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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-07-23
(54)【発明の名称】ＲＸＦＰ１モジュレーターの固体形態
(51)【国際特許分類】
C07C 237/30 20060101AFI20250715BHJP
A61K 31/192 20060101ALI20250715BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20250715BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20250715BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20250715BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20250715BHJP
C08K 5/09 20060101ALI20250715BHJP
C08L 101/00 20060101ALI20250715BHJP
C08F 226/10 20060101ALI20250715BHJP
【ＦＩ】
C07C237/30 CSP
A61K31/192
A61P9/04
A61P13/12
A61P9/12
A61K47/32
C08K5/09
C08L101/00
C08F226/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024572105
(86)(22)【出願日】2023-06-06
(85)【翻訳文提出日】2025-01-10
(86)【国際出願番号】 EP2023065044
(87)【国際公開番号】W WO2023237510
(87)【国際公開日】2023-12-14
(31)【優先権主張番号】63/365,970
(32)【優先日】2022-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】391008951
【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ
(71)【出願人】
【識別番号】000002956
【氏名又は名称】田辺三菱製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】アルビドソン，インゲ・トールビョーン
(72)【発明者】
【氏名】リンダヘン，マリカ・ジェニー・スザンナ
(72)【発明者】
【氏名】プトラ，オッキー・ドゥイチャンドラ
(72)【発明者】
【氏名】アブ・アワド，ホサム・アル－ディーン
(72)【発明者】
【氏名】コーナー，フィリップ・アンソニー
(72)【発明者】
【氏名】カラリア，ダヴァル・ラシクバイ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C206
4H006
4J002
4J100
【Ｆターム（参考）】
4C076AA36
4C076AA53
4C076BB01
4C076CC11
4C076CC17
4C076EE16
4C206AA01
4C206AA02
4C206AA03
4C206GA12
4C206GA30
4C206KA01
4C206KA16
4C206KA17
4C206MA02
4C206MA05
4C206MA55
4C206MA57
4C206MA72
4C206NA14
4C206ZA36
4C206ZA42
4C206ZA81
4H006AA01
4H006AB23
4H006BM30
4H006BM71
4H006BP30
4H006BP50
4H006BS20
4H006BV42
4H006BV73
4J002AA001
4J002BJ001
4J002EF086
4J002FD206
4J002GB01
4J100AG04Q
4J100AQ08P
4J100CA04
4J100JA51
(57)【要約】
本明細書は、一般に、（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸（化合物（Ｉ））の固体形態、例えば、結晶形態及び非晶質形態に関する。特に、化合物（Ｉ）の非晶質形態、そのような非晶質形態を含む固体分散体及び医薬組成物、並びに化合物（Ｉ）の結晶形態Ｇに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非晶質の化合物（Ｉ）。【化1】
【請求項2】
非晶質の化合物（Ｉ）及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項3】
前記医薬組成物中の化合物（Ｉ）の少なくとも８０ｗｔ％が非晶質である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体。
【請求項5】
１つ以上のポリマーをさらに含む、請求項４に記載の固体分散体。
【請求項6】
前記固体分散体中の化合物（Ｉ）の少なくとも８０ｗｔ％が非晶質である、請求項４又は５に記載の固体分散体。
【請求項7】
前記固体分散体中の化合物（Ｉ）の２０ｗｔ％未満が結晶性である、請求項４～６のいずれか一項に記載の固体分散体。
【請求項8】
化合物（Ｉ）が５ｗｔ％～９５ｗｔ％の量で存在する、請求項４～７のいずれか一項に記載の固体分散体。
【請求項9】
前記１つ以上のポリマーが５ｗｔ％～９５ｗｔ％の量で存在する、請求項４～８のいずれか一項に記載の固体分散体。
【請求項10】
前記１つ以上のポリマーが水溶性である、請求項４～９のいずれか一項に記載の固体分散体。
【請求項11】
前記１つ以上のポリマーが、ポリ（１－ビニル－２－ピロリドン）、１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルとのコポリマー、ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフトコポリマー、メタクリル酸－エチルアクリレートコポリマー、ポリアクリル酸、酢酸コハク酸ヒプロメロース、酢酸フタル酸セルロース及び酢酸フタル酸ポリビニルから選択される、請求項４～１０のいずれか一項に記載の固体分散体。
【請求項12】
前記１つ以上のポリマーが、１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルとのコポリマー、場合により、１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルとの重量比６：４のコポリマーである、請求項４～１０のいずれか一項に記載の固体分散体。
【請求項13】
請求項４～１２のいずれか一項に記載の固体分散体を含む医薬組成物。
【請求項14】
錠剤又はカプセル剤の形態である、請求項２、３又は１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
経口投与に適している、請求項２、３、１３又は１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項16】
治療に使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物、固体分散体又は医薬組成物。
【請求項17】
心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症、及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態を有する対象の治療に使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物、固体分散体又は医薬組成物。
【請求項18】
約２１７．５℃で融解開始温度を有する、化合物（Ｉ）の結晶形態。
【請求項19】
化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約４３．９℃超、場合により約４５℃超、場合により約５０℃超、場合により約５５℃超、場合により約６０℃超、場合により約６５℃超の温度に加熱することによって得ることができる、化合物（Ｉ）の結晶形態。
【請求項20】
化合物（Ｉ）の結晶形態（Ａ）を、約４３．９℃超、場合により約４５℃超、場合により約５０℃超、場合により約５５℃超、場合により約６０℃超、場合により約６５℃超の温度に加熱することを含む、請求項１８又は１９に記載の結晶形態を調製する方法。
【請求項21】
化合物（Ｉ）の形態（Ａ）が、約２θ＝７．５、１０．７、１２．８、１４．５及び１５．８°に少なくとも５つの特定のピークを有するＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα線）を有する、請求項１９に記載の結晶形態又は請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
化合物（Ｉ）の形態Ａが、図１に示されるＸ線粉末回折パターンと実質的に同じＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα線）を有する、請求項１９に記載の結晶形態又は請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
請求項１８～２２のいずれか一項に記載の結晶形態及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項24】
ヒト患者における心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態の治療のための医薬の製造において使用するための請求項１８～２２のいずれか一項に記載の結晶形態。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書では、ＲＸＦＰ１モジュレーター（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸（本明細書では化合物（Ｉ）と呼ぶ）の固体形態、例えば結晶及び非晶質形態、その医薬組成物、並びにそのような固体形態を調製するためのプロセスが記載される。
【背景技術】
【0002】
リラキシンは、妊娠中、全身血液動態の適応変化及び腎臓の適応変化を媒介することが知られている多面的ホルモンである。リラキシンはまた、抗線維化の特性を有し、且つ心不全、例えば、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）において有益な効果を有することも明らかにされている。心不全は、深刻な罹患率及び死亡率を伴う。心不全は、心筋細胞死の増加及び間質性線維症を伴う複雑な組織リモデリングを特徴とする。リラキシンは、虚血再灌流及び心不全といった状況において有益であることが示された多くのシグナル伝達カスケードを活性化する。これらのシグナル伝達経路は、ホスホイノシチド３－キナーゼ経路の活性化及び一酸化窒素シグナル伝達経路の活性化を含む（Ｂａｔｈｇａｔｅ ＲＡ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．９３（１）：４０５－４８０、Ｍｅｎｔｚ ＲＪ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．１６５（２）：１９３－１９９、Ｔｉｅｔｊｅｎｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｅａｒｔ １０２：９５－９９、Ｗｉｌｓｏｎ ＳＳ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３５：３１５－３２７）。
【0003】
心不全患者においては、有意な小集団が肺高血圧症も罹患する（ＨＦ＋ＰＨ患者）。駆出率が保持された心不全患者のうち約５０％が更に肺高血圧症を患い、これは、駆出率の低下を伴う心不全患者では６０％に増加するものと推定されている（Ｇｕａｚｚｉ，（２０１４）Ｃｉｒｃ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．，７：３６７－３７７、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＪＡＣＣ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．，１（４）：２９０－２９９）。肺高血圧症合併心不全の患者は、肺高血圧症非合併心不全の患者と比較して生存率が低下することが示されている（Ｂａｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｄｅ Ｍａｒｃｏ，（２０１２）Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．Ｃｌｉｎ．８：４４７－４５９）。心不全患者においては、推定肺動脈拡張期圧（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉａｓｔｏｌｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ、ｅＰＡＤ）の３ｍｍＨｇの増減（平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）の約４ｍｍＨｇの増減に相当）は、心血管系死亡率の２４％の増加又は１９％の減少とそれぞれ関連していた（Ｚｉｌｅ ＭＲ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｉｒｃ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．，１０：ｅ００３５９４）。ｍＰＡＰの４ｍｍＨｇの減少は、心不全及び肺高血圧症を患う患者における呼吸困難の改善にも関連する（Ｓｏｌｏｍｏｎｉｃａ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｉｒｃ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．，６：５３－６０）。
【0004】
抵抗性高血圧（ｒＨＴ）は、その１つが利尿薬である異なるクラスの３つの降圧剤の最適用量の同時使用にもかかわらず、標的目標を超えて上昇したままである高血圧患者の血圧として定義される。高血圧の初期治療のための現在のＳｏＣは、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、レニン－アンジオテンシン系の遮断薬（アンジオテンシン変換酵素［ＡＣＥ］阻害剤又はアンジオテンシン受容体遮断薬［ＡＲＢ］）、及び利尿薬である。ｒＨＴ患者の場合、次に何を追加するかについて複数の選択肢があり（例えば、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト（ＭＲＡ）、β遮断薬又はα遮断薬）、ガイドラインは現在、ｒＨＴの治療の好ましい選択肢としてＭＲＡを推奨している。ｒＨＴには、４種以上の降圧薬を同時に投与した場合に血圧が十分に制御される患者も含まれる（Ｃａｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２０１８，７２，ｅ５３－ｅ９０）。ｒＨＴを有する患者は、典型的には、重度の血圧上昇の長い既往歴を有し、血圧が制御されている治療された高血圧患者よりも高い心血管リスクになりやすい（Ａｃｅｌａｊａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１９，１２４，１０６１－１０７０）。リラキシンは高血圧性疾患の治療的潜在性を有し得ることが示唆されている（Ｌｅｋｇａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２００５，４６，４１２－８）。
【0005】
非修飾組換えヒトリラキシン２であるセレラキシンを使用して、臨床試験が実施された。入院患者にセレラキシンを連続的に静脈内投与することで、心臓、腎臓、及び肝臓の障害及び鬱血が改善した（ＦｅｌｋｅｒｇＭ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６４（１５）：１５９１－１５９８、Ｍｅｔｒａ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６１（２）：１９６－２０６、Ｔｅｅｒｌｉｎｋ ＪＲ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｌａｎｃｅｔ ３８１（９８６０）：２９－３９）。しかし、セレラキシンは患者の血液循環から速やかに除去されるため、その治療効果は限定的であり、一旦静脈内注射を中止するとプラスの効果は急速に消滅した。更に、患者の約３分の１が、セレラキシンを静脈内投与した後で有意な血圧低下（４０ｍｍ Ｈｇ超）を経験したため、用量を半分又は更にはそれ以上減少させなければならないという結論が得られた。
【0006】
ヒトリラキシンの同族受容体はＲＸＦＰ１であり、ホルモンリラキシンによる活性化が血行動態、抗線維化及び抗炎症特性に関連する、十分に検証された薬理学的に重要なＧＰＣＲファミリー１ｃメンバーである（ＨａｌｌｓｍＬ ｅｔ ａｌ．，（２０１５），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．６７（２）：３８９－４４０）。
【0007】
ＲＸＦＰ１の低分子モジュレーターは、リラキシン模倣物として求められている。例えば、Ｍａｒｕｇａｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，国際公開第２０１３／１６５６０６Ａ１号パンフレット；Ｘｉａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４：１９５３；及びＭｃＢｒｉｄｅ Ａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：１０８０６は、ＲＸＦＰ１の低分子モジュレーターを論じている。
【0008】
上記にもかかわらず、ＲＸＦＰ１のモジュレーターであるさらなる化合物（例えば、化合物（Ｉ）など）の必要性が存在し続けており、この化合物は、治療薬としての開発のために特に有望であるかもしれない。そのような化合物はまた、他の公知のＲＸＦＰ１モジュレーターと比較して、ＲＸＦＰ１の改善されたモジュレーションを示し得る。そのような化合物はまた、他の公知のＲＸＦＰ１モジュレーターと比較して、好ましい薬物動態学的プロファイル（例えば、より低い固有クリアランス）及び／又は有利な物理的特性（例えば、より高い水溶性）を示し得る。したがって、そのような化合物は、ＲＸＦＰ１の調節が有益である疾患状態の治療において特に有用であり得る。そのような化合物の経口投与に有用であり得る低ｐＨでの水溶性などの有利な物理的特性を有するそのような化合物の安定な固体形態も必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本明細書は、以下の構造：
を有し、化学名：（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸を有する化合物（Ｉ）の固体形態に関する。
【化1】
を有し、化学名：（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸を有する化合物（Ｉ）の固体形態に関する。
【0010】
簡潔には、本明細書は、非晶質の化合物（Ｉ）を部分的に記載する。
【0011】
本明細書はまた、非晶質化合物（Ｉ）及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を部分的に記載する。
【0012】
本明細書はまた、非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体を部分的に記載する。
【0013】
本明細書はまた、非晶質化合物（Ｉ）を含む固体分散体を含む医薬組成物を部分的に記載する。
【0014】
本明細書はまた、治療に使用するための本明細書に記載の非晶質化合物（Ｉ）又は固体分散体又は医薬組成物を部分的に記載する。
【0015】
本明細書はまた、心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症、及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態を有する対象の治療に使用するための本明細書に記載の非晶質化合物（Ｉ）又は固体分散体若しくは医薬組成物を部分的に記載する。
【0016】
本明細書はまた、部分的に、約２１７．５℃で融解開始温度を有する化合物（Ｉ）の結晶形態、及び化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約４３．９℃を超える温度に加熱することを含む、そのような結晶形態を調製する方法を記載する。
【0017】
本明細書はまた、化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約４３．９℃を超える温度に加熱することによって得ることができる化合物（Ｉ）の結晶形態、及び化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約４３．９℃を超える温度に加熱することを含むそのような結晶形態を調製する方法を部分的に記載する。
【0018】
本明細書はまた、本明細書に開示される結晶形態を含む医薬組成物を部分的に記載する。
【0019】
本明細書はまた、ヒト患者における心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症、及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態を治療するための医薬の製造に使用するための本明細書に開示される結晶形態を部分的に記載する。
【0020】
本開示のさらなる局面は、本明細書を読むことにより当技術分野の当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】化合物（Ｉ）の形態ＡのＸ線粉末回折パターンである。
【図2】非晶質の化合物（Ｉ）のＸ線粉末回折パターンである。
【図3】形成後、４０℃／７５％相対湿度で４週間保存後、及び周囲相対湿度で５０℃で４週間保存後の化合物（Ｉ）の非晶質固体分散体（２０％、３０％及び４０％負荷の化合物（Ｉ））のＸ線粉末回折パターンである。
【図4】形態Ａ／化合物（Ｉ）の形態Ｇの分析からのＤＳＣ出力を示す。
【図5】形態Ａ／化合物（Ｉ）の形態ＧのＴＧＡ分析を示す。
【図6】ｐＨ１．２の模擬胃液中の非晶質化合物（Ｉ）の総濃度の関数としての光散乱強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
多くの実施形態が、本明細書の全体を通して詳述されており、当技術分野の当業者には明らかであろう。本明細書は、本明細書に記載される任意の特定の実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。
【0023】
本明細書で具体的に定義されていない用語は、本開示及び文脈に照らして当業者によってそれらに与えられるであろう意味を有すると理解されるべきである。
【0024】
「約」は、一般に、測定法の性質又は精度を考慮すれば、測定される数量について許容され得る程度の誤差を意味してもよい。誤差の例示的な程度は、与えられた値又は値の範囲のパーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
【0025】
１つ以上の特徴を「含む」として本明細書において記載される実施形態はまた、そのような特徴「からなる」対応する実施形態の開示と見なし得る。
【0026】
濃度、量、体積、割合及び他の数値は、本明細書においては、範囲形式で示され得る。そのような範囲形式は、単に便宜及び簡潔さのために使用され、範囲の限界として明示的に詳述される数値だけでなく、あたかもそれぞれの数値及び部分範囲が明示的に詳述されるかのように、その範囲内に包含される個々の数値又は部分範囲の全てを含むことが柔軟に解釈されるべきであることもまた、理解されるべきである。
【0027】
本明細書に記載される化合物の化学名は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）のＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌバージョン１９．０．０．２２を使用して生成された。当業者は、異なる化学命名ソフトウェアが特定の化合物に対して異なる化学名を生成し得ることを理解するであろう。本明細書に記載の化合物が化学名の形で式として示されている場合、矛盾がある場合は式が優先するものとする。
【0028】
本明細書中で説明されている化合物及び塩は、溶媒和形態及び非溶媒和形態で存在し得る。例えば、溶媒和形態は、ヘミ水和物、一水和物、二水和物、三水和物又はその代替的な量など、水和物形態であり得る。本明細書に記載される化合物の全てのそのような溶媒和形態及び非溶媒和形態は、本明細書に包含される。
【0029】
本明細書中で説明されている化合物及び塩の原子は、これらの同位体として存在し得る。原子がその同位体（例えば、１つ以上の炭素原子が１１Ｃ若しくは１３Ｃ炭素同位体である、又は１つ以上の水素原子が２Ｈ若しくは３Ｈ同位体である、本明細書に記載の化合物）の１つ以上によって置き換えられている本明細書に記載される全ての化合物は、本明細書に包含される。
【0030】
本明細書に記載される化合物は、シス－及びトランス－形態、Ｅ－及びＺ－形態、並びにＲ－、Ｓ－及びメソ－形態を含むがこれらに限定されない１つ以上の幾何学的、光学的、エナンチオマー及びジアステレオマー形態で存在し得る。特に明記しない限り、特定の化合物についての言及は、ラセミ混合物及びその他の混合物を含むそのような異性体形態を全て含む。適宜、そのような異性体は、既知の方法（例えば、クロマトグラフィー技術及び再結晶技術）の適用又は改作によってそれらの混合物から分離され得る。適宜、そのような異性体は、既知の方法の適用又は改作によって調製され得る。
【0031】
本明細書に記載される化合物は、１つ以上のキラル中心を含み得る。本明細書の構造又は化学名がキラリティーを示さない限り、構造又は名称はその構造又は名称に対応する任意の単一の立体異性体、並びに立体異性体の任意の混合物（例えば、ラセミ体）を包含することが意図される。本明細書における構造が、実線及び破線の楔（すなわち
）を含む場合、実線及び破線の楔はキラル中心の絶対配置を示すことが意図されている。
【化2】
）を含む場合、実線及び破線の楔はキラル中心の絶対配置を示すことが意図されている。
【0032】
そのような光学活性形態をどのように分離することができるかは当技術分野で周知である。例えば、単一の立体異性体は、例えば、キラルクロマトグラフィー分離を用いて、異性体の混合物（例えば、ラセミ体）から単離することによって得ることができる。他の実施形態では、単一の立体異性体は、例えば、キラル出発物質からの直接的な合成により得られる。
【0033】
一実施形態によれば、本明細書中に記載される化合物は、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の鏡像体過剰率（％ｅｅ）である単一の鏡像体として提供される。簡便には、単一の鏡像体は、９９％以上のエナンチオマー過剰率で存在する。
【0034】
一実施形態によれば、本明細書に記載の化合物は、９５～１００％の範囲の鏡像体過剰率（％ｅｅ）である単一の鏡像体として提供される。
【0035】
本明細書中に記載される化合物は、１つ以上の互変異性型（ケト型及びエノール型が含まれるが、これらに限定されない）で存在し得る。特定の化合物への言及は、それらの混合物を含む全ての互変異性形態を含む。したがって、１つの互変異性体として本明細書に示される構造は、他の互変異性体も含むことが意図されている。
【0036】
本明細書中に記載される医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容され得る賦形剤を含み得る。特定の組成物中への包含のために選択される賦形剤は、投与の様式及び提供される組成物の形態などの要因に依存することになる。好適な薬学的に許容され得る賦形剤は、当業者によく知られており、例えば、Ｒｏｗｅ，Ｒａｙ Ｃ；Ｓｈｅｓｋｅｙ，Ｐａｕｌ Ｊ；Ｑｕｉｎｎ，Ｍａｒｉａｎによって編集されたＨａｎｄｂｏｏｋｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｓｉｘｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓに記載されている。薬学的に許容され得る賦形剤は、例えば、アジュバント、希釈剤、担体、安定剤、香味料、着色料、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、滑剤、増粘剤及びコーティング剤として機能し得る。当技術分野の当業者が認識するとおり、ある特定の薬学的に許容され得る賦形剤は、組成物中に存在する賦形剤の量及び他のどの賦形剤が組成物中に存在するかに応じて、２以上の機能を果たす場合があり、また代替の機能を果たす場合がある。
【0037】
医薬組成物は、経口使用（例えば、錠剤、ロゼンジ剤、硬質若しくは軟質カプセル剤、水性若しくは油性懸濁剤、又は分散性散剤若しくは顆粒剤として）、局所使用（例えば、クリーム、軟膏、又は水性若しくは油性懸濁剤として）、吸入による投与（例えば、微粉末として）、吹送による投与（例えば、微粉末として）、又は直腸投与用の坐剤として適した形態であり得る。この組成物を、当技術分野で公知の通常の手順により得ることができる。経口使用として意図されている組成物は、追加的成分を含み得、例えば、１つ以上の着色剤、甘味料、香味料、及び／又は保存剤を含み得る。
【0038】
非晶質の化合物（Ｉ）
一実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）が提供される。一実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）は、図２に示されるＸ線粉末回折パターンと実質的に同じＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα線）を有する。一実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）は、３から４０°の２θ（ＣｕＫα線）の範囲において反射を示さない。
一実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）が提供される。一実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）は、図２に示されるＸ線粉末回折パターンと実質的に同じＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα線）を有する。一実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）は、３から４０°の２θ（ＣｕＫα線）の範囲において反射を示さない。
【0039】
非晶質の化合物（Ｉ）を含む医薬組成物
一実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の少なくとも８０ｗｔ％は非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の少なくとも９０ｗｔ％は非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の少なくとも９５ｗｔ％は非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の少なくとも９９ｗｔ％は非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）は実質的に全てが非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の全てが非晶質である。
一実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の少なくとも８０ｗｔ％は非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の少なくとも９０ｗｔ％は非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の少なくとも９５ｗｔ％は非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の少なくとも９９ｗｔ％は非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）は実質的に全てが非晶質である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の全てが非晶質である。
【0040】
一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の２０ｗｔ％未満は結晶性である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の１０ｗｔ％未満は結晶性である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の５ｗｔ％未満は結晶性である。一実施形態において、医薬組成物中の化合物（Ｉ）の１ｗｔ％未満は結晶性である。一実施形態では、医薬組成物中の化合物（Ｉ）は実質的にいずれも結晶性ではない。一実施形態では、医薬組成物中の化合物（Ｉ）はいずれも結晶性ではない。
【0041】
非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体
別の実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体が提供される。固体分散体は、典型的には、１つの１つ以上のポリマーなどの適切な担体媒体中に分散した化合物を含む。一実施形態では、固体分散体は、１つ以上のポリマーをさらに含む。一実施形態では、１つ以上のポリマーは水溶性である。水溶性ポリマーは、水又は胃液などの水性媒体に溶解することができることは理解されよう。
別の実施形態において、非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体が提供される。固体分散体は、典型的には、１つの１つ以上のポリマーなどの適切な担体媒体中に分散した化合物を含む。一実施形態では、固体分散体は、１つ以上のポリマーをさらに含む。一実施形態では、１つ以上のポリマーは水溶性である。水溶性ポリマーは、水又は胃液などの水性媒体に溶解することができることは理解されよう。
【0042】
一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）の少なくとも９０ｗｔ％は、非晶質である。一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）の少なくとも９５ｗｔ％は、非晶質である。一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）の少なくとも９９ｗｔ％は、非晶質である。一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）は実質的に全てが非晶質である。一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）は全てが非晶質である。
【0043】
一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）の２０ｗｔ未満％は、結晶性である。一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）の１０ｗｔ未満％は、結晶性である。一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）の５ｗｔ未満％は、結晶性である。一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）の１ｗｔ未満％は、結晶性である。一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）は実質的にいずれも結晶性ではない。一実施形態において、固体分散体中の化合物（Ｉ）はいずれも結晶性ではない。
【0044】
一実施形態において、化合物（Ｉ）は、固体分散体中に５ｗｔ％～９５ｗｔ％の量で存在する。一実施形態において、化合物（Ｉ）は、固体分散体中に５ｗｔ％～８０ｗｔ％の量で存在する。一実施形態において、化合物（Ｉ）は、固体分散体中に５ｗｔ％～６０ｗｔ％の量で存在する。一実施形態において、化合物（Ｉ）は、固体分散体中に１０ｗｔ％～４０ｗｔ％の量で存在する。一実施形態において、化合物（Ｉ）は、固体分散体中に２０ｗｔ％～４０ｗｔ％の量で存在する。
【0045】
一実施形態において、１つ以上のポリマーは、ポリ（１－ビニル－２－ピロリドン）、１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルとのコポリマー、ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフトコポリマー、メタクリル酸－エチルアクリレートコポリマー、ポリアクリル酸、酢酸コハク酸ヒプロメロース、酢酸フタル酸セルロース及び酢酸フタル酸ポリビニルから選択される。
【0046】
一実施形態において、１つ以上のポリマーは、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）３０、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ ６４、Ｓｏｌｕｐｌｕｓ（登録商標）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００－５５Ｓ、ポリアクリル酸、ＡＱＯＡＴ（登録商標）ＨＰＭＣ ＡＳ－ＬＦ、ＡＱＯＡＴ（登録商標）ＨＰＭＣ ＡＳ－ＨＦ、酢酸フタル酸セルロース及び酢酸フタル酸ポリビニルから選択される。
【0047】
一実施形態において、１つ以上のポリマーは、１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルとのコポリマーである。一実施形態において、１つ以上のポリマーは、１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルとの重量比６：４のコポリマーである。一実施形態において、１つ以上のポリマーはＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ ６４である。
【0048】
一実施形態において、１つ以上のポリマーは、固体分散体中に５ｗｔ％～９５ｗｔ％の量で存在する。一実施形態において、１つ以上のポリマーは、固体分散体中に２０ｗｔ％～９０ｗｔ％の量で存在する。一実施形態において、１つ以上のポリマーは、固体分散体中に４０ｗｔ％～９０ｗｔ％の量で存在する。一実施形態において、１つ以上のポリマーは、固体分散体中に５０ｗｔ％～９０ｗｔ％の量で存在する。一実施形態において、１つ以上のポリマーは、固体分散体中に６０ｗｔ％～８０ｗｔ％の量で存在する。
【0049】
非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体を含む医薬組成物
一実施形態において、本明細書中に記載されるような非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体を含む医薬組成物が提供される。
一実施形態において、本明細書中に記載されるような非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体を含む医薬組成物が提供される。
【0050】
化合物（Ｉ）の結晶形態Ｇ
化合物（Ｉ）の結晶形態Ａの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析は、約４３．９℃観察される開始を伴う吸熱転移を示す。この吸熱ピークは、固体－固体相転移に割り当てられ、約４３．９℃で観察される吸熱ピークの完了を超える温度で得られる相は、形態Ｇと称される。この新たな無水相形態Ｇは、２１７．５℃での融解開始に対応するＤＳＣにおける最後の吸熱ピークまで存在する。
化合物（Ｉ）の結晶形態Ａの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析は、約４３．９℃観察される開始を伴う吸熱転移を示す。この吸熱ピークは、固体－固体相転移に割り当てられ、約４３．９℃で観察される吸熱ピークの完了を超える温度で得られる相は、形態Ｇと称される。この新たな無水相形態Ｇは、２１７．５℃での融解開始に対応するＤＳＣにおける最後の吸熱ピークまで存在する。
【0051】
したがって、一実施形態において、約２１７．５℃に融解開始温度を有する、化合物（Ｉ）の結晶形態（形態Ｇ）が提供される。一実施形態において、融解開始温度は２１７．５±５℃である。一実施形態において、融解開始温度は２１７．５±４°Ｃである。一実施形態において、融解開始温度は２１７．５±３℃である。一実施形態において、融解開始温度は２１７．５±２℃である。一実施形態において、融解開始温度は２１７．５±１℃である。
【0052】
一実施形態において、化合物（Ｉ）の結晶形態（形態Ｇ）は、化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約４３．９℃を超える温度に加熱することによって得ることができる。一実施形態において、結晶形態は、化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約４５℃を超える温度に加熱することによって得ることができる。一実施形態において、結晶形態は、化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約５０℃を超える温度に加熱することによって得ることができる。一実施形態において、結晶形態は、化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約５５℃を超える温度に加熱することによって得ることができる。一実施形態において、結晶形態は、化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約６０℃を超える温度に加熱することによって得ることができる。一実施形態において、結晶形態は、化合物（Ｉ）の結晶形態Ａを約６５℃を超える温度に加熱することによって得ることができる。
【0053】
一実施形態において、結晶化合物（Ｉ）の形態Ａを約４３．９°Ｃを超える温度に加熱することを含む、結晶形態（形態Ｇ）の化合物（Ｉ）を調製する方法が提供される。一実施形態において、結晶化合物（Ｉ）の形態Ａは、約４５℃を超える温度に加熱される。一実施形態において、結晶化合物（Ｉ）の形態Ａは、約５０℃を超える温度に加熱される。一実施形態において、結晶化合物（Ｉ）の形態Ａは、約５５℃を超える温度に加熱される。一実施形態において、結晶化合物（Ｉ）の形態Ａは、約６０℃を超える温度に加熱される。一実施形態において、結晶化合物（Ｉ）の形態Ａは、約６５℃を超える温度に加熱される。
【0054】
化合物（Ｉ）の形態Ａについての１０個の最も顕著なＸ線粉末回折ピーク［角度２θ（２θ）、強度］は以下の通りである：７．５（ｓ），１０．３（ｍ），１０．７（ｓ），１２．８（ｓ），１４．５（ｖｓ），１５．３（ｓ），１５．８（ｓ），１７．５（ｍ），１９．６（ｓ）及び２１．３（ｓ）．一実施形態において、化合物（Ｉ）の形態Ａは、約２θ＝７．５、１０．７、１２．８、１４．５及び１５．８°に少なくとも５つの特定のピークを有するＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα線）を有する。一実施形態において、形態Ａ形の化合物（Ｉ）は、約２－θ＝７．５、１０．３、１０．７、１２．８、１４．５、１５．３、１５．８、１７．５、１９．６及び２１．３°に特定のピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する。一実施形態において、化合物（Ｉ）の形態Ａは、２θ＝７．５、１０．７、１２．８、１４．５及び１５．８°に少なくとも５つの特定のピークを有するＸ線粉末回折パターンを有し、ここで、前記値は、±０．２° ２θであり得る。一実施形態において、化合物（Ｉ）の形態Ａは、２θ＝７．５、１０．３、１０．７、１２．８、１４．５、１５．３、１５．８、１７．５、１９．６及び２１．３°に特定のピークを有するＸ線粉末回折パターンを有し、ここで、前記値は、±０．２° ２θであり得る。一実施形態において、化合物（Ｉ）の形態Ａは、図１に示されるＸ線粉末回折パターンと実質的に同じＸ線粉末回折パターンを有する。
【0055】
本明細書に記載の規定の固体形態は、図面に示されるＸ線粉末回折パターンと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを提供し、本明細書に記載される種々の２－θ値を有する。Ｘ線粉末回折パターンの２－θ値は、機械ごと又は試料ごとにわずかに変動し、したがって、引用値は、絶対値と解釈すべきでないことが理解される。
【0056】
測定条件（例えば、使用される装置又は機械）に依存して、１つ以上の測定誤差を有するＸ線粉末回折パターンが得られる場合があることが知られている。特に、Ｘ線粉末回折パターンにおける強度は、測定条件に依存して変動する場合があることが一般に知られている。したがって、本明細書に記載の固体形態は、図面に示されるＸ線粉末回折パターンと同一であるＸ線粉末回折パターンを提供する結晶に限定されず、図面に示されるものと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを提供する任意の結晶が本明細書に記載の実施形態の範囲内に収まることは理解するべきである。Ｘ線粉末回折の技術分野の当業者は、Ｘ線粉末回折パターンの実質的な同一性を判断することができる。
【0057】
Ｘ線粉末回折の技術分野の当業者は、ピークの相対的強度が、例えば、３０μｍサイズ超の粒子及び試料の分析に影響を与え得る非ユニタリーアスペクト比により影響を受け得ることを理解する。当業者はまた、反射の位置が、試料が回折計内に位置する正確な高さ及び回折計のゼロ較正によって影響を受け得ることも認識するであろう。試料の表面の平面性もわずかな影響をもつ場合がある。したがって、提示した回折パターンデータは、絶対的な値とみなされるべきではない（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ ＆ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｌ．‘Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｘ－Ｒａｙ Ｐｏｗｄｅｒ Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙ’Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６；Ｂｕｎｎ，Ｃ．Ｗ．（１９４８），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｋｌｕｇ，Ｈ．Ｐ．＆ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｅ．（１９７４），Ｘ－Ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）。ピーク強度は、本明細書ではｖｓ（非常に強い）、ｓ（強い）、ｍ（中程度）及びｗ（弱い）として記載され、それぞれ２５～１００％、１０～２５％、３～１０％及び１～３％の％相対強度（最も強いピークに基づく）に対応する。相対強度は、固定スリットで測定したディフラクトグラムに由来する。
【0058】
一般に、Ｘ線粉末回折図における回折角の測定誤差は、約５％以下、特に±０．５° ２θであり、そのような程度の測定誤差は、本明細書に記載のデータを読み取る際に、本明細書の図面のＸ線粉末回折パターンを考慮するときに考慮されるべきである。さらに、当然のことながら、強度は、実験条件及び試料調製（好ましい配向）に依存して変動し得る。
【0059】
化合物（Ｉ）の形態Ｇを含む医薬組成物
一実施形態において、本明細書中に記載の化合物（Ｉ）の形態Ｇと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
一実施形態において、本明細書中に記載の化合物（Ｉ）の形態Ｇと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
【0060】
治療における固体形態の使用
ＲＸＦＰ１の調節の結果として、化合物（Ｉ）は治療に有用であると予想される。
ＲＸＦＰ１の調節の結果として、化合物（Ｉ）は治療に有用であると予想される。
【0061】
「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、その症状の１つ、いくつか、又は全てを完全に又は部分的に軽減するために、又は根底にある病理を修正又は補償するために、疾患又は状態を扱うその通常の意味を有することを意図している。「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語はまた、その反対の具体的な指示がない限り、「予防」を含む。「治療的な」及び「治療的に」という用語は、対応する様式で解釈されるべきである。
【0062】
「予防」という用語は、その標準的な意味を有することが意図されており、疾患又は状態の発生を予防するための一次予防、及び疾患又は状態が既に発生しており、疾患又は状態の増悪若しくは悪化、又は疾患又は状態に関連する新たな症状の発生に対して一時的又は持続的に患者を保護する二次予防を含む。
【0063】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」と同義的に用いられる。同様に、「治療する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）を適用する」（ここで、「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、本明細書で定義されるとおりである）こととみなすことができる。
【0064】
「治療有効量」という用語は、対象において「治療」を提供するため、又は対象において疾患若しくは状態を「治療」するために有効な化合物の量を指す。治療有効量は、上記の「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び「予防」の定義に記載されるように、対象において観察可能又は測定可能な変化のいずれかを引き起こし得る。当技術分野の当業者によって認識されるように、有効量は、投与経路、賦形剤の使用、及び他の薬剤との併用に依存して変化し得る。例えば、併用療法が使用される場合、薬学的活性剤の量及び他の薬学的活性剤の量は、組み合わせた場合、対象の標的障害又は状態を治療するために一緒に有効である。これに関連して、上記のようにＲＸＦＰ１の調節及び／又はアゴニズムに応答する疾患又は状態の症状を軽減させるのに十分である場合、合わせた量は「治療有効量」である。典型的には、そのような量は当技術分野の当業者によって決定され得る。
【0065】
本明細書で使用する場合、「対象」及び「患者」という用語は、互換的に用いられる。「対象」には、例えば、哺乳動物、例えばヒトが含まれる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【0066】
したがって、本明細書中に記載される非晶質の化合物（Ｉ）、化合物（Ｉ）の形態Ｇ、非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体、又は化合物（Ｉ）を含む医薬組成物は、治療において、例えば、疾患又は障害を治療するために使用し得る。治療有効量の非晶質の化合物（Ｉ）、化合物（Ｉ）の形態Ｇ、非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体、又は本明細書に記載の化合物（Ｉ）を含む医薬組成物を、それを必要とする対象又は患者に投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法も提供される。
【0067】
本明細書中に記載される非晶質の化合物（Ｉ）、化合物（Ｉ）の形態Ｇ、非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体、又は化合物（Ｉ）を含む医薬組成物は、心血管疾患の治療において、例えば、心不全及び高血圧症の治療のために使用し得ることは理解されるであろう。
【0068】
本明細書において使用されるように、「心不全」という用語は、急性心不全、慢性心不全（ＣＨＦ）、及び急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）を含む。「心不全」という用語はまた、駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）、中程度の駆出率の心不全（ＨＦｍｒＥＦ；駆出率が軽度に低下した心不全とも呼ばれる）、又は駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）などのより具体的な診断も含み得る。
【0069】
本明細書で使用される場合、「抵抗性高血圧症」という用語は、その１つが利尿薬である異なるクラスの３つの降圧剤の最適化された用量の同時使用にもかかわらず目標を上回って上昇したままである高血圧患者、又は４つ以上の降圧薬を同時投与された場合に血圧が十分に制御される患者の血圧として定義される（Ｃａｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２０１８，７２，ｅ５３－ｅ９０）。高血圧の初期治療は、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、レニン－アンジオテンシン系の遮断薬（アンジオテンシン変換酵素［ＡＣＥ］阻害剤又はアンジオテンシン受容体遮断薬［ＡＲＢ］）、及び利尿薬であり得る。ｒＨＴ患者の場合、さらなる治療には、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト（ＭＲＡ）、β遮断薬及び／又はα遮断薬が含まれ得る。抵抗性高血圧症を有する対象は、典型的には被験体が安静時に、収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ以上及び／又は拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上を有し得る。或いは、抵抗性高血圧症を有する対象は、典型的には被験体が安静時に、収縮期血圧１３０ｍｍＨｇ以上及び／又は拡張期血圧８０ｍｍＨｇ以上を有し得る。或いは、抵抗性高血圧症を有する対象は、典型的には被験体が安静時に、収縮期血圧１５０ｍｍＨｇ以上及び／又は拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上を有し得る。場合によっては、抵抗性高血圧症は抵抗性本態性高血圧症であり得る。本態性高血圧症は、原発性高血圧症としても知られており、同定された公知の二次的原因のない高血圧症の一形態である。
【0070】
非晶質の化合物（Ｉ）、化合物（Ｉ）の形態Ｇ、非晶質化合物（Ｉ）を含む固体分散体、又は本明細書に記載の化合物（Ｉ）を含む医薬組成物はまた、腎疾患（慢性腎疾患を含む）、急性腎障害、肺疾患及び線維性障害、例えば腎臓、心臓、肺及び肝臓の線維性障害、創傷治癒（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ＯＤ（２００４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２５（２）：２０５－２３４）、糖尿病患者におけるインスリン抵抗性の逆転（Ｂｏｎｎｅｒ ＪＳ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ６２（９）：３２５１－３２６０）、様々な形態の肺高血圧症、動脈硬化の結果又は原因である障害、動脈弾性の低下、動脈コンプライアンス及び拡張性の低下（すなわち、脳卒中及び認知症）、糖尿病、終末器官損傷をもたらす微小血管疾患、冠動脈疾患及び心不全、並びに子癇前症の治療に使用することができる。
【0071】
一実施形態において、治療に使用するための非晶質の化合物（Ｉ）が提供される。
【0072】
一実施形態において、心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態の治療において使用するための非晶質の化合物（Ｉ）が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0073】
一実施形態において、ヒト患者における心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態の治療のための医薬の製造において使用するための非晶質の化合物（Ｉ）が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0074】
一実施形態において、心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態を、そのような治療を必要とするヒト患者において治療する方法であって、治療有効量の非晶質の化合物（Ｉ）をヒト患者に投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0075】
一実施形態において、心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態の治療において使用するための化合物（Ｉ）の形態Ｇが提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0076】
一実施形態において、ヒト患者における心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態の治療のための医薬の製造において使用するための化合物（Ｉ）の形態Ｇが提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0077】
一実施形態において、心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態を、そのような治療を必要とするヒト患者において治療する方法であって、治療有効量の化合物（Ｉ）の形態Ｇをヒト患者に投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0078】
一実施形態において、心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態の治療において使用するための本明細書に記載の非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0079】
一実施形態において、ヒト患者における心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態の治療のための医薬の製造において使用するための本明細書に記載の非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0080】
一実施形態において、心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態を、そのような治療を必要とするヒト患者において治療する方法であって、治療有効量の本明細書中に記載されるような非晶質の化合物（Ｉ）を含む固体分散体をヒト患者に投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0081】
一実施形態において、心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態の治療において使用するための本明細書に記載の化合物（Ｉ）を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0082】
一実施形態において、ヒト患者における心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態の治療のための医薬の製造において使用するための本明細書に記載の化合物（Ｉ）を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【0083】
一実施形態において、心不全、駆出率が保持された心不全、中程度の駆出率を有する心不全、駆出率が低下した心不全、肺高血圧症を有する心不全、慢性腎疾患、急性腎障害、高血圧症及び抵抗性高血圧症から選択される疾患又は状態を、そのような治療を必要とするヒト患者において治療する方法であって、治療有効量の本明細書中に記載されるような化合物（Ｉ）を含む医薬組成物をヒト患者に投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、疾患又は状態は心不全である。一実施形態では、疾患又は状態は抵抗性高血圧である。
【実施例】
【0084】
概して、使用した溶媒の全ては、市販されている分析用のものとした。無水溶媒は、反応用に常用されているものとした。実施例で使用した相分離器は、ＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標）Ｐｈａｓｅ Ｓｅｐａｒａｔｏｒカラムである。以下に記載される化合物は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＣｈｅｍＤｒａｗ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌバージョン１９．０．０．２２を使用して命名した。
【0085】
熱重量分析（ＴＧＡ）及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）測定を、それぞれＴＧ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５５０（ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＤＳＣ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２５００（ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。ＴＧＡについては５．１５２ｍｇ及びＤＳＣについては２．４７４ｍｇの試料をアルミニウムパンに秤量した。次いで、１００ｍＬ／分の窒素パージ下で１０℃／分の加熱速度で、ＴＧＡについては室温から３５０℃まで、ＤＳＣについては０℃から２３０℃まで試料を加熱した。空のアルミニウムパンを、ＤＳＣの参照として使用した。
【0086】
Ｘ線粉末回折分析は、例えば、Ｋｉｔａｉｇｏｒｏｄｓｋｙ，Ａ．Ｉ．（１９７３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｕｎｎ，Ｃ．Ｗ．（１９４８），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；又はＫｌｕｇ，Ｈ．Ｐ．＆ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｅ．（１９７４），Ｘ－ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出すことができる標準方法に従って実行した。
【0087】
ＸＲＰＤ方法Ａ
Ｘ線粉末回折（本明細書においてＸＲＰＤと呼ばれる）パターンは、ゼロバックグラウンドのホルダーであるシリコン単結晶に試料を載せ、試料を薄い層へと広げることによって決定した。
Ｘ線粉末回折（本明細書においてＸＲＰＤと呼ばれる）パターンは、ゼロバックグラウンドのホルダーであるシリコン単結晶に試料を載せ、試料を薄い層へと広げることによって決定した。
【0088】
粉末Ｘ線回折は、シータ－２シータ走査軸を用いて、Ｄ／Ｔｅｘ検出器を備えたリガクＭｉｎｉｆｌｅｘ ６００（Ｘ線の波長１．５４１８Å、ニッケルフィルターを通したＣｕ Ｋα照射、４０ｋＶ、１５ｍＡ）を用いる一次元走査において記録した。自動可変発散及び散乱防止スリットを使用し、試料を測定中に毎分８０回転で回転させた。試料を、それぞれ０．０１°及び１°／分のステップ幅及び走査速度を用いて走査した。
【0089】
ＸＲＰＤ方法Ｂ
試料をシリコンウェハマウントに取り付け、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ回折計（Ｃｕアノード、λ＝１．５４１８Å）を使用して分析した。試料を、０．０２°増分当たり０．１２秒の露光（連続走査モード）で、走査範囲２°～４０°２θにわたってθ－２θ構成の反射ジオメトリで測定した。Ｘ線は、４０ｋＶ及び４０ｍＡで操作される銅製のロングファインフォーカスチューブによって生成された。
試料をシリコンウェハマウントに取り付け、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ回折計（Ｃｕアノード、λ＝１．５４１８Å）を使用して分析した。試料を、０．０２°増分当たり０．１２秒の露光（連続走査モード）で、走査範囲２°～４０°２θにわたってθ－２θ構成の反射ジオメトリで測定した。Ｘ線は、４０ｋＶ及び４０ｍＡで操作される銅製のロングファインフォーカスチューブによって生成された。
【0090】
以下の略語を使用した
Ａｑ 水性
Ｂ２Ｐｉｎ２ ４，４，５，５－テトラメチル－２－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－１，３，２－ジオキサボロラン
Ｃａｌｃｄ 計算
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＡ ジイソプロピルアミン
ＤＩＡＤ ジイソプロピル（Ｅ）－ジアゼン－１，２－ジカルボキシレート
ＤＩＰＥＡ Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル－プロパン－２－アミン
ＤＭＡ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ ジフェニルホスホリルアジド
ＤＴＢＢＰＹ ４，４’－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２’－ジピリジル
ＥＳＩ エレクトロスプレーイオン化
Ｅｔ エチル
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＥｔＯＨ エタノール
ｈ／ｈｒ 時間
ＨＲＭＳ 高分解能質量分析法
ＩＰＡ イソプロピルアルコール
ＩＰＡＣ 酢酸イソプロピル
［Ｉｒ（ＣＯＤ）ＯＭｅ］２ ビス（１，５－シクロオクタジエン）－ジ－μ－メトキシジイリジウム（Ｉ）
Ｌ リットル
Ｍｅ メチル
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ｍＬ ミリリットル
ＭｅＯＨ メタノール
２－Ｍｅ－ＴＨＦ ２－メチルテトラヒドロフラン
Ｍｉｎ 分
ＭＳ 質量分析法
ＭＴＢＥ メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＥ 石油エーテル
Ｒｔ 室温
Ｓａｔ 飽和
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＵＨＰＬＣ 超高速液体クロマトグラフィー
Ａｑ 水性
Ｂ２Ｐｉｎ２ ４，４，５，５－テトラメチル－２－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－１，３，２－ジオキサボロラン
Ｃａｌｃｄ 計算
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＡ ジイソプロピルアミン
ＤＩＡＤ ジイソプロピル（Ｅ）－ジアゼン－１，２－ジカルボキシレート
ＤＩＰＥＡ Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル－プロパン－２－アミン
ＤＭＡ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ ジフェニルホスホリルアジド
ＤＴＢＢＰＹ ４，４’－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２’－ジピリジル
ＥＳＩ エレクトロスプレーイオン化
Ｅｔ エチル
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＥｔＯＨ エタノール
ｈ／ｈｒ 時間
ＨＲＭＳ 高分解能質量分析法
ＩＰＡ イソプロピルアルコール
ＩＰＡＣ 酢酸イソプロピル
［Ｉｒ（ＣＯＤ）ＯＭｅ］２ ビス（１，５－シクロオクタジエン）－ジ－μ－メトキシジイリジウム（Ｉ）
Ｌ リットル
Ｍｅ メチル
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ｍＬ ミリリットル
ＭｅＯＨ メタノール
２－Ｍｅ－ＴＨＦ ２－メチルテトラヒドロフラン
Ｍｉｎ 分
ＭＳ 質量分析法
ＭＴＢＥ メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＥ 石油エーテル
Ｒｔ 室温
Ｓａｔ 飽和
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＵＨＰＬＣ 超高速液体クロマトグラフィー
【0091】
化合物（Ｉ）の調製
中間体１：エチル８－メチル－１，４－ジオキサスピロ［４．５］デカン－８－カルボキシレート
ＤＩＡ（５７６ｍＬ、４１３ｇ、４．０８ｍｏｌ）のＴＨＦ（３．５０Ｌ）中の溶液を－５０～－４０℃に冷却し、温度を－５０～－４０℃に維持しながら、ｎ－ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５ Ｍ、１．０９ｋｇ、３．９２ｍｏｌ）の溶液を３時間にわたって添加した。溶液を－５０～－４０℃で３時間撹拌した後、温度を－５０～－４０℃に維持しながら、エチル１，４－ジオキサスピロ［４．５］デカン－８－カルボキシレート（ＴＨＦ中７００ｇ、３．２７ｍｏｌ、２．３４Ｍ）の溶液を２時間にわたって添加した。反応混合物を－５０～－４０℃で４時間撹拌した後、ヨウ化メチル（ＴＨＦ中６０３ｇ、４．２５ｍｏｌ、３．０４ Ｍ）を３時間にわたって添加し、温度を－５０～－３０℃に維持した。反応混合物を－５０～－３０℃で２時間さらに撹拌した後、温度を０℃未満に維持しながらＮＨ４Ｃｌ水溶液（３．５０Ｌ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）を１時間にわたって添加した。溶液を１５～２５℃に加温し、０．５時間保持し、次いで、層を分離し、有機層をＮＨ４Ｃｌ水溶液（２×３．５０Ｌ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）で洗浄した。温度を４５℃未満に維持しながら、減圧下で有機反応溶媒をＴＨＦからＥｔＯＨに交換すると、表題化合物がＥｔＯＨ中２７％ ｗ／ｗ溶液（２．５１ｋｇ、２．９１ｍｏｌ、８９％）として得られた。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ １．１８（３Ｈ，ｓ），１．２７－１．２２（３Ｈ，ｍ），１．４７－１．３５（２Ｈ，ｍ），１．７０－１．５６（４Ｈ，ｍ），２．１３（２Ｈ，ｄ），３．９２（４Ｈ，ｓ），４．１４（２Ｈ，ｑ），ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２２９．２．
中間体１：エチル８－メチル－１，４－ジオキサスピロ［４．５］デカン－８－カルボキシレート
【化3】
ＤＩＡ（５７６ｍＬ、４１３ｇ、４．０８ｍｏｌ）のＴＨＦ（３．５０Ｌ）中の溶液を－５０～－４０℃に冷却し、温度を－５０～－４０℃に維持しながら、ｎ－ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５ Ｍ、１．０９ｋｇ、３．９２ｍｏｌ）の溶液を３時間にわたって添加した。溶液を－５０～－４０℃で３時間撹拌した後、温度を－５０～－４０℃に維持しながら、エチル１，４－ジオキサスピロ［４．５］デカン－８－カルボキシレート（ＴＨＦ中７００ｇ、３．２７ｍｏｌ、２．３４Ｍ）の溶液を２時間にわたって添加した。反応混合物を－５０～－４０℃で４時間撹拌した後、ヨウ化メチル（ＴＨＦ中６０３ｇ、４．２５ｍｏｌ、３．０４ Ｍ）を３時間にわたって添加し、温度を－５０～－３０℃に維持した。反応混合物を－５０～－３０℃で２時間さらに撹拌した後、温度を０℃未満に維持しながらＮＨ４Ｃｌ水溶液（３．５０Ｌ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）を１時間にわたって添加した。溶液を１５～２５℃に加温し、０．５時間保持し、次いで、層を分離し、有機層をＮＨ４Ｃｌ水溶液（２×３．５０Ｌ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）で洗浄した。温度を４５℃未満に維持しながら、減圧下で有機反応溶媒をＴＨＦからＥｔＯＨに交換すると、表題化合物がＥｔＯＨ中２７％ ｗ／ｗ溶液（２．５１ｋｇ、２．９１ｍｏｌ、８９％）として得られた。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ １．１８（３Ｈ，ｓ），１．２７－１．２２（３Ｈ，ｍ），１．４７－１．３５（２Ｈ，ｍ），１．７０－１．５６（４Ｈ，ｍ），２．１３（２Ｈ，ｄ），３．９２（４Ｈ，ｓ），４．１４（２Ｈ，ｑ），ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２２９．２．
【0092】
中間体２：８－メチル－１，４－ジオキサスピロ［４．５］デカン－８－カルボン酸
中間体１（ＥｔＯＨ中１．１３ｋｇ、１．３１ｍｏｌ、２７％ ｗ／ｗ）の溶液に、ＥｔＯＨ（９００ｍＬ）を添加し、その後、温度を１５℃～３０℃に維持しながた、ＮａＯＨ水溶液（２．６３Ｌ、５．２６ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中２Ｍ）を添加した。溶液を５０℃～６０℃に加熱し、次いで、６時間保持した後、１５℃～３０℃に冷却し、溶液を減圧下で１．８Ｌ～２．４Ｌに濃縮した。ヘキサン（１．５０Ｌ）を添加し、層を分離した。水層を回収し、温度を２０℃未満に維持しながらＨＣｌ水溶液（１．３０Ｌ、５．２ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）を添加することによってｐＨを３～４に調整した。この水溶液をＤＣＭ（２×１．５０Ｌ）で抽出し、合わせた有機相を減圧下で濃縮し、温度を３０℃未満に維持しながら、表題化合物をＤＣＭ中１７％ ｗ／ｗ溶液（１．４３ｋｇ、１．２４ｍｏｌ、９４％）として得た。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ １．２５（３Ｈ，ｓ），１．５３（２Ｈ，ｄｔ），１．６２－１．７２（４Ｈ，ｍ），２．０５－２．１９（２Ｈ，ｍ），３．９３（４Ｈ，ｓ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ２２３．１．
【化4】
中間体１（ＥｔＯＨ中１．１３ｋｇ、１．３１ｍｏｌ、２７％ ｗ／ｗ）の溶液に、ＥｔＯＨ（９００ｍＬ）を添加し、その後、温度を１５℃～３０℃に維持しながた、ＮａＯＨ水溶液（２．６３Ｌ、５．２６ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中２Ｍ）を添加した。溶液を５０℃～６０℃に加熱し、次いで、６時間保持した後、１５℃～３０℃に冷却し、溶液を減圧下で１．８Ｌ～２．４Ｌに濃縮した。ヘキサン（１．５０Ｌ）を添加し、層を分離した。水層を回収し、温度を２０℃未満に維持しながらＨＣｌ水溶液（１．３０Ｌ、５．２ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）を添加することによってｐＨを３～４に調整した。この水溶液をＤＣＭ（２×１．５０Ｌ）で抽出し、合わせた有機相を減圧下で濃縮し、温度を３０℃未満に維持しながら、表題化合物をＤＣＭ中１７％ ｗ／ｗ溶液（１．４３ｋｇ、１．２４ｍｏｌ、９４％）として得た。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ １．２５（３Ｈ，ｓ），１．５３（２Ｈ，ｄｔ），１．６２－１．７２（４Ｈ，ｍ），２．０５－２．１９（２Ｈ，ｍ），３．９３（４Ｈ，ｓ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ２２３．１．
【0093】
中間体３：１－メチル－４－オキソシクロヘキサン－１－カルボン酸
方法Ａ
中間体２（ＤＣＭ中３６７ｇ、２５０ｍｍｏｌ、１４％ ｗ／ｗ）の溶液に、ＴＦＡ（９５．３ｍＬ、１４２ｇ、１．２５ｍｏｌ）を添加した。反応温度を２５～３５℃に２０時間維持した後、０～１０℃に冷却した。Ｈ２Ｏ（２５０ｍＬ）を反応溶液に添加し、ＮａＯＨ水溶液（４４０ｍＬ、１．７６ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）を添加することにより、水相のｐＨを９～１０に調整した。層を分離し、水層を保持し、０～１０℃に冷却した。ＨＣｌ水溶液（７３．５ｍＬ、２９４ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）の添加によりｐＨを２～３に調整し、次いで、ＤＣＭ（３×２５０ｍＬ）で抽出し、合わせたＤＣＭ溶液を減圧下で１５０～２００ｍＬに濃縮した。温度を４０℃未満に維持しながら、減圧下で有機反応溶媒をＤＣＭからＭｅＣＮに交換すると、表題化合物がＭｅＣＮ中３０％ ｗ／ｗ溶液（１１９ｇ、２２７ｍｍｏｌ、９１％）として得られた。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ １．３９（３Ｈ，ｓ），１．７３（２Ｈ，ｔｄ），２．４３（６Ｈ，ｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １５７．１．
方法Ａ
【化5】
中間体２（ＤＣＭ中３６７ｇ、２５０ｍｍｏｌ、１４％ ｗ／ｗ）の溶液に、ＴＦＡ（９５．３ｍＬ、１４２ｇ、１．２５ｍｏｌ）を添加した。反応温度を２５～３５℃に２０時間維持した後、０～１０℃に冷却した。Ｈ２Ｏ（２５０ｍＬ）を反応溶液に添加し、ＮａＯＨ水溶液（４４０ｍＬ、１．７６ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）を添加することにより、水相のｐＨを９～１０に調整した。層を分離し、水層を保持し、０～１０℃に冷却した。ＨＣｌ水溶液（７３．５ｍＬ、２９４ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）の添加によりｐＨを２～３に調整し、次いで、ＤＣＭ（３×２５０ｍＬ）で抽出し、合わせたＤＣＭ溶液を減圧下で１５０～２００ｍＬに濃縮した。温度を４０℃未満に維持しながら、減圧下で有機反応溶媒をＤＣＭからＭｅＣＮに交換すると、表題化合物がＭｅＣＮ中３０％ ｗ／ｗ溶液（１１９ｇ、２２７ｍｍｏｌ、９１％）として得られた。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ １．３９（３Ｈ，ｓ），１．７３（２Ｈ，ｔｄ），２．４３（６Ｈ，ｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １５７．１．
【0094】
方法Ｂ
中間体２（ＤＣＭ中６．１７ｋｇ、３．８３ｍｏｌ、１２．４％）の溶液に、ＴＦＡ（１．４２Ｌ、２．１８ｋｇ、１９．１３ｍｏｌ）を添加した。反応温度を２５℃～３５℃に２０時間維持した後、０℃～１０℃に冷却した。ＮａＯＨ水溶液（７．６６Ｌ Ｈ２Ｏ中に溶解、９１８ｇ、２２．９６ｍｏｌ）を反応溶液に添加し、水相のｐＨを９～１１に調整した。層を分離し、水層を保持し、０～１０℃に冷却した。ＤＣＭ（３．８３Ｌ）を添加した後、ＨＣｌ水溶液（１．５２Ｌ、６．０８ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）を添加すると、ｐＨが３～４に調整される。有機層を保持し、水層をＤＣＭ（２×３．８３Ｌ）で抽出し、合わせた有機相をブライン（２．３Ｌ、１５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）で洗浄した。有機相を減圧下で２．３から３．１Ｌまで濃縮した。有機反応溶媒を減圧下でＤＣＭからＭｅＣＮに交換し、温度を４５℃未満に維持し、表題化合物をＭｅＣＮ中１８％溶液（２．８５ｋｇ、３．３２ｍｏｌ、８７％）として得た。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ １．３９（３Ｈ，ｓ），１．７３（２Ｈ，ｔｄ），２．４３（６Ｈ，ｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １５７．１．
中間体２（ＤＣＭ中６．１７ｋｇ、３．８３ｍｏｌ、１２．４％）の溶液に、ＴＦＡ（１．４２Ｌ、２．１８ｋｇ、１９．１３ｍｏｌ）を添加した。反応温度を２５℃～３５℃に２０時間維持した後、０℃～１０℃に冷却した。ＮａＯＨ水溶液（７．６６Ｌ Ｈ２Ｏ中に溶解、９１８ｇ、２２．９６ｍｏｌ）を反応溶液に添加し、水相のｐＨを９～１１に調整した。層を分離し、水層を保持し、０～１０℃に冷却した。ＤＣＭ（３．８３Ｌ）を添加した後、ＨＣｌ水溶液（１．５２Ｌ、６．０８ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）を添加すると、ｐＨが３～４に調整される。有機層を保持し、水層をＤＣＭ（２×３．８３Ｌ）で抽出し、合わせた有機相をブライン（２．３Ｌ、１５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）で洗浄した。有機相を減圧下で２．３から３．１Ｌまで濃縮した。有機反応溶媒を減圧下でＤＣＭからＭｅＣＮに交換し、温度を４５℃未満に維持し、表題化合物をＭｅＣＮ中１８％溶液（２．８５ｋｇ、３．３２ｍｏｌ、８７％）として得た。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ １．３９（３Ｈ，ｓ），１．７３（２Ｈ，ｔｄ），２．４３（６Ｈ，ｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １５７．１．
【0095】
中間体４：ナフタレン－１－イルメチル１－メチル－４－オキソシクロヘキサン－１－カルボキシレート
方法Ａ
中間体３の溶液（ＭｅＣＮ中１１９ｇ、１９２ｍｍｏｌ、２５％ ｗ／ｗ）に、１－クロロメチルナフタレン（３２．２ｇ、１８３ｍｍｏｌ）、引き続いてＤＩＰＥＡ（７０．０ｍＬ、４９．７ｇ、３８４ｍｍｏｌ）及びＮａＩ（２．８８ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を５０～６０℃に８時間加熱した後、０～１０℃まで冷却した。Ｈ２Ｏ（２４０ｍＬ）を添加し、ＨＣｌ水溶液（５５．０ｍＬ、２２０ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）の添加により反応混合物のｐＨを３～４に調整した。反応混合物をＭＴＢＥ（２×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をＮａＨＣＯ３水溶液（１５０ｍＬ、１４４ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中８％ ｗ／ｗ）で洗浄した。温度を４０℃未満に維持しながら、有機反応溶媒を減圧下でＭＴＢＥからＩＰＡに交換した。反応溶液の温度を－１０～３℃に低下させ、溶液を２時間撹拌したところ、固体沈殿物が形成された。固体を濾過し、Ｎ２下で１５時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（４２．８ｇ、１４４ｍｍｏｌ、７４％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．３０（３Ｈ，ｓ），１．６５（２Ｈ，ｔｄ），２．１６－２．４７（６Ｈ，ｍ），５．６６（２Ｈ，ｓ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．５１－７．６３（３Ｈ，ｍ），７．７８－７．９３（２Ｈ，ｍ），７．９３－８．０５（１Ｈ，ｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３１９．１．
方法Ａ
【化6】
中間体３の溶液（ＭｅＣＮ中１１９ｇ、１９２ｍｍｏｌ、２５％ ｗ／ｗ）に、１－クロロメチルナフタレン（３２．２ｇ、１８３ｍｍｏｌ）、引き続いてＤＩＰＥＡ（７０．０ｍＬ、４９．７ｇ、３８４ｍｍｏｌ）及びＮａＩ（２．８８ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を５０～６０℃に８時間加熱した後、０～１０℃まで冷却した。Ｈ２Ｏ（２４０ｍＬ）を添加し、ＨＣｌ水溶液（５５．０ｍＬ、２２０ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中４Ｍ）の添加により反応混合物のｐＨを３～４に調整した。反応混合物をＭＴＢＥ（２×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をＮａＨＣＯ３水溶液（１５０ｍＬ、１４４ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中８％ ｗ／ｗ）で洗浄した。温度を４０℃未満に維持しながら、有機反応溶媒を減圧下でＭＴＢＥからＩＰＡに交換した。反応溶液の温度を－１０～３℃に低下させ、溶液を２時間撹拌したところ、固体沈殿物が形成された。固体を濾過し、Ｎ２下で１５時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（４２．８ｇ、１４４ｍｍｏｌ、７４％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．３０（３Ｈ，ｓ），１．６５（２Ｈ，ｔｄ），２．１６－２．４７（６Ｈ，ｍ），５．６６（２Ｈ，ｓ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．５１－７．６３（３Ｈ，ｍ），７．７８－７．９３（２Ｈ，ｍ），７．９３－８．０５（１Ｈ，ｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３１９．１．
【0096】
方法Ｂ
中間体３（２．６６ｋｇ、３．０９ｍｏｌ、ＭｅＣＮ中１８．２％）の溶液に、１－クロロメチルナフタレン（５３５ｇ、２．９４ｍｏｌ）、引き続いて炭酸カリウム（５１３ｇ、３．７１ｍｏｌ）及びさらなる部分の新鮮なＭｅＣＮ（７１４ｍＬ）を添加した。懸濁液を５０℃～６０℃に１７時間加熱した後、２５℃～３０℃に冷却した。固体をＣｅｌｉｔｅパッドを通した濾過によって除去し、これをＭｅＣＮ（２×９６７ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で１．４５～１．９３Ｌに濃縮する。温度を５０℃未満に維持しながら、ＭｅＣＮを減圧下でイソプロパノールに交換した。混合物の温度を２０～２５℃に低下させ、その上に固体沈殿物が形成された。混合物をさらに－１０～０℃に冷却し、次いで、固体を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、Ｎ２下で乾燥させ、表題化合物が白色固体（７５２．６ｇ、２．４９ｍｏｌ、８０．５％）として得られた；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．３０（３Ｈ，ｓ），１．６５（２Ｈ，ｔｄ），２．１６－２．４７（６Ｈ，ｍ），５．６６（２Ｈ，ｓ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．５１－７．６３（３Ｈ，ｍ），７．７８－７．９３（２Ｈ，ｍ），７．９３－８．０５（１Ｈ，ｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３１９．１．
中間体３（２．６６ｋｇ、３．０９ｍｏｌ、ＭｅＣＮ中１８．２％）の溶液に、１－クロロメチルナフタレン（５３５ｇ、２．９４ｍｏｌ）、引き続いて炭酸カリウム（５１３ｇ、３．７１ｍｏｌ）及びさらなる部分の新鮮なＭｅＣＮ（７１４ｍＬ）を添加した。懸濁液を５０℃～６０℃に１７時間加熱した後、２５℃～３０℃に冷却した。固体をＣｅｌｉｔｅパッドを通した濾過によって除去し、これをＭｅＣＮ（２×９６７ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で１．４５～１．９３Ｌに濃縮する。温度を５０℃未満に維持しながら、ＭｅＣＮを減圧下でイソプロパノールに交換した。混合物の温度を２０～２５℃に低下させ、その上に固体沈殿物が形成された。混合物をさらに－１０～０℃に冷却し、次いで、固体を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、Ｎ２下で乾燥させ、表題化合物が白色固体（７５２．６ｇ、２．４９ｍｏｌ、８０．５％）として得られた；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．３０（３Ｈ，ｓ），１．６５（２Ｈ，ｔｄ），２．１６－２．４７（６Ｈ，ｍ），５．６６（２Ｈ，ｓ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．５１－７．６３（３Ｈ，ｍ），７．７８－７．９３（２Ｈ，ｍ），７．９３－８．０５（１Ｈ，ｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３１９．１．
【0097】
中間体５：メチル５－（１，３，６，２－ジオキサザボロカン－２－イル）－４－フルオロ－２－メトキシベンゾエート
方法Ａ
Ｂ２Ｐｉｎ２（３６２ｇ、１．４３ｍｏｌ）を、酸素１％未満までＮ２で脱気した２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１．７５Ｌ）に添加した。溶液を２０～３０℃に保持し、メチル４－フルオロ－２－メトキシベンゾエートを添加した（２５０ｇ、１．３６ｍｏｌ）。ＤＴＢＢＰＹ（１．０９ｇ、４．１０ｍｍｏｌ）を添加し、反応容器を排気し、酸素レベルが０．５％未満になるまでＮ２を再充填した。［Ｉｒ（ＣＯＤ）ＯＭｅ］２（（１．３５ｇ、２．０４ｍｍｏｌ）を添加し、反応容器を排気し、酸素レベルが０．５％未満になるまでＮ２を再充填した。反応混合物を８０～８５℃に加熱し、その温度でさらに２時間保持した。反応混合物を０～５℃に冷却し、引き続いてジエタノールアミン（４２８ｇ、４．０７ｍｏｌ、ＩＰＡ中１０．９ Ｍ）を２．５時間にわたってゆっくり添加し、同時にＨ２ガスを発生させた。反応混合物を０～５℃で２．５時間撹拌した後、濾過し、固体を２－Ｍｅ－ＴＨＦ（３×７５０ｍＬ）で洗浄した。固体をＮ２下で１０時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（３５６ｇ、１．２０ｍｏｌ、８８％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ２．８１－２．８９（２Ｈ，ｍ），３．１４（２Ｈ，ｄｑ），３．７１（２Ｈ，ｄｄｄ），３．７４（３Ｈ，ｓ），３．７８（３Ｈ，ｓ），３．８４（２Ｈ，ｔｄ），６．７７（１Ｈ，ｄ），７．１０（１Ｈ，ｓ），７．８３（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２９７．１．
方法Ａ
【化7】
Ｂ２Ｐｉｎ２（３６２ｇ、１．４３ｍｏｌ）を、酸素１％未満までＮ２で脱気した２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１．７５Ｌ）に添加した。溶液を２０～３０℃に保持し、メチル４－フルオロ－２－メトキシベンゾエートを添加した（２５０ｇ、１．３６ｍｏｌ）。ＤＴＢＢＰＹ（１．０９ｇ、４．１０ｍｍｏｌ）を添加し、反応容器を排気し、酸素レベルが０．５％未満になるまでＮ２を再充填した。［Ｉｒ（ＣＯＤ）ＯＭｅ］２（（１．３５ｇ、２．０４ｍｍｏｌ）を添加し、反応容器を排気し、酸素レベルが０．５％未満になるまでＮ２を再充填した。反応混合物を８０～８５℃に加熱し、その温度でさらに２時間保持した。反応混合物を０～５℃に冷却し、引き続いてジエタノールアミン（４２８ｇ、４．０７ｍｏｌ、ＩＰＡ中１０．９ Ｍ）を２．５時間にわたってゆっくり添加し、同時にＨ２ガスを発生させた。反応混合物を０～５℃で２．５時間撹拌した後、濾過し、固体を２－Ｍｅ－ＴＨＦ（３×７５０ｍＬ）で洗浄した。固体をＮ２下で１０時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（３５６ｇ、１．２０ｍｏｌ、８８％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ２．８１－２．８９（２Ｈ，ｍ），３．１４（２Ｈ，ｄｑ），３．７１（２Ｈ，ｄｄｄ），３．７４（３Ｈ，ｓ），３．７８（３Ｈ，ｓ），３．８４（２Ｈ，ｔｄ），６．７７（１Ｈ，ｄ），７．１０（１Ｈ，ｓ），７．８３（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２９７．１．
【0098】
方法Ｂ
Ｂ２Ｐｉｎ２（２９．０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）及びメチル４－フルオロ－２－メトキシベンゾエート（２０．６ｇ、１０９ｍｍｏｌ）を、酸素１％未満までＮ２で脱気した２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１４０ｍＬ）に添加した。溶液を２０～３０℃に保持し、次いで、ＤＴＢＢＰＹ（８８ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及び［Ｉｒ（ＣＯＤ）ＯＭｅ］２（１０８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、反応容器を排気し、酸素レベルが０．５％未満になるまでＮ２を再充填した。反応混合物を８０～８５℃に加熱し、その温度でさらに３時間保持した。反応混合物を０～１０℃に冷却し、続いてイソプロパノール（１２．４ｍＬ、２１８ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、同時にＨ２ガスを発生させた。種晶（中間体５ １００ｍｇ）を添加し、続いてＩＰＡ（２０ｍＬ）に溶解したジエタノールアミン（２２．８４ｇ、２１８ｍｍｏｌ）を添加して、移動性スラリーを得た。スラリーを２０～３０℃に加温し、固体を濾過によって回収した。次いで、これを２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１６０ｍＬ）で洗浄し、固体をＮ２下で１０時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（２９．１ｇ、９６ｍｏｌ、８８％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ２．８１－２．８９（２Ｈ，ｍ），３．１４（２Ｈ，ｄｑ），３．７１（２Ｈ，ｄｄｄ），３．７４（３Ｈ，ｓ），３．７８（３Ｈ，ｓ），３．８４（２Ｈ，ｔｄ），６．７７（１Ｈ，ｄ），７．１０（１Ｈ，ｓ），７．８３（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２９７．１．
Ｂ２Ｐｉｎ２（２９．０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）及びメチル４－フルオロ－２－メトキシベンゾエート（２０．６ｇ、１０９ｍｍｏｌ）を、酸素１％未満までＮ２で脱気した２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１４０ｍＬ）に添加した。溶液を２０～３０℃に保持し、次いで、ＤＴＢＢＰＹ（８８ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及び［Ｉｒ（ＣＯＤ）ＯＭｅ］２（１０８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、反応容器を排気し、酸素レベルが０．５％未満になるまでＮ２を再充填した。反応混合物を８０～８５℃に加熱し、その温度でさらに３時間保持した。反応混合物を０～１０℃に冷却し、続いてイソプロパノール（１２．４ｍＬ、２１８ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、同時にＨ２ガスを発生させた。種晶（中間体５ １００ｍｇ）を添加し、続いてＩＰＡ（２０ｍＬ）に溶解したジエタノールアミン（２２．８４ｇ、２１８ｍｍｏｌ）を添加して、移動性スラリーを得た。スラリーを２０～３０℃に加温し、固体を濾過によって回収した。次いで、これを２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１６０ｍＬ）で洗浄し、固体をＮ２下で１０時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（２９．１ｇ、９６ｍｏｌ、８８％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ２．８１－２．８９（２Ｈ，ｍ），３．１４（２Ｈ，ｄｑ），３．７１（２Ｈ，ｄｄｄ），３．７４（３Ｈ，ｓ），３．７８（３Ｈ，ｓ），３．８４（２Ｈ，ｔｄ），６．７７（１Ｈ，ｄ），７．１０（１Ｈ，ｓ），７．８３（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２９７．１．
【0099】
中間体６：メチル４－フルオロ－５－ヒドロキシ－２－メトキシベンゾエート
方法Ａ
中間体５（３５０ｇ、１．１８ｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１．０５Ｌ）中の懸濁液にＴＨＦ（１．７５Ｌ）を添加し、反応混合物を透明な溶液が得られるまで撹拌した。（ＮＨ４）２ＣＯ３（１３６ｇ、１．４１ｍｏｌ）を添加し、不均一な混合物を０～１０℃に冷却した。ＮａＢＯ３・４Ｈ２Ｏ（２１７ｇ、１．４１ｍｏｌ）を、反応温度を０～３０℃に維持しながら２時間かけて１０等量ずつ添加した。反応温度を２０～３０℃に調整し、１時間保持した。ＮａＨＳＯ３水溶液（１．９６Ｌ、９４２ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中０．４８ Ｍ）を３時間にわたって添加し、反応混合物をさらに０．５時間撹拌した。反応混合物を濾過し、固体を酢酸エチル（７００ｍＬ）及び濾液で洗浄し、洗浄して合わせ、二相性溶液を得た。溶液を分離し、保持した有機相溶媒を減圧下でＴＨＦ／酢酸エチルからＭｅＯＨに交換し、温度を４０℃未満に維持した。Ｈ２Ｏ（３．５０Ｌ）を４時間にわたって滴加し、反応混合物を０～５℃に冷却し、２時間保持した。反応混合物を濾過し、集めた固体をＨ２Ｏ（３×３５０ｍＬ）で洗浄し、４０℃未満の熱風下で乾燥させ、表題化合物を白色固体として得た（１９５ｇ、９７４ｍｍｏｌ、収率８３％）。１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ３．８２（３Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｄ），７．５４（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２０１．０．
方法Ａ
【化8】
中間体５（３５０ｇ、１．１８ｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１．０５Ｌ）中の懸濁液にＴＨＦ（１．７５Ｌ）を添加し、反応混合物を透明な溶液が得られるまで撹拌した。（ＮＨ４）２ＣＯ３（１３６ｇ、１．４１ｍｏｌ）を添加し、不均一な混合物を０～１０℃に冷却した。ＮａＢＯ３・４Ｈ２Ｏ（２１７ｇ、１．４１ｍｏｌ）を、反応温度を０～３０℃に維持しながら２時間かけて１０等量ずつ添加した。反応温度を２０～３０℃に調整し、１時間保持した。ＮａＨＳＯ３水溶液（１．９６Ｌ、９４２ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中０．４８ Ｍ）を３時間にわたって添加し、反応混合物をさらに０．５時間撹拌した。反応混合物を濾過し、固体を酢酸エチル（７００ｍＬ）及び濾液で洗浄し、洗浄して合わせ、二相性溶液を得た。溶液を分離し、保持した有機相溶媒を減圧下でＴＨＦ／酢酸エチルからＭｅＯＨに交換し、温度を４０℃未満に維持した。Ｈ２Ｏ（３．５０Ｌ）を４時間にわたって滴加し、反応混合物を０～５℃に冷却し、２時間保持した。反応混合物を濾過し、集めた固体をＨ２Ｏ（３×３５０ｍＬ）で洗浄し、４０℃未満の熱風下で乾燥させ、表題化合物を白色固体として得た（１９５ｇ、９７４ｍｍｏｌ、収率８３％）。１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ３．８２（３Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｄ），７．５４（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２０１．０．
【0100】
方法Ｂ
中間体５（３２．４１ｇ、６７．３ｍｍｏｌ）を、酢酸（１２．１３ｇ、２０２ｍｍｏｌ）を含む２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解し、０～１０℃に冷却した。過酸化水素溶液（３０％ ｗ／ｗ、９．１６ｇ、８０．８ｍｍｏｌ）を２時間にわたって添加し、次いで、反応温度を２０～３０℃に調整し、１８時間保持した。Ｎａ２Ｓ２Ｏ３．５Ｈ２Ｏの水溶液（２０％ ｗ／ｗ、５０ｍＬ）が混合物をクエンチし、相分離をもたらす。水相を廃棄し、有機相をＮａ２Ｓ２Ｏ３．５Ｈ２Ｏの水溶液（５％ ｗ／ｗ、１００ｍＬ）で２回洗浄する。有機相を減圧下で６０ｍＬに濃縮し、続いて２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１００ｍＬ）でさらに２回真空蒸留して、３５～４５℃で溶解溶液を得た。種晶（中間体６ １００ｍｇ）を添加し、続いてｎ－ヘプタン３００ｍＬを５時間にわたってゆっくり添加することによって核形成を制御した。得られたスラリーを２０～３０℃に調整し、一晩撹拌した後、濾過した。回収した固体をｎ－ヘプタン（２×６０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、表題化合物を白色固体として得た（１２．５ｇ、６２．５ｍｍｏｌ、収率９３％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ３．８２（３Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｄ），７．５４（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２０１．０．
中間体５（３２．４１ｇ、６７．３ｍｍｏｌ）を、酢酸（１２．１３ｇ、２０２ｍｍｏｌ）を含む２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解し、０～１０℃に冷却した。過酸化水素溶液（３０％ ｗ／ｗ、９．１６ｇ、８０．８ｍｍｏｌ）を２時間にわたって添加し、次いで、反応温度を２０～３０℃に調整し、１８時間保持した。Ｎａ２Ｓ２Ｏ３．５Ｈ２Ｏの水溶液（２０％ ｗ／ｗ、５０ｍＬ）が混合物をクエンチし、相分離をもたらす。水相を廃棄し、有機相をＮａ２Ｓ２Ｏ３．５Ｈ２Ｏの水溶液（５％ ｗ／ｗ、１００ｍＬ）で２回洗浄する。有機相を減圧下で６０ｍＬに濃縮し、続いて２－Ｍｅ－ＴＨＦ（１００ｍＬ）でさらに２回真空蒸留して、３５～４５℃で溶解溶液を得た。種晶（中間体６ １００ｍｇ）を添加し、続いてｎ－ヘプタン３００ｍＬを５時間にわたってゆっくり添加することによって核形成を制御した。得られたスラリーを２０～３０℃に調整し、一晩撹拌した後、濾過した。回収した固体をｎ－ヘプタン（２×６０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、表題化合物を白色固体として得た（１２．５ｇ、６２．５ｍｍｏｌ、収率９３％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ３．８２（３Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｄ），７．５４（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２０１．０．
【0101】
中間体７：（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）－３－（メトキシカルボニル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボン酸
（３ａＲ，４Ｒ，７Ｓ，７ａＳ）－３ａ，４，７，７ａ－テトラヒドロ－４，７－メタノイソベンゾフラン－１，３－ジオン（３８７ｇ、２．３６モル）のトルエン（４．６４Ｌ）中の溶液に、キニジン（８４３ｇ、２．６０ｍｏｌ）を添加した後、トルエン（７７４ｍＬ）を添加した。反応混合物を－１０～－５℃に冷却し、ＭｅＯＨ（２２７ｇ、２８６ｍＬ、７．０８ｍｏｌ）を１．５時間にわたって滴加した後、－１０～－５℃で１４時間保持した。反応混合物を－５～５℃に加温し、２時間保持し、次いで、濾過した。固体をトルエン（３×３８７ｍＬ）で洗浄し、濾液と洗液を合わせ、０～１０℃に冷却した。他の容器で、ＨＣｌ（５９０ｍＬ、７．０８ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中１２ Ｍ）の水溶液及びＮａＣｌ（１．２４ｋｇ、２１．２ｍｏｌ）をＨ２Ｏ（６．３９Ｌ）に添加し、得られた溶液を主反応容器に滴加し、反応溶液を１０℃未満に維持した。反応混合物を１０～２０℃に加温し、０．５時間保持した後、濾過した。固体をトルエン（１．９４Ｌ）で洗浄し、濾液と洗液を合わせ、二相性溶液を分離した。有機相をＮａＣｌ水溶液（３．８７Ｌ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）で洗浄し、５℃未満で保存して、表題化合物をトルエン中５．９％ ｗ／ｗ溶液として得た（６．１９ｋｇ、１．８３ｍｏｌ、７８％）；精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １．２５－１．３２（１Ｈ，ｍ），１．９５（１Ｈ，ｄ），２．４８－２．５０（２Ｈ，ｍ），２．９３（２Ｈ，ｓ），３．５１（３Ｈ，ｓ），６．１５－６．２２（２Ｈ，ｍ），１２．２１（１Ｈ，ｓ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ２１９．１．
【化9】
（３ａＲ，４Ｒ，７Ｓ，７ａＳ）－３ａ，４，７，７ａ－テトラヒドロ－４，７－メタノイソベンゾフラン－１，３－ジオン（３８７ｇ、２．３６モル）のトルエン（４．６４Ｌ）中の溶液に、キニジン（８４３ｇ、２．６０ｍｏｌ）を添加した後、トルエン（７７４ｍＬ）を添加した。反応混合物を－１０～－５℃に冷却し、ＭｅＯＨ（２２７ｇ、２８６ｍＬ、７．０８ｍｏｌ）を１．５時間にわたって滴加した後、－１０～－５℃で１４時間保持した。反応混合物を－５～５℃に加温し、２時間保持し、次いで、濾過した。固体をトルエン（３×３８７ｍＬ）で洗浄し、濾液と洗液を合わせ、０～１０℃に冷却した。他の容器で、ＨＣｌ（５９０ｍＬ、７．０８ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中１２ Ｍ）の水溶液及びＮａＣｌ（１．２４ｋｇ、２１．２ｍｏｌ）をＨ２Ｏ（６．３９Ｌ）に添加し、得られた溶液を主反応容器に滴加し、反応溶液を１０℃未満に維持した。反応混合物を１０～２０℃に加温し、０．５時間保持した後、濾過した。固体をトルエン（１．９４Ｌ）で洗浄し、濾液と洗液を合わせ、二相性溶液を分離した。有機相をＮａＣｌ水溶液（３．８７Ｌ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）で洗浄し、５℃未満で保存して、表題化合物をトルエン中５．９％ ｗ／ｗ溶液として得た（６．１９ｋｇ、１．８３ｍｏｌ、７８％）；精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １．２５－１．３２（１Ｈ，ｍ），１．９５（１Ｈ，ｄ），２．４８－２．５０（２Ｈ，ｍ），２．９３（２Ｈ，ｓ），３．５１（３Ｈ，ｓ），６．１５－６．２２（２Ｈ，ｍ），１２．２１（１Ｈ，ｓ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ２１９．１．
【0102】
中間体８：メチル（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－３－アミノビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボキシレート塩酸塩
中間体７のトルエン中溶液（６．１９ｋｇ、５．９％ ｗ／ｗ、１．８５ｍｏｌ）に、－５～５℃でＴＥＡ（３０７ｍＬ、２２３ｇ、２．２２ｍｏｌ）、引き続いてＤＰＰＡ（５３８ｇ、１．９４ｍｏｌ）を添加し、反応溶液を５℃に維持した。反応混合物を－５～５℃で４時間攪拌し、次いで、ＴＥＡ（７６７ｍＬ、５５７ｇ、５．５５ｍｏｌ）、引き続いてクエン酸（３５２ｇ、１．８５ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を－５～５℃で６時間攪拌し、次いで、反応溶液を１０℃未満に維持しながらＨ２Ｏ（３．６Ｌ）を添加した。二相反応溶液を０．５時間攪拌し、相を分離し、有機相をＨ２Ｏ（３．６Ｌ）及びＮａＣｌ水溶液（３．６Ｌ、Ｈ２Ｏ中１５％ ｗ／ｗ）で洗浄し、次いで、２～８℃で保存すると、メチル（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－３－（アジドカルボニル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボキシレート（中間体９）がトルエン溶液として得られ、これを次の工程で直接使用した。２℃～８℃のトルエン溶液としての中間体９を、７０℃～８０℃のトルエン（１．８０Ｌ）を含有する反応器に２時間かけて添加し、反応温度を８０℃未満に維持した。得られた溶液を１時間撹拌した後、２０℃～３０℃に冷却した。有機反応溶媒をトルエンから１，４－ジオキサンに減圧下で交換し、温度を５０℃未満に維持して、メチル（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－３－イソシアナトビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボキシレート（中間体１０）を１，４－ジオキサン溶液として得、これを次の工程で直接使用した。１０～２０℃の中間体１０の１，４－ジオキサン中溶液に、ＨＣｌ（４２０ｍＬ、１．６８ｍｏｌ、１，４－ジオキサン中４Ｍ）、引き続いてＨ２Ｏ（３６０ｍＬ、１．６８ｍｏｌ、１，４－ジオキサン中４．６７Ｍ）を添加した。反応混合物を２５～３５℃に加温し、１６時間保持した。ＭＴＢＥ（１．６５Ｌ）を滴加し、反応混合物を濾過し、固体をＭＴＢＥ／１，４－ジオキサン（１：１，６６０ｍＬ）及びＭＴＢＥ（６６０ｍＬ）で洗浄し、次いで、真空下、３０～４０℃で乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（２５８ｇ、１．２７ｍｏｌ、９９％超 ｅｅ、７５％）；１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １．４５（１Ｈ，ｄ），２．０４（１Ｈ，ｄ），２．５２－２．６７（１Ｈ，ｍ），２．９４－３．１０（２Ｈ，ｍ），３．１９（１Ｈ，ｄ），３．６５（３Ｈ，ｓ），６．２１（１Ｈ，ｍ），６．３０（１Ｈ，ｍ），８．３４（３Ｈ，ｓ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １６８．１．
【化10】
中間体７のトルエン中溶液（６．１９ｋｇ、５．９％ ｗ／ｗ、１．８５ｍｏｌ）に、－５～５℃でＴＥＡ（３０７ｍＬ、２２３ｇ、２．２２ｍｏｌ）、引き続いてＤＰＰＡ（５３８ｇ、１．９４ｍｏｌ）を添加し、反応溶液を５℃に維持した。反応混合物を－５～５℃で４時間攪拌し、次いで、ＴＥＡ（７６７ｍＬ、５５７ｇ、５．５５ｍｏｌ）、引き続いてクエン酸（３５２ｇ、１．８５ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を－５～５℃で６時間攪拌し、次いで、反応溶液を１０℃未満に維持しながらＨ２Ｏ（３．６Ｌ）を添加した。二相反応溶液を０．５時間攪拌し、相を分離し、有機相をＨ２Ｏ（３．６Ｌ）及びＮａＣｌ水溶液（３．６Ｌ、Ｈ２Ｏ中１５％ ｗ／ｗ）で洗浄し、次いで、２～８℃で保存すると、メチル（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－３－（アジドカルボニル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボキシレート（中間体９）がトルエン溶液として得られ、これを次の工程で直接使用した。２℃～８℃のトルエン溶液としての中間体９を、７０℃～８０℃のトルエン（１．８０Ｌ）を含有する反応器に２時間かけて添加し、反応温度を８０℃未満に維持した。得られた溶液を１時間撹拌した後、２０℃～３０℃に冷却した。有機反応溶媒をトルエンから１，４－ジオキサンに減圧下で交換し、温度を５０℃未満に維持して、メチル（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－３－イソシアナトビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボキシレート（中間体１０）を１，４－ジオキサン溶液として得、これを次の工程で直接使用した。１０～２０℃の中間体１０の１，４－ジオキサン中溶液に、ＨＣｌ（４２０ｍＬ、１．６８ｍｏｌ、１，４－ジオキサン中４Ｍ）、引き続いてＨ２Ｏ（３６０ｍＬ、１．６８ｍｏｌ、１，４－ジオキサン中４．６７Ｍ）を添加した。反応混合物を２５～３５℃に加温し、１６時間保持した。ＭＴＢＥ（１．６５Ｌ）を滴加し、反応混合物を濾過し、固体をＭＴＢＥ／１，４－ジオキサン（１：１，６６０ｍＬ）及びＭＴＢＥ（６６０ｍＬ）で洗浄し、次いで、真空下、３０～４０℃で乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（２５８ｇ、１．２７ｍｏｌ、９９％超 ｅｅ、７５％）；１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １．４５（１Ｈ，ｄ），２．０４（１Ｈ，ｄ），２．５２－２．６７（１Ｈ，ｍ），２．９４－３．１０（２Ｈ，ｍ），３．１９（１Ｈ，ｄ），３．６５（３Ｈ，ｓ），６．２１（１Ｈ，ｍ），６．３０（１Ｈ，ｍ），８．３４（３Ｈ，ｓ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ １６８．１．
【0103】
中間体１１：ナフタレン－１－イルメチル（１ｒ，４ｒ）－４－ヒドロキシ－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート
経路Ａ
２０～３０℃のＮａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ（８．２５ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．５５ｇ、４．４８ｍｍｏｌ）及びＭｇＣｌ２（０．１１ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５５０ｍＬ）中の溶液に、中間体４（５０．０ｇ、１６９ｍｍｏｌ）をＩＰＡ（４５０ｍＬ）中の溶液として添加した。６ Ｍ ＨＣｌを用いて反応溶液のｐＨを７．３～７．８に調整し、ＮＡＤ＋（０．６６ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＡＤＨ－２３０（７．５０ｇ、０．１５ｗｔ％）を添加した。ＡＤＨ－２３０は、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ ＰＬＣ，ＵＫ（カタログ番号ＡＤＨ－２３０）から入手可能なアルコールデヒドロゲナーゼである。次いで、反応混合物を３３℃～３７℃で１８時間保持した後、温度を４５℃未満に維持しながら、減圧下で３００ｍＬ～４００ｍＬに濃縮した。ＮａＣｌ（１５０ｇ）、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）（２０．０ｇ、０．４ｗｔ％）及びＭＴＢＥ（５００ｍＬ）を添加し、反応物を０．５時間保持した。混合物を濾過し、濾過ケーキをＭＴＢＥ（２５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を分離し、水相をＭＴＢＥ（５００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｈ２Ｏ（２５０ｍＬ）で洗浄した後、温度を４５℃未満に維持しながら、減圧下でＴＨＦに溶媒交換し、ＴＨＦ中の溶液として表題化合物（１３８ｇ、３３％ ｗ／ｗ％、＞９９：１ トランス：シス、０．１％未満のＩＰＡ、収率９２％）を得、これを次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．２１（３Ｈ，ｓ），１．４８－１．５８（２Ｈ，ｍ），１．６２－１．７７（４Ｈ，ｍ），１．８２－１．９３（２Ｈ，ｍ），３．７４－３．７７（１Ｈ，ｍ），５．５７（２Ｈ，ｓ），７．４１－７．４８（１Ｈ，ｍ），７．４８－７．５７（３Ｈ，ｍ），７．８５（１Ｈ，ｄ），７．８７－７．９１（１Ｈ，ｍ），７．９８（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３２１．１．
【化11】
経路Ａ
２０～３０℃のＮａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ（８．２５ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．５５ｇ、４．４８ｍｍｏｌ）及びＭｇＣｌ２（０．１１ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５５０ｍＬ）中の溶液に、中間体４（５０．０ｇ、１６９ｍｍｏｌ）をＩＰＡ（４５０ｍＬ）中の溶液として添加した。６ Ｍ ＨＣｌを用いて反応溶液のｐＨを７．３～７．８に調整し、ＮＡＤ＋（０．６６ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＡＤＨ－２３０（７．５０ｇ、０．１５ｗｔ％）を添加した。ＡＤＨ－２３０は、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ ＰＬＣ，ＵＫ（カタログ番号ＡＤＨ－２３０）から入手可能なアルコールデヒドロゲナーゼである。次いで、反応混合物を３３℃～３７℃で１８時間保持した後、温度を４５℃未満に維持しながら、減圧下で３００ｍＬ～４００ｍＬに濃縮した。ＮａＣｌ（１５０ｇ）、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）（２０．０ｇ、０．４ｗｔ％）及びＭＴＢＥ（５００ｍＬ）を添加し、反応物を０．５時間保持した。混合物を濾過し、濾過ケーキをＭＴＢＥ（２５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を分離し、水相をＭＴＢＥ（５００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｈ２Ｏ（２５０ｍＬ）で洗浄した後、温度を４５℃未満に維持しながら、減圧下でＴＨＦに溶媒交換し、ＴＨＦ中の溶液として表題化合物（１３８ｇ、３３％ ｗ／ｗ％、＞９９：１ トランス：シス、０．１％未満のＩＰＡ、収率９２％）を得、これを次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．２１（３Ｈ，ｓ），１．４８－１．５８（２Ｈ，ｍ），１．６２－１．７７（４Ｈ，ｍ），１．８２－１．９３（２Ｈ，ｍ），３．７４－３．７７（１Ｈ，ｍ），５．５７（２Ｈ，ｓ），７．４１－７．４８（１Ｈ，ｍ），７．４８－７．５７（３Ｈ，ｍ），７．８５（１Ｈ，ｄ），７．８７－７．９１（１Ｈ，ｍ），７．９８（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３２１．１．
【0104】
経路Ｂ
窒素下、－７８℃に冷却した中間体４（１．００ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中攪拌溶液に、リチウムトリ－ｓｅｃ－ブチルボロヒドリド（１．０６ｇ、５．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）中の溶液を１分間にわたって滴加した。得られた溶液を－７８℃で２時間撹拌した。反応混合物を－７８℃で０．１ Ｍ ＨＣｌ（１０ｍＬ）でクエンチし、次いで、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をプールし、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を分取ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ、１：３）によって精製して、表題化合物（０．４８８ｇ、４８．５％）を淡黄色ゴムとして得た。単離された物質は、３：１００のシス／トランス比率を有していた。１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２１－１．２５（ｓ，３Ｈ），１．３７－１．４９（ｍ，１Ｈ），１．４９－１．６１（ｍ，２Ｈ），１．６１－１．７４（ｍ，４Ｈ），１．８３－１．９５（ｍ，２Ｈ），３．７４－３．８３（ｄｑ，１Ｈ），５．５７－５．６１（ｓ，２Ｈ），７．４３－７．５４（ｄｄ，１Ｈ），７．５０－７．６１（ｍ，３Ｈ），７．８４－７．９４（ｍ，２Ｈ），７．９７－８．０４（ｍ，１Ｈ）．）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３２１．
窒素下、－７８℃に冷却した中間体４（１．００ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中攪拌溶液に、リチウムトリ－ｓｅｃ－ブチルボロヒドリド（１．０６ｇ、５．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）中の溶液を１分間にわたって滴加した。得られた溶液を－７８℃で２時間撹拌した。反応混合物を－７８℃で０．１ Ｍ ＨＣｌ（１０ｍＬ）でクエンチし、次いで、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をプールし、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を分取ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ、１：３）によって精製して、表題化合物（０．４８８ｇ、４８．５％）を淡黄色ゴムとして得た。単離された物質は、３：１００のシス／トランス比率を有していた。１Ｈｎｍ Ｒ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２１－１．２５（ｓ，３Ｈ），１．３７－１．４９（ｍ，１Ｈ），１．４９－１．６１（ｍ，２Ｈ），１．６１－１．７４（ｍ，４Ｈ），１．８３－１．９５（ｍ，２Ｈ），３．７４－３．８３（ｄｑ，１Ｈ），５．５７－５．６１（ｓ，２Ｈ），７．４３－７．５４（ｄｄ，１Ｈ），７．５０－７．６１（ｍ，３Ｈ），７．８４－７．９４（ｍ，２Ｈ），７．９７－８．０４（ｍ，１Ｈ）．）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ３２１．
【0105】
中間体１２：メチル４－フルオロ－２－メトキシ－５－（（（１ｓ，４ｓ）－４－メチル－４－（（ナフタレン－１－イルメトキシ）カルボニル）シクロヘキシル）オキシ）ベンゾエート
中間体１１のＴＨＦ中溶液（７３６ｇ、３４％ ｗ／ｗ、８３９ｍｍｏｌ）に、ＴＨＦ（１５６ｍＬ）、ＰＰｈ３（２４８ｇ、９４４ｍｍｏｌ）及び中間体６（１４０ｇ、６９９ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を３０℃に加熱した後、１時間かけてＤＩＡＤ（１８４ｇ、９０９ｍｍｏｌ）を滴加し、反応温度を４０℃未満に維持した。溶液を３０℃～４０℃で１時間保持した後、２０℃～３０℃に冷却し、続いてＮａＣｌの水溶液（７００ｍＬ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）を添加した。層を分離し、表題化合物のＴＨＦ中の粗製溶液を次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．１７（３Ｈ，ｓ），１．２０－１．３０（２Ｈ，ｍ），１．５８（２Ｈ，ｑｄ），１．８８－１．９８（２Ｈ，ｍ），２．２９（２Ｈ，ｄ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．８８（３Ｈ，ｓ），４．０５（１Ｈ，ｔｑ），５．６１（２Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｄ），７．４３－７．５８（５Ｈ，ｍ），７．８２－７．９４（２Ｈ，ｍ），８．００（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ５０３．２．
【化12】
中間体１１のＴＨＦ中溶液（７３６ｇ、３４％ ｗ／ｗ、８３９ｍｍｏｌ）に、ＴＨＦ（１５６ｍＬ）、ＰＰｈ３（２４８ｇ、９４４ｍｍｏｌ）及び中間体６（１４０ｇ、６９９ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を３０℃に加熱した後、１時間かけてＤＩＡＤ（１８４ｇ、９０９ｍｍｏｌ）を滴加し、反応温度を４０℃未満に維持した。溶液を３０℃～４０℃で１時間保持した後、２０℃～３０℃に冷却し、続いてＮａＣｌの水溶液（７００ｍＬ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）を添加した。層を分離し、表題化合物のＴＨＦ中の粗製溶液を次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．１７（３Ｈ，ｓ），１．２０－１．３０（２Ｈ，ｍ），１．５８（２Ｈ，ｑｄ），１．８８－１．９８（２Ｈ，ｍ），２．２９（２Ｈ，ｄ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．８８（３Ｈ，ｓ），４．０５（１Ｈ，ｔｑ），５．６１（２Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｄ），７．４３－７．５８（５Ｈ，ｍ），７．８２－７．９４（２Ｈ，ｍ），８．００（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ５０３．２．
【0106】
中間体１３：４－フルオロ－２－メトキシ－５－（（（１ｓ，４ｓ）－４－メチル－４－（（ナフタレン－１－イルメトキシ）カルボニル）シクロヘキシル）オキシ）安息香酸
前の工程から直接０～５℃で使用した中間体１２の粗製溶液に、反応温度を１０℃未満に維持しながら、ＬｉＯＨ．２Ｈ２Ｏ（８８．０ｇ、２．１０ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ ５２５ｍＬ中）の水溶液を１時間にわたって添加した。溶液を１５～３０℃に加温し、１６時間激しく撹拌した。ＩＰＡＣ（１．６８Ｌ）を添加し、溶液を０℃～１０℃に冷却し、引き続いて反応温度を１０℃未満に維持しながらＨ３ＰＯ４（１．２６Ｌ、２．５２Ｍ、Ｈ２Ｏ中２ Ｍ）を滴加して、４．０～５．０の溶液ｐＨを得た。有機層を分離し、ＮａＣｌ水溶液（７００ｍＬ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）で洗浄した。温度を５０℃未満に維持しながらＴＨＦを減圧下で除去し、ＩＰＡＣ（４．２０Ｌ）を添加して、ＩＰＡＣ中の表題化合物を得て、これを次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．１８（３Ｈ，ｓ），１．２２－１．３６（２Ｈ，ｍ），１．５８（２Ｈ，ｑｄ），１．９５（２Ｈ，ｄｔ），２．２９（２Ｈ，ｄ），４．０２（３Ｈ，ｓ），４．１９（１Ｈ，ｔｄ），５．６０（２Ｈ，ｓ），６．８２（１Ｈ，ｄ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．４９－７．６２（３Ｈ，ｍ），７．７８（１Ｈ，ｄ），７．８２－７．９４（２Ｈ，ｍ），７．９９（１Ｈ，ｄ）．
【化13】
前の工程から直接０～５℃で使用した中間体１２の粗製溶液に、反応温度を１０℃未満に維持しながら、ＬｉＯＨ．２Ｈ２Ｏ（８８．０ｇ、２．１０ｍｏｌ、Ｈ２Ｏ ５２５ｍＬ中）の水溶液を１時間にわたって添加した。溶液を１５～３０℃に加温し、１６時間激しく撹拌した。ＩＰＡＣ（１．６８Ｌ）を添加し、溶液を０℃～１０℃に冷却し、引き続いて反応温度を１０℃未満に維持しながらＨ３ＰＯ４（１．２６Ｌ、２．５２Ｍ、Ｈ２Ｏ中２ Ｍ）を滴加して、４．０～５．０の溶液ｐＨを得た。有機層を分離し、ＮａＣｌ水溶液（７００ｍＬ、Ｈ２Ｏ中２０％ ｗ／ｗ）で洗浄した。温度を５０℃未満に維持しながらＴＨＦを減圧下で除去し、ＩＰＡＣ（４．２０Ｌ）を添加して、ＩＰＡＣ中の表題化合物を得て、これを次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．１８（３Ｈ，ｓ），１．２２－１．３６（２Ｈ，ｍ），１．５８（２Ｈ，ｑｄ），１．９５（２Ｈ，ｄｔ），２．２９（２Ｈ，ｄ），４．０２（３Ｈ，ｓ），４．１９（１Ｈ，ｔｄ），５．６０（２Ｈ，ｓ），６．８２（１Ｈ，ｄ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．４９－７．６２（３Ｈ，ｍ），７．７８（１Ｈ，ｄ），７．８２－７．９４（２Ｈ，ｍ），７．９９（１Ｈ，ｄ）．
【0107】
中間体１４：４－フルオロ－２－メトキシ－５－（（（１ｓ，４ｓ）－４－メチル－４－（（ナフタレン－１－イルメトキシ）カルボニル）シクロヘキシル）オキシ）ベンゾエートシクロヘキサンアミニウム塩
前の工程から直接使用した中間体１３のＩＰＡＣ中粗製溶液に、５０～５５℃で、シクロヘキシルアミン（２８０ｍＬ、６９９ｍｍｏｌ、ＩＰＡＣ中２．５ Ｍ）の溶液を３時間にわたって滴加した。不均一なスラリーを５０℃～５５℃で０．５時間、次いで４０℃～４５℃でさらに１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、固体を４０～４５℃に予熱したＩＰＡＣ（３×０．９８Ｌ）で洗浄し、Ｎ２流下４５℃で１６時間乾燥させた。乾燥して回収した固体にＭｅＯＨ（３．６４Ｌ）を添加し、混合物を５５℃～５６℃に加熱した。Ｈ２Ｏ（１．５８Ｌ）を１時間かけて滴加し、次いで混合物を１時間撹拌した後、３時間かけて０℃～５℃に冷却した。不均一なスラリーをさらに１時間保持し、次いで濾過し、５：３ ＭｅＯＨで洗浄した：Ｈ２Ｏを０℃で（２×７５０ｍＬ）、固体をＮ２下、４５℃で１６時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（３３２ｇ、メチル４－フルオロ－５－ヒドロキシ－２－メトキシベンゾエートから８５％）。１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９６（１Ｈ，ｄｄｔ），１．０３－１．３６（６Ｈ，ｍ），重複１．１４（３Ｈ，Ｓ），１．４６－１．７（５Ｈ，ｍ），１．９１（４Ｈ，ｄｔ），２．２６（２Ｈ，ｄ），２．８１（１Ｈ，ｔ），３．７６（３Ｈ，ｓ），４．０３（１Ｈ，ｔｔ），５．５９（２Ｈ，ｓ），６．６５（１Ｈ，ｄ），７．３７－７．４９（２Ｈ，ｍ），７．４９－７．６（３Ｈ，ｍ），７．８１－７．９３（２Ｈ，ｍ），７．９８（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ４８９．２．
【化14】
前の工程から直接使用した中間体１３のＩＰＡＣ中粗製溶液に、５０～５５℃で、シクロヘキシルアミン（２８０ｍＬ、６９９ｍｍｏｌ、ＩＰＡＣ中２．５ Ｍ）の溶液を３時間にわたって滴加した。不均一なスラリーを５０℃～５５℃で０．５時間、次いで４０℃～４５℃でさらに１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、固体を４０～４５℃に予熱したＩＰＡＣ（３×０．９８Ｌ）で洗浄し、Ｎ２流下４５℃で１６時間乾燥させた。乾燥して回収した固体にＭｅＯＨ（３．６４Ｌ）を添加し、混合物を５５℃～５６℃に加熱した。Ｈ２Ｏ（１．５８Ｌ）を１時間かけて滴加し、次いで混合物を１時間撹拌した後、３時間かけて０℃～５℃に冷却した。不均一なスラリーをさらに１時間保持し、次いで濾過し、５：３ ＭｅＯＨで洗浄した：Ｈ２Ｏを０℃で（２×７５０ｍＬ）、固体をＮ２下、４５℃で１６時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（３３２ｇ、メチル４－フルオロ－５－ヒドロキシ－２－メトキシベンゾエートから８５％）。１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９６（１Ｈ，ｄｄｔ），１．０３－１．３６（６Ｈ，ｍ），重複１．１４（３Ｈ，Ｓ），１．４６－１．７（５Ｈ，ｍ），１．９１（４Ｈ，ｄｔ），２．２６（２Ｈ，ｄ），２．８１（１Ｈ，ｔ），３．７６（３Ｈ，ｓ），４．０３（１Ｈ，ｔｔ），５．５９（２Ｈ，ｓ），６．６５（１Ｈ，ｄ），７．３７－７．４９（２Ｈ，ｍ），７．４９－７．６（３Ｈ，ｍ），７．８１－７．９３（２Ｈ，ｍ），７．９８（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ４８９．２．
【0108】
中間体１５：メチル（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－３－（４－フルオロ－２－メトキシ－５－（（（１ｓ，４Ｓ）－４－メチル－４－（（ナフタレン－１－イルメトキシ）カルボニル）シクロヘキシル）オキシ）ベンズアミド）ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボキシレート
中間体１４（１４９ｇ、２６４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（７５０ｍＬ）中溶液に、１５～３０℃でＨ２Ｏ（４５０ｍＬ）を添加し、引き続いてＨＣｌ（３００ｍＬ、Ｈ２Ｏ中１ Ｍ）をゆっくり添加した。二相性溶液を０．５時間撹拌し、次いで、分離し、有機相をＨＣｌ（Ｈ２Ｏ中７５０ｍＬ、０．２ Ｍ）、次いで、Ｈ２Ｏ（３×７５０ｍＬ）で洗浄した。有機溶液を減圧下で濃縮し、温度を３０℃未満に維持して、Ｈ２Ｏ ０．１％未満まで乾燥させた。溶液をＤＣＭ（４５０ｍＬ）で希釈して総体積を７５０ｍＬにした後、中間体８（５９．３ｇ、２９１ｍｍｏｌ）を添加して不均一なスラリーを得た。この混合物に、ＤＩＰＥＡ（１３７ｇ、１．０６ｍｏｌ）、引き続いてＴ３Ｐ（２５２ｇ、３９７ｍｍｏｌ、ＥｔＡＯｃ中５０％ ｗ／ｗ）を添加し、溶液を１時間撹拌した。溶液を０℃～１０℃に冷却し、続いてＨ２Ｏ（７５０ｍＬ）を添加し、続いてさらに０．５時間撹拌した。二相溶液を分離し、有機相をＨ２Ｏ（２×７５０ｍＬ）で洗浄した後、減圧下でＴＨＦに溶媒交換して、ＴＨＦ中の表題化合物を得て、これを次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．１６（３Ｈ，ｓ），１．２５（２Ｈ，ｔｄ），１．４９－１．６９（３Ｈ，ｍ），１．９２－２．０１（２Ｈ，ｍ），２．０４－２．１（１Ｈ，ｍ），２．２８（２Ｈ，ｄ），２．７１（１Ｈ，ｄｄ），２．８３（１Ｈ，ｓ），２．９２－３．０５（１Ｈ，ｍ），３．６１（３Ｈ，ｓ），３．９３（３Ｈ，ｓ），４．１７（１Ｈ，ｔｄ），４．４６（１Ｈ，ｔｄ），５．６０（２Ｈ，ｓ），６．２５（２Ｈ，ｄｄｄ），６．７２（１Ｈ，ｄ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．４８－７．６（３Ｈ，ｍ），７．８１－７．９５（３Ｈ，ｍ），７．９９（１Ｈ，ｄ），８．６０（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６１６．３．
【化15】
中間体１４（１４９ｇ、２６４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（７５０ｍＬ）中溶液に、１５～３０℃でＨ２Ｏ（４５０ｍＬ）を添加し、引き続いてＨＣｌ（３００ｍＬ、Ｈ２Ｏ中１ Ｍ）をゆっくり添加した。二相性溶液を０．５時間撹拌し、次いで、分離し、有機相をＨＣｌ（Ｈ２Ｏ中７５０ｍＬ、０．２ Ｍ）、次いで、Ｈ２Ｏ（３×７５０ｍＬ）で洗浄した。有機溶液を減圧下で濃縮し、温度を３０℃未満に維持して、Ｈ２Ｏ ０．１％未満まで乾燥させた。溶液をＤＣＭ（４５０ｍＬ）で希釈して総体積を７５０ｍＬにした後、中間体８（５９．３ｇ、２９１ｍｍｏｌ）を添加して不均一なスラリーを得た。この混合物に、ＤＩＰＥＡ（１３７ｇ、１．０６ｍｏｌ）、引き続いてＴ３Ｐ（２５２ｇ、３９７ｍｍｏｌ、ＥｔＡＯｃ中５０％ ｗ／ｗ）を添加し、溶液を１時間撹拌した。溶液を０℃～１０℃に冷却し、続いてＨ２Ｏ（７５０ｍＬ）を添加し、続いてさらに０．５時間撹拌した。二相溶液を分離し、有機相をＨ２Ｏ（２×７５０ｍＬ）で洗浄した後、減圧下でＴＨＦに溶媒交換して、ＴＨＦ中の表題化合物を得て、これを次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．１６（３Ｈ，ｓ），１．２５（２Ｈ，ｔｄ），１．４９－１．６９（３Ｈ，ｍ），１．９２－２．０１（２Ｈ，ｍ），２．０４－２．１（１Ｈ，ｍ），２．２８（２Ｈ，ｄ），２．７１（１Ｈ，ｄｄ），２．８３（１Ｈ，ｓ），２．９２－３．０５（１Ｈ，ｍ），３．６１（３Ｈ，ｓ），３．９３（３Ｈ，ｓ），４．１７（１Ｈ，ｔｄ），４．４６（１Ｈ，ｔｄ），５．６０（２Ｈ，ｓ），６．２５（２Ｈ，ｄｄｄ），６．７２（１Ｈ，ｄ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．４８－７．６（３Ｈ，ｍ），７．８１－７．９５（３Ｈ，ｍ），７．９９（１Ｈ，ｄ），８．６０（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６１６．３．
【0109】
中間体１６：（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－３－（４－フルオロ－２－メトキシ－５－（（（１ｓ，４Ｓ）－４－メチル－４－（（ナフタレン－１－イルメトキシ）カルボニル）シクロヘキシル）オキシ）ベンズアミド）ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボン酸
前の工程からの中間体１５のＴＨＦ（７５０ｍＬ）中の粗製溶液を０～５℃に冷却した。ＬｉＯＨ．２Ｈ２Ｏ（２７．７ｇ、６６１ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ １５０ｍＬ中）の水溶液を添加し、溶液を３６時間保持した。ＨＣｌ（０．５ Ｍ、１．４５Ｌ、２．９０ｍｏｌ）を少しずつゆっくり添加して溶液のｐＨを２に調整し、０～５℃で１時間保持した。不均一なスラリーを濾過し、固体を１：３ ＭｅＯＨで洗浄した。Ｈ２Ｏを０℃で（６００ｍＬ）、固体をＮ２下、４５℃で１６時間乾燥させて、粗製表題化合物を白色固体として得た（１５８ｇ、９９％）。粗製生成物（１５０ｇ）をＩＰＡＣ（１．１３Ｌ）中で６０～６５°Ｃで０．５時間スラリー化した。不均一な混合物を３時間にわたって０～５℃に冷却し、次いでさらに１時間撹拌した後、濾過した。回収した固体を０～５℃のＩＰＡＣ（２×３００ｍＬ）で乾燥させ、次いで、Ｎ２下、４５℃で１２時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（１２７ｇ、中間体１４から８２％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．１６（３Ｈ，ｓ），１．２－１．３５（２Ｈ，ｍ），１．５０－１．６９（３Ｈ，ｍ），１．８９－２．０８（３Ｈ，ｍ），２．２７（２Ｈ，ｄｄｄ），２．７２（１Ｈ，ｄｄ），２．８０（１Ｈ，ｓ），３．０６（１Ｈ，ｓ），３．７５（３Ｈ，ｓ），４．１５（１Ｈ，ｔｔ），４．４３－４．５４（１Ｈ，ｍ），５．５９（２Ｈ，ｓ），６．２４（２Ｈ，ｄｄｄ），６．５３（１Ｈ，ｄ），７．４５（１Ｈ，ｄｄ），７．４７－７．５８（３Ｈ，ｍ），７．８－７．９（３Ｈ，ｍ），７．９４－８．０５（１Ｈ，ｍ），８．５９（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６０２．３．
【化16】
前の工程からの中間体１５のＴＨＦ（７５０ｍＬ）中の粗製溶液を０～５℃に冷却した。ＬｉＯＨ．２Ｈ２Ｏ（２７．７ｇ、６６１ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ １５０ｍＬ中）の水溶液を添加し、溶液を３６時間保持した。ＨＣｌ（０．５ Ｍ、１．４５Ｌ、２．９０ｍｏｌ）を少しずつゆっくり添加して溶液のｐＨを２に調整し、０～５℃で１時間保持した。不均一なスラリーを濾過し、固体を１：３ ＭｅＯＨで洗浄した。Ｈ２Ｏを０℃で（６００ｍＬ）、固体をＮ２下、４５℃で１６時間乾燥させて、粗製表題化合物を白色固体として得た（１５８ｇ、９９％）。粗製生成物（１５０ｇ）をＩＰＡＣ（１．１３Ｌ）中で６０～６５°Ｃで０．５時間スラリー化した。不均一な混合物を３時間にわたって０～５℃に冷却し、次いでさらに１時間撹拌した後、濾過した。回収した固体を０～５℃のＩＰＡＣ（２×３００ｍＬ）で乾燥させ、次いで、Ｎ２下、４５℃で１２時間乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（１２７ｇ、中間体１４から８２％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．１６（３Ｈ，ｓ），１．２－１．３５（２Ｈ，ｍ），１．５０－１．６９（３Ｈ，ｍ），１．８９－２．０８（３Ｈ，ｍ），２．２７（２Ｈ，ｄｄｄ），２．７２（１Ｈ，ｄｄ），２．８０（１Ｈ，ｓ），３．０６（１Ｈ，ｓ），３．７５（３Ｈ，ｓ），４．１５（１Ｈ，ｔｔ），４．４３－４．５４（１Ｈ，ｍ），５．５９（２Ｈ，ｓ），６．２４（２Ｈ，ｄｄｄ），６．５３（１Ｈ，ｄ），７．４５（１Ｈ，ｄｄ），７．４７－７．５８（３Ｈ，ｍ），７．８－７．９（３Ｈ，ｍ），７．９４－８．０５（１Ｈ，ｍ），８．５９（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６０２．３．
【0110】
中間体１７：ナフタレン－１－イルメチル（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート
ＤＩＰＥＡ（６．４５ｇ、４９．９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３００ｍＬ）中の溶液に、０～５℃で中間体１６（３０．６ｇ、４９．９ｍｍｏｌ）を添加し、引き続いて（１－メチルシクロブチル）メタンアミン塩酸塩（８．６３ｇ、６２．４ｍｍｏｌ）を添加した。温度を０～５℃に維持しながらＤＩＰＥＡ（２５．８ｇ、２００ｍｍｏｌ）を滴加し、続いてＴ３Ｐ（５０．８ｇ、７９．８ｍｍｏｌ、ＥｔＡＯｃ中５０％ ｗ／ｗ）を０．５時間にわたって添加した。溶液を１５℃～２５℃に加温し、１時間撹拌した後、温度を３０℃未満に維持しながらＨ２Ｏ（１５０ｍＬ）を滴加した。二相溶液を分離し、有機相をＨ２Ｏ（２×１５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、溶媒を減圧下でＥｔＯＨに交換して、表題化合物をＥｔＯＨ中の粗製溶液（１２８ｇ、２６％ ｗ／ｗ、収率９６％）として得て、これを次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９８（３Ｈ，ｓ），１．１６（３Ｈ，ｓ），１．２１－１．２９（２Ｈ，ｍ），１．５１－１．６６（５Ｈ，ｍ），１．６６－１．７６（３Ｈ，ｍ），１．７６－１．８２（１Ｈ，ｍ），１．８８－２．０２（２Ｈ，ｍ），２．２６（３Ｈ，ｄｄ），２．４０（１Ｈ，ｄｄ），２．８０（１Ｈ，ｓ），３．００（１Ｈ，ｓ），３．０５（１Ｈ，ｄｄ），３．２１（１Ｈ，ｄｄ），３．９３（３Ｈ，ｓ），４．０６－４．２（１Ｈ，ｍ），４．３９（１Ｈ，ｔｄ），５．６０（２Ｈ，ｓ），５．６４（１Ｈ，ｔ），６．１９－６．３８（２Ｈ，ｍ），６．７０（１Ｈ，ｄ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．４９－７．６２（３Ｈ，ｍ），７．７５－７．９３（３Ｈ，ｍ），８．００（１Ｈ，ｄ），８．６６（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６８３．３．
【化17】
ＤＩＰＥＡ（６．４５ｇ、４９．９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３００ｍＬ）中の溶液に、０～５℃で中間体１６（３０．６ｇ、４９．９ｍｍｏｌ）を添加し、引き続いて（１－メチルシクロブチル）メタンアミン塩酸塩（８．６３ｇ、６２．４ｍｍｏｌ）を添加した。温度を０～５℃に維持しながらＤＩＰＥＡ（２５．８ｇ、２００ｍｍｏｌ）を滴加し、続いてＴ３Ｐ（５０．８ｇ、７９．８ｍｍｏｌ、ＥｔＡＯｃ中５０％ ｗ／ｗ）を０．５時間にわたって添加した。溶液を１５℃～２５℃に加温し、１時間撹拌した後、温度を３０℃未満に維持しながらＨ２Ｏ（１５０ｍＬ）を滴加した。二相溶液を分離し、有機相をＨ２Ｏ（２×１５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、溶媒を減圧下でＥｔＯＨに交換して、表題化合物をＥｔＯＨ中の粗製溶液（１２８ｇ、２６％ ｗ／ｗ、収率９６％）として得て、これを次の工程で直接使用した。精製化合物の１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９８（３Ｈ，ｓ），１．１６（３Ｈ，ｓ），１．２１－１．２９（２Ｈ，ｍ），１．５１－１．６６（５Ｈ，ｍ），１．６６－１．７６（３Ｈ，ｍ），１．７６－１．８２（１Ｈ，ｍ），１．８８－２．０２（２Ｈ，ｍ），２．２６（３Ｈ，ｄｄ），２．４０（１Ｈ，ｄｄ），２．８０（１Ｈ，ｓ），３．００（１Ｈ，ｓ），３．０５（１Ｈ，ｄｄ），３．２１（１Ｈ，ｄｄ），３．９３（３Ｈ，ｓ），４．０６－４．２（１Ｈ，ｍ），４．３９（１Ｈ，ｔｄ），５．６０（２Ｈ，ｓ），５．６４（１Ｈ，ｔ），６．１９－６．３８（２Ｈ，ｍ），６．７０（１Ｈ，ｄ），７．４６（１Ｈ，ｄｄ），７．４９－７．６２（３Ｈ，ｍ），７．７５－７．９３（３Ｈ，ｍ），８．００（１Ｈ，ｄ），８．６６（１Ｈ，ｄ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６８３．３．
【0111】
化合物（Ｉ）：（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸
中間体１７のＥｔＯＨ（２０６ｇ、１９％ ｗ／ｗ、５７．９ｍｍｏｌ）中の溶液に、ＥｔＯＨ（３８５ｍＬ）を添加し、引き続いて１０ｗｔ％Ｐｄ／Ｃ（３．９６ｇ、５％ ｗ／ｗ）を添加した。容器をＮ２で６回パージし、続いてＨ２によってさらに６回パージした。容器をＨ２で０．４ＭＰａに加圧し、反応溶液を２０℃～３０℃で２０時間攪拌した。Ｈ２雰囲気をＮ２で完全に置換した後、反応混合物を濾過し、固体をＥｔＯＨ（３×８０ｍＬ）で洗浄した。第２の同一のバッチを実施し、回収したＥｔＯＨ溶液を合わせて単一溶液を得た。温度を４５℃未満に維持しながら、溶媒を減圧下でＥｔＯＡｃに交換した。ＥｔＯＡｃ溶液（２８０ｍＬ）を０．５時間で７０℃～７５℃に加熱し、次いで、４０℃～４５℃に冷却し、ｎ－ヘプタン（４７５ｍＬ）を０．５時間かけて滴加した。混合物を０．５時間撹拌し、次いで、２時間にわたって２０℃～２５℃に冷却し、次いで、さらに２時間保持した。不均一なスラリーを濾過し、次いで、固体を１：２ ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘプタン（１６０ｍＬ）で２回洗浄した後、４５℃未満で２０時間乾燥させて、粗製表題化合物を白色固体として得た（５５．７ｇ、８７％）。
【化18】
中間体１７のＥｔＯＨ（２０６ｇ、１９％ ｗ／ｗ、５７．９ｍｍｏｌ）中の溶液に、ＥｔＯＨ（３８５ｍＬ）を添加し、引き続いて１０ｗｔ％Ｐｄ／Ｃ（３．９６ｇ、５％ ｗ／ｗ）を添加した。容器をＮ２で６回パージし、続いてＨ２によってさらに６回パージした。容器をＨ２で０．４ＭＰａに加圧し、反応溶液を２０℃～３０℃で２０時間攪拌した。Ｈ２雰囲気をＮ２で完全に置換した後、反応混合物を濾過し、固体をＥｔＯＨ（３×８０ｍＬ）で洗浄した。第２の同一のバッチを実施し、回収したＥｔＯＨ溶液を合わせて単一溶液を得た。温度を４５℃未満に維持しながら、溶媒を減圧下でＥｔＯＡｃに交換した。ＥｔＯＡｃ溶液（２８０ｍＬ）を０．５時間で７０℃～７５℃に加熱し、次いで、４０℃～４５℃に冷却し、ｎ－ヘプタン（４７５ｍＬ）を０．５時間かけて滴加した。混合物を０．５時間撹拌し、次いで、２時間にわたって２０℃～２５℃に冷却し、次いで、さらに２時間保持した。不均一なスラリーを濾過し、次いで、固体を１：２ ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘプタン（１６０ｍＬ）で２回洗浄した後、４５℃未満で２０時間乾燥させて、粗製表題化合物を白色固体として得た（５５．７ｇ、８７％）。
【0112】
パート１：粗製表題化合物（２．５０ｇ、４．５９ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（１５．０ｍＬ）に溶解した。水（７．５０ｍＬ）を滴加している間、溶液の温度を２５．０±２．０℃に維持し、その間に沈殿物が形成された。不均一なスラリーをさらに１．０時間撹拌し、次いで、濾過によって回収した。固体をＥｔＯＨ／水（２×５．００ｍＬ）の（２：３）混合物で洗浄し、回収し、Ｎ２下で乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（１．８０ｇ、７２％）。この物質を形態Ａとして特徴付け、パート２に記載の方法に従って晶種として使用した。
【0113】
パート２：粗製表題化合物（５０．０ｇ、９１．８ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（３５０ｍＬ）に溶解し、次いで、フィルターに通した。ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）を容器に添加し、次いでフィルターに通して、合わせたＥｔＯＨ溶液を得た。Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）を０．５時間にわたってゆっくり添加している間、溶液の温度を２５．０±２．０℃に維持した。溶液をさらに０．５時間撹拌し、次いで、パート１からの種晶物質（０．００５ｇ、０．１％ ｗ／ｗ）を添加した。溶液を６時間保持し、次いで、２時間にわたって２０．０±０．５℃に冷却し、次いで、さらに６時間保持した。Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）を６時間にわたってゆっくり添加し、次いで、混合物を濾過前にさらに２時間保持した。ＥｔＯＨ（４５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（３０ｍＬ）を容器に添加し、次いで濾過ケーキを洗浄するために使用した。固体を回収し、Ｎ２下、４５℃未満で１２時間乾燥させて、表題化合物形態Ａを白色固体として得た（４２．２ｇ、８５％）；１Ｈｎｍ Ｒ（５００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９７（３Ｈ，ｓ），１．１２－１．４２（５Ｈ，ｍ），重複１．２５（３Ｈ，Ｓ），１．４３－１．８２（１０Ｈ，ｍ），１．９２－２．１（３Ｈ，ｍ），２．２５（３Ｈ，ｄｄ），２．５１（２Ｈ，ｄｄ），２．９６（１Ｈ，ｄｄ），３．１８（１Ｈ，ｄｄ），３．９２（３Ｈ，ｓ），４．１２－４．２８（１Ｈ，ｍ），４．４１（１Ｈ，ｔ），５．８１（１Ｈ，ｔ），６．７０（１Ｈ，ｄ），７．８６（１Ｈ，ｄ），８．６０（１Ｈ，ｄ）．Ｃ３０Ｈ４２ＦＮ２Ｏ６の計算ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋：５４５．３０２２、実測値：５４５．３０１９。ＸＲＰＤパターン（ＸＲＰＤ方法Ａ）を図１に示す。
【0114】
実施例１
非晶質の（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸
（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸（３９１５ｍｇ、７．１９ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン／水８０：２０（６７ｍＬ）中の溶液を液体窒素中で凍結し、凍結乾燥機（Ｃｈｒｉｓｔ Ａｌｐｈａ ２－４ＬＤ）中で一晩乾燥させて、非晶質の（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸（３９１５ｍｇ、７．１９ｍｍｏｌ）を白色固体として得た。この非晶質形態のＸ線粉末回折パターン（ＸＲＰＤ方法Ａ）を図２に示す。
非晶質の（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸
（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸（３９１５ｍｇ、７．１９ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン／水８０：２０（６７ｍＬ）中の溶液を液体窒素中で凍結し、凍結乾燥機（Ｃｈｒｉｓｔ Ａｌｐｈａ ２－４ＬＤ）中で一晩乾燥させて、非晶質の（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸（３９１５ｍｇ、７．１９ｍｍｏｌ）を白色固体として得た。この非晶質形態のＸ線粉末回折パターン（ＸＲＰＤ方法Ａ）を図２に示す。
【0115】
実施例２
非晶質の（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸の固体分散体
化合物（Ｉ）と適合するポリマーをスクリーニングして、固体分散体に適したポリマーを選択した。以下のポリマーは、結晶化の兆候なく５０℃及び４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）で４週間にわたって安定であることが判明し、１０％、２０％及び４０％の薬物負荷で適切であることが判明した；
・ Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）３０（ポリ（１－ビニル－２－ピロリドン）、ＢＡＳＦ Ｐｈａｒｍａから入手可能）
・ Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ ６４（１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルの質量比６：４のコポリマー、ＢＡＳＦ Ｐｈａｒｍａから入手可能）
・ Ｓｏｌｕｐｌｕｓ（登録商標）（ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフトコポリマー、ＢＡＳＦ Ｐｈａｒｍａから入手可能）
・ Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００－５５Ｓ（メタクリル酸－アクリル酸エチルコポリマー（１：１）、Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＡＧから入手可能）
・ ポリアクリル酸
・ ＡＱＯＡＴ（登録商標）ＨＰＭＣ ＡＳ－ＬＦ（酢酸コハク酸ヒプロメロース、Ｓｈｉｎ－Ｅｔｓｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）
・ ＡＱＯＡＴ（登録商標）ＨＰＭＣ ＡＳ－ＨＦ（酢酸コハク酸ヒプロメロース、Ｓｈｉｎ－Ｅｔｓｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）
・ 酢酸フタル酸セルロース
・ 酢酸フタル酸ポリビニル
非晶質の（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸の固体分散体
化合物（Ｉ）と適合するポリマーをスクリーニングして、固体分散体に適したポリマーを選択した。以下のポリマーは、結晶化の兆候なく５０℃及び４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）で４週間にわたって安定であることが判明し、１０％、２０％及び４０％の薬物負荷で適切であることが判明した；
・ Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）３０（ポリ（１－ビニル－２－ピロリドン）、ＢＡＳＦ Ｐｈａｒｍａから入手可能）
・ Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ ６４（１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルの質量比６：４のコポリマー、ＢＡＳＦ Ｐｈａｒｍａから入手可能）
・ Ｓｏｌｕｐｌｕｓ（登録商標）（ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフトコポリマー、ＢＡＳＦ Ｐｈａｒｍａから入手可能）
・ Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００－５５Ｓ（メタクリル酸－アクリル酸エチルコポリマー（１：１）、Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＡＧから入手可能）
・ ポリアクリル酸
・ ＡＱＯＡＴ（登録商標）ＨＰＭＣ ＡＳ－ＬＦ（酢酸コハク酸ヒプロメロース、Ｓｈｉｎ－Ｅｔｓｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）
・ ＡＱＯＡＴ（登録商標）ＨＰＭＣ ＡＳ－ＨＦ（酢酸コハク酸ヒプロメロース、Ｓｈｉｎ－Ｅｔｓｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）
・ 酢酸フタル酸セルロース
・ 酢酸フタル酸ポリビニル
【0116】
化合物（Ｉ）の３つの非晶質の固体分散体を、以下のプロセスに従って２０％、３０％及び４０％ ｗ／ｗの薬物負荷で調製した：
１．化合物（Ｉ）をガラス容器に秤量し、次いで、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ ６４（１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルの質量比６：４のコポリマー、ＢＡＳＦ Ｐｈａｒｍａから入手可能）を添加した。次いで、粉末をＴｕｒｂｕｌａ（登録商標）ブレンダーを用いて３２ｒｐｍで５分間混合した。
２．混合物を押出する前に、ホットメルト押出機を最初に溶融ビーズで洗浄した。２０％薬物負荷固体分散体を２００℃で押出し、フィラメントを清浄なガラス容器に回収した。３０％薬物負荷固体分散体も２００℃で押出し、４０％薬物負荷固体分散体を２１０℃で押出した。
３．次いで、収集したフィラメントを実験室ミルを用いて手動で粉砕した。
１．化合物（Ｉ）をガラス容器に秤量し、次いで、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＶＡ ６４（１－ビニル－２－ピロリドンと酢酸ビニルの質量比６：４のコポリマー、ＢＡＳＦ Ｐｈａｒｍａから入手可能）を添加した。次いで、粉末をＴｕｒｂｕｌａ（登録商標）ブレンダーを用いて３２ｒｐｍで５分間混合した。
２．混合物を押出する前に、ホットメルト押出機を最初に溶融ビーズで洗浄した。２０％薬物負荷固体分散体を２００℃で押出し、フィラメントを清浄なガラス容器に回収した。３０％薬物負荷固体分散体も２００℃で押出し、４０％薬物負荷固体分散体を２１０℃で押出した。
３．次いで、収集したフィラメントを実験室ミルを用いて手動で粉砕した。
【0117】
試料を４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）（開放容器）及び５０℃（密閉容器、周囲ＲＨ）で４週間安定させ、試料のＸＲＰＤを毎週記録した。図３は、形成後、並びに４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）（開放容器）で４週間、及び５０℃（密閉容器、周囲ＲＨ）で４週間保存した後の各試料のＸＲＰＤ回折パターン（ＸＲＰＤ方法Ｂ）を示す。ＸＲＰＤパターンは、非晶質の固体分散体を４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）で４週間（開放容器）及び５０℃で４週間（密閉容器、周囲ＲＨ）保存した際に化合物（Ｉ）の結晶化が起こらなかったことを示した。３０％薬物負荷固体分散体を用いた溶解実験は、模擬胃液ｐＨ １．８及び空腹状態模擬腸液（ＦａＳＳＩＦ）ｐＨ ６．５における改善された溶解を、化合物（Ｉ）の結晶形態Ａ物質に基づく顆粒物に対して示した。
【0118】
実施例３
（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸の形態Ｇ
（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸の形態Ａを加熱すると、ＤＳＣは、約４３．９℃に開始する吸熱転移を示す。この新しい吸熱ピークは、固体－固体相転移に割り当てられ、約４３．９℃で観察される、吸熱ピークの完了を上回る温度において得られる相を形態Ｇと称する。この新しい無水相形態Ｇは、２１７．５℃での融解開始に対応するＤＳＣにおける最後の吸熱ピークまで存在する。形態Ａ／形態ＧについてのＤＳＣ出力を図４に示す。形態Ａ／形態ＧのＴＧＡ分析を図５に示す。
（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸の形態Ｇ
（１Ｓ，４ｓ）－４－（２－フルオロ－４－メトキシ－５－（（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－（（（１－メチルシクロブチル）メチル）カルバモイル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）カルバモイル）フェノキシ）－１－メチルシクロヘキサン－１－カルボン酸の形態Ａを加熱すると、ＤＳＣは、約４３．９℃に開始する吸熱転移を示す。この新しい吸熱ピークは、固体－固体相転移に割り当てられ、約４３．９℃で観察される、吸熱ピークの完了を上回る温度において得られる相を形態Ｇと称する。この新しい無水相形態Ｇは、２１７．５℃での融解開始に対応するＤＳＣにおける最後の吸熱ピークまで存在する。形態Ａ／形態ＧについてのＤＳＣ出力を図４に示す。形態Ａ／形態ＧのＴＧＡ分析を図５に示す。
【0119】
化合物（Ｉ）の生物学的及び物理化学的データ
ＲＸＦＰ１ Ｈｕ ｃＡＭＰ（試験Ａ）
ｈＲＸＦＰ１のモジュレーターをスクリーニングするために、ＧＳ－結合ｈＲＸＦＰ１受容体を介してｃＡＭＰ産生を刺激する化合物同定アッセイを使用した。ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ ＨＴＲＦキット（ＣｉｓＢｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能；カタログ番号６２ＡＭ６ＰＥＪ）を、ｃＡＭＰの検出について製造業者の推奨に従って広範囲で使用した。ＨＴＲＦ法は、細胞によって産生された天然ｃＡＭＰと色素ｄ２で標識されたｃＡＭＰとの間の競合イムノアッセイである。トレーサー結合は、ｃＡＭＰに対するクリプテート標識抗体で可視化され、したがって、シグナルは、産生されたｃＡＭＰの量に反比例する。
ＲＸＦＰ１ Ｈｕ ｃＡＭＰ（試験Ａ）
ｈＲＸＦＰ１のモジュレーターをスクリーニングするために、ＧＳ－結合ｈＲＸＦＰ１受容体を介してｃＡＭＰ産生を刺激する化合物同定アッセイを使用した。ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ ＨＴＲＦキット（ＣｉｓＢｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能；カタログ番号６２ＡＭ６ＰＥＪ）を、ｃＡＭＰの検出について製造業者の推奨に従って広範囲で使用した。ＨＴＲＦ法は、細胞によって産生された天然ｃＡＭＰと色素ｄ２で標識されたｃＡＭＰとの間の競合イムノアッセイである。トレーサー結合は、ｃＡＭＰに対するクリプテート標識抗体で可視化され、したがって、シグナルは、産生されたｃＡＭＰの量に反比例する。
【0120】
アッセイ試薬の調製：
アッセイ緩衝液：０．１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ８８０６）を含有する５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５６３０）ｐＨ ７．４を有するＨＢＳＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１４０６５）
細胞：ヒトＲＸＦＰ１で安定にトランスフェクトしたＪｕｍｐ－Ｉｎ（商標）Ｔ－ＲＥｘ（商標）ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。１０ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンで２４時間処理することによって、細胞を誘導してヒトＲＸＦＰ１を発現させた。次いで、細胞を長期保存のために凍結保存した。各実験の開始時に、細胞を融解し、ＰＢＳで洗浄し、１．８７５×１０＾５細胞／ｍｌまでアッセイ緩衝液に再懸濁した。
ｃＡＭＰ標準：ＣｉｓＢｉｏキットで提供されるストック標準ｃＡＭＰをアッセイ緩衝液で希釈して、アッセイで２．８μＭの最高最終濃度にした。
ＨＴＲＦ検出試薬：ＣｉｓＢｉｏの説明書に従って再構成されたｃＡＭＰ－ｄ２及び抗ｃＡＭＰクリプテートを、ＨＴＲＦ－キットと共に提供された溶解緩衝液で１：４０に希釈した。
アッセイ緩衝液：０．１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ８８０６）を含有する５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５６３０）ｐＨ ７．４を有するＨＢＳＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１４０６５）
細胞：ヒトＲＸＦＰ１で安定にトランスフェクトしたＪｕｍｐ－Ｉｎ（商標）Ｔ－ＲＥｘ（商標）ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。１０ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンで２４時間処理することによって、細胞を誘導してヒトＲＸＦＰ１を発現させた。次いで、細胞を長期保存のために凍結保存した。各実験の開始時に、細胞を融解し、ＰＢＳで洗浄し、１．８７５×１０＾５細胞／ｍｌまでアッセイ緩衝液に再懸濁した。
ｃＡＭＰ標準：ＣｉｓＢｉｏキットで提供されるストック標準ｃＡＭＰをアッセイ緩衝液で希釈して、アッセイで２．８μＭの最高最終濃度にした。
ＨＴＲＦ検出試薬：ＣｉｓＢｉｏの説明書に従って再構成されたｃＡＭＰ－ｄ２及び抗ｃＡＭＰクリプテートを、ＨＴＲＦ－キットと共に提供された溶解緩衝液で１：４０に希釈した。
【0121】
アッセイを実行するための段階的手順：
１．ＤＭＳＯに溶解した４０ｎＬの試験化合物を、白色３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；７８４０７５）に水性的に分注し（Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ）、密封し、アッセイするまで室温で保存した。
２．アッセイの日に、エコー音響ディスペンサーを用いて、ＤＭＳＯ中４０ｎＬの２００ｎＭリラキシン－２（１ｎＭの最終濃度）を１００％対照ウェルに添加し、４０ｎＬのＤＭＳＯを０％ウェルに添加した。
３．ホスホジエステラーゼを遮断するための１ｍＭ ＩＢＭＸ（最終濃度０．５ｍＭ）を含む４μＬのアッセイ緩衝液を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて添加した。
４．４μＬ細胞溶液（１．８７５×１０＾５細胞／ｍｌ）をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉを用いて添加して、７５０細胞／ウェルを得た。
５．室温で４５分間のインキュベーション。
６．溶解緩衝液中４μＬのｃＡＭＰ－ｄ２をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉを用いて添加した。
７．溶解緩衝液中４μＬの抗ｃＡＭＰクリプテートをＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉを用いて添加した。
８．室温での２時間のインキュベーション。
９．均一な時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）シグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）又はＰｈｅｒａｓｔａｒ（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）リーダー（λｅｘ＝３４０ｎｍ、λｅｍ＝６６５及び６１５ｎｍ）で検出した。
１．ＤＭＳＯに溶解した４０ｎＬの試験化合物を、白色３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；７８４０７５）に水性的に分注し（Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ）、密封し、アッセイするまで室温で保存した。
２．アッセイの日に、エコー音響ディスペンサーを用いて、ＤＭＳＯ中４０ｎＬの２００ｎＭリラキシン－２（１ｎＭの最終濃度）を１００％対照ウェルに添加し、４０ｎＬのＤＭＳＯを０％ウェルに添加した。
３．ホスホジエステラーゼを遮断するための１ｍＭ ＩＢＭＸ（最終濃度０．５ｍＭ）を含む４μＬのアッセイ緩衝液を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて添加した。
４．４μＬ細胞溶液（１．８７５×１０＾５細胞／ｍｌ）をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉを用いて添加して、７５０細胞／ウェルを得た。
５．室温で４５分間のインキュベーション。
６．溶解緩衝液中４μＬのｃＡＭＰ－ｄ２をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉを用いて添加した。
７．溶解緩衝液中４μＬの抗ｃＡＭＰクリプテートをＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉを用いて添加した。
８．室温での２時間のインキュベーション。
９．均一な時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）シグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）又はＰｈｅｒａｓｔａｒ（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）リーダー（λｅｘ＝３４０ｎｍ、λｅｍ＝６６５及び６１５ｎｍ）で検出した。
【0122】
ｃＡＭＰ標準曲線を使用して、ＨＴＲＦデータを、濃度応答の計算のために引き続いて使用された試料中に産生されたｃＡＭＰの量に変換した。濃度応答データを、４パラメータロジスティックフィットを用いて、ヒルの等式に当てはめた。アッセイの結果をＥＣ５０（μＭ）及びＳｉｎｆ（％）として表１に報告する。
【0123】
ＥＣ５０は、刺激活性がその最大レベルの５０％に達する濃度として定義される。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、幾何平均を報告する。
【0124】
Ｓｉｎｆは、無限濃度の試験化合物における当てはめられた活性レベル、有効性である。有効性データの比較を容易にするために、有効性を、飽和濃度のリラキシン（１ｎＭ）によって刺激された応答の効果％に対して正規化した。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、算術平均を報告する。
【0125】
ヒト血漿タンパク質結合（試験Ｂ）
アッセイは、Ｗｅｒｎｅｖｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｓｓａｙ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０２０，１８（４），１５７－１７９の第１６７頁～第１７０頁に記載のヒト血漿タンパク質結合アッセイに従って行った。データを、非結合画分（ｆｕ）（遊離％）として表１に報告する。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、算術平均を報告する。
アッセイは、Ｗｅｒｎｅｖｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｓｓａｙ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０２０，１８（４），１５７－１７９の第１６７頁～第１７０頁に記載のヒト血漿タンパク質結合アッセイに従って行った。データを、非結合画分（ｆｕ）（遊離％）として表１に報告する。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、算術平均を報告する。
【0126】
ヒト肝臓ミクロソーム安定性（試験Ｃ）
アッセイは、Ｗｅｒｎｅｖｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｓｓａｙ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０２０，１８（４），１５７－１７９の第１７０頁～第１７４頁に記載のヒト肝臓ミクロソーム安定性アッセイに従って行った。データをＣＬｉｎｔ（μｌ／分／ｍｇタンパク質）として表１に報告する。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、算術平均を報告する。
アッセイは、Ｗｅｒｎｅｖｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｓｓａｙ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０２０，１８（４），１５７－１７９の第１７０頁～第１７４頁に記載のヒト肝臓ミクロソーム安定性アッセイに従って行った。データをＣＬｉｎｔ（μｌ／分／ｍｇタンパク質）として表１に報告する。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、算術平均を報告する。
【0127】
ヒト肝細胞安定性（試験Ｄ）
ヒト肝細胞における化合物の代謝安定性を、以下のプロトコルを使用して評価した：
１．化合物及び対照化合物を適切な溶媒（ＤＭＳＯ）に入れた１０ｍＭストック溶液を調製する。インキュベーション培地（Ｌ－１５培地）を、３７℃の水浴に入れ、使用前に少なくとも１５分間温めさせる。
２．９６ウェルディープウェルプレート（「クエンチプレート」）の各ウェルに、８０μＬのアセトニトリルを添加する。
３．新しい９６ウェルプレートにおいて、１９８μＬのアセトニトリル及び２μＬの１０ｍＭストック溶液を合わせることによって、１０ｍＭ試験化合物及び対照化合物を、１００μＭに希釈する。
４．凍結保存された（－１５０℃未満）ヒト肝細胞（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ（製品番号Ｓ０１２０５）から得たＬｉｖｅｒＰｏｏｌ（商標）１０－ドナーヒト肝細胞）のバイアルを保存庫から取り出し、融解プロセスが起こるまでバイアルが極低温に保たれるようにする。バイアルを３７℃の水浴に入れて軽く振盪させることによって、可能な限り速やかに、細胞を融解させる。全ての氷晶が溶解し、見えなくなるまで、バイアルを水浴に入れたままにするべきである。融解が完了した後、バイアルに７０％エタノールをスプレーし、バイアルをバイオセーフティキャビネットに移す。
５．バイアルを開け、内容物を、融解培地を含有する５０ｍＬコニカルチューブに注ぐ。５０ｍＬコニカルチューブを、遠心分離機に入れ、１００ｇで１０分間回転させる（室温）。回転の完了後、融解培地を吸引し、肝細胞を十分なインキュベーション培地に再懸濁して、約１．５×１０６細胞／ｍＬをもたらす。
６．Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）Ｖｉｓｉｏｎを使用して細胞を計数し、生存細胞密度を測定する。生存率が不十分（生存率８０％未満）である細胞は、使用が容認できない。細胞を、インキュベーション培地で、１．０×１０６生細胞／ｍＬの研究用細胞密度に希釈する。
７．２４７．５μＬの肝細胞を９６ウェル細胞インキュベーションプレートの各ウェルに移す。このプレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔプレートシェーカー上に置いて、肝細胞を１０分間温めさせる。
８．２．５μＬの１００μＭ試験化合物又は対照化合物を、細胞を含むインキュベーションウェルに添加して反応を開始させる。
９．このプレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔプレートシェーカー上で、３７℃及び９００ｒｐｍでインキュベートする。０．５、５、１５、３０、４５、６０、８０、１００及び１２０分で、２０μＬのインキュベートした混合物を別個の「クエンチプレート」に移し、次いでボルテックスによって試料を２分間混合する。
１０．クエンチプレートを、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。各化合物の上清の３０μＬを９６ウェル分析プレートに移した。４化合物を１つのカセットにまとめてプールする。次いで、プールされた試料を、１８０μｌの純水を添加することによって希釈する。全てのインキュベーションは、単回で行われる。
ヒト肝細胞における化合物の代謝安定性を、以下のプロトコルを使用して評価した：
１．化合物及び対照化合物を適切な溶媒（ＤＭＳＯ）に入れた１０ｍＭストック溶液を調製する。インキュベーション培地（Ｌ－１５培地）を、３７℃の水浴に入れ、使用前に少なくとも１５分間温めさせる。
２．９６ウェルディープウェルプレート（「クエンチプレート」）の各ウェルに、８０μＬのアセトニトリルを添加する。
３．新しい９６ウェルプレートにおいて、１９８μＬのアセトニトリル及び２μＬの１０ｍＭストック溶液を合わせることによって、１０ｍＭ試験化合物及び対照化合物を、１００μＭに希釈する。
４．凍結保存された（－１５０℃未満）ヒト肝細胞（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ（製品番号Ｓ０１２０５）から得たＬｉｖｅｒＰｏｏｌ（商標）１０－ドナーヒト肝細胞）のバイアルを保存庫から取り出し、融解プロセスが起こるまでバイアルが極低温に保たれるようにする。バイアルを３７℃の水浴に入れて軽く振盪させることによって、可能な限り速やかに、細胞を融解させる。全ての氷晶が溶解し、見えなくなるまで、バイアルを水浴に入れたままにするべきである。融解が完了した後、バイアルに７０％エタノールをスプレーし、バイアルをバイオセーフティキャビネットに移す。
５．バイアルを開け、内容物を、融解培地を含有する５０ｍＬコニカルチューブに注ぐ。５０ｍＬコニカルチューブを、遠心分離機に入れ、１００ｇで１０分間回転させる（室温）。回転の完了後、融解培地を吸引し、肝細胞を十分なインキュベーション培地に再懸濁して、約１．５×１０６細胞／ｍＬをもたらす。
６．Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）Ｖｉｓｉｏｎを使用して細胞を計数し、生存細胞密度を測定する。生存率が不十分（生存率８０％未満）である細胞は、使用が容認できない。細胞を、インキュベーション培地で、１．０×１０６生細胞／ｍＬの研究用細胞密度に希釈する。
７．２４７．５μＬの肝細胞を９６ウェル細胞インキュベーションプレートの各ウェルに移す。このプレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔプレートシェーカー上に置いて、肝細胞を１０分間温めさせる。
８．２．５μＬの１００μＭ試験化合物又は対照化合物を、細胞を含むインキュベーションウェルに添加して反応を開始させる。
９．このプレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔプレートシェーカー上で、３７℃及び９００ｒｐｍでインキュベートする。０．５、５、１５、３０、４５、６０、８０、１００及び１２０分で、２０μＬのインキュベートした混合物を別個の「クエンチプレート」に移し、次いでボルテックスによって試料を２分間混合する。
１０．クエンチプレートを、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。各化合物の上清の３０μＬを９６ウェル分析プレートに移した。４化合物を１つのカセットにまとめてプールする。次いで、プールされた試料を、１８０μｌの純水を添加することによって希釈する。全てのインキュベーションは、単回で行われる。
【0128】
全ての計算は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して実施した。ピーク面積は、抽出イオンクロマトグラムから決定した。親化合物のインビトロ固有クリアランス（インビトロＣｌｉｎｔ（Ｌ／分／１０６細胞））を、時間曲線に対する親の消失率（％）Ｌｎの回帰分析によって決定した。インビトロ固有クリアランス（インビトロＣｌｉｎｔ、μＬ／分／１０６細胞）を表１に報告し、以下の式を使用して勾配値から決定した：
インビトロＣｌｉｎｔ＝ｋＶ／Ｎ
Ｖ＝インキュベーション体積（０．２５ｍＬ）；
Ｎ＝ウェルあたりの肝細胞の数（０．２５×１０６細胞）。
アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、幾何平均を報告する。
インビトロＣｌｉｎｔ＝ｋＶ／Ｎ
Ｖ＝インキュベーション体積（０．２５ｍＬ）；
Ｎ＝ウェルあたりの肝細胞の数（０．２５×１０６細胞）。
アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、幾何平均を報告する。
【0129】
ラット肝細胞安定性（試験Ｅ）
アッセイは、Ｗｅｒｎｅｖｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｓｓａｙ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０２０，１８（４），１５７－１７９の第１７０頁～第１７４頁に記載のラット肝細胞安定性アッセイに従って行った。データを平均Ｃｌｉｎｔ（μｌ／分／１０６細胞）として表１に報告する。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、幾何平均を報告する。
アッセイは、Ｗｅｒｎｅｖｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｓｓａｙ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０２０，１８（４），１５７－１７９の第１７０頁～第１７４頁に記載のラット肝細胞安定性アッセイに従って行った。データを平均Ｃｌｉｎｔ（μｌ／分／１０６細胞）として表１に報告する。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、幾何平均を報告する。
【0130】
溶解度（ｐＨ ７．４）（試験Ｆ）
アッセイは、Ｗｅｒｎｅｖｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｓｓａｙ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０２０，１８（４），１５７－１７９の第１６４頁～第１６７頁に記載の可溶性アッセイに従って行った。データを溶解度（μＭ）として表１に報告する。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、算術平均を報告する。
アッセイは、Ｗｅｒｎｅｖｉｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｓｓａｙ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０２０，１８（４），１５７－１７９の第１６４頁～第１６７頁に記載の可溶性アッセイに従って行った。データを溶解度（μＭ）として表１に報告する。アッセイを同じ化合物について複数回行った場合、算術平均を報告する。
【0131】
【表1】
【0132】
ヒトＲＸＦＰ１ ｃＧＭＰ産生アッセイ（試験Ｇ）
ｃＧＭＰ産生に関するＲＸＦＰ１アゴニスト活性について化合物をプロファイルするために、ＧｒｅｅｎｇＥＮＩｅ ｃＧＭＰアッセイ（Ｍｏｎｔａｎａｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ；カタログ番号Ｄ８００Ｇ）を使用した。このアッセイは、ＢａｃＭａｍベクター中の哺乳動物細胞に送達されるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質蛍光バイオセンサに基づく。ｃＧＭＰがバイオセンサに結合すると、蛍光が減少する。
ｃＧＭＰ産生に関するＲＸＦＰ１アゴニスト活性について化合物をプロファイルするために、ＧｒｅｅｎｇＥＮＩｅ ｃＧＭＰアッセイ（Ｍｏｎｔａｎａｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ；カタログ番号Ｄ８００Ｇ）を使用した。このアッセイは、ＢａｃＭａｍベクター中の哺乳動物細胞に送達されるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質蛍光バイオセンサに基づく。ｃＧＭＰがバイオセンサに結合すると、蛍光が減少する。
【0133】
アッセイ試薬の調製：
アッセイ緩衝液：０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ；Ａ８８０６）を含有するＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ；１４０４０１３３）
細胞：ｐＩＲＥＳｎｅｏ３中のヒトＲＸＦＰ１で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ｓ細胞を使用した。細胞を、ＲＸＦＰ１発現を維持するために０．８ｍｇ／ｍＬで補完した１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ；３１９６６）中で培養した。
アッセイ緩衝液：０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ；Ａ８８０６）を含有するＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ；１４０４０１３３）
細胞：ｐＩＲＥＳｎｅｏ３中のヒトＲＸＦＰ１で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ｓ細胞を使用した。細胞を、ＲＸＦＰ１発現を維持するために０．８ｍｇ／ｍＬで補完した１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ；３１９６６）中で培養した。
【0134】
アッセイを実行するための段階的プロトコル：
１日目
１．形質導入の１日前に細胞を分割し、組織培養フラスコ内で抗生物質を含まない１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中６３０００細胞／ｃｍ２に播種した。
２日目
２．ＰＢＳ洗浄後、アキュターゼ（Ｇｉｂｃｏ；１７３７３４１）を用いて細胞を剥離し、培地に再懸濁し、５０ｍＬチューブに回収した。
３．細胞をＣＥＤＥＸ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）で計数し、培地で２６７０００細胞／ｍＬに希釈した。
４．ウイルス形質導入マスターミックスを、単一ウェルに対して以下の割合で試薬を混合することによって調製した：
６μＬｇＥＮＩｅ ＢａｃＭＡＭベクター
０．２μＬ ５００ｍＭ酪酸ナトリウム
１３．８μＬ １０％ ＦＢＳ 含有ＤＭＥＭ培地
総体積２０μＬ
５．細胞及び形質導入マスターミックスを、単一ウェルに対して３０μＬの細胞及び２０μＬのマスターミックスの割合で混合した。
６．上記由来の細胞形質導入混合物をウェルあたり５０μＬで、黒色ポリ－Ｄ－リジンコーティングされたμｃｌｅａｒ３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；７８１９４６）に分注した。
７．プレートを暗所で３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
３日目
８．Ｂｌｕｅｗａｓｈｅｒ（ＢｌｕＣａｔＢｉｏ）を使用してプレートから培地を除去した。
９．２０μＬのアッセイ緩衝液をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて添加した。
１０．プレートをアッセイ前に暗所で室温にて３０分間インキュベートした。
１１．プレートを、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してアッセイした：アッセイ緩衝液で希釈した１０μＬの化合物をＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａによって各ウェルに添加し、緑色蛍光を最大３時間にわたって経時的に測定した。
１日目
１．形質導入の１日前に細胞を分割し、組織培養フラスコ内で抗生物質を含まない１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中６３０００細胞／ｃｍ２に播種した。
２日目
２．ＰＢＳ洗浄後、アキュターゼ（Ｇｉｂｃｏ；１７３７３４１）を用いて細胞を剥離し、培地に再懸濁し、５０ｍＬチューブに回収した。
３．細胞をＣＥＤＥＸ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）で計数し、培地で２６７０００細胞／ｍＬに希釈した。
４．ウイルス形質導入マスターミックスを、単一ウェルに対して以下の割合で試薬を混合することによって調製した：
６μＬｇＥＮＩｅ ＢａｃＭＡＭベクター
０．２μＬ ５００ｍＭ酪酸ナトリウム
１３．８μＬ １０％ ＦＢＳ 含有ＤＭＥＭ培地
総体積２０μＬ
５．細胞及び形質導入マスターミックスを、単一ウェルに対して３０μＬの細胞及び２０μＬのマスターミックスの割合で混合した。
６．上記由来の細胞形質導入混合物をウェルあたり５０μＬで、黒色ポリ－Ｄ－リジンコーティングされたμｃｌｅａｒ３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；７８１９４６）に分注した。
７．プレートを暗所で３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
３日目
８．Ｂｌｕｅｗａｓｈｅｒ（ＢｌｕＣａｔＢｉｏ）を使用してプレートから培地を除去した。
９．２０μＬのアッセイ緩衝液をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて添加した。
１０．プレートをアッセイ前に暗所で室温にて３０分間インキュベートした。
１１．プレートを、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してアッセイした：アッセイ緩衝液で希釈した１０μＬの化合物をＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａによって各ウェルに添加し、緑色蛍光を最大３時間にわたって経時的に測定した。
【0135】
データを、Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェア（Ｇｅｎｅｄａｔａ ＡＧ）を使用して処理した。バックグラウンド蛍光を差し引いた後（化合物の添加前）、化合物添加後０～９０分の曲線下面積値を応答の計算に使用した。濃度応答データを４パラメータロジスティックフィットで当てはめ、ＥＣ５０値（ｎＭ）を表２に報告する。
【0136】
ヒトＲＸＦＰ１リン酸化－ＥＲＫアッセイ（試験Ｈ）
ＥＲＫリン酸化に関するＲＸＦＰ１アゴニスト活性について化合物をプロファイルするために、進行リン酸化ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）細胞キット（ＣｉｓＢｉｏ；６４ＡＥＲＰＥＨ）を使用した。このアッセイは、２つの抗体を使用する。１つはドナーフルオロフォア（Ｅｕクリプテート）で標識されたものであり、２つ目はアクセプター（ｄ２）で標識されたものである。第１の抗体はリン酸化ＥＲＫに特異的に結合し、第２の抗体はＥＲＫの別のモチーフに結合し、そのリン酸化状態とは無関係である。ＥＲＫリン酸化は、２つの抗体が関与する免疫複合体形成を可能にし、それによってＦＲＥＴシグナルを生成する。その強度は、試料中のリン酸化ＥＲＫの濃度に比例する。アッセイは、製造業者の推奨に従って実施した。
ＥＲＫリン酸化に関するＲＸＦＰ１アゴニスト活性について化合物をプロファイルするために、進行リン酸化ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）細胞キット（ＣｉｓＢｉｏ；６４ＡＥＲＰＥＨ）を使用した。このアッセイは、２つの抗体を使用する。１つはドナーフルオロフォア（Ｅｕクリプテート）で標識されたものであり、２つ目はアクセプター（ｄ２）で標識されたものである。第１の抗体はリン酸化ＥＲＫに特異的に結合し、第２の抗体はＥＲＫの別のモチーフに結合し、そのリン酸化状態とは無関係である。ＥＲＫリン酸化は、２つの抗体が関与する免疫複合体形成を可能にし、それによってＦＲＥＴシグナルを生成する。その強度は、試料中のリン酸化ＥＲＫの濃度に比例する。アッセイは、製造業者の推奨に従って実施した。
【0137】
アッセイ試薬の調製：
細胞：ｐＩＲＥＳｎｅｏ３中のヒトＲＸＦＰ１で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ｓ細胞を使用した。細胞を、ＲＸＦＰ１発現を維持するために０．８ｍｇ／ｍＬで補完した１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ；３１９６６）中で培養した。連続培養した細胞についてアッセイを行った。
細胞：ｐＩＲＥＳｎｅｏ３中のヒトＲＸＦＰ１で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ｓ細胞を使用した。細胞を、ＲＸＦＰ１発現を維持するために０．８ｍｇ／ｍＬで補完した１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ；３１９６６）中で培養した。連続培養した細胞についてアッセイを行った。
【0138】
試験化合物の希釈：化合物を、フェノールレッドを含まない無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ；３１０５３－０３８）で所望の濃度に希釈した。ＤＭＳＯ濃度を０．４％に調整した。
【0139】
抗体混合物：Ｅｕ及びｄ２標識抗ＥＲＫ１／２抗体を、キットに提供される検出緩衝液で２０倍に別々に希釈した。実験の直前に、等量の各希釈抗体溶液を抗体混合物に合わせた。
【0140】
アッセイを実行するための段階的プロトコル：
１日目
１．アキュターゼ（ＧＩｂｃｏ；１７３７３４１）を使用して細胞を培養フラスコから剥離し、１０％ ＦＢＳを含有するフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地に再懸濁し、５０ｍＬチューブに回収した。
２．細胞をＣＥＤＥＸ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）で計数し、上記の培地で３２０ ０００細胞／ｍＬに希釈した。
３．ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液を、黒色μｃｌｅａｒポリ－Ｄ－リジンコーティングμｃｌｅａｒ ９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；６５５９４６）に分注した。
４．プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
２日目
５．血清飢餓：培地を除去し、フェノールレッドを含まない５０μＬの無血清ＤＭＥＭと交換した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で５時間インキュベートした。
６．ウェルあたり５０μＬの試験化合物溶液を添加した。
７．プレートを室温で５分間インキュベートした。
８．培地を迅速に除去し、ウェルあたり５０μＬの溶解緩衝液（添加前に最終濃度の１倍に希釈）を添加することによって刺激を停止した。
９．プレートを－８０℃に移し、溶解物を凍結した。
３日目
１０．プレートを融解し、室温で３０分間振盪した。
１１．細胞溶解物をピペッティングによってホモジナイズした。
１２．ウェルあたり１６μＬのホモジネートを白色低容量３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；７８４０７５）に移した。
１３．ウェルあたり４μＬの抗体混合物を添加した。
１４．プレートを室温で暗所で４時間インキュベートした。
１５．均一な時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）シグナルを、Ｐｈｅｒａｓｔａｒ（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）リーダー（λｅｘ＝３４０ｎｍ、λｅｍ＝６６５及び６１５ｎｍ ）で検出した。
１日目
１．アキュターゼ（ＧＩｂｃｏ；１７３７３４１）を使用して細胞を培養フラスコから剥離し、１０％ ＦＢＳを含有するフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地に再懸濁し、５０ｍＬチューブに回収した。
２．細胞をＣＥＤＥＸ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）で計数し、上記の培地で３２０ ０００細胞／ｍＬに希釈した。
３．ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液を、黒色μｃｌｅａｒポリ－Ｄ－リジンコーティングμｃｌｅａｒ ９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；６５５９４６）に分注した。
４．プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
２日目
５．血清飢餓：培地を除去し、フェノールレッドを含まない５０μＬの無血清ＤＭＥＭと交換した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で５時間インキュベートした。
６．ウェルあたり５０μＬの試験化合物溶液を添加した。
７．プレートを室温で５分間インキュベートした。
８．培地を迅速に除去し、ウェルあたり５０μＬの溶解緩衝液（添加前に最終濃度の１倍に希釈）を添加することによって刺激を停止した。
９．プレートを－８０℃に移し、溶解物を凍結した。
３日目
１０．プレートを融解し、室温で３０分間振盪した。
１１．細胞溶解物をピペッティングによってホモジナイズした。
１２．ウェルあたり１６μＬのホモジネートを白色低容量３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；７８４０７５）に移した。
１３．ウェルあたり４μＬの抗体混合物を添加した。
１４．プレートを室温で暗所で４時間インキュベートした。
１５．均一な時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）シグナルを、Ｐｈｅｒａｓｔａｒ（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）リーダー（λｅｘ＝３４０ｎｍ、λｅｍ＝６６５及び６１５ｎｍ ）で検出した。
【0141】
ＨＴＲＦ比データを、Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェア（Ｇｅｎｅｄａｔａ ＡＧ）を使用して処理した。濃度応答データを、表２に報告される４パラメータロジスティックフィット及びＥＣ５０値（ｎＭ）に当てはめた。
【0142】
【表2】
【0143】
ｐＨ １．２のＳＧＦ中の非晶質化合物（Ｉ）の溶解度（試験Ｉ）
化合物（Ｉ）の非晶質のナノ懸濁物の調製
化合物（Ｉ）の１００ｍＭストック溶液を、超音波処理及び撹拌によってＤＭＡ及びミグリオール８１２（１４０．２μＬのＤＭＡ中９．４４ｍｇ及びミグリオール８１２中２３．６μＬ）中で調製した。１０μＬのストック溶液を、０．２％ ｗ／ｗ ＰＶＰＫ３０及び０．２％ ｗ／ｗ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７を含む９９０μＬの安定化剤溶液及び０．２５ｍＭ ＳＤＳ水溶液に数秒の超音波処理下で迅速に注入して、１ｍＭの非晶質のナノ懸濁物を作製した。この処方物を精製水でさらに０．２５ｍＭに希釈する。
化合物（Ｉ）の非晶質のナノ懸濁物の調製
化合物（Ｉ）の１００ｍＭストック溶液を、超音波処理及び撹拌によってＤＭＡ及びミグリオール８１２（１４０．２μＬのＤＭＡ中９．４４ｍｇ及びミグリオール８１２中２３．６μＬ）中で調製した。１０μＬのストック溶液を、０．２％ ｗ／ｗ ＰＶＰＫ３０及び０．２％ ｗ／ｗ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７を含む９９０μＬの安定化剤溶液及び０．２５ｍＭ ＳＤＳ水溶液に数秒の超音波処理下で迅速に注入して、１ｍＭの非晶質のナノ懸濁物を作製した。この処方物を精製水でさらに０．２５ｍＭに希釈する。
【0144】
溶解度実験
非晶質の粒子と平衡状態にあるバルク濃度を、濁度法（Ｌｉｎｄｆｏｒｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００６，２２（３），９１１－９１６に記載）によって３７℃で決定される。低体積の薬物懸濁液を、２０００μＬの模擬胃液ｐＨ １．２（ＳＧＦ）を含有する蛍光キュベットに直接連続的に添加し、次いで混合して所望の濃度を得る。７００ｎｍでの光散乱強度を、全薬物濃度の関数として９０°の散乱角で記録する。光散乱装置として、Ｐｅｒｋｉｎ－ＥｌｍｅｒＬＳ ５５Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用し、発光波長と励起波長の両方を７００ｎｍに設定する。スリット励起を２．５ｎｍに設定し、スリット発光を５ｎｍに設定する。測定を開始する前に、粒子を少なくとも３０秒間溶解させる。次いで、データを１分間収集し、平均光散乱強度を計算する。溶解度試験を、非晶質のナノ懸濁液の形成から４５分以内に行った。
非晶質の粒子と平衡状態にあるバルク濃度を、濁度法（Ｌｉｎｄｆｏｒｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００６，２２（３），９１１－９１６に記載）によって３７℃で決定される。低体積の薬物懸濁液を、２０００μＬの模擬胃液ｐＨ １．２（ＳＧＦ）を含有する蛍光キュベットに直接連続的に添加し、次いで混合して所望の濃度を得る。７００ｎｍでの光散乱強度を、全薬物濃度の関数として９０°の散乱角で記録する。光散乱装置として、Ｐｅｒｋｉｎ－ＥｌｍｅｒＬＳ ５５Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用し、発光波長と励起波長の両方を７００ｎｍに設定する。スリット励起を２．５ｎｍに設定し、スリット発光を５ｎｍに設定する。測定を開始する前に、粒子を少なくとも３０秒間溶解させる。次いで、データを１分間収集し、平均光散乱強度を計算する。溶解度試験を、非晶質のナノ懸濁液の形成から４５分以内に行った。
【0145】
【表3】
【0146】
光散乱を、化合物（Ｉ）の総濃度の関数としてプロットした。低濃度では粒子は溶解するが、溶解度を超える濃度では粒子は懸濁したままであり、総濃度の関数として光散乱強度がほぼ線形に増加する。高濃度データに当てはめた直線をゼロ強度に外挿して、３７℃でのｐＨ １．２のＳＧＦにおける化合物（Ｉ）の非晶質溶解度を推定し、これを８μＭであると決定した。総濃度の関数としての光散乱強度を図６に示す。
【0147】
ｐＨ １．２のＳＧＦ中の化合物（Ｉ）の結晶形態Ａの溶解度（試験Ｊ）
模擬胃液ｐＨ １．２（ＳＧＦ）中の結晶溶解度を、小型振盪フラスコ法（３７℃で２４時間撹拌）を使用して測定した。過剰の化合物（Ｉ）の形態Ａをバイアルに秤量し、１．２ｍＬのｐＨ １．２のＳＧＦを添加し、試料を４５分間超音波処理した。
模擬胃液ｐＨ １．２（ＳＧＦ）中の結晶溶解度を、小型振盪フラスコ法（３７℃で２４時間撹拌）を使用して測定した。過剰の化合物（Ｉ）の形態Ａをバイアルに秤量し、１．２ｍＬのｐＨ １．２のＳＧＦを添加し、試料を４５分間超音波処理した。
【0148】
試料を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆシェーカー、撹拌速度１０００ｒｐｍで、３７℃で２４時間撹拌した。次いで、試料を１００００ＲＰＭで１５分間、３７℃で遠心分離した。およそ５００μＬの上清を自動ピペットで新しいバイアルに取り出し、１００００ｒｐｍ、３７℃で再び１５分間遠心分離した。次いで、２回目の遠心分離から、試料を自動ピペットで採取して最終希釈した。２回目の遠心分離後の平衡化した残りの試料溶液のｐＨを測定した。ＸＲＰＤを使用して、形態変化が生じていないことを確認した。ＵＨＰＬＣを使用して試料中の濃度を定量化し、３７℃でのｐＨ １．２のＳＧＦ中の化合物（Ｉ）の形態Ａの溶解度は０．４μＭであることが見出された。
【0149】
当技術分野の当業者は、上記のアッセイが、結果に有意に影響を与えることなく、プロトコルに対する代替の装置及びわずかな変形を使用して実施され得ることを理解するであろう。
【0150】
この説明及びその特定の例は、特定の実施形態を示しているが、これは例示のみを目的としている。したがって、本開示は、本明細書に記載した例示的な実施形態に限定されるものではなく、様々に変形させることができる。加えて、明瞭さを理由として別々の実施形態に関連して説明されている様々な実施形態を組み合わせて、単一の実施形態を形成し得ることも認識されたい。逆に言うと、簡潔さを理由として単一の実施形態に関連して説明されている様々な実施形態を組み合わせて、これらの部分的組み合わせも形成し得る。
【0151】
本明細書内に開示された任意の刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】