知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2025-532409リトスペルミン酸の糖尿病性潰瘍治療薬物の製造における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-09-29
(54)【発明の名称】リトスペルミン酸の糖尿病性潰瘍治療薬物の製造における使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/343 20060101AFI20250919BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20250919BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20250919BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250919BHJP
【ＦＩ】
A61K31/343
A61P3/10
A61P17/00
A61P43/00 105
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2025520103
(86)(22)【出願日】2023-06-05
(85)【翻訳文提出日】2025-04-08
(86)【国際出願番号】 CN2023098309
(87)【国際公開番号】W WO2024077977
(87)【国際公開日】2024-04-18
(31)【優先権主張番号】202211238574.3
(32)【優先日】2022-10-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520318856
【氏名又は名称】上海市皮膚病医院
(74)【代理人】
【識別番号】100102532
【弁理士】
【氏名又は名称】好宮 幹夫
(74)【代理人】
【識別番号】100194881
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 俊弘
(74)【代理人】
【識別番号】100215142
【弁理士】
【氏名又は名称】大塚 徹
(72)【発明者】
【氏名】李斌
(72)【発明者】
【氏名】羅成
(72)【発明者】
【氏名】▲カイ▼仂
(72)【発明者】
【氏名】張元元
(72)【発明者】
【氏名】張豪
(72)【発明者】
【氏名】李永勇
(72)【発明者】
【氏名】呉徳群
(72)【発明者】
【氏名】陳啓龍
(72)【発明者】
【氏名】王瑞平
(72)【発明者】
【氏名】張展
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA05
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA63
4C086NA14
4C086ZA89
4C086ZC01
4C086ZC35
(57)【要約】
本発明はリトスペルミン酸の糖尿病性潰瘍治療薬物の製造における使用を提供し、糖尿病性潰瘍薬物の技術分野に属する。本発明は、漢方薬の単体であるリトスペルミン酸が糖尿病性潰瘍の治療作用を有することを初めて提案し、マウス糖尿病性潰瘍モデル及び人の角質形成細胞株ＨａＣａＴを用いて、リトスペルミン酸がマウス及び体外細胞における糖尿病性潰瘍治癒指標及び炎症指標に対する作用効果を研究し、今後の臨床における糖尿病性潰瘍の効率的な治療方案の開発及び糖尿病性潰瘍治療薬物の製造に重要な根拠を提供する。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リトスペルミン酸の糖尿病性潰瘍治療薬物の製造における使用。
【請求項2】
前記リトスペルミン酸が糖尿病性潰瘍創面の治癒及び再上皮化を促進することによって作用を発揮することを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記リトスペルミン酸は人の角質形成細胞の増殖及び移動を促進することによって作用を発揮することを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項4】
前記リトスペルミン酸は糖尿病性潰瘍創面における炎症因子の発現を抑制することによって作用を発揮することを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項5】
前記炎症因子はＩｌ－６及びＩｌ－１βを含むことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項6】
糖尿病性潰瘍治療薬物であって、前記薬物はリトスペルミン酸を唯一の活性成分とすることを特徴とする薬物。
【請求項7】
前記薬物は外用製剤であることを特徴とする請求項６に記載の薬物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は糖尿病性潰瘍薬物の技術分野に属し、特にリトスペルミン酸の糖尿病性潰瘍治療薬物の製造における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
糖尿病性潰瘍は糖尿病の深刻な合併症の一つであり、多くの場合、患者の足に発生するため、糖尿病性足とも呼ばれる。糖尿病性足は糖尿病における一般的且つ治療が難しい慢性合併症の一つで、発生率は２５％と高く、そのうち１５％以上の患者はいかなる時でも切断や死亡のリスクに直面している。糖尿病性潰瘍の治療には多学科的な協力が必要であり、血糖、血中脂質、血圧を調整した上で、抗感染、適時の血行再建、潰瘍部位の創傷を減少させるための減圧、創面の処置による治癒促進といった原則に従って治療を行う必要がある。しかしながら、創傷清掃、ドレッシング、減圧、抗感染及び血糖調整といった標準的な治療手段を講じた場合でも、２０週間の治療後に糖尿病性潰瘍の治癒率はわずか３１％にとどまる。したがって、効率的且つ簡便な糖尿病性潰瘍の治療方法の確立は、臨床現場において待望される重要な課題となっている。
【0003】
ダンシェンはシソ科植物ダンシェンの乾燥根及び根茎であり、活血化お、涼血消腫、清心除煩などの効能を有する。リトスペルミン酸はダンシェンの主要な有効成分であり、近年の研究により、痛風ラットモデルにおいて抗炎症作用及び尿酸形成抑制作用が示されている。リトスペルミン酸はセンキュウ、当帰、サフランなどの漢方薬材にも広く存在し、抽出が容易で価格も比較的安価である。現時点で、本技術分野においてリトスペルミン酸と糖尿病性潰瘍治療との関連性に関する報告はなく、また、糖尿病性潰瘍治療の新薬開発には重要な意義が認められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
以上の背景を踏まえ、本発明は、リトスペルミン酸の糖尿病性潰瘍治療薬物の製造における使用を提供することを目的とし、リトスペルミン酸は糖尿病性潰瘍の治療において顕著な効果を有する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記発明目的を達成するため、本発明は以下の技術方案を提供する。
本発明は、リトスペルミン酸の糖尿病性潰瘍治療薬物の製造における使用を提供する。
本発明は、リトスペルミン酸の糖尿病性潰瘍治療薬物の製造における使用を提供する。
【0006】
好ましくは、前記リトスペルミン酸は糖尿病性潰瘍創面の治癒及び再上皮化を促進することによって作用を発揮する。
【0007】
好ましくは、前記リトスペルミン酸は人の角質形成細胞の増殖及び移動を促進することによって作用を発揮する。
【0008】
好ましくは、前記リトスペルミン酸は糖尿病性潰瘍創面における炎症因子の発現を抑制することによって作用を発揮する。
【0009】
好ましくは、前記炎症因子はＩｌ－６及びＩｌ－１βを含む。
【0010】
本発明はさらに糖尿病性潰瘍治療薬物を提供し、前記薬物はリトスペルミン酸を唯一の活性成分とする。
【0011】
好ましくは、前記薬物は外用製剤である。
【発明の効果】
【0012】
本発明は、漢方薬の単体であるリトスペルミン酸が糖尿病性潰瘍の治療作用を有することを初めて提案し、顕著な治療効果を得た。これにより、今後の臨床における糖尿病性潰瘍の効率的な治療方案の開発に根拠を提供する。
【0013】
本発明は、マウス糖尿病性潰瘍モデル及び人の角質形成細胞株ＨａＣａＴを用いて、リトスペルミン酸がマウス及び体外細胞における糖尿病性潰瘍治癒指標及び炎症指標に対する作用効果を研究し、糖尿病性潰瘍治療薬物の製造に重要な実験的根拠を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図3】リトスペルミン酸がＨａＣａＴ細胞中の炎症因子Ｉｌ－６、Ｉｌ－１β ｍＲＮＡの発現に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明は、リトスペルミン酸の糖尿病性潰瘍治療薬物の製造における使用を提供する。
【0016】
本発明において、前記リトスペルミン酸の化学構造式は以下の通りである。
【0017】
【化1】
【0018】
分子式はＣ２７Ｈ２２Ｏ１２である。
【0019】
本発明におけるリトスペルミン酸の具体的な入手元については特に限定せず、自ら抽出・調製して取得することも、市販品を購入して取得することもできる。本発明において、前記リトスペルミン酸は好ましくは糖尿病性潰瘍創面の治癒及び再上皮化を促進することによって作用し、さらに、好ましくは、人の角質形成細胞の増殖及び移動を促進することによって作用を発揮する。本発明において、前記リトスペルミン酸は糖尿病性潰瘍創面における炎症因子の発現を抑制することにより作用し、前記炎症因子として好ましくは、Ｉｌ－６及びＩｌ－１βを含む。
【0020】
本発明はさらに、糖尿病性潰瘍治療薬物を提供し、前記薬物はリトスペルミン酸を唯一の活性成分とする。
【0021】
本発明において、前記薬物は好ましくは外用製剤であり、前記薬物は好ましくは外用製剤に通常用いられる補助材料をさらに含む。本発明は外用製剤に通常用いられる補助材料の種類及び具体的な入手元については特に限定せず、当該技術分野における外用製剤の一般的な補助材料を用いればよい。
【0022】
以下、実施例を参照して本発明によって提供される技術方案を詳細に説明するが、これらは本発明の保護範囲の限定と解するものではない。
【0023】
以下の実施例では、特に断りのない限り、いずれも通常的な方法である。
【0024】
以下の実施例に使用する材料や試薬は、特に断りのない限り、全て市販のソースから入手できる。
【実施例1】
【0025】
リトスペルミン酸が糖尿病性潰瘍マウスの創傷治癒状況に及ぼす影響
１．動物：Ｃ５７／ＢＬ雄マウス（６～７週齢）、体重２２～２４ｇ。
動物モデル：糖尿病群のマウスには高脂肪食を与え、４週間継続する。正常対照群（４匹のマウス）を除き、全てのマウスに対して隔日でストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を注射し、注射した４時間後に５％のブドウ糖溶液を摂取させた。７日後に血糖値を測定し、血糖濃度が３００．６ｍｇ／ｄｌ－１を超え、糖尿病マウスの多尿、多食、多飲の症状がモニタリングされる場合、糖尿病モデルの構築が成功したと判断する。体重軽減が２０％超えるマウスや、運動能力が低下したマウスは除外する。構築された１２匹の糖尿病マウスを糖尿病群、糖尿病リトスペルミン酸治療群、糖尿病陽性治療群にランダムに分ける。潰瘍モデル作製前にマウスをイソフルランで麻酔し、背部から４ｃｍ×４ｃｍの毛を除去し、パンチを用いて直径６ｍｍ、深さ２ｍｍの円形創傷を４箇所作製し、無菌条件下で実験を行う。
１．動物：Ｃ５７／ＢＬ雄マウス（６～７週齢）、体重２２～２４ｇ。
動物モデル：糖尿病群のマウスには高脂肪食を与え、４週間継続する。正常対照群（４匹のマウス）を除き、全てのマウスに対して隔日でストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を注射し、注射した４時間後に５％のブドウ糖溶液を摂取させた。７日後に血糖値を測定し、血糖濃度が３００．６ｍｇ／ｄｌ－１を超え、糖尿病マウスの多尿、多食、多飲の症状がモニタリングされる場合、糖尿病モデルの構築が成功したと判断する。体重軽減が２０％超えるマウスや、運動能力が低下したマウスは除外する。構築された１２匹の糖尿病マウスを糖尿病群、糖尿病リトスペルミン酸治療群、糖尿病陽性治療群にランダムに分ける。潰瘍モデル作製前にマウスをイソフルランで麻酔し、背部から４ｃｍ×４ｃｍの毛を除去し、パンチを用いて直径６ｍｍ、深さ２ｍｍの円形創傷を４箇所作製し、無菌条件下で実験を行う。
【0026】
２．グループ化及び治療
（１）正常群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）：潰瘍モデルを作製するが、いずれの薬物治療は行わない。（２）糖尿病群（ＳＴＺ）：潰瘍モデルを作製するが、いずれの薬物治療は行わない。（３）糖尿病リトスペルミン酸治療群（ＳＴＺ＋ＬＡ）：リトスペルミン酸モノマーをエタノール溶液に溶解し、濃度を５０μｇ／ｍｌとし、５０μｌ／匹／日の用量でマウスの潰瘍部位に湿布し、９日間連続して施用する。（４）糖尿病陽性治療群（ＳＴＺ＋ｒｂ－ｂＦＧＦ）：濃度２００ｎｇ／ｍｌのベフジー（ｒｂ－ｂＦＧＦ）を５０μｌ／匹／日の用量でマウスの潰瘍部位に局所外用し、９日間連続して施用する。
（１）正常群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）：潰瘍モデルを作製するが、いずれの薬物治療は行わない。（２）糖尿病群（ＳＴＺ）：潰瘍モデルを作製するが、いずれの薬物治療は行わない。（３）糖尿病リトスペルミン酸治療群（ＳＴＺ＋ＬＡ）：リトスペルミン酸モノマーをエタノール溶液に溶解し、濃度を５０μｇ／ｍｌとし、５０μｌ／匹／日の用量でマウスの潰瘍部位に湿布し、９日間連続して施用する。（４）糖尿病陽性治療群（ＳＴＺ＋ｒｂ－ｂＦＧＦ）：濃度２００ｎｇ／ｍｌのベフジー（ｒｂ－ｂＦＧＦ）を５０μｌ／匹／日の用量でマウスの潰瘍部位に局所外用し、９日間連続して施用する。
【0027】
３．実験方法
（１）創傷治癒分析
全体観察：投与治療後の１、３、５、７、９日目に撮影を行い、Ｉｍａｇｅ－Ｊソフトウェアを用いて撮影画像を処理し、創面の潰瘍面積を計算し、以下の公式を用いて創傷閉鎖状況を算出した。
（１）創傷治癒分析
全体観察：投与治療後の１、３、５、７、９日目に撮影を行い、Ｉｍａｇｅ－Ｊソフトウェアを用いて撮影画像を処理し、創面の潰瘍面積を計算し、以下の公式を用いて創傷閉鎖状況を算出した。
【0028】
創傷治癒率（％）＝（１－治療創傷幅／対照創傷幅）×１００、ここで、対照創傷幅はＤａｙ０に作製した創傷幅である。
【0029】
（２）組織学的ヘマトキシリン－エオシン染色（ＨＥ染色）
誘導後の５日及び９日目にマウスを殺し、皮膚標本を４％中性ホルマリン緩衝液に２４時間固定する。その後、通常の組織学的検査、パラフィン包埋、切片作製、ＨＥ染色を行う。デジタル切片スキャナーにて観察した。
誘導後の５日及び９日目にマウスを殺し、皮膚標本を４％中性ホルマリン緩衝液に２４時間固定する。その後、通常の組織学的検査、パラフィン包埋、切片作製、ＨＥ染色を行う。デジタル切片スキャナーにて観察した。
【0030】
４．実験結果
リトスペルミン酸は、糖尿病性潰瘍マウスの創傷治癒を改善できる。
創傷治癒分析及びＨＥ染色により、リトスペルミン酸が体内で糖尿病性潰瘍創傷の治癒に及ぼす影響を観察し、結果は図１に示す通りであり、図１Ａから、糖尿病陽性治療群と比較して、糖尿病リトスペルミン酸治療群は創傷後５、７、９日目においてより顕著な創傷治癒効果があることがわかる。ＨＥ染色結果（図１Ｂ）において、糖尿病リトスペルミン酸治療群の創傷が５及び９日目に著しく縮小しており、その効果は糖尿病陽性治療群よりも優れていることが示された。当該結果は、ＳＴＺにより誘導された糖尿病マウスにおいて創面治癒が遅延するが、リトスペルミン酸の介入により糖尿病性創傷の治癒及び再上皮化が効果的に促進され、陽性対照であるベフジーよりも顕著な治療効果が得られることが示された。
リトスペルミン酸は、糖尿病性潰瘍マウスの創傷治癒を改善できる。
創傷治癒分析及びＨＥ染色により、リトスペルミン酸が体内で糖尿病性潰瘍創傷の治癒に及ぼす影響を観察し、結果は図１に示す通りであり、図１Ａから、糖尿病陽性治療群と比較して、糖尿病リトスペルミン酸治療群は創傷後５、７、９日目においてより顕著な創傷治癒効果があることがわかる。ＨＥ染色結果（図１Ｂ）において、糖尿病リトスペルミン酸治療群の創傷が５及び９日目に著しく縮小しており、その効果は糖尿病陽性治療群よりも優れていることが示された。当該結果は、ＳＴＺにより誘導された糖尿病マウスにおいて創面治癒が遅延するが、リトスペルミン酸の介入により糖尿病性創傷の治癒及び再上皮化が効果的に促進され、陽性対照であるベフジーよりも顕著な治療効果が得られることが示された。
【実施例2】
【0031】
体外でのリトスペルミン酸を使用することがＨａＣａＴ細胞の増殖、移動に対する影響
１．細胞モデル：人の角質形成細胞株ＨａＣａＴ。細胞は、１０％の胎牛血清と１％のストレプトマイシン‐ペニシリン溶液を含むＤＭＥＭ‐高糖培地において、３７℃にて恒温培養した。
１．細胞モデル：人の角質形成細胞株ＨａＣａＴ。細胞は、１０％の胎牛血清と１％のストレプトマイシン‐ペニシリン溶液を含むＤＭＥＭ‐高糖培地において、３７℃にて恒温培養した。
【0032】
２．グループ化：
（１）正常群（ＮＣ）、（２）リトスペルミン酸治療群（ＬＡ）：濃度５μｇ／ｍｌのリトスペルミン酸（ＬＡ）を用いてＨａＣａＴ細胞に介入する。（３）陽性対照群（ｂＦＧＦ）：濃度２０ｎｇ／ｍｌの陽性対照薬物である塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いてＨａＣａＴ細胞に介入する。
（１）正常群（ＮＣ）、（２）リトスペルミン酸治療群（ＬＡ）：濃度５μｇ／ｍｌのリトスペルミン酸（ＬＡ）を用いてＨａＣａＴ細胞に介入する。（３）陽性対照群（ｂＦＧＦ）：濃度２０ｎｇ／ｍｌの陽性対照薬物である塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いてＨａＣａＴ細胞に介入する。
【0033】
３．実験方法：
（１）細胞計数キット‐８（ＣＣＫ‐８）検出
ＣＣＫ‐８はメーカーの説明書に従い、ＨａＣａＴ細胞の増殖評価に使用した。簡単に説明すると、細胞を２０００個／１００μＬの密度で９６ウェルプレートに播種し、３回に分けて播種後、指定時点でＣＣＫ‐８溶液を添加し４５０ｎｍにて吸光度を検出した。吸光度値は正規化し、対照細胞の吸光度値と一致させた。３つの独立した実験からのデータは、平均標準偏差とする。
（１）細胞計数キット‐８（ＣＣＫ‐８）検出
ＣＣＫ‐８はメーカーの説明書に従い、ＨａＣａＴ細胞の増殖評価に使用した。簡単に説明すると、細胞を２０００個／１００μＬの密度で９６ウェルプレートに播種し、３回に分けて播種後、指定時点でＣＣＫ‐８溶液を添加し４５０ｎｍにて吸光度を検出した。吸光度値は正規化し、対照細胞の吸光度値と一致させた。３つの独立した実験からのデータは、平均標準偏差とする。
【0034】
（２）スクラッチ実験
解離して回収した対数増殖期にある細胞を、希釈後、細胞密度を５×１０５個／ウェルとして６ウェルプレートに播種し、各群について３ウェルを用意し、細胞が顕微鏡下において単層で付着増殖していることを観察した後、事前に滅菌した２００μＬのピペットチップと定規を用い、６ウェルプレート上方にて垂直にスクラッチを入れ、その後ＰＢＳで何度も洗浄し、浮遊している細胞を可能な限り除去した。その後、リトスペルミン酸または塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をそれぞれ添加して処理し、５％ＣＯ２（３７℃、相対湿度９５％）の培養箱にて培養し、それぞれ０ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ後に顕微鏡下で撮影した。Ｉｍａｇｅ‐Ｊソフトウェアを用いて細胞移動面積を計算し、各群のスクラッチ面積修復率を分析した。公式は以下の通りである。
解離して回収した対数増殖期にある細胞を、希釈後、細胞密度を５×１０５個／ウェルとして６ウェルプレートに播種し、各群について３ウェルを用意し、細胞が顕微鏡下において単層で付着増殖していることを観察した後、事前に滅菌した２００μＬのピペットチップと定規を用い、６ウェルプレート上方にて垂直にスクラッチを入れ、その後ＰＢＳで何度も洗浄し、浮遊している細胞を可能な限り除去した。その後、リトスペルミン酸または塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をそれぞれ添加して処理し、５％ＣＯ２（３７℃、相対湿度９５％）の培養箱にて培養し、それぞれ０ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ後に顕微鏡下で撮影した。Ｉｍａｇｅ‐Ｊソフトウェアを用いて細胞移動面積を計算し、各群のスクラッチ面積修復率を分析した。公式は以下の通りである。
【0035】
スクラッチ面積修復率＝（０ｈスクラッチ面積－スクラッチ面積）／０ｈスクラッチ面積×１００％
【0036】
４．実験結果：
リトスペルミン酸はＨａＣａＴ細胞の増殖、移動を促進する
ＣＣＫ‐８の結果には、リトスペルミン酸群において細胞の増殖能力が４８ｈ、７２ｈで正常群及び陽性対照群よりも著しく高いことが示された（図２Ａ）。スクラッチ実験では、リトスペルミン酸治療後１２ｈ、２４ｈでＨａＣａＴ細胞の移動能力が著しく増強された（図２Ｂ）。以上の結果より、リトスペルミン酸はＨａＣａＴ細胞の増殖及び移動能力を効果的に促進し、その効果はｂＦＧＦよりも優れていることが示された。
リトスペルミン酸はＨａＣａＴ細胞の増殖、移動を促進する
ＣＣＫ‐８の結果には、リトスペルミン酸群において細胞の増殖能力が４８ｈ、７２ｈで正常群及び陽性対照群よりも著しく高いことが示された（図２Ａ）。スクラッチ実験では、リトスペルミン酸治療後１２ｈ、２４ｈでＨａＣａＴ細胞の移動能力が著しく増強された（図２Ｂ）。以上の結果より、リトスペルミン酸はＨａＣａＴ細胞の増殖及び移動能力を効果的に促進し、その効果はｂＦＧＦよりも優れていることが示された。
【実施例3】
【0037】
体外でのリトスペルミン酸の使用がＨａＣａＴ細胞中の炎症因子Ｉｌ‐６、Ｉｌ‐１βｍＲＮＡ発現に対する影響
１．細胞モデル：人の角質形成細胞株ＨａＣａＴ。
１．細胞モデル：人の角質形成細胞株ＨａＣａＴ。
【0038】
２．グループ化：
（１）正常群（ＮＣ）、（２）疾病群（ＭＧＯ）：メチルグリオキサール（ＭＧＯ）を用いてＨａＣａＴ細胞に介入し、糖尿病性潰瘍体外炎症モデルを誘導する。（３）リトスペルミン酸治療群（ＭＧＯ＋ＬＡ）：疾病群の上で、５μｇ／ｍｌのＬＡを用いて治療する。（４）陽性対照群（ＭＧＯ＋ｂＦＧＦ）：疾病群の上で、２０ｎｇ／ｍｌの陽性対照薬物ｂＦＧＦを用いて治療する。
（１）正常群（ＮＣ）、（２）疾病群（ＭＧＯ）：メチルグリオキサール（ＭＧＯ）を用いてＨａＣａＴ細胞に介入し、糖尿病性潰瘍体外炎症モデルを誘導する。（３）リトスペルミン酸治療群（ＭＧＯ＋ＬＡ）：疾病群の上で、５μｇ／ｍｌのＬＡを用いて治療する。（４）陽性対照群（ＭＧＯ＋ｂＦＧＦ）：疾病群の上で、２０ｎｇ／ｍｌの陽性対照薬物ｂＦＧＦを用いて治療する。
【0039】
３．実験方法：
実時定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
標準的なＴＲＩｚｏｌ方案を用いてＨａＣａＴ細胞から総ＲＮＡを抽出した。次いで、逆転写試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ） ＲＲ０３６Ａ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ８２０Ａ）を選択してＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応を行い、反応終了後にデータを収集、２－ΔΔＣＴ法を用いて、関係する定量データを分析し、差異倍数及び空白対照に対してＲＮＡ発現レベルで表した。
プライマーの詳細な情報は以下の表１に示した。
実時定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
標準的なＴＲＩｚｏｌ方案を用いてＨａＣａＴ細胞から総ＲＮＡを抽出した。次いで、逆転写試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ） ＲＲ０３６Ａ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ８２０Ａ）を選択してＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応を行い、反応終了後にデータを収集、２－ΔΔＣＴ法を用いて、関係する定量データを分析し、差異倍数及び空白対照に対してＲＮＡ発現レベルで表した。
プライマーの詳細な情報は以下の表１に示した。
【0040】
【表1】
【0041】
４．実験結果：
リトスペルミン酸はＨａＣａＴ細胞中の炎症因子Ｉｌ‐６、Ｉｌ‐１β ｍＲＮＡ発現を抑制する
本実施例では、ＭＧＯを用いてＨａＣａＴ細胞に介入し、糖尿病性潰瘍体外炎症モデルを誘導した。結果は、炎症因子Ｉｌ‐６、Ｉｌ‐１β ｍＲＮＡの発現が上昇したが、リトスペルミン酸はＭＧＯにより誘導された炎症浸潤を著しく低下させ、その効果はｂＦＧＦよりも顕著であることが示された（図３）。
リトスペルミン酸はＨａＣａＴ細胞中の炎症因子Ｉｌ‐６、Ｉｌ‐１β ｍＲＮＡ発現を抑制する
本実施例では、ＭＧＯを用いてＨａＣａＴ細胞に介入し、糖尿病性潰瘍体外炎症モデルを誘導した。結果は、炎症因子Ｉｌ‐６、Ｉｌ‐１β ｍＲＮＡの発現が上昇したが、リトスペルミン酸はＭＧＯにより誘導された炎症浸潤を著しく低下させ、その効果はｂＦＧＦよりも顕著であることが示された（図３）。
【0042】
上記は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、当業者であれば、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改良や変更を行うことができ、これらの改良や変更も本発明の保護範囲とみなされるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】