特表 2025-532609 遺伝子改変非ヒト動物及び重鎖抗体の産生方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-10-01

(54)【発明の名称】遺伝子改変非ヒト動物及び重鎖抗体の産生方法

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/0275 20240101AFI20250924BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250924BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20250924BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20250924BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250924BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20250924BHJP

【ＦＩ】

A01K67/0275 ZNA

C12N5/10

C12P21/08

C12N5/0735

C12N15/13

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2025515863

(86)(22)【出願日】2023-09-15

(85)【翻訳文提出日】2025-04-02

(86)【国際出願番号】 CN2023118958

(87)【国際公開番号】W WO2024056044

(87)【国際公開日】2024-03-21

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2022/119188

(32)【優先日】2022-09-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2022/136246

(32)【優先日】2022-12-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521213200

【氏名又は名称】バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フー イーチン

(72)【発明者】

【氏名】チャン チー

(72)【発明者】

【氏名】チャン リーチュン

(72)【発明者】

【氏名】チャン ヤーポー

(72)【発明者】

【氏名】チャオ ホイチェン

(72)【発明者】

【氏名】ヤオ チアウェイ

(72)【発明者】

【氏名】シェン ユエレイ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC22

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AB05

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、遺伝子改変動物及び重鎖抗体を産生するための方法に関する。一態様では、遺伝子改変非ヒト動物は改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座はＩｇＧ定常領域遺伝子を含み、上記ＩｇＧ定常領域遺伝子はＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ重鎖定常領域をコードし、上記遺伝子改変非ヒト動物は重鎖抗体を発現する。本明細書では、抗ＴＦＲ１抗体、抗原結合断片、及びそれらの使用も開示される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、前記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座がＩｇＧ定常領域遺伝子を含み、前記ＩｇＧ定常領域遺伝子がＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ重鎖定常領域をコードし、前記遺伝子改変非ヒト動物が重鎖抗体を発現する、遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項2】

前記動物が正確に１つのＩｇＧ定常領域遺伝子を含む、請求項１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項3】

前記ＩｇＧ重鎖定常領域遺伝子がＩＧＨＧ１である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項4】

前記ＩｇＧ重鎖定常領域が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、並びに任意選択でヒンジ領域を含むか、又はそれらからなる、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項5】

ゲノムが、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＧ２ｂ、及びＩＧＨＧ２ｃ遺伝子の欠失と、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＧ１遺伝子のＣＨ１エクソンの欠失とを含む生殖細胞系遺伝子改変を含む、遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項6】

前記生殖細胞系遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性ＩＧＨＥ遺伝子の欠失をさらに含む、請求項５に記載の動物。

【請求項7】

前記遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｓγ２ｂ、Ｓγ２ｃ、及びＳεスイッチ領域の欠失をさらに含む、請求項５又は６に記載の動物。

【請求項8】

前記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子を含み、前記改変ＩＧＨＧ１遺伝子が、配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の動物。

【請求項9】

前記遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｓγ３スイッチ領域の欠失をさらに含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の動物。

【請求項10】

前記動物のゲノムが、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変げっ歯類ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、ＩＧＨＡ遺伝子を含む、請求項５～９のいずれか１項に記載の動物。

【請求項11】

前記遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性ＩＧＨＭ遺伝子及びＩＧＨδ遺伝子の欠失をさらに含む、請求項５～９のいずれか１項に記載の動物。

【請求項12】

前記動物ゲノムが、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く前記改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＡ遺伝子を含む、請求項５～９及び１１のいずれか１項に記載の動物。

【請求項13】

前記Ｓμ及びＳγ１スイッチ領域が、配列番号８と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結されている、請求項１２に記載の動物。

【請求項14】

前記遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１コード配列の欠失をさらに含む、請求項５～９のいずれか１項に記載の動物。

【請求項15】

前記動物のゲノムが、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変内因性ＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く前記改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨδ、ＩＧＨＡ遺伝子を含む、請求項５～９及び１４のいずれか１項に記載の動物。

【請求項16】

前記Ｓμスイッチ領域及び前記改変ＩＧＨＭ遺伝子が、配列番号１０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結される、請求項１５に記載の動物。

【請求項17】

前記遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＭ遺伝子の前記ＣＨ１エクソンの欠失及びＩＧＨδ遺伝子の欠失をさらに含む、請求項５～９のいずれか１項に記載の動物。

【請求項18】

前記動物のゲノムが、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く前記改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＡ遺伝子を含む、請求項５～９及び１７のいずれか１項に記載の動物。

【請求項19】

前記遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＭ遺伝子の前記ＣＨ１エクソンの欠失及びＩＧＨδ遺伝子のＣＨ１コード配列の欠失をさらに含む、請求項５～９のいずれか１項に記載の動物。

【請求項20】

前記動物のゲノムが、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨδ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く前記改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＡ遺伝子を含む、請求項５～９及び１９のいずれか１項に記載の動物。

【請求項21】

前記改変ＩＧＨＭ遺伝子が、配列番号１０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結され、前記改変ＩＧＨδ遺伝子が、配列番号４１と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む、請求項１９又は２０に記載の動物。

【請求項22】

前記改変ＩＧＨＭ遺伝子が、配列番号１３と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の動物。

【請求項23】

前記遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｓγ１スイッチ領域の欠失をさらに含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の動物。

【請求項24】

前記動物のゲノムが、内因性Ｓμ、Ｓγ３、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く前記改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、ＩＧＨＡ遺伝子を含む、請求項５～８及び２３のいずれか１項に記載の動物。

【請求項25】

前記遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｓγ３スイッチ領域の欠失をさらに含む、請求項５～８及び２３のいずれか１項に記載の動物。

【請求項26】

前記遺伝子改変が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性ＩＧＨＭ及びＩＧＨδ遺伝子の欠失をさらに含む、請求項５～８、２３及び２５のいずれか１項に記載の動物。

【請求項27】

前記動物のゲノムが、内因性Ｓμ、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く前記改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＡ遺伝子を含む、請求項５～８、２３、２５又は２６のいずれか１項に記載の動物。

【請求項28】

前記Ｓμスイッチ領域及び前記改変ＩＧＨＧ１遺伝子が、配列番号９と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結される、請求項２７に記載の動物。

【請求項29】

前記改変ゲノムが機能的ＩＧＨＭ遺伝子を含む、請求項５～１０、２３及び２４のいずれか１項に記載の動物。

【請求項30】

ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含み、前記要素が作動可能に連結されている、遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項31】

前記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座が、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる、請求項３０に記載の動物。

【請求項32】

ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ３スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含み、前記要素が作動可能に連結されている、遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項33】

前記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座が、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ３スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる、請求項３２に記載の動物。

【請求項34】

ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含み、前記要素が作動可能に連結されている、遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項35】

前記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座が、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる、請求項３４に記載の動物。

【請求項36】

ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含み、前記要素が作動可能に連結されている、遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項37】

前記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座が、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる、請求項３６に記載の動物。

【請求項38】

ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含み、前記要素が作動可能に連結されている、遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項39】

前記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座が、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる、請求項３８に記載の動物。

【請求項40】

ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含み、前記要素が作動可能に連結されている、遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項41】

前記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座が、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる、請求項４０に記載の動物。

【請求項42】

ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含み、前記要素が作動可能に連結されている、遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項43】

前記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座が、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる、請求項４２に記載の動物。

【請求項44】

前記動物が、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ重鎖定常領域を含む重鎖抗体を発現する、請求項１～４３のいずれか１項に記載の動物。

【請求項45】

前記重鎖抗体が、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、又は１０^－９Ｍ未満のＫＤで標的抗原に結合する、請求項４４に記載の動物。

【請求項46】

前記重鎖抗体が、可変領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むか、又はそれらからなる、請求項４４又は４５に記載の動物。

【請求項47】

前記重鎖抗体が、膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインをさらに含む、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の動物。

【請求項48】

前記遺伝子改変非ヒト動物が、軽鎖を含むＩｇＧ抗体を発現しない、請求項１～４７のいずれか１項に記載の動物。

【請求項49】

前記動物が、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び／又はＩｇＡ（例えば、機能的ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び／又はＩｇＡ）を発現する、請求項１～４８のいずれか１項に記載の動物。

【請求項50】

前記動物が、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、１つ以上のヒトＩＧＨＶ遺伝子、１つ以上のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び１つ以上のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含み、ここで、前記ヒトＩＧＨＶ遺伝子、前記ヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び前記ヒトＩＧＨＪ遺伝子が作動可能に連結されており、ＶＤＪ再配列を受けることができる、請求項１～４９のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項51】

前記動物が、表１から選択される少なくとも１５０個のヒトＩＧＨＶ遺伝子、表２から選択される少なくとも２０個のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び表３から選択される少なくとも５個のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む、請求項５０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項52】

前記動物が、ヒト対象のヒト第１４染色体の前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てのヒトＩＧＨＶ遺伝子、全てのヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び全てのヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む、請求項５０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項53】

前記動物が、ヒト細胞のヒト第１４染色体の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てのヒトＩＧＨＶ遺伝子、全てのヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び全てのヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む、請求項５０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項54】

前記動物がマウスであり、前記動物の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における前記遺伝子改変が、表４の１つ以上のマウスＩＧＨＶ遺伝子、表５の１つ以上のマウスＩＧＨＤ遺伝子、及び／又は表６の１つ以上のマウスＩＧＨＪ遺伝子の欠失を含む、請求項５０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項55】

前記動物がマウスであり、前記動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座における前記遺伝子改変が、マウスＩＧＨＶ１－８５遺伝子からマウスＩＧＨＪ４遺伝子までの連続配列の欠失を含む、請求項５４に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項56】

前記動物が、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含み、ここで、前記未改変ヒト配列が少なくとも８００ｋｂである、請求項５０のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項57】

前記動物が、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＶ１－２までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含む、請求項５０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項58】

前記動物が、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＶ６－１までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含む、請求項５０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項59】

前記動物が、ヒトＩＧＨＤ１－１からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含む、請求項５０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項60】

前記動物が、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含む、請求項５０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項61】

ゲノムが、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、１つ以上のヒトＩＧＨＶ、ヒトＩＧＨＤ、及びヒトＩＧＨＪ遺伝子による１つ以上の内因性ＩＧＨＶ、内因性ＩＧＨＤ、及び内因性ＩＧＨＪ遺伝子の置換を含み、ここで、ヒトＩＧＨＶ、ヒトＩＧＨＤ、及びヒトＩＧＨＪ遺伝子が、内因性ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１、及びＩＧＨＡ遺伝子の１つ以上に作動可能に連結されている、請求項１～４９のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項62】

１つ以上の内因性ＩＧＨＶ遺伝子、内因性ＩＧＨＤ遺伝子、及び内因性ＩＧＨＪ遺伝子が、表１の少なくとも１５０個のヒトＩＧＨＶ遺伝子、表２の少なくとも２０個のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び表３の少なくとも５個のヒトＩＧＨＪ遺伝子で置き換えられている、請求項６１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項63】

前記動物がマウスであり、表４の少なくとも１８０個のマウスＩＧＨＶ遺伝子、表５の全てのマウスＩＧＨＤ遺伝子、及び表６の全てのマウスＩＧＨＪ遺伝子が置き換えられている、請求項６１又は６２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項64】

前記動物が前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してホモ接合性である、請求項１～６３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項65】

前記動物が前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性である、請求項１～６３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項66】

前記動物が内因性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む、請求項１～６５のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項67】

前記動物が前記内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に破壊を含む、請求項１～６５のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項68】

前記動物が、内因性重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を再配列及び形成することが可能な内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を欠いている、請求項１～６７のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項69】

前記動物がヒト化抗体を産生することができる、請求項１～６８のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項70】

前記動物が哺乳動物である、請求項１～５３、５６～６２、及び６４～６９のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項71】

前記動物がげっ歯類である、請求項１１～５３、５６～６２、及び６４～７０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項72】

前記動物がマウスである、請求項１～５３、５６～６２、及び６４～７１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項73】

前記動物が実質的に正常なＢ細胞の発達及び成熟を有する、請求項１～７２のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。

【請求項74】

請求項１～７３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られた、細胞。

【請求項75】

前記細胞が、１つ以上のヒトＩＧＨＶ遺伝子、１つ以上のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び１つ以上のヒトＩＧＨＪ遺伝子の再配列に由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むキメラ免疫グロブリン重鎖を発現するＢ細胞であり、ここで、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、非ヒト重鎖定常領域に作動可能に連結されている、請求項７４に記載の細胞。

【請求項76】

前記細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項７４又は７５に記載の細胞。

【請求項77】

抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、
ａ）請求項１～７３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を前記抗原に曝露することと、
ｂ）前記動物から採取した細胞からハイブリドーマを作製することと、
ｃ）前記ハイブリドーマによって産生された重鎖抗体を採取することと、
を含む、方法。

【請求項78】

前記方法が、前記ハイブリドーマのゲノムを配列決定することをさらに含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、
ａ）請求項１～７３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を前記抗原に曝露することと、
ｂ）前記抗原に特異的に結合する重鎖抗体を発現する細胞内でヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸を配列決定することと、
ｃ）細胞内で、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする前記核酸を、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸と作動可能に連結することと、
を含む、方法。

【請求項80】

抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、
ａ）前記抗原に特異的に結合する重鎖抗体を発現する細胞内でヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸配列を得ることであって、前記細胞が、請求項１～７３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を前記抗原に曝露することによって得られたものであり、
ｂ）前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする前記核酸を、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸と作動可能に連結することと、
ｃ）細胞内で核酸を発現させ、それによって前記抗体を得ることと、
を含む、方法。

【請求項81】

抗原に特異的に結合する抗体結合ドメインをコードする核酸を得る方法であって、
ａ）請求項１～７３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を前記抗原に曝露することと、
ｂ）前記抗原に特異的に結合する重鎖抗体を発現する細胞内でヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸を配列決定することと、
を含む、方法。

【請求項82】

抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、
ａ）請求項１～７３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を前記抗原に曝露することと、
ｂ）前記動物の免疫細胞（例えば、脾臓細胞）から調製したＲＮＡを使用してファージプラスミドライブラリを構築することと、
ｃ）前記ファージプラスミドライブラリをスクリーニングすることと、
ｄ）前記抗原に特異的に結合する重鎖抗体をコードするファージプラスミドから、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸を配列決定することと、
を含む、方法。

【請求項83】

前記スクリーニングが、前記抗原に対する結合親和性に基づいて免疫グロブリン重鎖可変領域を発現するファージを単離することを含む、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

サンプルを取得する方法であって、
ａ）請求項１～７３のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を前記抗原に曝露することと、
ｂ）前記動物からサンプルを採取することと、
を含む、方法。

【請求項85】

前記サンプルが免疫細胞、リンパ組織、脾臓組織、脾臓細胞、又はＢ細胞である、請求項８４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０２２年９月１６日に提出されたＰＣＴ／ＣＮ２０２２／１１９１８８及び２０２２年１２月２日に提出されたＰＣＴ／ＣＮ２０２２／１３６２４６に対する優先権を主張する。上述の内容全体が参照により、本明細書に組み込まれている。

【0002】

技術分野
本開示は、遺伝子改変動物及び重鎖抗体を産生するための方法に関する。本開示は、抗ＴＦＲ１抗体、抗原結合断片、及びその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

治療用抗体は、最も急速に成長しているクラスの治療用化合物の１つであり、低分子医薬品の成長を急速に上回っている。例えば、モノクローナル抗体は癌治療に革命をもたらした。しかし、従来の抗体はサイズが大きいため、インビボでの腫瘍細胞への送達が妨げられている。従来の抗体の最小標的認識モジュールは、非共有結合した２つの可変ドメイン（ＶＨとＶＬ）で構成されている。ＶＨドメインとＶＬドメインの固有の疎水性相互作用により、操作された抗体の安定性と溶解性が制限され、多くの場合、Ｖドメインの凝集及び／又は誤対合が発生する。

【0004】

重鎖抗体の発見により、癌治療に影響を与える前例のない機会をもたらされた。これらの独特な形態のラクダ科動物由来の抗体には、軽鎖全体とＣＨ１ドメインが欠かれており、ＶＨＨと呼ばれる単一の可変ドメインのみで構成されている。組換えＶＨＨは小さく（１５～２０ｋＤａ）、厳密に単量体である。それらは、ｎＭの親和性のみならず広いｐＨ範囲と温度範囲で安定な状態でそれらの標的に結合する。分子操作はＶＨＨでもより容易であり、これにより、凝集や親和性の低下により問題となる従来の組換え抗体とそれらの断片と比較して、多価形式のモノクローナル抗体の産生が容易になる。さらに、ＶＨＨは、従来の抗体に対して免疫原性が低いエピトープに結合することがよくある。

【0005】

通常、治療用抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。ヒト抗体又はヒト化抗体は、げっ歯類抗体（例えば、マウス抗体）のヒト化によって、又はファージライブラリを使用することによって生成できる。しかし、これらの動物やファージライブラリは通常、重鎖抗体を産生できない。代わりに、重鎖抗体はしばしばラクダ科動物の重鎖抗体から得られる。これらのラクダ科動物の重鎖抗体はヒト化する必要がある。ヒト化プロセスは結合親和性に悪影響を及ぼし、抗体に免疫原性エピトープを導入する可能性がある。これらの抗体の特性を改善するには、反復的で時間のかかる実験がしばしば必要とされる。また、場合によっては、これらの抗体が患者において免疫原性を示すこともあり、時間の経過と共にそれらの有効性の減弱をもたらす。したがって、ヒト又はヒト化重鎖抗体及びナノボディを産生するための効率的かつ信頼できるプラットフォームが必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座及び切断免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座を有する遺伝子改変動物及び細胞に関する。例えば、ＩＧＨＧ１遺伝子内のＣＨ１コード領域をノックアウトして、発現したＩｇＧにＣＨ１ドメインが含まれないようにすることができる。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ及びλ）遺伝子座もノックアウトされる。免疫付与すると、動物は高い親和性／多様性を持つ重鎖抗体を産生できる。いくつかの実施形態において、重鎖抗体をさらに処理してナノボディを生成することができる。

【0007】

一態様では、本開示は、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物に関し、いくつかの実施形態において、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座はＩｇＧ定常領域遺伝子を含み、いくつかの実施形態において、上記ＩｇＧ定常領域遺伝子はＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ重鎖定常領域をコードし、いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変非ヒト動物は重鎖抗体を発現する。いくつかの実施形態において、上記動物は正確に１つのＩｇＧ定常領域遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記ＩｇＧ重鎖定常領域遺伝子はＩＧＨＧ１である。いくつかの実施形態において、上記ＩｇＧ重鎖定常領域は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、並びに任意選択でヒンジ領域を含むか、又はそれらからなる。

【0008】

一態様では、本開示は、ゲノムが、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＧ２ｂ、及びＩＧＨＧ２ｃ遺伝子の欠失と、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＧ１遺伝子のＣＨ１エクソンの欠失とを含む生殖細胞系遺伝子改変を含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態において、上記生殖細胞系遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性ＩＧＨＥ遺伝子の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｓγ２ｂ、Ｓγ２ｃ、及びＳεスイッチ領域の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子を含み、いくつかの実施形態において、上記改変ＩＧＨＧ１遺伝子は、配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｓγ３スイッチ領域の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、ＩＧＨＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性ＩＧＨＭ遺伝子及びＩＧＨδ遺伝子の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記動物ゲノムは、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｓμ及びＳγ１スイッチ領域は、配列番号８と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結されている。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１コード配列の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨδ、ＩＧＨＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｓμスイッチ領域及び上記改変ＩＧＨＭ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結されている。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１エクソンの欠失及びＩＧＨδ遺伝子の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１エクソンの欠失及びＩＧＨδ遺伝子のＣＨ１コード配列の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、内因性Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨδ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記改変ＩＧＨＭ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結されており、上記改変ＩＧＨδ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、上記改変ＩＧＨＭ遺伝子は、配列番号１３と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｓγ１スイッチ領域の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、内因性Ｓμ、Ｓγ３、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び内因性ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、ＩＧＨＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｓγ３スイッチ領域の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性ＩＧＨＭ遺伝子及びＩＧＨδ遺伝子の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、内因性Ｓμ、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及び上記内因性ＩＧＨＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｓμスイッチ領域及び上記改変ＩＧＨＧ１遺伝子は、配列番号９と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結される。いくつかの実施形態において、改変ゲノムは機能的ＩＧＨＭ遺伝子を含む。

【0009】

いくつかの実施形態において、ゲノム内の配列が同じ配列又は同じ動物からの配列で置き換えられる場合でも、動物は依然として内因性配列を有することができる。

【0010】

一態様では、本開示は、ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態において、要素は作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座は、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる。

【0011】

一態様では、本開示は、ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ３スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態において、要素は作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座は、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ３スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる。

【0012】

一態様では、本開示は、ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態において、要素は作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座は、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる。

【0013】

一態様では、本開示は、ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態において、要素は作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座は、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる。

【0014】

一態様では、本開示は、ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態において、要素は作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座は、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、ＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる。

【0015】

一態様では、本開示は、ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態において、要素は作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座は、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる。

【0016】

一態様では、本開示は、ゲノムが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、５’から３’の順序で、以下の要素：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、を含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態において、要素は作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座は、以下の機能遺伝子及びスイッチ領域：Ｓμスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨδ遺伝子、Ｓγ１スイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１遺伝子、Ｓαスイッチ領域、及びＩＧＨＡ遺伝子、からなる。

【0017】

いくつかの実施形態において、上記動物は、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ重鎖定常領域を含む重鎖抗体を発現する。いくつかの実施形態において、上記重鎖抗体は、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、又は１０^－９Ｍ未満のＫＤで標的抗原に結合する。いくつかの実施形態において、上記重鎖抗体は、可変領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態において、上記重鎖抗体は、膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝子改変非ヒト動物は、軽鎖を含むＩｇＧ抗体を発現しない。いくつかの実施形態において、上記動物は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び／又はＩｇＡ（例えば、機能的ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び／又はＩｇＡ）を発現する。

【0018】

いくつかの実施形態において、上記動物は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、１つ以上のヒトＩＧＨＶ遺伝子、１つ以上のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び１つ以上のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含み、いくつかの実施形態において、上記ヒトＩＧＨＶ遺伝子、上記ヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び上記ヒトＩＧＨＪ遺伝子は作動可能に連結されており、ＶＤＪ再配列を受けることができる。いくつかの実施形態において、上記動物は、表１から選択される少なくとも１５０個のヒトＩＧＨＶ遺伝子、表２から選択される少なくとも２０個のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び表３から選択される少なくとも５個のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記動物は、ヒト対象のヒト第１４染色体の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てのヒトＩＧＨＶ遺伝子、全てのヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び全てのヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記動物は、ヒト細胞のヒト第１４染色体の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てのヒトＩＧＨＶ遺伝子、全てのヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び全てのヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記動物はマウスであり、上記動物の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における前記遺伝子改変は、表４の１つ以上のマウスＩＧＨＶ遺伝子、表５の１つ以上のマウスＩＧＨＤ遺伝子、及び／又は表６の１つ以上のマウスＩＧＨＪ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、上記動物はマウスであり、上記動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座における遺伝子改変は、マウスＩＧＨＶ１－８５遺伝子からマウスＩＧＨＪ４遺伝子までの連続配列の欠失を含む。いくつかの実施形態において、上記動物は、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含み、いくつかの実施形態において、上記未改変ヒト配列は少なくとも８００ｋｂである。いくつかの実施形態において、上記動物は、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＶ１－２までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含む。いくつかの実施形態において、上記動物は、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＶ６－１までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含む。いくつかの実施形態において、上記動物は、ヒトＩＧＨＤ１－１からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含む。いくつかの実施形態において、上記動物は、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変ヒト配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、１つ以上のヒトＩＧＨＶ、ヒトＩＧＨＤ、及びヒトＩＧＨＪ遺伝子による１つ以上の内因性ＩＧＨＶ、内因性ＩＧＨＤ、及び内因性ＩＧＨＪ遺伝子の置換を含むゲノムを有し、いくつかの実施形態において、ヒトＩＧＨＶ、ヒトＩＧＨＤ、及びヒトＩＧＨＪ遺伝子が、内因性ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠くＩＧＨＧ１、及びＩＧＨＡ遺伝子の１つ以上に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、１つ以上の内因性ＩＧＨＶ、内因性ＩＧＨＤ、及び内因性ＩＧＨＪ遺伝子が、表１の少なくとも１５０個のヒトＩＧＨＶ遺伝子、表２の少なくとも２０個のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び表３の少なくとも５個のヒトＩＧＨＪ遺伝子で置き換えられる。いくつかの実施形態において、上記動物はマウスであり、表４の少なくとも１８０個のマウスＩＧＨＶ遺伝子、表５の全てのマウスＩＧＨＤ遺伝子、及び表６の全てのマウスＩＧＨＪ遺伝子が置き換えられる。いくつかの実施形態において、上記動物は免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してホモ接合性である。いくつかの実施形態において、上記動物は免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性である。いくつかの実施形態において、上記動物は内因性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、上記動物は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に破壊を含む。いくつかの実施形態において、上記動物は、内因性重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を再配列及び形成することが可能な内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を欠いている。いくつかの実施形態において、上記動物はヒト化抗体を産生することができる。いくつかの実施形態において、上記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、上記動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態において、動物はマウスである。いくつかの実施形態において、上記動物は実質的に正常なＢ細胞の発達及び成熟を有する。

【0020】

一態様では、本開示は、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物から得られた細胞に関する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、１つ以上のヒトＩＧＨＶ遺伝子、１つ以上のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び１つ以上のヒトＩＧＨＪ遺伝子の再配列に由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むキメラ免疫グロブリン重鎖を発現するＢ細胞であり、いくつかの実施形態において、上記免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、非ヒト重鎖定常領域に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、上記細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である。

【0021】

一態様では、本開示は、抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法に関し、上記方法は、ａ）本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を上記抗原に曝露することと、ｂ）上記動物から採取した細胞からハイブリドーマを作製することと、ｃ）上記ハイブリドーマによって産生された重鎖抗体を採取することと、を含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ハイブリドーマのゲノムを配列決定することをさらに含む。

【0022】

一態様では、本開示は、抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法に関し、上記方法は、ａ）本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を上記抗原に曝露することと、ｂ）上記抗原に特異的に結合する重鎖抗体を発現する細胞内でヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸を配列決定することと、ｃ）細胞内で、上記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする上記核酸を、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸と作動可能に連結することと、を含む。

【0023】

一態様では、本開示は、抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法に関し、上記方法は、ａ）上記抗原に特異的に結合する重鎖抗体を発現する細胞内でヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸配列を得ることであって、いくつかの実施形態において、上記細胞は、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を上記抗原に曝露することによって得られたものであり、ｂ）上記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする上記核酸を、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸と作動可能に連結することと、ｃ）細胞内で核酸を発現させ、それによって上記抗体を得ることと、を含む。

【0024】

一態様では、本開示は、抗原に特異的に結合する抗体結合ドメインをコードする核酸を取得する方法に関し、上記方法は、ａ）本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を上記抗原に曝露することと、ｂ）上記抗原に特異的に結合する重鎖抗体を発現する細胞内でヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸を配列決定することと、を含む。

【0025】

一態様では、本開示は、抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法に関し、上記方法は、ａ）本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を上記抗原に曝露することと、ｂ）上記動物の免疫細胞（例えば、脾臓細胞）から調製したＲＮＡを使用してファージプラスミドライブラリを構築することと、ｃ）ファージプラスミドライブラリをスクリーニングすることと、ｄ）上記抗原に特異的に結合する重鎖抗体をコードするファージプラスミドから、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸を配列決定することと、を含む。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、上記抗原に対する結合親和性に基づいて免疫グロブリン重鎖可変領域を発現するファージを単離することを含む。

【0026】

一態様では、本開示は、サンプルを取得する方法に関し、上記方法は、ａ）本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を上記抗原に曝露することと、ｂ）上記動物から上記サンプルを採取することと、を含む。いくつかの実施形態において、上記サンプルは免疫細胞、リンパ組織、脾臓組織、脾臓細胞、又はＢ細胞である。

【0027】

一態様では、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３を含む重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含む、トランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）に結合する抗体又はその抗原結合断片に関し、いくつかの実施形態において、ＶＨＨ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＨＨ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＶＨＨ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、いくつかの実施形態において、選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、及び３アミノ酸配列は、以下の１つである：
（１）選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号４２、４３、及び４４に示され、
（２）選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５、４６、及び４７に示され、
（３）選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号４８、４９、及び５０に示され、
（４）選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５１、５２、及び５３に示され、
（５）選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５４、５５、及び５６に示され、
（６）選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５７、５８、及び５９に示され、
（７）選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６０、６１、及び６２に示され、並びに
（８）選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６３、６４、及び６５に示される。

【0028】

いくつかの実施形態において、ＶＨＨは、それぞれ配列番号４２、４３、及び４４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは、それぞれ配列番号４５、４６、及び４７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは、それぞれ配列番号４８、４９、及び５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは、それぞれ配列番号５１、５２、及び５３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む。

【0029】

一態様では、本開示は、選択されたＶＨＨ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖単一可変領域（ＶＨＨ）を含む、ＴＦＲ１に結合する抗体又はその抗原結合断片に関し、いくつかの実施形態において、選択されたＶＨＨ配列は、配列番号６６、６７、６８、及び６９からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは配列番号６６の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは配列番号６７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは配列番号６８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは配列番号６９の配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＦＲ１、サルＴＦＲ１、マウスＴＦＲ１、又はキメラＴＦＲ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒト又はヒト化抗体若しくはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。

【0030】

一態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片のＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３を含む抗体又はその抗原結合断片に関する。

【0031】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ Ｆｃは、ＥＵ番号付けによる位置２９７に非アスパラギン残基（例えば、アラニン）を含む。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、２つ以上の重鎖単一可変ドメインを含む。

【0032】

一態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む核酸に関する。いくつかの実施形態において、核酸はｃＤＮＡである。

【0033】

一態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸の１つ以上を含むベクターに関する。

【0034】

一態様では、本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む細胞に関する。いくつかの実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞である。一態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸の１つ以上を含む細胞に関する。

【0035】

一態様では、本開示は、抗体又はその抗原結合断片の産生方法に関し、上記方法は、（ａ）本明細書に記載される細胞を、当該細胞が、抗体又はその抗原結合断片を産生するのに十分な条件下で培養することと、（ｂ）上記細胞により産生される抗体又はその抗原結合断片を収集することと、を含む。

【0036】

一態様では、本開示は、治療剤に共有結合した、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片を含む、抗体薬物コンジュゲートに関する。いくつかの実施形態において、治療剤は、細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤である。

【0037】

一態様では、本開示は、脳疾患（例えば、脳癌）を有する対象の治療方法に関し、上記方法は、治療有効量の、本明細書に記載される、抗体若しくはその抗原結合断片を含む組成物、又は抗体薬物コンジュゲートを、上記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、抗体若しくはその抗原結合断片、又は抗体薬物コンジュゲートは、対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。

【0038】

一態様では、本開示は、癌を有する対象の治療方法に関し、上記方法は、治療有効量の、本明細書に記載される、抗体若しくはその抗原結合断片を含む組成物、又は抗体薬物コンジュゲートを、上記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、癌は、脳癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、白血病、又は乳癌である。一態様では、本開示は、対象が脳疾患（例えば、脳癌）を有すると同定する方法に関し、上記方法は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片によって、上記対象から採取されたサンプルから脳疾患を有するものを検出し、それによって上記対象を脳疾患を有すると同定することを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは対象からの脳実質サンプルである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される対象はヒト対象である。

【0039】

一態様では、本開示は、血液脳関門を通過するように薬剤を送達する方法に関し、上記方法は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片に共有結合した薬剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は抗体又は抗体薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態において、薬剤は抗アミロイド抗体である。

【0040】

一態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物に関する。一態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物に関する。

【0041】

一態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片と交差競合する、抗体又はその抗原結合断片に関する。

【0042】

一態様では、本開示は、抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法を提供する。上記方法は、本明細書に記載される動物を上記抗原に曝露することと、上記抗原に特異的に結合するキメラ重鎖抗体を発現する細胞内でヒト重鎖免疫グロブリン可変領域をコードする核酸の配列を取得することと（例えば、配列決定により）、細胞内で、上記ヒト重鎖免疫グロブリン可変領域をコードする上記核酸を、ヒト重鎖免疫グロブリン定常領域をコードする核酸と作動可能に連結することと、を含む。

【0043】

本開示は、非ヒト哺乳動物の子孫にも関する。いくつかの実施形態において、非ヒト哺乳動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態において、非ヒト哺乳動物はマウスである。

【0044】

本開示は、本明細書に記載されるターゲティングベクターを含む細胞もまた提供する。本開示はまた、非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来する細胞（例えば、幹細胞、胚性幹細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又はハイブリドーマ）又は細胞株、又はその一次細胞培養物に関する。本開示はさらに、非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来する組織、器官、又はその培養物に関する。

【0045】

本開示はさらに、免疫付与プロセスに関連する製品の開発、ヒト抗体の製造、又は薬理学、免疫学、微生物学、及び医学の研究のためのモデルシステムにおける、非ヒト哺乳動物又はその子孫、本明細書に記載される方法によって生成された動物モデルの使用に関する。

【0046】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法及び材料が、本明細書に記載され、他の好適な、当該技術分野において周知の方法及び材料もまた使用することができる。材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定的であることは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれている。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。

【0047】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0048】

【図1】重鎖抗体の概略図である。

【図2】ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡ免疫グロブリンアイソタイプの概略構造を示す。マウスとヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座遺伝子が整列され、対応する名前で標識される。

【図3】マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の定常領域遺伝子を示す概略図である。エクソンＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１、及びＭ２を含むＣγ１遺伝子構造を示す。

【図4】マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座における遺伝子改変後の変異対立遺伝子を示す。

【図5】Ｃγ１ΔＣＨ１の遺伝子構造を示す。ＣＨ１コード領域は、欠落しているか（左）、又はＮｅｏカセットで置き換えられている（右）。

【図6】ターゲティングベクターＶ１を使用した遺伝子改変のワークフローを示す（実施例３）。マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座におけるＳγ３からＣεまでの１００８８３ｂｐの配列を、マウスＳγ１及びＣγ１ΔＣＨ１ノックイン配列を含む１６０７６ｂｐの配列で１回のステップで置き換えて、変異対立遺伝子１を生成した。

【図7】ターゲティングベクターＶ２を使用した遺伝子改変のワークフローを示す（実施例３）。マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座におけるＣγ３からＣεまでの９２８５９ｂｐの配列を、Ｃγ１ΔＣＨ１ノックイン配列を含む配列で１回のステップで置き換えて、変異対立遺伝子１’を生成した。

【図8】ターゲティングベクターＶ３を使用した遺伝子改変のワークフローを示す（実施例３）。ＣμとＣδを含む１６４３４ｂｐの配列を変異対立遺伝子１からノックアウトして、変異対立遺伝子２を生成した。

【図9】ターゲティングベクターＶ４を使用した遺伝子改変のワークフローを示す（実施例３）。ＳμとＣγ１ΔＣＨ１’が直接接続するように、Ｃμ、Ｃδ、Ｓγ１を含む配列を変異対立遺伝子１からノックアウトし、変異対立遺伝子２’を生成した。

【図10】ターゲティングベクターＶ５を使用した遺伝子改変のワークフローを示す（実施例３）。Ｃμ中のＣＨ１コード配列を変異対立遺伝子１からノックアウトして、変異対立遺伝子３を生成した。

【図11】ターゲティングベクターＶ６を使用した遺伝子改変のワークフローを示す（実施例３）。Ｃμ中のＣＨ１コード配列とＣδ全体を変異対立遺伝子１からノックアウトして、変異対立遺伝子４を生成した。

【図12】ターゲティングベクターＶ７を使用した遺伝子改変のワークフローを示す（実施例３）。Ｃμ中のＣＨ１コード配列とＣδ中のＣＨ１コード配列を変異対立遺伝子１からノックアウトして、変異対立遺伝子５を生成した。

【図13】変異対立遺伝子１の遺伝子型を検証するためにそれぞれプライマーペアＬ－ＧＴ－Ｆ１／Ｌ－ＧＴ－Ｒ１及びＲ－ＧＴ－Ｆ２／Ｒ－ＧＴ－Ｒ２を使用したＰＣＲアッセイの結果を示す。ＷＴは野生型対照である。Ｈ２Ｏはブランク対照である。Ｍはマーカーである。

【図14】（Ａ）ＢｃｌＩで消化され、ＬＲプローブとハイブリダイズされた変異対立遺伝子１陽性クローンのサザンブロット結果を示す。Ｍはマーカーである。ＷＴは野生型である。（Ｂ）ＳｃａＩで消化され、３’プローブとハイブリダイズされた変異対立遺伝子１陽性クローンのサザンブロット結果を示す。Ｍはマーカーである。ＷＴは野生型である。（Ｃ）ＸｍｎＩで消化され、Ａプローブとハイブリダイズされた変異対立遺伝子１陽性クローンのサザンブロット結果を示す。Ｍはマーカーである。ＷＴは野生型である。（Ｄ）ＢｇｌＩＩで消化され、５’プローブとハイブリダイズされた変異対立遺伝子１陽性クローンのサザンブロット結果を示す。Ｍはマーカーである。ＷＴは野生型である。

【図15】変異対立遺伝子２におけるＣμからＣδまでの配列のノックアウトを検証するためにプライマーＤＥ－Ｆ１及びＤＥ－Ｒ１を使用したＰＣＲアッセイの結果を示す。

【図16】変異対立遺伝子２’におけるＣμからＳγ１までの配列のノックアウトを検証するためにプライマーＧＴ－Ｍｕｔ－Ｆ、ＧＴ－Ｍｕｔ－Ｒ及びＧＴ－ＷＴ－Ｒを使用したＰＣＲアッセイの結果を示す。

【図17】変異対立遺伝子３におけるＣμのＣＨ１コード配列のノックアウトを検証するためにプライマーＧＴ－３Ｆ及びＧＴ－３Ｒを使用したＰＣＲアッセイの結果を示す。

【図18A】変異対立遺伝子４におけるＣμΔＣＨ１の配列を検証するためにプライマーＭｕｔ－Ｆ及びＭｕｔ－Ｒを使用したＰＣＲアッセイの結果を示す。ＷＴは野生型対照である。Ｈ２Ｏはブランク対照である。

【図18B】変異対立遺伝子４におけるＣδの非存在を検証するためにプライマーＦ４及びＲ４を使用したＰＣＲアッセイの結果を示す。

【図19】変異対立遺伝子５におけるＣμΔＣＨ１とＣδΔＣＨ１の配列を検証するためにプライマーペアＭｕｔ－Ｆ／Ｍｕｔ－ＲとＦ３／Ｒ３を使用したＰＣＲアッセイの結果を示す。ＷＴは野生型対照である。Ｈ２Ｏはブランク対照である。

【図20】ヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスゲノムに導入する方法の例示的なフローチャートである。

【図21】マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座配列をヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座配列で置き換えることの概要である。

【図22】ヘテロ接合Ｍｕｔ３マウスを抗原Ａで免疫化することにより産生された抗体の重鎖可変領域におけるＣＤＲ３の長さ分布を示す。

【図23】重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてヘテロ接合性であるマウスにおける可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【図24】抗原Ａに対するヘテロ接合Ｍｕｔ３マウス（Ｈ／－）で産生された抗体のＫＤ値分布を示す。

【図25】抗原Ａに対するホモ接合Ｍｕｔ２マウスで産生された抗体のＫＤ値分布を示す。

【図26】ホモ接合Ｍｕｔ２マウスにおける可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【図27】染色体１４（１４ｑ３２．３３）上のヒト免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子座を示す概略図である。

【図28-1】マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の第１２染色体（１２Ｆ２）上のＩＧＨ遺伝子座（株Ｃ５７ＢＬ／６）を示す概略図である。

【図28-2】同上

【図29-1】ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座（ＩＧＨ）のＩＭＧＴレパートリーを列挙する。

【図29-2】同上

【図29-3】同上

【図29-4】同上

【図29-5】同上

【図30-1】マウスＩＧＨのＩＭＧＴレパートリーを列挙する。

【図30-2】同上

【図30-3】同上

【図30-4】同上

【図30-5】同上

【図30-6】同上

【図30-7】同上

【図30-8】同上

【図31-1】本開示で説明する配列を列挙する。

【図31-2】同上

【図31-3】同上

【図31-4】同上

【図31-5】同上

【図31-6】同上

【図32】それぞれ変異対立遺伝子２’、変異対立遺伝子３、及び変異対立遺伝子４遺伝子型を有するマウスにおける血清ＩｇＧレベルのウェスタンブロット結果を示す。Ｂｉｏｔ．Ｌａｄｄｅｒはタンパク質マーカーである。ＷＴは野生型マウスを表す。

【図33】ヘテロ接合Ｍｕｔ３マウスをヒト４－１ＢＢで免疫化することにより産生された抗体の重鎖可変領域におけるＣＤＲ３の長さ分布を示す。

【図34】重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてホモ接合性であるマウスにおける可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【図35】ヘテロ接合Ｍｕｔ３マウスをヒトＣＤ３ＥＤ及びカニクイザルＣＤ３ＥＤで免疫化することにより産生された抗体の重鎖可変領域におけるＣＤＲ３の長さ分布を示す。

【図36】重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてホモ接合性であるマウスにおける可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【図37】Ｋａｂａｔ番号付けによる抗ＴＦＲ１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ配列を列挙する。

【図38】ＩＭＧＴ番号付けによる抗ＴＦＲ１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ配列を列挙する。

【図39】抗ＴＦＲ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を列挙する。

【図40A】ｈＩｇＧ１（Ｇ１）、ＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２）、２３Ｂ８－Ｎ（Ｇ３）、２４Ａ１－Ｎ（Ｇ４）、２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５）、又は２４Ｃ９－Ｎ（Ｇ６）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の７２時間以内にｈＴＦＲ１マウスの全脳タンパク質中の抗体濃度を示す。

【図40B】ｈＩｇＧ１（Ｇ１）、ＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２）、２３Ｂ８－Ｎ（Ｇ３）、２４Ａ１－Ｎ（Ｇ４）、２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５）、又は２４Ｃ９－Ｎ（Ｇ６）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の７２時間以内にｈＴＦＲ１マウスの脳総タンパク質中の抗体濃度と血清抗体濃度との比を示す。

【図40C】ｈＩｇＧ１（Ｇ１）、ＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２）、２３Ｂ８－Ｎ（Ｇ３）、２４Ａ１－Ｎ（Ｇ４）、２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５）、又は２４Ｃ９－Ｎ（Ｇ６）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の７２時間以内にｈＴＦＲ１マウスの脳実質中の抗体濃度を示す。

【図40D】ｈＩｇＧ１（Ｇ１）、ＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２）、２３Ｂ８－Ｎ（Ｇ３）、２４Ａ１－Ｎ（Ｇ４）、２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５）、又は２４Ｃ９－Ｎ（Ｇ６）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の７２時間以内にｈＴＦＲ１マウスの脳実質中の抗体濃度と血清抗体濃度との比を示す。

【図41】（Ａ）ｈＩｇＧ１（Ｇ１）、ＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２）、２３Ｂ８－Ｎ（Ｇ３）、２４Ａ１－Ｎ（Ｇ４）、又は２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の２４時間後の脳実質中の抗体濃度試験の結果を示す。（Ｂ）ｈＩｇＧ１（Ｇ１）、ＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２）、２３Ｂ８－Ｎ（Ｇ３）、２４Ａ１－Ｎ（Ｇ４）、又は２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の２４時間後の脳総タンパク質（全脳）中の抗体濃度試験の結果を示す。

【図42】ＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２～Ｇ４）又は２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５～Ｇ７）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の６時間又は２４時間後の抗体濃度の結果を示す。ｈＩｇＧ１は陰性対照として使用した。

【図43】重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてホモ接合性であるマウスにおける可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【図44】ヘテロ接合Ｍｕｔ２’マウス（Ｈ／－）における可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【図45】ヒト血清アルブミンに対するヘテロ接合Ｍｕｔ２’マウス（Ｈ／－）で産生された抗体のＫＤ値分布を示す。

【図46】重鎖変異対立遺伝子４遺伝子型についてホモ接合性であるマウスにおける可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【図47】重鎖変異対立遺伝子５遺伝子型についてホモ接合性であるマウスにおける可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

本開示は、遺伝子改変動物及び重鎖抗体を産生するための方法に関する。

【0050】

重鎖抗体（又は重鎖のみの抗体）は、重鎖（一般に２つの重鎖）のみを有し、抗体に通常見られる２つの軽鎖を欠いている抗体である。天然に存在する重鎖抗体は、軟骨魚類（サメなど）及びラクダ科動物（ラマなど）で発見されている。例えば、軟骨魚類では、免疫グロブリン新抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）は重鎖抗体である。ＩｇＮＡＲは、他の抗体とは構造的に大きな違いがある。これは、１本の鎖に通常の３つの代わりに５つの定常ドメイン（ＣＨ）があり、通常とは異なる位置にいくつかのジスルフィド結合があり、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）は他の抗体の軽鎖に結合する部位をカバーする延長ループを形成する。これらの違いは、軟骨魚類の系統発生年代と組み合わせて、ＩｇＮＡＲが哺乳動物の免疫グロブリンよりも原始的な抗原結合タンパク質に密接に関連している可能性があるという仮説につながる。

【0051】

重鎖（ＩｇＧ様）抗体を有する唯一の哺乳動物は、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ及びアルパカなどのラクダ科動物である。全ての哺乳動物と同様に、ラクダ科動物（ラマなど）は、ジスルフィド結合でＹ字型に結合した２つの重鎖と２つの軽鎖からなる従来の抗体（ＩｇＧ１など）を産生できる。しかし、それらはまた、ＩｇＧ２とＩｇＧ３というＩｇＧの２つの独特なサブクラス（重鎖ＩｇＧとも呼ばれる）を産生する。これらの抗体は、ＣＨ１領域を欠いているものの、依然としてそれらのＮ末端に抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を有する２つの重鎖のみで構成されている。従来のＩｇでは、抗原抗体相互作用の高い多様性を可能にするために、重鎖と軽鎖の両方の可変領域の組み合わせが必要である。単独の重鎖と軽鎖は依然としてこの能力を示すが、ペアになった重鎖と軽鎖と比較すると、非常に低い親和性を示す。重鎖ＩｇＧの独特な特徴は、それらのモノマー抗原結合領域が、別の領域と対になる必要がなく、従来の抗体に匹敵する特異性、親和性、及び特に多様性で抗原に結合する能力である。この特徴は主に、２つの重鎖の可変領域のアミノ酸配列内のいくつかの主要な変異によるもので、従来のＩｇと比較すると大きな構造変化を引き起こす。可変領域における主要な置換により、軽鎖が重鎖に結合することが防止されるだけでなく、結合していない重鎖が免疫グロブリン結合タンパク質によってリサイクルされることも防止される。

【0052】

これらの重鎖抗体の単一可変ドメイン（ＶＨＨ、ｓｄＡｂ、又はナノボディと指定する）は、適応免疫系によって生成される最小の抗原結合ドメインである。これらの抗体の可変領域の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）は、従来の抗体の２倍の長さであることがよく知られている。その結果、抗原との相互作用面が拡大し、抗原－抗体相互作用の多様性も増加し、軽鎖の欠如を補うことになる。長い相補性決定領域３（ＣＤＲ３）により、ＶＨＨは、酵素の活性部位やウイルス表面上の受容体結合キャニオンなどの、機能的に興味深い部位を含む、従来の抗体にアクセスできないタンパク質上の隙間まで拡張できる。さらに、システイン残基を追加することで構造がより安定し、したがって相互作用の強度が高まる。

【0053】

ＶＨＨは、従来の抗体の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）を持つ従来の抗体と比較して、より高い安定性、溶解性、発現収量、及びリフォールディング能力、並びにより良好なインビボ組織浸透を含む、数多くの他の利点を提供する。さらに、従来の抗体のＶＨドメインとは対照的に、ＶＨＨは軽鎖に結合する本質的な傾向を示さない。これにより、機能的な軽鎖遺伝子座の存在下で重鎖抗体の誘導が促進される。さらに、ＶＨＨはＶＬドメインに結合しないため、従来のＶＨ－ＶＬペア、又はＶＨドメインに基づく単一ドメインを含有するコンストラクトよりも、ＶＨＨを二重特異性抗体コンストラクトに再フォーマットする方がはるかに簡単である。

【0054】

ラクダ科動物ＶＨＨとヒトＶＨドメインとの間の顕著な違いは、ＣＤＲ３ループの長さと配向である。ＣＤＲ３は、Ｂ細胞の発達中に新たに生成されるＤＮＡ要素によってコードされる抗体分子の独特な領域に対応する。遺伝子組換えの結果、Ｄ要素と隣接するＶ要素及びＪ要素が融合する。組換えの際には、接合部におけるヌクレオチドの追加及び／又は削除によってさらなる遺伝的多様性が生成される。これにより、ＣＤＲ３ループは抗体の多様性と特異性に主要な寄与を提供する。一部の初期のトランスジェニック重鎖抗体動物では可変領域遺伝子（ＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、及びＩＧＨＪ）の数が限られているため、野生型動物による強力な抗原応答にもかかわらず、これらの動物では一部の抗原が認識されない（Ｊａｎｓｓｅｎｓ，Ｒｉｃｋ，ｅｔａｌ． “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０３．４１（２００６）：１５１３０－１５１３５）。本開示は、完全なヒト重鎖抗体レパートリーを有する遺伝子改変動物を提供する。したがって、これらの動物によって生成された可変ドメインは、ヒト重鎖可変ドメインに対して最大の可能な多様性を持つことができ、それによって完全にヒト化された重鎖抗体を取得する可能性が最大化される。

【0055】

さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全配列が動物ゲノムに導入されるため（改変なし又は限定的な改変のみ）、これらの遺伝子は、ヒトで起こるものと非常に似た方法でＶ（Ｄ）Ｊ組換えを受けることができ、ヒトの免疫系で認識できる新しい免疫原性エピトープが生成されるリスクが軽減され、それによって免疫原性が低下する。免疫原性により抗薬物抗体が生成され、有効性を含む可能性がある。ここでは、内因性ＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、及びＩＧＨＪ遺伝子が効果的に削除されている。抗体レパートリーによって生成された抗体がヒトにおいて免疫原性を持つ可能性は低い。さらに、抗体の産生は非常に効率的であってもよく、かつ効率的なＶ（Ｄ）Ｊ組換えにより、通常の産生速度と同様の産生速度を有する。したがって、この抗体はヒトの治療薬としてより適している。したがって、遺伝子改変動物は、ヒト化重鎖抗体を産生するための有利なプラットフォームを提供する。

【0056】

さらに、ＩｇＧ１は血清中に最も多く存在する抗体サブタイプであり、血清半減期が長く、ＦｃγＲ親和性が強く、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性などを有している。ＩｇＧ１は抗体医薬品開発の分野で独特な利点を持っている。したがって、一態様では、本開示は特に、ＩｇＧ１サブタイプの重鎖抗体を産生することができるヒト化マウスの調製に関する。その間に、他の全てのＩｇＧサブタイプのコード配列を削除することができる。これにより、動物内で重鎖抗体を作成するための効率的かつ信頼できるプラットフォームが作成される。

【0057】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、又は６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、免疫グロブリン軽鎖由来の３つのＣＤＲのいずれか、又は、免疫グロブリン重鎖由来の３つのＣＤＲのいずれか）を含有し、エピトープに特異的に結合可能な、任意の抗原結合分子を意味する。抗体の非限定例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、重鎖抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体が挙げられる。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体のＦｃ領域を含有することができる。抗体という用語は、誘導体、例えば、抗体断片から形成される、二重特異性抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、線状抗体、及び多重特異性抗体もまた含む。

【0058】

本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という用語は、全長抗体の一部を意味し、当該部分は、抗原に特異的に結合可能である。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、少なくとも１つの可変ドメイン（例えば、重鎖の可変ドメイン、又は、軽鎖の可変ドメイン）を含有する。抗体断片の非限定例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片が挙げられる。

【0059】

本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒトに存在する核酸（例えば、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖又は軽鎖遺伝子座）によりコードされる抗体を意味する。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、ヒトから回収されるか、又は、ヒト細胞培養液中（例えば、ヒトハイブリドーマ細胞内）で産生される。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、非ヒト細胞（例えば、マウス又はハムスター細胞株）内で産生される。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、細菌細胞又は酵母菌細胞内で産生される。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、再配列されていない、又は、再配列されたヒト免疫グロブリン遺伝子座（例えば、重鎖又は軽鎖ヒト免疫グロブリン遺伝子座）を含有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）で産生される。

【0060】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗体に存在する配列を含有する抗体（例えば、ヒト及びマウス抗体など、２つの異なる哺乳動物種由来の抗体）を意味する。キメラ抗体の非限定例としては、ヒト抗体の、可変ドメイン配列（例えば、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメイン配列の全て又は一部）、並びに、非ヒト抗体の定常ドメインを含有する抗体が挙げられる。キメラ抗体の更なる例は、本明細書に記載され、当該技術分野において周知である。

【0061】

本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する配列を含有し、かつ、ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含有する、非ヒト抗体を意味する。

【0062】

本明細書で使用される場合、「一本鎖抗体」という用語は、抗原に特異的に結合可能な、少なくとも２つの免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、哺乳動物免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の可変ドメイン）を含有する、単一のポリペプチドを意味する。

【0063】

本明細書で使用される場合、「重鎖抗体」という用語は、重鎖（通常２つ）のみで構成され、かついかなる軽鎖を有していない抗体分子を意味する。

【0064】

本明細書で使用される場合、「ＶＨＨ」という用語は、重鎖抗体に由来する可変ドメインを意味する。ＶＨＨは、ＶＬと対になる必要がなく、抗原を特異的に認識できる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＶＨＨ（ｓｄＡｂ又はナノボディとも呼ばれる）は、本明細書に記載されるヒト化重鎖抗体のいずれかに由来する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＶＨＨ、ｓｄＡｂ、又はナノボディは、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物のいずれかによって産生される重鎖抗体に由来する。

【0065】

本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書全体を通じて互換的に使用され、動物、ヒト、又は非ヒトを表す。獣医学的及び非獣医学的用途が、本開示により想到される。ヒト患者は、成人のヒト又は若年のヒト（例えば、１８歳未満のヒト）であることができる。ヒトに加えて、患者としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌ、及び霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ科動物、ブタ科動物（例えば、ブタ、ミニブタ）、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ウシ科動物、並びに、他の家庭用、家畜用、及び動物園用動物が挙げられる。

【0066】

本明細書で使用される場合、抗体を言及する際に、「特異的に結合」、及び「特異的に結合する」という語句は、相互作用が、標的分子に特定の構造（即ち、抗原決定基又はエピトープ）が存在することに依存するために、換言すれば、試薬が、一般的に、全分子よりも、特定の構造を含む分子を認識し、これに結合するために、抗体が、好ましくは他の分子よりも、その標的分子と相互作用することを意味する。標的分子に特異的に結合する抗体は、標的特異性抗体と呼ばれることも可能である。

【0067】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、同じ意味で用いられ、少なくとも２つのアミノ酸の、任意の長さのアミノ酸のポリマーを意味する。

【0068】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、及び「核酸配列」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、少なくとも２つのヌクレオチドの、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びこれらの改変物が挙げられる。

【0069】

本明細書で使用される場合、「未改変ヒト配列」という用語は、ヒト対象、ヒト細胞、培養されたヒト細胞又はヒト細胞株に由来する配列を意味し、その配列はヒト対象、ヒト細胞、培養されたヒト細胞又はヒト細胞株の遺伝子配列と同一である。

【0070】

免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座
重鎖免疫グロブリン遺伝子座（ＩＧＨ又は免疫グロブリン重鎖遺伝子座とも呼ばれる）は、抗体（又は免疫グロブリン）の重鎖の遺伝子を含む染色体（例えば、マウス第１２染色体）上の領域である。これには、重鎖可変領域と重鎖定常領域をコードする配列が含まれる。

【0071】

図２に示すように、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子には、（以下の順序で示すように）免疫グロブリン重定常μ（ＩＧＨＭ、又はＣμ）、免疫グロブリン重定常δ（ＩＧＨδ、又はＣδ）、免疫グロブリン重定常γ３（ＩＧＨＧ３、又はＣγ３）、免疫グロブリン重定常γ１（ＩＧＨＧ１、又はＣγ１）、免疫グロブリン重定常γ２ｂ（ＩＧＨＧ２ｂ、又はＣγ２ｂ）、免疫グロブリン重定常γ２ｃ（ＩＧＨＧ２ｃ、又はＣγ２ｃ）、免疫グロブリン重定常ε（ＩＧＨＥ、又はＣε）、及び免疫グロブリン重定常α（ＩＧＨＡ、又はＣα）遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン重定常γ２ａ（ＩＧＨＧ２ａ）はＩＧＨＧ２ｃの位置にある。対照的に、ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子には、（以下の順序で示すように）免疫グロブリン重定常μ（ＩＧＨＭ、又はＣμ）、免疫グロブリン重定常δ（ＩＧＨδ、Ｃδ）、免疫グロブリン重定常γ３（ＩＧＨＧ３、又はＣγ３）、免疫グロブリン重定常γ１（ＩＧＨＧ１、又はＣγ１）、免疫グロブリン重定常εＰ１（偽遺伝子）（ＩＧＨＥＰ１、又はψＣε）、免疫グロブリン重定常α１（ＩＧＨＡ１、又はＣα１）、免疫グロブリン重定常γＰ（非機能的）（ＩＧＨＧＰ、又はＣγＰ、図示せず）、免疫グロブリン重定常γ２（ＩＧＨＧ２、又はＣγ２）、免疫グロブリン重定常γ４（ＩＧＨＧ４、Ｃγ４）、免疫グロブリン重定常ε（ＩＧＨＥ、又はＣε）、及び免疫グロブリン重定常α２（ＩＧＨＡ２、又はＣα２）遺伝子が含まれる。

【0072】

免疫グロブリンクラススイッチ（又はアイソタイプスイッチ、又はアイソタイプ交換、又はクラススイッチ組換え（ＣＳＲ））は、Ｂ細胞の抗体産生をあるクラスから別のクラス（例えば、アイソタイプＩｇＭからアイソタイプＩｇＧ）に変更する生物学的メカニズムである。このプロセスの間、抗体重鎖の定常領域部分は変化するが、重鎖の可変領域は同じままである。可変領域は変化しないため、クラススイッチは抗原特異性に影響を与えない。代わりに、抗体は同じ抗原に対する親和性を保持しながら、異なるエフェクター分子と相互作用することができる。これにより、同じ活性化Ｂ細胞からの異なる娘細胞が異なるアイソタイプ又はサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）の抗体を産生できるようになる。クラススイッチは、クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）結合と呼ばれるメカニズムによって発生する。クラススイッチ組換えは、アイソタイプスイッチ又はクラススイッチと呼ばれるプロセス中に、活性化Ｂ細胞によって産生される抗体のクラスを変更できるようにする生物学的メカニズムである。ＣＳＲでは、抗体重鎖遺伝子座の一部が染色体から除去され、削除された部分を囲む遺伝子セグメントが再結合され、異なるアイソタイプの抗体を産生する機能的な抗体遺伝子が保持される。二本鎖切断は、抗体重鎖の定常領域をコードする遺伝子セグメントの上流にある、スイッチ（Ｓ）領域と呼ばれる保存されたヌクレオチドモチーフでＤＮＡに生成され、これらは、Ｃδを除く全ての重鎖定常領域遺伝子に隣接して発生する。ＤＮＡは、活性化誘導（シチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、及びアピリミジン／アプリン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼを含む一連の酵素の活性によって、２つの選択されたスイッチ領域でニックされ、破壊される。その後、スイッチ領域間の介在ＤＮＡは染色体から削除され、例えば、不要なＣμ又はＣδ重鎖定常領域配列が除去され、Ｃγ、Ｃα、又はＣε定常領域遺伝子セグメントの置換が可能になる。ＤＮＡの遊離末端は、可変ドメインエクソンを抗体重鎖の目的の下流定常ドメインエクソンに連結するために、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と呼ばれるプロセスによって再結合される。非相同末端結合の非存在下では、ＤＮＡの遊離末端は、マイクロホモロジー結合に偏った代替経路によって再結合され得る。Ｃμ遺伝子とＣδ遺伝子を除いて、１つの抗体クラスのみが、任意の時点でＢ細胞によって発現される。図３は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座における各スイッチ領域（例えば、Ｓμ、Ｓγ３、Ｓγ１、Ｓγ２ｂ、Ｓγ２ｃ、Ｓε、及びＳα）の位置を示す。具体的には、Ｃγ１遺伝子は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び２つの膜貫通ドメインをコードするエクソンを含む。エクソンはそれぞれＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１、及びＭ２で標識される。

【0073】

免疫グロブリンの５つの主なクラスは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡであり、これらのそれぞれが膜貫通抗原受容体又は分泌抗体として存在する。ヒトでは、ＩｇＧは、４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に分かれており、血清中のそれらの存在量が多い順に命名され、ＩｇＡ抗体は２つのサブクラス（ＩｇＡ１とＩｇＡ２）に分かれている。これらのクラスを定義する異なる重鎖はアイソタイプと呼ばれ、それぞれ小文字のギリシャ文字μ（ＩｇＭ）、δ（ＩｇＤ）、γ（ＩｇＧ）、ε（ＩｇＥ）、及びα（ＩｇＡ）で指定される。

【0074】

ＩｇＧ１～ＩｇＧ４ではジスルフィド結合の位置と数は異なるが、４つのＩｇＧサブタイプの構造は非常に似ている。実際、血漿中に最も多く存在するＩｇＧサブタイプとして、ＩｇＧ１は、組換え治療用抗体の作製に広く使用されている。対照的に、ＩｇＧ３は、ＦｃＲｎへの結合親和性が弱く、半減期が短い（約９日）であるため、抗体薬物の開発にはほとんど使用されない。したがって、ＩｇＧ３ベースの抗体薬物は、薬物動態上の理由から、より頻繁に投与する必要がある。さらに、異なるサブタイプの抗体レベルは身体の発達中に変化する可能性があり、これは例えば、Ｅｌｅｎａ Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．， “Ａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ Ｂ－ｃｅｌｌ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １４１，Ｉｓｓｕｅ ６（２０１８）に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＩｇＧ１は血清中に最も多く存在する抗体サブタイプであり、血清半減期が長く、ＦｃγＲ親和性が強く、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性などを有している。ＩｇＧ１は抗体医薬品開発の分野で独特な利点を持っている。したがって、一態様では、本開示は、ＩｇＧ１サブタイプの重鎖抗体を産生することができるヒト化マウスの調製に関する。一態様では、本開示は特に、ＩｇＧ１サブタイプの重鎖抗体を産生することができるヒト化マウスの調製に関する。いくつかの実施形態において、重鎖抗体をさらに処理してナノボディを生成することができる。

【0075】

一態様では、本開示は、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物に関し、ここで、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座はＩｇＧ定常領域遺伝子を含み、上記ＩｇＧ定常領域遺伝子はＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ重鎖定常領域をコードし、上記遺伝子改変非ヒト動物は重鎖抗体を発現する。

【0076】

いくつかの実施形態において、ＩｇＧ定常領域遺伝子は、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２ａ、ＩＧＨＧ２ｂ、及びＩＧＨＧ２ｃのうちの１つである。いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのＩｇＧ定常領域遺伝子を有し、そのうちのいずれもＣＨ１ドメインをコードしない。いくつかの実施形態において、１つ、２つ、又は３つのＩＧＨＧ遺伝子のみがＣＨ１ドメインをコードせず、少なくとも１つ、２つ、又は３つの残りのＩＧＨＧ遺伝子がＣＨ１ドメインをコードできる。いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、１つだけ（例えば、正確に１つ）のＩｇＧ定常領域遺伝子、例えばＩＧＨＧ１有する。いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座には、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＧ２ａ、ＩＧＨＧ２ｂ、及び／又はＩＧＨＧ２ｃ遺伝子が含まれない。

【0077】

いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、１つだけのＩＧＨＧ遺伝子（例えば、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２ａ、ＩＧＨＧ２ｂ、又はＩＧＨＧ２ｃ）を有し、ＩＧＨＧ内のＣＨ１ドメインをコードする配列が欠失している。いくつかの実施形態において、ＩＧＨＧ遺伝子は、Ｓγ３、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ、又はＳγ２ｃ（例えば、Ｓγ３又はＳγ１）に作動可能に連結される。

【0078】

いくつかの実施形態において、ＩＧＨＭはインタクトな機能的内因性ＩＧＨＭ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＧＨＭ内のＣＨ１ドメインをコードする配列が欠失している。いくつかの実施形態において、ＩＧＨＭが欠失している。いくつかの実施形態において、ＩＧＨδはインタクトな機能的内因性ＩＧＨδ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＧＨδ内のＣＨ１ドメインをコードする配列が欠失している。いくつかの実施形態において、ＩＧＨδが欠失している。いくつかの実施形態において、ＩＧＨＭとＩＧＨδの両方が削除される。

【0079】

いくつかの実施形態において、ＩＧＨＥはインタクトな機能的内因性ＩＧＨＥ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＧＨＥ内のＣＨ１ドメインをコードする配列が欠失している。いくつかの実施形態において、ＩＧＨＥが欠失している。

【0080】

いくつかの実施形態において、ＩＧＨＡはインタクトな機能的内因性ＩＧＨＡ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＧＨＡ内のＣＨ１ドメインをコードする配列が欠失している。いくつかの実施形態において、ＩＧＨＡが欠失している。

【0081】

様々な実施形態において、ヒト化重鎖抗体は、少なくともＣＨ１ドメインを欠く独特な免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＦｃのヒンジ領域も欠いている。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖定常領域のＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態において、重鎖抗体の定常領域には、ＩｇＧ重鎖Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域が含まれる。

【0082】

いくつかの実施形態において、Ｂ細胞の発達中に提示された場合に選択を効果的に生き残ることができる適切な数の再配列された重鎖可変領域が必要である。一態様では、本開示は、ＩｇＧのＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む生殖細胞系遺伝子改変を含むトランスジェニック動物を提供し、ここで、上記動物は機能的ＩｇＭを発現し、かつ上記動物は血清中にＩｇＧ重鎖抗体（例えば、ＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）を発現する。いくつかの実施形態において、ＩｇＭは２つの重鎖を含み、それらは２つのλ又はκ軽鎖と結合して抗原を認識する。いくつかの実施形態において、機能的ＩｇＭにはＣＨ１ドメインが含まれる。いくつかの実施形態において、機能的ＩｇＭにはＣＨ１ドメインが含まれない。いかなる理論にも縛られるつもりはないが、内因性ＩＧＨＭ遺伝子からＣＨ１ドメインをコードする配列を削除しても、ＩｇＭ機能は実質的に変化しないと考えられる。

【0083】

いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座には、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨδ遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態において、改変ＩＧＨδは機能的ＩｇＤを発現する。いかなる理論にも縛られるつもりはないが、内因性ＩＧＨδ遺伝子からＣＨ１ドメインをコードする配列を削除しても、ＩｇＤ機能は実質的に変化しないと考えられる。

【0084】

免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座
ヒト化重鎖抗体（ＨＣＡｂ）を産生するには、動物の重鎖免疫グロブリン可変領域遺伝子座をヒト化することができる。この重鎖免疫グロブリン可変領域は、重鎖遺伝子座の生殖細胞系組織を表す。遺伝子座には、Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定数）セグメントが含まれる。Ｖ領域中の遺伝子は、Ｖ遺伝子クラスター（ＩＧＨＶ遺伝子クラスターとも呼ばれる）を形成する。Ｄ領域中の遺伝子は、Ｄ遺伝子クラスター（ＩＧＨＤ遺伝子クラスターとも呼ばれる）を形成する。Ｊ領域中の遺伝子は、Ｊ遺伝子クラスター（ＩＧＨＪ遺伝子クラスターとも呼ばれる）を形成する。

【0085】

Ｂ細胞の発達中に、ＤＮＡレベルでの組換えイベントにより、単一のＤセグメント（ＩＧＨＤ遺伝子とも呼ばれる）がＪセグメント（ＩＧＨＪ遺伝子とも呼ばれる）に結合され、その後、この部分的に再配列されたＤ－Ｊ領域の融合されたＤ－ＪエクソンがＶセグメント（ＩＧＨＶ遺伝子とも呼ばれる）に結合される。融合されたＶ－Ｄ－Ｊエクソンを含む再配列されたＶ－Ｄ－Ｊ領域は、その後転写され、ＲＮＡレベルでＩＧＨＭ定常領域に融合され、この転写物は、μ重鎖をコードする。発達の後期に、Ｂ細胞はＶ－Ｄ－Ｊ－Ｃμ－ＣδプレメッセンジャーＲＮＡを生成し、これが選択的にスプライシングされて、μ重鎖又はδ重鎖のいずれかをコードする。リンパ節の成熟Ｂ細胞はスイッチ組換えを受け、それによって融合されたＶ－Ｄ－Ｊ遺伝子セグメントがＩＧＨＧ、ＩＧＨＡ、又はＩＧＨＥ遺伝子セグメントのうちの１つに近接し、各細胞がγ、α、又はε重鎖のいずれかを発現する。多くの異なるＩＧＨＶ遺伝子といくつかのＩＧＨＪ遺伝子との潜在的な組換えは、広範囲の抗原認識を提供する。さらなる多様性は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素によるヌクレオチドのランダムな付加から生じる接合部の多様性と、脾臓とリンパ節におけるＢ細胞の成熟中に起こる体細胞超変異によって達成される。いくつかのＶ、Ｄ、Ｊ、及びＣセグメントは、タンパク質をコードできないことが知られており、疑似遺伝子セグメント（単に偽遺伝子と呼ばれることが多い）と見なされる。

【0086】

ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座はヒト第１４染色体上に位置する（図２７及び図２９）。表１には、この遺伝子座におけるＩＧＨＶ遺伝子とその相対順序が列挙されている。

【0087】

【表1】

【0088】

ＲＰＳ８Ｐ１、ＡＤＡＭ６、及びＫＩＡＡ０１２５もこの遺伝子座に位置する。ＲＰＳ８Ｐ１の相対順序は１６０、ＡＤＡＭ６の相対順序は１６１、ＫＩＡＡ０１２５の相対順序は１６４である。表２には、ヒト第１４染色体上の全てのＩＧＨＤ遺伝子とその相対順序が列挙されている。表３には、ヒト第１４染色体上の全てのＩＧＨＪ遺伝子とその相対順序が列挙されている。免疫グロブリン定常ドメインの遺伝子は、ＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、及びＩＧＨＪ遺伝子の後に位置する。これらの遺伝子には、（以下の順序で示すように）免疫グロブリン重定常μ（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリン重定常δ（ＩＧＨ δ）、免疫グロブリン重定常γ３（ＩＧＨＧ３）、免疫グロブリン重定常γ１（ＩＧＨＧ１）、免疫グロブリン重定常εＰ１（偽遺伝子）（ＩＧＨＥＰ１）、免疫グロブリン重定常α１（ＩＧＨＡ１）、免疫グロブリン重定常γＰ（非機能的）（ＩＧＨＧＰ）、免疫グロブリン重定常γ２（ＩＧＨＧ２）、免疫グロブリン重定常γ４（ＩＧＨＧ４）、免疫グロブリン重定常ε（ＩＧＨＥ）、及び免疫グロブリン重定常α２（ＩＧＨＡ２）が含まれる。これらの遺伝子及びこれらの遺伝子の順序は、図２７及び図２９にも示されている。

【0089】

【表2】

【0090】

【表3】

【0091】

マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座はマウス第１２染色体上に位置する（図２８及び図３０）。表４には、この遺伝子座におけるＩＧＨＶ遺伝子とその相対順序が列挙されている。

【0092】

【表4】

【0093】

表５には、マウス第１２染色体上の全てのＩＧＨＤ遺伝子とその相対順序が列挙されている。表６には、マウス第１２染色体上の全てのＩＧＨＪ遺伝子とその相対順序が列挙されている。免疫グロブリン定常ドメインの遺伝子は、ＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、及びＩＧＨＪ遺伝子の後にある。これらの遺伝子には、（以下の順序で示すように）免疫グロブリン重定常μ（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリン重定常δ（ＩＧＨδ）、免疫グロブリン重定常γ３（ＩＧＨＧ３）、免疫グロブリン重定常γ１（ＩＧＨＧ１）、免疫グロブリン重定常γ２ｂ（ＩＧＨＧ２ｂ）、免疫グロブリン重定常γ２ｃ（ＩＧＨＧ２ｃ）、免疫グロブリン重定常ε（ＩＧＨＥ）、及び免疫グロブリン重定常α（ＩＧＨＡ）遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン重定常γ２ａ（ＩＧＨＧ２ａ）はＩＧＨＧ２ｃの位置にある。これらの遺伝子及びこれらの遺伝子の順序は、図２８及び図３０にも示されている。

【0094】

【表5】

【0095】

【表6】

【0096】

本開示は、１つ以上のヒトＩＧＨＶ遺伝子、１つ以上のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び／又は１つ以上のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態において、ヒトＩＧＨＶ遺伝子、ヒトＩＧＨＤ遺伝子、及びヒトＩＧＨＪ遺伝子は、作動可能に連結されており、ＶＤＪ再配列を受けることができる。いくつかの実施形態において、ヒトＩＧＨＶ遺伝子、ヒトＩＧＨＤ遺伝子、及びヒトＩＧＨＪ遺伝子は、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座にある。

【0097】

いくつかの実施形態において、動物は、約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、若しくは１６１個のヒトＩＧＨＶ遺伝子（例えば、表１に示される遺伝子）を含む。

【0098】

いくつかの実施形態において、動物は、表１から選択される約又は少なくとも１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、若しくは１６１個のヒトＩＧＨＶ遺伝子、表２から選択される約又は少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、若しくは２７個のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び表３から選択される約又は少なくとも５、６、７、８、若しくは９個のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、動物は、ＩＧＨＶ２－１０、ＩＧＨＶ３－９、及びＩＧＨＶ１－８を除く表１の全てのヒトＩＧＨＶ遺伝子、表２の全てのヒトＩＧＨＤ遺伝子、並びに表３の全てのヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、動物は、ＩＧＨＶ５－１０－１及びＩＧＨＶ３－６４Ｄを除く表１の全てのヒトＩＧＨＶ遺伝子、表２の全てのヒトＩＧＨＤ遺伝子、並びに表３の全てのヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、動物は、ヒト対象のヒト第１４染色体の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座に、全てのヒトＩＧＨＶ遺伝子、全てのヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び全てのヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、動物は、ヒト細胞（例えば、体細胞、培養細胞、非免疫細胞、いかなるＶ（Ｄ）Ｊ再配列のない細胞）のヒト第１４染色体の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座に、全てのヒトＩＧＨＶ遺伝子、全てのヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び全てのヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。

【0099】

いくつかの実施形態において、動物は、ＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２、ＩＧＨＶ７－８１、ＩＧＨＶ４－８０、ＩＧＨＶ３－７９、ＩＧＨＶ（ＩＩ）－７８－１、ＩＧＨＶ５－７８、ＩＧＨＶ７－７７、ＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－７６－１、ＩＧＨＶ３－７６、及びＩＧＨＶ３－７５から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の遺伝子を含む。

【0100】

いくつかの実施形態において、動物は、ＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－５－２、ＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－５－１、ＩＧＨＶ２－５、ＩＧＨＶ７－４－１、ＩＧＨＶ４－４、ＩＧＨＶ１－３、ＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－２－１、ＩＧＨＶ１－２、ＩＧＨＶ（ＩＩ）－１－１、及びＩＧＨＶ６－１から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の遺伝子を含む。

【0101】

いくつかの実施形態において、動物は、ＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２、ＩＧＨＶ７－８１、ＩＧＨＶ４－８０、ＩＧＨＶ３－７９、ＩＧＨＶ（ＩＩ）－７８－１、ＩＧＨＶ５－７８、ＩＧＨＶ７－７７、ＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－７６－１、ＩＧＨＶ３－７６、及びＩＧＨＶ３－７５から選択される遺伝子から始まり、かつＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－５－２、ＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－５－１、ＩＧＨＶ２－５、ＩＧＨＶ７－４－１、ＩＧＨＶ４－４、ＩＧＨＶ１－３、ＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－２－１、ＩＧＨＶ１－２、ＩＧＨＶ（ＩＩ）－１－１、及びＩＧＨＶ６－１から選択される遺伝子で終わる配列を含む、未改変ヒト配列を含む。いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＶ１－２までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＶ（ＩＩ）－１－１までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＶ－６－１までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。

【0102】

いくつかの実施形態において、動物は、約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、若しくは２７個のヒトＩＧＨＤ遺伝子（例えば、表２に示される遺伝子）を含む。いくつかの実施形態において、動物は、ＩＧＨＤ１－１、ＩＧＨＤ２－２、ＩＧＨＤ３－３、ＩＧＨＤ４－４、ＩＧＨＤ５－５、ＩＧＨＤ４－２３、ＩＧＨＤ５－２４、ＩＧＨＤ６－２５、ＩＧＨＤ１－２６、及びＩＧＨＤ７－２７から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の遺伝子を含む。

【0103】

いくつかの実施形態において、動物は、約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９個のヒトＩＧＨＪ遺伝子（例えば、表３に示される遺伝子）を含む。いくつかの実施形態において、動物は、ＩＧＨＪ１Ｐ、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ２Ｐ、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５、ＩＧＨＪ３Ｐ、及びＩＧＨＪ６から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、動物は、ＩＧＨＤ１－１、ＩＧＨＤ２－２、ＩＧＨＤ３－３、ＩＧＨＤ４－４、ＩＧＨＤ５－５、ＩＧＨＤ４－２３、ＩＧＨＤ５－２４、ＩＧＨＤ６－２５、ＩＧＨＤ１－２６、及びＩＧＨＤ７－２７から選択される遺伝子から始まり、ＩＧＨＪ１Ｐ、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ２Ｐ、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５、ＩＧＨＪ３Ｐ、及びＩＧＨＪ６から選択される遺伝子で終わる配列を含む、未改変ヒト配列を含む。いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＤ１－１からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。

【0105】

いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＤ１－１からヒトＩＧＨＤ７－２７までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。

【0106】

いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＪ１ＰからヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＪ１からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。

【0107】

いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。

【0108】

いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＶ１－２からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＶ（ＩＩ）－１－１からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列は、ヒトＩＧＨＶ６－１からヒトＩＧＨＪ６までのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する。

【0109】

いくつかの実施形態において、動物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の未改変ヒト配列を有し得る。いくつかの実施形態において、未改変ヒト配列の長さは、約又は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００ｋｂである。

【0110】

いくつかの態様では、本開示は、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座に、１つ以上のヒトＩＧＨＶ遺伝子を含む第１の配列、内因性配列を含む第２の配列、及び１つ以上のヒトＩＧＨＤ遺伝子と１つ以上のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む第３の配列を含み、ここで、上記第１の配列、第２の配列、及び第３の配列が作動可能に連結されている、遺伝子改変動物に関する。

【0111】

いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１から選択される約又は少なくとも１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、若しくは１６１個のヒトＩＧＨＶ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表２から選択される約又は少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、若しくは２７個のヒトＩＧＨＤ遺伝子を含む。

【0112】

いくつかの実施形態において、第１の配列は、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来する未改変配列である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、約又は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００ｋｂである。

【0113】

いくつかの実施形態において、第２の配列は、約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｋｂの内因性配列を含む。

【0114】

いくつかの実施形態において、第３の配列は、表２から選択される約又は少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、若しくは２７個のヒトＩＧＨＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第３の配列は、表３から選択される約又は少なくとも５、６、７、８、若しくは９個のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第３の配列は、表２の全てのヒトＩＧＨＤ遺伝子と、表３の全てのヒトＩＧＨＪ遺伝子とを含む。

【0115】

いくつかの実施形態において、動物は、免疫グロブリン重定常μ（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリン重定常δ（ＩＧＨδ）、免疫グロブリン重定常γ３（ＩＧＨＧ３）、免疫グロブリン重定常γ１（ＩＧＨＧ１）、免疫グロブリン重定常γ２ｂ（ＩＧＨＧ２ｂ）、免疫グロブリン重定常γ２ｃ（ＩＧＨＧ２ｃ）、免疫グロブリン重定常ε（ＩＧＨＥ）、及び免疫グロブリン重定常α（ＩＧＨＡ）遺伝子からなる群から選択される１つ以上の内因性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン重定常γ２ａ（ＩＧＨＧ２ａ）はＩＧＨＧ２ｃの位置にある。いくつかの実施形態において、これらの内因性遺伝子は作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、これらの内因性遺伝子は野生型動物と同じ順序を有する。いくつかの実施形態において、動物においてアイソタイプスイッチ（免疫グロブリンクラススイッチ）が発生する可能性がある。

【0116】

いくつかの実施形態において、ＩＧＨＶ遺伝子、ＩＧＨＤ遺伝子、及び／又はＩＧＨＪ遺伝子は、作動可能に連結される。ＶＤＪ組換えは、これらの遺伝子間で起こり得、機能的な抗体を産生し得る。いくつかの実施形態において、これらの遺伝子は、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座の順序と同様の順序で配置される。この配置には様々な利点があり、例えば、これらの遺伝子の配置により、ヒトの重鎖可変ドメインの多様性に非常に類似した多様性を持つ重鎖可変ドメインの産生が可能になる。ＶＤＪ組換え中にいくつかのランダムな配列が配列に挿入される可能性があるため、いくつかの実施形態において、改変なし又は最小限の改変を有する完全なヒト抗体レパートリーにより、ＶＤＪ組換え中に非ヒト配列が挿入される可能性を低減することができる。

【0117】

いくつかの実施形態において、ＩＧＨＶ遺伝子、ＩＧＨＤ遺伝子、及び／又はＩＧＨＪ遺伝子は、ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２ａ、ＩＧＨＧ２ｂ、ＩＧＨＧ２ｃ、ＩＧＨＥ、及びＩＧＨＡ遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子（例えば、全ての遺伝子）に作動可能に連結される。

【0118】

いくつかの実施形態において、動物は、動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座に破壊を含む。いくつかの実施形態において、動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、１つ以上の内因性ＩＧＨＶ遺伝子、１つ以上の内因性ＩＧＨＤ遺伝子、及び１つ以上の内因性ＩＧＨＪ遺伝子の欠失を含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、動物はマウスである。動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、若しくは１８２個のマウスＩＧＨＶ遺伝子（例えば、表４に示される遺伝子）の欠失を含む。いくつかの実施形態において、破壊は、ＩＧＨＶ１－８６、ＩＧＨＶ１－８５、ＩＧＨＶ１－８４、ＩＧＨＶ１－８３、ＩＧＨＶ１－８２、ＩＧＨＶ１－８１、ＩＧＨＶ１－８０、ＩＧＨＶ１－７９、ＩＧＨＶ１－７８、及びＩＧＨＶ１－７７から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＨＶ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、マウスは、ＩＧＨＶ１－８６、ＩＧＨＶ１－８５、ＩＧＨＶ１－８４、ＩＧＨＶ１－８３、ＩＧＨＶ１－８２、ＩＧＨＶ１－８１、ＩＧＨＶ１－８０、ＩＧＨＶ１－７９、ＩＧＨＶ１－７８、及びＩＧＨＶ１－７７（例えば、ＩＧＨＶ１－８６）から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＨＶ遺伝子を依然として含む。

【0120】

いくつかの実施形態において、破壊は、ＩＧＨＶ５－６、ＩＧＨＶ５－５、ＩＧＨＶ２－３、ＩＧＨＶ６－１、ＩＧＨＶ５－４、ＩＧＨＶ５－３、ＩＧＨＶ２－２、ＩＧＨＶ５－２、ＩＧＨＶ２－１、及びＩＧＨＶ５－１から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＨＶ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、マウスは、ＩＧＨＶ５－６、ＩＧＨＶ５－５、ＩＧＨＶ２－３、ＩＧＨＶ６－１、ＩＧＨＶ５－４、ＩＧＨＶ５－３、ＩＧＨＶ２－２、ＩＧＨＶ５－２、ＩＧＨＶ２－１、及びＩＧＨＶ５－１から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＨＶ遺伝子の欠失を依然として含む。

【0121】

いくつかの実施形態において、動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個のマウスＩＧＨＤ遺伝子（例えば、表５に示される遺伝子）の欠失を含む。いくつかの実施形態において、破壊は、ＩＧＨＤ５－１、ＩＧＨＤ３－１、ＩＧＨＤ１－１、ＩＧＨＤ６－１、ＩＧＨＤ２－３、ＩＧＨＤ２－７、ＩＧＨＤ２－８、ＩＧＨＤ５－６、ＩＧＨＤ３－２、及びＩＧＨＤ４－１から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＨＤ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、マウスは、ＩＧＨＤ５－１、ＩＧＨＤ３－１、ＩＧＨＤ１－１、ＩＧＨＤ６－１、ＩＧＨＤ２－３、ＩＧＨＤ２－７、ＩＧＨＤ２－８、ＩＧＨＤ５－６、ＩＧＨＤ３－２、及びＩＧＨＤ４－１から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＨＤ遺伝子を依然として含む。

【0122】

いくつかの実施形態において、破壊は、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、及びＩＧＨＪ４から選択される約又は少なくとも１、２、３、若しくは４個のマウスＩＧＨＪ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、マウスは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、及びＩＧＨＪ４から選択される約又は少なくとも１、２、３、若しくは４個のマウスＩＧＨＪ遺伝子を依然として含む。

【0123】

いくつかの実施形態において、動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、内因性配列の約又は少なくとも５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１０００ｋｂ、１５００ｋｂ、２０００ｋｂ、２５００ｋｂ、若しくは３０００ｋｂの欠失を含む。

【0124】

いくつかの実施形態において、欠失配列は、ＩＧＨＶ１－８６からＩＧＨＪ４まで、ＩＧＨＶ１－８５からＩＧＨＪ４まで、ＩＧＨＶ１－８４からＩＧＨＪ４まで、ＩＧＨＶ１－８３からＩＧＨＪ４まで、又はＩＧＨＶ１－８２からＩＧＨＪ４まで（例えば、ＩＧＨＶ１－８５からＩＧＨＪ４まで）である。

【0125】

いくつかの実施形態において、動物は、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座における配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の配列を含む。いくつかの実施形態において、配列の長さは、約又は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００若しくは３５００ｋｂである。いくつかの実施形態において、配列はヒトＩＧＨＶ（ＩＩＩ）－８２からＩＧＨＶ１－２までである。いくつかの実施形態において、配列はヒトＩＧＨＶ７－８１からＩＧＨＶ１－２までである。いくつかの実施形態において、配列はヒトＩＧＨＶ（ＩＩ）－１－１からＩＧＨＪ６までである。いくつかの実施形態において、配列はヒトＩＧＨＶ６－１からＩＧＨＪ６までである。

【0126】

ヒトＩＧＨＶ遺伝子、ヒトＩＧＨＤ遺伝子、及びヒトＩＧＨＪ遺伝子は作動可能に連結されており、ＶＤＪ再配列を受けることができる。いくつかの実施形態において、改変マウスは完全なヒトＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、及びＩＧＨＪ遺伝子レパートリー（例えば、全ての非擬似ヒトＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、及びＩＧＨＪ遺伝子を含む）を有する。したがって、改変マウスは完全なヒト抗体レパートリーを産生することができる。いくつかの実施形態において、ＶＤＪ組換え後、１つのＩＧＨＶ遺伝子（例えば、ＩＧＨＶ３－２１又はＩＧＨＶ３－７４）が抗体重鎖可変領域をコードする配列に寄与する。１つのＩＧＨＤ遺伝子は、抗体重鎖可変領域をコードする配列に寄与する。そして、１つのＩＧＨＪ遺伝子は、抗体重鎖可変領域をコードする配列に寄与する。いくつかの実施形態において、ＩＧＨＶ遺伝子はＩＧＨＶ３－２１又はＩＧＨＶ３－７４である。

【0127】

いくつかの実施形態において、１つのＩＧＨＶ遺伝子（例えば、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ３－３３、ＩＧＨＶ４－３９、又はＩＧＨＶ４－３４）は、抗体重鎖可変領域をコードする配列に寄与する。１つのＩＧＨＤ遺伝子（例えば、ＩＧＨＤ６－１９）は、抗体重鎖可変領域をコードする配列に寄与する。また、１つのＩＧＨＪ遺伝子（例えば、ＩＧＨＪ４又はＩＧＨＪ６）は、抗体重鎖可変領域をコードする配列に寄与する。

【0128】

さらに、場合によっては、マウスのＩＧＨＶ遺伝子、ＩＧＨＤ遺伝子、及びＩＧＨＪ遺伝子全体（例えば、全ての非擬似遺伝子を含む）がノックアウトされ、重鎖可変領域にはマウス由来の配列によってコードされる配列が含まれなくなり、それによってヒトにおける免疫原性を最小限にする。

【0129】

いくつかの実施形態において、遺伝子座は、約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、若しくは４０個の非ヒト外因性ＩＧＨＶ遺伝子（例えば、ラクダ科動物由来）を有し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子座は、約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、若しくは４０個の非ヒト外因性ＩＧＨＤ遺伝子（例えば、ラクダ科動物由来）を有し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子座は、約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、若しくは４０個の非ヒト外因性ＩＧＨＪ遺伝子（例えば、ラクダ科動物由来）を有し得る。これらの非ヒト外因性遺伝子は、ＶＨＨドメインの多様性を改善するのに役立ち得る。

【0130】

重鎖免疫グロブリン遺伝子座上の様々な改変は、例えば、ＷＯ２０２０１６９０２２Ａ１に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0131】

免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
いくつかの実施形態において、動物は、インタクトなκ鎖及び／又はλ鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する。いくつかの実施形態において、動物は、破壊されたκ鎖及び／又はλ鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する。

【0132】

κ鎖免疫グロブリン遺伝子座（ＩＧＫ又は免疫グロブリンκ遺伝子座とも呼ばれる）は、ヒト抗体（又は免疫グロブリン）の軽鎖の遺伝子を含む染色体（例えば、第６染色体）上の領域である。同様に、免疫グロブリン軽鎖遺伝子はまた、成熟した免疫グロブリン軽鎖核酸（例えば、κ鎖）の産生をもたらす一連の再配列を受けることができる。

【0133】

Ｖセグメント（ＩＧＫＶ遺伝子とも呼ばれる）とＪセグメント（ＩＧＫＪ遺伝子とも呼ばれる）との結合は、軽鎖可変ドメイン全体をコードする連続したエクソン生み出す。再配列されていないＤＮＡでは、Ｖ遺伝子セグメント（又はＩＧＫＶ遺伝子クラスター）はＣ領域から比較的離れた位置にある。Ｊ遺伝子セグメント（又はＩＧＫＪ遺伝子クラスター）はＣ領域の近くに位置する。Ｊ遺伝子セグメントへのＶセグメントの結合はまた、Ｖ遺伝子をＣ領域配列に近づける。再配列されたＶ領域のＪ遺伝子セグメントは、イントロンのみによってＣ領域配列から分離される。完全な免疫グロブリン軽鎖メッセンジャーＲＮＡを作製するために、転写後にＲＮＡスプライシングによってＶ領域エクソンをＣ領域配列に結合する。

【0134】

いくつかの実施形態において、動物は、動物の内因性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座に破壊を含む。いくつかの実施形態において、動物の内因性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、１つ以上の内因性ＩＧＫＶ遺伝子及び１つ以上の内因性ＩＧＫＪ遺伝子の欠失を含む。

【0135】

いくつかの実施形態において、動物はマウスである。動物の内因性κ鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、若しくは１６３個のマウスＩＧＫＶ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、破壊は、ＩＧＫＶ２－１３７、ＩＧＫＶ１－１３６、ＩＧＫＶ１－１３５、ＩＧＫＶ１４－１３４－１、ＩＧＫＶ１７－１３４、ＩＧＫＶ１－１３３、ＩＧＫＶ１－１３２、ＩＧＫＶ１－１３１、ＩＧＫＶ１４－１３０、及びＩＧＫＶ９－１２９から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＫＶ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、マウスは、ＩＧＫＶ２－１３７、ＩＧＫＶ１－１３６、ＩＧＫＶ１－１３５、ＩＧＫＶ１４－１３４－１、ＩＧＫＶ１７－１３４、ＩＧＫＶ１－１３３、ＩＧＫＶ１－１３２、ＩＧＫＶ１－１３１、ＩＧＫＶ１４－１３０、及びＩＧＫＶ９－１２９から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＫＶ遺伝子を依然として含む。

【0136】

いくつかの実施形態において、破壊は、ＩＧＫＶ３－１０、ＩＧＫＶ３－９、ＩＧＫＶ３－８、ＩＧＫＶ３－７、ＩＧＫＶ３－６、ＩＧＫＶ３－５、ＩＧＫＶ３－４、ＩＧＫＶ３－３、ＩＧＫＶ３－２、及びＩＧＫＶ３－１から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＫＶ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、マウスは、ＩＧＫＶ３－１０、ＩＧＫＶ３－９、ＩＧＫＶ３－８、ＩＧＫＶ３－７、ＩＧＫＶ３－６、ＩＧＫＶ３－５、ＩＧＫＶ３－４、ＩＧＫＶ３－３、ＩＧＫＶ３－２、及びＩＧＫＶ３－１から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマウスＩＧＫＶ遺伝子を依然として含む。

【0137】

いくつかの実施形態において、破壊は、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４、及びＩＧＫＪ５から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５個のマウスＩＧＫＪ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、マウスは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４、及びＩＧＫＪ５（例えば、ＩＧＫＪ５）から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５個のマウスＩＧＫＪ遺伝子を依然として含む。

【0138】

いくつかの実施形態において、動物の内因性κ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、内因性配列の約又は少なくとも５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１０００ｋｂ、１５００ｋｂ、２０００ｋｂ、２５００ｋｂ、３０００ｋｂ若しくは３５００ｋｂの欠失を含む。

【0139】

いくつかの実施形態において、削除された配列は、ＩＧＫＶ２－１３７からＩＧＫＪ４まで、ＩＧＫＶ１－１３６からＩＧＫＪ４まで、ＩＧＫＶ１－１３５からＩＧＫＪ４まで、ＩＧＫＶ２－１３７からＩＧＫＪ５まで、ＩＧＫＶ１－１３６からＩＧＫＪ５まで、又はＩＧＫＶ１－１３５からＩＧＫＪ５まで（例えば、ＩＧＫＶ２－１３７からＩＧＫＪ５まで）である。

【0140】

いくつかの実施形態において、動物は、動物の内因性λ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座に破壊を含む。いくつかの実施形態において、動物の内因性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、１つ以上の内因性ＩＧＬＶ遺伝子、１つ以上の内因性ＩＧＬＪ遺伝子、及び／又は１つ以上の免疫グロブリンλ定常（ＩＧＬＣ）遺伝子（例えば、ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、及びＩＧＬＣ４）の欠失を含む。

【0141】

動物の内因性λ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２個のマウスＩＧＬＶ、ＩＧＬＪ、及びＩＧＬＣ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、欠失は、ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、及びＩＧＬＣ４から選択される約又は少なくとも１、２、３、若しくは４個のマウスＩＧＬＣ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、破壊は、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、及びＩＧＬＶ３から選択される約又は少なくとも１、２、若しくは３個のマウスＩＧＬＶ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態において、破壊は、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ３Ｐ、及びＩＧＬＪ４から選択される約又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５個のマウスＩＧＬＪ遺伝子の欠失を含む。

【0142】

いくつかの実施形態において、動物の内因性λ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座における破壊は、約又は少なくとも１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、１５０ｋｂ、１６０ｋｂ、１７０ｋｂ、１８０ｋｂ、１９０ｋｂ、２００ｋｂ、２１０ｋｂ、２２０ｋｂ、２３０ｋｂ、２４０ｋｂ、２５０ｋｂ、２６０ｋｂ、２７０ｋｂ、２８０ｋｂ、２９０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、５００ｋｂ、若しくは１０００ｋｂのヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態において、動物の内因性λ軽鎖免疫グロブリン遺伝子に破壊はない。

【0143】

いくつかの実施形態において、削除された配列は、ＩＧＬＶ２からＩＧＬＣ１まで、ＩＧＬＶ３からＩＧＬＣ１まで、又はＩＧＬＪ２からＩＧＬＣ１までである。

【0144】

軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の様々な改変は、例えば、ＷＯ２０２０１６９０２２Ａ１に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0145】

遺伝子改変動物
本出願は、重鎖のみの抗体、即ち軽鎖を欠く抗体を産生する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、軽鎖を含むＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）分子を産生しない。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、いかなる従来のＩｇＧ分子、即ち、２つの重鎖と２つの軽鎖を有するＩｇＧ抗体を産生しない。

【0146】

いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に機能的な内因性軽鎖遺伝子座を有する。いくつかの実施形態において、動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、完全に機能的ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、及び／又はＩＧＨＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、動物のゲノムは、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内に外因性配列（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子）を含まない。

【0147】

いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性ＩＧＨＧ遺伝子（例えば、ＩＧＨＧ１遺伝子）のＣＨ１エクソンを欠いている。いくつかの実施形態において、動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、ＩＧＨＧ１遺伝子の完全に機能的なＨ、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１、及び／又はＭ２エクソンを含む。

【0148】

いくつかの実施形態において、動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性ＩＧＨＧ１遺伝子のＣＨ１エクソンにのみ組換えを有する。いくつかの実施形態において、改変は、ＩｇＧ１のヒンジ領域をコードする遺伝子の欠失又は機能喪失変異などの変異を含まない。いくつかの実施形態において、改変は、ＩＧＨＧ１遺伝子のＣＨ２又はＣＨ３エクソンに対する欠失又は機能喪失変異などの変異を含まない。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、ＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１エクソンに変異又は組換えを有していない。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、内因性ＩＧＨＭ遺伝子座にＩｇＭのＣＨ１ドメインをコードする機能遺伝子セグメントを有する。

【0149】

いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び／又はＩｇＡなどの他の重鎖定常アイソタイプをコードする完全に機能的な遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に機能的ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ及び／又はＩＧＨＡ遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、野生型ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、及び／又はＩＧＨＡ遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、及び／又はＩＧＨＡ遺伝子に対するいかなる変異も含まない。いくつかの実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、インタクトな内因性ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、又はＩＧＨＡ遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、野生型ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び／又はＩｇＡタンパク質を発現する。

【0150】

いくつかの実施形態において、免疫グロブリン重鎖遺伝子座には、ＩＧＨＭ及び／又はＩＧＨδ遺伝子のＣＨ１エクソンへの変異（例えば、欠失）又は組換えが含まれる。いくつかの実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、改変ＩＧＨＭ遺伝子及び／又は改変ＩＧＨδ遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、野生型ＩｇＭ及び／又はＩｇＤを発現しない。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＭ及び／又はＣＨ１ドメインを欠くＩｇＤを発現する。

【0151】

いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物における内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座への改変の導入により、実質的に正常なＢ細胞の発達及び成熟を含む、動物の健康が維持される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物における内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座への改変の導入により、外因性配列の免疫原性が低減又は回避される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物における内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座への最小限の変化の導入により、Ｖ－Ｄ－Ｊ組換え、クラススイッチ組換え、及び体細胞超変異を含む、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の正常な機能が維持される。

【0152】

いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、１つ以上の完全に機能的な軽鎖遺伝子座、例えば、λ軽鎖遺伝子座、及び／又はκ軽鎖遺伝子座を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、変化していない内因性軽鎖遺伝子座を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物の内因性軽鎖遺伝子座に変異は導入されない。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物のλ及び／又はκ軽鎖可変領域遺伝子座は機能的であり、サイレンシングされていない。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、野生型λ軽鎖及び／又は野生型κ軽鎖を発現する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、軽鎖を含む機能的ＩｇＭ分子を発現する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、軽鎖を含む機能的ＩｇＡ、ＩｇＤ、及び／又はＩｇＭ分子を発現する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、外因性軽鎖遺伝子又は遺伝子クラスターを有していない。例えば、遺伝子改変非ヒト動物のλ及び／又はκ軽鎖可変領域遺伝子座をノックアウトすることができる。

【0153】

いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、再配列された遺伝子（例えば、再配列されたＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、及び／又はＩＧＨＪ遺伝子）を含まない。いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、再配列されていないヒトＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、及びＩＧＨＪ遺伝子の完全なセットを含む。

【0154】

いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性ＩＧＨＧ１遺伝子のＣＨ１エクソンの直後に機能的なスプライス部位を含む。いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性ＩＧＨＧ１遺伝子のＣＨ１エクソンの直後に野生型スプライス部位を含む。

【0155】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される動物は、ＣＨ１ドメインを欠く膜結合ＩｇＧ１を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される動物は、ＣＨ１ドメインを欠く可溶性ＩｇＧ１を発現する。

【0156】

一態様では、本開示は、ヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態において、動物は、１つ以上のヒトＩＧＨＶ遺伝子、１つ以上のヒトＩＧＨＤ遺伝子、及び／又は１つ以上のヒトＩＧＨＪ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、これらの遺伝子は内因性免疫グロブリン遺伝子座にある。

【0157】

いくつかの実施形態において、動物は内因性κ鎖又はλ鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、動物は内因性κ鎖又はλ鎖免疫グロブリン遺伝子座を含まない。いくつかの実施形態において、動物は、動物の内因性κ又はλ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座に破壊を含む。いくつかの実施形態において、動物は、動物の内因性κ又はλ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座に破壊を有していない。

【0158】

遺伝子改変非ヒト動物は、様々な動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ科の動物（例えば、ウシ、雄牛、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）であることができる。好適な、遺伝子改変可能な胚性幹（ＥＳ）細胞が速やかに入手できない非ヒト動物に関しては、他の方法を用いて、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞又は人工多能性細胞）を改変し、核移植を用いて改変ゲノムを好適な細胞、例えば卵母細胞に移すこと、及び、好適な条件下で、非ヒト動物にて改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を妊娠させて胚を形成することが挙げられる。これらの方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ａ．Ｎａｇｙ，ｅｔ ａｌ．， “Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００３に記載されており、本明細書中に、その全体が参照により組み込まれている。したがって、様々な実施形態において、ヒトＶ、Ｄ、及び／又はＪセグメントは、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター）の定常領域遺伝子配列に作動可能に連結することができる。Ｂ細胞の発達中に、これらの再配列されたヒトＶ、Ｄ、及び／又はＪセグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン定常領域に連結される。

【0159】

一態様では、動物は哺乳動物、例えば、トビネズミ上科又はネズミ上科のスーパーファミリーである。いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物はげっ歯類である。げっ歯類は、マウス、ラット、及びハムスターから選択することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科（例えば、カンガルーハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、野ネズミ）、ネズミ科（トゥルーマウス及びラット、アレチネズミ、トゲマウス、クレステッドラット）、アシナガマウス科（クライミングマウス、ロックマウス、オジロネズミ、マラガシーラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、並びに、メクラネズミ類（例えば、モグラネズミ、タケネズミ、及びゾコール）から選択されるファミリーに由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変げっ歯類は、トゥルーマウス又はラット（ネズミ科ファミリー）、アレチネズミ、トゲマウス、及びクレステッドラットから選択される。いくつかの実施形態において、非ヒト動物はマウスである。

【0160】

いくつかの実施形態において、動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ株のマウスである。いくつかの実施形態において、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である株からなる群から選択される１２９株である。これらのマウスは、例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６（１９９９）；Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２９／ＳｖＥｖ－ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ（２０００）に記載されており、これらは共に、その全体が、参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態において、遺伝子改変マウスは、１２９株とＣ５７ＢＬ／６株とのミックスである。いくつかの実施形態において、マウスは、１２９株のミックス、又は、ＢＬ／６株のミックスである。いくつかの実施形態において、マウスは、ＢＡＬＢ株、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ株である。いくつかの実施形態において、マウスは、ＢＡＬＢ株と別の株とのミックスである。いくつかの実施形態において、マウスは、ハイブリッド株（例えば、５０％のＢＡＬＢ／ｃ－５０％の１２９５４／Ｓｖ；又は、５０％のＣ５７ＢＬ／６－５０％の１２９）に由来する。いくつかの実施形態において、非ヒト動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態において、非ヒト動物は、ＢＡＬＢ／ｃ、Ａ、Ａ／Ｈｅ、Ａ／Ｊ、Ａ／ＷｙＳＮ、ＡＫＲ、ＡＫＲ／Ａ、ＡＫＲ／Ｊ、ＡＫＲ／Ｎ、ＴＡ１、ＴＡ２、ＲＦ、ＳＷＲ、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＲ、ＳＪＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ／２、ＫＭ、ＮＩＨ、ＩＣＲ、ＣＦＷ、ＦＡＣＡ、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、 Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ（Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａ）、Ｃ５８、ＣＢＡ／Ｂｒ、ＣＢＡ／Ｃａ、ＣＢＡ／Ｊ、ＣＢＡ／ｓｔ、又はＣＢＡ／Ｈバックグラウンドを有するマウスである。

【0161】

異なる動物は、それらの内因性免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座において異なる生殖細胞系組織と遺伝子を有する。多くの種のＩｇＨ遺伝子座が配列決定されている。マウス、ラット、ウサギのＩｇＨ遺伝子座の遺伝子位置及びエクソン／イントロン構成は、例えば、ＩＭＧＴレパートリー及びＮＣＢＩデータベースに見出すことができ、これらは全体として参照により本明細書に組み込まれている。

【0162】

いくつかの実施形態において、動物はラットである。ラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ株、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ株、フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）株、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択することができる。いくつかの実施形態において、ラット株は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の株のミックスである。

【0163】

動物は、ヒト化動物が作製される特定目的に好適な、１つ以上の他の遺伝子改変、及び／又は他の改変を有することができる。

【0164】

内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座の改変を含む遺伝子改変非ヒト動物。いくつかの実施形態において、改変は、ヒトタンパク質の少なくとも一部をコードするヒト核酸配列（例えば、ヒト重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である）を含むことができる。本明細書に記載される改変を含むことができる遺伝子改変細胞（例えば、ＥＳ細胞、体細胞）もまた提供するが、多くの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、動物の生殖細胞系における、内因性遺伝子座の改変を含む。

【0165】

遺伝子改変動物は、内因性マウス遺伝子座からヒト化抗体及び／又はキメラ抗体を発現することができ、ここで、１つ以上の内因性マウス免疫グロブリン遺伝子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子、及び／又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＫＶ及び／又はＩＧＫＪ遺伝子）と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列で置き換えられる。様々な実施形態において、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト核酸配列を含むように全体的又は部分的に改変される。

【0166】

上述の非ヒト哺乳動物の遺伝、分子、及び挙動分析を実施することができる。本開示は、同一又は他の遺伝子型と交配された、本開示で提供される非ヒト哺乳動物により産生される子孫にもまた関する。非ヒト哺乳動物は、当該技術分野において周知の任意の非ヒト動物であることができ、これを、本明細書に記載される方法で使用することができる。好ましい非ヒト哺乳動物は哺乳類（例えば、げっ歯類）である。いくつかの実施形態において、非ヒト哺乳動物はマウスである。

【0167】

本開示は、非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来する、細胞株又は初代細胞培養物もまた提供する。細胞培養に基づくモデルは、例えば、以下の方法により調製することができる。細胞培養物は、非ヒト哺乳動物からの単離によって入手することができ、或いは、細胞は、同じコンストラクト、及び標準的な細胞トランスフェクション技術を用いて確立された細胞培養物から入手することができる。ヒト又はヒト化免疫グロブリンをコードするＤＮＡ配列を含有する遺伝子コンストラクトの組込みは、様々な方法で検出することができる。

【0168】

（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）又はサザンブロッティング、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いる、ｍＲＮＡ定量化アプローチを含む）核酸レベルでの方法、並びに、（組織化学、イムノブロット分析、及びインビトロ結合研究を含む）タンパク質レベルでの方法を含む、外来性ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ上の改変を検出するために使用可能な多くの分析法が存在する。さらに、対象となる遺伝子の発現レベルを、当業者に周知のＥＬＩＳＡ技術により定量化することができる。多くの標準的な分析法を用いて定量的測定を完了することができる。例えば、ＲＮａｓｅ保護、サザンブロット分析、ＲＮＡドット分析（ＲＮＡｄｏｔ分析）を含む、ＲＴ－ＰＣＲ及びハイブリダイゼーション法を用いて、転写レベルを測定することができる。免疫組織化学染色、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット分析もまた用いて、ヒト又はヒト化タンパク質の存在を評価することができる。

【0169】

抗体及び抗原結合断片
本開示は、本明細書に記載される方法によって産生される抗体及びその抗原結合断片（例えば、重鎖抗体、ヒト化重鎖抗体、又は多重特異性抗体）を提供する。

【0170】

一般に、従来の抗体は、２種類のポリペプチド鎖、軽鎖及び重鎖で構成されている。本開示の非限定的な抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む、インタクトな４つの免疫グロブリン鎖抗体であることができる。抗体の重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、若しくはＩｇＤを含む任意のアイソタイプ、又は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２などを含むサブクラスであることができる。軽鎖は、κ軽鎖又はλ軽鎖であることができる。抗体は、２つの同一のコピーの軽鎖、及び、２つの同一のコピーの重鎖を含むことができる。それぞれが、１つの可変ドメイン（又は、可変領域、ＶＨ）、及び、複数の定常ドメイン（又は、定常領域）を含有する重鎖は、それらの定常ドメイン内で、ジスルフィド結合を介して互いに結合し、抗体の「幹」を形成する。それぞれが、１つの可変ドメイン（又は、可変領域、ＶＬ）、及び、１つの定常ドメイン（又は、定常領域）を含有する軽鎖は、それぞれ、ジスルフィド結合を介して、１つの重鎖に結合する。各軽鎖の可変領域を、それが結合する重鎖の可変領域とアラインする。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）どうしの間に挟まされた、３つの超可変領域を含有する。

【0171】

相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる超可変領域は、抗体の原理抗原結合表面を含むループを形成する。４つのフレームワーク領域は、βシート構造にほとんど適応し、ＣＤＲは、連結するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲはフレームワーク領域に近接して保持され、かつ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗原結合領域の形成に寄与している。

【0172】

抗体のアミノ酸配列を分析することにより、抗体のＣＤＲ領域を識別する方法は周知であり、いくつかのＣＤＲの定義が、一般的に用いられる。Ｋａｂａｔの定義は配列の変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づく。これらの方法及び定義は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ， “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ，” Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００１．４２２－４３９；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ，ｅｔ ａｌ． “Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｋａｂａｔ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｃｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ，” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５．１４（２００８）：３８３２－３８３９；Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（１９７０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１－２５０；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１－５３（１９９１）；Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．６８（１－３）：９－１６（Ｏｃｔ．１９９７）；Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２７５（２）：２６９－９４（Ｊａｎ．１９９８）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２５２）：８７７－８３（Ｄｅｃ．１９８９）；Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：６４（２００７）、に記載されており、これらそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。

【0173】

ＣＤＲは、抗原のエピトープを認識するのに重要である。本明細書で使用される場合、「エピトープ」とは、抗体の抗原結合ドメインにより、特異的に結合されることが可能な、標的分子の最小部分である。エピトープの最小サイズは、約３、４、５、６、又は７個のアミノ酸であり得るが、エピトープは、抗原の二次及び三次構造に基づいて、抗原の３次元構造に依存し得るため、これらのアミノ酸は、抗原の一次構造の、連続した直鎖状配列にある必要はない。

【0174】

いくつかの実施形態において、抗体は、インタクトな免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）である。ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）は、高度に保存されており、その定常領域、特に、ヒンジ及び上部ＣＨ２ドメインが異なっている。ＩｇＧサブクラスの配列及び違いは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ， “ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（２０１４）；Ｉｒａｎｉ，ｅｔ ａｌ． “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７．２（２０１５）：１７１－１８２；Ｓｈａｋｉｂ，Ｆａｒｏｕｋ，ｅｄ．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１６、に記載されており、これらそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。重鎖抗体の重鎖定常領域は、本明細書に記載される任意の免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）に由来することができる。

【0175】

抗体はまた、任意の種（例えば、ヒト、げっ歯類、マウス、ラット、ラクダ科動物）に由来する免疫グロブリン分子であることもできる。本明細書で開示される抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多重特異性抗体、及び、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合断片」という用語は、インタクトな抗体の特異的結合活性を保持する抗体の一部、即ち、インタクトな抗体の標的分子上のエピトープに特異的に結合可能な抗体の、任意の部分である。これは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びこれらの断片の変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異性抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、抗体断片から形成される多重特異性抗体、及び、抗体結合ドメインである結合ドメイン、又はこれと相同である結合ドメインを含む、任意のポリペプチドであってもよい。抗原結合ドメインの非限定例としては、例えば、インタクトな抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖ＣＤＲ、インタクトな抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域、インタクトな抗体の全長重鎖若しくは軽鎖、又は、インタクトな抗体の重鎖若しくは軽鎖のいずれかに由来する個別のＣＤＲが挙げられる。

【0176】

いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部を形成することができる。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、ＣＤ３－ζ膜貫通ドメイン及びエンドドメインに融合した、本明細書に記載されるＶＨＨの融合体である。

【0177】

本明細書に記載される方法によって産生される抗体及びその抗原結合断片（例えば、ヒト化抗体又はキメラ抗体）には、様々な利点がある。いくつかの実施形態において、所望の特性（例えば、結合親和性、熱安定性、及び／又は制限された凝集）を得るためにさらなる最適化は必要とされない。

【0178】

いくつかの実施形態において、抗体（又はその抗原結合断片）は、０．１ｓ^－１未満、０．０１ｓ^－１未満、０．００１ｓ^－１未満、０．０００１ｓ^－１未満、又は０．００００１ｓ^－１未満の解離速度（ｋｏｆｆ）で標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、解離速度（ｋｏｆｆ）は、０．０１ｓ^－１超、０．００１ｓ^－１超、０．０００１ｓ^－１超、０．００００１ｓ^－１超、又は、０．０００００１ｓ^－１超である。

【0179】

いくつかの実施形態において、動力学的会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０^２／Ｍｓ超、１×１０^３／Ｍｓ超、１×１０^４／Ｍｓ超、１×１０^５／Ｍｓ超、又は、１×１０^６／Ｍｓ超である。いくつかの実施形態において、動力学的会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０^５／Ｍｓ未満、１×１０^６／Ｍｓ未満、又は、１×１０^７／Ｍｓ未満である。

【0180】

親和性を、動力学的速度定数の商から推定することができる（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。いくつかの実施形態において、ＫＤは、１×１０^－６Ｍ未満、１×１０^－７Ｍ未満、１×１０^－８Ｍ未満、１×１０^－９Ｍ未満、又は、１×１０^－１０Ｍ未満である。いくつかの実施形態において、ＫＤは、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、又は１ｎＭ未満である。いくつかの実施形態において、ＫＤは、１×１０^－７Ｍ超、１×１０^－８Ｍ超、１×１０^－９Ｍ超、１×１０^－１０Ｍ超、１×１０^－１１Ｍ超、又は１×１０^－１２Ｍ超である。いくつかの実施形態において、抗体は、約０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、又は０．１ｎＭ以下のＫＤで標的に結合する。

【0181】

いくつかの実施形態において、熱安定性が測定される。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５℃を超えるＴｍを有し得る。

【0182】

様々な実施形態において、置換は、変異重鎖抗体を作製するために親重鎖抗体配列に対して行われる。一般に、親重鎖抗体の重鎖抗体変異体は、特定の抗原に対する親重鎖抗体の結合親和性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％（例えば、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、又は最大で少なくとも１０，０００％）の抗原結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、変異重鎖抗体は、親重鎖抗体と比較して単一の置換を含む。しかし、他の実施形態において、特定の位置で同一性を共有する他のヒト重鎖配列に由来する親重鎖抗体配列と比較して、いくつかのアミノ酸、例えば最大約５個又は１０個以上が置換される。様々な実施形態において、得られた変異重鎖抗体を試験して、所望の結合親和性及び／又は特異性が置換残基によって著しく低下していないことを確認する。いくつかの実施形態において、改良された変異重鎖抗体は、異なるヒト重鎖配列からのアミノ酸の置換によって産生される。様々な実施形態において、ＶＨＨは、親ＶＨＨと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。

【0183】

本明細書に記載されるＶＨＨは、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を作製するために使用できる。一態様では、本開示は、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分を含む多重特異性抗体を提供する。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ここで、上記ＶＨ及びＶＬは一緒になって、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部分は、第１のエピトープに特異的に結合するＶＨＨを含む。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合部分は、第２のエピトープに特異的に結合するＶＨＨを含む。いくつかの実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープは同じ抗原からのものである。いくつかの実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープは異なる抗原からのものである。

【0184】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部分は、２つの重鎖と２つの軽鎖からなる全長抗体である。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む抗体断片である。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合部分は単一のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合部分のＣ末端は、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合部分のＣ末端は、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合部分のＮ末端は、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合部分のＮ末端は、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合部分は、ＣＨ１ドメインに融合された第１のＶＨＨを含む第１のポリペプチド鎖と、ＣＬドメインに融合された第２のＶＨＨを含む第２のポリペプチド鎖とを含むＦａｂ様ドメインである。

【0185】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は三重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、三重特異性抗体は三重特異性ＶＨＨ－Ｆｃである。いくつかの実施形態において、三重特異性抗体は同じＶＨＨを含む。いくつかの実施形態において、三重特異性抗体は異なるＶＨＨを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは異なるエピトープに結合する。

【0186】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、４つ以上のＶＨＨを有する。いくつかの実施形態において、開発可能性を高めるために、ＩｇＧ Ｆｃドメインを追加せずに少なくとも４つのＶＨＨを組み合わせて、テトラ特異性ＶＨＨを構築する。これらの分子は、Ｆｃエフェクター機能が欠けているにもかかわらず、二重特異性及び三重特異性ＶＨＨ－Ｆｃと比較して、抗原に対する親和性と結合力が向上するという追加の利点がある。

【0187】

いくつかの実施形態において、これらの抗体又はその抗原結合断片（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０個超を含む）は、機能的Ｆｃを有する。

【0188】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物によって産生される重鎖抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨＨドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３の長さは６～２３であり、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３である。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３の長さは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３である。

【0189】

遺伝子改変動物の作製方法
遺伝子改変動物は、免疫グロブリン遺伝子座を改変することによって作製することができる。図６～１２は、それぞれターゲティングベクターＶ１～Ｖ７を使用した遺伝子改変のワークフローを示す。図２０は、ヒト化動物の作製方法を示す。いくつかの実施形態において、方法は、まず、ヒト染色体上のヒト免疫グロブリン遺伝子座を改変することを含む。次に、改変ヒト染色体をマウス受容細胞に導入する。次に、ヒト免疫グロブリン可変領域を、直接置換によってマウスゲノムの対応する領域に導入する。次に、受容細胞をスクリーニングする。いくつかの実施形態において、細胞にはヒト染色体が含まれない。その後、細胞を胚盤胞に注入してキメラマウスを作製する。その後の繁殖を実施して、インタクトなヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むマウスを得ることができる。

【0190】

遺伝子改変動物の作製には、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え（ＨＲ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化規則的間隔の短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムなどを含む、他のいくつかの技術も使用できる。いくつかの実施形態において、相同組換えを用いる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を用いて遺伝子改変動物を生成する。これらのゲノム編集技術の多くは当該技術分野において周知であり、例えば、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １６．６（２０１７）：３８７－３９９に記載されており、その全体が参照により組み込まれている。多くの他の方法もまた提供し、これらを、ゲノム編集、例えば、遺伝子改変核の、除核した卵母細胞へのマイクロインジェクション、及び、除核した卵母細胞の、別の遺伝子改変細胞との融合で用いることができる。

【0191】

遺伝子改変プロセスには、相同組換えによって内因性配列をヒト配列で置き換えることが含まれる場合がある。いくつかの実施形態において、（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、又はＣＲＩＳＰＲにより）標的部位の上流及び下流において切断を行うことで、ＤＮＡ二本鎖の破壊をもたらすことができ、相同組換えを用いて、内因性配列をヒト配列で置き換える。

【0192】

いくつかの実施形態において、ＩＧＨＧ遺伝子内のＣＨ１配列を削除する方法は、以下の方法の１つ又は組み合わせを含む。これらの改変は様々な細胞で実行できる。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞、胚性幹細胞、又は受精卵細胞である。

【0193】

いくつかの実施形態において、Ｓγ３スイッチ領域からＣεまでの配列がノックアウトされ、その後、Ｓγ１スイッチ領域とＣＨ１のないＣγ１配列（略してＣγ１ΔＣＨ１）とを含む配列が挿入される。その結果、Ｃγ１ΔＣＨ１はＳγ１と作動可能に連結される。

【0194】

いくつかの実施形態において、Ｓγ１スイッチ領域とＣＨ１のないＣγ１配列（略してＣγ１ΔＣＨ１）とを含む配列を使用して、Ｓγ３スイッチ領域からＣεまでの全ての配列を直接置き換える（図６）。その結果、Ｃγ１ΔＣＨ１はＳγ１と作動可能に連結される。

【0195】

いくつかの実施形態において、まずＳγ３スイッチ領域及びＣγ３配列がノックアウトされ、次にＣＨ１のないＣγ１配列（Ｃγ１ΔＣＨ１と略記）を使用してＣγ１からＣεまでの全ての配列を置き換える。その結果、Ｃγ１ΔＣＨ１はＳγ１と作動可能に連結される。

【0196】

いくつかの実施形態において、ＣＨ１のないＣγ１配列（Ｃγ１ΔＣＨ１と略記）を使用して、Ｃγ３からＣεまでの全ての配列を直接置き換える（図７）。その結果、Ｃγ１ΔＣＨ１はＳγ３と作動可能に連結される。

【0197】

いくつかの実施形態において、図６に示される対立遺伝子に基づいて、Ｃμ及びＣδを含む配列がノックアウトされる（図８）。その結果、ＩＧＨＭ遺伝子とＩＧＨδ遺伝子の両方がノックアウトされ、Ｃγ１ΔＣＨ１がＳγ１と作動可能に連結される。

【0198】

いくつかの実施形態において、図６に示される対立遺伝子に基づいて、Ｃμ、Ｃδ、及びＳγ１を含む配列がノックアウトされる（図９）。その結果、ＩＧＨＭ遺伝子とＩＧＨδ遺伝子の両方がノックアウトされ、Ｃγ１ΔＣＨ１’がＳμと作動可能に連結される。

【0199】

いくつかの実施形態において、図６に示される対立遺伝子に基づいて、ＣμのＣＨ１コード領域がノックアウトされる（図１０）。その結果、改変遺伝子座には、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ１をコードする配列が含まれる。さらに、Ｃγ１ΔＣＨ１はＳγ１と作動可能に連結される。

【0200】

いくつかの実施形態において、図６に示される対立遺伝子に基づいて、ＣＨ１コード領域のないＣμ配列（ＣμΔＣＨ１と略記）を使用して、Ｃμ及びＣδを含む配列を直接置き換える（図１１）。その結果、改変遺伝子座には、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＭと、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ１をコードする配列が含まれる。さらに、Ｃγ１ΔＣＨ１はＳγ１と作動可能に連結される。

【0201】

いくつかの実施形態において、図６に示される対立遺伝子に基づいて、ＣμΔＣＨ１とＣＨ１コード領域のないＣδ（ＣδΔＣＨ１と略記）とを含む配列を使用して、Ｃμ及びＣδを含む配列を直接置き換える（図１２）。その結果、改変遺伝子座には、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＭ、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＤ、及びＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ１をコードする配列が含まれる。さらに、Ｃγ１ΔＣＨ１はＳγ１と作動可能に連結される。

【0202】

いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、改変免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座は、Ｃγ１ΔＣＨ１、Ｃγ１ΔＣＨ１’、ＣμΔＣＨ１、又はＣδΔＣＨ１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｃγ１ΔＣＨ１’の配列は、Ｃγ１ΔＣＨ１（配列番号１）の配列の５’末端に少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも４個のヌクレオチドの欠失を含む。

【0203】

本開示はまた、核酸配列を含む遺伝子改変非ヒト動物に関し、ここで、上記核酸配列は以下からなる群から選択することができる：
ａ）配列番号１、８、９、１０、１３、又は４１に示される核酸配列；
ｂ）低ストリンジェンシー条件、又は厳密なストリンジェンシーの条件下で、配列番号１、８、９、１０、１３、又は４１に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる核酸配列；
ｃ）配列番号１、８、９、１０、１３、又は４１に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の相同性を有するか、又は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である核酸配列；及び
ｄ）アミノ酸配列をコードする核酸配列であって、ここで、上記アミノ酸配列が内因性ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡのアミノ酸配列と、少なくとも９０％の相同性を有するか、又は少なくとも９０％同一である核酸配列。

【0204】

この方法はさらに、遺伝子改変細胞を、レシピエントであるメス非ヒト哺乳動物の卵管又は子宮に移植し、メス非ヒト哺乳動物の子宮内で細胞を成長させるようにすることを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変遺伝子の子孫における生殖細胞系伝達を識別するための実験が実行される。

【0205】

いくつかの実施形態において、遺伝子改変されたヒト化動物を作製する方法には、内因性遺伝子座（又は部位）で核酸（例えば、Ｖ、Ｄ、Ｊ領域、又はＶ、Ｊ領域）をヒト配列の対応する領域で置き換えるステップも含まれる場合がある。配列には、ＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＫＶ、及び／又はＩＧＫＪ遺伝子の領域（例えば、一部又は全体の領域）が含まれる場合がある。いくつかの実施形態において、置換は相同組換えによって媒介される。いくつかの実施形態において、置換はＣｒｅリコンビナーゼによって媒介される。

【0206】

５’末端相同アーム及び／又は３’末端相同アームは、相同組換えを容易にするために所望の長さを有することができる。いくつかの実施形態において、相同アームは、約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、若しくは５０ｋｂ（例えば、約３ｋｂ）である。いくつかの実施形態において、相同アームは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、又は５０ｋｂ未満である。

【0207】

いくつかの実施形態において、ベクターには、必要に応じて、レポータータンパク質、例えば、ルシフェラーゼ（例えば、Ｇｌｕｃ）又は蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、ＢＦＰなど）も含まれ得る。

【0208】

これらの改変は様々な細胞で実行できる。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞、胚性幹細胞、又は受精卵細胞である。

【0209】

本開示は、
（ａ）本明細書に記載される方法に基づき、細胞（例えば、受精卵細胞）を提供するステップと、
（ｂ）液体培地内で細胞を培養するステップと、
（ｃ）培養した細胞を、レシピエントであるメス非ヒト哺乳動物の卵管又は子宮に移植し、メス非ヒト哺乳動物の子宮内で細胞を成長させるようにするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）における妊娠したメスの、子孫の遺伝子改変ヒト化非ヒト哺乳動物において生殖細胞系伝達を同定するステップと、
を含む、ヒト化動物モデルを確立するための方法をさらに提供する。

【0210】

いくつかの実施形態において、前述の方法における非ヒト哺乳動物はマウス（例えば、Ｃ５７マウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、又はＣ５７ＢＬ／６マウス）である。

【0211】

いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）における非ヒト哺乳動物は、偽妊娠（又は想像妊娠）したメスである。

【0212】

いくつかの実施形態において、上述の方法のための受精卵は、Ｃ５７ＢＬ／６受精卵である。本明細書に記載される方法で用いることができる他の受精卵としては、ＦＶＢ／Ｎ受精卵、ＢＡＬＢ／ｃ受精卵、ＤＢＡ／１受精卵、及びＤＢＡ／２受精卵が挙げられるが、これらに限定されない。

【0213】

受精卵は、任意の非ヒト動物、例えば、本明細書に記載される任意の非ヒト動物に由来することができる。いくつかの実施形態において、受精卵細胞はげっ歯類に由来する。遺伝子コンストラクトを、ＤＮＡのマイクロインジェクションにより受精卵に導入することができる。例えば、マイクロインジェクション後に受精卵を培養することで、培養受精卵を偽妊娠非ヒト動物に移し、この後非ヒト哺乳動物が生まれることで、上述の方法で言及した非ヒト哺乳動物を生成することができる。

【0214】

本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む細胞、組織、及び動物（例えば、マウス）、加えて、内因性非ヒト遺伝子座由来のヒト化又はキメラ抗体を発現する細胞、組織、及び動物（例えば、マウス）もまた、提供される。

【0215】

本開示は、様々なターゲティングベクター（例えば、遺伝子改変動物を作製するために有用なベクター）もまた提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、ａ）変更される領域の５’末端に相同なＤＮＡ断片（５’相同アーム）、ｂ）所望の遺伝要素（例えば、ＬｏｘＰ認識部位、薬剤耐性遺伝子、及び／又はレポーター遺伝子など）を含む配列、及びｃ）変更される領域の３’末端に相同な第２のＤＮＡ断片（３’相同アーム）、を含むことができる。本開示はまた、本明細書に記載されるターゲティングベクターを含む細胞に関する。

【0216】

いくつかの実施形態において、細胞内の遺伝子はヘテロ接合性である。いくつかの実施形態において、細胞内の遺伝子はホモ接合性である。

【0217】

いくつかの実施形態において、非ヒト哺乳動物細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は受精卵細胞である。

【0218】

本開示は、本明細書に記載される任意のヌクレオチド配列と、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である核酸配列、及び、本明細書に記載される任意のアミノ酸配列と、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列もまた提供する。

【0219】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される任意のペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は、本明細書に記載される任意のヌクレオチド配列によりコードされる任意のアミノ酸配列に関する。いくつかの実施形態において、核酸配列は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、又は６００ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００アミノ酸残基未満である。

【0220】

いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、（ｉ）アミノ酸配列を含み；又は、（ｉｉ）アミノ酸配列からなり、ここで、上記アミノ酸配列は、本明細書に記載される配列のいずれか１つである。

【0221】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、（ｉ）核酸配列を含み；又は、（ｉｉ）核酸配列からなり、ここで、上記核酸配列は、本明細書に記載される配列のいずれか１つである。

【0222】

２つのアミノ酸配列、又は、２つの核酸配列の同一性パーセントを測定するために、最適に比較するために配列をアライメントする（例えば、比較するために、最適にアライメントするように第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の１つ又は両方にギャップを導入してもよく、非相同配列を無視してもよい）。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同じものによって占められている場合、分子はその位置で同一であるとする（本明細書で使用されるように、アミノ酸又は核酸の「同一性」はアミノ酸又は核酸の「相同性」に相当する）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最適にアライメントするために導入される必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列に共有される同一の位置の数の関数である。例示の目的で、２つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの測定は、適切な場合、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及び、フレームシフトギャップペナルティ５の、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを用いて実施することができる。

【0223】

同様の物理化学的特性（相同性パーセント）が保存されている残基、例えば、ロイシン及びイソロイシンの割合もまた使用して、配列類似性を測定することができる。同様の物理化学的特性を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。多くの場合、相同性割合は、同一性割合よりも高くなる。したがって、本開示は、本明細書に記載される任意のアミノ酸配列に対して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列をコードする核酸もまた提供する。

【0224】

遺伝子改変動物の使用方法
遺伝子改変動物は、標的に特異的に結合できる重鎖抗体を生成するために使用できる。いくつかの実施形態において、標的（例えば、タンパク質又はタンパク質の断片）を免疫原として使用し、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を使用してこれらの動物で抗体を生成することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、動物が抗原に特異的な抗体を産生することを可能にする時間及び条件下で、選択された抗原に曝露される。

【0225】

ポリクローナル抗体は、抗原ペプチド又はタンパク質を複数回注射（例えば、皮下又は腹腔内注射）することにより、動物で生じさせることができる。いくつかの実施形態において、抗原ペプチド又はタンパク質は、少なくとも１つのアジュバントと共に注射される。いくつかの実施形態において、抗原ペプチド又はタンパク質は、免疫化される種において免疫原性である薬剤とコンジュゲートすることができる。動物には、抗原ペプチド又はタンパク質を２回以上（例えば、２回、３回、又は４回）注射することができる。

【0226】

全長ポリペプチド又はタンパク質を用いることができるか、或いは、その抗原ペプチド断片を、免疫原として用いることができる。タンパク質の抗原ペプチドは、アミノ酸配列の、少なくとも８（例えば、少なくとも１０、１５、２０、又は３０）個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して生成された抗体が、タンパク質との特異的な免疫複合体を形成するように、タンパク質のエピトープを包含する。

【0227】

免疫原は典型的には、適切な対象（例えば、本明細書に記載される遺伝子改変動物）を免疫することにより抗体を調製するために使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えにより発現された、又は、化学的に合成されたポリペプチド（例えば、タンパク質の断片）を含有することができる。調製物は、フロイント完全若しくは不完全アジュバントなどのアジュバント、又は、同様の免疫刺激剤をさらに含むことができる。

【0228】

不動化されたポリペプチド又はペプチドを用いる、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技術により、免疫付与された対象における抗体力価を、経時的にモニタリングすることができる。所望する場合、抗体分子を哺乳動物から（例えば、血液から）単離し、タンパク質Ｇ又はプロテインＡクロマトグラフィーなど、周知の技術によりさらに精製して、ＩｇＧ画分を入手することができる。免疫付与後の適切な時期、例えば、特異性抗体の力価が最大となる時期において、抗体産生細胞を対象から取得し、これを用いて、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５）により元々記載されているハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２，１９８３）、ＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６，１９８５）、又はトリオーマ技術などの、標準的な技術により、モノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマを産生する技術は周知である（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照されたい）。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用い、対象となるポリペプチド又はエピトープに結合する抗体用のハイブリドーマ培養上清液をスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が検出される。

【0229】

一態様では、本開示は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むマウスを提供し、上記マウスは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再配列された免疫グロブリン配列を含むＢ細胞を産生する。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再配列された免疫グロブリン配列は、ヒト重鎖Ｖ、Ｄ、及び／又はＪ配列を含む。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒト又はマウスの重鎖配列を含む。

【0230】

一態様では、本開示は、動物において体細胞変異した重鎖抗体を作製するための方法に関する。この方法は、動物を抗原で免疫し、抗原に対する免疫応答を開始するのに十分な条件下で動物を維持することと、ヒト又は内因性の重鎖免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む体細胞変異重鎖抗体を動物から単離することであって、体細胞変異重鎖抗体が抗原に特異的に結合することと、を含む。いくつかの実施形態において、動物は、再配列されていないヒト又は内因性重鎖免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含み、ここで、上記動物は、機能的ＩｇＧ ＣＨ１ドメインをコードする少なくとも１つの対立遺伝子のヌクレオチド配列を欠いており、かつ上記動物は、ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭを発現する。

【0231】

Ｂ細胞又は脾臓細胞は、例えばマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結された、再配列された非マウス免疫グロブリン可変遺伝子配列を含むことができる。ヒト重鎖可変領域をコードする配列を決定する。配列は、例えば、目的のハイブリドーマ又はＢ細胞を配列決定することによって決定できる。いくつかの実施形態において、単一のＢ細胞スクリーニングが使用される。それは、ハイブリドーマ融合やコンビナトリアルディスプレイを必要とせずに、天然抗体レパートリーをスクリーニングできる。例えば、Ｂ細胞をＤＮＡバーコード化抗原のパネルと混合すると、個々のＢ細胞の抗原バーコードとＢ細胞受容体（ＢＣＲ）配列の両方が単一細胞シーケンシングプロトコルによって回復される。

【0232】

抗体は、例えば、ヒト重鎖可変領域をコードする配列を、ヒト重鎖定常領域をコードする配列に作動可能に連結することにより、さらに改変されてヒト化抗体又はヒト抗体を得ることができる。

【0233】

いくつかの実施形態において、マウスが目的の抗原に非常に類似したタンパク質を発現する場合、マウス内で免疫応答を誘発することが困難である可能性がある。これは、免疫細胞の発達中に、自己起源のペプチドに結合したＭＨＣ分子を認識するＢ細胞とＴ細胞が免疫細胞のレパートリーから削除されるためである。そのような場合、ヒト化マウスをさらに改変することができる。マウス内の対応する遺伝子をノックアウトすることができ、その後、マウスを目的の抗原に曝露する。マウスは遺伝子産物に対するネガティブ選択を受けないため、標的に特異的に結合できる抗体を容易に生成することができる。

【0234】

本開示は、抗体、核酸、細胞、組織（例えば、脾臓組織）を作製する方法も提供する。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載される動物を抗原に曝露することを含む。抗体（例えば、ハイブリッド抗体）、抗体をコードする核酸、細胞、及び／又は組織（例えば、脾臓組織）を動物から得ることができる。いくつかの実施形態において、可変領域をコードする核酸は、例えば配列決定によって決定される。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖免疫グロブリン可変領域をコードする核酸は、ヒト重鎖免疫グロブリン定常領域をコードする核酸と作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸を含む細胞を培養し、抗体を収集する。

【0235】

いくつかの実施形態において、重鎖可変領域配列に寄与するマウス免疫グロブリンＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子（例えば、マウスＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＫＶ、又はＩＧＫＪ遺伝子）はない。いくつかの実施形態において、動物によって産生される重鎖可変領域配列は完全にヒトのものであり、ヒト免疫グロブリンＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子（例えば、ヒトＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＫＶ、及びＩＧＫＪ遺伝子）によって完全に寄与される。いくつかの実施形態において、再配列されたＶＤＪ配列は、さらに体細胞超変異を受ける可能性がある。

【0236】

適切なヌクレオチドの変化を、ヒト、ヒト化、若しくはキメラ抗体、又は、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合断片をコードするＤＮＡに導入することにより、或いは、ペプチド合成により本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の変異体を調製することができる。このような変異体としては、例えば、抗体の抗原結合部位又は抗原結合ドメインを製造する配列のアミノ酸内での、残基の欠失、挿入、又は置換が挙げられる。このような変異体の集団において、抗体又は抗原結合断片の中には、標的タンパク質対する親和性が増大するものもある。欠失、挿入、及び／又は組み合わせの任意の組み合わせを、標的に対して結合親和性が増大した、抗体又はその抗原結合断片において実現することができる。グリコシル化部位の数の変化（例えば、増加若しくは減少）、グリコシル化部位の種類の変化（例えば、異なる糖が、細胞内に存在する酵素により結合されるように、アミノ酸配列を変化させること）、又は、新規のグリコシル化部位を導入することなどの、抗体又は抗原結合断片に導入したアミノ酸の変化によって、抗体又は抗原結合断片を変化させる、又は、抗体又は抗原結合断片に、新規の翻訳後改変を導入することができる。

【0237】

本明細書で開示される抗体は、哺乳動物を含む、動物の任意の種に由来することができる。天然抗体の非限定例としては、ヒト、霊長類、例えば、サル及び類人猿、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラクダ科動物（例えば、ラクダ及びラマ）、ニワトリ、ヤギ、並びに、ヒト抗体を産生するように遺伝子組換えされたトランスジェニックげっ歯類を含む、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、及びウサギ）に由来する抗体が挙げられる。

【0238】

ヒト及びヒト化抗体としては、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する（又は、これに由来するものと同じアミノ酸配列を有する）可変及び定常領域を有する抗体が挙げられる。ヒト抗体としては、例えばＣＤＲ内に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、又はインビボでの体細胞突然変異により導入された変異）によりコードされないアミノ酸残基を挙げることができる。

【0239】

抗体又は抗原結合断片に追加の改変を加えることができる。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域内での、鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このように生成されたホモ二量体抗体は、任意の、増大したインビトロ及び／又はインビボでの半減期を有し得る。例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０－２５６５，１９９３）に記載されている、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、インビトロ及び／又はインビボでの半減期が増大したホモ二量体抗体を調製することもできる。或いは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を組換えることができる（例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９－２３０，１９８９を参照されたい）。

【0240】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片に、共有結合改変を加えることができる。これらの共有結合改変は、化学若しくは酵素合成により、又は、酵素又は化学切断により加えることができる。抗体又は抗体断片の、他の種類の共有結合改変を、抗体又は断片の標的とされたアミノ酸残基を、選択された側鎖、又は、Ｎ若しくはＣ末端残基と反応可能な、有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入する。

【0241】

トランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）
分化クラスター７１（ＣＤ７１）としても知られているＴＦＲ１は広範にわたり発現し、高い親和性でトランスフェリン（Ｔｆ）に結合することができる。ヒトＴＦＲ１は、細胞表面でジスルフィド結合により結合される、二量体（１８０ｋＤａ）として発見される７６０個のアミノ酸からなる、９０ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＴＦＲ１モノマーは、Ｔｆ結合部位、膜貫通ドメイン（２８個のアミノ酸）、及び、細胞内Ｎ末端ドメイン（６１個のアミノ酸）を含有する、６７１個のアミノ酸の、大型の細胞外Ｃ末端ドメインで構成される。Ｃ末端細胞外ドメインは、アスパラギン残基２５１、３１７、及び７２７における３つのＮ結合グリコシル化部位、並びに、トレオニン１０４における１つのＯ結合グリコシル化部位を含有し、これらは全て、受容体の十分な機能に必要なものである。

【0242】

トランスフェリン（Ｔｆ）は、短いリンカー配列により分離されているＮ－及びＣ－ｌｏｂｅとして知られている、４０ｋＤａのサブユニット２つで構成される、８０ｋＤａの糖タンパク質である。各サブユニットは、１個の遊離第二鉄イオン（Ｆｅ３＋）に結合することができるが故、Ｔｆは、結合した鉄の原子を最大２つ有し得る。鉄遊離形態にあるＴｆ、即ちアポＴｆは、血液中にて高効率でＦｅ^３＋に結合し、Ｆｅ^３＋を、ＴＦＲ１との相互作用により、内在化のために細胞表面まで輸送する。鉄輸入を制御する膜タンパク質として、ＴＦＲ１は、Ｆｅ３＋に結合したトランスフェリン（Ｔｆ）にナノモル親和性を示す、ＴＦＲファミリーのメンバーである。Ｔｆ－ＴＦＲ１の錯体は、クラスリンが媒介するエンドサイトーシスにより内在化し、ｐＨが５．５まで低下したときにＦｅ^３＋はＴｆから解離する。このｐＨでは、アポＴｆ及びＴＦＲ１は依然として会合しており、生理的ｐＨで細胞表面までリサイクルされ、アポＴｆが放出される。

【0243】

トランスフェリン受容体による鉄の取り込みは、癌細胞が鉄を吸収するための重要な方法であるため、腫瘍の開始及び進行に関与したＴＦＲ１、及びその発現が、多くの癌において著しく調節不全に陥ったことが、蓄積した証拠により証明されている。ＴＦＲ１と癌の関係が明らかになっており、ＴＦＲ１が、癌に介入するための貴重な薬学的標的となっている。

【0244】

血液脳関門の内皮細胞で発現するＴＦＲ１を前臨床研究でもまた用いることで、抗体を含む巨大分子を脳に送達させることが可能となる。ＴＦＲ１を標的とする抗体は、鉄の取り込みに干渉することなく、血液脳関門を通過することができる。

【0245】

ＴＦＲ１、Ｔｆ、及びそれらの機能の詳細な説明は、例えば、Ｃａｎｄｅｌａｒｉａ，Ｐ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ． “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＴｆＲ１）ａｓ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２（２０２１）：６０７６９２；ａｎｄ Ｓｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ． “Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｎｅｗ ｓｉｇｈｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．” Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．６（２０１８）：９１６、に見出すことができ、これらそれぞれの全体が、参照により組み込まれている。

【0246】

重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）抗体
モノクローナル抗体と組換え抗体は、医学とバイオテクノロジーにおける重要なツールである。全ての哺乳動物と同様に、ラクダ科動物（ラマなど）は、ジスルフィド結合でＹ字型に結合した２つの重鎖と２つの軽鎖からなる従来の抗体（ＩｇＧ１など）を産生できる。しかし、それらはまた、ＩｇＧ２とＩｇＧ３というＩｇＧの２つの独特なサブクラス（重鎖ＩｇＧとも呼ばれる）を産生する。これらの抗体は、ＣＨ１領域を欠いているものの、依然としてそれらのＮ末端にＶＨＨ（又はナノボディ）と呼ばれる抗原結合ドメインを有する２つの重鎖のみで構成されている。従来のＩｇでは、抗原抗体相互作用の高い多様性を可能にするために、重鎖と軽鎖の両方の可変領域の組み合わせが必要である。単独の重鎖と軽鎖は依然としてこの能力を示すが、ペアになった重鎖と軽鎖と比較すると、非常に低い親和性を示す。重鎖ＩｇＧの独特な特徴は、それらのモノマー抗原結合領域が、別の領域と対になる必要がなく、従来の抗体に匹敵する特異性、親和性、及び特に多様性で抗原に結合する能力である。この特徴は主に、２つの重鎖の可変領域のアミノ酸配列内のいくつかの主要な変異によるもので、従来のＩｇと比較すると大きな構造変化を引き起こす。可変領域における主要な置換は、軽鎖が重鎖に結合するのを防ぐが、結合していない重鎖が免疫グロブリン結合タンパク質によってリサイクルされるのも防ぐ。

【0247】

これらの抗体の単一可変ドメイン（ＶＨＨ、ｓｄＡｂ、又はナノボディと指定する）は、適応免疫系によって生成される最小の抗原結合ドメインである。これらの抗体の可変領域の第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）は、従来の抗体の２倍の長さであることがよく知られている。その結果、抗原との相互作用面が拡大し、抗原－抗体相互作用の多様性も増加し、軽鎖の欠如を補うことになる。長い相補性決定領域３（ＣＤＲ３）により、ＶＨＨは、酵素の活性部位やウイルス表面上の受容体結合キャニオンなどの、機能的に興味深い部位を含む、従来の抗体にアクセスできないタンパク質上の隙間まで拡張できる。

【0248】

ＶＨＨは、従来の抗体の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）を持つ従来の抗体と比較して、より高い安定性、溶解性、発現収量、及びリフォールディング能力、並びにより良好なインビボ組織への浸透と内部化を含む、数多くの他の利点を提供する。さらに、従来の抗体のＶＨドメインとは対照的に、ＶＨＨは軽鎖に結合する本質的な傾向を示さない。ＶＨＨはＶＬドメインに結合しないため、従来のＶＨ－ＶＬペア、又はＶＨドメインに基づく単一ドメインを含有するコンストラクトよりも、ＶＨＨを多重特異性（例えば、二重特異性抗体）コンストラクトに再フォーマットする方がはるかに簡単である。

【0249】

本開示は、例えば、抗ＴＦＲ１抗体、その改変抗体、そのキメラ抗体、及びそのヒト化抗体を提供する。

【0250】

２３Ｂ８及び２３Ｂ８由来の抗体（例えば、ヒト化抗体）のＣＤＲ配列には、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される、それぞれ配列番号４２、４３、及び４４に示されるＶＨＨドメインのＣＤＲが含まれる。ＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムによってもまた定義することができる。ＩＭＧＴ番号付けでは、ＶＨＨドメインのＣＤＲはそれぞれ配列番号５４、５５、及び５６に示される。

【0251】

２４Ａ１及び２４Ａ１由来の抗体（例えば、ヒト化抗体）のＣＤＲ配列には、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される、それぞれ配列番号４５、４６、及び４７に示されるＶＨＨドメインのＣＤＲが含まれる。ＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムによってもまた定義することができる。ＩＭＧＴ番号付けでは、ＶＨＨドメインのＣＤＲはそれぞれ配列番号５７、５８、及び５９に示される。

【0252】

２４Ｃ９及び２４Ｃ９由来の抗体（例えば、ヒト化抗体）のＣＤＲ配列には、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される、それぞれ配列番号４８、４９、及び５０に示されるＶＨＨドメインのＣＤＲが含まれる。ＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムによってもまた定義することができる。ＩＭＧＴ番号付けでは、ＶＨＨドメインのＣＤＲはそれぞれ配列番号６０、６１、及び６２に示される。

【0253】

２４Ｇ５及び２４Ｇ５由来の抗体（例えば、ヒト化抗体）のＣＤＲ配列には、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される、それぞれ配列番号５１、５２、及び５３に示されるＶＨＨドメインのＣＤＲが含まれる。ＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムによってもまた定義することができる。ＩＭＧＴ番号付けでは、ＶＨＨドメインのＣＤＲはそれぞれ配列番号６３、６４、及び６５に示される。

【0254】

２３Ｂ８抗体のＶＨＨドメインのアミノ酸配列は配列番号６６に示される。２４Ａ１抗体のＶＨＨドメインのアミノ酸配列は配列番号６７に示される。２４Ｃ９抗体のＶＨＨドメインのアミノ酸配列は配列番号６８に示される。２４Ｇ５抗体のＶＨＨドメインのアミノ酸配列は配列番号６９に示される。

【0255】

様々な改変又はヒト化ＶＨＨのアミノ酸配列も提供される。重鎖抗体を改変又はヒト化するための異なる方法が存在するため（例えば、配列を異なるアミノ酸置換で改変できる）、重鎖抗体のＶＨＨドメインには、ヒト化配列の複数のバージョンが存在する可能性がある。いくつかの実施形態において、ヒト化ＶＨＨドメインは、配列番号６６～６９の任意の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。

【0256】

さらに、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４２～４４、配列番号４５～４７、配列番号４８～５０、配列番号５１～５３、配列番号５４～５６、配列番号５７～５９、配列番号６０～６２、及び配列番号６３～６５からなる群から選択される１つ、２つ、又は３つのＶＨＨドメインＣＤＲもまた含有することができる。

【0257】

いくつかの実施形態において、抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、３を含む重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を有することができ、上記ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、上記ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、上記ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。選択されたＶＨＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列を図３７及び図３８に示す。

【0258】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するＶＨＨ ＣＤＲ１、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するＶＨＨ ＣＤＲ２、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するＶＨＨ ＣＤＲ３のうちの１つ、２つ、又は３つを含む重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含むことができ、ここで、ＶＨＨ ＣＤＲ１、ＶＨＨ ＣＤＲ２、及びＶＨＨ ＣＤＲ３は、図３９のＣＤＲから選択される。

【0259】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号４２、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号４３、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号４４のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含有することができる。

【0260】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号４５、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号４６、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号４７のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含有することができる。

【0261】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号４８、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号４９、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５０のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含有することができる。

【0262】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５１、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５２、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５３のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含有することができる。

【0263】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５４、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５５、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５６のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含有することができる。

【0264】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５７、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５８、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号５９のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含有することができる。

【0265】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号６０、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号６１、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号６２のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含有することができる。

【0266】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号６３、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号６４、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号６５のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含有することができる。

【0267】

挿入、欠失、及び置換は、ＣＤＲ配列内、又は、ＣＤＲ配列の片方若しくは両方の末端に存在することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けスキームに基づき決定される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けスキームに基づき決定される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、組み合わせの番号付けスキームに基づき決定される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴの番号付けスキームに基づき決定される。

【0268】

本開示は、ＴＦＲ１（ヒトＴＦＲ１）に結合する抗体又はその抗原結合断片もまた提供する。抗体又はその抗原結合断片には、選択されたＶＨＨ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖単一可変領域（ＶＨＨ）が含まれる。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨＨ配列は配列番号６６である。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨＨ配列は配列番号６７である。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨＨ配列は配列番号６８である。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨＨ配列は配列番号６９である。

【0269】

２つのアミノ酸配列、又は、２つの核酸配列の同一性パーセントを測定するために、最適に比較するために配列をアライメントする（例えば、比較するために、最適にアライメントするように第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の１つ又は両方にギャップを導入してもよく、非相同配列を無視してもよい）。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同じものによって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最適にアライメントするために導入される必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列に共有される同一の位置の数の関数である。例示の目的で、２つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの測定は、例えば、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及び、フレームシフトギャップペナルティ５の、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを用いて実施することができる。

【0270】

本開示は、免疫グロブリン重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸もまた提供する。ＶＨＨは、図３７及び図３８に示すようなＣＤＲを含むか、又は図３９に示すような配列を有する。

【0271】

抗体及び抗原結合断片はまた、抗体又は抗体断片の抗体変異体（誘導体及びコンジュゲートを含む）、並びに、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体又は抗体断片であることも可能である。本明細書により提供される追加の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性（多量体、例えば、二重特異性）、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ）、一本鎖抗体、細胞内で製造された抗体（即ち、イントラボディ）、及び、それらの抗原結合断片である。

【0272】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、様々なタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスに由来し得るＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＦｃドメインはＩｇＧ抗体又はその抗原結合断片に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の重鎖定常領域を含む。

【0273】

本開示は、本明細書に記載される任意の抗体又は抗原結合断片と交差競合する、抗体又はその抗原結合断片もまた提供する。交差競合アッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， “Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｐ１２０ ｅｘｔｅｒｉｏｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０．３（１９９６）：１８６３－１８７２に記載されており、その全体が、参照により本明細書に組み込まれている。一態様では、本開示は、本明細書に記載される任意の抗体又は抗原結合断片と同じエピトープ又は領域に結合する、抗体又はその抗原結合断片もまた提供する。エピトープ結合アッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｅｓｔｅｐ ｅｔ ａｌ． “Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．” ＭＡｂｓ．Ｖｏｌ．５．Ｎｏ．２．Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１３に記載されており、その全体が、参照により本明細書に組み込まれている。

【0274】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、及び６３から選択される重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）ＣＤＲ１を含む。

【0275】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、及び６４から選択される重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）ＣＤＲ２を含む。

【0276】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、及び６５から選択される重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）ＣＤＲ３を含む。

【0277】

抗体の特性
ＴＦＲ１は、鉄結合ＴＦとの相互作用を通じて、細胞の鉄の取り込みにおいて重要な役割を果たす。鉄は複数の細胞プロセスに必要であり、ＤＮＡ合成、ひいては細胞増殖に不可欠である。癌細胞病理学におけるその中心的な役割のため、悪性細胞はＴＦＲ１を過剰発現することが多く、この発現の増加は異なる種類の癌の予後不良と関連する可能性がある。悪性細胞におけるＴｆＲ１発現レベルの上昇、細胞外アクセス可能性、内在化能力、及び癌細胞病理学における中心的な役割により、この受容体は抗体媒介療法の魅力的なターゲットとなっている。

【0278】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＴＦＲ１とＴＦとの間の結合をブロッキングすることができない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＴＦＲ１とＴＦとの間の結合をブロッキングすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、受容体媒介エンドサイトーシスによって内在化される抗癌剤にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、受容体の機能を破壊することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃエフェクター機能を誘導することができず、したがって正常細胞に対するそれらの悪影響を防止又は改善する。

【0279】

本開示は、ヒトＦｃドメインを含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片が存在しないときと比較して、それはＦｃ依存性エフェクター機能を少なくとも又は約少なくとも又は約１倍、少なくとも又は約２倍、少なくとも又は約３倍、少なくとも又は約４倍、少なくとも又は約５倍、少なくとも又は約６倍、少なくとも又は約７倍、少なくとも又は約８倍、少なくとも又は約９倍、少なくとも又は約１０倍、少なくとも又は約２０倍、少なくとも又は約３０倍、少なくとも又は約４０倍、少なくとも又は約５０倍、或いは少なくとも又は約１００倍誘導する。

【0280】

本開示は、ヒトＦｃドメインを含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片が存在しないときと比較して、それは宿主免疫応答を少なくとも又は約少なくとも又は約１倍、少なくとも又は約２倍、少なくとも又は約３倍、少なくとも又は約４倍、少なくとも又は約５倍、少なくとも又は約６倍、少なくとも又は約７倍、少なくとも又は約８倍、少なくとも又は約９倍、少なくとも又は約１０倍、少なくとも又は約２０倍、少なくとも又は約３０倍、少なくとも又は約４０倍、少なくとも又は約５０倍、或いは少なくとも又は約１００倍誘導する。

【0281】

本開示は、エンドサイトーシス率が少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である、ヒト脳細胞（例えば、皮質微小血管内皮細胞）に内在化することができる抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片のエンドサイトーシス率は、アイソタイプ対照抗体と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍である。

【0282】

いくつかの実施形態において、単一の重鎖を含む抗体又はその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、一対の重鎖を含む抗体又はその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、重鎖対はジスルフィド結合によって連結される。いくつかの実施形態において、重鎖対はノブ－イン－ホール改変を含む。いくつかの実施形態において、重鎖はヒトＩｇＧ Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、各重鎖に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０つのＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、各重鎖のＶＨＨドメインは同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、各重鎖のＶＨＨドメインは異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、各重鎖のＶＨＨドメインは、少なくとも１、２、３、４、又は５つの異なるエピトープに結合する。

【0283】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性抗体、又は三重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも４、５、又は６個の抗原に特異的に結合することができる。

【0284】

いくつかの実施形態において、抗体（又はその抗原結合断片）は、０．１ｓ^－１未満、０．０１ｓ^－１未満、０．００１ｓ^－１未満、０．０００１ｓ^－１未満、又は０．００００１ｓ－１未満の解離速度（ｋｏｆｆ）でＴＦＲ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、解離速度（ｋｏｆｆ）は、０．０１ｓ^－１超、０．００１ｓ^－１超、０．０００１ｓ^－１超、０．００００１ｓ^－１超、又は、０．０００００１ｓ^－１超である。

【0285】

いくつかの実施形態において、動力学的会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０^２／Ｍｓ超、１×１０^３／Ｍｓ超、１×１０^４／Ｍｓ超、１×１０^５／Ｍｓ超、又は、１×１０^６／Ｍｓ超である。いくつかの実施形態において、動力学的会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０^５／Ｍｓ未満、１×１０^６／Ｍｓ未満、又は、１×１０^７／Ｍｓ未満である。

【0286】

親和性を、動力学的速度定数の商から推定することができる（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。いくつかの実施形態において、ＫＤは、１×１０^－６Ｍ未満、１×１０^－７Ｍ未満、１×１０^－８Ｍ未満、１×１０^－９Ｍ未満、又は、１×１０^－１０Ｍ未満である。いくつかの実施形態において、ＫＤは、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、又は１ｎＭ未満である。いくつかの実施形態において、ＫＤは、１×１０^－７Ｍ超、１×１０^－８Ｍ超、１×１０^－９Ｍ超、１×１０^－１０Ｍ超、１×１０^－１１Ｍ超、又は、１×１０^－１２Ｍ超である。

【0287】

抗原に対する抗体の親和性を測定する一般的な技術としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、抗体はヒトＴＦＲ１、サルＴＦＲ１、マウスＴＦＲ１、又はキメラＴＦＲ１に結合する。いくつかの実施形態において、抗体はヒトＴＦＲ１、サルＴＦＲ１、マウスＴＦＲ１、又はキメラＴＦＲ１に結合しない。

【0288】

いくつかの実施形態において、熱安定性が測定される。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５℃を超えるＴｍ（融解温度）を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｔｍは、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５℃未満である。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５℃を超えるＴａｇｇ（凝集温度、例えば、２６６ｎｍでのＴａｇｇ（Ｔａｇｇ２６６）又は４７３ｎｍでのＴａｇｇ（Ｔａｇｇ４７３））を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｔａｇｇは、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５℃未満である。

【0289】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４である。

【0290】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、機能的Ｆｃ領域を有する。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号７５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0291】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、Ｆｃ領域を有していない。例えば、抗体（又はその抗原結合断片）は、リンカーペプチドによって相互接続された１つ以上のＶＨＨドメインを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗体は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０つのＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨドメインは同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＶＨＨドメインは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、ＶＨＨドメインは、少なくとも１、２、３、４、又は５つの異なるエピトープに結合する。

【0292】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、機能的Ｆｃ領域を有していない。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＬＡＬＡ変異（ＥＵの番号付けにおけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異）、又は、ＬＡＬＡ－ＰＧ変異（ＥＵの番号付けにおけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ変異）を有する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＥＵ番号付けによる位置２９７（例えば、Ｎ２９７Ａ）に変異を有する。いくつかの実施形態において、変異したヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号７６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0293】

いくつかの実施形態において、対象に投与されてから６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、又は７２時間後に、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片の脳（例えば、全脳又は実質）における濃度は、投与直後（例えば、０．５時間）のその濃度の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％を超える可能性がある。いくつかの実施形態において、対象に投与されてから６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、又は７２時間後に、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片の脳（例えば、全脳又は実質）における濃度は、対照抗体（例えば、ｈＩｇＧ１又はＪＲ１４１－Ｎ）の濃度、又は対象の血清中の濃度の少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、又は１００００倍であり得る。

【0294】

抗ＴＦＲ１抗体の作製方法
適切なヌクレオチドの変化を、ヒト、ヒト化、若しくはキメラ抗体、又は、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合断片をコードするＤＮＡに導入することにより、或いは、ペプチド合成により本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の変異体を調製することができる。このような変異体としては、例えば、抗体の抗原結合部位又は抗原結合ドメインを製造する配列のアミノ酸内での、残基の欠失、挿入、又は置換が挙げられる。このような変異体の集団において、一部の抗体又は抗原結合断片は、標的タンパク質、例えば、ＴＦＲ１に対する親和性が増大する。欠失、挿入、及び／又は組み合わせの任意の組み合わせを、標的に対して結合親和性が増大した、抗体又はその抗原結合断片において実現することができる。グリコシル化部位の数の変化（例えば、増加若しくは減少）、グリコシル化部位の種類の変化（例えば、異なる糖が、細胞内に存在する酵素により結合されるように、アミノ酸配列を変化させること）、又は、新規のグリコシル化部位を導入することなどの、抗体又は抗原結合断片に導入したアミノ酸の変化によって、抗体又は抗原結合断片を変化させる、又は、抗体又は抗原結合断片に、新規の翻訳後改変を導入することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される重鎖抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載される遺伝子改変動物（例えば、重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてホモ接合性であるマウス）のいずれかを免疫化することによって得られる。

【0295】

ヒト化抗体には、ヒト免疫グロブリンスキャフォールド配列のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する（又は、由来するものと同じアミノ酸配列を有する）可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれる。ヒト化抗体には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的な変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）によってコードされていないアミノ酸残基が含まれる場合がある。したがって、「ヒト化」抗体は、非ヒト種由来の配列が対応するヒト配列によって置換されたキメラ抗体である。

【0296】

通常、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗ＴＦＲ１抗体のアミノ酸配列変異体は、元の抗体のＶＨＨドメインに存在する配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含有する。

【0297】

元の配列に対する同一性又は相同性とは、通常、配列をアラインして、必要な場合、ギャップを導入し、最大のパーセント配列同一性を達成した後に、配列同一性の一部としての保存的置換を考慮しない、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗ＴＦＲ１抗体又は断片内に存在する配列と同一である候補配列内に存在する、アミノ酸残基の割合である。

【0298】

抗ＴＦＲ１抗体又は抗原結合断片に、更なる改変を加えることができる。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域内での、鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このように生成されたホモ二量体抗体は、任意の、増大したインビトロ及び／又はインビボでの半減期を有し得る。例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．” Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３．１１（１９９３）：２５６０－２５６５）に記載されている、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、インビトロ及び／又はインビボでの半減期が増大したホモ二量体抗体を調製することもできる。或いは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を組換えることができる。

【0299】

いくつかの実施形態において、抗ＴＦＲ１抗体又はその抗原結合断片に、共有結合改変を加えることができる。これらの共有結合改変は、化学若しくは酵素合成により、又は、酵素又は化学切断により加えることができる。抗体又は抗体断片の、他の種類の共有結合改変を、抗体又は断片の標的とされたアミノ酸残基を、選択された側鎖、又は、Ｎ若しくはＣ末端残基と反応可能な、有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入する。

【0300】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体を提供する。例えば、このような抗体組成物中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、又は２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ ２００８／０７７５４６に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の位置２９７（Ｆｃ領域残基のＥｕの番号付け、又は、Ｋａｂａｔの番号付けにおける位置３１４）に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における微小な配列変動に起因して、位置２９７から約±３アミノ酸の上流又は下流、即ち、位置２９４～位置３００の間に位置してもよい。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。いくつかの実施形態において、グリカンの不均質性を低減するために、抗体のＦｃ領域をさらに組換え、位置２９７におけるアスパラギンをアラニンで置き換えることができる（Ｎ２９７Ａ）。

【0301】

本開示はまた、本明細書で開示される単離ポリヌクレオチド（例えば、本明細書で開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む組換えベクター（例えば、発現ベクター）、組換えベクターが導入された宿主細胞（即ち、当該宿主細胞が、ポリヌクレオチド、及び／又は、ポリヌクレオチドを含むベクターを含有するように）、並びに、組換え技術による、組換え抗体ポリペプチド又はその断片の産生を提供する。

【0302】

本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、ベクターが宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞に、対象となる１つ以上のポリヌクレオチドを送達することができる、任意のコンストラクトである。「発現ベクター」は、対象となる１つ以上のポリヌクレオチドを、発現ベクターが導入されている宿主細胞内で、コードされたポリペプチドとして送達し、発現することが可能である。したがって、発現ベクター内では、対象となるポリヌクレオチドが、発現ベクターと共に導入された宿主細胞内で翻訳されるように、対象となるポリヌクレオチドの組み込み部位において、又はこの付近で、又はこれに隣接して、ベクター内、又は宿主細胞のゲノムのいずれかにて、プロモーター、エンハンサー、及び／又はポリＡテールなどの制御エレメントと作動可能に結合されることにより、ベクター内での発現のために、対象となるポリヌクレオチドが配置される。

【0303】

当該技術分野において周知の方法、例えば、電気穿孔法、化学トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン）、形質転換、トランスフェクション、並びに、感染及び／又は形質導入（例えば、組換えウイルスによる）により、ベクターを宿主細胞に導入することができる。したがって、ベクターの非限定例としては、ウイルスベクター（組換えウイルスを生成するために使用可能なもの）、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ファージベクター、及び、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクターが挙げられる。

【0304】

いくつかの実施態様において、本明細書で開示されるポリヌクレオチド（例えば、本明細書で開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を、ウイルス発現系（例えば、痘疹若しくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、又はアデノウイルス）を用いて導入し、これには、非病原性（欠損型）の複製可能なウイルスの使用を伴う場合があるか、又は、複製不能ウイルスを用いる場合がある。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に、補完的なウイルスパッケージング細胞においてのみ生じる。好適なシステムは、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ－Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３１７－３２１；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．５６９：８６－１０３；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖａｃｃｉｎｅ，８：１７－２１；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、及び同第５，０１７，４８７号；ＷＯ ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ ２，２００，６５１；ＥＰ ０，３４５，２４２；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ－Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６１６－６２７，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１－４３４；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２１５－２１９；Ｋａｓｓ－Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１１４９８－１１５０２；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８８：２８３８－２８４８；並びにＧｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．，７３：１２０２－１２０７において開示されている。ＤＮＡを、このような発現系に組み込む技術は、当業者に周知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１７４５－１７４９，及びＣｏｈｅｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１６９１－１６９２に記載されているように、「ネイキッド」であってもよい。ＤＮＡを、細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズにコーティングすることにより、ネイキッドＤＮＡの取り込みを増大させることができる。

【0305】

発現のために、本明細書で開示されている、抗体をコードする、又は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡインサートを、適切なプロモーター（例えば、異種プロモーター）に作動可能に連結することができる。いくつかの例を挙げると、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びに、レトロウイルス型ＬＴＲのプロモーターなどである。他の好適なプロモーターが、当業者には既知である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。発現コンストラクトはさらに、転写開始及び終了のための部位、並びに、転写領域内に、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有することができる。コンストラクトにより発現した成熟転写物のコード部分は、先頭に翻訳開始、及び翻訳されるポリペプチドの末端部におおよそ配置される終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含むことができる。

【0306】

示したように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことができる。このようなマーカーとしては、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、又はネオマイシン耐性、並びに大腸菌及び他の細菌培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス、及びネズミチフス菌細胞などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、ショウジョウバエＳ２及びハスモンヨトウＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｂｏｗｅｓ黒色腫、及びＨＫ ２９３細胞などの動物細胞、並びに、植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される宿主細胞に対する、適切な培養培地及び条件は、当該技術分野において周知である。

【0307】

細菌で用いるための非限定的なベクターとしては、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ－９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、及び、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。非限定的な真核細胞ベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、及びｐＳＧ、並びに、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが挙げられる。他の好適なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。

【0308】

使用に好適な、非限定的な細菌プロモーターとしては、大腸菌ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ及びＰＬプロモーター、並びにｔｒｐプロモーターが挙げられる。好適な真核細胞プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のものなどの、レトロウイルス型ＬＴＲのプロモーター、及び、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターが挙げられる。

【0309】

酵母菌サッカロマイセス・セレヴィシエにおいて、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの、体質性又は誘導性プロモーターを含有する、いくつかのベクターを使用することができる。

【0310】

コンストラクトの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染、又は他の方法により行うことができる。このような方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）などの、多くの標準的な実験室用マニュアルに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0311】

より多くの真核生物による、本開示の抗体をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することで増大させることができる。エンハンサーは、通常、所与の宿主細胞型において、プロモーターの転写活性を増大させる役割を果たす、約１０～３００ｂｐの、ＤＮＡのｃｉｓ作用型エレメントである。エンハンサーの例としては、塩基対１００～２７０において、複製起点の後ろ側に位置する、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、及び、アデノウィルスエンハンサーが挙げられる。

【0312】

翻訳されたタンパク質を、小胞体の内腔、ペリプラズム空間、又は、細胞外環境に分泌させるために、適切な分泌シグナルを、発現したポリペプチドに組み込むことができる。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であることができる、又は、シグナルは、異種シグナルであることができる。

【0313】

ポリペプチド（例えば、抗体）は、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合物）などの改変形態で、又は、ヒスチジンタグにより発現することができ、分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能領域もまた含むことができる。例えば、追加のアミノ酸、特に、荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドのＮ末端に付加して、精製中に、又は、その後の取り扱い及び貯蔵の間に、宿主細胞での安定性及び耐久力を改善することができる。また、ペプチド部分をポリペプチドに付加して、精製を促進することができる。このような領域は、ポリペプチドの最終調製前に取り除くことができる。ペプチド部分をポリペプチドに付加して、とりわけ、分泌又は排泄を生じさせ、安定性を改善し、精製を促進することは、周知かつ日常的な当該技術である。

【0314】

本開示は、本明細書に記載される任意のヌクレオチド配列と、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である核酸配列、及び、本明細書に記載される任意のアミノ酸配列と、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列もまた提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される任意のペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は、本明細書に記載される任意のヌクレオチド配列によりコードされる任意のアミノ酸配列に関する。いくつかの実施形態において、核酸配列は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、又は６００ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００アミノ酸残基未満である。

【0315】

いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、（ｉ）アミノ酸配列を含み；又は、（ｉｉ）アミノ酸配列からなり、ここで、上記アミノ酸配列は、本明細書に記載される配列のいずれか１つである。

【0316】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、（ｉ）核酸配列を含み；又は、（ｉｉ）核酸配列からなり、ここで、上記核酸配列は、本明細書に記載される配列のいずれか１つである。

【0317】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、酵母、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）で発現される。

【0318】

治療と診断の方法
本開示の抗ＴＦＲ１抗体、又は抗体若しくはその抗原結合断片は、様々な治療目的に使用することができる。一態様では、本開示は、対象の脳疾患（例えば、脳癌、認知症、又はアルツハイマー病）を治療するための方法、脳疾患（例えば、脳癌、認知症、又はアルツハイマー病）を有する対象を同定する方法、脳疾患を発症するリスクを低減する方法、又は対象において追加の症状を発症するリスクを低減する方法を提供する。いくつかの実施形態において、治療により、脳疾患（例えば、脳癌、認知症、又はアルツハイマー病）の進行を停止する、遅らせる、遅延させる、又は阻害することができる。いくつかの実施形態において、治療により、対象における脳疾患（例えば、脳癌、認知症、又はアルツハイマー病）の１つ以上の症状の数、重症度、及び／又は持続期間が軽減され得る。

【0319】

一態様では、本開示は、治療有効量の本明細書で開示される抗体又はその抗原結合断片を、それを必要とする対象（例えば、脳疾患を有する、又は脳疾患を有すると同定又は診断された対象）に投与することを含む方法を特徴とする。

【0320】

一態様では、本開示は、血液脳関門を通過するように治療剤を運ぶ方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は治療剤に連結される。いくつかの実施形態において、治療剤は抗体、その抗原結合断片、小分子、又は抗体薬物コンジュゲートである。

【0321】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される組成物及び方法は、脳疾患（例えば、脳癌、認知症、又はアルツハイマー病）のリスクがある患者の治療に使用することができる。脳疾患（例えば、脳癌、認知症、又はアルツハイマー病）の患者は、当該技術分野で周知の様々な方法によって同定することができる。

【0322】

いくつかの実施形態において、脳疾患は脳癌である。

【0323】

一態様では、本開示は、腫瘍増殖速度を低減する方法であって、腫瘍細胞を、有効量の、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合断片を含む組成物、又は抗体薬物コンジュゲートと接触させることを含む、方法に関する。一態様では、本開示は、腫瘍細胞の殺傷方法であって、腫瘍細胞を、有効量の、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合断片を含む組成物、又は抗体薬物コンジュゲートと接触させることを含む、方法に関する。

【0324】

本明細書で使用される場合、「有効量」とは、疾患、例えば、癌の進行を停止する、遅らせる、遅延させる、又は阻害することを含む、有益な、又は所望の結果をもたらすのに十分な量又は用量を意味する。有効量は、例えば、抗体、抗原結合断片、抗体をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクター、及び／又はその組成物が投与される対象の年齢及び体重、症状の重症度、並びに投与経路に応じて変化し、故に、投与は、個別に決定することができる。

【0325】

有効量は、１回以上の投与で投与することができる。一例として、抗体又はその抗原結合断片の有効量は、患者の疾患の進行を改善する、停止する、安定化する、逆転する、阻害する、遅らせる及び／又は遅延させるのに十分な量である。当該技術分野において理解されるように、有効量の抗体又は抗原結合断片は、とりわけ、患者の病歴、加えて、用いた抗体の種類（及び／又は用量）などの、他の因子に応じて変化する場合がある。

【0326】

本明細書で開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、及び／又は組成物を投与するための有効量及びスケジュールは、実験によって決定することができ、このような決定を行うことは、当業者の範囲内である。当業者は、投与される必要がある用量は、例えば、本明細書で開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、及び／若しくは組成物を受ける哺乳動物、投与経路、抗体の具体的な種類、抗体をコードするポリヌクレオチド、抗原結合断片、並びに／又は、使用される、本明細書で開示される組成物、及び、哺乳動物に投与される他の薬剤に応じて変化することを理解するであろう。抗体又は抗原結合断片に対して適切な用量を選択する手引きは、抗体及び抗原結合断片の治療のための使用に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，１９８５，ｃｈ．２２ ａｎｄ ｐｐ．３０３－３５７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７７，ｐｐ．３６５－３８９に見出すことができる。

【0327】

有効量の抗体の、典型的な日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、用量は、１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ未満であることができる。いくつかの実施形態において、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、又は０．０１ｍｇ／ｋｇ超であることができる。いくつかの実施形態において、用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇである。

【0328】

本明細書に記載される方法のいずれかでは、少なくとも１つの抗体、その抗原結合断片、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合断片、又は医薬組成物のいずれか）、並びに、任意選択的に、少なくとも１つの追加の治療剤を、対象に、少なくとも週に１回（例えば、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、１日１回、１日２回、又は１日３回）投与することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なる抗体及び／又は抗原結合断片は、同じ組成物（例えば、液体組成物）として投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片、及び、少なくとも１つの追加の治療剤は、同じ組成物（例えば、液体組成物）として投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片、及び、少なくとも１つの追加の治療剤は、２つの異なる組成物（例えば、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片を含有する液体組成物、及び、少なくとも１つの追加の治療剤を含有する固体口腔用組成物）として投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、丸薬、錠剤、又はカプセルとして投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、徐放性経口製剤として投与される。

【0329】

いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療剤を、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物のいずれか）を投与する前、又は、投与した後に、対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療剤、及び、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物のいずれか）は、対象内で、１つ以上の追加の治療剤の生物活性期間と、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片（例えば、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれか）の生物活性期間に、重なりが生じるように、対象に投与される。

【0330】

いくつかの実施形態において、長期間にわたり（例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１年、２年、３年、４年、又は５年の期間にわたり）、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物のいずれか）を、対象に投与することができる。熟練した医療専門家は、治療の有効性を診断する、又は追跡する（例えば、疾患の少なくとも１つの症状を観察する）ために、本明細書に記載される方法のいずれかを用いて治療期間の長さを決定することができる。本明細書に記載されるように、熟練した医療専門家はまた、対象に投与される抗体若しくは抗原結合抗体断片（及び／又は、１つ以上の追加の治療剤）の同一性及び数を変化させる（例えば、増加又は減少させる）ことができ、また、（例えば、本明細書に記載の、及び、当該技術分野において周知の方法のいずれかを用いる）治療の有効性の評価に基づき、対象への、少なくとも１つの抗体若しくは抗原結合抗体断片（及び／又は、１つ以上の追加の治療剤）の投与用量又は頻度を調整する（例えば、増加又は減少させる）ことができる。

【0331】

いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療剤を、対象に投与することができる。追加の治療剤は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、ＥＲＫの阻害剤、Ｋ－Ｒａｓの阻害剤、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤、ホスファチジルイノシトール ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤、Ａｋｔの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤、並びに、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）及び／又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）の阻害剤からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を含むことができる。

【0332】

いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、ＨＥＲ３の阻害剤、ＬＳＤ１の阻害剤、ＭＤＭ２の阻害剤、ＢＣＬ２の阻害剤、ＣＨＫ１の阻害剤、活性化ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤、及び、エストロゲン受容体を選択的に分解する薬剤からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を含むことができる。

【0333】

いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、トラベクテジン、ｎａｂ－パクリタキセル、トレバナニブ、パゾパニブ、セディラニブ、パルボシクリブ、エベロリムス、フルオロピリミジン、ＩＦＬ、レゴラフェニブ、レオリシン、アリムタ、ジカイダ、スーテント、テムシロリムス、アキシチニブ、エベロリムス、ソラフェニブ、ヴォトリエント、パゾパニブ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ－００３、カボザンチニブ、ビンフルニン、Ｈｓｐ９０阻害剤、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ、テモゾロミド、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンブラスチン、サロミド、ダカルバジン、シクロホスファミド、レナリドマイド、アザシチジン、レナリドマイド、ボルテゾミブ、アムルビシン、カルフィルゾミブ、プララトレキサート、及びエンザスタウリンからなる群から選択される１つ以上の治療剤を含むことができる。

【0334】

いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＩＬ－１、ＨＭＧＢ１、ＩＬ－１０アンタゴニスト、ＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－１３アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＨＶＥＭアンタゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＣＸ３ＣＬ１を標的とする治療、ＣＸＣＬ９を標的とする治療、ＣＸＣＬ１０を標的とする治療、ＣＣＬ５を標的とする治療、ＬＦＡ－１アゴニスト、ＩＣＡＭ１アゴニスト、及びセレクチンアゴニストからなる群から選択される１つ以上の治療剤を含むことができる。

【0335】

いくつかの実施形態において、カルボプラチン、ｎａｂ－パクリタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、ペメトレキセド、ゲムシタビン、ＦＯＬＦＯＸ、又はＦＯＬＦＩＲＩが、対象に投与される。

【0336】

いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、又は抗ＧＩＴＲ抗体である。

【0337】

医薬組成物及び投与経路
本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、又は４つ）を含有する医薬組成物もまた、本明細書で提供する。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの、２つ以上（例えば、２、３、又は４つ）が、任意の組み合わせで、医薬組成物に存在することができる。医薬組成物は、当該技術分野において周知の任意の様式で、製剤化することができる。

【0338】

医薬組成物は、その意図する投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）と適合性を有するように、製剤化される。組成物は、無菌希釈剤（例えば、無菌水若しくは生理食塩水）、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶剤、抗菌若しくは抗カビ剤（例えば、ベンジルアルコール若しくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）、酸化防止剤（アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウムなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）、緩衝剤（アセテート、シトレート、若しくはホスフェートなど）、及び、等張剤（例えば、糖類（例えば、デキストロース）、ポリアルコール（例えば、マンニトール若しくはソルビトール）、若しくは塩類（例えば、塩化ナトリウム））、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として使用可能である（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号を参照されたい）。組成物の調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、又は複数回投与用バイアルに製剤化し、封入することができる。必要な場合（例えば、注射可能な製剤におけるように）、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング、又は界面活性剤を用いることにより、維持することができる。吸収を遅らせる剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることにより、抗体又はその抗原結合断片の吸収を長くすることができる。或いは、徐放は、インプラント及びマイクロカプセル化デリバリーシステムによって達成することができ、これらとしては、生分解性・生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸；Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を挙げることができる。

【0339】

本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの１つ以上を含有する組成物は、単位剤形（即ち、投与を容易にし、用量を均一にするための、所定量の活性化合物を含有する、物理的に別個の単位）で、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）投与のために製剤化することができる。

【0340】

組成物の毒性及び治療効果は、細胞培養液又は実験用動物（例えば、サル）における、標準的な薬学的手順により決定することができる。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）、及び、ＥＤ５０（集団の５０％において治療に有効な用量）を決定することができ、治療指数は、ＬＤ５０：ＥＤ５０の比率である。高い治療指数を示す薬剤が好ましい。薬剤が、望ましくない副作用を示す場合、損害の可能性を最低限に抑える（即ち、望ましくない副作用を軽減する）ためのケアを取る必要がある。毒性及び治療効果は、他の標準的な薬学的手順により決定することができる。

【0341】

細胞培養アッセイ及び動物研究から入手したデータを、対象（例えば、ヒト）で用いるための、任意の所与の剤の適切な用量の製剤化において使用することができる。１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つ）の抗体又はその抗原結合断片（例えば、本明細書に記載される抗体又は抗体断片のいずれか）の治療有効量は、対象、対象又は疾患を発症するリスクがあると同定された対象の疾患を治療し、対象（例えば、ヒト）の疾患の１つ以上の症状の重症度、頻度、及び／又は持続期間を減少させる量である。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの有効性及び投与は、当該技術分野において周知の方法を使用して、健康管理の専門家又は獣医学の専門家により、加えて、対象（例えば、ヒト）における疾患の１つ以上の症状を観察することにより、決定することができる。ある特定の因子は、対象を効果的に治療するのに必要な用量及びタイミング（例えば、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康及び／又は年齢、並びに、他の疾患の存在）に影響を及ぼし得る。

【0342】

例示的な用量としては、対象の体重１キログラム当たりの、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの量（ミリグラム又はマイクログラム）（例えば、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、又は、約１μｇ／ｋｇ～約５０μｇ／ｋｇ）が挙げられる。これらの用量は広範囲をカバーしているものの、抗体及びその抗原結合断片を含む治療剤は、これらの効能、及び有効量を、当該技術分野において周知の方法により決定することができることを、当業者は理解するであろう。典型的には、比較的低用量をまず投与し、担当の健康管理の専門家若しくは獣医学の専門家（治療用途の場合）、又は、研究者（依然として開発段階で働いている場合）が続けて、及び徐々に、適切な応答が得られるまで、用量を増大させることができる。加えて、任意の特定の対象に対する、具体的な用量レベルは、用いる具体的な化合物の活性、対象の年齢、体重、総体的な健康、性別、及び食事、投与時間、投与経路、排泄速度、並びに、インビボでの抗体又は抗体断片の半減期を含む様々な因子に依存すると理解されている。

【0343】

医薬組成物は、容器、パック、又はディスペンサーに、投与用の取扱説明書と共に含めることができる。本開示は、本明細書に記載される様々な用途のための、抗体又はその抗原結合断片の製造方法もまた提供する。

【0344】

追加の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、上記の説明は例示を目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、特許請求の範囲内である。追加の実施形態も提供される。

【0345】

実施形態１は、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む遺伝子改変げっ歯類であり、上記組換え免疫グロブリン重鎖遺伝子座はＩｇＧ定常領域遺伝子を含み、上記ＩｇＧ定常領域遺伝子はＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ重鎖定常領域をコードし、上記遺伝子改変げっ歯類は重鎖抗体を発現する。

【0346】

実施形態２は、実施形態１に記載の遺伝子改変げっ歯類であり、上記げっ歯類は正確に１つのＩｇＧ定常領域遺伝子を含む。

【0347】

実施形態３は、実施形態１又は２に記載の遺伝子改変げっ歯類であり、上記ＩｇＧ重鎖定常領域遺伝子はＩＧＨＧ１である。

【0348】

実施形態４は、実施形態１～３のいずれか１つに記載の遺伝子改変げっ歯類であり、上記ＩｇＧ重鎖定常領域は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、並びに任意選択でヒンジ領域を含むか、又はそれらからなる。

【0349】

実施形態５は、ゲノムが、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＧ２ｂ、及びＩＧＨＧ２ｃ遺伝子の欠失と、げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＧ１遺伝子のＣＨ１エクソンの欠失とを含む生殖細胞系遺伝子改変を含む遺伝子改変げっ歯類である。

【0350】

実施形態６は、実施形態５に記載のげっ歯類であり、上記生殖細胞系遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるげっ歯類ＩＧＨＥ遺伝子の欠失をさらに含む。

【0351】

実施形態７は、実施形態５又は６に記載のげっ歯類であり、上記遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるげっ歯類Ｓγ２ｂ、Ｓγ２ｃ、及びＳεスイッチ領域の欠失をさらに含む。

【0352】

実施形態８は、実施形態５～７のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子を含み、上記改変ＩＧＨＧ１遺伝子は、配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む。

【0353】

実施形態９は、実施形態５～８のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるげっ歯類Ｓγ３スイッチ領域の欠失をさらに含む。

【0354】

実施形態１０は、実施形態５～９のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記げっ歯類のゲノムは、げっ歯類Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変げっ歯類のＩＧＨＧ１遺伝子、及びげっ歯類ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、ＩＧＨＡ遺伝子を含む。

【0355】

実施形態１１は、実施形態５～９のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるげっ歯類ＩＧＨＭ遺伝子及びＩＧＨδ遺伝子の欠失をさらに含む。

【0356】

実施形態１２は、実施形態５～９及び１１のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記げっ歯類ゲノムは、げっ歯類Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及びげっ歯類ＩＧＨＡ遺伝子を含む。

【0357】

実施形態１３は、実施形態１２に記載のげっ歯類であり、上記Ｓμ及びＳγ１スイッチ領域が、配列番号８と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結される。

【0358】

実施形態１４は、実施形態５～９のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１コード配列の欠失をさらに含む。

【0359】

実施形態１５は、実施形態５～９及び１４のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記げっ歯類のゲノムは、げっ歯類Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変げっ歯類ＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及びげっ歯類ＩＧＨδ、ＩＧＨＡ遺伝子を含む。

【0360】

実施形態１６は、実施形態１５に記載のげっ歯類であり、上記Ｓμスイッチ領域及び上記改変ＩＧＨＭ遺伝子が、配列番号１０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結される。

【0361】

実施形態１７は、実施形態５～９のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１エクソンの欠失及びＩＧＨδ遺伝子の欠失をさらに含む。

【0362】

実施形態１８は、実施形態５～９及び１７のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記げっ歯類のゲノムは、げっ歯類Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及びげっ歯類ＩＧＨＡ遺伝子を含む。

【0363】

実施形態１９は、実施形態５～９のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＩＧＨＭ遺伝子のＣＨ１エクソンの欠失及びＩＧＨδ遺伝子のＣＨ１コード配列の欠失をさらに含む。

【0364】

実施形態２０は、実施形態５～９及び１９のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記げっ歯類のゲノムは、げっ歯類Ｓμ、Ｓγ１、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＭ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨδ遺伝子、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及びげっ歯類ＩＧＨＡ遺伝子を含む。

【0365】

実施形態２１は、実施形態１９又は２０に記載のげっ歯類であり、上記改変ＩＧＨＭ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列と連結され、上記改変ＩＧＨδ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む。

【0366】

実施形態２２は、実施形態１４～２１のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記改変ＩＧＨＭ遺伝子は、配列番号１３と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む。

【0367】

実施形態２３は、実施形態５～８のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるげっ歯類Ｓγ１スイッチ領域の欠失をさらに含む。

【0368】

実施形態２４は、実施形態５～８及び２３のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記げっ歯類のゲノムは、げっ歯類Ｓμ、Ｓγ３、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及びげっ歯類ＩＧＨＭ、ＩＧＨδ、ＩＧＨＡ遺伝子を含む。

【0369】

実施形態２５は、実施形態５～８及び２３のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるげっ歯類Ｓγ３スイッチ領域の欠失をさらに含む。

【0370】

実施形態２６は、実施形態５～８、２３及び２５のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記遺伝子改変は、上記げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるげっ歯類ＩＧＨＭ及びＩＧＨδ遺伝子の欠失をさらに含む。

【0371】

実施形態２７は、実施形態５～８、２３、２５又は２６のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、上記げっ歯類のゲノムは、げっ歯類Ｓμ、Ｓαスイッチ領域、ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く改変ＩＧＨＧ１遺伝子、及びげっ歯類ＩＧＨＡ遺伝子を含む。

【0372】

実施形態２８は、実施形態２７に記載のげっ歯類であり、上記Ｓμスイッチ領域及び上記改変ＩＧＨＧ１遺伝子は、配列番号９と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一の配列と連結される。

【0373】

実施形態２９は、実施形態５～１０、２３及び２４のいずれか１つに記載のげっ歯類であり、改変ゲノムは機能的ＩＧＨＭ遺伝子を含む。

【実施例】

【0374】

本発明を以下の実施例でさらに説明し、これらは、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。

【0375】

実施例１：概要
非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を遺伝子編集によって改変した。例えば、重鎖抗体を発現できるマウスを得るために、マウス第１２染色体内の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座を改変した。遺伝子改変マウスは、図１に示すように重鎖抗体を発現することができる。さらに、第１２染色体上の重鎖可変領域遺伝子座の全ての内因性ＶＤＪ配列がヒトＶＤＪ配列で置き換えられ、それによって、マウスによって発現された重鎖抗体の可変領域は完全にヒト化された配列を有した。いくつかの実験では、ヒトＶＤＪ配列を有するマウスで免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座の遺伝子改変を行った。

【0376】

実施例２：マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座の改変
図２に示すように、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）免疫グロブリン定常領域遺伝子には、（以下の順序で示すように）免疫グロブリン重定常μ（ＩＧＨＭ、又はＣμ）、免疫グロブリン重定常δ（ＩＧＨδ、又はＣδ）、免疫グロブリン重定常γ３（ＩＧＨＧ３、又はＣγ３）、免疫グロブリン重定常γ１（ＩＧＨＧ１、又はＣγ１）、免疫グロブリン重定常γ２ｂ（ＩＧＨＧ２ｂ、又はＣγ２ｂ）、免疫グロブリン重定常γ２ｃ（ＩＧＨＧ２ｃ、又はＣγ２ｃ）、免疫グロブリン重定常ε（ＩＧＨＥ、又はＣε）、及び免疫グロブリン重定常α（ＩＧＨＡ、又はＣα）遺伝子が含まれる。図３に示すように、スイッチ領域（例えば、Ｓμ、Ｓγ３、Ｓγ１、Ｓγ２ｂ、Ｓγ２ｃ、Ｓε、及びＳα）及びそれらのそれぞれのプロモーターは、対応する定常領域遺伝子の上流に位置する。特に、Ｃγ１遺伝子には、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＩｇＧ１のＣＨ１、Ｈ（ヒンジ）、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１、及びＭ２領域をコードする配列が含まれる。

【0377】

マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座は、以下に説明する様々な方法によって改変された。実験は、完全にヒト化されたＶＤＪ配列を有するマウスで実施された。ＶＤＪ領域ヒト化マウスの詳細は、例えばＷＯ２０２０１６９０２２Ａ１及びＵＳ２０２００３９００７３Ａ１に見出すことができ、これらそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。

【0378】

重鎖抗体のみを発現するマウスを得るために、Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂ、Ｃγ２ｃ、及びＣε遺伝子座を改変し、ＣＨ１コード領域のない切断されたＣγ１配列のみを保持し（Ｃγ１ΔＣＨ１）、図４Ａの変異対立遺伝子１又は変異対立遺伝子１’として示される変異対立遺伝子を得た。変異対立遺伝子１に基づいて、スイッチ領域（例えば、Ｓμ及びＳγ１）、Ｃμ及び／又はＣδ配列に異なる改変が加えられた。例えば、Ｃμ及びＣδ配列全体がノックアウトされ、結果として生じる対立遺伝子は、変異対立遺伝子２及び変異対立遺伝子２’（さらにＳγ１が欠落）として表示される。或いは、ノックアウトされる領域は、ＣμのＣＨ１コード領域（変異対立遺伝子３として示される、結果として生じる対立遺伝子を有する）、ＣμのＣＨ１コード領域とＣδ全体（変異対立遺伝子４として示される、結果として生じる対立遺伝子を有する）、及びＣμのＣＨ１コード領域とＣδのＣＨ１コード領域の両方（変異対立遺伝子５として示される、結果として生じる対立遺伝子を有する）から選択された。

【0379】

実施例３：ターゲティングベクターの構築
改変には、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７などのターゲティングベクターが使用された。

【0380】

ベクターＶ１
ベクターＶ１には、図５に示すようなＣγ１ΔＣＨ１ノックイン配列（配列番号１）が含まれていた。Ｃγ１ΔＣＨ１配列は、ＣＨ１のコード配列を有していない。ＣＨ１コード領域は欠失したか、又はＮｅｏカセットで置き換えられた。Ｎｅｏカセットは、２つのＦｒｔ（又はＬｏｘＰ）配列に隣接するＮｅｏ遺伝子配列を含む。Ｆｌｐトランスジェニックマウスを、カセットを除去するためにＮｅｏカセットを搭載したマウスと交配させた。

【0381】

ターゲティングベクターＶ１には、５’から３’の順序で、以下の特徴配列：上流相同アーム（５’相同アーム）、マウスＳγ１プロモーター配列、マウスＳγ１、Ｃγ１ΔＣＨ１配列、及び下流相同アーム（３’相同アーム）、が含まれていた。ターゲティングベクターにはさらに、陽性クローンスクリーニング用の抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、又はＮｅｏ）と、抗生物質耐性遺伝子に隣接する２つのＦｒｔ組換え部位が含まれる場合がある。さらに、ネガティブ選択マーカーを持つコーディング遺伝子（ジフテリア毒素Ａサブユニット（ＤＴＡ）をコードする遺伝子）をターゲティングベクターに挿入することもできる。

【0382】

マウスＳγ１プロモーター、マウスＳγ１、及びＣγ１ΔＣＨ１ノックイン配列（配列番号１）を含む１６０７６ｂｐの配列が、マウス細菌人工染色体（ＲＰ２３－３８Ｋ２２又はＲＰ２３－２６５Ｐ１８）からクローニングされた。以下の２セットのプライマーペアを使用して、Ｖ１ベクターの構築のために、マウスＳγ１プロモーター、マウスＳγ１、及びＣγ１ΔＣＨ１ノックイン配列を含む配列を取得した。次に、Ｖ１－Ｆ１とＶ１－Ｒ１から増幅された配列と、Ｖ１－Ｆ２とＶ１－Ｒ２から増幅された配列を連結した。
Ｖ１－Ｆ１（配列番号２）：
５’－ＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＡＣＡ－３’
Ｖ１－Ｒ１（配列番号３）：
５’－ＣＴＣＣＣＴＡＴＡＣＧＴＣＣＴＣＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＡＴＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＡＧ－３’
Ｖ１－Ｆ２（配列番号４）：
５’－ＧＴＧＴＡＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＧＧＴＧＡＧＡＧＧＡＣＧＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＴＣ－３’
Ｖ１－Ｒ２（配列番号５）：
５’－ＣＧＴＣＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＣＧＡＣＣＣＣＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧ－３’

【0383】

図６に示すように、Ｖ１ベクターを使用して、マウス重鎖定常領域遺伝子座（Ｓγ３からＣεまで）の１００８８３ｂｐ配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００７８．７の核酸１１３２３２１４２から１１３３３３０２４）を１つのステップで置き換えた。

【0384】

ベクターＶ２
図７に示すように、Ｖ２ベクターを使用して、マウス重鎖定常領域（Ｃγ３からＣεに及ぶ）の９２８５９ｂｐ配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００７８．７の核酸１１３２３２１４２から１１３３２５０００）を１つのステップで置き換えた。

【0385】

この方法には、一対のプライマーを使用してマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）からクローニングし、Ｃγ１ΔＣＨ１ノックイン配列（配列番号１）を含むノックイン配列を取得することも含まれていた。以下のプライマーを使用した。
Ｖ２－Ｆ１（配列番号６）：
５’－ＴＣＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＡＧＡＧＧＡＣＧＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧ－３’
Ｖ２－Ｒ１（配列番号７）：
５’－ＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣ－３’

【0386】

ベクターＶ３
図８に示すように、Ｖ３ベクターを使用して、Ｃμ及びＣδを含む染色体から合計１６４３４ｂｐのヌクレオチドをノックアウトした。組換え変異対立遺伝子２におけるＳμとＳγ１間の連結配列を配列番号８に示す。

【0387】

ベクターＶ４
図９に示すように、ターゲティングベクターＶ４には、５’から３’の順序で、以下の特徴配列：上流相同アーム（５’相同アーム）、マウスＳμの一部、及び下流相同アーム（３’相同アーム）、が含まれていた。ターゲティングベクターにはさらに、陽性クローンスクリーニング用の抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、又はＮｅｏ）と、抗生物質耐性遺伝子に隣接する２つのＦｒｔ組換え部位が含まれていた。さらに、ネガティブ選択マーカーを持つコーディング遺伝子（ジフテリア毒素Ａサブユニット（ＤＴＡ）をコードする遺伝子）もターゲティングベクターに挿入された。具体的には、Ｓμは組換え変異対立遺伝子２’のＣγ１ΔＣＨ１’に直接連結されていた（即ち、間に他のスイッチ領域や免疫グロブリン遺伝子配列はなかった）。連結配列を配列番号９に示す。

【0388】

ベクターＶ５
図１０に示すように、Ｖ５ベクターを使用して、Ｃμ内のＣＨ１コード配列をノックアウトした。ＣμのＣＨ１コード配列を削除すると、連結配列は配列番号１０に示される。

【0389】

ベクターＶ６
図１１に示すように、ターゲティングベクターＶ６には、５’から３’の順序で、以下の特徴配列：上流相同アーム（５’相同アーム）、マウスＳμ領域の一部、マウスＣμΔＣＨ１配列、及び下流相同アーム（３’相同アーム）、が含まれていた。ターゲティングベクターにはさらに、陽性クローンスクリーニング用の抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、又はＮｅｏ）と、抗生物質耐性遺伝子に隣接する２つのＦｒｔ組換え部位が含まれていた。さらに、ネガティブ選択マーカーを持つコーディング遺伝子（ジフテリア毒素Ａサブユニット（ＤＴＡ）をコードする遺伝子）もターゲティングベクターに挿入された。

【0390】

マウスＣμΔＣＨ１配列を含む配列が、マウス体細胞からクローニングされた。以下のプライマーペアを使用して、Ｖ６ベクターの構築のために、マウスＣμΔＣＨ１（又はＣμΔＣＨ１ノックイン配列、配列番号１３）を含む配列を取得した。
Ｖ６－Ｆ１（配列番号１１）：
５’－ＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＡＡＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＧＴＧ－３’
Ｖ６－Ｒ１（配列番号１２）：
５’－ＴＴＧＡＣＣＣＡＴＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＴＧＡＣＴＡＣＡＡＴＡＴＡＴＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧ－３’

【0391】

ベクターＶ７
図１２に示すように、ターゲティングベクターＶ７には、５’から３’の順序で、以下の特徴配列：上流相同アーム（５’相同アーム）、ＣμΔＣＨ１配列、ＣδΔＣＨ１配列（又は、ＣδΔＣＨ１ノックイン配列、配列番号４１）、及び下流相同アーム（３’相同アーム）、が含まれていた。ターゲティングベクターにはさらに、陽性クローンスクリーニング用の抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、又はＮｅｏ）と、抗生物質耐性遺伝子に隣接する２つのＦｒｔ組換え部位が含まれていた。さらに、ネガティブ選択マーカーを持つコーディング遺伝子（ジフテリア毒素Ａサブユニット（ＤＴＡ）をコードする遺伝子）もターゲティングベクターに挿入された。

【0392】

マウスＳμスイッチ領域、ＣμΔＣＨ１配列、及びＣδΔＣＨ１配列を含む配列が、マウスゲノムからクローニングされた。以下のプライマーペアを使用して、Ｖ７ベクターの構築のために、マウスＣμΔＣＨ１とＣδΔＣＨ１の上流のヌクレオチドを含むノックイン配列を取得した。
Ｖ７－Ｆ１（配列番号１４）：
５’－ＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＡＡＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＧＴＧ－３’
Ｖ７－Ｒ１（配列番号１５）：
５’－ＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＡＴＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡ－３’

【0393】

実施例４：遺伝子改変の検証
変異対立遺伝子１
ＰＣＲとサザンブロットを使用して、変異対立遺伝子１の遺伝子型を検出した。まず、Ｌ－ＧＴ－Ｆ１／Ｌ－ＧＴ－Ｒ１とＲ－ＧＴ－Ｆ２／Ｒ－ＧＴ－Ｒ２の２セットのプライマーペアを使用してＰＣＲによって陽性クローン細胞を同定した。例示的な結果をそれぞれ図１３Ａ～１３Ｂに示す。プライマーの配列を以下の表に示す。

【0394】

【表7】

【0395】

次に、陽性クローンをサザンブロット（それぞれＢｃｌＩ、ＳｃａＩ、ＸｍｎＩ、及びＢｇｌＩＩで消化し、続いて４つの対応するプローブでハイブリダイゼーションを行う）で検証し、正しい陽性クローン細胞を選別した。サザンブロット検出戦略（制限酵素、プローブ、及び標的断片サイズを含む）とプローブプライマーを以下の表に示す。

【0396】

【表8】

【0397】

【表9】

【0398】

例示的な検出結果を図１４Ａ～１４Ｄに示す。ＰＣＲ及びサザンブロットの結果によると、Ｆ１－０１２、Ｆ１－０１７、Ｆ１－０１８及びＦ１－０１９と番号付けられたマウスは、変異対立遺伝子１陽性ヘテロ接合マウスであると同定された。変異対立遺伝子１にランダム挿入は検出されなかった。

【0399】

変異対立遺伝子２
プライマーＤＥ－Ｆ１とＤＥ－Ｒ１を使用して、変異対立遺伝子２のＣμからＣδまでの配列のノックアウトを確認した。検出結果を図１５に示す。Ｆ１－１、Ｆ１－２、Ｆ１－３、Ｆ１－４、Ｆ１－５、Ｆ１－６、Ｆ１－７及びＦ１－８と番号付けられたマウスは、陽性ヘテロ接合マウスとして同定された。プライマーの配列を以下の表に示す。

【0400】

【表10】

【0401】

変異対立遺伝子２’
プライマーＧＴ－Ｍｕｔ－Ｆ、ＧＴ－Ｍｕｔ－Ｒ、及びＧＴ－ＷＴ－Ｒを使用して、変異対立遺伝子２’のＣμからＳγ１までの配列のノックアウトを確認した。検出結果を図１６に示す。Ｆ１－２及びＦ１－４と番号付けられたマウスは、陽性ヘテロ接合マウスとして同定された。プライマーの配列を以下の表に示す。

【0402】

【表11】

【0403】

変異対立遺伝子３
プライマーＧＴ－３ＦとＧＴ－３Ｒを使用して、変異対立遺伝子３のＣμのＣＨ１コード配列のノックアウトを確認した。検出結果を図１７に示す。Ｆ１－２、Ｆ１－３及びＦ１－６と番号付けられたマウスは、陽性ヘテロ接合マウスとして同定された。プライマーの配列を以下の表に示す。

【0404】

【表12】

【0405】

変異対立遺伝子４
プライマーＭｕｔ－ＦとＭｕｔ－Ｒを使用して、変異対立遺伝子４のＣμΔＣＨ１の配列を確認した。プライマーＦ４とＲ４を使用して、変異対立遺伝子４にＣδが存在しないことを確認した。検出結果をそれぞれ図１８Ａ～１８Ｂに示す。Ｆ１－１、Ｆ１－２、Ｆ１－３、Ｆ１－４、Ｆ１－５、Ｆ１－６、Ｆ１－７、Ｆ１－８、Ｆ１－９及びＦ１－１０と番号付けられたマウスは、陽性ヘテロ接合マウスとして同定された。プライマーの配列を以下の表に示す。

【0406】

【表13】

【0407】

変異対立遺伝子５
変異対立遺伝子５において、プライマーＭｕｔ－ＦとＭｕｔ－Ｒを使用してＣμΔＣＨ１の配列を確認し、かつプライマーＦ３とＲ３を使用してＣδΔＣＨ１の配列を確認した。検出結果をそれぞれ図１９Ａ～１９Ｂに示す。Ｆ１－１、Ｆ１－２、Ｆ１－３、Ｆ１－４、Ｆ１－５、Ｆ１－６、Ｆ１－７及びＦ１－８と番号付けられたマウスは、陽性ヘテロ接合マウスとして同定された。プライマーの配列を以下の表に示す。

【0408】

【表14】

【0409】

実施例５：マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座の改変
ヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスゲノムに導入し、ヒト化抗体を発現するマウスを作製するための実験を行った。図２０はヒト化マウスの作製方法を示す。この方法は、まず、ヒト染色体上のヒト免疫グロブリン領域を改変することを含む。その後、改変ヒト染色体をマウス受容細胞に導入した。

【0410】

マウス免疫グロブリン可変領域遺伝子座の配列は、直接置換（例えば、相同組換え、又はＣｒｅ媒介組換え）によってヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座の配列で置き換えられた。場合によっては、段階的なアプローチによってヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子をマウスゲノムに導入することができる。次に、正しい置換のために受容細胞をスクリーニングした。その後、細胞を胚盤胞に注入してキメラマウスを作製した。その後の繁殖を実施して、ヒト又はヒト化免疫グロブリン可変領域遺伝子座配列を含むマウスを得た。

【0411】

免疫グロブリン重鎖遺伝子座はマウス第１２染色体上に位置する。免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座の両側に２つの組換え部位を導入した。

【0412】

改変ヒト染色体を生成するための実験も行った。免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変領域の両側に２つの組換え部位を導入した。次に、改変ヒト染色体をマウス細胞に導入した。その後、細胞をスクリーニングし、ヒト染色体を１つだけ含む細胞を選択した。その後、Ｃｒｅリコンビナーゼは、マウス染色体上のＶ、Ｄ、Ｊ領域をヒト染色体上のＶ、Ｄ、Ｊ領域で置き換えることを媒介した（図２１）。

【0413】

陽性クローン細胞を、マイクロインジェクションによってＢＡＬＢ／ｃマウスの胚盤胞に注入した。胚のマイクロインジェクションは、例えば、Ａ．Ｎａｇｙ，ｅｔ ａｌ．， “Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００３に記載されている方法に従って実施した。注入された受精卵を培養液に移し、短時間培養した後、受容マウスの卵管に移植して、遺伝子改変ヒト化マウス（Ｆ０世代）を作製した。その後、マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドを有するマウスと交配させた。マウスの尾から得たＤＮＡに対してＰＣＲ分析を実施した。マウスを、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドを有するマウスとさらに数回（例えば、少なくとも５回）交配させ、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドを有する重鎖免疫グロブリン遺伝子座ヒト化ヘテロ接合マウスを得た。

【0414】

その後、ヘテロ接合マウスを互いに交配させてホモ接合マウスを得た。免疫グロブリン重鎖遺伝子座ヒト化ホモ接合マウスの作製方法の詳細な説明は、ＷＯ２０２０１６９０２２Ａ１及びＵＳ２０２００３９００７３Ａ１に提供されており、これらそれぞれその全体が、参照により本明細書に組み込まれている。

【0415】

実施例６：マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の改変
カッパ（κ）軽鎖遺伝子座ノックアウトマウス
免疫グロブリンκ軽鎖（κ）遺伝子座はマウス第６染色体上に位置する。マウス第６染色体を、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座の全配列をノックアウトすることによって改変した。詳細なノックアウト方法は、例えば、ＷＯ２０２０１６９０２２Ａ１及びＵＳ２０２００３９００７３Ａ１；Ｚｏｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ． “Ｓｕｂｔｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ λ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ χ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ．” Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２５．８（１９９５）：２１５４－２１６２；Ｚｏｕ，Ｙ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ． “Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｇ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｍｂｄａ ｃｈａｉｎ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌｓ，ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｉｇ ｋａｐｐａ．” Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２．３（１９９３）：８１１－８２０；Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ． “Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｃｈａｉｎ ｉｎｔｒｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｋａｐｐａ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｃｉｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌａｍｂｄａ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｒａｎｓ．” Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ１２．６（１９９３）：２３２９－２３３６、に見出すことができ、これらそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。

【0416】

ラムダ（λ）軽鎖遺伝子座ノックアウトマウス
免疫グロブリンλ軽鎖（λ）はマウス第１６染色体上に位置する。マウス第１６染色体を、免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座の全配列をノックアウトすることによって改変した。詳細なノックアウト方法は、例えば、Ｚｏｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ． “Ｂｌｏｃｋ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ ｐｒｅ－Ｂ－ＩＩ ｔｏ ｉｍｍａｔｕｒｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｓｔａｇｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｉｇκ ａｎｄ Ｉｇλ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ．” Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０．３（２００３）：１３５４－１３６１、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0417】

本明細書に記載されるマウスを互いに交配させることにより、ヒト免疫グロブリン重鎖ＶＤＪ領域、改変されたマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座（Ｃγ１のＣＨ１コード領域を欠く）を有し、かつマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の全部又は一部を欠くマウスを得ることができる。

【0418】

実施例７：改変ＩｇＧ１遺伝子を有するマウスの重鎖抗体
上記で同定されたＣγ１のＣＨ１コード領域を欠くマウス（それぞれ変異対立遺伝子２’、変異対立遺伝子３、及び変異対立遺伝子４の遺伝子型を有するマウス）及び野生型（ＷＴ）マウスから採血して血清サンプルを得た。抗ｍＩｇＧ１抗体（カタログ番号：ａｂ１９０４８１、Ａｂｃａｍ）を使用して血清中に任意の発現したＩｇＧを同定するためのウェスタンブロッティング分析のために血清サンプルはを調製した。図３２に示すように、結果によりバンドの混合物が明らかになった：約７５ｋＤのバンド１つ（ＣＨ１ドメインを欠く二量体ＩｇＧ１の予想されるサイズ）、及び約１５０ｋＤのバンド１つ（野生型ＩｇＧの予想されるサイズ）。結果は、本明細書に記載される方法を使用して作製されたマウスが、末梢血中にＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ１を発現できることを示している。

【0419】

免疫原を注射することでマウスを免疫し、その後、様々な方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージスクリーニング、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによる単一細胞技術、又はＢｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）によって特異的に結合する抗体をスクリーニングすることができる。予備的な結果は、本明細書に記載される方法で作製したマウスを使用して、高い親和性、高い多様性、良好な機能（例えば、高いエンドサイトーシス活性）、及び良好な開発可能性（例えば、高い親水性及び良好な熱安定性）を有する抗体を得ることができることを示した。

【0420】

変異対立遺伝子３（Ｍｕｔ３）を有するマウス
ヒト化マウス（重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてヘテロ接合性、κ軽鎖遺伝子座ノックアウト、及びλ軽鎖遺伝子座ノックアウトなし）を抗原Ａで免疫した（５匹のマウス）。３回の免疫付与後、血清力価は、ＦＡＣＳによって検出されるように、１０^４倍増加した。次に、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、抗原特異的モノクローナル抗体を産生できる形質細胞を単離した。各抗体の発現ベクターを構築し、宿主細胞に導入した。ＦＡＣＳで確認された陽性細胞の数は６３個であった。抗体配列のさらなる分析により、重鎖可変領域のＣＤＲ３の長さ（ＩＭＧＴによって定義される）は６～２３であることが示された（図２２）。さらに、クローンの９４％（５９／６３）はＣＤＲ３の長さが１２以上で、合計３５個の独特なＣＤＲ３配列があった。図２３は可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。さらに、いくつかの抗体の親和性もテストした。図２４に示すように、抗原Ａに対するこれらの抗体のＫＤは１０^－９Ｍに達し、良好な結合親和性を示している。

【0421】

別の実験では、ヒト化マウス（４匹のマウスは、重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてホモ接合性、κ軽鎖遺伝子座の欠失についてホモ接合性、かつλ軽鎖遺伝子座の欠失についてヘテロ接合性、３匹のマウスは、重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてホモ接合性、κ軽鎖遺伝子座の欠失についてホモ接合性、かつλ軽鎖遺伝子座の欠失についてホモ接合性であった）をヒト４－１ＢＢ（カタログ番号：４１Ｂ－Ｈ５２５８、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で免疫した。４回の免疫付与後、血清力価は、ＦＡＣＳによって検出されるように、１０^４倍増加した。ＦＡＣＳで確認された抗原特異的クローンの数は６７個であった。抗体配列のさらなる分析により、重鎖可変領域のＣＤＲ３の長さ（ＩＭＧＴによって定義される）は７～１９であることが示された（図３３）。図３４は可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。さらに、いくつかの抗体の親和性もテストした。

【0422】

別の実験では、ヒト化マウス（１９匹のマウスは、重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてホモ接合性、κ軽鎖遺伝子座の欠失についてホモ接合性、かつλ軽鎖遺伝子座の欠失についてヘテロ接合性であった）を抗原ヒトＣＤ３ＥＤ及びカニクイザルＣＤ３ＥＤで免疫した。４回の免疫付与後、血清力価は、ＦＡＣＳによって検出されるように、１０^５倍増加した。ＦＡＣＳで確認された抗原特異的クローンの数は２７３個であった。抗体配列のさらなる分析により、重鎖可変領域のＣＤＲ３の長さ（ＩＭＧＴによって定義される）は６～２５であることが示された（図３５）。図３６は可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。さらに、いくつかの抗体の親和性もテストした。

【0423】

ヒト化マウス（重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてホモ接合性、κ軽鎖遺伝子座及びλ軽鎖遺伝子座ノックアウト）を抗原ヒト血清アルブミンで免疫した（１０匹のマウス）。次に、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、抗原特異的モノクローナル抗体を産生できる形質細胞を単離した。ＦＡＣＳで確認された陽性細胞の数は８４個であった。抗体配列のさらなる分析により、重鎖可変領域のＣＤＲ３の長さ（ＩＭＧＴによって定義される）は１２～１７であることが示された。図４３は可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【0424】

変異対立遺伝子２（Ｍｕｔ２）を有するマウス
ヒト化マウス（重鎖変異対立遺伝子２遺伝子型についてホモ接合性、κ軽鎖遺伝子座ノックアウト、λ軽鎖遺伝子座ノックアウトなし）を抗原Ａ（１０匹のマウス）で免疫した。次に、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、抗原特異的モノクローナル抗体を産生できる形質細胞を単離した。ＦＡＣＳで確認された陽性細胞の数は４０個であった。抗体配列のさらなる分析により、合計１４個の独特なＣＤＲ３配列が示された。加えて、いくつかの抗体の親和性もテストした。図２５に示すように、抗原Ａに対するこれらの抗体のＫＤは１０^－８Ｍに達し、良好な結合親和性を示している。

【0425】

さらに、免疫化されたＭｕｔ２マウスの脾臓組織を採取し、脾臓細胞から全ＲＮＡを抽出した。免疫グロブリン可変領域遺伝子座をＰＣＲによってクローニングし、その後ファージプラスミドに挿入してファージ組換えプラスミドライブラリを構築することができる。ある実験では、構築されたライブラリの２ラウンドのパニングとスクリーニングの後、合計２０２個のＥＬＩＳＡ陽性クローンが得られた。冗長な配列を除去後、ＦＡＣＳで確認された陽性細胞の数は９４個であった。これらの抗体の配列のさらなる分析により、重鎖可変領域のＣＤＲ３の長さは８～１８であることが示された（ＩＭＧＴによって定義される）。図２６は可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【0426】

変異対立遺伝子２’（Ｍｕｔ２’）を有するマウス
ヒト化マウス（重鎖変異対立遺伝子２’遺伝子型についてヘテロ接合性、κ軽鎖及びλ軽鎖遺伝子座ノックアウト）を抗原ヒト血清アルブミンで免疫した（１２匹のマウス）。次に、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、抗原特異的モノクローナル抗体を産生できる形質細胞を単離した。ＦＡＣＳで確認された陽性細胞の数は９６個であった。抗体配列のさらなる分析により、重鎖可変領域のＣＤＲ３の長さ（ＩＭＧＴによって定義される）は５～２２であることが示された。さらに、クローンの７８．１％（７５／９６）はＣＤＲ３の長さが１２以上であった。図４４は可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。さらに、いくつかの抗体の親和性もテストした。図４５に示すように、ヒト血清アルブミンに対するいくつかの抗体のＫＤは１０^－９Ｍに達し、良好な結合親和性を示している。

【0427】

変異対立遺伝子４（Ｍｕｔ４）を有するマウス
ヒト化マウス（重鎖変異対立遺伝子４遺伝子型についてホモ接合性、κ軽鎖及びλ軽鎖遺伝子座ノックアウト）を抗原ヒト血清アルブミンで免疫した（１０匹のマウス）。次に、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、抗原特異的モノクローナル抗体を産生できる形質細胞を単離した。ＦＡＣＳで確認された陽性細胞の数は４１個であった。抗体配列のさらなる分析により、重鎖可変領域のＣＤＲ３の長さ（ＩＭＧＴによって定義される）は８～２３であり、クローンの６５．９％（２７／４１）はＣＤＲ３の長さが１２以上であることが示された。図４６は可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。

【0428】

変異対立遺伝子５（Ｍｕｔ５）を有するマウス
ヒト化マウス（重鎖変異対立遺伝子５遺伝子型についてホモ接合性、κ軽鎖及びλ軽鎖遺伝子座ノックアウト）を抗原Ａで免疫した。次に、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、抗原特異的モノクローナル抗体を産生できる形質細胞を単離した。ＦＡＣＳで確認された陽性細胞の数は２０個であった。配列のさらなる分析により、重鎖可変領域のＣＤＲ３の長さ（ＩＭＧＴによって定義される）は１０～１８であることが示された。図４７は可変領域遺伝子の生殖細胞系遺伝子使用を示す。加えて、いくつかの抗体の親和性もテストした。抗原Ａに対するこれらの抗体のＫＤは１０^－９Ｍに達し、良好な結合親和性を示している。

【0429】

Ｂ細胞の発達
改変ＩｇＧ１マウスと野生型マウスの免疫系を比較するための実験を行った。６～８週齢のＲｅｎＭａｂマウス（ヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座）及び改変ＩｇＧ１マウスを選択した。その中で、改変ＩｇＧ１マウスは、ＲｅｎＭａｂマウスと比較して、体重、外観、及び活力は類似していた。これらのマウスの末梢血、脾臓、リンパ節、及び骨髄組織を採取し、明らかな解剖学的変化は発見されなかった。

【0430】

実施例８．ヒト抗ＴＦＲ１抗体の生成
マウス（５匹のマウスは、重鎖変異対立遺伝子３遺伝子型についてホモ接合性、κ軽鎖遺伝子座の欠失についてホモ接合性、かつλ軽鎖遺伝子座の欠失についてヘテロ接合性であった）をＨｉｓタグ付きヒトＴＦＲ１（トランスフェリン受容体１）タンパク質（ｈＴＦＲ１－Ｈｉｓ、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＣＤ１－Ｈ５２４３）で免疫し、抗ＴＦＲ１抗体を取得した。免疫付与の前に、陰性対照として後眼窩血を採取した。最初の免疫付与には、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）を使用し、２回目、及び３回目の免疫付与には、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）を使用した。合計３回の免疫付与（２週間ごと）を実施した。３回目の免疫付与の１週間後に、後眼窩血を採取し、血清の抗体力価をＦＡＣＳにより検出した。

【0431】

前回の免疫付与から少なくとも１４日後に、免疫付与を強化する手順も実行した。ＴＦＲ１タンパク質を腹腔内注射し、ヒトＴＦＲ１抗原を発現するＣＨＯ－Ｓ細胞を尾静脈から注射した。

【0432】

抗原特異的免疫細胞を、免疫付与したマウスから単離し、さらに、抗ＴＦＲ１抗体を得た、又は、抗ＴＦＲ１抗体の重鎖可変領域配列を得た。例えば、単一細胞技術（例えば、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．を使用する）を使用して、抗原特異的モノクローナル抗体を分泌する形質細胞をスクリーニングして見つけた。逆転写とＰＣＲ配列決定を使用して、抗体可変領域配列を取得した。得られた可変領域配列を抗体発現のために使用し、ＦＡＣＳを用いて、ＴＦＲ１に対する結合親和性を検証した。ＣＨ１ドメインが欠いているため、得られた抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、重鎖単一可変ドメイン（ＶＨＨ）とも呼ばれる。

【0433】

具体的には、得られたＶＨＨ配列をそれぞれヒトＩｇＧ１定常領域（例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン）に接続した。本方法により得られた例示的な抗体は、２３Ｂ８、２４Ａ１、２４Ｃ９、及び２４Ｇ５を含んだ。重鎖ＣＤＲ１－３配列を図３７及び図３８に示す。２３Ｂ８、２４Ａ１、２４Ｃ９、及び２４Ｇ５のＶＨＨ領域配列を図３９に示す。

【0434】

抗体の定常領域をさらに組換え、位置２９７におけるアスパラギンをアラニンで置き換えることができる（Ｎ２９７Ａ）。例えば、２４Ｇ５の定常領域にＮ２９７Ａ変異が導入されると、結果として得られる抗体は２４Ｇ５－Ｎと命名される。

【0435】

実施例９．抗ＴＦＲ１抗体の種間結合
ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＦＲ１細胞又はＣＨＯ－Ｓ－ｆａｓＴＦＲ１細胞をそれぞれ１０^５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに移した。段階希釈したサンプル抗ＴＦＲ１抗体を９６ウェルプレートに加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳを陰性対照（ＮＣ）として使用した。次に、フローサイトメトリー分析の前に、細胞を二次抗体である抗ｈＩｇＧ－Ｆｃ－Ａｌｅｘ Ｆｌｏｕｒ（商標） ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：１０９－６０６－１７０）と共に暗所、４℃で１５分間インキュベートした。

【0436】

ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＦＲ１細胞又はＣＨＯ－Ｓ－ｆａｓＴＦＲ１細胞は、それぞれヒトＴＦＲ１（ｈＴＦＲ１、配列番号７０）又はＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＴＦＲ１アミノ酸配列（ｆａｓＴＦＲ１、配列番号７１）を発現するベクターでＣＨＯ－Ｓ細胞をトランスフェクトすることによって得られた。試験結果を以下の表に示す。

【0437】

ヒトイズロン酸－２－スルファターゼにコンジュゲートしたヒトＴＦＲ１を標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体であるＪＲ１４１は、２０２１年３月に日本でムコ多糖症ＩＩ型の静脈内治療薬として初めて承認された。ＪＲ１４１のＶＨ配列及びＶＬ配列は、それぞれ配列番号７２及び配列番号７３に示される。陽性対照（ＪＲ１４１－Ｎ）では、ＪＲ１４１のＶＨとＶＬをＮ２９７Ａ変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域に接続した。

【0438】

【表15】

【0439】

実施例１０．抗ＴＦＲ１抗体の結合親和性
抗ＴＦＲ１抗体のヒト（ｈＴＦＲ１－Ｈｉｓ、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＣＤ１－Ｈ５２４３）又はサル（ｆａｓＴＦＲ１－Ｈｉｓ、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＴＦＲ－Ｃ５２４ａ）のＨｉｓタグ付きＴＦＲ１タンパク質への結合親和性を、予め固定化したプロテインＡセンサチップを装着したＢｉａｃｏｒｅ（商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）８Ｋバイオセンサーでの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して検証した。

【0440】

精製された抗ＴＦＲ１抗体は、検出のためにプロテインＡチップ（シリーズＳセンサチッププロテインＡ）上に捕捉された。精製された抗ＴＦＲ１抗体（１μｇ／ｍＬ）を１０μＬ／分でロードして、ｈＴＦＲ１－Ｈｉｓ及びｆａｓＴＦＲ１－Ｈｉｓ（２００ｎＭ）に結合させた。流速は３０μＬ／分であった。結合時間及び解離時間をそれぞれ１８０秒及び６００秒に設定した。各滴定液の最後の注射の後に、チップをグリシン溶液（ｐＨ ２．０）で、３０μＬ／分で３０秒間再生した。

【0441】

Ｂｉａｃｏｒｅ（商標） ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．０を用いて、データ全体を、１：１のラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６．９９－１１０）に適合させることにより、動力学的会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得た。親和性を、動力学的速度定数の商から推定した（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。

【0442】

当業者が理解するように、パラメータ（例えば、抗体濃度）を適切に調整した同じ方法を、各試験抗体に対して実施した。試験抗体に対する結果を、以下の表にまとめる。結果は、４つの抗ＴＦＲ１抗体全てがヒト及びサルＴＦＲ１に高い親和性で結合できることを示している。

【0443】

【表16】

【0444】

実施例１１．抗ＴＦＲ１抗体のエピトープ分析
精製された抗ＴＦＲ１抗体のペア間の標的タンパク質エピトープの相対位置を、３０℃でＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用したバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって分析した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０×）から希釈した１×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭの、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び０．０５％のＰ２０、ｐＨ７．４）を、実験全体を通してランニング緩衝液として用いた。約１０μｇ／ｍＬのｈＴＦＲ１－Ｈｉｓタンパク質をＨＩＳ１Ｋ（抗ペンタＨＩＳ）で２００秒間捕捉し、２００ｎＭの抗体（検体１）を３０μＬ／分の流速で注入してリガンドに結合させた。異なる抗体の結合が互いに干渉するかどうかを決定するために、同じ条件下で別の抗体（検体２）を注射した。結合時間は、各抗体につき３００秒であった。

【0445】

各抗体の結合値を、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １２．０を使用して得た。ある抗体の、別の抗体への結合の干渉を定量するために、結合比を計算し、各対の抗体を比較した。第１の抗体（検体１）の結合値で除した、第２の抗体（検体２）の結合値により、結合比を定義する。各抗体ペアの結合比を、以下のマトリックス表にまとめる。具体的には、検体１が検体２に対して阻害効果を示した場合、結合比は０．０～０．５であり、検体１が検体２に対してブロッキング効果を示さなかった場合、結合比は０．５～１．１であった。一般的に、互いに干渉する抗体ペアは、同一又は重複するエピトープを持つ。

【0446】

エピトープ結合アッセイの結果は、２４Ａ１と２４Ｇ５が同じエピトープを認識でき、２３Ｂ８、２４Ｃ９及びＪＲ１４１－Ｎが異なるエピトープを認識できることを示している。

【0447】

【表17】

【0448】

実施例１２．抗ＴＦＲ１抗体の内在化
抗ＴＦＲ１抗体とｐＨＡｂ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体をヒト皮質微小血管内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ細胞）に加え、３時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、フローサイトメーターを使用して測定した。抗体のエンドサイトーシス率を計算した。ヒトＩｇＧ１タンパク質（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、カタログ番号：Ｃ０００１）をアイソタイプ対照（ＩＳＯ）として使用した。結果は以下の表に示されており、４つの抗体全てがヒト皮質微小血管内皮細胞において良好なエンドサイトーシス活性を示したことが示されている。

【0449】

【表18】

【0450】

実施例１３．抗ＴＦＲ１抗体の安定性分析
抗ＴＦＲ１抗体２３Ｂ８、２４Ａ１、２４Ｃ９、及び２４Ｇ５の安定性を評価した。具体的には、以下の試験を実施した：（１）溶液の外観及び目に見える不溶性物質の存在を観察する；（２）サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＵＰＬＣ）により抗体の純度変化を検出する（全てのピーク面積の合計に対する主ピーク面積のパーセンテージとして表示（純度、％））；（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー－高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）法を使用して抗体の見かけの疎水性の変化を検出する（主ピークの保持時間として表示（ＨＩＣ、分））；（４）キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）により抗体の電荷変異体を検出する（主成分、酸性成分、アルカリ性成分のパーセンテージとして表示）；（５）ＵＮｃｌｅシステムにより抗体の熱安定性を検出する（融解温度（Ｔｍ）及び凝集温度（Ｔａｇｇ）として表示）。

【0451】

ＳＥＣ－ＵＰＬＣ実験では、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０クロマトグラフシステム（ＸＢｒｉｄｇｅ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（２００Å、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と接続）を使用した。抗体サンプルを精製水で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。以下のパラメータを使用した：移動相：２５ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ ６．８）＋０．３ＭのＮａＣｌ；流速：１．８ｍＬ／分；カラム温度：２５℃；検出波長：２８０ｎｍ；注入量：１０μＬ；サンプルトレー温度：６℃；及び実行時間：７分。

【0452】

ＨＩＣ－ＨＰＬＣ実験では、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０クロマトグラフシステム（ＰｒｏＰａｃ（商標） ＨＩＣ－１０カラム（４．６×１００ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と接続）を使用し、サンプルを、移動相Ａを用いて０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。以下のパラメータを使用した：移動相Ａ：０．９Ｍの硫酸アンモニウム、０．１ＭのＰＢ、１０％のアセトニトリル（ｐＨ ６．５）；移動相Ｂ：０．１ＭのＰＢ、１０％のアセトニトリル（ｐＨ ６．５）；流速：０．８ｍＬ／分；勾配：０分 １００％ Ａ、２分 １００％ Ａ、３２分 １００％ Ｂ、３４分 １００％ Ｂ、３５分 １００％ Ａ、及び、４５分 １００％ Ａ；カラム温度：３０℃；検出波長：２８０ｎｍ；注入量：１０μｇ；サンプルトレー温度：約６℃；並びに実行時間：４５分。

【0453】

ｃＩＥＦ実験では、サンプル調製のために、Ｍａｕｒｉｃｅ ｃＩＥＦ法開発キット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ、カタログ番号：ＰＳ－ＭＤＫ０１－Ｃ）を使用した。具体的には、４０μｇのタンパク質サンプルを、キットの中で、以下の試薬と混合した：１μＬのＭａｕｒｉｃｅ ｃＩＥＦ ｐＩ Ｍａｒｋｅｒ－４．０５、１μＬのＭａｕｒｉｃｅ ｃＩＥＦ ｐＩ Ｍａｒｋｅｒ－９．９９、３５μＬの１％メチルセルロース溶液、２μＬのＭａｕｒｉｃｅ ｃＩＥＦ ５００ ｍＭ アルギニン、４μＬの両性電解質（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ｐＨ範囲３～１０）、及び、水（加えて１００μＬの終体積にする）。Ｍａｕｒｉｃｅ分析器（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）で、Ｍａｕｒｉｃｅ ｃＩＥＦカートリッジ（ＰＳ－ＭＣ０２－Ｃ）を使用して、イメージングキャピラリー等電点電気泳動スペクトルを生成した。サンプルに、合計１０分間焦点を合わせた。機器にインストールした解析ソフトウェアを使用して、２８０ｎｍに焦点を合わせたタンパク質の吸光度を分析した。

【0454】

熱安定性実験では、６０ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を１℃ずつ２５℃から９５℃まで加熱し、各測定の前に１分間の平衡時間を置いた。

【0455】

詳細な結果を以下の表に示す。結果は、４つの抗体全てが良好な安定性と物理的及び化学的特性を有することを示している。

【0456】

【表19】

【0457】

実施例１４．薬物動態（ＰＫ）分析
マウスＴＦＲ１タンパク質の細胞外領域が対応するヒトＴＦＲ１細胞外領域で置き換えられたキメラＴＦＲ１タンパク質（配列番号７４）を発現するように、ヒト化ＴＦＲ１マウスモデル（ｈＴＦＲ１マウス）を組換えた。ヒト化ＴＦＲ１マウスモデルに関する詳細な説明は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２２／１０５９２４に見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0458】

抗ＴＦＲ１抗体の濃度をｈＴＦＲ１マウスにおいて決定した。具体的には、マウスを異なる群（１群あたり８匹のマウス）に入れ、ほぼ等モル量のＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２）、２３Ｂ８－Ｎ（Ｇ３）、２４Ａ１－Ｎ（Ｇ４）、２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５）、又は２４Ｃ９－Ｎ（Ｇ６）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射で投与した。対照群（Ｇ１）マウスにヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を投与した。投与スキームの詳細を以下の表に示す。

【0459】

【表20】

【0460】

投与の０．５、６、２４、及び７２時間後に血液と脳サンプルを採取した。各時点で２匹のマウスをサンプリングし、後眼窩血を採取した後、マウスを麻酔した。脳内の残留血液による干渉を避けるために、マウスを室温で１０分間、生理食塩水で灌流した。具体的には、生理食塩水を左心室から右心室へ全身循環を介して灌流した。脳サンプルを切除し、矢状面によって２つの半脳に分割した。左半脳は注入した抗体の定量化にかけ、右半脳はホルマリンで固定し、連続切片用にパラフィンに包埋した。脳サンプルを細かく切り分け、１×混合プロテアーゼ阻害剤を含むＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）で均質化した。脳ホモジネートをアリコートしてタンパク質を抽出し、続いて電気化学発光法で抗体を定量化した。残りのホモジネートについては、１５％デキストランを使用して５４００ｇで１５分間の勾配密度遠心分離によって毛細血管を除去した。遠心分離後、遠心管の上部の画分を実質として保存し、タンパク質抽出と抗体定量化も行った。図４０Ａ～４０Ｄは、総脳タンパク質中の抗体濃度（図４０Ａ）、脳総タンパク質中の抗体濃度と血清抗体濃度との比（図４０Ｂ）、脳実質中の抗体濃度（図４０Ｃ）、及び各時点における脳実質中の抗体濃度と血清抗体濃度との比（図４０Ｄ）を示す。これらの結果は、２４Ｇ５－Ｎ（群Ｇ５）が実質又は全脳のいずれかで最も豊富であることを実証した。

【0461】

同様の実験では、ｈＴＦＲ１マウスを５つの群（１群あたり３匹のマウス）に入れ、１８．４ｍｇ／ｋｇのＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２）、１０ｍｇ／ｋｇの２３Ｂ８－Ｎ（Ｇ３）、１０ｍｇ／ｋｇの２４Ａ１－Ｎ（Ｇ４）、又は１０ｍｇ／ｋｇの２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５）を静脈内注射（合計１回投与）で投与した。対照群（Ｇ１）マウスにｈＩｇＧ１（Ｇ１）を投与した。投与の２４時間後に脳サンプルを採取し、抗ＴＦＲ１抗体の濃度を決定した。図４１Ａ～４１Ｂは、それぞれ脳実質及び脳総タンパク質中の抗体濃度試験の結果を示す。試験した全ての抗体は、脳内でｈＩｇＧ１（Ｇ１）よりも高い濃度を示し、陽性対照のＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２）と比較して、２３Ｂ８－Ｎ（Ｇ３）及び２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５）は血液脳関門をよりよく通過して脳実質に入ることができることを示している。

【0462】

別の同様の実験では、ｈＴＦＲ１マウスを７つの群（１群あたり６匹のマウス）に入れ、ＪＲ１４１－Ｎ（Ｇ２～Ｇ４）又は２４Ｇ５－Ｎ（Ｇ５～Ｇ７）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射で投与した。対照群（Ｇ１）マウスにｈＩｇＧ１を投与した。投与スキームの詳細を以下の表に示す。

【0463】

【表21】

【0464】

投与の６時間及び２４時間後に、上述の方法を使用して血液及び脳サンプルを採取した。各時点で３匹のマウスをサンプリングした。組織の処理及び抗体の定量化も上述のように実施した。脳実質中のヒト化抗ＴＦＲ１抗体の濃度の測定結果を図４２に示す。結果は、各投与条件下で、２４Ｇ５－Ｎの脳実質に蓄積された抗体濃度がｈＩｇＧ１のそれよりも有意に高かったことを示している。さらに、ＪＲ１４１－Ｎと２４Ｇ５－Ｎの両方の濃度は、脳実質において用量依存的な傾向を示した。

【0465】

マウス脳におけるヒト化抗ＴＦＲ１抗体２４Ｇ５－Ｎの分布を検出するために、上記の実験で使用したマウスの右半脳切片でそれぞれｈＩｇＧ、ｈＴＦＲ１、及びｍＣＤ３１を染色することによって免疫蛍光アッセイを実施した。結果は、ｍＣＤ３１が微小血管でよく標識されたことを示した。ｈＴＦＲ１も微小血管で検出され、ｍＣＤ３１と共局在していた。さらに、実質内のいくつかのニューロンでもｈＴＦＲ１の発現が検出された。特に、抗ＴＦＲ１抗体２４Ｇ５－Ｎを、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８とコンジュゲートした二次抗ＩｇＧ抗体によって染色した。ｈＴＦＲ１と同様に、２４Ｇ５－Ｎは微小血管と実質で検出され、そのシグナルはｈＴＦＲ１シグナルと重複していた。したがって、全脳若しくは実質における２４Ｇ５－Ｎの定量化、又は実質における２４Ｇ５－Ｎの免疫蛍光の視覚的証拠のいずれにおいても、結果は、ヒト化抗ＴＦＲ１抗体２４Ｇ５－Ｎが血液脳関門（ＢＢＢ）を効率的に通過できることを示している。

【0466】

実施例１５．ブロッキングアッセイ
抗ＴＦＲ１抗体２３Ｂ８、２４Ａ１、２４Ｃ９、及び２４Ｇ５によるＴＦ（トランスフェリン）へのＴＦＲ１の結合のブロッキングを、３０℃でＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システムを使用したバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）でテストした。具体的には、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０×）から希釈した１×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ ７．４）を、実験全体を通してランニング緩衝液として使用した。約１０μｇ／ｍＬの抗体をＡＨＣ（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃキャプチャー）で２００秒間捕捉し、８００ｎＭのｈＴＦＲ１－Ｈｉｓ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＣＤ１－Ｈ５２４３）とｈＴＦ－Ｈｉｓ（ヒトトランスフェリンタンパク質、Ｋａｃｔｕｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＴＦＮ－ＨＭ１０１）を注入してリガンドに結合させた。結合時間は、各抗体につき３００秒であった。各抗体の結合値を、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １２．０を使用して得た。結果は、これら４つの抗体がＴＦＲ１とＴＦの結合をブロッキングしなかったことを示した。したがって、このような非ブロッキング抗体は、正常細胞におけるＴＦＲ１－ＴＦ相互作用に干渉する可能性は低いと考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図29-1】

【図29-2】

【図29-3】

【図29-4】

【図29-5】

【図30-1】

【図30-2】

【図30-3】

【図30-4】

【図30-5】

【図30-6】

【図30-7】

【図30-8】

【図31-1】

【図31-2】

【図31-3】

【図31-4】

【図31-5】

【図31-6】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40A】

【図40B】

【図40C】

【図40D】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【配列表】

2025532609000001.xml

【国際調査報告】