特表 2025-524249 微生物の増殖が抑制された飲料

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-07-25

(54)【発明の名称】微生物の増殖が抑制された飲料

(51)【国際特許分類】

   A23B 70/10 20250101AFI20250717BHJP

   A23B 2/746 20250101ALI20250717BHJP

   A23B 2/754 20250101ALI20250717BHJP

【ＦＩ】

A23B70/10

A23B2/746

A23B2/754

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2025530965

(86)(22)【出願日】2023-07-31

(85)【翻訳文提出日】2024-10-18

(86)【国際出願番号】 JP2023030627

(87)【国際公開番号】W WO2024029635

(87)【国際公開日】2024-02-08

(31)【優先権主張番号】P 2022125749

(32)【優先日】2022-08-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】309007911

【氏名又は名称】サントリーホールディングス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100141265

【弁理士】

【氏名又は名称】小笠原 有紀

(72)【発明者】

【氏名】吉田 敦

(72)【発明者】

【氏名】村田 将一

(72)【発明者】

【氏名】横尾 芳明

(72)【発明者】

【氏名】榊原 裕

(72)【発明者】

【氏名】沼田 淳

【テーマコード（参考）】

4B021

4B117

【Ｆターム（参考）】

4B021LA33

4B021LW06

4B021MC01

4B021MC02

4B021MK05

4B021MK06

4B021MK17

4B021MK20

4B021MP01

4B117LC15

4B117LG02

4B117LG03

4B117LG05

4B117LG24

4B117LK06

4B117LL07

4B117LP01

(57)【要約】

明細書に記載の式１～６で表される６種類の天然物由来の化合物又はその塩のうちの１種以上を含有する飲料。これらの化合物は、安息香酸ナトリウムやソルビン酸カリウムといった既存の飲料用の保存料と同じかより低い濃度で飲料中で微生物の増殖を抑制する効果を示し得る。これらの化合物は、飲料の商品価値を低減しにくい傾向がある。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を含む、飲料：

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【請求項2】

式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を合計で０．１～２５０ｐｐｍの濃度で含む、請求項１に記載の飲料。

【請求項3】

微生物を添加して室温で２週間保管した際に、式１～６で表される化合物又はその塩を含有しない以外は同じ組成である飲料に比べて、微生物の増殖が抑制されている、請求項１又は２に記載の飲料。

【請求項4】

微生物が、酵母及び／又はカビである、請求項３に記載の飲料。

【請求項5】

微生物が、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、及びＮｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属のうちのいずれか一種以上である、請求項３に記載の飲料。

【請求項6】

式１～６で表される化合物又はその塩を含有しない以外は同じ組成である飲料に比べて、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物の増殖が抑制されている、請求項１又は２に記載の飲料。

【請求項7】

式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を添加することを含む、請求項１又は２に記載の飲料の製造方法。

【請求項8】

式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を合計で０．１～２５０ｐｐｍの濃度で添加することを含む、請求項７に記載の飲料の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［０００１］本発明は、特定の化合物を１種以上含有する飲料に関する。より詳細には、天然物由来の特定の化合物の１種以上を含有することにより、微生物の増殖が抑制された飲料に関する。さらに詳細には外観安定性などの飲料製品の商品価値を有する微生物の増殖が抑制された飲料に関する。

【背景技術】

【0002】

［０００２］保存料は、飲食品の腐敗や変敗の原因となる微生物の増殖を抑制し、保存性を高める添加物である。飲料用の保存料としては、安息香酸ナトリウムやソルビン酸カリウムといった合成保存料または合成抗菌剤が通常使われている。しかし、合成保存料は、腸内細菌叢への影響が近年示されており、健康への影響が懸念されている。また、安息香酸ナトリウムは、ビタミンＣと反応することにより、発がん性のベンゼンを生成するリスクがあると言われている。健康への影響の他にも、安息香酸ナトリウムには独特の収斂味があり（特許文献１）、飲料の風味に影響する可能性がある。また、ソルビン酸カリウムは特定の微生物の増殖抑制効果が低い上に、独特の臭いがあるという問題がある。

【0003】

［０００３］このような合成保存料の使用を減らすために、天然物由来の保存料についての検討がされている（特許文献２、特許文献３）。キトサンなどの天然物由来の化合物は、抗菌性があることが知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０２０－１７１３０１号公報

【特許文献2】特開平５－７４８２号公報

【特許文献3】特開平２－２１１８５６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

［０００５］天然物由来の保存料についての検討事例は存在するが、飲料において微生物の増殖が実際に抑制されることを確認した例は少ない。また、外観安定性や味などの飲料の商品価値も損なわれないことを確認した例はさらに少ない。近年の消費者の嗜好の多様化に伴い、飲料製品の種類も多様化しており、多様な飲料製品の様々な性質や風味に対応できるように、飲料に使用するのに適した新たな天然物由来の保存料を探索することは望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0006】

［０００６］本発明者らは、飲料製品の保存料（微生物の増殖抑制剤）として使用するのに適した天然物由来の化合物について探索を行った結果、６種類の化合物を発見した。これらの化合物を実際に市販の飲料中に添加して微生物増殖性を確認する試験を行ったところ、これらの化合物に微生物の増殖抑制効果があることを見出した。また、これらの化合物は、飲料製品に必要とされる外観安定性（経時で外観の変化が生じにくい性質）を有し、飲料の本来の色及び／又は味に影響しにくいことを見出し、本発明に至った。より具体的には、６種類の化合物は、以下の「発明を実施するための形態」の欄で説明する式１～６で表される化合物である。

【0007】

［０００７］本発明は、式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を含む飲料に関する。また、本発明は、式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を合計で０．１～２５０ｐｐｍの濃度で含む飲料に関する。また、本発明は、微生物を飲料に添加して室温で２週間保管した際に、式１～６で表される化合物又はその塩を含有しない以外は同じ組成である飲料に比べて、微生物の増殖が抑制されている上記飲料に関する。微生物は、好ましくは酵母及び／又はカビであり、さらに好ましくは、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属のうちのいずれか一種以上である。また、本発明は、式１～６で表される化合物又はその塩を含有しない以外は同じ組成である飲料に比べて、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物の増殖が抑制されている上記飲料に関する。本発明は、式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を添加することを含む、飲料の製造方法に関する。また、本発明は、式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を合計で０．１～２５０ｐｐｍの濃度で添加することを含む、飲料の製造方法に関する。式１～６で表される化合物はいずれも天然物から得られた化合物であるが、これらの化合物を実際に飲料製品に添加し、微生物の増殖抑制効果と飲料の商品価値とを確認した例は、本発明者らが知る限り、これまでに報告されていない。

【発明の効果】

【0008】

［０００８］本発明の飲料は、式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を含有することにより、飲料中での微生物の増殖が抑制され、高い保存性を有する。式１～６で表される化合物はいずれも天然物を由来とする化合物である。式１～６で表される化合物のいずれか一種以上を含有する本発明の飲料は、安息香酸ナトリウムやソルビン酸カリウム等の合成保存料を使わなければいけなかった飲料において、これらの合成保存料を使用せずに、又はこれらの合成保存料の使用量を低減させて、微生物の増殖抑制効果を得ることができるという利点がある。合成保存料を使用する場合、合成保存料は通常、飲料に２００～４００ｐｐｍ程度添加されるが、式１～６で表される化合物又はその塩は、合成保存料と同程度か又はそれより低い濃度においても微生物の増殖抑制効果を有する。式１～６で表される化合物又はその塩のうちの一種を飲料に添加してもよいし、それらの２種以上を組み合わせて飲料に添加してもよい。飲料の種類や風味に応じて、使用する化合物を選択すればよい。

【0009】

［０００９］式１～６で表される化合物は、飲料に添加した際に、飲料の商品価値（例えば、外観安定性、色、味）を低減させないという利点を有する。キトサンは、例えば、天然物由来の抗菌性物質として知られているが、キトサンは飲料の種類によっては経時で濁りが生じやすい（すなわち、キトサンはやや低い外観安定性を有する）。式１～６の化合物は、抗菌効果が得られる濃度で用いた際、同濃度のキトサンを用いた場合と同程度またはそれよりも高い外観安定性を示す場合がある。また、式１～６の化合物は、抗菌効果が得られる濃度で用いた際に、飲料の本来の色に影響しにくく（着色性が少なく）、また、味にも影響しにくい傾向がある。

【発明を実施するための形態】

【0010】

［００１０］本発明は、式１～６で表される化合物又はその塩のいずれか一種以上を含む飲料に関する。以下、式１で表される化合物を「化合物１」、式２で表される化合物を「化合物２」というように略称する。化合物１～６は、いずれも天然物から得られた化合物である。

【0011】

［００１１］化合物１（ＣＡＳ Ｎｏ．８６７５７８－３５－６）、化合物２（ＣＡＳ Ｎｏ．１４２７０３９－３３－５）、及び化合物３（ＣＡＳ Ｎｏ．１４２７０２８－８６－１）は、それぞれ以下の式１～３を有する化合物であり、トウモロコシなどにつくカビの一種であるＵｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓの培養液から抽出された化合物である。

【0012】

【化1】

【0013】

【化2】

【0014】

【化3】

【0015】

［００１２］化合物４（Ｃ_５１Ｈ_８２Ｏ_２１）（ＣＡＳ Ｎｏ．６８１２４－０４－９）は、以下の式４を有する化合物であり、メキシコヤム芋（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｍｅｘｉｃａｎａ）の根から抽出された化合物である。

【0016】

【化4】

【0017】

［００１３］化合物５（Ｃ_４６Ｈ_７４Ｏ_１６）（ＣＡＳ Ｎｏ．３０９９４－７５－３）は、以下の式５を有する化合物であり、Ｓｅｃｕｒｉｎｅｇａ ｌｅｕｃｏｐｙｒｕｓの葉から抽出された化合物である。

【0018】

【化5】

【0019】

［００１４］化合物６（ＣＡＳ Ｎｏ．１６８７７８－１９－６）は、以下の式６を有する化合物であり、アガベ・アメリカーナ（Ａｇａｖｅ ａｍｅｒｉｃａｎａ）の根から抽出された化合物である。

【0020】

【化6】

【0021】

［００１５］化合物１～６は、上述した微生物の培養液または植物から、抽出及び精製することにより得ることができる。また、それぞれの化合物の市販品を用いて本発明の飲料に含有させてもよい。あるいは、任意の方法で合成により各化合物を得てもよい。

【0022】

「００１６］化合物１～６は、飲料中で任意の塩の形態であってもよい。
［００１７］（飲料）
本発明の飲料は、上記の化合物１～６又はその塩のうちのいずれか１種以上を含有する。飲料の種類や目的とする微生物増殖抑制の効果の程度に応じて、また、飲料の風味への影響を考慮して、化合物１～６又はその塩のうちの１種を用いてもよいし、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0023】

［００１８］飲料中での各化合物の使用量は、その飲料において微生物の増殖抑制効果が得られる量であればよく、特に限定されない。例えば、下限値としては、化合物１～６又はその塩の合計の濃度として、０．１ｐｐｍ以上が好ましく、０．５ｐｐｍ以上がさらに好ましく、１．０ｐｐｍ以上がさらに好ましく、１０ｐｐｍ以上がさらに好ましく、２０ｐｐｍ以上がさらに好ましく、３０ｐｐｍ以上がさらに好ましい。飲料の風味や外観への影響を最小限とするためには、飲料中での化合物１～６の使用量を所望の効果が得られる範囲内でできるだけ少なく設定することは好ましい。例えば、上限値としては、４００ｐｐｍ以下が好ましく、３００ｐｐｍ以下がさらに好ましく、２５０ｐｐｍ以下がさらに好ましく、１２５ｐｐｍ以下がさらに好ましく、１００ｐｐｍ以下がさらに好ましく、５０ｐｐｍ以下がさらに好ましい。

【0024】

［００１９］後述する通り、本発明の飲料は、ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｄｒｉｎｋ飲料であってもよいし、希釈して飲用するための濃縮飲料であってもよい。濃縮飲料である場合は、保管時の濃縮された状態での微生物増殖抑制効果を得るために、濃縮飲料において上記の含有量を満たす化合物１～６又はその塩を用いてもよい。あるいは、濃縮飲料を希釈した状態での保管時の微生物増殖抑制効果を得るために、濃縮飲料の所定の希釈度に応じて、希釈された状態で上記の含有量を満たすように、濃縮飲料において上記の含有量に飲料の所定の希釈度を乗じた量の化合物１～６又はその塩を含有させてもよい。

【0025】

［００２０］従来の安息香酸ナトリウムやソルビン酸カリウムといった合成保存料は、飲料中で通常２００～４００ｐｐｍ程度の濃度で用いられる。化合物１～６又はその塩は、飲料中で、従来の合成保存料の濃度と同程度か又はそれよりも低い濃度において微生物の増殖抑制効果を達成する場合がある。また、化合物１～６は、天然物由来の抗菌物質として知られているキトサンに比べて、同程度か又はそれよりも低い濃度において微生物の増殖抑制効果を示し、また、化合物１～６は、外観安定性などの飲料製品の商品価値を損ねにくい。

【0026】

［００２１］飲料中の各化合物の含有量の測定方法は、特に限定されない。例えば、各化合物の標品を準備し、ＨＰＬＣ等を用いて、飲料の種類に応じて条件を設定して含有量を測定することができる。

【0027】

［００２２］化合物１～６又はその塩の１種以上を含有させる飲料の種類は特に限定されない。例えば、炭酸飲料、果汁飲料、野菜汁飲料、コーヒー飲料、茶飲料、ココア飲料、ゼリー飲料、乳性飲料、プロバイオティクス飲料、豆乳、エナジードリンク、スポーツ飲料、アルコール飲料、希釈して飲用される濃縮飲料を例示することができる。中でも、ｐＨが２～５（好ましくはｐＨ２．５～４．５）である酸性飲料は、合成保存料が頻繁に用いられてきた飲料であるため、化合物１～６又はその塩の１種以上を含有させる飲料として好ましい。酸性飲料としては、例えば、炭酸飲料、果汁飲料、野菜汁飲料、プロバイオティクス飲料、エナジードリンク、スポーツ飲料が挙げられる。飲料は、ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｄｒｉｎｋ飲料であってもよいし、希釈して飲用するための濃縮飲料であってもよい。果汁の種類は特に限定されず、例えば、柑橘果実の果汁（レモン、グレープフルーツ、ライム、オレンジ、マンダリンオレンジ、温州ミカン、タンゴール、なつみかん、甘夏、はっさく、ひゅうがなつ、シークヮーサー、すだち、ゆず、かぼす、だいだい、いよかん、ぽんかん、きんかん、さんぼうかん、オロブランコ、ぶんたん）、カシス果汁、リンゴ果汁、ブドウ果汁、モモ果汁、熱帯果実の果汁（パイナップル、グァバ、バナナ、マンゴー、アセロラ、パパイヤ、パッションフルーツ、ライチ等）、ウメ果汁、ナシ果汁、アンズ果汁、スモモ果汁、ベリー果汁、キウイフルーツ果汁、サクランンボ果汁、クリ果汁、スイカ果汁、トマト果汁、ニンジン果汁、イチゴ果汁、メロン果汁が挙げられる。

【0028】

［００２３］本発明の飲料は好ましくは、従来、飲料に用いられてきた合成保存料の全部または一部の代わりに、化合物１～６又はその塩のいずれか一種以上を用いた飲料である。化合物１～６又はその塩は、好ましくは、飲料の通常の成分とは別に、飲料における微生物増殖抑制効果を高める目的で意図的に添加される。

【0029】

［００２４］通常、飲料は多様な組成を有するものであるから、培地で培養した微生物に対する増殖抑制効果が一般に知られている物質であっても、必ずしも、飲料内において同等の効果を発揮するとは限らない。例えば、飲料に溶解しにくい物質や、飲料中の他の成分と反応する物質などは、培地中の微生物に対して効果があったとしても、飲料中で微生物の増殖を抑制できるとは限らない。また、例えば果汁等に含まれるペクチンや多糖類などは、共存する化合物を包摂するなどして抗菌効果を減ずる可能性がある。これに対し、後述する本願の実施例では、既存の炭酸飲料及び果汁飲料を用いて、化合物１～６の各種微生物に対する増殖抑制効果を実際に確認した。

【0030】

［００２５］本発明の飲料は、微生物を添加して室温で２週間保管した後に、化合物１～６又はその塩を含有しない以外は同じ組成である飲料（比較の飲料）に比べて、微生物の増殖が抑制されている飲料である。ここで、微生物は、飲料の変敗と腐敗の原因となるような微生物であり、酵母やカビが例示される。変敗と腐敗の原因となる酵母やカビの典型的な例として、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、またはＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属の酵母や、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属のカビなどが挙げられる。本発明の飲料は、好ましくは、上記の比較の飲料に比べて、これらの微生物のうちの一種以上の増殖が抑制されたものである。また、飲料の変敗や腐敗の原因となる微生物としては、強酸性域において高い耐熱性を有する好熱性好酸性菌（例えばＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）が知られている。好ましくは、本発明の飲料は、上記の比較の飲料に比べて、好熱性好酸性菌の増殖が抑制されたものである。

【0031】

［００２６］比較の飲料に比べて「微生物の増殖が抑制されている」とは、上記のような飲料を変敗および腐敗させるような微生物の増殖が、上記の比較の飲料に対して少ないことを意味する。微生物を添加して室温で２週間保管した際に、比較の飲料に対して微生物の増殖が少ないことは、飲料中に化合物１～６又はその塩が存在することにより、添加された微生物の増殖が抑制されたことを示す。なお、「微生物を添加して室温で２週間保管」の手順は、本発明の飲料における微生物の増殖性を試験する目的で行われるもの（微生物増殖性確認試験）である。当然ながら、通常の製品として出荷する飲料に対してはこのような微生物の添加を行うものではない。微生物増殖性確認試験における微生物の添加量は、酵母である場合にはおよそ１００００ｃｆｕ／ｍｌであり、カビである場合にはおよそ１５～７０ｃｆｕ／ｍｌである。室温とは、１０～３０℃、好ましくは２５～２８℃程度である。微生物の種類によっては、室温以外の温度を試験に用いることが望ましい場合もある。微生物増殖性試験の具体的な方法の例としては、後述する実施例に記載の方法が挙げられる。

【0032】

［００２７］本発明の飲料は、好ましくは、微生物を添加して室温で２週間保管した際に、微生物の増殖が非常に少ないため、変敗または腐敗が見られない飲料である。本発明の飲料は、さらに好ましくは、上記のような条件下で微生物が増殖しない飲料である。

【0033】

［００２８］本発明の飲料はまた、好ましくは、飲料の商品価値が損なわれない程度の外観安定性を有する。外観安定性とは、飲料の外観が経時で変化しにくいことをいう。例えば、開栓した飲料を室温で２週間程度保存した際の飲料の外観の変化が少ないことをいう。本発明の飲料はまた、好ましくは、化合物１～６又はその塩を含有しながらも、飲料の本来の色や味（化合物１～６又はその塩を含有しない以外は同じ組成である飲料の色や味）からの変化が少ない。

【0034】

［００２９］（製造方法）
本発明は、化合物１～６又はその塩のいずれか一種以上を添加することを含む、飲料の製造方法も提供する。本発明の方法は、飲料の通常の製造工程中に、化合物１～６又はその塩のいずれか一種以上を添加する工程を含む。各化合物の添加タイミングは特に限定されず、飲料の製造工程のいずれの段階において添加してもよい。例えば、飲料の通常の材料の添加及び混合時に、化合物１～６又はその塩を添加及び混合してもよいし、通常の材料を混合した後に、化合物１～６又はその塩を添加及び混合してもよい。添加する化合物１～６又はその塩は、上述した天然物（植物または微生物の培養液）から抽出及び精製することにより得たものであることが好ましい。あるいは、それぞれの化合物の市販品を用いてもよい。また、それぞれの化合物は、任意の方法で合成により得たものであってもよい。添加する化合物１～６又はその塩は、粉末状などの固体の形状であってもよいし、あるいは溶媒に溶解または懸濁させた液体状であってもよい。また、各化合物の添加方法も特に限定されず、飲料の通常の製造における材料の添加及び混合方法を用いればよい。

【0035】

［００３０］化合物１～６又はその塩の添加量は、製造する飲料において微生物の増殖抑制効果が得られる量であればよく、特に限定されない。例えば、下限値としては、化合物１～６又はその塩の合計の濃度として、０．１ｐｐｍ以上が好ましく、０．５ｐｐｍ以上がさらに好ましく、１．０ｐｐｍ以上がさらに好ましく、１０ｐｐｍ以上がさらに好ましく、２０ｐｐｍ以上がさらに好ましく、３０ｐｐｍ以上がさらに好ましい。また、上述したように、上限値としては、４００ｐｐｍ以下が好ましく、３００ｐｐｍ以下がさらに好ましく、２５０ｐｐｍ以下がさらに好ましく、１２５ｐｐｍ以下がさらに好ましく、１００ｐｐｍ以下がさらに好ましく、５０ｐｐｍ以下がさらに好ましい。

【0036】

［００３１］飲料の種類は特に限定されない。飲料の例は上述した通りである。上述した通り、上記の含有量は、ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｄｒｉｎｋ飲料であるか又は濃縮飲料であるかに応じて、また、濃縮飲料である場合、濃縮状態での微生物増殖抑制効果を意図するか又は希釈した状態での微生物増殖抑制効果を意図するかに応じて、調整してもよい。

【実施例】

【0037】

［００３２］以下、実験例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本明細書において、特に記載しない限り、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。

【0038】

［００３３］（酵母増殖性試験１）
市販のレモン果汁１％入り炭酸飲料（糖類（果糖ぶどう糖液糖、砂糖）、レモン果汁、炭酸、香料、ビタミンＣ、酸味料、ベニバナ色素、パントテン酸カルシウム、ビタミンＢ６、カロチン色素含有）及び市販のオレンジ果汁１２％入り炭酸飲料（果実（オレンジ、レモン、マンダリンオレンジ、グレープフルーツ）、糖類（砂糖、果糖ぶどう糖液糖）、果実繊維、オレンジピールエキス、炭酸、香料、酸化防止剤（ビタミンＣ）含有）を用い、化合物１～６及び比較としてのキトサンの各飲料中での各種酵母に対する増殖抑制効果を確認した。具体的な手順は以下の通りである。

【0039】

［００３４］上記の各飲料を開栓し、炭酸飲料は炭酸ガスが抜けるまで放置した後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて飲料のｐＨを３．３に調整した。化合物１～６のそれぞれをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解し、得られた各化合物の溶液を、飲料中に各化合物の濃度が２６０．３ｐｐｍとなるように添加した。比較として、キトサン２０ｍｇ／ｍＬ及びアスコルビン酸２０ｍｇ／ｍＬを含む水溶液を飲料中のキトサンの濃度が２６０．３ｐｐｍとなるように飲料に添加したものを用意した。９６ウェルマイクロプレートを用意し、前記の化合物１～６のぞれぞれを添加した飲料と前記キトサンを添加した飲料とのそれぞれを、１ウェルにつき２４０μＬずつ分注した。

【0040】

［００３５］３種類の酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）のそれぞれ１００００ｃｆｕ／ｍＬの菌液を用意した。

【0041】

［００３６］化合物１～６又はキトサンを含有する飲料を添加した３つのウェルに対し、各酵母の菌液をそれぞれ１ウェルにつき１０μＬずつ添加した（すなわち、１化合物１酵母につき３ウェルの試験区を用意した）。また、ブランクとして、化合物１～６又はキトサンを含有する飲料を添加したウェルのうち３ウェルに生理食塩水を１０μＬずつ添加した。これにより各ウェルにおける化合物１～６及びキトサンの終濃度は２５０ｐｐｍとなる。また、化合物無添加区として、化合物１～６もキトサンも添加していない飲料２４０μＬに、各酵母の菌液をそれぞれ１０μＬずつ添加した区も用意した。

【0042】

［００３７］上記の通り準備したマイクロプレートを２８℃で２週間保管した。保管後、化合物無添加区において酵母が増殖していることを確認した上で、各化合物を添加した飲料において、ブランクと比較し、酵母の増殖を目視で確認した。具体的には、酵母による沈殿の有無を目視で確認し、沈殿が確認できたものは増殖性ありとした。各化合物及び各酵母について、３ウェルのうち酵母が増殖したウェルの数を表１に示す。

【0043】

【表1】

【0044】

［００３８］表１の結果より、化合物１～６は抗菌性が既知であるキトサンと同様に、酵母の増殖を抑制する効果を示すことがわかる。
［００３９］（酵母増殖性試験２）
化合物１～３を用い、各ウェルにおける各化合物の終濃度を表２に記載の濃度とした以外は酵母増殖性試験１と同様にして、酵母の増殖を目視で確認した。各化合物及び各酵母について、３ウェルのうち酵母が増殖したウェルの数を表２に示す。

【0045】

【表2】

【0046】

［００４０］表２の結果より、化合物１～３は、飲料の種類によっては、より低い濃度で酵母の増殖を抑制する効果を示すことがわかる。
［００４１］（カビ増殖性試験１）
市販のリンゴ果汁２０％入り飲料（りんご、糖類（果糖ぶどう糖液糖、砂糖）、酸味料、香料含有）及び市販のオレンジ果汁３０％入り飲料（果実（オレンジ、マンダリンオレンジ）、糖類（果糖ぶどう糖液糖、砂糖）、酸味料、香料、ビタミンＣ含有）を用いた。各飲料中での、化合物１～６ならびに比較としてのキトサン及びソルビン酸カリウムのカビに対する増殖抑制効果を確認した。具体的な手順は以下の通りである。

【0047】

［００４２］上記飲料を開栓し、水酸化ナトリウム水溶液を用いて飲料のｐＨを３．５となるように調整した。化合物１～６のそれぞれをＤＭＳＯ中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解し、得られた各化合物の溶液を、飲料中に各化合物の濃度が２５０ｐｐｍとなるように添加した。また、比較として、キトサン２０ｍｇ／ｍＬ及びアスコルビン酸２０ｍｇ／ｍＬを含む水溶液を飲料中にキトサンの濃度が２５０ｐｐｍとなるように添加したものを用意した。同様に、比較として、飲料中のソルビン酸カリウムの濃度が２５０ｐｐｍとなるように添加したものも用意した。前記の化合物１～６のそれぞれを添加した飲料及び前記キトサン又はソルビン酸カリウムを添加した飲料のそれぞれを、容量１５ｍＬの遠沈管に３ｍＬずつ分注した。

【0048】

［００４３］各遠沈管に、カビ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｓｐ．）の胞子懸濁液を、それぞれ５０～２００ｃｆｕ／本となるように添加した。
［００４４］上記とは別に、胞子懸濁液を添加しないブランクを用意した。また、化合物無添加区として、化合物１～６もキトサンもソルビン酸カリウムも添加していない飲料３ｍＬに対し、カビの胞子懸濁液をそれぞれ５０～２００ｃｆｕ／本となるように添加した区も用意した。

【0049】

［００４５］上記の通り準備した各遠沈管を２８℃で８週間保管した。保管後、化合物無添加区においてカビの菌糸の伸長がみられることを確認した上で、各化合物を添加した飲料において、ブランクと比較し、カビの増殖を目視で確認した。具体的には、カビの菌糸の伸長の有無を目視で確認し、菌糸の伸長が確認できたものは増殖性あり（＋）、菌糸が確認されないものを増殖性なし（－）とした。結果を表３に示す。

【0050】

【表3】

【0051】

［００４６］キトサンは、２８℃で２週間経過した時点でカビの増殖が確認された。また、ソルビン酸カリウムは４週間経過した時点でカビの増殖が確認された。これに対し、化合物１～６は２８℃で８週間経過した際にもカビの増殖が確認されなかった。この結果は、化合物１～６は抗菌性が既知であるキトサンや既存の合成抗菌剤であるソルビン酸カリウムに比べて、カビの増殖抑制効果が高いことを示す。

【0052】

［００４７］（カビ増殖性試験２）
各飲料に添加する濃度を表４に記載の濃度とした以外はカビ増殖性試験１と同様にして、２８℃で８週間経過した際のカビの増殖を目視で確認した。結果を表４に示す。

【0053】

【表4】

【0054】

［００４８］表４の結果は、飲料の種類によっては、化合物１～６は、より低い濃度で用いられた場合であっても、カビの増殖を抑制する効果を有することを示す。
［００４９］（好熱性好酸性菌増殖性試験）
市販のぶどう果汁入り飲料（果汁（ぶどう、レモン）、糖類（果糖、砂糖）、食塩、レモンエキス、シークワーサーエキス、うんしゅうみかんエキス、ゆずピール、ドライトマトエキス、香料、乳酸、塩化カリウム、酸化防止剤（ビタミンＣ）含有）を用い、化合物１～６及び比較としての安息香酸ナトリウムの飲料中での好熱性好酸性菌に対する増殖抑制効果を確認した。具体的な手順は以下の通りである。

【0055】

［００５０］上記飲料を開栓し、水酸化ナトリウム水溶液を用いて飲料のｐＨを３．３に調整した。化合物１～６のそれぞれをＤＭＳＯ中に溶解し、得られた各化合物の溶液を、飲料中に最終的に表５に記載の濃度となるように添加した。比較として、安息香酸ナトリウムを表５に記載の濃度となるように添加した飲料を用意した。前記の化合物１～６のそれぞれを添加した飲料及び前記安息香酸ナトリウムを添加した飲料を、試験管に３ｍＬずつ分注した。

【0056】

［００５１］好熱性好酸性菌（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）の４０００００ｃｆｕ／ｍＬの菌液を用意した。
［００５２］化合物１～６又は安息香酸ナトリウムを含有する飲料を添加した試験管に対し、菌液を１試験管につき１０μＬずつ添加した。また、化合物無添加区として、化合物１～６も安息香酸ナトリウムも添加していないものに菌液を添加した区も用意した。

【0057】

上記の通り準備した各試験管を４５℃で２週間保管した。保管後、各試験管から１００μＬずつ飲料を抜き取り、ＹＳＧＡ培地に塗抹した後、５５℃で３日間培養した。培養後、培地上のコロニーの数を計測した。コロニーの数をもとに菌数を計算した。植菌数と比べて菌数が１０倍以上に増加したものを増殖あり（＋）、植菌数からの菌数の増加が１０倍未満だったものを増殖なし（－）とした。結果を表５に示す。

【0058】

【表5】

【0059】

表５に示される通り、少なくとも化合物１～３及び５は、好熱性好酸性菌に対して増殖抑制効果を示すことがわかった。これらの化合物の好熱性好酸性菌に対する増殖抑制効果は、既存の合成抗菌剤である安息香酸ナトリウムよりも高いものである。

【0060】

［００５４］（外観安定性試験１）
酵母増殖性試験１で用いた２種類の市販の飲料及びカビ増殖性試験１で用いた２種類の市販の飲料を用い、化合物１～６及び比較としてのキトサンの外観安定性を評価した。具体的な手順は以下の通りである。

【0061】

［００５５］上記の各飲料を開栓した。レモン炭酸飲料とオレンジ炭酸飲料は炭酸ガスが抜けるまで放置した後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて飲料のｐＨを３．３に調整した。化合物１～６のそれぞれをＤＭＳＯ中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、得られた各化合物の溶液を、飲料中に各化合物の濃度が２５０ｐｐｍとなるように添加した。比較として、キトサン２０ｍｇ／ｍＬ及びアスコルビン酸２０ｍｇ／ｍＬを含む水溶液を飲料中のキトサンの濃度が２５０ｐｐｍとなるように添加した飲料を用意した。前記の化合物１～６を添加した飲料及び前記キトサンを添加した飲料のそれぞれを、９６ウェルマイクロプレートに２４０μＬずつ分注した。リンゴ果汁飲料とオレンジ果汁飲料は、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを３．５に調整した。炭酸飲料の場合と同様に、それぞれの飲料に飲料中の各化合物の濃度が２５０ｐｐｍとなるように化合物１～６のそれぞれを添加した。比較として、２５０ｐｐｍのキトサンを含有する飲料を用意した。前記の化合物１～６を添加した飲料及び前記キトサンを添加した飲料のそれぞれを、容量１５ｍＬの遠沈管に３ｍＬずつ分注した。

【0062】

［００５６］上記とは別に、化合物１～６もキトサンも添加していない飲料を化合物無添加区として用意した。
［００５７］上記の通り準備したマイクロプレートを２８℃で２週間、遠沈管を２８℃で８週間保管した。保管後、化合物１～６又はキトサンを添加した飲料の外観を、化合物無添加区の飲料の外観と比較して以下の基準で点数を付けた。
０点：化合物無添加区と比較して外観に差がない
１点：化合物無添加区と比較して外観に少し違いがある
２点：化合物無添加区と比較して外観に違いがある
３点：化合物無添加区と比較して外観に著しく違いがあり飲料製品としての商品価値がない
［００５８］上記基準において、０～２点は飲料製品に必要な品質を有する（飲料商品価値がある）ことを意味し、３点は飲料製品に必要な品質がない（飲料商品価値がない）ことを意味する。結果を表６に示す。

【0063】

【表6】

【0064】

［００５９］表６の結果は、化合物１～６は、飲料の種類によっては、２５０ｐｐｍの濃度で用いた場合でも、飲料の商品価値を損ねない外観安定性を保持することを示す。
［００６０］（外観安定性試験２）
化合物１～３と、レモン炭酸飲料及びオレンジ炭酸飲料を用い、各飲料における各化合物の終濃度を表７に記載の濃度とした以外は外観安定性試験１と同様にして、飲料の外観を評価した。結果を表７に示す。

【0065】

【表7】

【0066】

［００６１］表２に示されるように、化合物１～３は３１ｐｐｍの濃度でレモン炭酸飲料に対して酵母の増殖抑制効果を示す。表７の結果は、化合物１～３は、そのような濃度でレモン炭酸飲料に用いた場合、飲料の商品価値を損ねない外観安定性を保持することを示す。

【0067】

［００６２］また、表１及び表２に示されるように、化合物１～３は３１ｐｐｍの濃度で、また化合物２は２５０ｐｐｍの濃度でオレンジ炭酸飲料に対して酵母の増殖抑制効果を示す。表６及び表７の結果は、化合物１～３は、そのような濃度でオレンジ炭酸飲料に用いた場合、飲料の商品価値を損ねない外観安定性を保持することを示す。

【0068】

［００６３］（外観安定性試験３）
化合物１～３と、リンゴ飲料及びオレンジ飲料を用い、各飲料における各化合物の終濃度を表８に記載の濃度とした以外は外観安定性試験１と同様にして、飲料の外観を評価した。結果を表８に示す。

【0069】

【表8】

【0070】

表４に示されるように、化合物１～３はリンゴ飲料及びオレンジ飲料に対して３１ｐｐｍの濃度でカビの増殖抑制効果を示す。表８の結果は、化合物１～３は、そのような濃度でリンゴ飲料及びオレンジ飲料に用いた場合、飲料の商品価値を損ねない外観安定性を保持することを意味する。

【国際調査報告】