特表 2025-518548 ＨＥＲ２－ＧＳＴ－ＳＮ－３８複合体およびそれを含む増殖性疾患の予防または治療用医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-06-17

(54)【発明の名称】ＨＥＲ２－ＧＳＴ－ＳＮ－３８複合体およびそれを含む増殖性疾患の予防または治療用医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20250610BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250610BHJP

   A61K 38/45 20060101ALI20250610BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20250610BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20250610BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250610BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20250610BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20250610BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20250610BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20250610BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250610BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20250610BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250610BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

A61K39/395 D ZNA

A61K39/395 N

A61K38/45

A61K31/4745

A61K9/14

A61P35/00

A61K47/68

C07K16/28

C07K14/47

C12N9/10

C12N15/62 Z

C12N15/54

C12N15/13

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024568557

(86)(22)【出願日】2023-05-17

(85)【翻訳文提出日】2024-11-15

(86)【国際出願番号】 KR2023006685

(87)【国際公開番号】W WO2023224385

(87)【国際公開日】2023-11-23

(31)【優先権主張番号】10-2022-0061077

(32)【優先日】2022-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2023-0063650

(32)【優先日】2023-05-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524422731

【氏名又は名称】ケーエムディー バイオ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＫＭＤ ＢＩＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100174001

【弁理士】

【氏名又は名称】結城 仁美

(72)【発明者】

【氏名】キム ミュンフン

(72)【発明者】

【氏名】ロ ジョンクク

(72)【発明者】

【氏名】ビュン スーンミン

(72)【発明者】

【氏名】チョイ ヒョジン

(72)【発明者】

【氏名】リー キョンヒー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA07

4C084DC25

4C084MA41

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB26

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA21

4C085CC22

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB22

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

グルタチオン－Ｓ－転移酵素および標的細胞または標的タンパク質結合能を有するタンパク質を含む融合タンパク質およびその薬物複合体および医薬組成物としての使用に関するもので、一態様による融合タンパク質およびそれを含む薬物複合体によれば、生体内残存時間を持続させることができるだけでなく、標的細胞への標的能が向上し、標的とする細胞に効果的に送達できるので、標的治療薬として有用に使用できる効果がある。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）分子、
ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、
前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および
前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン分子を含む薬物複合体。

【請求項2】

前記７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン分子は下記式で表される、請求項１に記載の薬物複合体。

【化1】

【請求項3】

前記アフィボディは、配列番号１４のＨＥＲ２特異的アフィボディである、請求項１に記載の薬物複合体。

【請求項4】

前記リンカーは、プロテアーゼが結合しない、請求項１に記載の薬物複合体。

【請求項5】

前記７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン分子は、ナノ粒子に担持されているものである、請求項１に記載の薬物複合体。

【請求項6】

前記ナノ粒子は、多孔質シリカナノ粒子（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ， ＭＳＮ）、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、核酸金属有機構造体ナノ粒子（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－Ｍｅｔａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）および高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）からなる群から選択されるいずれかである、請求項５に記載の薬物複合体。

【請求項7】

グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）分子、
ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、
前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および
前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン分子を含む薬物複合体を有効成分として含む増殖性疾患の予防または治療用医薬組成物。

【請求項8】

前記７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン分子は、下記式で表される、請求項７に記載の医薬組成物。

【化2】

【請求項9】

前記増殖性疾患は、がん、良性新生物、および血管新生からなる群から選択されるいずれかである、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記がんは、乳がん、大腸がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、脳がん、皮膚がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、直腸がん、甲状腺がん、肝がん、子宮頸がん、直腸がん、肛門がん、尿道がん、卵巣がん、食道がんおよび膵臓がんからなる群から選択されるいずれかである、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンは、ナノ粒子に担持されているものである、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記ナノ粒子は、多孔質シリカナノ粒子（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ， ＭＳＮ）、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、核酸金属有機構造体ナノ粒子（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－Ｍｅｔａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）および高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）からなる群から選択されるいずれかである、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

有効量の請求項１の複合体を、それを必要とする個体に投与するステップを含む増殖性疾患を予防または治療する方法。

【請求項14】

増殖性疾患の予防または治療用医薬製剤の製造のための請求項１の複合体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

グルタチオン－Ｓ－転移酵素および標的細胞または標的タンパク質結合能を有するタンパク質を含む融合タンパク質およびその薬物送達体、薬物複合体および医薬組成物としての使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ナノ粒子は生物学的分布能に優れ、薬物放出の程度を調節することができ、イメージング装置や標的治療薬などの分野で有用なツールとして使用されている。典型的には、ナノ粒子は、２００ｎｍの直径を有する場合、腫瘍の周りの血管の近くに流出する可能性があり、腫瘍の周囲ではリンパ管が形成されず、圧力が低いため、流出したナノ粒子は腫瘍組織内に残り続けることができることが知られている。この過程はＥＰＲ効果（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）と呼ばれ、これにより薬物送達体の透過性および残存性を改善することができる。

【0003】

現在市販されているナノ粒子として、アブラキサン（Ａｂｒａｘａｎｅ）およびドキシル（Ｄｏｘｉｌ）が代表的な例である。しかしながら、これらは腫瘍ごとに血管の透過性が様々であり、ナノ粒子を静脈投与したとき、単核貪食細胞系（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＭＰＳ）がこれを除去するために肝臓や脾臓などの細網内皮器官（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｏｒｇａｎ）に急速に蓄積するという制限があり得る。これにより、ナノ粒子を適用する標的治療薬は治療効果が低減され得、ナノ粒子の毒性による副作用を示し得る。

【0004】

このような欠点を克服するために、ポリエチレングリコール化（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ｙｌａｔｉｏｎ， ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）して、ナノ粒子を囲む方法が開発された。このような方法を使用した場合、生体内循環器でナノ粒子が循環できる時間が長くなるという利点があるが、逆に標的細胞に流入する可能性が減少し、非特異的な結合を通じて標的細胞以外の細胞を標的にすることがあり、これも治療効率が低下する可能性がある。

【0005】

ナノ粒子を薬物送達体として使用する際に、薬物送達のための標的能と共にＥＰＲ効果を促進するために、ナノ粒子の構造的変化を誘導しようとする戦略が提示されている。具体的には、ナノ粒子の表面にがん細胞で過剰発現する受容体と結合することができる抗体、タンパク質またはペプチドでコーティングするなどの構造的変化を誘導して薬物送達体の標的能を向上させようとする試みが続けられた。しかしながら、これらの方法によっても腫瘍標的効率が効果的に増加せず、むしろＭＰＳを介した体内免疫反応によりナノ粒子をより迅速に除去できるターゲットリガンドを提供することになり、全体的な腫瘍治療効果の面で有意な治療効果を示さないという限界がある。

【0006】

理論的には、生理的環境に暴露されたとき、エントロピーに応じた水分子の配置、パーティクル表面の電荷補償（ｃｈａｒｇｅ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）や疎水性部分が露出する点などが複合的に作用して表面エネルギーを下げる方向にナノ粒子の表面は自然に他の生物分子によって囲まれる。このとき、ナノ粒子の表面の表面に様々な生物分子が非特異的に吸着されるが、このような形態をタンパク質コロナ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｏｎａ）という。タンパク質コロナは他の分子に囲まれ、本来の分子的特徴が変化し、標的細胞または器官への標的能とナノ粒子が示す様々な生物学的機能が遮断される。そのため、ナノ粒子を標的治療薬として臨床レベルで適用できるようにタンパク質コロナを調節しようとする研究が進められている。

【0007】

したがって、ナノ粒子に基づく標的治療薬を製造する過程で、ナノ粒子の表面にタンパク質コロナを先に形成してそれを調節する方法が開発された。このために、タンパク質コロナによる標的能の遮断を避けるために、ナノ粒子の表面を双性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）、ＰＥＧ、炭水化物残基などに変更して血清中のタンパク質との相互作用を最小限に抑える方法が知られている。加えて、ナノ粒子をｄｙｓｏｐｓｏｎｉｃタンパク質で事前にコーティングして、血漿中の所望のタンパク質の循環を通じてタンパク質コロナを調節することができる。これにより、タンパク質コロナで事前にコーティングされたナノ粒子は、コロイド状態の安定性が増加し、ＭＰＳによって除去されずに血液中で循環時間を持続することができる効果を有する。しかしながら、このような方法によっても標的への標的能を制限する可能性があり、事前のコーティングに使用されるタンパク質とナノ粒子との間の生物学的相互作用による生物化学的作用が知られていないという点で臨床への適用に制限がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

一態様は、グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）分子、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンを含む薬物複合体を提供する。

【0009】

他の態様は、グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）分子、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンを含む増殖性疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することである。

【0010】

他の態様は、グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）分子、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンを含む薬物複合体を有効量でそれを必要とする個体に投与するステップを含む増殖性疾患を予防または治療する方法を提供することである。

【0011】

他の態様は、増殖性疾患の予防または治療用医薬製剤の製造のためのグルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）分子、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンを含む薬物複合体の使用を提供することである。

【発明を解決するための手段】

【0012】

一態様は、グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）分子、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンを含む薬物複合体を提供することである。

【0013】

本明細書で使用される「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、当技術分野で知られている用語として抗原性部位に対して指向される特異的なタンパク質分子を意味する。本明細書の目的のために、抗体は、標的細胞または標的細胞で発現する受容体に対して特異的に結合する抗体を意味し、このような抗体は、各遺伝子を従来の方法に従って発現ベクターにクローニングし、前記マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質を得て、得られたタンパク質から従来の方法で製造することができる。これには、前記タンパク質で作られる部分ペプチドも含まれ、本発明の部分ペプチドとしては、少なくとも７つのアミノ酸、好ましくは９つのアミノ酸、さらに好ましくは１２個以上のアミノ酸を含む。本明細書の抗体の形態は特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、または抗原結合性を有するものであればその一部である抗原結合断片も本明細書の抗体に含まれ、全ての免疫グロブリン抗体が含めることができる。

【0014】

本明細書で使用される「アフィボディ分子（ａｆｆｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、特定の標的タンパク質（受容体）に結合できる、抗体模倣体を意味し得る。一般に、アフィボディ分子は、２０～１５０のアミノ酸残基から構成され、２～１０個のアルファヘリックスからなるものであり得る。より詳細には、前記アフィボディ分子は、抗ＥｒｂＢアフィボディ分子（ａｂ３１８８９）、ＨＥＲ２特異的アフィボディ分子（ＺＨＥＲ２：３４２）、抗ＥＧＦＲアフィボディ分子（ＺＥＧＦＲ：２３７７）などを含み得る。さらに、これに限定されず、細胞の特定の受容体または標的タンパク質を認識できるアフィボディ分子をすべて含む。前記アフィボディ分子が認識できる標的受容体または標的タンパク質の例は、アミロイドβペプチド、シヌクレイン（例えば、α－シヌクレイン）、アポリポプロテイン（例えば、アポリポプロテインＡ１）、補体因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）（例えば、Ｃ５）、炭酸脱水酵素（Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）（例えば、ＣＡＩＸ）、インターロイキン－２受容体α鎖（ＩＬ２ＲＡ；ＣＤ２５）、細胞表面のＣＤ抗原（例えば、ＣＤ２８）、またはｃ－Ｊｕｎ、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、フィブリノーゲン、ＧＰ１２０、Ｈ－Ｒａｓ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＩＡＰＰ（Ｈｕｍａｎ ｉｓｌｅｔ ａｍｙｌｏｉｄｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、ＩｇＥ、ＩｇＭ、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１７）、インスリン、ブドウ球菌プロテインＡドメイン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｄｏｍａｉｎ）、Ｒａｆ－１、ＬＯＶドメイン（Ｌｉｇｈｔ－ｏｘｙｇｅｎ－ｖｏｌｔａｇｅ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、またはＲＳＶ Ｇタンパク質であり得る。前記アフィボディに関する情報は、Ｓｔｅｆａｎ Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｆｆｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｕｇｕｓｔ ２０１７， Ｖｏｌ ３５， Ｎｏ ８に記載されており、前記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0015】

本明細書で使用される「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」という用語は、２つ以上の化学構造を連結する分子を意味する。具体的には、前記リンカーは、１～４００個、１～２００個、または２～２００個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであり得る。前記ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含み得、ＴｈｒおよびＡｌａなどの中性アミノ酸も含まれ得る。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は当技術分野で知られている。さらに、機能的部分間の適切な分離を達成するために、または本質的な内部部分（ｉｎｔｅｒ－ｍｏｉｅｔｙ）の相互作用を維持するためのリンカーの最適化を考慮してコピー数「ｎ」を調節することができる。

【0016】

一実施形態では、前記ペプチドリンカーはプロテアーゼ耐性を有するリンカーであり得る。耐性があるということは、具体的には、プロテアーゼによって結合せず、および／または、プロテアーゼによって切断されず、および／または、プロテアーゼと接触すると安定に維持および／またはその活性を維持することを意味する。

【0017】

一実施形態では、前記ペプチドリンカーは、Ｇ、Ｓ、および／またはＴ残基を含む柔軟性リンカーであり得る。当技術分野では他の可撓性リンカーが知られており、例えば水溶性を向上させるために極性アミノ酸残基を追加するだけでなく、柔軟性を維持するためにＴおよびＡなどのアミノ酸残基を追加したＧおよびＳリンカーがあり得る。具体的には、前記リンカーは、（ＧｐＳｓ）ｎおよび（ＳｐＧｓ）ｎから選択される一般式を有し得、この場合、独立して、ｐは１～１０の整数であり、ｓは０～１０の０または整数であり、ｐ＋ｓは２０以下の整数であり、およびｎは１～２０の整数である。リンカーの例は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２）、（ＳＧＧＧＧ）ｎ（配列番号３）、（ＳＲＳＳＧ）ｎ（配列番号４）、（ＳＧＳＳＣ）ｎ（配列番号５）、（ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ）ｎ（配列番号６）、（ＲＰＰＰＰＣ）ｎ（配列番号７）、（ＳＳＰＰＰＰＣ）ｎ（配列番号８）、（ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ）ｎ（配列番号９）、（ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ）ｎ（配列番号１０）、（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ）ｎ（配列番号１１）、または（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ）ｎ（配列番号１２）であり、前記ｎは１～２０、または１～１０の整数である。

【0018】

他の態様は、前記ＧＳＴ分子とＨＥＲ２に結合能を有する抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体分子が結合された融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。

【0019】

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、一本鎖または二本鎖の形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの高分子を意味する。ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびこれから転写されるＲＮＡ配列を包含し、特に明記しない限り、天然のポリヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が修飾されたその類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。一実施形態では、前記ポリヌクレオチドは短鎖ポリヌクレオチドである。

【0020】

他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0021】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、適切な宿主細胞で目的タンパク質を発現することができるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された調節要素を含む遺伝子構築物を指す。一実施形態によるベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、および／またはエンハンサーなどの発現調節要素を含み得、ベクターのプロモーターは構成的または誘導性であり得る。また、前記ベクターは、宿主細胞内で前記融合タンパク質を安定的に発現させることができる、発現用ベクターであり得る。前記発現ベクターは、当技術分野において植物、動物または微生物において外来タンパク質を発現するために使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当技術分野で知られている様々な方法によって構築することができる。例えば、前記ベクターは、前記ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能なベクターである場合、複製起点を含み得る。さらに、ベクターは自己複製または宿主ＤＮＡに導入することができ、前記ベクターはプラスミド、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択されるものであり得る。

【0022】

前記ベクターは、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞で作動可能なプロモーターを含む。一実施形態による適切なプロモーターは、哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターおよび哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーター、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトＩＬ－２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ－４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびサバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含み得る。

【0023】

さらに、前記ベクターにおいて、上述した融合タンパク質はプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合部位のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または翻訳を調節する。

【0024】

他の態様は、前記融合タンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0025】

前記細胞、例えば、真核細胞は、酵母、カビ、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）、植物、高等植物および昆虫、または両生類の細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、およびＣＯＳ－１などの哺乳動物の細胞である得、例えば、当技術分野で一般的に使用されている培養細胞（インビトロ）、移植細胞（ｇｒａｆｔ ｃｅｌｌ）および一次細胞培養（インビトロおよびエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ））、およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）細胞、および／またはヒトを含む哺乳動物の細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）であり得る。さらに、前記生物は酵母、カビ、原生動物、植物、高等植物および昆虫、両生類、または哺乳動物であり得る。さらに、前記細胞は動物細胞または植物細胞であり得る。

【0026】

薬物送達体を使用して個体に送達できる薬学的活性成分の種類は、抗がん剤、造影剤（染料）、ホルモン剤、抗ホルモン剤、ビタミン剤、カルシウム剤、無機製剤、糖類剤、有機酸製剤、タンパク質アミノ酸製剤、解毒剤、酵素製剤、代謝性製剤、糖尿病併用剤、組織再生薬、クロロフィル製剤、色素製剤、腫瘍薬、腫瘍治療薬、放射性医薬品、組織細胞診断薬、組織細胞治療薬、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、複合抗生物質製剤、化学療法剤、ワクチン、毒素、トキソイド、抗毒素、レプトスピラ血清、血液製剤、生物製剤、鎮痛剤、免疫原性分子、抗ヒスタミン剤、アレルギー用薬、非特異性免疫原製剤、麻酔薬、覚醒剤、精神神経用剤、低分子化合物、核酸、アプタマー、アンチセンス核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡなどを含み得る。

【0027】

ＳＮ－３８は抗がん剤であり得、その薬学的に許容される塩を含み得る。「ＳＮ－３８（７－ｅｔｈｙｌ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）」はイリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（別名「ＣＰＴ－１１」とも呼ばれる）の活性成分であり、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）活性を阻害することにより抗腫瘍作用を示す。イリノテカンよりも生体外で各種がん細胞に抗して１，０００倍以上まで強力な細胞毒性活性を示すことができる。

【0028】

本発明において、グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）との結合は、ＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）によるものであり得る。すなわち、前記ＳＮ－３８は、ＧＳＨが結合したＳＮ－３８であり得る。ＧＳＨはグルタチオン－Ｓ－転移酵素の結合部位として機能し、ＳＮ－３８とグルタチオン－Ｓ－転移酵素を連結することができる。

【0029】

前記ＳＮ－３８分子は、ＳＮ－３８が担持されているか、またはＳＮ－３８を担持することができるナノ粒子であり得る。ナノ粒子は、従来の技術に従って薬物送達体として適用できるナノ粒子であれば制限なく適用することができる。具体的には、メソポーラスシリカナノ粒子（（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ， ＭＳＮ）、金ナノ粒子（ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、核酸金属有機構造体ナノ粒子（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－Ｍｅｔａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）および高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）からなる群から選択されるいずれかであり得る。また、前記ナノ粒子にＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）が結合したものであってもよい。これにより、前記ナノ粒子は、ＧＳＴを含む融合タンパク質と結合することができる。

【0030】

一実施形態では、前記ＳＮ－３８分子は下記式１で表される。

【化1】

【0031】

他の態様は、グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）分子、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンを含む増殖性疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することである。

【0032】

他の態様は、グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）分子、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンを含む薬物複合体を有効量でそれを必要とする個体に投与するステップを含む増殖性疾患を予防または治療する方法を提供することである。

【0033】

他の態様は、増殖性疾患の予防または治療用医薬製剤の製造のためのグルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）分子、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に結合能を有する抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）分子、前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素と前記抗体、アフィボディまたは二重特異性抗体を連結するリンカー、および前記グルタチオン－Ｓ－転移酵素とＧＳＨ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）分子によって結合された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンを含む薬物複合体の使用を提供することである。

【0034】

本明細書で使用される「増殖性疾患」という用語は、細胞の増大による異常な拡張によって引き起こされる疾患を指す。増殖性疾患は、以下に関連し得る：１）正常な休止期細胞の病理学的増殖、２）正常位置からの細胞の病理学的移動（例えば、新生物細胞の転移）、３）マトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびエラスターゼ）などのタンパク質分解酵素の病理学的発現、４）増殖性網膜症や腫瘍転移などの病理学的血管新生、または５）宿主免疫監視および新生物細胞除去の回避。

【0035】

前記増殖性疾患には、がん（すなわち、悪性新生物）、良性新生物、および血管新生が含まれる。

【0036】

一実施形態では、前記がんは血液がんまたは固形がんであり得る。

【0037】

前記血液がんは、急性骨髄性白血病（Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ性白血病（Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、多発性骨髄腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ）およびリンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａ）からなる群から選択されるものであり得るが、これに限定されるものではない。

【0038】

前記固形がんは乳がん、大腸がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、脳がん、皮膚がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がん、腎がん、直腸がん、甲状腺がん、肝がん、子宮頸がん、直腸がん、肛門がん、尿道がん、卵巣がん、食道がん、および膵臓がんからなる群から選択されるものであり得るが、これに限定されるものではない。さらに、前記がんは、抗がん剤に対する耐性（例えば、多剤耐性）を有する胃がん、乳がん、肺がん、肝がん、食道がんおよび前立腺がんからなる群から選択されるいずれか１つ以上であり得る。また、前記がんは、最初に発生した部位から分離されたがん細胞が血液、リンパ管などを介して他の部位に転移して増殖する転移がんであり得る。

【0039】

一実施形態では、前記良性新生物は、腺腫、線維腫、血管腫、結節性硬化症、および脂肪腫を含み得る。

【0040】

本明細書で使用される「治療薬」または「医薬組成物」という用語は、対象への投与時にいくつかの有利な効果を与える分子または化合物を指す。有利な効果は診断的決定を可能にすること、疾患、症状、障害または病態の改善、疾患、症状、障害または病の発症の減少または予防、および一般に、疾患、症状、障害または病態の対応を含む。

【0041】

本明細書で使用される「治療」または「治療する」または「緩和する」または「改善する」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、治療上の利益および／または予防上の利益を含むが、これらに限定されない有利なまたは所望の結果を得る方法を指す。治療上の利益は、治療下の１つ以上の疾患、病または症状の任意の治療的に有意な改善またはその効果を意味する。予防上の利益において、組成物は、特定の疾患、病または症状が発生する危険性がある対象に、または疾患、病または症状がまだ現れていない場合でも、疾患の１つ以上の生理学的症状を報告する対象に投与することができる。

【0042】

本明細書で使用される「有効量」または「治療的有効量」という用語は、有利なまたは所望の結果をもたらすのに十分な作用剤の量を指す。治療的有効量は、治療される対象および病態、対象の体重および年齢、病態の重症度、投与様式などのうち１つ以上によって変わり得、これは当業者によって容易に決定されることができる。さらに、前記用語は、本明細書に記載の映像化方法のいずれかによる検出のための画像を提供する容量に適用される。特定の用量は、選択された特定の作用剤、それに続く投与療法、それが他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与のタイミング、映像化される組織、およびそれを運ぶ体の送達システムの１つ以上によって変わることがあり得る。

【0043】

前記医薬組成物は臨床投与時に非経口投与することができ、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。非経口投与は、直腸、静脈、腹膜、筋肉、動脈、経皮、鼻腔（Ｎａｓａｌ）、吸入、眼球および皮下などの経口以外の投与経路を介した投与を意味することができる。本発明の前記医薬組成物を医薬品として使用する場合、さらに同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。

【0044】

前記医薬組成物を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用エステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。

【0045】

さらに、前記医薬組成物は、生理食塩水または有機溶媒などの薬剤として許容されるいくつかの送達体（Ｃａｒｒｉｅｒ）と組み合わせて使用することができ、安定性または吸収性を高めるためにグルコース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）またはグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）などの抗酸化剤（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、キレート剤（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、低分子タンパク質または他の安定剤（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）を薬剤として使用することができる。

【0046】

前記医薬組成物の有効用量は０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇであり、１日１回～３回投与することができる。

【0047】

本明細書で使用される「対象」、「個体」および「患者」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書で互換的に使用される。哺乳動物には、ネズミ科、猿、ヒト、農場動物、スポーツ動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されるものではない。生体内で得られた、または試験管内で培養された生物学的エンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）の組織、細胞、およびそれらの子孫も含まれる。

【0048】

他の態様は、以下の構成を含むタンパク質コロナ外層（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｏｎａ ｓｈｉｅｌｄ）を有するナノ粒子（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｏｎａ ｓｈｉｅｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ， ＰＣＳＮ）を提供する。

【0049】

ａ）薬物を担持できるナノ粒子、ｂ）ナノ粒子の表面に結合したグルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＧＳＴ）を含む融合タンパク質。

【0050】

また、本発明は、前記ナノ粒子の内部に薬物が担持された、タンパク質コロナ外層を有するナノ粒子薬物送達体または薬物複合体を提供する。

【0051】

さらに、本発明は、以下のｉ）～ｉｉｉ）ステップを含む、タンパク質コロナ外層を有するナノ粒子薬物送達体または薬物複合体の製造方法を提供する。

【0052】

ｉ）ナノ粒子表面にリンカー（例えば、ＧＳＨ）を結合させるステップ、ｉｉ）前記ステップｉ）において、リンカーと結合したナノ粒子の内部または表面に薬物を担持させるステップ、ｉｉｉ）前記ステップｉｉ）において薬物を担持したナノ粒子表面にＧＳＴ融合タンパク質をコーティングしてタンパク質コロナ外層（ＰＣＳ）を形成させるステップ。

【0053】

前記タンパク質コロナ外層（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｏｎａ ｓｈｉｅｌｄ）を有するナノ粒子は、融合タンパク質で表面が事前にコーティングされたタンパク質コロナ外層を先に生成したため、体内環境で血清タンパク質によって囲まれたコロナ層が形成されず、大食細胞の免疫反応を回避することができ、ステルス効果（ｓｔｅａｌｔｈ ｅｆｆｅｃｔ）を有意に有することができる。したがって、前記タンパク質コロナ外層を有するナノ粒子（ＰＣＳＮ）は、生体内の残存時間を持続させることができるだけでなく、標的細胞への標的能が向上し、標的とする細胞に効果的に送達することができるので、標的治療薬として有用に使用することができる。

【発明の効果】

【0054】

一態様による融合タンパク質およびそれを含む薬物送達体または薬物複合体によれば、生体内残存時間を持続させることができるだけでなく、標的細胞への標的能が向上し、標的とする細胞に効果的に送達することができるので、標的治療薬として有用に使用することができる効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1】ＧＳＴ－ＨＥＲ２ ＡｆｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示すグラフである。

【図2】ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ３、胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７、ＨＥＲ２陰性乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ２３１のＨＥＲ２発現量を確認した画像である。

【図3】ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ３、胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７、ＭＫＮ４５、ＨＥＲ２陰性乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ２３１にＫＭＤ１１１を処理した後の細胞生存率を示すグラフである。

【図4】胃がん細胞株であるＭＫＮ４５を移植したマウス動物モデルにおいて、ＫＭＤ１１１投与量による体重変化を示す結果グラフである。

【図5】胃がん細胞株であるＭＫＮ４５を移植したマウス動物モデルにおいて、ＫＭＤ１１１投与量による抗腫瘍効果を確認した結果のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0056】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施形態を提示する。しかしながら、以下の実施形態は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、以下の実施形態によって本発明の内容が限定されるものではない。実施形態は様々な変換を加えることができるが、実施形態は以下に開示される実施形態に限定されず、様々な形態で実施することができる。

【0057】

実施形態１．アフィボディおよびグルタチオン－Ｓ－転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＧＳＴ）融合タンパク質の調製

【0058】

本発明では、薬物送達体として使用するためのナノ粒子の表面にタンパク質コロナの外層を形成させ、生体内環境でも安定性および標的能が向上した薬物送達体を製造しようとした。この目的のために、まずタンパク質コロナ外層を構成することができる融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を調製した。融合タンパク質は、がん細胞表面の受容体に特異的に結合できるアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ、Ａｆｂ）とＧＳＴが結合した形態となるように発現した。

【0059】

具体的には、本発明では、ＡｆｂとしてＨＥＲ２に特異的に結合するＨＥＲ２ Ａｆｂを使用した。ＧＳＴタンパク質は配列番号１３のヒトＧＳＴＡ１（Ｐ０８２６３）を導入し、ＧＳＴのＣ末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）末端にリンカー配列ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１）を結合させた後、配列番号１４のＨＥＲ２－アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＺＨＥＲ２：３４２）を導入した。配列番号１５のＨＥＲ２－ａｆｆｉｂｏｄｙ－ＧＳＴ融合タンパク質のアミノ酸配列に基づいて大腸菌で発現を誘導するためのコドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を行った後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ遺伝子合成（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により暗号化された遺伝子（配列番号１６）を合成し、タンパク質発現プラスミドであるｐＥＴ１５１／Ｄ－ＴＯＰＯに挿入した。

【0060】

前記構築したプラスミドを大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株に挿入（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）して培養した。融合タンパク質は、培養液にＩＰＴＧを処理して発現を誘導し、３０℃で１６時間培養し、細胞を遠心分離して得た。得られた培養細胞を５０ｍＭ ＰＢＳに懸濁した後、高圧細胞破砕機を用いて細胞を破砕した。破砕後、遠心分離して融合タンパク質を含む上清を分離回収し、次いでＦＰＬＣ装置を用いてＮＩ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によりＨＥＲ２－ａｆｆｉｂｏｄｙ－ＧＳＴを精製した。精製されたタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によってタンパク質の純度および分子量を分析した。

【0061】

図１は、ＨＥＲ２－ａｆｆｉｂｏｄｙ－ＧＳＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示すグラフである。

【0062】

表１は、ＨＥＲ２－ａｆｆｉｂｏｄｙ－ＧＳＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によりタンパク質純度を定量的に数値化した結果を示す。

【0063】

【表1】

【0064】

図１および表１に示すように、純度９９．５％のＨＥＲ２－ａｆｆｉｂｏｄｙ－ＧＳＴタンパク質を精製した。

【0065】

実施形態２．タンパク質コロナ外層（ＰＣＳ）を有する薬物送達体の調製

【0066】

＜２－１＞多孔質シリカナノ粒子の準備

【0067】

薬物送達体の基本構造として、多孔質シリカナノ粒子（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ＭＳＮ）を用意した。

【0068】

まず、直径５０ｎｍ以下のＭＳＮを準備するために、１．５３ｇのＣＴＡＢおよび０．３ｇの水酸化テトラエチルアンモニウム溶液（Ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｏｄｉｏｘｉｄｅ、ＴＥＡＨ）を１００ｇの脱イオン水に加えた後、８０℃で１時間攪拌してこれを溶解した。ＣＴＡＢおよびＴＥＡＨが完全に溶解したら、１４．４５ｇのＴＥＯＳを加え、２時間８００ｒｐｍでさらに撹拌した。撹拌液が白色の固相を示す場合、それを真空フィルターで濾過し、次いで脱イオン水で洗浄し、７０℃の空気中で乾燥して乾燥物を得た。得られた乾燥物をメノウ乳鉢（ａｇａｔｅ ｍｏｒｔａｒ）で均質化した後、５５０℃で５時間か焼（ｃａｌｃｉｎｅ）して最終的に多孔質シリカナノ粒子（ＭＳＮ）を得た。

【0069】

＜２－２＞ＧＳＨを表面結合させたナノ粒子の製造

【0070】

本発明のタンパク質コロナ外層を有するナノ粒子を製造するための過程として、表面にグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ， ＧＳＨ）をチオール－エンクリックケミストリー（ｔｈｉｏｌ－ｅｎｅ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で結合させたナノ粒子（ＧＳＨ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ， ＭＭＳＮ）を調製した。

【0071】

上記実施形態＜２－１＞で調製したＭＳＮ１００ｍｇおよび１ｍｌの３－（トリメトキシシリル）アクリル酸プロピル（３－（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）を１８ｍｌのトルエンに混合した。混合された混合液を６０℃で２４時間撹拌して反応させた。反応後、エタノールと脱イオン水で反応したＭＳＮを洗浄し、次いで１６ｍｌのＤＭＦに加えてＭＳＮを用意した。外層を形成するためのＧＳＨは、１００ｍｇのＧＳＨを２ｍｌの脱イオン水に溶解して用意した。次いで、前記用意したＭＳＮ含有溶液とＧＳＨ水溶液とを混合し、４０μｌのピリジンを加えてボルテックスして撹拌した。撹拌後、混合液を室温で７２時間放置して反応を誘導した。反応終了後、ナノ粒子をエタノールで３回洗浄し、室温で真空乾燥して、ＧＳＨが表面に結合したナノ粒子（ＭＭＳＮ）を最終的に得た。

【0072】

＜２－３＞薬物を担持したナノ粒子の製造

【0073】

本発明において薬物送達体として使用しようとする、タンパク質コロナ外層を有するナノ粒子（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｏｎａ ｓｈｉｅｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ＰＣＳＮ）を製造するために、タンパク質コロナ外層としてＧＳＴ－Ａｆｂを適用したナノ粒子を製造した。ＭＳＮは内部および表面に化学官能基を介して物質を担持できる送達体として使用されるため、本発明ではＭＳＮ表面にＧＳＨを結合してＭＭＳＮを製造し、これにＧＳＴを介して結合されたタンパク質コロナ外層を形成してＰＣＳＮを製造した。

【0074】

具体的には、上記実施形態＜２－２＞で製造したＧＳＨ－ＭＳＮに薬物を担持するために５ｍｇのＧＳＨ－ＭＳＮを１ｍｌのＤＭＳＯに分散させた後、ＳＮ－３８が溶けているＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌにゆっくり加え、室温で１２時間撹拌した。撹拌後、ＳＮ－３８を担持したＧＳＨ－ＳＮ－３８ ＭＳＮを遠心分離して回収し、ＤＩ水で３回洗浄後、真空乾燥した。薬物が担持された割合は下記式で計算した。
［数１］
薬物担持容量（％）＝ＧＳＨ－ＭＳＮ中の薬物量／ＧＳＨ－ＭＳＮの量×１００

【0075】

次に、タンパク質コロナ外層を有するナノ粒子（ＰＣＳＮ）を調製するために、ＨＥＲ２－ａｆｆｉｂｏｄｙ－ＧＳＴタンパク質１ｍｇを用意し、２ｍｌのＰＢＳに溶解して用意した。ＳＮ－３８を担持したＧＳＨ－ＳＮ－３８ ＭＳＮ１ｍｇを３ｍｌのＰＢＳに分散させた後、用意したタンパク質溶液を４℃で撹拌しながら一滴ずつゆっくり加えて混合し、２時間さらに撹拌した。攪拌後遠心分離して未結合タンパク質を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、最終的にＨＥＲ２－ａｆｆｉｂｏｄｙ－ＧＳＴ－ＳＮ－３８ ＭＳＮであるＰＣＳＮ（ＫＭＤ１１１）を得、ＰＢＳに保存しながら下記の有効性評価実験に使用した。

【0076】

実験例１．各細胞におけるＨＥＲ２発現量の確認

【0077】

上記実施形態２で調製したＫＭＤ１１１の細胞毒性を確認する前に、まず各細胞株のＨＥＲ２発現量を確認した。ＨＥＲ２受容体はＥＲＢＢ／ＨＥＲ成長因子群（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属する細胞膜受容体であり、ＨＥＲ２遺伝子は周知の原発がん遺伝子である。ＫＭＤ１１１候補物質はＨＥＲ２を特異的に標的とするＡｆｆｉｂｏｄｙをＤＮＡ複製を抑制するトポイソメラーゼ（Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）系であるＳＮ－３８を搭載したナノ粒子に結合させた標的指向型薬物送達体（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）で、ＨＥＲ２発現レベルが高いほどアポトーシス効果が大きいと期待した。

【0078】

実験に使用した細胞は、韓国細胞株銀行から購入したヒト乳がん細胞株であるＳＫＢＲ３、ＭＤＡ－ＭＢ２３１とヒト胃がん細胞株であるＮＣＩ－Ｎ８７、ＭＫＮ４を用いた。１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ， Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ， ＵＳＡ）、１％ペニシリンーストレプトマイシン（ｓｔｅｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ－ｐｅｎｉｃｉｌｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）培地を使用して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で培養した。各実験で使用した細胞は、８０％～９０％程度の密度で成長したときに継代培養した。

【0079】

具体的には、実験に使用した細胞株のＨＥＲ２発現量はウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）で確認した。前記細胞株が培養皿に８０％～９０％程度の密度に成長したとき、プロテアーゼ／ホスファターゼインヒビター（Ｐｒｏｔｅａｓｅ／Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を添加したＲＩＰＡバッファーで細胞を破砕した後、遠心分離して細胞溶解液（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を得た。Ｎｕ－ＰＡＧＥ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｇｅｌに各ウェル（ｗｅｌｌ）あたり１０ｕｇのタンパク質をロードして展開した後、ＰＶＤＦ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した後、タンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、１次抗体、２次抗体、ＨＲＰの基質順に反応してシグナルを得、その結果を図２に示す。

【0080】

図２に示すように、ＨＥＲ２陰性の乳がん細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１ではＨＥＲ２発現量が非常に低いが、ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株であるＳＫＢＲ３および胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７はＨＥＲ２を多量発現していることを確認した。

【0081】

実験例２．ＨＥＲ２－ａｆｆｉｂｏｄｙ－ＧＳＴ－ＳＮ－３８（ＫＭＤ１１１）の標的細胞に対する細胞毒性の確認

【0082】

上記実施形態２で調製したＫＭＤ１１１の標的細胞への薬物送達能を確認するために、標的細胞に対する細胞毒性を確認した。

【0083】

具体的には、正常対照群として使用するためのＨＥＲ２陰性であるヒト乳がん細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞とＨＥＲ２ Ａｆｂが認識する受容体を過剰発現する乳がん細胞株であるＳＫ－ＢＲ３細胞、胃がん細胞株であるＮＣＩ－Ｎ８７、ＭＫＮ－４５を９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に１×１０⁴ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで分注し、２４時間培養した後、ＫＭＤ１１１を濃度別に処理して７２時間培養した。ＳＮ－３８の濃度基準、３．１、６．２、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍＬの濃度で各細胞に処理した。培養プレートにｃｃｋ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｊａｐａｎ）を１０μＬずつ９６ウェルで処理した後、１時間培養した。このとき、水溶性の高いテトラゾリウム塩ＷＳＴ－８は細胞の脱水素酵素活性により減少して組織培養培地に溶解する黄色ホルマザン染料を生成するため、吸光度を測定した値は生存細胞数に比例する。マイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＳｋｙＨｉｇｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で４５０ｎｍで吸光度を測定し、対照群と比較して細胞生存率を示し、その結果を図３に示す。

【0084】

図３に示すように、ＫＭＤ１１１はＨＥＲ２を発現しないＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞に対しては細胞毒性が３０％以内で現れ、ＨＥＲ２発現の高い乳がん細胞株であるＳＫＢＲ３細胞で８０％以上、胃がん細胞株であるＮＣＩ－Ｎ８７で７０％のアポトーシス効能を確認した。これにより、ＨＥＲ２陽性がん細胞に対して特異的にアポトーシス効果を示すことができ、薬物送達体として使用したときに有意な抗がん効果を示すことができることを確認した。

【0085】

実験例３．ＨＥＲ２－ａｆｆｉｂｏｄｙ－ＧＳＴ－ＳＮ－３８ ＭＳＮ（ＫＭＤ１１１）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ有効性評価

【0086】

ＫＭＤ１１１の標的腫瘍細胞に対する抗がん効果を確認するために、ヒト胃がんＭＫＮ４５細胞株を移植したマウス動物モデル（ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）を用いて生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）環境で評価を行った。

【0087】

具体的には、抗がん効果評価のために６週齢ＮＩＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ジエイチバイオ（株））マウスを購入して飼料および飲水を自由に給与できる環境で飼育しながら１０日以上浄化した後、腫瘍細胞を移植した。腫瘍細胞はＨＥＲ２陽性胃がんＭＫＮ４５細胞を個体別に５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／１００μＬで左脇腹部分の一定の位置に皮下投与し、１週経過以降から試験物質投与開始まで腫瘍測定を行い、腫瘍の大きさが約１５０ｍｍ³に到達した個体を選択して各試験群にランダムに分配した後、投与を開始した。

【0088】

試験群は、対照群ＰＢＳ投与群と試験物質ＫＭＤ１１１をＳＮ－３８基準で３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ投与群にそれぞれ３匹ずつ分け、２１日間３日１回、合計８回静脈投与（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＩＶ）し、がん細胞移植（０日）後１１日目から終了日（３２日間）まで腫瘍大きさおよび体重を測定した。腫瘍の大きさ、相対腫瘍体積（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）および腫瘍増殖抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ％、ＴＧＩ％）は、腫瘍の長軸および短軸長を測定して下記式で算出した。
［数２］
腫瘍大きさ（ｍｍ³）＝（長軸長×短軸長²）／２
［数３］
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝（終了日の腫瘍大きさ）／（初日の腫瘍大きさ）
［数４］
腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）％＝［１－（試験群のＲＴＶ）／（対照群のＲＴＶ）］×１００（％）

【0089】

各試験動物の体重をチェックした結果を図４に示し、腫瘍大きさを分析した結果を図５に示す。

【0090】

図４に示すように、全ての群において週齢による体重増加はなく、ＫＭＤ１１１投与群で体重減少が確認されたが、特別な臨床症状を示さず、状態が良好であった。

【0091】

図５に示すように、腫瘍大きさを分析したとき、ＰＢＳ投与群と比較してＫＭＤ１１１投与群において濃度依存的に腫瘍大きさが大幅に減少した。ＫＭＤ１１１投与群は、対照群ＰＢＳ投与群対比ＫＭＤ１１１－３ｍｇ／ｋｇ、ＫＭＤ１１１－６ｍｇ／ｋｇ、そしてＫＭＤ１１１－１２ｍｇ／ｋｇ投与群の腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ％）がそれぞれ７９．５％、８３．５％、９２．５％で腫瘍の進行が抑制されることが確認できた。これは、ＭＫＮ４５細胞株を移植した異種移植マウスモデル（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）において、ＫＭＤ１１１がすべての濃度で腫瘍増殖を抑制し、ＫＭＤ１１１はＭＫＮ４５腫瘍に明確な抗がん効果を有することを意味する。

【0092】

上述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できるだろう。したがって、上記で説明した実施形態はすべての点で例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】