添加し、３７℃で２～３日間培養した。その後、ＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現レベルを確認した。
【0167】
【表7】
【0168】
その結果、ＩＴＧＢ２ｓｇＲＮＡを注入したＭ２マクロファージは、ＩＴＧＢ２の発現が対照群に比べて、有意に減少することが示された（図１８）。
【0169】
７－２．Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡのＩＴＧＢ２によるＭ２ＴＡＭ細胞死滅の確認
Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡがＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２に結合し、細胞アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導するか否かを確認するために、前記実施例７－１にて作製したＣｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９によりＩＴＧＢ２発現が抑制されたＭ２マクロファージにＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡ（１μＭ）を２４時間処理し、ＣＣＫ－８分析方法を用いて細胞生存率を分析した。具体的には、前記実施例７－１にて作製したＩＴＧＢ２ロックダウンされたマクロファージにＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡ（１μＭ）を１時間反応させた。反応後、培地を交換し、３７℃で２４時間培養した。細胞生存能を確認するために、ＣＣＫ－８ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培地の１／１０入れ、３７℃で３時間反応させた。吸光度は、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍにて測定した。
Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡがＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２に結合し、細胞アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導するか否かを確認するために、前記実施例７－１にて作製したＣｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９によりＩＴＧＢ２発現が抑制されたＭ２マクロファージにＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡ（１μＭ）を２４時間処理し、ＣＣＫ－８分析方法を用いて細胞生存率を分析した。具体的には、前記実施例７－１にて作製したＩＴＧＢ２ロックダウンされたマクロファージにＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡ（１μＭ）を１時間反応させた。反応後、培地を交換し、３７℃で２４時間培養した。細胞生存能を確認するために、ＣＣＫ－８ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培地の１／１０入れ、３７℃で３時間反応させた。吸光度は、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍにて測定した。
【0170】
その結果、対照群Ｍ２マクロファージにおいて、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡにより細胞生存率が著しく減少したが、ＩＴＧＢ２がロックダウンされたＭ２マクロファージでは、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡによる細胞生存率の減少が抑制されることが示された（図１９）。したがって、これを通じて、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡがＭ２マクロファージのＩＴＧＢ２と特異的に結合することによって、Ｍ２マクロファージの細胞アポトシースを誘導することを確認することができた。
【0171】
７－３．ＴＢ５１１のＩＴＧＢ２によるＭ２ＴＡＭ細胞死滅の確認
ＴＢ５１１（ＴＡＭｐｅｐ８２６－ｄＫＬＡ）がＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２により細胞死滅を誘導するか否かを確認するために、前記実施例７－１にて作製したＣｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９によりＩＴＧＢ２発現が抑制されたＭ２マクロファージにＴＢ５１１を反応させた。その結果、Ｍ２マクロファージは、ＴＢ５１１により５０％程度の細胞生存能を示したが、ＩＴＧＢ２発現が抑制された細胞からは細胞生存能が有意に増加することが示された（図２０）。
ＴＢ５１１（ＴＡＭｐｅｐ８２６－ｄＫＬＡ）がＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２により細胞死滅を誘導するか否かを確認するために、前記実施例７－１にて作製したＣｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９によりＩＴＧＢ２発現が抑制されたＭ２マクロファージにＴＢ５１１を反応させた。その結果、Ｍ２マクロファージは、ＴＢ５１１により５０％程度の細胞生存能を示したが、ＩＴＧＢ２発現が抑制された細胞からは細胞生存能が有意に増加することが示された（図２０）。
【0172】
７－４．ＩＴＧＢ２抗体によるＴＢ５１１の細胞死滅誘導減少の確認
ＴＢ５１１がＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２により細胞死滅を誘導するか否かを確認するために、前記実施例７－１にて作製したＩＴＧＢ２発現が抑制されたＭ２マクロファージに抗－ＩＴＧＢ２抗体（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩＴＧＢ２／ＣＤ１８抗体）（ＬＳ－Ｃ３１２７８５；ＬＳ Ｂｉｏ）（１μｇ）を１時間前処理した後、ＴＢ５１１（１μＭ）を１時間反応させた後，細胞死滅誘発するか否かをＣＣＫ－８分析を用いた細胞生存能分析により、細胞死滅マーカーであるｃａｓｐａｓｅ－３のタンパク質発現をウェスタンブロット解析により、ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－８、ｃａｓｐａｓｅ－９の遺伝子発現をＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより、およびｃａｓｐａｓｅ－３のタンパク質発現誘導を免疫蛍光法により確認した。
ＴＢ５１１がＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２により細胞死滅を誘導するか否かを確認するために、前記実施例７－１にて作製したＩＴＧＢ２発現が抑制されたＭ２マクロファージに抗－ＩＴＧＢ２抗体（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩＴＧＢ２／ＣＤ１８抗体）（ＬＳ－Ｃ３１２７８５；ＬＳ Ｂｉｏ）（１μｇ）を１時間前処理した後、ＴＢ５１１（１μＭ）を１時間反応させた後，細胞死滅誘発するか否かをＣＣＫ－８分析を用いた細胞生存能分析により、細胞死滅マーカーであるｃａｓｐａｓｅ－３のタンパク質発現をウェスタンブロット解析により、ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－８、ｃａｓｐａｓｅ－９の遺伝子発現をＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより、およびｃａｓｐａｓｅ－３のタンパク質発現誘導を免疫蛍光法により確認した。
【0173】
その結果、Ｍ２マクロファージは、ＩＴＧＢ２抗体によっては細胞生存能には影響がなく、ＴＢ５１１によっては細胞生存能が有意に減少した。その反面、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージでは、ＴＢ５１１による細胞生存能が有意に増加したことが示された（図２１）。また、Ｍ２マクロファージは、ＴＢ５１１によりｃａｓｐａｓｅ－３発現が有意に増加するのに対し、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージでは、ＴＢ５１１によるｃａｓｐａｓｅ－３発現が有意に減少した（図２１）。また、Ｍ２マクロファージは、ＴＢ５１１によりｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－８およびｃａｓｐａｓｅ－９の発現が有意に増加するのに対し、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージでは、ＴＢ５１１によるｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－８およびｃａｓｐａｓｅ－９の発現が有意に減少した（図２１）。Ｍ２マクロファージは、ＴＢ５１１によりｃａｓｐａｓｅ－３発現が増加するのに対し、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージでは、ＴＢ５１１によるｃａｓｐａｓｅ－３発現が減少した（図２１）。さらに、ＴＢ５１１のミトコンドリア標的化を確認した結果、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージは、ＩＴＧＢ２前処理していない細胞に比べて、ミトコンドリアとＴＢ５１１のｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎが減少した（図２１）。
【0174】
実施例８．３Ｄ癌オルガノイドにおけるＰＤＣの効能の確認
８－１．乳癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの限界点を補完し、ｉｎ ｖｉｖｏを代替すべく乳癌の癌微小環境（Ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）を模擬した３Ｄオルガノイドを作製し、これに対するＴＢ５１１の効果を確認した。具体的には、ＲＰＭＩ－１６４０培養液にマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）が３％となるように混合し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞、ＣＡＦ（Ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）およびＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、ＧＦＰが発現されるように作製したＴＨＰ－１細胞を計数し、５：１：１の比率で２００μｌとなるように９６ｕ－ｂｏｔｔｏｍ ３－Ｄｃｕｌｔｕｅ ｐｌａｔｅ（Ｓｂｉｏ）に分注した。培養後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞を集めた後、３７℃のインキュベーターで４８時間培養し、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成した。スフェロイド形成２日目からＴＢ５１１を１μＭ、２μＭ、４μＭおよび８μＭの濃度で３日毎にそれぞれ処理し、蛍光顕微鏡で画像を撮影し、Ｂｒｉｇｈｔ－ｆｉｅｌｄ画像を撮影した後、ペレットの直径を測定方法により、スフェロイド領域（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ａｒｅａ）を測定した。また、平均腫瘍回転楕円体直径は、オープンソースを用いて、スフェロイド当たり平均３個の直径を測定し、ＩｍａｇｅＪ（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ１．４７ｍ）によりサイズを分析し、スフェロイドの大きさは、Ｂｒｉｇｈｔ－ｆｉｅｌｄ画像を撮影した後、（２０Ｘ）、平均腫瘍回転楕円体直径をスフェロイド当たり平均３個ずつ測定し、ＩｍａｇｅＪ（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４７ｍ）により分析した。併せて、薬物処理１０日目にスフェロイドを固定し、腫瘍増殖因子であるｋｉ－６７に対する抗体（ａｂｃａｍ）を反応させて免疫蛍光染色を行った（対照染色：ＤＡＰＩ）。ＴＨＰ－１の場合、別途の染色を進めず、細胞内に発現するＧＦＰ蛍光を共焦点顕微鏡で画像を撮影し、蛍光を発現する細胞の数を測定した。
８－１．乳癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの限界点を補完し、ｉｎ ｖｉｖｏを代替すべく乳癌の癌微小環境（Ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）を模擬した３Ｄオルガノイドを作製し、これに対するＴＢ５１１の効果を確認した。具体的には、ＲＰＭＩ－１６４０培養液にマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）が３％となるように混合し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞、ＣＡＦ（Ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）およびＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、ＧＦＰが発現されるように作製したＴＨＰ－１細胞を計数し、５：１：１の比率で２００μｌとなるように９６ｕ－ｂｏｔｔｏｍ ３－Ｄｃｕｌｔｕｅ ｐｌａｔｅ（Ｓｂｉｏ）に分注した。培養後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞を集めた後、３７℃のインキュベーターで４８時間培養し、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成した。スフェロイド形成２日目からＴＢ５１１を１μＭ、２μＭ、４μＭおよび８μＭの濃度で３日毎にそれぞれ処理し、蛍光顕微鏡で画像を撮影し、Ｂｒｉｇｈｔ－ｆｉｅｌｄ画像を撮影した後、ペレットの直径を測定方法により、スフェロイド領域（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ａｒｅａ）を測定した。また、平均腫瘍回転楕円体直径は、オープンソースを用いて、スフェロイド当たり平均３個の直径を測定し、ＩｍａｇｅＪ（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ１．４７ｍ）によりサイズを分析し、スフェロイドの大きさは、Ｂｒｉｇｈｔ－ｆｉｅｌｄ画像を撮影した後、（２０Ｘ）、平均腫瘍回転楕円体直径をスフェロイド当たり平均３個ずつ測定し、ＩｍａｇｅＪ（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４７ｍ）により分析した。併せて、薬物処理１０日目にスフェロイドを固定し、腫瘍増殖因子であるｋｉ－６７に対する抗体（ａｂｃａｍ）を反応させて免疫蛍光染色を行った（対照染色：ＤＡＰＩ）。ＴＨＰ－１の場合、別途の染色を進めず、細胞内に発現するＧＦＰ蛍光を共焦点顕微鏡で画像を撮影し、蛍光を発現する細胞の数を測定した。
【0175】
その結果、薬物を処理していない群は、時間が経つにつれてスフェロイドの大きさがだんだん大きくなり、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）であるＴＨＰ－１細胞が癌細胞およびＣＡＦと共培養時、癌細胞およびＴＭＥによってＴＡＭに分化され、腫瘍成長を促進することが示された。その反面、ＴＢ５１１を処理した群では、１０日目に１μＭの濃度で濃度依存的にスフェロイドの大きさが減少することが確認され（図２２）、ＧＦＰ蛍光を発現するＴＨＰ－１細胞の数が薬物無処理群に比べて濃度依存的に著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２３）。したがって、ＩＴＧＢ２結合ＰＤＣであるＴＢ５１１がＴＨＰ－１細胞に選択的に結合し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌の細胞死滅を誘導することが確認された。
【0176】
８－２．肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
前記実施例８－１の方法によりＡ５４９ヒト肺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、肺癌３Ｄスフェロイドを作製した後、ＴＢ５１１を１μＭ、２μＭおよび４μＭの濃度でそれぞれ処理し、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。スフェロイド作製時、癌細胞単独または癌細胞＋ＣＡＦ細胞のみを混合して、３Ｄスフェロイドも作製し、スフェロイドの大きさを比較した。
前記実施例８－１の方法によりＡ５４９ヒト肺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、肺癌３Ｄスフェロイドを作製した後、ＴＢ５１１を１μＭ、２μＭおよび４μＭの濃度でそれぞれ処理し、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。スフェロイド作製時、癌細胞単独または癌細胞＋ＣＡＦ細胞のみを混合して、３Ｄスフェロイドも作製し、スフェロイドの大きさを比較した。
【0177】
その結果、Ａ５４９細胞単独またはＡ５４９＋ＣＡＦ細胞のみでスフェロイドを形成したときよりもＡ５４９＋ＣＡＦ＋ＴＨＰ－１細胞でスフェロイドを形成したときのスフェロイドの大きさが著しく増加することが示された。また、ＴＢ５１１を処理していない群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、スフェロイドの大きさがＴＢ５１１の濃度依存的に著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２４）。また、薬物を処理してから１０日目にスフェロイドを蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＴＢ５１１を処理していない群に比べて、ＴＨＰ－１細胞の数が濃度依存的に著しく減少しており、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も濃度依存的に減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２５）。
【0178】
８－３．肺癌３ＤオルガノイドにおけるＭ－ＤＭ１の効果の確認
肺癌に対するＭ－ＤＭ１（Ｍｅｌ－ＤＭ１）の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりＡ５４９ヒト肺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合して、肺癌３Ｄスフェロイドを作製した後、Ｍ－ＤＭ１を１μＭ、２μＭおよび４μＭの濃度でそれぞれ処理し、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
肺癌に対するＭ－ＤＭ１（Ｍｅｌ－ＤＭ１）の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりＡ５４９ヒト肺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合して、肺癌３Ｄスフェロイドを作製した後、Ｍ－ＤＭ１を１μＭ、２μＭおよび４μＭの濃度でそれぞれ処理し、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
【0179】
その結果、Ｍ－ＤＭ１を処理していない群に比べて、Ｍ－ＤＭ１を処理した群において、濃度依存的にスフェロイドの大きさが減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２６）。
【0180】
実施例９．抗癌剤耐性３Ｄ癌オルガノイドにおけるＰＤＣの効能の確認
９－１．抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）耐性肺癌に対するＴＢ５１１の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりカルボプラチン耐性Ａ５４９細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＴＢ５１１を１μＭ、２μＭおよび４μＭの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
９－１．抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）耐性肺癌に対するＴＢ５１１の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりカルボプラチン耐性Ａ５４９細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＴＢ５１１を１μＭ、２μＭおよび４μＭの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
【0181】
その結果、Ａ５４９耐性細胞単独またはＡ５４９＋ＣＡＦ細胞のみでスフェロイドを形成したときよりも、Ａ５４９＋ＣＡＦ＋ＴＨＰ－１細胞でスフェロイドを形成したときのスフェロイドの大きさが著しく増加することが示され、ＴＢ５１１を処理していない群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、スフェロイドの大きさがＴＢ５１１濃度依存的に著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２７）。また、薬物を処理してから１０日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＴＢ５１１無処理群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、ＴＨＰ－１細胞の数が濃度依存的に著しく減少しており、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も２μＭから有意的に減少したことが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２８）。
【0182】
９－２．抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）耐性前立腺癌に対するＴＢ５１１の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりドセタキセル耐性ＰＣ３前立腺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＴＢ５１１を１μＭ、２μＭまたは４μＭの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）耐性前立腺癌に対するＴＢ５１１の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりドセタキセル耐性ＰＣ３前立腺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＴＢ５１１を１μＭ、２μＭまたは４μＭの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
【0183】
その結果、ＰＣ３耐性細胞単独またはＰＣ３＋ＣＡＦ細胞のみでスフェロイドを形成したときよりも、ＰＣ３＋ＣＡＦ＋ＴＨＰ－１細胞でスフェロイドを形成したとき、その大きさが著しく増加しており、ＴＢ５１１を処理していない群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、スフェロイドの大きさがＴＢ５１１濃度依存的に著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２９）。また、薬物を処理してから１０日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＴＢ５１１無処理群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、ＴＨＰ－１細胞の数が濃度依存的に著しく減少しており、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も減少する傾向を示した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３０）。
【0184】
実施例１０．３Ｄ癌オルガノイドにおけるＡＤＣの効能の確認
１０－１．乳癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
乳癌に対するＩＴＧＢ２結合ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、本発明のＡＤＣであるＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを１０μｇおよび２０μｇの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
１０－１．乳癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
乳癌に対するＩＴＧＢ２結合ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、本発明のＡＤＣであるＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを１０μｇおよび２０μｇの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
【0185】
その結果、ＡＤＣを処理していない群は、時間が経つにつれて乳癌スフェロイドの大きさがだんだん大きくなったが、ＡＤＣを処理した群では、８日目にスフェロイドの大きさが減少することが示された（図３１および３２）。また、ＡＤＣを処理していない群において、ＧＦＰ陽性ＴＨＰ－１細胞が強く増加したが、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥ処理群では、濃度依存的に減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３１および３２）。
【0186】
１０－２．肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
肺癌に対するＡＤＣの効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりＡ５４９ヒト肺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、本発明のＡＤＣであるＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを１０μｇの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
肺癌に対するＡＤＣの効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりＡ５４９ヒト肺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、本発明のＡＤＣであるＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを１０μｇの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
【0187】
その結果、ＡＤＣを処理していない群は、時間が経つにつれてスフェロイドの大きさがだんだん大きくなるのに対し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群では、８日目にスフェロイドの大きさが減少することが示された（図３３）。また、薬物を処理してから８日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＡＤＣを処理していない群において、ＴＨＰ－１細胞が強く増加するのに対し、ＡＤＣ処理群では、著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３４）。
【0188】
実施例１１．抗癌剤耐性３Ｄ癌オルガノイドにおけるＡＤＣの効能の確認
１１－１．抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
カルボプラチン耐性肺癌に対するＡＤＣの効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりカルボプラチン耐性Ａ５４９細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥをそれぞれ１０μｇの濃度で処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
１１－１．抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
カルボプラチン耐性肺癌に対するＡＤＣの効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりカルボプラチン耐性Ａ５４９細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥをそれぞれ１０μｇの濃度で処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
【0189】
その結果、ＡＤＣを処理していない群は、時間が経つにつれてスフェロイドの大きさがだんだん大きくなるのに対し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群では、８日目にスフェロイドの大きさが減少することが示された（図３５）。また、薬物を処理してから８日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＡＤＣを処理していない群に比べて、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群において、ＴＨＰ－１細胞の数が有意に減少し、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３６）。
【0190】
１１－２．抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
ドセタキセル耐性前立腺癌に対するＡＤＣの効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりドセタキセル耐性ＰＣ３前立腺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥをそれぞれ１０μｇの濃度で処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
ドセタキセル耐性前立腺癌に対するＡＤＣの効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりドセタキセル耐性ＰＣ３前立腺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥをそれぞれ１０μｇの濃度で処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
【0191】
その結果、ＡＤＣを処理していない群は、時間が経つにつれてスフェロイドの大きさがだんだん大きくなるのに対し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群では、８日目にスフェロイドの大きさが減少することが示された（図３７）。また、薬物を処理してから８日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＡＤＣを処理していない群では、蛍光が強く増加するのに対し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群では、ＴＨＰ－１細胞の数が著しく減少しており、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３８）。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【配列表】
【国際調査報告】