特表 2025-521625 ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳインビボ遺伝子編集を支持するＣＡＳ免疫寛容誘導のための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-07-10

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳインビボ遺伝子編集を支持するＣＡＳ免疫寛容誘導のための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20250703BHJP

   A61K 31/203 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250703BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 47/38 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20250703BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20250703BHJP

   A61K 31/593 20060101ALI20250703BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250703BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250703BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20250703BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 G

A61K31/203

A61K45/00

A61P37/06

A61K39/00 Z

A61K38/20

A61K38/18

A61K9/50

A61K9/14

A61K47/38

A61K47/32

A61K47/36

A61K47/34

A61K31/436

A61K31/593

A61P43/00 121

C12N15/09 110

C07K19/00 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024575740

(86)(22)【出願日】2023-06-28

(85)【翻訳文提出日】2025-02-20

(86)【国際出願番号】 US2023069282

(87)【国際公開番号】W WO2024006849

(87)【国際公開日】2024-01-04

(31)【優先権主張番号】63/356,932

(32)【優先日】2022-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】504279968

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ピッツバーグ － オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション

(71)【出願人】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】バルマート， スティーブン シー．

(72)【発明者】

【氏名】ファロ， ルイス ディー．

(72)【発明者】

【氏名】リトル， スティーブン アール．

(72)【発明者】

【氏名】ローレット， デイビッド エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】バートン， グレゴリー エム．

(72)【発明者】

【氏名】コルクマズ， エムラー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA29

4C076AA61

4C076AA73

4C076BB15

4C076BB16

4C076CC07

4C076EE06

4C076EE16

4C076EE23

4C076EE24

4C076EE26

4C076EE32

4C076EE37

4C076EE46

4C076EE48

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA19

4C084BA44

4C084DA14

4C084DB61

4C084MA38

4C084NA14

4C085AA02

4C085BB22

4C085EE03

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB22

4C086DA14

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA38

4C086MA41

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB08

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206DA12

4C206KA01

4C206MA03

4C206MA05

4C206MA58

4C206MA61

4C206MA86

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZB08

4C206ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA86

4H045EA20

(57)【要約】

対象においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容原性免疫応答を誘導するために有用な寛容原性組成物が開示される。この寛容原性組成物は、ａ）１または複数の微粒子、ｂ）各微小粒子内にカプセル化された１または複数の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）刺激剤、およびｃ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含み得る。この寛容原性組成物は、ａ）溶解性マイクロニードルアレイ、ｂ）溶解性マイクロニードルアレイにおける寛容原性ＤＣの分化を促進する１または複数の薬剤、およびｃ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含み得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

寛容原性組成物であって、
ａ１）１または複数の微粒子、
ｂ１）前記１または複数の微粒子内にカプセル化された１または複数の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）刺激剤、および
ｃ１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチド、あるいは
ａ２）溶解性マイクロニードルアレイ、
ｂ２）前記溶解性マイクロニードルアレイにおける、寛容原性ＤＣの分化を促進する１または複数の薬剤、および
ｃ２）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチド
を含む、寛容原性組成物。

【請求項2】

ａ１）前記１または複数の微粒子、
ｂ１）前記１または複数の微粒子内にカプセル化された前記１または複数の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）刺激剤、および
ｃ１）前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む融合ポリペプチド
を含む、請求項１に記載の寛容原性組成物。

【請求項3】

前記１または複数のＴｒｅｇ刺激剤が、ＣＣＬ２２、レチノイン酸、または血管作用性腸ペプチドを含む、請求項２に記載の寛容原性組成物。

【請求項4】

前記１または複数のＴｒｅｇ刺激剤が、ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、またはＣＣＲ８リガンドを含む、請求項２または請求項３に記載の寛容原性組成物。

【請求項5】

前記１または複数のＴｒｅｇ刺激剤が、ＴＧＦβ、ＩＬ２およびラパマイシンを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の寛容原性組成物。

【請求項6】

前記寛容原性組成物が、ｉ）ＴＧＦβを含む微粒子、ｉｉ）ＩＬ－２を含む微粒子、およびｉｉｉ）ラパマイシンを含む微粒子を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の寛容原性組成物。

【請求項7】

前記１または複数の微粒子が、少なくとも１つのポリマーを含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の寛容原性組成物。

【請求項8】

前記少なくとも１つのポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アミノ酸）、ポリラクタート、ポリ乳酸、ポリグルタミン酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール－ｂ－（ＤＬ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ｂ－エチレングリコール）（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧ）、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン－ＰＥＧ（ＰＣＬ－ＰＥＧ）、ポリ（フッ化ビニリデン）－ＰＥＧ（ＰＶＤＦ－ＰＥＧ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－ＰＥＧ）（ＰＬＡ－ＰＥＧ）、ポリ（メチルメタクリレート）－ＰＥＧ（ＰＭＭＡ－ＰＥＧ）、およびそれらの組合せを含む、請求項７に記載の寛容原性組成物。

【請求項9】

前記１または複数の微粒子が、アルギナートを含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の寛容原性組成物。

【請求項10】

１または複数の微粒子が、前記１または複数の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）刺激剤の持続放出のために製剤化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の寛容原性組成物。

【請求項11】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の寛容原性組成物。

【請求項12】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター融合ポリペプチドが、ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、およびｉｉ）１または複数の異種エフェクターポリペプチドを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の寛容原性組成物。

【請求項13】

前記１または複数の異種エフェクターポリペプチドの少なくとも１つが、一本鎖ヌクレアーゼ、二本鎖ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、デアミナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、塩基編集剤、またはプライム編集剤である、請求項１２に記載の寛容原性組成物。

【請求項14】

哺乳動物対象においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する方法であって、前記方法が、有効量の請求項２～１３のいずれか一項に記載の寛容原性組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより、前記ＣＲＩＳＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する、方法。

【請求項15】

前記組成物が、真皮内、真皮下、皮下または筋肉内に投与される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記組成物が、
ａ２）前記溶解性マイクロニードルアレイ、
ｂ２）前記溶解性マイクロニードルアレイにおける、寛容原性ＤＣの分化を促進する前記１または複数の薬剤、
ｃ２）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくは前記免疫原性断片を含む融合ポリペプチド
を含む、請求項１に記載の寛容原性組成物。

【請求項17】

前記溶解性マイクロニードルアレイが、ｉ）ベース部分を形成する生体適合性材料を含む基材、およびｉｉ）前記ベース部分から延在する複数のマイクロニードルを含む、請求項１６に記載の寛容原性組成物。

【請求項18】

前記生体適合性材料が、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、またはゼラチンを含む、請求項１７に記載の寛容原性組成物。

【請求項19】

前記生体適合性材料が、カルボキシメチルセルロースを含む、請求項１８に記載の寛容原性組成物。

【請求項20】

寛容原性ＤＣの分化を促進する前記１または複数の薬剤が、ビタミンＤ３またはビタミンＤ３類似体を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の寛容原性組成物。

【請求項21】

哺乳動物対象においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する方法であって、
有効量の請求項１７～２０のいずれか一項に記載の寛容原性組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより、前記ＣＲＩＳＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する、方法。

【請求項22】

前記組成物が、真皮内または真皮下に投与される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記寛容原性組成物が、前記対象に繰り返し投与される、請求項１４～１５または２１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記寛容原性組成物が、プライム－ブースト戦略で前記対象に投与される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記有効量の前記寛容原性組成物を投与するステップの後に、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む遺伝子編集組成物を前記対象に投与するステップを含み、前記寛容原性組成物が、前記遺伝子編集組成物中に存在する前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する、請求項１４～１５または２１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記遺伝子編集組成物が、前記寛容原性組成物の投与の約６ヶ月以内に前記対象に投与される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記寛容原性組成物が、遺伝子編集組成物を以前に投与された対象に投与される、請求項１４～１５または２１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記対象に遺伝子編集手順を実施するステップをさらに含む、請求項１４～１５または２１～２７のいずれかに記載の方法。

【請求項29】

前記対象が、ヒトである、請求項１４～１５または２１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記対象が、非ヒト哺乳動物である、請求項１４～１５または２１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２２年６月２９日に出願された米国仮出願第６３／３５６，９３２号に基づく利益を主張する。

【0002】

政府支援の記載
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号ＡＲ０７４２８５、および国防総省高等研究事業局（ＤＡＲＰＡ）によって授与された助成金番号ＨＲ００１１－１７－２－００４３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0003】

発明の分野
本出願は、遺伝子編集の分野に関し、具体的には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する免疫寛容を誘導するための方法に関する。

【0004】

電子配列表の参照
サイズが１２，２８８バイトであり、作成日：２０２３年６月２７日であるＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｘｍｌという名前の電子配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0005】

背景
遺伝子編集は、治療状況においてますます使用されている。インビボで細胞内の遺伝子を編集するために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓエフェクタータンパク質、例えばＣａｓ９およびガイドＲＮＡを細胞内の標的核酸と接触させ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターポリペプチドおよびガイドＲＮＡが一緒になって標的核酸またはその発現を修飾する。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ヒトなどの哺乳動物宿主に対して外来性であり、免疫応答を誘発し得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに特異的な誘導抗体および／またはＴ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを中和してよく、および／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む細胞を死滅させ得る。そのような免疫応答は、遺伝子編集の効率を低下させ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを使用した将来の編集を妨げる可能性がある。限定されないが、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する免疫寛容を誘発する方法が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

開示の要旨
対象においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容原性免疫応答を誘導するために有用な寛容原性組成物が開示される。いくつかの実施形態では、寛容原性組成物は、ａ）微粒子、ｂ）微粒子内にカプセル化された１または複数の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）刺激剤、およびｃ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。他の実施形態では、寛容原性組成物は、ａ）溶解性マイクロニードルアレイ、ｂ）溶解性マイクロニードルアレイにおける寛容原性ＤＣの分化を促進する１または複数の薬剤、およびｃ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。

【0007】

本発明の前述および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して進められるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１Ａ～１Ｃ概略図。図１Ａ 単独またはアジュバントと共に送達された抗原は、先天性炎症を促進することができ、これは炎症誘発性ＤＣの皮膚排出リンパ節（ＤＬＮ）への移動および炎症性エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の分化を誘発する。図１Ｂ タンパク質抗原（例えば、Ｃａｓ９）と皮下に同時投与されたＴＲＩ ＭＰは、皮膚ＤＬＮの微小環境を整え、制御性Ｔ細胞の分化を促進する。図１Ｃ ＭＣ９０３（ビタミンＤ類似体）マイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）条件による抗原（例えば、Ｃａｓ９）の同時送達は、皮膚微小環境を整え、抗原を取り込み、ＤＬＮに移動し、優先的Ｔｒｅｇ分化を誘導し、および／またはＴｅｆｆの分化を減少させるＤＣの寛容原性状況を提供する。

【0009】

【図2】図２：Ｃａｓ９発現細胞による免疫化は、Ｃａｓ９特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘発する。０日目および１４日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを腹腔内注射（赤色円）または皮下注射（白四角）によって１×１０^７ ＬＰＳ Ｃａｓ９－Ｔｇ脾細胞で免疫化した。２６日目に、免疫化マウスの脾細胞を採取した。細胞を、対照細胞（Ｂ６）、またはＬＰＳ処理で以前に活性化された（＋）もしくは活性化されていない（－）Ｃａｓ９抗原を発現する細胞（Ｃａｓ９）とインキュベートした。再刺激に応答してＩＦＮγを産生するＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を定量する細胞内サイトカイン染色が示されている（対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

【0010】

【図3】図３：アジュバントと共に製剤化されたＣａｓ９による免疫化は、Ｃａｓ９特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞を誘発する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目および１４日目に、１００μｇのＳｐＣａｓ９またはＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）Ｇｏｌｄアジュバントを製剤化したＰＢＳ緩衝液で免疫化した。２１日目に、ＰＢＳ（左）またはＳｐＣａｓ９（右）で免疫化したマウスの脾細胞を採取し、Ｃａｓ９タンパク質で再刺激した。細胞内サイトカイン染色によって評価した場合のＩＦＮγを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す（２元配置ＡＮＯＶＡ、ＵＮ＝刺激なし）。

【0011】

【図4AB】図４Ａ～４Ｃ：Ｃａｓ９を有するＴｒｅｇ誘導微粒子は、脾臓Ｔｒｅｇを拡大し、Ｃａｓ９特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を低下させる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃａｓ９を含むまたは含まないＰＢＳ緩衝液、ブランク微粒子（ＭＰ）またはＴｒｅｇ誘導微粒子（ＴＲＩ－ＭＰ）で－１２日目に前処理された。マウスは、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバントと共に製剤化された１００μｇのＣａｓ９タンパク質の１回（図４Ａ－４Ｂ）または２回（図４Ｃ）の免疫化を受けた。最終免疫化の７日後に、マウスは安楽死され、脾臓Ｔ細胞応答は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ（図４Ａ）、フローサイトメトリー（図４Ｂ）またはサイトカインビーズアレイ（図４Ｃ）によって評価された。ＩＦＮγ応答は、培地（白丸）、ＯＶＡ（菱形）またはＣａｓ９タンパク質（四角）による刺激によって誘発された（図４Ａ）。テューキーの多重比較検定による２元配置ＡＮＯＶＡとの統計的比較。図４Ｂ：脾臓中の制御性Ｔ細胞のパーセンテージ。通常の１元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１。図４Ｃ：テューキーの多重比較検定を用いた３日間刺激２元配置ＡＮＯＶＡ後の分泌ＩＦＮγを定量するサイトカインビーズアレイ。

【図4C】同上。

【0012】

【図5】図５：寛容原性マイクロニードルアレイは、Ｃａｓ９特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を低下させる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、無処置のままにされた（はるか左）か、または０、３および６日目にＣａｓ９単独もしくはＣａｓ９（５０μｇ）もしくはＢＳＡ（５０μｇ）を含有するＭＮＡの皮膚内適用を受けた。１３日目に、マウスを、遠位部位にＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）Ｇｏｌｄを製剤化したＣａｓ９で免疫化した。負荷（抗原投与）の７日後、脾細胞を採取し、培地（白丸）またはＣａｓ９タンパク質（黒四角）で刺激した。細胞内サイトカイン染色によるＩＦＮγを分泌するＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を示す（テューキー多重比較検定による２元配置ＡＮＯＶＡ）。

【0013】

【図6】図６：ＳｐＣａｓ９特異的遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイ。マウスは、Ｃａｓ９（抗原）＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（アジュバント）ＭＮＡの適用によって、またはＣａｓ９発現脾細胞の皮下注射によって、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）抗原に感作（免疫化）された。７日後、マウスはＣａｓ９ ＭＮＡを介して右耳に負荷し（Ｃａｓ９抗原に再曝露し）、耳厚さを次の４日間にわたって毎日測定した。Ｃａｓ９抗原特異的炎症応答に関連しない耳厚さの増加を対照するために、ブランク（空）ＭＮＡを反対側の耳に適用した。Ｃａｓ９に対する耳介腫脹関連Ｔ細胞媒介性ＤＴＨ応答は、耳厚さの変化（デルタ）として報告された（すなわち、Ｃａｓ９ ＭＮＡ処置右耳－ブランクＭＮＡ処置左耳）。より大きな耳介腫脹は、より強いＣａｓ９特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答と一致する。

【0014】

【図7】図７：Ｃａｓ９および寛容原性ビタミンＤ３類似体（ＭＣ９０３）マイクロニードルアレイによる予防的寛容誘導。Ｃａｓ９＋ポリＩＣ ＭＮＡによる感作の前に、マウスをＣａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡの３回の連続適用によって処置した（０、３、および６日目）。３日後（９日目）、マウスをＣａｓ９＋ポリ（Ｉ：Ｃ）ＭＮＡの適用によってＣａｓ９抗原に感作した。７日後、マウスをＣａｓ９ ＭＮＡを介して右耳に負荷し、耳厚さを次の４日間にわたって毎日測定した。Ｃａｓ９抗原特異的炎症応答に関連しない耳の厚さの増加を対照するために、ブランクＭＮＡを反対側の耳に適用した。Ｃａｓ９に対するＴ細胞媒介性ＤＴＨ応答に関連する耳介腫脹は、耳厚さの変化（デルタ）として報告された（すなわち、Ｃａｓ９ ＭＮＡ処置右耳－ブランクＭＮＡ処置左耳）。Ｃａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる前処置（予防的寛容化）は、その後の感作を減少させ、ＤＴＨ（耳介腫脹）応答を低下させた。

【0015】

【図8A】図８Ａ～８Ｃ。Ｃａｓ９およびＭＣ９０３マイクロニードルアレイによる予防的寛容誘導。耳負荷（図７と同様に）の４日後、耳皮膚排出リンパ節（ＤＬＮ）を単離し、Ｔ細胞応答をフローサイトメトリーによって評価した。図８Ａ～８Ｂ：耳ＤＬＮ当たりの総細胞：（１）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、（２）ＣＤ４＋Ｔ－ｂｅｔ＋１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）、（３）ＣＤ８^＋Ｔ－ｂｅｔ＋１型細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ１）、（４）Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１比、（５）Ｔｒｅｇ／（Ｔｈ１＋Ｔｃ１）またはＴｒｅｇ（エフェクターＴ細胞、Ｔｅｆｆ）比。図８Ｃ：耳ＤＬＮにおけるＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ、Ｔ－ｂｅｔ＋Ｔｈ１およびＴ－ｂｅｔ＋Ｔｃ１集団の頻度。群間を１元配置独立ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定によって比較した。コンパクト文字表示は、有意差（ｐ＜０．０５、異なる文字）または非有意差（ｐ＞０．０５、共通文字）を示す。非限定的な例として、「ａ」と標識された群は、「ｂ」と標識された群と有意に異なるが、ａと標識された別の群または「ａｂ」と標識された群とは異ならない。「ａｂ」と標識された群は、「ａ」と標識された群または「ｂ」と標識された群と有意に異ならないが、「ｃ」と標識された群と有意に異なる。

【図8B】同上。

【図8C】同上。

【0016】

【図9A】図９Ａ～９Ｂ：Ｃａｓ９＋Ｍｃ９０３ ＭＮＡによる治療的脱感作。寛容を、Ｃａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる以前に感作されたマウス（すなわち、Ｃａｓ９に対する既存の免疫を有するマウス）の処置によって誘導した。治療的脱感作モデルでは、マウスが最初にＳｐＣａｓ９発現脾細胞の皮下注射によってＳｐＣａｓ９に感作された。１週間後から、一部のマウスが、Ｃａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡ（７、１０、および１３日目）で処置された。Ｃａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる最後の処置の５日後（１８日目）、すべてのマウスに、Ｃａｓ９発現ＣＦＳＥ^ｈｉｇｈ「標的」細胞と「対照」ＣＦＳＥ^ｌｏｗ細胞との混合物の養子移入を行った（すなわち、Ｃａｓ９を発現しない野生型脾細胞）。翌日、マウスの脾臓を処理し、フローサイトメトリー（図９Ａ）によって分析して特異的細胞溶解を測定した（すなわち、Ｃａｓ９特異的エフェクターＴ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞によるＣａｓ９発現標的細胞の特異的殺滅）。特異的溶解パーセントは、｛１－［（ナイーブマウスからの平均ＣＦＳＥ^ｌｏｗ／ＣＦＳＥ^ｈｉｇｈ比）／（免疫化マウスからのＣＦＳＥ^ｌｏｗ／ＣＦＳＥ^ｈｉｇｈ比）］｝×１００％として計算される（図９Ｂ）。感作群および脱感作群を独立したｔ検定によって比較した。

【図9B】同上。

【0017】

【図10】アルギナートヒドロゲル微粒子からのＳｐＣａｓ９放出。製剤：ＳｐＣａｓ９（２．５ｍｇ）＋１％アルギナート（ｍｅｄ粘度、１００ｍｇアルギナート）－「ｂ」と標識； ＳｐＣａｓ９（２．５ｍｇ）＋１％アルギナート（低粘度、１００ｍｇアルギナート）－「ａ」と標識。

【0018】

【図11A】ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドの配列。配列番号１～４を示す。

【図11B】同上。

【図11C】同上。

【図11D】同上。

【0019】

【図12】図１２。ＳｐＣａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる前処置は、感作およびその後の遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を減少させる。列挙した各処置について耳厚さの変化を示す折れ線グラフ、ならびに対照およびＳｐＣａｓ９およびＭＣ９０３ ｍＲＮＡで処置した動物からの代表的なデジタル画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

いつくかの実施形態の詳細な説明
免疫応答を誘導せずにインビボ編集を容易にするために、Ｃａｓ９および他の編集者などのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する免疫応答を低下させる実験を行った。抗Ｃａｓ９ Ｔ細胞または抗体応答などの免疫応答の減少は、少なくとも２つの用途を有する：ｉ）最初の編集手順の効率の改善であって、多くの場合、同じガイドＲＮＡによる複数回の編集を伴い、その過程で編集者に対する免疫応答が誘導され、編集が行われる細胞に到達する前に編集および／または編集者の中和を受けている細胞の死をもたらし得る、初期編集手順の効率の改善；（ｉｉ）異なる遺伝子を編集するための後の手順を受けるための編集手順を以前に受けていた患者の使用可能化。対象においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容原性免疫応答を誘導するために使用される寛容原性組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、寛容原性組成物は、ａ）微粒子、ｂ）微粒子内にカプセル化された１または複数の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）刺激剤、およびｃ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくは免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。他の実施形態では、寛容原性組成物は、ａ）溶解性マイクロニードルアレイ、ｂ）ビタミンＤ類似体、例えば限定されないが、ＭＣ９０３、およびｃ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む融合ポリペプチドを、１または複数の追加の薬剤と同時投与する。

【0021】

用語
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｋｒｅｂｓら（Ｅｄｓ．）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩＩ、Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより出版、２０１７年；およびＭｅｙｅｒｓら（Ｅｄｓ．）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨにより１６巻で出版、２００８年；および他の同様の参考文献に掲載されている。

【0022】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、単数および複数の両方を指す。さらに、「または」には「および／または」も含む。したがって、「第１の粒子または第２の粒子」は「第１の粒子および／または第２の粒子」も含み、本明細書の方法で使用される組成物は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。本明細書に記載のものと類似または同等の多くの方法および材料が使用され得るが、特定の適切な方法および材料を以下に記載する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。「約」という用語は、特に明記しない限り、５パーセント以内を意味する。さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられるすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることを理解されたい。

【0023】

本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料は、本開示の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先するであろう。さらに、材料、方法、および例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

【0024】

本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。

【0025】

投与：選択された経路による、小分子阻害剤などの組成物の対象への導入。投与は局所的または全身的であり得る。例示的な投与経路は、限定されないが、経口、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、静脈内）、舌下、直腸、経皮（例えば、局所）、鼻腔内、膣および吸入経路を含む。

【0026】

薬剤：疾患もしくは障害、またはそれに関連する少なくとも１つの症状の処置、回復、もしくは予防、または制御性免疫応答を含む免疫応答の変化などの変化をもたらすために対象に投与され得る薬物、医薬、医薬、治療剤、栄養補助食品、生物学的分子、または他の化合物。薬剤は、一般に約２０００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する「小分子」であり得る。活性薬剤はまた、「生物学的薬剤」であり得る。生物学的薬剤は、タンパク質、抗体、抗体断片、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびそのような材料の様々な誘導体を含む。

【0027】

動物：生きている多細胞脊椎動物生物、例えば哺乳動物および鳥類を含むカテゴリー。哺乳動物という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、「対象」という用語は、ヒト対象と獣医学的対象の両方を含む。

【0028】

Ｃａｓ９：ＤＮＡをカットすることができるＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素。Ｃａｓ９は、二重らせんの各鎖に１つずつ、２つの活性カット部位（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を有する。触媒的に不活性な（非活性化された）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）も本開示に包含される。いくつかの例において、ｄＣａｓ９は、以下の点突然変異：Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０ＡおよびＮ８６３Ａのうちの１または複数のものを含む。

【0029】

Ｃａｓ９核酸およびタンパク質配列は、公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＣＰ０１２０４５．１のヌクレオチド７９６６９３．．８００７９９およびＣＰ０１４１３９．１のヌクレオチド１１０００４６．．１１０４１５２は、Ｃａｓ９核酸を開示しており、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＭＡ７０６８５．１およびＡＫＰ８１６０６．１は、Ｃａｓ９タンパク質を開示している。いくつかの例では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ欠損（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＫＡ６０２４２．１およびＫＲ０１１７４８．１に示されるもの）であるものなどのＣａｓ９の非活性化形態（ｄＣａｓ９）である。特定の例では、Ｃａｓ９は、そのような配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、ＤＮＡをカットする能力を保持する。Ｃａｓ９ミニタンパク質も含まれる。

【0030】

カスパーゼ：システイン－アスパラギン酸プロテアーゼ、システインアスパルターゼまたはシステイン依存性アスパラギン酸指向プロテアーゼである酵素。カスパーゼは、プログラム細胞死において必須の役割を果たすプロテアーゼ酵素のファミリーである。それらは、その特異的なシステインプロテアーゼ活性のためにカスパーゼと呼ばれ、その活性部位のシステインは、アスパラギン酸残基の後にのみ標的タンパク質を求核的に攻撃し、切断する。

【0031】

保存的変異体：「保存的」アミノ酸置換は、ポリペプチドの活性に実質的に影響を及ぼさない、またはポリペプチドの活性を低下させない置換である。保存的置換の具体的な非限定的な例は、以下の例を含む。

【表1】

保存的変異という用語は、ポリペプチドが非置換（親）ポリペプチドと同じ親和性で結合するという条件で、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含む。非保存的置換は、ポリペプチドの活性を変化させる置換である。

【0032】

同時投与：同じ一般的な期間内の少なくとも１つの他の治療剤または診断薬との本明細書に開示される薬剤の投与であり、同じ正確な時点での投与を必要としない（同時投与は同じ正確な時点での投与を含むが）。したがって、同時投与は、同時または指定された時間枠内であり得る。特定の実施形態では、複数の治療剤および／または診断薬は、薬剤を微粒子内にカプセル化することによって、または本明細書に開示されるマイクロニードルを使用することによって同時投与され得る。

【0033】

対照：参照標準。いくつかの実施形態では、対照は、健康な患者、または担体、非標的核酸配列、スクランブル核酸／アミノ酸配列もしくは健康な患者由来の未処理細胞で治療された対象から得られた陰性対照試料である。他の実施形態では、対照は、活性薬剤で処置された患者から得られた陽性対照試料である。さらに他の実施形態では、対照は、過去の対照または標準基準値または値の範囲（例えば、以前に試験された対照試料、例えば、既知の予後もしくは転帰を有する患者の群、またはベースライン値もしくは正常値を表す試料の群）である。

【0034】

免疫応答のための差、または試験試料および対照に対して行われるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＮＡ発現プロファイルなど）の差は、増加または逆に減少であり得る。差は、定性的差または定量的差、例えば統計的有意差であり得る。いくつかの例では、差は、対照と比較して、少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、または５００％超の増加または減少である。

【0035】

ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ＩｎｔｅｒＳｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）編集系：ゲノム操作に使用される細菌系に基づく操作されたヌクレアーゼ系。これは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答に部分的に基づく。そのような方法を使用して、遺伝物質を特定の位置、例えば標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に追加、除去、または変更することができる。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するため、任意の所望の位置で標的ＤＮＡまたはＲＮＡを修飾するため、または任意の所望の位置で標的ＤＮＡまたはＲＮＡをカットするために、核酸ターゲティング（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）に使用され得る。したがって、そのような方法は、例えば、遺伝子をノックアウトするなど、シレン発現に突然変異を導入することによって、タンパク質の発現を修飾するために使用され得る。

【0036】

一例では、本方法は、ゲノムなどのＤＮＡを編集し、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド」を使用する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、この系において核酸を切断する酵素である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、限定されないが、Ｃａｓ９を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細胞のゲノム内の所望の標的でＤＮＡの断裂を生じさせ、細胞の内因性機構を利用して、誘導された断裂を相同誘導修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復するように操作することができる。別の例では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｃａｓ１３ｄヌクレアーゼなどのＲＮＡを断裂する（例えば、国際公開第２０１９／０４０６６４号を参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＩＩ型、Ｖ型、またはＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドであり得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドの非限定的な例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ３、Ｃ２ｃ２ ａｎｄ Ｃ２ｃ１Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃａｓ Ｌａｍｂｄａ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹおよびＣａｓ ｐｈｉ、ならびにそれらの相同体を含む。

【0037】

樹状細胞（ＤＣ）：寛容原性ＤＣは、一般に、抗原取り込み能力の増加に加えて、低レベルまたは中レベルのＭＨＣ ＩＩ、共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０、ならびにケモカイン受容体ＣＣＲ７を含めることによって定義される。寛容原性ＤＣは、Ｉｇ様転写物（ＩＬＴ）分子（ＩＬＴ３／ＩＬＴ４）および／またはＰＤ－Ｌ分子（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２）などの高レベルの阻害性分子を発現することができる。さらに、寛容原性ＤＣは、少量の炎症促進性サイトカイン（ＩＬ－１２ｐ７０）および大量の抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－１０を分泌し得る。寛容原性ＤＣは、ナイーブＴ細胞のＴｒｅｇへの変換、免疫抑制性サイトカインの放出、および機能性インドールアミン－２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現を含むいくつかの機序によって、Ｔ細胞アネルギー、Ｔ細胞抑制、および制御性Ｔ細胞の生成を誘導するように機能する。

【0038】

有効量：対象において寛容原性免疫応答などの所望の応答を誘発するのに十分な、免疫原などの薬剤の量。目的の抗原に対する寛容原性免疫応答を得るために使用される手順は、開示される組成物の複数回投与を必要とし得ることが理解される。したがって、有効量の開示される組成物は、対象においてプライム免疫応答を誘発するのに十分な免疫原の量であり得、免疫原は、その後、同じまたは異なる組成物で寛容原性免疫応答を誘発するためにブーストされ得る。

【0039】

エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性である分子上の特定の化学基またはペプチド配列であり、特定の免疫応答を誘発し、例えば、エピトープは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の領域である。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置された連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成され得る。

【0040】

フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）：Ｔｒｅｇの分化および機能に関与する分子過程を調節および調整する転写因子（ＺｈｅｎｇおよびＲｕｄｅｎｓｋｙ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４５７－４６２，２００７）。Ｔｒｅｇ細胞は、過剰反応性免疫応答（Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，５３１－５６４，２０１２）を抑制することによって免疫系の恒常性を維持するのに重要な役割を果たすＴ細胞の一種である。Ｔｒｅｇ細胞の欠陥は、自己免疫障害および免疫病理学をもたらし得る。逆に、特定の腫瘍は、抗腫瘍免疫応答を抑制するＴｒｅｇ細胞で濃縮されている（ＴａｎａｋａおよびＳａｋａｇｕｃｈｉ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２７、１０９－１１８、２０１７）。Ｆｏｘｐ３活性の増加はＴｒｅｇサプレッサー機能を増強するが、Ｆｏｘｐ３活性の減少はＴｒｅｇサプレッサー機能を抑制する（Ｌｏｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、５３、１４３～１５７、２０２０）。

【0041】

免疫応答：刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、または単球などの免疫系の細胞の応答。一実施形態では、応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体の産生をもたらす。免疫応答は、「寛容原性」免疫応答であってよく、したがって、特定の抗原に対する寛容を誘導し得る。寛容原性免疫応答は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および／または寛容原性樹状細胞を誘導および／または刺激することを含み得る。寛容原性樹状細胞は、いくつかの機構を介して寛容を誘導する。刺激されると、寛容原性樹状細胞は、排出リンパ節に移動し、樹状細胞上のＭＨＣクラスＩＩ－抗原複合体とＴ細胞上のＴ細胞受容体との相互作用を介して抗原をＴ細胞に提示する。これは、Ｔ細胞クローン欠失、Ｔ細胞アネルギーまたはＴｒｅｇの増殖を誘導することができる。集合的に、これらの機構は、特定の抗原に対する寛容をもたらす。したがって、「免疫寛容」とは、そうでなければ所与の生物において免疫応答を誘発する能力を有するであろう物質、タンパク質、エピトープ、または細胞に対する免疫系の不応答性の状態を指す。

【0042】

単離された：「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸、タンパク質または細胞）は、その構成要素が存在する環境（細胞または組織など）内の他の生物学的構成要素、例えば、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸を包含する。

【0043】

哺乳動物：この用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、「対象」という用語は、ヒト対象と獣医学的対象の両方を含む。

【0044】

マイクロニードル：治療剤の経皮もしくは皮内送達または皮膚を通る流体のサンプリングを容易にするために角質層を貫通することができる、「マイクロアレイ」とも呼ばれるアレイに関連する顕微鏡構造。「アレイ」は、治療剤の経皮送達を容易にするために角質層を突き刺すことができる１または複数の構造の順序付けられたパターンを含む本明細書に記載の医療機器を指す。

【0045】

微粒子：微粒子は、一般に、リポソーム、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、マイクロカプセル、ナノロッドおよびナノカプセルを含む一般的なカテゴリーを指す。微粒子は複合構造であってもよく、必ずしも純粋な物質ではなく；球形であっても、他の任意の形状であってもよい。

【0046】

場合により、微粒子は、１または複数の生分解性ポリマーを含む。本明細書で使用される「生分解性」という用語は、浸食、溶解、腐食、分解、加水分解、摩耗、およびそれらの組み合わせなどの通常の化学的、生化学的および／または物理的プロセスによって材料が分解される能力を指す。微粒子は、直径が約０．１μｍ～約１０００μｍの範囲、またはそれらの間の任意の範囲であり得る。さらなる情報を以下に提供する。

【0047】

調整する：統計的に有意な様式で変化させる。調整は、増加または減少であり得る。当業者は、パラメータの統計学的に有意な増加または減少を決定するための適切なアッセイを特定することができる。これらは、限定されないが、スチューデントｔ検定または対応比ｔ検定を含む。例示的な方法は、実施例のセクションに提供されている。

【0048】

薬学的に許容され得る担体：薬学的投与に適合する任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２１^ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５を参照のこと）。そのような担体または希釈剤の例は、限定されないが、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、平衡塩類溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含む。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。補助活性化合物も組成物に組み込まれ得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２１^ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）に提供されているものを含む。

【0049】

ポリペプチド：長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、アミノ酸の任意の鎖。ポリペプチドおよびタンパク質に関して、「約」という用語は整数量を示す。したがって、一例では、「約」２９アミノ酸長のポリペプチドは、２８～３０アミノ酸長である。したがって、特定の数の残基「約」のポリペプチドは、特定の数よりも１つ短いアミノ酸または１つ長いアミノ酸であり得る。融合ポリペプチドは、第１のポリペプチドと第２の異なるポリペプチド（例えば、異種ポリペプチド）のアミノ酸配列を含み、単一のアミノ酸配列として合成することができる。組換えポリペプチドは、天然に存在しないか、またはアミノ酸配列の２つの他の方法で分離されたセグメントによって作製されるアミノ酸配列を有する。

【0050】

組換え：天然に生じない配列を有するか、そうでなければ分離された２つの配列セグメント（例えば、「キメラ」配列）の人工的な組合わせによって作製された配列を有する核酸またはタンパク質。この人工的な組合わせは、化学合成によって、または例えば遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成することができる。

【0051】

配列同一性：アミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性に関して表され、そうでなければ配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、同一性パーセント（または類似性もしくは相同性）に関して頻繁に測定される。パーセンテージが高いほど、２つの配列はより類似している。ポリペプチドの相同体または変異体は、標準的な方法を用いて整列させた場合、比較的高度の配列同一性を有する。

【0052】

比較のための配列のアラインメント方法は公知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８、４４３－４５３；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、１９８８、Ｇｅｎｅ ７３、２３７－２４４；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ ５、１５１－１５３；Ｃｏｒｐｅｔら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６、１０８８１－１０８９０；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５、２４４４－２４４８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ６、１１９－１２９は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察を提示している。

【0053】

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２１５、４０３－４１０）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州）およびインターネットを含むいくつかの情報源から入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。

【0054】

ポリペプチドの相同体および変異体は、典型的には、デフォルトパラメータに設定されたＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ２．０、ｇａｐｐｅｄ ｂｌａｓｔｐを使用して、ポリペプチドのアミノ酸配列との全長アラインメントにわたってカウントされた少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％の配列同一性を有することを特徴とする。約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較のために、デフォルトパラメータ（１１のギャップ存在コスト、１の残基ギャップあたりのコスト）に設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ ２配列関数が使用される。短いペプチド（約３０アミノ酸未満）をアライメントする場合、アライメントは、デフォルトパラメータ（開放ギャップ９、延長ギャップ１のペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ ２配列関数を使用して実行されるべきである。参照配列に対してさらに大きな類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性など、同一性パーセンテージの増加を示す。配列全体よりも少ない配列が配列同一性について比較される場合、相同体および変異体は、典型的には、１０～２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列に対するそれらの類似性に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有することができる。このような短いウィンドウで配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。当業者は、これらの配列同一性範囲が案内のためにのみ提供されることを理解するであろう。提供された範囲外にある非常に有意な相同体が得られ得ることは完全に可能である。

【0055】

したがって、いくつかの例では、ポリペプチドまたは核酸配列の変異体は、典型的には、目的のアミノ酸またはヌクレオチド配列との全長アラインメントにわたって数えて少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することを特徴とする。参照配列とのさらに大きな類似性を有する配列は、この方法によって評価した場合、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性などの同一性パーセンテージの増加を示す。配列全体よりも少ない配列が配列同一性について比較される場合、相同体および変異体は、典型的には、１０～２０アミノ酸（または３０～６０ヌクレオチド）の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列とのそれらの類似性に応じて、少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有し得る。このような短いウィンドウで配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。

【0056】

本明細書で使用される場合、「少なくとも９０％の同一性」（または同様の言葉）への言及は、特定の参照配列「少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらには１００％の同一性」を指す。

【0057】

単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）：標的ＤＮＡ配列を認識し、Ｃａｓヌクレアーゼを標的に誘導するために使用される合成ガイドＲＮＡ。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡは、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２－Ｂｒｉｅ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｅｎｃｈら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４：１８４－１９１、２０１６）などの最適化されたマウスゲノム全体のレンチウイルスＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリーのサブクローニングから生成される。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡ発現カセットは、Ｕ６プロモーターおよび／またはガイドＲＮＡスキャフォールドをさらに含む。

【0058】

対象：生きている多細胞脊椎動物生物、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー、例えば、非ヒト霊長類、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシおよびブタ。一例では、対象はヒトである。さらなる例では、破骨細胞融合の調整を必要とする対象が選択される。例えば、対象は、破骨細胞融合の増加または減少を必要とし得るか、または骨吸収の増加または減少を必要とし得る。

【0059】

Ｔ細胞：免疫応答の重要なメディエーターである白血球（リンパ球）。Ｔ細胞は、限定されないが、分化クラスター（ＣＤ）４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む。ヘルパーＴ細胞としても知られる成熟ＣＤ４＋細胞は、抗体応答ならびにキラーＴ細胞応答を含む免疫応答を統合するのに役立つ。成熟ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞であり得る。活性化Ｔ細胞は、細胞増殖および／または１もしくはそれを超えるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γまたはＴＮＦα）の発現もしくは分泌の増加によって検出することができる。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化は、抗原に応答した細胞溶解活性の増加によっても検出することができる。

【0060】

「制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞」は、過剰反応性免疫応答（Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０、５３１－５６４、２０１２）を抑制することによって免疫系の恒常性を維持する役割を有するＴ細胞の一種である。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞であり得る。Ｔｒｅｇ細胞の欠損は、自己免疫障害および免疫病理学をもたらすが、ある種の腫瘍は、抗腫瘍免疫応答を抑制するＴｒｅｇ細胞で濃縮されている（ＴａｎａｋａおよびＳａｋａｇｕｃｈｉ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２７、１０９－１１８、２０１７）。Ｔｒｅｇはまた、サイトカイン、例えばトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－β、インターロイキン（ＩＬ）－３５およびＩＬ－１０を産生し得る。Ｔｒｅｇの他のタイプは、Ｔｒ１細胞を含み、これは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＩＬ１０＋ＴＧＦβ１＋細胞である（ＧｒｅｇｏｒｉおよびＲｏｎｃａｒｏｌｏ、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００２３３、２月１５日、２０１８、参照により本明細書に組み込まれる。ビタミンＤ３は、Ｔｒｅｇ細胞およびＴｒ１細胞の両方の分化を誘導する（ｖａｎ ｄｅｒ Ａａｒら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（６）：１５３２－１５４０．ｅ７、２０１１を参照のこと）。

【0061】

概要
いくつかの実施形態では、開示されるのは、ａ１）１または複数の微粒子、ｂ１）各微小粒子内にカプセル化された１または複数の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）刺激剤、およびｃ１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくは免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む、寛容原性組成物である。

【0062】

いくつかの実施形態では、１または複数のＴｒｅｇ刺激剤は、ＣＣＬ２２、レチノイン酸、または血管作用性腸ペプチドを含む。さらなる実施形態では、１または複数のＴｒｅｇ刺激剤は、ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、またはＣＣＲ８リガンドを含む。さらに他の実施形態では、１または複数のＴｒｅｇ刺激因子は、ＴＧＦβ、ＩＬ２、およびラパマイシンを含む。さらなる実施形態では、寛容原性組成物は、ｉ）ＴＧＦβを含む微粒子、ｉｉ）ＩＬ－２を含む微粒子、およびｉｉｉ）ラパマイシンを含む微粒子を含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、微粒子は少なくとも１つのポリマーを含む。さらなる非限定的な例では、少なくとも１つのポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アミノ酸）、ポリラクタート（ｐｏｌｙｌａｃｔａｔｅ）、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリグルタミン酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール－ｂ－（ＤＬ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ｂ－エチレングリコール）（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧ）、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン－ＰＥＧ（ＰＣＬ－ＰＥＧ）、ポリ（フッ化ビニリデン）－ＰＥＧ（ＰＶＤＦ－ＰＥＧ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－ＰＥＧ）（ＰＬＡ－ＰＥＧ）、ポリ（メチルメタクリレート）－ＰＥＧ（ＰＭＭＡ－ＰＥＧ）、およびそれらの組合せを含む。

【0064】

他の実施形態では、微粒子は、アルギナートを含む。

【0065】

さらに他の実施形態では、微粒子は、直径が約０．５～５μｍであり、ＴＧＦ－β１、ラパマイシン、および／またはＩＬ－２の持続放出を提供する。特定の非限定的な例では、微粒子は約１週間放出する。

【0066】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター融合ポリペプチドは、ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、およびｉｉ）１または複数の異種エフェクターポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、１または複数の異種エフェクターポリペプチドのうちの少なくとも１つは、一本鎖ヌクレアーゼ、二本鎖ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、デアミナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、塩基編集剤、またはプライム編集剤である。

【0067】

さらなる実施形態では、哺乳動物対象においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する方法が開示され、この方法は、有効量の本明細書に開示される寛容原性組成物を対象に投与し、それによりＣＲＩＳＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、真皮内、真皮下、皮下、または筋肉内に投与される。

【0068】

他の実施形態では、寛容原性組成物は、ａ２）溶解性マイクロニードルアレイ、ｂ２）寛容原性ＤＣの分化を促進する１または複数の薬剤、およびｃ２）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、溶解性マイクロニードルアレイは、ｉ）ベース部分を形成する生体適合性材料を含む基材、およびｉｉ）ベース部分から延在する複数のマイクロニードルを含む。さらなる実施形態では、生体適合性材料は、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、またはゼラチンを含む。特定の非限定的な例では、生体適合性材料はカルボキシメチルセルロースを含む。

【0070】

さらなる実施形態では、寛容原性樹状細胞の分化を促進する１または複数の薬剤は、ビタミンＤ３またはビタミンＤ３類似体などのビタミンまたはその類似体を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイを含む有効量の寛容原性組成物を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する方法が開示される。さらなる実施形態では、組成物は、局所的に、例えば真皮内または皮内に投与される。

【0072】

さらに他の実施形態では、寛容原性組成物は、対象に繰り返し投与される。非限定的な例では、寛容原性組成物は、プライム－ブースト戦略で対象に投与される。

【0073】

さらなる実施形態では、開示される方法は、有効量の寛容原性組成物を投与した後に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む遺伝子編集組成物を、対象に投与することを含み、寛容原性組成物が、遺伝子編集組成物中に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集組成物は、寛容原性組成物の投与の約６ヶ月以内に対象に投与される。対象はヒトであり得る。対象は、非ヒト哺乳動物であり得る。

【0074】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド
開示される方法は、１または複数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む１または複数の融合ポリペプチドを含む寛容原性組成物を使用する。使用に適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、本明細書ではクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドとも呼ばれるクラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターポリペプチドである。例えば、いくつかの場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。いくつかの場合、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターポリペプチドはＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、例えばＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄまたはＣａｓ１２ｅポリペプチドである。いくつかの場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、例えばＣａｓ１３ａポリペプチド、Ｃａｓ１３ｂポリペプチド、Ｃａｓ１３ｃポリペプチドまたはＣａｓ１３ｄポリペプチドである。いくつかの場合、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターポリペプチドはＣａｓ１４ポリペプチドである。いくつかの場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｃａｓ１４ａポリペプチド、Ｃａｓ１４ｂポリペプチドまたはＣａｓ１４ｃポリペプチドである。使用に適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲｉポリペプチドを含む。例えば、Ｑｉら（２０１３）、Ｃｅｌｌ、１５２：１１７３；およびＪｅｎｓｅｎら（２０２１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．２７５６０７．１２１を参照のこと。使用に適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲａポリペプチドを含む。例えば、Ｊｅｎｓｅｎら（２０２１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．２７５６０７．１２１；およびＢｒｅｉｎｉｇら（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：５１を参照のこと。使用に適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲｏｆｆポリペプチドを含む。例えば、Ｎｕｎｅｚら（２０２１）、Ｃｅｌｌ、１８４：２５０３を参照のこと。使用に適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ニッカーゼを含む。使用に適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、標的核酸への結合（ガイドＲＮＡと複合体化した場合）を保持する触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む。使用に適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、およびｉｉ）１または複数の異種融合パートナー（「異種ポリペプチド」とも呼ばれる）を含む、融合ポリペプチドを含む。Ｃａｓヌクレアーゼの非限定的な例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ３、Ｃ２ｃ２ ａｎｄ Ｃ２ｃ１Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃａｓ ｌａｍｂｄａ、Ｃａｓ ｐｈｉ、Ｃａｓ Ｘ、およびＣａｓ Ｙ、ならびにそれらの相同体を含む。これらのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドの免疫原性断片も、開示される組成物に含まれ得る。

【0075】

いくつかの場合、本開示の組成物に含めるのに適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。いくつかの場合、Ｃａｓ９ポリペプチドは、図１１Ａに示されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９アミノ酸配列（配列番号１）と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0076】

いくつかの場合、Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）ポリペプチドである。いくつかの場合、ｓａＣａｓ９ポリペプチドは、任意の既知のｓａＣａｓ９アミノ酸配列、例えば図１１Ｂに示されるｓａＣａｓ９アミノ酸配列（配列番号２）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0077】

いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、高忠実度（ＨＦ）Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０。例えば、図１Ａに示されるアミノ酸配列のアミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５およびＱ９２６は、例えばアラニンで置換される。例えば、ＨＦ Ｃａｓ９ポリペプチドは、図１Ａに示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５およびＱ９２６は、例えばアラニンで置換されている。いくつかの場合において、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、変化したＰＡＭ特異性を示す。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２３：４８１を参照のこと。

【0078】

いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、Ｒ６９１Ａ置換を含む。例えば、いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、図１１Ａに示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸６９１はＡｌａである。

【0079】

いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５ＱおよびＴ１３３７Ｒ置換を含む。例えば、いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、図１Ａに示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸１１３５はＶａｌであり、アミノ酸１３３５はＧｌｎであり、アミノ酸１３３７はＡｒｇであり、Ｃａｓ９ポリペプチドは緩和されたＰＡＭ要件を示す。

【0080】

いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、ＳｐＲＹ変異体である。例えば、ＺｈａｎｇおよびＺｈａｎｇ（２０２０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３６：５４６；およびＷａｌｔｏｎら（２０２０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６８：２９０；および米国特許出願公開第２０２１／０２８４９７８号を参照のこと。ＳｐＲＹはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の変異体であり、この変形例ではＰＡＭ要件が低減されている。例えば、いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、Ｄ１１３５Ｌ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｑ、Ｒ１３３５ＱおよびＴ１３３７Ｒ置換を含む。例えば、いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、図１１Ａに示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸１１３５はＬｅｕであり、アミノ酸１１３６はＴｒｐであり、アミノ酸１２１８はＬｙｓであり、アミノ酸１２１９はＧｌｎであり、アミノ酸１３３５はＧｌｎであり、アミノ酸１３３７はＡｒｇである。いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、図１１Ａに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。以下の位置の１、２、３、４、５、または６つすべてにアミノ酸置換を含む：Ｅ１２１９（例えば、Ｅ１２１９Ｑ、Ｅ１２１９Ｈ、Ｅ１２１９ＳまたはＥ１２１９Ｖ置換）；Ｓ１１３６（例えば、Ｓ１１３６Ｗ、Ｓ１１３６Ｆ、Ｓ１１３６Ａ、またはＳ１１３６Ｖ置換）；Ｄ１１３５（例えば、Ｄ１１３５Ｌ、Ｄ１１３５Ａ、Ｄ１１３５ＷまたはＤ１１３５Ｆ置換）；Ｇ１２１８（例えば、Ｇ１２１８Ｒ、Ｇ１２１８ＫまたはＧ１２１８Ｓ置換）；Ｒ１３３５（例えば、Ｒ１３３５Ｑ置換）；およびＴ１３３７（例えば、Ｔ１３３７ＲまたはＴ１３３７Ｋ置換）。

【0081】

いくつかの場合、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９－ＮＧポリペプチドである。例えば、Ｚｈｏｎｇら（２０１９）Ｍｏｌｅｃ．プラント１２：１０２７；Ｈｕら（２０１８）、Ｎａｔｕｒｅ、５５６：５７；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕら（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６１：１２５９を参照のこと。Ｃａｓ９核酸およびタンパク質配列は、公的に入手可能である。例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＣＰ０１２０４５．１のヌクレオチド７９６６９３．．８００７９９およびＣＰ０１４１３９．１のヌクレオチド１１０００４６．．１１０４１５２は、Ｃａｓ９核酸を開示しており、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＭＡ７０６８５．１およびＡＫＰ８１６０６．１は、Ｃａｓ９タンパク質を開示している。いくつかの例では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ欠損（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＫＡ６０２４２．１およびＫＲ０１１７４８．１に示されるもの）であるものなどのＣａｓ９の非活性化形態（ｄＣａｓ９）である。特定の例では、Ｃａｓ９は、そのような配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、ＤＮＡをカットする能力を保持する。

【0082】

いくつかの場合、適切なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。いくつかの場合、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターポリペプチドはＣａｓ１２ａタンパク質である。いくつかの場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、任意の公知のＣａｓ１２ａタンパク質と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、図１１Ｃまたは図１１Ｄに示されるＣａｓ１２ａアミノ酸配列を含む。

【0083】

場合により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドまたはその免疫原性断片、およびｂ）１または複数の異種ポリペプチド（融合パートナーとも呼ばれる）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター融合ポリペプチドである。いくつかの場合、１または複数の異種ポリペプチドは、一本鎖ヌクレアーゼ、二本鎖ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、デアミナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、塩基編集剤、またはプライム編集剤を含む。いくつかの場合、１または複数の異種ポリペプチドは、核局在化シグナルを含む。いくつかの場合、融合パートナー（異種ポリペプチド）は逆転写酵素である。いくつかの場合、融合パートナーは、塩基編集剤である。いくつかの場合、融合パートナー（異種ポリペプチド）は、デアミナーゼである。融合ポリペプチドはまた、適切な担体を含むことができる。

【0084】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、当技術分野で公知であり、親ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドと比較して免疫原性が低下している（参照により組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１７／０８１２８８Ａ１を参照のこと）。これらの組換えＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、野生型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドの１または複数のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ結合部位に対応する１または複数の残基に１または複数のアミノ酸置換を含み、組換えＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、野生型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドと比較して免疫原性が低下している。

【0085】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドの免疫原性断片、例えばＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ結合部位に対応する免疫原性断片もまた有用である。免疫原性断片は、９（９量体）または１０（１０量体）のアミノ酸を含み得る。免疫原性断片は、寛容原性免疫応答を誘導することができる。さらなる実施形態では、断片は、８、９、１０、１１または１２アミノ酸長さである。免疫原性断片の混合物も有用である。混合物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる断片を含むことができる。これらの免疫原性断片は、寛容原性免疫応答を誘導するために使用され得る。

【0086】

対象の処置のために、１または複数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、または１または複数の融合ポリペプチドの活性、患者の投与様式、年齢および体重に応じて、異なる用量が必要な場合がある。特定の状況下では、より高い用量またはより低い用量が適切であり得る。用量の投与は、個々の用量単位またはいくつかのより小さい用量単位の形態での単回投与、および特定の間隔での細分された用量の複数回投与の両方によって行うことができる。熟練した臨床医は、寛容を誘導するための有効用量を容易に決定することができる。

【0087】

対象への投与のために、有効量の１または複数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む１または複数の融合ポリペプチドを、薬学的に許容され得る担体に含めることができる。これらの医薬組成物は、用量単位で調製および投与することができる。液体製剤は、一般に有用である。固体用量単位は、錠剤、カプセル剤、単回注射剤およびさらには坐剤である。適切な投与フォーマットは、各対象に対して個別に医師によって最もよく決定され得る。様々な薬学的に許容され得る担体およびそれらの製剤は、標準的な製剤専門書、例えばＥ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。Ｗａｎｇ、Ｙ．Ｊ．およびＨａｎｓｏｎ、Ｍ．Ａ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．１０、Ｓｕｐｐ．４２：２Ｓ、１９８８も参照のこと。医薬組成物の剤形は、選択された投与様式によって決定される。一般に、医薬組成物は、有効量のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、免疫原性断片および融合ポリペプチドを含む。

【0088】

適切な固体または液体医薬製剤形態は、例えば、顆粒、散剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、エアロゾル、滴剤またはアンプル形態の注射液、ならびに１または複数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む１または複数の融合ポリペプチドの持続放出を有する製剤であり、その製剤賦形剤および添加剤ならびに／または補助剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味料、可溶化剤またはスキャフォールドが慣用的に使用される。医薬組成物は、様々な薬物送達系における使用に適している。薬物送達のための本方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３、１９９０を参照のこと。

【0089】

本開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、免疫原性断片、および融合ポリペプチドに限定されない。本開示の組成物および方法は、とりわけ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの他の系と共に使用される。

【0090】

微粒子
１または複数の微粒子、１または複数の微粒子内にカプセル化された１または複数のＴｒｅｇ刺激剤、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む寛容原性組成物が提供される。例示的なＴｒｅｇ刺激剤は、Ｃ－Ｃケモカインモチーフ（ＣＣＬ２２）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、ラパマイシン、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、レチノイン酸、および血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）を含む。

【0091】

特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ刺激剤は、Ｔｒｅｇを漸加するのに非常に有効である。特に、ＣＣＬ２２、レチノイン酸およびＶＩＰは、Ｔｒｅｇを漸加する。特定の実施形態では、治療剤担持微粒子は、Ｔｒｅｇを漸加するのに非常に有効である。微粒子は、内因性Ｔｒｅｇ細胞を局所部位に漸加するのに有効である。

【0092】

特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ刺激剤は、Ｔｒｅｇを誘導するのに非常に有効である。特に、ＩＬ－２、ラパマイシンおよびＴＧＦ－βは、Ｔｒｅｇを誘導するのに有効である。特定の実施形態では、治療剤担持微粒子は、Ｔｒｅｇを刺激するのに非常に有効である。溶解性ミクロスフェアは、局所部位で内因性Ｔｒｅｇ細胞を刺激するのに有効である。

【0093】

特定の実施形態では、理論に束縛されるものではないが、寛容は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からの対象自身のＴｒｅｇの誘導によって誘導される。このアプローチは、寛容原性樹状細胞（ｔＤＣ）として公知の抗原提示細胞のサブセットを介して末梢ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞をＴｒｅｇに分化させるために身体自体の天然の機構を利用する。具体的には、ｔＤＣは、ＩＬ－２およびＴＧＦ－βサイトカインの分泌を介してＴｒｅｇの分化を誘導することができる。しかしながら、Ｔｒｅｇの維持は、幾分より複雑であり、Ｔｒｅｇの分化に有利であるだけでなく、他のエフェクターＴ細胞への分化にも不利である局所微小環境に依存する。細胞が病原性エフェクターＴ細胞に分化しないことを確実にする１つの方法は、小分子ラパマイシンによるものである。ラパマイシン（Ｒａｐａ）は、エフェクターＴ細胞の生成および増殖を抑制することができるｍＴＯＲ阻害剤である。ラパマイシン誘導体も有用であり、当技術分野で公知である。

【0094】

特定の実施形態では、身体自身の内因性Ｔｒｅｇは、ＴＧＦ－β１、ＲａｐａおよびＩＬ－２をカプセル化する微粒子であるＴＲＩミクロスフェア（ＴＧＦ－β１、ラパマイシン（Ｒａｐａ）またはその誘導体、およびＩＬ－２）を通してＴｒｅｇ誘導剤の組み合わせを送達することによって濃縮される。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ－β１、ＲａｐａおよびＩＬ－２は、別々の微粒子に含まれ、混合物が投与される。したがって、いくつかの実施形態では、寛容原性組成物は、ｉ）ＴＧＦβを含む微粒子、ｉｉ）ＩＬ－２を含む微粒子、およびｉｉｉ）ラパマイシン（またはその誘導体）を含む微粒子を含む。理論に束縛されるものではないが、この系はＴｒｅｇの有病率を増加させ、ひいては寛容を誘導することができる。

【0095】

１または複数の微粒子は、皮下注射または筋肉内注射によって送達され得る。微粒子は、ゲルなどの粘膜表面に送達することができる。１または複数の微粒子は、局所注射または局所保持系によって送達され得る。１または複数の微粒子は、インビボ遺伝子編集の部位またはその近傍に投与される。１または複数の微粒子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、その免疫原性断片、または融合ポリペプチドと同じ位置／部位で欠失させることができる。

【0096】

特定の実施形態では、１または複数の微粒子に担持される１または複数のＴｒｅｇ刺激剤の量は、微粒子１ｍｇ当たり約１ｎｇ～約１ｍｇ、より具体的には約１ｎｇ～約１００μｇの薬剤の範囲であり得る。特定の具体的な実施形態では、１または複数の微粒子に担持された１または複数のＴｒｅｇ刺激剤の量は、微粒子１ｍｇ当たり約２５ｎｇ～７．５μｇの薬剤である。Ｔｒｅｇ刺激剤は、ＩＬ－２またはＴＧＦ－β１であり得る。Ｔｒｅｇ刺激剤は、別個の微粒子に含めることができ、または複数のＴｒｅｇ刺激剤を含む１つの微粒子に含めることができる。本明細書で使用される場合、「微粒子」の投与は、Ｔｒｅｇ刺激剤を含む１または複数の微粒子の投与を対象とする。

【0097】

適切な用量は、限定されないが、約２００ｍｇのポリマーあたり約５μｇ～約１００μｇのＩＬ－２を含む。適切な用量は、限定されないが、約２００ｍｇのポリマーあたり約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００μｇのＩＬ－２を含む。適切な用量は、限定されないが、約２００ｍｇのポリマーあたり約５μｇ～約１００μｇのＴＧＦ－β１を含む。適切な用量は、限定されないが、約２００ｍｇのポリマーあたり約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００μｇのＴＧＦ－β１を含む。適切な用量は、限定されないが、約２００ｍｇのポリマーあたり約１．５ｍｇ～約２ｍｇのラパマイシンを含む。適切な用量は、限定されないが、約２００ｍｇのポリマーあたり約７．５μｇ～約２ｍｇのラパマイシンも含む。適切な用量は、限定されないが、ポリマー１ｍｇ当たり約１０μｇのラパマイシンも含む。

【0098】

さらに他の実施形態では、微粒子は、直径が約０．５～５μｍであり、ＴＧＦ－β１、ラパマイシン、および／またはＩＬ－２の持続放出を提供する。特定の例では、微粒子は約１週間放出する。

【0099】

微粒子は、少なくとも１つのポリマーを含む。微粒子のためのポリマーは、生体適合性である限り、生体内分解性ポリマーであり得る。生体内分解性ポリマーは、ポリ乳酸およびそのコポリマーなどのポリヒドロキシ酸を含む。例示的なポリマーは、ポリグリコリド、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む。別のクラスの承認された生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエートである。他の適切なポリマーは、限定されないが、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそれらのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレンポリエチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニルポリスチレン、ポリビニルピロリドン、アルギナート、ポリ（カプロラクトン）、デキストランおよびキトサンを含む。いくつかの非限定的な例では、微粒子はアルギナートを含むことができる。他の非限定的な例では、ポリマーはエステル末端ＰＬＧＡである。

【0100】

さらなる実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコール－ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）コポリマーである。さらなる実施形態では、少なくとも１つのポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アミノ酸）、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔａｔｅ）、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリグルタミン酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール－ｂ－（ＤＬ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ｂ－エチレングリコール）（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧ）、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン－ＰＥＧ（ＰＣＬ－ＰＥＧ）、ポリ（フッ化ビニリデン）－ＰＥＧ（ＰＶＤＦ－ＰＥＧ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－ＰＥＧ）（ＰＬＡ－ＰＥＧ）、ポリ（メチルメタクリレート）－ＰＥＧ（ＰＭＭＡ－ＰＥＧ）、およびそれらの組合せを含む。

【0101】

担持パーセントは、カプセル化される薬剤に対するポリマーの親水性または疎水性によって「マッチング」によって増加され得る。ＰＬＧＡなどのいくつかの場合、これは、コポリマーが親水性薬物に対してより親水性であるか、または疎水性薬物に対してより親水性でないようにモノマー比を選択することによって達成することができる。あるいは、ポリマーは、例えば、ポリマー上にカルボキシル基を導入することによって、より親水性にすることができる。非限定的な例では、親水性薬物と疎水性薬物との組み合わせは、より親水性のＰＬＧＡとＰＬＡなどの疎水性ポリマーとのブレンドから調製された微粒子にカプセル化することができる。

【0102】

いくつかの実施形態では、ポリマーは、ＰＬＧＡコポリマーまたはＰＬＧＡとＰＬＡとのブレンドである。ＰＬＧＡの分子量は、約１０ｋＤ～約８０ｋＤ、より好ましくは約１０ｋＤ～約３５ｋＤである。ＰＬＡの分子量範囲は、約２０～約３０ｋＤａである。ラクチドとグリコリドとの比は、約７５：２５～約５０：５０である。一実施形態では、比率は５０：５０である。例示的なポリマーは、限定されないが、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ、乳酸対グリコール酸比５０：５０、Ｍ_ｎ＝１０ｋＤａ、酸末端、５０２Ｈと呼ばれる）；ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ、乳酸対グリコール酸比５０：５０、Ｍ_ｎ＝２５ｋＤａ、酸末端、５０３Ｈと呼ばれる）；ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ、乳酸対グリコール酸比５０：５０、Ｍ_ｎ＝３０ｋＤａ、酸末端、５０４Ｈと呼ばれる）；ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ、乳酸対グリコール酸比５０：５０、Ｍ_ｎ＝３５ｋＤａ、エステル末端、５０４と呼ばれる）；およびポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ、７５：２５乳酸対グリコール酸比、Ｍ_ｎ＝１０ｋＤａ、７５２と呼ばれる）を含む。

【0103】

微粒子は、直径が約０．１μｍ～約１０００μｍの範囲、またはそれらの間の任意の範囲、例えば０．１μｍ～０．５μｍ、０．５μｍ～１．０μｍ、約１．０μｍ～約５．０μｍ、約５．０μｍ～約１０．０μｍ、約１０．０μｍ～約２０．０μｍ、約２０．０μｍ～約３５．０μｍ、約３５．０μｍ～約５０．０μｍ、約５０．０μｍ～約７５．０μｍ、約７５．０μｍ～約１００．０μｍ、約１００．０μｍ～約２５０．０μｍ、約２５０．０μｍ～約５００．０μｍ、約５００．０μｍ～約７５０μｍ、または約７５０．０μｍ～約１０００．０μｍであり得る。一実施形態では、微粒子は、直径が約０．１μｍ～１μｍ、例えば約０．２μｍ～約１μｍ、約０．３μｍ～約１μｍ、約０．４μｍ～約１μｍ、または約０．５μｍ～約１μｍの範囲である。別の実施形態では、微粒子は、直径が約０．１μｍ～５μｍ、例えば約０．２μｍ～約５μｍ、約０．３μｍ～約５μｍ、約０．４μｍ～約５μｍ、または約０．５μｍ～約５μｍの範囲である。特定の実施形態では、担持微粒子は、２００ｎｍ～３０μｍ、より具体的には１～１０μｍの体積平均直径を有し得る。特定の実施形態では、薬剤担持微粒子は、１０μｍまたはそれを超える体積平均直径を有さない。微粒子は、例えば、直径約１５μｍ～３０μｍ、例えば直径約１５、２０、２５、または３０μｍであり得る。微粒子は、例えば、直径約０．５μｍ～５μｍ、例えば直径約０．５、１、２、３、４、または５μｍであり得る。微粒子は、例えば、直径約２μｍであり得る。薬剤担持微粒子は、細孔が少ないか、または典型的には合成プロセス中にＮａＣｌを添加することによって、制御される様々なサイズの様々な量の細孔を含有し得る。

【0104】

薬剤担持微粒子作製方法は、水への所望のカプセル化剤の溶解度、微粒子の分解速度およびその後の薬物放出動態を制御する微粒子を作製するために使用されるポリマー鎖の分子量（ＭＷは約１０００Ｄａ～１００，０００Ｄａの範囲であり得る）に応じて、単一または二重エマルジョンであり得る。

【0105】

本明細書に開示される方法で使用される微粒子は、持続放出を提供し得る。例えば、持続放出は、少なくとも１日、より具体的には少なくとも５日間または少なくとも１０日間、最も具体的には少なくとも３０日間にわたるものであり得る。薬剤放出は、線形または非線形（単一または複数のバースト放出）であり得る。特定の実施形態では、薬剤はバースト効果なしで放出され得る。例えば、持続放出は、少なくとも１日、より具体的には少なくとも５日間または少なくとも１０日間、最も具体的には少なくとも３０日間にわたって、インビボでの治療剤の実質的に線形の放出速度を示し得る。実質的に線形の放出速度とは、治療剤が、所望の期間にわたって約２０％を超えて、より通常には約１０％を超えて変動しない速度で放出されることを意味する。系の寿命にわたって送達系からの薬剤の比較的一定の放出速度を提供することが望ましい場合がある。例えば、系の寿命の間、薬剤が１日当たり０．１～１００μｇ、より具体的には１日当たり１～１０μｇの量で放出されることが望ましい場合がある。ただし、ポリマー微粒子の製剤化によっては、放出速度が増減する場合がある

【0106】

特定の実施形態では、送達系は、１ｐｇ／ｍｌ～２００μｇ／ｍｌ、例えば１～５μｇ／ｍｌの範囲の局所濃度を提供するのに有効な量の薬剤を放出し得る。具体的な非限定的な実施形態は、約１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２、約５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β１、および約１０ｎｇ／ｍｌのラパマイシンである（Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １５９（１）：７８－８４、２０１２参照のこと）。特定の実施形態では、放出の初期遅滞期はない。所望の放出速度および標的薬物濃度は、選択される特定の薬剤に応じて変化し得る。

【0107】

本明細書に開示される方法で使用される微粒子は、薬剤の持続放出を提供することができる。本明細書で使用される「持続放出」または「制御放出」という用語は、所定の速度での任意の結合またはカプセル化された薬剤の漏出を指す。例えば、ポリマー粒子（すなわち、例えば、人工抗原提示細胞）の予測可能な生分解から生じる薬剤の持続放出が起こり得る。生分解速度は、ポリマー組成および／または粒子を含む比率を変更することによって予め決定され得る。その結果、持続放出は短期間であり得るか、または制御放出は長期間であり得る。

【0108】

一実施形態では、短期放出は３０分～１時間である。一実施形態では、短期放出は１時間～３時間である。一実施形態では、短期放出は３時間～１０時間である。一実施形態では、短期放出は１０時間～２４時間である。

【0109】

一実施形態では、長期放出は２４時間～３６時間である。一実施形態では、長期放出は３日間～７日間である。一実施形態では、長期放出は７日間～１ヶ月間である。いくつかの実施形態では、微粒子は、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間または３ヶ月間など、１または複数のＴｒｅｇ刺激剤の持続放出を提供する。いくつかの実施形態では、長期放出は、約１週間、例えば約２日～約１週間、約３日～約１週間、約４日～約１週間、約５日～約１週間、または約６日～約１週間である。長期放出は、約１ヶ月未満であり得る。

【0110】

一実施形態では、長期放出は１ヶ月～６ヶ月である。一実施形態では、長期放出は６カ月～１年である。一実施形態では、長期放出は少なくとも１ヶ月である。

【0111】

本明細書に開示される微粒子を含む寛容原性組成物は、賦形剤成分、例えば有効量の緩衝剤、および滅菌中の電離放射線の影響から保護するための酸化防止剤を含み得る。適切な水溶性緩衝剤は、限定されないが、アルカリおよびアルカリ土類炭酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩など、例えばリン酸ナトリウム、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、重炭酸塩、炭酸塩などを含む。これらの薬剤は、有利には、系のｐＨを約２～約９、より好ましくは約４～約８に維持するのに十分な量で存在する。したがって、緩衝剤は、全系の約５％（重量基準）程度であり得る。適切な水溶性防腐剤は、重亜硫酸ナトリウム、重硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸塩、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、パラベン、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、ベンジルアルコール、フェニルエタノールなど、およびそれらの混合物を含む。これらの薬剤は、０．００１～約５％（重量基準）、好ましくは０．０１～約２％（重量基準）の量で存在し得る。

【0112】

特定の実施形態では、本明細書に開示される微粒子は、注射によって投与され得る。注射部位は、限定されないが、皮内、皮下、皮下、または筋肉内投与を含む。いくつかの実施形態では、微粒子を含む寛容原性組成物は、静脈内投与によって送達される。

【0113】

マイクロニードルアレイ
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、その免疫原性断片、または融合ポリペプチドは、溶解性マイクロニードルアレイで投与することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ－２０１６－０２７１３８１－Ａ１号、および参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０２０／２３２３９４を参照のこと。いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイは先端担持マイクロアレイであり、これは、マイクロミル粉砕されたマスター鋳型およびスピン鋳型を使用して調製され得る。米国特許出願公開第ＵＳ－２０１６－０２７１３８１－Ａ１号を参照のこと。ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０２０／２３２３９４に開示されているように、アンダーカットまたはアンカー特徴は、塗布中の皮膚保持を改善することができ、また処理工程を妨げることなく達成することができ、それによってＭＮＡを鋳型から直接除去することを可能にする。マイクロニードルデバイスの有用性の例は、例えば、（１）開示されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドと、必要に応じて寛容原性免疫応答を生成するための他の薬剤との同時送達、および（２）局所皮膚送達を含む。

【0114】

溶解性マイクロニードルアレイは、皮膚および粘膜表面への効率的かつ安全な送達を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドの効果的な送達を可能にする完全溶解性マイクロニードルアレイ基材および独自のマイクロニードルジオメトリを利用することができる。この技術はまた、多機能薬物送達のための複数の化学的に異なる薬剤の同時共送達を独自に可能にすることができる。薬剤は、例えば、部分配列抗原曝露に対する低応答性を誘導することによって、またはＴ細胞がＴｒｅｇに分化するように誘導することによって、寛容原性樹状細胞の分化を促進することができる。

【0115】

いくつかの実施形態では、薬剤は、ビタミンＤもしくはその類似体、例えばビタミンＤ３、またはビタミンＤ３類似体である。ビタミンＤ３は、以下の構造を有する。

【化1】

【0116】

カルシポトリエン（カルシポトリオールまたはＭＣ－９０３としても公知）は、当技術分野で公知のビタミンＤ３類似体である。カルシポトリエンは、以下の構造を有する。

【化2】

例えば、Ｍａｓｕｄａら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：４７９を参照のこと。

【0117】

アルファカルシドールも、利用され得る。アルファカルシドールは、以下の構造を有する。

【化3】

【0118】

タカルシトールも、利用され得る。タカルシトールは、以下の構造を有する。

【化4】

【0119】

寛容原性ＤＣの分化を促進する他の適切な薬剤は、限定されないが、レチノイン酸、デキサメタゾン、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－βを含む。

【0120】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｃａｓ９に対する寛容を促進するための、それを必要とする対象における対象への経皮挿入、例えば局所皮膚送達のための溶解性マイクロニードルアレイである。アレイは、ベース部分と、ベース部分から延在し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、その免疫原性断片または融合ポリペプチドを含有する複数のマイクロニードルと、必要に応じて追加の薬剤とを含む。

【0121】

マイクロニードルは、上部に第１の断面寸法、底部に第２の断面寸法、および中間部に第３の断面寸法を含む形状を有するように予め形成することができ、中間部は上部と底部との間に位置し、第３の断面寸法は第１および第２の断面寸法よりも大きい。

【0122】

さらに他の実施形態では、各マイクロニードルは、不溶性生体適合性材料の複数の層を含む。いくつかの実施形態では、ニードル先端部に組み込まれる様々な活性成分をもたらす製造技術が利用される（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ－２０１６－０２７１３８１－Ａ１号を参照）。したがって、このように活性成分を局在化させることにより、マイクロニードルアレイボリュームの残りの部分は、非活性であり、一般に安全と見なされるより安価なマトリックス材料を含む。正味の結果は、（１）マイクロニードルアレイの非ニードル部分に組み込まれた送達不可能な活性成分の廃棄の減少、および（２）皮膚貫通ニードル先端部におけるより高い薬物濃度に基づく薬物送達の効率の大幅な改善である。

【0123】

したがって、いくつかの実施形態では、活性成分は、それぞれのアレイのマイクロニードル先端に濃縮される。したがって、従来のマイクロニードルアレイとは対照的に、支持基部構造には活性成分がほとんどまたは全く存在しないので、活性成分はマイクロニードルアレイ全体にわたって均一な濃度で存在しない。さらに、いくつかの実施形態では（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国公開特許出願第ＵＳ－２０１６－０２７１３８１－Ａ１号の図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、および図４Ｂに示されるように）、支持構造内に活性成分がほとんどまたは全く存在しないだけでなく、活性成分の位置はアレイ内の個々のマイクロニードルの上半分に集中している。いくつかの実施形態では、活性成分は、個々のマイクロニードルの上半分に濃縮された。活性成分は、マイクロニードルの先端に濃縮され、先端は、ベース部分から狭窄および／またはテーパ状に延びるマイクロニードルの領域によって画定される。ベース部分は、アレイの支持構造から延在する。

【0124】

上記のように、いくつかの実施形態では、個々のマイクロニードルは、マイクロニードルの上半分のみに活性成分を含むことができる。他の実施形態では、個々のマイクロニードルは、マイクロニードルの先端または先端付近の狭窄部にのみ活性成分を含むことができる。さらに他の実施形態では、個々のニードルは、支持構造から延びるマイクロニードル部分全体にわたって活性成分を含むことができ、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ－２０１６－０２７１３８１－Ａ１号を参照のこと。

【0125】

開示された寛容原性組成物は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７３６３に開示されているように送達され得る。このＰＣＴ出願は、角質層を貫通してそれらのカーゴ（例えば、生物製剤または生物活性成分）を表皮および／または真皮に送達するように構成され得るマイクロニードルアレイを開示し、一方、神経終末および血管を含み得るより深い層への貫通を防止することによって疼痛および出血を最小限に抑える。ピラミッド状ＣＭＣマイクロニードルは、生きているヒト皮膚の角質層、表皮、および真皮を効果的に貫通し、したがって皮膚送達に使用され得る。したがって、いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、ピラミッド状ＣＭＣマイクロニードルを含む。他の実施形態では、マイクロニードルアレイはオベリスク形状のニードルを含む。

【0126】

マイクロニードルアレイを構築するために、基材を使用して、生物活性成分を有する各マイクロニードルの部分およびそうでない部分を形成することができる。上述のように、各マイクロニードルは、マイクロニードルのみ、またはいくつかの実施形態では、マイクロニードルの上半分のみ、または他の実施形態では、先端付近で先細になるマイクロニードルの一部のみに生物活性成分を含むことができる。したがって、生物活性成分の送達を制御し、マイクロニードルアレイのコストを制御するために、各マイクロニードルは、生物活性成分（免疫原および／またはアジュバント）を含む部分と、生物活性成分を含まない部分とを有することができる。本明細書に記載の実施形態では、生物活性成分を含まない部分は、マイクロニードルアレイの支持構造、およびいくつかの実施形態では、アレイ内の各マイクロニードルのベース部分（例えば、下半分）を含む。

【0127】

いくつかの実施形態では、溶解性マイクロニードルアレイは、溶解性マイクロニードルアレイが、ｉ）ベース部分を形成する生体適合性材料を含む基材、およびｉｉ）ベース部分から延在する複数のマイクロニードルを含むを、含む。マイクロニードルアレイのための基材として、様々な生体適合性材料が使用され得る。

【0128】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドおよび／またはビタミンＤもしくはその類似体を含む融合ポリペプチドなどの１つの生物活性成分は、ジスルフィド結合などによって生体適合性材料に共有結合することができる。場合によっては、生体適合性材料はカルボキシメチルセルロースであり得る。結合は、酵素によって、および／またはｐＨ、温度もしくはその両方に応答してインビボで切断可能であり得る。１または複数の生物活性成分は、同じまたは異なる生物活性成分であってもよく、生物活性成分の一方または両方を生体適合性材料にコンジュゲートされ得る。生物活性成分は、限定されないが、寛容原性ＤＣ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、その免疫原性断片、または融合ポリペプチドの分化を促進する薬剤を含み得る。

【0129】

生分解性固体マイクロニードルの構造基材は、最も一般的は、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ベースの製剤を含む。しかしながら、他の塩基を使用することもできる。他のポリマー材料は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ゼラチン、および／またはこれらの２またはそれを超える混合物を含む。他の小分子賦形剤、例えば非還元糖（例えば、トレハロース、スクロースなど）が、含まれ得る。ＰＬＧＡは水溶性ではない生分解性ポリマーであるが、ＣＭＣ、ＰＶＰ、ＰＶＡ、ＨＡおよびゼラチンは水に溶解可能である。

【0130】

いくつかの実施形態では、生体適合性材料はＣＭＣである。ＰＬＧＡベースの装置は、製造に必要な比較的高温（例えば、摂氏１３５度またはそれより高い摂氏度）ならびに真空および／または有機溶媒のために、薬物送達およびタンパク質送達用途を制限する可能性がある。対照的に、ＣＭＣベースのマトリックスは、単純なスピンキャスティングおよび乾燥プロセスで、室温で形成することができ、それにより、ＣＭＣマイクロニードルアレイが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドの組み込みにとってより望ましいものになる。

【0131】

ＣＭＣ－ヒドロゲルは、滅菌ｄＨ_２Ｏ中の活性成分（以下に記載）を含むかまたは含まないＣＭＣの低粘度ナトリウム塩から調製することができる。例示的な実施形態では、ＣＭＣを滅菌蒸留水（ｄＨ_２Ｏ）および活性成分と混合して、約２５重量％のＣＭＣ濃度を達成することができる。得られた混合物を均一になるまで撹拌し、約４℃で２４時間平衡化することができる。この期間中、ＣＭＣおよび任意の他の成分を水和させることができ、ヒドロゲルを形成することができる。ヒドロゲルを真空中で約一時間脱気し、約２０，０００ｇで一時間遠心分離して、ＣＭＣマイクロニードルアレイの穿刺／乾燥プロセスを妨害し得る残留マイクロサイズ気泡を除去することができる。ヒドロゲルの乾燥物質含有量は、その一部（１０ｇ）を摂氏８５度で約７２時間乾燥させることによって試験することができる。すぐに使用可能なＣＭＣ－ヒドロゲルは、使用するまで約４℃で保存することが望ましい。

【0132】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、その免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドなどの活性成分、および必要に応じてビタミンＤまたはビタミンＤ類似体などの別の薬剤は、スピンキャスティングプロセスの前に、比較的高い（２０～３０％）ＣＭＣ乾燥生物製剤重量比でＣＭＣのヒドロゲルに組み込まれ得る。アレイは、室温でスピンキャストされ得、プロセスを構造的に広範囲の生物活性成分の機能的安定性と適合させる。マスター鋳型および生産鋳型は、多数の製造サイクルで再利用可能であるため、製造コストが大幅に削減され得る。得られた脱水ＣＭＣマイクロニードルアレイは、一般に室温またはわずかに低い温度（約４℃など）で安定であり、組み込まれた生物製剤の活性を維持し、容易で低コストの貯蔵および分配を容易にする。

【0133】

例示的な実施形態では、製造鋳型の表面は、約５０μｌ（直径１１ｍｍの鋳型の場合）のＣＭＣ－ヒドロゲルで覆され、２，５００ｇで約５分間の遠心分離によってスピンキャストされ得る。最初のＣＭＣ－ヒドロゲル層の後、別の５０μｌのＣＭＣ－ヒドロゲルが、鋳型上に積層され、２，５００ｇで約４時間遠心分離され得る。乾燥プロセスの終わりに、ＣＭＣマイクロニードルアレイを鋳型から分離し、縁部で過剰な材料からトリミングし、収集し、約４℃で保存することができる。製造鋳型を洗浄し、マイクロニードルアレイのさらなるキャスティングに再使用され得る。

【0134】

いくつかの実施形態では、ＣＭＣ固体は、活性成分を含有しない層および活性成分を含有する層で形成することができる。参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７３６３の図１１Ａ～Ｄは、異なる形状（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７３６３の図１１Ａおよび図１１Ｂ）を有し、マイクロミリング後に活性成分を有するマイクロニードルの部分となる上層に埋め込まれた活性カーゴを有するＣＭＣ固体を示す。ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７３６３の図１２Ａおよび図１２Ｂはまた、異なる形状を有するＣＭＣ固体を示し、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７３６３の図１２Ｂは正方形を示し、図１２Ｂは長方形を示す。両方のＣＭＣ固体を、本明細書に記載のさらなる処理のための寸法に粉砕することができる。形状は、限定することを意図するものではないことを理解されたい。本明細書に開示される方法では、任意の形状が使用され得る。

【0135】

一般に、マイクロニードルは、皮膚に挿入されている間、数日間までの間、および除去されている間、送達のために無傷のままである機械的強度を有する。マイクロニードルは、直線状またはテーパ状のシャフトを有することができる。１つの実施形態では、マイクロニードルの直径は、マイクロニードルの基端で最大であり、基端から遠位の端の点まで先細になる。マイクロニードルはまた、直線状（非テーパ状）部分とテーパ状部分の両方を含むシャフトを有するように製造することができる。

【0136】

マイクロニードルは、垂直に円形断面を有するシャフトで形成することができ、または断面は非円形であり得る。例えば、マイクロニードルの断面は、多角形（例えば、星形、正方形、三角形）、長方形、または別の形状であり得る。シャフトは、１または複数のボアを有することができる。断面寸法は、典型的には、約１０ｎｍ～１ｍｍ、例えば１μｍ～２００μｍ、およびより好ましくは１０μｍ～１００μｍである。外径は典型的には約１０μｍ～約１００μｍであり、内径は典型的には約３μｍ～約８０μｍである。

【0137】

マイクロニードルの長さは、典型的には、約１μｍ～１ｍｍ、例えば約１μｍ～５０μｍ、約５０μｍ～１００μｍ、約１００μｍ～２５０μｍ、約２５０μｍ～５００μｍ、約５００μｍ～７５０μｍ、約７５０μｍ～８５０μｍ、または約７５０μｍ～１ｍｍである。長さは、挿入部分および非挿入部分の両方を考慮して、特定の用途のために選択される。マイクロニードルのアレイは、例えば、様々な長さ、外径、内径、断面形状、およびマイクロニードル間の間隔を有するマイクロニードルの混合物を含むことができる。

【0138】

マイクロニードルは、マイクロニードルアレイの支持構造に対して垂直またはある角度で配向することができる。好ましくは、マイクロニードルは、支持構造体に対して垂直に配向され、その結果、基材の単位面積当たりのマイクロニードルの密度をより大きくすることができる。マイクロニードルのアレイは、マイクロニードルの配向、高さ、または他のパラメータの混合物を含むことができる。

【0139】

場合によっては、マイクロニードルアレイの支持構造は、典型的には約５０ｍｍ^２～１５０ｍｍ^２、例えば約１００ｍｍ^２～１５０ｍｍ^２、約７５ｍｍ^２～１００ｍｍ^２、約５０ｍｍ^２～７５ｍｍ^２、約５０ｍｍ^２～６５ｍｍ^２、または約６０ｍｍ^２～６５ｍｍ^２の面積を有する基材である。

【0140】

場合によっては、基材および／またはマイクロニードルならびに他の構成要素は、デバイスが適用される皮膚、血管壁または眼などの生物学的バリアの輪郭にデバイスが適合することを可能にするために可撓性材料から形成される。可撓性装置は、貫通が取り付け面の偏りによって制限され得るので、使用中のより一貫した貫通を容易にすることができる。例えば、皮膚紋理（すなわち、小さなしわ）および毛髪のために、ヒト皮膚の表面は平坦ではない。

【0141】

場合によっては、マイクロニードルアレイを含む寛容原性組成物は真皮内投与される。場合によっては、マイクロニードルアレイを含む寛容原性組成物は真皮下投与される。場合によっては、マイクロニードルアレイを含む寛容原性組成物は皮下投与される。

【0142】

寛容を誘導するための方法
本開示は、哺乳動物対象においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する方法であって、有効量の本開示の寛容原性組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、寛容原性組成物は、ａ）１または複数の微粒子、ｂ）各微粒子内にカプセル化された１または複数の制御性Ｔｒｅｇ刺激剤、およびｃ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。他の実施形態では、寛容原性組成物は、ａ）溶解性マイクロニードルアレイ、ｂ）ビタミンＤ類似体または他の薬剤、およびｃ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。本方法は、一般に、それを必要とする対象に、有効量の本開示の寛容原性組成物を投与することを含む。

【0143】

いくつかの場合、本開示の方法は、対象においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドに対する免疫寛容を誘導し、それにより、対象へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドの投与後の反応性免疫応答を低下させる。したがって、本開示は、対象におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドに対する免疫応答を低下させる方法であって、有効量の寛容原性組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0144】

本開示の方法による処置に適した対象は、遺伝子治療を必要とする対象、または遺伝子編集組成物を投与される対象、例えば疾患を処置するため、または抗ウイルス、抗病原体、もしくは抗癌治療剤として、または生物学的研究のための対象を含む。対象は、新生児、若年者または成人であり得る。特に興味深いのは、哺乳動物対象である。本発明の方法で処理され得る哺乳動物種は、イヌ科動物およびネコ科動物；ウマ；ウシ；ヒツジ；等および霊長類、特にヒトを含む。動物モデル、特に小型哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ目（例えば、ウサギ）など）が、実験的調査に使用され得る。いくつかの非限定的な例では、対象はヒトである。他の非限定的な例では、対象は、非ヒト霊長類を含む獣医学的対象である。いくつかの実施形態では、対象は、同じもしくは異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドなどによる遺伝子編集手順を以前に有していてもよい。これらの対象は、処置のために選択することができる。

【0145】

いくつかの実施形態では、有効量の寛容原性組成物は、１または複数の用量で、Ｔｒｅｇを誘導することまたはＴｒｅｇを漸加することなどによって、対象においてＴｒｅｇを刺激する。場合によっては、有効な寛容原性組成物は、１または複数の用量で、対象におけるＴｒｅｇの数を増加させる。ＣＤ４^＋、ＦＯＸＰ３^＋およびＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇならびに／またはＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^－ＩＬ－１０^＋Ｔｒ１細胞は、反応性Ｔ細胞を抑制することができる。有効な寛容原性組成物は、１または複数の用量で、ナイーブＴ細胞に作用してＴｒｅｇへの分化を含み得る。いくつかの場合、有効量の寛容原性組成物は、それを必要とする対象に１または複数の用量で投与した場合、本明細書に記載のアッセイまたは当業者に公知の他のアッセイを使用して決定される寛容原性組成物による処置前の対象のＴｒｅｇの数と比較して、対象のＴｒｅｇの数を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍または２．５倍超増加させる量である。

【0146】

場合によっては、１または複数の用量における有効量の寛容原性組成物は、対象における寛容原性ＤＣの数を増加させる。いくつかの場合、有効量の寛容原性組成物は、それを必要とする対象に１または複数の用量で投与した場合、対象における寛容原性ＤＣの数を、寛容原性組成物による処置前の対象における寛容原性ＤＣの数と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍または２．５倍超増加させる量である。

【0147】

場合によっては、１または複数の用量における有効量の寛容原性組成物は、寛容原性ＤＣの免疫寛容誘導能力を増加させる。寛容原性ＤＣの免疫寛容誘導能は、当業者に公知の技術を用いて評価することができる。当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して、本明細書に記載の寛容原性ＤＣが免疫寛容を誘導するかどうかを評価することができる。一態様では、本明細書に記載の寛容原性ＤＣは、サイトカインの抗炎症性分泌の増加（例えばＩＬ－１０）および炎症促進性サイトカインの分泌の減弱（例えば、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＴＮＦα）を通じて抗炎症環境を作り出すことによって免疫寛容を誘導する。場合によっては、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６およびＴＮＦαを分泌する寛容原性ＤＣの能力を、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＬｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰアッセイを使用して評価する。いくつかの場合、１または複数の用量における有効量の寛容原性組成物は、寛容原性組成物による処置前の対象における寛容原性ＤＣの免疫寛容誘導能力と比較して、対象における寛容原性ＤＣの免疫寛容誘導能力を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍または２．５倍超増加させる。

【0148】

いくつかの実施形態では、寛容原性組成物は、それを必要とする対象に１または複数の用量で投与された場合、対象のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する免疫学的応答に関連する１または複数の効果を改善する。いくつかの例では、寛容原性組成物はＣＤ４^＋反応性Ｔ細胞（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドと反応性のＣＤ４^＋Ｔ細胞の数）の数を減少させ、それは次にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドと反応性のＣＤ８^＋の減少をもたらす。いくつかの例では、寛容原性組成物はＣＤ４^＋Ｔｒｅｇの数および／または活性を増加させ、それは次にＣＤ４^＋反応性Ｔ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ反応性Ｔ細胞の数および／または活性を減少させる。これらの細胞は、対象からの試料中で測定することができる。

【0149】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する免疫学的応答を決定するための方法は、当技術分野で周知である。いくつかの場合、免疫学的応答は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドによって誘導されるＴ細胞活性化のレベルを測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞の活性化レベルは、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、脱顆粒マーカーの染色、および免疫組織化学染色を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の方法を使用して測定される。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞活性化のためのマーカーは、限定されないが、ＣＤ１３７および／またはＣＤ１５４および／またはＣＤ１０７ａ（脱顆粒マーカー）を含む。特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）などのサイトカインの産生によって同定することができる。いくつかの場合、免疫学的応答は、ＥＬＩＳＡまたは当技術分野で公知の他のアッセイによってＣａｓ特異的抗体の存在を検出することによって測定される。免疫学的応答はまた、ＣＤ４、ＣＤ２５および／またはＦｏｘＰ３の発現を検出するための蛍光活性化細胞選別などによってＴｒｅｇ細胞の数を決定することによって評価することができる。

【0150】

いくつかの実施形態では、本開示の寛容原性組成物は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む遺伝子編集組成物が対象に投与される前に、対象に投与される。寛容原性組成物は、遺伝子編集組成物の約１日～約９ヶ月前、例えば約１日～約１週間、約１週間～約３週間、約３週間～約１ヶ月間、約１ヶ月～約２ヶ月間、約２ヶ月～約４ヶ月間、約４ヶ月～約６ヶ月間、または約６ヶ月～約９ヶ月間投与され得る。一実施形態では、遺伝子編集組成物は、寛容原性組成物の投与の約６ヶ月以内に対象に投与される。

【0151】

いくつかの場合、方法は、本開示の寛容原性組成物を投与する前に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む遺伝子編集組成物を対象に投与することを含む。遺伝子編集組成物は、寛容原性組成物の１日前～９ヶ月前、例えば、寛容原性組成物の１日前～１週間前、１週間前～３週間前、３週間前～１ヶ月前、１ヶ月前～２ヶ月前、２ヶ月前～４ヶ月前、４ヶ月前～６ヶ月前、または６ヶ月前～９ヶ月前に投与され得る。いくつかの場合、遺伝子編集組成物は、寛容原性組成物の投与の６ヶ月以内に対象に投与される。遺伝子編集組成物は、同じＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド、または異なるが関連するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象は、寛容原性組成物を投与する前に遺伝子編集組成物を以前に投与されており、次いで、その後、寛容原性組成物の投与後に別の遺伝子編集組成物が投与される。したがって、この実施形態では、対象は、２つ以上の遺伝子編集手順を受ける。

【0152】

いくつかの実施形態では、本方法は、本開示の寛容原性組成物に加えて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む遺伝子編集組成物を対象に投与することを含み、寛容原性組成物は、遺伝子編集組成物中に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導する。投与は、同時であり得る。

【0153】

これらの実施形態では、遺伝子編集組成物は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含むことができるが、これらに限定されない。遺伝子編集組成物に適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、限定されないが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、ＣＲＩＳＰＲｉポリペプチド、ＣＲＩＳＰＲａポリペプチド、ＣＲＩＳＰＲｏｆｆポリペプチド、および遺伝子編集組成物に必要に応じて修飾された他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドを含む。いくつかの場合、遺伝子編集組成物に含めるのに適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、標的核酸への結合（ガイドＲＮＡと複合体化した場合）を保持する触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む。いくつかの場合、遺伝子編集組成物は、ｇＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの場合、遺伝子編集組成物は、標的核酸に挿入される配列をコードする核酸を含む。

【0154】

開示された寛容原性組成物の適切な投与量は、様々な臨床的要因に基づいて、主治医または他の資格のある医療従事者によって決定され得る。医学分野で周知のように、任意の１人の患者の投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定のポリペプチドまたは核酸、患者の性別、時間および投与経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。投与の反復速度は、測定された滞留時間および体液または組織中の投与された薬剤の濃度に基づいて決定され得る。処置の成功後、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、この場合、本開示の寛容原性組成物は、その後の遺伝子療法手順のための維持用量で投与される。当業者は、用量レベルが、寛容原性組成物の種類、投与経路、および副作用に対する対象の感受性の関数として変動し得ることを容易に理解するであろう。

【0155】

場合によっては、本開示の寛容原性組成物の複数回用量が投与され、その結果、寛容原性組成物が同じ対象に繰り返し投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも２回の用量がプライムおよびブーストとして投与される。プライムおよびブーストは、同じ用量または異なる用量であり得る。

【0156】

本開示の寛容原性組成物の投与頻度は、種々の因子のいずれか、例えば症状の重症度などに応じて変動し得る。例えば、いくつかの場合、本開示の寛容原性組成物は、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、１週間おきに（ｑｏｗ）、１週間に１回（ｑｗ）、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１週間に２回（ｂｉｗ）、１週間に３回（ｔｉｗ）、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、１日おきに（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日に２回（ｑｉｄ）、または１日に３回（ｔｉｄ）投与される。本開示の寛容原性組成物が静脈内投与される場合、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回または４週間に１回または毎月１回の投与が、処置の開始時に一般的に用いられ得る。寛容原性組成物は、寛容原性組成物で投与されることができ、プライム－ブースト戦略で対象に投与され、２回目の（ブースト）投与後に完全寛容が誘導される。

【0157】

本開示の寛容原性組成物の投与期間、例えば、本開示の寛容原性組成物が投与される期間は、種々の因子のいずれか、例えば、患者の応答などに応じて変動し得る。例えば、本開示の寛容原性組成物は、約１日～約１週間、約２週間～約４週間、約１ヶ月～約２ヶ月、約２ヶ月～約４ヶ月、約４ヶ月～約６ヶ月、約６ヶ月～約８ヶ月、約８ヶ月～約１年、約１年～約２年、もしくは約２年～約４年、またはそれを超える範囲の期間にわたって投与され得る。本開示の寛容原性組成物は、インビボおよびインビトロ方法、ならびに全身および局所投与経路を含む、薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を使用して対象に投与される。適切な投与方法が、上に列挙される。

【0158】

キット

【0159】

寛容原性組成物を含むキットが本明細書で提供される。寛容原性組成物は、ａ１）微粒子、ｂ１）微小粒子内にカプセル化された１または複数のＴｒｅｇ刺激剤、およびｃ１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含むことができる。キットは、各々が異なるＴｒｅｇ刺激剤をカプセル化する複数のタイプの微粒子、または２を超えるＴｒｅｇ刺激剤をカプセル化する１つのタイプの微粒子を含むことができる。

【0160】

寛容原性組成物は、ａ２）溶解性マイクロニードルアレイ、ｂ２）寛容原性ＤＣの分化を促進する１または複数の薬剤、またはｃ２）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含むことができる。

【0161】

キットはまた、キットが設計される特定の用途を容易にするための追加の構成要素を含む。例えば、キットは、特定の方法を実施するために日常的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。キットは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む遺伝子編集組成物を含み得る。キットは、寛容原性組成物が遺伝子編集組成物中に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに対する寛容を誘導するという情報を含み得る。遺伝子編集系は、目的の遺伝子に対するｇＲＮＡを含み得る。

【0162】

キットは、容器、容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書を含むことができる。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。いくつかの実施形態では、容器は、特定の量の薬剤を引き出すことができるように、アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射ニードルによって穿刺可能なストッパを有するバイアルであり得る）。

【0163】

いくつかの実施形態では、ラベルまたは添付文書は、例えば寛容を誘導するための組成物の使用を示す。添付文書は、典型的は、製品の市販パッケージに通常含まれる、そのような製品の使用に関する適応症、投与量、禁忌および／または警告に関する情報を含む指示書を含む。使用説明書は、電子形式（コンピュータディスケットまたはコンパクトディスクなど）で書かれてもよく、または視覚的（ビデオファイルなど）であってもよい。

【0164】

本開示は、以下の非限定的な実施例によって例示される。

【実施例】

【0165】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いた遺伝子編集は、様々なヒト疾患の処置に大きな可能性を有する。遺伝子を欠失または挿入するために使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、ヒトが一般的に曝露される細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ）に由来する。したがって、集団の大部分は、これらのＣａｓ９タンパク質に対する既存の体液性および細胞性免疫を有し、これは安全かつ効果的なインビボ遺伝子編集のための潜在的な障壁である（Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１９を参照のこと）。特に、Ｃａｓ９特異的メモリーＴ細胞は、Ｃａｓ９が送達された、またはＣａｓ９発現が誘導された患者の細胞を攻撃し、死滅させ得る。これは、遺伝子編集の成功を妨げ、組織または器官の毒性を引き起こす可能性がある。

【0166】

マウスにおけるＣａｓ９に対するＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を測定する方法が開発され、免疫原性を低下させるためのアプローチの評価を可能にした。特定のマウス株においてＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩによって提示されたＣａｓ９ペプチドを同定した。さらに、方法を使用して、Ｃａｓ９に対する免疫寛容（非応答性）を誘導した（図１Ａ～１Ｃを参照のこと）。免疫系にＣａｓ９を許容することを教示し、それによってインビボ遺伝子編集を妨げるＣａｓ９に対する有害な免疫応答を潜在的に防止する２つの薬物送達系。第１のアプローチは、天然抑制性Ｔｒｅｇの分化を誘導するために、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導微粒子（ＴＲＩ ＭＰ）、ＴＧＦ－Ｂ１、ラパマイシンおよびＩＬ－２の持続的送達を提供する生分解性ポリマー微粒子と共にＣａｓ９タンパク質の注射を使用する。第２のアプローチは、例えば寛容原性ビタミンＤ３類似体（ＭＣ９０３）とのマイクロニードル中のＣａｓ９タンパク質の共送達を使用する。皮膚微小環境への送達は、溶解性マイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）によって達成された。開示されたアプローチは、最終的に、炎症性Ｔ細胞比に対する制御性の増大を促進し、それにより、インビボＣＲＩＳＰＲ遺伝子治療の目的のためにＣａｓ９を発現または内在化する細胞に対する有害な免疫応答を防止または低減する。

【0167】

実施例１
マウスにおける関連するＣａｓ９応答を測定するためのアッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＳｐＣａｓ９特異的Ｔ細胞免疫を測定するために、２つのロバストな免疫化レジメンおよびエクスビボ再刺激プロトコルを確立した。Ｃ５７ＢＬ／６免疫担当マウスをＳｐＣａｓ９タンパク質およびアジュバントで免疫化してＳｐＣａｓ９特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を誘発するか、またはＳｐＣａｓ９発現細胞を注射してＳｐＣａｓ９特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を誘発した。同様の方法を使用して、他の編集者に対する免疫を研究することができる。

【0168】

ＳｐＣａｓ９特異的ＣＤ８ Ｔ細胞免疫を誘導するために、ＳｐＣａｓ９を細胞内で発現する脾細胞を単離し、５００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）で一晩活性化した。これらの脾細胞をナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに２回注射した（０日目プライム、１４日目ブースト）。免疫化マウス由来の脾細胞を、野生型脾細胞またはＣａｓ９を発現する細胞で、インビトロで再刺激した。Ｃａｓ９に対する統計学的に有意なリコール応答が、側腹部において免疫化された動物において観察された（図２）。

【0169】

ＳｐＣａｓ９特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を誘発するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＴＩＴＥＲＭＡＸ（商標）Ｇｏｌｄアジュバントで製剤化したＳｐＣａｓ９タンパク質で２回免疫化した（０日目プライム、１４日目ブースト）。免疫化マウスからの脾細胞を２１日目に採取し、ＳｐＣａｓ９タンパク質で、インビトロで再刺激した。ＳｐＣａｓ９で免疫化したマウスのみが、再刺激時に抗原特異的リコール応答を示した（図３）。

【0170】

実施例２
Ｃａｓ９に対する寛容誘導の２つの異なる方法
寛容原性微粒子による結果。ラパマイシン、ＴＧＦ－βおよびＩＬ－２（Ｔｒｉ－ＭＰ）を含有する微粒子（ＭＰ）と同時送達されるＣａｓ９をマウスの首のうなじに皮下注射した。微粒子は、特異的Ｔｒｅｇの増殖を誘導し、最終的に抗原特異的負荷に対する全身寛容を提供する薬剤の徐放を提供する。図４Ｂに示すように、ラパマイシン、ＴＧＦ－βおよびＩＬ－２を含有する微粒子と混合したＣａｓ９（「Ｔｒｉ－ＭＰ Ｃａｓ９」）を投与した後に脾臓において制御性Ｔ細胞の増殖が観察されたが、ラパマイシン、ＴＧＦ－βおよびＩＬ－２が微粒子から除外された場合（「ブランクＭＰ Ｃａｓ９」）も、Ｃａｓ９が除外された場合（「Ｔｒｉ－ＭＰ」）も観察されなかった。

【0171】

Ｃａｓ９に対する免疫応答に対する影響を調べるために、マウスはＴｒｉ－ＭＰ Ｃａｓ９で前処理され、７日後にＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）アジュバントと混合したＣａｓ９で免疫化された。７日後、マウス由来の脾細胞は、Ｃａｓ９で刺激した場合にＩＦＮ－ｇを産生するＴ細胞の存在についてＥｌｉｓｐｏｔアッセイによって試験された。Ｔｒｉ－ＭＰ Ｃａｓ９による前処理は、Ｃａｓ９に対するＣＤ４ Ｔ細胞応答をほぼ完全に抑制した（図４Ａ）。驚くべきことに、Ｃａｓ９を含まないＴｒｉ－ＭＰで前処置したマウスにおいても応答低下が観察されたが、これは、１週間後のＣａｓ９負荷時に存在する残存免疫抑制因子の存在に起因し得る。したがって、手順を繰り返し、ＭＰを投与してから１４日後まで免疫化を遅延させた。１週間後に２回目の免疫化で応答がブーストされ、その１週間後にサイトカインビーズアレイを用いて脾臓細胞が試験されて、培養物中に産生されたＩＦＮ－γを定量した（図４Ｃ）。Ｃａｓ９と混合したＴＲＩ－ＭＰによる前処理は、Ｔ細胞応答をほぼ完全に無効にした。対照的に、ＴＲＩ－ＭＰ単独またはＣａｓ９と混合したブランク－ＭＰによる前処理は、統計学的に有意な効果を及ぼさなかった。これらの結果は、Ｃａｓ９およびＴＲＩ－ＭＰの共送達がＴｒｅｇを拡大し、Ｃａｓ９エフェクターＴ細胞応答を排除し得ることを示す。

【0172】

寛容原性マイクロニードルによる結果：寛容誘導の第２の方法は、Ｃａｓ９または対照タンパク質ＢＳＡを含有する寛容原性マイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）を適用することを含む。マウスはＭＮＡの３回の適用を受けた。１週間後、それらは、ＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）アジュバントと共に製剤化されたＣａｓ９タンパク質で異なる部位の皮下に免疫化された。１週間後、マウスから脾細胞が採取され、Ｃａｓ９に対するＴ細胞応答が細胞内サイトカイン染色によって評価された。特にＣａｓ９によるＭＮＡ適用は、その後の刺激に対する応答を減少させた（図５）。驚くべきことに、ＢＳＡ対照ＭＮＡは、Ｃａｓ９ ＭＮＡとほぼ同程度に有効であった。予想外ではあるが、結果は、Ｃａｓ９によるＭＮＡ適用が、Ｃａｓ９に対するその後の免疫応答を低下させる免疫抑制環境を誘発することを示唆している。

【0173】

実施例３
図１Ａ～１Ｃは、ＴＲＩ ＭＰおよびＭＣ９０３ ＭＮＡが抗原特異的寛容誘導を促進する提案された機構を示す。特定のＣａｓ９適用のために、Ｃａｓ９抗原は、ＴＲＩ ＭＰ注射部位の近くの皮膚に投与されるのではなく、ＴＲＩ ＭＰと共に皮下注射され得る。

【0174】

ＴＲＩ ＭＰ＋Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９に対する既存の免疫を低下させるためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系によるインビボ遺伝子編集の前に１または複数回数投与され得る。あるいは、ＴＲＩ ＭＰは、投与部位に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９インビボ遺伝子編集系（すなわち、編集時）と共に投与され得る。最後に、ＴＲＩ ＭＰ＋Ｃａｓ９は、１回目の遺伝子編集の後、その後の１回または複数回の遺伝子編集の前に投与され得る。同様に、Ｃａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡは、Ｃａｓ９に対する既存の免疫を低下させるためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集の前に１または複数回数、および／または遺伝子編集の最初の回の後、後続の回の前に１または複数回数投与され得る。

【0175】

マウスを、Ｃａｓ９（抗原）＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（アジュバント）ＭＮＡの適用によって、またはＣａｓ９発現細胞（具体的には脾細胞）の皮下注射によって、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）抗原に感作（免疫化）された。７日後、マウスはＣａｓ９ ＭＮＡを介して右耳に負荷し（Ｃａｓ９抗原に再曝露し）、耳厚さを次の４日間にわたって毎日測定した。Ｃａｓ９抗原特異的炎症応答に関連しない耳厚さの増加を対照するために、ブランク（空）ＭＮＡを反対側の耳に適用した。Ｃａｓ９に対する遅延型過敏症（Ｔ細胞媒介性）応答に関連する耳介腫脹は、耳厚さの変化（デルタ）として報告された（すなわち、Ｃａｓ９ ＭＮＡ処置右耳－ブランクＭＮＡ処置左耳）。より大きな耳介腫脹は、より強いＣａｓ９特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答と一致する（図６を参照のこと）。

【0176】

Ｃａｓ９＋ポリＩＣ ＭＮＡによる感作（免疫化）の前に、マウスは、Ｃａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡの３回（０、３、および６日目）の連続適用によって処置された。３日後（９日目）、マウスをＣａｓ９＋ポリ（Ｉ：Ｃ）ＭＮＡの適用によってＣａｓ９抗原に感作（免疫化）した。７日後、マウスはＣａｓ９ ＭＮＡを介して右耳に負荷し（Ｃａｓ９抗原に再曝露し）、耳厚さを次の４日間にわたって毎日測定した。Ｃａｓ９抗原特異的炎症応答に関連しない耳厚さの増加を対照するために、ブランク（空）ＭＮＡを反対側の耳に適用した。Ｃａｓ９に対する遅延型過敏症（Ｔ細胞媒介性）応答に関連する耳介腫脹は、耳厚さの変化（デルタ）として報告された（すなわち、Ｃａｓ９ ＭＮＡ処置右耳－ブランクＭＮＡ処置左耳）。より大きな耳介腫脹は、より強いＣａｓ９特異的なＴ細胞媒介性免疫応答、およびＣａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる前処置（予防的寛容化）がその後の感作を予防／減少させ、遅延型過敏症（耳介腫脹）応答をより少なくすることと一致する。未感作マウス（灰色）は、Ｃａｓ９ ＭＮＡによる耳負荷の前にＣａｓ９に対する既存の免疫を有していなかった。結果を図７に示す。

【0177】

耳負荷（図７参照）の４日後に、耳皮膚排出リンパ節（ＤＬＮ）を単離し、Ｔ細胞応答をフローサイトメトリーによって評価した。このモデルでは、Ｃａｓ９＋ポリＩＣ ＭＮＡ感作は、主にＴｈ１媒介性炎症促進性エフェクターＴ細胞応答を誘導するようであり、感作前のＣａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる前処置は、Ｔｈ１集団を有意に減少させ、Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１およびＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比を増加させた（図８Ａ～８Ｃを参照のこと）。エフェクターＴ細胞に対する制御性の比率のこのシフトは、より寛容原性の免疫応答の誘導と一致している。

【0178】

以前の予防的寛容誘導モデルとは異なり、Ｃａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる以前に感作されたマウス（すなわち、Ｃａｓ９に対する既存の免疫を有するマウス）の処置によって寛容が誘導された。図９Ａ～９Ｂを参照のこと。この治療的脱感作モデルでは、マウスは、最初に、Ｃａｓ９＋ポリ（Ｉ：Ｃ）ＭＮＡの適用またはＣａｓ９発現脾細胞の皮下注射のいずれかによってＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）抗原に感作（免疫化）された。１週間後から、一部のマウスが、Ｃａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡ（７、１０、および１３日目）で処置された。Ｃａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる最後の処置の５日後（１８日目）、すべてのマウスは、Ｃａｓ９発現ＣＦＳＥ^ｈｉｇｈ「標的」細胞（脾細胞）および「対照」ＣＦＳＥ^ｌｏｗ細胞（すなわち、Ｃａｓ９を発現しない脾細胞）の混合物の養子移入を受けた。標的細胞はＣＦＳＥ色素（１０ｕＭ）で標識され、対照細胞はＣＦＳＥ（１ｕＭ）で標識されたので、それらは、フローサイトメトリーによって特定および識別され得た。翌日、マウスの脾臓を処理し、フローサイトメトリーによって分析して特異的細胞溶解を測定した（すなわち、Ｃａｓ９特異的エフェクターＴ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞によるＣａｓ９発現標的細胞の特異的殺滅）。特異的溶解パーセントは、｛１－［（ナイーブマウスからの平均ＣＦＳＥ^ｌｏｗ／ＣＦＳＥ^ｈｉｇｈ比）／（免疫化マウスからのＣＦＳＥ^ｌｏｗ／ＣＦＳＥ^ｈｉｇｈ比）］｝×１００％として計算される。

【0179】

予想されるように、ナイーブマウスは、Ｃａｓ９特異的細胞傷害性Ｔ細胞の欠如と一致して、Ｃａｓ９発現標的細胞の特異的溶解を示さない。Ｃａｓ９＋ポリＩＣ ＭＮＡで感作したマウスも特異的溶解を示さず、この感作方法が堅牢な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導しなかったことを示唆した。これは、優勢なＴｈ１応答を示す図８Ａ～８Ｃの結果と一致しており、外因性（細胞外タンパク質）抗原のＣＤ８＋Ｔ細胞への交差提示の欠如から生じ得る。対照的に、皮下注射されたＣａｓ９発現脾細胞による感作は、Ｃａｓ９発現標的細胞の特異的溶解をもたらし（図９Ａ～９Ｂを参照のこと）、特異的溶解の程度は、感作後のＣａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる処理によって幾分低下した（図９Ａ～９Ｂを参照のこと）。免疫系によるＣａｓ９発現細胞の溶解または死滅の防止が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるインビボ編集を可能にする最終目標であるので、このインビボ特異的溶解アッセイは、Ｃａｓ９特異的Ｔ細胞応答の寛容誘導および抑制の関連指標である。

【0180】

ＳｐＣａｓ９およびＭｃ９０３ ＭＮＡによる前処理は、感作およびその後の遅延型過敏症応答を減少させた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＳｐＣａｓ９＋ポリＩＣ ＭＮＡで感作される前に（９日目）、ＭＣ９０３ ＭＮＡ、ＳｐＣａｓ９ ＭＮＡ、またはＳｐＣａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡ（０、３、および６日目）で処置された。対照マウスは感作されたが、寛容化されなかった（前処置）。感作の５日後、右耳へのＳｐＣａｓ９ ＭＮＡの適用によってＤＴＨ応答が誘発された。ブランクＭＮＡを反対側の耳に適用し、負荷後１～４日の耳介腫脹を、ＳｐＣａｓ９ ＭＮＡ処置耳とブランクＭＮＡ処置耳との耳厚さの差として報告した。ＳｐＣａｓ９＋ＭＣ９０３ ＭＮＡによる前処置は、ＳｐＣａｓ９負荷に対する耳介腫脹ＤＴＨ応答を減少させた（図１２を参照のこと）。対照的に、ＭＣ９０３ ＭＮＡまたはＳｐＣａｓ９ ＭＮＡによる前処理は耳介腫脹応答に最小限の効果しか及ぼさず、ＭＮＡを介したＳｐＣａｓ９とＭＣ９０３の同時送達が耳介腫脹を軽減するために必要であることを示唆した（抗原特異的Ｔ細胞媒介性炎症の減少の証明）。

【0181】

図１０は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）タンパク質の持続放出がアルギナートヒドロゲル微粒子（ＭＰ）への封入によって達成され得ることを示す。Ｃａｓ９は、ＣａＣｌ_２と架橋した低粘度または中粘度のアルギナートＭＰに担持された。インビトロ放出アッセイは、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ緩衝液中の既知の質量のＣａｓ９ ＭＰを３７℃でインキュベートすることによって行われた。様々な時点で、ＭＰの懸濁液を遠心分離し、放出されたＣａｓ９を含有する上清をサンプリングし、ＭＰを新鮮な緩衝液に再懸濁した。放出緩衝液中のＣａｓ９濃度をＥＬＩＳＡによって測定し、累積放出が、ＭＰの質量あたりの放出されたＣａｓ９の量に関して計算された。図１０において、左のグラフは、総累積放出（ｎｇ Ｃａｓ９／ｍｇ ＭＰ）を示し、右は、カプセル化された総Ｃａｓ９のパーセンテージとしての累積放出を示す。

【0182】

記載された方法または組成物の正確な詳細は、記載された発明の精神から逸脱することなく変更または修正され得ることは明らかであろう。本発明者らは、以下の特許請求の範囲および主旨の範囲内に入るすべてのそのような修正および変形を主張する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4AB】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】